改良ＲＮＡディスプレイ法
本発明は、発現ライブラリーからｓｃＦｖ抗体分子の確実な発現および選別を可能にするインビトロＲＮＡディスプレイの改良法を特徴とする。改良法は、ｓｃＦｖ鎖内ジスルフィド結合、従ってｓｃＦｖ抗体分子の正確なフォールディングに有利に働く弱還元条件の使用を部分的に含む。本発明の方法は、ｓｃＦｖ抗体分子の発現および選別に特に適しているが、あらゆるクラスのタンパク質のインビトロＲＮＡディスプレイにも都合が良い。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、これによりその内容が参照によって本明細書に組み込まれている、２００８年９月３０日に出願された米国仮出願第６１／１０１４７１号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、ＲＮＡディスプレイに関し、特に可溶性および細胞表面抗原の選別を可能にするＲＮＡディスプレイ法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ほぼどのような構造的エピトープでもそれと高い特異性および親和性で結合し、リサーチツールとして、またＦＤＡに認可された治療薬として日常的に使用される抗体を選別することができる。その結果、治療用および診断用モノクローナル抗体は、世界中で数十億ドル規模のマーケットを構成している。
【０００４】
動物を免疫して抗体を得る古典的手法は、時間がかかり煩雑である。その結果、合成抗体ライブラリーを用いた、所望の標的分子に対する抗体をエキソビボ選別するための方法が開発された。一部の方法において、抗体またはその断片のライブラリーは生物（例えば、バクテリオファージ、ウイルス、酵母細胞、細菌細胞または哺乳類細胞）表面に提示され、生物は所望の抗体の発現を有するものが選別される。他の方法において、抗体ライブラリーは無細胞インビトロシステムにおいて発現、選別される。ＲＮＡディスプレイと呼ばれるこのようなシステムの一型において、発現されたタンパク質またはペプチドは、共有結合または緊密な非共有結合的相互作用によってそのコード化ｍＲＮＡと結合してＲＮＡ／タンパク質融合分子を形成する。ＲＮＡ／タンパク質融合体のタンパク質またはペプチド成分は、所望の標的との結合および結合しているコード化ｍＲＮＡ成分の配列決定によって決定されたタンパク質またはペプチドの同一性について選別され得る。
【０００５】
現在のインビトロＲＮＡディスプレイシステムは、単一の抗体可変領域の発現に優れているが、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）分子等、多ドメイン抗体の発現には非効率的である。これは主に現在のインビトロ発現システムの反応条件と、ＰＣＲによる増幅の繰り返しによってライブラリーからｓｃＦｖのｃＤＮＡ全長が失われ易いことに起因する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本技術分野における、所望の標的に対するｓｃＦｖ抗体選別のための改良インビトロディスプレイ法の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、発現ライブラリーからｓｃＦｖ分子の確実な発現および選別を可能にする、インビトロＲＮＡディスプレイの改良法を提供することによって上述の課題を解決する。本発明の方法は、ｓｃＦｖ分子の発現および選別に特に適しているが、可溶性および細胞表面抗原の両方を含むあらゆるクラスのタンパク質のインビトロディスプレイにも都合が良い。
【０００８】
従って、本発明は、前に記載された方法よりも簡便で実施にかかる時間が短い改良インビトロＲＮＡディスプレイ法の提供を含むが、それに限定されない、いくつかの利点を有する。さらに、本発明の方法は、鎖内ジスルフィド結合を含有するタンパク質、例えばｓｃＦｖ抗体分子の増強された機能的発現を可能にする。
【０００９】
本発明は、その一態様において、（ａ）ピューロマイシンまたはそのアナログを３’末端に、ソラレンＣ６を５’末端に有する一本鎖核酸リンカーと架橋し、５’ｓｃＦｖおよび３’スペーサー配列をコードするｍＲＮＡを含む、ピューロマイシンまたはそのアナログと架橋したｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子を提供するステップ、（ｂ）標識の存在下、ＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）／ＧＳＨ（還元型グルタチオン）およびＰＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）の存在下ならびにジチオスレイトールの不在下、標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子が形成されるような条件下でピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡをインビトロ翻訳するステップ、（ｃ）標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を精製するステップ、（ｄ）精製された標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を少なくとも１種類の抗原を用いた抗原選別に付すステップおよび（ｅ）精製された標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を、親和性に基づいた磁気ビーズを用いて回収するステップを含む、ｓｃＦｖ抗体ＲＮＡディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。
【００１０】
一実施形態において、本方法は、（ｇ）抗原選別の後、ｓｃＦｖ ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製するステップをさらに含む。別の一実施形態において、本方法は、（ｈ）ｃＤＮＡを増幅するステップをさらに含む。
【００１１】
一実施形態において、標識は、例えば３５Ｓメチオニンまたはシステイン等、放射性標識である。
【００１２】
一実施形態において、３’スペーサー配列は、約０−約２００アミノ酸、例えば約１６アミノ酸を含む、および／または３’スペーサーはアフィニティータグを含む。
【００１３】
一実施形態において、リンカーは、５’から３’へと、ソラレンＣ６、配列ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ（配列番号２０）を含む２’ＯＭｅリボヌクレオチド、６個のトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０部分、２個のシチジン残基、およびピューロマイシンを含む。
【００１４】
一実施形態において、ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子は、ＵＶＡによってＤＮＡリンカーと光架橋される。別の一実施形態において、ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子は、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択された５’プロモーターを含む。特別な一実施形態において、ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子は、タバコモザイクウイルス５’非翻訳領域を含む。
【００１５】
一実施形態において、標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子は、オリゴｄＴクロマトグラフィーによって精製される。別の一実施形態において、標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体アガロースビーズを用いて精製される。さらに別の一実施形態において、標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子は、オリゴｄＴクロマトグラフィーおよび抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体アガロースビーズによって精製される。
【００１６】
一実施形態において、抗原は、ビオチン化ペプチド、タンパク質またはハプテンである。別の一実施形態において、抗原は、ヒト免疫グロブリン結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）またはマウス免疫グロブリン結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）との融合タンパク質、さもなければ抗原は細胞集団である。特定の一実施形態において、本発明に係る抗体は、抗ＩＬ−１２抗体、抗赤血球凝集素（抗ＨＡ）抗体、マウス抗体またはヒト抗体である。
【００１７】
一実施形態において、ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳は、ＧＳＳＨ／ＧＳＨの存在下で行われる。
【００１８】
一実施形態において、本方法は、ｍＲＮＡキャッピングステップを含まない。別の一実施形態において、本方法は、精製ステップの前にインビトロ逆転写ステップを含まない。さらに別の一実施形態において、ステップ（ａ）から（ｇ）の内いずれかの前、間または後にＲＮａｓｅインヒビターが添加される。一実施形態において、精製ステップは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）不在下におけるｃＤＮＡ作製のためのｍＲＮＡ逆転写を含む。
【００１９】
特定の実施形態において、ｃＤＮＡは、約ｐＨ＝８．０−約ｐＨ＝１０．０のアルカリ加水分解によって溶出される。あるいは、ｃＤＮＡは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを変性するのに十分な熱によって、約ｐＨ＝３．０−約ｐＨ＝６．０の酸によって、またはＲＮａｓｅＨ消化によって溶出される。
【００２０】
一実施形態において、ｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。一実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、またはＰｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉおよびＫＯＤからなる群から選択されたＤＮＡポリメラーゼを用いる。
【００２１】
別の一実施形態において、ビーズはストレプトアビジン−Ｍ２８０、ニュートラアビジン−Ｍ２８０、ＳＡ−Ｍ２７０、ＮＡ−Ｍ２７０、ＳＡ−ＭｙＯｎｅ、ＮＡ−ＭｙＯｎｅ、ＳＡ−アガロースおよびＮＡ−アガロースからなる群から選択される。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な説明と特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一部の実施形態におけるｍＲＮＡ−ｓｃＦｖディスプレイ技術の概略図を示す図である。
【図２】本発明の他の実施形態におけるｍＲＮＡ−ｓｃＦｖディスプレイ技術の概略図を示す図である。
【図３】ライブラリーＤＮＡコンストラクトの概要描写を示す図である。
【図４ａ】機能的ｓｃＦｖがｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子として生じ得ることを表す結果を示す図である。
【図４ｂ】遊離ｓｃＦｖ分子とｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子のモデルを示す図である。
【図５】ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子フォーマットにおいて結合しているｓｃＦｖが遊離ｓｃＦｖ分子と機能的に同等であることを表す結果を示す図である。
【図６】異なる３’スペーサー長を備える３種類のＤ２Ｅ７ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖコンストラクトを示す図である。
【図７】より短いスペーサー長が、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖの抗原への結合およびｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ抗体分子の収量を改善したことを表す結果を示す図である。
【図８】Ｄ２Ｅ７の短い、中程度および長いＣｋ３’スペーサー長の配列（記載順にそれぞれ配列番号４２−４４）を表す図である。
【図９ａ】短いおよび長いスペーサー長を備える１７／９ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖコンストラクトを示す図である。
【図９ｂ】より短いスペーサー長が１７／９ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の標的抗原への結合およびｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ抗体分子の収量を改善したことを表す結果を示す図である。
【図１０】ＰＤＩ活性がｓｃＦｖ機能の一部に必要であったことを表す結果を示す図である。
【図１１】逆転写におけるＤＴＴの存在が１７／９ｓｃＦｖの赤血球凝集素（ＨＡ）抗原への結合を阻害したことを表す結果を示す図である。
【図１２】ＤＴＴが逆転写過程を有意に変化させなかったことを表すアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１３】選別前と後の両方におけるＤＴＴおよびＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）有りまたは無しの異なるＲＴ条件から得られたアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１４】選別前ＲＴおよびｃＤＮＡアルカリ溶出（左レーン）と比較した、選別前または後のいずれかに逆転写した場合のＰｈｙｌｏｓ４０ＶＨ配列の回収を表すアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１５】ＲＮａｓｅインヒビターが、抗原選別後の逆転写によるＲＮＡテンプレート回収を保存したことを表すアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１６】ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）の存在下または不在下におけるＣＬ長およびＣＬ短スペーサーの並列比較の結果を示す図である。
【図１７】ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）の存在下または不在下におけるＣＬ長およびＣＬ短スペーサー回収の並列比較を表すアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１８】１ラウンドのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ選別の前と後における１７／９ｓｃＦｖを定量化するアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１９】Ｄ２Ｅ７と２ＳＤ４との間のキメラの概要描写を示す図である。
【図２０ａ】ｍＲＮＡディスプレイ技術が異なる親和性のバインダーの識別に用いられ得ることを表す、異なるキメラ間の抗原結合後の回収率を示す図である。
【図２０ｂ】ｍＲＮＡディスプレイ技術が異なる親和性のバインダーの識別に用いられ得ることを表す、抗原選別後の正規化回収率を示す図である。
【図２１】ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の耐熱性を示す図である。
【図２２】ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の高温処理後にＲＮＡが回収され得ることを表すアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図２３】短いおよび長いスペーサー長を備えるｍＲＮＡ−ｓｃＦｖＹ６１コンストラクトならびにｍＲＮＡとｓｃＦｖタンパク質の間のＤＮＡリンカーにポリＡテールを備えるＰＦ−ｙ６１ｓｃＧｅｎｅ３コンストラクトを示す図である。
【図２４】本発明の他の実施形態におけるｍＲＮＡ−ｓｃＦｖディスプレイ技術の概略図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な記述）
配列番号
本明細書に参照されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、次の配列番号を付与されている。
配列番号１−ＭＡＫ１９５ｓｃＦｖタンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号２−Ｙ６１ｓｃＦｖ短タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号３−Ｙ６１ｓｃＦｖ長タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号４−Ｙ６１ｓｃＦｖ Ｇｅｎｅ３タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号５−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ短タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号６−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ中タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号７−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ長タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号８−１７／９ｓｃＦｖ短タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号９−１７／９ｓｃＦｖ長タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号１０−ＭＡＫ１９５ｓｃＦｖヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１１−Ｙ６１ｓｃＦｖ短ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１２−Ｙ６１ｓｃＦｖ長ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１３−Ｙ６１ｓｃＦｖ Ｇｅｎｅ３ＰＡヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１４−Ｙ６１ｓｃＦｖ Ｇｅｎｅ３ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１５−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ短ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１６−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ中ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１７−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ長ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１８−１７／９ｓｃＦｖ短ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１９−１７／９ｓｃＦｖ長ヌクレオチド配列の核酸配列。
【００２５】
本発明をより容易に理解できるように、特定の用語を先ず定義する。
【００２６】
Ｉ．定義
用語「抗体」は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体等）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マウス抗体およびそれらの断片、例えば、抗体Ｌ鎖（ＶＬ）、抗体Ｈ鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単領域抗体フラグメント（ｄＡｂ）を含む。
【００２７】
用語「抗体ライブラリー」は、抗体またはその断片をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する複数のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。これはまた、前記ＤＮＡまたはＲＮＡ分子から発現した複数の抗体タンパク質および核酸／抗体融合分子も含む。
【００２８】
用語「Ｈ鎖可変領域」は、抗体Ｈ鎖可変領域をコードする核酸および該核酸のタンパク質産物を意味する。
【００２９】
用語「Ｌ鎖可変領域」は、抗体Ｌ鎖可変領域をコードする核酸および該核酸のタンパク質産物を意味する。
【００３０】
用語「エピトープタグ」は、抗体によって特異的に認識される短いアミノ酸配列であって、分子に化学的または遺伝学的に結合して、前記抗体によるその検出を可能にするアミノ酸配列、例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＭｙｃタグまたはＴ７タグを意味する。
【００３１】
用語「非抗体配列」は、本発明の抗体ライブラリーに出現する、本来の抗体配列の一部ではない任意の核酸またはアミノ酸配列を意味する。このような配列は、例えばエピトープタグを含む。
【００３２】
用語「調節配列」は、特定の宿主生物またはインビトロ発現システムにおける、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列または遺伝要素を意味する。このような配列は、本技術分野においてよく知られている。原核生物に適した調節配列は、例えばプロモーター、場合によってオペレーター配列、そしてリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。例えば、核酸は、別の核酸配列と機能的な関係になるよう配置されている場合「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に作用する場合コード配列に作動可能に連結されており、またリボソーム結合部位は、転写を促進できるよう配置されている場合コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」は、連結されたＤＮＡ配列同士が隣接していることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも隣接している必要はない。
【００３３】
用語「特異的結合」または「と特異的に結合する」は、少なくとも１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ以下の親和性で標的と結合する、および／またはその非特異的抗原との親和性より少なくとも２倍強い親和性で標的と結合する、結合分子の能力を意味する。
【００３４】
用語「標的」は、抗体によって認識される抗原またはエピトープを意味する。標的は、任意のペプチド、タンパク質、糖類、核酸またはそれに対して特異抗体を作製できる小分子等、他の分子を含む。一実施形態において、抗体は、ヒトタンパク質、例えばＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ１８、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βに対するものである。
【００３５】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、本技術分野において定義されている。
【００３６】
用語「ＲＮＡディスプレイ」または「ｍＲＮＡディスプレイ」は、発現したタンパク質またはペプチドがそのコード化ｍＲＮＡと共有結合してまたは緊密な非共有結合的相互作用によって、「ＲＮＡ／タンパク質融合」分子を形成するインビトロ技術を意味する。ＲＮＡ／タンパク質融合体におけるタンパク質またはペプチド成分は、所望の標的との結合および結合しているコード化ｍＲＮＡ成分の配列決定によって決定されたタンパク質またはペプチドの同一性について選別され得る。このような方法は、本技術分野においてよく知られており、例えば、その内容全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，１９５，８８０号、６，９５１，７２５号、７，０７８，１９７号、７，０２２，４７９号、６，５１８，０１８号、７，１２５，６６９号、６，８４６，６５５号、６，２８１，３４４号、６，２０７，４４６号、６，２１４，５５３号、６，２５８，５５８号、６，２６１，８０４号、６，４２９，３００号、６，４８９，１１６号、６，４３６，６６５号、６，５３７，７４９号、６，６０２，６８５号、６，６２３，９２６号、６，４１６，９５０号、６，６６０，４７３号、６，３１２，９２７号、５，９２２，５４５号および６，３４８，３１５号に記載されている。
【００３７】
用語「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」は、ＶＬおよびＶＨ領域が組み合わされて一価分子を形成しそれらが単一のタンパク質鎖として生成されることを可能にする合成リンカーによる、組換え法を用いて接続されたＬ鎖可変領域の抗原結合部分とＨ鎖可変領域の抗原結合部分を意味する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ８５：５８７９−５８８３を参照）。
【００３８】
用語「機能性部分」は、それが結合した分子に追加的な機能性を付与する任意の生物学的または化学的物質を意味する。
【００３９】
用語「選別」は、ある分子を集団内の他の分子から実質的に区分化することを意味する。本明細書において、「選別」ステップは、選別ステップの後に集団における望ましくない分子に対する所望の分子の、少なくとも２倍、好ましくは３０倍、さらに好ましくは１００倍、最も好ましくは１０００倍濃縮を提供する。本明細書に示されているように、選別ステップは任意の回数繰り返すことができ、また異なる種類の選別ステップを特定のアプローチと組み合わせることもできる。
【００４０】
用語「休止配列」は、リボソームの翻訳速度を減速または停止させる核酸配列を意味する。
【００４１】
用語「固体支持体」は、アフィニティー複合体が直接的または間接的（例えば、他の抗体やプロテインＡ等、他の結合パートナーの介在によって）のいずれかで結合することのできる、またはアフィニティー複合体を包埋できる（例えば、レセプターまたはチャネルによって）、任意のカラム（またはカラム材料）、ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子（例えば、アガロースまたはセファロース）、マイクロチップ（例えば、シリコン、シリコンガラスまたはゴールドチップ）または膜（例えば、リポソームや小胞の膜）を意味するが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
用語「リンカー領域」は、ｓｃＦｖ抗体遺伝子における抗体ＶＨおよびＶＬ領域をコード化する核酸配列を接続する核酸領域を意味する。リンカー領域は、ＶＨ、ＶＬおよびリンカー領域を含む連続的なオープンリーディングフレームが形成されるように、抗体ＶＨおよびＶＬをコード化する核酸配列とフレーム内に存在する。この用語はまた、ｓｃＦｖタンパク質においてＶＨとＶＬを接続する領域も意味する。
【００４３】
用語「ペプチドアクセプター」は、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ機能の触媒活性によって、成長中のタンパク質鎖のＣ末端に付加され得る任意の分子を意味する。通常、このような分子は、（ｉ）ヌクレオチドまたはヌクレオチド様部分（例えば、ピューロマイシンおよびそのアナログ）、（ｉｉ）アミノ酸またはアミノ酸様部分（例えば、２０種類のＤ−もしくはＬ−アミノ酸の内のいずれかまたはその任意のアミノ酸アナログ（例えば、Ｏ−メチルチロシンまたはＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１、１９９１によって記載されたアナログの内のいずれか））および（ｉｉｉ）両者の間の結合（例えば、３’位置、より好ましくないが２’位置におけるエステル、アミドまたはケトン結合）を含むが、この結合は好ましくは天然のリボヌクレオチド構造由来の環状構造を顕著に乱さない。さらにこの用語は、タンパク質コード配列に（核酸配列に介在することによって直接的または間接的に）共有結合したペプチドアクセプター分子と共に、一部の非共有結合的手段、例えばタンパク質コード配列の３’末端に、またはその近傍に結合する第二の核酸配列を用いたハイブリダイゼーションによってタンパク質コード配列と接続した分子や、それ自身がペプチドアクセプター分子と結合する分子を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
ＩＩ．概観
本発明は、発現ライブラリーからｓｃＦｖ抗体分子の確実な発現および選別を可能にするインビトロＲＮＡディスプレイの改良法を特徴とする。
【００４５】
ＲＮＡディスプレイ法は、発現したタンパク質またはペプチドが共有結合または緊密な非共有結合的相互作用によってそのコード化ｍＲＮＡと結合してＲＮＡ／タンパク質融合分子を形成する、タンパク質またはペプチドライブラリーの発現を一般に含む。ＲＮＡ／タンパク質融合体におけるタンパク質またはペプチド成分は、所望の標的との結合および結合しているコード化ｍＲＮＡ成分の配列決定によって決定されるタンパク質またはペプチドの同一性に対して選別され得る。現在のＲＮＡディスプレイ法は、ｓｃＦｖ鎖内ジスルフィド結合の形成、従ってｓｃＦｖ抗体分子の正確なフォールディングを抑制する還元条件下でそのステップのいくつかが行われるため、ｓｃＦｖ抗体発現に対して最適ではない。現在の方法は、追加的にＶＨまたはＶＬ抗体断片のいずれかを選別プロセスにおいて利用する。
【００４６】
本発明は、ｓｃＦｖ鎖内ジスルフィド結合、従ってｓｃＦｖ抗体分子の正確なフォールディングに有利に働く、弱還元条件下でインビトロＲＮＡディスプレイアッセイを行うことによって、この技術上の課題を解決する。単一の可変領域（例えば、単一のＨ鎖可変（ＶＨ）領域）ではなくむしろｓｃＦｖフォーマットを用いることはまた、選別されたＶＨ領域を完全ＩｇＧ抗体に変換するのに必要な、適合するＬ鎖可変（ＶＬ）領域を同定する必要もなくす。従って、本発明の方法は、ｓｃＦｖ抗体分子の発現および選別に特に適しているが、あらゆるクラスのタンパク質のインビトロＲＮＡディスプレイにも都合が良い。
【００４７】
本発明の方法はまた、ＲＮＡディスプレイ実施のためのより短く、より簡便なプロトコールも提供する。これは、標的で選別する前にＲＮＡ−タンパク質融合体におけるｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する、時間のかかるステップを避けることにより部分的に達成される。
【００４８】
ＩＩＩ．改良インビトロＲＮＡディスプレイスクリーニング法
本発明はその一態様において、改良インビトロＲＮＡディスプレイスクリーニング法を特徴とする。概要方法は、次の通りである。
【００４９】
１）ＲＮＡ／タンパク質融合体の形成
１種類以上のインビトロ抗体ＤＮＡ発現ライブラリーが転写され、ｍＲＮＡを生成する。どのようなインビトロ抗体発現ライブラリー（例えば、ＶＨ、ＶＬまたはｓｃＦｖライブラリー）も適切であるが、本発明の方法はｓｃＦｖライブラリーに特によく適している。技術分野で認識されているどの転写方法も適切である。ＲＮＡ転写後、ＤＮＡライブラリーテンプレートは除去される。この操作は、技術分野で認識されている任意の方法、例えばＤＮａｓｅＩによる消化を用いて行うことができる。
【００５０】
ＤＮＡ除去後、ペプチドアクセプターがライブラリーｍＲＮＡの３’末端に結合される。この操作は、技術分野で認識されている任意の方法を用いて行うことができる。一実施形態において、５’（ソラレンＣ６）２’ＯＭｅ（ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ）ＸＸＸＸＸＸＣＣ（ピューロマイシン）３’（配列番号２０）、（式中、ＸはトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０であり、ＣＣは標準的なＤＮＡ骨格である）を含むリンカーが用いられる。リンカーは先ず、相補的塩基対合によってライブラリーｍＲＮＡの３’末端に結合される。続いてリンカーは、ソラレンＣ６分子のＵＶ活性化によってｍＲＮＡと架橋される。
【００５１】
ペプチドアクセプターの付加後、続いてライブラリーｍＲＮＡはインビトロシステムにおいて翻訳される。技術分野で認識されている任意のインビトロ翻訳方法、例えばウサギ網状赤血球ライセート法が適切である。なお、ｓｃＦｖ分子において適切な鎖内ジスルフィド結合を形成させるため、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）がインビトロ翻訳反応に添加されるおよび／または弱酸化条件下で反応が行われる。一実施形態において、弱い酸化剤（例えば、ＧＳＳＧ／ＧＳＨ、例えば、１００ｍＭ ＧＳＳＧ／１０ｍＭ ＧＳＨ）がインビトロ翻訳反応に添加される。別の一実施形態において、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））がインビトロ翻訳反応から取り除かれる。
【００５２】
１種類以上の標識アミノ酸またはその誘導体が、標識アミノ酸がその結果生じる抗体に取り込まれるようにインビトロ翻訳システムに添加されてよい。技術分野で認識されている任意の標識アミノ酸、例えば放射性標識アミノ酸、例えば３５Ｓ標識メチオニンまたはシステインが企図される。
【００５３】
インビトロ翻訳反応において、ｍＲＮＡ分子は、３’末端に融合したペプチドアクセプター（例えば、ピューロマイシン）を介してそのタンパク質産物と共有結合するようになる。このＲＮＡ／タンパク質融合分子は、インビトロ翻訳反応混合液から精製される。反応混合液からＲＮＡ／タンパク質融合分子を分離する、技術分野で認識されている任意の方法が企図される。一実施形態において、ＲＮＡ／タンパク質融合タンパク質は、ポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）レジンを用いたクロマトグラフィーによって分離される。別の一実施形態において、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質は、ＲＮＡ／タンパク質融合タンパク質の抗体成分に存在するエピトープに特異的な抗体への結合によって分離される。エピトープは、アミノ酸配列タグ、例えばＲＮＡ−抗体融合タンパク質の抗体成分のアミノ酸配列の、例えばＮ末端、Ｃ末端または可変領域間リンカーに取り込まれたＦＬＡＧまたはＨＡタグとなることができる。
【００５４】
本発明のＲＮＡ／タンパク質融合体は、裸のＲＮＡの使用を含む。好ましい一実施形態において、ＲＮＡ／タンパク質融合体と接触するあらゆる試薬は、ＲＮａｓｅインヒビター試薬、例えばＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）、酵母ｔＲＮＡ、ＳＵＰＥＲａｓｅＩｎ（商標）、ＲＮａｓｉｎ（登録商標）その他の本技術分野で公知のＲＮａｓｅインヒビターで処理される。
【００５５】
２）所望の標的に対する抗体のスクリーニング
ＲＮＡ／タンパク質融合体のライブラリーは、所望の標的とのインビトロ結合に対してスクリーニングされる。一般に、標的分子は、固体支持体、例えばアガロースビーズに結合する。一実施形態において、標的分子は固体基質と直接結合する。別の一実施形態において、標的分子は先ず修飾、例えばビオチン化され、続いて修飾標的分子は修飾を介して固体基質、例えばストレプトアビジン−Ｍ２８０、ニュートラアビジン−Ｍ２８０、ＳＡ−Ｍ２７０、ＮＡ−Ｍ２７０、ＳＡ−ＭｙＯｎｅ、ＮＡ−ＭｙＯｎｅ、ＳＡ−アガロースおよびＮＡ−アガロースと結合する。他の実施形態において、固体支持体は、磁気ビーズ、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓをさらに含む。このような磁気ビーズによって、固体支持体とそれに結合した任意のＲＮＡ／抗体融合体をアッセイ混合液から磁石を用いて分離できる。
【００５６】
ＲＮＡ／タンパク質融合体の結合の後、固体支持体は１回以上洗浄されて非結合ＲＮＡ／タンパク質融合体を除去し、次にＲＮＡが増幅される。一実施形態において、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡが増幅されてより多くのｍＲＮＡを産生する。技術分野で認識されている任意のＲＮＡ複製方法、例えばＲＮＡレプリカーゼ酵素を用いた方法が企図される。別の一実施形態において、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡは、ＰＣＲで増幅される前にｃＤＮＡに転写されてもよい。ＰＣＲ増幅プールは１ラウンド以上のスクリーニングに付されて、最も高い親和性の抗体を濃縮してもよい。
【００５７】
さらに、またはあるいは、ＲＮＡ／タンパク質融合体は、核酸成分の増幅前に固体支持体から溶出され得る。技術分野で認識されている任意の溶出方法が企図される。一実施形態において、ＲＮＡ／タンパク質融合体は、アルカリ性条件を用いて、例えば約８．０−１０．０のｐＨを用いて溶出される。別の一実施形態において、ＲＮＡ／タンパク質融合体は、酸性条件を用いて、例えば約３．０−６．０のｐＨを用いて溶出される。一実施形態において、ＲＮＡ／タンパク質融合体は、核酸成分の増幅前に溶出されず、むしろＲＮＡ／タンパク質融合体は増幅反応混合液に直接添加される。
【００５８】
さらに、またはあるいは、核酸のＰＣＲ増幅プールは単分子配列決定法を用いて配列決定され、選別された全ＲＮＡ／タンパク質分子の核酸配列を決定することができる。一実施形態において、ＰＣＲ増幅は、高忠実度プルーフリーディングポリメラーゼ、例えばサーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来のＫＯＤ１耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われてよい。
【００５９】
さらに、またはあるいは、核酸配列は増幅ＤＮＡに突然変異を導入させる条件下で増幅され、これにより選別された核酸配列にさらなる多様性を導入することができる。この突然変異したＤＮＡ分子のプールは、さらなるスクリーニングラウンドに付されてよい。
【００６０】
ＩＶ．ライブラリー構築
本発明のライブラリーは、標的に結合できる任意の抗体断片から作製され得る。一実施形態において、抗体可変領域のライブラリーが作製される。これは、ＶＨおよび／またはＶＬ領域となることができる。別の一実施形態において、ｓｃＦｖライブラリーが作製される。
【００６１】
本発明のライブラリーは、可変部の外側の領域、例えば定常部もしくはその断片またはヒンジ部をコード化する抗体核酸配列を含むこともできる。
【００６２】
本発明の核酸ライブラリーは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両要素を含有するハイブリッドを含むことができる。
【００６３】
核酸のペプチドアクセプターとの連結
抗体核酸ライブラリーは、ペプチドアクセプター部分を含むよう修飾され得る。この操作は、核酸発現ライブラリーの個々のメンバーとその同系タンパク質産物との共有結合を容易にする。例えばその内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，６４３，７６８号、米国特許第５，６５８，７５４号、米国特許第７，１９５，８８０号および米国特許第６，９５１，７２５号に記載されている手段等、技術分野で認識されているペプチドアクセプターを核酸に結合する任意の手段が企図される。
【００６４】
本発明はその一態様において、ペプチドアクセプターを核酸ライブラリーへと結合するための新しい方法および組成物を特徴とする。一実施形態において、ソラレンＣ６分子およびペプチドアクセプター分子が核酸ライブラリーの３’末端配列と相補的な核酸配列と融合した、ソラレンＣ６分子およびペプチドアクセプター分子を含む連結分子が合成され得る。このような連結分子は、相補的塩基対合を介して核酸ライブラリークローンの３’末端と結合することができる。ソラレンＣ６は、紫外線（ＵＶ）光感受性であり、リンカーを核酸ライブラリークローンに架橋し、これによりペプチドアクセプターを核酸ライブラリークローンに共有結合させる。別の一実施形態において、リンカー分子の核酸部分は、修飾されたヌクレオチド、例えば２プライムメトキシ（２’ＯＭｅ）リボヌクレオチドを含むことができる。別の一実施形態において、リンカー分子は、ソラレンＣ６分子とペプチドアクセプター分子を含む核酸領域を隔てるトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０リンカーをさらに含む。一実施形態において、リンカーは、５’から３’へと、ソラレンＣ６、配列ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ（配列番号２０）を含む２’ＯＭｅリボヌクレオチド、６個のトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０部分、２個のシチジン残基、およびピューロマイシンを含むことができる。このようなリンカーは、例えばＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によってオーダーメイド合成され得る。
【００６５】
Ｖ．一般スクリーニング法
本発明はその一態様において、本発明の発現ライブラリーをスクリーニングして所望の抗原と結合できる抗体を同定する方法を特徴とする。抗体の標的分子への結合に基づいて発現ライブラリーから抗体の選別を可能にする任意のインビトロまたはインビボスクリーニング法が企図される。
【００６６】
一実施形態において、本発明の発現ライブラリーは、技術分野で認識されているインビトロ無細胞表現型−遺伝子型連関ディスプレイを用いてスクリーニングされ得る。このような方法は、本技術分野でよく知られており、例えば米国特許第７，１９５，８８０号、６，９５１，７２５号、７，０７８，１９７号、７，０２２，４７９号、６，５１８，０１８号、７，１２５，６６９号、６，８４６，６５５号、６，２８１，３４４号、６，２０７，４４６号、６，２１４，５５３号、６，２５８，５５８号、６，２６１，８０４号，６，４２９，３００号、６，４８９，１１６号、６，４３６，６６５号、６，５３７，７４９号、６，６０２，６８５号、６，６２３，９２６号、６，４１６，９５０号、６，６６０，４７３号、６，３１２，９２７号、５，９２２，５４５号および６，３４８，３１５号に記載されている。これらの方法は、タンパク質がその起源である核酸と物理的に関連または結合するような仕方で、核酸からインビトロでタンパク質を転写することを含む。発現したタンパク質を標的分子で選別することによって、タンパク質をコードする核酸もまた選別される。
【００６７】
ｓｃＦｖタンパク質の発現を改善するため、上述において参照されたインビトロスクリーニングアッセイは特定の試薬の添加または除去を必要とし得る。一実施形態において、機能的ｓｃＦｖ分子の産生を改善するために、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素がインビトロ発現システムに添加されてよい。別の一実施形態において、弱い酸化剤（例えば、ＧＳＳＧ／ＧＳＨ、例えば、１００ｍＭ ＧＳＳＧ／１０ｍＭ ＧＳＨ）がｓｃＦｖタンパク質のインビトロ翻訳反応混合液に添加されて、ｓｃＦｖ分子のＶＨおよびＶＬ領域における鎖内ジスルフィド結合を形成させることができる。別の一実施形態において、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））が、ｓｃＦｖのインビトロ翻訳反応混合物から除去されてよい。
【００６８】
別の一実施形態において、１種類以上の標識アミノ酸またはその誘導体が、標識アミノ酸がその結果生じる抗体に取り込まれるように、インビトロ翻訳システムに添加されてよい。技術分野で認識されている任意の標識アミノ酸、例えば放射性標識アミノ酸、例えば３５Ｓ標識メチオニンまたはシステインが企図される。
【００６９】
一実施形態において、本発明のインビトロスクリーニングアッセイは、単数または複数の抗体のインビトロ選別後に、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡが逆転写されて前記単数または複数の抗体をコードするｃＤＮＡを生成できることを必要とする。任意の適切な逆転写方法、例えば、酵素を介した逆転写、例えばモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素が企図される。
【００７０】
本発明で用いられているスクリーニング法は、所望の標的に特異的に結合する抗体をコードする核酸の増幅を必要とし得る。一実施形態において、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡは、増幅されてさらにｍＲＮＡを生成することができる。技術分野で認識されている任意のＲＮＡ複製方法、例えばＲＮＡレプリカーゼ酵素を用いた方法が企図される。別の一実施形態において、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡは、ＰＣＲで増幅される前に先ずｃＤＮＡに逆転写されてよい。一実施形態において、ＰＣＲ増幅は、高忠実度プルーフリーディングポリメラーゼ、例えばサーモコッカス・コダカラエンシス由来のＫＯＤ１耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われてよい。別の一実施形態において、ＰＣＲ増幅は、増幅されたＤＮＡに突然変異を導入する条件下、例えばエラープローンＰＣＲを用いて行われてもよい。
【００７１】
別の一実施形態において、本発明の発現ライブラリーは、細胞、ウイルスまたはバクテリオファージ表面における提示によってスクリーニングされ、固定化した標的分子を用いた選別に付されてよい。適切なスクリーニング方法は、米国特許第７，０６３，９４３号、６，６９９，６５８号、６，４２３，５３８号、６，６９６，２５１号、６，３００，０６５号、６，３９９，７６３号、６，１１４，１４７号および５，８６６，３４４号に記載されている。
【００７２】
本発明で用いられているスクリーニング法は、発現した抗体分子における１個以上のアミノ酸置換および／または欠失を生じ得る核酸置換および／または欠失を導入することによって、抗体ライブラリーへの多様性の導入を必要とし得る。技術分野で認識されている任意の突然変異誘発方法、例えばランダム突然変異誘発、「ｗａｌｋ ｔｈｒｏｕｇｈ」突然変異誘発および「ｌｏｏｋ ｔｈｒｏｕｇｈ」突然変異誘発が企図される。このような抗体の突然変異誘発は、例えばエラープローンＰＣＲ、酵母もしくは細菌の「ミューテーター」株または抗体の全体もしくは一部のアブイニシオ合成における、ランダムまたは確定的な核酸変化の取り込みを用いて達成され得る。一実施形態において、１個以上のアミノ酸がランダムに突然変異した抗体分子のライブラリーが作製され得る。別の一実施形態において、１個以上のアミノ酸が１個以上の所定のアミノ酸に突然変異した抗体分子のライブラリーが作製され得る。
【００７３】
本発明で用いられているスクリーニング法は、改善された標的親和性を備える抗体の選別のため、標的結合スクリーニングアッセイのストリンジェンシーが強まることも必要とし得る。抗体−標的相互作用アッセイのストリンジェンシー増強するための、技術分野で認識されている任意の方法が考慮され得る。一実施形態において、１種類以上のアッセイ条件（例えば、アッセイバッファーの塩濃度）が変化され、抗体分子の所望の標的に対する親和性を低減させることができる。別の一実施形態において、抗体が所望の標的と結合できる時間の長さが短縮され得る。別の一実施形態において、抗体−標的相互作用アッセイに競合結合ステップが加えられてよい。例えば、抗体は所望の固定化標的と先ず結合できる。次に、抗原に対して最も低い親和性を有する抗体が固定化標的から溶出され、その結果、抗原結合親和性の向上した抗体が濃縮されるよう、固定化標的との結合と競合するよう作用する特定の濃度の非固定化標的が添加され得る。アッセイ条件のストリンジェンシーは、アッセイに添加される非固定化標的濃度を増加することによってさらに強くなることができる。
【００７４】
本発明のスクリーニング法はまた、標的結合の向上した１種類以上の抗体を濃縮するために複数ラウンドの選別も必要とし得る。一実施形態において、選別の各ラウンドにおいて、技術分野で認識されている方法を用いてさらなるアミノ酸突然変異が抗体に導入され得る。別の一実施形態において、選別の各ラウンドにおける所望の標的に対する結合のストリンジェンシーは、所望の標的に対して向上した親和性を有する抗体を選別するために強くなることができる。
【００７５】
本発明のスクリーニング法は、インビトロ翻訳システムの成分からＲＮＡ−抗体融合タンパク質の精製を必要とし得る。この操作は、技術分野で認識されている任意の分離方法を用いて行われてよい。一実施形態において、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質は、ポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）レジンを用いたクロマトグラフィーによって分離されてよい。別の一実施形態において、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質は、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質の抗体成分に存在するエピトープに特異的な抗体を用いたクロマトグラフィーによって分離されてよい。エピトープは、アミノ酸配列タグ、例えばＲＮＡ−抗体融合タンパク質の抗体成分のアミノ酸配列の、例えばＮ末端、Ｃ末端または可変領域間リンカーに取り込まれたＦＬＡＧ、ＭｙｃまたはＨＡタグとなることができる。
【００７６】
本発明のライブラリーの抗体選別は、固定化標的分子の使用を必要とし得る。一実施形態において、標的分子は固体基質、例えばアガロースビーズに直接連結される。別の一実施形態において、標的分子は先ず修飾、例えばビオチン化され、続いて修飾された標的分子は修飾を介して固体支持体、例えばストレプトアビジン−Ｍ２８０、ニュートラアビジン−Ｍ２８０、ＳＡ−Ｍ２７０、ＮＡ−Ｍ２７０、ＳＡ−ＭｙＯｎｅ、ＮＡ−ＭｙＯｎｅ、ＳＡ−アガロースおよびＮＡ−アガロースと結合する。
【実施例】
【００７７】
発明の具体例
他に記載がなければ、実施例を通じて次の材料と方法が用いられた。
【００７８】
材料と方法
一般に、他に断りがなければ、本発明の実施において、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば免疫グロブリン技術）および畜産業における従来の技法が用いられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０、Ｐａｕｌ、Ｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、１６９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、Ｅｄ．、Ｉｒｌ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ、Ｐｕｂ．（１９９９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照。
【００７９】
ｓｃＦｖ用のｍＲＮＡディスプレイプロトコール
ｍＲＮＡディスプレイは、図２に示されている方法に従って行うことができる。この方法の特定の実施形態はより詳細に後述される。これら実施形態は、本発明の方法を説明することを目的としており、限定するものであると理解するべきでない。
【００８０】
１．抗体ライブラリーテンプレートの設計
ライブラリーＤＮＡコンストラクトは、本技術分野で公知の抗体ライブラリー作製方法に従って設計することができる。一実施形態において、ライブラリーコンストラクトは、抗体断片、すなわち抗体Ｌ鎖断片（ＶＬ）または抗体Ｈ鎖断片（ＶＨ）をコードすることができる。例示的な実施形態において、ライブラリーコンストラクトは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードすることができる。
【００８１】
２．標的抗原の調製
一般に、ｍＲＮＡディスプレイ抗体ライブラリーは、ビオチン化抗原に対して選別することができる。各標的に対する最良の抗原は、ケースバイケースの原則に従って決定するべきであるが、次の記載は一般的ガイドラインとして用いることができる。標的抗原は、通常十分に特徴付けられ、多型（ＳＮＰおよびハプロタイプ）および／または薬理遺伝学的解析によって決定されるような、関連または優性遺伝アイソタイプである。標的抗原はさらに適切な生物活性（天然の抗原と同等の）、十分な溶解度ならびに化学的および物理的特性を有することができ、ライブラリー選別すなわちスクリーニングおよび下流のバイオアッセイに十分な量を調製することができる。
【００８２】
３．ライブラリーＤＮＡの調製
ライブラリーＤＮＡおよびその選別アウトプットは、ＰＣＲによって増幅することができる。ＰＣＲ増幅は、本技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。ＰＣＲ反応液は通常、ＤＮＡテンプレート、反応バッファー、ｄＮＴＰ、増幅用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび水を含む。複数の反応チューブをマスターミックスから一度に調製し、増幅ＤＮＡ収量を増加することができる。２５サイクルのＰＣＲによって通常十分な増幅がもたらされるが、より多くの産物を得るために３５サイクルもの回数を用いてもよい。
【００８３】
４．ライブラリーＤＮＡの精製
産物が正確なサイズ（ｓｃＦｖは、ほぼ８５０ｂｐ、ＶＨまたはＶＬライブラリーは、ほぼ５００ｂｐ）であり、最小限の非特異的産物を含む場合、産物は転写反応に直接用いることができる。あるいは、産物は調製用アガロースゲルにおいて正確なサイズの特異的なバンドを切り出して精製することができる。ＤＮＡ濃度は分光計で測定することができる。
【００８４】
５．ＲＮＡの転写
ライブラリーＤＮＡからＲＮＡの転写は、本技術分野で公知の標準的な方法を用いて行うことができる。大量の反応容量を用いて、全ライブラリー多様性を標本抽出するのに十分なＤＮＡテンプレートを転写することができる。例示的な一実施形態において、１×１０１３コピーのライブラリーテンプレートをＲＮＡ転写反応に用いることができる。ＲＮＡ転写液は、通常５−１０μｇのＰＣＲ産物、反応バッファー、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む。ＲＮＡ転写反応は３７℃で２時間から一晩の間行うことができる。選別の最初のラウンドの後、より短い時間を用いてもよいが、一晩の温置によって反応のＲＮＡ収量を最大化することができる。ＲＮＡ転写の後、ＤＮＡテンプレートはＤＮａｓｅＩ消化によって反応混合液から除去できる。
【００８５】
６．ＮＡＰカラムクロマトグラフィーによるＲＮＡ精製
転写後、ＲＮＡはＮＡＰ−１０カラムを用いて分画することができる。最大約１ｍＬの転写反応液が、ＲＮＡ精製のためＮＡＰ−１０カラムに装填できる。カラムは、分画前にＤＥＰＣ処理ｄＨ２Ｏを用いて平衡化することができる。ＲＮＡは、約１．５×反応容量のＤＥＰＣ処理ｄＨ２Ｏ（例えば、５００μＬの転写反応液につき７５０μＬ）を用いてカラムから溶出できる。全溶出容量は、転写反応液の容量の約１５０％未満となることができる。さらに、またはあるいは、ＲＮＡはＮＡＰ−２５カラムを用いて分画できる。
【００８６】
７．ＲＮＡの品質管理と定量
ＲＮＡサンプルのサイズおよび収量は、ゲル電気泳動を用いて、あるいは収集した画分におけるＲＮＡ濃度の２６０ｎｍのＯＤ（ＯＤ２６０）を測定することによって分析できる。例えば、ｓｃＦｖ ＲＮＡのモル濃度は、次の通り計算できる。
［ＲＮＡ］（μＭ）＝［ＲＮＡ］（ｍｇ／ｍＬ）×１０６／（８５０×３３０）
＝ＯＤ２６０×希釈係数×４０（μｇ／ｍＬ）×１０００／（８５０×３３０）
ＲＮＡ収量（ｎｍｏｌ）＝［ＲＮＡ］（μＭ）×容量（μＬ）／１０００
ＲＮＡ収量は、通常５００μＬの転写反応液につき約２０ｎｍｏｌ／ｍＬの最高値に達する。
【００８７】
８．リンカーへのＲＮＡライゲーション
ペプチドアクセプター分子をその３’末端に備えるＤＮＡリンカーは、ＵＶ架橋によって各ＲＮＡ分子の３’末端と共有結合的ライゲーションを行う。リボソームＡ部位に入り込んで未完成ポリペプチド鎖のカルボキシル末端に共有結合できるペプチドアクセプターは、ｍＲＮＡ（遺伝子型）の、該ｍＲＮＡによってコード化されたタンパク質（表現型）との共有結合的関連を最終的に可能にできる。次式を有する例示的なＰＥＧ６／１０リンカーを用いることができる。
５’（ソラレンＣ６）２’ＯＭｅ（ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ）ＸＸＸＸＸＸＣＣ（ピューロマイシン）３’（配列番号２０）
【００８８】
ソラレンＣ６の５’修飾は光感受性であり、ＵＶ架橋によってリンカーとｍＲＮＡとの間の共有結合を形成するよう機能する。２’ＯＭｅ（ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ）（配列番号２０）骨格領域は、ｍＲＮＡにおけるＦＬＡＧ配列に対して３’のリンカーアニーリング部位とアニーリングする（図１参照）。上述の配列において、Ｘは「スペーサー９」、あるいはトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０として知られている物質を示す。このスペーサーは、ピューロマイシンの真核生物リボソームＡ部位への挿入に対する柔軟性を提供するよう最適化されている。ＣＣは標準的なＤＮＡ骨格を含む。ピューロマイシンの３’修飾は、リボソームＡ部位に挿入してリンカーと未完成ポリペプチドとの間に安定的な結合を形成する。本明細書に記載されているリンカーの減衰係数は、約１４７．７ＯＤ２６０／μモルとなることができる。このリンカーは光感受性であるため、このリンカーを含む溶液は、光から保護しなくてはならない。
【００８９】
推定約１０１２−１０１３の多様性を備える未処理の抗体ライブラリーの全多様性を標本抽出するため、ライブラリー選別の最初のラウンドのためにラージスケールのライゲーション反応（約５ｎｍｏｌまたは約３．１×１０１５転写ＲＮＡ分子）が推奨され得る。このＲＮＡ量は、十分なテンプレートが翻訳反応に取り込まれて、ほぼ１０ｐｍｏｌの機能的ｍＲＮＡディスプレイ分子が産生されることを保証し得る。後期ラウンドでは、ＲＮＡインプットは選別当たり約０．５ｎｍｏｌへと減少できる。例示的な一実施形態において、ＲＮＡライゲーション反応液は、次の成分、すなわちＲＮＡ、水、化学ライゲーションバッファーおよびＰＥＧ６／ピューロマイシンリンカー（１ｍＭ）を含むことができる。例示的な一実施形態において、全反応容量は約１００μＬである。好ましい一実施形態において、リンカー／ＲＮＡ分子比は、約１．５より大きくなることができる。一実施形態において、反応液における最終リンカー濃度は約１５μＭであり、反応液におけるＲＮＡ濃度は約３−１０μＭ（＝０．３−１ｎｍｏｌのＲＮＡインプット）の範囲に及ぶ。参考までに、１ｍｇ／ｍＬの８５０ｎｔのｓｃＦｖ ＲＮＡ＝３．５６μＭであり、達成可能な最大ライゲーション濃度は、約３．１６μＭ（約０．３２ｎｍｏｌ）である。
【００９０】
アニーリング反応（リンカーと転写されたＲＮＡとのアニールにおける）は、サーマルサイクラーにおいて行うことができる。好ましい一実施形態において、アニーリング反応は、サンプルを約８５℃で約３０秒間、続いて１秒当たり約０．３℃のランプ速度を用いて約４℃で温置することによって行うことができる。次に、反応液は約４℃で維持することができる。
【００９１】
アニーリングしたリンカー／ＲＮＡのライゲーションは、ＵＶ架橋によって行うことができる。この操作は当業者に知られた任意の方法を用いて行うことができる。一実施形態において、反応チューブは凍結したフリーザーパックの上に置いて、手持ち式長波長（約３６５ｎｍ）ＵＶランプの下に直接置き、暗所で約１５分間架橋することができる。通常のライゲーション効率は約５０−９０％である。一般に精製は必要とされない。ライゲーション産物は−８０℃で保存することができる。
【００９２】
９．翻訳反応
例示的な一実施形態において、全反応および精製の後、ほぼ約０．１％のインプットＲＮＡをｍＲＮＡディスプレイ分子へと作製することができる。インビトロ翻訳は、当業者に知られた方法と試薬を用いて行われる。一実施形態において、ｓｃＦｖライブラリーを用いた翻訳反応は、約１５ｍＬの反応容量における約５ｎｍｏｌのＲＮＡテンプレートと約１０ｍＬの網状赤血球ライセートを用いる。
【００９３】
翻訳反応液の調製において、ＧＳＳＧ／ＧＳＨ（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン）溶液は、最終濃度約１００ｍＭ ＧＳＳＧ／１０ｍＭ ＧＳＨに調製できる。ＰＤＩは、ＰＤＩ粉末をｄＨ２Ｏに溶解して約１ユニット／μＬ濃度になるよう調製される。ＰＤＩ溶液は−２０℃で保存できる。
【００９４】
【表１】
【００９５】
翻訳反応液は、３０℃のウォーターバスで１−２時間温置することができ、ＲＮＡ／タンパク質融合体形成は遅滞なく行うべきである。翻訳容量が３ｍＬを超える場合、ＲＮＡ／タンパク質融合体収量の顕著な減少が観察できる。従って、反応容量が３ｍＬより多い場合、翻訳反応液のマスターミックスを調製し、続いてより小さなアリコートに分注してよい。
【００９６】
１０．ＲＮＡ／タンパク質融合体形成
翻訳反応後、３００μＬの翻訳反応混合液につき約１００μＬの２Ｍ ＫＣｌおよび約２０μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２を添加し、約１時間室温または−２０℃で一晩温置することができる。あるいは、１．５ｍｌの翻訳反応混合液につき約５００μＬの２Ｍ ＫＣｌおよび約１００μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２を添加し、約１時間室温または−２０℃で一晩温置することができる。この操作は、ｍＲＮＡテンプレート末端における休止リボソームを安定化し、ＤＮＡリンカー末端のピューロマイシンを休止リボソームのＡ部位に挿入し、これにより翻訳されたｓｃＦｖタンパク質とそのｍＲＮＡテンプレートとを永続的に接続する。反応液が−２０℃で一晩保存される場合、室温の温置は短縮できる。反応は、３００μＬまたは１．５ｍｌの翻訳反応液につきそれぞれ約５０μＬまたは約２５０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えてリボソームを停止することによって終了できる。反応液は−２０℃で保存できる。５−１０μＬアリコートを後のシンチレーション計数のため取り分けることができる。
【００９７】
１１．オリゴｄＴセルロースによるＲＮＡ／タンパク質融合体の精製
このステップは、ｍＲＮＡディスプレイ分子および残存ＲＮＡテンプレートを翻訳／融合反応液から精製するために含まれる。オリゴｄＴ結合のため、全ＲＮＡテンプレートを捕集するのに必要な、前洗浄したオリゴｄＴセルロース量を概算するべきである。十分量のオリゴｄＴ結合バッファーは、約１×最終濃度となるよう融合反応液に加えることができる。次に、前洗浄したオリゴｄＴセルロースが加えられ、反応液は１時間、４℃で回転することができる。反応液は、場合によって約１５００ｒｐｍ、５分間、４℃でスピンダウンすることができ、上清は廃棄される。オリゴｄＴセルロースビーズを移し、スピンカラムを用いて１×オリゴｄＴ結合バッファーで約６回洗浄することができ、バッファーは通常、カラムを約１０００ｒｐｍ、１０秒間スピンすることによって除去される。貫流液は廃棄してよいが、最後の洗浄液はシンチレーション計数のため取っておくことができる。塩濃度を低下させて溶出を容易にするため、最初のスラリー容量の１／１０のｄＨ２Ｏを乾燥オリゴｄＴビーズに添加し、即座に１０秒間遠心分離して貫流液を廃棄することができる。ｍＲＮＡディスプレイ分子（および遊離ＲＮＡテンプレート）は、ビーズにｄＨ２Ｏを加えて５分間室温で温置することによって溶出できる。溶出液は、約４０００ｒｐｍ（以上）で２０秒間スピンすることによって収集できる。溶出は通常１回繰り返し、溶出液を合わせる。５μＬの溶出液をシンチレーション計数のため取り分けることができる。場合によって、オリゴｄＴ精製効率は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光装置の２６０ｎｍのＯＤ（ＯＤ２６０）によって評価することもできる。理論的に、全残存ＲＮＡテンプレートおよびｍＲＮＡディスプレイ分子がオリゴｄＴビーズによって回収される。５×ＦＬＡＧ結合バッファーが、約１×最終濃度になるよう溶出液に加えられる。サンプルは、次のＦＬＡＧ精製ステップに進まない場合、−８０℃で保存することができる。
【００９８】
オリゴｄＴ回収は、次の通りに計算される。約５μＬのインプット（融合反応液由来）、最後の洗浄液由来の約１００μＬおよび約５μＬのアウトプット（オリゴｄＴ精製由来の溶出液）。最後の洗浄液は、洗浄の程度を評価するために用いられ、他の２種の計数は、元来のＲＮＡテンプレートインプットからＲＮＡ／タンパク質融合体回収を計算するために用いられる。ＲＮＡ／タンパク質融合体収量（ｐｍｏｌ）＝（ＣＰＭアウトプット×容量アウトプット×５μＭ×容量ライセート）／［ＣＰＭインプット×容量インプット×（産物におけるメチオニンの＃）］。この式は網状赤血球ライセートにおける５μＭのメチオニン濃度を推測し、計算に用いられているあらゆる容量はμＬで表されている。選別の初期のラウンドのｍＲＮＡディスプレイ分子収量は、通常０．５−２％であるが、後期ラウンドでは１０％に増加する。例えば、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおける初期ラウンドのメチオニン数は次の通りとなることができる。
・ＶＨ−Ｖκ ｓｃＦｖは約３μＭ
・ＶＨ−Ｖλ ｓｃＦｖは約２−３μＭ
・ＶＨは約２μＭ
・Ｖκは約２μＭ、および
・Ｖλは約１μＭ
これらの数値は平均であり、生殖細胞系列の配列に基づいており、当業者であれば、ライブラリーが特定の配列へと濃縮するに従って、これらが選別ラウンドにわたって変化し得ることを理解できる。
【００９９】
１２．抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースによるＲＮＡ／タンパク質融合体精製
このステップは、残存ＲＮＡテンプレートからｍＲＮＡディスプレイ分子を精製するよう設計されている。ライブラリーが抗原オフレート競合によってまたは抗原発現細胞によって選別される場合、このステップに進む必要はない。全ｍＲＮＡディスプレイ分子の捕集に必要とされる、前洗浄された抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースビーズの量を概算することができる。一実施形態において、ビーズの結合能力は、５０％スラリー１ｍＬ当たり約６ｎｍｏｌ融合タンパク質となることができる。結合と洗浄における操作に十分なビーズ容量を有するために、少なくとも約２００μＬの前洗浄されたビーズを用いることが推奨される。後述の例は、最初の翻訳反応液３００μＬに対するものである。
【０１００】
ＦＬＡＧ精製：大口径ピペットチップを用いて３００μＬの前洗浄した抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースをオリゴｄＴ精製されたアウトプットに移し、次に１時間４℃で回転することができる。抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースとの温置は一晩続けてよい。抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースは、場合によって遠心分離機で約１５００ｒｐｍ、約１分間４℃でスピンして、上清を捨てることができる。抗ＦＬＡＧビーズは、スピンカラムを用いて（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）微量遠心スピンカラム）約５００−７００μＬの１×ＦＬＡＧ結合バッファーで約５−６回洗浄し、各洗浄につき約１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離することができる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カラムは、より高速、例えば約１０，０００ｒｐｍでスピンできることに留意）。貫流液は廃棄することができる。ビーズは約１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離することによって、７００μＬの選別バッファー（後述を参照）で追加的に２回洗浄することができる。最後の洗浄は、シンチレーション計数のため取っておくことができる。ｍＲＮＡディスプレイ分子は、約４００μＬの１００μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧペプチド（選別バッファーに溶解）を添加して５分間室温で温置することによって溶出できる。溶出液は、約３０００ｒｐｍ（か、可能であればそれ以上）で２０秒間スピンすることによって収集することができる。溶出ステップは、約４００μＬの１００μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧペプチドを加えることによって、もう１回繰り返すことができる。両方の溶出液は合わされて、約５μＬをシンチレーション計数のために取り分けることができる。この容量のＦＬＡＧペプチドは、最大約１ｍＬの５０％スラリーからの溶出に十分となることができ、より少量のスラリーが用いられているおよび／またはより高いＲＮＡ／タンパク質融合体濃度が望ましい場合、半量（２００μＬ）に縮小することができる。保存や抗原選別におけるＲＮＡ分解を防ぐため、適量の本技術分野で公知のＲＮａｓｅインヒビター（すなわち、１−２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅＯＵＴおよび０．０２μｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ）が、精製されたｍＲＮＡディスプレイライブラリーに添加されてよい。次の抗原選別ステップに進まない場合、サンプルを−８０℃で保存する。
【０１０１】
ＦＬＡＧ回収を定量するため、約５μＬの溶出アウトプットおよび最後の洗浄由来の約１００μＬをベータカウンターで計数する。１０−３０％以上の回収を予想でき、次式に従って計算することができる。
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子回収％＝（ＣＰＭアウトプット×容量アウトプット）／（ＣＰＭインプット×容量インプット）
【０１０２】
１３．ビオチン化抗原によるライブラリー選別
選別は、ライブラリーの抗原への結合が平衡に達したときに目的の標的に特異的に結合する分子を濃縮するように設計される。ネガティブ選別（プレクリア）は、非特異的およびマトリックスバインダーを未処理ｓｃＦｖライブラリーから除去するのに必要となり得るが、単一のテンプレートから作製されたライブラリー、例えば単一ｓｃＦｖテンプレートに基づいて親和性成熟を行う、親和性成熟のために作製されたライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない、を用いる場合省略することができる。標的フォーマットに依存して選別プロトコールは異なる。次に、ビオチン化標的を用いた使用のための例示的な選別プロトコールを記載する。このプロトコールは、他のフォーマットの標的抗原に適合するよう修正することができ、所望のアウトプットに応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができる。
【０１０３】
Ａ．選別前の調製
ストレプトアビジン（ＳＡ）磁気ビーズは、捕集のため用いることができ、通常使用前にプレブロッキングすることができる。ＳＡビーズは、原瓶から１．５または２ｍＬチューブに移して２ｍＬの１×ＦＬＡＧ結合バッファーで２回洗浄することができる。ビーズは２ｍＬの選別バッファーで（２時間から一晩）４℃で回転しながらブロッキングすることができる。プレクリアと選別捕集の両方に十分なビーズを調製することが重要である。プレブロッキングされたビーズは４℃で保存することができる。１０ｐｍｏｌのビオチン化抗原につき約１００μＬのビーズが通常用いられるが、捕集ビーズ容量は、反応収量に対する遊離ビオチンの結合能力（例えば、ビーズ濃度が通常１０ｍｇ／ｍｌである場合、６５０−９００ｐモル／ｍｇビーズ）を考慮して計算するべきことを当業者であれば理解できる。
【０１０４】
１．５ｍＬまたは２ｍＬ微量遠心チューブは、１×ＦＬＡＧ結合バッファーで約１時間から一晩、プレブロッキングすることができる。プレブロッキングされたチューブは、全プレクリアおよび選別ステップに用いることができる。通常、各サンプルにつき４本のチューブが必要とされる。２本はプレクリア用、１本はビーズ用、そして１本は選別用である。
【０１０５】
最適な結果は、ライブラリーをプレクリアすることによって得ることができる。ＦＬＡＧ精製したｍＲＮＡディスプレイライブラリーは、捕集容量の半量に相当するＳＡビーズ容量のビーズ（バッファーから分離）に加えることができる。ビーズは、３０℃で約３０分間回転することができる。プレクリアしたｍＲＮＡディスプレイライブラリーは、磁石を用いてビーズから分離することができ、プレクリアはもう一回繰り返すことができる。第二のプレクリアＳＡビーズは、上述の通りに洗浄、計数して、バックグラウンドが高いか判断することができる。これは、「抗原無し」ネガティブコントロールとすることもできる。
【０１０６】
Ｂ．ライブラリー選別：結合
選別の第一ラウンドのため、ビオチン化標的（１００ｎＭ）をプレクリアしたライブラリー全体に添加して、３０℃で１時間回転することができる。後期選別ラウンドのため、抗原結合分子の回収が１％を超えることが予想される場合、プレクリアしたライブラリーは、２個の等量アリコートに分注することができる。ビオチン化抗原は一方のアリコートに加えることができ、他方のアリコートは「抗原無し」ネガティブコントロールとなることができる。あるいは、上述の通り、洗浄した第二のプレクリアビーズは、より「プレクリア」でないことになるが、「抗原無し」コントロールであると考えることができる。後期ラウンドにおける抗原濃度は、抗原結合分子の回収が５％を超える場合減少させることができる。特に、抗原濃度は、抗原が「粘着性」であるように思われ、顕著な回収が初期ラウンドで観察される場合、減少させるべきである。抗原濃度は、抗原結合分子の回収がバックグラウンドより（例えば、抗原無しコントロールに対して）顕著に高くなる場合、後期ラウンドで減少させてよい。ライブラリーと抗原との間の化学量論に注意して、特に抗原濃度が低い場合、ライブラリーＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子より少なくとも５倍モル過剰の抗原が含まれていることを確実にすることが重要である。
【０１０７】
Ｃ．ライブラリー選別：捕集
ライブラリー捕集用ＳＡビーズのブロッキングに用いられている選別バッファーは、遠心分離と磁気選別によって除去することができる。抗原と結合したライブラリーは、プレブロッキングされたＳＡビーズ（バッファーから分離）、次に結合反応液へと移され、３０℃で５−１０分間回転した。捕集用ＳＡビーズ量は、結合能力および選別に用いられている標的の濃度（上述を参照）に基づいて計算するべきである。ＳＡビーズ量は、ＳＡビーズバインダーを抑制するため標的濃度を下げる場合少なくするべきであるが、通常５０μＬ以上のビーズが用いられる。
【０１０８】
Ｄ．ライブラリー選別：洗浄
磁石を用いてＳＡビーズを捕集し、約１ｍＬの選別バッファーで１分間洗浄することができる。このステップは、約５回繰り返すことができる（合計約６回）。洗浄回数を後期ラウンドで増やして、オフレート選別戦略を一部の標的に取り込むことができる。ビーズは、最後の１回は約１ｍＬの逆転写に適切な１×バッファーで洗浄して磁石で捕集し、水（上で計算された捕集ビーズ容量の４分の１）に再懸濁することができる。
【０１０９】
別の一例として、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることができるが、当業者であれば、他のビーズも等しく適切であることを理解することができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、遠心分離と磁気選別によって非結合ライブラリーから分離することができる。上清は１ｍＬチップで除去することができるが、相互汚染を避けるため各ライブラリー選別チューブにつき１本の新しいフィルターチップを用いる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、１ｍＬの選別バッファーで洗浄し、穏やかにピペッティングまたはチューブを複数回反転することによって再懸濁することができる。チューブは、次のライブラリーを処理している間にビーズ分離用の磁気ホルダーに戻すことができる。全ライブラリーを洗浄した後、上清は１ｍＬチップによって除去することができるが、相互汚染を避けるため各ライブラリー選別チューブにつき１本の新しいフィルターチップを用いる。洗浄を５回繰り返す。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、上述の通り１ｍＬの１×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄することができる。最後の洗浄において、必要に応じて、計数のためライブラリーの１／１０を別個のチューブに取り分けて、ライブラリー回収を決定した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、磁気選別によって捕集することができ、バックグラウンド計数のため約１００μｌの洗浄バッファーを取り分けることができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、上で計算された通り、捕集ビーズ容量の１／４の水に再懸濁することができる。
【０１１０】
Ｅ．ライブラリー選別：計数および回収計算
ラウンド３から始めて、最後の洗浄液およびビーズの約１０−２０％を計数する。計数を抑える可能性があるため、１００μＬより多いビーズを計数することは望ましくない。ライブラリー選別回収は次式に従って計算することができる。
選別回収％＝１００×ＣＰＭ全ビーズ／ＣＰＭ全インプット
【０１１１】
１４．Ｆｃ融合タンパク質による平衡ライブラリー選別
別の一実施形態において、ライブラリー選別は、抗体Ｆｃ領域と結合した標的抗原（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）に対して行うことができる。ネガティブ選別（プレクリア）は、未処理抗体ライブラリーから非特異的およびマトリックスバインダーを除去するために必要となり得るが、親和性成熟には省略してよい。選別特異性は、標的抗原をヒトＩｇＧ１とマウスＩｇＧ２ａの両方と融合することによって改善することができる。ライブラリー選別においてＦｃ融合タンパク質中に異なるＦｃ領域を有することによって、Ｆｃ領域特異的なライブラリーバインダーを同定するリスクを最小限に抑えることができる。この操作はまた、ライブラリーバインダーを２種類の異なる磁気ビーズ（プロテインＧおよび抗マウスＩｇＧ）によってプルダウンすることもでき、これによりさらに抗プロテインＧまたは抗−抗マウスＩｇＧバインダーを回収する可能性を低減させることができる。標的Ｆｃ融合タンパク質は、ビオチン化し、本明細書に記載されている方法か上述第１３節の方法のいずれかによって選別することができる。抗体ＶＨ領域の特定部位（例えば、ヒトＶＨ３ファミリー生殖細胞系列の配列に由来するＶＨ）との交差反応のため、プロテインＡ磁気ビーズがＦｃ融合タンパク質標的に対する選別に適さない可能性を留意するべきである。ｓｃＦｖ−ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子と結合する抗原のプルダウンに適切な磁気ビーズは、ＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＧ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ全マウスＩｇＧおよび他のヒトまたはマウスＩｇＧに利用可能なＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０を含むが、これらに限定されるものではない。一般に、プロテインＧビーズの結合能力は、プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズ１００μＬにつき約２５μｇのヒトＩｇＧ１（ほぼ１６７ｐｍｏｌ）であると考えられる。
【０１１２】
Ａ．選別前の調製
ＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＧまたはＤｙｎａｂｅａｄｓ全マウスＩｇＧ（標的抗原がマウスＦｃ融合タンパク質である場合）は、捕集のため用いることができ、通常使用前にプレブロッキングされる。ライブラリーのプレクリアと選別に必要とされるＤｙｎａｂｅａｄｓの量は計算することができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、原瓶から１．５または２ｍＬ微量遠心チューブへと移してバッファーを除去することができる。ビーズは１ｍＬの選別バッファーで（２時間から一晩）４℃、または１時間室温でブロッキングすることができる。プレクリアと選別捕集の両方に十分なビーズを調製することが重要である。
【０１１３】
１．５ｍＬまたは２ｍＬ微量遠心チューブは選別バッファーで１時間から一晩プレブロッキングすることができ、全プレクリアおよびライブラリー選別ステップにおいてプレブロッキングされたチューブを用いるべきである。
【０１１４】
ＦＬＡＧ精製したｓｃＦｖ ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーは、プレブロッキングしたビーズ（バッファーから分離）に加えることができ、捕集容量（上述の通り計算された）の半量に相当するＤｙｎａｂｅａｄ（プロテインＧまたは全マウスＩｇＧ）容量を用いて、反応液を３０℃で３０分間回転することができる。プレクリアした融合ライブラリーは、磁石を用いてビーズから分離することができ、プレクリアはもう１回繰り返される。第二のプレクリアＤｙｎａｂｅａｄｓは、上述の通り洗浄、計数してバックグラウンドが高いか判断することができる。これは「抗原無し」ネガティブコントロールとなることもできる。
【０１１５】
Ｂ．ライブラリー選別：結合
選別の第一ラウンドのため、ビオチン化標的（１００ｎＭ）をプレクリアしたライブラリー全体に添加して、３０℃で１時間回転することができる。後期選別ラウンドのため、抗原結合分子の回収が１％を超えることが予想される場合、プレクリアしたライブラリーは、２個のアリコートに分注することができる（ライブラリーの計数に応じて、５０／５０から８０／２０）。ビオチン化抗原が一方のアリコート（全体の５０−８０％）に添加され、他方のアリコートは「抗原無し」ネガティブコントロールとなることができる。あるいは、上述の通り、洗浄された第二のプレクリアビーズも、より「プレクリア」でない場合を除き「抗原無し」コントロールであると考えることができる。抗原が「粘着性」であると思われ、初期ラウンドで顕著な回収が観察される場合、抗原濃度は低減させてよい。さらに、抗原結合分子の回収がバックグラウンド（抗原無しコントロール）よりも顕著に高くなる場合、抗原濃度は後期ラウンドで低減させてよい。ライブラリーと抗原との間の化学量論に注意して、特に抗原濃度が低い場合、ライブラリーＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子に対して少なくとも５倍モル過剰の抗原が含まれていることを確実にすることが重要である。
【０１１６】
Ｃ．ライブラリー選別：捕集
ライブラリー捕集用Ｄｙｎａｂｅａｄｓのブロッキングに用いられている選別バッファーは、遠心分離と磁気選別によって除去することができる。抗原結合ライブラリーは、プレブロッキングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（バッファーから分離）へと移され、続いて結合反応液へと移されて３０℃で２０分間回転することができる。捕集に用いられているＤｙｎａｂｅａｄｓの量は、上述の通りビーズの結合能力と、選別に用いられている標的抗原濃度に基づいて計算することができる。ビーズバインダーのプルダウンを避けるため、標的抗原濃度が低い場合、Ｄｙｎａｂｅａｄｓの量は低く抑えるべきである（なお、５００μｇまたは５０μｌ以上であること）。
【０１１７】
Ｄ．ライブラリー選別：洗浄
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、非結合ライブラリーから遠心分離や磁気選別によって分離することができる。上清は１ｍＬチップで除去することができるが、相互汚染をなくすため各ライブラリー選別チューブにつき１本の新しいフィルターチップを用いることができる。新しいピペットチップを用いて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を約１ｍＬの選別バッファーで洗浄することができ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、穏やかなピペッティングによってまたはチューブを複数回反転することによって再懸濁することができる。チューブは、次のライブラリーを処理している間にビーズの分離のために磁気ホルダーに戻すことができる。全ライブラリーを洗浄した後、上清は１ｍＬチップ（相互汚染をなくすため、各ライブラリー選別チューブにつき１本の新しいフィルターチップを用いる）で除去することができる。このステップは、５回の洗浄を繰り返すことができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、上述の通り１ｍＬの１×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄することができる。最後の洗浄において、ライブラリーの１／１０は、必要に応じてライブラリー回収を決定する計数のため別個のチューブに取り分けることができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、磁気分離によって捕集することができ、約１００μｌの洗浄バッファーはバックグラウンド計数のため取り分けることができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、上で計算された捕集ビーズ容量の１／４の水に再懸濁することができる。
【０１１８】
Ｅ．ライブラリー選別：計数
上述の第１３節（Ｅ）に記載されている通りに行うことができる。
【０１１９】
１５．抗原競合によるオフレートライブラリー選別
オフレート選別と平衡選別との間の大きな差は、ＦＬＡＧ精製の前に先ずライブラリーが選別抗原と結合することである。ＦＬＡＧ精製後、オフレート競合においてＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子から非結合になった任意の前結合抗原が競合分子と置き換わるように、ライブラリーは過剰量の競合抗原または抗体（例えば、競合抗原が利用できない場合）と温置することができる。競合分子と結合したＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子が次の回収ステップで回収されないという点において、競合分子は前結合抗原と異なる。これらは、非修飾抗原または異なるフォーマットの抗原となることができる。抗体もまた競合分子となり得るが、通常抗体は抗原ほど効率的な競合分子ではなく、その効率はライブラリーの抗原に対する親和性が高くなるにつれ減少する。適切な競合期間を特定するため、選別のちょうど前にライブラリーのオフレートを決定することは都合が良い。この期間は、数時間から数週間の範囲に及ぶ。
【０１２０】
Ａ：ビオチン化抗原または抗原−Ｆｃ融合タンパク質を用いたプレロードライブラリー
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子を翻訳し、上述の通りオリゴｄＴによって精製することができる。オリゴｄＴ精製ライブラリーは、５×ＦＬＡＧ結合バッファーを加えて１×最終濃度にする（単純に、ライブラリー容量の２５％を加える）ことによって平衡化することができる。十分に高い濃度になるよう抗原（ビオチン化またはＦｃ融合）が加えられ、３０℃で３０分間回転して抗原−抗体結合を飽和させることができる。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子は、上述の通り抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースによって精製することができる。ＦＬＡＧ精製したＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーは氷上に維持するべきだが、凍結してはならないことに留意することが重要である。上述の通り、十分な量の捕集ビーズをプレブロッキングすることが重要である。
【０１２１】
Ｂ：競合分子の濃度およびライブラリーのベースライン回収の決定
前記ステップから回収されたライブラリー量を計算してそのモル濃度を決定することができる。これは、最大量のライブラリー結合抗原を表し、オフレート競合に必要とされる量（５００×から１０００×）の計算に用いることができる。
【０１２２】
１０％のプレブロッキングしたビーズが、抗原結合ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーの１０％アリコートに加えられ、約２０分間約４℃で回転することができる。ビーズは、上述の通り１ｍＬの選別バッファーで５回洗浄することができる。オフレート選別前に抗原と結合したＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーの割合は、ビーズを計数して次の通り決定することができる。
回収％＝１００×（ＣＰＭビーズ／ＣＰＭインプット）×１０
【０１２３】
Ｃ：ライブラリー選別：競合
１０００倍モル過剰の競合分子（例えば、非修飾抗原または抗体）が、ＦＬＡＧ精製ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーに加えられ、より良いオフレートを備えるクローンを選別するための十分な淘汰圧をかけることのできる所定の期間約３０℃で回転することができる。氷上でライブラリーを約１−２分間冷却して、ビーズ捕集前にオフレート減速する。
【０１２４】
Ｄ：ライブラリー選別：捕集
ライブラリー捕集用Ｄｙｎａｂｅａｄｓのブロッキングに用いられている選別バッファーは、遠心分離および磁気選別によって除去することができる。抗原結合ライブラリーはプレブロッキングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（バッファーから分離）へと移し、４℃で約２０分間回転することができる。
【０１２５】
Ｅ：ライブラリー選別：洗浄
Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、遠心分離および磁気選別によってライブラリーから収集することができる。上清は、１ｍＬチップ（上述の通り、相互汚染を避けるため各ライブラリー選別チューブにつき１本の新しいフィルターチップを用いる）で除去することができる。
【０１２６】
上述の通り、ビーズは約１ｍＬの１×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄することができる。最後の洗浄において、ライブラリーの１０−２０％は、必要に応じ計数してライブラリー回収を決定するため別個のチューブに移すことができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、磁気選別によって捕集することができ、１００μｌの洗浄バッファーはバックグラウンド計数のため取っておくことができる。ビーズは、水（上で計算された捕集ビーズ容量の１／４）に再懸濁することができる。
【０１２７】
Ｆ：ライブラリー選別：計数および回収の計算
最後の洗浄液およびビーズの１０−２０％を計算することができる。１００μＬを超えるビーズの使用は計数を抑えるため、避けることが望ましい。ライブラリー選別回収は、次式を用いて計算することができる。
選別回収％＝１００×ＣＰＭ全ビーズ／ＣＰＭ全インプット
【０１２８】
１６．ライブラリー選別アウトプットの逆転写
逆転写は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて行うことができる。各反応液の容量は、選別後のビーズ容量に従ってスケールアップすることができる。アウトプットは、適切なプライマー対を用いた逆転写（ＲＴ）によって分析することができる。例えば、「Ｃｋリバース」または「Ｃｋ５−ＦＬＡＧＡ２０Ｒｅｖ」プライマーはκライブラリーに対して用いることができ、「ＣＪＬリバース」または「ＣＬ５ＦＬＡＧＡ２０Ｒｅｖ」プライマーはλライブラリーに対して用いることができ、「Ｌｉｂ−ＧＳ−Ｒｅｖ」または「ＶＨ−ＧＳＦＬＡＧＡ２０−Ｒｅｖ」プライマーはヒトＰＢＭＣ ＶＨライブラリーに対して用いることができる。
【０１２９】
逆転写プライマーは、逆転写反応から取り残された残存プライマーが異なる３’末端配列を有する増幅産物を生成するのを避けるため、少なくとも続くＰＣＲのリバースプライマーと同一の５’末端配列を有するべきである。これらプライマーはいかなる残存量であっても次のＰＣＲに関与してポリＡテールを欠く産物を生成し得るため、より短い「Ｃｋリバース」、「ＣＪＬリバース」または「Ｌｉｂ−ＧＳ−Ｒｅｖ」プライマーがＲＴに用いられている場合特に、このことが重要である。
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
例示的なＲＴ反応条件
最終容量２００μＬの反応液に対し、ＲＴ反応は次の通り設定することができる。
ビーズ（水に懸濁） ＸμＬ
ｄＨ２Ｏ １０８μＬとする
１０μＭリバースプライマー ２μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ １０μＬ
６５℃、５分間温置し、氷上で冷却する。次の試薬を加える。
５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー ４０μＬ
０．１Ｍ ＤＴＴ ２０μＬ
ＲＮａｓｅＯＵＴ １０μＬ
【０１３２】
反応液は、１０μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を加える前に４２℃で２分間温置することができる。反応液は、１００μＬアリコートに分注し、時々攪拌しつつ４２℃で５０分間温置することができる。次に反応後、チューブを９５℃で５分間温置することができる。ビーズを単離し、上清を新しいチューブに移すことができる。通常、同一の選別アウトプットに由来する場合、サンプルはプールすることができる。ビーズを水（ＲＴ容量の半量）に再懸濁する。反応後、チューブは９５℃で５分間温置することができ、ビーズは磁石によって捕集することができ、上清は前に移した上清と共にプールすることができる。これは、選別アウトプットのＰＣＲ増幅のためのｃＤＮＡテンプレートを表す。
【０１３３】
１７．細胞表面抗原に対するライブラリー選別
細胞表面抗原に対する場合と可溶性ビオチン化抗原に対する場合との間のＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリー選別の大きな差は、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子のｍＲＮＡ部分が、ｃＤＮＡの相補性によって細胞性ＲＮａｓｅ分解から保護され、従ってライブラリー選別前にｃＤＮＡに逆転写される必要があることである。逆転写反応は、オリゴｄＴ精製後のライブラリー容量に応じてＦＬＡＧ精製の前または後に行うことができる。ｓｃＦｖ分子の鎖内ジスルフィド結合を保存するため、還元剤ＤＴＴは逆転写またはライブラリー選別前のどのステップにも含まれるべきではないことに留意することが重要である。
【０１３４】
Ａ：オリゴｄＴ精製後のライブラリー調製
一実施形態において、選別の第一ラウンドに適切な最初の１０ｍｌの翻訳容量を用いることができるが、次の手順はより少量の翻訳反応に容易に適用できることに留意するべきである。
【０１３５】
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子は、上述の通り翻訳およびオリゴｄＴによって精製することができる。精製されたライブラリーは、翻訳に用いられている網状赤血球ライセート容量と等量またはより少ないｄＨ２Ｏ容量で回収するべきである。インプット、最後の洗浄バッファーおよび１０μｌのライブラリーは、上述の通り計数して収量および回収率を決定することができる。
【０１３６】
Ｂ：ＦＬＡＧ結合
オリゴｄＴ精製したライブラリーは、ライブラリー容量の１／４の５×ＰＢＳを加えることによって最終濃度１×ＰＢＳに平衡化することができる。全ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子の捕集に必要な抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースビーズ量を概算することができる（例えば、ビーズの結合能力を５０％スラリー１ｍＬ当たり約６ｎｍｏｌ融合タンパク質であると概算）。結合および洗浄における操作に十分なビーズ容量を有するために、２００μＬ未満の前洗浄ビーズを用いることは勧められない。大口径ピペットチップを用いて抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースを新しいチューブに移すことができる。ビーズをスピンダウン（１５００ｒｐｍ、１分間）してバッファーを除去することができる。保存バッファーに含まれているどれ程微量の界面活性剤も除去するため、ビーズを１ｍｌのＰＢＳで２−３回洗浄することができる。オリゴｄＴ精製したライブラリーは、１×ＰＢＳにおいて洗浄した抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースビーズに移して、４℃で１時間から一晩回転することができる。
【０１３７】
Ｃ：ＦＬＡＧ洗浄
場合によるステップとして、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースビーズは、１５００ｒｐｍ、１分間４℃でスピンダウンして上清を廃棄することができる。１×ＰＢＳを用いてビーズをＢｉｏ−Ｒａｄ（商標）ミニスピンカラムまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）微量遠心スピンカラムに移し、続いてバッファーは１０００ｒｐｍで１０秒間スピンすることによって除去できる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カラムは、より高速（例えば、１０，０００ＲＰＭが可能）でスピンすることができる。ビーズは、５００−６００μＬの１×ＰＢＳによって４回洗浄することができ、ＰＢＳはカラムを通してスピンすることができる。ビーズは、５００−６００の１×ＲＴ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー（ＤＴＴ無し）によって２回洗浄することができる。貫流液は廃棄することができるが、シンチレーション計数のため最後の洗浄液を取り分けることが望ましい。
【０１３８】
Ｄ：ＦＬＡＧ溶出
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子は、１００μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧペプチドの１：２０希釈のＲＮａｓｅＯＵＴを含有するＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー（ＤＤＴ無し）中溶液を４５０μＬ（より少量のＭ２アガロース容量には２３０μＬを用いてよいことに留意）加え、続いて混合液を１０分間室温で温置することによって溶出することができる。溶出液は、３０００ｒｐｍ以上で２０秒間スピンすることによって収集できる。このステップは、１回繰り返すことができ、次に両方の溶出液から得られたライブラリーをプールすることができる。
【０１３９】
Ｅ：ＦＬＡＧ回収の計算
５−１０μＬの溶出アウトプットおよび最後の洗浄液から得られた１００μＬをベータカウンターで計数する。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子の回収％は、次の通りに計算することができる（１０−３０％以上の回収が予想されることに留意）。
＝（ＣＰＭアウトプット×容量アウトプット）／（ＣＰＭインプット×容量インプット）
【０１４０】
Ｆ：逆転写
上述の第１６節に記載されているプライマーを用いることができる。
【０１４１】
【表３】
反応液は、攪拌有りまたは無しで、３７℃で１時間温置することができる。ライブラリーは、次の通り細胞表面抗原に対する選別のため平衡化することができる。逆転写反応が完了した後、５Ｍ ＮａＣｌが反応混合液に添加されて、７５ｍＭとなることができる（１５．３μＬが１ｍＬ反応液に、７．６が５００μＬに）。容量を増やす必要がある場合、追加的な１×ＰＢＳをライブラリーに加えることができる。次のブロッキング試薬は、選別前にライブラリーに添加することができる。
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
プレクリアステップは、未処理ライブラリー選別に必要となり得るが、単一のテンプレートから作製されたライブラリー、例えば親和性成熟のため作製されたライブラリーを用いる場合、省略することができる。
【０１４４】
ライブラリープレクリアに用いられている細胞（抗原未処理細胞）は、フローサイトメトリーまたはウエスタンブロット解析によって標的抗原を細胞表面に発現していないことを確認するべきである。例えば、この細胞は、抗原を発現する安定した細胞系の作製に用いた親細胞となることができ、このことは、プレクリアと選別に用いられている細胞の間の唯一知られている表面タンパク質の差異が、標的抗原そのものであるべき状況を提示する。
【０１４５】
ライブラリーのプレクリアに必要とされる細胞数を計算するべきである。これは、ライブラリーのプレクリアに必要とされる抗原未処理細胞の数であり、ライブラリー選別用と同数である。細胞数（Ｘ）は、いくつかの数値、すなわち抗原発現細胞表面上の抗原コピー数（Ｃ）、選別のためのライブラリーサイズ（Ｓ＝モル数×６×１０２３）および標的抗原と結合するライブラリーの画分（Ｆ）から計算される。これは次式により概算して、１０倍過剰の標的抗原またはプレクリア能力を可能にする。
Ｘ＝１０×Ｓ×Ｆ／Ｃ
【０１４６】
例えば、ある特定の抗原が１×１０４の推定細胞表面コピー数を有するとすると、抗原結合またはバックグラウンド固着によって、１０ｐｍｏｌ未処理抗体ライブラリーにおいて０．０５％（５×１０−４）未満のライブラリーが回収できる。プレクリアおよび選別に必要とされる細胞数は、次の通りである。
Ｘ＝１０×（１０×１０−１２×６×１０２３）×（５×１０−４）／（１×１０４）＝３×１０６
【０１４７】
実際には、ペレット形成後に細胞ペレットを目視できることを確実にするため、細胞数は５×１０６以上とするべきである。
【０１４８】
Ｇ：ライブラリーのプレクリア
細胞密度は血球計算板またはコールターカウンターによって計数することができ、十分な細胞を遠心分離チューブに移すことができる。細胞は、１５００ｒｐｍ、４℃でスピンダウンし、１ｍＬの氷冷ＰＢＳに非常に穏やかに再懸濁することができる。細胞懸濁液は１．７ｍＬねじ蓋付き微量遠心チューブに移すことができる。細胞をピペッティングによって剪断しないよう注意する。細胞は、１５００ｒｐｍでスピンダウンしてＰＢＳを除去することができる。ＰＢＳによる洗浄ステップは、もう１回繰り返すことができる。ステップ１３．３．３から得られたライブラリーは、穏やかに再懸濁した細胞に即座に添加するべきである。次にチューブは、氷水ウォーターバスに浸して約６０分間攪拌することができる。細胞を１５００ｒｐｍでスピンダウンし、第二のプレクリアまたは抗原選別のための細胞の新しいチューブにライブラリーを移すことができる。
【０１４９】
Ｈ：抗原発現細胞に対するライブラリー選別
抗原選別に必要な細胞数を計算する。これは、上で計算された通りのライブラリープレクリア用と同数である。細胞数（Ｘ）は、いくつかの数値、すなわち抗原発現細胞表面における抗原のコピー数（Ｃ）、選別のためのライブラリーサイズ（Ｓ＝モル数×６×１０２３）および標的抗原と結合するライブラリーの画分（Ｆ）から計算される。これは、次式によって概算して、１０倍過剰の標的抗原またはプレクリア能力を可能にする。
Ｘ＝１０×Ｓ×Ｆ／Ｃ
【０１５０】
Ｉ：ライブラリー選別
抗原発現細胞の密度は、血球計算板またはコールターカウンターによって計数することができ、十分な抗原発現細胞を遠心チューブに移すことができる。細胞は、１５００ｒｐｍ、４℃でスピンダウンし、細胞を非常に穏やかに１ｍＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁することができる。細胞懸濁液は、１．７ｍＬねじ蓋付き微量遠心チューブに移すことができる。細胞をピペッティングによって剪断しないよう注意する。細胞を１５００ｒｐｍでスピンダウンしてＰＢＳを除去し、ＰＢＳでもう１回洗浄を繰り返す。精製および／またはプレクリアしたライブラリーを即座に用いて、細胞を穏やかに再懸濁することができる。チューブは氷水のウォーターバスに浸し、２時間回転することができる。１５００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を廃棄する。細胞は１ｍＬのＰＢＳで４回洗浄し、１５００ｒｐｍでスピンダウンして上清を廃棄することができる。細胞は、５００μＬのＰＢＳに再懸濁することができる。必要に応じて、細胞と最後の洗浄液の２０％までを計数する。
【０１５１】
Ｊ：ライブラリーアウトプットの回収
５μＬのＲＮａｓｅＨ（２Ｕ／μＬ）を再懸濁した細胞に加え、３７℃で２０分間温置することができる。この操作はＲＮＡを消化し、細胞表面からｃＤＮＡを遊離させる。細胞を１５００ｒｐｍで３０秒間スピンダウンし、上清を新しいチューブに移すことができる。ここに至って細胞を廃棄することができる。５μＬのＲＮａｓｅＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を上清に加え、３７℃で３０分間温置することができる。この操作は、選別過程において破砕された細胞に由来する可能性のあるあらゆる細胞性ＲＮＡを分解する。分解されたＲＮＡは後に透析によって除去することができ、これによってＰＣＲによるライブラリー増幅への干渉を防ぐことができる。上清に等量のフェノール／ＣＨＣｌ３／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、３０秒間ボルテックスにかける。下層の有機相は、Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ Ｈｅａｖｙ２ｍｌチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において、最高速度で５分間遠心分離することによって上層の水相から分離することができる。上層の水相を新しいチューブに移し、フェノール／ＣＨＣｌ３／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回、ＣＨＣｌ３で１回抽出を繰り返すことができる。ＣＨＣｌ３抽出後の上層の水相は、Ｍｉｎｉ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ、８ｋＤａ ｃｕｔ−ｏｆｆ、２ｍＬ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へと移し、一晩４℃で４リットルのｄＨ２Ｏに対して透析することができる。
【０１５２】
Ｋ：計数およびライブラリー選別回収の計算
ラウンド３から始めて、最後の洗浄液と細胞の１０−２０％を計数する。
選別回収％＝１００×ＣＰＭ全細胞／ＣＰＭ全インプット
【０１５３】
１８．ＲＴ−ＰＣＲによるライブラリーＤＮＡの再増幅
逆転写は、ライブラリーから捕集した材料を用いて行うことができる。本技術分野で公知の試薬およびプロトコールが、逆転写反応の実施に適切である。選別後のビーズ容量に応じて、反応液の容量はスケールアップまたはダウンすることができる。
【０１５４】
逆転写に用いられているプライマーは、抗体ライブラリーの３’末端非可変領域に位置する任意の適切なリバース相補配列となることができ、また続く増幅ＰＣＲに用いられるリバースプライマーと同一またはさらに３’となることができる。
【０１５５】
例示的な逆転写反応液は、ライブラリー選別由来のビーズ（水に懸濁）、リバースプライマーおよびｄＮＴＰを含む。反応液を６５℃で約５分間温置し、氷上で冷却する。次に、通常Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ合成バッファー、約０．１Ｍ ＤＴＴおよびＲＮａｓｅインヒビターを反応液に添加する。逆転写酵素の添加前に、逆転写反応液を約４２℃で２分間温置する。反応液は、時々攪拌しつつ約４２℃で５０分間温置する。次に反応液は９５℃で５分間温置する。続いてビーズを磁石によって収集し、上清を新しいチューブに移し、同一の選別アウトプット由来であればプールする。ビーズを水（ＲＴ容量の半量）に再懸濁し、チューブにおいて９５℃で５分間温置する。磁石を用いてビーズを再度収集し、上清を、前に移しておいた上清と共にプールする。これは選別アウトプットのＰＣＲ増幅のためのｃＤＮＡテンプレートを含む。ＰＣＲ後、１０−□ＬのＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上にロードし、反応が成功したことを確認する。
【０１５６】
１９．ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のためのＰＣＲ
第一および第二ラウンドの選別アウトプットのため、ｃＤＮＡ（ＲＴ反応由来の上清）は８ｋＤａカットオフを用いて水に対して透析することができ、ｃＤＮＡ全量をＰＣＲテンプレートとして用いることができる。後期ラウンドの選別アウトプットのため、通常ｃＤＮＡの１０％をＰＣＲテンプレートとして用いることができ、通常透析は必要とされない。ラウンド１および２のアウトプットのために（全ＲＴ産物を用いて）、反応は１ｍＬのＰＣＲ容量において行うことができるが、一方後期ラウンド由来のアウトプットのために反応容量はスケールダウンすることができる。１００μＬ反応溶液のためのアリコートはマスターミックスから作製するべきである。ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のための例示的なＰＣＲ反応液を下の表７に示す。
【０１５７】
【表５】
【０１５８】
例示的な一実施形態において、ラウンド１および２のアウトプットには１ｍＬのＰＣＲ反応液が用いられ、後期ラウンド由来のアウトプットには０．５ｍＬの反応液が用いられる。１００μＬ反応液のアリコートはマスターミックスから作製するべきである。ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のための例示的なサーマルサイクル条件を下の表８に示す。
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
例示的な一実施形態において、ラウンド１および２のアウトプットには１ｍＬのＰＣＲ反応液が用いられ、後期ラウンド由来のアウトプットには０．５ｍＬ反応液が用いられる。１００−□Ｌ反応液のアリコートはマスターミックスから作製するべきである。ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のための例示的なサーマルサイクル条件を下の表８に示す。
【０１６１】
【表７】
ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のためのサーマルサイクル条件
９５℃ ２分間
９５℃ ２０秒間
５５℃ １０秒間 ２０サイクル＊
７０℃ １５秒間
７０℃ ３０秒間
４℃ 永続的に維持する
＊注記：通常、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いて１８−２０サイクルの増幅を行うことができるが、十分量のライブラリーＤＮＡの増幅には１３サイクルもの回数でも良好に行うことができる。追加的な増幅サイクルによって様々なサイズの非特異的産物がより顕著となる可能性があり、産物はゲル精製が必要となり得る。可能であれば、増幅サイクル数よりもＤＮＡテンプレートインプットの増加が有用となり得る。
【０１６２】
【表８】
【０１６３】
ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物のサイズは例えばアガロースゲル電気泳動によって確認される。産物が正確なサイズ（ｓｃＦｖは、ほぼ８５０ｂｐ、ＶＨまたはＶＬライブラリーは、ほぼ５００ｂｐ）であり、最小限の非特異的産物が存在している場合、産物は一般に、直接次のラウンドの転写反応溶液において、またはスピンカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（商標） ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット）による精製の後に用いることができる。一部のケースにおいて、ＰＣＲ産物はゲル精製を必要とし得る。ゲル精製がＰＣＲ産物に対して行われる場合、残りの全産物を調製的アガロースゲルで分離して、特異的バンドをゲル抽出のために切り出す。ＤＮＡにおける残存ＥｔＢｒはＵＶ吸光度に干渉する傾向があるため、ゲル精製したＤＮＡは定量を誤らせる可能性がある。ゲル抽出におけるより広範な洗浄ステップはこの干渉を低減するのに有用となり得る。ＵＶ走査トレースは純粋なＤＮＡサンプルと残存ＥｔＢｒを有するＤＮＡとの間で非常に異なるため、可能であればＤＮＡ濃度は分光計で測定するべきである。続いてこのプロトコールは繰り返され、複数ラウンドの選別を行う。
【０１６４】
Ａ：ＶＨ ＣＤＲ３スペクトラタイピングＰＣＲ
スペクトラタイピングＰＣＲは、ライブラリーまたはその選別アウトプットにおけるＶＨ ＣＤＲサイズ分布の解析に用いることができる。これは選別の進行と共にライブラリーの多様性を評価するのに有用なツールである。最初の数ラウンドのライブラリー選別アウトプットと選別前のライブラリーは十分に多様でなければならず、ＣＤＲ３サイズ分布はガウス分布に近似する。
【０１６５】
【表９】
スペクトラタイピングＰＣＲの設定
ｃＤＮＡテンプレート ２．０μＬ
ｄＨ２Ｏ １８．１μＬ
５×ＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ反応バッファー ６．０μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．８μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．６μＬ
５’フォワードプライマー（１０μＭ） ０．６μＬ
３’リバースプライマー（１０μＭ） ０．６μＬ
ＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡポリメラーゼ ０．３μＬ
全容量 ３０．０μＬ
【０１６６】
Ｐｒｏｍｅｇａ製ＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼがこの設定に用いられているが、他のソース由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが代用してもよい。最終Ｍｇ２＋濃度は１．５ｍＭである。
サーマルサイクルのプログラム
９４℃ ２分間
９４℃ ２０秒間
５５℃ ２０秒間 ３０サイクル
７２℃ ３０秒間
７２℃ ５分間
４℃ 永続的に維持する
【０１６７】
Ｂ：スペクトラタイピング電気泳動と解析
ＰＣＲ後、１０μＬの産物を２％アガロースゲルにロードし、反応が成功したことを確認することができ、残りの産物は、ＲＯＸ標識ＤＮＡサイズマーカーと共にシーケンサーでスペクトラタイピング電気泳動のための配列決定コアファシリティーに付すことができるが、これは恐らく標識色素が異なるためＤＮＡ産物のサイズを通常３ｂｐ過小評価する。
【０１６８】
増幅ＤＮＡ産物は、次の構成を備える。
５’−ＦＲ３（２７ｂｐ）−ＶＨ ＣＤＲ３−ＦＲ４（３５ｂｐ）−３’
ＶＨ ＣＤＲ３のサイズは、Ｒｏｘ色素サイズマーカーによって決定された見かけ上のＤＮＡ産物のサイズから、次の計算によって推定される。
サイズＶＨ ＣＤＲ３＝（サイズ見かけ上のＤＮＡ産物サイズ−６０）／３
式中、６０＝（６２両末端のフレームワーク−１３’突出＋３ＤＮＡマーカー過小評価）
【０１６９】
１６．例示的な試薬およびバッファーの組成
１０×化学ライゲーションバッファー
Ｔｒｉｓ、ｐＨ７ ２５０ｍＭ
ＮａＣｌ １Ｍ
【０１７０】
【表１０】
【０１７１】
【表１１】
【０１７２】
選別バッファー
リン酸塩ベースバッファー
ＰＢＳ １×
ＢＳＡ １ｍｇ／ｍＬ
サケ精子ＤＮＡ ０．１ｍｇ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０２５％
酵母ｔＲＮＡ（場合による、使用前に添加） ２０ｎｇ／ｍＬ
【０１７３】
代替的なＨＥＰＥＳベースバッファー
ＨＥＰＥＳ ５０ｍＭ
ＮａＣｌ １５０ｍＭ
ＢＳＡ １ｍｇ／ｍＬ
サケ精子ＤＮＡ ０．１ｍｇ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０２５％
酵母ｔＲＮＡ（場合による、使用前に添加） ２０ｎｇ／ｍＬ
【０１７４】
Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３ ２５０ｍＭ
ＫＣｌ ３７５ｍＭ
ＭｇＣｌ２ １５ｍＭ
【０１７５】
５０×ＦＬＡＧストック溶液
ＦＬＡＧペプチド ２５ｍｇ
選別バッファー ５ｍＬ
１ｍＬのアリコートを作製し、−２０℃で保存する。
【０１７６】
ＦＬＡＧ溶出溶液
５０×ＦＬＡＧストック溶液 １ｍＬ
選別バッファー ４９ｍＬ
１ｍＬのアリコートを作製し、−２０℃で保存する。
【０１７７】
オリゴｄＴセルロースの調製
２．５ｇのオリゴｄＴセルロースを５０ｍＬチューブ内で計量する。
２５ｍＬの０．１Ｎ ＮａＯＨを添加し、混合する。
１５００ｒｐｍで３分間スピンダウンし、上清を捨てる。
オリゴｄＴセルロースを２５ｍＬの１×オリゴｄＴ結合バッファーで洗浄する。
１５００ｒｐｍで３分間スピンダウンし、上清を捨てる。
もう３回洗浄を繰り返し、上清のｐＨを測定する。
ｐＨは洗浄バッファーと同じでなければならない（ほぼｐＨ８．５）。
最終容量が２５ｍＬになるよう１×オリゴｄＴ結合バッファーを加えることによってオリゴｄＴセルロースを再懸濁する。これは約５０％スラリーとなることができる。
前洗浄したセルロースビーズを４℃で保存する。
最終濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ＝１ｎｍｏｌ ＲＮＡ結合能力。
【０１７８】
抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースの調製
２５ｍＬのＭ２アガロースビーズを５０ｍＬチューブに移す。
Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機において５分間１０００ｒｐｍでビーズをスピンダウンし、アスピレーションによって上清を除去する。
ビーズを等量の１０ｍＭグリシン、ｐＨ３．５に再懸濁することによって洗浄する。
Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機において５分間１０００ｒｐｍでビーズをスピンダウンし、アスピレーションによって上清を除去する。
１カラム容量の１×ＦＬＡＧ結合バッファーに再懸濁する。
Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機において５分間１０００ｒｐｍでスラリーをスピンダウンし、アスピレーションによって上清を除去する。
洗浄を３回繰り返す。
１カラム容量の１×結合バッファー（１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡと１００ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む）に再懸濁する。
１時間または一晩、４℃で転倒混和する。
必要に応じて２ｍＬ画分のアリコートを作製し、４℃で維持する。
【０１７９】
（実施例１）
機能的ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の証明
４種の公知の抗体を用いて、機能的ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子が提示され、それらそれぞれの抗原と結合できることを証明した。Ｄ２Ｅ７（ヒト抗ｈＴＮＦ）、Ｙ６１（ヒト抗ｈＩＬ−１２）、１７／９（マウス抗−ＨＡ）およびＭＡＫ１９５（マウス抗ｈＴＮＦ）。下の表９に示されているプライマーを用いたプラスミドＤＮＡのＰＣＲによって、ＭＡＫ−１９５ｓｃＦｖを作製した。
【０１８０】
【表１２】
ＮＣＢＩデータベースからダウンロードしたタンパク質配列Ａ３１７９０およびＢ３１７９０に基づく次のプライマー（下の表１０を参照）を用いたＰＣＲによって、抗ＨＡ１７／９ｓｃＦｖ（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｇａｈｍｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４（４）：１０９８−１１８を参照）を作製した。
【０１８１】
【表１３】
【０１８２】
これらｓｃＦｖのＤＮＡコンストラクトは、インビトロで転写され、次にウサギ網状赤血球ライセートによってｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ（タンパク質はピューロマイシン修飾を有するリンカーを介してｍＲＮＡに結合している）として、または遊離ｓｃＦｖ（タンパク質はｍＲＮＡに結合していない）として翻訳された。両方のタイプの分子を精製し、対応するビオチン化抗原によるプルダウンアッセイに付した（図４を参照）。
【０１８３】
図４のデータは、機能的ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ（ビオチン化抗原と結合）は、遊離ｓｃＦｖよりも低い回収率であったがストレプトアビジン−磁気ビーズによってプルダウンできることを示す。さらに別の実験によって、この差が単にｓｃＦｖに繋がった重いＲＮＡによるものであることが示された。ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子におけるＲＮＡ部分をＲＮａｓｅによって分解することにより、ｓｃＦｖの抗原による回収を遊離ｓｃＦｖの回収と同一のレベルにまで回復させた（図５を参照）。
【０１８４】
（実施例２）
翻訳反応を改善するためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化
好ましい一実施形態において、ライブラリーサイズは１×１０１２である。ライブラリーサイズの１２倍をカバーするため、約２０ｐｍｏｌの融合タンパク質（例えば、１．２×１０１３）が選別に必要とされる。ＦＬＡＧ精製に続いて行われる回収は、通常約３０％である。従って、ＦＬＡＧ精製にインプットするため、約６０ｐｍｏｌの融合タンパク質がオリゴｄＴ精製の後に必要とされる。一実施形態において、オリゴｄＴ精製の後、１００ｐｍｏｌのＲＮＡにつき約１．２ｐｍｏｌの融合タンパク質が得られる。この実施形態において、６０ｐｍｏｌの融合タンパク質を得るために約５ｎｍｏｌのＲＮＡ（ライブラリーサイズの３０００倍に及ぶ）が必要とされる。この計算が、融合ｍＲＮＡディスプレイ分子の約２０−３０％だけが機能的である（選別後に回収できる）との観察を考慮に入れていないことに留意。
【０１８５】
ｍＲＮＡディスプレイ法の次のステップに必要とされる前記融合タンパク質量のため、タンパク質の回収を最大化するよう翻訳反応を最適化した。翻訳反応への最初のＲＮＡインプット量の変化をＦＬＡＧ精製の後に評価した。翻訳反応において取り込まれたＳ３５メチオニンの比率を測定することによって、またタンパク質ｐｍｏｌ数（アウトプット）のＲＮＡｐｍｏｌ数（インプット）に対する比率を計算することによってタンパク質回収を評価した。試験したインプットＲＮＡ出発量を、その結果得られたタンパク質回収と共に表１２に示す。この解析で証明されたように、より少量のＲＮＡインプットによって驚くほどさらに高いタンパク質回収率がもたらされる。
【０１８６】
【表１４】
【０１８７】
様々な量の遊離アミノ酸混合物を用いた翻訳反応も行って、タンパク質回収における影響を決定した。試験したアミノ酸混合物の相対的な出発量を、その結果得られたタンパク質回収と共に表１３に示す。各ケースにおけるＲＮＡインプットは５０ｐｍｏｌであった。この解析で証明されたように、アミノ酸プールの増加は翻訳効率を減少させる。
【０１８８】
【表１５】
【０１８９】
様々な量の「非アイソトープ」（すなわち、非放射性）メチオニンの、その翻訳効率における効果も試験した。試験した様々な濃度の非アイソトープメチオニンを、その結果得られたタンパク質回収と共に表１４に示す。各ケースのＲＮＡインプットは５０ｐｍｏｌである。この解析によって証明されたように、非アイソトープメチオニンのインプット増加は翻訳効率の増加を生じない。
【０１９０】
【表１６】
【０１９１】
従って、ｍＲＮＡディスプレイの翻訳反応を計画する場合、ＲＮＡインプットおよびアミノ酸濃度を考慮するべきである。各反応におけるＲＮＡインプットの減少はタンパク質回収を改善できるが、これはライブラリーサイズにも影響を与える。本発明のｍＲＮＡディスプレイ法の実施に有用となり得る例示的なＲＮＡ翻訳反応液を表１５に示す。
【０１９２】
【表１７】
【０１９３】
（実施例３）
ｓｃＦｖ選別のためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化−スペーサー長
ｓｃＦｖタンパク質とｍＲＮＡ末端の間の長いスペーサー長がｓｃＦｖフォールディングおよび機能を改善させることは、以前から提案されていた（Ｈａｎｅｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１０）：４９３７−４２を参照）。従って、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の機能および収量におけるｓｃＦｖとリンカーアニーリング部位との間のスペーサー長の影響を調査した（図６を参照）。短い、中程度のおよび長い３’スペーサーを備える３種類の異なるＤ２Ｅ７ｓｃＦｖコンストラクトと、Ｙ６１および１７／９ｓｃＦｖのための２種類の短いおよび長いスペーサーコンストラクトを作製した（Ｄ２Ｅ７スペーサーコンストラクトは図８を参照）。図７に示されている結果は、より長いスペーサーは、抗原結合に評価されるようなｍＲＮＡ−ｓｃＦＶ分子の機能に測定可能な利点をもたらさないことを示す。さらに、より長いスペーサー長は、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖの収量を顕著に低減させた（図７参照）。より長いスペーサーはＲＮＡ収量も低かった。短いスペーサーは６ｎｍｏｌ ＲＮＡを生じ、中程度のスペーサーは３．４ｎｍｏｌ ＲＮＡを生じ、長いスペーサーは１．７ｎｍｏｌを生じた。従って、一実施形態において、より短いスペーサーがｓｃＦｖライブラリー構築に好ましい。
【０１９４】
３種類の異なるＹ６１コンストラクト（図２３を参照）を用いて異なるスペーサーおよびリンカーの比較も行った。下の表１６に示されている結果は、より長いスペーサーはＲＮＡ収量も低いことを示す。さらに、配列番号１０と配列番号４それぞれに示されている通り、これら２種類のコンストラクトの間でｓｃＦｖタンパク質は同一であるため、ｍＲＮＡそのもの（Ｙ６１−ｓｃＧｅｎｅ３ｐＡ）からｍＲＮＡとｓｃＦｖタンパク質の間のＤＮＡリンカー（Ｙ６１−ｓｃＧｅｎｅ３）へとポリＡテールを移動することによっても、ｍＲＮＡ分子の精製にも抗原結合に違いはなかった。
【０１９５】
【表１８】
【０１９６】
下に示す通り、１７／９は機能的となるために翻訳においてＰＤＩを必要とし、選別前の逆転写反応においてＤＴＴはその抗原結合に影響することが示された。これらの結果が示すように、ジスルフィド結合は１７／９機能に必要であり、このことから１７／９はスペーサー長要求を調べるのに適切な候補となる。図９は、より長いスペーサー長はｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の抗原への結合を改善せず、その収量を低減させることを示す。
【０１９７】
（実施例４）
ｓｃＦｖタンパク質のフォールディングおよび機能を改善するためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化−システイン残基における化学修飾の省略
本技術分野におけるメッセンジャーＲＮＡディスプレイ技術は、シアニル化をもたらす２−ニトロ−５−チオシアナト安息香酸による、またはスルフヒドリル基と共有結合するＮ−エチルマレイミドによる、望ましくないシステインジスルフィド結合の形成を防ぐためのフリーのシステイン残基の化学キャッピング反応を含む。このキャッピング反応は、フリーのシステイン残基のランダム架橋に起因する潜在的なタンパク質誤フォールディングを取り除くが、本発明は、予見できない物理的または化学的特性に起因するその将来的な製造可能性を損なう可能性のある抗体内フリーシステインの人為的な保護を取り除く。ライブラリー選別においてｓｃＦｖのＩｇ領域フォールディングに必要とされる４個のシステインを超えるどの余分のフリーのシステインも活発に保護されないように、化学キャッピングのステップは削除される。
【０１９８】
（実施例５）
ｓｃＦｖタンパク質フォールディングおよび機能を改善するためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化−同時翻訳タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性要求
イソメラーゼかシャペロンのいずれかの活性またはその両方によって、ＰＤＩがより良いタンパク質機能および分泌に寄与することが示唆されてきた（Ｓｈｕｓｔａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（８）：７７３−７；Ｓｍｉｔｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８５（３）：３４０−５０を参照）。２個のＩｇ領域内ジスルフィド結合は全ｓｃＦｖ配列によってコード化されており、一方はＶＨに、他方はＶＬ領域に存在する。同時翻訳タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）活性が、適切なジスルフィド結合のインビトロ形成に重要であることが示唆されてきた（Ｒｙａｂｏｖａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５（１）：７９−８４を参照）。本技術分野におけるｍＲＮＡディスプレイのプロトコールは、翻訳反応液に（ＰＤＩ）を含むことを定める。
【０１９９】
Ｄ２Ｅ７、Ｙ６１および１７／９ｓｃＦｖを用いて、これらのｍＲＮＡディスプレイシステムにおけるＰＤＩ活性要求を試験した。結果は、ｓｃＦｖの内の２種類（Ｄ２Ｅ７および１７／９）が、その生成においてＰＤＩ無しではその同起源の抗原と結合しないのに対し、Ｙ６１は影響を受けない様子であることを示した（図１０を参照）。広範なライブラリーレベルにおいて、高い多様性は、最大限のｓｃＦｖ機能を確実にするためＰＤＩ活性を必要とすることが結論される。
【０２００】
追加的なＰＤＩ添加有りまたは無しで翻訳されたＤ２Ｅ７ｓｃＦｖの回収と機能性も試験した。翻訳反応液は、１チューブのライセート（２００μｌ）、１００ｐｍｏｌ Ｄ２Ｅ７短スペーサーＲＮＡ、ＰＤＩおよびＧＳＳＧ／ＧＳＨを含む。ＰＤＩ無しの翻訳は、ＰＤＩとＧＳＳＧ／ＧＳＨを含まない。翻訳されたタンパク質をＦＬＡＧ精製によって回収し、回収量を定量した。続いて１０００００ｃｐｍ当たり５０ｍＭビオチン化ＴＮＦαおよび等量のインプットを用いて抗原結合／回収を行った。結果を下の表１７に示す。
【０２０１】
【表１９】
【０２０２】
Ｙ６１が機能性のために翻訳においてＰＤＩを必要としないことを示す結果を下の表１８に示す。
【０２０３】
【表２０】
【０２０４】
１７／９が機能性のために翻訳においてＰＤＩを必要とすることを示す結果を下の表１９に示す。
【０２０５】
【表２１】
【０２０６】
（実施例６）
ｓｃＦｖタンパク質フォールディングおよび機能を改善するためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化−反応からジチオスレイトールの除去
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、タンパク質凝集を最小限に抑え、タンパク質の酸化を抑制するよう酵素反応に一般に導入される還元剤である。これはまた、ｍＲＮＡｓｃＦｖ分子のインビトロ翻訳ステップに続く逆転写（ＲＴ）反応に通常用いられる。これを含有することによって、ＰＤＩ活性によって形成されたｓｃＦｖ分子における２個の鎖内ジスルフィド結合を抑制できるため、ＤＴＴのｓｃＦｖ抗原結合機能における潜在的な効果を調査した（図１１参照）。ＤＴＴが存在することによって、ＲＴ後の１７／９ｓｃＦｖの抗原結合活性が顕著に失われ、これは図１１に示されている１７／９機能のＰＤＩ活性依存と矛盾しない。ＲＴからＤＴＴが除かれると１７／９の大部分の抗原結合活性が保存されたため、この抗原結合活性の損失はＲＴ反応それ自身が原因ではない。さらに、結果から、１７／９ｓｃＦｖのｃＤＮＡはＤＴＴ無しでｍＲＮＡから確かに逆転写されたことがＰＣＲによって示され、これはＤＴＴがＲＴ反応に必須でないことを示唆する（データ無し）。
【０２０７】
選別前のＲＴ反応におけるＤＴＴが１７／９機能性に影響を与えることを示す結果は、下の表２０に示されている。しかし、図１２に示されている通り、ＤＴＴはＲＴ過程には影響を与えない。
【０２０８】
【表２２】
【０２０９】
１７／９ｓｃＦｖと対照的に、抗ＩＬ−１２Ｙ６１ｓｃＦｖの機能は、ＤＴＴに影響されなかった（図１１参照）。この結果は、上述のＰＤＩ活性に対して感受性がないことと矛盾なく、あらゆる抗体ｓｃＦｖがジスルフィド結合を機能のために必要とする訳ではないことを示唆する。様々なＲＴ条件をＹ６１−ｓｃＣＬ−短のために検討し、対応する結果を下の表２１に、また図１３にも示す。
【０２１０】
【表２３】
【０２１１】
一実施形態において、ＤＴＴはＲＴに含まれない、あるいはＲＴは抗原選別後まで延期してｍＲＮＡ−ｓｃＦｖライブラリーから得られる機能的ｓｃＦｖ収量の生産を最大化する。下の表２２および２３は、Ｙ６１−ＳｃＣＬ−長およびＹ６１−ＳｃＣＬ−短それぞれにおける抗原選別ステップ後までＲＴステップを延期させた結果を示す。
【０２１２】
【表２４】
【０２１３】
【表２５】
【０２１４】
（実施例７）
ｓｃＦｖタンパク質フォールディングおよび機能を改善するためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化−抗原選別におけるＲＮａｓｅインヒビターの含有
ＲＴによる二本鎖ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡの形成は、抗原結合のためのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を準備し、ＲＮＡ分解を防止してＲＮＡ二次構造を抑制すると考えられる。抗原による選別の後、ｃＤＮＡはｍＲＮＡのアルカリ加水分解によって回収することができ、ＰＣＲの増幅テンプレートとなる。抗原選別前のＲＴにおけるＤＴＴのｓｃＦｖ機能に対する潜在的な影響を避けるため、選別後の増幅のためのｍＲＮＡを保護するために代替法を用いることが必要とされる。
【０２１５】
従って、ｍＲＮＡ−ＶＨ分子におけるその保護的ｃＤＮＡ鎖を欠くｍＲＮＡが、十分に安定的で、抗原選別後のＲＴ−ＰＣＲによる増幅に接近可能であるかどうか調査した。前に確認したＩＬ−１α結合ｍＲＮＡ−ＶＨ分子をモデル分子として用いた。抗原選別前または後にＲＴが行われた場合のＰｈｙｌｏｓ４０ＶＨ配列の回収を比較した（図１４参照）。本技術分野における方法（選別前ＲＴおよびｃＤＮＡのアルカリ溶出、左レーン）と比較したところ、ｍＲＮＡ−ＩＬ−１α複合体をＳＡ磁気ビーズに捕集して直接ＲＴに用いた場合（右レーン）、抗原選別後のＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの回収は顕著に抑制されたと考えられる。これは抗原選別における部分的なＲＮＡ分解、またはビーズ上のｍＲＮＡへＲＴのために接近しづらいことに起因する可能性がある。ＩＬ−１α−Ｐｈｙｌｏｓ４０ＶＨ相互作用を阻害し、ｍＲＮＡ接近可能性をより良くするための酸溶出（ｐＨ３）によってＳＡビーズからｍＲＮＡ−ＶＨ分子を解離する試みは、恐らくｍＲＮＡ安定性の低下、またはＳＡビーズと複合体を除去する前にｍＲＮＡ−ＶＨ分子がその抗原から溶出バッファーに解離しにくいため、その回収を悪化させると思われる。図１４は、酸溶出を用いたオリゴＤＴ後に続いてＲＴ−ＰＣＲが行われる標準的なＲＴ−ＰＣＲ法と、捕集後のビーズから直接行ったＲＴ−ＰＣＲを比較する、抗原選別後の逆転写の結果を示す。非結合ビーズで１：１０、１：１００および１：１０００希釈することによって、１：１０００希釈において強い再増幅が達成されたことが示された。
【０２１６】
抗原選別前のＲＴを省略し、その後ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡを回収することが可能なため、コンタミネートしたＲＮａｓｅ活性からＲＮＡをＲＮａｓｅインヒビターで保護することによって、減少したｍＲＮＡテンプレートの回収を回復または増強することができるか調査した。抗原選別ステップにおいてＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃１０７７７−０１９）を１：２０希釈で含有させ、続いてＲＴ−ＰＣＲを行ってｍＲＮＡ回収を比較した（図１５参照）。抗原選別前のＲＴと比較すると、ＲＴを抗原選別後にＲＮａｓｅインヒビター無しで行った場合、ｍＲＮＡテンプレートの再度の回収は減少する。興味深いことに、抗原選別におけるＲＮａｓｅインヒビターの含有は、ｍＲＮＡ回収を回復させるだけでなく顕著に増強する。従って、この増強は少なくとも部分的により軽いほぼ２８０ｋＤａのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の、追加的なｃＤＮＡを有するより重いほぼ５６０ｋＤａｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子より高い捕集効率に起因すると思われる。
【０２１７】
ＲＮａｓｅＯＵＴの含有はまた、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を用いても試験した。図１６は、ＲＮａｓｅＯＵＴ有りまたは無しにおいてＹ６１−ＣＬ−長とＹ６１−ＣＬ−短を比較するよう行われた実験を表す。結果は図１７と共に下の表２４に見出すことができる。
【０２１８】
【表２６】
【０２１９】
（実施例８）
１７／９ｓｃＦｖのライブラリー選別
本明細書に記載されているｍＲＮＡディスプレイ法を用いた数ラウンドの選別によってｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を濃縮できることを証明するため、重複ＰＣＲによって２５の多様性を有するｓｃＦｖライブラリーを構築した。ｓｃＦｖライブラリーを作製するため、１７／９、Ｄ２Ｅ７、２ＳＤ４、Ｙ６１およびＭＡＫ１９５の等量のＶＨおよびＶＬ断片を混合し、２５の最大多様性を有するｓｃＦｖライブラリーに合わせ、上述の通りに用いた。次にこのライブラリーからビオチン化ＨＡタグペプチドによって１７／９ｓｃＦｖを選別した。選別後、クローニングおよびコロニーＰＣＲによって１７／９の濃縮を検査した。１ラウンドのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ選別の前と後で１７／９ｓｃＦｖを定量した結果を、図１８に示す。１ラウンドのＨＡペプチドに対する選別の後、選別アウトプットから回収された全ｓｃＦｖ配列は、１７／９ｓｃＦｖの配列であった。
【０２２０】
（実施例９）
ｍＲＮＡディスプレイ技術は、異なる親和性を有するｓｃＦｖバインダーを識別するために用いることができる
ｍＲＮＡディスプレイ技術、すなわち上述の技術が、異なる親和性を有するｓｃＦｖバインダーを識別するために用いることができるか決定するため、Ｄ２Ｅ７と２ＳＤ４のキメラを作製した。２ＳＤ４は、ＴＮＦαに対して低い親和性（遊離タンパク質としてＫＤほぼ２００ｎＭ）を示す、Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの前駆体である。図１９はキメラを示す。
【０２２１】
遊離タンパク質に対して滴定を行った。図２０ａは異なるキメラの間の抗原結合後の回収率を示すが、一方図２０ｂは抗原選別後の正規化回収率を表す。上述の結果から、本明細書に記載されているｍＲＮＡディスプレイ技術は、異なる親和性を有するバインダーを識別するために用いることができることが示される。
【０２２２】
（実施例１０）
ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の耐熱性
ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の耐熱性を決定するため、本明細書に記載されているようにＤ２Ｅ７−ｓｃＣｋおよびＹ６１−ｓｃＣｋを翻訳して、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖフォーマットに精製した。次に、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を抗原選別前に様々な温度で３０分間温置した。抗原選別後の正規化回収率を図２１に示す。
【０２２３】
図２２は、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の高温処理後にＲＮＡを回収できることを示す。そこで、回収されたＹ６１−ｓｃＣｌのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を有するビーズにおいてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０２２４】
参照による援用
本願を通じて引用されている可能性のあるあらゆる引用文献（参考文献、特許、特許出願およびウエブサイト）の内容は、そこに引用されている参考文献のように、いかなる目的においてもこれによりその内容全体が参照によって本明細書に特に組み込まれている。本発明の実施において、他に断りがない限り、本技術分野においてよく知られている従来の細胞培養と分子生物学の技法が用いられている。
【０２２５】
均等
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態に具体化することができる。従って上述の実施形態は、本明細書の記載に本発明を限定するものではなくむしろ説明のためのものであることをあらゆる点で考慮するべきである。従って本発明の範囲は、上述の説明によってではなくむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、従って特許請求の範囲における均等の意義および範囲内のあらゆる変更を本明細書に包含することを目的とする。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、これによりその内容が参照によって本明細書に組み込まれている、２００８年９月３０日に出願された米国仮出願第６１／１０１４７１号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、ＲＮＡディスプレイに関し、特に可溶性および細胞表面抗原の選別を可能にするＲＮＡディスプレイ法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ほぼどのような構造的エピトープでもそれと高い特異性および親和性で結合し、リサーチツールとして、またＦＤＡに認可された治療薬として日常的に使用される抗体を選別することができる。その結果、治療用および診断用モノクローナル抗体は、世界中で数十億ドル規模のマーケットを構成している。
【０００４】
動物を免疫して抗体を得る古典的手法は、時間がかかり煩雑である。その結果、合成抗体ライブラリーを用いた、所望の標的分子に対する抗体をエキソビボ選別するための方法が開発された。一部の方法において、抗体またはその断片のライブラリーは生物（例えば、バクテリオファージ、ウイルス、酵母細胞、細菌細胞または哺乳類細胞）表面に提示され、生物は所望の抗体の発現を有するものが選別される。他の方法において、抗体ライブラリーは無細胞インビトロシステムにおいて発現、選別される。ＲＮＡディスプレイと呼ばれるこのようなシステムの一型において、発現されたタンパク質またはペプチドは、共有結合または緊密な非共有結合的相互作用によってそのコード化ｍＲＮＡと結合してＲＮＡ／タンパク質融合分子を形成する。ＲＮＡ／タンパク質融合体のタンパク質またはペプチド成分は、所望の標的との結合および結合しているコード化ｍＲＮＡ成分の配列決定によって決定されたタンパク質またはペプチドの同一性について選別され得る。
【０００５】
現在のインビトロＲＮＡディスプレイシステムは、単一の抗体可変領域の発現に優れているが、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）分子等、多ドメイン抗体の発現には非効率的である。これは主に現在のインビトロ発現システムの反応条件と、ＰＣＲによる増幅の繰り返しによってライブラリーからｓｃＦｖのｃＤＮＡ全長が失われ易いことに起因する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本技術分野における、所望の標的に対するｓｃＦｖ抗体選別のための改良インビトロディスプレイ法の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、発現ライブラリーからｓｃＦｖ分子の確実な発現および選別を可能にする、インビトロＲＮＡディスプレイの改良法を提供することによって上述の課題を解決する。本発明の方法は、ｓｃＦｖ分子の発現および選別に特に適しているが、可溶性および細胞表面抗原の両方を含むあらゆるクラスのタンパク質のインビトロディスプレイにも都合が良い。
【０００８】
従って、本発明は、前に記載された方法よりも簡便で実施にかかる時間が短い改良インビトロＲＮＡディスプレイ法の提供を含むが、それに限定されない、いくつかの利点を有する。さらに、本発明の方法は、鎖内ジスルフィド結合を含有するタンパク質、例えばｓｃＦｖ抗体分子の増強された機能的発現を可能にする。
【０００９】
本発明は、その一態様において、（ａ）ピューロマイシンまたはそのアナログを３’末端に、ソラレンＣ６を５’末端に有する一本鎖核酸リンカーと架橋し、５’ｓｃＦｖおよび３’スペーサー配列をコードするｍＲＮＡを含む、ピューロマイシンまたはそのアナログと架橋したｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子を提供するステップ、（ｂ）標識の存在下、ＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）／ＧＳＨ（還元型グルタチオン）およびＰＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）の存在下ならびにジチオスレイトールの不在下、標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子が形成されるような条件下でピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡをインビトロ翻訳するステップ、（ｃ）標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を精製するステップ、（ｄ）精製された標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を少なくとも１種類の抗原を用いた抗原選別に付すステップおよび（ｅ）精製された標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を、親和性に基づいた磁気ビーズを用いて回収するステップを含む、ｓｃＦｖ抗体ＲＮＡディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。
【００１０】
一実施形態において、本方法は、（ｇ）抗原選別の後、ｓｃＦｖ ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製するステップをさらに含む。別の一実施形態において、本方法は、（ｈ）ｃＤＮＡを増幅するステップをさらに含む。
【００１１】
一実施形態において、標識は、例えば３５Ｓメチオニンまたはシステイン等、放射性標識である。
【００１２】
一実施形態において、３’スペーサー配列は、約０−約２００アミノ酸、例えば約１６アミノ酸を含む、および／または３’スペーサーはアフィニティータグを含む。
【００１３】
一実施形態において、リンカーは、５’から３’へと、ソラレンＣ６、配列ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ（配列番号２０）を含む２’ＯＭｅリボヌクレオチド、６個のトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０部分、２個のシチジン残基、およびピューロマイシンを含む。
【００１４】
一実施形態において、ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子は、ＵＶＡによってＤＮＡリンカーと光架橋される。別の一実施形態において、ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子は、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択された５’プロモーターを含む。特別な一実施形態において、ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子は、タバコモザイクウイルス５’非翻訳領域を含む。
【００１５】
一実施形態において、標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子は、オリゴｄＴクロマトグラフィーによって精製される。別の一実施形態において、標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体アガロースビーズを用いて精製される。さらに別の一実施形態において、標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子は、オリゴｄＴクロマトグラフィーおよび抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体アガロースビーズによって精製される。
【００１６】
一実施形態において、抗原は、ビオチン化ペプチド、タンパク質またはハプテンである。別の一実施形態において、抗原は、ヒト免疫グロブリン結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）またはマウス免疫グロブリン結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）との融合タンパク質、さもなければ抗原は細胞集団である。特定の一実施形態において、本発明に係る抗体は、抗ＩＬ−１２抗体、抗赤血球凝集素（抗ＨＡ）抗体、マウス抗体またはヒト抗体である。
【００１７】
一実施形態において、ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳は、ＧＳＳＨ／ＧＳＨの存在下で行われる。
【００１８】
一実施形態において、本方法は、ｍＲＮＡキャッピングステップを含まない。別の一実施形態において、本方法は、精製ステップの前にインビトロ逆転写ステップを含まない。さらに別の一実施形態において、ステップ（ａ）から（ｇ）の内いずれかの前、間または後にＲＮａｓｅインヒビターが添加される。一実施形態において、精製ステップは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）不在下におけるｃＤＮＡ作製のためのｍＲＮＡ逆転写を含む。
【００１９】
特定の実施形態において、ｃＤＮＡは、約ｐＨ＝８．０−約ｐＨ＝１０．０のアルカリ加水分解によって溶出される。あるいは、ｃＤＮＡは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを変性するのに十分な熱によって、約ｐＨ＝３．０−約ｐＨ＝６．０の酸によって、またはＲＮａｓｅＨ消化によって溶出される。
【００２０】
一実施形態において、ｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。一実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、またはＰｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉおよびＫＯＤからなる群から選択されたＤＮＡポリメラーゼを用いる。
【００２１】
別の一実施形態において、ビーズはストレプトアビジン−Ｍ２８０、ニュートラアビジン−Ｍ２８０、ＳＡ−Ｍ２７０、ＮＡ−Ｍ２７０、ＳＡ−ＭｙＯｎｅ、ＮＡ−ＭｙＯｎｅ、ＳＡ−アガロースおよびＮＡ−アガロースからなる群から選択される。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な説明と特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一部の実施形態におけるｍＲＮＡ−ｓｃＦｖディスプレイ技術の概略図を示す図である。
【図２】本発明の他の実施形態におけるｍＲＮＡ−ｓｃＦｖディスプレイ技術の概略図を示す図である。
【図３】ライブラリーＤＮＡコンストラクトの概要描写を示す図である。
【図４ａ】機能的ｓｃＦｖがｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子として生じ得ることを表す結果を示す図である。
【図４ｂ】遊離ｓｃＦｖ分子とｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子のモデルを示す図である。
【図５】ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子フォーマットにおいて結合しているｓｃＦｖが遊離ｓｃＦｖ分子と機能的に同等であることを表す結果を示す図である。
【図６】異なる３’スペーサー長を備える３種類のＤ２Ｅ７ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖコンストラクトを示す図である。
【図７】より短いスペーサー長が、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖの抗原への結合およびｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ抗体分子の収量を改善したことを表す結果を示す図である。
【図８】Ｄ２Ｅ７の短い、中程度および長いＣｋ３’スペーサー長の配列（記載順にそれぞれ配列番号４２−４４）を表す図である。
【図９ａ】短いおよび長いスペーサー長を備える１７／９ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖコンストラクトを示す図である。
【図９ｂ】より短いスペーサー長が１７／９ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の標的抗原への結合およびｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ抗体分子の収量を改善したことを表す結果を示す図である。
【図１０】ＰＤＩ活性がｓｃＦｖ機能の一部に必要であったことを表す結果を示す図である。
【図１１】逆転写におけるＤＴＴの存在が１７／９ｓｃＦｖの赤血球凝集素（ＨＡ）抗原への結合を阻害したことを表す結果を示す図である。
【図１２】ＤＴＴが逆転写過程を有意に変化させなかったことを表すアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１３】選別前と後の両方におけるＤＴＴおよびＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）有りまたは無しの異なるＲＴ条件から得られたアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１４】選別前ＲＴおよびｃＤＮＡアルカリ溶出（左レーン）と比較した、選別前または後のいずれかに逆転写した場合のＰｈｙｌｏｓ４０ＶＨ配列の回収を表すアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１５】ＲＮａｓｅインヒビターが、抗原選別後の逆転写によるＲＮＡテンプレート回収を保存したことを表すアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１６】ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）の存在下または不在下におけるＣＬ長およびＣＬ短スペーサーの並列比較の結果を示す図である。
【図１７】ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）の存在下または不在下におけるＣＬ長およびＣＬ短スペーサー回収の並列比較を表すアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１８】１ラウンドのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ選別の前と後における１７／９ｓｃＦｖを定量化するアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図１９】Ｄ２Ｅ７と２ＳＤ４との間のキメラの概要描写を示す図である。
【図２０ａ】ｍＲＮＡディスプレイ技術が異なる親和性のバインダーの識別に用いられ得ることを表す、異なるキメラ間の抗原結合後の回収率を示す図である。
【図２０ｂ】ｍＲＮＡディスプレイ技術が異なる親和性のバインダーの識別に用いられ得ることを表す、抗原選別後の正規化回収率を示す図である。
【図２１】ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の耐熱性を示す図である。
【図２２】ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の高温処理後にＲＮＡが回収され得ることを表すアガロースゲル電気泳動結果を示す図である。
【図２３】短いおよび長いスペーサー長を備えるｍＲＮＡ−ｓｃＦｖＹ６１コンストラクトならびにｍＲＮＡとｓｃＦｖタンパク質の間のＤＮＡリンカーにポリＡテールを備えるＰＦ−ｙ６１ｓｃＧｅｎｅ３コンストラクトを示す図である。
【図２４】本発明の他の実施形態におけるｍＲＮＡ−ｓｃＦｖディスプレイ技術の概略図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な記述）
配列番号
本明細書に参照されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、次の配列番号を付与されている。
配列番号１−ＭＡＫ１９５ｓｃＦｖタンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号２−Ｙ６１ｓｃＦｖ短タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号３−Ｙ６１ｓｃＦｖ長タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号４−Ｙ６１ｓｃＦｖ Ｇｅｎｅ３タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号５−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ短タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号６−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ中タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号７−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ長タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号８−１７／９ｓｃＦｖ短タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号９−１７／９ｓｃＦｖ長タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号１０−ＭＡＫ１９５ｓｃＦｖヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１１−Ｙ６１ｓｃＦｖ短ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１２−Ｙ６１ｓｃＦｖ長ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１３−Ｙ６１ｓｃＦｖ Ｇｅｎｅ３ＰＡヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１４−Ｙ６１ｓｃＦｖ Ｇｅｎｅ３ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１５−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ短ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１６−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ中ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１７−Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖ長ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１８−１７／９ｓｃＦｖ短ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号１９−１７／９ｓｃＦｖ長ヌクレオチド配列の核酸配列。
【００２５】
本発明をより容易に理解できるように、特定の用語を先ず定義する。
【００２６】
Ｉ．定義
用語「抗体」は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体等）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マウス抗体およびそれらの断片、例えば、抗体Ｌ鎖（ＶＬ）、抗体Ｈ鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単領域抗体フラグメント（ｄＡｂ）を含む。
【００２７】
用語「抗体ライブラリー」は、抗体またはその断片をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する複数のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。これはまた、前記ＤＮＡまたはＲＮＡ分子から発現した複数の抗体タンパク質および核酸／抗体融合分子も含む。
【００２８】
用語「Ｈ鎖可変領域」は、抗体Ｈ鎖可変領域をコードする核酸および該核酸のタンパク質産物を意味する。
【００２９】
用語「Ｌ鎖可変領域」は、抗体Ｌ鎖可変領域をコードする核酸および該核酸のタンパク質産物を意味する。
【００３０】
用語「エピトープタグ」は、抗体によって特異的に認識される短いアミノ酸配列であって、分子に化学的または遺伝学的に結合して、前記抗体によるその検出を可能にするアミノ酸配列、例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＭｙｃタグまたはＴ７タグを意味する。
【００３１】
用語「非抗体配列」は、本発明の抗体ライブラリーに出現する、本来の抗体配列の一部ではない任意の核酸またはアミノ酸配列を意味する。このような配列は、例えばエピトープタグを含む。
【００３２】
用語「調節配列」は、特定の宿主生物またはインビトロ発現システムにおける、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列または遺伝要素を意味する。このような配列は、本技術分野においてよく知られている。原核生物に適した調節配列は、例えばプロモーター、場合によってオペレーター配列、そしてリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。例えば、核酸は、別の核酸配列と機能的な関係になるよう配置されている場合「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に作用する場合コード配列に作動可能に連結されており、またリボソーム結合部位は、転写を促進できるよう配置されている場合コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」は、連結されたＤＮＡ配列同士が隣接していることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも隣接している必要はない。
【００３３】
用語「特異的結合」または「と特異的に結合する」は、少なくとも１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ以下の親和性で標的と結合する、および／またはその非特異的抗原との親和性より少なくとも２倍強い親和性で標的と結合する、結合分子の能力を意味する。
【００３４】
用語「標的」は、抗体によって認識される抗原またはエピトープを意味する。標的は、任意のペプチド、タンパク質、糖類、核酸またはそれに対して特異抗体を作製できる小分子等、他の分子を含む。一実施形態において、抗体は、ヒトタンパク質、例えばＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＬ１８、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βに対するものである。
【００３５】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、本技術分野において定義されている。
【００３６】
用語「ＲＮＡディスプレイ」または「ｍＲＮＡディスプレイ」は、発現したタンパク質またはペプチドがそのコード化ｍＲＮＡと共有結合してまたは緊密な非共有結合的相互作用によって、「ＲＮＡ／タンパク質融合」分子を形成するインビトロ技術を意味する。ＲＮＡ／タンパク質融合体におけるタンパク質またはペプチド成分は、所望の標的との結合および結合しているコード化ｍＲＮＡ成分の配列決定によって決定されたタンパク質またはペプチドの同一性について選別され得る。このような方法は、本技術分野においてよく知られており、例えば、その内容全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，１９５，８８０号、６，９５１，７２５号、７，０７８，１９７号、７，０２２，４７９号、６，５１８，０１８号、７，１２５，６６９号、６，８４６，６５５号、６，２８１，３４４号、６，２０７，４４６号、６，２１４，５５３号、６，２５８，５５８号、６，２６１，８０４号、６，４２９，３００号、６，４８９，１１６号、６，４３６，６６５号、６，５３７，７４９号、６，６０２，６８５号、６，６２３，９２６号、６，４１６，９５０号、６，６６０，４７３号、６，３１２，９２７号、５，９２２，５４５号および６，３４８，３１５号に記載されている。
【００３７】
用語「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」は、ＶＬおよびＶＨ領域が組み合わされて一価分子を形成しそれらが単一のタンパク質鎖として生成されることを可能にする合成リンカーによる、組換え法を用いて接続されたＬ鎖可変領域の抗原結合部分とＨ鎖可変領域の抗原結合部分を意味する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ８５：５８７９−５８８３を参照）。
【００３８】
用語「機能性部分」は、それが結合した分子に追加的な機能性を付与する任意の生物学的または化学的物質を意味する。
【００３９】
用語「選別」は、ある分子を集団内の他の分子から実質的に区分化することを意味する。本明細書において、「選別」ステップは、選別ステップの後に集団における望ましくない分子に対する所望の分子の、少なくとも２倍、好ましくは３０倍、さらに好ましくは１００倍、最も好ましくは１０００倍濃縮を提供する。本明細書に示されているように、選別ステップは任意の回数繰り返すことができ、また異なる種類の選別ステップを特定のアプローチと組み合わせることもできる。
【００４０】
用語「休止配列」は、リボソームの翻訳速度を減速または停止させる核酸配列を意味する。
【００４１】
用語「固体支持体」は、アフィニティー複合体が直接的または間接的（例えば、他の抗体やプロテインＡ等、他の結合パートナーの介在によって）のいずれかで結合することのできる、またはアフィニティー複合体を包埋できる（例えば、レセプターまたはチャネルによって）、任意のカラム（またはカラム材料）、ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子（例えば、アガロースまたはセファロース）、マイクロチップ（例えば、シリコン、シリコンガラスまたはゴールドチップ）または膜（例えば、リポソームや小胞の膜）を意味するが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
用語「リンカー領域」は、ｓｃＦｖ抗体遺伝子における抗体ＶＨおよびＶＬ領域をコード化する核酸配列を接続する核酸領域を意味する。リンカー領域は、ＶＨ、ＶＬおよびリンカー領域を含む連続的なオープンリーディングフレームが形成されるように、抗体ＶＨおよびＶＬをコード化する核酸配列とフレーム内に存在する。この用語はまた、ｓｃＦｖタンパク質においてＶＨとＶＬを接続する領域も意味する。
【００４３】
用語「ペプチドアクセプター」は、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ機能の触媒活性によって、成長中のタンパク質鎖のＣ末端に付加され得る任意の分子を意味する。通常、このような分子は、（ｉ）ヌクレオチドまたはヌクレオチド様部分（例えば、ピューロマイシンおよびそのアナログ）、（ｉｉ）アミノ酸またはアミノ酸様部分（例えば、２０種類のＤ−もしくはＬ−アミノ酸の内のいずれかまたはその任意のアミノ酸アナログ（例えば、Ｏ−メチルチロシンまたはＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１、１９９１によって記載されたアナログの内のいずれか））および（ｉｉｉ）両者の間の結合（例えば、３’位置、より好ましくないが２’位置におけるエステル、アミドまたはケトン結合）を含むが、この結合は好ましくは天然のリボヌクレオチド構造由来の環状構造を顕著に乱さない。さらにこの用語は、タンパク質コード配列に（核酸配列に介在することによって直接的または間接的に）共有結合したペプチドアクセプター分子と共に、一部の非共有結合的手段、例えばタンパク質コード配列の３’末端に、またはその近傍に結合する第二の核酸配列を用いたハイブリダイゼーションによってタンパク質コード配列と接続した分子や、それ自身がペプチドアクセプター分子と結合する分子を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
ＩＩ．概観
本発明は、発現ライブラリーからｓｃＦｖ抗体分子の確実な発現および選別を可能にするインビトロＲＮＡディスプレイの改良法を特徴とする。
【００４５】
ＲＮＡディスプレイ法は、発現したタンパク質またはペプチドが共有結合または緊密な非共有結合的相互作用によってそのコード化ｍＲＮＡと結合してＲＮＡ／タンパク質融合分子を形成する、タンパク質またはペプチドライブラリーの発現を一般に含む。ＲＮＡ／タンパク質融合体におけるタンパク質またはペプチド成分は、所望の標的との結合および結合しているコード化ｍＲＮＡ成分の配列決定によって決定されるタンパク質またはペプチドの同一性に対して選別され得る。現在のＲＮＡディスプレイ法は、ｓｃＦｖ鎖内ジスルフィド結合の形成、従ってｓｃＦｖ抗体分子の正確なフォールディングを抑制する還元条件下でそのステップのいくつかが行われるため、ｓｃＦｖ抗体発現に対して最適ではない。現在の方法は、追加的にＶＨまたはＶＬ抗体断片のいずれかを選別プロセスにおいて利用する。
【００４６】
本発明は、ｓｃＦｖ鎖内ジスルフィド結合、従ってｓｃＦｖ抗体分子の正確なフォールディングに有利に働く、弱還元条件下でインビトロＲＮＡディスプレイアッセイを行うことによって、この技術上の課題を解決する。単一の可変領域（例えば、単一のＨ鎖可変（ＶＨ）領域）ではなくむしろｓｃＦｖフォーマットを用いることはまた、選別されたＶＨ領域を完全ＩｇＧ抗体に変換するのに必要な、適合するＬ鎖可変（ＶＬ）領域を同定する必要もなくす。従って、本発明の方法は、ｓｃＦｖ抗体分子の発現および選別に特に適しているが、あらゆるクラスのタンパク質のインビトロＲＮＡディスプレイにも都合が良い。
【００４７】
本発明の方法はまた、ＲＮＡディスプレイ実施のためのより短く、より簡便なプロトコールも提供する。これは、標的で選別する前にＲＮＡ−タンパク質融合体におけるｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する、時間のかかるステップを避けることにより部分的に達成される。
【００４８】
ＩＩＩ．改良インビトロＲＮＡディスプレイスクリーニング法
本発明はその一態様において、改良インビトロＲＮＡディスプレイスクリーニング法を特徴とする。概要方法は、次の通りである。
【００４９】
１）ＲＮＡ／タンパク質融合体の形成
１種類以上のインビトロ抗体ＤＮＡ発現ライブラリーが転写され、ｍＲＮＡを生成する。どのようなインビトロ抗体発現ライブラリー（例えば、ＶＨ、ＶＬまたはｓｃＦｖライブラリー）も適切であるが、本発明の方法はｓｃＦｖライブラリーに特によく適している。技術分野で認識されているどの転写方法も適切である。ＲＮＡ転写後、ＤＮＡライブラリーテンプレートは除去される。この操作は、技術分野で認識されている任意の方法、例えばＤＮａｓｅＩによる消化を用いて行うことができる。
【００５０】
ＤＮＡ除去後、ペプチドアクセプターがライブラリーｍＲＮＡの３’末端に結合される。この操作は、技術分野で認識されている任意の方法を用いて行うことができる。一実施形態において、５’（ソラレンＣ６）２’ＯＭｅ（ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ）ＸＸＸＸＸＸＣＣ（ピューロマイシン）３’（配列番号２０）、（式中、ＸはトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０であり、ＣＣは標準的なＤＮＡ骨格である）を含むリンカーが用いられる。リンカーは先ず、相補的塩基対合によってライブラリーｍＲＮＡの３’末端に結合される。続いてリンカーは、ソラレンＣ６分子のＵＶ活性化によってｍＲＮＡと架橋される。
【００５１】
ペプチドアクセプターの付加後、続いてライブラリーｍＲＮＡはインビトロシステムにおいて翻訳される。技術分野で認識されている任意のインビトロ翻訳方法、例えばウサギ網状赤血球ライセート法が適切である。なお、ｓｃＦｖ分子において適切な鎖内ジスルフィド結合を形成させるため、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）がインビトロ翻訳反応に添加されるおよび／または弱酸化条件下で反応が行われる。一実施形態において、弱い酸化剤（例えば、ＧＳＳＧ／ＧＳＨ、例えば、１００ｍＭ ＧＳＳＧ／１０ｍＭ ＧＳＨ）がインビトロ翻訳反応に添加される。別の一実施形態において、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））がインビトロ翻訳反応から取り除かれる。
【００５２】
１種類以上の標識アミノ酸またはその誘導体が、標識アミノ酸がその結果生じる抗体に取り込まれるようにインビトロ翻訳システムに添加されてよい。技術分野で認識されている任意の標識アミノ酸、例えば放射性標識アミノ酸、例えば３５Ｓ標識メチオニンまたはシステインが企図される。
【００５３】
インビトロ翻訳反応において、ｍＲＮＡ分子は、３’末端に融合したペプチドアクセプター（例えば、ピューロマイシン）を介してそのタンパク質産物と共有結合するようになる。このＲＮＡ／タンパク質融合分子は、インビトロ翻訳反応混合液から精製される。反応混合液からＲＮＡ／タンパク質融合分子を分離する、技術分野で認識されている任意の方法が企図される。一実施形態において、ＲＮＡ／タンパク質融合タンパク質は、ポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）レジンを用いたクロマトグラフィーによって分離される。別の一実施形態において、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質は、ＲＮＡ／タンパク質融合タンパク質の抗体成分に存在するエピトープに特異的な抗体への結合によって分離される。エピトープは、アミノ酸配列タグ、例えばＲＮＡ−抗体融合タンパク質の抗体成分のアミノ酸配列の、例えばＮ末端、Ｃ末端または可変領域間リンカーに取り込まれたＦＬＡＧまたはＨＡタグとなることができる。
【００５４】
本発明のＲＮＡ／タンパク質融合体は、裸のＲＮＡの使用を含む。好ましい一実施形態において、ＲＮＡ／タンパク質融合体と接触するあらゆる試薬は、ＲＮａｓｅインヒビター試薬、例えばＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）、酵母ｔＲＮＡ、ＳＵＰＥＲａｓｅＩｎ（商標）、ＲＮａｓｉｎ（登録商標）その他の本技術分野で公知のＲＮａｓｅインヒビターで処理される。
【００５５】
２）所望の標的に対する抗体のスクリーニング
ＲＮＡ／タンパク質融合体のライブラリーは、所望の標的とのインビトロ結合に対してスクリーニングされる。一般に、標的分子は、固体支持体、例えばアガロースビーズに結合する。一実施形態において、標的分子は固体基質と直接結合する。別の一実施形態において、標的分子は先ず修飾、例えばビオチン化され、続いて修飾標的分子は修飾を介して固体基質、例えばストレプトアビジン−Ｍ２８０、ニュートラアビジン−Ｍ２８０、ＳＡ−Ｍ２７０、ＮＡ−Ｍ２７０、ＳＡ−ＭｙＯｎｅ、ＮＡ−ＭｙＯｎｅ、ＳＡ−アガロースおよびＮＡ−アガロースと結合する。他の実施形態において、固体支持体は、磁気ビーズ、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓをさらに含む。このような磁気ビーズによって、固体支持体とそれに結合した任意のＲＮＡ／抗体融合体をアッセイ混合液から磁石を用いて分離できる。
【００５６】
ＲＮＡ／タンパク質融合体の結合の後、固体支持体は１回以上洗浄されて非結合ＲＮＡ／タンパク質融合体を除去し、次にＲＮＡが増幅される。一実施形態において、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡが増幅されてより多くのｍＲＮＡを産生する。技術分野で認識されている任意のＲＮＡ複製方法、例えばＲＮＡレプリカーゼ酵素を用いた方法が企図される。別の一実施形態において、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡは、ＰＣＲで増幅される前にｃＤＮＡに転写されてもよい。ＰＣＲ増幅プールは１ラウンド以上のスクリーニングに付されて、最も高い親和性の抗体を濃縮してもよい。
【００５７】
さらに、またはあるいは、ＲＮＡ／タンパク質融合体は、核酸成分の増幅前に固体支持体から溶出され得る。技術分野で認識されている任意の溶出方法が企図される。一実施形態において、ＲＮＡ／タンパク質融合体は、アルカリ性条件を用いて、例えば約８．０−１０．０のｐＨを用いて溶出される。別の一実施形態において、ＲＮＡ／タンパク質融合体は、酸性条件を用いて、例えば約３．０−６．０のｐＨを用いて溶出される。一実施形態において、ＲＮＡ／タンパク質融合体は、核酸成分の増幅前に溶出されず、むしろＲＮＡ／タンパク質融合体は増幅反応混合液に直接添加される。
【００５８】
さらに、またはあるいは、核酸のＰＣＲ増幅プールは単分子配列決定法を用いて配列決定され、選別された全ＲＮＡ／タンパク質分子の核酸配列を決定することができる。一実施形態において、ＰＣＲ増幅は、高忠実度プルーフリーディングポリメラーゼ、例えばサーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来のＫＯＤ１耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われてよい。
【００５９】
さらに、またはあるいは、核酸配列は増幅ＤＮＡに突然変異を導入させる条件下で増幅され、これにより選別された核酸配列にさらなる多様性を導入することができる。この突然変異したＤＮＡ分子のプールは、さらなるスクリーニングラウンドに付されてよい。
【００６０】
ＩＶ．ライブラリー構築
本発明のライブラリーは、標的に結合できる任意の抗体断片から作製され得る。一実施形態において、抗体可変領域のライブラリーが作製される。これは、ＶＨおよび／またはＶＬ領域となることができる。別の一実施形態において、ｓｃＦｖライブラリーが作製される。
【００６１】
本発明のライブラリーは、可変部の外側の領域、例えば定常部もしくはその断片またはヒンジ部をコード化する抗体核酸配列を含むこともできる。
【００６２】
本発明の核酸ライブラリーは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両要素を含有するハイブリッドを含むことができる。
【００６３】
核酸のペプチドアクセプターとの連結
抗体核酸ライブラリーは、ペプチドアクセプター部分を含むよう修飾され得る。この操作は、核酸発現ライブラリーの個々のメンバーとその同系タンパク質産物との共有結合を容易にする。例えばその内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，６４３，７６８号、米国特許第５，６５８，７５４号、米国特許第７，１９５，８８０号および米国特許第６，９５１，７２５号に記載されている手段等、技術分野で認識されているペプチドアクセプターを核酸に結合する任意の手段が企図される。
【００６４】
本発明はその一態様において、ペプチドアクセプターを核酸ライブラリーへと結合するための新しい方法および組成物を特徴とする。一実施形態において、ソラレンＣ６分子およびペプチドアクセプター分子が核酸ライブラリーの３’末端配列と相補的な核酸配列と融合した、ソラレンＣ６分子およびペプチドアクセプター分子を含む連結分子が合成され得る。このような連結分子は、相補的塩基対合を介して核酸ライブラリークローンの３’末端と結合することができる。ソラレンＣ６は、紫外線（ＵＶ）光感受性であり、リンカーを核酸ライブラリークローンに架橋し、これによりペプチドアクセプターを核酸ライブラリークローンに共有結合させる。別の一実施形態において、リンカー分子の核酸部分は、修飾されたヌクレオチド、例えば２プライムメトキシ（２’ＯＭｅ）リボヌクレオチドを含むことができる。別の一実施形態において、リンカー分子は、ソラレンＣ６分子とペプチドアクセプター分子を含む核酸領域を隔てるトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０リンカーをさらに含む。一実施形態において、リンカーは、５’から３’へと、ソラレンＣ６、配列ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ（配列番号２０）を含む２’ＯＭｅリボヌクレオチド、６個のトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０部分、２個のシチジン残基、およびピューロマイシンを含むことができる。このようなリンカーは、例えばＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によってオーダーメイド合成され得る。
【００６５】
Ｖ．一般スクリーニング法
本発明はその一態様において、本発明の発現ライブラリーをスクリーニングして所望の抗原と結合できる抗体を同定する方法を特徴とする。抗体の標的分子への結合に基づいて発現ライブラリーから抗体の選別を可能にする任意のインビトロまたはインビボスクリーニング法が企図される。
【００６６】
一実施形態において、本発明の発現ライブラリーは、技術分野で認識されているインビトロ無細胞表現型−遺伝子型連関ディスプレイを用いてスクリーニングされ得る。このような方法は、本技術分野でよく知られており、例えば米国特許第７，１９５，８８０号、６，９５１，７２５号、７，０７８，１９７号、７，０２２，４７９号、６，５１８，０１８号、７，１２５，６６９号、６，８４６，６５５号、６，２８１，３４４号、６，２０７，４４６号、６，２１４，５５３号、６，２５８，５５８号、６，２６１，８０４号，６，４２９，３００号、６，４８９，１１６号、６，４３６，６６５号、６，５３７，７４９号、６，６０２，６８５号、６，６２３，９２６号、６，４１６，９５０号、６，６６０，４７３号、６，３１２，９２７号、５，９２２，５４５号および６，３４８，３１５号に記載されている。これらの方法は、タンパク質がその起源である核酸と物理的に関連または結合するような仕方で、核酸からインビトロでタンパク質を転写することを含む。発現したタンパク質を標的分子で選別することによって、タンパク質をコードする核酸もまた選別される。
【００６７】
ｓｃＦｖタンパク質の発現を改善するため、上述において参照されたインビトロスクリーニングアッセイは特定の試薬の添加または除去を必要とし得る。一実施形態において、機能的ｓｃＦｖ分子の産生を改善するために、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素がインビトロ発現システムに添加されてよい。別の一実施形態において、弱い酸化剤（例えば、ＧＳＳＧ／ＧＳＨ、例えば、１００ｍＭ ＧＳＳＧ／１０ｍＭ ＧＳＨ）がｓｃＦｖタンパク質のインビトロ翻訳反応混合液に添加されて、ｓｃＦｖ分子のＶＨおよびＶＬ領域における鎖内ジスルフィド結合を形成させることができる。別の一実施形態において、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））が、ｓｃＦｖのインビトロ翻訳反応混合物から除去されてよい。
【００６８】
別の一実施形態において、１種類以上の標識アミノ酸またはその誘導体が、標識アミノ酸がその結果生じる抗体に取り込まれるように、インビトロ翻訳システムに添加されてよい。技術分野で認識されている任意の標識アミノ酸、例えば放射性標識アミノ酸、例えば３５Ｓ標識メチオニンまたはシステインが企図される。
【００６９】
一実施形態において、本発明のインビトロスクリーニングアッセイは、単数または複数の抗体のインビトロ選別後に、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡが逆転写されて前記単数または複数の抗体をコードするｃＤＮＡを生成できることを必要とする。任意の適切な逆転写方法、例えば、酵素を介した逆転写、例えばモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素が企図される。
【００７０】
本発明で用いられているスクリーニング法は、所望の標的に特異的に結合する抗体をコードする核酸の増幅を必要とし得る。一実施形態において、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡは、増幅されてさらにｍＲＮＡを生成することができる。技術分野で認識されている任意のＲＮＡ複製方法、例えばＲＮＡレプリカーゼ酵素を用いた方法が企図される。別の一実施形態において、単数または複数の抗体と物理的に関連したｍＲＮＡは、ＰＣＲで増幅される前に先ずｃＤＮＡに逆転写されてよい。一実施形態において、ＰＣＲ増幅は、高忠実度プルーフリーディングポリメラーゼ、例えばサーモコッカス・コダカラエンシス由来のＫＯＤ１耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われてよい。別の一実施形態において、ＰＣＲ増幅は、増幅されたＤＮＡに突然変異を導入する条件下、例えばエラープローンＰＣＲを用いて行われてもよい。
【００７１】
別の一実施形態において、本発明の発現ライブラリーは、細胞、ウイルスまたはバクテリオファージ表面における提示によってスクリーニングされ、固定化した標的分子を用いた選別に付されてよい。適切なスクリーニング方法は、米国特許第７，０６３，９４３号、６，６９９，６５８号、６，４２３，５３８号、６，６９６，２５１号、６，３００，０６５号、６，３９９，７６３号、６，１１４，１４７号および５，８６６，３４４号に記載されている。
【００７２】
本発明で用いられているスクリーニング法は、発現した抗体分子における１個以上のアミノ酸置換および／または欠失を生じ得る核酸置換および／または欠失を導入することによって、抗体ライブラリーへの多様性の導入を必要とし得る。技術分野で認識されている任意の突然変異誘発方法、例えばランダム突然変異誘発、「ｗａｌｋ ｔｈｒｏｕｇｈ」突然変異誘発および「ｌｏｏｋ ｔｈｒｏｕｇｈ」突然変異誘発が企図される。このような抗体の突然変異誘発は、例えばエラープローンＰＣＲ、酵母もしくは細菌の「ミューテーター」株または抗体の全体もしくは一部のアブイニシオ合成における、ランダムまたは確定的な核酸変化の取り込みを用いて達成され得る。一実施形態において、１個以上のアミノ酸がランダムに突然変異した抗体分子のライブラリーが作製され得る。別の一実施形態において、１個以上のアミノ酸が１個以上の所定のアミノ酸に突然変異した抗体分子のライブラリーが作製され得る。
【００７３】
本発明で用いられているスクリーニング法は、改善された標的親和性を備える抗体の選別のため、標的結合スクリーニングアッセイのストリンジェンシーが強まることも必要とし得る。抗体−標的相互作用アッセイのストリンジェンシー増強するための、技術分野で認識されている任意の方法が考慮され得る。一実施形態において、１種類以上のアッセイ条件（例えば、アッセイバッファーの塩濃度）が変化され、抗体分子の所望の標的に対する親和性を低減させることができる。別の一実施形態において、抗体が所望の標的と結合できる時間の長さが短縮され得る。別の一実施形態において、抗体−標的相互作用アッセイに競合結合ステップが加えられてよい。例えば、抗体は所望の固定化標的と先ず結合できる。次に、抗原に対して最も低い親和性を有する抗体が固定化標的から溶出され、その結果、抗原結合親和性の向上した抗体が濃縮されるよう、固定化標的との結合と競合するよう作用する特定の濃度の非固定化標的が添加され得る。アッセイ条件のストリンジェンシーは、アッセイに添加される非固定化標的濃度を増加することによってさらに強くなることができる。
【００７４】
本発明のスクリーニング法はまた、標的結合の向上した１種類以上の抗体を濃縮するために複数ラウンドの選別も必要とし得る。一実施形態において、選別の各ラウンドにおいて、技術分野で認識されている方法を用いてさらなるアミノ酸突然変異が抗体に導入され得る。別の一実施形態において、選別の各ラウンドにおける所望の標的に対する結合のストリンジェンシーは、所望の標的に対して向上した親和性を有する抗体を選別するために強くなることができる。
【００７５】
本発明のスクリーニング法は、インビトロ翻訳システムの成分からＲＮＡ−抗体融合タンパク質の精製を必要とし得る。この操作は、技術分野で認識されている任意の分離方法を用いて行われてよい。一実施形態において、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質は、ポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）レジンを用いたクロマトグラフィーによって分離されてよい。別の一実施形態において、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質は、ＲＮＡ−抗体融合タンパク質の抗体成分に存在するエピトープに特異的な抗体を用いたクロマトグラフィーによって分離されてよい。エピトープは、アミノ酸配列タグ、例えばＲＮＡ−抗体融合タンパク質の抗体成分のアミノ酸配列の、例えばＮ末端、Ｃ末端または可変領域間リンカーに取り込まれたＦＬＡＧ、ＭｙｃまたはＨＡタグとなることができる。
【００７６】
本発明のライブラリーの抗体選別は、固定化標的分子の使用を必要とし得る。一実施形態において、標的分子は固体基質、例えばアガロースビーズに直接連結される。別の一実施形態において、標的分子は先ず修飾、例えばビオチン化され、続いて修飾された標的分子は修飾を介して固体支持体、例えばストレプトアビジン−Ｍ２８０、ニュートラアビジン−Ｍ２８０、ＳＡ−Ｍ２７０、ＮＡ−Ｍ２７０、ＳＡ−ＭｙＯｎｅ、ＮＡ−ＭｙＯｎｅ、ＳＡ−アガロースおよびＮＡ−アガロースと結合する。
【実施例】
【００７７】
発明の具体例
他に記載がなければ、実施例を通じて次の材料と方法が用いられた。
【００７８】
材料と方法
一般に、他に断りがなければ、本発明の実施において、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば免疫グロブリン技術）および畜産業における従来の技法が用いられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０、Ｐａｕｌ、Ｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、１６９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、Ｅｄ．、Ｉｒｌ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ、Ｐｕｂ．（１９９９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照。
【００７９】
ｓｃＦｖ用のｍＲＮＡディスプレイプロトコール
ｍＲＮＡディスプレイは、図２に示されている方法に従って行うことができる。この方法の特定の実施形態はより詳細に後述される。これら実施形態は、本発明の方法を説明することを目的としており、限定するものであると理解するべきでない。
【００８０】
１．抗体ライブラリーテンプレートの設計
ライブラリーＤＮＡコンストラクトは、本技術分野で公知の抗体ライブラリー作製方法に従って設計することができる。一実施形態において、ライブラリーコンストラクトは、抗体断片、すなわち抗体Ｌ鎖断片（ＶＬ）または抗体Ｈ鎖断片（ＶＨ）をコードすることができる。例示的な実施形態において、ライブラリーコンストラクトは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードすることができる。
【００８１】
２．標的抗原の調製
一般に、ｍＲＮＡディスプレイ抗体ライブラリーは、ビオチン化抗原に対して選別することができる。各標的に対する最良の抗原は、ケースバイケースの原則に従って決定するべきであるが、次の記載は一般的ガイドラインとして用いることができる。標的抗原は、通常十分に特徴付けられ、多型（ＳＮＰおよびハプロタイプ）および／または薬理遺伝学的解析によって決定されるような、関連または優性遺伝アイソタイプである。標的抗原はさらに適切な生物活性（天然の抗原と同等の）、十分な溶解度ならびに化学的および物理的特性を有することができ、ライブラリー選別すなわちスクリーニングおよび下流のバイオアッセイに十分な量を調製することができる。
【００８２】
３．ライブラリーＤＮＡの調製
ライブラリーＤＮＡおよびその選別アウトプットは、ＰＣＲによって増幅することができる。ＰＣＲ増幅は、本技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。ＰＣＲ反応液は通常、ＤＮＡテンプレート、反応バッファー、ｄＮＴＰ、増幅用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび水を含む。複数の反応チューブをマスターミックスから一度に調製し、増幅ＤＮＡ収量を増加することができる。２５サイクルのＰＣＲによって通常十分な増幅がもたらされるが、より多くの産物を得るために３５サイクルもの回数を用いてもよい。
【００８３】
４．ライブラリーＤＮＡの精製
産物が正確なサイズ（ｓｃＦｖは、ほぼ８５０ｂｐ、ＶＨまたはＶＬライブラリーは、ほぼ５００ｂｐ）であり、最小限の非特異的産物を含む場合、産物は転写反応に直接用いることができる。あるいは、産物は調製用アガロースゲルにおいて正確なサイズの特異的なバンドを切り出して精製することができる。ＤＮＡ濃度は分光計で測定することができる。
【００８４】
５．ＲＮＡの転写
ライブラリーＤＮＡからＲＮＡの転写は、本技術分野で公知の標準的な方法を用いて行うことができる。大量の反応容量を用いて、全ライブラリー多様性を標本抽出するのに十分なＤＮＡテンプレートを転写することができる。例示的な一実施形態において、１×１０１３コピーのライブラリーテンプレートをＲＮＡ転写反応に用いることができる。ＲＮＡ転写液は、通常５−１０μｇのＰＣＲ産物、反応バッファー、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む。ＲＮＡ転写反応は３７℃で２時間から一晩の間行うことができる。選別の最初のラウンドの後、より短い時間を用いてもよいが、一晩の温置によって反応のＲＮＡ収量を最大化することができる。ＲＮＡ転写の後、ＤＮＡテンプレートはＤＮａｓｅＩ消化によって反応混合液から除去できる。
【００８５】
６．ＮＡＰカラムクロマトグラフィーによるＲＮＡ精製
転写後、ＲＮＡはＮＡＰ−１０カラムを用いて分画することができる。最大約１ｍＬの転写反応液が、ＲＮＡ精製のためＮＡＰ−１０カラムに装填できる。カラムは、分画前にＤＥＰＣ処理ｄＨ２Ｏを用いて平衡化することができる。ＲＮＡは、約１．５×反応容量のＤＥＰＣ処理ｄＨ２Ｏ（例えば、５００μＬの転写反応液につき７５０μＬ）を用いてカラムから溶出できる。全溶出容量は、転写反応液の容量の約１５０％未満となることができる。さらに、またはあるいは、ＲＮＡはＮＡＰ−２５カラムを用いて分画できる。
【００８６】
７．ＲＮＡの品質管理と定量
ＲＮＡサンプルのサイズおよび収量は、ゲル電気泳動を用いて、あるいは収集した画分におけるＲＮＡ濃度の２６０ｎｍのＯＤ（ＯＤ２６０）を測定することによって分析できる。例えば、ｓｃＦｖ ＲＮＡのモル濃度は、次の通り計算できる。
［ＲＮＡ］（μＭ）＝［ＲＮＡ］（ｍｇ／ｍＬ）×１０６／（８５０×３３０）
＝ＯＤ２６０×希釈係数×４０（μｇ／ｍＬ）×１０００／（８５０×３３０）
ＲＮＡ収量（ｎｍｏｌ）＝［ＲＮＡ］（μＭ）×容量（μＬ）／１０００
ＲＮＡ収量は、通常５００μＬの転写反応液につき約２０ｎｍｏｌ／ｍＬの最高値に達する。
【００８７】
８．リンカーへのＲＮＡライゲーション
ペプチドアクセプター分子をその３’末端に備えるＤＮＡリンカーは、ＵＶ架橋によって各ＲＮＡ分子の３’末端と共有結合的ライゲーションを行う。リボソームＡ部位に入り込んで未完成ポリペプチド鎖のカルボキシル末端に共有結合できるペプチドアクセプターは、ｍＲＮＡ（遺伝子型）の、該ｍＲＮＡによってコード化されたタンパク質（表現型）との共有結合的関連を最終的に可能にできる。次式を有する例示的なＰＥＧ６／１０リンカーを用いることができる。
５’（ソラレンＣ６）２’ＯＭｅ（ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ）ＸＸＸＸＸＸＣＣ（ピューロマイシン）３’（配列番号２０）
【００８８】
ソラレンＣ６の５’修飾は光感受性であり、ＵＶ架橋によってリンカーとｍＲＮＡとの間の共有結合を形成するよう機能する。２’ＯＭｅ（ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ）（配列番号２０）骨格領域は、ｍＲＮＡにおけるＦＬＡＧ配列に対して３’のリンカーアニーリング部位とアニーリングする（図１参照）。上述の配列において、Ｘは「スペーサー９」、あるいはトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０として知られている物質を示す。このスペーサーは、ピューロマイシンの真核生物リボソームＡ部位への挿入に対する柔軟性を提供するよう最適化されている。ＣＣは標準的なＤＮＡ骨格を含む。ピューロマイシンの３’修飾は、リボソームＡ部位に挿入してリンカーと未完成ポリペプチドとの間に安定的な結合を形成する。本明細書に記載されているリンカーの減衰係数は、約１４７．７ＯＤ２６０／μモルとなることができる。このリンカーは光感受性であるため、このリンカーを含む溶液は、光から保護しなくてはならない。
【００８９】
推定約１０１２−１０１３の多様性を備える未処理の抗体ライブラリーの全多様性を標本抽出するため、ライブラリー選別の最初のラウンドのためにラージスケールのライゲーション反応（約５ｎｍｏｌまたは約３．１×１０１５転写ＲＮＡ分子）が推奨され得る。このＲＮＡ量は、十分なテンプレートが翻訳反応に取り込まれて、ほぼ１０ｐｍｏｌの機能的ｍＲＮＡディスプレイ分子が産生されることを保証し得る。後期ラウンドでは、ＲＮＡインプットは選別当たり約０．５ｎｍｏｌへと減少できる。例示的な一実施形態において、ＲＮＡライゲーション反応液は、次の成分、すなわちＲＮＡ、水、化学ライゲーションバッファーおよびＰＥＧ６／ピューロマイシンリンカー（１ｍＭ）を含むことができる。例示的な一実施形態において、全反応容量は約１００μＬである。好ましい一実施形態において、リンカー／ＲＮＡ分子比は、約１．５より大きくなることができる。一実施形態において、反応液における最終リンカー濃度は約１５μＭであり、反応液におけるＲＮＡ濃度は約３−１０μＭ（＝０．３−１ｎｍｏｌのＲＮＡインプット）の範囲に及ぶ。参考までに、１ｍｇ／ｍＬの８５０ｎｔのｓｃＦｖ ＲＮＡ＝３．５６μＭであり、達成可能な最大ライゲーション濃度は、約３．１６μＭ（約０．３２ｎｍｏｌ）である。
【００９０】
アニーリング反応（リンカーと転写されたＲＮＡとのアニールにおける）は、サーマルサイクラーにおいて行うことができる。好ましい一実施形態において、アニーリング反応は、サンプルを約８５℃で約３０秒間、続いて１秒当たり約０．３℃のランプ速度を用いて約４℃で温置することによって行うことができる。次に、反応液は約４℃で維持することができる。
【００９１】
アニーリングしたリンカー／ＲＮＡのライゲーションは、ＵＶ架橋によって行うことができる。この操作は当業者に知られた任意の方法を用いて行うことができる。一実施形態において、反応チューブは凍結したフリーザーパックの上に置いて、手持ち式長波長（約３６５ｎｍ）ＵＶランプの下に直接置き、暗所で約１５分間架橋することができる。通常のライゲーション効率は約５０−９０％である。一般に精製は必要とされない。ライゲーション産物は−８０℃で保存することができる。
【００９２】
９．翻訳反応
例示的な一実施形態において、全反応および精製の後、ほぼ約０．１％のインプットＲＮＡをｍＲＮＡディスプレイ分子へと作製することができる。インビトロ翻訳は、当業者に知られた方法と試薬を用いて行われる。一実施形態において、ｓｃＦｖライブラリーを用いた翻訳反応は、約１５ｍＬの反応容量における約５ｎｍｏｌのＲＮＡテンプレートと約１０ｍＬの網状赤血球ライセートを用いる。
【００９３】
翻訳反応液の調製において、ＧＳＳＧ／ＧＳＨ（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン）溶液は、最終濃度約１００ｍＭ ＧＳＳＧ／１０ｍＭ ＧＳＨに調製できる。ＰＤＩは、ＰＤＩ粉末をｄＨ２Ｏに溶解して約１ユニット／μＬ濃度になるよう調製される。ＰＤＩ溶液は−２０℃で保存できる。
【００９４】
【表１】
【００９５】
翻訳反応液は、３０℃のウォーターバスで１−２時間温置することができ、ＲＮＡ／タンパク質融合体形成は遅滞なく行うべきである。翻訳容量が３ｍＬを超える場合、ＲＮＡ／タンパク質融合体収量の顕著な減少が観察できる。従って、反応容量が３ｍＬより多い場合、翻訳反応液のマスターミックスを調製し、続いてより小さなアリコートに分注してよい。
【００９６】
１０．ＲＮＡ／タンパク質融合体形成
翻訳反応後、３００μＬの翻訳反応混合液につき約１００μＬの２Ｍ ＫＣｌおよび約２０μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２を添加し、約１時間室温または−２０℃で一晩温置することができる。あるいは、１．５ｍｌの翻訳反応混合液につき約５００μＬの２Ｍ ＫＣｌおよび約１００μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２を添加し、約１時間室温または−２０℃で一晩温置することができる。この操作は、ｍＲＮＡテンプレート末端における休止リボソームを安定化し、ＤＮＡリンカー末端のピューロマイシンを休止リボソームのＡ部位に挿入し、これにより翻訳されたｓｃＦｖタンパク質とそのｍＲＮＡテンプレートとを永続的に接続する。反応液が−２０℃で一晩保存される場合、室温の温置は短縮できる。反応は、３００μＬまたは１．５ｍｌの翻訳反応液につきそれぞれ約５０μＬまたは約２５０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えてリボソームを停止することによって終了できる。反応液は−２０℃で保存できる。５−１０μＬアリコートを後のシンチレーション計数のため取り分けることができる。
【００９７】
１１．オリゴｄＴセルロースによるＲＮＡ／タンパク質融合体の精製
このステップは、ｍＲＮＡディスプレイ分子および残存ＲＮＡテンプレートを翻訳／融合反応液から精製するために含まれる。オリゴｄＴ結合のため、全ＲＮＡテンプレートを捕集するのに必要な、前洗浄したオリゴｄＴセルロース量を概算するべきである。十分量のオリゴｄＴ結合バッファーは、約１×最終濃度となるよう融合反応液に加えることができる。次に、前洗浄したオリゴｄＴセルロースが加えられ、反応液は１時間、４℃で回転することができる。反応液は、場合によって約１５００ｒｐｍ、５分間、４℃でスピンダウンすることができ、上清は廃棄される。オリゴｄＴセルロースビーズを移し、スピンカラムを用いて１×オリゴｄＴ結合バッファーで約６回洗浄することができ、バッファーは通常、カラムを約１０００ｒｐｍ、１０秒間スピンすることによって除去される。貫流液は廃棄してよいが、最後の洗浄液はシンチレーション計数のため取っておくことができる。塩濃度を低下させて溶出を容易にするため、最初のスラリー容量の１／１０のｄＨ２Ｏを乾燥オリゴｄＴビーズに添加し、即座に１０秒間遠心分離して貫流液を廃棄することができる。ｍＲＮＡディスプレイ分子（および遊離ＲＮＡテンプレート）は、ビーズにｄＨ２Ｏを加えて５分間室温で温置することによって溶出できる。溶出液は、約４０００ｒｐｍ（以上）で２０秒間スピンすることによって収集できる。溶出は通常１回繰り返し、溶出液を合わせる。５μＬの溶出液をシンチレーション計数のため取り分けることができる。場合によって、オリゴｄＴ精製効率は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光装置の２６０ｎｍのＯＤ（ＯＤ２６０）によって評価することもできる。理論的に、全残存ＲＮＡテンプレートおよびｍＲＮＡディスプレイ分子がオリゴｄＴビーズによって回収される。５×ＦＬＡＧ結合バッファーが、約１×最終濃度になるよう溶出液に加えられる。サンプルは、次のＦＬＡＧ精製ステップに進まない場合、−８０℃で保存することができる。
【００９８】
オリゴｄＴ回収は、次の通りに計算される。約５μＬのインプット（融合反応液由来）、最後の洗浄液由来の約１００μＬおよび約５μＬのアウトプット（オリゴｄＴ精製由来の溶出液）。最後の洗浄液は、洗浄の程度を評価するために用いられ、他の２種の計数は、元来のＲＮＡテンプレートインプットからＲＮＡ／タンパク質融合体回収を計算するために用いられる。ＲＮＡ／タンパク質融合体収量（ｐｍｏｌ）＝（ＣＰＭアウトプット×容量アウトプット×５μＭ×容量ライセート）／［ＣＰＭインプット×容量インプット×（産物におけるメチオニンの＃）］。この式は網状赤血球ライセートにおける５μＭのメチオニン濃度を推測し、計算に用いられているあらゆる容量はμＬで表されている。選別の初期のラウンドのｍＲＮＡディスプレイ分子収量は、通常０．５−２％であるが、後期ラウンドでは１０％に増加する。例えば、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーにおける初期ラウンドのメチオニン数は次の通りとなることができる。
・ＶＨ−Ｖκ ｓｃＦｖは約３μＭ
・ＶＨ−Ｖλ ｓｃＦｖは約２−３μＭ
・ＶＨは約２μＭ
・Ｖκは約２μＭ、および
・Ｖλは約１μＭ
これらの数値は平均であり、生殖細胞系列の配列に基づいており、当業者であれば、ライブラリーが特定の配列へと濃縮するに従って、これらが選別ラウンドにわたって変化し得ることを理解できる。
【００９９】
１２．抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースによるＲＮＡ／タンパク質融合体精製
このステップは、残存ＲＮＡテンプレートからｍＲＮＡディスプレイ分子を精製するよう設計されている。ライブラリーが抗原オフレート競合によってまたは抗原発現細胞によって選別される場合、このステップに進む必要はない。全ｍＲＮＡディスプレイ分子の捕集に必要とされる、前洗浄された抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースビーズの量を概算することができる。一実施形態において、ビーズの結合能力は、５０％スラリー１ｍＬ当たり約６ｎｍｏｌ融合タンパク質となることができる。結合と洗浄における操作に十分なビーズ容量を有するために、少なくとも約２００μＬの前洗浄されたビーズを用いることが推奨される。後述の例は、最初の翻訳反応液３００μＬに対するものである。
【０１００】
ＦＬＡＧ精製：大口径ピペットチップを用いて３００μＬの前洗浄した抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースをオリゴｄＴ精製されたアウトプットに移し、次に１時間４℃で回転することができる。抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースとの温置は一晩続けてよい。抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースは、場合によって遠心分離機で約１５００ｒｐｍ、約１分間４℃でスピンして、上清を捨てることができる。抗ＦＬＡＧビーズは、スピンカラムを用いて（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）微量遠心スピンカラム）約５００−７００μＬの１×ＦＬＡＧ結合バッファーで約５−６回洗浄し、各洗浄につき約１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離することができる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カラムは、より高速、例えば約１０，０００ｒｐｍでスピンできることに留意）。貫流液は廃棄することができる。ビーズは約１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離することによって、７００μＬの選別バッファー（後述を参照）で追加的に２回洗浄することができる。最後の洗浄は、シンチレーション計数のため取っておくことができる。ｍＲＮＡディスプレイ分子は、約４００μＬの１００μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧペプチド（選別バッファーに溶解）を添加して５分間室温で温置することによって溶出できる。溶出液は、約３０００ｒｐｍ（か、可能であればそれ以上）で２０秒間スピンすることによって収集することができる。溶出ステップは、約４００μＬの１００μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧペプチドを加えることによって、もう１回繰り返すことができる。両方の溶出液は合わされて、約５μＬをシンチレーション計数のために取り分けることができる。この容量のＦＬＡＧペプチドは、最大約１ｍＬの５０％スラリーからの溶出に十分となることができ、より少量のスラリーが用いられているおよび／またはより高いＲＮＡ／タンパク質融合体濃度が望ましい場合、半量（２００μＬ）に縮小することができる。保存や抗原選別におけるＲＮＡ分解を防ぐため、適量の本技術分野で公知のＲＮａｓｅインヒビター（すなわち、１−２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅＯＵＴおよび０．０２μｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ）が、精製されたｍＲＮＡディスプレイライブラリーに添加されてよい。次の抗原選別ステップに進まない場合、サンプルを−８０℃で保存する。
【０１０１】
ＦＬＡＧ回収を定量するため、約５μＬの溶出アウトプットおよび最後の洗浄由来の約１００μＬをベータカウンターで計数する。１０−３０％以上の回収を予想でき、次式に従って計算することができる。
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子回収％＝（ＣＰＭアウトプット×容量アウトプット）／（ＣＰＭインプット×容量インプット）
【０１０２】
１３．ビオチン化抗原によるライブラリー選別
選別は、ライブラリーの抗原への結合が平衡に達したときに目的の標的に特異的に結合する分子を濃縮するように設計される。ネガティブ選別（プレクリア）は、非特異的およびマトリックスバインダーを未処理ｓｃＦｖライブラリーから除去するのに必要となり得るが、単一のテンプレートから作製されたライブラリー、例えば単一ｓｃＦｖテンプレートに基づいて親和性成熟を行う、親和性成熟のために作製されたライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない、を用いる場合省略することができる。標的フォーマットに依存して選別プロトコールは異なる。次に、ビオチン化標的を用いた使用のための例示的な選別プロトコールを記載する。このプロトコールは、他のフォーマットの標的抗原に適合するよう修正することができ、所望のアウトプットに応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができる。
【０１０３】
Ａ．選別前の調製
ストレプトアビジン（ＳＡ）磁気ビーズは、捕集のため用いることができ、通常使用前にプレブロッキングすることができる。ＳＡビーズは、原瓶から１．５または２ｍＬチューブに移して２ｍＬの１×ＦＬＡＧ結合バッファーで２回洗浄することができる。ビーズは２ｍＬの選別バッファーで（２時間から一晩）４℃で回転しながらブロッキングすることができる。プレクリアと選別捕集の両方に十分なビーズを調製することが重要である。プレブロッキングされたビーズは４℃で保存することができる。１０ｐｍｏｌのビオチン化抗原につき約１００μＬのビーズが通常用いられるが、捕集ビーズ容量は、反応収量に対する遊離ビオチンの結合能力（例えば、ビーズ濃度が通常１０ｍｇ／ｍｌである場合、６５０−９００ｐモル／ｍｇビーズ）を考慮して計算するべきことを当業者であれば理解できる。
【０１０４】
１．５ｍＬまたは２ｍＬ微量遠心チューブは、１×ＦＬＡＧ結合バッファーで約１時間から一晩、プレブロッキングすることができる。プレブロッキングされたチューブは、全プレクリアおよび選別ステップに用いることができる。通常、各サンプルにつき４本のチューブが必要とされる。２本はプレクリア用、１本はビーズ用、そして１本は選別用である。
【０１０５】
最適な結果は、ライブラリーをプレクリアすることによって得ることができる。ＦＬＡＧ精製したｍＲＮＡディスプレイライブラリーは、捕集容量の半量に相当するＳＡビーズ容量のビーズ（バッファーから分離）に加えることができる。ビーズは、３０℃で約３０分間回転することができる。プレクリアしたｍＲＮＡディスプレイライブラリーは、磁石を用いてビーズから分離することができ、プレクリアはもう一回繰り返すことができる。第二のプレクリアＳＡビーズは、上述の通りに洗浄、計数して、バックグラウンドが高いか判断することができる。これは、「抗原無し」ネガティブコントロールとすることもできる。
【０１０６】
Ｂ．ライブラリー選別：結合
選別の第一ラウンドのため、ビオチン化標的（１００ｎＭ）をプレクリアしたライブラリー全体に添加して、３０℃で１時間回転することができる。後期選別ラウンドのため、抗原結合分子の回収が１％を超えることが予想される場合、プレクリアしたライブラリーは、２個の等量アリコートに分注することができる。ビオチン化抗原は一方のアリコートに加えることができ、他方のアリコートは「抗原無し」ネガティブコントロールとなることができる。あるいは、上述の通り、洗浄した第二のプレクリアビーズは、より「プレクリア」でないことになるが、「抗原無し」コントロールであると考えることができる。後期ラウンドにおける抗原濃度は、抗原結合分子の回収が５％を超える場合減少させることができる。特に、抗原濃度は、抗原が「粘着性」であるように思われ、顕著な回収が初期ラウンドで観察される場合、減少させるべきである。抗原濃度は、抗原結合分子の回収がバックグラウンドより（例えば、抗原無しコントロールに対して）顕著に高くなる場合、後期ラウンドで減少させてよい。ライブラリーと抗原との間の化学量論に注意して、特に抗原濃度が低い場合、ライブラリーＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子より少なくとも５倍モル過剰の抗原が含まれていることを確実にすることが重要である。
【０１０７】
Ｃ．ライブラリー選別：捕集
ライブラリー捕集用ＳＡビーズのブロッキングに用いられている選別バッファーは、遠心分離と磁気選別によって除去することができる。抗原と結合したライブラリーは、プレブロッキングされたＳＡビーズ（バッファーから分離）、次に結合反応液へと移され、３０℃で５−１０分間回転した。捕集用ＳＡビーズ量は、結合能力および選別に用いられている標的の濃度（上述を参照）に基づいて計算するべきである。ＳＡビーズ量は、ＳＡビーズバインダーを抑制するため標的濃度を下げる場合少なくするべきであるが、通常５０μＬ以上のビーズが用いられる。
【０１０８】
Ｄ．ライブラリー選別：洗浄
磁石を用いてＳＡビーズを捕集し、約１ｍＬの選別バッファーで１分間洗浄することができる。このステップは、約５回繰り返すことができる（合計約６回）。洗浄回数を後期ラウンドで増やして、オフレート選別戦略を一部の標的に取り込むことができる。ビーズは、最後の１回は約１ｍＬの逆転写に適切な１×バッファーで洗浄して磁石で捕集し、水（上で計算された捕集ビーズ容量の４分の１）に再懸濁することができる。
【０１０９】
別の一例として、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることができるが、当業者であれば、他のビーズも等しく適切であることを理解することができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、遠心分離と磁気選別によって非結合ライブラリーから分離することができる。上清は１ｍＬチップで除去することができるが、相互汚染を避けるため各ライブラリー選別チューブにつき１本の新しいフィルターチップを用いる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、１ｍＬの選別バッファーで洗浄し、穏やかにピペッティングまたはチューブを複数回反転することによって再懸濁することができる。チューブは、次のライブラリーを処理している間にビーズ分離用の磁気ホルダーに戻すことができる。全ライブラリーを洗浄した後、上清は１ｍＬチップによって除去することができるが、相互汚染を避けるため各ライブラリー選別チューブにつき１本の新しいフィルターチップを用いる。洗浄を５回繰り返す。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、上述の通り１ｍＬの１×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄することができる。最後の洗浄において、必要に応じて、計数のためライブラリーの１／１０を別個のチューブに取り分けて、ライブラリー回収を決定した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、磁気選別によって捕集することができ、バックグラウンド計数のため約１００μｌの洗浄バッファーを取り分けることができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、上で計算された通り、捕集ビーズ容量の１／４の水に再懸濁することができる。
【０１１０】
Ｅ．ライブラリー選別：計数および回収計算
ラウンド３から始めて、最後の洗浄液およびビーズの約１０−２０％を計数する。計数を抑える可能性があるため、１００μＬより多いビーズを計数することは望ましくない。ライブラリー選別回収は次式に従って計算することができる。
選別回収％＝１００×ＣＰＭ全ビーズ／ＣＰＭ全インプット
【０１１１】
１４．Ｆｃ融合タンパク質による平衡ライブラリー選別
別の一実施形態において、ライブラリー選別は、抗体Ｆｃ領域と結合した標的抗原（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）に対して行うことができる。ネガティブ選別（プレクリア）は、未処理抗体ライブラリーから非特異的およびマトリックスバインダーを除去するために必要となり得るが、親和性成熟には省略してよい。選別特異性は、標的抗原をヒトＩｇＧ１とマウスＩｇＧ２ａの両方と融合することによって改善することができる。ライブラリー選別においてＦｃ融合タンパク質中に異なるＦｃ領域を有することによって、Ｆｃ領域特異的なライブラリーバインダーを同定するリスクを最小限に抑えることができる。この操作はまた、ライブラリーバインダーを２種類の異なる磁気ビーズ（プロテインＧおよび抗マウスＩｇＧ）によってプルダウンすることもでき、これによりさらに抗プロテインＧまたは抗−抗マウスＩｇＧバインダーを回収する可能性を低減させることができる。標的Ｆｃ融合タンパク質は、ビオチン化し、本明細書に記載されている方法か上述第１３節の方法のいずれかによって選別することができる。抗体ＶＨ領域の特定部位（例えば、ヒトＶＨ３ファミリー生殖細胞系列の配列に由来するＶＨ）との交差反応のため、プロテインＡ磁気ビーズがＦｃ融合タンパク質標的に対する選別に適さない可能性を留意するべきである。ｓｃＦｖ−ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子と結合する抗原のプルダウンに適切な磁気ビーズは、ＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＧ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ全マウスＩｇＧおよび他のヒトまたはマウスＩｇＧに利用可能なＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０を含むが、これらに限定されるものではない。一般に、プロテインＧビーズの結合能力は、プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズ１００μＬにつき約２５μｇのヒトＩｇＧ１（ほぼ１６７ｐｍｏｌ）であると考えられる。
【０１１２】
Ａ．選別前の調製
ＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＧまたはＤｙｎａｂｅａｄｓ全マウスＩｇＧ（標的抗原がマウスＦｃ融合タンパク質である場合）は、捕集のため用いることができ、通常使用前にプレブロッキングされる。ライブラリーのプレクリアと選別に必要とされるＤｙｎａｂｅａｄｓの量は計算することができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、原瓶から１．５または２ｍＬ微量遠心チューブへと移してバッファーを除去することができる。ビーズは１ｍＬの選別バッファーで（２時間から一晩）４℃、または１時間室温でブロッキングすることができる。プレクリアと選別捕集の両方に十分なビーズを調製することが重要である。
【０１１３】
１．５ｍＬまたは２ｍＬ微量遠心チューブは選別バッファーで１時間から一晩プレブロッキングすることができ、全プレクリアおよびライブラリー選別ステップにおいてプレブロッキングされたチューブを用いるべきである。
【０１１４】
ＦＬＡＧ精製したｓｃＦｖ ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーは、プレブロッキングしたビーズ（バッファーから分離）に加えることができ、捕集容量（上述の通り計算された）の半量に相当するＤｙｎａｂｅａｄ（プロテインＧまたは全マウスＩｇＧ）容量を用いて、反応液を３０℃で３０分間回転することができる。プレクリアした融合ライブラリーは、磁石を用いてビーズから分離することができ、プレクリアはもう１回繰り返される。第二のプレクリアＤｙｎａｂｅａｄｓは、上述の通り洗浄、計数してバックグラウンドが高いか判断することができる。これは「抗原無し」ネガティブコントロールとなることもできる。
【０１１５】
Ｂ．ライブラリー選別：結合
選別の第一ラウンドのため、ビオチン化標的（１００ｎＭ）をプレクリアしたライブラリー全体に添加して、３０℃で１時間回転することができる。後期選別ラウンドのため、抗原結合分子の回収が１％を超えることが予想される場合、プレクリアしたライブラリーは、２個のアリコートに分注することができる（ライブラリーの計数に応じて、５０／５０から８０／２０）。ビオチン化抗原が一方のアリコート（全体の５０−８０％）に添加され、他方のアリコートは「抗原無し」ネガティブコントロールとなることができる。あるいは、上述の通り、洗浄された第二のプレクリアビーズも、より「プレクリア」でない場合を除き「抗原無し」コントロールであると考えることができる。抗原が「粘着性」であると思われ、初期ラウンドで顕著な回収が観察される場合、抗原濃度は低減させてよい。さらに、抗原結合分子の回収がバックグラウンド（抗原無しコントロール）よりも顕著に高くなる場合、抗原濃度は後期ラウンドで低減させてよい。ライブラリーと抗原との間の化学量論に注意して、特に抗原濃度が低い場合、ライブラリーＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子に対して少なくとも５倍モル過剰の抗原が含まれていることを確実にすることが重要である。
【０１１６】
Ｃ．ライブラリー選別：捕集
ライブラリー捕集用Ｄｙｎａｂｅａｄｓのブロッキングに用いられている選別バッファーは、遠心分離と磁気選別によって除去することができる。抗原結合ライブラリーは、プレブロッキングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（バッファーから分離）へと移され、続いて結合反応液へと移されて３０℃で２０分間回転することができる。捕集に用いられているＤｙｎａｂｅａｄｓの量は、上述の通りビーズの結合能力と、選別に用いられている標的抗原濃度に基づいて計算することができる。ビーズバインダーのプルダウンを避けるため、標的抗原濃度が低い場合、Ｄｙｎａｂｅａｄｓの量は低く抑えるべきである（なお、５００μｇまたは５０μｌ以上であること）。
【０１１７】
Ｄ．ライブラリー選別：洗浄
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、非結合ライブラリーから遠心分離や磁気選別によって分離することができる。上清は１ｍＬチップで除去することができるが、相互汚染をなくすため各ライブラリー選別チューブにつき１本の新しいフィルターチップを用いることができる。新しいピペットチップを用いて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を約１ｍＬの選別バッファーで洗浄することができ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、穏やかなピペッティングによってまたはチューブを複数回反転することによって再懸濁することができる。チューブは、次のライブラリーを処理している間にビーズの分離のために磁気ホルダーに戻すことができる。全ライブラリーを洗浄した後、上清は１ｍＬチップ（相互汚染をなくすため、各ライブラリー選別チューブにつき１本の新しいフィルターチップを用いる）で除去することができる。このステップは、５回の洗浄を繰り返すことができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、上述の通り１ｍＬの１×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄することができる。最後の洗浄において、ライブラリーの１／１０は、必要に応じてライブラリー回収を決定する計数のため別個のチューブに取り分けることができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、磁気分離によって捕集することができ、約１００μｌの洗浄バッファーはバックグラウンド計数のため取り分けることができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、上で計算された捕集ビーズ容量の１／４の水に再懸濁することができる。
【０１１８】
Ｅ．ライブラリー選別：計数
上述の第１３節（Ｅ）に記載されている通りに行うことができる。
【０１１９】
１５．抗原競合によるオフレートライブラリー選別
オフレート選別と平衡選別との間の大きな差は、ＦＬＡＧ精製の前に先ずライブラリーが選別抗原と結合することである。ＦＬＡＧ精製後、オフレート競合においてＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子から非結合になった任意の前結合抗原が競合分子と置き換わるように、ライブラリーは過剰量の競合抗原または抗体（例えば、競合抗原が利用できない場合）と温置することができる。競合分子と結合したＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子が次の回収ステップで回収されないという点において、競合分子は前結合抗原と異なる。これらは、非修飾抗原または異なるフォーマットの抗原となることができる。抗体もまた競合分子となり得るが、通常抗体は抗原ほど効率的な競合分子ではなく、その効率はライブラリーの抗原に対する親和性が高くなるにつれ減少する。適切な競合期間を特定するため、選別のちょうど前にライブラリーのオフレートを決定することは都合が良い。この期間は、数時間から数週間の範囲に及ぶ。
【０１２０】
Ａ：ビオチン化抗原または抗原−Ｆｃ融合タンパク質を用いたプレロードライブラリー
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子を翻訳し、上述の通りオリゴｄＴによって精製することができる。オリゴｄＴ精製ライブラリーは、５×ＦＬＡＧ結合バッファーを加えて１×最終濃度にする（単純に、ライブラリー容量の２５％を加える）ことによって平衡化することができる。十分に高い濃度になるよう抗原（ビオチン化またはＦｃ融合）が加えられ、３０℃で３０分間回転して抗原−抗体結合を飽和させることができる。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子は、上述の通り抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースによって精製することができる。ＦＬＡＧ精製したＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーは氷上に維持するべきだが、凍結してはならないことに留意することが重要である。上述の通り、十分な量の捕集ビーズをプレブロッキングすることが重要である。
【０１２１】
Ｂ：競合分子の濃度およびライブラリーのベースライン回収の決定
前記ステップから回収されたライブラリー量を計算してそのモル濃度を決定することができる。これは、最大量のライブラリー結合抗原を表し、オフレート競合に必要とされる量（５００×から１０００×）の計算に用いることができる。
【０１２２】
１０％のプレブロッキングしたビーズが、抗原結合ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーの１０％アリコートに加えられ、約２０分間約４℃で回転することができる。ビーズは、上述の通り１ｍＬの選別バッファーで５回洗浄することができる。オフレート選別前に抗原と結合したＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーの割合は、ビーズを計数して次の通り決定することができる。
回収％＝１００×（ＣＰＭビーズ／ＣＰＭインプット）×１０
【０１２３】
Ｃ：ライブラリー選別：競合
１０００倍モル過剰の競合分子（例えば、非修飾抗原または抗体）が、ＦＬＡＧ精製ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリーに加えられ、より良いオフレートを備えるクローンを選別するための十分な淘汰圧をかけることのできる所定の期間約３０℃で回転することができる。氷上でライブラリーを約１−２分間冷却して、ビーズ捕集前にオフレート減速する。
【０１２４】
Ｄ：ライブラリー選別：捕集
ライブラリー捕集用Ｄｙｎａｂｅａｄｓのブロッキングに用いられている選別バッファーは、遠心分離および磁気選別によって除去することができる。抗原結合ライブラリーはプレブロッキングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（バッファーから分離）へと移し、４℃で約２０分間回転することができる。
【０１２５】
Ｅ：ライブラリー選別：洗浄
Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、遠心分離および磁気選別によってライブラリーから収集することができる。上清は、１ｍＬチップ（上述の通り、相互汚染を避けるため各ライブラリー選別チューブにつき１本の新しいフィルターチップを用いる）で除去することができる。
【０１２６】
上述の通り、ビーズは約１ｍＬの１×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄することができる。最後の洗浄において、ライブラリーの１０−２０％は、必要に応じ計数してライブラリー回収を決定するため別個のチューブに移すことができる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、磁気選別によって捕集することができ、１００μｌの洗浄バッファーはバックグラウンド計数のため取っておくことができる。ビーズは、水（上で計算された捕集ビーズ容量の１／４）に再懸濁することができる。
【０１２７】
Ｆ：ライブラリー選別：計数および回収の計算
最後の洗浄液およびビーズの１０−２０％を計算することができる。１００μＬを超えるビーズの使用は計数を抑えるため、避けることが望ましい。ライブラリー選別回収は、次式を用いて計算することができる。
選別回収％＝１００×ＣＰＭ全ビーズ／ＣＰＭ全インプット
【０１２８】
１６．ライブラリー選別アウトプットの逆転写
逆転写は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて行うことができる。各反応液の容量は、選別後のビーズ容量に従ってスケールアップすることができる。アウトプットは、適切なプライマー対を用いた逆転写（ＲＴ）によって分析することができる。例えば、「Ｃｋリバース」または「Ｃｋ５−ＦＬＡＧＡ２０Ｒｅｖ」プライマーはκライブラリーに対して用いることができ、「ＣＪＬリバース」または「ＣＬ５ＦＬＡＧＡ２０Ｒｅｖ」プライマーはλライブラリーに対して用いることができ、「Ｌｉｂ−ＧＳ−Ｒｅｖ」または「ＶＨ−ＧＳＦＬＡＧＡ２０−Ｒｅｖ」プライマーはヒトＰＢＭＣ ＶＨライブラリーに対して用いることができる。
【０１２９】
逆転写プライマーは、逆転写反応から取り残された残存プライマーが異なる３’末端配列を有する増幅産物を生成するのを避けるため、少なくとも続くＰＣＲのリバースプライマーと同一の５’末端配列を有するべきである。これらプライマーはいかなる残存量であっても次のＰＣＲに関与してポリＡテールを欠く産物を生成し得るため、より短い「Ｃｋリバース」、「ＣＪＬリバース」または「Ｌｉｂ−ＧＳ−Ｒｅｖ」プライマーがＲＴに用いられている場合特に、このことが重要である。
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
例示的なＲＴ反応条件
最終容量２００μＬの反応液に対し、ＲＴ反応は次の通り設定することができる。
ビーズ（水に懸濁） ＸμＬ
ｄＨ２Ｏ １０８μＬとする
１０μＭリバースプライマー ２μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ １０μＬ
６５℃、５分間温置し、氷上で冷却する。次の試薬を加える。
５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー ４０μＬ
０．１Ｍ ＤＴＴ ２０μＬ
ＲＮａｓｅＯＵＴ １０μＬ
【０１３２】
反応液は、１０μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を加える前に４２℃で２分間温置することができる。反応液は、１００μＬアリコートに分注し、時々攪拌しつつ４２℃で５０分間温置することができる。次に反応後、チューブを９５℃で５分間温置することができる。ビーズを単離し、上清を新しいチューブに移すことができる。通常、同一の選別アウトプットに由来する場合、サンプルはプールすることができる。ビーズを水（ＲＴ容量の半量）に再懸濁する。反応後、チューブは９５℃で５分間温置することができ、ビーズは磁石によって捕集することができ、上清は前に移した上清と共にプールすることができる。これは、選別アウトプットのＰＣＲ増幅のためのｃＤＮＡテンプレートを表す。
【０１３３】
１７．細胞表面抗原に対するライブラリー選別
細胞表面抗原に対する場合と可溶性ビオチン化抗原に対する場合との間のＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリー選別の大きな差は、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子のｍＲＮＡ部分が、ｃＤＮＡの相補性によって細胞性ＲＮａｓｅ分解から保護され、従ってライブラリー選別前にｃＤＮＡに逆転写される必要があることである。逆転写反応は、オリゴｄＴ精製後のライブラリー容量に応じてＦＬＡＧ精製の前または後に行うことができる。ｓｃＦｖ分子の鎖内ジスルフィド結合を保存するため、還元剤ＤＴＴは逆転写またはライブラリー選別前のどのステップにも含まれるべきではないことに留意することが重要である。
【０１３４】
Ａ：オリゴｄＴ精製後のライブラリー調製
一実施形態において、選別の第一ラウンドに適切な最初の１０ｍｌの翻訳容量を用いることができるが、次の手順はより少量の翻訳反応に容易に適用できることに留意するべきである。
【０１３５】
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子は、上述の通り翻訳およびオリゴｄＴによって精製することができる。精製されたライブラリーは、翻訳に用いられている網状赤血球ライセート容量と等量またはより少ないｄＨ２Ｏ容量で回収するべきである。インプット、最後の洗浄バッファーおよび１０μｌのライブラリーは、上述の通り計数して収量および回収率を決定することができる。
【０１３６】
Ｂ：ＦＬＡＧ結合
オリゴｄＴ精製したライブラリーは、ライブラリー容量の１／４の５×ＰＢＳを加えることによって最終濃度１×ＰＢＳに平衡化することができる。全ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子の捕集に必要な抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースビーズ量を概算することができる（例えば、ビーズの結合能力を５０％スラリー１ｍＬ当たり約６ｎｍｏｌ融合タンパク質であると概算）。結合および洗浄における操作に十分なビーズ容量を有するために、２００μＬ未満の前洗浄ビーズを用いることは勧められない。大口径ピペットチップを用いて抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースを新しいチューブに移すことができる。ビーズをスピンダウン（１５００ｒｐｍ、１分間）してバッファーを除去することができる。保存バッファーに含まれているどれ程微量の界面活性剤も除去するため、ビーズを１ｍｌのＰＢＳで２−３回洗浄することができる。オリゴｄＴ精製したライブラリーは、１×ＰＢＳにおいて洗浄した抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースビーズに移して、４℃で１時間から一晩回転することができる。
【０１３７】
Ｃ：ＦＬＡＧ洗浄
場合によるステップとして、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースビーズは、１５００ｒｐｍ、１分間４℃でスピンダウンして上清を廃棄することができる。１×ＰＢＳを用いてビーズをＢｉｏ−Ｒａｄ（商標）ミニスピンカラムまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）微量遠心スピンカラムに移し、続いてバッファーは１０００ｒｐｍで１０秒間スピンすることによって除去できる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カラムは、より高速（例えば、１０，０００ＲＰＭが可能）でスピンすることができる。ビーズは、５００−６００μＬの１×ＰＢＳによって４回洗浄することができ、ＰＢＳはカラムを通してスピンすることができる。ビーズは、５００−６００の１×ＲＴ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー（ＤＴＴ無し）によって２回洗浄することができる。貫流液は廃棄することができるが、シンチレーション計数のため最後の洗浄液を取り分けることが望ましい。
【０１３８】
Ｄ：ＦＬＡＧ溶出
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子は、１００μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧペプチドの１：２０希釈のＲＮａｓｅＯＵＴを含有するＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー（ＤＤＴ無し）中溶液を４５０μＬ（より少量のＭ２アガロース容量には２３０μＬを用いてよいことに留意）加え、続いて混合液を１０分間室温で温置することによって溶出することができる。溶出液は、３０００ｒｐｍ以上で２０秒間スピンすることによって収集できる。このステップは、１回繰り返すことができ、次に両方の溶出液から得られたライブラリーをプールすることができる。
【０１３９】
Ｅ：ＦＬＡＧ回収の計算
５−１０μＬの溶出アウトプットおよび最後の洗浄液から得られた１００μＬをベータカウンターで計数する。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子の回収％は、次の通りに計算することができる（１０−３０％以上の回収が予想されることに留意）。
＝（ＣＰＭアウトプット×容量アウトプット）／（ＣＰＭインプット×容量インプット）
【０１４０】
Ｆ：逆転写
上述の第１６節に記載されているプライマーを用いることができる。
【０１４１】
【表３】
反応液は、攪拌有りまたは無しで、３７℃で１時間温置することができる。ライブラリーは、次の通り細胞表面抗原に対する選別のため平衡化することができる。逆転写反応が完了した後、５Ｍ ＮａＣｌが反応混合液に添加されて、７５ｍＭとなることができる（１５．３μＬが１ｍＬ反応液に、７．６が５００μＬに）。容量を増やす必要がある場合、追加的な１×ＰＢＳをライブラリーに加えることができる。次のブロッキング試薬は、選別前にライブラリーに添加することができる。
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
プレクリアステップは、未処理ライブラリー選別に必要となり得るが、単一のテンプレートから作製されたライブラリー、例えば親和性成熟のため作製されたライブラリーを用いる場合、省略することができる。
【０１４４】
ライブラリープレクリアに用いられている細胞（抗原未処理細胞）は、フローサイトメトリーまたはウエスタンブロット解析によって標的抗原を細胞表面に発現していないことを確認するべきである。例えば、この細胞は、抗原を発現する安定した細胞系の作製に用いた親細胞となることができ、このことは、プレクリアと選別に用いられている細胞の間の唯一知られている表面タンパク質の差異が、標的抗原そのものであるべき状況を提示する。
【０１４５】
ライブラリーのプレクリアに必要とされる細胞数を計算するべきである。これは、ライブラリーのプレクリアに必要とされる抗原未処理細胞の数であり、ライブラリー選別用と同数である。細胞数（Ｘ）は、いくつかの数値、すなわち抗原発現細胞表面上の抗原コピー数（Ｃ）、選別のためのライブラリーサイズ（Ｓ＝モル数×６×１０２３）および標的抗原と結合するライブラリーの画分（Ｆ）から計算される。これは次式により概算して、１０倍過剰の標的抗原またはプレクリア能力を可能にする。
Ｘ＝１０×Ｓ×Ｆ／Ｃ
【０１４６】
例えば、ある特定の抗原が１×１０４の推定細胞表面コピー数を有するとすると、抗原結合またはバックグラウンド固着によって、１０ｐｍｏｌ未処理抗体ライブラリーにおいて０．０５％（５×１０−４）未満のライブラリーが回収できる。プレクリアおよび選別に必要とされる細胞数は、次の通りである。
Ｘ＝１０×（１０×１０−１２×６×１０２３）×（５×１０−４）／（１×１０４）＝３×１０６
【０１４７】
実際には、ペレット形成後に細胞ペレットを目視できることを確実にするため、細胞数は５×１０６以上とするべきである。
【０１４８】
Ｇ：ライブラリーのプレクリア
細胞密度は血球計算板またはコールターカウンターによって計数することができ、十分な細胞を遠心分離チューブに移すことができる。細胞は、１５００ｒｐｍ、４℃でスピンダウンし、１ｍＬの氷冷ＰＢＳに非常に穏やかに再懸濁することができる。細胞懸濁液は１．７ｍＬねじ蓋付き微量遠心チューブに移すことができる。細胞をピペッティングによって剪断しないよう注意する。細胞は、１５００ｒｐｍでスピンダウンしてＰＢＳを除去することができる。ＰＢＳによる洗浄ステップは、もう１回繰り返すことができる。ステップ１３．３．３から得られたライブラリーは、穏やかに再懸濁した細胞に即座に添加するべきである。次にチューブは、氷水ウォーターバスに浸して約６０分間攪拌することができる。細胞を１５００ｒｐｍでスピンダウンし、第二のプレクリアまたは抗原選別のための細胞の新しいチューブにライブラリーを移すことができる。
【０１４９】
Ｈ：抗原発現細胞に対するライブラリー選別
抗原選別に必要な細胞数を計算する。これは、上で計算された通りのライブラリープレクリア用と同数である。細胞数（Ｘ）は、いくつかの数値、すなわち抗原発現細胞表面における抗原のコピー数（Ｃ）、選別のためのライブラリーサイズ（Ｓ＝モル数×６×１０２３）および標的抗原と結合するライブラリーの画分（Ｆ）から計算される。これは、次式によって概算して、１０倍過剰の標的抗原またはプレクリア能力を可能にする。
Ｘ＝１０×Ｓ×Ｆ／Ｃ
【０１５０】
Ｉ：ライブラリー選別
抗原発現細胞の密度は、血球計算板またはコールターカウンターによって計数することができ、十分な抗原発現細胞を遠心チューブに移すことができる。細胞は、１５００ｒｐｍ、４℃でスピンダウンし、細胞を非常に穏やかに１ｍＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁することができる。細胞懸濁液は、１．７ｍＬねじ蓋付き微量遠心チューブに移すことができる。細胞をピペッティングによって剪断しないよう注意する。細胞を１５００ｒｐｍでスピンダウンしてＰＢＳを除去し、ＰＢＳでもう１回洗浄を繰り返す。精製および／またはプレクリアしたライブラリーを即座に用いて、細胞を穏やかに再懸濁することができる。チューブは氷水のウォーターバスに浸し、２時間回転することができる。１５００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を廃棄する。細胞は１ｍＬのＰＢＳで４回洗浄し、１５００ｒｐｍでスピンダウンして上清を廃棄することができる。細胞は、５００μＬのＰＢＳに再懸濁することができる。必要に応じて、細胞と最後の洗浄液の２０％までを計数する。
【０１５１】
Ｊ：ライブラリーアウトプットの回収
５μＬのＲＮａｓｅＨ（２Ｕ／μＬ）を再懸濁した細胞に加え、３７℃で２０分間温置することができる。この操作はＲＮＡを消化し、細胞表面からｃＤＮＡを遊離させる。細胞を１５００ｒｐｍで３０秒間スピンダウンし、上清を新しいチューブに移すことができる。ここに至って細胞を廃棄することができる。５μＬのＲＮａｓｅＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を上清に加え、３７℃で３０分間温置することができる。この操作は、選別過程において破砕された細胞に由来する可能性のあるあらゆる細胞性ＲＮＡを分解する。分解されたＲＮＡは後に透析によって除去することができ、これによってＰＣＲによるライブラリー増幅への干渉を防ぐことができる。上清に等量のフェノール／ＣＨＣｌ３／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、３０秒間ボルテックスにかける。下層の有機相は、Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ Ｈｅａｖｙ２ｍｌチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において、最高速度で５分間遠心分離することによって上層の水相から分離することができる。上層の水相を新しいチューブに移し、フェノール／ＣＨＣｌ３／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回、ＣＨＣｌ３で１回抽出を繰り返すことができる。ＣＨＣｌ３抽出後の上層の水相は、Ｍｉｎｉ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ、８ｋＤａ ｃｕｔ−ｏｆｆ、２ｍＬ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へと移し、一晩４℃で４リットルのｄＨ２Ｏに対して透析することができる。
【０１５２】
Ｋ：計数およびライブラリー選別回収の計算
ラウンド３から始めて、最後の洗浄液と細胞の１０−２０％を計数する。
選別回収％＝１００×ＣＰＭ全細胞／ＣＰＭ全インプット
【０１５３】
１８．ＲＴ−ＰＣＲによるライブラリーＤＮＡの再増幅
逆転写は、ライブラリーから捕集した材料を用いて行うことができる。本技術分野で公知の試薬およびプロトコールが、逆転写反応の実施に適切である。選別後のビーズ容量に応じて、反応液の容量はスケールアップまたはダウンすることができる。
【０１５４】
逆転写に用いられているプライマーは、抗体ライブラリーの３’末端非可変領域に位置する任意の適切なリバース相補配列となることができ、また続く増幅ＰＣＲに用いられるリバースプライマーと同一またはさらに３’となることができる。
【０１５５】
例示的な逆転写反応液は、ライブラリー選別由来のビーズ（水に懸濁）、リバースプライマーおよびｄＮＴＰを含む。反応液を６５℃で約５分間温置し、氷上で冷却する。次に、通常Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ合成バッファー、約０．１Ｍ ＤＴＴおよびＲＮａｓｅインヒビターを反応液に添加する。逆転写酵素の添加前に、逆転写反応液を約４２℃で２分間温置する。反応液は、時々攪拌しつつ約４２℃で５０分間温置する。次に反応液は９５℃で５分間温置する。続いてビーズを磁石によって収集し、上清を新しいチューブに移し、同一の選別アウトプット由来であればプールする。ビーズを水（ＲＴ容量の半量）に再懸濁し、チューブにおいて９５℃で５分間温置する。磁石を用いてビーズを再度収集し、上清を、前に移しておいた上清と共にプールする。これは選別アウトプットのＰＣＲ増幅のためのｃＤＮＡテンプレートを含む。ＰＣＲ後、１０−□ＬのＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上にロードし、反応が成功したことを確認する。
【０１５６】
１９．ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のためのＰＣＲ
第一および第二ラウンドの選別アウトプットのため、ｃＤＮＡ（ＲＴ反応由来の上清）は８ｋＤａカットオフを用いて水に対して透析することができ、ｃＤＮＡ全量をＰＣＲテンプレートとして用いることができる。後期ラウンドの選別アウトプットのため、通常ｃＤＮＡの１０％をＰＣＲテンプレートとして用いることができ、通常透析は必要とされない。ラウンド１および２のアウトプットのために（全ＲＴ産物を用いて）、反応は１ｍＬのＰＣＲ容量において行うことができるが、一方後期ラウンド由来のアウトプットのために反応容量はスケールダウンすることができる。１００μＬ反応溶液のためのアリコートはマスターミックスから作製するべきである。ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のための例示的なＰＣＲ反応液を下の表７に示す。
【０１５７】
【表５】
【０１５８】
例示的な一実施形態において、ラウンド１および２のアウトプットには１ｍＬのＰＣＲ反応液が用いられ、後期ラウンド由来のアウトプットには０．５ｍＬの反応液が用いられる。１００μＬ反応液のアリコートはマスターミックスから作製するべきである。ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のための例示的なサーマルサイクル条件を下の表８に示す。
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
例示的な一実施形態において、ラウンド１および２のアウトプットには１ｍＬのＰＣＲ反応液が用いられ、後期ラウンド由来のアウトプットには０．５ｍＬ反応液が用いられる。１００−□Ｌ反応液のアリコートはマスターミックスから作製するべきである。ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のための例示的なサーマルサイクル条件を下の表８に示す。
【０１６１】
【表７】
ライブラリーＤＮＡテンプレート増幅のためのサーマルサイクル条件
９５℃ ２分間
９５℃ ２０秒間
５５℃ １０秒間 ２０サイクル＊
７０℃ １５秒間
７０℃ ３０秒間
４℃ 永続的に維持する
＊注記：通常、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼを用いて１８−２０サイクルの増幅を行うことができるが、十分量のライブラリーＤＮＡの増幅には１３サイクルもの回数でも良好に行うことができる。追加的な増幅サイクルによって様々なサイズの非特異的産物がより顕著となる可能性があり、産物はゲル精製が必要となり得る。可能であれば、増幅サイクル数よりもＤＮＡテンプレートインプットの増加が有用となり得る。
【０１６２】
【表８】
【０１６３】
ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物のサイズは例えばアガロースゲル電気泳動によって確認される。産物が正確なサイズ（ｓｃＦｖは、ほぼ８５０ｂｐ、ＶＨまたはＶＬライブラリーは、ほぼ５００ｂｐ）であり、最小限の非特異的産物が存在している場合、産物は一般に、直接次のラウンドの転写反応溶液において、またはスピンカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（商標） ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット）による精製の後に用いることができる。一部のケースにおいて、ＰＣＲ産物はゲル精製を必要とし得る。ゲル精製がＰＣＲ産物に対して行われる場合、残りの全産物を調製的アガロースゲルで分離して、特異的バンドをゲル抽出のために切り出す。ＤＮＡにおける残存ＥｔＢｒはＵＶ吸光度に干渉する傾向があるため、ゲル精製したＤＮＡは定量を誤らせる可能性がある。ゲル抽出におけるより広範な洗浄ステップはこの干渉を低減するのに有用となり得る。ＵＶ走査トレースは純粋なＤＮＡサンプルと残存ＥｔＢｒを有するＤＮＡとの間で非常に異なるため、可能であればＤＮＡ濃度は分光計で測定するべきである。続いてこのプロトコールは繰り返され、複数ラウンドの選別を行う。
【０１６４】
Ａ：ＶＨ ＣＤＲ３スペクトラタイピングＰＣＲ
スペクトラタイピングＰＣＲは、ライブラリーまたはその選別アウトプットにおけるＶＨ ＣＤＲサイズ分布の解析に用いることができる。これは選別の進行と共にライブラリーの多様性を評価するのに有用なツールである。最初の数ラウンドのライブラリー選別アウトプットと選別前のライブラリーは十分に多様でなければならず、ＣＤＲ３サイズ分布はガウス分布に近似する。
【０１６５】
【表９】
スペクトラタイピングＰＣＲの設定
ｃＤＮＡテンプレート ２．０μＬ
ｄＨ２Ｏ １８．１μＬ
５×ＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ反応バッファー ６．０μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．８μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．６μＬ
５’フォワードプライマー（１０μＭ） ０．６μＬ
３’リバースプライマー（１０μＭ） ０．６μＬ
ＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡポリメラーゼ ０．３μＬ
全容量 ３０．０μＬ
【０１６６】
Ｐｒｏｍｅｇａ製ＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼがこの設定に用いられているが、他のソース由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが代用してもよい。最終Ｍｇ２＋濃度は１．５ｍＭである。
サーマルサイクルのプログラム
９４℃ ２分間
９４℃ ２０秒間
５５℃ ２０秒間 ３０サイクル
７２℃ ３０秒間
７２℃ ５分間
４℃ 永続的に維持する
【０１６７】
Ｂ：スペクトラタイピング電気泳動と解析
ＰＣＲ後、１０μＬの産物を２％アガロースゲルにロードし、反応が成功したことを確認することができ、残りの産物は、ＲＯＸ標識ＤＮＡサイズマーカーと共にシーケンサーでスペクトラタイピング電気泳動のための配列決定コアファシリティーに付すことができるが、これは恐らく標識色素が異なるためＤＮＡ産物のサイズを通常３ｂｐ過小評価する。
【０１６８】
増幅ＤＮＡ産物は、次の構成を備える。
５’−ＦＲ３（２７ｂｐ）−ＶＨ ＣＤＲ３−ＦＲ４（３５ｂｐ）−３’
ＶＨ ＣＤＲ３のサイズは、Ｒｏｘ色素サイズマーカーによって決定された見かけ上のＤＮＡ産物のサイズから、次の計算によって推定される。
サイズＶＨ ＣＤＲ３＝（サイズ見かけ上のＤＮＡ産物サイズ−６０）／３
式中、６０＝（６２両末端のフレームワーク−１３’突出＋３ＤＮＡマーカー過小評価）
【０１６９】
１６．例示的な試薬およびバッファーの組成
１０×化学ライゲーションバッファー
Ｔｒｉｓ、ｐＨ７ ２５０ｍＭ
ＮａＣｌ １Ｍ
【０１７０】
【表１０】
【０１７１】
【表１１】
【０１７２】
選別バッファー
リン酸塩ベースバッファー
ＰＢＳ １×
ＢＳＡ １ｍｇ／ｍＬ
サケ精子ＤＮＡ ０．１ｍｇ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０２５％
酵母ｔＲＮＡ（場合による、使用前に添加） ２０ｎｇ／ｍＬ
【０１７３】
代替的なＨＥＰＥＳベースバッファー
ＨＥＰＥＳ ５０ｍＭ
ＮａＣｌ １５０ｍＭ
ＢＳＡ １ｍｇ／ｍＬ
サケ精子ＤＮＡ ０．１ｍｇ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０２５％
酵母ｔＲＮＡ（場合による、使用前に添加） ２０ｎｇ／ｍＬ
【０１７４】
Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄバッファー
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３ ２５０ｍＭ
ＫＣｌ ３７５ｍＭ
ＭｇＣｌ２ １５ｍＭ
【０１７５】
５０×ＦＬＡＧストック溶液
ＦＬＡＧペプチド ２５ｍｇ
選別バッファー ５ｍＬ
１ｍＬのアリコートを作製し、−２０℃で保存する。
【０１７６】
ＦＬＡＧ溶出溶液
５０×ＦＬＡＧストック溶液 １ｍＬ
選別バッファー ４９ｍＬ
１ｍＬのアリコートを作製し、−２０℃で保存する。
【０１７７】
オリゴｄＴセルロースの調製
２．５ｇのオリゴｄＴセルロースを５０ｍＬチューブ内で計量する。
２５ｍＬの０．１Ｎ ＮａＯＨを添加し、混合する。
１５００ｒｐｍで３分間スピンダウンし、上清を捨てる。
オリゴｄＴセルロースを２５ｍＬの１×オリゴｄＴ結合バッファーで洗浄する。
１５００ｒｐｍで３分間スピンダウンし、上清を捨てる。
もう３回洗浄を繰り返し、上清のｐＨを測定する。
ｐＨは洗浄バッファーと同じでなければならない（ほぼｐＨ８．５）。
最終容量が２５ｍＬになるよう１×オリゴｄＴ結合バッファーを加えることによってオリゴｄＴセルロースを再懸濁する。これは約５０％スラリーとなることができる。
前洗浄したセルロースビーズを４℃で保存する。
最終濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ＝１ｎｍｏｌ ＲＮＡ結合能力。
【０１７８】
抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースの調製
２５ｍＬのＭ２アガロースビーズを５０ｍＬチューブに移す。
Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機において５分間１０００ｒｐｍでビーズをスピンダウンし、アスピレーションによって上清を除去する。
ビーズを等量の１０ｍＭグリシン、ｐＨ３．５に再懸濁することによって洗浄する。
Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機において５分間１０００ｒｐｍでビーズをスピンダウンし、アスピレーションによって上清を除去する。
１カラム容量の１×ＦＬＡＧ結合バッファーに再懸濁する。
Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機において５分間１０００ｒｐｍでスラリーをスピンダウンし、アスピレーションによって上清を除去する。
洗浄を３回繰り返す。
１カラム容量の１×結合バッファー（１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡと１００ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む）に再懸濁する。
１時間または一晩、４℃で転倒混和する。
必要に応じて２ｍＬ画分のアリコートを作製し、４℃で維持する。
【０１７９】
（実施例１）
機能的ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の証明
４種の公知の抗体を用いて、機能的ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子が提示され、それらそれぞれの抗原と結合できることを証明した。Ｄ２Ｅ７（ヒト抗ｈＴＮＦ）、Ｙ６１（ヒト抗ｈＩＬ−１２）、１７／９（マウス抗−ＨＡ）およびＭＡＫ１９５（マウス抗ｈＴＮＦ）。下の表９に示されているプライマーを用いたプラスミドＤＮＡのＰＣＲによって、ＭＡＫ−１９５ｓｃＦｖを作製した。
【０１８０】
【表１２】
ＮＣＢＩデータベースからダウンロードしたタンパク質配列Ａ３１７９０およびＢ３１７９０に基づく次のプライマー（下の表１０を参照）を用いたＰＣＲによって、抗ＨＡ１７／９ｓｃＦｖ（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｇａｈｍｅｎら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４（４）：１０９８−１１８を参照）を作製した。
【０１８１】
【表１３】
【０１８２】
これらｓｃＦｖのＤＮＡコンストラクトは、インビトロで転写され、次にウサギ網状赤血球ライセートによってｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ（タンパク質はピューロマイシン修飾を有するリンカーを介してｍＲＮＡに結合している）として、または遊離ｓｃＦｖ（タンパク質はｍＲＮＡに結合していない）として翻訳された。両方のタイプの分子を精製し、対応するビオチン化抗原によるプルダウンアッセイに付した（図４を参照）。
【０１８３】
図４のデータは、機能的ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ（ビオチン化抗原と結合）は、遊離ｓｃＦｖよりも低い回収率であったがストレプトアビジン−磁気ビーズによってプルダウンできることを示す。さらに別の実験によって、この差が単にｓｃＦｖに繋がった重いＲＮＡによるものであることが示された。ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子におけるＲＮＡ部分をＲＮａｓｅによって分解することにより、ｓｃＦｖの抗原による回収を遊離ｓｃＦｖの回収と同一のレベルにまで回復させた（図５を参照）。
【０１８４】
（実施例２）
翻訳反応を改善するためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化
好ましい一実施形態において、ライブラリーサイズは１×１０１２である。ライブラリーサイズの１２倍をカバーするため、約２０ｐｍｏｌの融合タンパク質（例えば、１．２×１０１３）が選別に必要とされる。ＦＬＡＧ精製に続いて行われる回収は、通常約３０％である。従って、ＦＬＡＧ精製にインプットするため、約６０ｐｍｏｌの融合タンパク質がオリゴｄＴ精製の後に必要とされる。一実施形態において、オリゴｄＴ精製の後、１００ｐｍｏｌのＲＮＡにつき約１．２ｐｍｏｌの融合タンパク質が得られる。この実施形態において、６０ｐｍｏｌの融合タンパク質を得るために約５ｎｍｏｌのＲＮＡ（ライブラリーサイズの３０００倍に及ぶ）が必要とされる。この計算が、融合ｍＲＮＡディスプレイ分子の約２０−３０％だけが機能的である（選別後に回収できる）との観察を考慮に入れていないことに留意。
【０１８５】
ｍＲＮＡディスプレイ法の次のステップに必要とされる前記融合タンパク質量のため、タンパク質の回収を最大化するよう翻訳反応を最適化した。翻訳反応への最初のＲＮＡインプット量の変化をＦＬＡＧ精製の後に評価した。翻訳反応において取り込まれたＳ３５メチオニンの比率を測定することによって、またタンパク質ｐｍｏｌ数（アウトプット）のＲＮＡｐｍｏｌ数（インプット）に対する比率を計算することによってタンパク質回収を評価した。試験したインプットＲＮＡ出発量を、その結果得られたタンパク質回収と共に表１２に示す。この解析で証明されたように、より少量のＲＮＡインプットによって驚くほどさらに高いタンパク質回収率がもたらされる。
【０１８６】
【表１４】
【０１８７】
様々な量の遊離アミノ酸混合物を用いた翻訳反応も行って、タンパク質回収における影響を決定した。試験したアミノ酸混合物の相対的な出発量を、その結果得られたタンパク質回収と共に表１３に示す。各ケースにおけるＲＮＡインプットは５０ｐｍｏｌであった。この解析で証明されたように、アミノ酸プールの増加は翻訳効率を減少させる。
【０１８８】
【表１５】
【０１８９】
様々な量の「非アイソトープ」（すなわち、非放射性）メチオニンの、その翻訳効率における効果も試験した。試験した様々な濃度の非アイソトープメチオニンを、その結果得られたタンパク質回収と共に表１４に示す。各ケースのＲＮＡインプットは５０ｐｍｏｌである。この解析によって証明されたように、非アイソトープメチオニンのインプット増加は翻訳効率の増加を生じない。
【０１９０】
【表１６】
【０１９１】
従って、ｍＲＮＡディスプレイの翻訳反応を計画する場合、ＲＮＡインプットおよびアミノ酸濃度を考慮するべきである。各反応におけるＲＮＡインプットの減少はタンパク質回収を改善できるが、これはライブラリーサイズにも影響を与える。本発明のｍＲＮＡディスプレイ法の実施に有用となり得る例示的なＲＮＡ翻訳反応液を表１５に示す。
【０１９２】
【表１７】
【０１９３】
（実施例３）
ｓｃＦｖ選別のためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化−スペーサー長
ｓｃＦｖタンパク質とｍＲＮＡ末端の間の長いスペーサー長がｓｃＦｖフォールディングおよび機能を改善させることは、以前から提案されていた（Ｈａｎｅｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（１０）：４９３７−４２を参照）。従って、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の機能および収量におけるｓｃＦｖとリンカーアニーリング部位との間のスペーサー長の影響を調査した（図６を参照）。短い、中程度のおよび長い３’スペーサーを備える３種類の異なるＤ２Ｅ７ｓｃＦｖコンストラクトと、Ｙ６１および１７／９ｓｃＦｖのための２種類の短いおよび長いスペーサーコンストラクトを作製した（Ｄ２Ｅ７スペーサーコンストラクトは図８を参照）。図７に示されている結果は、より長いスペーサーは、抗原結合に評価されるようなｍＲＮＡ−ｓｃＦＶ分子の機能に測定可能な利点をもたらさないことを示す。さらに、より長いスペーサー長は、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖの収量を顕著に低減させた（図７参照）。より長いスペーサーはＲＮＡ収量も低かった。短いスペーサーは６ｎｍｏｌ ＲＮＡを生じ、中程度のスペーサーは３．４ｎｍｏｌ ＲＮＡを生じ、長いスペーサーは１．７ｎｍｏｌを生じた。従って、一実施形態において、より短いスペーサーがｓｃＦｖライブラリー構築に好ましい。
【０１９４】
３種類の異なるＹ６１コンストラクト（図２３を参照）を用いて異なるスペーサーおよびリンカーの比較も行った。下の表１６に示されている結果は、より長いスペーサーはＲＮＡ収量も低いことを示す。さらに、配列番号１０と配列番号４それぞれに示されている通り、これら２種類のコンストラクトの間でｓｃＦｖタンパク質は同一であるため、ｍＲＮＡそのもの（Ｙ６１−ｓｃＧｅｎｅ３ｐＡ）からｍＲＮＡとｓｃＦｖタンパク質の間のＤＮＡリンカー（Ｙ６１−ｓｃＧｅｎｅ３）へとポリＡテールを移動することによっても、ｍＲＮＡ分子の精製にも抗原結合に違いはなかった。
【０１９５】
【表１８】
【０１９６】
下に示す通り、１７／９は機能的となるために翻訳においてＰＤＩを必要とし、選別前の逆転写反応においてＤＴＴはその抗原結合に影響することが示された。これらの結果が示すように、ジスルフィド結合は１７／９機能に必要であり、このことから１７／９はスペーサー長要求を調べるのに適切な候補となる。図９は、より長いスペーサー長はｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の抗原への結合を改善せず、その収量を低減させることを示す。
【０１９７】
（実施例４）
ｓｃＦｖタンパク質のフォールディングおよび機能を改善するためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化−システイン残基における化学修飾の省略
本技術分野におけるメッセンジャーＲＮＡディスプレイ技術は、シアニル化をもたらす２−ニトロ−５−チオシアナト安息香酸による、またはスルフヒドリル基と共有結合するＮ−エチルマレイミドによる、望ましくないシステインジスルフィド結合の形成を防ぐためのフリーのシステイン残基の化学キャッピング反応を含む。このキャッピング反応は、フリーのシステイン残基のランダム架橋に起因する潜在的なタンパク質誤フォールディングを取り除くが、本発明は、予見できない物理的または化学的特性に起因するその将来的な製造可能性を損なう可能性のある抗体内フリーシステインの人為的な保護を取り除く。ライブラリー選別においてｓｃＦｖのＩｇ領域フォールディングに必要とされる４個のシステインを超えるどの余分のフリーのシステインも活発に保護されないように、化学キャッピングのステップは削除される。
【０１９８】
（実施例５）
ｓｃＦｖタンパク質フォールディングおよび機能を改善するためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化−同時翻訳タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性要求
イソメラーゼかシャペロンのいずれかの活性またはその両方によって、ＰＤＩがより良いタンパク質機能および分泌に寄与することが示唆されてきた（Ｓｈｕｓｔａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（８）：７７３−７；Ｓｍｉｔｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８５（３）：３４０−５０を参照）。２個のＩｇ領域内ジスルフィド結合は全ｓｃＦｖ配列によってコード化されており、一方はＶＨに、他方はＶＬ領域に存在する。同時翻訳タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）活性が、適切なジスルフィド結合のインビトロ形成に重要であることが示唆されてきた（Ｒｙａｂｏｖａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５（１）：７９−８４を参照）。本技術分野におけるｍＲＮＡディスプレイのプロトコールは、翻訳反応液に（ＰＤＩ）を含むことを定める。
【０１９９】
Ｄ２Ｅ７、Ｙ６１および１７／９ｓｃＦｖを用いて、これらのｍＲＮＡディスプレイシステムにおけるＰＤＩ活性要求を試験した。結果は、ｓｃＦｖの内の２種類（Ｄ２Ｅ７および１７／９）が、その生成においてＰＤＩ無しではその同起源の抗原と結合しないのに対し、Ｙ６１は影響を受けない様子であることを示した（図１０を参照）。広範なライブラリーレベルにおいて、高い多様性は、最大限のｓｃＦｖ機能を確実にするためＰＤＩ活性を必要とすることが結論される。
【０２００】
追加的なＰＤＩ添加有りまたは無しで翻訳されたＤ２Ｅ７ｓｃＦｖの回収と機能性も試験した。翻訳反応液は、１チューブのライセート（２００μｌ）、１００ｐｍｏｌ Ｄ２Ｅ７短スペーサーＲＮＡ、ＰＤＩおよびＧＳＳＧ／ＧＳＨを含む。ＰＤＩ無しの翻訳は、ＰＤＩとＧＳＳＧ／ＧＳＨを含まない。翻訳されたタンパク質をＦＬＡＧ精製によって回収し、回収量を定量した。続いて１０００００ｃｐｍ当たり５０ｍＭビオチン化ＴＮＦαおよび等量のインプットを用いて抗原結合／回収を行った。結果を下の表１７に示す。
【０２０１】
【表１９】
【０２０２】
Ｙ６１が機能性のために翻訳においてＰＤＩを必要としないことを示す結果を下の表１８に示す。
【０２０３】
【表２０】
【０２０４】
１７／９が機能性のために翻訳においてＰＤＩを必要とすることを示す結果を下の表１９に示す。
【０２０５】
【表２１】
【０２０６】
（実施例６）
ｓｃＦｖタンパク質フォールディングおよび機能を改善するためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化−反応からジチオスレイトールの除去
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、タンパク質凝集を最小限に抑え、タンパク質の酸化を抑制するよう酵素反応に一般に導入される還元剤である。これはまた、ｍＲＮＡｓｃＦｖ分子のインビトロ翻訳ステップに続く逆転写（ＲＴ）反応に通常用いられる。これを含有することによって、ＰＤＩ活性によって形成されたｓｃＦｖ分子における２個の鎖内ジスルフィド結合を抑制できるため、ＤＴＴのｓｃＦｖ抗原結合機能における潜在的な効果を調査した（図１１参照）。ＤＴＴが存在することによって、ＲＴ後の１７／９ｓｃＦｖの抗原結合活性が顕著に失われ、これは図１１に示されている１７／９機能のＰＤＩ活性依存と矛盾しない。ＲＴからＤＴＴが除かれると１７／９の大部分の抗原結合活性が保存されたため、この抗原結合活性の損失はＲＴ反応それ自身が原因ではない。さらに、結果から、１７／９ｓｃＦｖのｃＤＮＡはＤＴＴ無しでｍＲＮＡから確かに逆転写されたことがＰＣＲによって示され、これはＤＴＴがＲＴ反応に必須でないことを示唆する（データ無し）。
【０２０７】
選別前のＲＴ反応におけるＤＴＴが１７／９機能性に影響を与えることを示す結果は、下の表２０に示されている。しかし、図１２に示されている通り、ＤＴＴはＲＴ過程には影響を与えない。
【０２０８】
【表２２】
【０２０９】
１７／９ｓｃＦｖと対照的に、抗ＩＬ−１２Ｙ６１ｓｃＦｖの機能は、ＤＴＴに影響されなかった（図１１参照）。この結果は、上述のＰＤＩ活性に対して感受性がないことと矛盾なく、あらゆる抗体ｓｃＦｖがジスルフィド結合を機能のために必要とする訳ではないことを示唆する。様々なＲＴ条件をＹ６１−ｓｃＣＬ−短のために検討し、対応する結果を下の表２１に、また図１３にも示す。
【０２１０】
【表２３】
【０２１１】
一実施形態において、ＤＴＴはＲＴに含まれない、あるいはＲＴは抗原選別後まで延期してｍＲＮＡ−ｓｃＦｖライブラリーから得られる機能的ｓｃＦｖ収量の生産を最大化する。下の表２２および２３は、Ｙ６１−ＳｃＣＬ−長およびＹ６１−ＳｃＣＬ−短それぞれにおける抗原選別ステップ後までＲＴステップを延期させた結果を示す。
【０２１２】
【表２４】
【０２１３】
【表２５】
【０２１４】
（実施例７）
ｓｃＦｖタンパク質フォールディングおよび機能を改善するためのｍＲＮＡディスプレイ技術の最適化−抗原選別におけるＲＮａｓｅインヒビターの含有
ＲＴによる二本鎖ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡの形成は、抗原結合のためのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を準備し、ＲＮＡ分解を防止してＲＮＡ二次構造を抑制すると考えられる。抗原による選別の後、ｃＤＮＡはｍＲＮＡのアルカリ加水分解によって回収することができ、ＰＣＲの増幅テンプレートとなる。抗原選別前のＲＴにおけるＤＴＴのｓｃＦｖ機能に対する潜在的な影響を避けるため、選別後の増幅のためのｍＲＮＡを保護するために代替法を用いることが必要とされる。
【０２１５】
従って、ｍＲＮＡ−ＶＨ分子におけるその保護的ｃＤＮＡ鎖を欠くｍＲＮＡが、十分に安定的で、抗原選別後のＲＴ−ＰＣＲによる増幅に接近可能であるかどうか調査した。前に確認したＩＬ−１α結合ｍＲＮＡ−ＶＨ分子をモデル分子として用いた。抗原選別前または後にＲＴが行われた場合のＰｈｙｌｏｓ４０ＶＨ配列の回収を比較した（図１４参照）。本技術分野における方法（選別前ＲＴおよびｃＤＮＡのアルカリ溶出、左レーン）と比較したところ、ｍＲＮＡ−ＩＬ−１α複合体をＳＡ磁気ビーズに捕集して直接ＲＴに用いた場合（右レーン）、抗原選別後のＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの回収は顕著に抑制されたと考えられる。これは抗原選別における部分的なＲＮＡ分解、またはビーズ上のｍＲＮＡへＲＴのために接近しづらいことに起因する可能性がある。ＩＬ−１α−Ｐｈｙｌｏｓ４０ＶＨ相互作用を阻害し、ｍＲＮＡ接近可能性をより良くするための酸溶出（ｐＨ３）によってＳＡビーズからｍＲＮＡ−ＶＨ分子を解離する試みは、恐らくｍＲＮＡ安定性の低下、またはＳＡビーズと複合体を除去する前にｍＲＮＡ−ＶＨ分子がその抗原から溶出バッファーに解離しにくいため、その回収を悪化させると思われる。図１４は、酸溶出を用いたオリゴＤＴ後に続いてＲＴ−ＰＣＲが行われる標準的なＲＴ−ＰＣＲ法と、捕集後のビーズから直接行ったＲＴ−ＰＣＲを比較する、抗原選別後の逆転写の結果を示す。非結合ビーズで１：１０、１：１００および１：１０００希釈することによって、１：１０００希釈において強い再増幅が達成されたことが示された。
【０２１６】
抗原選別前のＲＴを省略し、その後ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡを回収することが可能なため、コンタミネートしたＲＮａｓｅ活性からＲＮＡをＲＮａｓｅインヒビターで保護することによって、減少したｍＲＮＡテンプレートの回収を回復または増強することができるか調査した。抗原選別ステップにおいてＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．＃１０７７７−０１９）を１：２０希釈で含有させ、続いてＲＴ−ＰＣＲを行ってｍＲＮＡ回収を比較した（図１５参照）。抗原選別前のＲＴと比較すると、ＲＴを抗原選別後にＲＮａｓｅインヒビター無しで行った場合、ｍＲＮＡテンプレートの再度の回収は減少する。興味深いことに、抗原選別におけるＲＮａｓｅインヒビターの含有は、ｍＲＮＡ回収を回復させるだけでなく顕著に増強する。従って、この増強は少なくとも部分的により軽いほぼ２８０ｋＤａのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の、追加的なｃＤＮＡを有するより重いほぼ５６０ｋＤａｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子より高い捕集効率に起因すると思われる。
【０２１７】
ＲＮａｓｅＯＵＴの含有はまた、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を用いても試験した。図１６は、ＲＮａｓｅＯＵＴ有りまたは無しにおいてＹ６１−ＣＬ−長とＹ６１−ＣＬ−短を比較するよう行われた実験を表す。結果は図１７と共に下の表２４に見出すことができる。
【０２１８】
【表２６】
【０２１９】
（実施例８）
１７／９ｓｃＦｖのライブラリー選別
本明細書に記載されているｍＲＮＡディスプレイ法を用いた数ラウンドの選別によってｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を濃縮できることを証明するため、重複ＰＣＲによって２５の多様性を有するｓｃＦｖライブラリーを構築した。ｓｃＦｖライブラリーを作製するため、１７／９、Ｄ２Ｅ７、２ＳＤ４、Ｙ６１およびＭＡＫ１９５の等量のＶＨおよびＶＬ断片を混合し、２５の最大多様性を有するｓｃＦｖライブラリーに合わせ、上述の通りに用いた。次にこのライブラリーからビオチン化ＨＡタグペプチドによって１７／９ｓｃＦｖを選別した。選別後、クローニングおよびコロニーＰＣＲによって１７／９の濃縮を検査した。１ラウンドのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ選別の前と後で１７／９ｓｃＦｖを定量した結果を、図１８に示す。１ラウンドのＨＡペプチドに対する選別の後、選別アウトプットから回収された全ｓｃＦｖ配列は、１７／９ｓｃＦｖの配列であった。
【０２２０】
（実施例９）
ｍＲＮＡディスプレイ技術は、異なる親和性を有するｓｃＦｖバインダーを識別するために用いることができる
ｍＲＮＡディスプレイ技術、すなわち上述の技術が、異なる親和性を有するｓｃＦｖバインダーを識別するために用いることができるか決定するため、Ｄ２Ｅ７と２ＳＤ４のキメラを作製した。２ＳＤ４は、ＴＮＦαに対して低い親和性（遊離タンパク質としてＫＤほぼ２００ｎＭ）を示す、Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの前駆体である。図１９はキメラを示す。
【０２２１】
遊離タンパク質に対して滴定を行った。図２０ａは異なるキメラの間の抗原結合後の回収率を示すが、一方図２０ｂは抗原選別後の正規化回収率を表す。上述の結果から、本明細書に記載されているｍＲＮＡディスプレイ技術は、異なる親和性を有するバインダーを識別するために用いることができることが示される。
【０２２２】
（実施例１０）
ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の耐熱性
ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の耐熱性を決定するため、本明細書に記載されているようにＤ２Ｅ７−ｓｃＣｋおよびＹ６１−ｓｃＣｋを翻訳して、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖフォーマットに精製した。次に、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を抗原選別前に様々な温度で３０分間温置した。抗原選別後の正規化回収率を図２１に示す。
【０２２３】
図２２は、ｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子の高温処理後にＲＮＡを回収できることを示す。そこで、回収されたＹ６１−ｓｃＣｌのｍＲＮＡ−ｓｃＦｖ分子を有するビーズにおいてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０２２４】
参照による援用
本願を通じて引用されている可能性のあるあらゆる引用文献（参考文献、特許、特許出願およびウエブサイト）の内容は、そこに引用されている参考文献のように、いかなる目的においてもこれによりその内容全体が参照によって本明細書に特に組み込まれている。本発明の実施において、他に断りがない限り、本技術分野においてよく知られている従来の細胞培養と分子生物学の技法が用いられている。
【０２２５】
均等
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態に具体化することができる。従って上述の実施形態は、本明細書の記載に本発明を限定するものではなくむしろ説明のためのものであることをあらゆる点で考慮するべきである。従って本発明の範囲は、上述の説明によってではなくむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、従って特許請求の範囲における均等の意義および範囲内のあらゆる変更を本明細書に包含することを目的とする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ピューロマイシンまたはそのアナログを３’末端に、ソラレンＣ６を５’末端に有する一本鎖核酸リンカーと架橋し、５’ｓｃＦｖおよび３’スペーサー配列をコードするｍＲＮＡを含む、ピューロマイシンまたはそのアナログと架橋した単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ｍＲＮＡ分子を提供するステップ、
（ｂ）標識の存在下、標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子が形成されるような条件下で、ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡをインビトロ翻訳するステップ、
（ｃ）標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を精製するステップ、
（ｄ）精製された標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を少なくとも１種類の抗原を用いた抗原選別に付すステップおよび
（ｅ）精製された標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を、親和性に基づいた磁気ビーズを用いて回収するステップ
を含む、ｓｃＦｖ抗体ＲＮＡディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項２】
（ｇ）抗原選別の後、ｓｃＦｖ ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
（ｈ）ｃＤＮＡを増幅するステップをさらに含む、請求項２の方法。
【請求項４】
標識が放射性標識である、請求項１の方法。
【請求項５】
標識が３５Ｓメチオニンまたはシステインである、請求項４の方法。
【請求項６】
３’スペーサー配列が約０から約２００アミノ酸を含む、請求項１の方法。
【請求項７】
３’スペーサー配列が約１６アミノ酸を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
３’スペーサー配列がアフィニティータグを含む、請求項１の方法。
【請求項９】
核酸リンカーが、５’から３’へと、
ソラレンＣ６、
配列ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ（配列番号２０）を含む２’ＯＭｅリボヌクレオチド、
６個のトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０部分、
２個のデオキシシチジン残基および
ピューロマイシン
を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子がＵＶＡによってＤＮＡリンカーと光架橋される、請求項１の方法。
【請求項１１】
ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子がＴ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択された５’プロモーターを含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子がタバコモザイクウイルス５’非翻訳領域を含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子がオリゴｄＴクロマトグラフィーによって精製される、請求項１の方法。
【請求項１４】
標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子が抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体アガロースビーズを用いて精製される、請求項１の方法。
【請求項１５】
標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子が、オリゴｄＴクロマトグラフィーおよび抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体アガロースビーズによって精製される、請求項１の方法。
【請求項１６】
抗原がビオチン化ペプチド、タンパク質またはハプテンである、請求項１の方法。
【請求項１７】
抗原がヒト免疫グロブリン結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）との融合タンパク質である、請求項１の方法。
【請求項１８】
抗原がマウス免疫グロブリン結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）との融合タンパク質である、請求項１の方法。
【請求項１９】
抗原がビオチン化ペプチド、タンパク質またはハプテンである、請求項１の方法。
【請求項２０】
抗原が細胞集団である、請求項１の方法。
【請求項２１】
抗体が抗ＩＬ−１２抗体である、請求項１の方法。
【請求項２２】
抗体が抗ＨＡ抗体である、請求項１の方法。
【請求項２３】
抗体がマウス抗体である、請求項１の方法。
【請求項２４】
抗体がヒト抗体である、請求項１の方法。
【請求項２５】
抗体がヒト化抗体である、請求項１の方法。
【請求項２６】
ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳が、ＧＳＳＨ／ＧＳＨの存在下でさらに行われる、請求項１から２４のいずれか一項の方法。
【請求項２７】
ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳がタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の存在下でさらに行われる、請求項２６の方法。
【請求項２８】
ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳がジチオスレイトールの不在下でさらに行われる、請求項１から２４のいずれか一項の方法。
【請求項２９】
ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳がジチオスレイトールの不在下でさらに行われる、請求項２７の方法。
【請求項３０】
ｍＲＮＡキャッピングステップを含まない、請求項１の方法。
【請求項３１】
精製ステップの前にインビトロ逆転写ステップを含まない、請求項１の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）から（ｇ）の内いずれかの前、間または後にＲＮａｓｅインヒビターが添加される、請求項１の方法。
【請求項３３】
前記精製ステップが、ジチオスレイトール不在下におけるｃＤＮＡ作製のためのｍＲＮＡの逆転写を含む、請求項１の方法。
【請求項３４】
ｃＤＮＡが約ｐＨ＝８．０−約ｐＨ＝１０．０のアルカリ加水分解によって溶出される、請求項２または３３の方法。
【請求項３５】
ｃＤＮＡが熱によって溶出される、請求項２または３３の方法。
【請求項３６】
ｃＤＮＡが約ｐＨ＝３．０−約ｐＨ＝６．０の酸によって溶出される、請求項２または３３の方法。
【請求項３７】
ｃＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項３３の方法。
【請求項３８】
ポリメラーゼ連鎖反応が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる、請求項３７の方法。
【請求項３９】
ポリメラーゼ連鎖反応がＰｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉおよびＫＯＤからなる群から選択された増幅酵素を用いる、請求項３７の方法。
【請求項４０】
ビーズが、ストレプトアビジン−Ｍ２８０、ニュートラアビジン−Ｍ２８０、ＳＡ−Ｍ２７０、ＮＡ−Ｍ２７０、ＳＡ−ＭｙＯｎｅ、ＮＡ−ＭｙＯｎｅ、ＳＡ−アガロースおよびＮＡ−アガロースからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項１】
（ａ）ピューロマイシンまたはそのアナログを３’末端に、ソラレンＣ６を５’末端に有する一本鎖核酸リンカーと架橋し、５’ｓｃＦｖおよび３’スペーサー配列をコードするｍＲＮＡを含む、ピューロマイシンまたはそのアナログと架橋した単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ｍＲＮＡ分子を提供するステップ、
（ｂ）標識の存在下、標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子が形成されるような条件下で、ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡをインビトロ翻訳するステップ、
（ｃ）標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を精製するステップ、
（ｄ）精製された標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を少なくとも１種類の抗原を用いた抗原選別に付すステップおよび
（ｅ）精製された標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子を、親和性に基づいた磁気ビーズを用いて回収するステップ
を含む、ｓｃＦｖ抗体ＲＮＡディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項２】
（ｇ）抗原選別の後、ｓｃＦｖ ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
（ｈ）ｃＤＮＡを増幅するステップをさらに含む、請求項２の方法。
【請求項４】
標識が放射性標識である、請求項１の方法。
【請求項５】
標識が３５Ｓメチオニンまたはシステインである、請求項４の方法。
【請求項６】
３’スペーサー配列が約０から約２００アミノ酸を含む、請求項１の方法。
【請求項７】
３’スペーサー配列が約１６アミノ酸を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
３’スペーサー配列がアフィニティータグを含む、請求項１の方法。
【請求項９】
核酸リンカーが、５’から３’へと、
ソラレンＣ６、
配列ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＣ（配列番号２０）を含む２’ＯＭｅリボヌクレオチド、
６個のトリエチレングリコールまたはＰＥＧ−１５０部分、
２個のデオキシシチジン残基および
ピューロマイシン
を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子がＵＶＡによってＤＮＡリンカーと光架橋される、請求項１の方法。
【請求項１１】
ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子がＴ７、ＳＰ６およびＴ３からなる群から選択された５’プロモーターを含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ分子がタバコモザイクウイルス５’非翻訳領域を含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子がオリゴｄＴクロマトグラフィーによって精製される、請求項１の方法。
【請求項１４】
標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子が抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体アガロースビーズを用いて精製される、請求項１の方法。
【請求項１５】
標識ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡ／タンパク質分子が、オリゴｄＴクロマトグラフィーおよび抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体アガロースビーズによって精製される、請求項１の方法。
【請求項１６】
抗原がビオチン化ペプチド、タンパク質またはハプテンである、請求項１の方法。
【請求項１７】
抗原がヒト免疫グロブリン結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）との融合タンパク質である、請求項１の方法。
【請求項１８】
抗原がマウス免疫グロブリン結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）との融合タンパク質である、請求項１の方法。
【請求項１９】
抗原がビオチン化ペプチド、タンパク質またはハプテンである、請求項１の方法。
【請求項２０】
抗原が細胞集団である、請求項１の方法。
【請求項２１】
抗体が抗ＩＬ−１２抗体である、請求項１の方法。
【請求項２２】
抗体が抗ＨＡ抗体である、請求項１の方法。
【請求項２３】
抗体がマウス抗体である、請求項１の方法。
【請求項２４】
抗体がヒト抗体である、請求項１の方法。
【請求項２５】
抗体がヒト化抗体である、請求項１の方法。
【請求項２６】
ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳が、ＧＳＳＨ／ＧＳＨの存在下でさらに行われる、請求項１から２４のいずれか一項の方法。
【請求項２７】
ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳がタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の存在下でさらに行われる、請求項２６の方法。
【請求項２８】
ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳がジチオスレイトールの不在下でさらに行われる、請求項１から２４のいずれか一項の方法。
【請求項２９】
ピューロマイシン架橋ｓｃＦｖ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳がジチオスレイトールの不在下でさらに行われる、請求項２７の方法。
【請求項３０】
ｍＲＮＡキャッピングステップを含まない、請求項１の方法。
【請求項３１】
精製ステップの前にインビトロ逆転写ステップを含まない、請求項１の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）から（ｇ）の内いずれかの前、間または後にＲＮａｓｅインヒビターが添加される、請求項１の方法。
【請求項３３】
前記精製ステップが、ジチオスレイトール不在下におけるｃＤＮＡ作製のためのｍＲＮＡの逆転写を含む、請求項１の方法。
【請求項３４】
ｃＤＮＡが約ｐＨ＝８．０−約ｐＨ＝１０．０のアルカリ加水分解によって溶出される、請求項２または３３の方法。
【請求項３５】
ｃＤＮＡが熱によって溶出される、請求項２または３３の方法。
【請求項３６】
ｃＤＮＡが約ｐＨ＝３．０−約ｐＨ＝６．０の酸によって溶出される、請求項２または３３の方法。
【請求項３７】
ｃＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項３３の方法。
【請求項３８】
ポリメラーゼ連鎖反応が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる、請求項３７の方法。
【請求項３９】
ポリメラーゼ連鎖反応がＰｌａｔｉｎｕｍ ＨｉＦｉおよびＫＯＤからなる群から選択された増幅酵素を用いる、請求項３７の方法。
【請求項４０】
ビーズが、ストレプトアビジン−Ｍ２８０、ニュートラアビジン−Ｍ２８０、ＳＡ−Ｍ２７０、ＮＡ−Ｍ２７０、ＳＡ−ＭｙＯｎｅ、ＮＡ−ＭｙＯｎｅ、ＳＡ−アガロースおよびＮＡ−アガロースからなる群から選択される、請求項１の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０ａ】
【図２０ｂ】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０ａ】
【図２０ｂ】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２０１２−５０４４１５（Ｐ２０１２−５０４４１５Ａ）
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３０１７８（Ｐ２０１１−５３０１７８）
【出願日】平成２１年９月３０日（２００９．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５９０５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３９８５０
【国際公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月３０日（２００９．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５９０５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３９８５０
【国際公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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