新規なキャノーラタンパク質単離物
主として２Ｓキャノーラタンパク質からなり、水性媒体中で等しいまたはより優れた溶解特性および改善された透明特性を有する新規なキャノーラタンパク質単離物は、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しており、７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少している。新規なキャノーラタンパク質単離物は、キャノーラタンパク質のミセル形成および沈殿による上澄み水溶液を等電点沈殿させて、７Ｓタンパク質の沈殿をもたらし、これを沈降させて除去することによって形成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２００９年６月２０日出願の米国特許出願第１２／２１３，４９９号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は、新規なキャノーラタンパク質単離物の製造、ならびにソフトドリンクおよびスポーツドリンクを含む水溶液におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
少なくとも１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラ油糧種子タンパク質単離物は、本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年５月３日出願の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（米国特許出願公開第２００３−０１２５５２６号およびＷＯ０２／０８９５９７）および２００４年６月９日出願の米国特許出願第１０／４７６，２３０号（米国特許出願公開第２００４−０２５４３５３号）に記載の方法によって油糧種子粗粉から形成することができる。この手順は、塩水溶液を用いてキャノーラ油糧種子粗粉を抽出するステップと、得られたタンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、水溶液のタンパク質濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増加させるステップと、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水中に希釈し、タンパク質のミセルの形成をもたらすステップと、タンパク質のミセルを沈降させて非晶質、粘着性で、ゼラチン状のグルテン様タンパク質ミセル塊（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）（ＰＭＭ）を形成するステップと、タンパク質ミセル塊を、少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する上澄み液から回収するステップとを含む多数のステップのプロセスを含む。本明細書で用いる場合、タンパク質含量は、乾燥重量基準で測定される。回収したＰＭＭは乾燥することができる。
【０００４】
本方法の一実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、キャノーラタンパク質単離物を上澄み液から回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、濃縮物を乾燥させることによって行うことができる。得られるキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する。
【０００５】
米国特許出願第１０／１３７，３９１号および第１０／４７６，２３０号に記載の手順は、基本的に回分式手順である。本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年１１月１９日出願の米国特許出願第１０／２９８，６７８号（米国特許出願公開第２００４−００３９１７４号およびＷＯ０３／０４３４３９）では、キャノーラタンパク質単離物を作るための連続プロセスが記載されている。それによると、キャノーラ油糧種子粗粉を塩水溶液と連続的に混合し、その混合物をパイプを通して輸送し、同時にキャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、そのタンパク質水溶液を選択的膜操作によって連続的に輸送して、イオン強度を実質的に一定に維持しながらタンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約５０ｇ／Ｌに増加させ、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質のミセルの形成をもたらし、そのタンパク質のミセルを連続的に沈降させ、同時に所望の量のＰＭＭが沈降容器に蓄積するまで上澄み液を連続的にあふれさせる（ｏｖｅｒｆｌｏｗｅｄ）。ＰＭＭを沈降容器から回収し、乾燥させることができる。ＰＭＭは、少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％のタンパク質含量を有する。上記のように、あふれた上澄み液を処理してそこからキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【０００６】
キャノーラ種子は、約１０〜約３０重量％のタンパク質を含むことが知られており、いくつかの異なるタンパク質成分が同定されている。これらのタンパク質には、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）として知られている１２Ｓグロブリン、７Ｓタンパク質およびナピン（ｎａｐｉｎ）として知られている２Ｓ貯蔵タンパク質が含まれる。本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００３年４月１５日出願の米国特許出願第１０／４１３，３７１号（米国特許出願公開第２００４−００３４２００号およびＷＯ０３／０８８７６０）および２００５年４月２９日出願の米国特許出願第１０／５１０，７６６号（米国特許出願公開第２００５−０２４９８２８号）に記載のように、濃縮タンパク質水溶液を希釈してＰＭＭを形成し、上澄み液を処理して追加のタンパク質を回収することを含む上記手順によって、異なるタンパク質プロファイルの単離物の回収がもたらされる。
【０００７】
この点について、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９８重量％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５重量％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５重量％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する。上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９５重量％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０重量％の７Ｓタンパク質および０〜約５重量％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する。したがって、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物は、主として７Ｓタンパク質であり、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、主として２Ｓタンパク質である。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号および第１０／５１０，７６６号に記載のように、２Ｓタンパク質は、約１４０００ダルトンの分子サイズを有し、７Ｓタンパク質は約１４５０００ダルトンの分子質量を有し、１２Ｓタンパク質は約２９００００ダルトンの分子サイズを有する。
【０００８】
菜種種子からの均一（ｈｏｍｏｇｅｎｉｔｙ）な２Ｓ貯蔵タンパク質ナピンの精製、ならびにこのタンパク質の二次構造および立体配座の安定性の評価が、Ｎａｈｒｕｎｇ（４２）１９９８，Ｎｒ．３／４，２０１−２０４ページでＫｒｚｙｚａｎｉａｋらにより以前記載された。ナピンは、緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）による菜種種子からの抽出、続いて（ＮＨ4）2ＳＯ4を使用した沈殿、得られたペレットの緩衝液Ａへの溶解、同じ緩衝液に対しての透析およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムを使用したゲルクロマトグラフィーによる脱塩によって単離した。ナピン抽出物を含む画分を回収し、（ＮＨ4）2ＳＯ4によって再沈殿させた。得られた粗製ナピンを緩衝液Ｂ（ｐＨ７．４の緩衝液Ａ）に溶解し、それに対して透析し、次いでＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０カラムに装填（ｌｏａｄｅｄ）し、緩衝液Ｂ中０．１５〜０．３５Ｍ ＮａＣｌ勾配で溶出させた。ナピンを含む画分をプール（ｐｏｏｌｅｄ）し、（ＮＨ4）2ＳＯ4で沈殿させ、緩衝液Ａ中に再溶解し、透析した。ナピンは、ｐＨ５．０で１ＭまでのＮａＣｌ勾配を使用して、陽イオン交換ＨＰＬＣによってさらに精製した。λmax＝２８０ｎｍの画分を回収し、濃縮し、分析した。
【０００９】
出願人らは、以下のような、均一に精製した２Ｓキャノーラタンパク質のサンプルの実験室的調製を記載した追加の参照文献を認識している。
Ｂｅｒｏｔ， Ｓ， Ｃｏｍｐｏｉｎｔ， Ｊ．Ｐ．， Ｌａｒｒｅ， Ｃ．， Ｍａｌａｂａｔ， Ｃ． 及び Ｇｕｅｇｕｅｎ， Ｊ． ２００５． 菜種タンパク質（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ）の大きなスケールでの精製、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ， ８１８： ３５−４２
Ｂｈａｔｔｙ， Ｒ．Ｓ．， ＭｃＫｅｎｚｉｅ， Ｓ．Ｌ． 及び Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ， Ａ．Ｊ． １９６８． 塩溶液中の菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ）のタンパク質の可溶物（ｓｏｌｕｂｌｅ）、Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４６： １１９１−１１９７
Ｇｅｈｒｉｇ， Ｐ．Ｍ．， Ｋｒｚｙｚａｎｉａｋ， Ａ．， Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ． 及び Ｂｉｅｍａｎｎ， Ｋ． １９９６． 多重遺伝子族の製品であるＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓからの種子貯蔵タンパク質（ｎａｐｉｎ）の混合物の、質量分析法によるアミノ酸シークエンシング、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９３： ３６４７−３６５２．
Ｍｏｎｓａｌｖｅ， Ｒ．Ｉ． 及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｒ． １９９０． アブラナ科種子の２Ｓフラクションから得たタンパク質の精製及び特性評価、Ｊ． Ｅｘｐｅｒ． Ｂｏｔ．， ４１（２２２）：８９−９４
Ｍｕｒｅｎ， Ｅ．， Ｅｋ， Ｂ．， Ｂｊｏｒｋ， Ｉ． 及びＲａｓｋ， Ｌ． １９９６． Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓの２Ｓ貯蔵タンパク質であるｎａｐｉｎの前駆体と成熟形態（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）の構造的な比較、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２４２：２１４−２１９
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３−０１２５５２６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４−０２５４３５３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４−００３９１７４号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４−００３４２００号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５−０２４９８２８号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｒｚｙｚａｎｉａｋら、Ｎａｈｒｕｎｇ（４２）１９９８，Ｎｒ．３／４，２０１−２０４
【非特許文献２】Ｂｅｒｏｔ， Ｓ， Ｃｏｍｐｏｉｎｔ， Ｊ．Ｐ．， Ｌａｒｒｅ， Ｃ．， Ｍａｌａｂａｔ， Ｃ． 及び Ｇｕｅｇｕｅｎ， Ｊ． ２００５． 「菜種タンパク質（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ）の大きなスケールでの精製」、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ， ８１８： ３５−４２
【非特許文献２】Ｂｈａｔｔｙ， Ｒ．Ｓ．， ＭｃＫｅｎｚｉｅ， Ｓ．Ｌ． 及び Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ， Ａ．Ｊ． １９６８． 「塩溶液中の菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ）のタンパク質の可溶物（ｓｏｌｕｂｌｅ）」、Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４６： １１９１−１１９７
【非特許文献３】Ｇｅｈｒｉｇ， Ｐ．Ｍ．， Ｋｒｚｙｚａｎｉａｋ， Ａ．， Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ． 及び Ｂｉｅｍａｎｎ， Ｋ． １９９６． 「多重遺伝子族の製品であるＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓからの種子貯蔵タンパク質（ｎａｐｉｎ）の混合物の、質量分析法によるアミノ酸シークエンシング」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９３： ３６４７−３６５２．
【非特許文献４】Ｍｏｎｓａｌｖｅ， Ｒ．Ｉ． 及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｒ． １９９０． 「アブラナ科種子の２Ｓフラクションから得たタンパク質の精製及び特性評価」、Ｊ． Ｅｘｐｅｒ． Ｂｏｔ．， ４１（２２２）：８９−９４
【非特許文献５】Ｍｕｒｅｎ， Ｅ．， Ｅｋ， Ｂ．， Ｂｊｏｒｋ， Ｉ． 及びＲａｓｋ， Ｌ． １９９６． 「Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓの２Ｓ貯蔵タンパク質であるｎａｐｉｎの前駆体と成熟形態（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）の構造的な比較」、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２４２：２１４−２１９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は、本明細書で提供する２Ｓが主であるキャノーラタンパク質単離物が、常に少量の７Ｓタンパク質を含むという点でこのような開示と区別される。
【００１３】
キャノーラは、菜種またはアブラナとしても知られている。
発明の概要
驚くべきことに、２Ｓタンパク質の割合が増加しており、好ましくは少なくとも約８５重量％の２Ｓタンパク質を含み、７Ｓタンパク質の割合が減少している新規なキャノーラタンパク質単離物は、上記米国特許出願第１０／１３７，３９１号および第１０／４７６，２３０号の手順に従って調製した上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物よりも水溶液中で優れた特性を示すことが今や分かった。
【００１４】
種々のｐＨ値における等しいまたはより大きい溶解度に加えて、本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は、ソフトドリンクおよびスポーツドリンクに溶液の透明度の向上をもたらし、透明なタンパク質強化飲料を提供することができる。さらに、新規なキャノーラタンパク質単離物は、約０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液中、約３．５のｐＨにおいて、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物よりも大きな溶解度を示す。
【００１５】
本発明の一態様では、乾燥重量基準（ｄ．ｂ．）で少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％のタンパク質含量を有する２Ｓキャノーラタンパク質から主としてなり、かつ主として２Ｓキャノーラタンパク質からなりキャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み水溶液から得られるキャノーラタンパク質単離物と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加し、７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少した、キャノーラタンパク質単離物を提供する。キャノーラタンパク質単離物は、上澄み液からの７Ｓタンパク質の等電点沈殿（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によって得られる。
【００１６】
本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物および組成物は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物の特性とは異なる、溶解度、透明度、熱安定性、２８０ｎｍでの吸光度、表面疎水性、およびアミノ酸プロファイルを含むいくつかの特有の特性を有する。これらの特性を以下に説明し、この考察を支持するデータを以下の例に示す。
溶解度：
新規なキャノーラタンパク質単離物は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物と比較して、広範囲のｐＨにわたって、約１％ｗ／ｖタンパク質濃度で、水、ならびに炭酸および非炭酸のソフトドリンクおよびスポーツドリンク中で等しいまたは増加した溶解度を示す。
【００１７】
さらに、新規なキャノーラタンパク質単離物は、広範囲のｐＨにわたって、約１％ｗ／ｖタンパク質濃度で、水中で等しいまたは増加した溶解度を示し、溶液または分散液の形成の後に、サンプルを遠心分離して不溶性物質を沈降させると、透明な上澄み液が得られる。
【００１８】
さらに、新規なキャノーラタンパク質単離物は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物と比較して、ｐＨ３．５で０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液中でより大きな溶解度を示す。
透明度：
新規なキャノーラタンパク質単離物は、炭酸および非炭酸ソフトドリンク、ならびにジュース、パンチ（ｐｕｎｃｈ）およびカクテルを含む種々の飲料に組み込んで、このような飲料にタンパク質強化をもたらすことができる。このような飲料は、約２．５〜約５にわたる広範囲のｐＨ値を有し、１２液量オンスの量で詰められることが多い。新規なキャノーラタンパク質単離物は、例えば１２液量オンスの量当たり少なくとも約５ｇの新規なキャノーラタンパク質単離物など、任意の好都合な量で添加して、飲料にタンパク質強化をもたらすことができる。
【００１９】
添加された新規なキャノーラタンパク質単離物は、飲料に溶解し、飲料の透明度を損なわない。タンパク質濃度２重量％の透明な飲料では、６００ｎｍで可視光の吸光度を測定することにより決定すると、透明度は約０．５未満である。タンパク質濃度１重量％の水では、６００ｎｍで可視光の吸光度を測定することにより決定すると、透明度は、約２〜約７のｐＨ範囲にわたって約１．０未満である。
熱安定性：
本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物と比較して、ｐＨ６およびｐＨ７の両方で、熱安定性が向上している。以下に詳細に説明するように、上澄み液からの７Ｓタンパク質の等電点沈殿（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）の後、加熱処理した上澄み液は、加熱の際にさらなるタンパク質の沈殿に耐える。
２８０ｎｍでの吸光度：
本発明の新規なキャノーラタンパク質は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物よりも２８０ｎｍで弱い吸光度を有する。この結果は、本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物が、上澄み液由来のキャノーラタンパク質ほどには、２８０ｎｍで強く吸収するチロシンおよびトリプトファンを含まないことを示す。
表面疎水性：
本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物よりも低い表面疎水性を有し、それはおそらく、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物と比較して、新規なキャノーラタンパク質単離物のグロブリン含量が低いことに起因する。
【００２０】
新規なキャノーラタンパク質単離物の表面疎水性は、一般的に約２５未満、好ましくは約２０未満である。
【００２１】
本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物は、米国特許出願第１０／１３７，３９１号および第１０／４７６，２３０号の手順による濃縮上澄み液から、７Ｓタンパク質を等電点沈殿（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させることによって、濃縮上澄み液中の７Ｓタンパク質の割合を減少させ、結果として２Ｓタンパク質の割合を増加させることにより調製される。あるいは、上澄み液の濃縮または次の部分的濃縮の前に、上澄み液に対する処理を行うことができる。従って、本発明の別の態様では、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質単離物の調製方法であって、（ａ）主として２Ｓタンパク質からなる、２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、（ｂ）水溶液から７Ｓキャノーラタンパク質を等電点沈殿させるステップと、（ｃ）水溶液から沈殿した７Ｓタンパク質を除去するステップと、（ｄ）少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質単離物を回収するステップとを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、タンパク質単離物の回収プロセスの概略図である。
【図２】図２は、図１に示すＰＭＭ形成プロセスによる上澄み液から本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物を製造するために使用する手順の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の概略説明
本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％のタンパク質含量を有し、回分プロセスまたは連続プロセスまたは半連続プロセスによって、キャノーラ油糧種子粗粉から単離することができる。
【００２４】
本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は主として２Ｓタンパク質からなり、かつ主として２Ｓタンパク質からなりキャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み液から得られ調製の同じ実験条件下で調製されるキャノーラタンパク質単離物と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しており、７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少している。上記のように、本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物は、７Ｓタンパク質の割合が減少しており、２Ｓタンパク質の割合が増加しているが、少量の残留する７Ｓタンパク質が常に存在する。キャノーラタンパク質単離物は、上澄み液からの７Ｓタンパク質の等電点沈殿（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）により得られる。
【００２５】
新規なキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約８５重量％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１５重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質、好ましくは少なくとも約９０重量％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１０重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質、より好ましくは可能な限り高い割合の２Ｓタンパク質を含む。上記のように、このようなキャノーラタンパク質単離物は、以下でより詳細に説明する上澄み液、部分濃縮上澄み液および濃縮上澄み液の処理によって得ることができる。上澄み液、部分濃縮上澄み液および濃縮上澄み液の処理により、７Ｓタンパク質の沈殿がもたらされ、これは遠心分離または濾過などの任意の好都合な手段によって、処理した上澄み液から除去することができる。２Ｓタンパク質は処理によって影響されないので、処理は、７Ｓタンパク質の割合を減少させることによって、存在する２Ｓタンパク質の割合を増加させる。
【００２６】
新規なキャノーラタンパク質単離物は、一般的に約ｐＨ２〜約ｐＨ７．５、好ましくは約ｐＨ２〜ｐＨ４の広範囲のｐＨ値にわたって、水溶液に可溶性であり、一般的に、主として２Ｓタンパク質からなり、調製の同じ実験条件下でのキャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物と等しいまたはより高い溶解度を有している。さらに、市販のものなどの、炭酸および非炭酸両方のソフトドリンクおよびスポーツドリンクを含み、炭酸および非炭酸両方のスポーツエネルギードリンクを含む、ソフトドリンク中の新規なキャノーラタンパク質単離物の水溶液は、主として２Ｓタンパク質からなり調製の同じ条件下でのキャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物から製造されるそのような水溶液よりも高い透明度を有する。
【００２７】
ソフトドリンクおよびスポーツドリンク中の溶液を含む水溶液中のキャノーラタンパク質単離物の濃度は、溶液の所期の使用に応じて変えることができる。一般に、タンパク質濃度は、約０．１〜約３０重量％、好ましくは約１〜約５重量％で変えることができる。
【００２８】
従って、本発明は、上記の飲料だけでなく、ジュース、アルコール飲料、コーヒー飲料および乳飲料などの他の飲料も含む、本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物の水溶液を含む。
【００２９】
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質性物質を可溶化させることを含む。キャノーラ油糧種子粗粉から回収したタンパク質性物質は、キャノーラ種子中に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質性物質は、遺伝子操作によって改変されているが、天然のタンパク質の特徴的な疎水性および極性の特性を有しているタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、例えば高温ヘキサン抽出法または冷オイル押出法によって得られる、異なるレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子から、キャノーラ油を除去することによって得られる任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油の除去は、通常、本明細書に記載のタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００３０】
塩の存在が、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去を増大させるので、タンパク質可溶化は食品グレードの塩溶液を使用することによって最も効率的に行われる。キャノーラタンパク質単離物を食品以外へ使用するつもりである場合、非食品グレードの化学製品を使用することができる。塩化カリウムなどの他の塩を使用することができるが、塩は通常塩化ナトリウムである。塩溶液は、かなりの量のタンパク質の可溶化が行われるのを可能にするため、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増加するにつれて、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化の程度は、最大値に達するまで最初は増加する。その後のイオン強度の増加は、可溶化される全体のタンパク質を増加させない。最大のタンパク質可溶化をもたらす食品グレードの塩溶液のイオン強度は、当該塩および選択した油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００３１】
イオン強度の増加に伴ってタンパク質の沈殿に要する希釈度がより大きくなることを考慮して、約０．８未満のイオン強度値、より好ましくは約０．１〜約０．１５の値を用いることが通常好ましい。
【００３２】
回分プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、約５℃〜約７５℃の温度で、通常約１０〜約６０分である可溶化時間を短縮するために、好ましくは攪拌を伴って行う。全体として高い製品収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うことが好ましい。
【００３３】
この温度より低いと可溶化が実際的でないくらい遅くなるので、約５℃の下限温度を選択し、一方で存在するタンパク質のいくらかの変性温度のため約７５℃の好ましい上限温度を選択する。
【００３４】
連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続的抽出を行うのに調和した任意の方法で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を食品グレードの塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を通して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間をもたらす流速で輸送する。このような連続的手順では、塩可溶化ステップは、好ましくはキャノーラ油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、迅速に、約１０分までの時間で行う。連続的手順での可溶化は、約５℃と約７５℃との間、好ましくは約１５℃と約３５℃との間の温度で行う。
【００３５】
食品グレードの塩水溶液は、一般的に約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有し、この塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて、任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲内の任意の所望の値に調整することができる。
【００３６】
可溶化ステップ中の食品グレードの塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、広範囲で変えられる。典型的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００３７】
塩水溶液によるタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉中に存在しうる脂肪を可溶化する追加的な効果を有し、それによって脂肪が水相中に存在するという結果になる。
【００３８】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般的に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００３９】
塩水溶液は、酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤とすることができる。使用する酸化防止剤の量は、溶液の約０．０１〜約１重量％で変えることができ、好ましくは約０．０５重量％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液中のフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００４０】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機の使用に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離することができる。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。
【００４１】
キャノーラタンパク質の最終単離物の色は、分離したタンパク質水溶液と、粉末活性炭または他の色素吸着剤を混合し、引き続いて濾過により好都合に吸着剤を除去してタンパク質溶液を得ることによって、明色およびより弱い黄色の観点から、改善することができる。色素の除去に透析濾過を使用することもできる。
【００４２】
このような色素除去ステップは、任意の適当な色素吸着剤を使用して、一般的に分離したタンパク質水溶液の周囲温度で、任意の好都合な条件下で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用する。
【００４３】
本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉がかなりの量の脂肪を含んでいる場合、分離したタンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に、上記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色改善ステップを行う場合、このステップは第１脱脂ステップの後に行うことができる。
【００４４】
水のみの使用では、塩水溶液よりも油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出が少ない傾向があるが、塩水溶液による油糧種子粗粉の抽出の代替法として水のみを使用して抽出を行うことができる。このような代替法を使用する場合、以下で説明する濃縮ステップ中にタンパク質を溶液中に維持するために、残留油糧種子粗粉からの分離後に、上記の濃度で塩をタンパク質溶液に添加することができる。第１脂肪除去ステップを行う場合、塩は一般的にこのような操作の完了後に添加する。
【００４５】
別の代替手順は、一般的に約９．９までの、約６．８を超える比較的高いｐＨ値で、食品グレードの塩溶液により油糧種子粗粉を抽出するというものである。食品グレードの塩溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液などの任意の好都合な食品グレードのアルカリを使用することによって、所望のアルカリ性値に調整することができる。あるいは、油糧種子粗粉は、一般的に約ｐＨ３までの、約ｐＨ５未満の比較的低いｐＨで、塩溶液により抽出することができる。このような代替法を使用する場合、油糧種子粗粉の抽出ステップから得られた水相は、デカンター型遠心分離に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過を使用して残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離する。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。
【００４６】
次いで、高ｐＨまたは低ｐＨ抽出ステップから得られたタンパク質水溶液を、以下に述べるさらなる処理の前に、上記のように、約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２の範囲にｐＨ調整する。このようなｐＨ調整は、必要に応じて、任意の好都合な塩酸などの酸または水酸化ナトリウムなどのアルカリを使用して行うことができる。
【００４７】
タンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増加させると同時に、そのイオン強度を実質的に一定に維持する。このような濃縮は、一般的に少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を得るように行う。
【００４８】
濃縮ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンなどの適当な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有し、連続操作の場合には、タンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃縮度が可能になるような寸法にする、中空繊維膜またはスパイラル膜（ｓｐｉｒａｌ−ｗｏｕｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ）などの膜を使用した、限外濾過または透析濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用するなど、回分操作または連続操作に調和した任意の好都合な方法で行うことができる。
【００４９】
周知のように、限外濾過および同様の選択的膜技術は、低分子量の種が膜を通過するのを許すと同時に、高分子量の種が膜を通過するのを阻止する。低分子量の種には、食品グレードの塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素および抗栄養因子（ａｎｔｉ−ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒｓ）などの供給源材料から抽出された低分子量物質、ならびに任意の低分子量形タンパク質も含まれる。膜の分画分子量は、通常、異なる膜材料および構造を考慮して、かなりの割合のタンパク質を溶液中に確実に保持すると同時に、汚染物質が通過するのを許すよう選択する。
【００５０】
次いで、濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液と同じモル濃度およびｐＨの塩水溶液を使用して、透析濾過ステップに供することができる。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を通過させることにより、タンパク質水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかしながら、所望であれば、透析濾過ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量を有する膜などの、異なる分画分子量を有する分離膜を使用して行うことができる。
【００５１】
透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１重量％で変えることができ、好ましくは約０．０５重量％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００５２】
濃縮ステップおよび透析濾過ステップは、任意の好都合な温度、一般的には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の程度の濃縮を行うための時間行うことができる。使用する温度および他の条件は、ある程度、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度に依存する。
【００５３】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、必要に応じて、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のようにさらなる脱脂操作に供することができる。
【００５４】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、上記色除去操作の代替として、ある色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。
【００５５】
色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００５６】
任意選択の色除去ステップから得られた、濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、貯蔵またはそれ以外の結果として元の粗粉中に存在しており、抽出ステップで粗粉からキャノーラタンパク質溶液中に抽出された可能性のある細菌を完全に殺すために、低温殺菌に供することができる。このような低温殺菌は、任意の所望の低温殺菌条件下で行うことができる。一般に、濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液を、約５５℃〜約７０℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃の温度で、約１０〜約１５分間、好ましくは約１０分間加熱する。次いで、低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を、以下に説明するさらなる処理のために、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度に冷却することができる。
【００５７】
濃縮ステップおよび任意選択の透析濾過ステップで使用する温度、ならびに低温殺菌ステップを行うかどうかに応じて、濃縮タンパク質溶液を、少なくとも約２０℃で約６０℃まで、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度に加温し、濃縮タンパク質溶液の粘度を減少させ、引き続く希釈ステップおよびミセル形成の実行を容易にすることができる。濃縮タンパク質溶液は、それを超えると冷水による希釈時にミセル形成が起こらない温度を超えて加熱すべきではない。
【００５８】
次いで、濃縮ステップ、ならびに任意選択の透析濾過ステップ、任意選択の色除去ステップ、任意選択の低温殺菌ステップおよび任意選択の脱脂ステップから得られた濃縮タンパク質溶液を、その濃縮タンパク質溶液を所望の希釈度を得るのに必要な容積を有する冷水と混合することによって希釈してミセル形成を行う。ミセル経路によって得ようとするキャノーラタンパク質の割合および上澄み液からの割合に応じて、濃縮タンパク質溶液の希釈度を変えることができる。一般に、より低い希釈レベルでは、より高い割合のキャノーラタンパク質が水相中に残留する。
【００５９】
ミセル経路によって最も高い割合のタンパク質を得ることが望まれる場合、濃縮タンパク質溶液を約５倍〜約２５倍、好ましくは約１０倍〜約２０倍で希釈する。
【００６０】
濃縮タンパク質溶液と混合する冷水は、約１５℃未満、一般的に約１℃〜約１５℃、好ましくは約１０℃未満の温度を有するが、その理由は、使用する希釈倍率でこれらのより冷たい温度で改善された収率のタンパク質ミセル塊形状のタンパク質単離物が得られるからである。
【００６１】
回分操作では、濃縮タンパク質溶液のバッチを、上記のように所望の容積を有する冷水の静止体（ｓｔａｔｉｃ ｂｏｄｙ）に添加する。濃縮タンパク質溶液の希釈および結果として生じるイオン強度の減少は、ミセル形状の離散したタンパク質小滴の形態を取る高度に会合したタンパク質分子の雲様塊の形成を引き起こす。回分式手順では、タンパク質のミセルは、冷水体中に沈降させることにより、凝集、合体して濃密な、非晶質で粘着性のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成する。沈降は、遠心分離などによって促進することができる。このように誘導された沈降により、タンパク質ミセル塊の液体含量が減少し、それにより、水分含量は一般的に全ミセル塊の約７０重量％〜約９５重量％から、一般的に約５０重量％〜約８０重量％の値に減少する。このようにしてミセル塊の水分含量が減少すると、ミセル塊の吸蔵塩含量、結果として乾燥単離物の塩含量も減少する。
【００６２】
あるいは、濃縮タンパク質溶液をＴ字型パイプの一方の入口に連続的に通すと同時に、希釈水をＴ字型パイプの他方の入口に供給して、パイプ中で混合させることによって、希釈操作を連続的に行うことができる。希釈水は、濃縮タンパク質溶液の所望の希釈度を達成するのに十分な速度で、Ｔ字型パイプ中に供給する。
【００６３】
濃縮タンパク質溶液および希釈水のパイプ中での混合により、タンパク質のミセルの形成が開始され、混合物はＴ字型パイプの出口から沈降容器中へ連続的に供給され、満杯になったときに、この沈降容器から上澄み液をあふれさせる。混合物は、好ましくは、液体内の乱流を最小化するように、沈降容器中の液体中に供給する。
【００６４】
連続手順では、タンパク質のミセルは、沈降容器中に沈降させることにより、凝集、合体して濃密な、非晶質で粘着性のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成し、所望の量のＰＭＭが沈降容器の底に蓄積するまでこの手順を続け、その後すぐに蓄積したＰＭＭを沈降容器から取り出す。沈殿による沈降の代わりに、遠心分離によってＰＭＭを連続的に分離することができる。
【００６５】
少なくとも約２００ｇ／Ｌの好ましいタンパク質含量へのタンパク質溶液の濃縮に関するプロセスのパラメータの組み合わせ、および約１０〜約２０の希釈倍率の使用により、上記米国特許出願で論じた既知の従来技術のタンパク質単離物形成手順のいずれを使用して達成されるよりも、元の粗粉抽出物からのタンパク質ミセル塊形状のタンパク質回収に関して、より高い収率、多くの場合有意に高い収率が得られ、しかもタンパク質含量に関してずっと高い純度の単離物が得られる。
【００６６】
回分プロセスと比較して、キャノーラタンパク質単離物の回収のために連続プロセスを利用することにより、同じレベルのタンパク質抽出に関して、最初のタンパク質抽出ステップの時間が著しく短縮され、かつ抽出ステップにおいて、著しく高い温度を使用することができる。さらに、連続操作では、回分手順よりも汚染の機会が少なく、より高い製品品質が得られ、より小型の装置でプロセスを行うことができる。
【００６７】
沈降した単離物は、沈降した塊からの残留水相のデカンテーションまたは遠心分離などによって、残留水相または上澄み液から分離する。ＰＭＭは、湿った形態で使用することも、または噴霧乾燥もしくは凍結乾燥などの任意の好都合な技術により乾燥させて乾燥形態にすることもできる。乾燥ＰＭＭは、約９０重量％を超えるタンパク質、好ましくは少なくとも約１００重量％タンパク質（ケルダールＮ×６．２５として計算）の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定により測定）。必要に応じて米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号の手順を使用した場合、脂肪性油糧種子粗粉から単離した乾燥ＰＭＭも残留脂肪含量が低く、それは約１重量％未満になり得る。
【００６８】
上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号および第１０／５１０，７６６号に記載のように、ＰＭＭは、主として、約６０〜約９８重量％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５重量％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５重量％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する７Ｓキャノーラタンパク質からなる。
【００６９】
ＰＭＭ形成および沈降ステップからの上澄み液は、希釈ステップでは沈殿しない、かなりの量のキャノーラタンパク質を含み、これを処理してキャノーラタンパク質単離物を回収する。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号および第１０／５１０，７６６号に記載のように、上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物は、主として、約６０〜約９５重量％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０重量％の７Ｓタンパク質および０〜約５重量％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する２Ｓキャノーラタンパク質からなる。
【００７０】
希釈ステップからの上澄み液は、ＰＭＭの除去の後で濃縮して、そのタンパク質濃度を増加させる。このような濃縮は、タンパク質供給源材料から抽出された塩および他の非タンパク質性低分子量物質を含む低分子量種が膜を通過するのを可能にすると同時に、キャノーラタンパク質を溶液中に保持する適当な分画分子量を有する膜を使用する、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行う。異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの分画分子量を有する限外濾過膜を使用することができる。このような上澄み液の濃縮は、乾燥してタンパク質を回収するのに必要な液体の容積も減少させる。上澄み液は、一般的に、乾燥の前に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約３００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮する。このような濃縮操作は、タンパク質溶液濃縮ステップに関して上記したように、回分様式または連続操作で行うことができる。
【００７１】
次いで、濃縮上澄み液を、水、食塩水または酸性水を使用して、透析濾過ステップに供することができる。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液を通過させることにより、上澄み水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、所望であれば、透析濾過は、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量を有する膜などの分離膜を使用して行うことができる。
【００７２】
透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１重量％で変えることができ、好ましくは約０．０５重量％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００７３】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、上記色除去操作の代替法として、ある色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。
【００７４】
色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００７５】
本発明によると、濃縮され、場合により透析濾過された上澄み液は、任意選択の色除去操作の後、等電点沈殿および７Ｓタンパク質の除去、およびその結果、濃縮上澄み液中に存在するキャノーラタンパク質中の２Ｓタンパク質の割合を増加させることによって、溶液中に存在する７Ｓタンパク質の量を減少させるように処理する。
【００７６】
このような処理は、濃縮上澄み液中に存在する７Ｓの割合を減少させる、好ましくは７Ｓタンパク質の割合を相当の程度減少させるのに十分なｐＨおよび塩条件下で行うことができる。一般に、上澄み液の７Ｓタンパク質含量を、処理によって、少なくとも約５０重量％、好ましくは少なくとも約７５重量％減少させる。沈殿した７Ｓタンパク質は、遠心分離もしくは濾過、またはこれらの組み合わせなどの任意の好都合な方法で除去することができる。
【００７７】
等電処理手順では、塩として、塩化カリウムなどの他の塩も使用できるが、通常は塩化ナトリウムを、上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液に最初に添加し、少なくとも約０．３ｍＳ、好ましくは約１０〜約２０ｍＳの導電率を有する塩添加溶液を得る。
【００７８】
塩添加上澄み液のｐＨを、７Ｓタンパク質の等電点沈殿をもたらす値、一般的に約２．０〜約４．０、好ましくは約３．０〜約３．５のｐＨに調整する。７Ｓタンパク質の等電点沈殿は、広い温度範囲にわたって、一般的に約５℃〜約７０℃、好ましくは約１０℃〜約４０℃で行うことができる。沈殿した７Ｓタンパク質は、遠心分離もしくは濾過、またはこれらの組み合わせなどの任意の好都合な手段によって、等電点沈殿させた上澄み液から除去する。
【００７９】
次いで、等電点沈殿させた上澄み液は、まだ濃縮していない場合、上記のように濃縮し、透析濾過して塩を除去し、その後、濃縮され、透析濾過された上澄み液を乾燥させて本発明のキャノーラタンパク質単離物を形成する。噴霧乾燥または凍結乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥形態に乾燥させて、本発明によるキャノーラタンパク質単離物を得る前に、濃縮され、透析濾過され、等電点沈殿させた上澄み液を、上記のように、濾過して残留粒子を除去し、任意選択の色除去ステップに供することができる。このようなキャノーラタンパク質単離物は、約９０重量％を超える、好ましくは少なくとも約１００重量％タンパク質（Ｎ×６．２５）の高いタンパク質含量を有する。
【００８０】
濃縮され、透析濾過され、等電点沈殿させた上澄み液のｐＨは、乾燥の前に、乾燥単離物の所期の使用に対応したｐＨ、一般的には約２〜約５、好ましくは約２．５〜約４のｐＨに調整することができる。
【００８１】
このような新規なキャノーラタンパク質単離物は、高い割合の２Ｓタンパク質、好ましくは単離物中のキャノーラタンパク質の少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも約９５重量％を含む。単離物中には、ある割合の７Ｓタンパク質も存在する。
【００８２】
あるいは、上記の濃縮ステップおよび透析濾過ステップの前に、７Ｓタンパク質を沈殿させるための上澄み液の等電処理（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を上澄み液に対して行うことができる。沈殿した７Ｓタンパク質の除去の後で、上澄み液を濃縮し、場合により透析濾過し、場合により色除去操作にかけ、乾燥させて本発明によるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００８３】
さらなる代替法として、上澄み液を最初に任意の好都合なレベルまで部分的に濃縮することができる。次いで、部分濃縮上澄み液を、７Ｓタンパク質を沈殿させるための等電処理に供する。沈殿した７Ｓタンパク質の除去の後で、上澄み液を、一般的に約５０〜約３００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌの濃度までさらに濃縮し、場合により透析濾過し、場合により色除去操作にかけ、乾燥させて本発明によるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００８４】
沈殿した７Ｓタンパク質は、遠心分離もしくは濾過、またはこれらの組み合わせなどの任意の好都合な手段によって、上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液から除去する。
【００８５】
沈殿した７Ｓタンパク質の除去の後で、等電処理された上澄み液、または等電処理された部分濃縮上澄み液を、上記のように、濃縮もしくは透析濾過の間または後の任意の時点でｐＨ調整することができる。
好ましい実施形態の説明
図１を参照すると、ミセル経路によるキャノーラタンパク質単離物（ＣＰＩ）の形成と比較して、二膜プロセスが示されている。
【００８６】
図から分かるように、限外濾過ステップおよび透析濾過ステップを含むことができる第１限外濾過段階（限外濾過＃１）からの保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を２つの方法のうちの一方で処理する。二膜プロセスでは、保持液を噴霧乾燥して、主として７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００８７】
上記米国特許出願第１０／１３７，３２１号および第１０／４７６，２３０号の手順では、保持液は希釈ステップに進み、そこでキャノーラタンパク質単離物がタンパク質ミセル塊として沈殿する。タンパク質ミセル塊を噴霧乾燥して、主として７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００８８】
二膜実施形態では、第１限外濾過ステップからの透過液を、限外濾過および透析濾過を含むことができる第２限外濾過ステップ（限外濾過＃２−Ａ）に供する。第２限外濾過ステップからの保持液を噴霧乾燥して、主として２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００８９】
米国特許出願第１０／１３７，３２１号および第１０／４７６，２３０号の手順では、タンパク質ミセル塊の沈殿による上澄み液を、限外濾過および透析濾過を含むことができる限外濾過ステップ（限外濾過＃２−Ｂ）に供する。限外濾過ステップからの保持液を、７Ｓタンパク質の等電点沈殿に供し、次いで、噴霧乾燥して、主として２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００９０】
図２を参照すると、ミセルプロセスからの上澄み液を処理して本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物を製造する手順が示されており、この手順では濃縮（限外濾過＃２）の後（右側のフロー）または濃縮の前（左側のフロー）のいずれかで、上澄み液の等電点沈殿を行う。
【実施例】
【００９１】
例１：
この例は、新規なキャノーラタンパク質単離物の製造のための一手順を説明する。
【００９２】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過により清澄化して、「ｄ」重量％のタンパク質含量を有する濾過されたタンパク質溶液「ｃ」Ｌを製造した。
【００９３】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｅ」Ｌを、５０００ダルトンの分画分子量を有するポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜で濃縮して容積を「ｆ」Ｌに減少させ、次いで、同じ膜で０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｇ」Ｌにより透析濾過した。次いで、透析濾過した保持液を６０℃で１０分間低温殺菌した。得られた低温殺菌した濃縮タンパク質溶液は、「ｈ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【００９４】
「ｉ」℃の濃縮された溶液を、「ｋ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｊ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した、粘性の、粘着性塊（ＰＭＭ）を、容器の底から、濾過したタンパク質溶液の「ｌ」重量％の収率で回収した。乾燥ＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｍ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｎ」Ｃ３００という名称を与えた。
【００９５】
２つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｎ」を以下の表Ｉに示す。
【００９６】
【表１】
【００９７】
除去した上澄み液を、１００００ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｏ」Ｌに減少させ、次いで、濃縮液を、同じ膜で水「ｐ」Ｌにより透析濾過した。次いで、透析濾過した濃縮液を６０℃で１０分間低温殺菌した。低温殺菌した濃縮液は、「ｑ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は、「ｒ」重量％であった。低温殺菌した濃縮液は、２つの等しい部分に分割した。一方の部分を噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｎ」Ｃ２００という名称を与え、この最終生成物は「ｓ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。
【００９８】
２つの実験についてのパラメータ「ｎ」〜「ｓ」を以下の表ＩＩに示す。
【００９９】
【表２】
【０１００】
低温殺菌した濃縮上澄み液の他方の部分を８５℃で１０分間加熱し、次いで、遠心分離して沈殿したタンパク質を除去した。次いで、得られた濃縮液を噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｎ」Ｃ２００Ｈという名称を与え、この最終生成物は「ｔ」％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有していた。２つの実験についてのパラメータ「ｎ」および「ｔ」を以下の表ＩＩＩに示す。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
例２：
この例は、新規なキャノーラタンパク質単離物の製造のための代替手順を説明する。
【０１０３】
キャノーラ粗粉を、周囲温度で塩化ナトリウム溶液に添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質を遠心分離および濾過により清澄化した。
【０１０４】
タンパク質抽出溶液の一定分量を、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜で濃縮して容積を減少させ、次いで場合により、同じ膜で塩化ナトリウム溶液により透析濾過した。次いで、保持液を６０℃で１０分間低温殺菌した。
【０１０５】
濃縮された溶液を、冷ＲＯ水中に入れて希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した粘性の粘着性塊（ＰＭＭ）を、デカンテーションまたは遠心分離のいずれかにより回収した。ＰＭＭを噴霧乾燥し、最終生成物を形成した。
【０１０６】
次いで、除去した希釈水（上澄み液と呼ぶ）、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液に加熱処理を行った。
【０１０７】
濃縮上澄み液に加熱処理を行った場合、上澄み液「ａ」Ｌを、「ｃ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｂ」Ｌに減少させ、次いで、濃縮液を、同じ膜で水「ｄ」Ｌにより透析濾過した。次いで、透析濾過した濃縮液を６０℃で１０分間低温殺菌した。低温殺菌した濃縮液は、「ｅ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は、「ｆ」重量％であった。低温殺菌した濃縮液は、２つの等しい部分に分割した。一方の部分「ｇ」Ｌを噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｈ」Ｃ２００という名称を与え、この最終生成物は「ｉ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。
【０１０８】
６つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｉ」を以下の表ＩＶに示す。
【０１０９】
【表４】
【０１１０】
低温殺菌した濃縮上澄み液の他方の部分「ｊ」Ｌを８５℃で１０分間加熱し、次いで、遠心分離して沈殿したタンパク質を除去した。次いで、得られた濃縮液（ｃｅｎｔｒａｔｅ）を噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｈ」Ｃ２００Ｈという名称を与え、この最終生成物は「ｋ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。６つの実験についてのパラメータ「ｈ」、「ｊ」および「ｋ」を以下の表Ｖに示す。
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
上澄み液または部分濃縮上澄み液に加熱処理を行った場合、上澄み液「ｌ」Ｌを、「ｎ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｍ」Ｌに減少させた。次いで、上澄み液または部分濃縮上澄み液を８５℃で１０分間加熱し、次いで、遠心分離して沈殿したタンパク質を除去した。必要な場合には、残留する沈殿したタンパク質を濾過によって除去した。次いで、清澄化したサンプルを、「ｐ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｏ」Ｌに減少させた。濃縮液は、「ｑ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は、「ｒ」重量％であった。濃縮液を噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｈ」Ｃ２００ＨＳという名称を与え、この最終生成物は「ｓ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。６つの実験についてのパラメータ「ｈ」および「ｌ」〜「ｓ」を以下の表ＶＩに示す。
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
例３：
この例は、本発明の一実施形態による新規なキャノーラタンパク質単離物の製造を説明する。
【０１１５】
キャノーラ粗粉を、周囲温度で塩化ナトリウム溶液に添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過により清澄化した。
【０１１６】
タンパク質抽出溶液の一定分量を、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で濃縮して容積を減少させた。次いで、保持液を６０℃で１分間低温殺菌した。
【０１１７】
濃縮された溶液を、冷ＲＯ水中に入れて希釈した。直ちに白色の雲状物が形成した。沈殿した粘性の粘着性塊（ＰＭＭ）を、遠心分離により上澄み液から分離した。ＰＭＭを噴霧乾燥し、最終生成物を形成した。
【０１１８】
上澄み液「ａ」Ｌを、塩化ナトリウム「ｂ」ｋｇと混ぜ合わせて、塩濃度を約０．１Ｍに調整した。塩添加の後に、希塩酸の添加によってｐＨを３．５に調整した。サンプルの導電率は１４．０３ｍＳであった。タンパク質沈殿が生じたら、サンプルを１０分間静置した。
【０１１９】
沈殿したタンパク質を遠心分離により酸性化した上澄み液から除去した。沈殿したタンパク質を噴霧乾燥し、最終生成物を形成した。
【０１２０】
酸性化した上澄み液のｐＨを、希塩酸の添加によって３に下げた。次いで、酸性化した上澄み液「ｃ」Ｌを、「ｅ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を約「ｄ」Ｌに減少させ、次いで、濃縮液を同じ膜で酸性水「ｆ」Ｌにより透析濾過した。透析濾過した濃縮液を濾過して、残留する沈殿したタンパク質を除去した。一定分量「ｇ」ｋｇを噴霧乾燥し、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｈ」Ｃ２００ＩＳという名称を与え、この最終生成物は「ｉ」重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。
【０１２１】
パラメータ「ａ」〜「ｉ」を以下の表ＶＩＩＩに示す。
【０１２２】
【表７】
【０１２３】
例４：
この例は、例２および例３で製造した噴霧乾燥したキャノーラタンパク質単離物の溶解度の評価を含む。
【０１２４】
噴霧乾燥した、例２の手順により製造した濃縮上澄み液（Ｃ２００）および改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）、ならびに例３の手順により製造した等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）の溶解度を、Ｍｏｒｒら、Ｊ．Ｆｏｏｄ．Ｓｃｉ．５０：１７１５−１７１８の手順の修正版を使用して測定した。
【０１２５】
タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、少量の逆浸透（ＲＯ）精製水を添加し、滑らかなペーストが形成されるまで混合物を攪拌した。次いで、追加の水を添加し、容積を約４５ｍｌにした。次いで、ビーカーの内容物を、磁気攪拌器を使用して６０分間ゆっくり攪拌した。タンパク質を分散させた直後にｐＨを測定し、ＮａＯＨまたはＨＣｌにより適当なレベル（２、３、４、５、６または７）に調整した。サンプルは元のｐＨでも調製した。ｐＨを調整したサンプルに関して、ｐＨを測定し、６０分の攪拌中に２度修正した。６０分の攪拌の後、ＲＯ水でサンプルを５０ｍｌの総容量にし、１％ｗ／ｖのタンパク質分散液を得た。Ｌｅｃｏ ＦＡ２８窒素分析装置（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を使用したＬｅｃｏ分析によってタンパク質含量を測定するために、一定分量のタンパク質分散液を保存した。サンプルの他の部分は、８０００ｇで１０分間遠心分離した。これにより、いずれの未溶解物質も沈降し、透明な上澄み液が得られた。次いで、上澄み液のタンパク質含量をＬｅｃｏ分析によって測定した。
【０１２６】
溶解度（％）＝（上澄み液のタンパク質濃度／元の分散液のタンパク質濃度）×１００
得られた結果を以下の表ＩＸに示す。
【０１２７】
【表８】
【０１２８】
表ＩＸの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、例１に従って製造した濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、種々のｐＨ値において水に著しく可溶性であった。
例５：
この例は、例２および例３で製造した噴霧乾燥したキャノーラタンパク質単離物のソフトドリンクおよびスポーツドリンク中の溶解度の評価を含む。
【０１２９】
例４中の上記のように、ただし、水に代えてソフトドリンクまたはスポーツドリンクを用いて、２％ｗ／ｖのタンパク質濃度で、ｐＨ調製を行わずに、噴霧乾燥した、例２の手順により製造した濃縮上澄み液（Ｃ２００）および改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）、ならびに例３の手順により製造した等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）の、ソフトドリンク（スプライト（Ｓｐｒｉｔｅ））またはスポーツドリンク（オレンジゲータレード（Ｏｒａｎｇｅ Ｇａｔｏｒａｄｅ））中の溶解度を、Ｍｏｒｒら、Ｊ．Ｆｏｏｄ．Ｓｃｉ．５０：１７１５−１７１８の手順の修正版を使用して測定した。
【０１３０】
得られた結果を以下の表Ｘに示す。
【０１３１】
【表９】
【０１３２】
表Ｘの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、ソフトドリンクおよびスポーツドリンクに著しく可溶性であった。
例６：
この例は、種々のｐＨ値で水中に溶解した、例２および例３で製造した噴霧乾燥したキャノーラタンパク質単離物の溶液中の透明度の評価を含む。
【０１３３】
タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、少量の逆浸透（ＲＯ）精製水を添加し、滑らかなペーストが形成されるまで混合物を攪拌した。次いで、追加の水を添加し、容積を約４５ｍｌにした。次いで、ビーカーの内容物を、磁気攪拌器を使用して６０分間ゆっくり攪拌した。タンパク質を分散させた直後にｐＨを測定し、ＮａＯＨまたはＨＣｌにより適当なレベル（２、３、４、５、６または７）に調整した。サンプルは元のｐＨでも調製した。ｐＨを調整したサンプルに関して、ｐＨを測定し、６０分の攪拌中に２度修正した。６０分の攪拌の後、ＲＯ水でサンプルを５０ｍｌの総容量にし、１％ｗ／ｖのタンパク質分散液を得た。溶液の透明度は、純水をブランクに使用して、分光光度計により、６００ｎｍで吸光度を測定することにより決定した。吸光度の読みが小さくなると、透明度は大きくなる。
【０１３４】
得られた結果を以下の表ＸＩに示す。
【０１３５】
【表１０】
【０１３６】
表ＸＩの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、種々のｐＨ値で水中の透明度が著しく高い溶液を生み出した。この差は、低いｐＨ値で最も顕著であった。
例７：
この例は、ソフトドリンクまたはスポーツドリンク中に溶解した、例２および例３で製造した噴霧乾燥した単離物の溶液中の透明度の評価を含む。
【０１３７】
透明度は、無色透明の市販の炭酸ソフトドリンク（スプライト（Ｓｐｒｉｔｅ））または有色の市販の非炭酸スポーツドリンク（オレンジゲータレード（Ｏｒａｎｇｅ Ｇａｔｏｒａｄｅ））中の２％ｗ／ｖタンパク質の溶液で、６００ｎｍで可視光の吸光度を測定することによって評価した。サンプルを含むタンパク質の透明度を測定する前に、分光光度計は、適当な飲料の純粋なサンプルをブランクとした。吸光度の読みが低いほど、より十分に光が透過しており、溶液の透明度がより優れていた。
【０１３８】
得られた結果を以下の表ＸＩＩに示す。
【０１３９】
【表１１】
【０１４０】
表ＸＩＩの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの噴霧乾燥した単離物から調製した溶液の透明度は、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）から調製した溶液の透明度よりはるかに優れていた。
例８：
この例は、一般的な飲料のｐＨ値を含む。
【０１４１】
一般的な飲料のｐＨ値はｐＨメーターによって測定し、得られた結果を以下の表ＸＩＩＩに示す。
【０１４２】
【表１２】
【０１４３】
例９：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）の溶解度のさらなる評価を含む。
【０１４４】
タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、少量の逆浸透（ＲＯ）精製水を添加し、滑らかなペーストが形成されるまで混合物を攪拌した。次いで、追加の水を添加し、容積を約４５ｍｌにした。次いで、ビーカーの内容物を、磁気攪拌器を使用して６０分間ゆっくり攪拌した。タンパク質を分散させた直後にｐＨを測定し、ＮａＯＨまたはＨＣｌにより適当なレベル（２、３、４、５、６または７）に調整した。サンプルは元のｐＨでも調製した。ｐＨを調整したサンプルに関して、ｐＨを測定し、６０分の攪拌中に２度修正した。６０分の攪拌の後、ＲＯ水でサンプルを５０ｍｌの総容量にし、１％ｗ／ｖのタンパク質分散液を得た。次いで、分散液のサンプル（２０ｍｌ）を、１０５℃のオーブンで３０分間乾燥させ、次いでデシケーター中で冷却した予め秤量した遠心管に移し、管に蓋をした。サンプルを７８００ｇで１０分間遠心分離し、不溶性物質を沈降させて透明な上澄み液を得た。上澄み液および管の蓋を捨て、ペレット物質を５５℃に設定したオーブンで一晩乾燥させた。翌朝、管をデシケーターに移し、冷却させた。乾燥ペレット物質の重量を記録した。最初のタンパク質粉末の乾燥重量は、使用した粉末の重量に、（（１００−粉末の水分含量（％））／１００）倍を掛けることによって計算した。次いで、生成物の溶解度を以下のように計算した。
溶解度（％）＝（１−（乾燥不溶性ペレット物質重量／（２／５×最初の乾燥タンパク質粉末重量）））×１００
得られた結果を以下の表ＸＩＶに示す。
【０１４５】
【表１３】
【０１４６】
表ＸＩＶの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、種々のｐＨ値において水に著しく可溶性であった。
例１０：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００Ｈ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）のｐＨ７での熱安定性の評価を含む。
【０１４７】
タンパク質１．６ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、約１５ｇの逆浸透（ＲＯ）精製水を添加し、磁気攪拌器を使用して計６０分間混合物を攪拌した。必要に応じて、磁気攪拌を進める際に、生成物を攪拌棒により手動でも分散させた。３０分の攪拌の後、サンプルのｐＨを測定し、必要に応じて、ＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して７に調整した。次いで、サンプルをさらに３０分間攪拌した。６０分の攪拌の後、ｐＨを調べ、必要であれば７に再調整し、次いで、ＲＯ水でサンプルを２０ｇの総重量にし、８％ｗ／ｗのタンパク質分散液を得た。分散液を、１０５℃のオーブンで３０分間乾燥させ、次いでデシケーター中で冷却した予め秤量した遠心管に移した。管中の分散液の重量を記録し、次いでサンプルに蓋をし、これを９０℃の水浴中に３０分間置くことにより加熱処理した。加熱プロセスの間ずっと、水のレベルをサンプルの液体のレベルよりも高く維持した。加熱処理後、サンプルを氷浴中に置くことにより直ちに冷却した。次いで、サンプルを一晩冷蔵庫中に置いた。翌朝、サンプルを３度、それぞれ７８００ｇで１０分間、遠心分離した。上澄み液を管から静かに移し（完全に密なペレットが得られなかった場合、特定のサンプルでペレット物質のいくらかの小さい損失が認められたことに注意する）、管の蓋を捨てた。一晩、５５℃のオーブン中に開いた管を置くことにより、ペレット物質を乾燥させた。翌朝、サンプルをデシケーターに移し、冷却させた。乾燥ペレット物質の重量を測定した。最初のタンパク質粉末の乾燥重量は、使用した粉末の重量に、（（１００−粉末の水分含量（％））／１００）倍を掛けることによって計算した。次いで、生成物の溶解度への加熱処理の影響を以下のように計算した。
加熱処理後の不溶性粉末の％＝（乾燥不溶性ペレット物質重量／遠心管中の分散液重量／２０）×最初の乾燥タンパク質粉末重量））×１００
得られた結果を以下の表ＸＶに示す。
【０１４８】
【表１４】
【０１４９】
表ＸＶの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの噴霧乾燥した単離物から調製した溶液の熱安定性は、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）から調製した溶液の熱安定性よりも優れていた。
例１１：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）のｐＨ６での熱安定性の評価を含む。
【０１５０】
タンパク質０．３ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、約２５ｇの逆浸透（ＲＯ）精製水を添加し、磁気攪拌器を使用して計６０分間混合物を攪拌した。３０分の攪拌の後、サンプルのｐＨを測定し、必要に応じて、ＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して６に調整した。次いで、サンプルをさらに３０分間攪拌した。６０分の攪拌の後、ｐＨを調べ、必要であれば６に再調整し、次いで、ＲＯ水でサンプルを３０ｇの総重量にし、１％ｗ／ｗのタンパク質分散液を得た。分散液を、１０５℃のオーブンで３０分間乾燥させ、次いでデシケーター中で冷却した予め秤量した遠心管に移した。管中の分散液の重量を記録し、次いでサンプルに蓋をし、これを８５℃の水浴中に１０分間置くことにより加熱処理した。加熱プロセスの間ずっと、水のレベルをサンプルの液体のレベルよりも高く維持した。加熱処理後、サンプルを氷浴中に置くことにより直ちに冷却した。次いで、サンプルを７８００ｇで１０分間遠心分離した。上澄み液を管から静かに移し、管の蓋を捨てた。一晩、５５℃のオーブン中に開いた管を置くことにより、ペレット物質を乾燥させた。翌朝、サンプルをデシケーターに移し、冷却させた。乾燥ペレット物質の重量を測定した。最初のタンパク質粉末の乾燥重量は、使用した粉末の重量に、（（１００−粉末の水分含量（％））／１００）倍を掛けることによって計算した。次いで、生成物の溶解度への加熱処理の影響を以下のように計算した。
加熱処理後の不溶性粉末の％＝（乾燥不溶性ペレット物質重量／遠心管中の分散液重量／３０）×最初の乾燥タンパク質粉末重量））×１００
得られた結果を以下の表ＸＶＩに示す。
【０１５１】
【表１５】
【０１５２】
表ＸＶＩの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの噴霧乾燥した単離物から調製した溶液の熱安定性は、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）から調製した溶液の熱安定性よりも優れていた。
例１２：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００Ｈ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）のｐＨ３．５、０．１０Ｍ ＮａＣｌの塩分濃度での溶解度の評価を含む。
【０１５３】
タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、約４５ｇの０．１Ｍ ＮａＣｌを添加した。ビーカーの内容物を、磁気攪拌器を使用して３０分間攪拌した。次いで、ＨＣｌの添加によってｐＨを３．５に調整した。次いで、サンプルをさらに３０分間攪拌した。この時、ｐＨを調べ、必要であれば３．５に再調整し、次いで、追加の０．１Ｍ ＮａＣｌでサンプル重量を５０ｇにし、１％ｗ／ｗのタンパク質分散液を得た。次いで、分散液のサンプル（約３０ｇ）を、１０５℃のオーブンで３０分間乾燥させ、次いでデシケーター中で冷却した予め秤量した遠心管に移した。管中の分散液の重量を記録し、管に蓋をした。サンプルを７８００ｇで１０分間遠心分離し、不溶性物質を沈降させた。上澄み液を管から静かに移し（完全に密なペレットが得られなかった場合、特定のサンプルでペレット物質のいくらかの小さい損失が認められたことに注意する）、管の蓋を捨てた。ペレット物質を一晩、５５℃に設定したオーブン中で乾燥させた。翌朝、管をデシケーターに移し、冷却させた。乾燥ペレット物質の重量を記録した。最初のタンパク質粉末の乾燥重量は、使用した粉末の重量に、（（１００−粉末の水分含量（％））／１００）倍を掛けることによって計算した。次いで、生成物の溶解度へのｐＨおよび塩濃度の影響を以下のように計算した。
試験条件下での不溶性粉末の％＝（乾燥不溶性ペレット物質重量／（（遠心管中の最初のサンプルの重量／５０）×最初の乾燥タンパク質粉末重量））×１００
得られた結果を以下の表ＸＶＩＩに示す。
【０１５４】
【表１６】
【０１５５】
表ＸＶＩＩの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、ｐＨ３．５で食塩水に著しく可溶性であった。
例１３：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）の表面疎水性の評価を含む。
【０１５６】
異なる単離物の表面疎水性は、疎水性色素、１−アニリン８−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を伴う表面疎水性（Ｓ0）試験を使用して室温で測定した。相対蛍光強度は、分光蛍光光度計を使用して測定し、タンパク質の疎水性（Ｓ0）を相対蛍光強度（ＲＦＩ）の正味傾斜の計算により決定した。色素はタンパク質分子上の疎水性の部位に引きつけられるので、Ｓ0が高いほど、タンパク質はより疎水性である。
【０１５７】
濃縮上澄み液由来のタンパク質（Ｃ２００）は、より高い割合のグロブリン（７Ｓ）を含むので、この単離物は、ＡＮＳ試験によってより高い疎水性を有することが分かった。キャノーラグロブリンは極めて疎水性であると考えられており、これが事実であることが示された。改変された生成物は、グロブリンタンパク質のレベルが減少しているので、予想通り低い値であった。両単離物の主成分は、アルブミンのナピンである。このタンパク質は、非常に極性であり、結果として表面疎水性が非常に低い。
【０１５８】
結果を以下の表ＸＶＩＩＩに示す。データは、各々の単離物について１００％（Ｎ×６．２５）タンパク質を反映するよう調整している。
【０１５９】
【表１７】
【０１６０】
表ＸＶＩＩＩの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、著しく疎水性が低かった。さらに、この結果は、表面疎水性がグロブリンの含量と比例関係にあることを示している。
例１４：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）の１ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液の２８０ｎｍでの吸光度の評価を含む。
【０１６１】
タンパク質５０ｍｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、約４５ｍｌのｐＨ６．６６の１０ｍＭリン酸緩衝液を添加し、磁気攪拌器を使用して計６０分間混合物を攪拌した。６０分の攪拌の後、緩衝液でサンプルを５０ｍｌの総容積にし、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得た。サンプルを７８００ｇで１０分間遠心分離することにより清澄化し、次いで、上澄み液を石英キュベットに移し、リン酸緩衝液をブランクとして使用して、２８０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０１６２】
得られた結果を以下の表ＸＩＸに示す。
【０１６３】
【表１８】
【０１６４】
表ＸＩＸの結果から分かるように、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）から調製した溶液は、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）から調製した溶液よりも、２８０ｎｍでより強く吸収した。
開示の概要
本開示を要約すると、特に飲料において透明な水溶液の製造に有用な、２Ｓタンパク質の含量が増加しており、７Ｓタンパク質の量が減少している新規なキャノーラタンパク質単離物を提供する。本発明の範囲内で、改変が可能である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２００９年６月２０日出願の米国特許出願第１２／２１３，４９９号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は、新規なキャノーラタンパク質単離物の製造、ならびにソフトドリンクおよびスポーツドリンクを含む水溶液におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
少なくとも１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラ油糧種子タンパク質単離物は、本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年５月３日出願の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（米国特許出願公開第２００３−０１２５５２６号およびＷＯ０２／０８９５９７）および２００４年６月９日出願の米国特許出願第１０／４７６，２３０号（米国特許出願公開第２００４−０２５４３５３号）に記載の方法によって油糧種子粗粉から形成することができる。この手順は、塩水溶液を用いてキャノーラ油糧種子粗粉を抽出するステップと、得られたタンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、選択的膜技術を用いてイオン強度を実質的に一定に維持しながら、水溶液のタンパク質濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増加させるステップと、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水中に希釈し、タンパク質のミセルの形成をもたらすステップと、タンパク質のミセルを沈降させて非晶質、粘着性で、ゼラチン状のグルテン様タンパク質ミセル塊（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｍａｓｓ）（ＰＭＭ）を形成するステップと、タンパク質ミセル塊を、少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する上澄み液から回収するステップとを含む多数のステップのプロセスを含む。本明細書で用いる場合、タンパク質含量は、乾燥重量基準で測定される。回収したＰＭＭは乾燥することができる。
【０００４】
本方法の一実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、キャノーラタンパク質単離物を上澄み液から回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、濃縮物を乾燥させることによって行うことができる。得られるキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する。
【０００５】
米国特許出願第１０／１３７，３９１号および第１０／４７６，２３０号に記載の手順は、基本的に回分式手順である。本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００２年１１月１９日出願の米国特許出願第１０／２９８，６７８号（米国特許出願公開第２００４−００３９１７４号およびＷＯ０３／０４３４３９）では、キャノーラタンパク質単離物を作るための連続プロセスが記載されている。それによると、キャノーラ油糧種子粗粉を塩水溶液と連続的に混合し、その混合物をパイプを通して輸送し、同時にキャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、そのタンパク質水溶液を選択的膜操作によって連続的に輸送して、イオン強度を実質的に一定に維持しながらタンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約５０ｇ／Ｌに増加させ、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質のミセルの形成をもたらし、そのタンパク質のミセルを連続的に沈降させ、同時に所望の量のＰＭＭが沈降容器に蓄積するまで上澄み液を連続的にあふれさせる（ｏｖｅｒｆｌｏｗｅｄ）。ＰＭＭを沈降容器から回収し、乾燥させることができる。ＰＭＭは、少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％のタンパク質含量を有する。上記のように、あふれた上澄み液を処理してそこからキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【０００６】
キャノーラ種子は、約１０〜約３０重量％のタンパク質を含むことが知られており、いくつかの異なるタンパク質成分が同定されている。これらのタンパク質には、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）として知られている１２Ｓグロブリン、７Ｓタンパク質およびナピン（ｎａｐｉｎ）として知られている２Ｓ貯蔵タンパク質が含まれる。本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００３年４月１５日出願の米国特許出願第１０／４１３，３７１号（米国特許出願公開第２００４−００３４２００号およびＷＯ０３／０８８７６０）および２００５年４月２９日出願の米国特許出願第１０／５１０，７６６号（米国特許出願公開第２００５−０２４９８２８号）に記載のように、濃縮タンパク質水溶液を希釈してＰＭＭを形成し、上澄み液を処理して追加のタンパク質を回収することを含む上記手順によって、異なるタンパク質プロファイルの単離物の回収がもたらされる。
【０００７】
この点について、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９８重量％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５重量％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５重量％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する。上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９５重量％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０重量％の７Ｓタンパク質および０〜約５重量％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する。したがって、ＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物は、主として７Ｓタンパク質であり、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、主として２Ｓタンパク質である。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号および第１０／５１０，７６６号に記載のように、２Ｓタンパク質は、約１４０００ダルトンの分子サイズを有し、７Ｓタンパク質は約１４５０００ダルトンの分子質量を有し、１２Ｓタンパク質は約２９００００ダルトンの分子サイズを有する。
【０００８】
菜種種子からの均一（ｈｏｍｏｇｅｎｉｔｙ）な２Ｓ貯蔵タンパク質ナピンの精製、ならびにこのタンパク質の二次構造および立体配座の安定性の評価が、Ｎａｈｒｕｎｇ（４２）１９９８，Ｎｒ．３／４，２０１−２０４ページでＫｒｚｙｚａｎｉａｋらにより以前記載された。ナピンは、緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）による菜種種子からの抽出、続いて（ＮＨ4）2ＳＯ4を使用した沈殿、得られたペレットの緩衝液Ａへの溶解、同じ緩衝液に対しての透析およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムを使用したゲルクロマトグラフィーによる脱塩によって単離した。ナピン抽出物を含む画分を回収し、（ＮＨ4）2ＳＯ4によって再沈殿させた。得られた粗製ナピンを緩衝液Ｂ（ｐＨ７．４の緩衝液Ａ）に溶解し、それに対して透析し、次いでＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０カラムに装填（ｌｏａｄｅｄ）し、緩衝液Ｂ中０．１５〜０．３５Ｍ ＮａＣｌ勾配で溶出させた。ナピンを含む画分をプール（ｐｏｏｌｅｄ）し、（ＮＨ4）2ＳＯ4で沈殿させ、緩衝液Ａ中に再溶解し、透析した。ナピンは、ｐＨ５．０で１ＭまでのＮａＣｌ勾配を使用して、陽イオン交換ＨＰＬＣによってさらに精製した。λmax＝２８０ｎｍの画分を回収し、濃縮し、分析した。
【０００９】
出願人らは、以下のような、均一に精製した２Ｓキャノーラタンパク質のサンプルの実験室的調製を記載した追加の参照文献を認識している。
Ｂｅｒｏｔ， Ｓ， Ｃｏｍｐｏｉｎｔ， Ｊ．Ｐ．， Ｌａｒｒｅ， Ｃ．， Ｍａｌａｂａｔ， Ｃ． 及び Ｇｕｅｇｕｅｎ， Ｊ． ２００５． 菜種タンパク質（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ）の大きなスケールでの精製、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ， ８１８： ３５−４２
Ｂｈａｔｔｙ， Ｒ．Ｓ．， ＭｃＫｅｎｚｉｅ， Ｓ．Ｌ． 及び Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ， Ａ．Ｊ． １９６８． 塩溶液中の菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ）のタンパク質の可溶物（ｓｏｌｕｂｌｅ）、Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４６： １１９１−１１９７
Ｇｅｈｒｉｇ， Ｐ．Ｍ．， Ｋｒｚｙｚａｎｉａｋ， Ａ．， Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ． 及び Ｂｉｅｍａｎｎ， Ｋ． １９９６． 多重遺伝子族の製品であるＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓからの種子貯蔵タンパク質（ｎａｐｉｎ）の混合物の、質量分析法によるアミノ酸シークエンシング、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９３： ３６４７−３６５２．
Ｍｏｎｓａｌｖｅ， Ｒ．Ｉ． 及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｒ． １９９０． アブラナ科種子の２Ｓフラクションから得たタンパク質の精製及び特性評価、Ｊ． Ｅｘｐｅｒ． Ｂｏｔ．， ４１（２２２）：８９−９４
Ｍｕｒｅｎ， Ｅ．， Ｅｋ， Ｂ．， Ｂｊｏｒｋ， Ｉ． 及びＲａｓｋ， Ｌ． １９９６． Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓの２Ｓ貯蔵タンパク質であるｎａｐｉｎの前駆体と成熟形態（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）の構造的な比較、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２４２：２１４−２１９
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３−０１２５５２６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４−０２５４３５３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４−００３９１７４号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４−００３４２００号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５−０２４９８２８号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｒｚｙｚａｎｉａｋら、Ｎａｈｒｕｎｇ（４２）１９９８，Ｎｒ．３／４，２０１−２０４
【非特許文献２】Ｂｅｒｏｔ， Ｓ， Ｃｏｍｐｏｉｎｔ， Ｊ．Ｐ．， Ｌａｒｒｅ， Ｃ．， Ｍａｌａｂａｔ， Ｃ． 及び Ｇｕｅｇｕｅｎ， Ｊ． ２００５． 「菜種タンパク質（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ）の大きなスケールでの精製」、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ， ８１８： ３５−４２
【非特許文献２】Ｂｈａｔｔｙ， Ｒ．Ｓ．， ＭｃＫｅｎｚｉｅ， Ｓ．Ｌ． 及び Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ， Ａ．Ｊ． １９６８． 「塩溶液中の菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ）のタンパク質の可溶物（ｓｏｌｕｂｌｅ）」、Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４６： １１９１−１１９７
【非特許文献３】Ｇｅｈｒｉｇ， Ｐ．Ｍ．， Ｋｒｚｙｚａｎｉａｋ， Ａ．， Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ． 及び Ｂｉｅｍａｎｎ， Ｋ． １９９６． 「多重遺伝子族の製品であるＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓからの種子貯蔵タンパク質（ｎａｐｉｎ）の混合物の、質量分析法によるアミノ酸シークエンシング」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９３： ３６４７−３６５２．
【非特許文献４】Ｍｏｎｓａｌｖｅ， Ｒ．Ｉ． 及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｒ． １９９０． 「アブラナ科種子の２Ｓフラクションから得たタンパク質の精製及び特性評価」、Ｊ． Ｅｘｐｅｒ． Ｂｏｔ．， ４１（２２２）：８９−９４
【非特許文献５】Ｍｕｒｅｎ， Ｅ．， Ｅｋ， Ｂ．， Ｂｊｏｒｋ， Ｉ． 及びＲａｓｋ， Ｌ． １９９６． 「Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓの２Ｓ貯蔵タンパク質であるｎａｐｉｎの前駆体と成熟形態（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）の構造的な比較」、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２４２：２１４−２１９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は、本明細書で提供する２Ｓが主であるキャノーラタンパク質単離物が、常に少量の７Ｓタンパク質を含むという点でこのような開示と区別される。
【００１３】
キャノーラは、菜種またはアブラナとしても知られている。
発明の概要
驚くべきことに、２Ｓタンパク質の割合が増加しており、好ましくは少なくとも約８５重量％の２Ｓタンパク質を含み、７Ｓタンパク質の割合が減少している新規なキャノーラタンパク質単離物は、上記米国特許出願第１０／１３７，３９１号および第１０／４７６，２３０号の手順に従って調製した上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物よりも水溶液中で優れた特性を示すことが今や分かった。
【００１４】
種々のｐＨ値における等しいまたはより大きい溶解度に加えて、本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は、ソフトドリンクおよびスポーツドリンクに溶液の透明度の向上をもたらし、透明なタンパク質強化飲料を提供することができる。さらに、新規なキャノーラタンパク質単離物は、約０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液中、約３．５のｐＨにおいて、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物よりも大きな溶解度を示す。
【００１５】
本発明の一態様では、乾燥重量基準（ｄ．ｂ．）で少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％のタンパク質含量を有する２Ｓキャノーラタンパク質から主としてなり、かつ主として２Ｓキャノーラタンパク質からなりキャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み水溶液から得られるキャノーラタンパク質単離物と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加し、７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少した、キャノーラタンパク質単離物を提供する。キャノーラタンパク質単離物は、上澄み液からの７Ｓタンパク質の等電点沈殿（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によって得られる。
【００１６】
本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物および組成物は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物の特性とは異なる、溶解度、透明度、熱安定性、２８０ｎｍでの吸光度、表面疎水性、およびアミノ酸プロファイルを含むいくつかの特有の特性を有する。これらの特性を以下に説明し、この考察を支持するデータを以下の例に示す。
溶解度：
新規なキャノーラタンパク質単離物は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物と比較して、広範囲のｐＨにわたって、約１％ｗ／ｖタンパク質濃度で、水、ならびに炭酸および非炭酸のソフトドリンクおよびスポーツドリンク中で等しいまたは増加した溶解度を示す。
【００１７】
さらに、新規なキャノーラタンパク質単離物は、広範囲のｐＨにわたって、約１％ｗ／ｖタンパク質濃度で、水中で等しいまたは増加した溶解度を示し、溶液または分散液の形成の後に、サンプルを遠心分離して不溶性物質を沈降させると、透明な上澄み液が得られる。
【００１８】
さらに、新規なキャノーラタンパク質単離物は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物と比較して、ｐＨ３．５で０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液中でより大きな溶解度を示す。
透明度：
新規なキャノーラタンパク質単離物は、炭酸および非炭酸ソフトドリンク、ならびにジュース、パンチ（ｐｕｎｃｈ）およびカクテルを含む種々の飲料に組み込んで、このような飲料にタンパク質強化をもたらすことができる。このような飲料は、約２．５〜約５にわたる広範囲のｐＨ値を有し、１２液量オンスの量で詰められることが多い。新規なキャノーラタンパク質単離物は、例えば１２液量オンスの量当たり少なくとも約５ｇの新規なキャノーラタンパク質単離物など、任意の好都合な量で添加して、飲料にタンパク質強化をもたらすことができる。
【００１９】
添加された新規なキャノーラタンパク質単離物は、飲料に溶解し、飲料の透明度を損なわない。タンパク質濃度２重量％の透明な飲料では、６００ｎｍで可視光の吸光度を測定することにより決定すると、透明度は約０．５未満である。タンパク質濃度１重量％の水では、６００ｎｍで可視光の吸光度を測定することにより決定すると、透明度は、約２〜約７のｐＨ範囲にわたって約１．０未満である。
熱安定性：
本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物と比較して、ｐＨ６およびｐＨ７の両方で、熱安定性が向上している。以下に詳細に説明するように、上澄み液からの７Ｓタンパク質の等電点沈殿（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）の後、加熱処理した上澄み液は、加熱の際にさらなるタンパク質の沈殿に耐える。
２８０ｎｍでの吸光度：
本発明の新規なキャノーラタンパク質は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物よりも２８０ｎｍで弱い吸光度を有する。この結果は、本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物が、上澄み液由来のキャノーラタンパク質ほどには、２８０ｎｍで強く吸収するチロシンおよびトリプトファンを含まないことを示す。
表面疎水性：
本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物は、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物よりも低い表面疎水性を有し、それはおそらく、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物と比較して、新規なキャノーラタンパク質単離物のグロブリン含量が低いことに起因する。
【００２０】
新規なキャノーラタンパク質単離物の表面疎水性は、一般的に約２５未満、好ましくは約２０未満である。
【００２１】
本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物は、米国特許出願第１０／１３７，３９１号および第１０／４７６，２３０号の手順による濃縮上澄み液から、７Ｓタンパク質を等電点沈殿（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させることによって、濃縮上澄み液中の７Ｓタンパク質の割合を減少させ、結果として２Ｓタンパク質の割合を増加させることにより調製される。あるいは、上澄み液の濃縮または次の部分的濃縮の前に、上澄み液に対する処理を行うことができる。従って、本発明の別の態様では、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質単離物の調製方法であって、（ａ）主として２Ｓタンパク質からなる、２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、（ｂ）水溶液から７Ｓキャノーラタンパク質を等電点沈殿させるステップと、（ｃ）水溶液から沈殿した７Ｓタンパク質を除去するステップと、（ｄ）少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質単離物を回収するステップとを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、タンパク質単離物の回収プロセスの概略図である。
【図２】図２は、図１に示すＰＭＭ形成プロセスによる上澄み液から本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物を製造するために使用する手順の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の概略説明
本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％のタンパク質含量を有し、回分プロセスまたは連続プロセスまたは半連続プロセスによって、キャノーラ油糧種子粗粉から単離することができる。
【００２４】
本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は主として２Ｓタンパク質からなり、かつ主として２Ｓタンパク質からなりキャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み液から得られ調製の同じ実験条件下で調製されるキャノーラタンパク質単離物と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しており、７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少している。上記のように、本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物は、７Ｓタンパク質の割合が減少しており、２Ｓタンパク質の割合が増加しているが、少量の残留する７Ｓタンパク質が常に存在する。キャノーラタンパク質単離物は、上澄み液からの７Ｓタンパク質の等電点沈殿（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）により得られる。
【００２５】
新規なキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約８５重量％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１５重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質、好ましくは少なくとも約９０重量％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１０重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質、より好ましくは可能な限り高い割合の２Ｓタンパク質を含む。上記のように、このようなキャノーラタンパク質単離物は、以下でより詳細に説明する上澄み液、部分濃縮上澄み液および濃縮上澄み液の処理によって得ることができる。上澄み液、部分濃縮上澄み液および濃縮上澄み液の処理により、７Ｓタンパク質の沈殿がもたらされ、これは遠心分離または濾過などの任意の好都合な手段によって、処理した上澄み液から除去することができる。２Ｓタンパク質は処理によって影響されないので、処理は、７Ｓタンパク質の割合を減少させることによって、存在する２Ｓタンパク質の割合を増加させる。
【００２６】
新規なキャノーラタンパク質単離物は、一般的に約ｐＨ２〜約ｐＨ７．５、好ましくは約ｐＨ２〜ｐＨ４の広範囲のｐＨ値にわたって、水溶液に可溶性であり、一般的に、主として２Ｓタンパク質からなり、調製の同じ実験条件下でのキャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物と等しいまたはより高い溶解度を有している。さらに、市販のものなどの、炭酸および非炭酸両方のソフトドリンクおよびスポーツドリンクを含み、炭酸および非炭酸両方のスポーツエネルギードリンクを含む、ソフトドリンク中の新規なキャノーラタンパク質単離物の水溶液は、主として２Ｓタンパク質からなり調製の同じ条件下でのキャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物から製造されるそのような水溶液よりも高い透明度を有する。
【００２７】
ソフトドリンクおよびスポーツドリンク中の溶液を含む水溶液中のキャノーラタンパク質単離物の濃度は、溶液の所期の使用に応じて変えることができる。一般に、タンパク質濃度は、約０．１〜約３０重量％、好ましくは約１〜約５重量％で変えることができる。
【００２８】
従って、本発明は、上記の飲料だけでなく、ジュース、アルコール飲料、コーヒー飲料および乳飲料などの他の飲料も含む、本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物の水溶液を含む。
【００２９】
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質性物質を可溶化させることを含む。キャノーラ油糧種子粗粉から回収したタンパク質性物質は、キャノーラ種子中に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質性物質は、遺伝子操作によって改変されているが、天然のタンパク質の特徴的な疎水性および極性の特性を有しているタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、例えば高温ヘキサン抽出法または冷オイル押出法によって得られる、異なるレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子から、キャノーラ油を除去することによって得られる任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油の除去は、通常、本明細書に記載のタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００３０】
塩の存在が、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去を増大させるので、タンパク質可溶化は食品グレードの塩溶液を使用することによって最も効率的に行われる。キャノーラタンパク質単離物を食品以外へ使用するつもりである場合、非食品グレードの化学製品を使用することができる。塩化カリウムなどの他の塩を使用することができるが、塩は通常塩化ナトリウムである。塩溶液は、かなりの量のタンパク質の可溶化が行われるのを可能にするため、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増加するにつれて、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化の程度は、最大値に達するまで最初は増加する。その後のイオン強度の増加は、可溶化される全体のタンパク質を増加させない。最大のタンパク質可溶化をもたらす食品グレードの塩溶液のイオン強度は、当該塩および選択した油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００３１】
イオン強度の増加に伴ってタンパク質の沈殿に要する希釈度がより大きくなることを考慮して、約０．８未満のイオン強度値、より好ましくは約０．１〜約０．１５の値を用いることが通常好ましい。
【００３２】
回分プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、約５℃〜約７５℃の温度で、通常約１０〜約６０分である可溶化時間を短縮するために、好ましくは攪拌を伴って行う。全体として高い製品収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うことが好ましい。
【００３３】
この温度より低いと可溶化が実際的でないくらい遅くなるので、約５℃の下限温度を選択し、一方で存在するタンパク質のいくらかの変性温度のため約７５℃の好ましい上限温度を選択する。
【００３４】
連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続的抽出を行うのに調和した任意の方法で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を食品グレードの塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を通して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間をもたらす流速で輸送する。このような連続的手順では、塩可溶化ステップは、好ましくはキャノーラ油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、迅速に、約１０分までの時間で行う。連続的手順での可溶化は、約５℃と約７５℃との間、好ましくは約１５℃と約３５℃との間の温度で行う。
【００３５】
食品グレードの塩水溶液は、一般的に約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有し、この塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて、任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲内の任意の所望の値に調整することができる。
【００３６】
可溶化ステップ中の食品グレードの塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、広範囲で変えられる。典型的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００３７】
塩水溶液によるタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉中に存在しうる脂肪を可溶化する追加的な効果を有し、それによって脂肪が水相中に存在するという結果になる。
【００３８】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般的に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００３９】
塩水溶液は、酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤とすることができる。使用する酸化防止剤の量は、溶液の約０．０１〜約１重量％で変えることができ、好ましくは約０．０５重量％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液中のフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００４０】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機の使用に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離することができる。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。
【００４１】
キャノーラタンパク質の最終単離物の色は、分離したタンパク質水溶液と、粉末活性炭または他の色素吸着剤を混合し、引き続いて濾過により好都合に吸着剤を除去してタンパク質溶液を得ることによって、明色およびより弱い黄色の観点から、改善することができる。色素の除去に透析濾過を使用することもできる。
【００４２】
このような色素除去ステップは、任意の適当な色素吸着剤を使用して、一般的に分離したタンパク質水溶液の周囲温度で、任意の好都合な条件下で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用する。
【００４３】
本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉がかなりの量の脂肪を含んでいる場合、分離したタンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に、上記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色改善ステップを行う場合、このステップは第１脱脂ステップの後に行うことができる。
【００４４】
水のみの使用では、塩水溶液よりも油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出が少ない傾向があるが、塩水溶液による油糧種子粗粉の抽出の代替法として水のみを使用して抽出を行うことができる。このような代替法を使用する場合、以下で説明する濃縮ステップ中にタンパク質を溶液中に維持するために、残留油糧種子粗粉からの分離後に、上記の濃度で塩をタンパク質溶液に添加することができる。第１脂肪除去ステップを行う場合、塩は一般的にこのような操作の完了後に添加する。
【００４５】
別の代替手順は、一般的に約９．９までの、約６．８を超える比較的高いｐＨ値で、食品グレードの塩溶液により油糧種子粗粉を抽出するというものである。食品グレードの塩溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液などの任意の好都合な食品グレードのアルカリを使用することによって、所望のアルカリ性値に調整することができる。あるいは、油糧種子粗粉は、一般的に約ｐＨ３までの、約ｐＨ５未満の比較的低いｐＨで、塩溶液により抽出することができる。このような代替法を使用する場合、油糧種子粗粉の抽出ステップから得られた水相は、デカンター型遠心分離に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過を使用して残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離する。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。
【００４６】
次いで、高ｐＨまたは低ｐＨ抽出ステップから得られたタンパク質水溶液を、以下に述べるさらなる処理の前に、上記のように、約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２の範囲にｐＨ調整する。このようなｐＨ調整は、必要に応じて、任意の好都合な塩酸などの酸または水酸化ナトリウムなどのアルカリを使用して行うことができる。
【００４７】
タンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増加させると同時に、そのイオン強度を実質的に一定に維持する。このような濃縮は、一般的に少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を得るように行う。
【００４８】
濃縮ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンなどの適当な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有し、連続操作の場合には、タンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃縮度が可能になるような寸法にする、中空繊維膜またはスパイラル膜（ｓｐｉｒａｌ−ｗｏｕｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ）などの膜を使用した、限外濾過または透析濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用するなど、回分操作または連続操作に調和した任意の好都合な方法で行うことができる。
【００４９】
周知のように、限外濾過および同様の選択的膜技術は、低分子量の種が膜を通過するのを許すと同時に、高分子量の種が膜を通過するのを阻止する。低分子量の種には、食品グレードの塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素および抗栄養因子（ａｎｔｉ−ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒｓ）などの供給源材料から抽出された低分子量物質、ならびに任意の低分子量形タンパク質も含まれる。膜の分画分子量は、通常、異なる膜材料および構造を考慮して、かなりの割合のタンパク質を溶液中に確実に保持すると同時に、汚染物質が通過するのを許すよう選択する。
【００５０】
次いで、濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液と同じモル濃度およびｐＨの塩水溶液を使用して、透析濾過ステップに供することができる。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を通過させることにより、タンパク質水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかしながら、所望であれば、透析濾過ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量を有する膜などの、異なる分画分子量を有する分離膜を使用して行うことができる。
【００５１】
透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１重量％で変えることができ、好ましくは約０．０５重量％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００５２】
濃縮ステップおよび透析濾過ステップは、任意の好都合な温度、一般的には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の程度の濃縮を行うための時間行うことができる。使用する温度および他の条件は、ある程度、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度に依存する。
【００５３】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、必要に応じて、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のようにさらなる脱脂操作に供することができる。
【００５４】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、上記色除去操作の代替として、ある色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。
【００５５】
色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００５６】
任意選択の色除去ステップから得られた、濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、貯蔵またはそれ以外の結果として元の粗粉中に存在しており、抽出ステップで粗粉からキャノーラタンパク質溶液中に抽出された可能性のある細菌を完全に殺すために、低温殺菌に供することができる。このような低温殺菌は、任意の所望の低温殺菌条件下で行うことができる。一般に、濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液を、約５５℃〜約７０℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃の温度で、約１０〜約１５分間、好ましくは約１０分間加熱する。次いで、低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を、以下に説明するさらなる処理のために、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度に冷却することができる。
【００５７】
濃縮ステップおよび任意選択の透析濾過ステップで使用する温度、ならびに低温殺菌ステップを行うかどうかに応じて、濃縮タンパク質溶液を、少なくとも約２０℃で約６０℃まで、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度に加温し、濃縮タンパク質溶液の粘度を減少させ、引き続く希釈ステップおよびミセル形成の実行を容易にすることができる。濃縮タンパク質溶液は、それを超えると冷水による希釈時にミセル形成が起こらない温度を超えて加熱すべきではない。
【００５８】
次いで、濃縮ステップ、ならびに任意選択の透析濾過ステップ、任意選択の色除去ステップ、任意選択の低温殺菌ステップおよび任意選択の脱脂ステップから得られた濃縮タンパク質溶液を、その濃縮タンパク質溶液を所望の希釈度を得るのに必要な容積を有する冷水と混合することによって希釈してミセル形成を行う。ミセル経路によって得ようとするキャノーラタンパク質の割合および上澄み液からの割合に応じて、濃縮タンパク質溶液の希釈度を変えることができる。一般に、より低い希釈レベルでは、より高い割合のキャノーラタンパク質が水相中に残留する。
【００５９】
ミセル経路によって最も高い割合のタンパク質を得ることが望まれる場合、濃縮タンパク質溶液を約５倍〜約２５倍、好ましくは約１０倍〜約２０倍で希釈する。
【００６０】
濃縮タンパク質溶液と混合する冷水は、約１５℃未満、一般的に約１℃〜約１５℃、好ましくは約１０℃未満の温度を有するが、その理由は、使用する希釈倍率でこれらのより冷たい温度で改善された収率のタンパク質ミセル塊形状のタンパク質単離物が得られるからである。
【００６１】
回分操作では、濃縮タンパク質溶液のバッチを、上記のように所望の容積を有する冷水の静止体（ｓｔａｔｉｃ ｂｏｄｙ）に添加する。濃縮タンパク質溶液の希釈および結果として生じるイオン強度の減少は、ミセル形状の離散したタンパク質小滴の形態を取る高度に会合したタンパク質分子の雲様塊の形成を引き起こす。回分式手順では、タンパク質のミセルは、冷水体中に沈降させることにより、凝集、合体して濃密な、非晶質で粘着性のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成する。沈降は、遠心分離などによって促進することができる。このように誘導された沈降により、タンパク質ミセル塊の液体含量が減少し、それにより、水分含量は一般的に全ミセル塊の約７０重量％〜約９５重量％から、一般的に約５０重量％〜約８０重量％の値に減少する。このようにしてミセル塊の水分含量が減少すると、ミセル塊の吸蔵塩含量、結果として乾燥単離物の塩含量も減少する。
【００６２】
あるいは、濃縮タンパク質溶液をＴ字型パイプの一方の入口に連続的に通すと同時に、希釈水をＴ字型パイプの他方の入口に供給して、パイプ中で混合させることによって、希釈操作を連続的に行うことができる。希釈水は、濃縮タンパク質溶液の所望の希釈度を達成するのに十分な速度で、Ｔ字型パイプ中に供給する。
【００６３】
濃縮タンパク質溶液および希釈水のパイプ中での混合により、タンパク質のミセルの形成が開始され、混合物はＴ字型パイプの出口から沈降容器中へ連続的に供給され、満杯になったときに、この沈降容器から上澄み液をあふれさせる。混合物は、好ましくは、液体内の乱流を最小化するように、沈降容器中の液体中に供給する。
【００６４】
連続手順では、タンパク質のミセルは、沈降容器中に沈降させることにより、凝集、合体して濃密な、非晶質で粘着性のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成し、所望の量のＰＭＭが沈降容器の底に蓄積するまでこの手順を続け、その後すぐに蓄積したＰＭＭを沈降容器から取り出す。沈殿による沈降の代わりに、遠心分離によってＰＭＭを連続的に分離することができる。
【００６５】
少なくとも約２００ｇ／Ｌの好ましいタンパク質含量へのタンパク質溶液の濃縮に関するプロセスのパラメータの組み合わせ、および約１０〜約２０の希釈倍率の使用により、上記米国特許出願で論じた既知の従来技術のタンパク質単離物形成手順のいずれを使用して達成されるよりも、元の粗粉抽出物からのタンパク質ミセル塊形状のタンパク質回収に関して、より高い収率、多くの場合有意に高い収率が得られ、しかもタンパク質含量に関してずっと高い純度の単離物が得られる。
【００６６】
回分プロセスと比較して、キャノーラタンパク質単離物の回収のために連続プロセスを利用することにより、同じレベルのタンパク質抽出に関して、最初のタンパク質抽出ステップの時間が著しく短縮され、かつ抽出ステップにおいて、著しく高い温度を使用することができる。さらに、連続操作では、回分手順よりも汚染の機会が少なく、より高い製品品質が得られ、より小型の装置でプロセスを行うことができる。
【００６７】
沈降した単離物は、沈降した塊からの残留水相のデカンテーションまたは遠心分離などによって、残留水相または上澄み液から分離する。ＰＭＭは、湿った形態で使用することも、または噴霧乾燥もしくは凍結乾燥などの任意の好都合な技術により乾燥させて乾燥形態にすることもできる。乾燥ＰＭＭは、約９０重量％を超えるタンパク質、好ましくは少なくとも約１００重量％タンパク質（ケルダールＮ×６．２５として計算）の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定により測定）。必要に応じて米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号の手順を使用した場合、脂肪性油糧種子粗粉から単離した乾燥ＰＭＭも残留脂肪含量が低く、それは約１重量％未満になり得る。
【００６８】
上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号および第１０／５１０，７６６号に記載のように、ＰＭＭは、主として、約６０〜約９８重量％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５重量％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５重量％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する７Ｓキャノーラタンパク質からなる。
【００６９】
ＰＭＭ形成および沈降ステップからの上澄み液は、希釈ステップでは沈殿しない、かなりの量のキャノーラタンパク質を含み、これを処理してキャノーラタンパク質単離物を回収する。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号および第１０／５１０，７６６号に記載のように、上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物は、主として、約６０〜約９５重量％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０重量％の７Ｓタンパク質および０〜約５重量％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する２Ｓキャノーラタンパク質からなる。
【００７０】
希釈ステップからの上澄み液は、ＰＭＭの除去の後で濃縮して、そのタンパク質濃度を増加させる。このような濃縮は、タンパク質供給源材料から抽出された塩および他の非タンパク質性低分子量物質を含む低分子量種が膜を通過するのを可能にすると同時に、キャノーラタンパク質を溶液中に保持する適当な分画分子量を有する膜を使用する、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行う。異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの分画分子量を有する限外濾過膜を使用することができる。このような上澄み液の濃縮は、乾燥してタンパク質を回収するのに必要な液体の容積も減少させる。上澄み液は、一般的に、乾燥の前に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約３００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮する。このような濃縮操作は、タンパク質溶液濃縮ステップに関して上記したように、回分様式または連続操作で行うことができる。
【００７１】
次いで、濃縮上澄み液を、水、食塩水または酸性水を使用して、透析濾過ステップに供することができる。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液を通過させることにより、上澄み水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、所望であれば、透析濾過は、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量を有する膜などの分離膜を使用して行うことができる。
【００７２】
透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１重量％で変えることができ、好ましくは約０．０５重量％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００７３】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、上記色除去操作の代替法として、ある色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。
【００７４】
色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００７５】
本発明によると、濃縮され、場合により透析濾過された上澄み液は、任意選択の色除去操作の後、等電点沈殿および７Ｓタンパク質の除去、およびその結果、濃縮上澄み液中に存在するキャノーラタンパク質中の２Ｓタンパク質の割合を増加させることによって、溶液中に存在する７Ｓタンパク質の量を減少させるように処理する。
【００７６】
このような処理は、濃縮上澄み液中に存在する７Ｓの割合を減少させる、好ましくは７Ｓタンパク質の割合を相当の程度減少させるのに十分なｐＨおよび塩条件下で行うことができる。一般に、上澄み液の７Ｓタンパク質含量を、処理によって、少なくとも約５０重量％、好ましくは少なくとも約７５重量％減少させる。沈殿した７Ｓタンパク質は、遠心分離もしくは濾過、またはこれらの組み合わせなどの任意の好都合な方法で除去することができる。
【００７７】
等電処理手順では、塩として、塩化カリウムなどの他の塩も使用できるが、通常は塩化ナトリウムを、上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液に最初に添加し、少なくとも約０．３ｍＳ、好ましくは約１０〜約２０ｍＳの導電率を有する塩添加溶液を得る。
【００７８】
塩添加上澄み液のｐＨを、７Ｓタンパク質の等電点沈殿をもたらす値、一般的に約２．０〜約４．０、好ましくは約３．０〜約３．５のｐＨに調整する。７Ｓタンパク質の等電点沈殿は、広い温度範囲にわたって、一般的に約５℃〜約７０℃、好ましくは約１０℃〜約４０℃で行うことができる。沈殿した７Ｓタンパク質は、遠心分離もしくは濾過、またはこれらの組み合わせなどの任意の好都合な手段によって、等電点沈殿させた上澄み液から除去する。
【００７９】
次いで、等電点沈殿させた上澄み液は、まだ濃縮していない場合、上記のように濃縮し、透析濾過して塩を除去し、その後、濃縮され、透析濾過された上澄み液を乾燥させて本発明のキャノーラタンパク質単離物を形成する。噴霧乾燥または凍結乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥形態に乾燥させて、本発明によるキャノーラタンパク質単離物を得る前に、濃縮され、透析濾過され、等電点沈殿させた上澄み液を、上記のように、濾過して残留粒子を除去し、任意選択の色除去ステップに供することができる。このようなキャノーラタンパク質単離物は、約９０重量％を超える、好ましくは少なくとも約１００重量％タンパク質（Ｎ×６．２５）の高いタンパク質含量を有する。
【００８０】
濃縮され、透析濾過され、等電点沈殿させた上澄み液のｐＨは、乾燥の前に、乾燥単離物の所期の使用に対応したｐＨ、一般的には約２〜約５、好ましくは約２．５〜約４のｐＨに調整することができる。
【００８１】
このような新規なキャノーラタンパク質単離物は、高い割合の２Ｓタンパク質、好ましくは単離物中のキャノーラタンパク質の少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも約９５重量％を含む。単離物中には、ある割合の７Ｓタンパク質も存在する。
【００８２】
あるいは、上記の濃縮ステップおよび透析濾過ステップの前に、７Ｓタンパク質を沈殿させるための上澄み液の等電処理（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を上澄み液に対して行うことができる。沈殿した７Ｓタンパク質の除去の後で、上澄み液を濃縮し、場合により透析濾過し、場合により色除去操作にかけ、乾燥させて本発明によるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００８３】
さらなる代替法として、上澄み液を最初に任意の好都合なレベルまで部分的に濃縮することができる。次いで、部分濃縮上澄み液を、７Ｓタンパク質を沈殿させるための等電処理に供する。沈殿した７Ｓタンパク質の除去の後で、上澄み液を、一般的に約５０〜約３００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌの濃度までさらに濃縮し、場合により透析濾過し、場合により色除去操作にかけ、乾燥させて本発明によるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００８４】
沈殿した７Ｓタンパク質は、遠心分離もしくは濾過、またはこれらの組み合わせなどの任意の好都合な手段によって、上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液から除去する。
【００８５】
沈殿した７Ｓタンパク質の除去の後で、等電処理された上澄み液、または等電処理された部分濃縮上澄み液を、上記のように、濃縮もしくは透析濾過の間または後の任意の時点でｐＨ調整することができる。
好ましい実施形態の説明
図１を参照すると、ミセル経路によるキャノーラタンパク質単離物（ＣＰＩ）の形成と比較して、二膜プロセスが示されている。
【００８６】
図から分かるように、限外濾過ステップおよび透析濾過ステップを含むことができる第１限外濾過段階（限外濾過＃１）からの保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を２つの方法のうちの一方で処理する。二膜プロセスでは、保持液を噴霧乾燥して、主として７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００８７】
上記米国特許出願第１０／１３７，３２１号および第１０／４７６，２３０号の手順では、保持液は希釈ステップに進み、そこでキャノーラタンパク質単離物がタンパク質ミセル塊として沈殿する。タンパク質ミセル塊を噴霧乾燥して、主として７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００８８】
二膜実施形態では、第１限外濾過ステップからの透過液を、限外濾過および透析濾過を含むことができる第２限外濾過ステップ（限外濾過＃２−Ａ）に供する。第２限外濾過ステップからの保持液を噴霧乾燥して、主として２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００８９】
米国特許出願第１０／１３７，３２１号および第１０／４７６，２３０号の手順では、タンパク質ミセル塊の沈殿による上澄み液を、限外濾過および透析濾過を含むことができる限外濾過ステップ（限外濾過＃２−Ｂ）に供する。限外濾過ステップからの保持液を、７Ｓタンパク質の等電点沈殿に供し、次いで、噴霧乾燥して、主として２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得る。
【００９０】
図２を参照すると、ミセルプロセスからの上澄み液を処理して本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物を製造する手順が示されており、この手順では濃縮（限外濾過＃２）の後（右側のフロー）または濃縮の前（左側のフロー）のいずれかで、上澄み液の等電点沈殿を行う。
【実施例】
【００９１】
例１：
この例は、新規なキャノーラタンパク質単離物の製造のための一手順を説明する。
【００９２】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過により清澄化して、「ｄ」重量％のタンパク質含量を有する濾過されたタンパク質溶液「ｃ」Ｌを製造した。
【００９３】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｅ」Ｌを、５０００ダルトンの分画分子量を有するポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜で濃縮して容積を「ｆ」Ｌに減少させ、次いで、同じ膜で０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｇ」Ｌにより透析濾過した。次いで、透析濾過した保持液を６０℃で１０分間低温殺菌した。得られた低温殺菌した濃縮タンパク質溶液は、「ｈ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【００９４】
「ｉ」℃の濃縮された溶液を、「ｋ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｊ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した、粘性の、粘着性塊（ＰＭＭ）を、容器の底から、濾過したタンパク質溶液の「ｌ」重量％の収率で回収した。乾燥ＰＭＭ由来のタンパク質は、「ｍ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｎ」Ｃ３００という名称を与えた。
【００９５】
２つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｎ」を以下の表Ｉに示す。
【００９６】
【表１】
【００９７】
除去した上澄み液を、１００００ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｏ」Ｌに減少させ、次いで、濃縮液を、同じ膜で水「ｐ」Ｌにより透析濾過した。次いで、透析濾過した濃縮液を６０℃で１０分間低温殺菌した。低温殺菌した濃縮液は、「ｑ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は、「ｒ」重量％であった。低温殺菌した濃縮液は、２つの等しい部分に分割した。一方の部分を噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｎ」Ｃ２００という名称を与え、この最終生成物は「ｓ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。
【００９８】
２つの実験についてのパラメータ「ｎ」〜「ｓ」を以下の表ＩＩに示す。
【００９９】
【表２】
【０１００】
低温殺菌した濃縮上澄み液の他方の部分を８５℃で１０分間加熱し、次いで、遠心分離して沈殿したタンパク質を除去した。次いで、得られた濃縮液を噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｎ」Ｃ２００Ｈという名称を与え、この最終生成物は「ｔ」％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有していた。２つの実験についてのパラメータ「ｎ」および「ｔ」を以下の表ＩＩＩに示す。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
例２：
この例は、新規なキャノーラタンパク質単離物の製造のための代替手順を説明する。
【０１０３】
キャノーラ粗粉を、周囲温度で塩化ナトリウム溶液に添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質を遠心分離および濾過により清澄化した。
【０１０４】
タンパク質抽出溶液の一定分量を、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜で濃縮して容積を減少させ、次いで場合により、同じ膜で塩化ナトリウム溶液により透析濾過した。次いで、保持液を６０℃で１０分間低温殺菌した。
【０１０５】
濃縮された溶液を、冷ＲＯ水中に入れて希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した粘性の粘着性塊（ＰＭＭ）を、デカンテーションまたは遠心分離のいずれかにより回収した。ＰＭＭを噴霧乾燥し、最終生成物を形成した。
【０１０６】
次いで、除去した希釈水（上澄み液と呼ぶ）、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液に加熱処理を行った。
【０１０７】
濃縮上澄み液に加熱処理を行った場合、上澄み液「ａ」Ｌを、「ｃ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｂ」Ｌに減少させ、次いで、濃縮液を、同じ膜で水「ｄ」Ｌにより透析濾過した。次いで、透析濾過した濃縮液を６０℃で１０分間低温殺菌した。低温殺菌した濃縮液は、「ｅ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は、「ｆ」重量％であった。低温殺菌した濃縮液は、２つの等しい部分に分割した。一方の部分「ｇ」Ｌを噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｈ」Ｃ２００という名称を与え、この最終生成物は「ｉ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。
【０１０８】
６つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｉ」を以下の表ＩＶに示す。
【０１０９】
【表４】
【０１１０】
低温殺菌した濃縮上澄み液の他方の部分「ｊ」Ｌを８５℃で１０分間加熱し、次いで、遠心分離して沈殿したタンパク質を除去した。次いで、得られた濃縮液（ｃｅｎｔｒａｔｅ）を噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｈ」Ｃ２００Ｈという名称を与え、この最終生成物は「ｋ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。６つの実験についてのパラメータ「ｈ」、「ｊ」および「ｋ」を以下の表Ｖに示す。
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
上澄み液または部分濃縮上澄み液に加熱処理を行った場合、上澄み液「ｌ」Ｌを、「ｎ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｍ」Ｌに減少させた。次いで、上澄み液または部分濃縮上澄み液を８５℃で１０分間加熱し、次いで、遠心分離して沈殿したタンパク質を除去した。必要な場合には、残留する沈殿したタンパク質を濾過によって除去した。次いで、清澄化したサンプルを、「ｐ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｏ」Ｌに減少させた。濃縮液は、「ｑ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は、「ｒ」重量％であった。濃縮液を噴霧乾燥して、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｈ」Ｃ２００ＨＳという名称を与え、この最終生成物は「ｓ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。６つの実験についてのパラメータ「ｈ」および「ｌ」〜「ｓ」を以下の表ＶＩに示す。
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
例３：
この例は、本発明の一実施形態による新規なキャノーラタンパク質単離物の製造を説明する。
【０１１５】
キャノーラ粗粉を、周囲温度で塩化ナトリウム溶液に添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過により清澄化した。
【０１１６】
タンパク質抽出溶液の一定分量を、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で濃縮して容積を減少させた。次いで、保持液を６０℃で１分間低温殺菌した。
【０１１７】
濃縮された溶液を、冷ＲＯ水中に入れて希釈した。直ちに白色の雲状物が形成した。沈殿した粘性の粘着性塊（ＰＭＭ）を、遠心分離により上澄み液から分離した。ＰＭＭを噴霧乾燥し、最終生成物を形成した。
【０１１８】
上澄み液「ａ」Ｌを、塩化ナトリウム「ｂ」ｋｇと混ぜ合わせて、塩濃度を約０．１Ｍに調整した。塩添加の後に、希塩酸の添加によってｐＨを３．５に調整した。サンプルの導電率は１４．０３ｍＳであった。タンパク質沈殿が生じたら、サンプルを１０分間静置した。
【０１１９】
沈殿したタンパク質を遠心分離により酸性化した上澄み液から除去した。沈殿したタンパク質を噴霧乾燥し、最終生成物を形成した。
【０１２０】
酸性化した上澄み液のｐＨを、希塩酸の添加によって３に下げた。次いで、酸性化した上澄み液「ｃ」Ｌを、「ｅ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を約「ｄ」Ｌに減少させ、次いで、濃縮液を同じ膜で酸性水「ｆ」Ｌにより透析濾過した。透析濾過した濃縮液を濾過して、残留する沈殿したタンパク質を除去した。一定分量「ｇ」ｋｇを噴霧乾燥し、最終生成物を形成した。この最終生成物に「ｈ」Ｃ２００ＩＳという名称を与え、この最終生成物は「ｉ」重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。
【０１２１】
パラメータ「ａ」〜「ｉ」を以下の表ＶＩＩＩに示す。
【０１２２】
【表７】
【０１２３】
例４：
この例は、例２および例３で製造した噴霧乾燥したキャノーラタンパク質単離物の溶解度の評価を含む。
【０１２４】
噴霧乾燥した、例２の手順により製造した濃縮上澄み液（Ｃ２００）および改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）、ならびに例３の手順により製造した等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）の溶解度を、Ｍｏｒｒら、Ｊ．Ｆｏｏｄ．Ｓｃｉ．５０：１７１５−１７１８の手順の修正版を使用して測定した。
【０１２５】
タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、少量の逆浸透（ＲＯ）精製水を添加し、滑らかなペーストが形成されるまで混合物を攪拌した。次いで、追加の水を添加し、容積を約４５ｍｌにした。次いで、ビーカーの内容物を、磁気攪拌器を使用して６０分間ゆっくり攪拌した。タンパク質を分散させた直後にｐＨを測定し、ＮａＯＨまたはＨＣｌにより適当なレベル（２、３、４、５、６または７）に調整した。サンプルは元のｐＨでも調製した。ｐＨを調整したサンプルに関して、ｐＨを測定し、６０分の攪拌中に２度修正した。６０分の攪拌の後、ＲＯ水でサンプルを５０ｍｌの総容量にし、１％ｗ／ｖのタンパク質分散液を得た。Ｌｅｃｏ ＦＡ２８窒素分析装置（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を使用したＬｅｃｏ分析によってタンパク質含量を測定するために、一定分量のタンパク質分散液を保存した。サンプルの他の部分は、８０００ｇで１０分間遠心分離した。これにより、いずれの未溶解物質も沈降し、透明な上澄み液が得られた。次いで、上澄み液のタンパク質含量をＬｅｃｏ分析によって測定した。
【０１２６】
溶解度（％）＝（上澄み液のタンパク質濃度／元の分散液のタンパク質濃度）×１００
得られた結果を以下の表ＩＸに示す。
【０１２７】
【表８】
【０１２８】
表ＩＸの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、例１に従って製造した濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、種々のｐＨ値において水に著しく可溶性であった。
例５：
この例は、例２および例３で製造した噴霧乾燥したキャノーラタンパク質単離物のソフトドリンクおよびスポーツドリンク中の溶解度の評価を含む。
【０１２９】
例４中の上記のように、ただし、水に代えてソフトドリンクまたはスポーツドリンクを用いて、２％ｗ／ｖのタンパク質濃度で、ｐＨ調製を行わずに、噴霧乾燥した、例２の手順により製造した濃縮上澄み液（Ｃ２００）および改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）、ならびに例３の手順により製造した等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）の、ソフトドリンク（スプライト（Ｓｐｒｉｔｅ））またはスポーツドリンク（オレンジゲータレード（Ｏｒａｎｇｅ Ｇａｔｏｒａｄｅ））中の溶解度を、Ｍｏｒｒら、Ｊ．Ｆｏｏｄ．Ｓｃｉ．５０：１７１５−１７１８の手順の修正版を使用して測定した。
【０１３０】
得られた結果を以下の表Ｘに示す。
【０１３１】
【表９】
【０１３２】
表Ｘの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、ソフトドリンクおよびスポーツドリンクに著しく可溶性であった。
例６：
この例は、種々のｐＨ値で水中に溶解した、例２および例３で製造した噴霧乾燥したキャノーラタンパク質単離物の溶液中の透明度の評価を含む。
【０１３３】
タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、少量の逆浸透（ＲＯ）精製水を添加し、滑らかなペーストが形成されるまで混合物を攪拌した。次いで、追加の水を添加し、容積を約４５ｍｌにした。次いで、ビーカーの内容物を、磁気攪拌器を使用して６０分間ゆっくり攪拌した。タンパク質を分散させた直後にｐＨを測定し、ＮａＯＨまたはＨＣｌにより適当なレベル（２、３、４、５、６または７）に調整した。サンプルは元のｐＨでも調製した。ｐＨを調整したサンプルに関して、ｐＨを測定し、６０分の攪拌中に２度修正した。６０分の攪拌の後、ＲＯ水でサンプルを５０ｍｌの総容量にし、１％ｗ／ｖのタンパク質分散液を得た。溶液の透明度は、純水をブランクに使用して、分光光度計により、６００ｎｍで吸光度を測定することにより決定した。吸光度の読みが小さくなると、透明度は大きくなる。
【０１３４】
得られた結果を以下の表ＸＩに示す。
【０１３５】
【表１０】
【０１３６】
表ＸＩの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、種々のｐＨ値で水中の透明度が著しく高い溶液を生み出した。この差は、低いｐＨ値で最も顕著であった。
例７：
この例は、ソフトドリンクまたはスポーツドリンク中に溶解した、例２および例３で製造した噴霧乾燥した単離物の溶液中の透明度の評価を含む。
【０１３７】
透明度は、無色透明の市販の炭酸ソフトドリンク（スプライト（Ｓｐｒｉｔｅ））または有色の市販の非炭酸スポーツドリンク（オレンジゲータレード（Ｏｒａｎｇｅ Ｇａｔｏｒａｄｅ））中の２％ｗ／ｖタンパク質の溶液で、６００ｎｍで可視光の吸光度を測定することによって評価した。サンプルを含むタンパク質の透明度を測定する前に、分光光度計は、適当な飲料の純粋なサンプルをブランクとした。吸光度の読みが低いほど、より十分に光が透過しており、溶液の透明度がより優れていた。
【０１３８】
得られた結果を以下の表ＸＩＩに示す。
【０１３９】
【表１１】
【０１４０】
表ＸＩＩの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの噴霧乾燥した単離物から調製した溶液の透明度は、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）から調製した溶液の透明度よりはるかに優れていた。
例８：
この例は、一般的な飲料のｐＨ値を含む。
【０１４１】
一般的な飲料のｐＨ値はｐＨメーターによって測定し、得られた結果を以下の表ＸＩＩＩに示す。
【０１４２】
【表１２】
【０１４３】
例９：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）の溶解度のさらなる評価を含む。
【０１４４】
タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、少量の逆浸透（ＲＯ）精製水を添加し、滑らかなペーストが形成されるまで混合物を攪拌した。次いで、追加の水を添加し、容積を約４５ｍｌにした。次いで、ビーカーの内容物を、磁気攪拌器を使用して６０分間ゆっくり攪拌した。タンパク質を分散させた直後にｐＨを測定し、ＮａＯＨまたはＨＣｌにより適当なレベル（２、３、４、５、６または７）に調整した。サンプルは元のｐＨでも調製した。ｐＨを調整したサンプルに関して、ｐＨを測定し、６０分の攪拌中に２度修正した。６０分の攪拌の後、ＲＯ水でサンプルを５０ｍｌの総容量にし、１％ｗ／ｖのタンパク質分散液を得た。次いで、分散液のサンプル（２０ｍｌ）を、１０５℃のオーブンで３０分間乾燥させ、次いでデシケーター中で冷却した予め秤量した遠心管に移し、管に蓋をした。サンプルを７８００ｇで１０分間遠心分離し、不溶性物質を沈降させて透明な上澄み液を得た。上澄み液および管の蓋を捨て、ペレット物質を５５℃に設定したオーブンで一晩乾燥させた。翌朝、管をデシケーターに移し、冷却させた。乾燥ペレット物質の重量を記録した。最初のタンパク質粉末の乾燥重量は、使用した粉末の重量に、（（１００−粉末の水分含量（％））／１００）倍を掛けることによって計算した。次いで、生成物の溶解度を以下のように計算した。
溶解度（％）＝（１−（乾燥不溶性ペレット物質重量／（２／５×最初の乾燥タンパク質粉末重量）））×１００
得られた結果を以下の表ＸＩＶに示す。
【０１４５】
【表１３】
【０１４６】
表ＸＩＶの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、種々のｐＨ値において水に著しく可溶性であった。
例１０：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００Ｈ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）のｐＨ７での熱安定性の評価を含む。
【０１４７】
タンパク質１．６ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、約１５ｇの逆浸透（ＲＯ）精製水を添加し、磁気攪拌器を使用して計６０分間混合物を攪拌した。必要に応じて、磁気攪拌を進める際に、生成物を攪拌棒により手動でも分散させた。３０分の攪拌の後、サンプルのｐＨを測定し、必要に応じて、ＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して７に調整した。次いで、サンプルをさらに３０分間攪拌した。６０分の攪拌の後、ｐＨを調べ、必要であれば７に再調整し、次いで、ＲＯ水でサンプルを２０ｇの総重量にし、８％ｗ／ｗのタンパク質分散液を得た。分散液を、１０５℃のオーブンで３０分間乾燥させ、次いでデシケーター中で冷却した予め秤量した遠心管に移した。管中の分散液の重量を記録し、次いでサンプルに蓋をし、これを９０℃の水浴中に３０分間置くことにより加熱処理した。加熱プロセスの間ずっと、水のレベルをサンプルの液体のレベルよりも高く維持した。加熱処理後、サンプルを氷浴中に置くことにより直ちに冷却した。次いで、サンプルを一晩冷蔵庫中に置いた。翌朝、サンプルを３度、それぞれ７８００ｇで１０分間、遠心分離した。上澄み液を管から静かに移し（完全に密なペレットが得られなかった場合、特定のサンプルでペレット物質のいくらかの小さい損失が認められたことに注意する）、管の蓋を捨てた。一晩、５５℃のオーブン中に開いた管を置くことにより、ペレット物質を乾燥させた。翌朝、サンプルをデシケーターに移し、冷却させた。乾燥ペレット物質の重量を測定した。最初のタンパク質粉末の乾燥重量は、使用した粉末の重量に、（（１００−粉末の水分含量（％））／１００）倍を掛けることによって計算した。次いで、生成物の溶解度への加熱処理の影響を以下のように計算した。
加熱処理後の不溶性粉末の％＝（乾燥不溶性ペレット物質重量／遠心管中の分散液重量／２０）×最初の乾燥タンパク質粉末重量））×１００
得られた結果を以下の表ＸＶに示す。
【０１４８】
【表１４】
【０１４９】
表ＸＶの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの噴霧乾燥した単離物から調製した溶液の熱安定性は、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）から調製した溶液の熱安定性よりも優れていた。
例１１：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）のｐＨ６での熱安定性の評価を含む。
【０１５０】
タンパク質０．３ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、約２５ｇの逆浸透（ＲＯ）精製水を添加し、磁気攪拌器を使用して計６０分間混合物を攪拌した。３０分の攪拌の後、サンプルのｐＨを測定し、必要に応じて、ＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して６に調整した。次いで、サンプルをさらに３０分間攪拌した。６０分の攪拌の後、ｐＨを調べ、必要であれば６に再調整し、次いで、ＲＯ水でサンプルを３０ｇの総重量にし、１％ｗ／ｗのタンパク質分散液を得た。分散液を、１０５℃のオーブンで３０分間乾燥させ、次いでデシケーター中で冷却した予め秤量した遠心管に移した。管中の分散液の重量を記録し、次いでサンプルに蓋をし、これを８５℃の水浴中に１０分間置くことにより加熱処理した。加熱プロセスの間ずっと、水のレベルをサンプルの液体のレベルよりも高く維持した。加熱処理後、サンプルを氷浴中に置くことにより直ちに冷却した。次いで、サンプルを７８００ｇで１０分間遠心分離した。上澄み液を管から静かに移し、管の蓋を捨てた。一晩、５５℃のオーブン中に開いた管を置くことにより、ペレット物質を乾燥させた。翌朝、サンプルをデシケーターに移し、冷却させた。乾燥ペレット物質の重量を測定した。最初のタンパク質粉末の乾燥重量は、使用した粉末の重量に、（（１００−粉末の水分含量（％））／１００）倍を掛けることによって計算した。次いで、生成物の溶解度への加熱処理の影響を以下のように計算した。
加熱処理後の不溶性粉末の％＝（乾燥不溶性ペレット物質重量／遠心管中の分散液重量／３０）×最初の乾燥タンパク質粉末重量））×１００
得られた結果を以下の表ＸＶＩに示す。
【０１５１】
【表１５】
【０１５２】
表ＸＶＩの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの噴霧乾燥した単離物から調製した溶液の熱安定性は、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）から調製した溶液の熱安定性よりも優れていた。
例１２：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００Ｈ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）のｐＨ３．５、０．１０Ｍ ＮａＣｌの塩分濃度での溶解度の評価を含む。
【０１５３】
タンパク質０．５ｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、約４５ｇの０．１Ｍ ＮａＣｌを添加した。ビーカーの内容物を、磁気攪拌器を使用して３０分間攪拌した。次いで、ＨＣｌの添加によってｐＨを３．５に調整した。次いで、サンプルをさらに３０分間攪拌した。この時、ｐＨを調べ、必要であれば３．５に再調整し、次いで、追加の０．１Ｍ ＮａＣｌでサンプル重量を５０ｇにし、１％ｗ／ｗのタンパク質分散液を得た。次いで、分散液のサンプル（約３０ｇ）を、１０５℃のオーブンで３０分間乾燥させ、次いでデシケーター中で冷却した予め秤量した遠心管に移した。管中の分散液の重量を記録し、管に蓋をした。サンプルを７８００ｇで１０分間遠心分離し、不溶性物質を沈降させた。上澄み液を管から静かに移し（完全に密なペレットが得られなかった場合、特定のサンプルでペレット物質のいくらかの小さい損失が認められたことに注意する）、管の蓋を捨てた。ペレット物質を一晩、５５℃に設定したオーブン中で乾燥させた。翌朝、管をデシケーターに移し、冷却させた。乾燥ペレット物質の重量を記録した。最初のタンパク質粉末の乾燥重量は、使用した粉末の重量に、（（１００−粉末の水分含量（％））／１００）倍を掛けることによって計算した。次いで、生成物の溶解度へのｐＨおよび塩濃度の影響を以下のように計算した。
試験条件下での不溶性粉末の％＝（乾燥不溶性ペレット物質重量／（（遠心管中の最初のサンプルの重量／５０）×最初の乾燥タンパク質粉末重量））×１００
得られた結果を以下の表ＸＶＩＩに示す。
【０１５４】
【表１６】
【０１５５】
表ＸＶＩＩの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、ｐＨ３．５で食塩水に著しく可溶性であった。
例１３：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）の表面疎水性の評価を含む。
【０１５６】
異なる単離物の表面疎水性は、疎水性色素、１−アニリン８−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を伴う表面疎水性（Ｓ0）試験を使用して室温で測定した。相対蛍光強度は、分光蛍光光度計を使用して測定し、タンパク質の疎水性（Ｓ0）を相対蛍光強度（ＲＦＩ）の正味傾斜の計算により決定した。色素はタンパク質分子上の疎水性の部位に引きつけられるので、Ｓ0が高いほど、タンパク質はより疎水性である。
【０１５７】
濃縮上澄み液由来のタンパク質（Ｃ２００）は、より高い割合のグロブリン（７Ｓ）を含むので、この単離物は、ＡＮＳ試験によってより高い疎水性を有することが分かった。キャノーラグロブリンは極めて疎水性であると考えられており、これが事実であることが示された。改変された生成物は、グロブリンタンパク質のレベルが減少しているので、予想通り低い値であった。両単離物の主成分は、アルブミンのナピンである。このタンパク質は、非常に極性であり、結果として表面疎水性が非常に低い。
【０１５８】
結果を以下の表ＸＶＩＩＩに示す。データは、各々の単離物について１００％（Ｎ×６．２５）タンパク質を反映するよう調整している。
【０１５９】
【表１７】
【０１６０】
表ＸＶＩＩＩの結果から分かるように、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）からの乾燥単離物は、濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物よりも、著しく疎水性が低かった。さらに、この結果は、表面疎水性がグロブリンの含量と比例関係にあることを示している。
例１４：
この例は、例１、２および３の手順により製造した、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）、改変された生成物（Ｃ２００ＨおよびＣ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）の１ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液の２８０ｎｍでの吸光度の評価を含む。
【０１６１】
タンパク質５０ｍｇを供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量り入れ、次いで、約４５ｍｌのｐＨ６．６６の１０ｍＭリン酸緩衝液を添加し、磁気攪拌器を使用して計６０分間混合物を攪拌した。６０分の攪拌の後、緩衝液でサンプルを５０ｍｌの総容積にし、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得た。サンプルを７８００ｇで１０分間遠心分離することにより清澄化し、次いで、上澄み液を石英キュベットに移し、リン酸緩衝液をブランクとして使用して、２８０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０１６２】
得られた結果を以下の表ＸＩＸに示す。
【０１６３】
【表１８】
【０１６４】
表ＸＩＸの結果から分かるように、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）から調製した溶液は、改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）、加熱処理され、次いで濃縮された上澄み液（Ｃ２００ＨＳ）および等電点沈殿させた上澄み液（Ｃ２００ＩＳ）から調製した溶液よりも、２８０ｎｍでより強く吸収した。
開示の概要
本開示を要約すると、特に飲料において透明な水溶液の製造に有用な、２Ｓタンパク質の含量が増加しており、７Ｓタンパク質の量が減少している新規なキャノーラタンパク質単離物を提供する。本発明の範囲内で、改変が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥重量基準（ｄ．ｂ．）で少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する２Ｓキャノーラタンパク質から主としてなり、
かつ主として２Ｓキャノーラタンパク質からなりキャノーラタンパク質のミセル形成および沈殿による上澄み水溶液から得られるキャノーラタンパク質単離物と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加し、７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少しており、
前記上澄み液からの７Ｓタンパク質の等電点沈殿（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によって得られる、キャノーラタンパク質単離物。
【請求項２】
少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する、請求項１に記載のキャノーラタンパク質単離物。
【請求項３】
単離物中に存在するキャノーラタンパク質のうち、少なくとも約８５重量％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１５重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含む、請求項１に記載のキャノーラタンパク質単離物。
【請求項４】
単離物中に存在するキャノーラタンパク質のうち、少なくとも約９０重量％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１０重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含む、請求項３に記載のキャノーラタンパク質単離物。
【請求項５】
少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する、請求項３に記載のキャノーラタンパク質単離物。
【請求項６】
２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質単離物の調製方法であって、
（ａ）主として２Ｓタンパク質からなる２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、
（ｂ）前記水溶液から７Ｓタンパク質を等電点沈殿させるステップと、
（ｃ）前記水溶液から沈殿した７Ｓタンパク質を除去するステップと、
（ｄ）少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、かつ前記２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質単離物を回収するステップと
を含む方法。
【請求項７】
前記等電点沈殿を、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも約５０重量％を沈殿させるのに十分なｐＨおよび塩条件下で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記等電点沈殿を、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも約７５重量％を沈殿させるのに十分なｐＨおよび塩条件下で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記等電点沈殿を、
（ｉ）前記水溶液に塩を加えて（ｓａｌｉｎａｔｉｎｇ）少なくとも約０．３ｍＳの導電率にするステップと、
（ｉｉ）前記塩を加えた水溶液（ｓａｌｉｎａｔｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）のｐＨを約２．０〜約４．０の値に調整するステップと
により行う、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記導電率が約１０〜約２０ｍＳであり、前記ｐＨが約３．０〜約３．５である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
２Ｓおよび７Ｓキャノーラタンパク質の前記水溶液が、キャノーラタンパク質のミセル形成および沈殿による上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記キャノーラタンパク質のミセル形成を、
（ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、前記キャノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、タンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）前記タンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）選択的膜技術によってイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記タンパク質水溶液の濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｄ）前記濃縮タンパク質溶液を、約１５℃未満の温度の冷水中に希釈して、前記タンパク質のミセルを形成させるステップと、
（ｅ）沈降したタンパク質ミセル塊から上澄み液を分離するステップと
によって行う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記等電点沈殿の前に、前記上澄み液を約１００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記上澄み液を約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記濃縮ステップを、約３０００〜約１０００００ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有する少なくとも１つの膜を使用した限外濾過によって行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記等電点沈殿の前に、限外濾過によって得られた前記濃縮上澄み液を透析濾過に供する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記透析濾過ステップを、約３０００〜約１０００００ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有する少なくとも１つの膜を使用して、約２〜約２０倍容、好ましくは約５〜約１０倍容の水、食塩水または酸性水を使用して行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ｅ）前記キャノーラタンパク質単離物を、水性飲料組成物として処方する（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ）ステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のキャノーラタンパク質単離物の水溶液。
【請求項２０】
キャノーラタンパク質単離物で強化した飲料である、請求項１９に記載の水溶液。
【請求項１】
乾燥重量基準（ｄ．ｂ．）で少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する２Ｓキャノーラタンパク質から主としてなり、
かつ主として２Ｓキャノーラタンパク質からなりキャノーラタンパク質のミセル形成および沈殿による上澄み水溶液から得られるキャノーラタンパク質単離物と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加し、７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少しており、
前記上澄み液からの７Ｓタンパク質の等電点沈殿（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によって得られる、キャノーラタンパク質単離物。
【請求項２】
少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する、請求項１に記載のキャノーラタンパク質単離物。
【請求項３】
単離物中に存在するキャノーラタンパク質のうち、少なくとも約８５重量％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１５重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含む、請求項１に記載のキャノーラタンパク質単離物。
【請求項４】
単離物中に存在するキャノーラタンパク質のうち、少なくとも約９０重量％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１０重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含む、請求項３に記載のキャノーラタンパク質単離物。
【請求項５】
少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する、請求項３に記載のキャノーラタンパク質単離物。
【請求項６】
２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質単離物の調製方法であって、
（ａ）主として２Ｓタンパク質からなる２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、
（ｂ）前記水溶液から７Ｓタンパク質を等電点沈殿させるステップと、
（ｃ）前記水溶液から沈殿した７Ｓタンパク質を除去するステップと、
（ｄ）少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、かつ前記２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質単離物を回収するステップと
を含む方法。
【請求項７】
前記等電点沈殿を、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも約５０重量％を沈殿させるのに十分なｐＨおよび塩条件下で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記等電点沈殿を、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも約７５重量％を沈殿させるのに十分なｐＨおよび塩条件下で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記等電点沈殿を、
（ｉ）前記水溶液に塩を加えて（ｓａｌｉｎａｔｉｎｇ）少なくとも約０．３ｍＳの導電率にするステップと、
（ｉｉ）前記塩を加えた水溶液（ｓａｌｉｎａｔｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）のｐＨを約２．０〜約４．０の値に調整するステップと
により行う、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記導電率が約１０〜約２０ｍＳであり、前記ｐＨが約３．０〜約３．５である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
２Ｓおよび７Ｓキャノーラタンパク質の前記水溶液が、キャノーラタンパク質のミセル形成および沈殿による上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記キャノーラタンパク質のミセル形成を、
（ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、前記キャノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、タンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）前記タンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）選択的膜技術によってイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記タンパク質水溶液の濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｄ）前記濃縮タンパク質溶液を、約１５℃未満の温度の冷水中に希釈して、前記タンパク質のミセルを形成させるステップと、
（ｅ）沈降したタンパク質ミセル塊から上澄み液を分離するステップと
によって行う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記等電点沈殿の前に、前記上澄み液を約１００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記上澄み液を約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記濃縮ステップを、約３０００〜約１０００００ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有する少なくとも１つの膜を使用した限外濾過によって行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記等電点沈殿の前に、限外濾過によって得られた前記濃縮上澄み液を透析濾過に供する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記透析濾過ステップを、約３０００〜約１０００００ダルトンの分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有する少なくとも１つの膜を使用して、約２〜約２０倍容、好ましくは約５〜約１０倍容の水、食塩水または酸性水を使用して行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ｅ）前記キャノーラタンパク質単離物を、水性飲料組成物として処方する（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ）ステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のキャノーラタンパク質単離物の水溶液。
【請求項２０】
キャノーラタンパク質単離物で強化した飲料である、請求項１９に記載の水溶液。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５２４３７７（Ｐ２０１１−５２４３７７Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３８３２（Ｐ２０１１−５１３８３２）
【出願日】平成２１年６月２０日（２００９．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００８５５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２６２０
【国際公開日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【出願人】（５０３４０３８６９）バーコン ニュートラサイエンス （エムビー） コーポレイション (25)
【氏名又は名称原語表記】ＢＵＲＣＯＮ ＮＵＴＲＡＳＣＩＥＮＣＥ （ＭＢ） ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２０日（２００９．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／０００８５５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２６２０
【国際公開日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【出願人】（５０３４０３８６９）バーコン ニュートラサイエンス （エムビー） コーポレイション (25)
【氏名又は名称原語表記】ＢＵＲＣＯＮ ＮＵＴＲＡＳＣＩＥＮＣＥ （ＭＢ） ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
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