改良されたプローモーターおよびそれを用いたＬ−リシンの生産方法
【課題】アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターを改良して発現効率を高めた微生物およびそれを用いたＬ−リシンの生産方法の提供。
【解決手段】本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結され、改良されたプロモーター活性を有するコリネ型微生物由来の核酸分子、該核酸分子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、および該形質転換体を用いてＬ−リシンを生産する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結され、改良されたプロモーター活性を有するコリネ型微生物由来の核酸分子、該核酸分子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、および該形質転換体を用いてＬ−リシンを生産する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたプロモーターおよびそれを用いたＬ−リシンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型微生物は、アミノ酸と核酸関連物質の生産に伝統的に最も広く用いられる産業用微生物である。主にＬ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アルギニン、およびグルタミン酸塩などのアミノ酸および各種核酸を含む飼料、医薬品および食品などの分野で多様な用途を有する化学物質を生産するのに用いられるグラム陽性細菌であり、生育にビオチンを要求する。細胞分裂の際に直角に折り曲げられる特徴(ｓｎａｐｐｉｎｇ)を持っており、生成された代謝物質に対する分解活性が低いことも、この菌が持つ利点の一つである。代表的な菌種としては、コリネバクテリウム・グルタミクム(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ)を含むコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム・フラバム(Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ)を含むブレビバクテリウム属、アルスロバクター属(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．)、およびマイクロバクテリウム属(Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．)などがある。
【０００３】
Ｌ−リシンは、Ｌ−アミノ酸の一つであって、その他のアミノ酸の吸収を増加させることにより飼料の質を向上させることが可能な能力により動物飼料補充物として商業的に用いられており、医学では注入用溶液剤の成分として使用され、製薬産業にも使用されている。よって、リシンを産業的に生産することは経済的に重要な産業工程である。
【０００４】
リシンの生産効率を改善させるための方法として、リシン生合成経路上の遺伝子を増幅させるか、あるいは該遺伝子のプロモーターを改変して、生合成経路上の酵素活性を増大させる方法が用いられてきた。従来のリシン生合成関連遺伝子が強化されたコリネバクテリウム菌株およびそれを用いたＬ−リシンの生産方法が知られていた。例えば、米国特許第６，７４６，８５５号には、ｌｙｓＥ遺伝子（リシン排出キャリア遺伝子）が強化され、ｄａｐＡ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ｐｙｃ遺伝子およびｄａｐＢ遺伝子からなる群より選ばれた遺伝子がさらに導入されたコリネバクテリアを培養してＬ−リシンを生産する方法が開示されている。また、米国特許第６，２２１，６３６号には、Ｌ−リシンおよびＬ−トレオニンによるフィードバック阻害が実質的に脱感作されたアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡで形質転換されたコリネバクテリアが開示されている。
【０００５】
そして、米国特許公開番号第２００６０００３４２４号には、ＧＤＨ遺伝子、ＣＳ遺伝子、ＩＣＤＨ遺伝子、ｐＤＨ遺伝子、ＡＣＯ生産遺伝子などのプロモーター配列をコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列と類似するように改変して酵素活性が増加したコリネ型微生物を用いて、Ｌ−アミノ酸を生産する方法が開示されている。
【０００６】
前記のようにコリネ型微生物を、遺伝子工学的または代謝工学的技術を用いて目的の物質などを高力価で生産することが可能な菌株として開発するためには、微生物内の様々な代謝過程に関連した遺伝子の発現を選択的に調節することができなければならない。このような調節のためには、調節遺伝子の一つとしてＤＮＡ分子上にＲＮＡ合成酵素が結合して転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を開始する部位としてのプロモーターの活性を調節することが重要である。
ところが、現在まで、リシン生合成経路のうち、リシンの前駆体であるアスパラギン酸塩を供給する重要な役割を担当すると思われるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＥＣ；２．６．１．１；ａｓｐＢ）遺伝子のプロモーターを改良して、発現率を高めたコリネ型細菌については開示されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを改良して発現率を高めた微生物を提供し、該微生物を用いて効率よくリシンを生産する方法を提供することである。
すなわち、本発明の目的は、改良されたプロモーターの活性を有するコリネバクテリウム・グルタミクム由来の核酸分子を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記プロモーターの活性を有する核酸分子を含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記形質転換体を培養する段階を含む、リシンの生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意努力した結果、コリネバクテリウム染色体上のａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを塩基置換によって改良し、改良されたプロモーターをコリネバクテリウム属微生物に導入させることにより、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素の活性が内在的活性より増加しているコリネバクテリウム属微生物を提供することができることを見出し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００９】
ａｓｐＢ遺伝子と作動可能に連結された、コリネバクテリウム・グルタミクム由来の、改良されたプロモーター活性を有する本発明に係る核酸分子は、野生型プロモーターに比べて高いプロモーター活性を示すので、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を増加させ、それによりリシンの生産効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１はコリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを示す図である。
【図２】図２はコリネバクテリウム塩基置換用ベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ１を示す図である。
【図３】図３はコリネバクテリウム塩基置換用ベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ２を示す図である。
【図４】図４はコリネバクテリウム塩基置換用ベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ３を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一つの態様として、本発明は、配列番号２、３、および４よりなる群から選ばれたいずれか一つの塩基配列を持つ、改良されたプロモーター活性を有する核酸分子に関する。
【００１２】
好ましい一実施態様として、前記の塩基配列は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結することができ、コリネバクテリウム属由来であり得る。
【００１３】
本発明において、用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するようにするＤＮＡ領域、すなわち、通常コード領域の上流に見出される非翻訳核酸配列をいい、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位を含み、かつｍＲＮＡ転写開始部位の５’上流側に位置し、プロモーター下流にある遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有する。
【００１４】
本発明のプロモーター活性を有するコリネバクテリウム・グルタミクム核酸分子は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結される。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ａｓｐＢ遺伝子であって、コリネバクテリウム属細菌でリシンを生産する生合成経路上の主要な遺伝子である。
【００１５】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、グルタミン酸塩のアミノ基をオキサロ酢酸へ転移する反応を触媒することにより、リシン生合成の前駆体であるアスパラギン酸塩を供給する重要な役割をする。したがって、前記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性が増加すると、リシン生合成の前駆体であるアスパラギン酸塩が増加し、結局、リシンの生合成が増加することとなる。
【００１６】
また、前記用語「作動可能に連結」とは、本発明のプロモーター活性を有する核酸配列がアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の転写を開始および媒介するように、前記遺伝子配列とプロモーター配列とが機能的に連結されていることを意味する。これは本発明のプロモーター活性を有する核酸配列がａｓｐＢ遺伝子と作動可能に連結されることにより、前記オペロン遺伝子の転写活性を調節することができることを意味する。
【００１７】
現在まで、ａｓｐＢ遺伝子のプロモーター上で遺伝子の転写を開始する転写開始点(transcriptional start site)は、知られていなかった。
本発明者らは、具体的な一実施例において、ａｓｐＢ遺伝子の転写開始点同定のために５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ５’ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）技法(Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．８．５４)を行った。５’−ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡの一部が既知の場合に、それを用いて５’上流の未知領域をクローニングするための方法であり、Ｔａｋａｒａ社の５’−Ｆｕｌｌ Ｒａｃｅ ｃｏｒｅ ｓｅｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６１２２）を用いて実験を行った。実験の結果、ａｓｐＢ遺伝子の転写開始点は、ＡＴＧ開始コドンの上流７２ｂｐに位置するＧであると同定された。
前記で同定された転写開始点を＋１位置にして、改良のためのプロモーターコンセンサス配列部位を選定した。
【００１８】
本発明のプロモーター活性を有する核酸配列は、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいてａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを改良したもので、野生型プロモーターより高いプロモーター活性を持つようにしたことを特徴とする。さらに高いプロモーター活性を持つように改良する方法としては、当業界における公知の方法を、制限なく使用することができ、好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムａｓｐＢ遺伝子のプロモーター核酸配列に、欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより、配列上の変異を誘導して改良することができる。
【００１９】
本発明のプロモーター核酸分子は、標準分子生物学技術を用いて単離または製造できる。例えば、適切なプライマー配列を用いてＰＣＲによって単離することができる。また、自動化されたＤＮＡ合成機を用いる標準合成技術を利用して製造することもできる。
【００２０】
具体的な一実施例において、本発明者は、米国国立衛生研究所のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、ａｓｐＢ遺伝子（コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＣ＿００３４５０．３）上の遺伝子座タグ（ｌｏｃａｓ ｔａｇ）ＮＣｇ１０２３７）のプロモーター部位を含む塩基配列を収得し（配列番号１）、この塩基配列に基づいて８つのプライマー（配列番号１０〜１７）を合成した。その後、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーを用いてＰＣＲを行い、主要部位に改変された配列を有するプロモーターを含む本発明に係る核酸分子（配列番号２、３、および４）を収得した。
【００２１】
本発明のコリネバクテリウム・グルタミクムプロモーター活性を有する核酸分子は、好ましくは原核細胞、特に大腸菌またはコリネ型細菌における遺伝子発現のためのプロモーターとして有用である。本発明において、用語「コリネ型細菌」は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、およびマイクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の微生物を含む概念である。このようなコリネ型細菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、およびこれらから製造されたＬ−アミノ酸生産突然変異体または菌株、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１１００１を含み、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１であるが、これらの例に限定されない。
【００２２】
他の態様として、本発明は、前記改良されたプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターに関する。
本発明の用語「ベクター」は、適切な宿主内で目的の遺伝子を発現させることができるように適切な調節配列に作動可能に連結された遺伝子の塩基配列を含有するＤＮＡ構築物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することが可能なプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写および翻訳の終結を調節する配列を含む。
【００２３】
本発明で使用されるベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界における公知の任意のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ粒子、または簡単には潜在的ゲノム挿入物であり、好ましくはｐＥＣＣＧ１２２ベクター（ノ・ガブスら、Ｋｏｒ．Ｊｏｕｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｊｕｌｙ．１９９１ ｐ．１４９−１５４）を使用することができるが、これに限定されない。ベクターは、適当な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノムとは関係なく複製または機能することができ、ゲノムそのものに組み込まれる場合もある。
【００２４】
具体的には、本発明のベクターは、宿主細胞内に導入されると、ベクター内のプロモーター活性を有する核酸分子配列が宿主細胞ゲノム上の内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）ａｓｐＢ遺伝子のプロモーター部位の配列と相同組換えを起こし、染色体内に挿入され得る。したがって、本発明のベクターとしては、宿主染色体への挿入有無を確認するための選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含みうる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち、目的遺伝子の挿入有無を確認するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型を付与するマーカーが使用できる。選択剤を含む環境では、選択マーカーを発現する細胞のみが生存し、あるいは他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。本発明のベクターは、好ましくはｌａｃＺ遺伝子を含み得る。
【００２５】
本発明の具体的な一実施例において、本発明者は、相同組換えによってコリネバクテリウム・グルタミクムのａｓｐＢ遺伝子のプロモーター部位を、プロモーター活性が増進するように変異したプロモーター配列に置換させることが可能なベクターを製造した。まず、大腸菌クローニング用ベクターｐＡＣＹＣ１７７を制限酵素処理して平滑末端化した後、ｌａｃＺ遺伝子を挿入させるために、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いて自体のプロモーターを含むようにｌａｃＺ遺伝子を増幅した後、多数の制限酵素認識部位を含むアダプター配列を挿入することにより、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを製造した(図１)。その後、上述したように高いプロモーター活性を持つように製造された、ａｓｐＢ遺伝子のプロモーター配列内に変異を有するプロモーターを含む核酸分子を、前記ｐＤＺベクターのアダプター部位に挿入することにより、配列番号２の核酸配列を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ１(図２)、配列番号３の核酸配列を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ２(図３)、および配列番号４の核酸配列を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ３(図４)を、それぞれ製造した。
【００２６】
別の態様として、本発明は、前記ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
本発明の用語「形質転換」は、ＤＮＡを宿主に導入し、該ＤＮＡが染色体外因子として、または染色体に組み込まれることによって複製可能になることを意味する。好ましい一実施態様として、ベクターで宿主細胞を形質転換した後、ベクター内のプロモーター活性を有する核酸分子配列は、宿主細胞ゲノム上の内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）ａｓｐＢ遺伝子のプロモーター部位の配列と相同組換えを起こして染色体内に挿入されてもよいし、プラスミド形態で保持されてもよい。
【００２７】
本発明のベクターによる細胞の形質転換は、核酸を細胞内に導入するいずれの方法でも行うことができる。宿主細胞に応じて、当分野における公知の適切な標準技術が選択され、例えば、エレクトロポーレション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、および酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などがある。
【００２８】
前記宿主細胞としては、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主を使用することが望ましいが、原核および真核を含む全ての微生物が使用可能であり、好ましくは大腸菌またはコリネ型細菌、さらに好ましくはコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属、より一層好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１を使用することができる。
【００２９】
本発明のベクターで形質転換された形質転換体では、相同組換えによってコリネバクテリウム・グルタミクムのａｓｐＢ遺伝子のプロモーター部位を、プロモーター活性が増進するように変異したプロモーター配列に置換することにより、ａｓｐＢ遺伝子は改良されたプロモーターを有する。これにより該形質転換体は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性が野生型よりも高いという特徴を持つ。
【００３０】
本発明の具体的な一実施例では、本発明に係る、配列番号２で構成されるプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ１(図２)、配列番号３で構成されるプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ２(図３)、および配列番号４で構成されるプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ３(図４)のそれぞれで、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１を形質転換させることにより、ａｓｐＢ遺伝子のプロモーター活性が増進した各形質転換体を製造した。
【００３１】
本発明ではｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１で形質転換させて得た形質転換体を、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１と、ｐＤＺ-ａｓｐＢＰ２で形質転換させて得た形質転換体をＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２と、ｐＤＺ-ａｓｐＢＰ３で形質転換させて得た形質転換体をＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３とそれぞれ命名した。それぞれの形質転換体のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性を母菌株であるＫＦＣＣ１０８８１と比較したところ、それぞれの形質転換体は母菌株よりそれぞれ２．１倍、２．６倍および１．８倍活性が高いことが確認され(表３)、これによって本発明の改良されたプロモーターがアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性を増加させることを確認した。また、前記形質転換体は、活性改善効果を有することが示されたので、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３をそれぞれＣＡ０１−７７３、ＣＡ０１−７７４、およびＣＡ０１-７７５と命名し、２０１０年２月５日付で韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇｉａｎｉｓｍｓ、以下、「ＫＣＣＭ」と略する)に受託番号ＫＣＣＭ１１０６１Ｐ、ＫＣＣＭ１１０６２Ｐ、およびＫＣＣＭ１１０６３Ｐで寄託した。
【００３２】
別の態様として、本発明は、前記形質転換体を培養する工程を含む、リシンの生産方法に関する。
本発明において、形質転換体の培養は公知の方法によって行われ得る。培養温度、培養時間および培地のｐＨなどの条件は適切に調節できる。これらの公知の培養方法は、文献［Ｃｈｍｉｅｌ；Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １．Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１）、およびＳｔｏｒｈａｓ；Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ／ Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４）］に詳細に記述されている。また、培養方法には回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、および流加式培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）が含まれる。好ましくはバッチ工程、または注入バッチまたは反復注入バッチ工程で連続的に培養することができるが、これらに限定されない。
【００３３】
使用される培養培地は、特定の菌株の要求条件を適切に充足させなければならない。多様な微生物に対する培養培地は公知である（例えば、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」ｆｒｏｍ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）。培地内の炭素供給源としては、糖および炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラッセ、澱粉およびセルロース）、油脂および脂肪（例：大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナツ油）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸）、アルコール（例：グリセロールおよびエタノール）、および有機酸（例：酢酸）などを用いることができる。これらの物質は個別的にまたは混合物として使用できる。窒素供給源は、窒素含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉および尿素）、または無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）を用いることができ、これらの物質も個別的にまたは混合物として使用することができる。リン供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩を用いることができる。
【００３４】
また、培養培地は、成長に必須の金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）を含有することができ、最終的に、アミノ酸およびビタミンなどの必須成長促進物質を前述した物質の他に使用することができる。適切な前駆体を前記培養培地にさらに加えることができる。前記供給物質は、培養培地に一度に全部加えるか、あるいは培養中に適切に供給することができる。
【００３５】
培養培地のｐＨは、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を適切に用いて調節することができる。発泡は、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの起泡剤を用いて調節することができる。酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養培地中に導入して好気性条件を維持することができる。培養温度は通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養は所望のＬ−アミノ酸の生成量が最大に得られるまで続けられ、このような目的によって通常１０〜１６０時間で達成される。Ｌ−リシンは培養培地中に排出されるか、あるいは細胞中に含まれていてもよい。
【００３６】
一方、本発明の形質転換体を培養する工程を含むリシンの生産方法は、前記培養工程で生成されるリシンを回収する工程をさらに含みうる。当業界における公知の方法によって、細胞または培養培地からＬ−リシンを分離することができる。本発明において有用なＬ−リシン回収方法の例として、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化およびＨＰＬＣなどの方法が挙げられるが、これらの例に限定されない。
以下、下記実施例によって本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は本発明を例示的に実施するためのもので、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００３７】
本実施例では、改良されたプロモーター製作のために、ａｓｐＢ遺伝子の転写開始点を明らかにし、リシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクムのａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを、相同組換えによって改良されたプロモーターで置換するための組換えベクターを製作し、前記ベクターでコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１菌株を形質転換させて、染色体上のプロモーターが改良された菌株を得ることにより、リシン生産効率の向上した菌株を製造した。
【００３８】
本発明で利用するコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクム野生株（ＡＴＣＣ１３０３２）を母菌株として人工変異法によって製作されたＳ−（２−アミノエチル）システイン（以下、「ＡＥＣ」という）に対する耐性およびホモセリン漏出（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌｅａｋｙ）の特徴を持つ菌株である（韓国登録特許第０１５９８１２号、同第０３９７３２２号参照）。
【００３９】
実施例１：ａｓｐＢ遺伝子転写開始点の同定
本実施例では、現在まで、知られていなかったａｓｐＢ遺伝子の転写開始点（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ）を同定した。
ａｓｐＢ遺伝子の転写開始点の同定のために、５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ５’ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ．Ｗ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ． ８．５４）を用いた。
５’−ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡの一部が既知の場合に、それを用いて５’上流の未知領域をクローニングするための方法であり、本実施例ではＴａｋａｒａ社の５’−Ｆｕｌｌ Ｒａｃｅ ｃｏｒｅ ｓｅｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６１２２）を用いて実験を行った。
５’−ＲＡＣＥ実験のために、米国国立衛生研究所のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されたａｓｐＢ遺伝子（コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＣ＿００３４５０．３）上の遺伝子座タグ（ｌｏｃａｓ ｔａｇ）ＮＣｇ１０２３７）の塩基配列に基づいて５つのプライマー（表１、配列番号５〜９）を合成した。
【００４０】
【表１】
【００４１】
まず、ＡＴＣＣ１３０３２菌株のｍＲＮＡを抽出し、ａｓｐＢ遺伝子のｍＲＮＡに特異的な５’末端リン酸化ＲＴ−プライマー（配列番号５）を用いて逆転写反応で一本鎖（１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡを合成した。その後、ＲＮａｓｅＨで処理してハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡのＲＮＡを分解した後、ＲＮＡリガーゼにより一本のｃＤＮＡを環状に（あるいはコンカテマー化）した。
前記において、ライゲーション反応が終わった試料を鋳型とし、配列番号６と７をプライマーとして用いてＰＣＲ増幅をし、１次ＰＣＲ産物を得た。前記で得られた１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号８と９をプライマーとして用いてＰＣＲを再び行い、２次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲは、変性９５℃、３０秒、アニーリング５５℃、３０秒、および重合反応７２℃、１分の条件を３０サイクル繰り返し行った。最終的に得られたＰＣＲ産物は、遺伝子精製を行った後、シークエンシングによる塩基配列の分析を行った。
塩基配列の分析の結果、ａｓｐＢ遺伝子の転写開始点は、ＡＴＧ開始コドンの上流７２ｂｐに位置するＧであると同定された。前記において、同定された転写開始点を＋１位置にし、改良のためのプロモーターコンセンサス配列部位を選定した。
【００４２】
実施例２：プロモーター改良用組換えベクターの製作
（１）染色体挿入用ベクター(ｐＤＺ)の製作
本実施例では、大腸菌クローニング用ベクターｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｔｉｏｎ ＃Ｘ０６４０２）を基本ベクターとして用いて、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを製作した。
ｐＡＣＹＣ１７７ベクターをＡｃｕＩおよびＢａｎＩ制限酵素で処理した後、クレノウ酵素処理によって平滑末端化した。選択マーカーとして使用される大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子は、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって自体のプロモーターを含むように増幅した後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびポリヌクレオチドキナーゼ処理によって５’−末端リン酸化および平滑化することにより準備した。このように準備した２種のＤＮＡ断片を接合し、接合された環状ＤＮＡ分子の制限酵素ＢａｍＨＩ部位に、人為的に合成した多数の制限酵素認識部位を含んでいるアダプター配列を挿入することにより、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを完成した。図１はコリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを示す図である。
【００４３】
（２）ａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを改良するための組換えベクター製作
本実施例では、リシンを生産する菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを改良するための組換えベクターを製作した。
まず、米国国立衛生研究所のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、ａｓｐＢ遺伝子(コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＣ＿００３４５０．３）上の遺伝子座タグ（ｌｏｃａｓ ｔａｇ）ＮＣｇ１０２３７)のプロモーター部位を含む塩基配列（配列番号１）を収得し、改変されたプロモーター配列を含むＤＮＡの断片（配列番号２、３、および４）を収得した。改変プロモーター配列は一般に微生物において知られているプロモーターコンセンサス配列に基づいて考案した。
また、前記変形されたプロモーター配列を製造するためのプライマーとしては、前記塩基配列に基づいて８つのプライマー（表２、配列番号１０〜１７）を合成した。
【００４４】
【表２】
【００４５】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｓｐＢ遺伝子のプロモーター配列を得るために、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表２に表記されたオリゴヌクレオチド対をプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素はＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲは、変性９５℃、３０秒、アニーリング５５℃、３０秒、および重合反応７２℃、１分の条件を３０サイクル繰り返し行った。その結果、置換部位を一方の側の末端に含んでいる３００ｂｐ ＤＮＡ断片を得た。ａｓｐＢＰ１−１は配列番号１０と１２をプライマーとして用いて増幅されたものであり、ａｓｐＢＰ１−２は配列番号１１と１３をプライマーとして用いて増幅されたものである。前記増幅産物を、予めＸｂａＩ制限酵素で切断して準備したｐＤＺベクターと混合し、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてクローニングすることにより、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１ベクターを得た。
ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ２およびｐＤＺ−ａｓｐＢＰ３の場合にも、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１の場合と同様の方法によって製作した。但し、挿入断片のＰＣＲ増幅の際に、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ２の場合には、配列番号１０と１４をプライマーとして用いて得られたａｓｐＢＰ２−１断片、および配列番号１１と１５を用いて得られたａｓｐＢＰ２−２断片とを用いて製作し、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ３の場合には、配列番号１０と１６をプライマーとして用いて得られたａｓｐＢＰ３−１断片と、配列番号１１と１７を用いて得られたａｓｐＢＰ３−２断片とを用いて製作した。
図２、３、および４は、それぞれ配列番号２、３、および４に該当するａｓｐＢＰ１、ａｓｐＢＰ２、ａｓｐＢＰ３を含んでいるコリネバクテリウム染色体置換用ベクターｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ２およびｐＤＺ−ａｓｐＢＰ３を示す図である。
【００４６】
実施例３：組換えベクターのコリネバクテリウム・グルタミクム菌株内への挿入
本実施例では、コリネバクテリウムの染色体上のａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを改良するために、前記で製作した組換えベクターでリシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１を形質転換させて、菌株染色体のプロモーター配列と前記ベクター上のプロモーター配列とを相同組換えによって置換させることにより、染色体内に前記改良プロモーター配列を挿入した。
前記実施例２において製造した改良プロモーター配列を有するＤＮＡ断片を含む前記の組換えベクターであるコリネバクテリウム染色体置換用ベクターｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ２およびｐＤＺ−ａｓｐＢＰ３を、それぞれコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１に電気パルス法により導入し、形質転換した後（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）５２：５４１−５４５による形質転換法を用いる）、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地で、染色体上の同遺伝子との相同性により挿入された菌株を選択した。
ベクターが首尾よく染色体に挿入されたことは、Ｘ−ｇａｌ（５−プロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む固体培地で青色を示すか否かを確認することにより、検出可能であった。１次染色体挿入された菌株を栄養培地で振とう培養（３０℃、８時間）した後、それぞれ１０−４から１０−１０まで希釈し、Ｘ−ｇａｌを含んでいる固体培地に塗抹した。大部分のコロニーが青色を示すが、これに反して低い比率で現れる白色のコロニーを選択することにより、二重交差（Ｄｏｕｂｌｅ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）によってａｓｐＢ遺伝子のプロモーター内で塩基配列が置換された菌株を選択した。このように選択された菌株は、ＰＣＲを用いた塩基置換の有無の確認および当該領域における塩基配列確認過程を経て最終選定した。
プロモーターの塩基置換の有無は、ａｓｐＢＰ１の場合、配列番号１１と１９、ａｓｐＢＰ２の場合、配列番号１１と１８、ａｓｐＢＰ３の場合、配列番号１１と１８をプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより分析し、目的の部位に対する塩基配列分析によって最終確認した。
最終的に、二重の交差過程を経て、染色体上のａｓｐＢ遺伝子のプロモーターに塩基置換を含む、リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３をそれぞれ得て、これらをそれぞれＣＡ０１−７７３、ＣＡ０１−７７４およびＣＡ０１−７７５と命名し、２０１０年２月５日付で韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１０６１Ｐ、ＫＣＣＭ１１０６２ＰおよびＫＣＣＭ１１０６３Ｐで寄託した。
【００４７】
実施例４：ａｓｐＢプロモーター改良菌株におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性の測定
母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１菌株および実施例３で最終的に製作されたＬ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３菌株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を測定するために、下記のような方法で培養し、培養液からタンパク質を分離して、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を測定した。
対数期まで培養した培養液をＯＤ６００値が０．３となるように２５ｍＬの下記種培地に接種した後、ＯＤ６００値が約１５に達するまで培養した。
＊種培地（ｐＨ７．０）
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１Ｌ基準）
培養液から遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１０分）によって菌体を回収し、０．１％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄した後、同緩衝溶液で６００ｎｍの濁度が１６０程度となるように懸濁した。懸濁液１．５ｍＬ当り１．２５ｇのガラスビーズ（ｇｌａｓｓ ｂｅａｄ）を添加した後、ビーズビーター（ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒ）を用いて６分間菌体を破砕した。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、３０分）によって上澄み液を回収し、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ．Ｍ １９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）によりタンパク質の濃度を定量した後、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として使用した。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を測定するために、０．２４Ｍ アスパラギン酸塩、０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、０．６４ｍＭ ＮＡＤＨ、０．１１ｍＭ ピリドキサルリン酸塩（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、０．９３ｋＵ／ｌ ＭＤＨ、０．４２ｋＵ／ｌ ＬＤＨを含む反応液に０．１ｍＬの粗タンパク質溶液を混合し、３０℃で１０分間定置した後、１２ｍＭの２−オキソグルタル酸塩（ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）を添加することにより反応を開始した。３４０ｎｍ波長で５分間吸光度の減少を測定してアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を計算した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性単位（Ｕ）は、１分間に１ｍｇのタンパク質によって減少したＮＡＤＨのｎｍｏｌｅとして定義した。
コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２、およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３の各菌株が示すアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を、母菌株ＫＦＣＣ１０８８１と比較してみた結果、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１菌株の場合、２．１倍、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２菌株の場合、２．６倍、そしてＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３菌株の場合、１．８倍高いアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を示すことが確認された（表３）。
【００４８】
【表３】
【００４９】
実施例５：ａｓｐＢプロモーター改良菌株におけるリシン生産
母菌株として用いたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１菌株、および実施例３で最終的に製作されたＬ−リシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２、およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３菌株を、Ｌ−リシン生産のために下記の方法で培養した。
下記の種培地２５ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミクム母菌株ＫＦＣＣ１０８８１と、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２、およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３とを接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振とう培養した。下記の生産培地２４ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに１ｍＬの種培養液を接種し、３０℃で１２０時間２００ｒｐｍで振とう培養した。
＊種培地（ｐＨ７．０）
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１Ｌ基準）
＊生産培地（ｐＨ７．０）
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸溜水１Ｌ基準）
培養終了の後、ＨＰＬＣを用いた方法によってＬ−リシンの生産量を測定した。 コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１と、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２、およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３とにおける培養液中のＬ−リシン濃度は、下記表４のとおりである。
【００５０】
【表４】
【００５１】
表４に示したように、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が２．６倍に強化されたＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２菌株は、母菌株ＫＦＣＣ１０８８１に比べてリシン生産効率が５％以上高いことを確認することができた。また、活性が２．１倍に強化されたＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１菌株は、リシン生産効率が３％以上、活性が１．８倍に強化されたＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３菌株は、リシン生産効率が３％以上母菌株より高いことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の改良されたプロモーター活性を有するコリネバクテリウム・グルタミクム由来の核酸分子は、野生型に比べて高いプロモーター活性を示し、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を増加させることによって、リシンの生合成効率を増加させることができる。これにより、産業的に有用なＬ−アミノ酸の一種である、Ｌ−リシンを高収率で生産することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたプロモーターおよびそれを用いたＬ−リシンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型微生物は、アミノ酸と核酸関連物質の生産に伝統的に最も広く用いられる産業用微生物である。主にＬ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アルギニン、およびグルタミン酸塩などのアミノ酸および各種核酸を含む飼料、医薬品および食品などの分野で多様な用途を有する化学物質を生産するのに用いられるグラム陽性細菌であり、生育にビオチンを要求する。細胞分裂の際に直角に折り曲げられる特徴(ｓｎａｐｐｉｎｇ)を持っており、生成された代謝物質に対する分解活性が低いことも、この菌が持つ利点の一つである。代表的な菌種としては、コリネバクテリウム・グルタミクム(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ)を含むコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム・フラバム(Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ)を含むブレビバクテリウム属、アルスロバクター属(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．)、およびマイクロバクテリウム属(Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．)などがある。
【０００３】
Ｌ−リシンは、Ｌ−アミノ酸の一つであって、その他のアミノ酸の吸収を増加させることにより飼料の質を向上させることが可能な能力により動物飼料補充物として商業的に用いられており、医学では注入用溶液剤の成分として使用され、製薬産業にも使用されている。よって、リシンを産業的に生産することは経済的に重要な産業工程である。
【０００４】
リシンの生産効率を改善させるための方法として、リシン生合成経路上の遺伝子を増幅させるか、あるいは該遺伝子のプロモーターを改変して、生合成経路上の酵素活性を増大させる方法が用いられてきた。従来のリシン生合成関連遺伝子が強化されたコリネバクテリウム菌株およびそれを用いたＬ−リシンの生産方法が知られていた。例えば、米国特許第６，７４６，８５５号には、ｌｙｓＥ遺伝子（リシン排出キャリア遺伝子）が強化され、ｄａｐＡ遺伝子、ｌｙｓＣ遺伝子、ｐｙｃ遺伝子およびｄａｐＢ遺伝子からなる群より選ばれた遺伝子がさらに導入されたコリネバクテリアを培養してＬ−リシンを生産する方法が開示されている。また、米国特許第６，２２１，６３６号には、Ｌ−リシンおよびＬ−トレオニンによるフィードバック阻害が実質的に脱感作されたアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ配列、およびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡで形質転換されたコリネバクテリアが開示されている。
【０００５】
そして、米国特許公開番号第２００６０００３４２４号には、ＧＤＨ遺伝子、ＣＳ遺伝子、ＩＣＤＨ遺伝子、ｐＤＨ遺伝子、ＡＣＯ生産遺伝子などのプロモーター配列をコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列と類似するように改変して酵素活性が増加したコリネ型微生物を用いて、Ｌ−アミノ酸を生産する方法が開示されている。
【０００６】
前記のようにコリネ型微生物を、遺伝子工学的または代謝工学的技術を用いて目的の物質などを高力価で生産することが可能な菌株として開発するためには、微生物内の様々な代謝過程に関連した遺伝子の発現を選択的に調節することができなければならない。このような調節のためには、調節遺伝子の一つとしてＤＮＡ分子上にＲＮＡ合成酵素が結合して転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を開始する部位としてのプロモーターの活性を調節することが重要である。
ところが、現在まで、リシン生合成経路のうち、リシンの前駆体であるアスパラギン酸塩を供給する重要な役割を担当すると思われるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＥＣ；２．６．１．１；ａｓｐＢ）遺伝子のプロモーターを改良して、発現率を高めたコリネ型細菌については開示されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを改良して発現率を高めた微生物を提供し、該微生物を用いて効率よくリシンを生産する方法を提供することである。
すなわち、本発明の目的は、改良されたプロモーターの活性を有するコリネバクテリウム・グルタミクム由来の核酸分子を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記プロモーターの活性を有する核酸分子を含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記形質転換体を培養する段階を含む、リシンの生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意努力した結果、コリネバクテリウム染色体上のａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを塩基置換によって改良し、改良されたプロモーターをコリネバクテリウム属微生物に導入させることにより、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素の活性が内在的活性より増加しているコリネバクテリウム属微生物を提供することができることを見出し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００９】
ａｓｐＢ遺伝子と作動可能に連結された、コリネバクテリウム・グルタミクム由来の、改良されたプロモーター活性を有する本発明に係る核酸分子は、野生型プロモーターに比べて高いプロモーター活性を示すので、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を増加させ、それによりリシンの生産効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１はコリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを示す図である。
【図２】図２はコリネバクテリウム塩基置換用ベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ１を示す図である。
【図３】図３はコリネバクテリウム塩基置換用ベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ２を示す図である。
【図４】図４はコリネバクテリウム塩基置換用ベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ３を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一つの態様として、本発明は、配列番号２、３、および４よりなる群から選ばれたいずれか一つの塩基配列を持つ、改良されたプロモーター活性を有する核酸分子に関する。
【００１２】
好ましい一実施態様として、前記の塩基配列は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結することができ、コリネバクテリウム属由来であり得る。
【００１３】
本発明において、用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するようにするＤＮＡ領域、すなわち、通常コード領域の上流に見出される非翻訳核酸配列をいい、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位を含み、かつｍＲＮＡ転写開始部位の５’上流側に位置し、プロモーター下流にある遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有する。
【００１４】
本発明のプロモーター活性を有するコリネバクテリウム・グルタミクム核酸分子は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結される。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ａｓｐＢ遺伝子であって、コリネバクテリウム属細菌でリシンを生産する生合成経路上の主要な遺伝子である。
【００１５】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、グルタミン酸塩のアミノ基をオキサロ酢酸へ転移する反応を触媒することにより、リシン生合成の前駆体であるアスパラギン酸塩を供給する重要な役割をする。したがって、前記アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性が増加すると、リシン生合成の前駆体であるアスパラギン酸塩が増加し、結局、リシンの生合成が増加することとなる。
【００１６】
また、前記用語「作動可能に連結」とは、本発明のプロモーター活性を有する核酸配列がアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の転写を開始および媒介するように、前記遺伝子配列とプロモーター配列とが機能的に連結されていることを意味する。これは本発明のプロモーター活性を有する核酸配列がａｓｐＢ遺伝子と作動可能に連結されることにより、前記オペロン遺伝子の転写活性を調節することができることを意味する。
【００１７】
現在まで、ａｓｐＢ遺伝子のプロモーター上で遺伝子の転写を開始する転写開始点(transcriptional start site)は、知られていなかった。
本発明者らは、具体的な一実施例において、ａｓｐＢ遺伝子の転写開始点同定のために５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ５’ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）技法(Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．８．５４)を行った。５’−ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡの一部が既知の場合に、それを用いて５’上流の未知領域をクローニングするための方法であり、Ｔａｋａｒａ社の５’−Ｆｕｌｌ Ｒａｃｅ ｃｏｒｅ ｓｅｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６１２２）を用いて実験を行った。実験の結果、ａｓｐＢ遺伝子の転写開始点は、ＡＴＧ開始コドンの上流７２ｂｐに位置するＧであると同定された。
前記で同定された転写開始点を＋１位置にして、改良のためのプロモーターコンセンサス配列部位を選定した。
【００１８】
本発明のプロモーター活性を有する核酸配列は、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいてａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを改良したもので、野生型プロモーターより高いプロモーター活性を持つようにしたことを特徴とする。さらに高いプロモーター活性を持つように改良する方法としては、当業界における公知の方法を、制限なく使用することができ、好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムａｓｐＢ遺伝子のプロモーター核酸配列に、欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより、配列上の変異を誘導して改良することができる。
【００１９】
本発明のプロモーター核酸分子は、標準分子生物学技術を用いて単離または製造できる。例えば、適切なプライマー配列を用いてＰＣＲによって単離することができる。また、自動化されたＤＮＡ合成機を用いる標準合成技術を利用して製造することもできる。
【００２０】
具体的な一実施例において、本発明者は、米国国立衛生研究所のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、ａｓｐＢ遺伝子（コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＣ＿００３４５０．３）上の遺伝子座タグ（ｌｏｃａｓ ｔａｇ）ＮＣｇ１０２３７）のプロモーター部位を含む塩基配列を収得し（配列番号１）、この塩基配列に基づいて８つのプライマー（配列番号１０〜１７）を合成した。その後、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーを用いてＰＣＲを行い、主要部位に改変された配列を有するプロモーターを含む本発明に係る核酸分子（配列番号２、３、および４）を収得した。
【００２１】
本発明のコリネバクテリウム・グルタミクムプロモーター活性を有する核酸分子は、好ましくは原核細胞、特に大腸菌またはコリネ型細菌における遺伝子発現のためのプロモーターとして有用である。本発明において、用語「コリネ型細菌」は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、およびマイクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）の微生物を含む概念である。このようなコリネ型細菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、およびこれらから製造されたＬ−アミノ酸生産突然変異体または菌株、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１１００１を含み、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１であるが、これらの例に限定されない。
【００２２】
他の態様として、本発明は、前記改良されたプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターに関する。
本発明の用語「ベクター」は、適切な宿主内で目的の遺伝子を発現させることができるように適切な調節配列に作動可能に連結された遺伝子の塩基配列を含有するＤＮＡ構築物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することが可能なプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写および翻訳の終結を調節する配列を含む。
【００２３】
本発明で使用されるベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界における公知の任意のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ粒子、または簡単には潜在的ゲノム挿入物であり、好ましくはｐＥＣＣＧ１２２ベクター（ノ・ガブスら、Ｋｏｒ．Ｊｏｕｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｊｕｌｙ．１９９１ ｐ．１４９−１５４）を使用することができるが、これに限定されない。ベクターは、適当な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノムとは関係なく複製または機能することができ、ゲノムそのものに組み込まれる場合もある。
【００２４】
具体的には、本発明のベクターは、宿主細胞内に導入されると、ベクター内のプロモーター活性を有する核酸分子配列が宿主細胞ゲノム上の内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）ａｓｐＢ遺伝子のプロモーター部位の配列と相同組換えを起こし、染色体内に挿入され得る。したがって、本発明のベクターとしては、宿主染色体への挿入有無を確認するための選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含みうる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち、目的遺伝子の挿入有無を確認するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型を付与するマーカーが使用できる。選択剤を含む環境では、選択マーカーを発現する細胞のみが生存し、あるいは他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。本発明のベクターは、好ましくはｌａｃＺ遺伝子を含み得る。
【００２５】
本発明の具体的な一実施例において、本発明者は、相同組換えによってコリネバクテリウム・グルタミクムのａｓｐＢ遺伝子のプロモーター部位を、プロモーター活性が増進するように変異したプロモーター配列に置換させることが可能なベクターを製造した。まず、大腸菌クローニング用ベクターｐＡＣＹＣ１７７を制限酵素処理して平滑末端化した後、ｌａｃＺ遺伝子を挿入させるために、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０ゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いて自体のプロモーターを含むようにｌａｃＺ遺伝子を増幅した後、多数の制限酵素認識部位を含むアダプター配列を挿入することにより、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを製造した(図１)。その後、上述したように高いプロモーター活性を持つように製造された、ａｓｐＢ遺伝子のプロモーター配列内に変異を有するプロモーターを含む核酸分子を、前記ｐＤＺベクターのアダプター部位に挿入することにより、配列番号２の核酸配列を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ１(図２)、配列番号３の核酸配列を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ２(図３)、および配列番号４の核酸配列を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ３(図４)を、それぞれ製造した。
【００２６】
別の態様として、本発明は、前記ベクターで形質転換された形質転換体に関する。
本発明の用語「形質転換」は、ＤＮＡを宿主に導入し、該ＤＮＡが染色体外因子として、または染色体に組み込まれることによって複製可能になることを意味する。好ましい一実施態様として、ベクターで宿主細胞を形質転換した後、ベクター内のプロモーター活性を有する核酸分子配列は、宿主細胞ゲノム上の内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）ａｓｐＢ遺伝子のプロモーター部位の配列と相同組換えを起こして染色体内に挿入されてもよいし、プラスミド形態で保持されてもよい。
【００２７】
本発明のベクターによる細胞の形質転換は、核酸を細胞内に導入するいずれの方法でも行うことができる。宿主細胞に応じて、当分野における公知の適切な標準技術が選択され、例えば、エレクトロポーレション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、および酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などがある。
【００２８】
前記宿主細胞としては、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主を使用することが望ましいが、原核および真核を含む全ての微生物が使用可能であり、好ましくは大腸菌またはコリネ型細菌、さらに好ましくはコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属、より一層好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１を使用することができる。
【００２９】
本発明のベクターで形質転換された形質転換体では、相同組換えによってコリネバクテリウム・グルタミクムのａｓｐＢ遺伝子のプロモーター部位を、プロモーター活性が増進するように変異したプロモーター配列に置換することにより、ａｓｐＢ遺伝子は改良されたプロモーターを有する。これにより該形質転換体は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性が野生型よりも高いという特徴を持つ。
【００３０】
本発明の具体的な一実施例では、本発明に係る、配列番号２で構成されるプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ１(図２)、配列番号３で構成されるプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ２(図３)、および配列番号４で構成されるプロモーター活性を有する核酸分子を含むベクターｐＤＺ-ａｓｐＢＰ３(図４)のそれぞれで、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１を形質転換させることにより、ａｓｐＢ遺伝子のプロモーター活性が増進した各形質転換体を製造した。
【００３１】
本発明ではｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１で形質転換させて得た形質転換体を、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１と、ｐＤＺ-ａｓｐＢＰ２で形質転換させて得た形質転換体をＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２と、ｐＤＺ-ａｓｐＢＰ３で形質転換させて得た形質転換体をＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３とそれぞれ命名した。それぞれの形質転換体のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性を母菌株であるＫＦＣＣ１０８８１と比較したところ、それぞれの形質転換体は母菌株よりそれぞれ２．１倍、２．６倍および１．８倍活性が高いことが確認され(表３)、これによって本発明の改良されたプロモーターがアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの活性を増加させることを確認した。また、前記形質転換体は、活性改善効果を有することが示されたので、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３をそれぞれＣＡ０１−７７３、ＣＡ０１−７７４、およびＣＡ０１-７７５と命名し、２０１０年２月５日付で韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇｉａｎｉｓｍｓ、以下、「ＫＣＣＭ」と略する)に受託番号ＫＣＣＭ１１０６１Ｐ、ＫＣＣＭ１１０６２Ｐ、およびＫＣＣＭ１１０６３Ｐで寄託した。
【００３２】
別の態様として、本発明は、前記形質転換体を培養する工程を含む、リシンの生産方法に関する。
本発明において、形質転換体の培養は公知の方法によって行われ得る。培養温度、培養時間および培地のｐＨなどの条件は適切に調節できる。これらの公知の培養方法は、文献［Ｃｈｍｉｅｌ；Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １．Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１）、およびＳｔｏｒｈａｓ；Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ／ Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４）］に詳細に記述されている。また、培養方法には回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、および流加式培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）が含まれる。好ましくはバッチ工程、または注入バッチまたは反復注入バッチ工程で連続的に培養することができるが、これらに限定されない。
【００３３】
使用される培養培地は、特定の菌株の要求条件を適切に充足させなければならない。多様な微生物に対する培養培地は公知である（例えば、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」ｆｒｏｍ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）。培地内の炭素供給源としては、糖および炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラッセ、澱粉およびセルロース）、油脂および脂肪（例：大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナツ油）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸）、アルコール（例：グリセロールおよびエタノール）、および有機酸（例：酢酸）などを用いることができる。これらの物質は個別的にまたは混合物として使用できる。窒素供給源は、窒素含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉および尿素）、または無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）を用いることができ、これらの物質も個別的にまたは混合物として使用することができる。リン供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩を用いることができる。
【００３４】
また、培養培地は、成長に必須の金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）を含有することができ、最終的に、アミノ酸およびビタミンなどの必須成長促進物質を前述した物質の他に使用することができる。適切な前駆体を前記培養培地にさらに加えることができる。前記供給物質は、培養培地に一度に全部加えるか、あるいは培養中に適切に供給することができる。
【００３５】
培養培地のｐＨは、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を適切に用いて調節することができる。発泡は、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの起泡剤を用いて調節することができる。酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養培地中に導入して好気性条件を維持することができる。培養温度は通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養は所望のＬ−アミノ酸の生成量が最大に得られるまで続けられ、このような目的によって通常１０〜１６０時間で達成される。Ｌ−リシンは培養培地中に排出されるか、あるいは細胞中に含まれていてもよい。
【００３６】
一方、本発明の形質転換体を培養する工程を含むリシンの生産方法は、前記培養工程で生成されるリシンを回収する工程をさらに含みうる。当業界における公知の方法によって、細胞または培養培地からＬ−リシンを分離することができる。本発明において有用なＬ−リシン回収方法の例として、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化およびＨＰＬＣなどの方法が挙げられるが、これらの例に限定されない。
以下、下記実施例によって本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は本発明を例示的に実施するためのもので、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００３７】
本実施例では、改良されたプロモーター製作のために、ａｓｐＢ遺伝子の転写開始点を明らかにし、リシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクムのａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを、相同組換えによって改良されたプロモーターで置換するための組換えベクターを製作し、前記ベクターでコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１菌株を形質転換させて、染色体上のプロモーターが改良された菌株を得ることにより、リシン生産効率の向上した菌株を製造した。
【００３８】
本発明で利用するコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクム野生株（ＡＴＣＣ１３０３２）を母菌株として人工変異法によって製作されたＳ−（２−アミノエチル）システイン（以下、「ＡＥＣ」という）に対する耐性およびホモセリン漏出（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｌｅａｋｙ）の特徴を持つ菌株である（韓国登録特許第０１５９８１２号、同第０３９７３２２号参照）。
【００３９】
実施例１：ａｓｐＢ遺伝子転写開始点の同定
本実施例では、現在まで、知られていなかったａｓｐＢ遺伝子の転写開始点（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ）を同定した。
ａｓｐＢ遺伝子の転写開始点の同定のために、５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ５’ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ．Ｗ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ． ８．５４）を用いた。
５’−ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡの一部が既知の場合に、それを用いて５’上流の未知領域をクローニングするための方法であり、本実施例ではＴａｋａｒａ社の５’−Ｆｕｌｌ Ｒａｃｅ ｃｏｒｅ ｓｅｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６１２２）を用いて実験を行った。
５’−ＲＡＣＥ実験のために、米国国立衛生研究所のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されたａｓｐＢ遺伝子（コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＣ＿００３４５０．３）上の遺伝子座タグ（ｌｏｃａｓ ｔａｇ）ＮＣｇ１０２３７）の塩基配列に基づいて５つのプライマー（表１、配列番号５〜９）を合成した。
【００４０】
【表１】
【００４１】
まず、ＡＴＣＣ１３０３２菌株のｍＲＮＡを抽出し、ａｓｐＢ遺伝子のｍＲＮＡに特異的な５’末端リン酸化ＲＴ−プライマー（配列番号５）を用いて逆転写反応で一本鎖（１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡを合成した。その後、ＲＮａｓｅＨで処理してハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡのＲＮＡを分解した後、ＲＮＡリガーゼにより一本のｃＤＮＡを環状に（あるいはコンカテマー化）した。
前記において、ライゲーション反応が終わった試料を鋳型とし、配列番号６と７をプライマーとして用いてＰＣＲ増幅をし、１次ＰＣＲ産物を得た。前記で得られた１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号８と９をプライマーとして用いてＰＣＲを再び行い、２次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲは、変性９５℃、３０秒、アニーリング５５℃、３０秒、および重合反応７２℃、１分の条件を３０サイクル繰り返し行った。最終的に得られたＰＣＲ産物は、遺伝子精製を行った後、シークエンシングによる塩基配列の分析を行った。
塩基配列の分析の結果、ａｓｐＢ遺伝子の転写開始点は、ＡＴＧ開始コドンの上流７２ｂｐに位置するＧであると同定された。前記において、同定された転写開始点を＋１位置にし、改良のためのプロモーターコンセンサス配列部位を選定した。
【００４２】
実施例２：プロモーター改良用組換えベクターの製作
（１）染色体挿入用ベクター(ｐＤＺ)の製作
本実施例では、大腸菌クローニング用ベクターｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｔｉｏｎ ＃Ｘ０６４０２）を基本ベクターとして用いて、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを製作した。
ｐＡＣＹＣ１７７ベクターをＡｃｕＩおよびＢａｎＩ制限酵素で処理した後、クレノウ酵素処理によって平滑末端化した。選択マーカーとして使用される大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子は、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって自体のプロモーターを含むように増幅した後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびポリヌクレオチドキナーゼ処理によって５’−末端リン酸化および平滑化することにより準備した。このように準備した２種のＤＮＡ断片を接合し、接合された環状ＤＮＡ分子の制限酵素ＢａｍＨＩ部位に、人為的に合成した多数の制限酵素認識部位を含んでいるアダプター配列を挿入することにより、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを完成した。図１はコリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺを示す図である。
【００４３】
（２）ａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを改良するための組換えベクター製作
本実施例では、リシンを生産する菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを改良するための組換えベクターを製作した。
まず、米国国立衛生研究所のジーンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、ａｓｐＢ遺伝子(コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノム（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＣ＿００３４５０．３）上の遺伝子座タグ（ｌｏｃａｓ ｔａｇ）ＮＣｇ１０２３７)のプロモーター部位を含む塩基配列（配列番号１）を収得し、改変されたプロモーター配列を含むＤＮＡの断片（配列番号２、３、および４）を収得した。改変プロモーター配列は一般に微生物において知られているプロモーターコンセンサス配列に基づいて考案した。
また、前記変形されたプロモーター配列を製造するためのプライマーとしては、前記塩基配列に基づいて８つのプライマー（表２、配列番号１０〜１７）を合成した。
【００４４】
【表２】
【００４５】
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のａｓｐＢ遺伝子のプロモーター配列を得るために、コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表２に表記されたオリゴヌクレオチド対をプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素はＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲは、変性９５℃、３０秒、アニーリング５５℃、３０秒、および重合反応７２℃、１分の条件を３０サイクル繰り返し行った。その結果、置換部位を一方の側の末端に含んでいる３００ｂｐ ＤＮＡ断片を得た。ａｓｐＢＰ１−１は配列番号１０と１２をプライマーとして用いて増幅されたものであり、ａｓｐＢＰ１−２は配列番号１１と１３をプライマーとして用いて増幅されたものである。前記増幅産物を、予めＸｂａＩ制限酵素で切断して準備したｐＤＺベクターと混合し、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてクローニングすることにより、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１ベクターを得た。
ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ２およびｐＤＺ−ａｓｐＢＰ３の場合にも、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１の場合と同様の方法によって製作した。但し、挿入断片のＰＣＲ増幅の際に、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ２の場合には、配列番号１０と１４をプライマーとして用いて得られたａｓｐＢＰ２−１断片、および配列番号１１と１５を用いて得られたａｓｐＢＰ２−２断片とを用いて製作し、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ３の場合には、配列番号１０と１６をプライマーとして用いて得られたａｓｐＢＰ３−１断片と、配列番号１１と１７を用いて得られたａｓｐＢＰ３−２断片とを用いて製作した。
図２、３、および４は、それぞれ配列番号２、３、および４に該当するａｓｐＢＰ１、ａｓｐＢＰ２、ａｓｐＢＰ３を含んでいるコリネバクテリウム染色体置換用ベクターｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ２およびｐＤＺ−ａｓｐＢＰ３を示す図である。
【００４６】
実施例３：組換えベクターのコリネバクテリウム・グルタミクム菌株内への挿入
本実施例では、コリネバクテリウムの染色体上のａｓｐＢ遺伝子のプロモーターを改良するために、前記で製作した組換えベクターでリシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１を形質転換させて、菌株染色体のプロモーター配列と前記ベクター上のプロモーター配列とを相同組換えによって置換させることにより、染色体内に前記改良プロモーター配列を挿入した。
前記実施例２において製造した改良プロモーター配列を有するＤＮＡ断片を含む前記の組換えベクターであるコリネバクテリウム染色体置換用ベクターｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ２およびｐＤＺ−ａｓｐＢＰ３を、それぞれコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１に電気パルス法により導入し、形質転換した後（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）５２：５４１−５４５による形質転換法を用いる）、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地で、染色体上の同遺伝子との相同性により挿入された菌株を選択した。
ベクターが首尾よく染色体に挿入されたことは、Ｘ−ｇａｌ（５−プロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む固体培地で青色を示すか否かを確認することにより、検出可能であった。１次染色体挿入された菌株を栄養培地で振とう培養（３０℃、８時間）した後、それぞれ１０−４から１０−１０まで希釈し、Ｘ−ｇａｌを含んでいる固体培地に塗抹した。大部分のコロニーが青色を示すが、これに反して低い比率で現れる白色のコロニーを選択することにより、二重交差（Ｄｏｕｂｌｅ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）によってａｓｐＢ遺伝子のプロモーター内で塩基配列が置換された菌株を選択した。このように選択された菌株は、ＰＣＲを用いた塩基置換の有無の確認および当該領域における塩基配列確認過程を経て最終選定した。
プロモーターの塩基置換の有無は、ａｓｐＢＰ１の場合、配列番号１１と１９、ａｓｐＢＰ２の場合、配列番号１１と１８、ａｓｐＢＰ３の場合、配列番号１１と１８をプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより分析し、目的の部位に対する塩基配列分析によって最終確認した。
最終的に、二重の交差過程を経て、染色体上のａｓｐＢ遺伝子のプロモーターに塩基置換を含む、リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３をそれぞれ得て、これらをそれぞれＣＡ０１−７７３、ＣＡ０１−７７４およびＣＡ０１−７７５と命名し、２０１０年２月５日付で韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１０６１Ｐ、ＫＣＣＭ１１０６２ＰおよびＫＣＣＭ１１０６３Ｐで寄託した。
【００４７】
実施例４：ａｓｐＢプロモーター改良菌株におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性の測定
母菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１菌株および実施例３で最終的に製作されたＬ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３菌株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を測定するために、下記のような方法で培養し、培養液からタンパク質を分離して、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を測定した。
対数期まで培養した培養液をＯＤ６００値が０．３となるように２５ｍＬの下記種培地に接種した後、ＯＤ６００値が約１５に達するまで培養した。
＊種培地（ｐＨ７．０）
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１Ｌ基準）
培養液から遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１０分）によって菌体を回収し、０．１％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄した後、同緩衝溶液で６００ｎｍの濁度が１６０程度となるように懸濁した。懸濁液１．５ｍＬ当り１．２５ｇのガラスビーズ（ｇｌａｓｓ ｂｅａｄ）を添加した後、ビーズビーター（ｂｅａｄ ｂｅａｔｅｒ）を用いて６分間菌体を破砕した。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、３０分）によって上澄み液を回収し、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ．Ｍ １９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）によりタンパク質の濃度を定量した後、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性の測定のための粗タンパク質溶液として使用した。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を測定するために、０．２４Ｍ アスパラギン酸塩、０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、０．６４ｍＭ ＮＡＤＨ、０．１１ｍＭ ピリドキサルリン酸塩（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、０．９３ｋＵ／ｌ ＭＤＨ、０．４２ｋＵ／ｌ ＬＤＨを含む反応液に０．１ｍＬの粗タンパク質溶液を混合し、３０℃で１０分間定置した後、１２ｍＭの２−オキソグルタル酸塩（ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）を添加することにより反応を開始した。３４０ｎｍ波長で５分間吸光度の減少を測定してアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性を計算した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素活性単位（Ｕ）は、１分間に１ｍｇのタンパク質によって減少したＮＡＤＨのｎｍｏｌｅとして定義した。
コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２、およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３の各菌株が示すアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を、母菌株ＫＦＣＣ１０８８１と比較してみた結果、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１菌株の場合、２．１倍、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２菌株の場合、２．６倍、そしてＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３菌株の場合、１．８倍高いアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を示すことが確認された（表３）。
【００４８】
【表３】
【００４９】
実施例５：ａｓｐＢプロモーター改良菌株におけるリシン生産
母菌株として用いたコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１菌株、および実施例３で最終的に製作されたＬ−リシン生産菌株としてのコリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２、およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３菌株を、Ｌ−リシン生産のために下記の方法で培養した。
下記の種培地２５ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミクム母菌株ＫＦＣＣ１０８８１と、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２、およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３とを接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振とう培養した。下記の生産培地２４ｍＬを含有する２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに１ｍＬの種培養液を接種し、３０℃で１２０時間２００ｒｐｍで振とう培養した。
＊種培地（ｐＨ７．０）
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１Ｌ基準）
＊生産培地（ｐＨ７．０）
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸溜水１Ｌ基準）
培養終了の後、ＨＰＬＣを用いた方法によってＬ−リシンの生産量を測定した。 コリネバクテリウム・グルタミクムＫＦＣＣ１０８８１と、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１、ＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２、およびＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３とにおける培養液中のＬ−リシン濃度は、下記表４のとおりである。
【００５０】
【表４】
【００５１】
表４に示したように、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性が２．６倍に強化されたＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ２菌株は、母菌株ＫＦＣＣ１０８８１に比べてリシン生産効率が５％以上高いことを確認することができた。また、活性が２．１倍に強化されたＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ１菌株は、リシン生産効率が３％以上、活性が１．８倍に強化されたＫＦＣＣ１０８８１−ａｓｐＢＰ３菌株は、リシン生産効率が３％以上母菌株より高いことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の改良されたプロモーター活性を有するコリネバクテリウム・グルタミクム由来の核酸分子は、野生型に比べて高いプロモーター活性を示し、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を増加させることによって、リシンの生合成効率を増加させることができる。これにより、産業的に有用なＬ−アミノ酸の一種である、Ｌ−リシンを高収率で生産することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、３、および４からなる群より選ばれるいずれか一つの塩基配列を含む、プロモーター活性を有する核酸分子。
【請求項２】
前記塩基配列は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結されている、請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の改良されたプロモーター活性を有する核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４】
前記ベクターが、図２、３、および４に示されるｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ２、およびｐＤＺ−ａｓｐＢＰ３からなる群より選ばれるいずれか一つの開裂地図で表される構造を有する、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３のベクターで形質転換された、形質転換体。
【請求項６】
前記形質転換体が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
前記形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタクムＣＡ０１−７７３（受託番号ＫＣＣＭ１１０６１Ｐ）である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項８】
前記形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタクムＣＡ０１−７７４（受託番号ＫＣＣＭ１１０６２Ｐ）である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項９】
前記形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタクムＣＡ０１−７７５（受託番号ＫＣＣＭ１１０６３Ｐ）である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のプロモーター活性を有する核酸分子が、染色体内に相同組換えで挿入されることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のプロモーター活性を有する核酸分子が、プラスミド形態で保持されていることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項５乃至１１のいずれか一項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、リシンの生産方法。
【請求項１３】
前記培養する工程で生成されるリシンを回収する工程をさらに含む、請求項１２に記載のリシンの生産方法。
【請求項１】
配列番号２、３、および４からなる群より選ばれるいずれか一つの塩基配列を含む、プロモーター活性を有する核酸分子。
【請求項２】
前記塩基配列は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子と作動可能に連結されている、請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の改良されたプロモーター活性を有する核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４】
前記ベクターが、図２、３、および４に示されるｐＤＺ−ａｓｐＢＰ１、ｐＤＺ−ａｓｐＢＰ２、およびｐＤＺ−ａｓｐＢＰ３からなる群より選ばれるいずれか一つの開裂地図で表される構造を有する、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３のベクターで形質転換された、形質転換体。
【請求項６】
前記形質転換体が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
前記形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタクムＣＡ０１−７７３（受託番号ＫＣＣＭ１１０６１Ｐ）である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項８】
前記形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタクムＣＡ０１−７７４（受託番号ＫＣＣＭ１１０６２Ｐ）である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項９】
前記形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタクムＣＡ０１−７７５（受託番号ＫＣＣＭ１１０６３Ｐ）である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のプロモーター活性を有する核酸分子が、染色体内に相同組換えで挿入されることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のプロモーター活性を有する核酸分子が、プラスミド形態で保持されていることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項５乃至１１のいずれか一項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、リシンの生産方法。
【請求項１３】
前記培養する工程で生成されるリシンを回収する工程をさらに含む、請求項１２に記載のリシンの生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１８２７７９（Ｐ２０１１−１８２７７９Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４４７６（Ｐ２０１１−１４４７６）
【出願日】平成２３年１月２６日（２０１１．１．２６）
【出願人】（５１１０２３５９８）シージェイ チェイルジェダン コーポレイション (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２６日（２０１１．１．２６）
【出願人】（５１１０２３５９８）シージェイ チェイルジェダン コーポレイション (6)
【Ｆターム（参考）】
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