放射線不透過性の注入可能核ヒドロゲル組成物
経皮注入の際の椎間板核のすべてまたは一部のための置換材料としての使用に適した組成物であって、この組成物は、注入可能で、硬化性で、架橋可能で、非免疫原性の無毒なタンパク質ヒドロゲルであって、（ｉ）このタンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸を含有し、（ｉｉ）少なくとも約１０ｋＰａの静的圧縮弾性率を有し、かつ（ｉｉｉ）少なくとも約１０ｋＰａの動的圧縮弾性率を有する、タンパク質ヒドロゲルと；放射線不透過性を認識できるレベルまで高めるのに十分な量のヨウ素化合物を含むヨウ素化された造影液であって、この造影液は、静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下を引き起こす、ヨウ素化された造影液と；このヨウ素化された造影液の添加によって引き起こされる静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下の少なくとも約１００％を回復させるのに十分な量の架橋剤とを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、脊髄の疾患および損傷の処置において利用されるタンパク質ヒドロゲル組成物、特に脊椎椎間板（ｓｐｉｎａｌ ｄｉｓｃ）の回復に関する。より具体的には、本発明は、正常な椎間腔高さを回復するため、および好ましくは侵襲的な外科的手順なしでヒドロゲルの経皮注入によって、椎間円板の修復および回復における使用のための生体材料の導入を容易にするための組成物および方法を企図する。
【背景技術】
【０００２】
椎間円板の破壊または変性の原因は多く存在し、それらは、一般に力学的、遺伝的および生化学的と分類することができる。１つのそのような原因は、椎間板髄核（ｄｉｓｃ ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｌｐｏｓｕｓ）と呼ばれる、椎間板の中に作られるゼリー様の物質の喪失である。
【０００３】
多くの注入可能な生体材料が椎間板髄核の代用物として開発されてきた。このような物質としては、ヒアルロン酸、フィブリン糊、アルギン酸またはアルギン酸エステル、エラスチン様ポリペプチド、Ｉ型コラーゲンゲルなどを含めた種々のタンパク質が挙げられる。例えば、特許文献１；特許文献２；および特許文献３を参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，７７３，２４９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３８０，１５４（Ｂ１）号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１８４，３４８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような物質を椎間板に導入することの侵襲性は、変性椎間板疾患（ＤＤＤ）の処置のためなど、そのような物質を経皮注入することによって最小にされる可能性がある。従って、高強度でかつ耐久性のある、そして経皮的手順のあいだ可視化することができる物質についてのニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの実施形態では、本発明は、椎間板核（ｄｉｓｃ ｎｕｃｌｅｕｓ）のすべてまたは一部のための置換材料としての使用に適した注入可能組成物に関する。この組成物は、以下の成分を有する注入可能で、硬化性で、架橋可能で、非免疫原性の無毒なタンパク質ヒドロゲルを含む：
このヒドロゲルの最小で約１０重量％および最大で約２５重量％を構成するタンパク質成分；
認識できる放射線不透過性レベルを有しかつこのヒドロゲルの最小で約５重量％および最大で約３５重量％を構成するヨウ素化された造影液；および
このヒドロゲルの最小で約０．１重量％および最大で約１０重量％を構成する架橋剤。
【０００７】
別の実施形態では、本発明は、椎間板核のすべてまたは一部のための置換材料としての使用に適した組成物に関する。この組成物は、
（ｉ）少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸を含有するタンパク質成分を有し；（ｉｉ）少なくとも約１０ｋＰａの静的圧縮弾性率を有し；かつ（ｉｉｉ）少なくとも約１０ｋＰａの動的圧縮弾性率を有する、注入可能で、硬化性で、架橋可能で、非免疫原性の無毒なタンパク質ヒドロゲルと、
放射線不透過性を認識できるレベルまで高めるのに十分な量のヨウ素化合物を含むヨウ素化された造影液であって、この造影液は、静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下を引き起こす、ヨウ素化された造影液と、
このヨウ素化された造影液の添加によって引き起こされる静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下の少なくとも約１００％を回復させるのに十分な量の架橋剤と
を含む。
【０００８】
別の実施形態では、当該組成物のタンパク質ヒドロゲルは、以下の残基のうちの少なくとも１つを含有する：リジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、およびシステイン。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の組成物は、椎間円板核、すなわち、髄核（ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｌｐｏｓｕｓ）の中の天然物質の一部分または実質的にすべてを置き換える上で有用である。椎間円板は、脊椎の中の隣接する椎骨の間にある。このような椎間板としては、例えば、腰椎椎間板、胸部椎間板、頸部椎間板、および仙骨椎間板が挙げられる。
【００１０】
本発明の組成物は、好ましくは経皮注入の際の、椎間板核の（すなわち、髄核の）すべてまたは一部のための置換材料としての使用に適している。このような手順の間、当該組成物は、損傷を受けた椎間板へと注入される。
【００１１】
経皮的手順で硬化性生体材料を、損傷を受けた椎間板へと注入するための方法および器具は、より具体的には、本発明と同じ譲受人へとともに譲渡され、かつ参照によりあらゆる目的のためにその全体を本願明細書に援用したものとする、２００５年６月２９日出願の米国特許出願公開第２００６／００９８５１号に記載されている。
【００１２】
タンパク質ヒドロゲル
当該組成物は、タンパク質ヒドロゲル、すなわち、水が分散媒体であるコロイド状ゲル、またはタンパク質ヒドロゲルの混合物を含む。このタンパク質ヒドロゲルは、その顕著な水分含量に起因して、自然の組織の柔軟性度と同程度の柔軟性度を有することが好ましい。
【００１３】
１つの実施形態では、タンパク質成分は、このヒドロゲルの最小で約１０％および最大で約２５重量％を含む。
【００１４】
１つの実施形態では、このタンパク質ヒドロゲルは、以下のセグメントのうちの少なくとも２つ、好ましくは４つを含むタンパク質ブロック共重合体を使用して構築される：
（ｉ）天然に存在する絹に見出される６アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；
（ｉｉ）天然に存在するエラスチンに見出される５アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；
（ｉｉｉ）天然に存在するコラーゲンに見出される３アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；または
（ｉｖ）天然に存在するケラチンに見出される７アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；または
上記のもののいずれか２つ、３つ、もしくは４つすべての組み合わせ。
【００１５】
別の実施形態では、当該タンパク質ヒドロゲルは、タンパク質ブロック共重合体、好ましくは以下のセグメントを含むブロック共重合体を使用して構築される：
（ｉ）少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、これらの配列の各々は、天然に存在する絹に見出される６アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；
（ｉｉ）少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、これらの配列の各々は、天然に存在するエラスチンに見出される５アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；
（ｉｉｉ）少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、これらの配列の各々は、天然に存在するコラーゲンに見出される３アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；または
（ｉｖ）少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、これらの配列の各々は、天然に存在するケラチンに見出される７アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；または
上記のもののいずれか２つ、３つ、もしくは４つすべての組み合わせ。
【００１６】
好ましくは、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は、合計で少なくとも５０配列、および最大数で５００配列を含む。
【００１７】
加えて、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は、架橋されることができる官能基を含有する少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。天然に存在する官能基のいくつかの例としては、リジンおよびヒスチジン残基上のアミノ基、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基上のカルボキシル基、アルギニン残基上のグアニジノ基、セリンおよびトレオニン残基上のヒドロキシル基、ならびにシステイン残基上のチオール基が挙げられる。
【００１８】
このタンパク質が架橋のために利用できる官能基を含有しない場合、そのタンパク質のアミノ酸残基（上記の配列のアミノ酸を含むことができる）は、そのような官能基を含有するアミノ酸で置き換えられる。このタンパク質は、架橋可能な官能基を含有する少なくとも１つのアミノ酸を有する。好ましくは、このタンパク質は、少なくとも０．１％、より好ましくは少なくとも１％、最も好ましくは少なくとも約２％の、架橋可能な官能基を含有するアミノ酸を有する。通常は、このタンパク質は、２０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下の架橋可能な官能基を含有するアミノ酸を有する。
【００１９】
天然に存在する絹に見出されるアミノ酸の配列（Ｓｋ）の例はＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒである。天然に存在するエラスチンに見出されるアミノ酸の配列（Ｅｓ）の例はＧｌｙＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏである。天然に存在するコラーゲンに見出されるアミノ酸の配列（Ｃｌ）の例はＧｌｙＡｌａＰｒｏである。天然に存在するケラチンに見出されるアミノ酸の配列（Ｋｒ）の例はＬｙｓＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａである。
【００２０】
１つの態様では、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［［Ｂ］ｎ１−［Ｊ］ｎ２］ｎ３−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ（式１）
を有する。式中、
ＵおよびＺは、Ｓｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒ以外のアミノ酸配列、好ましくは当該タンパク質をクローニングする上で有用である配列を表し；
Ｂは、独立に、各位置でＳｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒを表し；
Ｊは、独立に、各位置でＳｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒを表すが、Ｂにおけるのと同じ配列ではなく；
Ｓｋは、ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒを表し；
Ｅｓは、ＧｌｙＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏを表し；
Ｃｌは、ＧｌｙＡｌａＰｒｏを表し；
Ｋｒは、ＬｙｓＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａを表し；
ｎ１は、１〜１２、より通常は２〜６、より通常は２〜４を表し；
ｎ２は、１〜１６、より通常は２〜１２、より通常は４〜８を表し；
ｎ３は、１〜３０、より通常は４〜２０、より通常は１２〜１８を表し；
ｎ６およびｎ７は、独立に０または１を表し；
ＢまたはＪによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸残基、例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、セリン、トレオニン、もしくはシステインを含むか、または含むように改変されている。
【００２１】
本願明細書では、用語「（当該）タンパク質をクローニングする上で有用であるＳｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒ以外のアミノ酸配列」および類似の語句、例えば、ＵおよびＺは、当該タンパク質をコードする核酸分子を単離または精製する上で役立つヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を意味する。
【００２２】
式１の１つの実施形態では、ＢはＳｋまたはＥｓを表す。別の実施形態では、ＪはＳｋまたはＥｓを表す。好ましい実施形態では、ＢおよびＪはＳｋまたはＥｓを表す。より好ましい実施形態では、ＢはＳｋを表し、ＪはＥｓを表す。
【００２３】
式１の別の態様では、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）ｎ３（Ｅｓ）ｎ４］ｎ５−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有する。式中、
ｎ３は１〜１２を表し；
ｎ４は１〜１６を表し；
ｎ５は１〜３０を表し；
ｎ６およびｎ７は０または１を表し；
ＳｋまたはＥｓによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸残基、例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、セリン、トレオニン、またはシステインを含むように改変されている。
【００２４】
式１のより特定の態様では、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）２（Ｅｓ）８］１７−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有する。式中、ＳｋまたはＥｓによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸残基、例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、セリン、トレオニン、またはシステインを含むように改変されている。この態様の好ましい実施形態では、少なくとも１つのＥｓセグメントは、ＧｌｙＸＧｌｙＶａｌＰｒｏまたはＧｌｙＶａｌＧｌｙＸＰｒｏ（式中、Ｘはリジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、セリン、トレオニン、およびシステインを表す）からなる群から選択されるアミノ酸配列；好ましくはＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏまたはＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｙｓＰｒｏによって置き換えられている。
【００２５】
式１のさらにより特定の態様では、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）２（Ｅｓ）４Ｅｓ’（Ｅｓ）３］１７−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有する。式中、Ｅｓ’は、ＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏまたはＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｙｓＰｒｏを表す。好ましくは、Ｅｓ’は、ＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏ（このようなタンパク質はＰ２７Ｋとして知られている）を表す。また、本発明は、Ｐ２７Ｋのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、好ましくはＰ２７Ｋのアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質ヒドロゲルを包含する。
【００２６】
本発明に係るタンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は、少なくとも約２０ｋＤ、一般に少なくとも約３０ｋＤ、好ましくは少なくとも約５０ｋＤの最小分子量を有することになろう。最大分子量は、通常は約２０５ｋＤ以下、より通常は約１５０ｋＤ以下、好ましくは約１００ｋＤ以下、さらにより好ましくは約７７ｋＤ以下である。当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は、少なくとも２つの架橋に利用できる官能基、より通常は少なくとも約４つの架橋に利用できる官能基を有することになろう。１つの官能基あたりの当量重量は、一般に、約１ｋＤ〜４０ｋＤの範囲、より通常は約５ｋＤ〜２５ｋＤの範囲、好ましくは約７ｋＤ〜１０ｋＤの範囲にある。
【００２７】
本発明の１つの実施形態によれば、当該核内物質の経皮的置換の間、当該タンパク質ヒドロゲルの機械的強度を維持すること、およびコラーゲン基材へのインプラントの接着を維持することが重要である。コラーゲン基材へのインプラントの接着は、インプラントを椎間板内の適所に保持する上で重要な構成要素であり、耐押出性試験（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）によって測定される。
【００２８】
ヨウ素化された造影液および架橋剤を加えた後、当該タンパク質ヒドロゲルは、好ましくは、各々約１０ｋＰａの、好ましくは各々約２０ｋＰａの最小静的圧縮弾性率および最小動的圧縮弾性率を有する。最大の静的圧縮弾性率および動的圧縮弾性率は、各々、約５００ｋＰａ、好ましくは各々約３００ｋＰａである。静的圧縮弾性率および動的圧縮弾性率は、それぞれ静的条件下および振動条件下での圧縮におけるひずみに対する応力の比である。（例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＣｈａｗｌａ、「Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」、１９９９年、９８−１０３頁を参照）。
【００２９】
ヨウ素化された造影剤
本発明の注入可能組成物は、注入の際に腰椎の許容できる可視性を提供するために、当該技術分野で公知のイメージング方法における使用のために適切な有機造影剤、好ましくはヨウ素化された造影剤をさらに含有する。このヨウ素化された造影剤は、例えば、Ｘ線、放射活性、赤外線、紫外線、電子線もしくは中性子線などの放射線、または磁場といった検出可能な形態にさらされている周囲の組織を区別する上で有用である。ヨウ素化された造影剤は、蛍光透視検査、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波などのイメージング方法で有用である。
【００３０】
１つの実施形態では、ヨウ素化された造影剤は非イオン性である。本願明細書で使用する場合、非イオン性は、１〜３個の共有結合されたヨウ素原子を含有する有機化合物を指す。例示的なヨウ素ベースの造影剤としては、ジアトリゾ酸、ヨーデコール、イオジキサノール、イオフラトール、イオグラミド（ｉｏｇｕｌａｍｉｄｅ）、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオトロール（ｉｏｔｒｏｌ）、イオベルソール、イオキサグル酸、およびメトリザミドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいヨウ素化された造影剤はＩｓｏｖｕｅ ３７０である。例えば、タンパク質ポリマー１ｍＬあたり６０ｍｇのＩの最終のヨウ素濃度を得るために必要とされるＩｓｏｖｕｅ ３７０の量は、弾性率および接着強度のおよそ３０％低下を引き起こすが、耐押出性に対しては最小の効果しか引き起こさない。
【００３１】
別の実施形態では、このヨウ素剤はイオン性である。本願明細書で使用する場合、イオン性は、１〜３個のヨウ化物イオンを含有する塩を指す。ヨウ化物塩のいくつかの例としては、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、およびヨウ化アンモニウムが挙げられる。
【００３２】
１つの実施形態では、ヨウ素化合物の原子と当該タンパク質ヒドロゲルの原子との間には、共有結合は実質的に存在しない。
【００３３】
ヨウ素化された造影剤は、当該組成物を放射線不透過性にするのに十分な量で、タンパク質に加えられる。本願明細書で使用する場合、用語「放射線不透過性」は、電磁放射線、特にＸ線、が特定の物質を通過できないという相対的無能力を指す。電磁放射線の通過を妨げる密な物質は、「放射線不透過性」と呼ばれる。この用語は、Ｘ線を密な物体に通したときの、Ｘ線撮影による撮像における相対的な不透明な白い外観を指す。放射線不透過性物質は、Ｘ線または類似の放射線が通過することを許容しないであろう物質である。
【００３４】
本発明の組成物は、放射線不透過性が認識できるレベル、すなわち、適切なイメージング方法、例えば、蛍光透視検査、ＣＴ、Ｘ線などによって検出可能であるレベルまで高められるとき、放射線不透過性である。
【００３５】
１つの実施形態では、認識できる放射線不透過性レベルを有するヨウ素化された造影液は、当該ヒドロゲルの最小で約５重量％および最大で約３５重量％を含む。
【００３６】
好ましい実施形態では、放射線不透過性は一過性である。本願明細書で使用する場合、一過性は、短期間でかつ短寿命であるという状態を指す。例えば、当該ヒドロゲルは、放射線不透過性を、最大で、通常は３０日以下、より通常は１４日以下、好ましくは７日以下、より好ましくは２日以下のあいだ、維持する。
【００３７】
架橋剤
当該架橋剤は、少なくとも２つの基を有する分子であって、この少なくとも２つの基の各々が当該タンパク質上の架橋可能な官能基、例えばアミノ、カルボキシル、グアニジノ、ヒドロキシル、またはチオ基と共有結合を形成することができる分子である。架橋のための官能基は、すべて同じであってもよいし、または上記官能基と共有結合を形成することができる官能基の組み合わせであってもよく、アミノ、例えばリジン、ヒスチジン；カルボキシル、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸；グアニジノ、例えばアルギニン；ヒドロキシル、例えばセリンおよびトレオニン；ならびにチオール、例えばシステインなどの官能基を含んでもよい。例えば、この架橋剤は、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分のアミノ酸上の天然に存在する官能基と反応する官能基を有してもよい。
【００３８】
アルデヒド、イソシアネート、混合カルボン酸無水物、例えばエトキシカルボニル無水物、活性化されたオレフィン、ハロ、アミノなどの種々の反応性官能基が、この架橋剤で用いられてもよい。当該タンパク質ポリマー上の官能基、および架橋剤の適切な選択によって、反応速度および架橋度を制御することができる。
【００３９】
１つの実施形態では、当該架橋剤は式：Ｘ１−Ｒ−Ｘ２を有し、式中、Ｘ１およびＸ２は、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分の官能基と共有結合を形成する官能基である。Ｒは、鎖の中に最小で２個、好ましくは３個、より好ましくは４個、および最大で２４個、好ましくは最大で１２個、より好ましくは最大で８個の炭素原子を有する飽和または不飽和のヒドロカルビル鎖（すなわちアルキルまたはアルケニル）を表す。このヒドロカルビル鎖の中の炭素原子は、任意に少なくとも１つのヘテロ原子によって置き換えられてもよく、ここでヘテロ原子は、−Ｏ−または−ＮＨ２−からなる群から選択され、各ヘテロ原子は少なくとも２つの炭素原子によって互いのヘテロ原子から隔てられている。１つの実施形態では、Ｘ１およびＸ２はエステル基またはイソシアネート基である。
【００４０】
種々の架橋剤、特にこれまで使用されてきており、かつ生理的に許容できることが判明している種々の架橋剤を用いてよい。当該架橋剤上のいくつかの有用な官能基としては、例えばグルタルアルデヒドなどのジアルデヒド、活性化されたジオレフィン、テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、オクタメチレンジイソシアネートなどのジイソシアネート、コハク酸二無水物、エチレンジアミン四酢酸二無水物などの酸無水物、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン、シクロ（Ｌ−リジル−Ｌ−リジン）イソシアネート基（例えば、テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、オクタメチレンジイソシアネート）アルデヒド基（グルタルアルデヒド）；酸無水物が挙げられる。好ましくは、この官能基はアミノ（グアニジンを含む）などである。また、この架橋剤は、非対称の官能基、例えば活性化されたオレフィンアルデヒド、例えばアクロレインおよびキノイド系アルデヒド、活性化されたハロカルボン酸無水物などを含有してもよい。これらの架橋剤は、通常は市販されているであろうし、または接着剤の付与の前か、もしくはその場での合成によって従来の方法に従って容易に合成されうる。
【００４１】
従って、当該タンパク質上の官能基および当該架橋剤に依存して、アミド、イミン、尿素、エステル、エーテル、ウレタン、チオエーテル、ジスルフィドなどが形成されうる。
【００４２】
当該架橋剤は、２以上の官能基、通常は４を超えない数の官能基を含有する。これらの官能基は、同じであってもよいし異なっていてもよい。当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分に対する架橋剤の比は、架橋剤、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分上に存在する官能基の数、所望の硬化速度などに依存して大きく変わるであろう。一般に、架橋剤に対する当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分の重量比は、少なくとも約１：１、通常は少なくとも約１０：１、一般に少なくとも約２０：１；および約２５０：１以下、通常は約１５０：１以下、一般に約５０：１以下であろう。このタンパク質−架橋剤当量比を選択する際の考慮事項は、固化（ｓｅｔｕｐ）の速度、架橋剤の反応性、混合物に対する架橋剤の相対的溶解性、架橋剤の生理学的特性、架橋生成物の所望の安定性度などであろう。
【００４３】
１つの実施形態では、架橋剤は、当該ヒドロゲルの、最小で約０．１重量％、最大で約１０重量％の量で含まれる。
【００４４】
ヨウ素化された造影液および当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分を一緒に混合することで、タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分の希釈が引き起こされ、得られるヒドロゲルの機械的強度の対応する低下が生じる。従って、本発明の組成物は、このヨウ素化された造影液の添加によって引き起こされる静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下の少なくとも約１００％、好ましくは少なくとも約１５０％を回復させるための十分な量の架橋剤を含む。
【００４５】
架橋剤を増やすことは、上記希釈効果を補うため、または希釈されたタンパク質濃度を含有するヒドロゲルの材料特性を改善するために使用することができる。この強度低下は希釈の量に依存する。希釈の量は、選ばれたヨウ素化された造影液の中のヨウ素濃度とともに変わるであろう。特に、造影液の中のヨウ素濃度が低いほど、インプラント材料の中のヨウ素の必要レベルを達成するためにより多くの液体が加えられる必要があろう。架橋剤が増えると、コラーゲンへの接着は、もとの希釈されていない材料と比べて、約３０％増大する可能性があり、耐押出性は、約１００％増大する可能性がある。
【００４６】
組成物
当該組成物は注入可能で、硬化性で、非免疫原性で無毒である。注入可能は、経皮的手順においてなどの髄核の置換の際に、当該組成物は、シリンジ、ポンプ、または類似のデバイスから、好ましくは液体として、核の中へと注入することができるということを意味する。
【００４７】
当該組成物は硬化性でもある。硬化性は、好都合な態様での状態、コンディションおよび／または構造の変化を意味する。硬化プロセスは、架橋剤の添加、熱、放射線、硬化触媒または促進剤の存在などの少なくとも１つの変動要素によって誘導される。硬化は部分的であってもよいし、完全であってもよい。硬化性組成物の注入は、本願明細書中上記で特定された米国特許出願公開第２００６／０００９８５１号明細書に記載されている。
【００４８】
本発明の組成物は非免疫原性であり、すなわち、当該組成物は重大な免疫応答を引き起こさない。当該組成物は「無毒」でもあり、すなわち、当該組成物は、核置換の対象、通常は人または実験室動物、に傷害を加えない。ヨウ素化された造影剤が一過性である場合は、その造影剤は、免疫原性または毒性にほとんど寄与しないであろう。
【００４９】
本発明に係る組成物は、組成物が要求される基準を達成する限り、大きく変わる可能性がある。このような組成物の適切な例は、例えば、最小で約３０重量％の水、および最大で約８５重量％の水；最小で約１０重量％のタンパク質および最大で約２５重量％のタンパク質；最小で約５重量％のヨウ素化された造影剤および最大で約３５重量％のヨウ素化された造影剤；ならびに最小で約０．１重量％の架橋剤および最大で約１０重量％の架橋剤を有する。この組成物は、約０．１重量％〜１０重量％の範囲のバッファー塩および／または他の配合添加剤も含んでよい。このようなバッファー塩および配合添加剤は、リン酸ナトリウムおよび／またはリン酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、トロメタミン、クエン酸ナトリウム、スクロースおよびマンノースを含んでもよい。
【００５０】
本発明の組成物は、本願明細書では特に経皮注入に関して記載されてきたが、当該組成物は、非経皮的手順において、例えば変性椎間板疾患（ＤＤＤ）の処置のための開放性の外科的手技において、または上述の米国特許出願公開第２００６／０００９８５１号明細書にも記載されている顕微鏡視下ヘルニア摘出術の補助的手段（ａｄｊｕｎｃｔ ｔｏ ｍｉｃｒｏｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ）（ＡＭＤ）手順において、注入可能組成物として使用されてもよいということは、理解されるはずである。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態の放射線不透過性の注入可能核ヒドロゲル組成物に関する。
【００５２】
実施例１Ａ−１Ｄ：
イオパミドール（Ｉｓｏｖｕｅ（登録商標））およびイオヘキソール（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ（登録商標））を造影剤として、ヘキサメチレンジイソシアネートを架橋剤として、ならびにリン酸ナトリウムを塩バッファーとして用いて、実施例１Ａ〜１Ｄに示す組成物に従って、放射線不透過性の注入可能核ヒドロゲル組成物を調製する。
【００５３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【００５４】
実施例２Ａ−２Ｅ：
イオジキサノール（Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ（登録商標））およびイオトロラン（Ｏｓｍｏｖｉｓｔ（登録商標））を造影剤として、水素化ジフェニルメタンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート、およびグルタルアルデヒドを架橋剤として、ならびにクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびトロメタミンをバッファー塩として用いて、実施例２Ａ〜２Ｅに示す組成物に従って、放射線不透過性の注入可能核ヒドロゲル組成物を調製する。
【００５５】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、脊髄の疾患および損傷の処置において利用されるタンパク質ヒドロゲル組成物、特に脊椎椎間板（ｓｐｉｎａｌ ｄｉｓｃ）の回復に関する。より具体的には、本発明は、正常な椎間腔高さを回復するため、および好ましくは侵襲的な外科的手順なしでヒドロゲルの経皮注入によって、椎間円板の修復および回復における使用のための生体材料の導入を容易にするための組成物および方法を企図する。
【背景技術】
【０００２】
椎間円板の破壊または変性の原因は多く存在し、それらは、一般に力学的、遺伝的および生化学的と分類することができる。１つのそのような原因は、椎間板髄核（ｄｉｓｃ ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｌｐｏｓｕｓ）と呼ばれる、椎間板の中に作られるゼリー様の物質の喪失である。
【０００３】
多くの注入可能な生体材料が椎間板髄核の代用物として開発されてきた。このような物質としては、ヒアルロン酸、フィブリン糊、アルギン酸またはアルギン酸エステル、エラスチン様ポリペプチド、Ｉ型コラーゲンゲルなどを含めた種々のタンパク質が挙げられる。例えば、特許文献１；特許文献２；および特許文献３を参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，７７３，２４９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３８０，１５４（Ｂ１）号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１８４，３４８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような物質を椎間板に導入することの侵襲性は、変性椎間板疾患（ＤＤＤ）の処置のためなど、そのような物質を経皮注入することによって最小にされる可能性がある。従って、高強度でかつ耐久性のある、そして経皮的手順のあいだ可視化することができる物質についてのニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの実施形態では、本発明は、椎間板核（ｄｉｓｃ ｎｕｃｌｅｕｓ）のすべてまたは一部のための置換材料としての使用に適した注入可能組成物に関する。この組成物は、以下の成分を有する注入可能で、硬化性で、架橋可能で、非免疫原性の無毒なタンパク質ヒドロゲルを含む：
このヒドロゲルの最小で約１０重量％および最大で約２５重量％を構成するタンパク質成分；
認識できる放射線不透過性レベルを有しかつこのヒドロゲルの最小で約５重量％および最大で約３５重量％を構成するヨウ素化された造影液；および
このヒドロゲルの最小で約０．１重量％および最大で約１０重量％を構成する架橋剤。
【０００７】
別の実施形態では、本発明は、椎間板核のすべてまたは一部のための置換材料としての使用に適した組成物に関する。この組成物は、
（ｉ）少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸を含有するタンパク質成分を有し；（ｉｉ）少なくとも約１０ｋＰａの静的圧縮弾性率を有し；かつ（ｉｉｉ）少なくとも約１０ｋＰａの動的圧縮弾性率を有する、注入可能で、硬化性で、架橋可能で、非免疫原性の無毒なタンパク質ヒドロゲルと、
放射線不透過性を認識できるレベルまで高めるのに十分な量のヨウ素化合物を含むヨウ素化された造影液であって、この造影液は、静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下を引き起こす、ヨウ素化された造影液と、
このヨウ素化された造影液の添加によって引き起こされる静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下の少なくとも約１００％を回復させるのに十分な量の架橋剤と
を含む。
【０００８】
別の実施形態では、当該組成物のタンパク質ヒドロゲルは、以下の残基のうちの少なくとも１つを含有する：リジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、およびシステイン。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の組成物は、椎間円板核、すなわち、髄核（ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｌｐｏｓｕｓ）の中の天然物質の一部分または実質的にすべてを置き換える上で有用である。椎間円板は、脊椎の中の隣接する椎骨の間にある。このような椎間板としては、例えば、腰椎椎間板、胸部椎間板、頸部椎間板、および仙骨椎間板が挙げられる。
【００１０】
本発明の組成物は、好ましくは経皮注入の際の、椎間板核の（すなわち、髄核の）すべてまたは一部のための置換材料としての使用に適している。このような手順の間、当該組成物は、損傷を受けた椎間板へと注入される。
【００１１】
経皮的手順で硬化性生体材料を、損傷を受けた椎間板へと注入するための方法および器具は、より具体的には、本発明と同じ譲受人へとともに譲渡され、かつ参照によりあらゆる目的のためにその全体を本願明細書に援用したものとする、２００５年６月２９日出願の米国特許出願公開第２００６／００９８５１号に記載されている。
【００１２】
タンパク質ヒドロゲル
当該組成物は、タンパク質ヒドロゲル、すなわち、水が分散媒体であるコロイド状ゲル、またはタンパク質ヒドロゲルの混合物を含む。このタンパク質ヒドロゲルは、その顕著な水分含量に起因して、自然の組織の柔軟性度と同程度の柔軟性度を有することが好ましい。
【００１３】
１つの実施形態では、タンパク質成分は、このヒドロゲルの最小で約１０％および最大で約２５重量％を含む。
【００１４】
１つの実施形態では、このタンパク質ヒドロゲルは、以下のセグメントのうちの少なくとも２つ、好ましくは４つを含むタンパク質ブロック共重合体を使用して構築される：
（ｉ）天然に存在する絹に見出される６アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；
（ｉｉ）天然に存在するエラスチンに見出される５アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；
（ｉｉｉ）天然に存在するコラーゲンに見出される３アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；または
（ｉｖ）天然に存在するケラチンに見出される７アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；または
上記のもののいずれか２つ、３つ、もしくは４つすべての組み合わせ。
【００１５】
別の実施形態では、当該タンパク質ヒドロゲルは、タンパク質ブロック共重合体、好ましくは以下のセグメントを含むブロック共重合体を使用して構築される：
（ｉ）少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、これらの配列の各々は、天然に存在する絹に見出される６アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；
（ｉｉ）少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、これらの配列の各々は、天然に存在するエラスチンに見出される５アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；
（ｉｉｉ）少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、これらの配列の各々は、天然に存在するコラーゲンに見出される３アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；または
（ｉｖ）少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、これらの配列の各々は、天然に存在するケラチンに見出される７アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；または
上記のもののいずれか２つ、３つ、もしくは４つすべての組み合わせ。
【００１６】
好ましくは、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は、合計で少なくとも５０配列、および最大数で５００配列を含む。
【００１７】
加えて、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は、架橋されることができる官能基を含有する少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。天然に存在する官能基のいくつかの例としては、リジンおよびヒスチジン残基上のアミノ基、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基上のカルボキシル基、アルギニン残基上のグアニジノ基、セリンおよびトレオニン残基上のヒドロキシル基、ならびにシステイン残基上のチオール基が挙げられる。
【００１８】
このタンパク質が架橋のために利用できる官能基を含有しない場合、そのタンパク質のアミノ酸残基（上記の配列のアミノ酸を含むことができる）は、そのような官能基を含有するアミノ酸で置き換えられる。このタンパク質は、架橋可能な官能基を含有する少なくとも１つのアミノ酸を有する。好ましくは、このタンパク質は、少なくとも０．１％、より好ましくは少なくとも１％、最も好ましくは少なくとも約２％の、架橋可能な官能基を含有するアミノ酸を有する。通常は、このタンパク質は、２０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下の架橋可能な官能基を含有するアミノ酸を有する。
【００１９】
天然に存在する絹に見出されるアミノ酸の配列（Ｓｋ）の例はＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒである。天然に存在するエラスチンに見出されるアミノ酸の配列（Ｅｓ）の例はＧｌｙＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏである。天然に存在するコラーゲンに見出されるアミノ酸の配列（Ｃｌ）の例はＧｌｙＡｌａＰｒｏである。天然に存在するケラチンに見出されるアミノ酸の配列（Ｋｒ）の例はＬｙｓＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａである。
【００２０】
１つの態様では、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［［Ｂ］ｎ１−［Ｊ］ｎ２］ｎ３−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ（式１）
を有する。式中、
ＵおよびＺは、Ｓｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒ以外のアミノ酸配列、好ましくは当該タンパク質をクローニングする上で有用である配列を表し；
Ｂは、独立に、各位置でＳｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒを表し；
Ｊは、独立に、各位置でＳｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒを表すが、Ｂにおけるのと同じ配列ではなく；
Ｓｋは、ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒを表し；
Ｅｓは、ＧｌｙＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏを表し；
Ｃｌは、ＧｌｙＡｌａＰｒｏを表し；
Ｋｒは、ＬｙｓＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａを表し；
ｎ１は、１〜１２、より通常は２〜６、より通常は２〜４を表し；
ｎ２は、１〜１６、より通常は２〜１２、より通常は４〜８を表し；
ｎ３は、１〜３０、より通常は４〜２０、より通常は１２〜１８を表し；
ｎ６およびｎ７は、独立に０または１を表し；
ＢまたはＪによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸残基、例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、セリン、トレオニン、もしくはシステインを含むか、または含むように改変されている。
【００２１】
本願明細書では、用語「（当該）タンパク質をクローニングする上で有用であるＳｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒ以外のアミノ酸配列」および類似の語句、例えば、ＵおよびＺは、当該タンパク質をコードする核酸分子を単離または精製する上で役立つヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を意味する。
【００２２】
式１の１つの実施形態では、ＢはＳｋまたはＥｓを表す。別の実施形態では、ＪはＳｋまたはＥｓを表す。好ましい実施形態では、ＢおよびＪはＳｋまたはＥｓを表す。より好ましい実施形態では、ＢはＳｋを表し、ＪはＥｓを表す。
【００２３】
式１の別の態様では、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）ｎ３（Ｅｓ）ｎ４］ｎ５−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有する。式中、
ｎ３は１〜１２を表し；
ｎ４は１〜１６を表し；
ｎ５は１〜３０を表し；
ｎ６およびｎ７は０または１を表し；
ＳｋまたはＥｓによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸残基、例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、セリン、トレオニン、またはシステインを含むように改変されている。
【００２４】
式１のより特定の態様では、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）２（Ｅｓ）８］１７−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有する。式中、ＳｋまたはＥｓによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸残基、例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、セリン、トレオニン、またはシステインを含むように改変されている。この態様の好ましい実施形態では、少なくとも１つのＥｓセグメントは、ＧｌｙＸＧｌｙＶａｌＰｒｏまたはＧｌｙＶａｌＧｌｙＸＰｒｏ（式中、Ｘはリジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、セリン、トレオニン、およびシステインを表す）からなる群から選択されるアミノ酸配列；好ましくはＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏまたはＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｙｓＰｒｏによって置き換えられている。
【００２５】
式１のさらにより特定の態様では、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）２（Ｅｓ）４Ｅｓ’（Ｅｓ）３］１７−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有する。式中、Ｅｓ’は、ＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏまたはＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｙｓＰｒｏを表す。好ましくは、Ｅｓ’は、ＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏ（このようなタンパク質はＰ２７Ｋとして知られている）を表す。また、本発明は、Ｐ２７Ｋのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、好ましくはＰ２７Ｋのアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質ヒドロゲルを包含する。
【００２６】
本発明に係るタンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は、少なくとも約２０ｋＤ、一般に少なくとも約３０ｋＤ、好ましくは少なくとも約５０ｋＤの最小分子量を有することになろう。最大分子量は、通常は約２０５ｋＤ以下、より通常は約１５０ｋＤ以下、好ましくは約１００ｋＤ以下、さらにより好ましくは約７７ｋＤ以下である。当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分は、少なくとも２つの架橋に利用できる官能基、より通常は少なくとも約４つの架橋に利用できる官能基を有することになろう。１つの官能基あたりの当量重量は、一般に、約１ｋＤ〜４０ｋＤの範囲、より通常は約５ｋＤ〜２５ｋＤの範囲、好ましくは約７ｋＤ〜１０ｋＤの範囲にある。
【００２７】
本発明の１つの実施形態によれば、当該核内物質の経皮的置換の間、当該タンパク質ヒドロゲルの機械的強度を維持すること、およびコラーゲン基材へのインプラントの接着を維持することが重要である。コラーゲン基材へのインプラントの接着は、インプラントを椎間板内の適所に保持する上で重要な構成要素であり、耐押出性試験（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）によって測定される。
【００２８】
ヨウ素化された造影液および架橋剤を加えた後、当該タンパク質ヒドロゲルは、好ましくは、各々約１０ｋＰａの、好ましくは各々約２０ｋＰａの最小静的圧縮弾性率および最小動的圧縮弾性率を有する。最大の静的圧縮弾性率および動的圧縮弾性率は、各々、約５００ｋＰａ、好ましくは各々約３００ｋＰａである。静的圧縮弾性率および動的圧縮弾性率は、それぞれ静的条件下および振動条件下での圧縮におけるひずみに対する応力の比である。（例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＣｈａｗｌａ、「Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」、１９９９年、９８−１０３頁を参照）。
【００２９】
ヨウ素化された造影剤
本発明の注入可能組成物は、注入の際に腰椎の許容できる可視性を提供するために、当該技術分野で公知のイメージング方法における使用のために適切な有機造影剤、好ましくはヨウ素化された造影剤をさらに含有する。このヨウ素化された造影剤は、例えば、Ｘ線、放射活性、赤外線、紫外線、電子線もしくは中性子線などの放射線、または磁場といった検出可能な形態にさらされている周囲の組織を区別する上で有用である。ヨウ素化された造影剤は、蛍光透視検査、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波などのイメージング方法で有用である。
【００３０】
１つの実施形態では、ヨウ素化された造影剤は非イオン性である。本願明細書で使用する場合、非イオン性は、１〜３個の共有結合されたヨウ素原子を含有する有機化合物を指す。例示的なヨウ素ベースの造影剤としては、ジアトリゾ酸、ヨーデコール、イオジキサノール、イオフラトール、イオグラミド（ｉｏｇｕｌａｍｉｄｅ）、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオトロール（ｉｏｔｒｏｌ）、イオベルソール、イオキサグル酸、およびメトリザミドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいヨウ素化された造影剤はＩｓｏｖｕｅ ３７０である。例えば、タンパク質ポリマー１ｍＬあたり６０ｍｇのＩの最終のヨウ素濃度を得るために必要とされるＩｓｏｖｕｅ ３７０の量は、弾性率および接着強度のおよそ３０％低下を引き起こすが、耐押出性に対しては最小の効果しか引き起こさない。
【００３１】
別の実施形態では、このヨウ素剤はイオン性である。本願明細書で使用する場合、イオン性は、１〜３個のヨウ化物イオンを含有する塩を指す。ヨウ化物塩のいくつかの例としては、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、およびヨウ化アンモニウムが挙げられる。
【００３２】
１つの実施形態では、ヨウ素化合物の原子と当該タンパク質ヒドロゲルの原子との間には、共有結合は実質的に存在しない。
【００３３】
ヨウ素化された造影剤は、当該組成物を放射線不透過性にするのに十分な量で、タンパク質に加えられる。本願明細書で使用する場合、用語「放射線不透過性」は、電磁放射線、特にＸ線、が特定の物質を通過できないという相対的無能力を指す。電磁放射線の通過を妨げる密な物質は、「放射線不透過性」と呼ばれる。この用語は、Ｘ線を密な物体に通したときの、Ｘ線撮影による撮像における相対的な不透明な白い外観を指す。放射線不透過性物質は、Ｘ線または類似の放射線が通過することを許容しないであろう物質である。
【００３４】
本発明の組成物は、放射線不透過性が認識できるレベル、すなわち、適切なイメージング方法、例えば、蛍光透視検査、ＣＴ、Ｘ線などによって検出可能であるレベルまで高められるとき、放射線不透過性である。
【００３５】
１つの実施形態では、認識できる放射線不透過性レベルを有するヨウ素化された造影液は、当該ヒドロゲルの最小で約５重量％および最大で約３５重量％を含む。
【００３６】
好ましい実施形態では、放射線不透過性は一過性である。本願明細書で使用する場合、一過性は、短期間でかつ短寿命であるという状態を指す。例えば、当該ヒドロゲルは、放射線不透過性を、最大で、通常は３０日以下、より通常は１４日以下、好ましくは７日以下、より好ましくは２日以下のあいだ、維持する。
【００３７】
架橋剤
当該架橋剤は、少なくとも２つの基を有する分子であって、この少なくとも２つの基の各々が当該タンパク質上の架橋可能な官能基、例えばアミノ、カルボキシル、グアニジノ、ヒドロキシル、またはチオ基と共有結合を形成することができる分子である。架橋のための官能基は、すべて同じであってもよいし、または上記官能基と共有結合を形成することができる官能基の組み合わせであってもよく、アミノ、例えばリジン、ヒスチジン；カルボキシル、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸；グアニジノ、例えばアルギニン；ヒドロキシル、例えばセリンおよびトレオニン；ならびにチオール、例えばシステインなどの官能基を含んでもよい。例えば、この架橋剤は、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分のアミノ酸上の天然に存在する官能基と反応する官能基を有してもよい。
【００３８】
アルデヒド、イソシアネート、混合カルボン酸無水物、例えばエトキシカルボニル無水物、活性化されたオレフィン、ハロ、アミノなどの種々の反応性官能基が、この架橋剤で用いられてもよい。当該タンパク質ポリマー上の官能基、および架橋剤の適切な選択によって、反応速度および架橋度を制御することができる。
【００３９】
１つの実施形態では、当該架橋剤は式：Ｘ１−Ｒ−Ｘ２を有し、式中、Ｘ１およびＸ２は、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分の官能基と共有結合を形成する官能基である。Ｒは、鎖の中に最小で２個、好ましくは３個、より好ましくは４個、および最大で２４個、好ましくは最大で１２個、より好ましくは最大で８個の炭素原子を有する飽和または不飽和のヒドロカルビル鎖（すなわちアルキルまたはアルケニル）を表す。このヒドロカルビル鎖の中の炭素原子は、任意に少なくとも１つのヘテロ原子によって置き換えられてもよく、ここでヘテロ原子は、−Ｏ−または−ＮＨ２−からなる群から選択され、各ヘテロ原子は少なくとも２つの炭素原子によって互いのヘテロ原子から隔てられている。１つの実施形態では、Ｘ１およびＸ２はエステル基またはイソシアネート基である。
【００４０】
種々の架橋剤、特にこれまで使用されてきており、かつ生理的に許容できることが判明している種々の架橋剤を用いてよい。当該架橋剤上のいくつかの有用な官能基としては、例えばグルタルアルデヒドなどのジアルデヒド、活性化されたジオレフィン、テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、オクタメチレンジイソシアネートなどのジイソシアネート、コハク酸二無水物、エチレンジアミン四酢酸二無水物などの酸無水物、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン、シクロ（Ｌ−リジル−Ｌ−リジン）イソシアネート基（例えば、テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、オクタメチレンジイソシアネート）アルデヒド基（グルタルアルデヒド）；酸無水物が挙げられる。好ましくは、この官能基はアミノ（グアニジンを含む）などである。また、この架橋剤は、非対称の官能基、例えば活性化されたオレフィンアルデヒド、例えばアクロレインおよびキノイド系アルデヒド、活性化されたハロカルボン酸無水物などを含有してもよい。これらの架橋剤は、通常は市販されているであろうし、または接着剤の付与の前か、もしくはその場での合成によって従来の方法に従って容易に合成されうる。
【００４１】
従って、当該タンパク質上の官能基および当該架橋剤に依存して、アミド、イミン、尿素、エステル、エーテル、ウレタン、チオエーテル、ジスルフィドなどが形成されうる。
【００４２】
当該架橋剤は、２以上の官能基、通常は４を超えない数の官能基を含有する。これらの官能基は、同じであってもよいし異なっていてもよい。当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分に対する架橋剤の比は、架橋剤、当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分上に存在する官能基の数、所望の硬化速度などに依存して大きく変わるであろう。一般に、架橋剤に対する当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分の重量比は、少なくとも約１：１、通常は少なくとも約１０：１、一般に少なくとも約２０：１；および約２５０：１以下、通常は約１５０：１以下、一般に約５０：１以下であろう。このタンパク質−架橋剤当量比を選択する際の考慮事項は、固化（ｓｅｔｕｐ）の速度、架橋剤の反応性、混合物に対する架橋剤の相対的溶解性、架橋剤の生理学的特性、架橋生成物の所望の安定性度などであろう。
【００４３】
１つの実施形態では、架橋剤は、当該ヒドロゲルの、最小で約０．１重量％、最大で約１０重量％の量で含まれる。
【００４４】
ヨウ素化された造影液および当該タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分を一緒に混合することで、タンパク質ヒドロゲルのタンパク質成分の希釈が引き起こされ、得られるヒドロゲルの機械的強度の対応する低下が生じる。従って、本発明の組成物は、このヨウ素化された造影液の添加によって引き起こされる静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下の少なくとも約１００％、好ましくは少なくとも約１５０％を回復させるための十分な量の架橋剤を含む。
【００４５】
架橋剤を増やすことは、上記希釈効果を補うため、または希釈されたタンパク質濃度を含有するヒドロゲルの材料特性を改善するために使用することができる。この強度低下は希釈の量に依存する。希釈の量は、選ばれたヨウ素化された造影液の中のヨウ素濃度とともに変わるであろう。特に、造影液の中のヨウ素濃度が低いほど、インプラント材料の中のヨウ素の必要レベルを達成するためにより多くの液体が加えられる必要があろう。架橋剤が増えると、コラーゲンへの接着は、もとの希釈されていない材料と比べて、約３０％増大する可能性があり、耐押出性は、約１００％増大する可能性がある。
【００４６】
組成物
当該組成物は注入可能で、硬化性で、非免疫原性で無毒である。注入可能は、経皮的手順においてなどの髄核の置換の際に、当該組成物は、シリンジ、ポンプ、または類似のデバイスから、好ましくは液体として、核の中へと注入することができるということを意味する。
【００４７】
当該組成物は硬化性でもある。硬化性は、好都合な態様での状態、コンディションおよび／または構造の変化を意味する。硬化プロセスは、架橋剤の添加、熱、放射線、硬化触媒または促進剤の存在などの少なくとも１つの変動要素によって誘導される。硬化は部分的であってもよいし、完全であってもよい。硬化性組成物の注入は、本願明細書中上記で特定された米国特許出願公開第２００６／０００９８５１号明細書に記載されている。
【００４８】
本発明の組成物は非免疫原性であり、すなわち、当該組成物は重大な免疫応答を引き起こさない。当該組成物は「無毒」でもあり、すなわち、当該組成物は、核置換の対象、通常は人または実験室動物、に傷害を加えない。ヨウ素化された造影剤が一過性である場合は、その造影剤は、免疫原性または毒性にほとんど寄与しないであろう。
【００４９】
本発明に係る組成物は、組成物が要求される基準を達成する限り、大きく変わる可能性がある。このような組成物の適切な例は、例えば、最小で約３０重量％の水、および最大で約８５重量％の水；最小で約１０重量％のタンパク質および最大で約２５重量％のタンパク質；最小で約５重量％のヨウ素化された造影剤および最大で約３５重量％のヨウ素化された造影剤；ならびに最小で約０．１重量％の架橋剤および最大で約１０重量％の架橋剤を有する。この組成物は、約０．１重量％〜１０重量％の範囲のバッファー塩および／または他の配合添加剤も含んでよい。このようなバッファー塩および配合添加剤は、リン酸ナトリウムおよび／またはリン酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、トロメタミン、クエン酸ナトリウム、スクロースおよびマンノースを含んでもよい。
【００５０】
本発明の組成物は、本願明細書では特に経皮注入に関して記載されてきたが、当該組成物は、非経皮的手順において、例えば変性椎間板疾患（ＤＤＤ）の処置のための開放性の外科的手技において、または上述の米国特許出願公開第２００６／０００９８５１号明細書にも記載されている顕微鏡視下ヘルニア摘出術の補助的手段（ａｄｊｕｎｃｔ ｔｏ ｍｉｃｒｏｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ）（ＡＭＤ）手順において、注入可能組成物として使用されてもよいということは、理解されるはずである。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態の放射線不透過性の注入可能核ヒドロゲル組成物に関する。
【００５２】
実施例１Ａ−１Ｄ：
イオパミドール（Ｉｓｏｖｕｅ（登録商標））およびイオヘキソール（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ（登録商標））を造影剤として、ヘキサメチレンジイソシアネートを架橋剤として、ならびにリン酸ナトリウムを塩バッファーとして用いて、実施例１Ａ〜１Ｄに示す組成物に従って、放射線不透過性の注入可能核ヒドロゲル組成物を調製する。
【００５３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【００５４】
実施例２Ａ−２Ｅ：
イオジキサノール（Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ（登録商標））およびイオトロラン（Ｏｓｍｏｖｉｓｔ（登録商標））を造影剤として、水素化ジフェニルメタンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート、およびグルタルアルデヒドを架橋剤として、ならびにクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびトロメタミンをバッファー塩として用いて、実施例２Ａ〜２Ｅに示す組成物に従って、放射線不透過性の注入可能核ヒドロゲル組成物を調製する。
【００５５】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
椎間板核のすべてまたは一部のための置換材料としての使用に適した注入可能組成物であって、前記注入可能組成物は
注入可能で、硬化性で、架橋可能で、非免疫原性の無毒なタンパク質ヒドロゲル
を含み、前記タンパク質ヒドロゲルは、
前記ヒドロゲルの最小で約１０重量％および最大で約２５重量％を構成するタンパク質成分と、
認識できる放射線不透過性レベルを有しかつ前記ヒドロゲルの最小で約５重量％および最大で約３５重量％を構成するヨウ素化された造影液と、
前記ヒドロゲルの最小で約０．１重量％および最大で約１０重量％を構成する架橋剤と
を有する、注入可能組成物。
【請求項２】
前記造影液の放射線不透過性は一過性である、請求項１に記載の注入可能組成物。
【請求項３】
椎間板核のすべてまたは一部のための置換材料としての使用に適した組成物であって、前記組成物は、
（ｉ）少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸を含有するタンパク質成分を有し；（ｉｉ）少なくとも約１０ｋＰａの静的圧縮弾性率を有し；かつ（ｉｉｉ）少なくとも約１０ｋＰａの動的圧縮弾性率を有する注入可能で、硬化性で、架橋可能で、非免疫原性の無毒なタンパク質ヒドロゲルと、
放射線不透過性を認識できるレベルまで高めるのに十分な量のヨウ素化合物を含むヨウ素化された造影液であって、前記造影液は、静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下を引き起こす、ヨウ素化された造影液と、
前記ヨウ素化された造影液の添加によって引き起こされる静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下の少なくとも約１００％を回復させるのに十分な量の架橋剤と
を含む、組成物。
【請求項４】
前記組成物は経皮注入の際の使用に適している、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記架橋可能なアミノ酸は、リジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、またはシステインである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記静的圧縮弾性率は少なくとも約５００ｋＰａの最大値を有し、前記動的圧縮弾性率は少なくとも約５００ｋＰａの最大値を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記タンパク質ヒドロゲルの前記タンパク質成分は、約２０，０００の最小分子量および約２０５，０００の最大分子量を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記タンパク質ヒドロゲルの前記タンパク質成分は、
天然に存在する絹に見出される６アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；
天然に存在するエラスチンに見出される５アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；
天然に存在するコラーゲンに見出される３アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；
天然に存在するケラチンに見出される７アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；または
これらの組み合わせ；
を含み、前記少なくとも１つの配列の中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、リジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、またはシステイン残基によって置き換えられている、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記タンパク質ヒドロゲルの前記タンパク質成分は、
少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、前記配列の各々は、天然に存在する絹に見出される６アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；
少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、前記配列の各々は、天然に存在するエラスチンに見出される５アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；
少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、前記配列の各々は、天然に存在するコラーゲンに見出される３アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；
少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、前記配列の各々は、天然に存在するケラチンに見出される７アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；または
これらの組み合わせ；
を含むブロック共重合体であり、少なくとも１つのアミノ酸残基が、リジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、またはシステイン残基によって置き換えられている、請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質ヒドロゲルの前記タンパク質成分は、天然に存在する絹に見出される少なくとも２つのセグメント、および天然に存在するエラスチンに見出される少なくとも２つのセグメントを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記天然に存在する絹に見出されるアミノ酸の配列（Ｓｋ）はＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記天然に存在するエラスチンに見出されるアミノ酸の配列（Ｅｌ）はＧｌｙＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記天然に存在するコラーゲンに見出されるアミノ酸の配列（Ｃｌ）はＧｌｙＡｌａＰｒｏである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記天然に存在するケラチンに見出されるアミノ酸の配列（Ｋｒ）はＬｙｓＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記タンパク質ヒドロゲルの前記タンパク質成分は式：
ＮＨ２−Ｕｎ６−［［Ｂ］ｎ１−［Ｊ］ｎ２］ｎ３−Ｚｎ７−ＣＯＯＨ
を有し、式中、
ＵおよびＺは、前記タンパク質をクローニングする上で有用であるアミノ酸配列を表し；
Ｂは、独立に、各位置でＳｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒを表し；
Ｊは、独立に、各位置でＳｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒを表すが、Ｂにおけるのと同じ配列ではなく；
Ｓｋは、ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒを表し；
Ｅｓは、ＧｌｙＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏを表し；
Ｃｌは、ＧｌｙＡｌａＰｒｏを表し；
Ｋｒは、ＬｙｓＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａを表し；
ｎ１は、１〜１２を表し；
ｎ２は、１〜１６を表し；
ｎ３は、１〜３０を表し；
ｎ６およびｎ７は、独立に０または１を表し；
ＢまたはＪによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのリジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、システイン残基を含むように改変されている、請求項３に記載の組成物。
【請求項１６】
ＢはＳｋまたはＥｓを表す、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＪはＳｋまたはＥｓを表す、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＪはＥｓを表す、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記タンパク質は式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）ｎ３（Ｅｓ）ｎ４］ｎ５−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有し、式中、
ｎ３は１〜１２を表し；
ｎ４は１〜１６を表し；
ｎ５は１〜３０を表し；
ｎ６およびｎ７は、独立に０または１を表し；
ＳｋまたはＥｓによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのリジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、システイン残基を含むように改変されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）２（Ｅｓ）８］１７−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有し、式中、ＳｋまたはＥｓによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのリジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、システイン残基を含むように改変されている、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つのＥｓセグメントは、ＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏまたはＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｙｓＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸配列によって置き換えられている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）２（Ｅｓ）４Ｅｓ’（Ｅｓ）３］１７−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有し、式中、Ｅｓ’は、ＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏまたはＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｙｓＰｒｏを表す、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｅｓ’はＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏ（Ｐ２７Ｋ）を表し、ｎ６およびｎ７は１を表す、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記タンパク質ヒドロゲルは、Ｐ２７Ｋのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記タンパク質ヒドロゲルは、Ｐ２７Ｋのアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記放射線不透過性は一過性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ヨウ素化合物は非イオン性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ヨウ素化合物は、イオパミドール、ジアトリゾ酸、ヨーデコール、イオジキサノール、イオフラトール、イオグラミド、イオヘキソール、イオメプロール、イオトロール、イオベルソール、イオキサグル酸、およびメトリザミドからなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ヨウ素化合物はＩｓｏｖｕｅ３７０である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ヨウ素化合物の原子と前記タンパク質ヒドロゲルの原子との間には、共有結合は実質的に存在しない、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ヨウ素化合物はイオン性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ヨウ素化合物は、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化アンモニウムからなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記架橋剤は式：
Ｘ１−Ｒ−Ｘ２
を有し、式中、Ｘ１およびＸ２はＮＨ２またはＯＨ基と共有結合を形成する基であり、Ｒは、鎖の中に最小で２個、好ましくは最小で３個、より好ましくは最小で４個、最大で２４個、好ましくは最大で１２個、より好ましくは最大で８個の炭素原子を有する飽和または不飽和のヒドロカルビル鎖（すなわちアルキルまたはアルケニル）を表し、前記ヒドロカルビル鎖の中の炭素原子は、任意に少なくとも１つのヘテロ原子によって置き換えられてもよく、ヘテロ原子は−Ｏ−または−ＮＨ２−からなる群から選択され、各ヘテロ原子は少なくとも２つの炭素原子によって互いのヘテロ原子から隔てられている、請求項３に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｘ１およびＸ２はエステル基またはイソシアネート基である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記架橋剤は、テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、オクタメチレンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ジフェニルメタンジイソシアネート、グルタルアルデヒド、コハク酸二無水物、エチレンジアミン四酢酸二無水物、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジル）スクシネート、酒石酸ジスルホスクシンイミジル、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド、スルホコハク酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記架橋剤はヘキサメチレンジイソシアネートである、請求項３に記載の組成物。
【請求項１】
椎間板核のすべてまたは一部のための置換材料としての使用に適した注入可能組成物であって、前記注入可能組成物は
注入可能で、硬化性で、架橋可能で、非免疫原性の無毒なタンパク質ヒドロゲル
を含み、前記タンパク質ヒドロゲルは、
前記ヒドロゲルの最小で約１０重量％および最大で約２５重量％を構成するタンパク質成分と、
認識できる放射線不透過性レベルを有しかつ前記ヒドロゲルの最小で約５重量％および最大で約３５重量％を構成するヨウ素化された造影液と、
前記ヒドロゲルの最小で約０．１重量％および最大で約１０重量％を構成する架橋剤と
を有する、注入可能組成物。
【請求項２】
前記造影液の放射線不透過性は一過性である、請求項１に記載の注入可能組成物。
【請求項３】
椎間板核のすべてまたは一部のための置換材料としての使用に適した組成物であって、前記組成物は、
（ｉ）少なくとも１つの架橋可能なアミノ酸を含有するタンパク質成分を有し；（ｉｉ）少なくとも約１０ｋＰａの静的圧縮弾性率を有し；かつ（ｉｉｉ）少なくとも約１０ｋＰａの動的圧縮弾性率を有する注入可能で、硬化性で、架橋可能で、非免疫原性の無毒なタンパク質ヒドロゲルと、
放射線不透過性を認識できるレベルまで高めるのに十分な量のヨウ素化合物を含むヨウ素化された造影液であって、前記造影液は、静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下を引き起こす、ヨウ素化された造影液と、
前記ヨウ素化された造影液の添加によって引き起こされる静的圧縮弾性率および／または動的圧縮弾性率の低下の少なくとも約１００％を回復させるのに十分な量の架橋剤と
を含む、組成物。
【請求項４】
前記組成物は経皮注入の際の使用に適している、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記架橋可能なアミノ酸は、リジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、またはシステインである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記静的圧縮弾性率は少なくとも約５００ｋＰａの最大値を有し、前記動的圧縮弾性率は少なくとも約５００ｋＰａの最大値を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記タンパク質ヒドロゲルの前記タンパク質成分は、約２０，０００の最小分子量および約２０５，０００の最大分子量を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記タンパク質ヒドロゲルの前記タンパク質成分は、
天然に存在する絹に見出される６アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；
天然に存在するエラスチンに見出される５アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；
天然に存在するコラーゲンに見出される３アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；
天然に存在するケラチンに見出される７アミノ酸の反復配列を含む少なくとも１つの配列を有するセグメント；または
これらの組み合わせ；
を含み、前記少なくとも１つの配列の中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、リジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、またはシステイン残基によって置き換えられている、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記タンパク質ヒドロゲルの前記タンパク質成分は、
少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、前記配列の各々は、天然に存在する絹に見出される６アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；
少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、前記配列の各々は、天然に存在するエラスチンに見出される５アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；
少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、前記配列の各々は、天然に存在するコラーゲンに見出される３アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；
少なくとも２つの配列を有するセグメントであって、前記配列の各々は、天然に存在するケラチンに見出される７アミノ酸の反復配列から構成されるセグメント；または
これらの組み合わせ；
を含むブロック共重合体であり、少なくとも１つのアミノ酸残基が、リジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、またはシステイン残基によって置き換えられている、請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質ヒドロゲルの前記タンパク質成分は、天然に存在する絹に見出される少なくとも２つのセグメント、および天然に存在するエラスチンに見出される少なくとも２つのセグメントを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記天然に存在する絹に見出されるアミノ酸の配列（Ｓｋ）はＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記天然に存在するエラスチンに見出されるアミノ酸の配列（Ｅｌ）はＧｌｙＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記天然に存在するコラーゲンに見出されるアミノ酸の配列（Ｃｌ）はＧｌｙＡｌａＰｒｏである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記天然に存在するケラチンに見出されるアミノ酸の配列（Ｋｒ）はＬｙｓＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記タンパク質ヒドロゲルの前記タンパク質成分は式：
ＮＨ２−Ｕｎ６−［［Ｂ］ｎ１−［Ｊ］ｎ２］ｎ３−Ｚｎ７−ＣＯＯＨ
を有し、式中、
ＵおよびＺは、前記タンパク質をクローニングする上で有用であるアミノ酸配列を表し；
Ｂは、独立に、各位置でＳｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒを表し；
Ｊは、独立に、各位置でＳｋ、Ｅｓ、Ｃｌ、またはＫｒを表すが、Ｂにおけるのと同じ配列ではなく；
Ｓｋは、ＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙＳｅｒを表し；
Ｅｓは、ＧｌｙＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏを表し；
Ｃｌは、ＧｌｙＡｌａＰｒｏを表し；
Ｋｒは、ＬｙｓＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＧｌｕＡｌａを表し；
ｎ１は、１〜１２を表し；
ｎ２は、１〜１６を表し；
ｎ３は、１〜３０を表し；
ｎ６およびｎ７は、独立に０または１を表し；
ＢまたはＪによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのリジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、システイン残基を含むように改変されている、請求項３に記載の組成物。
【請求項１６】
ＢはＳｋまたはＥｓを表す、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＪはＳｋまたはＥｓを表す、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＪはＥｓを表す、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記タンパク質は式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）ｎ３（Ｅｓ）ｎ４］ｎ５−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有し、式中、
ｎ３は１〜１２を表し；
ｎ４は１〜１６を表し；
ｎ５は１〜３０を表し；
ｎ６およびｎ７は、独立に０または１を表し；
ＳｋまたはＥｓによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのリジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、システイン残基を含むように改変されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）２（Ｅｓ）８］１７−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有し、式中、ＳｋまたはＥｓによって表される配列のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのリジン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、システイン残基を含むように改変されている、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つのＥｓセグメントは、ＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏまたはＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｙｓＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸配列によって置き換えられている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
式：
ＮＨ２−（Ｕ）ｎ６−［（Ｓｋ）２（Ｅｓ）４Ｅｓ’（Ｅｓ）３］１７−（Ｚ）ｎ７−ＣＯＯＨ
を有し、式中、Ｅｓ’は、ＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏまたはＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｙｓＰｒｏを表す、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｅｓ’はＧｌｙＬｙｓＧｌｙＶａｌＰｒｏ（Ｐ２７Ｋ）を表し、ｎ６およびｎ７は１を表す、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記タンパク質ヒドロゲルは、Ｐ２７Ｋのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記タンパク質ヒドロゲルは、Ｐ２７Ｋのアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記放射線不透過性は一過性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ヨウ素化合物は非イオン性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ヨウ素化合物は、イオパミドール、ジアトリゾ酸、ヨーデコール、イオジキサノール、イオフラトール、イオグラミド、イオヘキソール、イオメプロール、イオトロール、イオベルソール、イオキサグル酸、およびメトリザミドからなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ヨウ素化合物はＩｓｏｖｕｅ３７０である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ヨウ素化合物の原子と前記タンパク質ヒドロゲルの原子との間には、共有結合は実質的に存在しない、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ヨウ素化合物はイオン性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ヨウ素化合物は、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化アンモニウムからなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記架橋剤は式：
Ｘ１−Ｒ−Ｘ２
を有し、式中、Ｘ１およびＸ２はＮＨ２またはＯＨ基と共有結合を形成する基であり、Ｒは、鎖の中に最小で２個、好ましくは最小で３個、より好ましくは最小で４個、最大で２４個、好ましくは最大で１２個、より好ましくは最大で８個の炭素原子を有する飽和または不飽和のヒドロカルビル鎖（すなわちアルキルまたはアルケニル）を表し、前記ヒドロカルビル鎖の中の炭素原子は、任意に少なくとも１つのヘテロ原子によって置き換えられてもよく、ヘテロ原子は−Ｏ−または−ＮＨ２−からなる群から選択され、各ヘテロ原子は少なくとも２つの炭素原子によって互いのヘテロ原子から隔てられている、請求項３に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｘ１およびＸ２はエステル基またはイソシアネート基である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記架橋剤は、テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、オクタメチレンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ジフェニルメタンジイソシアネート、グルタルアルデヒド、コハク酸二無水物、エチレンジアミン四酢酸二無水物、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジル）スクシネート、酒石酸ジスルホスクシンイミジル、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド、スルホコハク酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記架橋剤はヘキサメチレンジイソシアネートである、請求項３に記載の組成物。
【公表番号】特表２０１３−５０８１１６（Ｐ２０１３−５０８１１６Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３６９３４（Ｐ２０１２−５３６９３４）
【出願日】平成２２年１０月２６日（２０１０．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５４０１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５６５２８
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５１２１０１７７４）スパイン ウェイブ，インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２６日（２０１０．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５４０１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５６５２８
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５１２１０１７７４）スパイン ウェイブ，インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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