新規なグリコシダーゼの単離及び組成物
【課題】明確な基質特異性を有しており再現的な開裂活性をもつ形態の精製酵素調製物を与える試薬として適当な、実質的に純粋な新規なグリコシダーゼの提供。
【解決手段】選択されたグリコシド結合を開裂し得る実質的に純粋なグリコシダーゼとして、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから単離されたグリコシダーゼ及び組換えグリコシダーゼが開示されている。単離された酵素の基質特異性は、ＧｌｃＮａｃβ１−Ｘ、Ｇａｌα１−３Ｒ、Ｇａｌα１−６Ｒ、Ｇａｌβ１−３Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｒ、Ｆｕｃα１−３Ｒ、Ｆｕｃα１−４Ｒ、Ｍａｎα１−２Ｒ、Ｍａｎα１−３Ｒ、Ｍａｎα１−６Ｒ、Ｍａｎβ１−４Ｒ、Ｘｙｌβ１−２Ｒ及びＧｌｃβ１−４Ｒから同定され、糖質基質中のグリコシド結合を選択的に開裂する能力及び修飾された糖質を形成する能力の改良が得られる。
【解決手段】選択されたグリコシド結合を開裂し得る実質的に純粋なグリコシダーゼとして、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから単離されたグリコシダーゼ及び組換えグリコシダーゼが開示されている。単離された酵素の基質特異性は、ＧｌｃＮａｃβ１−Ｘ、Ｇａｌα１−３Ｒ、Ｇａｌα１−６Ｒ、Ｇａｌβ１−３Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｒ、Ｆｕｃα１−３Ｒ、Ｆｕｃα１−４Ｒ、Ｍａｎα１−２Ｒ、Ｍａｎα１−３Ｒ、Ｍａｎα１−６Ｒ、Ｍａｎβ１−４Ｒ、Ｘｙｌβ１−２Ｒ及びＧｌｃβ１−４Ｒから同定され、糖質基質中のグリコシド結合を選択的に開裂する能力及び修飾された糖質を形成する能力の改良が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なグリコシダーゼ類及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖質が生物体の生物活動の基幹的な役割を果たすことが認識されたため、糖質の研究が医学及び基礎科学で極めて重要視されるようになっている。分子が限りなく複雑で多様でありまた科学研究者が1つの形態を他の形態から識別できるような分析ツール及び合成ツールが入手可能でないため、糖質の研究は他の種類の生物分子の研究に立ち遅れている。
【発明の開示】
【０００３】
糖質の天然形態
実際、糖質は、グリコシド結合によって共有結合して分枝状及び直鎖状の高分子を形成する一連の単糖類から成り多糖類として知られる重合体として存在する。更に、多糖類、またはより一般的にオリゴ糖類は、タンパク質または脂質のような高分子に結合して糖タンパク質または糖脂質を形成し得る。天然に産する多糖類と違って、タンパク質または脂質と結合したオリゴ糖類は、単糖類の比較的小さいサブセットから成る。
【０００４】
糖タンパク質と結合したオリゴ糖類は、分子の生物学的特性が多様でありまた比較的短い単糖配列であるため研究し易いことを主な理由として、今日までの多くの糖質研究の中心的役割を果たしている。
【０００５】
糖タンパク質の構造的特徴
糖タンパク質は、タンパク質との結合に従って２つのグループに大別される。ムチン型オリゴ糖、プロテオグリカン型、コラーゲン型及びエクステンシン型のようなＯ−グリコシル結合したオリゴ糖は、Ｌ−セリンまたはＬ−トレオニンのヒドロキシル酸素に結合している。Ｎ−グリコシル結合したオリゴ糖は、一般にはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ(Ｘａａは任意のアミノ酸)の形態のトリペプチド中のアスパラギンのアミド窒素に結合している。Ｎ−結合したオリゴ糖は更に、高マンノース型、複合体型及びハイブリッド型の３つのサブグループに分類される。Ｎ−結合したオリゴ糖は多くの場合分枝状であり、分枝は一般にマンノース残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基で生じる。これらの分枝状構造は、分枝が２つの場合にはバイアンテナリーと呼ばれており、分枝が３つの場合にはトリアンテナリーと呼ばれている。
【０００６】
オリゴ糖はその単糖配列によって特性決定され得る。オリゴ糖は、その還元末端でタンパク質のアミノ酸残基に結合し、非還元末端はオリゴ糖の他端の末端単糖中に見出される。オリゴ糖の他の重要な特徴は、個々の単糖類を結合させているグリコシド結合である。グリコシド結合は、結合が生じる単糖環中の炭素に従って番号付けされる。炭素は右回り方向で１から６までの番号を有している。これらの炭素はいずれもグリコシド結合に関与し得るが、一般にはオリゴ糖の非還元末端に近い方の単糖の炭素１が還元末端に近い方の単糖の他の任意の炭素とグリコシド結合を形成する。単糖上の各炭素は不斉炭素であるから、グリコシド結合はαアノマーとβアノマーとから成る２つのアノマー配置で生じる。アノマー形態は炭素上の反応性ヒドロキシル基の位置によって決定される。図１は、２つの単糖間の可能な結合配置を示す。
【０００７】
オリゴ糖の合成及び分解
オリゴ糖は、グリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼとして知られる細胞中の酵素系によって合成される。典型的には、オリゴ糖が脂質キャリアーに集合し、グリコシル化されるタンパク質内部の適当なアミノ酸に転移される。次いで、グリコシダーゼによる切断及びグリコシルトランスフェラーゼに媒介される合成が生じ、個々の単糖または予め集成されたオリゴ糖ユニットが除去または付加される。更に、通常は加水分解酵素であるエキソグリコシダーゼが合成機能におけるトランスフェラーゼとして作用するときは微視的可逆性が生じ得る(Ｉｃｈｉｋａｗａら,１９９２,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.２０２：２１５−２３８)。いくつかの場合には、単糖の除去によって、次の鎖合成を容易にするようなコンホメーション変化が生じる(Ｃａｍｉｒａｎｄら,ｃｈ.,１９９２)。他の理論によって解釈できる可能性も否定はしないが、１種類のタンパク質のグリコシル化パターンが細胞内多様性を示す原因の１つは、任意の単一細胞中に種々の量及び種類の可用なグリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼが存在することにあると考えられる。
【０００８】
個々のグリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼの有効性は、細胞の栄養環境(Ｇｏｏｃｈｅｅ ａｎｄ Ｍｏｎｉｃａ １９９０,Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：６７−７１)、細胞の種類(Ｓｈｅａｒｅｓ ａｎｄ Ｒｏｂｂｉｎｓ １９８６,ＰＮＡＳ ８３：１９９３)及び細胞の恒常性状態(Ｋｏｂａｔａ １９８８,Ｇａｎｎ Ｍｏｎｏｇｒ.Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.３４：３−１３)に依存する。これらの細胞内酵素の量及び種類の多様性に関連して、単一糖タンパク質の多数の配糖形態が生じる(Ｐａｒｅｋｈら,１９８７,ＥＭＢＯ ６：１２３３−１２４４)。これらの配糖形態は、オリゴ糖配列、結合特性並びにオリゴ糖とタンパク質との結合部位の位置及び数などに違いを有している。構造的な不均一性は生物機能に衝撃を与える可能性があるので、種々の細胞中で得られる単一糖タンパク質のグリコシル化の多様性は、組換えタンパク質治療薬製造の重要な一面である(Ｓａｓａｋｉら,１９８７,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６２：１２０５９−１２０７６；Ｄｕｂｅら,１９８８,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６３：１７５１６−１７５２１；Ｌｕｎｄら,１９９３,Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂ.Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ,４：２０−２５；Ｐａｒｅｋｈら,１９８９,Ｂｉｏｃｈｅｍ.２８：７６４４−７６６２；Ｋａｇａｗａら,１９８８,Ｊ.ｏｆ Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６３：１７５０８−１７５１５；Ｐａｒｅｋｈら,１９８９,Ｂｉｏｃｈｅｍ.２８：７６６２−７６６９；Ｐａｒｅｋｈら,１９８９,Ｂｉｏｃｈｅｍ.２８：７６７０−７６７９)。
【０００９】
どの細胞の内部で合成されるかに従って単一タンパク質のグリコシル化パターンが変化するだけでなく、個々のグリコシル化イベントはある種の進化的に近縁の動物種にのみ特有であろう。Ｇａｌｉｌｉら,１９８７,Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８４：１３６９−１３７３及びＧａｌｉｌｉら,１９８８,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６３：１７７５５−１７７６２は、非霊長類の哺乳動物及び新世界の猿にＧａｌα１−３Ｇａｌが発生することを同定し、これはヒト及び旧世界の猿には存在しなかったグリコシル化パターンであることを確認した。この二糖がヒトの免疫応答を誘発することからこの構造の欠如が証明された。非定型グリコシル化パターンに対する免疫応答は、非霊長類ソースに由来するかまたは該ソース中で製造される糖タンパク質の使用に起因する未解決の抗原性の問題を提示する。
【００１０】
オリゴ糖は、リコシド結合及びオリゴ糖の立体化学にしばしば極めて特異的なグリコシダーゼによって分解される。遠方に位置する単糖がオリゴ糖の消化に与える影響の一例は、フコシド蓄積症に罹患したヒト患者に見出される。これらの患者では、エンドグリコシダーゼによる消化に先立ってＮ−結合オリゴ糖からフコースを除去するために必要なエキソグリコシダーゼが欠損している。フコースはエンドグリコシダーゼの酵素活性を妨害し、未消化のオリゴ糖を尿中に排泄させる(Ｋｏｂａｔａ １９８４,Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ,Ｅｄｓ.,Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｂｂｉｎｓ,Ｗｉｌｅｙ,ＮＹｖｏｌ.２,ｐｐ.８７−１６２)。
【００１１】
タンパク質のグリコシル化の生物学的衝撃
オリゴ糖の正しい合成及び分解が生物に対して重要であることは、糖質構造の誤ったプロセシングを生じる１つの欠損グリコシダーゼに起因する疾患の存在によって証明された。上記に引用した例では、糖タンパク質の誤ったプロセシングを生じるフコシダーゼの欠如が疾患の原因となっている。他の例としては、主要なリソソーム性α−マンノシダーゼ活性が顕著に欠損しているヒトα−マンノシド症がある(Ｇａｓｐｅｒｉら,１９９２,Ｊ.ｏｆ Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：９７０６−９７１２)。異常オリゴ糖構造は癌にも関連を有している(Ｓａｎｏら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：１５２２−１５２７)。
【００１２】
糖タンパク質のオリゴ糖側鎖はこのような細胞プロセスにおいて、ペプチド鎖をタンパク質分解性攻撃から保護し、細胞表面への分泌を容易にし、生物学的活性形態のタンパク質のコンホメーションを誘発及び維持し、血漿から糖タンパク質を除去し、分化及び発達中に抗原決定基として機能すると推定されている。実際、発達の任意の段階で、細胞は、１つの糖タンパク質を合成するだけでなく１つのタンパク質の多数の可能形態をコードすることによって、調節された変異という生合成の問題を解決してきたと考えられる。各変異体は異なる共有結合オリゴ糖(配糖形態)を有している。１つのペプチドの多数のグリコシル化部位または実際には１つのグリコシル化部位の多数の形態に起因する多様性の範囲は、Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら,１９８８,Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.５７：７８５−８３８に組換えタンパク質に関して記載されている。糖タンパク質の特性並びにその生物学的特性及び機能は結合したオリゴ糖の配列及び構造に従って変化するので(Ｃｕｍｍｉｎｇ １９９１,Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１：１１５−１３０)、糖タンパク質構造の分析が組換え医薬用タンパク質のキャラクタリゼーションの重要な要件となっている。
【００１３】
製造された医薬グレードの組換えタンパク質の品質管理を容易にするためには、極めて近縁の構造を識別するためのオリゴ糖の迅速、廉価かつ信頼性の高いキャラクタリゼーションを可能にするような分析方法が必要である(Ｓｐｅｌｌｍａｎ １９９０,Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ.６２：１７１４−１７２２)。細胞からの産生レベルを向上させ、治療薬としてのタンパク質の生物機能を最適化するために、糖タンパク質に対してオリゴ糖を操作及び修飾する方法が望まれている。
【００１４】
糖タンパク質及び糖質一般の合成の指令及び機能の分析を行うため、更に、種々の生物、器官、細胞並びに単一細胞内で産生されたグリコシル化分子中の微細な不均一性
（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）の原因及び関連を理解するために、オリゴ糖の配列及び結合を分析する迅速で簡単な方法が有用であろう。
【００１５】
糖質構造の分析方法
糖質構造の既存の分析方法は複雑な多段階手順に依存している。これらの手順としては、質量分析、ＮＭＲ、高速原子衝撃、複合クロマトグラフィー法(高圧液体クロマトグラフィー、気相クロマトグラフィー、イオン交換及び逆相クロマトグラフィー)、複合化学反応系(メチル化分析、過ヨウ素酸塩酸化及び種々の加水分解反応)などの方法があり、これらはいずれもオリゴ糖の配列及びそれらのグリコシド結合の特徴を決定するために種々の組み合わせで使用されている。各方法は糖質構造に関していくつかの断片的情報を与えるが、各々が欠点を有している。例えば、高速原子衝撃は(Ｄｅｌｌ １９８７,Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１９−７３)、大きさ及び配列に関するいくつかのデータを与えるが、結合位置またはアノマー配置に関する情報を与えない。ＮＭＲは糖質を分析するための最も強力なツールであるが(Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔら,１９８３ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：２０９−３７５)、比較的感度が鈍く大量の分析液を要する。これらの方法は、Ｓｐｅｌｌｍａｎ １９９０,Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ.６２：１７１４−１７２２；Ｌｅｅら,１９９０,Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ. ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ.２３：５３−８０；Ｇｅｉｓｏｗ １９９２,Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２７７−２８０；Ｋｏｂａｔａ １９８４に概説されている。上記手順の多くは高価な装置を必要としており、またそれらの操作にはかなりの技術的熟練及び技術的支援が必要なので、それらの使用は少数の専門研究機関に限定される。
【００１６】
グリコシダーゼを用いる糖質分析
多段階分析の一段階を構成する糖質分析の種々の段階で酵素が使用されている。これらの酵素は、結合タンパク質のグリカン部分とアミノ酸(普通はアスパラギン)との間を開裂する能力を有するグリコアミダーゼである。エンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼは双方ともヒドロラーゼであり、糖質構造の内部(エンド)または分子の非還元末端の末端単糖(エキソ)でグリコシド結合を開裂する能力を有するのでこのように呼ばれているが、これらは極めて重要である。
【００１７】
エンドグリコシダーゼは、ペプチドのアミノ酸結合部位に対して最後から二番目の単糖の還元末端でオリゴ糖を開裂すると記載されている。各々が異なる基質特異性を有する５種類のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは構造研究で使用するために十分に精製された(Ｋｏｂａｔａ １９８４)。更に、エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼも単離された(Ｕｍｅｍｏｔｏら,１９７７,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２５２：８６０９−８６１４；Ｂｈａｖａｎａｎｄａｎら,１９７６,Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ.７０：７３８−７４５)。これらのエンドグリコシダーゼの特異性はオリゴ糖構造の分析の強力なツールとなり得る。現状では、特性決定された市販の酵素の数が少ないのでエンドグリコシダーゼがあまり使用されていない。種々の特異性を有する多数の特性決定されたエンドグリコシダーゼを得ることは糖質の分析に役立つであろう。
【００１８】
エンドグリコシダーゼ消化によってまたは化学的手段によって遊離されたオリゴ糖はエキソグリコシダーゼ消化によって更に特性決定され得る。エキソグリコシダーゼは、オリゴ糖類及び多糖類の非還元末端から単糖ユニットを開裂するヒドロラーゼである。エキソグリコシダーゼは種々の末端単糖類及び種々のアノマー形態に対して既知の特異性を有するので、オリゴ糖を配列決定するために使用されている。ゲル浸透クロマトグラフィーを併用するエキソグリコシダーゼの順次消化は、Ｙａｓｈｉｔａら,１９８２によって初めて記載された(Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ８３：１０５−１２６)。Ｅｄｇｅら(１９９２,ＰＮＡＳ ８９：６３３８−６３４２)は、多重酵素反応消化物及び酵素消化物系列の分析による配列の分析を記載した。グリコシダーゼを用いたオリゴ糖の配列決定の機能は、十分に特性決定された基質特異性をもつ酵素の入手可能性によって限定されていた。グリコシダーゼ活性の分析に使用できる基質が少ないので単糖間のグリコシド結合に関するデータは不完全であった。その結果として、配列分析後にグリコシド結合を決定するためにメチル化分析が必要であった。
【００１９】
エキソグリコシダーゼは、細菌、ウイルス、植物及び哺乳類などの多様なソースから単離され、シアル酸(αアノマー)、ガラクトース(α及びβ)、Ｎ−アセチルグルコサミン(α及びβ)、Ｎ−アセチルガラクトサミン(α及びβ)、マンノース(α及びβ)に対して特異性を有している(Ｓａｎｏら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：１５２２−１５２７；Ｍｏｒｅｍｅｎら,１９９１,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６６：１６８７６−１６８８５；Ｃａｍｉｒａｎｄら,１９９１,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６６：１５１２０−１５１２７；Ｇａｓｐｅｒｉら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：９７０６−９７１２；Ｚｉｅｇｌｅｒら,１９９１,Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：６０５−６１４；Ｓｃｈａｔｚｌｅら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：４０００−４００７)。
【００２０】
従来技術のグリコシダーゼは多くの実例でこれらの基質特異性によって定義されているが、酵素のキャラクタリゼーションは適当な基質の入手可能性及びアッセイの複雑さによって制約を受けている。更に、従来技術の酵素は任意の名称で呼ばれることが多く、その場合、名称は、証明されていない生物学的活性を示唆している。従来技術における粗抽出物または精製酵素のキャラクタリゼーションの制約は、任意の１種類の酵素によってどの基質が開裂されどの基質が開裂されなかったかを同定する適当なアッセイが存在しないことに起因する。酵素の特性決定という問題に関連して、夾雑グリコシダーゼ活性の同定に関する問題が発生する。更に、グリコシダーゼ調製物は一般に他の夾雑グリコシダーゼを含むだけでなく、夾雑プロテアーゼも含む。従来技術で引用された酵素の特性決定に関する制約及び実質的に純粋なグリコシダーゼ調製物を得ることの難しさが市販のグリコシダーゼのリストの貧弱さに反映されている(表１参照)。
【００２１】
従来技術において最も一般的に使用されている基質は、誘導体化された単糖類(ｐ−ニトロフェニル−単糖または４−メチルウンベリフェリル単糖)である。これらの基質は、グリコシダーゼによって認識される単糖類のいくつかに関する情報を提供するであろうが、単糖は色素産生マーカーに化学結合しグリコシド結合を介して第二の単糖に結合しないので、グリコシド結合開裂特異性に関する情報は得られない。更に、グリコシダーゼの認識部位を特性決定するための誘導体化された基質の使用には制約がある。単糖誘導体を開裂するグリコシダーゼは、１つのオリゴ糖の必ずしも同じ単糖を開裂しない。同様に、１つのオリゴ糖を開裂するグリコシダーゼが、誘導体化された基質を開裂しないこともあり得る(Ｇａｓｐｅｒｉら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：９７０６−９７１２)。
【００２２】
グリコシダーゼの認識部位及びグリコシド開裂部位を特性決定するための適当な標識オリゴ糖の一群を開発する体系的な方法が必要である。適当な基質を提供する以外に、多数の基質に対する１つのグリコシダーゼのスクリーニングまたは１種類基質に対する多数のグリコシダーゼのスクリーニングを行うために単一または多重グリコシダーゼ反応の産物を簡単にかつ迅速に分析する方法が必要である。
【００２３】
現在可用な多くのグリコシダーゼは分析試薬としては重大な問題を有している(Ｊａｃｏｂら,１９９４,Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.２３０：２８０−２９９)。これらの問題としては、
(１)エキソグリコシダーゼ調製物が他の夾雑エキソグリコシダーゼ不純物を含み、その結果として消化結果が不明瞭になること、及び、
(２)特定のグリコシド結合に対するエキソグリコシダーゼの特異性が欠如していること、がある。特性決定されたグリコシダーゼは多数の結合を認識し、いくつかの結合が他の結合よりも優先的に認識されると考えられている。従って、所与のグリコシダーゼが優先度を有している１つの結合を同定するのが望ましい。
【００２４】
更に分析試薬としては、種々の特異性を有する入手可能なエキソグリコシダーゼの種類は、天然に産する多くの直鎖状または分枝状構造を分析及び識別するために十分ではない。
【００２５】
入手可能なグリコシダーゼに関しては、糖質分析を行うための明確で再現的な基質特異性を有する実質的に純粋で高度に特異的な酵素が不足している。糖質分析に関するこれらの酵素の可用性が不足している原因の少なくとも一部は、新規なグリコシダーゼを単離しそれらの基質特異性を特性決定するために可用な方法が欠如していることにある。単糖及びグリコシド結合に対して明らかな優先性を有する広い範囲のグリコシダーゼが入手可能であるならば、オリゴ糖を完全に特性決定するために現状では必要とされているメチル化のような追加分析が不要になり、新規な糖質構造及びそれらの生物学的特性の迅速なキャラクタリゼーションの強力なツールが提供されるであろう。
【００２６】
エキソグリコシダーゼのソース
少数のエキソグリコシダーゼは市販されている(表１参照)。更に、上記のような種々の生物から多数のエキソグリコシダーゼが単離された。配列決定に有用であることか分かっているエキソグリコシダーゼの部分的リストは、Ｌｉｎｈａｒｄｔら,１９９２の国際特許出願公告ＷＯ／９２／０２８１６に提示されている。エキソグリコシダーゼの追加リストは、Ｈａｕｇｈｌａｎｄ,１９９３の国際特許出願公告ＷＯ／９３／０４０７４に提示されている。グリコシダーゼに関する包括的な概説は、Ｃｏｎｚｅｌｍａｎら,１９８７,Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６０：８９；Ｆｌｏｗｅｒｓら,１９７９,Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ４８：２９；Ｋｏｂａｔａ １９７９,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１００：１−１４に提示されている。
【００２７】
現在入手可能なグリコシダーゼは概して天然ソースから単離され製造されているが、Ｓｃｈａｔｚｌｅら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：４０００−４００７は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍから単離されたリソソーム酵素α−マンノシダーゼのクローニング及び配列決定を報告した。Ｓｃｈａｔｚｌｅらは、酵素の構造的特性を特性決定したが、グリコシド結合に対する基質特異性は解明されなかった。
【００２８】
【表１】
【００２９】
上記の理由から、明確な基質特異性を有しており再現的な開裂活性をもつ形態の精製酵素調製物を与える試薬として適当な実質的に純粋な新規なグリコシダーゼが必要とされている。更に、天然に産する多様な糖質構造の分析に適した広汎な酵素系列を単離及び製造する方法が必要とされている。更に、酵素の基質特異性を決定するため、糖質構造を配列決定する迅速廉価な方法を提供するため、糖タンパク質及び糖脂質のような分子の生物学的特性を改変する目的で糖タンパク質及び糖脂質の糖質部分を修飾するための迅速廉価簡単な糖質分析方法が必要とされている。迅速廉価簡単な糖質分析方法が利用できれば、天然に産する多様な糖質構造の分析、これらの分子の機能の理解、これらの構造の操作による有用な目的の生物学的特性の修飾、などの機会が数多く提供されるであろう。
【００３０】
発明の概要
本発明の目的は、同定された基質特異性を有する実質的に純粋な新規なグリコシダーゼに対する要望を満足させる組成物及び方法を提供することである。
【００３１】
好ましくは本発明は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから得られる実質的に純粋なグリコシダーゼを提供する。１つの形態のグリコシダーゼは、第１の生物からＤＮＡを単離し、第２の生物中でＤＮＡから遺伝子ライブラリーを形成し、グリコシダーゼ活性を有する第２の生物の組換えクローンを同定することによってクローニングされる組換えグリコシダーゼである。
【００３２】
好ましくは本発明は更に、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘに基質特異性を有し、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘに対してＧａｌＮＡｃβ１−Ｘの１００倍の特異性を有する実質的に純粋なグリコシダーゼを提供する。
【００３３】
本発明は更に、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから得られうる実質的に純粋なガラクトシダーゼ、フコシダーゼまたはマンノシダーゼから成る組成物を提供する。
【００３４】
本発明は更に、Ｍａｎα１−３Ｒグリコシド結合、Ｍａｎβ１−４Ｒグリコシド結合またはＸｙｌβ１−２Ｒグリコシド結合に基質特異性を有する実質的に純粋なグリコシダーゼを提供する。
【００３５】
本発明の目的の１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから誘導された少なくとも１種類のグリコシダーゼを選択し、糖質の構成単糖間の選択されたグリコシド結合をグリコシダーゼ消化によって開裂し、修飾された糖質を形成する段階から成る糖質の修飾方法を提供することである。
【００３６】
本発明はまた、糖質基質中のグリコシド結合を選択的に開裂するために、グリコシド結合に基質特異性を有するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のグリコシダーゼを選択し、グリコシダーゼを糖質基質と反応させ、糖質基質を開裂する段階から成る方法を提供する。
【００３７】
本発明はまた、糖質からＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘを選択的に開裂するために、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘに対してＧａｌＮＡｃβ１−Ｘに対する基質特異性の少なくとも１００倍の基質特異性を有するグリコシダーゼを選択し、グリコシダーゼを糖質と反応させ、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘを開裂する段階から成る方法を提供する。
【００３８】
本発明はまた、Ｍａｎα１−３ＲまたはＭａｎα１−６Ｒ結合をＭａｎα１−６ＲまたはＭａｎα１−３Ｒに比べて少なくとも１００倍の優先度で選択的に開裂し得るグリコシダーゼを選択することによって糖質中のＭａｎα１−３ＲまたはＭａｎα１−６Ｒ結合を開裂する方法を提供する。
【００３９】
本発明の上記及びその他の目的、特徴及び利点は以下の記載及び添付の請求の範囲より更に十分に理解されよう。
【００４０】
図面の簡単な説明
本発明の上記の特徴は、以下の記載、添付の請求の範囲及び添付図面より更に十分に理解されよう。
【００４１】
図１は、２つの単糖間に形成されることが可能なグリコシド結合を示す。
【００４２】
図２は、グリコシド活性の存在を判定するためにＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓの粗抽出物をオリゴ糖基質と共にインキュベートした結果を示す。
【００４３】
図３は、酵素濃度を測定するために倍加系列希釈の精製酵素を用いて行ったα１−３,６ガラクトシダーゼの基質(１０９)に対する力価の測定を示す。
【００４４】
図４は、基質１２０、９５及び１１３を用いて行ったα１−２フコシダーゼ(ＩＩ)及びα１−３,４フコシダーゼ(Ｉ)のキャラクタリゼーションを示す。
【００４５】
図５は、直鎖状βＧｌｃＮＡｃ１−Ｘの選択的開裂をβＧａｌＮＡｃ１−Ｘとの比較によって証明するために基質１１８及び１６７を用いて行ったβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【００４６】
図６は、直鎖状及び分枝状の基質を用いて行ったβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【００４７】
図７は、付加的夾雑グリコシダーゼを含む市販のソースに由来のヘキソサミニダーゼとの比較によって行ったＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【００４８】
図８は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ１−３＞＞４ガラクトシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、Ｇａｌβ１−４Ｒ結合に比較したＧａｌβ１−３Ｒ結合に対する基質優先性が証明され、ニワトリ肝臓及びウシ睾丸から得られた市販の酵素との違いが示されている。
【００４９】
図９は、α１−３,６ガラクトシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、他のソース(コーヒー豆)から得られたガラクトシダーゼ中に見出されるＧａｌα１−４Ｒ結合に対する酵素活性の欠如を示す。
【００５０】
図１０は、直鎖状基質に対するα−マンノシダーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩの活性のキャラクタリゼーションを示す。
【００５１】
図１１は、分枝状基質上に対するα−マンノシダーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩの活性のキャラクタリゼーションを示す。
【００５２】
図１２は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−グルコシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、Ｇｌｕα１−４Ｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｒ結合に比較したＧｌｕβ１−４Ｒ結合に対する基質優先性が証明されている。
【００５３】
図１３は、グリコシダーゼ活性の存在を判定するために、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓの粗抽出物をオリゴ糖基質３００と共にインキュベートした結果を示す。
【００５４】
図１４は、グリコシダーゼ活性を測定するために、Ｘ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの粗抽出物をｐ−ニトロフェニルグリコシド基質と共にインキュベートした結果を示す。
【００５５】
図１５は、グリコシダーゼ活性の存在を判定するために、Ｘ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの粗抽出物をオリゴ糖基質と共にインキュベートした結果を示す。
【００５６】
図１６は、基質３００及び２６４を用いたＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−キシロシダーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【００５７】
図１７は、基質２５９及び３００を用いたＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−マンノシダーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【００５８】
特定実施態様の詳細な説明
本文及び請求の範囲において、グリコシダーゼの「基質特異性」とは、特定の単糖またはオリゴ糖を認識し、糖質構造中に位置する特有のグリコシド結合を開裂するグリコシダーゼの能力と定義される。
【００５９】
本文及び請求の範囲において、「グリコシダーゼ」とは、隣合う２つの単糖間のグリコシド結合の加水分解を触媒し得る酵素と定義される(この場合、単糖類はオリゴ糖類、多糖類中に存在してもよくまたは糖タンパク質もしくは糖脂質のような糖質複合体中に存在してもよい)。
【００６０】
本文及び請求の範囲において、「糖質」とは、オリゴ糖類、多糖類または複合構造を意味すると定義されており、これらの分子は遊離状態でて存在してもよくまたはタンパク質もしくは脂質のような第２の分子に結合していてもよい。
【００６１】
本文及び請求の範囲において、「オリゴ糖」とは、２個以上からほぼ３０個までの範囲の単糖から成る鎖長を有する結合単糖系と定義される。
【００６２】
本文及び請求の範囲において、「１−Ｘ」は、特定された単糖の炭素１と隣接の不特定単糖の不特定炭素との間の結合と定義される。
【００６３】
本文及び請求の範囲において、「１−３Ｒ」は、特定された単糖の炭素１と隣接の不特定単糖の炭素３との間の結合と定義される(不特定単糖"Ｒ"はオリゴ糖内に存在する)。炭素３以外の炭素原子に対する他の結合も特定される限り使用できる。
【００６４】
本文及び請求の範囲において、「生物からの調製物」とは、細胞抽出物または培地と定義される。
【００６５】
以下の略号を使用した。Ｇｌｃはグルコース、Ｇａｌはガラクトース、Ｆｒｕはフルクトース、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン、Ｘｙｌはキシロース、Ｆｕｃはフコース、β−ＧｌｃＮＡｃａｓｅはβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−ＧａｌＮＡｃａｓｅはβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−Ｇｌｃａｓｅはβ−グルコシダーゼ、Ｃｏはクマリン、ＡＭＣは７−アミノメチルクマリン、ＴＬＣは薄層クロマトグラフィーである。
【００６６】
グリコシド活性アッセイの開発
本発明の好ましい実施態様の１つは、グリコシダーゼ反応の消化産物を迅速、簡単及び正確に決定する方法である。基質を標識し、グリコシド活性を測定するために適当なマーカーを選択した。迅速かつ再現的な分離方法を用いて反応生成物を検出した。アッセイ方法は十分な感度を有しており、夾雑酵素活性の検出(図７)、系列希釈による酵素力価の測定(図３)、単一及び多数のグリコシド結合に対する１種類の酵素の相対的親和性の測定(実施例４、図２、４−１１)が可能であることが判明した。
【００６７】
グリコシダーゼ活性のスクリーニングに適した標識基質
グリコシダーゼ活性を測定するためにいくつかの酵素標識方法が存在する。例えば以下の標識を使用し得る。
【００６８】
(ａ)色素産生単糖誘導体。グリコシダーゼをスクリーニングする既存の方法では単糖類の色素産生誘導体、例えばｐ−ニトロフェニルグリコシドを最も普通に使用する(Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６０：８９；Ｔｒｏｎｓｍｏら,１９９３,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.２０３：７４−７９)。色素産生単糖類の開裂は特定単糖に対するグリコシダーゼの特異性に関する情報を提供するが、これらの基質は、グリコシド結合に対する酵素の特異性に関してはほとんど情報を与えない。更に、誘導体化された単糖類の開裂は隣接の単糖類または他の分枝構造によって酵素活性が受けた影響に関してはいかなる情報も与えない。その結果として、合成基質に対して活性のいくつかのグリコシダーゼがオリゴ糖基質に対して不活性なこともあり、またその逆もある(Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌら,Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ,Ｃｈａｐｌｉｎら,Ｅｄｓ.,ｃｈ.５,ｐｇ.１４３)。本発明の実施態様においては、選択された単糖類に対する新しく単離されたグリコシダーゼの特異性を測定するためにｐ−ニトロフェニル基質を使用した。
(ｂ)蛍光標識オリゴ糖類。還元性アミン化によってオリゴ糖を蛍光アミンで標識する方法が可用である。このような蛍光アミンの例としては、７−アミノ−メチルクマリン(ＡＭＣ)(Ｐｒａｈａｓｈら,１９８３,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１２８：４１−４６)、２−アミノピリジン(Ｒｅｉｎｈｏｌｄら,１９８３,Ｊ.Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ.Ｃｈｅｍ ２(１)：１−１８、ｐ−アミノアセトフェノン、ｐ−アミノ安息香酸エチルエステル及びアニリン(Ｗａｎｇら,１９８４,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１４１：３６０−３６１)、並びに、Ｋｌｏｃｋ(１９９３)の国際特許出願ＷＯ９３／０５０７６、Ｈａｕｇｌａｎｄ(１９９３)の国際特許出願(ＷＯ９３／０４０７７)及びＷＯ９３／０４０７４に参照によって含まれる他のアミンがある。
(ｃ)放射性標識オリゴ糖類。複合オリゴ糖の構造決定に
使用される種々の分析方法ではオリゴ糖の還元末端をＮａＢ３Ｈ４で化学量論的に放射性標識した(Ｙｏｕｎｇら,１９７１,Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０：３４５７；Ｔｙｒｃｏ １９８１,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１１８：２７８−２８３；Ｗｅｌｌｓら,１９８１,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１１０：３９７−４０６)。代替方法ではトリチウム標識オリゴ糖類を使用する(Ｙａｍａｓｈｉｔａら,１９８０,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２５５(１２)：５６３５−５６４２；Ｆｕｋｕｄａ １９８５,Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４：２１５４−２１６３)。
【００６９】
本発明の好ましい実施態様においては、オリゴ糖基質の還元末端を標識するために蛍光発色団、７−アミノクマリン(ＡＭＣ)を使用した。ＡＭＣ標識の利点は、高い量子効率及び優良な光安定性、還元末端から除去される２つ以上の単糖類から成るグリコシド結合の酵素開裂を殆どまたは全く阻害しない、発色団で標識されたオリゴ糖は薄層クロマトグラムで容易に検出できる、などである。
【００７０】
グリコシダーゼの反応生成物の分析
(１種以上の)標識基質をグリコシダーゼと反応させ、反応生成物が得られた場合には、この反応生成物を適当な分離方法を用いて特性決定した。オリゴ糖と単糖との分離方法には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、濾紙電気泳動、下降式濾紙クロマトグラフィー、毛細管電気泳動、ＴＬＣ及びＨＰＬＣがある。標識基質の特性が分離技術の選択をある程度決定する。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ(Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.１９９０,２７０：７０５−７１３)は、フルオロフォア８−アミノナフタレン−１,３,６トリスルホン酸(ＡＮＴＳ)を用いてオリゴ糖及び短い多糖類の還元末端の共有結合的標識を要する方法を記載した。このフルオロフォアは、ラベルによって付与されるイオン電荷が電界中でのオリゴ糖の分離を容易にするのでポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離に好適であった。この方法は実際、少量の材料を用いて単一の単糖から２６残基のポリマーまでの種々の大きさの分子を単一ゲル上で解明することが可能であった。残念なことに、基質の還元末端を比較的大きい荷電マーカーで標識する必要があるため、エキソグリコシダーゼ反応が妨害され得る。Ｌｉｎｈａｒｄｔ(国際特許出願公告ＷＯ９２／０２８１６)は、オリゴ糖を配列決定するためにＪａｃｋｓｏｎの方法と同様の方法を記載した。この方法では、複合糖質から遊離されたオリゴ糖成分の還元末端に負の電荷をもつ蛍光基を付加し、次いで、細管式動的篩分け（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｄｙｎａｍｉｃ ｓｉｅｖｉｎｇ）電気泳動によってポリアクリルアミドゲル上の種々のオリゴ糖を分離する必要がある。この方法の修正方法が最近Ｏ'Ｎｅｉｌ(ＡＡＡＳ会議,１９９３年８月)及びＨｉｇｇｉｎｓ(ＡＡＡＳ会議,１９９３年８月)によって報告された。上記方法の欠点は手順がコスト高なことである。
【００７１】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の代替方法として、低圧浸透クロマトグラフィーがある。この方法は、試薬系列分析方法を用いてオリゴ糖を配列決定するためにＥｄｇｅら,１９９２,ＰＮＡＳ ８９：６３３８−６３４２によって使用された。Ｅｄｇｅらは、放射性オリゴ糖を種々の組み合わせのエキソグリコシダーゼの混合物と混合し、次いで消化産物をＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ４カラムクロマトグラフィーによって分析した。
【００７２】
本発明の好ましい実施態様においては、薄層シリカゲルクロマトグラフィー(ＴＬＣ)を、分子量及びヒドロキシル基の数に基づくグリコシダーゼ反応の加水分解産物の高速分離方法として選択した。この方法は、ＵＶ光下で容易に検出できる７−アミノメチルクマリン標識した種々の長さのオリゴ糖を分離し得る(実施例２参照)。
【００７３】
上記方法の感度は実施例において、市販の基質中の夾雑酵素の存在を解明できること(図７)、また、１つのグリコシダーゼが１つのグリコシド結合に対して他のグリコシド結合に対するよりも高い親和性を有する(図８)と証明できることを示した。
【００７４】
本発明の方法に対するＴＬＣの重要な利点は、膨大な時間的及び設備的投資を要せずに(少量の基質を用いて)多数のサンプルをグリコシダーゼ活性に基づいて速やかにスクリーニングできることである(図２参照)。２５〜３０個という多数のサンプルを標準サイズの１つのシリカゲルＴＬＣプレートに充填し１つのバッチで分析することが可能である。１〜３０個の糖質残基から成る大きさのＡＭＣ標識オリゴ糖を最適に分離するために、非修飾オリゴ糖を最適に分離するような極性溶媒系を本発明によって調合した(表２)。
【００７５】
【表２】
【００７６】
本発明の方法の１つであるＴＬＣを使用しグリコシド開裂に基づいて迅速、簡単及び正確に多数のオリゴ糖をスクリーニングする能力は、糖質の配列決定の全自動化を実現する新規な方法を提供する。
【００７７】
ＴＬＣ上のクマリン標識基質の分析を利用する全自動化方法は主として以下の段階から成る。所定のエキソグリコシダーゼ混合物と混合した標識基質のアリコートから成る一次系列を形成する。この系列は、オリゴ糖の種類(例えば、高マンノース、複合体またはハイブリッド)を決定するように、または、結合特異的でないグリコシダーゼを用いてマンノース、ガラクトースなどの領域に関してオリゴ糖の全体構造を決定するように選択される。反応混合物のサンプルをＴＬＣプレートに滴下し、(オリゴ糖の大きさに基づいて)種々の溶媒中で処理する。次に、ＵＶ光によって蛍光を検出し、ディジタル化し、記録し得るように編制したグリッドにＴＬＣプレートを配置する。コンピュータ処理したデータベースに記憶されたパターンとグリッドの区画とを比較し、可能なすべての理論的配列を決定し得る。不明確な配列構造は、選択されたグリコシド結合及び分枝状または直鎖状分子に基質特異性を有するエキソグリコシダーゼを用いる第２ラウンドのグリコシダーゼ反応で解明する。
【００７８】
この種の全自動化分析方法は多くの利点を有する。即ち、一段階配列決定方法であること、広い範囲の特性決定されたグリコシダーゼ及び基質を使用できること、基質の必要量が少ないこと、などがある。
【００７９】
しかしながら、蛍光マーカーとしてＡＭＣ、分離方法としてＴＬＣを選択することは、本発明方法によるグリコシド活性の検定に他のマーカーまたは他の分離方法を使用することを排除しない。
【００８０】
グリコシダーゼのスクリーニング及びキャラクタリゼーション
本発明の特定実施態様は、グリコシダーゼのスクリーニング及び特性決定方法である。一連のグリコシダーゼを産生する確率の高い生物を選択する。この方法では、生物の粗調製物からのグリコシダーゼ加水分解産物を、所定の長さ、組成及び二次構造を有する標識オリゴ糖基質または誘導体化した単糖類を用いて分析する。次いで、グリコシダーゼを単離し、更に特性決定し、それらの基質特異性を更に定義する。
【００８１】
新規なグリコシダーゼ用生物のスクリーニング
本発明の１つの実施態様は、食物資源として糖質を選択的に利用する生物が新規なグリコシダーゼのソースを提供するという認識である。この特徴は表３及び表４に例示されている。これらの表においては、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓの種々の菌株の細胞抽出物を、実施例２に記載のようなクマリン標識オリゴ糖群を基質として用いてスクリーニングした。反応生成物をＴＬＣによって同定した。細胞抽出物以外に、細胞調製物から収集した培地をグリコシダーゼ活性に基づいてスクリーニングしてもよい。
【００８２】
反応基質の薄層クロマトグラフィー後にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ抽出物から多数の新規なエキソグリコシダーゼを同定した(図２)。基質群で試験したすべてのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌株は少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を有していた。７つの菌株のうちの６つが(８６％)、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、フコシダーゼ、ガラクトシダーゼ及びマンノシダーゼ活性を含むグリコシダーゼ活性を少なくとも３種類有していた。対照的に、土壌由来のＢａｃｉｌｌｕｓ菌株のグリコシダーゼ活性を試験すると、９つの菌株のうちの２つだけが少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を有していた。
【００８３】
表３及び表４に関連して、近縁生物または非近縁生物から得られた広範囲の細胞抽出物、培地または他の調製物を、既知の構造及び配列を有する蛍光標識されたオリゴ糖群に対するグリコシダーゼ活性に基づいて体系的にスクリーニングし得るランダムスクリーニング方法が開発された。
【００８４】
この新規な方法では、近縁生物の種々の菌株中で多重酵素活性が判明した(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ)(図２)。これらを生物の１つの菌株、例えばＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ中で更に特性決定した。本発明の範囲はＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓに限定されるものではなく、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓは本発明の１つの使用例を示すだけである。逆に、本発明は広範囲の生物及び細胞に適用可能である。
【００８５】
グリコシダーゼの産生
本発明のランダムスクリーニング方法によって同定し、次いで単離し、精製し、選択基質に対して更にスクリーニングしたグリコシダーゼを、酵素の組換え形態を調製するために、部分または完全タンパク質配列及びＤＮＡコーディング配列を与えるタンパク質配列決定によって更に特性決定し得る。本発明の１つの実施態様においては、クローンを同定し単離するために、グリコシダーゼをクローニングし、組換えクローンをスクリーニングする方法が記載されている(実施例５)。特定のグリコシダーゼを発現する生物だけが利用し得る特定の食物資源上で組換えライブラリーを増殖させることによって組換えクローンの単離効率を更に改良し得る。このようなスクリーニング基質の実例としてはパントテン酸に結合した二糖(実施例５参照)またはオリゴ糖がある。更に、既知のＤＮＡ配列を有するクローン化グリコシダーゼの入手が可能になったので、これらのＤＮＡ配列の遺伝子操作を行うことによって改変された基質特異性を有する突然変異酵素を形成し得る。
【００８６】
グリコシダーゼ活性のキャラクタリゼーション
粗抽出物中の酵素活性の同定に引き続いて、本発明では、(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のグリコシダーゼについて)実施例３でより十分に記載された当業界で公知の方法によってグリコシダーゼの単離及び精製を行う。グリコシダーゼの単離及び精製後、基質特異性によって更に進んだ酵素のキャラクタリゼーションを行った(図４〜１１)。また、表５及び実施例４に記載したように反応の補因子を決定し最適ｐＨも確認した。
【００８７】
本発明の範囲は後述する基質または酵素に全く限定されない。実際、記載のスクリーニング方法から得られる新規な酵素は、新規な標識オリゴ糖基質を構築する手段を提供し、これらの基質は更に、反復プロセスで生物または細胞の粗抽出物を分析するために使用され得る。
【００８８】
本発明に従ってＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓから単離し特性決定した新規なグリコシダーゼは以下の特徴を有していた。
【００８９】
(ａ)種々の単糖類に対する選択的基質特異性。本発明のグリコシダーゼは、ピラノース単糖類の立体異性体を識別し得る。特に、本発明のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼはβ−Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘ)に対してβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン(ＧａｌＮＡｃβ１−Ｘ)に対する親和性の少なくとも１００倍の選択的親和性を有している。これは、双方の形態を容易に識別できなかった従来技術のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼと対照的である(図７)。
【００９０】
(ｂ)１つの単糖のアノマー形態を識別する能力。検定した基質群のうちで、１つのグリコシダーゼは１つの単糖の１つのアノマー形態(αまたはβ)にだけ特異性を有している。
【００９１】
(ｃ)選択されたグリコシド結合に対する基質特異性。本発明のグリコシダーゼは、１つのグリコシド結合(例えば、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＦｕｃα１−２Ｒ、Ｍａｎα１−６Ｒ)、または、２つ以上のグリコシド結合(例えば、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＭａｎα１−３ＲとＭａｎα１−６Ｒ、またはＧａｌα１−３ＲとＧａｌα１−６Ｒ、またはＦｕｃα１−３ＲとＦｕｃα１−４Ｒ)に対して選択的特異性を示した(図４、９〜１１；表６、８)。
【００９２】
いくつかの場合には、１つの結合に対する選択的優先性が確認される。いくつかの酵素の場合、複数の結合を開裂することが観察され、１つの結合に対する作用が第２の結合に対する作用よりも優先することが確認された(例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから得られたβ−ガラクトシダーゼは、Ｇａｌβ１−４Ｒに比べてＧａｌβ１−３Ｒに優先性を有することが定量された(Ｇａｌβ−３＞＞４Ｒ)(図８)。更に、本発明のグリコシダーゼのいくつかは、直鎖状系列中の基質を優先的に開裂し、他のグリコシダーゼはオリゴ糖中の分岐点を開裂し得る(α１−３,４フコシダーゼ、α１−３,６マンノシダーゼ)。本発明のグリコシダーゼは、入手可能なオリゴ糖モチーフを用いて再現的な開裂プロフィルを提供するが、基質が糖質構造(単糖類、オリゴ糖もしくは多糖類)またはタンパク質、脂質または立体配置的に酵素活性に影響を与える合成マーカーと結合しているときは開裂パターンの変化が生じるであろう。
【００９３】
１つの新規なグリコシダーゼを、予想される全種類の基質に対してスクリーニングすることは可能ではないが、本発明では本発明のグリコシダーゼを特性決定するために、共通の糖質モチーフを有する選択基質を使用した。しかしながらこの分析は、本発明のグリコシダーゼがスクリーニングアッセイに含まれない追加の基質を認識できるという可能性を排除しない。または、既知の基質がより大きい分子の一部分に含まれている場合、同一構造中で分子が遠く隔たっていることに起因する立体効果のためにグリコシダーゼが既知の基質を認識できないこともあり得る。
【００９４】
本文中に記載のグリコシダーゼとしては、Ｆｕｃα１−２Ｒ結合を分岐点で開裂する能力を有するα１−２フコシダーゼがある。分枝状Ｆｕｃα１−２Ｒの開裂は、保存血液の免疫原性を減少させるために有用であり、この基質を選択的に開裂するα−フコシダーゼが入手可能になれば、血液バンクに保存された血液のＡＢＯ反応性を修飾する方法が得られる。上記のグリコシダーゼのうちで、α１−３,６ガラクトシダーゼは、ヒト以外の細胞系において作製された組換え糖タンパク質の通常は末端に位置する抗原性Ｇａｌα１−３Ｒ結合を開裂する能力を有しているので、臨床的に重要である。Ｇａｌα１−３Ｒ結合の除去によって治療用の組換えタンパク質に対する望ましくない免疫応答が除去されるであろう。
【００９５】
α１−３,６マンノシダーゼ、α１−２,３マンノシダーゼ、α１−３マンノシダーゼ及びα１−６マンノシダーゼの同定は、高マンノース及びハイブリッド構造中の特異的マンノース結合に結合したアンテナ状分枝を同定し配列決定する能力を初めて提供し、酵素法で従来可能であったよりも有意に優れた構造解明を可能にする。
【００９６】
グリコシダーゼの用途
本発明の１つの実施態様においては、同定された基質特異性を有する実質的に純粋な多くの単離グリコシダーゼと迅速で簡単な反応生成物同定アッセイとを組み合わせることによって以下の目的に適う改良方法が提供される。
【００９７】
(ａ)天然に遊離状態で産するかまたはタンパク質もしくは脂質から開裂された糖質構造を配列決定する。
【００９８】
(ｂ)分子が治療用タンパク質を含有する場合にオリゴ糖類の生物学的役割の確認のためまたは分子の生物学的特性値の変更のために、天然に遊離状態で産する糖タンパク質、糖脂質または糖質分子のオリゴ糖を修飾する。
【００９９】
(ｃ)カラムクロマトグラフィーを用いるかまたは解糖活性を含む画分の他の分析手段を用いて、望ましいグリコシダーゼを精製したり、不要な夾雑グリコシダーゼを検出したりする。
【０１００】
(ｄ)製紙産業における植物材料からのセルロース製造のような天然産糖質構造の分解を要する工程で使用する。
【０１０１】
(ｅ)選択されたオリゴ糖リガンドに特異性を有する細胞上の糖質レセプターを特性決定する。
【０１０２】
(ｆ)Ｖａｒｋｉ １９９３,Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：９７−１３０に記載されたような特徴的糖質構造に依存する生物系に対する作用メカニズムを研究する。引用の文献は参照によって本明細書に含まれるものとする。
【０１０３】
上記方法をより容易に実施するためのキットを調製し得る。キットは、天然ソースまたは組換え手段から単離され、糖質の配列決定に適した基質特異性が同定された実質的に純粋なグリコシド酵素群を含む(組換え形態は、形質転換微生物の発酵によってまたはトランスジェニック動物及び植物から作製される)。このようなキットは、タンパク質、脂質または糖質からオリゴ糖を開裂しかつ還元末端に蛍光ラベル(クマリン)を付加させる適当な試薬を単独または組み合わせて含む。
【０１０４】
更に、天然ソースからまたは組換え手段によって単離され糖質部分の生物学的役割の同定または治療用タンパク質を含む高分子の生物学的特性の改変に適した基質特異性が同定された実質的に純粋なグリコシド酵素群を含むキットを作製し得る。
【０１０５】
更に、酵素の精製中にカラムクロマトグラフィーまたは解糖活性含有画分の分析を要する他の手段を用いるグリコシダーゼ活性の迅速な検定に適したクマリン標識基質のような蛍光標識基質群を含むキットを作製し得る。
【０１０６】
天然産または合成の糖質構造の工業規模処理に適した酵素を含むキットを作製し得る。
【０１０７】
実施例
【実施例１】
【０１０８】
酵素アッセイ用基質の調製：オリゴ糖のＡＭＣ−標識
０.２５〜１ｍｇのオリゴ糖(Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ.,Ｗｅｓｔｂｕｒｙ,ＮＹ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ,Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ,ＭＯ；Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ Ｌａｂｓ,Ｗａｕｋｅｇａｎ,ＩＬ；及びＶ−Ｌａｂｓ Ｉｎｃ.,Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ,Ｌａから商品として得られるか、または、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ(１９８６)Ｅｄｓ.Ｃｈａｐｌｉｎ,Ｍ.Ｆ.Ｋｅｎｎｅｄｙ,Ｊ.Ｆ.(ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ,Ｅｎｇｌａｎｄ) ｐｐ.１５０−１５１から参照によって本明細書に含まれる方法に従って単離される)。
【０１０９】
０.１〜５.０μモルのオリゴ糖を１００μｌのＨ２Ｏに溶解した。糖質水溶液を、３００μｌのメタノールと、２０ｍｇの(０.１１μモル)のＡＭＣ(Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ−Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ)と、３５ｍｇ(０.５５μモル)のＮａＣＮＢＨ３と、４１μｌの氷酢酸とを含む溶液に添加した。混合物を、ネジ蓋付き微量遠心管にシールし、乾燥器(dry block)中で８０℃で４５分間加熱した。脱イオン水で平衡させたＧ−２５カラム(２×５０ｃｍ)に反応物を充填した。生成物を脱イオン水で溶出させ、１ｍｌの画分を収集した。５μｌの画分をシリカゲル６０ＴＬＣプレートに慎重に滴下し(バンドを形成するため)、画分の純度を検定した。実施例２に記載の手順でプレートをＴＬＣによって展開した。適当な画分をプールし、真空によって約０.１〜１μモル／ｍｌまで濃縮した。原液を−２０℃で保存した。
【実施例２】
【０１１０】
グリコシダーゼ活性に基づく生物のスクリーニング方法
スクリーニングアッセイ用細胞抽出物の調製
０.１〜０.５ｇの細胞ペーストを解凍し、３倍容のバッファＡ"(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ)に懸濁させた。細胞懸濁液を短時間音波処理し、エッペンドルフ微量遠心管に入れて１４,０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心した。
【０１１１】
グリコシダーゼ消化反応
１〜５μｌの細菌細胞抽出物または細胞増殖培地または部分精製した抽出物を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファ(種々のｐＨ及び補因子、表５参照)中に１ナノモルのＡＭＣ−標識基質を含む１０μｌの反応混合物に添加した。反応物を３７℃で５分間〜２０時間の期間インキュベートした。２〜３μｌの反応物を後述するようなシリカゲルＴＬＣプレートにバンドとして滴下した。３７℃、１時間でオリゴ糖基質から１ナノモルの末端単糖を遊離させるために必要な酵素の量を酵素１単位と定義した。
【０１１２】
ＡＭＣ−標識オリゴ糖の消化産物の薄層クロマトグラフィーによる分析
２〜３μｌ(＝０.２５ナノモルの基質)のグリコシダーゼ消化反応物をガラス裏面をもつシリカゲル６０ＴＬＣプレート(０.２５ｍｍ厚、２０×２０ｃｍ)に緻密なバンド(０.５ｃｍ幅のレーン)として滴下した。温風ガン(温度７０℃以下)でバンドを完全に乾燥させた。オリゴ糖の大きさに基づく種々の割合のイソプロパノール：エタノール：Ｈ２Ｏ混合物(表１)中で溶媒前縁が１０ｃｍ移動するまでＴＬＣプレートを展開させた。手持ち型の３１４ｎｍ紫外線ランプでバンドを可視化した。この方法を用いると最も少ない場合で０.１ナノモルの消化産物を検出できた。
【０１１３】
非消化二糖(９２ｂ)(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ)、四糖(１６７)(Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)、及び、六糖(１９７)(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３)Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)から成るマーカーを対照として用いた。非消化の基質も対照として使用した。
【０１１４】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓの種々の細菌株から得られた１６個の細胞抽出物のスクリーニングの結果を表３及び表４にまとめる。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの全部の抽出物は、試験した１４種の基質の少なくとも１つを開裂し、いくつかの抽出物は１０種類もの基質を開裂する多重酵素活性を示した。
【０１１５】
図２は、基質１１３(Ｇａｌβ１−３(Ｆｕｃα１−４)ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)及び基質１６７(Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)に対して試験したＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌株に由来の７つの粗抽出物の分析結果を示す。
【０１１６】
【表３】
注：試験した９種のバチルス菌株のうちの２種だけが少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を有していた。少なくとも３つのグリコシダーゼ活性を有する菌株はなかった。
【０１１７】
【表４】
注：試験した全部のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌株が少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を有していた。
７種の菌株のうちの６種(８６％)が少なくとも３つのグリコシダーゼ活性を有していた。
【実施例３】
【０１１８】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓからのグリコシダーゼの精製方法
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓの発酵
１ｇ／ｌの酵母エキス、２ｇ／ｌのトリプトン、６ｇ／ｌのリン酸ナトリウム(二塩基性)、３ｇ／ｌのリン酸カリウム(一塩基性)、０.５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１ｇ／ｌの塩化アンモニウム、２ｇ／ｌのグルコース、１ｍＭの塩化カルシウム、１ｍＭの硫酸マグネシウムから成る培地でＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ菌ＮＥＢ２５７株(ＡＴＣＣ＃４９７６４)を増殖させた。細胞を３０℃で通気及び撹拌しながら後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心分離によって採取し−７０℃で凍結保存した。
【０１１９】
粗抽出物の調製
以後のすべての手順を氷上または４℃で行った。上記で得られた２５４ｇの細胞ペーストを２倍容のバッファＡ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)に懸濁させた。細胞懸濁液をＧａｕｌｉｎホモジナイザー(Ｍ−１５モデル)に１２,０００ｐｓｉで２回通した。Ｓｈａｒｐｌｅｓ連続遠心機で溶菌液を１,３００ｇで４０分間遠心した。５００ｍｌの上清が得られた。
【０１２０】
グリコシダーゼの精製
疎水性及び電荷に従って酵素を分画する一連の分離方法を利用することによって粗細胞抽出物からグリコシダーゼを分離及び精製した。表５に記載の条件を用い実施例２に記載の方法に従って酵素を検定した。
【０１２１】
バッファＡ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)で平衡させたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(５.０×２５ｃｍ)に粗抽出物(５００ｍｌ)を充填した。カラムを２,０００ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、２,０００ｍｌのバッファＡと１ＭのＮａＣｌを含有する２,０００ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(２１ｍｌ)を流速３ｍｌ／分で収集した。画分のα１−２フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラムから０.３５−０.５ＭのＮａＣｌに溶出した。α１−２フコシダーゼ活性を含有する画分をプールし、以下のＡ項に記載の手順で酵素を更に精製した。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの通過物を収集し、他のすべてのグリコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。存在する全部のグリコシダーゼを定量した後で、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(２.６×３５ｃｍ)にＤＥＡＥ通過物を直ちに導入した。カラムを４００ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで５００ｍｌのバッファＡと０.９５ＭのＮａＣｌを含有する５００ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１２ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集した。画分のβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼ、α１−６マンノシダーゼ及びα１−３,６ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。β−ＧｌｃＮＡｃアーゼ及びα１−６マンノシダーゼのピークはカラムから０.３−０.４５ＭのＮａＣｌに同時溶出した。双方の活性を含む画分をプールし(１３０ｍｌ)、酵素を以下のＢ項及びＣ項に記載の手順で更に精製した。α１−３,６ガラクトシダーゼ活性のピークはＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから０.４５−０.５５ＭのＮａＣｌに溶出した。α１−３,６ガラクトシダーゼ活性を含む画分をプールし、酵素を以下のＤ項に記載の手順で更に精製した。カラム通過物とＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの洗浄液(３５０ｍｌ)とを収集し、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ、α１−２,３マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ及びα１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。カラム洗浄液中に全部の酵素活性が見出された。４６.２５ｇの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度１Ｍまでカラムに添加した。次いで、バッファＢ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)で平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１５ｃｍ)に洗浄液を導入した。カラムを６０ｍｌのバッファＢで洗浄し、次いで、１２０ｍｌのバッファＢと０.００１Ｍだけの(ＮＨ４)２ＳＯ４を含有する１２０ｍｌのバッファＢとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(４ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集した。画分のβ１−３＞＞４ガラクトシダーゼ、α１−２,３マンノシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ及びα１−２,３マンノシダーゼ活性のピークはカラムから０.６−０.３５Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４に同時溶出した。双方の活性を含有する画分をプールし、以下のＥ項及びＦ項に記載の手順で酵素を更に精製した。β−グルコシダーゼ活性のピークはカラムから０.２５−０.００１の(ＮＨ４)２ＳＯ４に溶出した。β−グルコシダーゼ活性を含有する画分をプールし、以下のＧ項に記載の手順で酵素を更に精製した。カラム通過物とＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの洗浄液とを収集し、α１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。洗浄液はα１−３,４フコシダーゼのピークを含むことが判明した。この酵素を以下のＨ項に記載の手順で更に精製した。
【０１２２】
Ａ.α１−２フコシダーゼ
α１−２フコシダーゼ活性を含有する上記のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプール(３００ｍｌ)に、４０ｇの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度１Ｍまで添加した。次いで、バッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１５ｃｍ)にプールを導入した。カラムを６０ｍｌのバッファＢで洗浄し、次いで、１２０ｍｌのバッファＢと０.００１Ｍだけの(ＮＨ４
)２ＳＯ４を含有する１２０ｍｌのバッファＢとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(４ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集した。画分のα１−２フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.００１Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４で溶出させた。バッファＣ(２０ｍＭの酢酸ナトリウムＨ５.２、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)に一夜透析後、プールした酵素を、バッファＣで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(１.０×１０ｃｍ)カラムに充填した。カラムを２０ｍｌのバッファＣで洗浄した。カラム通過物と洗浄液とを収集し、酵素活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラム洗浄液中で検出された。バッファＡに一夜透析後、洗浄液を、バッファＡで平衡させたＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５(１ｍｌ)カラムに充填した。カラムを２ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、４０ｍｌのバッファＡと０.６ＭのＮａＣｌを含有する４０ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−２フコシダーゼ活性を検定した。酵素活性のピークをプールし、カラムから０.０５−０.１５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。粗抽出物の精製後に収量１,５００単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
【０１２３】
Ｂ.β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとα１−６マンノシダーゼの双方の活性を含む上記の酵素プール(１３０ｍｌ)をバッファＡに一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファＡで平衡させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１５ｃｍ)に導入した。カラムを６０ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、１２０ｍｌのバッファＡと１ＭのＮａＣｌを含有する１２０ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(４ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集した。カラム通過物を収集し、β−ＧｌｃＮＡｃアーゼ及びα１−６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム通過物中でα１−６マンノシダーゼ活性だけが検出された。この酵素を以下のＣ項に記載の手順で更に精製した。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから得られた画分のβＧｌｃＮＡｃアーゼ活性を上記の手順で検定した。β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性のピークをプールし、カラムから０.１５−０.３ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、酵素プールを、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラムを６ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、４５ｍｌのバッファＡと０.６ＭのＮａＣｌを含有する４５ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、βＧｌｃＮＡｃアーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、カラムから０.２５−０.３ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。粗抽出物の精製後に収量３０,０００単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
【０１２４】
Ｃ.α１−６マンノシダーゼ
上記のＢ項に記載のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ通過物を、バッファＤ(２０ｍＭのリン酸カリウムｐＨ６.０、１０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)に一夜透析した。透析後、通過物を、バッファＤで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１２ｃｍ)に導入した。カラムを４０ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、８０ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する８０ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(２.５ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集し、α１−６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１５−０.３ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＥ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)に一夜透析後、酵素プールを、バッファＥで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラムを６ｍｌのバッファＥで洗浄し、次いで、４５ｍｌのバッファＥと０.６ＭのＮａＣｌを含有する４５ｍｌのバッファＥとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１５−０.２ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量２００,０００単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
【０１２５】
Ｄ.α１−３,６ガラクトシダーゼ
α１−３,６ガラクトシダーゼを含有する上記のＨｅｐａｒｉｎプールをバッファＤに一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファＤで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１２ｃｍ)に導入した。カラムを４０ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、８０ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する８０ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(３ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−３,６ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.２５−０.３５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、酵素プールを、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラムを６ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、４５ｍｌのバッファＡと１ＭのＮａＣｌを含有する４５ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−３,６ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素ピークをプールし、０.１５−０.２５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量６７,５００単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
【０１２６】
Ｅ.β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ
β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ及びα１−２,３マンノシダーゼの双方の活性を含有する上記のＰｈｅｎｙｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅプールをバッファＤに一夜透析した。透析後、プールを、バッファＤで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、５０ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。カラム通過物を収集し、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ及びα１−２,３マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム通過物中でα１−２,３マンノシダーゼ活性だけが検出された。
【０１２７】
この酵素を以下のＦ項に記載の手順で更に精製した。画分(２ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１５−０.２５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＤに一夜透析後、酵素プールを、バッファＤで平衡させたＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５(１ｍｌ)カラムに導入した。カラムを２ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、２５ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する２５ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.０−０.１ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、酵素プールをバッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラムを６ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、４５ｍｌのバッファＡと０.６ＭのＮａＣｌを含有する４５ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。カラム通過物を収集し、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ活性を検定した。酵素活性のピークはカラム通過物中に検出された。通過物を次にバッファＡに一夜透析した。ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。実質的に純粋な酵素の収量は４５,０００単位であった。
【０１２８】
Ｆ.α１−２,３マンノシダーゼ
α１−２,３マンノシダーゼ活性を含有する上記のＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム通過物をバッファＥに一夜透析した。透析後、通過物を、バッファＥで平衡させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラム通過物を収集し、α１−２,３マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラム通過物中で検出された。通過物を次に、バッファＥで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。通過物を収集し、検定すると、酵素活性のピークを含むことが判明した。通過物を次に、バッファＥで平衡させたＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ１０／１０(８ｍｌ)カラムに充填した。カラム通過物と洗浄液とを収集し、α１−２,３マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。Ｍｏｎｏ Ｑカラム洗浄液が酵素活性のピークを含むことが判明した。４.３６ｇの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら洗浄液に最終濃度１Ｍまで添加した。洗浄液を、バッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＢで洗浄し、次いで、１Ｍから０.００１Ｍまで漸減する硫酸アンモニウムを含有する５０ｍｌのバッファＢによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(２ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集し、α１−２,３マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.５５−０.３Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４に溶出させた。バッファＤに一夜透析後、酵素プールを、バッファＤで平衡させたＰｏｌｙ−Ｃａｔ Ａ(３ｍｌ)カラムに導入した。通過物を収集し、α１−２,３マンノシダーゼ活性を検定した。カラム通過物が酵素活性のピークを含むことが判明した。４.６２ｇの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度１Ｍまで通過物に添加した。通過物を次に、バッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０(８ｍｌ)カラムに導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＢで洗浄し、次いで、５０ｍｌのバッファＤと０.００１Ｍだけの(ＮＨ４)２ＳＯ４１Ｍを含有する５０ｍｌのバッファＢとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−２,３マンノシダーゼ活性を検定した。酵素活性のピークをプールし、０.６５−０.５Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４に溶出させた。バッファＥに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量４,０００単位が得られた。
【０１２９】
Ｇ.β−グルコシダーゼ
β−グルコシダーゼ活性を含有する上記のＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅプールをバッファＤに一夜透析した。透析後、プールを、バッファＤで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、５０ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、β−グルコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１−０.１ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＤに一夜透析後、酵素プールをＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５(１ｍｌ)カラムに導入した。カラムを２ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、２０ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、β−グルコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.０５−０.１ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、酵素プールを、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラム通過物及び洗浄液を収集し、βグルコシダーゼ活性を上記の手順で検定し、洗浄液が酵素活性のピークを含むことを検出した。洗浄液をバッファＡに一夜透析した。ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。粗抽出物の精製後に５００単位の収量が得られた。
【０１３０】
Ｈ.α１−３,４フコシダーゼ
α１−３,４フコシダーゼ活性を含有する上記のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ洗浄液をバッファＣに透析した。透析後の洗浄液を、バッファＣで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＣで洗浄し、次いで、５０ｍｌのバッファＣと０.６ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍｌのバッファＣとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(２ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集し、α１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１５−０.２５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＣに一夜透析後、酵素プールを、バッファＣで平衡させたＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５(１ｍｌ)カラムに導入した。カラムを２ｍｌのバッファＣで洗浄し、次いで、３５ｍｌのバッファＣと０.６ＭのＮａＣｌを含有する３５ｍｌのバッファＣとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.２５−０.３５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、酵素プールを、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラム通過物を収集し、α１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。通過物が酵素活性のピークを含むことが判明した。１.１９ｇの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度１.５Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４となるまで通過物に添加した。通過物を次に、バッファＦ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１.５Ｍの硫酸アンモニウム、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)で平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０(８ｍｌ)カラムに導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＦで洗浄し、次いで、５０ｍｌのバッファＦと０.００２Ｍだけの(ＮＨ４)２ＳＯ４を含有する５０ｍｌのバッファＦとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.６−０.５Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４に溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。粗抽出物の精製後に６０,０００単位の収量が得られた。
【０１３１】
α１−３,６マンノシダーゼの精製
上記で得られた２８０ｇの細胞抽出物を３倍容のバッファＡ'(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ)に懸濁させた。細胞懸濁液をＧａｕｌｉｎホモジナイザー(Ｍ−１５モデル)に１２,０００ｐｓｉｇで２回通した。溶菌液をＳｈａｒｐｌｅｓ連続遠心機で１３,０００ｇで４０分間遠心した。７００ｍｌの上清が得られた。
【０１３２】
粗抽出物(７００ｍｌ)を、バッファＡ'で平衡させたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(５.０×２６ｃｍ)に充填した。カラムを２,５００ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、２,０００ｍｌのバッファＡ'と１ＭのＮａＣｌを含有する２,０００ｍｌのバッファＡ'とによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(２１ｍｌ)を流速３ｍｌ／分で収集し、α１−３,６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラムから０.１５〜０.２５ＭのＮａＣｌに溶出した。酵素活性を含有する画分をプールし、バッファＡ'に一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファＡ'で平衡させたＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(２.６×２５ｃｍ)に導入した。カラムを３００ｍｌのバッファＡ'で洗浄し、次いで、２５０ｍｌのバッファＡ"と０.９５ＭのＮａＣｌを含有する２５０ｍｌのバッファＡ'とによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(６ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集し、α１−３,６マンノシダーゼ活性を検定した。酵素活性のピークは０.４−０.６ＭのＮａＣｌに同時溶出した。活性を含む画分をプールし、バッファＡ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)に一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファＥ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)で平衡させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０.０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＥで洗浄し、次いで、６０ｍｌのバッファＥと０.６ＭのＮａＣｌを含有する６０ｍｌのバッファＥとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(２ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集し、α１−３,６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１５−０.２５ＭのＮａＣｌに希釈した。バッファＥに一夜透析後、酵素プールを、バッファＥで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラムを６ｍｌのバッファＥで洗浄し、次いで４５ｍｌのバッファＥと０.６ＭのＮａＣｌを含有する４５ｍｌのバッファＥとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−３,６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１−０.２ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。粗抽出物の精製後に、１,０００単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
【０１３３】
【表５】
【実施例４】
【０１３４】
グリコシダーゼの特性決定
Ａ.フコシダーゼ
α１−３,４フコシダーゼ(Ｉ)及びα１−２フコシダーゼ(ＩＩ)に対する反応条件を最適にした。５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６.０中の１.０ナノモルの基質を酵素で消化した(２単位のα−フコシダーゼＩＩ(図４、レーン２)、１００単位のα−フコシダーゼＩ(図４、レーン３)、２単位のα−フコシダーゼＩ(図４、レーン５、６、９、１０)、２０単位のα−フコシダーゼＩＩ(図４、レーン７、１１)、及び、２単位のβ−ガラクトシダーゼ(図４、レーン６、１０)(ウシ睾丸、ＢＭＢ))。(１単位は、３７℃、１時間でオリゴ糖から１ナノモルの末端糖を遊離するために必要な酵素の量と定義される)。補因子は全く不要であることが判明した。インキュベーションを３７℃で４時間及び２４時間行った。４時間後、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓのフコシダーゼによる基質の消化が完了していた。活性の弱いβ−ガラクトシダーゼによる消化が完了できるようにインキュベーションを２４時間まで延長した。
【０１３５】
図４は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから単離されたα−フコシダーゼＩ及びＩＩの基質特異性を示す。これらの２つの酵素は選択されたグリコシド結合に対して異なる特異性を有している。クマリン標識オリゴ糖基質の開裂及び薄層クロマトグラフィーによる反応生成物の分離によって証明されるように(レーン３、５、９)、α−フコシダーゼＩはＦｕｃα１−３Ｒ及びＦｕｃα１−４Ｒ結合を選択的に開裂し、α−フコシダーゼＩＩはＦｕｃα１−２Ｒ結合を選択的に開裂する。α−フコシダーゼＩＩは、ＴＬＣ上のバンドが１つの単糖の喪失に対応するより高い位置に泳動したことによって証明されるように、三糖の末端α１−２結合を開裂したが(レーン２)、分枝状のＦｕｃα１−３ＲまたはＦｕｃα１−４Ｒ結合を認識しなかった(レーン７、１１)。α−フコシダーゼＩＩと対照的にα−フコシダーゼＩは、Ｆｕｃα１−２Ｒ結合を消化することができなかった。
【０１３６】
α１−３,４フコシダーゼＩがフコースを除去したが末端ガラクトースを除去しなかったことを確認するために、基質をα−フコシダーゼＩ及び０.５単位のウシ睾丸β−ガラクトシダーゼ(ＢＭＢ)によって消化して、末端β−ガラクトース及びフコースの双方を基質から除去した。図４において、レーン６及び１０は、α−フコシダーゼＩ及びβ−ガラクトシダーゼによる処理後に第二の単糖(末端ガラクトース)が除去されたことを示し、レーン５及び９はα−フコシダーゼＩ消化後に１つの単糖だけが除去されたことを示す。
【０１３７】
３種類の基質、１２０：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ；９５：Ｇａｌβ１−４(Ｆｕｃα１−３)ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ；及び１１３：Ｇａｌβ１−３(Ｆｕｃα１−４)ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏを用いて基質特異性を証明した。非消化基質を対照とした(レーン１、４、８)。
【０１３８】
【表６】
【０１３９】
Ｂ.β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから上記のごとく精製した１０単位のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(β−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ)は、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４.５中で補因子の非存在下に０.５〜１ナノモルの基質と反応することが判明した。ｐＨ４〜６のｐＨ範囲で酵素は同様に活性であった。インキュベーションを３７℃で４時間行った。
【０１４０】
図５は、ＴＬＣによって分析されたこれらの反応の結果を示す。レーン１及び３は夫々、非消化の基質１１８(ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ)及び１６７(Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)を示す。レーン２は末端ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｒ結合が開裂されるという結果を示す。レーン４は、０.５単位のウシ睾丸β−ガラクトシダーゼを用いた末端Ｇａｌβ１−３Ｒの開裂を示し、レーン５はβ−ガラクトシダーゼによる開裂後のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによるＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｒ結合の付加的な開裂を示す。 図６は更に、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｒ及びＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｒ結合を含む基質を用いてβ−ＧｌｃＮＡｃに対するβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの特異性を試験した結果を示す。ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｒ結合は分岐点を形成している(２００：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ；１９７：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３)Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)。これらの基質は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓのβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼによる開裂に先立ったβ−ガラクトシダーゼ(ウシ睾丸)によって開裂される末端Ｇａｌβ１−４残基を有している。レーン１及び４は、開裂されない基質２００及び１９７を夫々示しているが、レーン(ｍ)は大きさのマーカーとして二糖及び四糖を有している。レーン２及び５は夫々、β−ガラクトシダーゼによって消化された基質２００及び１９７を示し、レーン３及び６は夫々、β−ガラクトシダーゼとβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼとによって消化された基質２００及び１９７を示す。
【０１４１】
図７は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから得られたβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼはβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン(β−ＧａｌＮＡｃ)を消化しないが、ウシ腎臓から得られたβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼはこの基質を消化することを示す。レーン１及び４は夫々、非消化の基質９６(ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)及び２０５(ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)を示す。レーン２及び５は夫々、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓのβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼで消化した基質９６及び２０５を示す。開裂反応は全く検出されない。しかしながら、ウシ腎臓のβ−ＧａｌＮＡｃアーゼを用いると(レーン３及び６)、基質９６及び２０５の双方のβ−ＧａｌＮＡｃの開裂が観察される。二糖及び四糖から成るマーカー(ｍ)は、ウシ腎臓のβ−ＧａｌＮＡｃアーゼによって９６及び２０５の１つの単糖が開裂されることを示している。
【０１４２】
結果を表７にまとめる。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓのβ−ＧｌｃＮＡｃだけはＰＮＰ−ＧａｌＮＡｃに対して検出可能な活性を示さなかったが、市販の酵素類はこの基質に対して活性を有していた。
【０１４３】
【表７】
【０１４４】
実施例２で定義したように１ＮＥＢ単位の酵素を３７℃で１時間使用してアッセイを実施した。
ＮＤ＝検出不能
１０ｍＭのＰＮＰ基質、２５μｌの反応容量を使用し、７５μｌの０.２Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ９.８で反応を停止させ、得られた吸光度をＯＤ４００で測定した。
＊Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから精製した５０ＮＥＢ単位の酵素をＰＮＰβＧａｌＮＡｃに対して検定した。(一夜インキュベートした場合であっても、ＰＮＰ−ＧａｌＮＡｃに対する測定可能な活性は検出できなかった)。
【０１４５】
Ｃ.マンノシダーゼ
直鎖状構造に対する特異性
クマリン標識オリゴ糖を用いＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから単離した３種の酵素の基質特異性を試験した。基質を表８に示し、開裂を(＋)によって記録する。この表を導いたＴＬＣデータを図１０に示す。ＴＬＣに示されたマーカーは、二糖、四糖及び六糖から成るオリゴ糖混合物である。レーン１、７及び１１は非消化の基質である。
【０１４６】
５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６.０のバッファ中で調製した１ナノモルの基質を後述の濃度の酵素によって消化させた。α１−３,６マンノシダーゼ(Ｉ)及びα１−２,３マンノシダーゼ(ＩＩＩ)の場合には５ｍＭのＣａ＋＋をインキュベーション混合物に添加した。
【０１４７】
レーン２、８及び１４は夫々、消化産物が得られた場合の基質１３４、１１４及び２００に対するマンノシダーゼＩの消化産物を示す。この酵素は、比較的高い濃度(１５単位)の酵素の存在下に長時間(２０時間)のインキュベーションを行っても基質１３４上の末端Ｍａｎα１−２Ｒ結合を開裂できない。対照的に、この酵素は、基質１１４の末端Ｍａｎα１−２Ｒ結合、及び、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２が除去された後の基質２００の末端Ｍａｎα１−６Ｒ結合を開裂できる。これらの実施例では、１.５単位という少量の酵素を基質と共に２時間インキュベートしたときにも開裂が生じる。
【０１４８】
レーン５、１０及び１６は、α−マンノシダーゼＩＩの消化産物を示す。この酵素は、１００単位の濃度で２０時間インキュベーションを行ったときにもＭａｎα１−２ＲまたはＭａｎα１−３Ｒ結合を開裂しない。対照的に、この酵素は、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２の除去後の基質２００からＭａｎα１−６Ｒ結合を開裂する。
【０１４９】
レーン３、４、９及び１５は夫々、消化産物が得られた場合のα−マンノシダーゼＩＩＩの消化産物を示す。この酵素は、基質１３４の末端Ｍａｎα１−２Ｒ結合、及び、基質１１４の末端Ｍａｎα１−３Ｒ結合を開裂するが、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２の除去後にも基質２００を開裂しない。開裂が観察される場合には、１.５単位の酵素を基質と共に２時間インキュベートする。活性が全く観察されない場合には、１５単位の酵素を２０時間使用した。
【０１５０】
上記の開裂活性に従って、α−マンノシダーゼＩはα１−３,６マンノシダーゼと同定され、α−マンノシダーゼＩＩはα１−６マンノシダーゼと同定され、α−マンノシダーゼＩＩＩはα１−２,３マンノシダーゼと同定された。
【０１５１】
【表８】
【０１５２】
分枝状構造に対する特異性
図１１に示すように、基質２１３及び２１６に対するα−マンノシダーゼＩのインキュベーション(２時間)は、この酵素が分枝状構造を開裂し得ることを証明した。レーン２及び８は２個のマンノース残基の除去を示す。インキュベーションを更に継続(２０時間)すると、第２の対の分枝状マンノースが除去された(レーン１３、１９)。この消化は部分的であり、その理由は還元末端の隣接標識マンノースの負の作用にあると考えられるが、天然産オリゴ糖基質の第２の分枝が開裂されていたと考えることもできる。
【０１５３】
α−マンノシダーゼＩＩのインキュベーション(２時間及び２０時間)は基質２１３及び２１６の開裂の証拠を示さなかった。(レーン６、１１、１７及び２３)。他の理論で解釈できる可能性も否定はしないが、α−マンノシダーゼＩＩ(α１−６マンノシダーゼ)は直鎖状分子を開裂し得るが分枝状分子を開裂できないと推測される。この酵素の使用は、分枝状及び直鎖状のＭａｎα１−６Ｒグリコシド結合を識別する手段を提供し得る。
【０１５４】
α−マンノシダーゼＩＩＩと基質２１３及び基質２１６とのインキュベーション(２時間及び２０時間)の結果は(レーン４、９、１５及び２１)、基質が部分開裂されて２１６から１つのマンノースが除去されたことを示し、これはＭａｎα１−２Ｒ及びＭａｎα１−３Ｒに対する酵素の特異性と一致する。結果は、この酵素が分枝状基質よりも直鎖状基質に対してより大きい親和性を有することを示す。α−マンノシダーゼＩＩの存在下で、基質２１３ではいくつかの付加的開裂が観察されたが、基質２１６では観察されなかった。
【０１５５】
Ｄ.α１−３,６ガラクトシダーゼ
図９に示すように、α１−３,６ガラクトシダーゼはＧａｌα１−３Ｒ及びＧａｌα１−６Ｒ結合(レーン３、６及び９)を優先的に開裂する。５ｍＭのＣａＣｌ２を補充した５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６.０中の１ナノモルの基質に１０単位の酵素を添加し３７℃で２時間インキュベートしたときに、基質１０９(Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ)から１つの単糖が遊離したことがレーン３に示されており、また、基質１８１(Ｇａｌα１−６Ｇｌｃα１−２Ｆｒｕ−Ｃｏ)から単糖開裂産物が得られたことが示されている。対照的に、酵素の量を１０単位に比べて１００単位に増加しインキュベーション時間を２時間に比べて２０時間に延長したときであっても酵素が基質１９３(Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４３Ｇａｌ−Ｃｏ)を開裂しないことがレーン５に示されている。これらの結果は、コーヒー豆(ＢＭＢ)に由来の市販のα−ガラクトシダーゼと対照的である。コーヒー豆のα−ガラクトシダーゼはレーン６に示すように基質１９３のＧａｌα１−４Ｒ結合を容易に開裂する。対照レーン１、４及び７は酵素非添加の非消化基質を示す。マーカーは二糖、四糖及び六糖を含む。
Ｅ.β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ
図８に示すように、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼはＧａｌβ１−３Ｒ結合を優先的に開裂する。レーン２は、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４.５中の１ナノモルの基質に１単位の酵素を添加し３７℃で２時間インキュベートしたときに基質１６７(Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)から少なくとも１つの単糖が遊離されることを示す。対照的に、酵素の濃度を１単位に比べて１００単位に増加したときに酵素が基質２０２(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)を部分的にしか開裂しないことがレーン６に示されている。これらの結果は、ニワトリ肝臓(ｃｌ)及びウシ睾丸(ｂｔ)に由来の市販のβ−ガラクトシダーゼと対照的であり、これらの酵素はいずれも基質１６７及び２０２を同様に十分に切断する(レーン３、４、７及び８)。レーン１及び５は酵素非添加の非消化基質対照を示す。
【０１５６】
Ｆ.β−グルコシダーゼ
図１２に示すように、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓに由来の粗抽出物は少なくともＧｌｃβ１−４Ｒ結合に特異性を有することが判明した。５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４.５及び５ｍＭのＣａＣｌ２中に１ナノモルの基質を含むインキュベーション混合物中で３７℃で２時間の酵素消化を行った。酵素を種々の濃度で使用した。次いで、反応混合物をＴＬＣプレートに滴下した。酵素非添加の基質を陰性対照として添加し、更に、基質とβＧｌｃＮＡｃアーゼとから成る陽性対照(レーン７)、及び、基質とβ−ガラクトシダーゼ(ウシ睾丸)とから成る陽性対照(レーン１０)を添加した。レーン２、４、６及び９は夫々、１単位のβ−ガラクトシダーゼ(β−Ｇｌｃアーゼ)を１７９(Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)と混合した場合、５単位のβ−Ｇｌｃアーゼを１８０(Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)と混合した場合、５単位のβ−Ｇｌｃアーゼを１１８(ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ)と混合した場合、及び、５単位のβ−Ｇｌｃアーゼを２０２(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)と混合した場合の反応生成物を示す。試験した４種の基質のうちで末端Ｇｌｃβ１−４結合を含む基質１７９だけがβ−Ｇｌｃアーゼによって開裂された。
【実施例５】
【０１５７】
エキソグリコシダーゼ遺伝子のクローニング
天然産グリコシダーゼのソースとしてＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓを用いるエキソグリコシダーゼ遺伝子のクローニング方法を記載する。しかしながらこの方法は、このソースだけでなく、上記の手順で少なくとも１種類のグリコシダーゼを検出できると判断された任意の生物に応用できる。
【０１５８】
Ａ.ＤＮＡ精製
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓのＤＮＡを作製するために、１ｇの細胞ペーストを５ｍｌの０.１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１ＭのＥＤＴＡ,ｐＨ７.６中で３０分間穏やかに撹拌することによって再懸濁させた。上清を各３.０ｍｌの２つのアリコートに分割した。０.１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１ＭのＥＤＴＡ,ｐＨ７.６中の１.７ｍｇ／ｍｌのリゾチーム３.５ｍｌを各アリコートに添加し、夫々を３７℃で１５分間インキュベートした。ＳＤＳを１％まで添加し、プロテイナーゼＫを０.１３ｍｇ／ｍｌまで添加し、次いでアリコートを３７℃で１時間インキュベートした。１０％ＳＤＳと８％サルコシルとの溶液０.４ｍｌを各々に添加し、インキュベーションを５５℃で２時間継続した。次いで、２つのアリコートを一緒にし、ＤＮＡバッファ(１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ,ｐＨ８.０)を４回交換しながら２４時間透析した。透析したＤＮＡ溶液を次に、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度遠心の準備として、ＤＮＡバッファで総量を４０ｍｌに増量し、次いでＤＮＡ溶液を各２０ｍｌの２つのアリコートに分け、各アリコートに２０ｇの塩化セシウムと０.２ｍｌの５ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムとを添加した。ＤＮＡ溶液を４４,０００ｒｐｍで４８時間遠心し、得られたＤＮＡのバンドを注射器及び１８ゲージ針で採取した。氷冷し水で飽和した等容量のＮ−ブタノールで４回抽出することによって臭化エチジウムを除去した。透析によって塩化セシウムを除去した。次に、ＮａＣｌを０.５Ｍまで添加し、上部に０.５５倍容のイソプロピルアルコールを重層させることによってＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡをガラス棒に巻取った。２ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ,ｐＨ８.０中でＤＮＡを最終濃度約７６μｇ／ｍｌまで溶解した。
【０１５９】
Ｂ.部分消化
精製ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで開裂し部分消化するために、１００ｍＭのＢｉｓ Ｔｒｉｓプロパン−ＨＣｌ,ｐＨ７.０、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオトレイトールバッファ中で７６μｇ／ｍｌの濃度の１２４μｌのＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡによって処理し、、４００μｌのアリコートと各２００μｌの４つのアリコートとに分割した。４００μｌの管に２単位のＳａｕ３ＡＩを添加して、ＤＮＡ４.７５μｇあたり１単位の酵素が含まれる濃度にした。第１の管から取り出した２００μｌを第２の管に移して４.７５ｍｇあたり０.５単位のＳａｕ３ＡＩが含まれる濃度にし、以後同様にして、継続する管が直前の管の半量のＳａｕ３ＡＩを含むようにした。管を３７℃で１５分間インキュベートし、７２℃で１５分間熱処理し、次いでＴｒｉｓ−ホウ酸塩−ＥＤＴＡバッファ中の０.７％アガロースゲル中で電気泳動処理した。ＤＥＡＥアニオン交換濾紙に２時間電気泳動させることによって約９〜２ｋｂの大きさを有するＤＮＡフラグメントを収集した。濾紙を０.１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのバッファで２回洗浄した。次いで、濾紙を１.０ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む７５μｌのバッファで４回洗浄することによって濾紙からＤＮＡを溶出させた。得られたＤＮＡフラグメント含有溶液を、３００μｌのフェノール／クロロホルムで抽出し、３００μｌのクロロホルムで抽出し、ドライアイス／エタノール浴に１５分間入れることによって１ｍｌの無水エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを１４Ｋｒｐｍで５分間ペレット化した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、風乾し、１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８及び１ｍＭのＥＤＴＡの最終容量１０μｌに再懸濁させた。精製フラグメントを以下の段階３に記載の手順で使用した。
【０１６０】
Ｃ.結合
フラグメント化したＤＮＡを以下の手順でｐＵＣ１９に結合させた。３μｇのＳａｕ３ＡＩで部分消化したＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓのＤＮＡ(１０μｌ)を、１.５μｇのＢａｍＨＩ開裂し脱リン酸化したｐＵＣ１９(１μｌ)と混合した。４μｌの１０×結合バッファ(５００ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.５、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＡＴＰ)を添加し、更に２５μｌの滅菌蒸留水を加えて最終濃度３９μｌとした。１μｌの濃縮Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(２×１０６Ｕ／ｍｌ)を添加し、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＶＳ ０.０２５μＭフィルターを用いた滴下透析によって１０μｌの結合混合物を脱イオン化した。次いで、ＤＮＡを大腸菌ＥＤ８７６７に電気穿孔させた。電気穿孔の準備として１リットルの大腸菌細胞をＬブイヨン中でＫｌｅｔｔ５０−８０まで増殖させた。細胞を氷上で１５〜３０分間冷却し、次いで低温下で４,０００ｒｐｍで１５分間ペレット化した。ペレットを氷冷滅菌水で２回及び１０％グリセロールで１回洗浄した。洗浄したペレットを１〜２ｍｌの１０％グリセロール中で最終濃度３×１０１０細胞／ｍｌまで再懸濁させた。必要になるまで細胞を１００μｌのアリコートとして−７０℃で凍結保存した。準備した細胞にＤＮＡを電気穿孔するために、細胞を静かに解凍し氷に載せた。４０μｌの細胞を結合及び透析した１０μｌのＤＮＡと混合した。混合物を低温の０.２ｃｍ電気穿孔キュベットに導入した。１２.５ｋｖ／ｃｍの電気パルスを４〜５ミリ秒の時定数でＤＮＡ細胞混合物に印加した。大腸菌を直ちに１ｍｌのＬブイヨンで希釈し、３７℃で３０分間増殖させ、選択培地を含む１５０ｍｍのＬ寒天プレート上で平板培養した。３７℃で一夜インキュベーション後、エキソグリコシダーゼを発現するクローンを以下の手順でスクリーニングした。
【０１６１】
Ｄ.エキソグリコシダーゼクローンのスクリーニング
エキソグリコシダーゼ活性を発現するクローンをスクリーニングするために、異なる３種の色素産生指示基質を使用した。色素産生基質の１つとして、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド(Ｘ−ｇａｌ)を使用した。この基質を５０μｇ／ｍｌの濃度で、形質転換細胞を平板培養する前の選択寒天培地に添加した。Ｘ−ｇａｌを含む寒天プレート上で増殖するβ−ガラクトシダーゼ発現コロニーは青色を呈するであろう。この手順でスクリーニングした９×１０４個のコロニーのうちで、１つのコロニーだけが青色を呈した。また、エキソグリコシダーゼ活性をスクリーニングするための色素産生基質として４−メチルウンベリフェリル(４−ＭＵ)基質も使用した。これらの基質は、コロニー形成後に１μｇ／ｍｌの濃度で選択プレートの表面に噴霧してもよく、または１.５％寒天に添加しコロニー含有選択プレートに重層させてもよい。噴霧または重層後に、活性エキソグリコシダーゼを産生するコロニーを、長波紫外光(３６６ｎｍ)でコロニーを観察することによって同定した。この実験では、４−ＭＵ基質の混合物を１.５％寒天に添加して重層させた。混合物としては、４−ＭＵ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、４−ＭＵ−β−Ｄ−マンノピラノシド、４−ＭＵ−α−Ｄ−グルコシド、４−ＭＵ−β−Ｄ−グルコシド、４−ＭＵ−α−Ｄ−ガラクトシドを使用した。これらの基質の１つを開裂し得る活性β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼまたはα−ガラクトシダーゼを産生するコロニーはＵＶ光下で青色の蛍光を発するであろう。これらの基質を用いてスクリーニングした２×１０４個のコロニーから、８つの蛍光コロニーを単離した。３つの単離コロニーはα−ガラクトシダーゼを産生し、２つはβ−グルコシダーゼを産生し、１つはβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを産生し、残りの２つは、夫々の４−ＭＵ基質開裂能力及び夫々のｐ−ニトロフェニル基質開裂能力から判断して検出可能なエキソグリコシダーゼ活性を有していなかった。
【０１６２】
エキソグリコシダーゼ活性を発現するが合成基質を開裂しないクローンをスクリーニングするためには他の方法を使用しなければならない。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来のα−マンノシダーゼＩまたはＩＩを発現するクローンをスクリーニングするためには、分画平板培養培地を使用した。使用した培地は、ラクトースを炭素ソースとして利用できない大腸菌突然変異体(ｌａｃ−)をスクリーニングするために使用したＥＭＢ寒天の変種である。旧来のＥＭＢ寒天はラクトースと２種類の指示色素、エオシンイエロー及びメチレンブルーを含む。ラクトースを発酵させ得る大腸菌の株(ｌａｃ＋)がＥＭＢ寒天上で増殖するとき、コロニーは暗紫色から黒色を呈する。しかしながら、ｌａｃ−コロニーは、ラクトースを発酵させることができないので白色である。α−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、培地１リットルあたり１００ｍｇのカルベニシリン、０.４ｇのエオシンイエロー、０.０６５ｇのメチレンブルー及び１ｇのα−マンノビオースを含有するＭ９最小培地にライブラリー(上記)を約３０,０００ｃｆｕ／ｍｌの濃度で平板培養した。マンノビオースを宿主によって発酵されるマンノースに開裂するクローン化α−マンノシダーゼを発現しない大腸菌は、二糖マンノビオース(マンノースα１−６マンノース)を炭素ソースとして利用することができない。プレートを３７℃で２〜４日間インキュベートした。１５,０００ｃｆｕで平板培養したコロニーのうちの１１個のコロニーが濃紫色を呈した。これらのコロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天上に単離コロニーとして画線培養し、３７℃で増殖させた。試験した１１個のコロニーのうちで、２つのコロニーからの粗抽出物がα１−３,６マンノシダーゼ(ＭａｎＩ)活性を示した。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから他のマンノシダーゼ(α１−２,３及びα１−６特異的)を発現するクローンは単離されなかった。この方法は、合成基質を開裂しない他のエキソグリコシダーゼを単離するために使用できる。以下の制約だけがある。(１)エキソグリコシダーゼが存在しなければ宿主は二糖、三糖またはオリゴ糖を利用できない。(２)エキソグリコシダーゼによって遊離された糖は大腸菌が利用できる唯一の炭素ソースでなければならない、(３)エキソグリコシダーゼを発現する宿主を増殖させる寒天ベースに十分な量で添加できる量の糖基質を入手しなければならない。
【０１６３】
本発明をいくつかの好ましい実施態様について説明したが、本発明の要旨及び範囲はこれらの記載に限定されない。例えば、適正に標識された基質に対して細胞抽出物をスクリーニングするエンドグリコシダーゼの単離は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓからの一般的なグリコシダーゼ単離方法に包含される。更に、適正に標識された基質を用いたエンドグリコシダーゼのクローニングは、一般的なグリコシダーゼクローニング方法に包含される。
【実施例６】
【０１６４】
酵素アッセイ基質の調製
： オリゴ糖のＡＭＣ−標識
基質は、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ.(Ｗｅｓｔｂｕｒｙ,Ｎ
Ｙ),Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ Ｌａｂｓ(Ｗａｕｋｅｇａ,ＩＬ),Ｖ−Ｌａｂｓ,Ｉｎｃ.,(Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ,ＬＡ)から購入するか、または、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ(１９８６)Ｅｄｓ.Ｃｈａｐｌｉｎ,Ｍ.Ｆ.ＫｅｎｎｅｄｙＪ.Ｆ.(ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ,Ｅｎｇｌａｎｄ)ｐｐ.１５０−１５１)から参照によって本明細書に含まれる方法に従って単離した。調製用シリカゲル６０プレート(１,０００μｍ厚、２０×２０ｃｍ)はＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ(Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ,ＮＪ)から得られた。７−アミノメチルクマリン(ＡＭＣ)はＥａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ(Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ,ＮＹ)から得られた。西洋ワサビペルオキシダーゼはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ(Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ,ＭＯ)から購入した。
【０１６５】
オリゴ糖(０.１〜５.０μモル)を、１００μｌのＨ２Ｏに溶解した。３００μｌのメタノール、２０ｍｇの７−アミノメチルクマリン(ＡＭＣ)、３５ｍｇのＮａＣＮＢＨ３及び４１μｌの氷酢酸を含む溶液に糖質水溶液を添加した。混合物をネジ蓋付き遠心管にシールし、乾燥器に入れて８５℃で４５分間加熱した。反応物をＨ２Ｏで平衡させたＳｅｐｈａｄｅx Ｇ−２５カラム(２×５０ｃｍ)に充填した。生成物をＨ２Ｏで溶出させ、１ｍｌの画分を収集した。後述するようにＴＬＣによって画分の純度を検定した後で、適当な画分をプールし、０.１〜１μモル／ｍｌに真空濃縮し、−２０℃で保存した。
【０１６６】
西洋ワサビペルオキシダーゼから得られたオリゴ糖は、加ヒドラジン分解及び再アセチル化によってタンパク質から遊離された(Ａ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ(１９８６)Ｅｄｓ.Ｃｈａｐｌｉｎ,Ｍ.Ｆ.Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｊ.Ｆ.(ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ,Ｅｎｇｌａｎｄ)、前出)。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム(２.５×３ｃｍ)で糖質を脱塩した後、マイクロタイタープレートフォーマットを用いて修飾された中性糖(Ｄｕｂｏｉｓら,１９５６,Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ.,２８：３５０−３５６)によって画分を検定した。要約すると、サンプルをＨ２Ｏで最終容量９０μｌに調整した。５μｌの８５％フェノール／Ｈ２Ｏ(ｖ：ｖ)を添加し、次いで１８０μｌのＨ２ＳＯ４を速やかに添加した。ＯＤ４９０で吸光度を読み取って糖濃度を測定した。種々の濃度のマンノースを使用して標準曲線を作成した。オリゴ糖含有画分をプールし上記のように標識した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５クロマトグラフィー処理後、調製用吸収層クロマトグラフィーを用いてサンプルを１,０００μｍ厚の２０×２０ｃｍ準備用シリカゲル６０プレートに画線培養することによって更に精製した。イソプロパノール：エタノール：Ｈ２Ｏ(２.３：１.０：０.７、ｖ：ｖ：ｖ)中で更にクロマトグラフィー処理した後、適当なバンドを切除し、シリカを粉砕した。５０％イソプロパノール：水(ｖ：ｖ)で溶出剤が蛍光を発光しなくなるまでシリカを洗浄することによって糖質を溶出させた。溶出剤を０.１μモル／ｍｌに真空濃縮し、−２０℃で保存した。オリゴ糖構造(Ｋｕｒｏｓａｋａ,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.(１９９１)２６６：４１６８−４１７２)をエキソグリコシダーゼ消化及びＴＬＣ分析によって以下のごとく確認した。
【実施例７】
【０１６７】
グリコシダーゼ活性に基づく生物のスクリーニング方法
Ｆガラス裏面をもたないシリカゲル６０のＴＬＣプレートをＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ(Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ,ＮＨ)から購入した。ｐ−ニトロフェニルグリコピラノシドをＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.(Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ,ＭＯ)から購入した。対照グリコシダーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ(Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ,ＩＮ)、Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｙｓｔｅｍｓ(Ｒｏｓｅｄａｌｅ,ＮＹ)またはＳｅｉｋａｇａｋｕ(Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ,ＭＤ)から得られた。カラム及びクロマトグラフィー試薬は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ(Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ,ＮＹ)またはＴｏｓｏＨａａｓ(Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ,ＰＡ)から購入した。
【０１６８】
スクリーニングアッセイ用細胞抽出物の調製
細胞ペースト(０.１〜０.５ｇ)を解凍し、３倍容のバッファＡ'(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７.５]、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ)に懸濁させた。短時間の音波処理後、細胞懸濁液をエッペンドルフ微量遠心管で１４,０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心した。
【０１６９】
グリコシダーゼ消化反応
細胞抽出物、細胞増殖培地または部分精製抽出物のグリコシダーゼ活性を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５.５(種々のｐＨ及び補因子、表５参照)中の１ナノモルのＡＭＣ−標識オリゴ糖を含む１０μｌの混合物に１〜５μｌ添加することによって検定した。３７℃で５分〜２０時間の範囲の期間インキュベーション後、反応物を後述するようにＴＬＣによって分析した。β−キシロシダーゼ活性の最終収量を定量するために、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４.５中のＸｙｌβ１−４Ｘｙｌβ１−４Ｘｙｌβ１−４Ｘｙｌ−Ｃｏを基質として使用した。３７℃、１時間でオリゴ糖基質から１ナノモルの末端キシロースを遊離するために必要な酵素の量を１単位のβ−キシロシダーゼと定義する。β−マンノシダーゼ活性の最終収量を定量するために、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを補充した５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５.５中のＭａｎβ１−４Ｍａｎβ１−４Ｍａｎ−Ｃｏを基質として使用した。３０℃、１時間でオリゴ糖基質から１ナノモルの末端マンノースを遊離するために必要な酵素の量を１単位のβ−マンノシダーゼと定義する。
【０１７０】
ＡＭＣ−標識オリゴ糖類の消化産物の薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)による分析
ガラス裏面をもつシリカゲルＴＬＣプレート上に少量のグリコシダーゼ消化反応物(２〜３μｌ)を緻密なバンドとして滴下した。バンドを温風ガン(温度７０℃以下)で完全に乾燥した。イソプロパノール：エタノール：Ｈ２Ｏ(２.５：１.０：０.５、ｖ：ｖ：ｖ)中で溶媒前縁が１０ｃｍ移動するまでプレートを展開させた。クロマトグラフィー処理後、原点の近傍に残存するＡＭＣ−基質、及び、移動相と共に上方に泳動した加水分解産物を、３１４ｎｍのＵＶランプで可視化した。非消化の二糖(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ)、四糖(Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)及び六糖(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６[Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３]Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)のマーカーを対照として用いた。非消化の基質も対照として用いた。
【０１７１】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓの種々の細菌株からのＭａｎα１−６(Ｍａｎα１−３)(Ｘｙｌβ１−２)Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４(Ｆｕｃα１−３)ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏに対して細胞抽出物をスクリーニングした結果を図１３に示す(表３及び４参照)。Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株からの細胞抽出物は活性がないことを示したが、１つの菌株Ｘ.ｍａｎｉｈｏｔｉｓからの細胞抽出物はＡＭＣ−基質から３つの糖を除去できた。他の２つの菌株Ｘ.ｈｏｌｉｃｏｌａ及びＸ.ｏｒｙｚａｅからの細胞抽出物は４つの糖を除去することが可能であり、これはα−マンノシダーゼ、β−キシロシダーゼ、及びα−フコシダーゼまたはβ−マンノシダーゼ活性の存在を示唆する。
【実施例８】
【０１７２】
ｐ−ニトロフェニルグリコシド基質を用いる生物のスクリーニング
エキソグリコシダーゼは典型的には、ｐ−ニトロフェニルグリコピラノシドのような誘導体化された単糖を基質として同定及び精製された(Ｈａｙｗａｒｄ,Ａ.Ｃ.(１９７７)Ｊ.Ａｐｐｌ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.４３：４０７−４１１)。これらの基質は、特異的単糖をそのアノマー性と共に認識し得る酵素の能力に関する情報を与える。しかしながら、単糖は第２の糖に結合せずむしろ色素産生マーカーに結合するので、酵素の結合特異性に関する情報は全く得られない。単糖誘導体を開裂し得るグリコシダーゼはしばしば、糖残基がオリゴ糖の一部であるときに糖残基を加水分解できない(Ｔａｌｂｏｔ,Ｇ. ＆ Ｓｙｇｕｓｃｈ,Ｊ.(１９９０)Ａｐｐｌ.Ｅｎｖｉｒｏｎ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.５６：３５０５−３５１０)。
【０１７３】
Ｈａｙｗａｒｄ(前出)によって証明されたように、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ菌株は複数のｐ−ニトロフェニルグリコピラノシド基質を開裂するであろう。実施例２のように調製した細胞抽出物(５μｌ)を、２５０ナノモルのｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グリコピラノシド、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−キシロピラノシドまたはｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを含む２５μｌの５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５.５と共に３７℃で４時間インキュベートした。７５μｌのホウ酸ナトリウムｐＨ９.８を添加して反応を停止させ、反応混合物の吸光度を４１０ｎｍで測定した。Ｘ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの２つの菌株ＮＥＢ４２０及びＮＥＢ４９７に対するこのスクリーニングアッセイの結果を図１４に示す。双方の菌株が、試験した全部のｐ−ニトロフェニルグリコピラノシド基質を開裂し、これは、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ及びβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の存在を示唆する。
【０１７４】
しかしながら、実施例２に記載のようにＡＭＣ−基質を使用したとき、２つの菌株の細胞抽出物は図１４及び図１５に示すようにα−及びβ−グルコシダーゼ活性だけを示した。５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５.５中に１ナノモルのＡＭＣ−基質を含む１０μｌの反応混合物に細胞抽出物(５μｌ)を３７℃で４時間添加し、実施例２に記載の手順でＴＬＣによって分析した。図１５は、細胞抽出物ＮＥＢ４２０及びＮＥＢ４９７を、基質２０２：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ(夫々レーン２及び３)、１６７：Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ(夫々レーン５及び６)、１８０：Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ(夫々レーン８及び９)、１７９：Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ(夫々レーン１１及び１２)、及び２３３：ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ(夫々レーン１４及び１５)に対して試験した結果を示す。非消化の基質(レーン１、４、７及び１０)を対照として用いた。図１５において、レーン８、９、１１及び１２だけが末端単糖の遊離を示した。レーン８及び９は、α−グルコースの除去を示し、レーン１１及び１２はβ−グルコースの遊離を示し、これらは、双方の菌株にα−及びβ−グルコシダーゼ活性が存在することを示唆する。他の全部のＡＭＣ−基質は２つのＸ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ菌株からの細胞抽出物とインキュベートしたときに加水分解耐性であり、これによって、特定の単糖誘導体について測定したグリコシダーゼ活性は、この糖残基がオリゴ糖の一部であるときは必ずしも糖残基に対する活性に翻訳されないことを示す。同様に、オリゴ糖基質を開裂する能力が発見されたグリコシダーゼは、誘導体化された単糖を必ずしも加水分解しない(Ｓａｎｏら,(１９９２)Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：１５２２−１５２７)。
【実施例９】
【０１７５】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ Ｈｏｌｃｉｃｏｌａからのグリコシダーゼの精製方法
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｌｃｉｃｏｌａの発酵
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｌｃｉｃｏｌａ菌ＮＥＢ１２１株(ＡＴＣＣ＃１３４６１)を、１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ及び０.３ｇ／ｌのＮａＯＨから成る培地中で増殖させた。細胞を通気及び撹拌を伴って後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心によって採取し、−７０℃で凍結保存した。
【０１７６】
粗抽出物の調製
以後の手順はすべて氷上または４℃で行った。上記で得られた細胞ペースト(１９１ｇ)を２倍容のバッファＡ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７.５]、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ)に懸濁させた。細胞懸濁液をＧａｕｌｉｎホモジナイザー(Ｍ−１５モデル)に１２,０００ｐｓｉで２回通した。溶菌液をＳｈａｒｐｌｅｓ連続遠心管で１,３００ｇで４０分間遠心した。５６５ｍｌの上清が得られた。
【０１７７】
グリコシダーゼの精製
酵素を疎水性及び電荷に従って分画する一連の分離方法を使用して、粗細胞抽出物からグリコシダーゼを分離及び精製した。表５に記載の条件を用い実施例７に記載の方法に従って酵素を検定した。
【０１７８】
粗抽出物(５６５ｍｌ)をバッファＢで平衡させたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(５.０×１５ｃｍ)に充填した。β−キシロシダーゼ及びβ−マンノシダーゼの双方を含有するカラム通過物を、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(２.６×１５ｃｍ)に導入した。カラムを１６０ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、４００ｍｌのバッファＡ中のＮａＣｌの直線勾配(０.０５−０.９５Ｍ)によって処理した(流速１ｍｌ／分；８ｍｌ画分)。ＮａＣｌ勾配(０.３５−０.６Ｍ)で溶出したβ−キシロシダーゼを含有する画分をプールし、酵素をＡ項に記載の手順で更に精製した。β−マンノシダーゼ活性はヘパリンカラム通過物中に存在し、これをＢ項に記載の手順で更に精製した。
【０１７９】
Ａ.β−キシロシダーゼ
上記の酵素プールをバッファＡに２時間透析し、次いでバッファＡで平衡させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１２ｃｍ)に導入した。酵素活性を含有するカラム通過物を、バッファＣ(２０ｍＭのリン酸カリウム[ｐＨ６.０]、２５ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ)に２時間透析し、バッファＣで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＣで洗浄し、次いで、１５０ｍｌのバッファＣ中のＮａＣｌの直線勾配(０.０２５−０.９５Ｍ)で処理した(流速１ｍｌ／分；２ｍｌの画分)。酵素は０.４−０.５５Ｍに溶出し、プールした画分をバッファＡに２時間透析した。透析後、プールをバッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに充填した。カラムを６ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで９０ｍｌのバッファＡ中のＮａＣｌの直線勾配(０.０５−０.９５Ｍ)で処理した(流速１ｍｌ／分；１ｍｌ画分)。酵素活性は０.２−０.３Ｍに溶出し、プールした画分をバッファＡに一夜透析した。ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、次いで酵素を４℃で保存した。４,０００単位の収量の実質的に純粋な酵素が得られた。
Ｂ.β−マンノシダーゼ
(ＮＨ４)２ＳＯ４(６６ｇ)をカラム通過物(５００ｍｌ)に最終濃度１Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４となるまで添加し、バッファＢ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７.５]、０.９５Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０.１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ)で平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１５ｃｍ)に導入した。カラムを１６０ｍｌのバッファＢで洗浄し、次いで８００ｍｌのバッファＢ中の(ＮＨ４)２ＳＯ４の漸減直線勾配(０.０９５−０.００１Ｍ)で処理した。酵素が０.９−０.７Ｍに溶出し、プールした画分をバッファＣに４時間透析した。プールした酵素を、バッファＣで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に充填した。カラムを２０ｍＭのバッファＣで洗浄し、次いで１５０ｍｌのバッファＣ中のＮａＣｌの直線勾配(０.０２５−０.９５Ｍ)で処理した(流速１ｍｌ／分、２ｍｌ画分)。プールした酵素をバッファＤ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７.５]、２５ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭ
のＮａ２ＥＤＴＡ)に４時間透析し、次いでバッファＤで平衡させたＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５(１ｍｌ)のカラムに導入した。活性はカラム通過物中で検出された。０.８ｇの(ＮＨ４)２ＳＯ４を通過物に添加し、次いで、バッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０(８ｍｌ)カラムに導入した。活性はカラム通過物中で検出された。０.８ｇの(ＮＨ４)２ＳＯ４を最終濃度１.５Ｍに添加し、次いで、バッファＥ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７.５]、２.０Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０.１ｍＭのＮ
ａ２ＥＤＴＡ)で平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０カラムに導入した。カラムを１０ｍｌのバッファＥで洗浄し、次いで１００ｍｌのバッファＥ中の(ＮＨ４)２ＳＯ４の漸減直線勾配(２.０−０.０２Ｍ)で処理した(流速１ｍｌ／分、１.５ｍｌ画分)。酵素活性は１.０−０.８５Ｍに溶出し、プールした画分をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮装置(Ａｍｉｃｏｎ,Ｉｎｃ.Ｂｅｖｅｒｌｙ,Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ)を用いて１ｍｌに濃縮した。濃縮した酵素をバッファＡに一夜透析した。ナトリウムアジド(０.２％)及びＢＳＡ(０.１ｍｇ／ｍｌ)を添加し、酵素を４℃で保存した。５００単位の収量の実質的に純粋な酵素が得られた。
【実施例１０】
【０１８０】
グリコシダーゼの特性決定
Ａ.β−キシロシダーゼ
図１６は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｌｃｉｃｏｌａから単離されたβ−キシロシダーゼが、ＡＭＣ−基質３００：Ｍａｎα１−６(Ｍａｎα１−４)(Ｘｙ１β１−２)(Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４(Ｆｕｃα１−３)ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ(レーン１−４)、及び、２６４：Ｘｙ１β１−４Ｘｙ１β１−４Ｘｙ１β−４−Ｃｏ(レーン５及び６)を開裂する能力を示す。５ｍＭのＣａＣｌ２を補充した５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６.０中に１ナノモルのＡＭＣ−基質３００(レーン３及び４)を含むか、または、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４.５中に１ナノモルのＡＭＣ−基質２６４(レーン６)を含む１０μｌの反応混合物に５単位のβ−キシロシダーゼを添加した。β１−３キシロシル結合がβ−キシロシダーゼによって加水分解されるいくつかの反応物は、Ｘ.ｍａｎｉｈｏｔｉｓから単離された２単位のα１−２,３マンノシダーゼ(実施例４)を含んでいた(レーン２及び４)。非消化の基質を対照として用いた(レーン１及び５)。二糖１９１：Ｇａｌα１−３Ｇａｌ−Ｃｏ及び四糖２０２：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏをマーカー(Ｍ)として用いた。反応物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで実施例２に記載の手順でＴＬＣによって分析した。図１６に示すように、β−キシロシダーゼは反応物にα１−２,３マンノシダーゼが含まれているときにのみ(レーン２及び３)ＡＭＣ−基質３００のβ１−２結合を開裂した(レーン３)。α−マンノシダーゼ非含有でインキュベートしたときは開裂が全く観察されなかった(レーン４)。β−キシロシダーゼはまたＡＭＣ−基質２６４のβ１−４結合を開裂した。
【０１８１】
Ｂ.β−マンノシダーゼ
図１７は、β−マンノシダーゼがＡＭＣ−基質２５９：Ｍａｎ１−４Ｍａｎ１−４Ｍａｎ−Ｃｏ(レーン１及び２)、及び、３００：Ｍａｎα１−６(Ｍａｎα１−４)(Ｘｙ１β１−２)Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４(Ｆｕｃα１−３)ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ(レーン３−８)を開裂する能力を示す。５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５.５中に１ナノモルのＡＭＣ−基質２５９(レーン２)を含むかまたは５ｍＭのＣａＣａｌ２を補充した５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６.０中に１ナノモルのＡＭＣ−基質３００(レーン７及び８)を含む１０μｌの反応混合物に２.５単位のβ−マンノシダーゼを添加した。β１−４マンノシル結合がβ−マンノシダーゼによって加水分解されるいくつかの反応物は、Ｘ.ｍａｎｉｈｏｔｉｓ(実施例４)から単離された２単位のα１−２,３マンノシダーゼ(レーン４−７)、Ｘ.ｈｏｌｃｉｃｏｌａ(上記)から単離された２単位のβ−キシロシダーゼ(レーン５−７)、Ｘ.ｍａｎｉｈｏｔｉｓ(実施例４)から単離された１０単位のα１−６マンノシダーゼ(レーン６及び７)を含んでいた。非消化基質を対照として用いた(レーン１及び３)。二糖１９１：Ｇａｌα１−３Ｇａｌ−Ｃｏ及び四糖２０２：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏをマーカー(Ｍ)として用いた。反応物を３０℃で２時間インキュベートし、次いで実施例２に記載の手順でＴＬＣによって分析した。図１７に示すように、β−マンノシダーゼは、反応物にα１−２,３マンノシダーゼ、β−キシロシダーゼ及びα１−６マンノシダーゼが含まれているときにのみＡＭＣ−基質３００のβ１−４結合を開裂した(レーン７)。これらの酵素を伴わずにインキュベートしたときは開裂が全く観察されなかった(レーン８)。β−マンノシダーゼはまたＡＭＣ−基質２５９のβ１−４結合を開裂した(レーン２)。
【実施例１１】
【０１８２】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅからβ−マンノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼを精製する方法
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅの発酵
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ菌ＮＥＢ４１６株をＤｉｆｃｏ栄養ブイヨンで増殖させた。通気及び撹拌を伴って細胞を３０℃で後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心分離によって採取し、−７０℃で凍結保存した。
【０１８３】
β−マンノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼの精製
１００リットルの発酵物から得られた３７８ｇのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ細胞からβ−マンノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼを精製した。細胞を１,１４４ｍｌのバッファＡ(２０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.５、５０ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させ、Ｇａｕｌｉｎプレスを通すことによって溶解した。Ｓｈａｒｐｌｅｓ遠心管中の遠心分離によって細胞破片を除去した。上清をバッファＡで平衡させたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム(５.０×１６.０ｃｍ)に通した。カラムを１,５００ｍｌのバッファＡで洗浄した。ＤＥＡＥカラムの通過物と洗浄液の最初の５００ｍｌとを収集し、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂカラム(２.５×２９.０ｃｍ)に充填した。Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを７５０ｍｌのバッファＡで洗浄した。β−マンノシダーゼを精製するために、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから収集した通過物及び洗浄液(２,３００ｍｌ)に１,２０３ｇの硫酸アンモニウムをゆっくりと添加し、硫酸アンモニウムの濃度を８０％飽和にした。沈殿物を撹拌しながら４℃で一夜インキュベートした。１５,０００×ｇで２０分間遠心分離することによって沈殿物を収集した。ペレットを３５０ｍｌのバッファＡに再懸濁させ、１Ｍの硫酸アンモニウムを含有するバッファＢ(２０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.５及び１ｍＭのＥＤＴＡ)に一夜透析した。透析後に残存する沈殿物を１５,０００×ｇで２０分間遠心分離することによって完全に除去した。次のカラムがオーバーロードにならないように、上清(２７０ｍｌ)を２組に分け、以後は等しく処理した。１３５ｍｌの上清を、１Ｍの硫酸アンモニウムを含有するバッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６高速流(ｌｏｗ ｓｕｂ)カラム(２.５×２９ｃｍ)に充填した。Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを、１Ｍの硫酸アンモニウムを含有する１,０００ｍｌのバッファＢで洗浄した。１Ｍ−０.０５Ｍの硫酸アンモニウムの漸減直線勾配でカラムからβ−マンノシダーゼを溶出させた。１４ｍｌの画分を流速２ｍｌ／分で収集し、活性を検定した。０.６−０.５Ｍ硫酸アンモニウムに溶出する活性のピークをプールし、バッファＣ(２０ｍＭのＫＰＯ４,ｐＨ６.０、０.１ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのＮａＣｌ)に透析し、バッファＣで平衡させたＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.５×１０ｃｍ)に充填した。カラムを８０ｍｌのバッファＣで洗浄し、酵素を０.０１−０.９５ＭのＮａＣｌ直線勾配でカラムから溶出させた。３ｍｌの画分を流速１ｍｌ／分で収集した。０.１５〜０.１３Ｍに溶出する活性のピークをプールし、１Ｍの硫酸アンモニウムを含有するバッファＢに４時間透析した。透析したプールを１Ｍの硫酸アンモニウムを含有するバッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０カラムに充填した。１Ｍの硫酸アンモニウムを含有するバッファＢでカラムを洗浄し、酵素を１Ｍ−０.０５Ｍの硫酸アンモニウムの漸減直線勾配でカラムから溶出させた。１.５ｍｌの画分を流速１ｍｌ／分で収集し、活性を検定した。０.７−０.６Ｍの硫酸アンモニウムに溶出する活性のピークをプールし、０.０２％のナトリウムアジドを含有するバッファＡに透析し、酵素を４℃で保存した。実質的に純粋なβ−マンノシダーゼの収量は１.２×１０３単位であった。
【０１８４】
実質的に実施例９に記載のプロトコルに従ってＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅからβ−キシロシダーゼを精製した。実施例７に記載の方法に従って測定した収量は５００単位であった。
【０１８５】
精製したβ−マンノシダーゼの特性決定
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅから上記の手順で精製した１０単位のβ−マンノシダーゼは、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファｐＨ５.４中で補因子の非存在下に０.５ナノモルの基質(Ｍａｎβ１−４Ｍａｎβ１−４Ｍａｎ−Ｃｏと反応することが判明した。酵素は４.５〜６.０のｐＨ範囲で同様に活性であった。３７℃で１時間インキュベーションを実施した。
【０１８６】
β−マンノシダーゼ遺伝子のクローニング
１.ＤＮＡ精製：Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅのＤＮＡを調製するために、１ｇの細胞ペーストを３ｍｌの０.３Ｍショ糖、２５ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ８.０)、２５ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍｇ／ｍｌのリゾチームに再懸濁させた。懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、４ｍｌの２×Ｋｉｒｂｙミックス[２ｇのトリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、１２ｇの２−アミノ−サリチル酸ナトリウム、５ｍｌの２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ８、６ｍｌのフェノール(Ｔｒｉｓ,ｐＨ８.０で中和)]を細胞懸濁液に添加し、渦流ミキサーで１分間撹拌した。中和フェノールとクロロホルムとの１：１混合物(フェノール／クロロホルム)８ｍｌを管に添加し、混合物を１５分間撹拌した。細胞溶解液を１２,０００×ｇで１０分間遠心処理した。水相を３ｍｌのフェノール／クロロホルムを入れた新しい管に移し、渦流ミキサーで１５秒間撹拌した。懸濁液を１２,０００×ｇで１０分間遠心した。上方の相を新しい管に移し、１／１０倍容の３Ｍの酢酸ナトリウムと等容量のイソプロパノールとを管に添加した。管を倒立させて管の内容物を混合した。ＤＮＡの凝塊をシールしたパスツールピペットで管から取り出し、１０ｍｌの７０％エタノールを入れた管に移した。ＤＮＡを一度洗浄し、５ｍｌのＴＥ(１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０及び１ｍＭのＥＤＴＡ)に溶解し、ＲＮアーゼを最終濃度４０ｍｇ／ｍｌに添加した。ＤＮＡを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１.５ｍｌのフェノール／クロロホルムを１５秒間渦流させることによってＤＮＡ溶液と混合した。懸濁液を１２,０００×ｇで１０分間遠心し、水相を新しい管に移した。１／１０倍容の３Ｍの酢酸ナトリウムと等容量のイソプロパノールとを水相に添加した。ＤＮＡの凝塊をシールしたパスツールピペットで管から取り出し、１０ｍｌの７０％エタノールを入れた管に移した。ＤＮＡを一度洗浄し、２ｍｌのＴＥに溶解させた。
２.部分消化：精製したＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで開裂して以下のごとく部分消化した。１０ｍＭのＢｉｓ Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ−ＨＣｌ,ｐＨ７.０、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオトレイトールバッファ中に７６μｇ／ｍｌの１２５μｌのＤＮＡを１００μｇ／ｍｌのＢＳＡと共に含む溶液を、４００μｌのアリコートと４つの２００μｌのアリコートとに分割した。４００μｌの管に２単位のＳａｕ３ＡＩを添加し、４.７５μｇのＤＮＡあたり１単位の酵素が含まれるようにした。第１の管から２００μｌを取り出して第２の管に移し、４.７５μｇあたり０.５単位のＳａｕ３ＡＩが含まれるようにし、以後同様にして、連続する管の各々が直前の管の半量のＳａｕ３ＡＩを含むようにした。管を３７℃で１５分間インキュベートし、７２℃で１５分間熱処理し、次いで、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡバッファ中の０.７％アガロースゲルで電気泳動にかけた。ＤＥＡＥアニオン交換濾紙に２時間電気泳動させることによって約９〔２ｋｂ範囲の大きさのＤＮＡフラグメントを収集した。０.１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのバッファ中で濾紙を２回洗浄した。次いで、１.０ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む７５μｌのバッファ中で濾紙を４回洗浄することによって濾紙からＤＮＡを溶出させた。得られたＤＮＡフラグメント含有溶液を３００μｌのフェノール／クロロホルムで抽出し、次いで３００μｌのクロロホルムで抽出し、ドライアイス／エタノール浴に１５分間入れることによって１ｍｌの無水エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを１４Ｋｒｐｍで５分間ペレット化した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、風乾し、最終容量１０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８及び１ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁させた。精製したフラグメントを以下の段階３で使用した。
３.結合：フラグメント化したＤＮＡを以下の手順でｐＵＣ１９に結合した。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した３μｇのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ＤＮＡ(１０μｌ)を、１.５μｇのＢａｍＨＩ開裂し脱リン酸化したｐＵＣ１９(１μｌ)と混合した。４μｌの１０×結合ミックス(５００ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.５、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＡＴＰ)を添加し、更に２５μｌの滅菌蒸留水を添加して最終容量を３９μｌとした。１μｌの濃縮Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(２×１０６Ｕ／ｍｌ)を添加し、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。１０μｌの結合物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＶＳ ０.０２５μＭフィルターを用いて滴下透析することによって脱イオン化した。次に、ＤＮＡを大腸菌ＥＤ８７６７に電気穿孔した。電気穿孔の準備として１リットルの大腸菌細胞をＬブイヨン中でＫｌｅｔｔ５０−８０まで増殖させた。細胞を氷上で１５〜３０分間冷却し、次いで低温下で４,０００ｒｐｍで１５分間ペレット化した。ペレットを氷冷滅菌水中で２回及び１０％グリセロール中で１回洗浄した。洗浄したペレットを１〜２ｍｌの１０％グリセロールに最終細胞濃度３×１０１０細胞／ｍｌに再懸濁させた。必要になるまで細胞を１００μｌのアリコートにして−７０℃で凍結した。準備した細胞にＤＮＡを電気穿孔するために、細胞を静かに解凍し、氷に載せた。４０μｌの細胞と１０μｌの結合及び透析したＤＮＡとを混合した。混合物を低温の０.２ｃｍの電気穿孔キュベットに入れた。時定数４〜５ミリ秒で１２.５ｋＶ／ｃｍの電気パルスをＤＮＡ細胞混合物に印加した。大腸菌を直ちに１ｍｌのＬブイヨンに希釈し、３７℃で３０分間増殖させ、選択培地を含む１５０ｍｍのＬ寒天プレートで平板培養した。３７℃で一夜インキュベーション後、β−マンノシダーゼを発現するクローンを以下の手順でスクリーニングした。
４.β−マンノシダーゼクローンのスクリーニング。パラ−ニトロフェニル糖のような合成基質を開裂し得るβ−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、先ず、色素産生基質４−メチルウンベリフェリル(４−ＭＵ)β−Ｄ−マンノピラノシドを試験した。この基質を１.５％寒天に添加し、コロニーを含む選択プレートに重層した。重層後、長波紫外光(３６６ｎｍ)でコロニーを観察することによって活性β−マンノシダーゼを産生するコロニーを同定し得る。この実験では２×１０４コロニーをこの基質を用いてスクリーニングしたが、蛍光コロニーは単離されなかった。この方法でクローンが全く単離されなかったので、他の方法を使用しなければならなかった。Ｘ.ｏｒｙｚａｅのβ−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、分画平板培養培地を使用した。使用した培地はラクトースを利用できない炭素ソースとして大腸菌突然変異体(ｌａｃ−)をスクリーニングするために使用したＥＭＢ寒天の変種である。旧来のＥＭＢ寒天はラクトースと２種類の指示色素、エオシンイエロー及びメチレンブルーを含む。ラクトースを発酵させ得る大腸菌の菌株(ｌａｃ＋)をＥＭＢ寒天で増殖させたときに、コロニーは暗紫色から黒色を呈するが、ｌａｃ−大腸菌コロニーはラクトース発酵能力がないので白色である。β−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、ライブラリー(上記)を１００ｍｇのカルベニシリン、０.４ｇのエオシンイエロー、０.０６５ｇのメチレンブルー及び１ｇのα−マンノビオースを培地１リットルあたりに含むＭ９最小培地に約３０,０００ｃｆｕ／ｍｌの濃度で平板培養した。二糖マンノビオース(マンノースβ−１−４マンノース)は、マンノビオースを宿主によって発酵させられるマンノースに開裂するクローン化したβ−マンノシダーゼを発現しなければ大腸菌によって炭素ソースとして利用されない。プレートを３７℃で７日間インキュベートした。１５,０００ｃｆｕの平板培養コロニーのうちの２つのコロニーが、暗赤色を呈した。これらのコロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天上で単離コロニーとして画線培養し、３７℃で増殖させた。単離コロニーをアンピシリン含有の５ｍｌのＬＢに採取し、３７℃で６時間増殖させた。２つの試験コロニーのうちで、一方からの粗抽出物はβ−マンノシダーゼ活性を示した。アンピシリン含有ＬＢに採取し３７℃で１８時間増殖させた単離コロニーから調製した粗抽出物はβ−マンノシダーゼ活性を全く示さなかった。この方法は、合成基質を開裂しないかまたは大腸菌中で不安定な他のグリコシダーゼ(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓからのエキソ−α１−６マンノシダーゼ及びエキソ−α１−２,３−マンノシダーゼ)を単離するために使用された。以下の制約だけが存在する。(１)エキソ−グリコシダーゼが存在しなければ宿主は二糖、三糖またはオリゴ糖を利用できない。(２)エキソ−グリコシダーゼによって遊離された糖は大腸菌が利用できる唯一の炭素ソースでなければならない。(３)エキソ−グリコシダーゼを発現する宿主を増殖させる寒天ベースに十分な量で添加できる量の糖基質を入手しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】２つの単糖間に形成されることが可能なグリコシド結合を示す。
【図２】グリコシド活性の存在を判定するためにＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓの粗抽出物をオリゴ糖基質と共にインキュベートした結果を示す。
【図３】酵素濃度を測定するために倍加系列希釈の精製酵素を用いて行ったα１−３,６ガラクトシダーゼの基質(１０９)に対する力価の測定を示す。
【図４】基質１２０、９５及び１１３を用いて行ったα１−２フコシダーゼ(ＩＩ)及びα１−３,４フコシダーゼ(Ｉ)のキャラクタリゼーションを示す。
【図５】直鎖状βＧｌｃＮＡｃ１−Ｘの選択的開裂をβＧａｌＮＡｃ１−Ｘとの比較によって証明するために基質１１８及び１６７を用いて行ったβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【図６】直鎖状及び分枝状の基質を用いて行ったβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【図７】付加的夾雑グリコシダーゼを含む市販のソースに由来のヘキソサミニダーゼとの比較によって行ったＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【図８】Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ１−３＞＞４ガラクトシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、Ｇａｌβ１−４Ｒ結合に比較したＧａｌβ１−３Ｒ結合に対する基質優先性が証明され、ニワトリ肝臓及びウシ睾丸から得られた市販の酵素との違いが示されている。
【図９】α１−３,６ガラクトシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、他のソース(コーヒー豆)から得られたガラクトシダーゼ中に見出されるＧａｌα１−４Ｒ結合に対する酵素活性の欠如を示す。
【図１０】直鎖状基質に対するα−マンノシダーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩの活性のキャラクタリゼーションを示す。
【図１１】分枝状基質上に対するα−マンノシダーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩの活性のキャラクタリゼーションを示す。
【図１２】Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−グルコシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、Ｇｌｕα１−４Ｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｒ結合に比較したＧｌｕβ１−４Ｒ結合に対する基質優先性が証明されている。
【図１３】グリコシダーゼ活性の存在を判定するために、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓの粗抽出物をオリゴ糖基質３００と共にインキュベートした結果を示す。
【図１４】グリコシダーゼ活性を測定するために、Ｘ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの粗抽出物をｐ−ニトロフェニルグリコシド基質と共にインキュベートした結果を示す。
【図１５】グリコシダーゼ活性の存在を判定するために、Ｘ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの粗抽出物をオリゴ糖基質と共にインキュベートした結果を示す。
【図１６】基質３００及び２６４を用いたＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−キシロシダーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【図１７】基質２５９及び３００を用いたＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−マンノシダーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なグリコシダーゼ類及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖質が生物体の生物活動の基幹的な役割を果たすことが認識されたため、糖質の研究が医学及び基礎科学で極めて重要視されるようになっている。分子が限りなく複雑で多様でありまた科学研究者が1つの形態を他の形態から識別できるような分析ツール及び合成ツールが入手可能でないため、糖質の研究は他の種類の生物分子の研究に立ち遅れている。
【発明の開示】
【０００３】
糖質の天然形態
実際、糖質は、グリコシド結合によって共有結合して分枝状及び直鎖状の高分子を形成する一連の単糖類から成り多糖類として知られる重合体として存在する。更に、多糖類、またはより一般的にオリゴ糖類は、タンパク質または脂質のような高分子に結合して糖タンパク質または糖脂質を形成し得る。天然に産する多糖類と違って、タンパク質または脂質と結合したオリゴ糖類は、単糖類の比較的小さいサブセットから成る。
【０００４】
糖タンパク質と結合したオリゴ糖類は、分子の生物学的特性が多様でありまた比較的短い単糖配列であるため研究し易いことを主な理由として、今日までの多くの糖質研究の中心的役割を果たしている。
【０００５】
糖タンパク質の構造的特徴
糖タンパク質は、タンパク質との結合に従って２つのグループに大別される。ムチン型オリゴ糖、プロテオグリカン型、コラーゲン型及びエクステンシン型のようなＯ−グリコシル結合したオリゴ糖は、Ｌ−セリンまたはＬ−トレオニンのヒドロキシル酸素に結合している。Ｎ−グリコシル結合したオリゴ糖は、一般にはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ(Ｘａａは任意のアミノ酸)の形態のトリペプチド中のアスパラギンのアミド窒素に結合している。Ｎ−結合したオリゴ糖は更に、高マンノース型、複合体型及びハイブリッド型の３つのサブグループに分類される。Ｎ−結合したオリゴ糖は多くの場合分枝状であり、分枝は一般にマンノース残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基で生じる。これらの分枝状構造は、分枝が２つの場合にはバイアンテナリーと呼ばれており、分枝が３つの場合にはトリアンテナリーと呼ばれている。
【０００６】
オリゴ糖はその単糖配列によって特性決定され得る。オリゴ糖は、その還元末端でタンパク質のアミノ酸残基に結合し、非還元末端はオリゴ糖の他端の末端単糖中に見出される。オリゴ糖の他の重要な特徴は、個々の単糖類を結合させているグリコシド結合である。グリコシド結合は、結合が生じる単糖環中の炭素に従って番号付けされる。炭素は右回り方向で１から６までの番号を有している。これらの炭素はいずれもグリコシド結合に関与し得るが、一般にはオリゴ糖の非還元末端に近い方の単糖の炭素１が還元末端に近い方の単糖の他の任意の炭素とグリコシド結合を形成する。単糖上の各炭素は不斉炭素であるから、グリコシド結合はαアノマーとβアノマーとから成る２つのアノマー配置で生じる。アノマー形態は炭素上の反応性ヒドロキシル基の位置によって決定される。図１は、２つの単糖間の可能な結合配置を示す。
【０００７】
オリゴ糖の合成及び分解
オリゴ糖は、グリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼとして知られる細胞中の酵素系によって合成される。典型的には、オリゴ糖が脂質キャリアーに集合し、グリコシル化されるタンパク質内部の適当なアミノ酸に転移される。次いで、グリコシダーゼによる切断及びグリコシルトランスフェラーゼに媒介される合成が生じ、個々の単糖または予め集成されたオリゴ糖ユニットが除去または付加される。更に、通常は加水分解酵素であるエキソグリコシダーゼが合成機能におけるトランスフェラーゼとして作用するときは微視的可逆性が生じ得る(Ｉｃｈｉｋａｗａら,１９９２,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.２０２：２１５−２３８)。いくつかの場合には、単糖の除去によって、次の鎖合成を容易にするようなコンホメーション変化が生じる(Ｃａｍｉｒａｎｄら,ｃｈ.,１９９２)。他の理論によって解釈できる可能性も否定はしないが、１種類のタンパク質のグリコシル化パターンが細胞内多様性を示す原因の１つは、任意の単一細胞中に種々の量及び種類の可用なグリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼが存在することにあると考えられる。
【０００８】
個々のグリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼの有効性は、細胞の栄養環境(Ｇｏｏｃｈｅｅ ａｎｄ Ｍｏｎｉｃａ １９９０,Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：６７−７１)、細胞の種類(Ｓｈｅａｒｅｓ ａｎｄ Ｒｏｂｂｉｎｓ １９８６,ＰＮＡＳ ８３：１９９３)及び細胞の恒常性状態(Ｋｏｂａｔａ １９８８,Ｇａｎｎ Ｍｏｎｏｇｒ.Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.３４：３−１３)に依存する。これらの細胞内酵素の量及び種類の多様性に関連して、単一糖タンパク質の多数の配糖形態が生じる(Ｐａｒｅｋｈら,１９８７,ＥＭＢＯ ６：１２３３−１２４４)。これらの配糖形態は、オリゴ糖配列、結合特性並びにオリゴ糖とタンパク質との結合部位の位置及び数などに違いを有している。構造的な不均一性は生物機能に衝撃を与える可能性があるので、種々の細胞中で得られる単一糖タンパク質のグリコシル化の多様性は、組換えタンパク質治療薬製造の重要な一面である(Ｓａｓａｋｉら,１９８７,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６２：１２０５９−１２０７６；Ｄｕｂｅら,１９８８,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６３：１７５１６−１７５２１；Ｌｕｎｄら,１９９３,Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂ.Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ,４：２０−２５；Ｐａｒｅｋｈら,１９８９,Ｂｉｏｃｈｅｍ.２８：７６４４−７６６２；Ｋａｇａｗａら,１９８８,Ｊ.ｏｆ Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６３：１７５０８−１７５１５；Ｐａｒｅｋｈら,１９８９,Ｂｉｏｃｈｅｍ.２８：７６６２−７６６９；Ｐａｒｅｋｈら,１９８９,Ｂｉｏｃｈｅｍ.２８：７６７０−７６７９)。
【０００９】
どの細胞の内部で合成されるかに従って単一タンパク質のグリコシル化パターンが変化するだけでなく、個々のグリコシル化イベントはある種の進化的に近縁の動物種にのみ特有であろう。Ｇａｌｉｌｉら,１９８７,Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８４：１３６９−１３７３及びＧａｌｉｌｉら,１９８８,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６３：１７７５５−１７７６２は、非霊長類の哺乳動物及び新世界の猿にＧａｌα１−３Ｇａｌが発生することを同定し、これはヒト及び旧世界の猿には存在しなかったグリコシル化パターンであることを確認した。この二糖がヒトの免疫応答を誘発することからこの構造の欠如が証明された。非定型グリコシル化パターンに対する免疫応答は、非霊長類ソースに由来するかまたは該ソース中で製造される糖タンパク質の使用に起因する未解決の抗原性の問題を提示する。
【００１０】
オリゴ糖は、リコシド結合及びオリゴ糖の立体化学にしばしば極めて特異的なグリコシダーゼによって分解される。遠方に位置する単糖がオリゴ糖の消化に与える影響の一例は、フコシド蓄積症に罹患したヒト患者に見出される。これらの患者では、エンドグリコシダーゼによる消化に先立ってＮ−結合オリゴ糖からフコースを除去するために必要なエキソグリコシダーゼが欠損している。フコースはエンドグリコシダーゼの酵素活性を妨害し、未消化のオリゴ糖を尿中に排泄させる(Ｋｏｂａｔａ １９８４,Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ,Ｅｄｓ.,Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｂｂｉｎｓ,Ｗｉｌｅｙ,ＮＹｖｏｌ.２,ｐｐ.８７−１６２)。
【００１１】
タンパク質のグリコシル化の生物学的衝撃
オリゴ糖の正しい合成及び分解が生物に対して重要であることは、糖質構造の誤ったプロセシングを生じる１つの欠損グリコシダーゼに起因する疾患の存在によって証明された。上記に引用した例では、糖タンパク質の誤ったプロセシングを生じるフコシダーゼの欠如が疾患の原因となっている。他の例としては、主要なリソソーム性α−マンノシダーゼ活性が顕著に欠損しているヒトα−マンノシド症がある(Ｇａｓｐｅｒｉら,１９９２,Ｊ.ｏｆ Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：９７０６−９７１２)。異常オリゴ糖構造は癌にも関連を有している(Ｓａｎｏら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：１５２２−１５２７)。
【００１２】
糖タンパク質のオリゴ糖側鎖はこのような細胞プロセスにおいて、ペプチド鎖をタンパク質分解性攻撃から保護し、細胞表面への分泌を容易にし、生物学的活性形態のタンパク質のコンホメーションを誘発及び維持し、血漿から糖タンパク質を除去し、分化及び発達中に抗原決定基として機能すると推定されている。実際、発達の任意の段階で、細胞は、１つの糖タンパク質を合成するだけでなく１つのタンパク質の多数の可能形態をコードすることによって、調節された変異という生合成の問題を解決してきたと考えられる。各変異体は異なる共有結合オリゴ糖(配糖形態)を有している。１つのペプチドの多数のグリコシル化部位または実際には１つのグリコシル化部位の多数の形態に起因する多様性の範囲は、Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら,１９８８,Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.５７：７８５−８３８に組換えタンパク質に関して記載されている。糖タンパク質の特性並びにその生物学的特性及び機能は結合したオリゴ糖の配列及び構造に従って変化するので(Ｃｕｍｍｉｎｇ １９９１,Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１：１１５−１３０)、糖タンパク質構造の分析が組換え医薬用タンパク質のキャラクタリゼーションの重要な要件となっている。
【００１３】
製造された医薬グレードの組換えタンパク質の品質管理を容易にするためには、極めて近縁の構造を識別するためのオリゴ糖の迅速、廉価かつ信頼性の高いキャラクタリゼーションを可能にするような分析方法が必要である(Ｓｐｅｌｌｍａｎ １９９０,Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ.６２：１７１４−１７２２)。細胞からの産生レベルを向上させ、治療薬としてのタンパク質の生物機能を最適化するために、糖タンパク質に対してオリゴ糖を操作及び修飾する方法が望まれている。
【００１４】
糖タンパク質及び糖質一般の合成の指令及び機能の分析を行うため、更に、種々の生物、器官、細胞並びに単一細胞内で産生されたグリコシル化分子中の微細な不均一性
（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）の原因及び関連を理解するために、オリゴ糖の配列及び結合を分析する迅速で簡単な方法が有用であろう。
【００１５】
糖質構造の分析方法
糖質構造の既存の分析方法は複雑な多段階手順に依存している。これらの手順としては、質量分析、ＮＭＲ、高速原子衝撃、複合クロマトグラフィー法(高圧液体クロマトグラフィー、気相クロマトグラフィー、イオン交換及び逆相クロマトグラフィー)、複合化学反応系(メチル化分析、過ヨウ素酸塩酸化及び種々の加水分解反応)などの方法があり、これらはいずれもオリゴ糖の配列及びそれらのグリコシド結合の特徴を決定するために種々の組み合わせで使用されている。各方法は糖質構造に関していくつかの断片的情報を与えるが、各々が欠点を有している。例えば、高速原子衝撃は(Ｄｅｌｌ １９８７,Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１９−７３)、大きさ及び配列に関するいくつかのデータを与えるが、結合位置またはアノマー配置に関する情報を与えない。ＮＭＲは糖質を分析するための最も強力なツールであるが(Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔら,１９８３ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：２０９−３７５)、比較的感度が鈍く大量の分析液を要する。これらの方法は、Ｓｐｅｌｌｍａｎ １９９０,Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ.６２：１７１４−１７２２；Ｌｅｅら,１９９０,Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ. ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ.２３：５３−８０；Ｇｅｉｓｏｗ １９９２,Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２７７−２８０；Ｋｏｂａｔａ １９８４に概説されている。上記手順の多くは高価な装置を必要としており、またそれらの操作にはかなりの技術的熟練及び技術的支援が必要なので、それらの使用は少数の専門研究機関に限定される。
【００１６】
グリコシダーゼを用いる糖質分析
多段階分析の一段階を構成する糖質分析の種々の段階で酵素が使用されている。これらの酵素は、結合タンパク質のグリカン部分とアミノ酸(普通はアスパラギン)との間を開裂する能力を有するグリコアミダーゼである。エンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼは双方ともヒドロラーゼであり、糖質構造の内部(エンド)または分子の非還元末端の末端単糖(エキソ)でグリコシド結合を開裂する能力を有するのでこのように呼ばれているが、これらは極めて重要である。
【００１７】
エンドグリコシダーゼは、ペプチドのアミノ酸結合部位に対して最後から二番目の単糖の還元末端でオリゴ糖を開裂すると記載されている。各々が異なる基質特異性を有する５種類のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは構造研究で使用するために十分に精製された(Ｋｏｂａｔａ １９８４)。更に、エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼも単離された(Ｕｍｅｍｏｔｏら,１９７７,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２５２：８６０９−８６１４；Ｂｈａｖａｎａｎｄａｎら,１９７６,Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ.７０：７３８−７４５)。これらのエンドグリコシダーゼの特異性はオリゴ糖構造の分析の強力なツールとなり得る。現状では、特性決定された市販の酵素の数が少ないのでエンドグリコシダーゼがあまり使用されていない。種々の特異性を有する多数の特性決定されたエンドグリコシダーゼを得ることは糖質の分析に役立つであろう。
【００１８】
エンドグリコシダーゼ消化によってまたは化学的手段によって遊離されたオリゴ糖はエキソグリコシダーゼ消化によって更に特性決定され得る。エキソグリコシダーゼは、オリゴ糖類及び多糖類の非還元末端から単糖ユニットを開裂するヒドロラーゼである。エキソグリコシダーゼは種々の末端単糖類及び種々のアノマー形態に対して既知の特異性を有するので、オリゴ糖を配列決定するために使用されている。ゲル浸透クロマトグラフィーを併用するエキソグリコシダーゼの順次消化は、Ｙａｓｈｉｔａら,１９８２によって初めて記載された(Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ８３：１０５−１２６)。Ｅｄｇｅら(１９９２,ＰＮＡＳ ８９：６３３８−６３４２)は、多重酵素反応消化物及び酵素消化物系列の分析による配列の分析を記載した。グリコシダーゼを用いたオリゴ糖の配列決定の機能は、十分に特性決定された基質特異性をもつ酵素の入手可能性によって限定されていた。グリコシダーゼ活性の分析に使用できる基質が少ないので単糖間のグリコシド結合に関するデータは不完全であった。その結果として、配列分析後にグリコシド結合を決定するためにメチル化分析が必要であった。
【００１９】
エキソグリコシダーゼは、細菌、ウイルス、植物及び哺乳類などの多様なソースから単離され、シアル酸(αアノマー)、ガラクトース(α及びβ)、Ｎ−アセチルグルコサミン(α及びβ)、Ｎ−アセチルガラクトサミン(α及びβ)、マンノース(α及びβ)に対して特異性を有している(Ｓａｎｏら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：１５２２−１５２７；Ｍｏｒｅｍｅｎら,１９９１,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６６：１６８７６−１６８８５；Ｃａｍｉｒａｎｄら,１９９１,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６６：１５１２０−１５１２７；Ｇａｓｐｅｒｉら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：９７０６−９７１２；Ｚｉｅｇｌｅｒら,１９９１,Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １：６０５−６１４；Ｓｃｈａｔｚｌｅら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：４０００−４００７)。
【００２０】
従来技術のグリコシダーゼは多くの実例でこれらの基質特異性によって定義されているが、酵素のキャラクタリゼーションは適当な基質の入手可能性及びアッセイの複雑さによって制約を受けている。更に、従来技術の酵素は任意の名称で呼ばれることが多く、その場合、名称は、証明されていない生物学的活性を示唆している。従来技術における粗抽出物または精製酵素のキャラクタリゼーションの制約は、任意の１種類の酵素によってどの基質が開裂されどの基質が開裂されなかったかを同定する適当なアッセイが存在しないことに起因する。酵素の特性決定という問題に関連して、夾雑グリコシダーゼ活性の同定に関する問題が発生する。更に、グリコシダーゼ調製物は一般に他の夾雑グリコシダーゼを含むだけでなく、夾雑プロテアーゼも含む。従来技術で引用された酵素の特性決定に関する制約及び実質的に純粋なグリコシダーゼ調製物を得ることの難しさが市販のグリコシダーゼのリストの貧弱さに反映されている(表１参照)。
【００２１】
従来技術において最も一般的に使用されている基質は、誘導体化された単糖類(ｐ−ニトロフェニル−単糖または４−メチルウンベリフェリル単糖)である。これらの基質は、グリコシダーゼによって認識される単糖類のいくつかに関する情報を提供するであろうが、単糖は色素産生マーカーに化学結合しグリコシド結合を介して第二の単糖に結合しないので、グリコシド結合開裂特異性に関する情報は得られない。更に、グリコシダーゼの認識部位を特性決定するための誘導体化された基質の使用には制約がある。単糖誘導体を開裂するグリコシダーゼは、１つのオリゴ糖の必ずしも同じ単糖を開裂しない。同様に、１つのオリゴ糖を開裂するグリコシダーゼが、誘導体化された基質を開裂しないこともあり得る(Ｇａｓｐｅｒｉら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：９７０６−９７１２)。
【００２２】
グリコシダーゼの認識部位及びグリコシド開裂部位を特性決定するための適当な標識オリゴ糖の一群を開発する体系的な方法が必要である。適当な基質を提供する以外に、多数の基質に対する１つのグリコシダーゼのスクリーニングまたは１種類基質に対する多数のグリコシダーゼのスクリーニングを行うために単一または多重グリコシダーゼ反応の産物を簡単にかつ迅速に分析する方法が必要である。
【００２３】
現在可用な多くのグリコシダーゼは分析試薬としては重大な問題を有している(Ｊａｃｏｂら,１９９４,Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.２３０：２８０−２９９)。これらの問題としては、
(１)エキソグリコシダーゼ調製物が他の夾雑エキソグリコシダーゼ不純物を含み、その結果として消化結果が不明瞭になること、及び、
(２)特定のグリコシド結合に対するエキソグリコシダーゼの特異性が欠如していること、がある。特性決定されたグリコシダーゼは多数の結合を認識し、いくつかの結合が他の結合よりも優先的に認識されると考えられている。従って、所与のグリコシダーゼが優先度を有している１つの結合を同定するのが望ましい。
【００２４】
更に分析試薬としては、種々の特異性を有する入手可能なエキソグリコシダーゼの種類は、天然に産する多くの直鎖状または分枝状構造を分析及び識別するために十分ではない。
【００２５】
入手可能なグリコシダーゼに関しては、糖質分析を行うための明確で再現的な基質特異性を有する実質的に純粋で高度に特異的な酵素が不足している。糖質分析に関するこれらの酵素の可用性が不足している原因の少なくとも一部は、新規なグリコシダーゼを単離しそれらの基質特異性を特性決定するために可用な方法が欠如していることにある。単糖及びグリコシド結合に対して明らかな優先性を有する広い範囲のグリコシダーゼが入手可能であるならば、オリゴ糖を完全に特性決定するために現状では必要とされているメチル化のような追加分析が不要になり、新規な糖質構造及びそれらの生物学的特性の迅速なキャラクタリゼーションの強力なツールが提供されるであろう。
【００２６】
エキソグリコシダーゼのソース
少数のエキソグリコシダーゼは市販されている(表１参照)。更に、上記のような種々の生物から多数のエキソグリコシダーゼが単離された。配列決定に有用であることか分かっているエキソグリコシダーゼの部分的リストは、Ｌｉｎｈａｒｄｔら,１９９２の国際特許出願公告ＷＯ／９２／０２８１６に提示されている。エキソグリコシダーゼの追加リストは、Ｈａｕｇｈｌａｎｄ,１９９３の国際特許出願公告ＷＯ／９３／０４０７４に提示されている。グリコシダーゼに関する包括的な概説は、Ｃｏｎｚｅｌｍａｎら,１９８７,Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６０：８９；Ｆｌｏｗｅｒｓら,１９７９,Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ４８：２９；Ｋｏｂａｔａ １９７９,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１００：１−１４に提示されている。
【００２７】
現在入手可能なグリコシダーゼは概して天然ソースから単離され製造されているが、Ｓｃｈａｔｚｌｅら,１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：４０００−４００７は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍから単離されたリソソーム酵素α−マンノシダーゼのクローニング及び配列決定を報告した。Ｓｃｈａｔｚｌｅらは、酵素の構造的特性を特性決定したが、グリコシド結合に対する基質特異性は解明されなかった。
【００２８】
【表１】
【００２９】
上記の理由から、明確な基質特異性を有しており再現的な開裂活性をもつ形態の精製酵素調製物を与える試薬として適当な実質的に純粋な新規なグリコシダーゼが必要とされている。更に、天然に産する多様な糖質構造の分析に適した広汎な酵素系列を単離及び製造する方法が必要とされている。更に、酵素の基質特異性を決定するため、糖質構造を配列決定する迅速廉価な方法を提供するため、糖タンパク質及び糖脂質のような分子の生物学的特性を改変する目的で糖タンパク質及び糖脂質の糖質部分を修飾するための迅速廉価簡単な糖質分析方法が必要とされている。迅速廉価簡単な糖質分析方法が利用できれば、天然に産する多様な糖質構造の分析、これらの分子の機能の理解、これらの構造の操作による有用な目的の生物学的特性の修飾、などの機会が数多く提供されるであろう。
【００３０】
発明の概要
本発明の目的は、同定された基質特異性を有する実質的に純粋な新規なグリコシダーゼに対する要望を満足させる組成物及び方法を提供することである。
【００３１】
好ましくは本発明は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから得られる実質的に純粋なグリコシダーゼを提供する。１つの形態のグリコシダーゼは、第１の生物からＤＮＡを単離し、第２の生物中でＤＮＡから遺伝子ライブラリーを形成し、グリコシダーゼ活性を有する第２の生物の組換えクローンを同定することによってクローニングされる組換えグリコシダーゼである。
【００３２】
好ましくは本発明は更に、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘに基質特異性を有し、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘに対してＧａｌＮＡｃβ１−Ｘの１００倍の特異性を有する実質的に純粋なグリコシダーゼを提供する。
【００３３】
本発明は更に、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから得られうる実質的に純粋なガラクトシダーゼ、フコシダーゼまたはマンノシダーゼから成る組成物を提供する。
【００３４】
本発明は更に、Ｍａｎα１−３Ｒグリコシド結合、Ｍａｎβ１−４Ｒグリコシド結合またはＸｙｌβ１−２Ｒグリコシド結合に基質特異性を有する実質的に純粋なグリコシダーゼを提供する。
【００３５】
本発明の目的の１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから誘導された少なくとも１種類のグリコシダーゼを選択し、糖質の構成単糖間の選択されたグリコシド結合をグリコシダーゼ消化によって開裂し、修飾された糖質を形成する段階から成る糖質の修飾方法を提供することである。
【００３６】
本発明はまた、糖質基質中のグリコシド結合を選択的に開裂するために、グリコシド結合に基質特異性を有するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のグリコシダーゼを選択し、グリコシダーゼを糖質基質と反応させ、糖質基質を開裂する段階から成る方法を提供する。
【００３７】
本発明はまた、糖質からＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘを選択的に開裂するために、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘに対してＧａｌＮＡｃβ１−Ｘに対する基質特異性の少なくとも１００倍の基質特異性を有するグリコシダーゼを選択し、グリコシダーゼを糖質と反応させ、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘを開裂する段階から成る方法を提供する。
【００３８】
本発明はまた、Ｍａｎα１−３ＲまたはＭａｎα１−６Ｒ結合をＭａｎα１−６ＲまたはＭａｎα１−３Ｒに比べて少なくとも１００倍の優先度で選択的に開裂し得るグリコシダーゼを選択することによって糖質中のＭａｎα１−３ＲまたはＭａｎα１−６Ｒ結合を開裂する方法を提供する。
【００３９】
本発明の上記及びその他の目的、特徴及び利点は以下の記載及び添付の請求の範囲より更に十分に理解されよう。
【００４０】
図面の簡単な説明
本発明の上記の特徴は、以下の記載、添付の請求の範囲及び添付図面より更に十分に理解されよう。
【００４１】
図１は、２つの単糖間に形成されることが可能なグリコシド結合を示す。
【００４２】
図２は、グリコシド活性の存在を判定するためにＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓの粗抽出物をオリゴ糖基質と共にインキュベートした結果を示す。
【００４３】
図３は、酵素濃度を測定するために倍加系列希釈の精製酵素を用いて行ったα１−３,６ガラクトシダーゼの基質(１０９)に対する力価の測定を示す。
【００４４】
図４は、基質１２０、９５及び１１３を用いて行ったα１−２フコシダーゼ(ＩＩ)及びα１−３,４フコシダーゼ(Ｉ)のキャラクタリゼーションを示す。
【００４５】
図５は、直鎖状βＧｌｃＮＡｃ１−Ｘの選択的開裂をβＧａｌＮＡｃ１−Ｘとの比較によって証明するために基質１１８及び１６７を用いて行ったβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【００４６】
図６は、直鎖状及び分枝状の基質を用いて行ったβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【００４７】
図７は、付加的夾雑グリコシダーゼを含む市販のソースに由来のヘキソサミニダーゼとの比較によって行ったＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【００４８】
図８は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ１−３＞＞４ガラクトシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、Ｇａｌβ１−４Ｒ結合に比較したＧａｌβ１−３Ｒ結合に対する基質優先性が証明され、ニワトリ肝臓及びウシ睾丸から得られた市販の酵素との違いが示されている。
【００４９】
図９は、α１−３,６ガラクトシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、他のソース(コーヒー豆)から得られたガラクトシダーゼ中に見出されるＧａｌα１−４Ｒ結合に対する酵素活性の欠如を示す。
【００５０】
図１０は、直鎖状基質に対するα−マンノシダーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩの活性のキャラクタリゼーションを示す。
【００５１】
図１１は、分枝状基質上に対するα−マンノシダーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩの活性のキャラクタリゼーションを示す。
【００５２】
図１２は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−グルコシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、Ｇｌｕα１−４Ｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｒ結合に比較したＧｌｕβ１−４Ｒ結合に対する基質優先性が証明されている。
【００５３】
図１３は、グリコシダーゼ活性の存在を判定するために、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓの粗抽出物をオリゴ糖基質３００と共にインキュベートした結果を示す。
【００５４】
図１４は、グリコシダーゼ活性を測定するために、Ｘ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの粗抽出物をｐ−ニトロフェニルグリコシド基質と共にインキュベートした結果を示す。
【００５５】
図１５は、グリコシダーゼ活性の存在を判定するために、Ｘ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの粗抽出物をオリゴ糖基質と共にインキュベートした結果を示す。
【００５６】
図１６は、基質３００及び２６４を用いたＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−キシロシダーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【００５７】
図１７は、基質２５９及び３００を用いたＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−マンノシダーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【００５８】
特定実施態様の詳細な説明
本文及び請求の範囲において、グリコシダーゼの「基質特異性」とは、特定の単糖またはオリゴ糖を認識し、糖質構造中に位置する特有のグリコシド結合を開裂するグリコシダーゼの能力と定義される。
【００５９】
本文及び請求の範囲において、「グリコシダーゼ」とは、隣合う２つの単糖間のグリコシド結合の加水分解を触媒し得る酵素と定義される(この場合、単糖類はオリゴ糖類、多糖類中に存在してもよくまたは糖タンパク質もしくは糖脂質のような糖質複合体中に存在してもよい)。
【００６０】
本文及び請求の範囲において、「糖質」とは、オリゴ糖類、多糖類または複合構造を意味すると定義されており、これらの分子は遊離状態でて存在してもよくまたはタンパク質もしくは脂質のような第２の分子に結合していてもよい。
【００６１】
本文及び請求の範囲において、「オリゴ糖」とは、２個以上からほぼ３０個までの範囲の単糖から成る鎖長を有する結合単糖系と定義される。
【００６２】
本文及び請求の範囲において、「１−Ｘ」は、特定された単糖の炭素１と隣接の不特定単糖の不特定炭素との間の結合と定義される。
【００６３】
本文及び請求の範囲において、「１−３Ｒ」は、特定された単糖の炭素１と隣接の不特定単糖の炭素３との間の結合と定義される(不特定単糖"Ｒ"はオリゴ糖内に存在する)。炭素３以外の炭素原子に対する他の結合も特定される限り使用できる。
【００６４】
本文及び請求の範囲において、「生物からの調製物」とは、細胞抽出物または培地と定義される。
【００６５】
以下の略号を使用した。Ｇｌｃはグルコース、Ｇａｌはガラクトース、Ｆｒｕはフルクトース、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン、Ｘｙｌはキシロース、Ｆｕｃはフコース、β−ＧｌｃＮＡｃａｓｅはβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−ＧａｌＮＡｃａｓｅはβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−Ｇｌｃａｓｅはβ−グルコシダーゼ、Ｃｏはクマリン、ＡＭＣは７−アミノメチルクマリン、ＴＬＣは薄層クロマトグラフィーである。
【００６６】
グリコシド活性アッセイの開発
本発明の好ましい実施態様の１つは、グリコシダーゼ反応の消化産物を迅速、簡単及び正確に決定する方法である。基質を標識し、グリコシド活性を測定するために適当なマーカーを選択した。迅速かつ再現的な分離方法を用いて反応生成物を検出した。アッセイ方法は十分な感度を有しており、夾雑酵素活性の検出(図７)、系列希釈による酵素力価の測定(図３)、単一及び多数のグリコシド結合に対する１種類の酵素の相対的親和性の測定(実施例４、図２、４−１１)が可能であることが判明した。
【００６７】
グリコシダーゼ活性のスクリーニングに適した標識基質
グリコシダーゼ活性を測定するためにいくつかの酵素標識方法が存在する。例えば以下の標識を使用し得る。
【００６８】
(ａ)色素産生単糖誘導体。グリコシダーゼをスクリーニングする既存の方法では単糖類の色素産生誘導体、例えばｐ−ニトロフェニルグリコシドを最も普通に使用する(Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６０：８９；Ｔｒｏｎｓｍｏら,１９９３,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.２０３：７４−７９)。色素産生単糖類の開裂は特定単糖に対するグリコシダーゼの特異性に関する情報を提供するが、これらの基質は、グリコシド結合に対する酵素の特異性に関してはほとんど情報を与えない。更に、誘導体化された単糖類の開裂は隣接の単糖類または他の分枝構造によって酵素活性が受けた影響に関してはいかなる情報も与えない。その結果として、合成基質に対して活性のいくつかのグリコシダーゼがオリゴ糖基質に対して不活性なこともあり、またその逆もある(Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌら,Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ,Ｃｈａｐｌｉｎら,Ｅｄｓ.,ｃｈ.５,ｐｇ.１４３)。本発明の実施態様においては、選択された単糖類に対する新しく単離されたグリコシダーゼの特異性を測定するためにｐ−ニトロフェニル基質を使用した。
(ｂ)蛍光標識オリゴ糖類。還元性アミン化によってオリゴ糖を蛍光アミンで標識する方法が可用である。このような蛍光アミンの例としては、７−アミノ−メチルクマリン(ＡＭＣ)(Ｐｒａｈａｓｈら,１９８３,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１２８：４１−４６)、２−アミノピリジン(Ｒｅｉｎｈｏｌｄら,１９８３,Ｊ.Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ.Ｃｈｅｍ ２(１)：１−１８、ｐ−アミノアセトフェノン、ｐ−アミノ安息香酸エチルエステル及びアニリン(Ｗａｎｇら,１９８４,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１４１：３６０−３６１)、並びに、Ｋｌｏｃｋ(１９９３)の国際特許出願ＷＯ９３／０５０７６、Ｈａｕｇｌａｎｄ(１９９３)の国際特許出願(ＷＯ９３／０４０７７)及びＷＯ９３／０４０７４に参照によって含まれる他のアミンがある。
(ｃ)放射性標識オリゴ糖類。複合オリゴ糖の構造決定に
使用される種々の分析方法ではオリゴ糖の還元末端をＮａＢ３Ｈ４で化学量論的に放射性標識した(Ｙｏｕｎｇら,１９７１,Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０：３４５７；Ｔｙｒｃｏ １９８１,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１１８：２７８−２８３；Ｗｅｌｌｓら,１９８１,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１１０：３９７−４０６)。代替方法ではトリチウム標識オリゴ糖類を使用する(Ｙａｍａｓｈｉｔａら,１９８０,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２５５(１２)：５６３５−５６４２；Ｆｕｋｕｄａ １９８５,Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４：２１５４−２１６３)。
【００６９】
本発明の好ましい実施態様においては、オリゴ糖基質の還元末端を標識するために蛍光発色団、７−アミノクマリン(ＡＭＣ)を使用した。ＡＭＣ標識の利点は、高い量子効率及び優良な光安定性、還元末端から除去される２つ以上の単糖類から成るグリコシド結合の酵素開裂を殆どまたは全く阻害しない、発色団で標識されたオリゴ糖は薄層クロマトグラムで容易に検出できる、などである。
【００７０】
グリコシダーゼの反応生成物の分析
(１種以上の)標識基質をグリコシダーゼと反応させ、反応生成物が得られた場合には、この反応生成物を適当な分離方法を用いて特性決定した。オリゴ糖と単糖との分離方法には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、濾紙電気泳動、下降式濾紙クロマトグラフィー、毛細管電気泳動、ＴＬＣ及びＨＰＬＣがある。標識基質の特性が分離技術の選択をある程度決定する。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ(Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.１９９０,２７０：７０５−７１３)は、フルオロフォア８−アミノナフタレン−１,３,６トリスルホン酸(ＡＮＴＳ)を用いてオリゴ糖及び短い多糖類の還元末端の共有結合的標識を要する方法を記載した。このフルオロフォアは、ラベルによって付与されるイオン電荷が電界中でのオリゴ糖の分離を容易にするのでポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離に好適であった。この方法は実際、少量の材料を用いて単一の単糖から２６残基のポリマーまでの種々の大きさの分子を単一ゲル上で解明することが可能であった。残念なことに、基質の還元末端を比較的大きい荷電マーカーで標識する必要があるため、エキソグリコシダーゼ反応が妨害され得る。Ｌｉｎｈａｒｄｔ(国際特許出願公告ＷＯ９２／０２８１６)は、オリゴ糖を配列決定するためにＪａｃｋｓｏｎの方法と同様の方法を記載した。この方法では、複合糖質から遊離されたオリゴ糖成分の還元末端に負の電荷をもつ蛍光基を付加し、次いで、細管式動的篩分け（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｄｙｎａｍｉｃ ｓｉｅｖｉｎｇ）電気泳動によってポリアクリルアミドゲル上の種々のオリゴ糖を分離する必要がある。この方法の修正方法が最近Ｏ'Ｎｅｉｌ(ＡＡＡＳ会議,１９９３年８月)及びＨｉｇｇｉｎｓ(ＡＡＡＳ会議,１９９３年８月)によって報告された。上記方法の欠点は手順がコスト高なことである。
【００７１】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の代替方法として、低圧浸透クロマトグラフィーがある。この方法は、試薬系列分析方法を用いてオリゴ糖を配列決定するためにＥｄｇｅら,１９９２,ＰＮＡＳ ８９：６３３８−６３４２によって使用された。Ｅｄｇｅらは、放射性オリゴ糖を種々の組み合わせのエキソグリコシダーゼの混合物と混合し、次いで消化産物をＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ４カラムクロマトグラフィーによって分析した。
【００７２】
本発明の好ましい実施態様においては、薄層シリカゲルクロマトグラフィー(ＴＬＣ)を、分子量及びヒドロキシル基の数に基づくグリコシダーゼ反応の加水分解産物の高速分離方法として選択した。この方法は、ＵＶ光下で容易に検出できる７−アミノメチルクマリン標識した種々の長さのオリゴ糖を分離し得る(実施例２参照)。
【００７３】
上記方法の感度は実施例において、市販の基質中の夾雑酵素の存在を解明できること(図７)、また、１つのグリコシダーゼが１つのグリコシド結合に対して他のグリコシド結合に対するよりも高い親和性を有する(図８)と証明できることを示した。
【００７４】
本発明の方法に対するＴＬＣの重要な利点は、膨大な時間的及び設備的投資を要せずに(少量の基質を用いて)多数のサンプルをグリコシダーゼ活性に基づいて速やかにスクリーニングできることである(図２参照)。２５〜３０個という多数のサンプルを標準サイズの１つのシリカゲルＴＬＣプレートに充填し１つのバッチで分析することが可能である。１〜３０個の糖質残基から成る大きさのＡＭＣ標識オリゴ糖を最適に分離するために、非修飾オリゴ糖を最適に分離するような極性溶媒系を本発明によって調合した(表２)。
【００７５】
【表２】
【００７６】
本発明の方法の１つであるＴＬＣを使用しグリコシド開裂に基づいて迅速、簡単及び正確に多数のオリゴ糖をスクリーニングする能力は、糖質の配列決定の全自動化を実現する新規な方法を提供する。
【００７７】
ＴＬＣ上のクマリン標識基質の分析を利用する全自動化方法は主として以下の段階から成る。所定のエキソグリコシダーゼ混合物と混合した標識基質のアリコートから成る一次系列を形成する。この系列は、オリゴ糖の種類(例えば、高マンノース、複合体またはハイブリッド)を決定するように、または、結合特異的でないグリコシダーゼを用いてマンノース、ガラクトースなどの領域に関してオリゴ糖の全体構造を決定するように選択される。反応混合物のサンプルをＴＬＣプレートに滴下し、(オリゴ糖の大きさに基づいて)種々の溶媒中で処理する。次に、ＵＶ光によって蛍光を検出し、ディジタル化し、記録し得るように編制したグリッドにＴＬＣプレートを配置する。コンピュータ処理したデータベースに記憶されたパターンとグリッドの区画とを比較し、可能なすべての理論的配列を決定し得る。不明確な配列構造は、選択されたグリコシド結合及び分枝状または直鎖状分子に基質特異性を有するエキソグリコシダーゼを用いる第２ラウンドのグリコシダーゼ反応で解明する。
【００７８】
この種の全自動化分析方法は多くの利点を有する。即ち、一段階配列決定方法であること、広い範囲の特性決定されたグリコシダーゼ及び基質を使用できること、基質の必要量が少ないこと、などがある。
【００７９】
しかしながら、蛍光マーカーとしてＡＭＣ、分離方法としてＴＬＣを選択することは、本発明方法によるグリコシド活性の検定に他のマーカーまたは他の分離方法を使用することを排除しない。
【００８０】
グリコシダーゼのスクリーニング及びキャラクタリゼーション
本発明の特定実施態様は、グリコシダーゼのスクリーニング及び特性決定方法である。一連のグリコシダーゼを産生する確率の高い生物を選択する。この方法では、生物の粗調製物からのグリコシダーゼ加水分解産物を、所定の長さ、組成及び二次構造を有する標識オリゴ糖基質または誘導体化した単糖類を用いて分析する。次いで、グリコシダーゼを単離し、更に特性決定し、それらの基質特異性を更に定義する。
【００８１】
新規なグリコシダーゼ用生物のスクリーニング
本発明の１つの実施態様は、食物資源として糖質を選択的に利用する生物が新規なグリコシダーゼのソースを提供するという認識である。この特徴は表３及び表４に例示されている。これらの表においては、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓの種々の菌株の細胞抽出物を、実施例２に記載のようなクマリン標識オリゴ糖群を基質として用いてスクリーニングした。反応生成物をＴＬＣによって同定した。細胞抽出物以外に、細胞調製物から収集した培地をグリコシダーゼ活性に基づいてスクリーニングしてもよい。
【００８２】
反応基質の薄層クロマトグラフィー後にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ抽出物から多数の新規なエキソグリコシダーゼを同定した(図２)。基質群で試験したすべてのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌株は少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を有していた。７つの菌株のうちの６つが(８６％)、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、フコシダーゼ、ガラクトシダーゼ及びマンノシダーゼ活性を含むグリコシダーゼ活性を少なくとも３種類有していた。対照的に、土壌由来のＢａｃｉｌｌｕｓ菌株のグリコシダーゼ活性を試験すると、９つの菌株のうちの２つだけが少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を有していた。
【００８３】
表３及び表４に関連して、近縁生物または非近縁生物から得られた広範囲の細胞抽出物、培地または他の調製物を、既知の構造及び配列を有する蛍光標識されたオリゴ糖群に対するグリコシダーゼ活性に基づいて体系的にスクリーニングし得るランダムスクリーニング方法が開発された。
【００８４】
この新規な方法では、近縁生物の種々の菌株中で多重酵素活性が判明した(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ)(図２)。これらを生物の１つの菌株、例えばＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ中で更に特性決定した。本発明の範囲はＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓに限定されるものではなく、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓは本発明の１つの使用例を示すだけである。逆に、本発明は広範囲の生物及び細胞に適用可能である。
【００８５】
グリコシダーゼの産生
本発明のランダムスクリーニング方法によって同定し、次いで単離し、精製し、選択基質に対して更にスクリーニングしたグリコシダーゼを、酵素の組換え形態を調製するために、部分または完全タンパク質配列及びＤＮＡコーディング配列を与えるタンパク質配列決定によって更に特性決定し得る。本発明の１つの実施態様においては、クローンを同定し単離するために、グリコシダーゼをクローニングし、組換えクローンをスクリーニングする方法が記載されている(実施例５)。特定のグリコシダーゼを発現する生物だけが利用し得る特定の食物資源上で組換えライブラリーを増殖させることによって組換えクローンの単離効率を更に改良し得る。このようなスクリーニング基質の実例としてはパントテン酸に結合した二糖(実施例５参照)またはオリゴ糖がある。更に、既知のＤＮＡ配列を有するクローン化グリコシダーゼの入手が可能になったので、これらのＤＮＡ配列の遺伝子操作を行うことによって改変された基質特異性を有する突然変異酵素を形成し得る。
【００８６】
グリコシダーゼ活性のキャラクタリゼーション
粗抽出物中の酵素活性の同定に引き続いて、本発明では、(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のグリコシダーゼについて)実施例３でより十分に記載された当業界で公知の方法によってグリコシダーゼの単離及び精製を行う。グリコシダーゼの単離及び精製後、基質特異性によって更に進んだ酵素のキャラクタリゼーションを行った(図４〜１１)。また、表５及び実施例４に記載したように反応の補因子を決定し最適ｐＨも確認した。
【００８７】
本発明の範囲は後述する基質または酵素に全く限定されない。実際、記載のスクリーニング方法から得られる新規な酵素は、新規な標識オリゴ糖基質を構築する手段を提供し、これらの基質は更に、反復プロセスで生物または細胞の粗抽出物を分析するために使用され得る。
【００８８】
本発明に従ってＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓから単離し特性決定した新規なグリコシダーゼは以下の特徴を有していた。
【００８９】
(ａ)種々の単糖類に対する選択的基質特異性。本発明のグリコシダーゼは、ピラノース単糖類の立体異性体を識別し得る。特に、本発明のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼはβ−Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｘ)に対してβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン(ＧａｌＮＡｃβ１−Ｘ)に対する親和性の少なくとも１００倍の選択的親和性を有している。これは、双方の形態を容易に識別できなかった従来技術のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼと対照的である(図７)。
【００９０】
(ｂ)１つの単糖のアノマー形態を識別する能力。検定した基質群のうちで、１つのグリコシダーゼは１つの単糖の１つのアノマー形態(αまたはβ)にだけ特異性を有している。
【００９１】
(ｃ)選択されたグリコシド結合に対する基質特異性。本発明のグリコシダーゼは、１つのグリコシド結合(例えば、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＦｕｃα１−２Ｒ、Ｍａｎα１−６Ｒ)、または、２つ以上のグリコシド結合(例えば、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＭａｎα１−３ＲとＭａｎα１−６Ｒ、またはＧａｌα１−３ＲとＧａｌα１−６Ｒ、またはＦｕｃα１−３ＲとＦｕｃα１−４Ｒ)に対して選択的特異性を示した(図４、９〜１１；表６、８)。
【００９２】
いくつかの場合には、１つの結合に対する選択的優先性が確認される。いくつかの酵素の場合、複数の結合を開裂することが観察され、１つの結合に対する作用が第２の結合に対する作用よりも優先することが確認された(例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから得られたβ−ガラクトシダーゼは、Ｇａｌβ１−４Ｒに比べてＧａｌβ１−３Ｒに優先性を有することが定量された(Ｇａｌβ−３＞＞４Ｒ)(図８)。更に、本発明のグリコシダーゼのいくつかは、直鎖状系列中の基質を優先的に開裂し、他のグリコシダーゼはオリゴ糖中の分岐点を開裂し得る(α１−３,４フコシダーゼ、α１−３,６マンノシダーゼ)。本発明のグリコシダーゼは、入手可能なオリゴ糖モチーフを用いて再現的な開裂プロフィルを提供するが、基質が糖質構造(単糖類、オリゴ糖もしくは多糖類)またはタンパク質、脂質または立体配置的に酵素活性に影響を与える合成マーカーと結合しているときは開裂パターンの変化が生じるであろう。
【００９３】
１つの新規なグリコシダーゼを、予想される全種類の基質に対してスクリーニングすることは可能ではないが、本発明では本発明のグリコシダーゼを特性決定するために、共通の糖質モチーフを有する選択基質を使用した。しかしながらこの分析は、本発明のグリコシダーゼがスクリーニングアッセイに含まれない追加の基質を認識できるという可能性を排除しない。または、既知の基質がより大きい分子の一部分に含まれている場合、同一構造中で分子が遠く隔たっていることに起因する立体効果のためにグリコシダーゼが既知の基質を認識できないこともあり得る。
【００９４】
本文中に記載のグリコシダーゼとしては、Ｆｕｃα１−２Ｒ結合を分岐点で開裂する能力を有するα１−２フコシダーゼがある。分枝状Ｆｕｃα１−２Ｒの開裂は、保存血液の免疫原性を減少させるために有用であり、この基質を選択的に開裂するα−フコシダーゼが入手可能になれば、血液バンクに保存された血液のＡＢＯ反応性を修飾する方法が得られる。上記のグリコシダーゼのうちで、α１−３,６ガラクトシダーゼは、ヒト以外の細胞系において作製された組換え糖タンパク質の通常は末端に位置する抗原性Ｇａｌα１−３Ｒ結合を開裂する能力を有しているので、臨床的に重要である。Ｇａｌα１−３Ｒ結合の除去によって治療用の組換えタンパク質に対する望ましくない免疫応答が除去されるであろう。
【００９５】
α１−３,６マンノシダーゼ、α１−２,３マンノシダーゼ、α１−３マンノシダーゼ及びα１−６マンノシダーゼの同定は、高マンノース及びハイブリッド構造中の特異的マンノース結合に結合したアンテナ状分枝を同定し配列決定する能力を初めて提供し、酵素法で従来可能であったよりも有意に優れた構造解明を可能にする。
【００９６】
グリコシダーゼの用途
本発明の１つの実施態様においては、同定された基質特異性を有する実質的に純粋な多くの単離グリコシダーゼと迅速で簡単な反応生成物同定アッセイとを組み合わせることによって以下の目的に適う改良方法が提供される。
【００９７】
(ａ)天然に遊離状態で産するかまたはタンパク質もしくは脂質から開裂された糖質構造を配列決定する。
【００９８】
(ｂ)分子が治療用タンパク質を含有する場合にオリゴ糖類の生物学的役割の確認のためまたは分子の生物学的特性値の変更のために、天然に遊離状態で産する糖タンパク質、糖脂質または糖質分子のオリゴ糖を修飾する。
【００９９】
(ｃ)カラムクロマトグラフィーを用いるかまたは解糖活性を含む画分の他の分析手段を用いて、望ましいグリコシダーゼを精製したり、不要な夾雑グリコシダーゼを検出したりする。
【０１００】
(ｄ)製紙産業における植物材料からのセルロース製造のような天然産糖質構造の分解を要する工程で使用する。
【０１０１】
(ｅ)選択されたオリゴ糖リガンドに特異性を有する細胞上の糖質レセプターを特性決定する。
【０１０２】
(ｆ)Ｖａｒｋｉ １９９３,Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：９７−１３０に記載されたような特徴的糖質構造に依存する生物系に対する作用メカニズムを研究する。引用の文献は参照によって本明細書に含まれるものとする。
【０１０３】
上記方法をより容易に実施するためのキットを調製し得る。キットは、天然ソースまたは組換え手段から単離され、糖質の配列決定に適した基質特異性が同定された実質的に純粋なグリコシド酵素群を含む(組換え形態は、形質転換微生物の発酵によってまたはトランスジェニック動物及び植物から作製される)。このようなキットは、タンパク質、脂質または糖質からオリゴ糖を開裂しかつ還元末端に蛍光ラベル(クマリン)を付加させる適当な試薬を単独または組み合わせて含む。
【０１０４】
更に、天然ソースからまたは組換え手段によって単離され糖質部分の生物学的役割の同定または治療用タンパク質を含む高分子の生物学的特性の改変に適した基質特異性が同定された実質的に純粋なグリコシド酵素群を含むキットを作製し得る。
【０１０５】
更に、酵素の精製中にカラムクロマトグラフィーまたは解糖活性含有画分の分析を要する他の手段を用いるグリコシダーゼ活性の迅速な検定に適したクマリン標識基質のような蛍光標識基質群を含むキットを作製し得る。
【０１０６】
天然産または合成の糖質構造の工業規模処理に適した酵素を含むキットを作製し得る。
【０１０７】
実施例
【実施例１】
【０１０８】
酵素アッセイ用基質の調製：オリゴ糖のＡＭＣ−標識
０.２５〜１ｍｇのオリゴ糖(Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ.,Ｗｅｓｔｂｕｒｙ,ＮＹ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ,Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ,ＭＯ；Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ Ｌａｂｓ,Ｗａｕｋｅｇａｎ,ＩＬ；及びＶ−Ｌａｂｓ Ｉｎｃ.,Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ,Ｌａから商品として得られるか、または、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ(１９８６)Ｅｄｓ.Ｃｈａｐｌｉｎ,Ｍ.Ｆ.Ｋｅｎｎｅｄｙ,Ｊ.Ｆ.(ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ,Ｅｎｇｌａｎｄ) ｐｐ.１５０−１５１から参照によって本明細書に含まれる方法に従って単離される)。
【０１０９】
０.１〜５.０μモルのオリゴ糖を１００μｌのＨ２Ｏに溶解した。糖質水溶液を、３００μｌのメタノールと、２０ｍｇの(０.１１μモル)のＡＭＣ(Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ−Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ)と、３５ｍｇ(０.５５μモル)のＮａＣＮＢＨ３と、４１μｌの氷酢酸とを含む溶液に添加した。混合物を、ネジ蓋付き微量遠心管にシールし、乾燥器(dry block)中で８０℃で４５分間加熱した。脱イオン水で平衡させたＧ−２５カラム(２×５０ｃｍ)に反応物を充填した。生成物を脱イオン水で溶出させ、１ｍｌの画分を収集した。５μｌの画分をシリカゲル６０ＴＬＣプレートに慎重に滴下し(バンドを形成するため)、画分の純度を検定した。実施例２に記載の手順でプレートをＴＬＣによって展開した。適当な画分をプールし、真空によって約０.１〜１μモル／ｍｌまで濃縮した。原液を−２０℃で保存した。
【実施例２】
【０１１０】
グリコシダーゼ活性に基づく生物のスクリーニング方法
スクリーニングアッセイ用細胞抽出物の調製
０.１〜０.５ｇの細胞ペーストを解凍し、３倍容のバッファＡ"(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ)に懸濁させた。細胞懸濁液を短時間音波処理し、エッペンドルフ微量遠心管に入れて１４,０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心した。
【０１１１】
グリコシダーゼ消化反応
１〜５μｌの細菌細胞抽出物または細胞増殖培地または部分精製した抽出物を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファ(種々のｐＨ及び補因子、表５参照)中に１ナノモルのＡＭＣ−標識基質を含む１０μｌの反応混合物に添加した。反応物を３７℃で５分間〜２０時間の期間インキュベートした。２〜３μｌの反応物を後述するようなシリカゲルＴＬＣプレートにバンドとして滴下した。３７℃、１時間でオリゴ糖基質から１ナノモルの末端単糖を遊離させるために必要な酵素の量を酵素１単位と定義した。
【０１１２】
ＡＭＣ−標識オリゴ糖の消化産物の薄層クロマトグラフィーによる分析
２〜３μｌ(＝０.２５ナノモルの基質)のグリコシダーゼ消化反応物をガラス裏面をもつシリカゲル６０ＴＬＣプレート(０.２５ｍｍ厚、２０×２０ｃｍ)に緻密なバンド(０.５ｃｍ幅のレーン)として滴下した。温風ガン(温度７０℃以下)でバンドを完全に乾燥させた。オリゴ糖の大きさに基づく種々の割合のイソプロパノール：エタノール：Ｈ２Ｏ混合物(表１)中で溶媒前縁が１０ｃｍ移動するまでＴＬＣプレートを展開させた。手持ち型の３１４ｎｍ紫外線ランプでバンドを可視化した。この方法を用いると最も少ない場合で０.１ナノモルの消化産物を検出できた。
【０１１３】
非消化二糖(９２ｂ)(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ)、四糖(１６７)(Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)、及び、六糖(１９７)(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３)Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)から成るマーカーを対照として用いた。非消化の基質も対照として使用した。
【０１１４】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓの種々の細菌株から得られた１６個の細胞抽出物のスクリーニングの結果を表３及び表４にまとめる。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの全部の抽出物は、試験した１４種の基質の少なくとも１つを開裂し、いくつかの抽出物は１０種類もの基質を開裂する多重酵素活性を示した。
【０１１５】
図２は、基質１１３(Ｇａｌβ１−３(Ｆｕｃα１−４)ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)及び基質１６７(Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)に対して試験したＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌株に由来の７つの粗抽出物の分析結果を示す。
【０１１６】
【表３】
注：試験した９種のバチルス菌株のうちの２種だけが少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を有していた。少なくとも３つのグリコシダーゼ活性を有する菌株はなかった。
【０１１７】
【表４】
注：試験した全部のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌株が少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を有していた。
７種の菌株のうちの６種(８６％)が少なくとも３つのグリコシダーゼ活性を有していた。
【実施例３】
【０１１８】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓからのグリコシダーゼの精製方法
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓの発酵
１ｇ／ｌの酵母エキス、２ｇ／ｌのトリプトン、６ｇ／ｌのリン酸ナトリウム(二塩基性)、３ｇ／ｌのリン酸カリウム(一塩基性)、０.５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１ｇ／ｌの塩化アンモニウム、２ｇ／ｌのグルコース、１ｍＭの塩化カルシウム、１ｍＭの硫酸マグネシウムから成る培地でＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ菌ＮＥＢ２５７株(ＡＴＣＣ＃４９７６４)を増殖させた。細胞を３０℃で通気及び撹拌しながら後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心分離によって採取し−７０℃で凍結保存した。
【０１１９】
粗抽出物の調製
以後のすべての手順を氷上または４℃で行った。上記で得られた２５４ｇの細胞ペーストを２倍容のバッファＡ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)に懸濁させた。細胞懸濁液をＧａｕｌｉｎホモジナイザー(Ｍ−１５モデル)に１２,０００ｐｓｉで２回通した。Ｓｈａｒｐｌｅｓ連続遠心機で溶菌液を１,３００ｇで４０分間遠心した。５００ｍｌの上清が得られた。
【０１２０】
グリコシダーゼの精製
疎水性及び電荷に従って酵素を分画する一連の分離方法を利用することによって粗細胞抽出物からグリコシダーゼを分離及び精製した。表５に記載の条件を用い実施例２に記載の方法に従って酵素を検定した。
【０１２１】
バッファＡ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)で平衡させたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(５.０×２５ｃｍ)に粗抽出物(５００ｍｌ)を充填した。カラムを２,０００ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、２,０００ｍｌのバッファＡと１ＭのＮａＣｌを含有する２,０００ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(２１ｍｌ)を流速３ｍｌ／分で収集した。画分のα１−２フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラムから０.３５−０.５ＭのＮａＣｌに溶出した。α１−２フコシダーゼ活性を含有する画分をプールし、以下のＡ項に記載の手順で酵素を更に精製した。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの通過物を収集し、他のすべてのグリコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。存在する全部のグリコシダーゼを定量した後で、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(２.６×３５ｃｍ)にＤＥＡＥ通過物を直ちに導入した。カラムを４００ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで５００ｍｌのバッファＡと０.９５ＭのＮａＣｌを含有する５００ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１２ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集した。画分のβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼ、α１−６マンノシダーゼ及びα１−３,６ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。β−ＧｌｃＮＡｃアーゼ及びα１−６マンノシダーゼのピークはカラムから０.３−０.４５ＭのＮａＣｌに同時溶出した。双方の活性を含む画分をプールし(１３０ｍｌ)、酵素を以下のＢ項及びＣ項に記載の手順で更に精製した。α１−３,６ガラクトシダーゼ活性のピークはＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから０.４５−０.５５ＭのＮａＣｌに溶出した。α１−３,６ガラクトシダーゼ活性を含む画分をプールし、酵素を以下のＤ項に記載の手順で更に精製した。カラム通過物とＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの洗浄液(３５０ｍｌ)とを収集し、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ、α１−２,３マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ及びα１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。カラム洗浄液中に全部の酵素活性が見出された。４６.２５ｇの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度１Ｍまでカラムに添加した。次いで、バッファＢ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)で平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１５ｃｍ)に洗浄液を導入した。カラムを６０ｍｌのバッファＢで洗浄し、次いで、１２０ｍｌのバッファＢと０.００１Ｍだけの(ＮＨ４)２ＳＯ４を含有する１２０ｍｌのバッファＢとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(４ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集した。画分のβ１−３＞＞４ガラクトシダーゼ、α１−２,３マンノシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ及びα１−２,３マンノシダーゼ活性のピークはカラムから０.６−０.３５Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４に同時溶出した。双方の活性を含有する画分をプールし、以下のＥ項及びＦ項に記載の手順で酵素を更に精製した。β−グルコシダーゼ活性のピークはカラムから０.２５−０.００１の(ＮＨ４)２ＳＯ４に溶出した。β−グルコシダーゼ活性を含有する画分をプールし、以下のＧ項に記載の手順で酵素を更に精製した。カラム通過物とＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの洗浄液とを収集し、α１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。洗浄液はα１−３,４フコシダーゼのピークを含むことが判明した。この酵素を以下のＨ項に記載の手順で更に精製した。
【０１２２】
Ａ.α１−２フコシダーゼ
α１−２フコシダーゼ活性を含有する上記のＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプール(３００ｍｌ)に、４０ｇの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度１Ｍまで添加した。次いで、バッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１５ｃｍ)にプールを導入した。カラムを６０ｍｌのバッファＢで洗浄し、次いで、１２０ｍｌのバッファＢと０.００１Ｍだけの(ＮＨ４
)２ＳＯ４を含有する１２０ｍｌのバッファＢとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(４ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集した。画分のα１−２フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.００１Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４で溶出させた。バッファＣ(２０ｍＭの酢酸ナトリウムＨ５.２、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)に一夜透析後、プールした酵素を、バッファＣで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(１.０×１０ｃｍ)カラムに充填した。カラムを２０ｍｌのバッファＣで洗浄した。カラム通過物と洗浄液とを収集し、酵素活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラム洗浄液中で検出された。バッファＡに一夜透析後、洗浄液を、バッファＡで平衡させたＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５(１ｍｌ)カラムに充填した。カラムを２ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、４０ｍｌのバッファＡと０.６ＭのＮａＣｌを含有する４０ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−２フコシダーゼ活性を検定した。酵素活性のピークをプールし、カラムから０.０５−０.１５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。粗抽出物の精製後に収量１,５００単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
【０１２３】
Ｂ.β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとα１−６マンノシダーゼの双方の活性を含む上記の酵素プール(１３０ｍｌ)をバッファＡに一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファＡで平衡させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１５ｃｍ)に導入した。カラムを６０ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、１２０ｍｌのバッファＡと１ＭのＮａＣｌを含有する１２０ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(４ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集した。カラム通過物を収集し、β−ＧｌｃＮＡｃアーゼ及びα１−６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム通過物中でα１−６マンノシダーゼ活性だけが検出された。この酵素を以下のＣ項に記載の手順で更に精製した。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから得られた画分のβＧｌｃＮＡｃアーゼ活性を上記の手順で検定した。β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性のピークをプールし、カラムから０.１５−０.３ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、酵素プールを、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラムを６ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、４５ｍｌのバッファＡと０.６ＭのＮａＣｌを含有する４５ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、βＧｌｃＮＡｃアーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、カラムから０.２５−０.３ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。粗抽出物の精製後に収量３０,０００単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
【０１２４】
Ｃ.α１−６マンノシダーゼ
上記のＢ項に記載のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ通過物を、バッファＤ(２０ｍＭのリン酸カリウムｐＨ６.０、１０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)に一夜透析した。透析後、通過物を、バッファＤで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１２ｃｍ)に導入した。カラムを４０ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、８０ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する８０ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(２.５ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集し、α１−６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１５−０.３ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＥ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)に一夜透析後、酵素プールを、バッファＥで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラムを６ｍｌのバッファＥで洗浄し、次いで、４５ｍｌのバッファＥと０.６ＭのＮａＣｌを含有する４５ｍｌのバッファＥとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１５−０.２ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量２００,０００単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
【０１２５】
Ｄ.α１−３,６ガラクトシダーゼ
α１−３,６ガラクトシダーゼを含有する上記のＨｅｐａｒｉｎプールをバッファＤに一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファＤで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１２ｃｍ)に導入した。カラムを４０ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、８０ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する８０ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(３ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−３,６ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.２５−０.３５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、酵素プールを、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラムを６ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、４５ｍｌのバッファＡと１ＭのＮａＣｌを含有する４５ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−３,６ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素ピークをプールし、０.１５−０.２５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量６７,５００単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
【０１２６】
Ｅ.β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ
β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ及びα１−２,３マンノシダーゼの双方の活性を含有する上記のＰｈｅｎｙｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅプールをバッファＤに一夜透析した。透析後、プールを、バッファＤで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、５０ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。カラム通過物を収集し、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ及びα１−２,３マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム通過物中でα１−２,３マンノシダーゼ活性だけが検出された。
【０１２７】
この酵素を以下のＦ項に記載の手順で更に精製した。画分(２ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１５−０.２５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＤに一夜透析後、酵素プールを、バッファＤで平衡させたＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５(１ｍｌ)カラムに導入した。カラムを２ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、２５ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する２５ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.０−０.１ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、酵素プールをバッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラムを６ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、４５ｍｌのバッファＡと０.６ＭのＮａＣｌを含有する４５ｍｌのバッファＡとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。カラム通過物を収集し、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ活性を検定した。酵素活性のピークはカラム通過物中に検出された。通過物を次にバッファＡに一夜透析した。ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。実質的に純粋な酵素の収量は４５,０００単位であった。
【０１２８】
Ｆ.α１−２,３マンノシダーゼ
α１−２,３マンノシダーゼ活性を含有する上記のＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム通過物をバッファＥに一夜透析した。透析後、通過物を、バッファＥで平衡させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラム通過物を収集し、α１−２,３マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラム通過物中で検出された。通過物を次に、バッファＥで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。通過物を収集し、検定すると、酵素活性のピークを含むことが判明した。通過物を次に、バッファＥで平衡させたＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ１０／１０(８ｍｌ)カラムに充填した。カラム通過物と洗浄液とを収集し、α１−２,３マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。Ｍｏｎｏ Ｑカラム洗浄液が酵素活性のピークを含むことが判明した。４.３６ｇの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら洗浄液に最終濃度１Ｍまで添加した。洗浄液を、バッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＢで洗浄し、次いで、１Ｍから０.００１Ｍまで漸減する硫酸アンモニウムを含有する５０ｍｌのバッファＢによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(２ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集し、α１−２,３マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.５５−０.３Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４に溶出させた。バッファＤに一夜透析後、酵素プールを、バッファＤで平衡させたＰｏｌｙ−Ｃａｔ Ａ(３ｍｌ)カラムに導入した。通過物を収集し、α１−２,３マンノシダーゼ活性を検定した。カラム通過物が酵素活性のピークを含むことが判明した。４.６２ｇの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度１Ｍまで通過物に添加した。通過物を次に、バッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０(８ｍｌ)カラムに導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＢで洗浄し、次いで、５０ｍｌのバッファＤと０.００１Ｍだけの(ＮＨ４)２ＳＯ４１Ｍを含有する５０ｍｌのバッファＢとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−２,３マンノシダーゼ活性を検定した。酵素活性のピークをプールし、０.６５−０.５Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４に溶出させた。バッファＥに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。上記プロトコルを用いて収量４,０００単位が得られた。
【０１２９】
Ｇ.β−グルコシダーゼ
β−グルコシダーゼ活性を含有する上記のＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅプールをバッファＤに一夜透析した。透析後、プールを、バッファＤで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、５０ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、β−グルコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１−０.１ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＤに一夜透析後、酵素プールをＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５(１ｍｌ)カラムに導入した。カラムを２ｍｌのバッファＤで洗浄し、次いで、２０ｍｌのバッファＤと０.６ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍｌのバッファＤとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、β−グルコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.０５−０.１ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、酵素プールを、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラム通過物及び洗浄液を収集し、βグルコシダーゼ活性を上記の手順で検定し、洗浄液が酵素活性のピークを含むことを検出した。洗浄液をバッファＡに一夜透析した。ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。粗抽出物の精製後に５００単位の収量が得られた。
【０１３０】
Ｈ.α１−３,４フコシダーゼ
α１−３,４フコシダーゼ活性を含有する上記のＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ洗浄液をバッファＣに透析した。透析後の洗浄液を、バッファＣで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＣで洗浄し、次いで、５０ｍｌのバッファＣと０.６ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍｌのバッファＣとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(２ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集し、α１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１５−０.２５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＣに一夜透析後、酵素プールを、バッファＣで平衡させたＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５(１ｍｌ)カラムに導入した。カラムを２ｍｌのバッファＣで洗浄し、次いで、３５ｍｌのバッファＣと０.６ＭのＮａＣｌを含有する３５ｍｌのバッファＣとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.２５−０.３５ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、酵素プールを、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラム通過物を収集し、α１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。通過物が酵素活性のピークを含むことが判明した。１.１９ｇの硫酸アンモニウムを穏やかに撹拌しながら最終濃度１.５Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４となるまで通過物に添加した。通過物を次に、バッファＦ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１.５Ｍの硫酸アンモニウム、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)で平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０(８ｍｌ)カラムに導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＦで洗浄し、次いで、５０ｍｌのバッファＦと０.００２Ｍだけの(ＮＨ４)２ＳＯ４を含有する５０ｍｌのバッファＦとによって形成された硫酸アンモニウムの漸減直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−３,４フコシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.６−０.５Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４に溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。粗抽出物の精製後に６０,０００単位の収量が得られた。
【０１３１】
α１−３,６マンノシダーゼの精製
上記で得られた２８０ｇの細胞抽出物を３倍容のバッファＡ'(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ)に懸濁させた。細胞懸濁液をＧａｕｌｉｎホモジナイザー(Ｍ−１５モデル)に１２,０００ｐｓｉｇで２回通した。溶菌液をＳｈａｒｐｌｅｓ連続遠心機で１３,０００ｇで４０分間遠心した。７００ｍｌの上清が得られた。
【０１３２】
粗抽出物(７００ｍｌ)を、バッファＡ'で平衡させたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(５.０×２６ｃｍ)に充填した。カラムを２,５００ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、２,０００ｍｌのバッファＡ'と１ＭのＮａＣｌを含有する２,０００ｍｌのバッファＡ'とによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(２１ｍｌ)を流速３ｍｌ／分で収集し、α１−３,６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークはカラムから０.１５〜０.２５ＭのＮａＣｌに溶出した。酵素活性を含有する画分をプールし、バッファＡ'に一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファＡ'で平衡させたＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(２.６×２５ｃｍ)に導入した。カラムを３００ｍｌのバッファＡ'で洗浄し、次いで、２５０ｍｌのバッファＡ"と０.９５ＭのＮａＣｌを含有する２５０ｍｌのバッファＡ'とによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(６ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集し、α１−３,６マンノシダーゼ活性を検定した。酵素活性のピークは０.４−０.６ＭのＮａＣｌに同時溶出した。活性を含む画分をプールし、バッファＡ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)に一夜透析した。透析後、酵素プールを、バッファＥ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ７.５、１０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＥＤＴＡ)で平衡させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０.０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＥで洗浄し、次いで、６０ｍｌのバッファＥと０.６ＭのＮａＣｌを含有する６０ｍｌのバッファＥとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(２ｍｌ)を流速２ｍｌ／分で収集し、α１−３,６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１５−０.２５ＭのＮａＣｌに希釈した。バッファＥに一夜透析後、酵素プールを、バッファＥで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに導入した。カラムを６ｍｌのバッファＥで洗浄し、次いで４５ｍｌのバッファＥと０.６ＭのＮａＣｌを含有する４５ｍｌのバッファＥとによって形成されたＮａＣｌの直線勾配で処理した。画分(１.５ｍｌ)を流速１ｍｌ／分で収集し、α１−３,６マンノシダーゼ活性を上記の手順で検定した。酵素活性のピークをプールし、０.１−０.２ＭのＮａＣｌに溶出させた。バッファＡに一夜透析後、ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、酵素を４℃で保存した。粗抽出物の精製後に、１,０００単位の実質的に純粋な酵素が得られた。
【０１３３】
【表５】
【実施例４】
【０１３４】
グリコシダーゼの特性決定
Ａ.フコシダーゼ
α１−３,４フコシダーゼ(Ｉ)及びα１−２フコシダーゼ(ＩＩ)に対する反応条件を最適にした。５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６.０中の１.０ナノモルの基質を酵素で消化した(２単位のα−フコシダーゼＩＩ(図４、レーン２)、１００単位のα−フコシダーゼＩ(図４、レーン３)、２単位のα−フコシダーゼＩ(図４、レーン５、６、９、１０)、２０単位のα−フコシダーゼＩＩ(図４、レーン７、１１)、及び、２単位のβ−ガラクトシダーゼ(図４、レーン６、１０)(ウシ睾丸、ＢＭＢ))。(１単位は、３７℃、１時間でオリゴ糖から１ナノモルの末端糖を遊離するために必要な酵素の量と定義される)。補因子は全く不要であることが判明した。インキュベーションを３７℃で４時間及び２４時間行った。４時間後、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓのフコシダーゼによる基質の消化が完了していた。活性の弱いβ−ガラクトシダーゼによる消化が完了できるようにインキュベーションを２４時間まで延長した。
【０１３５】
図４は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから単離されたα−フコシダーゼＩ及びＩＩの基質特異性を示す。これらの２つの酵素は選択されたグリコシド結合に対して異なる特異性を有している。クマリン標識オリゴ糖基質の開裂及び薄層クロマトグラフィーによる反応生成物の分離によって証明されるように(レーン３、５、９)、α−フコシダーゼＩはＦｕｃα１−３Ｒ及びＦｕｃα１−４Ｒ結合を選択的に開裂し、α−フコシダーゼＩＩはＦｕｃα１−２Ｒ結合を選択的に開裂する。α−フコシダーゼＩＩは、ＴＬＣ上のバンドが１つの単糖の喪失に対応するより高い位置に泳動したことによって証明されるように、三糖の末端α１−２結合を開裂したが(レーン２)、分枝状のＦｕｃα１−３ＲまたはＦｕｃα１−４Ｒ結合を認識しなかった(レーン７、１１)。α−フコシダーゼＩＩと対照的にα−フコシダーゼＩは、Ｆｕｃα１−２Ｒ結合を消化することができなかった。
【０１３６】
α１−３,４フコシダーゼＩがフコースを除去したが末端ガラクトースを除去しなかったことを確認するために、基質をα−フコシダーゼＩ及び０.５単位のウシ睾丸β−ガラクトシダーゼ(ＢＭＢ)によって消化して、末端β−ガラクトース及びフコースの双方を基質から除去した。図４において、レーン６及び１０は、α−フコシダーゼＩ及びβ−ガラクトシダーゼによる処理後に第二の単糖(末端ガラクトース)が除去されたことを示し、レーン５及び９はα−フコシダーゼＩ消化後に１つの単糖だけが除去されたことを示す。
【０１３７】
３種類の基質、１２０：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ；９５：Ｇａｌβ１−４(Ｆｕｃα１−３)ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ；及び１１３：Ｇａｌβ１−３(Ｆｕｃα１−４)ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏを用いて基質特異性を証明した。非消化基質を対照とした(レーン１、４、８)。
【０１３８】
【表６】
【０１３９】
Ｂ.β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから上記のごとく精製した１０単位のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(β−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ)は、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４.５中で補因子の非存在下に０.５〜１ナノモルの基質と反応することが判明した。ｐＨ４〜６のｐＨ範囲で酵素は同様に活性であった。インキュベーションを３７℃で４時間行った。
【０１４０】
図５は、ＴＬＣによって分析されたこれらの反応の結果を示す。レーン１及び３は夫々、非消化の基質１１８(ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ)及び１６７(Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)を示す。レーン２は末端ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｒ結合が開裂されるという結果を示す。レーン４は、０.５単位のウシ睾丸β−ガラクトシダーゼを用いた末端Ｇａｌβ１−３Ｒの開裂を示し、レーン５はβ−ガラクトシダーゼによる開裂後のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによるＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｒ結合の付加的な開裂を示す。 図６は更に、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｒ及びＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｒ結合を含む基質を用いてβ−ＧｌｃＮＡｃに対するβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの特異性を試験した結果を示す。ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｒ結合は分岐点を形成している(２００：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ；１９７：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３)Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)。これらの基質は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓのβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼによる開裂に先立ったβ−ガラクトシダーゼ(ウシ睾丸)によって開裂される末端Ｇａｌβ１−４残基を有している。レーン１及び４は、開裂されない基質２００及び１９７を夫々示しているが、レーン(ｍ)は大きさのマーカーとして二糖及び四糖を有している。レーン２及び５は夫々、β−ガラクトシダーゼによって消化された基質２００及び１９７を示し、レーン３及び６は夫々、β−ガラクトシダーゼとβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼとによって消化された基質２００及び１９７を示す。
【０１４１】
図７は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから得られたβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼはβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン(β−ＧａｌＮＡｃ)を消化しないが、ウシ腎臓から得られたβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼはこの基質を消化することを示す。レーン１及び４は夫々、非消化の基質９６(ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)及び２０５(ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)を示す。レーン２及び５は夫々、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓのβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼで消化した基質９６及び２０５を示す。開裂反応は全く検出されない。しかしながら、ウシ腎臓のβ−ＧａｌＮＡｃアーゼを用いると(レーン３及び６)、基質９６及び２０５の双方のβ−ＧａｌＮＡｃの開裂が観察される。二糖及び四糖から成るマーカー(ｍ)は、ウシ腎臓のβ−ＧａｌＮＡｃアーゼによって９６及び２０５の１つの単糖が開裂されることを示している。
【０１４２】
結果を表７にまとめる。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓのβ−ＧｌｃＮＡｃだけはＰＮＰ−ＧａｌＮＡｃに対して検出可能な活性を示さなかったが、市販の酵素類はこの基質に対して活性を有していた。
【０１４３】
【表７】
【０１４４】
実施例２で定義したように１ＮＥＢ単位の酵素を３７℃で１時間使用してアッセイを実施した。
ＮＤ＝検出不能
１０ｍＭのＰＮＰ基質、２５μｌの反応容量を使用し、７５μｌの０.２Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ９.８で反応を停止させ、得られた吸光度をＯＤ４００で測定した。
＊Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから精製した５０ＮＥＢ単位の酵素をＰＮＰβＧａｌＮＡｃに対して検定した。(一夜インキュベートした場合であっても、ＰＮＰ−ＧａｌＮＡｃに対する測定可能な活性は検出できなかった)。
【０１４５】
Ｃ.マンノシダーゼ
直鎖状構造に対する特異性
クマリン標識オリゴ糖を用いＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから単離した３種の酵素の基質特異性を試験した。基質を表８に示し、開裂を(＋)によって記録する。この表を導いたＴＬＣデータを図１０に示す。ＴＬＣに示されたマーカーは、二糖、四糖及び六糖から成るオリゴ糖混合物である。レーン１、７及び１１は非消化の基質である。
【０１４６】
５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６.０のバッファ中で調製した１ナノモルの基質を後述の濃度の酵素によって消化させた。α１−３,６マンノシダーゼ(Ｉ)及びα１−２,３マンノシダーゼ(ＩＩＩ)の場合には５ｍＭのＣａ＋＋をインキュベーション混合物に添加した。
【０１４７】
レーン２、８及び１４は夫々、消化産物が得られた場合の基質１３４、１１４及び２００に対するマンノシダーゼＩの消化産物を示す。この酵素は、比較的高い濃度(１５単位)の酵素の存在下に長時間(２０時間)のインキュベーションを行っても基質１３４上の末端Ｍａｎα１−２Ｒ結合を開裂できない。対照的に、この酵素は、基質１１４の末端Ｍａｎα１−２Ｒ結合、及び、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２が除去された後の基質２００の末端Ｍａｎα１−６Ｒ結合を開裂できる。これらの実施例では、１.５単位という少量の酵素を基質と共に２時間インキュベートしたときにも開裂が生じる。
【０１４８】
レーン５、１０及び１６は、α−マンノシダーゼＩＩの消化産物を示す。この酵素は、１００単位の濃度で２０時間インキュベーションを行ったときにもＭａｎα１−２ＲまたはＭａｎα１−３Ｒ結合を開裂しない。対照的に、この酵素は、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２の除去後の基質２００からＭａｎα１−６Ｒ結合を開裂する。
【０１４９】
レーン３、４、９及び１５は夫々、消化産物が得られた場合のα−マンノシダーゼＩＩＩの消化産物を示す。この酵素は、基質１３４の末端Ｍａｎα１−２Ｒ結合、及び、基質１１４の末端Ｍａｎα１−３Ｒ結合を開裂するが、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２の除去後にも基質２００を開裂しない。開裂が観察される場合には、１.５単位の酵素を基質と共に２時間インキュベートする。活性が全く観察されない場合には、１５単位の酵素を２０時間使用した。
【０１５０】
上記の開裂活性に従って、α−マンノシダーゼＩはα１−３,６マンノシダーゼと同定され、α−マンノシダーゼＩＩはα１−６マンノシダーゼと同定され、α−マンノシダーゼＩＩＩはα１−２,３マンノシダーゼと同定された。
【０１５１】
【表８】
【０１５２】
分枝状構造に対する特異性
図１１に示すように、基質２１３及び２１６に対するα−マンノシダーゼＩのインキュベーション(２時間)は、この酵素が分枝状構造を開裂し得ることを証明した。レーン２及び８は２個のマンノース残基の除去を示す。インキュベーションを更に継続(２０時間)すると、第２の対の分枝状マンノースが除去された(レーン１３、１９)。この消化は部分的であり、その理由は還元末端の隣接標識マンノースの負の作用にあると考えられるが、天然産オリゴ糖基質の第２の分枝が開裂されていたと考えることもできる。
【０１５３】
α−マンノシダーゼＩＩのインキュベーション(２時間及び２０時間)は基質２１３及び２１６の開裂の証拠を示さなかった。(レーン６、１１、１７及び２３)。他の理論で解釈できる可能性も否定はしないが、α−マンノシダーゼＩＩ(α１−６マンノシダーゼ)は直鎖状分子を開裂し得るが分枝状分子を開裂できないと推測される。この酵素の使用は、分枝状及び直鎖状のＭａｎα１−６Ｒグリコシド結合を識別する手段を提供し得る。
【０１５４】
α−マンノシダーゼＩＩＩと基質２１３及び基質２１６とのインキュベーション(２時間及び２０時間)の結果は(レーン４、９、１５及び２１)、基質が部分開裂されて２１６から１つのマンノースが除去されたことを示し、これはＭａｎα１−２Ｒ及びＭａｎα１−３Ｒに対する酵素の特異性と一致する。結果は、この酵素が分枝状基質よりも直鎖状基質に対してより大きい親和性を有することを示す。α−マンノシダーゼＩＩの存在下で、基質２１３ではいくつかの付加的開裂が観察されたが、基質２１６では観察されなかった。
【０１５５】
Ｄ.α１−３,６ガラクトシダーゼ
図９に示すように、α１−３,６ガラクトシダーゼはＧａｌα１−３Ｒ及びＧａｌα１−６Ｒ結合(レーン３、６及び９)を優先的に開裂する。５ｍＭのＣａＣｌ２を補充した５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６.０中の１ナノモルの基質に１０単位の酵素を添加し３７℃で２時間インキュベートしたときに、基質１０９(Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ)から１つの単糖が遊離したことがレーン３に示されており、また、基質１８１(Ｇａｌα１−６Ｇｌｃα１−２Ｆｒｕ−Ｃｏ)から単糖開裂産物が得られたことが示されている。対照的に、酵素の量を１０単位に比べて１００単位に増加しインキュベーション時間を２時間に比べて２０時間に延長したときであっても酵素が基質１９３(Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４３Ｇａｌ−Ｃｏ)を開裂しないことがレーン５に示されている。これらの結果は、コーヒー豆(ＢＭＢ)に由来の市販のα−ガラクトシダーゼと対照的である。コーヒー豆のα−ガラクトシダーゼはレーン６に示すように基質１９３のＧａｌα１−４Ｒ結合を容易に開裂する。対照レーン１、４及び７は酵素非添加の非消化基質を示す。マーカーは二糖、四糖及び六糖を含む。
Ｅ.β１−３＞＞４ガラクトシダーゼ
図８に示すように、β１−３＞＞４ガラクトシダーゼはＧａｌβ１−３Ｒ結合を優先的に開裂する。レーン２は、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４.５中の１ナノモルの基質に１単位の酵素を添加し３７℃で２時間インキュベートしたときに基質１６７(Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)から少なくとも１つの単糖が遊離されることを示す。対照的に、酵素の濃度を１単位に比べて１００単位に増加したときに酵素が基質２０２(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)を部分的にしか開裂しないことがレーン６に示されている。これらの結果は、ニワトリ肝臓(ｃｌ)及びウシ睾丸(ｂｔ)に由来の市販のβ−ガラクトシダーゼと対照的であり、これらの酵素はいずれも基質１６７及び２０２を同様に十分に切断する(レーン３、４、７及び８)。レーン１及び５は酵素非添加の非消化基質対照を示す。
【０１５６】
Ｆ.β−グルコシダーゼ
図１２に示すように、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓに由来の粗抽出物は少なくともＧｌｃβ１−４Ｒ結合に特異性を有することが判明した。５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４.５及び５ｍＭのＣａＣｌ２中に１ナノモルの基質を含むインキュベーション混合物中で３７℃で２時間の酵素消化を行った。酵素を種々の濃度で使用した。次いで、反応混合物をＴＬＣプレートに滴下した。酵素非添加の基質を陰性対照として添加し、更に、基質とβＧｌｃＮＡｃアーゼとから成る陽性対照(レーン７)、及び、基質とβ−ガラクトシダーゼ(ウシ睾丸)とから成る陽性対照(レーン１０)を添加した。レーン２、４、６及び９は夫々、１単位のβ−ガラクトシダーゼ(β−Ｇｌｃアーゼ)を１７９(Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)と混合した場合、５単位のβ−Ｇｌｃアーゼを１８０(Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)と混合した場合、５単位のβ−Ｇｌｃアーゼを１１８(ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ)と混合した場合、及び、５単位のβ−Ｇｌｃアーゼを２０２(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)と混合した場合の反応生成物を示す。試験した４種の基質のうちで末端Ｇｌｃβ１−４結合を含む基質１７９だけがβ−Ｇｌｃアーゼによって開裂された。
【実施例５】
【０１５７】
エキソグリコシダーゼ遺伝子のクローニング
天然産グリコシダーゼのソースとしてＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓを用いるエキソグリコシダーゼ遺伝子のクローニング方法を記載する。しかしながらこの方法は、このソースだけでなく、上記の手順で少なくとも１種類のグリコシダーゼを検出できると判断された任意の生物に応用できる。
【０１５８】
Ａ.ＤＮＡ精製
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓのＤＮＡを作製するために、１ｇの細胞ペーストを５ｍｌの０.１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１ＭのＥＤＴＡ,ｐＨ７.６中で３０分間穏やかに撹拌することによって再懸濁させた。上清を各３.０ｍｌの２つのアリコートに分割した。０.１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１ＭのＥＤＴＡ,ｐＨ７.６中の１.７ｍｇ／ｍｌのリゾチーム３.５ｍｌを各アリコートに添加し、夫々を３７℃で１５分間インキュベートした。ＳＤＳを１％まで添加し、プロテイナーゼＫを０.１３ｍｇ／ｍｌまで添加し、次いでアリコートを３７℃で１時間インキュベートした。１０％ＳＤＳと８％サルコシルとの溶液０.４ｍｌを各々に添加し、インキュベーションを５５℃で２時間継続した。次いで、２つのアリコートを一緒にし、ＤＮＡバッファ(１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ,ｐＨ８.０)を４回交換しながら２４時間透析した。透析したＤＮＡ溶液を次に、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度遠心の準備として、ＤＮＡバッファで総量を４０ｍｌに増量し、次いでＤＮＡ溶液を各２０ｍｌの２つのアリコートに分け、各アリコートに２０ｇの塩化セシウムと０.２ｍｌの５ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムとを添加した。ＤＮＡ溶液を４４,０００ｒｐｍで４８時間遠心し、得られたＤＮＡのバンドを注射器及び１８ゲージ針で採取した。氷冷し水で飽和した等容量のＮ−ブタノールで４回抽出することによって臭化エチジウムを除去した。透析によって塩化セシウムを除去した。次に、ＮａＣｌを０.５Ｍまで添加し、上部に０.５５倍容のイソプロピルアルコールを重層させることによってＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡをガラス棒に巻取った。２ｍｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ,ｐＨ８.０中でＤＮＡを最終濃度約７６μｇ／ｍｌまで溶解した。
【０１５９】
Ｂ.部分消化
精製ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで開裂し部分消化するために、１００ｍＭのＢｉｓ Ｔｒｉｓプロパン−ＨＣｌ,ｐＨ７.０、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオトレイトールバッファ中で７６μｇ／ｍｌの濃度の１２４μｌのＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡによって処理し、、４００μｌのアリコートと各２００μｌの４つのアリコートとに分割した。４００μｌの管に２単位のＳａｕ３ＡＩを添加して、ＤＮＡ４.７５μｇあたり１単位の酵素が含まれる濃度にした。第１の管から取り出した２００μｌを第２の管に移して４.７５ｍｇあたり０.５単位のＳａｕ３ＡＩが含まれる濃度にし、以後同様にして、継続する管が直前の管の半量のＳａｕ３ＡＩを含むようにした。管を３７℃で１５分間インキュベートし、７２℃で１５分間熱処理し、次いでＴｒｉｓ−ホウ酸塩−ＥＤＴＡバッファ中の０.７％アガロースゲル中で電気泳動処理した。ＤＥＡＥアニオン交換濾紙に２時間電気泳動させることによって約９〜２ｋｂの大きさを有するＤＮＡフラグメントを収集した。濾紙を０.１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのバッファで２回洗浄した。次いで、濾紙を１.０ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む７５μｌのバッファで４回洗浄することによって濾紙からＤＮＡを溶出させた。得られたＤＮＡフラグメント含有溶液を、３００μｌのフェノール／クロロホルムで抽出し、３００μｌのクロロホルムで抽出し、ドライアイス／エタノール浴に１５分間入れることによって１ｍｌの無水エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを１４Ｋｒｐｍで５分間ペレット化した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、風乾し、１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８及び１ｍＭのＥＤＴＡの最終容量１０μｌに再懸濁させた。精製フラグメントを以下の段階３に記載の手順で使用した。
【０１６０】
Ｃ.結合
フラグメント化したＤＮＡを以下の手順でｐＵＣ１９に結合させた。３μｇのＳａｕ３ＡＩで部分消化したＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓのＤＮＡ(１０μｌ)を、１.５μｇのＢａｍＨＩ開裂し脱リン酸化したｐＵＣ１９(１μｌ)と混合した。４μｌの１０×結合バッファ(５００ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.５、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＡＴＰ)を添加し、更に２５μｌの滅菌蒸留水を加えて最終濃度３９μｌとした。１μｌの濃縮Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(２×１０６Ｕ／ｍｌ)を添加し、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＶＳ ０.０２５μＭフィルターを用いた滴下透析によって１０μｌの結合混合物を脱イオン化した。次いで、ＤＮＡを大腸菌ＥＤ８７６７に電気穿孔させた。電気穿孔の準備として１リットルの大腸菌細胞をＬブイヨン中でＫｌｅｔｔ５０−８０まで増殖させた。細胞を氷上で１５〜３０分間冷却し、次いで低温下で４,０００ｒｐｍで１５分間ペレット化した。ペレットを氷冷滅菌水で２回及び１０％グリセロールで１回洗浄した。洗浄したペレットを１〜２ｍｌの１０％グリセロール中で最終濃度３×１０１０細胞／ｍｌまで再懸濁させた。必要になるまで細胞を１００μｌのアリコートとして−７０℃で凍結保存した。準備した細胞にＤＮＡを電気穿孔するために、細胞を静かに解凍し氷に載せた。４０μｌの細胞を結合及び透析した１０μｌのＤＮＡと混合した。混合物を低温の０.２ｃｍ電気穿孔キュベットに導入した。１２.５ｋｖ／ｃｍの電気パルスを４〜５ミリ秒の時定数でＤＮＡ細胞混合物に印加した。大腸菌を直ちに１ｍｌのＬブイヨンで希釈し、３７℃で３０分間増殖させ、選択培地を含む１５０ｍｍのＬ寒天プレート上で平板培養した。３７℃で一夜インキュベーション後、エキソグリコシダーゼを発現するクローンを以下の手順でスクリーニングした。
【０１６１】
Ｄ.エキソグリコシダーゼクローンのスクリーニング
エキソグリコシダーゼ活性を発現するクローンをスクリーニングするために、異なる３種の色素産生指示基質を使用した。色素産生基質の１つとして、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド(Ｘ−ｇａｌ)を使用した。この基質を５０μｇ／ｍｌの濃度で、形質転換細胞を平板培養する前の選択寒天培地に添加した。Ｘ−ｇａｌを含む寒天プレート上で増殖するβ−ガラクトシダーゼ発現コロニーは青色を呈するであろう。この手順でスクリーニングした９×１０４個のコロニーのうちで、１つのコロニーだけが青色を呈した。また、エキソグリコシダーゼ活性をスクリーニングするための色素産生基質として４−メチルウンベリフェリル(４−ＭＵ)基質も使用した。これらの基質は、コロニー形成後に１μｇ／ｍｌの濃度で選択プレートの表面に噴霧してもよく、または１.５％寒天に添加しコロニー含有選択プレートに重層させてもよい。噴霧または重層後に、活性エキソグリコシダーゼを産生するコロニーを、長波紫外光(３６６ｎｍ)でコロニーを観察することによって同定した。この実験では、４−ＭＵ基質の混合物を１.５％寒天に添加して重層させた。混合物としては、４−ＭＵ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、４−ＭＵ−β−Ｄ−マンノピラノシド、４−ＭＵ−α−Ｄ−グルコシド、４−ＭＵ−β−Ｄ−グルコシド、４−ＭＵ−α−Ｄ−ガラクトシドを使用した。これらの基質の１つを開裂し得る活性β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼまたはα−ガラクトシダーゼを産生するコロニーはＵＶ光下で青色の蛍光を発するであろう。これらの基質を用いてスクリーニングした２×１０４個のコロニーから、８つの蛍光コロニーを単離した。３つの単離コロニーはα−ガラクトシダーゼを産生し、２つはβ−グルコシダーゼを産生し、１つはβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを産生し、残りの２つは、夫々の４−ＭＵ基質開裂能力及び夫々のｐ−ニトロフェニル基質開裂能力から判断して検出可能なエキソグリコシダーゼ活性を有していなかった。
【０１６２】
エキソグリコシダーゼ活性を発現するが合成基質を開裂しないクローンをスクリーニングするためには他の方法を使用しなければならない。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来のα−マンノシダーゼＩまたはＩＩを発現するクローンをスクリーニングするためには、分画平板培養培地を使用した。使用した培地は、ラクトースを炭素ソースとして利用できない大腸菌突然変異体(ｌａｃ−)をスクリーニングするために使用したＥＭＢ寒天の変種である。旧来のＥＭＢ寒天はラクトースと２種類の指示色素、エオシンイエロー及びメチレンブルーを含む。ラクトースを発酵させ得る大腸菌の株(ｌａｃ＋)がＥＭＢ寒天上で増殖するとき、コロニーは暗紫色から黒色を呈する。しかしながら、ｌａｃ−コロニーは、ラクトースを発酵させることができないので白色である。α−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、培地１リットルあたり１００ｍｇのカルベニシリン、０.４ｇのエオシンイエロー、０.０６５ｇのメチレンブルー及び１ｇのα−マンノビオースを含有するＭ９最小培地にライブラリー(上記)を約３０,０００ｃｆｕ／ｍｌの濃度で平板培養した。マンノビオースを宿主によって発酵されるマンノースに開裂するクローン化α−マンノシダーゼを発現しない大腸菌は、二糖マンノビオース(マンノースα１−６マンノース)を炭素ソースとして利用することができない。プレートを３７℃で２〜４日間インキュベートした。１５,０００ｃｆｕで平板培養したコロニーのうちの１１個のコロニーが濃紫色を呈した。これらのコロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天上に単離コロニーとして画線培養し、３７℃で増殖させた。試験した１１個のコロニーのうちで、２つのコロニーからの粗抽出物がα１−３,６マンノシダーゼ(ＭａｎＩ)活性を示した。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓから他のマンノシダーゼ(α１−２,３及びα１−６特異的)を発現するクローンは単離されなかった。この方法は、合成基質を開裂しない他のエキソグリコシダーゼを単離するために使用できる。以下の制約だけがある。(１)エキソグリコシダーゼが存在しなければ宿主は二糖、三糖またはオリゴ糖を利用できない。(２)エキソグリコシダーゼによって遊離された糖は大腸菌が利用できる唯一の炭素ソースでなければならない、(３)エキソグリコシダーゼを発現する宿主を増殖させる寒天ベースに十分な量で添加できる量の糖基質を入手しなければならない。
【０１６３】
本発明をいくつかの好ましい実施態様について説明したが、本発明の要旨及び範囲はこれらの記載に限定されない。例えば、適正に標識された基質に対して細胞抽出物をスクリーニングするエンドグリコシダーゼの単離は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓからの一般的なグリコシダーゼ単離方法に包含される。更に、適正に標識された基質を用いたエンドグリコシダーゼのクローニングは、一般的なグリコシダーゼクローニング方法に包含される。
【実施例６】
【０１６４】
酵素アッセイ基質の調製
： オリゴ糖のＡＭＣ−標識
基質は、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ.(Ｗｅｓｔｂｕｒｙ,Ｎ
Ｙ),Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ Ｌａｂｓ(Ｗａｕｋｅｇａ,ＩＬ),Ｖ−Ｌａｂｓ,Ｉｎｃ.,(Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ,ＬＡ)から購入するか、または、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ(１９８６)Ｅｄｓ.Ｃｈａｐｌｉｎ,Ｍ.Ｆ.ＫｅｎｎｅｄｙＪ.Ｆ.(ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ,Ｅｎｇｌａｎｄ)ｐｐ.１５０−１５１)から参照によって本明細書に含まれる方法に従って単離した。調製用シリカゲル６０プレート(１,０００μｍ厚、２０×２０ｃｍ)はＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ(Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ,ＮＪ)から得られた。７−アミノメチルクマリン(ＡＭＣ)はＥａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ(Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ,ＮＹ)から得られた。西洋ワサビペルオキシダーゼはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ(Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ,ＭＯ)から購入した。
【０１６５】
オリゴ糖(０.１〜５.０μモル)を、１００μｌのＨ２Ｏに溶解した。３００μｌのメタノール、２０ｍｇの７−アミノメチルクマリン(ＡＭＣ)、３５ｍｇのＮａＣＮＢＨ３及び４１μｌの氷酢酸を含む溶液に糖質水溶液を添加した。混合物をネジ蓋付き遠心管にシールし、乾燥器に入れて８５℃で４５分間加熱した。反応物をＨ２Ｏで平衡させたＳｅｐｈａｄｅx Ｇ−２５カラム(２×５０ｃｍ)に充填した。生成物をＨ２Ｏで溶出させ、１ｍｌの画分を収集した。後述するようにＴＬＣによって画分の純度を検定した後で、適当な画分をプールし、０.１〜１μモル／ｍｌに真空濃縮し、−２０℃で保存した。
【０１６６】
西洋ワサビペルオキシダーゼから得られたオリゴ糖は、加ヒドラジン分解及び再アセチル化によってタンパク質から遊離された(Ａ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ(１９８６)Ｅｄｓ.Ｃｈａｐｌｉｎ,Ｍ.Ｆ.Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｊ.Ｆ.(ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ,Ｅｎｇｌａｎｄ)、前出)。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム(２.５×３ｃｍ)で糖質を脱塩した後、マイクロタイタープレートフォーマットを用いて修飾された中性糖(Ｄｕｂｏｉｓら,１９５６,Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ.,２８：３５０−３５６)によって画分を検定した。要約すると、サンプルをＨ２Ｏで最終容量９０μｌに調整した。５μｌの８５％フェノール／Ｈ２Ｏ(ｖ：ｖ)を添加し、次いで１８０μｌのＨ２ＳＯ４を速やかに添加した。ＯＤ４９０で吸光度を読み取って糖濃度を測定した。種々の濃度のマンノースを使用して標準曲線を作成した。オリゴ糖含有画分をプールし上記のように標識した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５クロマトグラフィー処理後、調製用吸収層クロマトグラフィーを用いてサンプルを１,０００μｍ厚の２０×２０ｃｍ準備用シリカゲル６０プレートに画線培養することによって更に精製した。イソプロパノール：エタノール：Ｈ２Ｏ(２.３：１.０：０.７、ｖ：ｖ：ｖ)中で更にクロマトグラフィー処理した後、適当なバンドを切除し、シリカを粉砕した。５０％イソプロパノール：水(ｖ：ｖ)で溶出剤が蛍光を発光しなくなるまでシリカを洗浄することによって糖質を溶出させた。溶出剤を０.１μモル／ｍｌに真空濃縮し、−２０℃で保存した。オリゴ糖構造(Ｋｕｒｏｓａｋａ,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.(１９９１)２６６：４１６８−４１７２)をエキソグリコシダーゼ消化及びＴＬＣ分析によって以下のごとく確認した。
【実施例７】
【０１６７】
グリコシダーゼ活性に基づく生物のスクリーニング方法
Ｆガラス裏面をもたないシリカゲル６０のＴＬＣプレートをＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ(Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ,ＮＨ)から購入した。ｐ−ニトロフェニルグリコピラノシドをＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.(Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ,ＭＯ)から購入した。対照グリコシダーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ(Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ,ＩＮ)、Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｙｓｔｅｍｓ(Ｒｏｓｅｄａｌｅ,ＮＹ)またはＳｅｉｋａｇａｋｕ(Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ,ＭＤ)から得られた。カラム及びクロマトグラフィー試薬は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ(Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ,ＮＹ)またはＴｏｓｏＨａａｓ(Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ,ＰＡ)から購入した。
【０１６８】
スクリーニングアッセイ用細胞抽出物の調製
細胞ペースト(０.１〜０.５ｇ)を解凍し、３倍容のバッファＡ'(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７.５]、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ)に懸濁させた。短時間の音波処理後、細胞懸濁液をエッペンドルフ微量遠心管で１４,０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心した。
【０１６９】
グリコシダーゼ消化反応
細胞抽出物、細胞増殖培地または部分精製抽出物のグリコシダーゼ活性を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５.５(種々のｐＨ及び補因子、表５参照)中の１ナノモルのＡＭＣ−標識オリゴ糖を含む１０μｌの混合物に１〜５μｌ添加することによって検定した。３７℃で５分〜２０時間の範囲の期間インキュベーション後、反応物を後述するようにＴＬＣによって分析した。β−キシロシダーゼ活性の最終収量を定量するために、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４.５中のＸｙｌβ１−４Ｘｙｌβ１−４Ｘｙｌβ１−４Ｘｙｌ−Ｃｏを基質として使用した。３７℃、１時間でオリゴ糖基質から１ナノモルの末端キシロースを遊離するために必要な酵素の量を１単位のβ−キシロシダーゼと定義する。β−マンノシダーゼ活性の最終収量を定量するために、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを補充した５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５.５中のＭａｎβ１−４Ｍａｎβ１−４Ｍａｎ−Ｃｏを基質として使用した。３０℃、１時間でオリゴ糖基質から１ナノモルの末端マンノースを遊離するために必要な酵素の量を１単位のβ−マンノシダーゼと定義する。
【０１７０】
ＡＭＣ−標識オリゴ糖類の消化産物の薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)による分析
ガラス裏面をもつシリカゲルＴＬＣプレート上に少量のグリコシダーゼ消化反応物(２〜３μｌ)を緻密なバンドとして滴下した。バンドを温風ガン(温度７０℃以下)で完全に乾燥した。イソプロパノール：エタノール：Ｈ２Ｏ(２.５：１.０：０.５、ｖ：ｖ：ｖ)中で溶媒前縁が１０ｃｍ移動するまでプレートを展開させた。クロマトグラフィー処理後、原点の近傍に残存するＡＭＣ−基質、及び、移動相と共に上方に泳動した加水分解産物を、３１４ｎｍのＵＶランプで可視化した。非消化の二糖(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ)、四糖(Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)及び六糖(Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６[Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３]Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ)のマーカーを対照として用いた。非消化の基質も対照として用いた。
【０１７１】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓの種々の細菌株からのＭａｎα１−６(Ｍａｎα１−３)(Ｘｙｌβ１−２)Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４(Ｆｕｃα１−３)ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏに対して細胞抽出物をスクリーニングした結果を図１３に示す(表３及び４参照)。Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株からの細胞抽出物は活性がないことを示したが、１つの菌株Ｘ.ｍａｎｉｈｏｔｉｓからの細胞抽出物はＡＭＣ−基質から３つの糖を除去できた。他の２つの菌株Ｘ.ｈｏｌｉｃｏｌａ及びＸ.ｏｒｙｚａｅからの細胞抽出物は４つの糖を除去することが可能であり、これはα−マンノシダーゼ、β−キシロシダーゼ、及びα−フコシダーゼまたはβ−マンノシダーゼ活性の存在を示唆する。
【実施例８】
【０１７２】
ｐ−ニトロフェニルグリコシド基質を用いる生物のスクリーニング
エキソグリコシダーゼは典型的には、ｐ−ニトロフェニルグリコピラノシドのような誘導体化された単糖を基質として同定及び精製された(Ｈａｙｗａｒｄ,Ａ.Ｃ.(１９７７)Ｊ.Ａｐｐｌ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.４３：４０７−４１１)。これらの基質は、特異的単糖をそのアノマー性と共に認識し得る酵素の能力に関する情報を与える。しかしながら、単糖は第２の糖に結合せずむしろ色素産生マーカーに結合するので、酵素の結合特異性に関する情報は全く得られない。単糖誘導体を開裂し得るグリコシダーゼはしばしば、糖残基がオリゴ糖の一部であるときに糖残基を加水分解できない(Ｔａｌｂｏｔ,Ｇ. ＆ Ｓｙｇｕｓｃｈ,Ｊ.(１９９０)Ａｐｐｌ.Ｅｎｖｉｒｏｎ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.５６：３５０５−３５１０)。
【０１７３】
Ｈａｙｗａｒｄ(前出)によって証明されたように、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ菌株は複数のｐ−ニトロフェニルグリコピラノシド基質を開裂するであろう。実施例２のように調製した細胞抽出物(５μｌ)を、２５０ナノモルのｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−グリコピラノシド、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−キシロピラノシドまたはｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを含む２５μｌの５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５.５と共に３７℃で４時間インキュベートした。７５μｌのホウ酸ナトリウムｐＨ９.８を添加して反応を停止させ、反応混合物の吸光度を４１０ｎｍで測定した。Ｘ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの２つの菌株ＮＥＢ４２０及びＮＥＢ４９７に対するこのスクリーニングアッセイの結果を図１４に示す。双方の菌株が、試験した全部のｐ−ニトロフェニルグリコピラノシド基質を開裂し、これは、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ及びβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の存在を示唆する。
【０１７４】
しかしながら、実施例２に記載のようにＡＭＣ−基質を使用したとき、２つの菌株の細胞抽出物は図１４及び図１５に示すようにα−及びβ−グルコシダーゼ活性だけを示した。５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５.５中に１ナノモルのＡＭＣ−基質を含む１０μｌの反応混合物に細胞抽出物(５μｌ)を３７℃で４時間添加し、実施例２に記載の手順でＴＬＣによって分析した。図１５は、細胞抽出物ＮＥＢ４２０及びＮＥＢ４９７を、基質２０２：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ(夫々レーン２及び３)、１６７：Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ(夫々レーン５及び６)、１８０：Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ(夫々レーン８及び９)、１７９：Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏ(夫々レーン１１及び１２)、及び２３３：ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ(夫々レーン１４及び１５)に対して試験した結果を示す。非消化の基質(レーン１、４、７及び１０)を対照として用いた。図１５において、レーン８、９、１１及び１２だけが末端単糖の遊離を示した。レーン８及び９は、α−グルコースの除去を示し、レーン１１及び１２はβ−グルコースの遊離を示し、これらは、双方の菌株にα−及びβ−グルコシダーゼ活性が存在することを示唆する。他の全部のＡＭＣ−基質は２つのＸ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ菌株からの細胞抽出物とインキュベートしたときに加水分解耐性であり、これによって、特定の単糖誘導体について測定したグリコシダーゼ活性は、この糖残基がオリゴ糖の一部であるときは必ずしも糖残基に対する活性に翻訳されないことを示す。同様に、オリゴ糖基質を開裂する能力が発見されたグリコシダーゼは、誘導体化された単糖を必ずしも加水分解しない(Ｓａｎｏら,(１９９２)Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７：１５２２−１５２７)。
【実施例９】
【０１７５】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ Ｈｏｌｃｉｃｏｌａからのグリコシダーゼの精製方法
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｌｃｉｃｏｌａの発酵
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｌｃｉｃｏｌａ菌ＮＥＢ１２１株(ＡＴＣＣ＃１３４６１)を、１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ及び０.３ｇ／ｌのＮａＯＨから成る培地中で増殖させた。細胞を通気及び撹拌を伴って後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心によって採取し、−７０℃で凍結保存した。
【０１７６】
粗抽出物の調製
以後の手順はすべて氷上または４℃で行った。上記で得られた細胞ペースト(１９１ｇ)を２倍容のバッファＡ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７.５]、５０ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ)に懸濁させた。細胞懸濁液をＧａｕｌｉｎホモジナイザー(Ｍ−１５モデル)に１２,０００ｐｓｉで２回通した。溶菌液をＳｈａｒｐｌｅｓ連続遠心管で１,３００ｇで４０分間遠心した。５６５ｍｌの上清が得られた。
【０１７７】
グリコシダーゼの精製
酵素を疎水性及び電荷に従って分画する一連の分離方法を使用して、粗細胞抽出物からグリコシダーゼを分離及び精製した。表５に記載の条件を用い実施例７に記載の方法に従って酵素を検定した。
【０１７８】
粗抽出物(５６５ｍｌ)をバッファＢで平衡させたＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(５.０×１５ｃｍ)に充填した。β−キシロシダーゼ及びβ−マンノシダーゼの双方を含有するカラム通過物を、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム(２.６×１５ｃｍ)に導入した。カラムを１６０ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで、４００ｍｌのバッファＡ中のＮａＣｌの直線勾配(０.０５−０.９５Ｍ)によって処理した(流速１ｍｌ／分；８ｍｌ画分)。ＮａＣｌ勾配(０.３５−０.６Ｍ)で溶出したβ−キシロシダーゼを含有する画分をプールし、酵素をＡ項に記載の手順で更に精製した。β−マンノシダーゼ活性はヘパリンカラム通過物中に存在し、これをＢ項に記載の手順で更に精製した。
【０１７９】
Ａ.β−キシロシダーゼ
上記の酵素プールをバッファＡに２時間透析し、次いでバッファＡで平衡させたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１２ｃｍ)に導入した。酵素活性を含有するカラム通過物を、バッファＣ(２０ｍＭのリン酸カリウム[ｐＨ６.０]、２５ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ)に２時間透析し、バッファＣで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に導入した。カラムを２０ｍｌのバッファＣで洗浄し、次いで、１５０ｍｌのバッファＣ中のＮａＣｌの直線勾配(０.０２５−０.９５Ｍ)で処理した(流速１ｍｌ／分；２ｍｌの画分)。酵素は０.４−０.５５Ｍに溶出し、プールした画分をバッファＡに２時間透析した。透析後、プールをバッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ(３ｍｌ)カラムに充填した。カラムを６ｍｌのバッファＡで洗浄し、次いで９０ｍｌのバッファＡ中のＮａＣｌの直線勾配(０.０５−０.９５Ｍ)で処理した(流速１ｍｌ／分；１ｍｌ画分)。酵素活性は０.２−０.３Ｍに溶出し、プールした画分をバッファＡに一夜透析した。ナトリウムアジドを０.０２％まで添加し、次いで酵素を４℃で保存した。４,０００単位の収量の実質的に純粋な酵素が得られた。
Ｂ.β−マンノシダーゼ
(ＮＨ４)２ＳＯ４(６６ｇ)をカラム通過物(５００ｍｌ)に最終濃度１Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４となるまで添加し、バッファＢ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７.５]、０.９５Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０.１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ)で平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.６×１５ｃｍ)に導入した。カラムを１６０ｍｌのバッファＢで洗浄し、次いで８００ｍｌのバッファＢ中の(ＮＨ４)２ＳＯ４の漸減直線勾配(０.０９５−０.００１Ｍ)で処理した。酵素が０.９−０.７Ｍに溶出し、プールした画分をバッファＣに４時間透析した。プールした酵素を、バッファＣで平衡させたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.０×１０ｃｍ)に充填した。カラムを２０ｍＭのバッファＣで洗浄し、次いで１５０ｍｌのバッファＣ中のＮａＣｌの直線勾配(０.０２５−０.９５Ｍ)で処理した(流速１ｍｌ／分、２ｍｌ画分)。プールした酵素をバッファＤ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７.５]、２５ｍＭのＮａＣｌ、０.１ｍＭ
のＮａ２ＥＤＴＡ)に４時間透析し、次いでバッファＤで平衡させたＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５(１ｍｌ)のカラムに導入した。活性はカラム通過物中で検出された。０.８ｇの(ＮＨ４)２ＳＯ４を通過物に添加し、次いで、バッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０(８ｍｌ)カラムに導入した。活性はカラム通過物中で検出された。０.８ｇの(ＮＨ４)２ＳＯ４を最終濃度１.５Ｍに添加し、次いで、バッファＥ(２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ７.５]、２.０Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０.１ｍＭのＮ
ａ２ＥＤＴＡ)で平衡させたＰｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０カラムに導入した。カラムを１０ｍｌのバッファＥで洗浄し、次いで１００ｍｌのバッファＥ中の(ＮＨ４)２ＳＯ４の漸減直線勾配(２.０−０.０２Ｍ)で処理した(流速１ｍｌ／分、１.５ｍｌ画分)。酵素活性は１.０−０.８５Ｍに溶出し、プールした画分をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮装置(Ａｍｉｃｏｎ,Ｉｎｃ.Ｂｅｖｅｒｌｙ,Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ)を用いて１ｍｌに濃縮した。濃縮した酵素をバッファＡに一夜透析した。ナトリウムアジド(０.２％)及びＢＳＡ(０.１ｍｇ／ｍｌ)を添加し、酵素を４℃で保存した。５００単位の収量の実質的に純粋な酵素が得られた。
【実施例１０】
【０１８０】
グリコシダーゼの特性決定
Ａ.β−キシロシダーゼ
図１６は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｌｃｉｃｏｌａから単離されたβ−キシロシダーゼが、ＡＭＣ−基質３００：Ｍａｎα１−６(Ｍａｎα１−４)(Ｘｙ１β１−２)(Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４(Ｆｕｃα１−３)ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ(レーン１−４)、及び、２６４：Ｘｙ１β１−４Ｘｙ１β１−４Ｘｙ１β−４−Ｃｏ(レーン５及び６)を開裂する能力を示す。５ｍＭのＣａＣｌ２を補充した５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６.０中に１ナノモルのＡＭＣ−基質３００(レーン３及び４)を含むか、または、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ４.５中に１ナノモルのＡＭＣ−基質２６４(レーン６)を含む１０μｌの反応混合物に５単位のβ−キシロシダーゼを添加した。β１−３キシロシル結合がβ−キシロシダーゼによって加水分解されるいくつかの反応物は、Ｘ.ｍａｎｉｈｏｔｉｓから単離された２単位のα１−２,３マンノシダーゼ(実施例４)を含んでいた(レーン２及び４)。非消化の基質を対照として用いた(レーン１及び５)。二糖１９１：Ｇａｌα１−３Ｇａｌ−Ｃｏ及び四糖２０２：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏをマーカー(Ｍ)として用いた。反応物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで実施例２に記載の手順でＴＬＣによって分析した。図１６に示すように、β−キシロシダーゼは反応物にα１−２,３マンノシダーゼが含まれているときにのみ(レーン２及び３)ＡＭＣ−基質３００のβ１−２結合を開裂した(レーン３)。α−マンノシダーゼ非含有でインキュベートしたときは開裂が全く観察されなかった(レーン４)。β−キシロシダーゼはまたＡＭＣ−基質２６４のβ１−４結合を開裂した。
【０１８１】
Ｂ.β−マンノシダーゼ
図１７は、β−マンノシダーゼがＡＭＣ−基質２５９：Ｍａｎ１−４Ｍａｎ１−４Ｍａｎ−Ｃｏ(レーン１及び２)、及び、３００：Ｍａｎα１−６(Ｍａｎα１−４)(Ｘｙ１β１−２)Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４(Ｆｕｃα１−３)ＧｌｃＮＡｃ−Ｃｏ(レーン３−８)を開裂する能力を示す。５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５.５中に１ナノモルのＡＭＣ−基質２５９(レーン２)を含むかまたは５ｍＭのＣａＣａｌ２を補充した５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６.０中に１ナノモルのＡＭＣ−基質３００(レーン７及び８)を含む１０μｌの反応混合物に２.５単位のβ−マンノシダーゼを添加した。β１−４マンノシル結合がβ−マンノシダーゼによって加水分解されるいくつかの反応物は、Ｘ.ｍａｎｉｈｏｔｉｓ(実施例４)から単離された２単位のα１−２,３マンノシダーゼ(レーン４−７)、Ｘ.ｈｏｌｃｉｃｏｌａ(上記)から単離された２単位のβ−キシロシダーゼ(レーン５−７)、Ｘ.ｍａｎｉｈｏｔｉｓ(実施例４)から単離された１０単位のα１−６マンノシダーゼ(レーン６及び７)を含んでいた。非消化基質を対照として用いた(レーン１及び３)。二糖１９１：Ｇａｌα１−３Ｇａｌ−Ｃｏ及び四糖２０２：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−Ｃｏをマーカー(Ｍ)として用いた。反応物を３０℃で２時間インキュベートし、次いで実施例２に記載の手順でＴＬＣによって分析した。図１７に示すように、β−マンノシダーゼは、反応物にα１−２,３マンノシダーゼ、β−キシロシダーゼ及びα１−６マンノシダーゼが含まれているときにのみＡＭＣ−基質３００のβ１−４結合を開裂した(レーン７)。これらの酵素を伴わずにインキュベートしたときは開裂が全く観察されなかった(レーン８)。β−マンノシダーゼはまたＡＭＣ−基質２５９のβ１−４結合を開裂した(レーン２)。
【実施例１１】
【０１８２】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅからβ−マンノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼを精製する方法
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅの発酵
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ菌ＮＥＢ４１６株をＤｉｆｃｏ栄養ブイヨンで増殖させた。通気及び撹拌を伴って細胞を３０℃で後期対数増殖期までインキュベートした。細胞を遠心分離によって採取し、−７０℃で凍結保存した。
【０１８３】
β−マンノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼの精製
１００リットルの発酵物から得られた３７８ｇのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ細胞からβ−マンノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼを精製した。細胞を１,１４４ｍｌのバッファＡ(２０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.５、５０ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させ、Ｇａｕｌｉｎプレスを通すことによって溶解した。Ｓｈａｒｐｌｅｓ遠心管中の遠心分離によって細胞破片を除去した。上清をバッファＡで平衡させたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム(５.０×１６.０ｃｍ)に通した。カラムを１,５００ｍｌのバッファＡで洗浄した。ＤＥＡＥカラムの通過物と洗浄液の最初の５００ｍｌとを収集し、バッファＡで平衡させたＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂカラム(２.５×２９.０ｃｍ)に充填した。Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを７５０ｍｌのバッファＡで洗浄した。β−マンノシダーゼを精製するために、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから収集した通過物及び洗浄液(２,３００ｍｌ)に１,２０３ｇの硫酸アンモニウムをゆっくりと添加し、硫酸アンモニウムの濃度を８０％飽和にした。沈殿物を撹拌しながら４℃で一夜インキュベートした。１５,０００×ｇで２０分間遠心分離することによって沈殿物を収集した。ペレットを３５０ｍｌのバッファＡに再懸濁させ、１Ｍの硫酸アンモニウムを含有するバッファＢ(２０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.５及び１ｍＭのＥＤＴＡ)に一夜透析した。透析後に残存する沈殿物を１５,０００×ｇで２０分間遠心分離することによって完全に除去した。次のカラムがオーバーロードにならないように、上清(２７０ｍｌ)を２組に分け、以後は等しく処理した。１３５ｍｌの上清を、１Ｍの硫酸アンモニウムを含有するバッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６高速流(ｌｏｗ ｓｕｂ)カラム(２.５×２９ｃｍ)に充填した。Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを、１Ｍの硫酸アンモニウムを含有する１,０００ｍｌのバッファＢで洗浄した。１Ｍ−０.０５Ｍの硫酸アンモニウムの漸減直線勾配でカラムからβ−マンノシダーゼを溶出させた。１４ｍｌの画分を流速２ｍｌ／分で収集し、活性を検定した。０.６−０.５Ｍ硫酸アンモニウムに溶出する活性のピークをプールし、バッファＣ(２０ｍＭのＫＰＯ４,ｐＨ６.０、０.１ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのＮａＣｌ)に透析し、バッファＣで平衡させたＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム(１.５×１０ｃｍ)に充填した。カラムを８０ｍｌのバッファＣで洗浄し、酵素を０.０１−０.９５ＭのＮａＣｌ直線勾配でカラムから溶出させた。３ｍｌの画分を流速１ｍｌ／分で収集した。０.１５〜０.１３Ｍに溶出する活性のピークをプールし、１Ｍの硫酸アンモニウムを含有するバッファＢに４時間透析した。透析したプールを１Ｍの硫酸アンモニウムを含有するバッファＢで平衡させたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ１０／１０カラムに充填した。１Ｍの硫酸アンモニウムを含有するバッファＢでカラムを洗浄し、酵素を１Ｍ−０.０５Ｍの硫酸アンモニウムの漸減直線勾配でカラムから溶出させた。１.５ｍｌの画分を流速１ｍｌ／分で収集し、活性を検定した。０.７−０.６Ｍの硫酸アンモニウムに溶出する活性のピークをプールし、０.０２％のナトリウムアジドを含有するバッファＡに透析し、酵素を４℃で保存した。実質的に純粋なβ−マンノシダーゼの収量は１.２×１０３単位であった。
【０１８４】
実質的に実施例９に記載のプロトコルに従ってＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅからβ−キシロシダーゼを精製した。実施例７に記載の方法に従って測定した収量は５００単位であった。
【０１８５】
精製したβ−マンノシダーゼの特性決定
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅから上記の手順で精製した１０単位のβ−マンノシダーゼは、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファｐＨ５.４中で補因子の非存在下に０.５ナノモルの基質(Ｍａｎβ１−４Ｍａｎβ１−４Ｍａｎ−Ｃｏと反応することが判明した。酵素は４.５〜６.０のｐＨ範囲で同様に活性であった。３７℃で１時間インキュベーションを実施した。
【０１８６】
β−マンノシダーゼ遺伝子のクローニング
１.ＤＮＡ精製：Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅのＤＮＡを調製するために、１ｇの細胞ペーストを３ｍｌの０.３Ｍショ糖、２５ｍＭのＴｒｉｓ(ｐＨ８.０)、２５ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍｇ／ｍｌのリゾチームに再懸濁させた。懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、４ｍｌの２×Ｋｉｒｂｙミックス[２ｇのトリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、１２ｇの２−アミノ−サリチル酸ナトリウム、５ｍｌの２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ８、６ｍｌのフェノール(Ｔｒｉｓ,ｐＨ８.０で中和)]を細胞懸濁液に添加し、渦流ミキサーで１分間撹拌した。中和フェノールとクロロホルムとの１：１混合物(フェノール／クロロホルム)８ｍｌを管に添加し、混合物を１５分間撹拌した。細胞溶解液を１２,０００×ｇで１０分間遠心処理した。水相を３ｍｌのフェノール／クロロホルムを入れた新しい管に移し、渦流ミキサーで１５秒間撹拌した。懸濁液を１２,０００×ｇで１０分間遠心した。上方の相を新しい管に移し、１／１０倍容の３Ｍの酢酸ナトリウムと等容量のイソプロパノールとを管に添加した。管を倒立させて管の内容物を混合した。ＤＮＡの凝塊をシールしたパスツールピペットで管から取り出し、１０ｍｌの７０％エタノールを入れた管に移した。ＤＮＡを一度洗浄し、５ｍｌのＴＥ(１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０及び１ｍＭのＥＤＴＡ)に溶解し、ＲＮアーゼを最終濃度４０ｍｇ／ｍｌに添加した。ＤＮＡを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１.５ｍｌのフェノール／クロロホルムを１５秒間渦流させることによってＤＮＡ溶液と混合した。懸濁液を１２,０００×ｇで１０分間遠心し、水相を新しい管に移した。１／１０倍容の３Ｍの酢酸ナトリウムと等容量のイソプロパノールとを水相に添加した。ＤＮＡの凝塊をシールしたパスツールピペットで管から取り出し、１０ｍｌの７０％エタノールを入れた管に移した。ＤＮＡを一度洗浄し、２ｍｌのＴＥに溶解させた。
２.部分消化：精製したＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで開裂して以下のごとく部分消化した。１０ｍＭのＢｉｓ Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ−ＨＣｌ,ｐＨ７.０、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオトレイトールバッファ中に７６μｇ／ｍｌの１２５μｌのＤＮＡを１００μｇ／ｍｌのＢＳＡと共に含む溶液を、４００μｌのアリコートと４つの２００μｌのアリコートとに分割した。４００μｌの管に２単位のＳａｕ３ＡＩを添加し、４.７５μｇのＤＮＡあたり１単位の酵素が含まれるようにした。第１の管から２００μｌを取り出して第２の管に移し、４.７５μｇあたり０.５単位のＳａｕ３ＡＩが含まれるようにし、以後同様にして、連続する管の各々が直前の管の半量のＳａｕ３ＡＩを含むようにした。管を３７℃で１５分間インキュベートし、７２℃で１５分間熱処理し、次いで、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡバッファ中の０.７％アガロースゲルで電気泳動にかけた。ＤＥＡＥアニオン交換濾紙に２時間電気泳動させることによって約９〔２ｋｂ範囲の大きさのＤＮＡフラグメントを収集した。０.１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む１５０μｌのバッファ中で濾紙を２回洗浄した。次いで、１.０ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８.０及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む７５μｌのバッファ中で濾紙を４回洗浄することによって濾紙からＤＮＡを溶出させた。得られたＤＮＡフラグメント含有溶液を３００μｌのフェノール／クロロホルムで抽出し、次いで３００μｌのクロロホルムで抽出し、ドライアイス／エタノール浴に１５分間入れることによって１ｍｌの無水エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを１４Ｋｒｐｍで５分間ペレット化した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、風乾し、最終容量１０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ８及び１ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁させた。精製したフラグメントを以下の段階３で使用した。
３.結合：フラグメント化したＤＮＡを以下の手順でｐＵＣ１９に結合した。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した３μｇのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ＤＮＡ(１０μｌ)を、１.５μｇのＢａｍＨＩ開裂し脱リン酸化したｐＵＣ１９(１μｌ)と混合した。４μｌの１０×結合ミックス(５００ｍＭのＴｒｉｓ,ｐＨ７.５、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＡＴＰ)を添加し、更に２５μｌの滅菌蒸留水を添加して最終容量を３９μｌとした。１μｌの濃縮Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(２×１０６Ｕ／ｍｌ)を添加し、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。１０μｌの結合物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＶＳ ０.０２５μＭフィルターを用いて滴下透析することによって脱イオン化した。次に、ＤＮＡを大腸菌ＥＤ８７６７に電気穿孔した。電気穿孔の準備として１リットルの大腸菌細胞をＬブイヨン中でＫｌｅｔｔ５０−８０まで増殖させた。細胞を氷上で１５〜３０分間冷却し、次いで低温下で４,０００ｒｐｍで１５分間ペレット化した。ペレットを氷冷滅菌水中で２回及び１０％グリセロール中で１回洗浄した。洗浄したペレットを１〜２ｍｌの１０％グリセロールに最終細胞濃度３×１０１０細胞／ｍｌに再懸濁させた。必要になるまで細胞を１００μｌのアリコートにして−７０℃で凍結した。準備した細胞にＤＮＡを電気穿孔するために、細胞を静かに解凍し、氷に載せた。４０μｌの細胞と１０μｌの結合及び透析したＤＮＡとを混合した。混合物を低温の０.２ｃｍの電気穿孔キュベットに入れた。時定数４〜５ミリ秒で１２.５ｋＶ／ｃｍの電気パルスをＤＮＡ細胞混合物に印加した。大腸菌を直ちに１ｍｌのＬブイヨンに希釈し、３７℃で３０分間増殖させ、選択培地を含む１５０ｍｍのＬ寒天プレートで平板培養した。３７℃で一夜インキュベーション後、β−マンノシダーゼを発現するクローンを以下の手順でスクリーニングした。
４.β−マンノシダーゼクローンのスクリーニング。パラ−ニトロフェニル糖のような合成基質を開裂し得るβ−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、先ず、色素産生基質４−メチルウンベリフェリル(４−ＭＵ)β−Ｄ−マンノピラノシドを試験した。この基質を１.５％寒天に添加し、コロニーを含む選択プレートに重層した。重層後、長波紫外光(３６６ｎｍ)でコロニーを観察することによって活性β−マンノシダーゼを産生するコロニーを同定し得る。この実験では２×１０４コロニーをこの基質を用いてスクリーニングしたが、蛍光コロニーは単離されなかった。この方法でクローンが全く単離されなかったので、他の方法を使用しなければならなかった。Ｘ.ｏｒｙｚａｅのβ−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、分画平板培養培地を使用した。使用した培地はラクトースを利用できない炭素ソースとして大腸菌突然変異体(ｌａｃ−)をスクリーニングするために使用したＥＭＢ寒天の変種である。旧来のＥＭＢ寒天はラクトースと２種類の指示色素、エオシンイエロー及びメチレンブルーを含む。ラクトースを発酵させ得る大腸菌の菌株(ｌａｃ＋)をＥＭＢ寒天で増殖させたときに、コロニーは暗紫色から黒色を呈するが、ｌａｃ−大腸菌コロニーはラクトース発酵能力がないので白色である。β−マンノシダーゼを発現するクローンをスクリーニングするために、ライブラリー(上記)を１００ｍｇのカルベニシリン、０.４ｇのエオシンイエロー、０.０６５ｇのメチレンブルー及び１ｇのα−マンノビオースを培地１リットルあたりに含むＭ９最小培地に約３０,０００ｃｆｕ／ｍｌの濃度で平板培養した。二糖マンノビオース(マンノースβ−１−４マンノース)は、マンノビオースを宿主によって発酵させられるマンノースに開裂するクローン化したβ−マンノシダーゼを発現しなければ大腸菌によって炭素ソースとして利用されない。プレートを３７℃で７日間インキュベートした。１５,０００ｃｆｕの平板培養コロニーのうちの２つのコロニーが、暗赤色を呈した。これらのコロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天上で単離コロニーとして画線培養し、３７℃で増殖させた。単離コロニーをアンピシリン含有の５ｍｌのＬＢに採取し、３７℃で６時間増殖させた。２つの試験コロニーのうちで、一方からの粗抽出物はβ−マンノシダーゼ活性を示した。アンピシリン含有ＬＢに採取し３７℃で１８時間増殖させた単離コロニーから調製した粗抽出物はβ−マンノシダーゼ活性を全く示さなかった。この方法は、合成基質を開裂しないかまたは大腸菌中で不安定な他のグリコシダーゼ(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｓからのエキソ−α１−６マンノシダーゼ及びエキソ−α１−２,３−マンノシダーゼ)を単離するために使用された。以下の制約だけが存在する。(１)エキソ−グリコシダーゼが存在しなければ宿主は二糖、三糖またはオリゴ糖を利用できない。(２)エキソ−グリコシダーゼによって遊離された糖は大腸菌が利用できる唯一の炭素ソースでなければならない。(３)エキソ−グリコシダーゼを発現する宿主を増殖させる寒天ベースに十分な量で添加できる量の糖基質を入手しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】２つの単糖間に形成されることが可能なグリコシド結合を示す。
【図２】グリコシド活性の存在を判定するためにＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓの粗抽出物をオリゴ糖基質と共にインキュベートした結果を示す。
【図３】酵素濃度を測定するために倍加系列希釈の精製酵素を用いて行ったα１−３,６ガラクトシダーゼの基質(１０９)に対する力価の測定を示す。
【図４】基質１２０、９５及び１１３を用いて行ったα１−２フコシダーゼ(ＩＩ)及びα１−３,４フコシダーゼ(Ｉ)のキャラクタリゼーションを示す。
【図５】直鎖状βＧｌｃＮＡｃ１−Ｘの選択的開裂をβＧａｌＮＡｃ１−Ｘとの比較によって証明するために基質１１８及び１６７を用いて行ったβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【図６】直鎖状及び分枝状の基質を用いて行ったβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【図７】付加的夾雑グリコシダーゼを含む市販のソースに由来のヘキソサミニダーゼとの比較によって行ったＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−ＧｌｃＮＡｃアーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【図８】Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ１−３＞＞４ガラクトシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、Ｇａｌβ１−４Ｒ結合に比較したＧａｌβ１−３Ｒ結合に対する基質優先性が証明され、ニワトリ肝臓及びウシ睾丸から得られた市販の酵素との違いが示されている。
【図９】α１−３,６ガラクトシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、他のソース(コーヒー豆)から得られたガラクトシダーゼ中に見出されるＧａｌα１−４Ｒ結合に対する酵素活性の欠如を示す。
【図１０】直鎖状基質に対するα−マンノシダーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩの活性のキャラクタリゼーションを示す。
【図１１】分枝状基質上に対するα−マンノシダーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩの活性のキャラクタリゼーションを示す。
【図１２】Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−グルコシダーゼのキャラクタリゼーションを示しており、Ｇｌｕα１−４Ｒ、ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｒ結合に比較したＧｌｕβ１−４Ｒ結合に対する基質優先性が証明されている。
【図１３】グリコシダーゼ活性の存在を判定するために、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓの粗抽出物をオリゴ糖基質３００と共にインキュベートした結果を示す。
【図１４】グリコシダーゼ活性を測定するために、Ｘ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの粗抽出物をｐ−ニトロフェニルグリコシド基質と共にインキュベートした結果を示す。
【図１５】グリコシダーゼ活性の存在を判定するために、Ｘ.ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの粗抽出物をオリゴ糖基質と共にインキュベートした結果を示す。
【図１６】基質３００及び２６４を用いたＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−キシロシダーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【図１７】基質２５９及び３００を用いたＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のβ−マンノシダーゼのキャラクタリゼーションを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞ライセート中におけるグリコシダーゼの存在をスクリーニングする方法であって、
（ａ）宿主細胞のライセートを得、
（ｂ）一組の標識オリゴ糖基質と共に該ライセートをインキュベートし、
（ｃ）一組の基質のうちいずれの標識オリゴ糖基質が切断されるかを特定し、
（ｄ）工程（ｃ）よりグリコシダーゼを同定する段階を含む前記方法。
【請求項２】
工程（ｃ）が更に
（ｉ）グリコシダーゼを単離、精製し、
（ｉｉ）単離したグリコシダーゼを同一のまたは更なる一組の標識オリゴ糖基質とともにインキュベートし、いずれの基質が切断されるかを特定し、
（ｉｉｉ）精製されたグリコシダーゼを基質特異性で特徴付ける段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
同定または精製されたグリコシダーゼが炭水化物中の特定のタイプのグリコシド結合を選択的に切断する請求項１または２に記載の方法。
【請求項１】
細菌細胞ライセート中におけるグリコシダーゼの存在をスクリーニングする方法であって、
（ａ）宿主細胞のライセートを得、
（ｂ）一組の標識オリゴ糖基質と共に該ライセートをインキュベートし、
（ｃ）一組の基質のうちいずれの標識オリゴ糖基質が切断されるかを特定し、
（ｄ）工程（ｃ）よりグリコシダーゼを同定する段階を含む前記方法。
【請求項２】
工程（ｃ）が更に
（ｉ）グリコシダーゼを単離、精製し、
（ｉｉ）単離したグリコシダーゼを同一のまたは更なる一組の標識オリゴ糖基質とともにインキュベートし、いずれの基質が切断されるかを特定し、
（ｉｉｉ）精製されたグリコシダーゼを基質特異性で特徴付ける段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
同定または精製されたグリコシダーゼが炭水化物中の特定のタイプのグリコシド結合を選択的に切断する請求項１または２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−１６１１９７（Ｐ２００８−１６１１９７Ａ）
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０７８２（Ｐ２００８−２０７８２）
【出願日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【分割の表示】特願２００４−３０７７２０（Ｐ２００４−３０７７２０）の分割
【原出願日】平成６年９月２２日（１９９４．９．２２）
【出願人】（５９１０２１９７０）ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【分割の表示】特願２００４−３０７７２０（Ｐ２００４−３０７７２０）の分割
【原出願日】平成６年９月２２日（１９９４．９．２２）
【出願人】（５９１０２１９７０）ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド (18)
【Ｆターム（参考）】
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