新規な核内受容体の非ゲノム活性のモジュレーター（ＭＮＡＲ）およびその使用
【課題】新規な蛋白である、核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）（これは、エストロゲン受容体α（ＥＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）、および他の核内受容体と相互作用する）の利用。
【解決手段】ＭＮＡＲのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含む融合ポリペプチド、およびゲノム活性に対して非ゲノム活性を示す化合物を同定する方法であって、ＭＮＡＲ−核内受容体の複合体を含む細胞に試験化合物を投与し、該試験化合物から由来の非ゲノム活性またはゲノム活性を測定することを含む方法等が提供される。
【解決手段】ＭＮＡＲのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含む融合ポリペプチド、およびゲノム活性に対して非ゲノム活性を示す化合物を同定する方法であって、ＭＮＡＲ−核内受容体の複合体を含む細胞に試験化合物を投与し、該試験化合物から由来の非ゲノム活性またはゲノム活性を測定することを含む方法等が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学および内科の分野に関し、そして新規な核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）（これは、エストロゲンα（ＥＲα）、およびエストロゲンβ（ＥＲβ）の両方と相互作用する）に関する。より詳細には、本発明は、エストロゲン受容体の転写活性および／またはチロシンキナーゼのｓｒｃファミリーの活性化を調節するための新規な組成物、方法、ならびにアッセイに関する。本発明はまた、核内受容体（例えば、エストロゲン受容体）のゲノム活性と非ゲノム活性との間の区別のための、新規な組成物、方法、およびアッセイに関する。さらに、本発明は、ＭＮＡＲをコードする核酸、アンチセンス、核酸の組み換え発現、ならびに本発明の核酸および蛋白を利用する宿主細胞、組成物、およびアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
核ホルモン受容体は、リガンド誘導性転写因子のスーパーファミリーであり、これは、遺伝子発現のリガンド依存性転写制御に関与する、クラスである。受容体分子において立体配置的な変化を誘導する特定のリガンドの結合は、他の転写因子との受容体相互作用に影響し、そして最終的には前開始複合体の形成に影響する。このプロセスは、遺伝子転写の速度を調節する（D．J．Mangelsdorfら、Cell ８３：８３５〜９，１９９５（非特許文献１））。
【０００３】
核ホルモン受容体のスーパーファミリーとしては、ステロイドホルモン受容体、非ステロイドホルモン受容体、およびオーファン受容体が挙げられる。糖質コルチコイド（ＧＲ）、鉱質コルチコイド（ＭＲ）、プロゲスチン（ＰＲ）、アンドロゲン（ＡＲ）、およびエストロゲン（ＥＲ）の受容体は、古典的なステロイド受容体の例である。ステロイドホルモン受容体に加えて、この核ホルモン受容体のスーパーファミリーは、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、およびレチノイドのような非ステロイドホルモンの受容体からなる。さらに、いわゆる「オーファン」受容体をコードする、ある範囲の核内受容体様配列が、同定されている。これらのオーファン受容体は、核ホルモン受容体に構造的に関連しており、従って核ホルモン受容体として分類されるが、推定のリガンドは、まだ同定されていない（Cell，８３：８５１〜８５７，１９９５（非特許文献２））。
【０００４】
核ホルモン受容体のスーパーファミリーは、６つの別個の構造、かつ機能であるドメイン（Ａ〜Ｆ）を含むモジュール構造によって構造的かつ機能的に特徴付けられる。より詳細には、これらの受容体は、可変性のＮ末端領域（ドメインＡ／Ｂ）を有し；その後ろに、以下を有する：中心に位置した、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン（本明細書において以降では、ＤＢＤと呼ばれる；ドメインＣ）；可変性のヒンジ領域（ドメインＤ）；保存されたリガンド結合ドメイン（本明細書において以降はＬＢＤと呼ばれる；ドメインＥ）；および可変性のＣ末端領域（ドメインＦ）。Cell（前出）。
【０００５】
サイズおよび配列が高度に可変性であるＮ末端領域は、このスーパーファミリーの異なるメンバーの間でもあまり保存されていない。この受容体のこの部分は、転写活性化の調節に関与する。
【０００６】
ＤＢＤは、約６６〜７０のアミノ酸からなっており、ＤＮＡ結合活性を担う。このドメインは、クロマチン上の特定の標的遺伝子の転写制御単位内の、ホルモン反応性エレメント（本明細書において以降はＨＲＥと呼ばれる）と呼ばれる、ＤＮＡ配列に特異的な受容体を標的する。ＧＲ、ＭＲ、ＰＲ、およびＡＲのようなステロイド受容体は、同様のＨＲＥ ＤＮＡ配列を認識するが、ＥＲは、異なるＤＮＡ ＨＲＥ配列を認識する。ＤＮＡへの結合後、このステロイド受容体は、基礎的な転写機構の成分と、そして配列特異的な転写因子と相互作用して、これによって特定の標的遺伝子の発現を調節すると考えられる。
【０００７】
ＬＢＤは、この受容体のＣ末端部分に位置しており、主にリガンド結合活性を担う。このように、ＬＢＤは、ホルモンリガンドの認識および結合に必須であり、そしてさらに、転写活性化機能を有し、それによってこの受容体のホルモン応答の特異性および選択性を決定する。構造中では中程度に保存されているが、ＬＢＤは、核ホルモン受容体スーパーファミリーの個々のメンバーの間では相同性がかなり変化していることが公知である。
【０００８】
核内受容体のホルモンリガンドが細胞に進入し、かつＬＢＤによって認識されるとき、それは、特定の受容体蛋白に結合して、それによって受容体蛋白のアロステリックな改変を開始する。（Cell，前出）。この改変の結果として、リガンド／受容体複合体は、転写的に活性な状況に切り替わり、そしてそれ自体が、ＤＢＤの存在によって、クロマチンＤＮＡ上で対応するＨＲＥに高い親和性で結合し得る。このように、リガンド／受容体複合体は、特定の標的遺伝子の発現を調節する。このファミリーの受容体によって達成された多様性は、異なるリガンドに対して応答する能力に起因する。
【０００９】
ゲノム活性の調節に加えて、ホルモン受容体複合体は、重要かつ変化した非ゲノム効果を有し得る。この非ゲノム活性は、細胞内のセカンドメッセンジャーにおける高速かつ一過性の増大によって特徴付けられる。次に、これらのセカンドメッセンジャーは、増殖および分化のような細胞機能に影響する、多数の異なる経路およびカスケードに関与する。
【００１０】
より詳細には、ステロイドホルモン受容体は、胚の発生、成体の恒常性、および器官の生理学に関連する。種々の疾患および異常が、ステロイドホルモン作用における撹乱に帰せられる。ステロイド受容体は、非ゲノム活性のホルモン活性化転写モジュレーターとして、およびホルモン活性化合物刺激因子として、その影響を及ぼすので、これらの受容体を改変するか、これらの受容体と相互作用するか、またはこれらの受容体を調節するための種々のアプローチへのさらなる検討が、非常に重要な領域である。例えば、これらの受容体における変異および欠損、ならびにこれらの受容体の過剰刺激またはブロックによって、ホルモンシグナル伝達経路の基礎にある機構に対して良好な洞察が提供され得、これによって、ステロイド受容体に関連する疾患および異常の広範な種々の処置における効力の増大がもたらされる。
【００１１】
（エストロゲン受容体）
エストロゲン（Ｅ２）は、ＥＲとの相互作用を通じて、異なる組織において多くの生物学的効果を発揮する。アミノ酸配列解析、一過性のトランスフェクション研究、およびＥＲの変異分析によって、ＥＲが、上記の古典的なモジュール構造を有することが示される。ＥＲのＮ末端Ａ／Ｂドメインは、転写活性化機能１（ＴＡＦ−１）と呼ばれる、トランス活性化機能を含む。ＤＢＤは、２つのジンクフィンガーを含み、かつＤＮＡ認識を担う。ＬＢＤおよび二次トランス活性化機能（ＴＡＦ−２と呼ばれる）は、ＥＲのＣ末端に位置する。
【００１２】
ホルモンに対する結合の際、ＥＲは、活性化および形質転換の段階を経験する。活性化されたＥＲは、特定のエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）と相互作用する。このＥＲＥは、エストロゲン調節遺伝子のプロモーター領域に位置しており、かつその標的遺伝子転写に影響する。過去１０年間にわたって、多くの研究が、ＥＲ上のリガンド（アゴニスト／アンタゴニスト）の効果、およびＥＲの構造と機能との間の関係の両方の基本的な理解を提供してきた。それにもかかわらず、ＥＲの非ゲノム活性についての機能に関しては、ほとんど明らかになっていない。
【００１３】
ＥＲβは、ＥＲαと呼ばれる、さらに一般的に公知のエストロゲン受容体とは異なっていると考えられる。ＥＲαおよびＥＲβは、総称的に、本明細書においてＥＲと呼ばれる。ＥＲβのＤＢＤは、ＥＲαのＤＢＤに対して９０％同一である。しかし、ＥＲαのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）とＥＲβのリガンド結合ドメインとの間の全体的な相同性は、５５％未満である。ＥＲα同様に、ＥＲβは、リガンド依存性の様式でＥＲＥからの転写を刺激し得る。
【００１４】
エストロゲンは、細胞内セカンドメッセンジャー（カルシウムおよびｃＡＭＰを含む）のレベルの高速かつ一過性の増大を誘導すること、およびエストロゲンは、マイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＭＡＰＫ）およびホスホリパーゼＣの活性化を誘導することが確認されている（CollinsおよびWebb，１９９９）。実際、多くの研究によって、エストロゲンが、Ｓｒｃ／Ｒａｓ／ＭＡＰキナーゼリン酸化経路の迅速かつ一過性の活性化を誘導することが実証された。この経路の活性化によって、細胞増殖および分化を誘導する重要な細胞機能が誘引される。これらの急性の事象の時間経過は、ペプチドホルモンによって惹起されたものと似ており、これによって、これらの事象はエストロゲンの「古典的な（clasical）」ゲノム作用に関与しないという仮説が、支持される。
【００１５】
現在のデータによってまた、エストロゲン受容体と、マイトジェン活性化蛋白（ＭＡＰ）キナーゼシグナル伝達カスケードとの間の直接のリンクが示唆される。ＭＡＰキナーゼは、リン酸化され、かつ種々のシグナルに対する応答において活性化されるセリン−トレオニンキナーゼのファミリーである。これらの酵素は、細胞外シグナルを、複数の膜受容体から細胞内標的（転写因子、細胞骨格蛋白、および酵素を含む）に伝達する。ＭＡＰキナーゼファミリーは、細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）、ｐ３８、およびｃＪｕｎＮ末端キナーゼ（Ｒａｓ、Ｒａｆ、およびマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＭＥＫ）の連続的活性化に関与する経路を通じてシグナル伝達する）を含む（S．M．Thomas，J．S．Brugge，Annual Review of Cell ＆ Developmental Biology １３，５１３〜６０９，１９９７（非特許文献３））。肺の内皮細胞、ニューロン細胞、骨芽細胞、および破骨細胞において、１７βエストラジオール（Ｅ２）は、ＭＡＰＫ経路を急速に活性化することが報告されている。
【００１６】
より詳細には、肺内皮細胞において、１７βエストラジオール（Ｅ２）は、一酸化窒素（ＮＯ）産生を急速に刺激することが報告されており、したがってこのことは、Ｅ２が血管の急性拡張を誘導する能力を説明する。Chenら（Chenら、１９９９）は最近、単離された肺内皮細胞において、Ｅ２が内皮一酸化窒素合成（ｅＮＯＳ）の急速な活性化合物を誘導することを報告している。ｅＮＯＳのエストロゲン活性化は、ＭＡＰキナーゼ経路の急速な活性化を通じて生じることが示された。コンプリメンタリーな研究によってまた、Ｅ２が、原形質膜から核に近い細胞内部位へのｅＮＯＳのカルシウム依存性転位を誘導すること（急速（５分以内）であり、受容体媒介性であるが、非ゲノムである作用）が示された（Goetzら、１９９９）。さらに、ホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ（３）Ｋ）のｐ８５α調節性サブユニットとのリガンド依存性ＥＲα相互作用は最近、エストロゲンの心血管保護効果の薬物治療に結び付けられた（Simoncini T、およびJ．K．、２０００）。エストロゲンを用いた刺激によって、ＥＲα関連ＰＩ（３）Ｋ活性が増大され、それによって蛋白キナーゼＢ／Ａｋｔ、および内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）の活性化がもたらされる。
【００１７】
ニューロン細胞において、Ｅ２によるＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の急速な活性化によって、グルタミン酸塩興奮毒性の後の一次皮質ニューロンにおける神経保護が生じる（Singerら、１９９９）。エストロゲンのこれらの神経保護効果（曝露の後５分以内に生じることが報告された）は、ＥＲ依存性の様式で、c−Ｓｒｃ−チロシンキナーゼの一過性の活性化、およびｐ２１（ｒａｓ）−グアニンヌクレオチド活性化蛋白のチロシンリン酸化を通じて媒介された。
【００１８】
同様に、骨芽細胞において、Ｅ２は、５分以内にＭＡＰキナーゼリン酸化、および活性化を誘導する（Endohら、１９９７）。従って、Ｅ２は、これらの細胞における細胞増殖および分化を調節し、骨形成の増大を導く。いくつかの研究によってまた、エストロゲンは、Ｓｒｃキナーゼの活性化を通じて、破骨細胞においてＭＡＰキナーゼ経路を活性化することが示される（Oursler，１９９８）。これはまた、ＭＡＰキナーゼ活性化が、骨再吸収に必要な酵素の調節に関与し得ることを示している（Kristen D．Brubaker，１９９９）。
【００１９】
ヒト乳癌由来細胞株であるＭＣＦ−７、およびＴ４７Ｄにおいて、ならびにヒト結腸癌由来細胞株であるＣａｃｏ−２において、Ｅ２は、Ｓｒｃ／Ｒａｓ／Ｅｒｋ経路を誘導するシグナルを活性化する（Migliaccioら、１９９３）、（Migliaccioら、１９９６）、（Migliaccioら、１９９８）、（Migliaccioら、２０００）。この活性化は、直接のＥＲ−Ｓｒｃ相互作用によって媒介される。興味深いことに、プロゲステロンはまた、Ｔ４７Ｄ細胞において同じ経路を活性化する（Migliaccioら、１９９８）。Ｓｒｃ／Ｒａｓ／Ｅｒｋシグナル伝達経路は、増殖因子の周知の標的である。重要なことに、この経路の活性化は、ＥＲとＳｒｃとの直接の相互作用を必要とする。この経路の活性化は、増殖または分化のような異なる細胞応答を誘発する［Cantley，１９９１］；［Marshall，１９９６］；Downward，１９９７］。ステロイドホルモンのような、エストロゲン受容体リガンドによるこの経路の活性化によって、細胞周期制御におけるその関与が詳細に説明される。
【００２０】
これらのデータによって、ＥＲの非転写活性／非ゲノム活性が、細胞増殖の刺激の原因であり得るという見解が支持される。しかし、このプロセスの分子機構の詳細はほとんど未知である。Ｓｒｃ活性化は、多数のヒト乳癌および結腸癌において以前に観察されている（［Rosen，１９８６］；［Ottenhoff−Kalff，１９９２］）。Ｓｒｃの活性化によって、トランスジェニックマウスにおける乳房腫瘍が誘導される（［Guy，１９９４］）。構成的に活性なＲａｓ変異体は、乳癌を含む全ての癌のうち２５〜３０％で見出されている（［Kasid，１９８７］）。
【００２１】
最近の研究によって、古典的なＥＲに無関係の原形質膜エストロゲン受容体の存在が示唆されている。この膜ＥＲのクローニングまたは単離は、達成されていないが、他の研究では、古典的なＥＲの小集団は、細胞膜に関連しており、かつエストロゲンの急速な効果の原因であることが示唆されている。
【００２２】
核内受容体自体の転写活性が、複数のシグナル伝達経路による緻密な調節のための標的である。これらの経路としては、神経伝達物質ドーパミン（［Power，１９９１］；［Smith，１９９３］）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）のような増殖因子、トランスホーミング成長因子−α（ＴＧＦ−ａ）、およびインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）（［Ignar−Trowbridge，１９９６］、［Aronica，１９９３］；［Bunone，１９９６］）によって、ならびにプロテインキナーゼＣのアクチベーター（［Aronica，１９９４］）によって刺激される経路が挙げられる。このような交差カップリングの分子機構は、少なくとも一部は、受容体リン酸化によって媒介されると考えられる。ＥＲは、ＥＧＦに対する応答においてＭＡＰキナーゼによってリン酸化され、それによってＡＦ１の刺激が生じることが実証されている（［Kato，１９９６（非特許文献２１）］；［Bunone，１９９６］）。他の研究によって、ＥＲ（［Auricchio，１９８７］；［Arnold，１９９５］；［Pietras，１９９５］）、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲβ）（［Lin，１９９２］）、ＲＡＲγ（［Rochette−Egly，１９９２］）、糖質コルチコイド受容体（［Rao，１９８７］）、およびオーファン受容体ＨＮＦ−４（［Ktistaki，１９９５］）がまた、チロシンリン酸化の標的であることが実証された。特定のチロシンリン酸化部位は、ヒトＥＲ（ｈＥＲ）のＡＦ２ドメイン内の、アミノ酸５３７で（Ｙ５３７）同定された（［Castoria，１９９３］；［Arnold，１９９５］）。このチロシンは、ＡＦ２配列のすぐＮ末端に位置しており、かつＥＲβを含む、多様な種由来の全ての公知のＥＲ配列において保存されている（［Kuiper，１９９６］；［Mosselman，１９９６］）。
【００２３】
Ｅ２の非ゲノム活性およびゲノム活性の分子機構は、十分解明されていないが、本発明によって、我々は、組織および遺伝子の選択性の活性を用いた新世代の治療法を創出することができるはずである。
【００２４】
いくつかのＥＲリガンドの組織選択性作用をさらに理解するために、本発明者らは、異なる細胞株においてＥＲ相互作用蛋白の発現および活性を評価した。アフィニティー精製および質量分析（ミクロシーケンシングに基づく）を用いて、本発明者らは、ＭＮＡＲ（核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター）と命名された新規なＥＲ相互作用蛋白を開発した。
【非特許文献１】D．J．Mangelsdorfら、Cell ８３：８３５〜９，１９９５
【非特許文献２】Cell，８３：８５１〜８５７，１９９５
【非特許文献３】S．M．Thomas，J．S．Brugge，Annual Review of Cell ＆ Developmental Biology １３，５１３〜６０９，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、新規な蛋白である、核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）、およびこの蛋白をコードする核酸を提供する。ＭＮＡＲ蛋白は、エストロゲン受容体のような核ホルモン受容体と相互作用し得る。概して、ＭＮＡＲの蛋白またはポリペプチドとは、ＭＮＡＲのアミノ酸配列をいう。特に好ましい実施形態において、ＭＮＡＲ蛋白は、ＥＲα、およびＥＲβと相互作用する。この相互作用はリガンド依存性である。ＭＮＡＲはまた、ＥＲおよびキナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーのメンバー）と複合体を形成する。ＳｒｃおよびＭＡＰキナーゼ活性は、ＥＲ転写活性の増強をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、（ａ）配列番号２の推定アミノ酸配列を有する、ＭＮＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む新規な核酸を提供する（図１２を参照のこと）。ヒトＭＮＡＲのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される（図１５を参照のこと）。ヒトＭＮＡＲのアミノ酸配列は、配列番号１３に示される（図１６を参照のこと）。マウスＭＮＡＲのヌクレオチド配列は、配列番号１２に示される（図１７を参照のこと）。マウスＭＮＡＲのアミノ酸配列は、配列番号１３に示される（図１８を参照のこと）。
【００２７】
本発明は、新規な単離された核酸であって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号１３のアミノ酸配列を含む、新規な蛋白である、核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｂ）高度にストリンジェントな条件下で、以下：（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列のある領域と、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列の少なくとも１００ヌクレオチドの配列と、（ｉｉｉ）または、（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１の配列、または配列番号１２の配列をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも８５％同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１の配列、または配列番号１２の配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの変種；ならびに
（ｅ）配列番号２０または２３のアミノ酸を含むポリヌクレオチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）のポリヌクレオチドの相補型またはアンチセンス型；
からなる群より選択されるポリヌクレオチドであって、ここでこのポリヌクレオチドは、ｐ１６０蛋白（図１）をコードしない、ポリヌクレオチド、
を含む、新規な単離された核酸配列を提供する。好ましい実施形態において、この単離された核酸は、このポリヌクレオチドの対立遺伝子変種を含む。
【００２８】
特定の実施形態において、この核酸は、発現制御配列（例えば、異種制御配列、または同種制御配列）に作動可能に連結される。本発明は、このような単離された核酸を用いて形質転換された宿主細胞（細菌、酵母、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）を提供する。
【００２９】
本発明はまた、ポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号１３のアミノ酸配列を含む、蛋白である、核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１４、１５、または１６のアミノ酸配列を含む、ＭＮＡＲフラグメントのアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の変種、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のフラグメント、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、に関する。
別の実施形態において、これらのポリペプチドは、配列番号１３または１４のアミノ酸配列に９０％、または９５％より多く同一である、アミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２、１３、１４、１５、１６、２０、または２２のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、１つ以上の核内受容体の存在下において、チロシンキナーゼの活性を刺激し得る。この核内受容体は、ステロイド核内受容体、および非ステロイド核内受容体、ならびにオーファン核内受容体から選択され得る。特定の実施形態において、この核内受容体は、エストロゲン受容体である。
【００３０】
別の実施形態は、ＭＮＡＲポリペプチドに対応するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメントを含む。
【００３１】
核内受容体のＭＮＡＲによる調節の観点において、本発明の多くの実施形態は、核内受容体の転写活性を調節する工程に関する。この工程は、核内受容体の遺伝子座に対してＭＮＡＲポリペプチドを提供することを含む。例えば、（ａ）請求項１に記載のＭＮＡＲの核酸配列を有する組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程；および（ｂ）；この核酸を発現するように形質転換されたこの宿主細胞を、核内受容体の存在下で培養する工程によって、核内受容体の転写活性を調節することができる。
【００３２】
本発明はまた、核内受容体の非ゲノム活性またはゲノム活性に影響する化合物を同定するための多くのアプローチを示す。１つの実施形態において、ゲノム活性に対して、非ゲノム活性を示す化合物を同定する方法は、ＭＮＡＲ−核内受容体複合体を含む細胞に対して試験化合物を投与する工程、およびこの試験化合物から生じる非ゲノム活性またはゲノム活性を測定する工程、を含む。これらの方法において、好ましくは、核内受容体の少なくとも１つのリガンドが細胞中に存在するか、またはキナーゼが存在するか、または両方ともが存在する。他の方法は、核内受容体上でＭＮＡＲの活性を調節する化合物についてのスクリーニングに関する。これは、以下の工程：（ａ）試験化合物と、ＭＮＡＲポリペプチドとを接触させる工程；および（ｂ）この試験化合物が、このポリペプチドに特異的に結合するか否かを決定する工程、を含む。さらに、核内受容体上でＭＮＡＲの活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法であって、この方法は、以下の工程（ａ）このポリペプチドおよび核内受容体を含む細胞に、試験化合物を添加する工程；ならびに（ｂ）この添加工程の前後でＭＮＡＲ活性を比較する工程、を含む方法を実施することができる。この方法に対するさらなるアプローチは、ＭＮＡＲ活性を欠くか、または有意に低下したＭＮＡＲ活性を有する変異細胞を含むコントロールに対して、試験化合物を投与することを含む。これらの方法のいずれかにおいて、当業者は、コントロールを用いて、ある化合物の非ゲノム活性（またはゲノム活性）を評価し得る。この評価は、ＭＮＡＲおよび核内受容体の存在下で、ある細胞に対してある化合物を投与する工程、次いでＭＮＡＲの非存在下でこの実験を繰り返す工程、ならびに非ゲノム活性のレベルを比較する工程による。好ましい方法は、ＭＮＡＲ、核内受容体、またはその両方を過剰発現する細胞を使用する。ある化合物のゲノム活性は、レポーターと作動可能に結合した核レポーターを有することによって検出される。
【００３３】
本発明の特定の実施形態はまた、非ゲノム活性に対して、選択的ゲノム活性を有する化合物を同定する方法に関しており、この方法は、以下の工程：（ａ）ＭＮＡＲ−核内受容体複合体を含む細胞に対して試験化合物を添加する工程、および（ｂ）この試験化合物のこの添加の前後に非ゲノム活性に対してゲノム活性を比較する工程、を含む。選択的ゲノム活性は、従来の手段によって測定され得る。好ましくは、測定される非ゲノム活性の増大または正の影響は、ＭＮＡＲの非存在下において試験化合物を用いたゲノム活性と比べて（ここで、この試験化合物の添加後に非ゲノム活性の変化は観察されない）、ＭＮＡＲ核レポーターの存在下において、細胞に対するこの試験化合物の添加後に、２倍増大する。一方では、非ゲノム活性について試験化合物を選択する場合、ＭＮＡＲの非存在下において試験化合物を用いた非ゲノム活性と比べて（ここで、この試験化合物の添加後にゲノム活性の変化は観察されない）、ＭＮＡＲ核内受容体複合体の存在下において、細胞に対するこの試験化合物の添加後に、少なくとも約２倍増大しなければならない。ＭＮＡＲの存在下で核内受容体の転写活性が増大するか低下するかを決定することによって、この効果を測定することができる。
【００３４】
種々の細胞（健常、または疾患細胞）において、細胞にとって有益な状態または健常な状態が、非ゲノム活性またはゲノム活性に起因するか否かを理解することが有用であり得る。本発明は、ＭＮＡＲの存在下および非存在下において、細胞の所望の表現型を比較することによって、このような決定を可能にする。
【００３５】
本発明はまた、ヒト以外のトランスジェニック動物に関する。ここで１つ以上の細胞が、少なくとも１つの非機能性の内因性ＭＮＡＲポリヌクレオチド配列、少なくとも１つの非機能性内因性核内受容体、またはその両方を含む。好ましい実施形態において、このヒト以外のトランスジェニック哺乳動物は、ＥＲα、およびＥＲβの機能的な内因性形態を有さない。あるいは、トランスジェニック動物は、内因性ＭＮＡＲプロモーターの誘導性／抑制性プロモーターでの置換を含む。請求の範囲のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物は、この哺乳動物の少なくとも１つの細胞型において活性なプロモーターの制御下で、内因性選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。
【００３６】
本発明はまた、ＭＮＡＲの機能を破壊する化合物についてスクリーニングする方法に関する。この方法は、ＭＮＡＲと相互作用する化合物を同定するための蛋白間相互作用アッセイを用いることを含む。一旦、任意の周知のツーハイブリッドアッセイまたは他の従来のアッセイを使用すれば、蛋白間相互作用、および試験化合物（これは、天然の産物の単離物、低分子化合物、ペプチドなどであり得る）によるその破壊を研究することができる。
【００３７】
ＭＮＡＲ蛋白およびＭＮＡＲコード核酸は、哺乳動物の細胞および組織（例えば、ヒトおよびマウスの細胞および組織）から入手できる。組み換えＭＮＡＲ、および抗ＭＮＡＲ抗体は、薬物スクリーニング、診断、および治療法における用途を見出す。詳細には、Ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼ（遺伝子発現を調節するのに関与する）の酵素活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズするＥＲリガンドについて化合物をスクリーニングするための特定の生化学的アッセイを開発するのにおいて、ＭＮＡＲは、有用な試薬を提供する。さらに、種々の核内受容体リガンドについて化合物をスクリーニングするための特定の生化学的アッセイを開発するのにおいて、ＭＮＡＲは有用な試薬を提供する。従って、核内受容体（例えば、ＥＲ）、および／またはキナーゼに関与する任意の経路において効果を分析することができる。例えば、以下：（Ｉ）癌細胞における細胞周期刺激；（ＩＩ）骨の発達または調節のための細胞増殖、細胞分化、および細胞保護；（ＩＩＩ）神経細胞におけるＥＲリガンド／試験化合物の神経保護活性；ならびに（ＩＶ）内皮細胞の肺の指標、に対するＥＲリガンドまたは試験化合物の影響を決定するために、ＭＮＡＲを用いてアッセイを構成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
（特定の実施形態の詳細な説明）
（定義）
所定のＭＮＡＲ蛋白または、所定のＭＮＡＲに対して「実質的な機能的同一性」を有する蛋白の機能的類似体を、このようなＭＮＡＲに特異的な１つ以上の生化学的特性を示す蛋白として規定する。
【００３９】
「核酸分子」とは、一本鎖分子または二本鎖分子を意味し、そしてこれには、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、およびＲＮＡまたはＤＮＡ分子の類似体が挙げられる。
【００４０】
「転写調節」とは、転写の改変を意味し、そしてこれには、以下：転写開始の速度、転写のレベル、または調節性制御に対する転写／転写開始の反応性、の変化が挙げられる。
【００４１】
「細胞の新生物状態」とは、細胞（良性であっても悪性であってもよい）の任意の新しい増殖を意味する。
【００４２】
「実質的に純粋」、または「単離された」という用語は、ＭＮＡＲ蛋白、ＭＮＡＲ蛋白フラグメント、またはＭＮＡＲもしくはＭＮＡＲフラグメントをコードする核酸が、それが正常には、その天然の状態で伴っている、少なくともいくつかの物質を伴わないことを意味する。実質的に純粋なＭＮＡＲの組成物、またはその一部は、診断、治療、および研究用の試薬において有用な、賦形剤および添加物を含んでもよい。
【００４３】
「改変された発現状態」とは、天然に存在する状態のＭＮＡＲの発現が、天然に存在する状態と比較して、ＭＮＡＲ発現を増大または減少するように改変されていることを意味する。
【００４４】
「実質的な配列同一性」とは、蛋白または核酸の一部が、ＭＮＡＲ配列部分と、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、または９９％の配列同一性を示すことを意味する。この配列が本明細書に開示されるネイティブなＭＮＡＲ配列とは異なる場合、その相違は好ましくは保存的、すなわち、酸性アミノ酸の酸性アミノ酸置換であるか、または冗長性コドンを提供するヌクレオチド変化である。異なる配列は、重合体にわたって均一に分布されるのではなく、領域内で局所的に集合される。実質的に同一な配列は、比較的高いストリンジェンシーのもとで、相補的なＭＮＡＲコード配列に対してハイブリダイズする。高ストリンジェンシーなサザンハイブリダイゼーション条件を規定する目的で、Sambrookら（１９８９）第３８７〜３８９頁（参考として本明細書に援用される）が都合よく参照され得る。ここで、第１１頁における洗浄工程が、高ストリンジェンシーであると考えられる。
【００４５】
「融合蛋白またはポリペプチド」とは、第二のアミノ酸配列に融合した少なくとも第一のアミノ酸配列を含む、蛋白またはポリペプチドであって、ここでこのような融合は天然に存在する蛋白またはポリペプチドには生じない、蛋白またはポリペプチドを意味する。好ましくは、この融合蛋白またはポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸配列は、ＭＮＡＲのアミノ酸配列である。
【００４６】
「変異体または変異」とは、遺伝物質（例えば、ＤＮＡ）における任意の検出可能な変化、またはこのような変化の任意のプロセス、機構もしくは結果を意味する。これには、遺伝子変異（遺伝子の構造（例えば、ＤＮＡ配列）が改変されている）、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子またはＤＮＡ、および改変された遺伝子またはＤＮＡ配列によって発現される任意の発現産物（例えば、蛋白、ポリペプチド、または酵素）が挙げられる。
【００４７】
「変種」は、改変されたかまたは改変された遺伝子、ＤＮＡ配列、蛋白、ポリペプチド、酵素、細胞など（すなわち、任意の種類の変異体）を示すために用いられる。天然に存在する蛋白またはポリペプチドの変種は、例えば、天然に存在する蛋白またはポリペプチドにおける、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、改変、および／または挿入を含む。
【００４８】
「組み換え体」とは、任意の遺伝物質であって、その遺伝物質（例えば、ＤＮＡ配列）に、もともと生物学的にも天然にも存在しないある配列（例えば、全長または部分的ＤＮＡ配列）のその配列または鎖への挿入から、生物学的もしくは化学的に生じる遺伝物質（例えば、ＤＮＡ配列）、を意味する。
【００４９】
「蛋白またはポリペプチドフラグメント」とは、より大きい蛋白またはポリペプチドのうちのより小さい任意の部分であって、ここでこのフラグメントは好ましくは、少なくとも約８アミノ酸、そしてより好ましくは２５、５０、１００、または２００アミノ酸を有する部分、を意味する。
【００５０】
受容体の非ゲノム活性とは、「細胞に対して有益」であり、ここでこの細胞は、この細胞に対する増大した量のＭＮＡＲの導入の際、所望の活性または表現型の存在を示す。
【００５１】
受容体の非ゲノム活性とは、「細胞に対して有益でない」であり、ここでこの細胞は、この細胞に対する増大した量のＭＮＡＲの導入の際、所望の活性または表現型の非存在を示す。
【００５２】
（ＭＮＡＲの特徴づけ）
ＭＮＡＲの配列解析によって、ＭＮＡＲの分子のＮ末端部分に局在する複数のＬＸＸＬＬモチーフが明らかになった。他の転写因子における同様のモチーフは、核内受容体のリガンド結合ドメインの表面上の疎水性グルーブとの接触を形成することが以前に示された（（Heeryら、１９８７）、（Torchiaら、１９９７））。ＭＮＡＲ分子の別の重要な特徴は、プロリンリッチドメインである。このドメインは、ＳｒｃファミリーのプロテインキナーゼのＳＨ３ドメインとの相互作用のために利用され得る。初めに、本発明者らは、ＭＮＡＲが、核内受容体とＳｒｃキナーゼとの相互作用を増強し得ると仮定した。本発明者らのデータによって、エストロゲン受容体α、およびβが、ＭＮＡＲと相互作用すること、およびこの相互作用は、１７βエストラジオールによって増強されるが、４（ＯＨ）タモキシフェンでは増強されないことが示される。興味深いことに、ＭＮＡＲ−ＥＲ複合体は、インビトロおよびインビボの両方で、Ｓｒｃキナーゼの酵素活性と強力に相互作用し、かつこれを刺激する。重要なことに、ＭＮＡＲの過剰発現は、ＥＲ転写活性の増強をもたらす。本発明者らは、ＥＲのこの活性が、Ｓｒｃの下流のキナーゼの１つによる、ＥＲのリン酸化に起因すると予想する。従って、本発明者らは、ＭＮＡＲが、ＥＲとＳｒｃキナーゼとの相互作用を調節し、かつそれによってＥＲの非ゲノム活性を媒介すると提起する。
【００５３】
本発明者らのデータによって、ＥＲリガンドについて、本発明者らがアッセイすることを可能にする、ＥＲリガンドのゲノム活性と非ゲノム活性との間を区別し得る実験モデルの開発が支持される。ＥＲの転写活性に影響しないが、Ｓｒｃ酵素活性を刺激するリガンドは、重要な骨節約、ＣＮＳ防御的、かつ心保護的な活性を保有し得る。一方では、ＥＲの転写活性を選択的に制御する化合物は、かなりの選択性作用を有し、それによって多数の副作用を回避する。全体として、本発明者らが核内受容体リガンド、特にＥＲリガンドのゲノム活性および非ゲノム活性を分離する能力によって、本発明者らは、大いに集中した選択性の作用を用いて新世代の治療方法を創出することができるかもしれない。
【００５４】
本発明者らのデータによってまた、核内受容体リガンドのゲノム活性と非ゲノム活性との間を区別し得る核内受容体リガンドについて、本発明者らがアッセイすることを可能にする実験モデルの開発が支持される。種々の核内受容体の転写活性に影響しないが、Ｓｒｃ酵素活性、または他の非ゲノム酵素活性を刺激するリガンドは、重要な治療的特性、または活性を保有する。一方では、核内受容体の転写活性を選択的に制御する化合物は、かなりの選択性作用を有し、それによって多数の副作用を回避する。全体として、本発明者らが核内受容体リガンドのゲノム活性および非ゲノム活性を分離する能力によって、本発明者らは、大いに集中した選択性の作用を用いて新世代の治療方法を創出することができるかもしれない。
【００５５】
（ＭＮＡＲをコードする核酸配列、および対応するＭＮＡＲ蛋白）
生物学的に活性なＭＮＡＲ，またはそのＭＮＡＲフラグメントは、ＭＮＡＲの機能（例えば、ＥＲとの複合体を特異的に形成する能力、またはＥＲの転写活性を調節もしくは強化する能力）のうち１つ以上を保持する。生物学的活性についての例示的なアッセイを、以下、および実施例に記載している。特異的な結合は、ＭＮＡＲ（例えば）を、成分の混合物と接触させること、およびＭＮＡＲに優先的に結合する成分を同定することによって、経験的に決定される。特異的な結合は、多数の方法（酵母および哺乳動物のハイブリッドシステム、ならびに競合的結合研究が挙げられるがこれらに限定されない）によって都合よく示され得る。例えば、ＥＲまたはＭＮＡＲについての、可能性のある活性化補助因子、受容体、および／またはリガンドを同定するために、酵母ツーハイブリッドアッセイを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【００５６】
キナーゼとＭＮＡＲ−ＥＲ複合体との間の相互作用の分析に加えて、ＭＮＡＲを同様のストラテジーで用いて、ＥＲリガンドと、他の公知の転写因子を有するＥＲ（他の核内受容体を含む）との間の相互作用を評価し、かつ新規な相互作用する蛋白を同定し得る。例えば、ＭＮＡＲ−ＥＲの相互作用は、１７β−エストラジオールによって増強され得るので、試験因子（化合物であっても、蛋白であっても、ペプチドであってもよい）の効果を評価することができる。さらに、Ｓｒｃの有無において、ＭＮＡＲとＥＲとの間の直接の相互作用を実証するために、酵母ツーハイブリッドシステム、哺乳動物ツーハイブリッドシステム、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、または他のアッセイを用いてもよい。同様に、ＭＮＡＲ−ＥＲ複合体、またはＭＮＡＲ−ＥＲ−Ｓｒｃ複合体と相互作用する公知の蛋白および新規の蛋白について広範にスクリーニングするために、これらのアッセイシステムを用いることができた。
【００５７】
本発明は、組み換え産生されたＭＮＡＲ蛋白、ＭＮＡＲ類似体、およびそれらのフラグメントを提供する。これらの組み換え産物は、本明細書に開示されるか、または引用された、さもなければ当業者に公知である、物理的技術、化学的技術、および分子技術によって容易に改変される。本発明の特定の実施形態に従って、ＭＮＡＲコード配列のフラグメントは、異種配列と接合されて融合蛋白を生成する。このような融合蛋白は、インビトロおよびインビボでＥＲ活性を調節するのにおいて特に有用である。
【００５８】
ＭＮＡＲはさらに、当該分野で公知の方法によって改変され得る。例えば、ＭＮＡＲは、リン酸化されても、脱リン酸化されても、グリコシル化されても、脱グリコシル化されても、放射性標識があっても、放射性標識がなくても、その他でもよい。セリン残基、トレオニン残基、およびチロシン残基は特に、有用なリン酸化部分を提供し得る。特に有用なのは、ＭＮＡＲの溶解性、膜輸送能力、安定性、ならびに結合特性および親和性を変更する改変である。いくつかの例としては、脂肪酸アシル化、蛋白分解、および結合を安定化する、核内受容体転写因子相互作用ドメインにおける変異が挙げられる。特に、ＬＸＸＬＬモチーフのうちの１つのプロリンリッチ領域を改変してもよい。
【００５９】
実質的に純粋もしくは単離された、ＭＮＡＲ蛋白、またはＭＮＡＲ部分（核酸によってコードされる）は、一般に、このＭＮＡＲコード核酸に対して少なくとも約１％；好ましくは少なくとも約１０％；より好ましくは少なくとも約５０％；そして最も好ましくは少なくとも９０％相同性である。核酸重量のパーセンテージは、ＭＮＡＲまたはＭＮＡＲ部分をコードする核酸（選択的スプライシング型または部分的転写型のような、別の型および類似体を含む）の重量を、存在する総核酸重量で割ることによって決定される。
【００６０】
本発明はまた、以下を提供する：転位、転換、欠失、挿入、または他の改変（例えば、選択的スプライシング、およびこのような別の型）によって改変されたＭＮＡＲ配列、ゲノムＭＮＡＲ配列、ＭＮＡＲ遺伝子隣接配列（ＭＮＡＲ調節配列、および他の非転写ＭＮＡＲ配列を含む）、ＭＮＡＲのｍＲＮＡ配列、ならびにＭＮＡＲコード配列に相補的なＲＮＡおよびＤＮＡのアンチセンス配列、異種ＭＮＡＲをコードする配列、および合成ヌクレオチドを含むＭＮＡＲ配列。ここで、例えば、リン酸基の酸素は、イオウ、メチルなどで置換されてもよい。
【００６１】
改変されたＭＮＡＲコード配列、または関連の配列は、ＭＮＡＲ様の機能を有する蛋白をコードする。一般に、その少なくとも一部と、ＭＮＡＲの一部との間には、特に保存的置換、特にプロリンリッチ領域、およびＬＸＸＬＬモチーフ内において、ならびに蛋白間相互作用、特にＭＮＡＥ−ＥＲもしくはＭＮＡＲ−ＥＲ−キナーゼ相互作用、特にＭＮＡＲ−核内受容体、もしくはＭＮＡＲ−核内受容体−キナーゼ相互作用に関与する蛋白ドメインをコードする領域内において、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％の実質的な配列同一性が存在する。
【００６２】
ＭＮＡＲは、本明細書において記載されるか、さもなければ当該分野で公知の方法によって、別の精製、生合成、改変、または用途に供されてもよい。例えば、そのアミノ酸は、多数の方法（安定性、溶解度、結合親和性、特異性、およびメチル化を改変する工程が挙げられるがこれらに限定されない）で改変されてもよい。本発明のアミノ酸配列はまた、検出可能なシグナルを提供し得る標識を用いて、直接または間接的に、改変されてもよい。例示的な標識としては、放射性同位体、蛍光剤、およびビオチン化が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
ＭＮＡＲの少なくとも一部をコードする核酸を用いて、そのＭＮＡＲと相互作用する核因子および核薬剤を同定する。この同定には、Current Protocols in Molecular Biologyにおいて記載されたとおり、酵母または哺乳動物の細胞における発現スクリーニングを用いる（「Protein Expression」第１６章（２００２）を参照のこと）。ＭＮＡＲと相互作用するこれらの核因子および核薬剤を同定する方法の１つは、哺乳動物、または酵母のツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイを利用することである。（例えば、以下を参照のこと：Fields S．ら（１９９４）Trends Genet．１０：２８６〜２９２；Young Pら（１９９２）Current Biology ３：４０８〜４２０；Zervosら（１９９３）Cell ７２：２２３〜２３２；Maduraら（１９９３）J．Biol．Chem．２６８：１２０４６〜１２０５４；Bartelら（１９９３）Biotechniques １４：９２０〜９２４；およびIwabuchiら（１９９３）Oncogene ８：１６９３〜１６９６）。本明細書において例証されたように、転写因子（例えば、Ｇａｌ４）の活性化ドメインをコードするＤＮＡと連結された、融合遺伝子のｃＤＮＡを含有する酵母ｃＤＮＡライブラリーを、ＭＮＡＲの一部、および転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードする融合遺伝子を用いてトランスフェクトした。ＭＮＡＲ結合蛋白をコードするクローンは、転写因子の相補性を提供して、レポーター遺伝子の転写を通じて同定される。例えば、FieldsおよびSong（１９８９）Nature ３４０，２４５〜２４６、およびChienら（１９９１）Proc．Natl．Acad．Sci USA ８８，９５７８〜９５８２を参照のこと。
【００６４】
本発明はまた、ＭＮＡＲ、またはその一部、またはその類似体をコードし、かつ必要に応じてＥＲおよび／またはキナーゼをコードする核酸を含むベクターを提供する。多数のベクター（これとしては、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる）が、種々の真核生物宿主、および原核生物宿主における発現について記載されている。ベクターは、しばしば、クローニングまたは発現のための１つ以上の複製システム、宿主での選択のための１つ以上のマーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）、および１つ以上の発現カセットを備える。挿入されたＭＮＡＲコード配列は、合成されてもよいし、天然の供給源から単離されてもよいし、ハイブリッドとして調製されてもよいし、それ以外でもよい。転写調節配列に対する、このコード配列の連結は、公知の方法によって達成され得る。有利には、ベクターは、ＭＮＡＲコード部分に対して作動可能に連結されたプロモーターを備え得る。
【００６５】
適切な宿主細胞を、任意の適切な方法（エレクトロポレーション、ＣａＣｌ２媒介性ＤＮＡ取り込み、ウイルス感染、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル、または他の確立された方法を含む）によって、形質転換／トランスフェクト／感染させてもよい。あるいは、１つ以上のＭＮＡＲをコードする核酸は、組み換え事象によって細胞に導入されてもよい。例えば、ある配列を、細胞中にマイクロインジェクションして、それによって、ＭＮＡＲをコードする内因性遺伝子、その類似体もしくは偽遺伝子、またはＭＮＡＲコード遺伝子に対して実質的な同一性を有する配列の部位での相同組み換えを達成し得る。非相同組み換え、相同組み換えによる内因性遺伝子の欠失（特に多能性細胞などにおける）のような、他の組み換えベースの方法によってさらなる適用が提供される。
【００６６】
適切な宿主細胞としては、細菌、古細菌、真菌、特に酵母、ならびに植物および動物の細胞、特に哺乳動物細胞が挙げられる。特に興味があるのは、E．coli、B．Subtilis、Saccharomyces cerevisiae、Ａ５４９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｈｅｐ２細胞、ならびに骨細胞、および不死化された哺乳動物骨髄性細胞株およびリンパ細胞株である。好ましい宿主細胞株としては、ＭＣＦ−７細胞、およびＴ４７Ｄ細胞のようなヒト癌細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。理想的には、このような発現系は、市販されているＴＥＴ オン／オフシステムのような誘導性の発現ストラテジーを利用する。このような細胞株は、非ゲノムＥＲ活性におけるＭＮＡＲの役割を規定するために、そしてＭＮＡＲ−ＥＲ相互作用を調節する潜在的な化合物の効果を評価するために有用である。多数の転写開始のエレメント／領域、および終止調節のエレメント／領域が単離されており、そして種々の宿主における異種蛋白の転写および翻訳に有効であることが示されている。これらの領域、単離の方法、操作の様式などの例は、当該分野で公知である。適切な発現制御配列、および宿主細胞／クローニングビヒクルの組み合わせは周知であり、かつSambrookら（１９８９）に記載されている。
【００６７】
オリゴヌクレオチドをコードするＭＮＡＲはまた、他のＭＮＡＲ，または転写因子の活性化補助因子を同定するために用いられ得る。例えば、３２Ｐ−標識されたＭＮＡＲコード核酸を用いて、ＭＮＡＲ関連ドメインを有する蛋白をコードする類似のｃＤＮＡを同定するために、低ストリンジェンシーにおいてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。さらに、本明細書に開示された配列を用いる縮重オリゴヌクレオチドプローブによるＰＣＲ増幅によって、ＭＮＡＲ関連蛋白を単離する。ＭＮＡＲをクローニングするための他の実験方法もまた、以下の実施例に記載されている。本明細書に開示される本発明を実施するための他の有用なクローニング、発現、および遺伝子操作技術は、当業者に公知である。
【００６８】
本明細書に開示される組成物および方法は、遺伝子治療を達成するために用いられてもよい。例えば、Gutierrezら（１９９２）Lancet．３３９，７１５〜７２１を参照のこと。例えば、ＭＮＡＲの発現または調節の改変を達成し得る遺伝子調節配列に対して作動可能に連結されたＭＮＡＲ配列を用いて、細胞をトランスフェクトする。ＭＮＡＲ翻訳を調節するために、ＭＮＡＲ相補性アンチセンスポリヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクトしてもよい。
【００６９】
アンチセンス調節は、遺伝子調節配列に作動可能に連結されたＭＮＡＲアンチセンス配列を使用し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０の長さのヌクレオチド配列であり得る。アンチセンス核酸は、化学合成、および酵素連結反応（当該分野で公知の手順を用いる）を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または種々の改変されたヌクレオチド（この分子の生物学的活性を増大するように、またはアンチセンスとセンスの核酸との間で形成された二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された）を用いて化学的に合成されてもよい。例えば、ホスホロチオエート誘導体、およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る。あるいは、アンチセンス核酸は、発現ベクターを用いて生物学的に生成されてもよい。この発現ベクターには、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされている（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のＲＮＡである）。本発明においては、その遺伝子の転写がＭＮＡＲコードｍＲＮＡに結合し得るアンチセンス転写物を生じるように配向されたプロモーター配列とともにＭＮＡＲ配列を含むベクターを用いて、細胞がトランスフェクトされる。転写は、構成的であっても誘導性であってもよく、そしてベクターは、安定な染色体外の維持または組み込みをもたらし得る。あるいは、ＭＮＡＲの少なくとも一部をコードするゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合する一本鎖アンチセンス核酸配列は、ＭＮＡＲ発現の実質的な減少を生じる濃度で標的細胞に投与され得る。
【００７０】
（核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター、および治療因子を同定するためのアッセイ）
本発明は、核内受容体（例えば、ＥＲ）のゲノム活性または非ゲノム活性を調節するのに有用な因子を同定するための方法および組成物を提供する。このような因子は、広範な疾患（癌、心血管疾患、微生物および真菌の感染、ならびに特に免疫疾患、骨保護、などが挙げられるがこれらに限定されない）の診断または処置において有用である。ヒト細胞において、核内受容体（例えば、ＥＲ）のゲノム活性に対する、核内受容体（例えば、ＥＲ）の非ゲノム活性を通じて作用する化合物をスクリーニングするための迅速かつ簡便なハイスループット生化学アッセイを開発する能力によって、薬物開発の新しい道筋が開かれる。さらに、本発明は、細胞内の疾患状態、または細胞の有益な細胞状態が、核内受容体（例えば、ＥＲ）のゲノム活性／経路によって達成されるか、非ゲノム活性／経路によって達成されるかを決定するためのツールを提供する。すなわち、核内受容体（例えば、ＥＲ）の非ゲノム活性、または核内受容体（例えば、ＥＲ）のゲノム活性が低下／増強されるとき、癌細胞が増殖するか否かを決定することができる。一般に、本発明は、核内受容体（例えば、ＥＲ）のゲノム／非ゲノム活性を必要とするとして、多くの細胞型を分類する工程を提供する。
【００７１】
本明細書において参考として援用される、Young、およびOzenberger（米国特許第５，９８９，８０８号）によって開示されるように、通常のアッセイは、酵母ツーハイブリッドアッセイを含む。ツーハイブリッドアッセイは、本発明の低分子化合物、またはペプチド、または蛋白についてスクリーニングするために用いられてもよい。
【００７２】
代表的には、見込みのある因子を、合成化合物または天然化合物の大きいライブラリーからスクリーニングする。例えば、糖類、ペプチド、および核酸ベースの化合物のランダムな合成および定方向の合成には多くの手段が利用可能である（例えば、Lamら（１９９１）Nature ３５４、８２〜８６を参照のこと）。あるいは、ライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に改変される。このような改変の例は、本明細書に開示される。
【００７３】
ＭＮＡＲまたはＭＮＡＲコード核酸を使用する広範なアッセイを用いて、有用な因子を同定する。このアッセイはまた、核内受容体、ステロイド受容体、オーファン受容体、ＥＲ、ＥＲＥ（エストロゲン応答エレメント）、ＥＲリガンド、キナーゼ、およびこのようなキナーゼのインヒビターから選択される１つ以上を使用してもよい。例えば、蛋白結合アッセイ、核酸結合アッセイ、およびゲルシフトアッセイは有用なアプローチである。例示的なアッセイは、固定されたＭＮＡＲに結合している標識された核内受容体（例えば、ＥＲ）、標識されたＭＮＡＲ、または固定された核内受容体（例えば、ＥＲ）に結合しているＭＮＡＲペプチドなどをアッセイする工程を含む。多くの適切なアッセイが、大量薬物スクリーニングに適切な、大規模化されたハイスループット用法を受け入れやすい。用いられる特定のアッセイは、ＭＮＡＲ相互作用の特定の性質によって決定される。アッセイは、単一のＭＮＡＲ，ＭＮＡＲフラグメント、ＭＮＡＲ融合産物、部分的ＭＮＡＲ複合体、またはＭＮＡＲ核酸を含む完全な基礎的な転写複合体を使用し得る。
【００７４】
有用な因子は、代表的には、ＭＮＡＲ、ＭＮＡＲ−核内受容体複合体、またはＭＮＡＲ−ＥＲ複合体に結合するかまたはそれらの会合を改変する因子である。好ましい因子としては、ＭＮＡＲ遺伝子の発現を調節し得る因子、特に核内受容体スーパーファミリーのメンバーによって転写された遺伝子が挙げられる。
【００７５】
有用な因子は、多くの化学的クラス内で見出されるが、代表的にはそれらは、有機化合物（好ましくは低分子有機化合物）である。低分子有機化合物は、５０を超えるが約２，５００未満、好ましくは約７５０未満、より好ましくは約２５０未満の分子量を有する。例示的なクラスとしては、ペプチド、糖類、ステロイド、などが挙げられる。
【００７６】
選択された因子は、効率性、安定性、薬学的適合性、などを増強するために改変されてもよい。因子の構造的特定は、さらなる因子を特定、生成、またはスクリーニングするために用いられ得る。例えば、ペプチド因子が同定される場合、それらのペプチドは、その安定性を増強するための種々の方法で、例えば、天然にないアミノ酸（例えば、Ｄアミノ酸、特にＤ−アラニン）を用いて、このアミノ末端またはカルボキシ末端を官能化すること（例えば、アミノ基についてはアシル化またはアルキル化、そしてカルボキシル基については、エステル化、またはアミド化）などによって、改変され得る。安定化の他の方法としては、例えば、リポソームなどにおけるカプセル化が挙げられ得る。
【００７７】
因子は、当業者に公知の種々の方法で調製され得る。例えば、約６０アミノ酸未満のペプチドは、従来の市販の自動シンセサイザーを用いて、今日では容易に合成され得る。あるいは、ペプチド（ならびに蛋白および核酸因子）は、公知の組み換え技術によって容易に産生される。
【００７８】
これらのアッセイシステムはまた、潜在的な治療剤（ペプチドおよび化学的リガンドを含む）をスクリーニングするために用いられ得る。ＭＮＡＲ機能のこのような潜在的な治療剤、活性化因子、またはインヒビターは、ＭＮＡＲと、核内受容体（例えば、ＥＲ）、もしくはキナーゼ（「クラスＩ」）のいずれかとの間の相互作用を調節するか、またはＭＮＡＲ、もしくは核内受容体（例えば、ＥＲ）、もしくはキナーゼ（「クラスＩＩ」）の活性を調節することによって作用し得る。ツーハイブリッドアッセイ、免疫沈降アッセイ、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを含むがこれらに限定されない相互作用アッセイが、（「クラスＩ」）治療剤を同定するために用いられ得る。例えば、化合物またはペプチドは、それらがＭＮＡＲと核内受容体（例えば、ＥＲ）との間の相互作用を調節する能力について、ＳＰＲによってスクリーニングされ得る。哺乳動物トランスフェクションアッセイ（ここで核内受容体（例えば、ＥＲ）転写活性が観察される）を含むがこれに限定されない活性アッセイを用いて、「クラスＩＩ」の化合物を同定し得る。例えば、化合物は、それらが核内受容体（例えば、ＥＲ）活性の強化を調節する能力について、ＭＮＡＲによってスクリーニングされ得る。このような化合物は、ＭＮＡＲと核内受容体（例えば、ＥＲ）との相互作用を調節し得るか、またはそれらの化合物は、ＭＮＡＲ、もしくは核内受容体（例えば、ＥＲ）の公知の活性もしくは未知の活性（転写の活性またはキナーゼの酵素活性を評価するために用いられ得る、アッセイを含む）を調節し得る。
【００７９】
治療用途のために、本明細書に開示される組成物および選択された因子は、その化合物の性質に依存する、任意の都合の良い方法で投与され得る。低分子量の因子については、経口投与が好ましく、そして腸溶性コーティング（その化合物が胃の環境に曝された後に保持しているとは予想されない）が必要とされ得る。一般に、投与された量は、慣用的な用量応答実験によって経験的に決定される。代表的には、量は、レシピエントの体重あたりで、約１〜１０００μｇ／ｋｇに及ぶ。大型の蛋白は好ましくは、非経口的に、好都合には生理学的に受容可能なキャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、生理食塩水、脱イオン水など）中で投与される。代表的には、このような組成物は、血液、または滑液のような、保持されている生理学的液体に添加される。他の添加物としては、安定化剤、殺菌剤などが挙げられ得る。これらの添加物は、従来の量で存在する。
【００８０】
ＭＮＡＲはまた、検出可能なシグナルを提供し得る標識を用いて直接または間接的に改変され得る。例示的な標識としては、放射性同位体、蛍光剤などが挙げられる。あるいは、ＭＮＡＲは、３５Ｓ−メチオニンのような標識されたアミノ酸の存在下で発現され得る。このような標識されたＭＮＡＲおよびその類似体は、例えば、ＭＮＡＲと相互作用する蛋白について、発現スクリーニングアッセイにおけるプローブとして、または例えば、薬物スクリーニングアッセイにおいてＥＲに結合するＭＮＡＲ、もしくは他のＥＲと相互作用する蛋白、もしくは転写因子として有用である。
【００８１】
他の核蛋白からＭＮＡＲを識別し得る特定のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、Harlow、およびLane、Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，１９８８、本明細書に援用された他の参考文献に開示された方法および組成物、ならびに当該分野で公知の免疫学的技術およびハイブリドーマ技術を用いて、容易に作成される。詳細には、ＭＮＡＲおよびその類似体およびフラグメントはまた、マウスおよびウサギのような実験動物において抗ＭＮＡＲ抗体を惹起するのに、そして細胞融合または形質転換によるモノクローナル抗体の生成に有用である。
【００８２】
抗ＭＮＡＲ抗体、およびそのフラグメント（Ｆａｂなど）は、転写複合体におけるＭＮＡＲの役割を調節すること、ＭＮＡＲ発現ライブラリーをスクリーニングすること、などに有用である。さらに、これらの抗体は、ＭＮＡＲの構造的類似体を同定、単離、および精製するのに用いられ得る。抗ＭＮＡＲ抗体はまた、種々の細胞周期段階の間の感染、サイトカインによる誘導、プロテインキナーゼＣおよびＡのようなプロテインキナーゼ、などのような、種々の条件下におけるＭＮＡＲの細胞下局在化のために有用である。他の例示的な適用としては、インビトロ転写抽出物を免疫枯渇するためにＭＮＡＲ特異的抗体（モノクローナル抗体、またはＭＮＡＲ由来ペプチド特異的抗体を含む）を用いる工程、ならびにＭＮＡＲ（類似体を含む）、またはＭＮＡＲと相互作用する他の核因子を精製するために免疫親和性クロマトグラフィーを用いる工程が挙げられる。
【００８３】
組成物はまた、例えば、ＭＮＡＲまたはＭＮＡＲコード核酸を改変することによる、疾患における治療行為のために提供される。オリゴペプチドは、純粋な形態で合成され得、そして診断および治療において多くの用途を見出し得る。これらのポリペプチドは、例えば、ＭＮＡＲ相互作用蛋白を用いてネイティブなＭＮＡＲ相互作用を調節するために用いられ得る。このオリゴペプチドは一般に、６アミノ酸より大きく、かつ約６０アミノ酸未満、より通常には約３０アミノ酸未満であるが、大きいオリゴペプチドが使用されてもよい。ＭＮＡＲまたはその一部は、一般には約５０％を超えて、通常は約９０％を超えて純粋な精製型で用いられ得る。このような純度までこのようなペプチドを精製するための方法としては、本明細書で開示されるか、さもなければ当業者に公知の種々の形態のクロマトグラフィーによる分離、化学的分離、および電気泳動による分離が挙げられる。
【００８４】
（トランスジェニック動物およびトランスジェニック細胞）
動物モデルは、例えば、コレステロールレベル、コレステロール吸収、および胆汁酸合成に対する影響について、化合物をスクリーニングするために有用なビヒクルとして役立つ。トランスジェニック動物（操作されたゲノムを有する動物と規定される）は、特定の適用において特に有用であることが証明されるかもしれない。本出願において、関心は、ＥＲ活性の調節または他の核内受容体、およびＥＲの非ゲノム活性に影響するのにおけるＭＮＡＲの役割に集中している。従って、本発明の実施形態は、ＭＮＡＲ活性を欠くトランスジェニックマウス、および核内受容体活性、ＥＲ活性、またはキナーゼ活性を欠くかもしれないトランスジェニック動物を含む。上記の１つ以上を欠いている動物は、ＭＮＡＲ、ＥＲ、キナーゼについての化合物またはリガンドの特異性を決定するために有用である。これらの動物は、このシグナル伝達経路の生物学を解明するのに有用なだけでなく、潜在的な治療組成物、および処置方法を検討するのにおけるツールとしても有用である。
【００８５】
これらの理由によって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも１つの非機能性の内因性ＭＮＡＲ（および／またはＥＲ、および／またはキナーゼ）を有する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物が、改変されたＭＮＡＲおよびＥＲの両方を有し得、これによって、機能的なＭＮＡＲ−ＥＲ複合体を欠く細胞を提供することがさらに意図される。非機能性の特質は、ＭＮＡＲ調節領域において、遺伝子コード配列の中断、蛋白産物を短縮するナンセンス変異、遺伝子コード配列の欠失、または改変を含んでもよい。動物における発現のための異臭遺伝子を設計するのにおいて、遺伝子発現の効率を妨害する配列（例えば、コード配列、プロモーター、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ポリメラーゼＩＩ終止配列、ヘアピン、コンセンサススプライス部位、など）が排除されてもよい。
【００８６】
トランスジェニックのアプローチおよび技術における現在の進歩によって、遺伝子付加、遺伝子欠失、または遺伝子改変を介した、種々の動物ゲノムの操作が可能になった（Franzら、１９９７）。非ヒト動物における、ヒトのヘモグロビン（本明細書において参考として詳細に援用される、米国特許第５，６０２，３０６号）、およびフィブリノーゲン（本明細書において参考として詳細に援用される、米国特許第５，６３９，９４０号）のトランスジェニック合成がまた開示されている。その各々は、その全体が参考として本明細書において詳細に援用されている。トランスジェニックマウスモデルの構築は現在、アルツハイマー病のための可能性のある処置をアッセイするために用いられている（本明細書においてその全体が参考として詳細に援用される、米国特許第５，７２０，９３６号）。トランスジェニックのＭＮＡＲノックアウトおよびＥＲノックアウト動物モデルにおいて、ＭＮＡＲ、および／またはＥＲに特異的なリガンドの効果を研究するためのモデルとして、トランスジェニック動物が価値のある情報をもたらすことが、本発明において意図される。
【００８７】
（結論）
本発明は、蛋白である核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）の分子クローニング、構造分析、および特徴づけに基づく。本発明は、ヒトＭＮＡＲが、核ホルモン受容体と相互作用して、複合体を形成して、Ｓｒｃ蛋白キナーゼの酵素活性に影響することを実証する。
【００８８】
ＥＲの細胞表面と、細胞内シグナル伝達経路との間のクロストークは、２０年より昔に初めて実証された（Pietras，１９７５）（Pietras，１９７７）。それ以来、多数の報告が、血管構造、乳房、骨、子宮、およびニューロン組織において存在する急速なエストロゲン効果を確認したが、その効果は、エストロゲン受容体の「ゲノム」作用では説明できない。反応性細胞におけるエストロゲンの生物学的活性は、特定の高親和性受容体（排他的にその核に位置する）を通してだけでなく、エストロゲンと細胞表面受容体との相互作用を通じても媒介される。この受容体の性質が論議される。いくつかの証拠によって、固有の膜受容体の存在が支持される。他の証拠によって、細胞表面と核エストロゲン受容体との間の同一性、または強力な類似性が支持される（Pietras、およびSzego、１９７９）、（Bressionら、１９８６）、（Pappasら、１９９５）。
【００８９】
ＥＲαｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ細胞による実験に基づく重要な証拠によって、古典的なエストロゲン受容体が、チロシンリン酸化反応／ｐ２１ｒａｓ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を導くプロセスにおいて、ｃＳｒｃを活性化し得ることが明確に実証された（Migliaccioら、１９９６）。
【００９０】
ＭＣＦ７細胞においてＥＲ相互作用蛋白のスペクトルを評価して、本発明者らは、新規なＥＲ−相互作用蛋白であるＭＮＡＲを発見した。本発明者らは、ＥＲα、およびＥＲβの両方が、ＭＮＡＲと相互作用して、この相互作用の親和性が、１７βエストラジオールによって増強され、かつ４（ＯＨ）タモキシフェンによって減少されることを示した（図３）。
【００９１】
ＭＮＡＲに相同な蛋白であるｐ１６０は、ＬｃｋのＳＨ２ドメインによるプルダウンアプローチを用いて最近単離された。本発明者らのデータによって、ＭＮＡＲは、ＭＣＦ７細胞において発現されたこの蛋白の主な形態であることが示される（図２）。
【００９２】
次に、本発明者らは、ＭＮＡＲが、Ｓｒｃファミリーのキナーゼとのエストロゲン受容体の相互作用に影響するか否かを評価した。本発明者らのデータによって、ＥＲαおよびＥＲβの両方が、部分的に精製されたｃＳｒｃと相互作用して、この相互作用は、１７βエストラジオールによって増強されないことが示される（図４Ａ、およびＢ）。この結果は、以前に報告されたデータ（Migliaccioら、２０００）、（Migliaccioら、１９９８）と矛盾しない。なぜなら、本発明者らは、インビトロで転写／翻訳されたＥＲおよびＭＮＡＲを用い、そしてまたｃＳｒｃを精製したからである。同時にMigliaccioら（Migliaccioら、２０００）、（Migliaccioら、１９９８）は、ＭＮＡＲを含み得る細胞集出物からＳｒｃ相互作用蛋白、またはＥＲ相互作用蛋白をプルダウンすることによって彼らの実験を実施した。重要なことに、ＭＮＡＲの存在において、エストロゲン受容体は、リガンド依存性の様式でｃＳｒｃおよびＬｃｋと相互作用する（図４Ａ、およびＢ）。本発明者らはまた、ＭＮＡＲ自体は、低い親和性でｃＳｒｃまたはＬｃｋに結合することを観察した。従って、本発明者らの結果によって、ＥＲおよびＭＮＡＲは、Ｓｒｃファミリーキナーゼに対して相乗作用的に結合することが示唆される。基礎的な条件下で、Ｓｒｃファミリーキナーゼの触媒性ドメインは、分子内相互作用によって不活性な状態に強制される。Ｃ末端リン酸化チロシンに対するＳＨ２ドメインの結合は、この分子を阻害された高次構造にロックする（［Matsuda，１９９０］）。このリンカー領域のプロリンリッチドメインに対するＳＨ３ドメインの結合はまた、キナーゼ不活性化に重要である（［Superti−Furga，１９９３］）。完全な触媒活性には、これらの制限の解除が必要である。Ｓｒｃのキナーゼ活性は、ホスホチロシン含有配列に対するＳＨ２ドメインの結合によって、およびプロリンリッチ配列に対するＳＨ３ドメインの結合によって増強され得る（［Hubbard，１９９８］）。本発明者らは、次に、ＥＲ−ＭＮＡＲ結合がｃＳｒｃ活性化をもたらすか否かを検討した。本発明者らの結果によって、ＭＮＡＲは、ｃＳｒｃ触媒性活性を強力に増強し、この活性は、ＥＲ−Ｅ２の付加によってさらに刺激され得ることが示唆される（図５）。ＥＲαのホスホチロシン５３７は、ＥＲとＳｒｃのＳＨ２ドメインとの相互作用に必須の残基として同定された（Migliaccioら、１９９８））。本発明者らは、ＥＲが、ＭＮＡＲ分子のＬＸＸＬＬモチーフと相互作用し、そしてＥＲのホスホチロシン５３７が、ＳｒｃのＳＨ２ドメインと相互作用することを提示する。同時に、ＭＮＡＲのプロリンリッチドメインは、おそらくＳｒｃのＳＨ３ドメインと相互作用する。この複合体の形成は、ｃＳｒｃ活性化を導く。
【００９３】
ＥＧＦに応答するｃＳｒｃの活性化は、ＭＡＰキナーゼによるＥＲリン酸化、およびＥＲ媒介転写の刺激を促進することが以前に示されている（［Kato，１９９６］；［Bunone，１９９６］）。本発明者らの結果によって、おそらくｃＳｒｃ媒介リン酸化カスケードの活性化を通じた、ＭＮＡＲの過剰発現が、ＥＲ転写活性を増強することが示される（図６Ａ）。ＳｒｃインヒビターであるＰＰ２およびゲニステインの存在におけるＭＮＡＲ誘導性ＥＲ活性化の減弱（図６Ｂ）によって、ＭＮＡＲが、ｃＳｒｃ媒介リン酸化カスケードを介してＥＲと相互作用するという見解が支持される。
【００９４】
本発明者らの研究は、ＥＲとＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼとの間のクロストークを調節し、これによってエストロゲンおよび可能性としては他のステロイドの非ゲノム活性を調節する新しいＥＲ相互作用蛋白を記載する。この非ゲノム活性は、重要な機構（これによってエストロゲンが細胞の成長および増殖を調節する）を示す。従ってＭＮＡＲは、より選択性の作用を有する新しいエストロゲンの開発のための重要な標的を意味し得る。
【００９５】
上記の結論は、以下の実施例によって支持される。以下の実施例は、例示の目的で示されるものであって、限定の目的ではない。
【００９６】
（実施例）
（機器および試薬）。１７β−エストラジオール（Ｅ２）および４（ＯＨ）タモキシフェンは、Sigmaから入手した。ＩＣＩ−１８２，７８０は、AstraZeneca Pharmaceuticals（Wlimington．DE）から提供された。５’ＲＡＣＥプライマーは、マラソンｃＤＮＡキット（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）からであった。精製したｃＳｒｃ、またはＬｃｋは、Upstate（Charlottesville，VA）からであった。ｐ３４cdc２由来のビオチン化ペプチドは、Wyeth ResearchのPeptide Chemistryグループによって合成された。グルタチオンアガロースビーズは、Sigma−Aldrich（St．Louis，MO）から入手した。抗ホスホチロシン抗体、およびSuperSignal Elisa Picoペルオキシダーゼ基質は、Perbio Science AB（Pierce，Rockford，IL）からであった。ＳｒｃインヒビターＰＰ２は、Calbiochem−Novobiochem Corporation（San Diego，CA）からであった。
【００９７】
（方法１：）
（ＮＭＡＲの単離および同定）。ＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤ、およびＧＳＴ−ＥＲα―ＬＢＤを、ＢＬ２１（ＤＥ３）E．coli中で発現させた（ＧＳＴは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである）。ＬＢ中の細胞培養物を、ＯＤ０．６で、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導し、２５℃で３時間インキュベートし、そして細胞を遠心分離によってペレットにした。細菌細胞を、５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２、５００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ中で超音波処理して、４０，０００ｇで３０分間、遠心分離した。ＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤ、およびＧＳＴ−ＥＲα−ＬＢＤを固定するために、細胞抽出物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２，１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００５％ ＮＰ４０（結合緩衝液）中に含有される５０％のグルタチオンアガローススラリーとともに、４℃でインキュベートした。製造業者の指示に従って、NE−PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Perbio Science AB，Pierce，Rockford，IL）を用いて、ＭＣＦ７細胞抽出物を調製した。１７βエストラジオール（０．１μＭ）とともに、または１７βエストラジオールなしで、ＧＳＴ、またはＧＳＴ−ＥＲ−ＬＢＤ融合蛋白のいずれかとともに、０．５ｍｇのＭＣＦ７細胞抽出物を、４℃でインキュベートさせた。結合した材料を、煮沸して２×ＳＤＳ緩衝液中のアガロースビーズを除いて、１０％ＰＡＡゲル上で精製した。このゲルを銀染色した。
【００９８】
（方法２：）
（精製した蛋白の質量分析解析）。電気泳動によって精製した蛋白サンプルを、手動的に切り出し、次いで還元して、アルキル化して、自動ゲル内トリプシン消化ロボット（Houthaeve T，１９９７）を用いて、インサイチュでトリプシン（Promega，Madison，WI）を用いて消化した。消化後、Savant Speed Vac Concentrator（ThermoQuest，Holdbrook，NY）を用いて、ペプチド抽出物を、１０〜２０μlの最終容積まで遠心分離した。自動化マイクロエレクトロスプレー逆相ＨＰＬＣ上で、ペプチド抽出物を分析した。要するに、マイクロエレクトロスプレーの接触面（interface）は、Picofrit溶融シリカスプレーニードル、長さ５０ｃｍ×内径７５μｍ、１０ｃｍの長さまで１０μｍ Ｃ１８逆相ビーズ（YMC、Wilmington，NC）を充填された８μｍの開口部直径（New Objuctive，Cambridge MA）から構成された。Picofritニードルは、質量分析検出器の前面に配置された手製の基礎の上に保持された光ファイバーホルダー（Melles Griot，Irvine，CA）に装着された。このカラムの後ろは、チタンユニオンによって垂直にされ、電気スプレー接触面のための電気的接触を供給する。このユニオンを、ＦＡＭＯＳオートサンプラー（LC−Packings，San Francisco，CA）に配管している溶融シリカキャピラリー（ＦＳＣ）の長さにそって連結し、そのオートサンプラーを、ＨＰＬＣ溶媒ポンプ（ＡＢＩ １４０Ｃ、Perkin−Elmer，Norwalk，CT）に連結した。ＨＰＬＣ溶媒ポンプは、５０μL／分の流量を送液し、この流量を、ＰＥＥＫマイクロタイトスプリッティングティー（Upchurch Scientific，Oak Harbor，WA）を用いて２５０ｎＬ／分に低下させ、次いで、ＦＳＣトランスファーラインを用いて、このオートサンプラーに送液した。このＬＣポンプおよびオートサンプラーを、その内蔵のユーザープログラムを用いて各々制御した。サンプルをプラスチックのオートサンプラーのバイアル中に入れ、密閉して、５μｌサンプルループを用いて注入した。表面消化物から抽出したペプチドを、Savant Speed Vac Concentrator（ThermoQuest，Holdbrook，NY）を用いて１０倍に濃縮し、次いで０〜５０％の溶媒Ｂ（Ａ：０．１Ｍ ＨｏＡｃ，Ｂ：９０％ ＭｅＣＮ／０．１Ｍ ＨｏＡｃ）の５０分の勾配を用いて、マイクロエレクトロスプレーＨＰＬＣシステムによって分離した。１．５ｋＶのスプレー電圧で作動するFinnigan LCQ−ＤＥＣＡイオントラップ質量分析計（ThermoQuest，San Jose，CA）上で、かつ１２５℃の加熱キャピラリー温度を用いて、ペプチド分析を行った。この装置に備わったデータ獲得ソフトウェアを用いて、自動化ＭＳ／ＭＳ様式でデータを獲得した。この獲得方法は、１ＭＳスキャン（３７５〜６００ｍ／ｚ）、その後にＭＳスキャンにおける上位の２つの最も豊富なイオンのＭＳスキャンを含んだ。次いで、この装置は、第二のＭＳスキャン（６００〜１０００ｍ／ｚ）、その後にそのスキャンにおける上位の２つの最も豊富なイオンのＭＳ／ＭＳスキャンを行った。この動的な排除、および同位体排除機能を使用して、分析されるペプチドイオンの数を増やした（設定：３amu＝排除幅、３分＝排除期間、３０秒＝排除前期間、３ａｍｕ＝同位体排除幅）。ＮＣＢＩゲノムセンターから入手した蛋白の非冗長性（重複のない）（ＮＲ）データベースを用いる、Finnigan Bioworksデータ分析パッケージ（ThermoQuest，San Jose，CA）に組み込まれたＳＥＱＵＥＳＴコンピュータープログラム（（Houthaeve T，１９９７））を用いて、ＭＳ／ＭＳデータの自動化分析を実施した。
【００９９】
（方法３：）
（ＭＮＡＲのクローニング：）ＭＮＡＲのＮ末端部分、中間部分、およびＣ末端部分をクローニングするために、オリゴヌクレオチドの３つの対を設計して用いた。オリゴ＃１：ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＴＧＡＧ（配列番号３）、およびオリゴ＃２：ＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＧＣ（配列番号４）を用いて、Ｎ末端部分をクローニングした。オリゴ＃３：ＧＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧ（配列番号５）、およびオリゴ＃４：ＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣ（配列番号６）を用いて中間部分をクローニングした。オリゴ＃５：ＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧ（配列番号７）、およびオリゴ＃６：ＧＣＴＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧ（配列番号８）を用いて、Ｃ末端部分をクローニングした。１×１０７個のＭＣＦ７細胞を、プロトコールに従って、総ＲＮＡ単離のために、Trizol（Life Technologies，Rockville，MD）中で溶解した。ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen，Valencia，CA）を用いるＲＴ−ＰＣＲ反応物中で、４０ｎｇの総ＲＮＡ、および４００ｎＭのオリゴを用いて、ＭＮＡＲを増幅した。この増幅は、５０℃で３０分で開始し、続いて９５℃で１５分、次いで９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒、および７２℃での伸長７分の３０サイクルであった。個々の産物をｐＴ−Ａｄｖベクター（Invitrogen，Carlsbad，CA）中にクローニングして、配列決定した。制限酵素消化および連結によって、全長ＭＮＡＲを構築した。プロトコール（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）に従って、ヒトリンパ球マラソンｃＤＮＡライブラリーから、オリゴ＃１および＃６を用いることによって、ＭＮＡＲをまた、独立してクローニングした。ＭＣＦ−７からクローニングしたＭＮＡＲは、マラソンｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたＭＮＡＲに同一であった。さらなる配列情報を得るために、オリゴ＃７ＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧ（配列番号９）、およびマラソンｃＤＮＡキット（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）由来のアダプタープライマー１オリゴを用いて５’ＲＡＣＥを実施した。
【０１００】
（方法４：）
（ＭＮＡＲ発現の解析）ＨｅｐＧ２細胞、ＳａＯＳ２細胞、ＨＯＢｓ０２／０２細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＭＤＡ２３１細胞、イシカワ細胞、Ｉ−１０細胞、ＬＮＣａＰＬＮ３細胞、ＬＮＣａＰＦＧＣ細胞、ＪＣＡ細胞、ＴＳＵＰＲＬ細胞由来の総ＲＮＡ（１０μｇ）を、トリドール（Trizol）によって調製し、ゲル上で分離し、膜に転写して、クローニングされたＭＮＡＲのヌクレオチド３６７〜４００に相当する放射性標識したオリゴ＃７を用いてプローブした。ジンバンク（Genbank）配列に寄託されたヌクレオチド１４８０〜１５０９に対応する別のオリゴプローブ＃８：ＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＡＡＧＡＧＴ（配列番号１０）を用いて、別のノーザンにおいてＭＣＦ−７ ＲＮＡをプローブした。
【０１０１】
第二のＭＮＡＲ発現解析を実施した。ＭＮＡＲのヌクレオチド３６７〜３９３に相当する放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブを、Perfect Hybridization緩衝液（Sigma−Aldrich，St．Louis，MO）に含有されるヒト複数組織ノーザンブロットＩＩ（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）に対して、４２℃でハイブリダイズさせた。そのブロットを０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で４２℃で３回洗浄して、フィルムに曝露した。コントロールとして、β−アクチンプローブを用いた。
【０１０２】
（方法５：）
（一過性トランスフェクション解析：）１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、ＨｅｐＧ２細胞、およびＣＯＳ−７細胞を、慣用的に維持した。フェノールレッドを含有せず、１０％チャコール剥離血清を補充したＤＭＥＭ中で９６ウェルプレートに、１ウェルあたり５０，０００個のＨｅｐＧ２細胞、または１ウェルあたり３０，０００個のＣＯＳ−７細胞を播種した。プロトコールに従って、０．５μｌのリポフェクタミン２０００（Life Technologies，Rockville，MD）を用いて、１００ｎｇの２×ＥＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃレポーター、１０ｎｇのｐＣＭＶ−β−ｇａｌ内部コントロール、１ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１ ＥＲα発現ベクター、または５ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１ＥＲβ発現ベクターのいずれかを、漸増する量のｐｃＤＮＡ３．１ＭＮＡＲ、またはｐｃＤＮＡ３．１ＳＲＣ３発現プラスミドの有無において、トランスフェクトした。１０−８Ｍ １７ｂ−エストラジオール、タモキシフェン、またはＩＣＩのいずれかを用いて細胞を２４時間刺激し、その後ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ活性について処理した。
【０１０３】
（方法６：）
（ＭＮＡＲ−ＥＲ相互作用の解析：）
ＭＮＡＲ−核内受容体相互作用解析を実施した。全長フラッグ−ＭＮＡＲを過剰発現するＳＦ９細胞抽出物を、インビトロにおいて、転写され／翻訳された［３５Ｓ］標識全長ＥＲα（図５Ａ）、ＥＲβ（図５Ｂ）、アンドロゲン（ＡＲ）（図５Ｃ）、および糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）（図５Ｄ）とともに、それらの対応するリガンド（全て１μＭで）の有無において、インキュベートした。抗ＦＬＡＧセファロースビーズを用いて、形成された複合体を単離し、２×ＳＤＳ緩衝液中で煮沸して、ＳＤＳゲルにロードした。そのゲルを乾燥して、オートラジオグラフィーに供した。
【０１０４】
（方法７：）
（ＥＲ−ＭＮＡＲ−ｃＳｒｃの相互作用の解析）１μＭ Ｅ２の存在下（図６Ａ、レーン３、５、７、および９）、または非存在下（図６Ａ、レーン２、４、６、および８）において、ＭＮＡＲの存在下（図６Ａ、レーン４、５、および８、９）、または非存在下（図６Ａ、レーン２、３、および６、７）において、インビトロで転写／翻訳されたＥＲαを、精製したｃＳｒｃ（図６Ａ、レーン２〜５）、またはＬｃｋ（図６Ａ，レーン６〜９）とともにインキュベートした。抗ｃＳｒｃ抗体または抗Ｌｃｋ抗体、およびプロテインＡアガロースを用いたプルダウンによって、形成された複合体を単離し、２×ＳＤＳ緩衝液中で煮沸して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ゲルを乾燥させて、オートラジオグラフィーに供した。
【０１０５】
（方法８：）
（ｃＳｒｃ酵素活性の解析）基質として酸性化したエノラーゼを用いて、ＥＲの非存在下（図８、レーン１および２）、または存在下（図８、レーン３〜６）、１７βエストラジオール（図８、レーン３および５）、およびＭＮＡＲ（図８、レーン２、５、および６）の存在下で、ｃＳｒｃチロシンキナーゼ活性を評価した。反応の前に、蛋白を４℃で１時間インキュベートした。［３２Ｐ］−γＡＴＰの添加によって、リン酸化反応を開始して、３０℃で１０分間継続した。２×ＳＤＳ緩衝液の添加によって、反応を停止した。リン酸化した蛋白を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、乾燥したゲルをオートラジオグラフィーに供した。
【０１０６】
（方法９：）
（ＥＲ媒介性転写に対するＭＮＡＲの効果）
Ａ−ＨｅｐＧ２細胞を、ＥＲα、ＭＮＡＲ，および／またはＳＲＣ３の発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。ルシフェラーゼ遺伝子発現（２×ＥＲＥ−ｔｋ−レポーターによって駆動された）を、Ｅ２、４（ＯＨ）−タモキシフェン、またはＩＣＩ １８２，７８０（全て１０ｎＭ）を用いて処理した細胞中で評価した。Ｂ−ＨｅｐＧ２細胞を、ＥＲα、およびＭＮＡＲの発現ベクターを用いてトランスフェクトした。ルシフェラーゼ遺伝子発現（２×ＥＲＥ−ｔｋ−レポーターによって駆動された）を、１０ｎＭのＥ２か、１０ｎＭのＥ２とそれに加えて１μＭのＰＰ２か、または１μＭのＰＤ９８０５９かを用いて処理した細胞中で評価した。Ｃ−ＭＣＦ−７細胞を、Sequitur，Inc．（Natick，MA）からの１００ｎＭのアンチセンス（ＡＳ）ＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＡ（配列番号１１）、または１μｇ／ｍｌのリポフェクタミン２０００を複合体化したリバースコントロール（Ｃ）オリゴマーを用いて、白色培地中でトランスフェクトした。２４時間後、細胞を１０ｎＭ Ｅ２を用いて刺激し、その２４時間後、細胞をグアニジウム緩衝液中で溶解して、溶解物から総ＲＮＡを単離した。ＭＮＡＲ、ｐＳ２、およびカテプシンＤを標的するために設計したプライマー／プローブのセットを用いてTaqMan解析を実施した。Ｄ−１００ｎＭのアンチセンス（ＡＳ）−１、またはリバースコントロール（Ｃ）−２オリゴマー（１０ｎＭのＥ２を用いて刺激した）を用いてトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞の抽出物を、ウサギポリクローナルＭＮＡＲ抗血清を用いるウエスタンブロット解析のために用いた。ＭＮＡＲのアミノ酸５０９〜５２０（ＳＨＲＫＧＤＳＮＡＮＳＤ）（配列番号３１）をコードする１１マーのペプチドに対して、ＭＮＡＲ抗血清を生成した。
【０１０７】
（方法１０：）
（ＭＮＡＲ、およびＥＲの相互作用、およびＳｒｃキナーゼ活性化）
ＭＮＡＲ、およびＥＲαは、Ｓｒｃと相互作用して、内因性蛋白のリン酸化反応を促進する。ＦＬＡＧ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いてトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞、またはＦＬＡＧ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いてトランスフェクトしていないＭＣＦ−７細胞を、Ｅ２（１０ｎＭ）を用いて処理しない（図１０、レーン１、および３）か、またはＥ２（１０ｎＭ）を用いて５分間処理した（レーン２、および４）。対応する抗体を用いて細胞抽出物から、フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ）、ｃＳｒｃ（パネルＢ）、またはＥＲα（パネルＣ、Ｄ、およびＥ）を、免疫沈降させた。免疫沈降物を［３２Ｐ］−γＡＴＰを用いて３０分間、３０℃（パネルＡ〜Ｃ）、または［３２Ｐ］−γＡＴＰおよびエノラーゼを用いて（パネルＤ）インキュベートした。２×ＳＤＳ緩衝液中での煮沸によってキナーゼ反応を停止した。リン酸化した材料をＳＤＳゲル上にロードして、次いで乾燥してオートラジオグラフィーに供した。フラッグ−ＭＮＡＲでトランスフェクトしていない、Ｅ２を用いて処理していない細胞（１）、およびＥ２を用いて処理した細胞（２）からＥＲαプルダウンによって得た材料を、ＭＮＡＲ−抗血清を用いてプローブした（パネルＥ）。
【０１０８】
（方法１１：）
（Ｅ２誘導性のＥｒｋキナーゼ１および２活性化に対してＭＮＡＲは影響する）
エストラジオールによるＳｒｃの活性化が、Ｒａｓ／Ｅｒｋ５キナーゼ経路を誘発することは以前に報告されている。本発明者らは、ＭＮＡＲ誘導性Ｓｒｃ活性化がＥｒｋキナーゼ１および２の活性化を導き得ると予想した。本発明者らは、ＭＣＦ７細胞、ＭＮＡＲを過剰発現する細胞、およびＭＮＡＲ発現がＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１１）を用いた処理によって実質的に減弱された細胞における、Ｅ２によるＥｒｋ活性化のレベルを評価した。リン酸化したＥｒｋ１および２を認識する抗体を用いて、Ｅｒｋ１および２のリン酸化のＥ２誘導性刺激を検出した。ＭＮＡＲ発現プラスミド（図１１、レーン１および２）、またはＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチド１００ｎＭ（図１１、レーン５および６）を用いてトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞の抽出物（図１１、レーン３、および４）；Ｅ２（１０ｎＭ）を用いて刺激していない（図１１、レーン１、３、および５）、または５分間刺激した（図１１、レーン２、４、および６）ＭＣＦ７細胞の抽出物を、ウエスタンブロット分析のために用いた。このウエスタンブロット分析には、リン酸化したＥｒｋ１および２に対する抗体（パネルＡ）；Ｅｒｋ１／２抗体（パネルＢ）；ＭＮＡＲ抗体（パネルＣ）を用いた。ＭＮＡＲ抗血清オリゴヌクレオチド（配列番号１１）は、Sequitur Inc．（Natick，MA）で開発された。
【０１０９】
（方法１２：）
（ＭＮＡＲの構造−機能解析）
ＭＮＡＲ配列解析によって、ＭＮＡＲ分子のＮ末端部分は、核ホルモンレポーターとの相互作用に重要であることが以前に見出された複数のＬＸＸＬＬモチーフを含むが、ＭＮＡＲはＣ末端では、プロリンおよびグルタミン酸の両方がリッチな領域を含むことが明らかになった。エストロゲン受容体およびｃ−Ｓｒｃチロシンキナーゼとの相互作用を担うＭＮＡＲの領域を描写するため、本発明者らは、ＭＮＡＲ欠失変異体の機能的評価を実施した（図１２）。適切なフラグメントを増幅すること、およびそれらを適切な発現ベクター中にクローニングすることによって、特別に設計したオリゴヌクレオチドを用いて、ＭＮＡＲの一連のＣ末端短縮を生成した。ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされた場合、これらの変異体が、ＥＲ刺激された転写物を増強する能力について、これらの変異体を試験した。
【０１１０】
（方法１３：）
（キナーゼ活性に影響する化合物についてのスクリーニング）
以下のとおり化合物をスクリーニングする。用いた反応緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ Ｎａ３ＶＯ４である。基質ペプチドを得て、６ｍｇを１．７ｍＬのＲＢ中に溶解し、−２０℃で保存する。用いられるＡＴＰは、最終濃度４００μＭである。インヒビターは、例えば、ピセアタノール−３ｍＭ（４℃で保存し、かつ遮光する）を用いるべきである。
【０１１１】
まず、ＥＲを、Ｅ２とともにインキュベーションする。例えば、１０μｌの市販のＥＲ（Panvera）を、４０μｌのＲＢおよび０．５μｌのＥ２（１０−６Ｍ）とともにインキュベートする。その混合物を室温で１時間インキュベートする。
【０１１２】
次に、その混合物をＭＮＡＲ、Ｅ２、およびＥＲの有無の状態に置く。その溶液を室温で３０分間インキュベートする。
【０１１３】
各々のチューブに、１０μｌのＡＴＰ（最終濃度４００μＭ）を、１０μｌの基質ペプチドとともに添加する。これを３０℃で６０分間インキュベートする。
【０１１４】
１０μｌの３ｍＭ ピセアタノールを添加して反応を停止する。ここで、この溶液を室温で５分間インキュベートする。
【０１１５】
希釈およびペプチドの固定を実施する。１０μｌの反応液を２０ｍｌのＨ２Ｏで希釈する。２００μｌの希釈液をNeutrAvidin Plateのウェルに添加する。
【０１１６】
２００μｌのＰＢＳを添加することによって洗浄（各々３分間、５回）を実施する。その後に抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体を添加する。その抗体をＰＢＳおよびＢＳＡ中で希釈して、溶液をカバーして、３７℃で１時間インキュベートさせる。その混合物を上記と同様に洗浄する。
【０１１７】
次に、ＨＲＰプロトコールを用いて、１００μｌのPierce基質を添加すること、およびVictorで読み取ることによって基質反応を行う。
【実施例１】
【０１１８】
（ＭＮＡＲの単離および同定、ＭＮＡＲをコードするｃＤＮＡのクローニング）
ＥＲリガンドの組織選択性作用をさらによく理解するために、本発明者らは、異なる細胞株においてＥＲ相互作用蛋白の発現および活性を評価するためのプロテオミクスアプローチを確立した。本発明者らは、ＧＳＴプルダウンアプローチを用いてＭＮＡＲを同定した。ＧＳＴ−ＥＲβリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を、ＭＣＦ−７細胞抽出物とともにインキュベートした。図２Ａは、プルダウン実験によって得られた画分の銀染色を示す。ＧＳＴ−ＥＲβ−Ｅ２と特異的に相互作用するが、ＧＳＴ−ＥＲβ、またはＧＳＴ単独とは相互作用しない多数の蛋白を検出した。
【０１１９】
対応するバンドを切り出して、トリプシンで消化し、濃縮して、マイクロエレクトロスプレーＨＰＬＣシステムによって分離した。Finnigan LCQ−ＤＥＣＡイオントラップ質量分析計（ThermoQuest，San Jose，CA）上でペプチド分析を行った。ＮＣＢＩゲノムセンターから入手した蛋白の非冗長性（重複のない）データベースを用い、Finnigan Bioworksデータ解析パッケージ（ThermoQuest，San Jose，CA）中に組み込まれたＳＥＱＵＥＳＴコンピューターアルゴリズム（［Houthaeve T，１９９７］）を用いて、質量分析データの自動解析を実施した。
【０１２０】
図２Ａは、上記で方法１において概説されたような実験工程から得られる、銀染色されたゲルを示す。細胞抽出物をグルタチオンビーズ−１、リガンドの非存在下−２、または両方とも１０−７ＭのＥ２の存在下−３、または４（ＯＨ）タモキシフェンの存在下−４において、細菌で発現されたＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤ融合蛋白とともにインキュベートした。抗ＧＳＴアガロースを用いてＥＲ相互作用蛋白を単離して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。対応するバンドを含有するゲル領域を切り出して、トリプシン消化に供した。
【０１２１】
リガンド依存性相互作用を表す蛋白に相当するバンドを切り出して、トリプシンで消化して、質量分析に基づくペプチドのマイクロシーケンシングを用いて同定した。公知であり十分特徴付けられた活性化補助因子（例えば、ＳＲＣ３、およびＤＲＩＰ２０５）と一緒に、本発明者らは、ＥＲと相互作用することが以前に示された蛋白を同定した。この蛋白は、Ｅ２の存在下でＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤと相互作用し、かつ約１２０ｋＤａの見かけの分子量を有した（図２Ａ）。
【０１２２】
ペプチド配列解析によって、この蛋白が、ｐ５６lck（Ｌｃｋ）のＳｒｃ相同性ドメイン２（ＳＨ２）を用いたプルダウンによって以前に単離された、プロリンおよびグルタミン酸リッチな蛋白であるｐ１６０（Genbank U８８１５３）に関連し得ることが明らかになった（２１）。図２Ｂは、質量分析、およびＭＮＡＲ分子におけるペプチドの位置によって同定されたペプチドの配列を示す。
【０１２３】
ＮＣＩデータベースを検索することによって、本発明者らはまた、この蛋白にマッチしたいくつかのＥＳＴを同定した。それらの１つであるＡＬ０３９３９は、Ｎ末端でマッチし、そして５’配列をさらに１００ｂｐ伸長した。整列された配列を用いて、ＭＣＦ−７細胞からこの蛋白をクローニングするためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した（２２）。
【０１２４】
しかし、クローニングされた蛋白の配列（図１を参照のこと）は、ｐ１６０（Genbank U８８１５３）とは実質的に異なった。２つの配列の間を識別するため、そしてｐ１６０とも呼ばれる核内受容体活性化補助因子のファミリー（（Voegelら、１９９８）、（Hongら、１９９７）、（Anzickら、１９９７）、［Suen，１９９８］）との混同を避けるため、本発明者らがＭＣＦ７細胞からクローニングしたこの蛋白を、本発明者らは、ＭＮＡＲと命名した。
【０１２５】
ＭＮＡＲおよびｐ１６０の配列アラインメント（図１Ａ）によって、ＭＮＡＲが、ｐ１６０（Genbank U８８１５３）に存在するヌクレオチドの１０７５〜１５１０、および３１２５〜３１５１を含まないことが示された。さらに、ｐ１６０配列と比べて、１０個の単一塩基対のギャップ、および１個の二重塩基対のギャップが存在した。
【０１２６】
ＭＮＡＲはまた、ヒトリンパ球マラソンｃＤＮＡライブラリー（Invitrogen）から独立してクローニングされた。重要なことに、ＭＣＦ−７細胞からクローニングされたＭＮＡＲは、マラソンｃＤＮＡライブラリーを用いてクローニングされたＭＮＡＲと同一であった。さらなる配列情報を得るために、本発明者らは、マラソンｃＤＮＡキット（Clontech）由来のプライマーを用いて５’ＲＡＣＥを実施した。５’ＲＡＣＥを用いて、ＭＮＡＲの推定開始コドンの５’側の３つのリーディングフレームの全てにおいて、終止コドンを見出した。ＭＮＡＲクローンの概念上の翻訳によって、計算上の分子量が１１９．６ｋＤａである１１３０個のアミノ酸の蛋白を生じた。このクローンは、質量分析の解析によって最初に同定されたペプチド配列を全て含んだ（図２Ｂ）。
【０１２７】
配列の解析によって、ＭＮＡＲ分子のＮ末端部分に局在する複数のＬＸＸＬＬモチーフが明らかになった。本発明者らは、それを、仮定的に、核内受容体相互作用ドメイン（ＮＲＩＤ）と呼ぶ。他の転写因子における類似のモチーフは、核ホルモン受容体のリガンド結合ドメインの表面上の疎水性グルーブと相互作用することが示されている（Heeryら、１９９７）、（Torchiaら、１９９７）（２３）。ＭＮＡＲ分子の興味深い特徴は、ＭＮＡＲ分子のＣ末端部分に局在する、伸長したプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）、およびグルタミン酸リッチドメイン（ＥＲＤ）である。これらのドメインに対する相同性は、ＮＣＩデータベースにおいては見出されなかった。
【実施例２】
【０１２８】
（ＭＮＡＲ発現の解析）ＨｅｐＧ２、ＳａＯＳ２、ＨＯＢｓ０２／０２、ＣＯＳ−７、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ２３１、イシカワ、Ｉ−１０、ＬＮＣａＰＬＮ３、ＬＮＣａＰＦＧＣ、ＪＣＡ、ＴＳＵＰＲＬの各細胞株におけるＭＮＡＲ発現を、ノーザンブロット解析を用いて評価した。この目的のために、本発明者らは、ＭＮＡＲの配列と、寄託されたｐ１６０（GenbankU８８１５３）の配列との間に共通する、ＭＮＡＲのＮ末端部分由来のオリゴペプチドを用いた。ほとんど全ての細胞株において、ＭＮＡＲ ｍＲＮＡの発現を、４ｋｂのバンドの存在によって評価されるとおり、検出した（図３）。ＭＮＡＲ発現のレベルは、異なる細胞株の中で有意に異なった。ＭＮＡＲ発現は、肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、および前立腺細胞（ＬＮＣａＰＬＮ３、ＬＮＣａＰＦＧＣ、ＪＣＡ、ＴＳＵＰＲＬ）中で高く、そしてＥＲを発現しない乳房腫瘍細胞（Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ２３１）においては低度〜検出不能であった（図３）。ｐ１６０が、ＭＣＦ−７細胞中で発現されるか否かを評価するために、本発明者らは、ＭＮＡＲ配列を欠いており、Genbankに対して寄託されたｐ１６０配列のヌクレオチド１４８０〜１５０９によってコードされる、ｐ１６０の領域に対するオリゴ−プローブを用いたノーザンブロット解析を用いた。このプローブを用いて、本発明者らは、どのようなメッセージも検出できなかった（データ示さず）。この結果によって、ＭＣＦ−７細胞中で発現したこの蛋白のほとんどの型は、ＭＮＡＲと十分にマッチするが、ｐ１６０をコードするｍＲＮＡは、発現されないか、非常に低いレベルで発現されることが示される。
【０１２９】
異なる組織におけるＭＮＡＲ分布を、ノーザンブロットによって解析した。ここでも、本発明者らは、ＭＮＡＲと寄託されたｐ１６０配列（GenbankU８８１５３）との間で共通である、ＭＮＡＲのＮ末端部分由来のオリゴプローブを用いた。またここでも、ＭＮＡＲ ｍＲＮＡの発現は、４ｋｂのバンドの存在による評価として（図４）、ほとんど全ての組織において検出された（図４）。ＭＮＡＲ発現のレベルは、異なる組織の間では変動すると考えられる。
【実施例３】
【０１３０】
（ＭＮＡＲは、エストロゲン受容体と特異的に相互作用する）
全長フラッグ−ＭＮＡＲを用いて、本発明者らは、ＭＮＡＲとエストロゲン受容体との相互作用が、ＥＲリガンドによって影響されるか否かをさらに評価した。バキュロウイルス発現系を用いて、ＳＦ９細胞において過剰発現された全長フラッグ−ＭＮＡＲを、インビトロで転写／翻訳された、リガンドが結合していない全長のＥＲαおよびβ、またはＥ２もしくは４−ＯＨタモキシフェンとリガンド結合した受容体、を用いるプルダウン実験において用いた。形成された複合体を、抗フラッグセファロースビーズを用いて単離した。
【０１３１】
図５Ａ、および５Ｂによって、ＥＲαおよびβが、ＭＮＡＲと相互作用すること、ならびにこの相互作用は、Ｅ２によって増強されて、４（ＯＨ）タモキシフェンによって阻害されることが明らかになった。本発明者らは、また、他のいくつかの核ホルモン受容体とのＭＮＡＲの相互作用を評価した。全長フラッグ−ＭＮＡＲを、転写／翻訳されたアンドロゲン（ＡＲ）、および糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）とともに、それらの対応するホルモンの有無において、インキュベートした。このデータによって、ＡＲおよびＧＲのリガンドは、ＭＮＡＲと独立して相互作用することが示された（図５Ｂ、および５Ｃ）。この相互作用は、これらの受容体リガンドの非ゲノム活性を説明し得る。これらおよび他の核ホルモン受容体のＭＮＡＲとのクロストーク、ならびにＳｒｃリン酸化カスケードの詳細な検討は、将来の検討のための重要な課題である。
【実施例４】
【０１３２】
（ＭＮＡＲのｃ−ＳｒｃおよびＬｃｋとの相互作用は、Ｅ２リガンド結合エストロゲン受容体によって増強される）ＭＮＡＲに対して相同な蛋白であるｐ１６０が、ｐ５６lck（Ｌｃｋ）のＳＨ２ドメインを用いたプルダウンを介して最初に同定されたことを考慮して、本発明者らは、次に、ＭＮＡＲが、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼのメンバーと相互作用し、ＥＲとのそれらの相互作用に影響するか否かを検討した。
【０１３３】
この疑問に取り組むため、本発明者らは、インビトロで転写／翻訳されたエストロゲン受容体であるＥＲα、ＥＲβ、およびＭＮＡＲを用いた。１７βエストラジオール（Ｅ２）の存在の有無において、ＥＲを、単独でかまたはＭＮＡＲと一緒に、市販の部分的に生成されたｃＳｒｃまたはＬｃｋ（Upstate Biotechnology）とともにインキュベートした。形成された複合体を、抗c−Ｓｒｃ、または抗Ｌｃｋ抗体、およびプロテインＡセファロースを用いてプルダウンし、次いでＳＤＳゲル上で分離した。
【０１３４】
このデータは、ＥＲαが、ｃＳｒｃおよびＬｃｋと相互作用することを示す（図６Ａ、レーン２、および３、６および７）。驚くべきことに、この相互作用は、Ｅ２によって阻害された。ＥＲαを、ＭＮＡＲおよびｃＳｒｃの両方（図６Ａ、レーン４、および５）、またはＬｃｋ（図６Ａ、レーン８、および９）とともにインキュベートした場合、リガンド結合していないＥＲα（図６Ａ、レーン４、および８）と比べて、Ｅ２の存在下において（図６Ａ、レーン５、および９）、Ｓｒｃ−ＥＲ−ＭＮＡＲ複合体形成の有意な刺激が検出された。ＭＮＡＲ自体は、ｃＳｒｃまたはＬｃｋと十分相互作用せず（図６Ａ、レーン１１）、ＥＲとのｃＳｒｃおよび／またはＬｃｋの相互作用は、Ｅ２によって阻害される（図６Ａ、レーン３）ので、本発明者らは、全ての３つの蛋白が、Ｅ２の存在下で強力に相互作用すること、およびＭＮＡＲが、ＥＲ−Ｓｒｃ相互作用に対して重要であることを結論する。ＥＲβについても同一のデータが得られた（図６Ｂ）。
【０１３５】
Auricchioおよび共同研究者による以前の研究によって、ＥＲがＳｒｃのＳＨ２ドメインに直接結合すること、およびこの結合は、Ｅ２によって増強されることが示唆された。本発明者らのデータと、彼らのデータとの間の明白な不一致について可能性のある説明は、ＥＲ−Ｓｒｃ相互作用を評価するために、彼らが細胞抽出物からのＳｒｃプルダウンを用いたという事実に依存するかもしれない。ＭＮＡＲは、これらの抽出物に存在する可能性が最も高く、ＥＲ−Ｓｒｃ複合体形成を媒介した。
【０１３６】
基礎的な条件下では、Ｓｒｃの触媒性ドメインは、分子内相互作用を通じて不活性状態に強制される。Ｃ末端リン酸化チロシンに対するＳＨ２ドメインの結合、およびＳｒｃリンカー中のプロリンリッチ領域に対するＳＨ３ドメインの結合によって、この分子は阻害された高次構造にロックされる（図７）。完全な触媒性活性には、これらの拘束の解放が必要である。
【０１３７】
Ｓｒｃのキナーゼ活性は、ＳＨ２ドメインに対するホスホチロシン含有配列の結合、およびＳＨ３ドメインに対するプロリンリッチ配列の結合によって増強され得る。ＭＮＡＲが、伸長したプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）を含むこと、およびＥＲのリガンド結合ドメインが、リン酸化され得るチロシン残基を含むことを考慮して、本発明者らは、これらの相互作用がＳｒｃ活性化をもたらし得ると仮定した（図７を参照のこと）。
【実施例５】
【０１３８】
（ＭＮＡＲは、ＥＲ駆動トランス活性化を刺激する）ＥＧＦに対する応答におけるｃＳｒｃの活性化は、ＥＲリン酸化を促進すること、およびＭＡＰキナーゼによって他の転写因子のリン酸化を促進すること（これによってＥＲ媒介性転写を刺激する）が、以前に示されている（［Kato，１９９６］；［Bunone，１９９６］）。ＭＮＡＲが、ＥＲの転写活性に影響するか否かを評価するため、ＥＲα（図６Ａ），またはＥＲβ（図６Ｂ）、およびＭＮＡＲを用いてＣＯＳ７細胞を同時トランスフェクトした。２×ＥＲＥ−ｔｋ−レポーターによって駆動されたルシフェラーゼ遺伝子発現を、１７βエストラジオールで処理された細胞、および処理されていない細胞において評価した。本発明者らのデータによって、ＭＮＡＲ発現の増大は、ＥＲαおよびＥＲβの転写活性の刺激に相関することが示される（図６Ａ、および６Ｂ）。次に、本発明者らは、ｃＳｒｃインヒビターが、ＭＮＡＲ促進ＥＲ活性化に影響するか否かを評価した。ＥＲα、およびＭＮＡＲを用いてトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞（図８）を、１７βエストラジオール単独か、１７βエストラジオールおよびＳｒｃの選択性インヒビターであるＰＰ２（Calbiochem）か、またはゲニステインを用いて２４時間処理した。以前の実験（図８）においてと同様に、ＭＮＡＲは、Ｅ２誘導性ＥＲα活性化を刺激した。同時に、ＳｒｃインヒビターであるＰＰ２およびゲニステインは、ＭＮＡＲ刺激を阻害した（図８）。これらのデータによって、ＥＲ活性のＭＮＡＲ誘導性刺激は、リン酸化カスケードの活性化とリンクしていることが示される。
【実施例６】
【０１３９】
（ＭＮＡＲ過剰発現は、ＥＲの転写活性に影響する）
ＭＮＡＲ過剰発現がＥＲの転写活性に影響するか否かを評価するため、ＥＲαおよびＭＮＡＲの発現のためのプラスミドを用いて、ＨｅｐＧ２細胞を一過性に同時トランスフェクトした。２×ＥＲＥ−ｔｋレポーターによって制御したルシフェラーゼ遺伝子発現を、Ｅ２、４（ＯＨ）−タモキシフェン、またはＩＣＩ １８２，７８０（全て１０ｎＭ）で処理した細胞中で評価した。
【０１４０】
この結果（図９Ａ）によって、ＭＮＡＲ発現が増大することは、ＥＲα転写活性の刺激と十分に相関することが示される。ＥＲ転写活性の同様の刺激が、ＥＲ活性化補助因子ＳＲＣ３の過剰発現によって観察された。本発明者らのデータによってまた、４（ＯＨ）−タモキシフェン、およびＩＣＩ １８２，７８０は、ＥＲ活性のＮＭＡＲ刺激を支持しないことが示される。ＥＲβを用いて同様の結果が観察された（データ示さず）。
【０１４１】
ｃＳｒｃ活性化が、ＥＲ活性のＭＮＡＲ刺激の原因である否かを検討するため、ＥＲα、ＭＮＡＲ、および２×ＥＲＥ−ｔｋ−レポーターのプラスミドを用いてトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞（図９Ｂ）を、Ｅ２単独を用いるか、またはＥ２と、ｃＳｒｃインヒビターであるＰＰ２、もしくはＭＥＫキナーゼインヒビターであるＰＤ９８０５９のいずれかを用いて処理した。本発明者らは、ＰＰ２およびＰＤ９８０５９が両方ともＥＲ活性のＭＮＡＲ刺激を抑止することを見出した。これらの結果によって、ＥＲ転写活性のＭＮＡＲ促進性刺激は、ＭＡＰキナーゼリン酸化カスケードの活性化にリンクしていることが示される。本発明者らは、以前に記載されたように、ＳｒｃおよびＭＥＫキナーゼの下流の、ＥｒｋによるＥＲリン酸化が、ＥＲ転写活性の増強の原因であり得ると仮定する。さらに、Ｓｒｃ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化が、ＥＲ転写活性に重要である、いくつかの他の転写因子のリン酸化をもたらすことは、あり得る。重要なことに、これらのデータによってまた、リン酸化カスケードの活性化を通じた核ホルモン受容体のいわゆる「非ゲノム」作用が、転写因子の活性を調節し得、それによって最終的に遺伝子発現に影響し得ることが示唆される。本発明者らは、この機構が、ＭＮＡＲと相互作用し得る核内受容体と、リン酸化によって活性が調節される他の転写因子との間のクロストークを設け得ると推測する。
【実施例７】
【０１４２】
（ＭＮＡＲは、ＥＲ媒介性遺伝子発現に影響する）
本発明者らは、次にアンチセンスアプローチを用いて、遺伝子転写のエストロゲン調節におけるＭＮＡＲの役割を評価した。TaqMan（図９Ｃ）、およびウエスタンブロット（図９Ｄ）解析によって評価されるように、ＭＣＦ−７細胞におけるＭＮＡＲ発現を有意に阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１１）が、開発された（Sequitur Inc．，Natick，MA）。ＭＣＦ−７細胞を１００ｎＭのアンチセンスまたはリバースコントロールオリゴマーを用いてトランスフェクトした。２４時間後、１０ｎＭのＥ２を用いて細胞を刺激して、その２４時間後、細胞を溶解して総ＲＮＡを単離した。ＭＮＡＲ、ｐＳ２、およびカテプシンＤを標的するために設計されたプライマー／プローブセットを用いて、TaqMan解析を実施した（２つの遺伝子は、ＭＣＦ−７細胞においてエストロゲンによって調節されることが公知）。図９Ｃは、ＭＮＡＲ、ｐＳ２、およびカテプシンＤのｍＲＮＡ発現のレベル（ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対して正規化した）を示す。興味深いことに、ＭＮＰＡ ｍＲＮＡの発現は、Ｅ２処理によって実質的に刺激された。本発明者らのデータによって、ＭＮＡＲ発現の減少は、Ｅ２刺激性のｐＳ２およびカテプシンＤの発現の劇的な低下をもたらすことが示される。重要なことに、ＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらの遺伝子発現の基本的なレベルに有意に影響しない。本発明者らは、ＥＲリン酸化がおそらくｐＳ２およびカテプシンＤのＥ２媒介性発現に重要であると予想する。これらのデータによって、ＭＮＡＲは遺伝子発現のＥＲ調節に必須であるという、本発明者らの見解が支持される。
【実施例８】
【０１４３】
（ＭＣＦ−７細胞における、ＭＮＡＲおよびＥＲの相互作用、ならびにＳｒｃキナーゼ活性化）
本発明者らは、ＭＮＡＲおよびＥＲがＭＣＦ−７細胞において相互作用して、Ｓｒｃキナーゼを活性化するか否かを評価した。フラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞を、１０ｎＭのＥ２を用いて５分間、処理した。フラッグ−ＭＮＡＲ（図１０、パネルＡ）、ＥＲα（図１０、パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（図１０、パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。Ｅｒα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（図１０、パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が明確に検出された。フラッグ−ＭＮＡＲを用いてトランスフェクトされていないＭＣＦ７細胞がこの実験に用いられたことを考慮すれば、このデータによって、内因性ＭＮＡＲおよびＥＲαが、ＭＣＦ７細胞において相互作用することが確認される。免疫沈降物を［３２Ｐ］−γＡＴＰとともに３０℃で３０分間インキュベートした。２×ＳＤＳ緩衝液中での煮沸によって反応を停止して、ＳＤＳ ＰＡＡＧ上で分離した。いくつかの内因性蛋白の強力なＭＮＡＲ依存性およびＥ２依存性のリン酸化が検出された。ｃＳｒｃ、ＥＲ，およびＭＮＡＲと同時沈降した、約３４ｋＤａの見かけの分子量を有する内因性蛋白のリン酸化が特に明白であった（図１０を参照のこと）。
【０１４４】
重要なことに、ＭＮＡＲでトランスフェクトされていない細胞から抗Ｓｒｃ抗体および抗ＥＲ抗体を用いて同時沈降した物質中で、この蛋白のリン酸化が検出された（図１０、レーン１および２）。このリン酸化は、Ｅ２の存在下（図１０、レーン２）で刺激され、次いでＭＮＡＲでトランスフェクトされた細胞中で劇的に増強された（図１０、レーン３および４）。これらのデータによって、ＭＮＡＲ、ＥＲ、およびｃＳｒｃがＭＣＦ−７細胞中で相互作用し、そしてＭＮＡＲ−ＥＲ複合体が、ｃＳｒｃキナーゼ活性を強力に刺激する（これがＭＣＦ−７細胞中においていくつかの内因性蛋白のリン酸化を促進する）という本発明者らの見解が強力に支持される。エノラーゼをＳｒｃ基質として用いた場合、同一のリン酸化パターンが検出された（図１０、パネルＤ）。
【実施例９】
【０１４５】
（ＭＮＡＲは、Ｅ２誘導性Ｅｒｋキナーゼ１および２活性化に影響する）
本発明者らは、次に、ＭＣＦ７細胞（図１１、レーン３および４）、ＭＮＡＲを過剰発現する細胞（図１１、レーン１および２）、およびＭＮＡＲ発現がＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理によって実質的に減弱された細胞（図１１、レーン５および６）において、Ｅ２によるＥｒｋ活性化のレベルを評価した。リン酸化したＥｒｋ１および２を認識する抗体を用いて、Ｅｒｋ１および２のリン酸化の強力なＥ２誘導性刺激を明確に検出した（図１１、パネルＡ）。この活性化は有意に、ＭＮＡＲを過剰発現する細胞（図１１、パネルＡ，レーン１および２）において増強されて、ＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理された細胞（図１１、パネルＡ，レーン５および６）において減弱された。ＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理でも、Ｅ２を用いた短時間処理でも、Ｅｒｋ１および２の総レベルには影響しなかった（図１１、パネルＢ）。ウエスタンブロット解析によって、ＭＮＡＲレベルが、ＭＮＡＲ発現プラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞において強力に増大されること（図１１、パネルＣ、レーン１および２）、そしてＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチド（図１１、レーン５および６）を用いて処理された細胞において減少されること（図１１、パネルＣ、レーン５、および６）が示された。これらのデータによって、ＭＮＡＲは、ｃＳｒｃおよびＥｒｋ１および２キナーゼのＥ２誘導性刺激を制御することが示される。
【実施例１０】
【０１４６】
（ＭＮＡＲの構造−機能の組織化）
ＭＮＡＲ配列解析によって、ＭＮＡＲ分子のＮ末端部分は、核ホルモンレポーターとの相互作用に重要であることが見出された複数のＬＸＸＬＬモチーフを含むことが明らかになった。ＭＮＡＲはＣ末端では、プロリンおよびグルタミン酸の両方がリッチな領域を含む。エストロゲン受容体およびc−Ｓｒｃチロシンキナーゼとの相互作用を担うＭＮＡＲの領域を描写するため、ＭＮＡＲ欠失変異体の機能的評価を実施した（図１２）。適切なフラグメントを増幅すること、およびそれらを適切な発現ベクター中にクローニングすることによって、特別に設計したオリゴヌクレオチドを用いて、ＭＮＡＲの一連のＣ末端短縮を生成した。ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされた場合、これらの変異体が、ＥＲ刺激された転写物を増強する能力について、これらの変異体を試験した。
【０１４７】
アミノ酸１〜４６９（変異体２、配列番号１４）、アミノ酸１〜２７８（変異体３、配列番号１５）、およびアミノ酸１〜１８９（変異体４、配列番号１６）を含むＭＮＡＲ変異体は依然として、ＥＲ転写活性を増強し得るが、ＭＮＡＲ分子のＣ末端部分（アミノ酸５５５〜１１３１（変異体９、配列番号１７）、アミノ酸５９５〜９６２（変異体１０、配列番号１８）、およびアミノ酸５９５〜８８７（変異体１１、配列番号１９））を含有する変異体は、不活性である。これらのデータによって、ＥＲ転写活性を刺激するのに必要かつ十分であるこのドメインが、アミノ酸１と１８９との間のＮＲＩＤのＮ末端部分に局在することが示唆される（図１３）。この領域は、ＬＸＸＬＬモチーフ：４番目（アミノ酸１５４〜１５９）（配列番号２０）、５番目（アミノ酸１７６〜１８１）（配列番号２１）、および６番目（アミノ酸１８１〜１８５）（配列番号２２）を含む（図１２）。これらのモチーフが、エストロゲン受容体との相互作用の原因であることを評価するため、本発明者らは、変異されたこれらの３つのＬＸＸＬＬモチーフを、個々にまたは組み合わせて有するＭＮＡＲの変異体を作成した。
【０１４８】
ＭＮＡＲは、ＬＸＸＬＬモチーフを利用してエストロゲン受容体と相互作用するが、ＭＮＡＲは、ＰＸＸＰモチーフを用いてＥｒｃと相互作用する。ＭＮＡＲは、Ｎ末端部分内にこれらのＰＸＸＰモチーフのうちの３つを含む。欠失分析によれば、最初の２つのＰＸＸＰモチーフを失っているＭＮＡＲの構築物は、トランスフェクションアッセイにおいてエストロゲン受容体活性を刺激できない（図１３）。このことは、これらの最初の２つのＰＸＸＰモチーフが、Ｓｒｃとの相互作用に十分であることを示唆する。これらのモチーフの変異によって、最初のＰＸＸＰモチーフ（アミノ酸５５〜５８）（ＰＸＸＰ変異体１、配列番号２３）は、ＥＲ転写活性を活性化するのに必要かつ十分であるが、第二のＰＸＸＰモチーフ（アミノ酸６４〜６７）（ＰＸＸＰ変異体２、配列番号３２）は、除去可能であることが明らかになった（図１４）。
【０１４９】
本研究において作成されたさらなる変異体は以下のとおりであった：アミノ酸１〜１２０を有する変異体５（配列番号２４）；アミノ酸１〜７９を有する変異体６（配列番号２５）；アミノ酸１〜４０を有する変異体７（配列番号２６）；アミノ酸１９０〜４６９を有する変異体８（配列番号２７）；アミノ酸８８８〜１１３１を有する変異体１２（配列番号２８）；アミノ酸８０〜５９４を有する変異体１３（配列番号２９）；アミノ酸８０〜５７４を有する変異体１４（配列番号３０）。これらの変異体の各々は、上記に列挙した他の変異体とともに、図１２に模式的に図示されており、ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされた場合、ＥＲ刺激性転写を増強する能力について解析された（図１３）。
【０１５０】
結論として、本発明者らは、エストロゲン受容体αおよびβとＭＮＡＲとの相互作用が、Ｅ２によって増強されるが、４（ＯＨ）タモキシフェンによっては増強されないことを実証する。本発明者らはまた、ＭＮＡＲ−ＥＲ複合体が、Ｓｒｃ酵素活性を劇的に刺激するＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼであるｐ６０ｓｒｃ（Ｓｒｃ）およびｐ５６lck（Ｌｃｋ）と相互作用することを示す。本発明者らはまた、ＭＮＡＲが、Ｓｒｃリン酸化カスケードの活性化を通じて、ＥＲ転写活性に影響して、最終的にはＥＲ媒介性遺伝子発現に影響することを示す。詳細には、本発明者らは、Ｅ２を用いたＭＣＦ−７細胞の短時間処理が、ＭＮＡＲ−Ｓｒｃ−ＥＲ複合体形成、Ｓｒｃの活性化、およびいくつかの内因性蛋白のリン酸化をもたらすことを実証する。一過性にトランスフェクトされた細胞における増強されたＭＮＡＲ発現は、ＥＲ転写活性の刺激をもたらす。ＳｒｃおよびＭＥＫキナーゼの特定のインヒビターは、ＭＮＡＲがＥＲ転写活性を増強する能力をブロックするので、本発明者らは、ＥＲのこの活性化は、Ｓｒｃキナーゼの活性化によって促進されたＭＡＰキナーゼリン酸化カスケードの刺激に起因すると結論する。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる、ＭＣＦ−７細胞からのＭＮＡＲの欠失は、ＥＲ媒介性遺伝子発現を阻害し、このことは、ＭＮＡＲがＥＲ調節性遺伝子発現に関与することを支持する。これらのデータによって、ＭＮＡＲは、ＳｒｃファミリーチロシンキナーゼとのＥＲのクロストークを調節し、それによってエストロゲン受容体の非ゲノム活性を媒介することが明らかになる。
【０１５１】
これらの研究によって、核内受容体との相互作用におけるＭＮＡＲの重要性が実証される。ＭＮＡＲは、核内受容体の非ゲノム活性に対してゲノム活性を選択的に調節する化合物を開発する手段を提供する。
【０１５２】
本明細書において引用された全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が参考として援用されることが詳細にかつ個々に示されたかのように、本明細書において参考として援用される。前述の本発明は、理解を明確にするための例示および実施例によって詳細に記載されているが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の趣旨からも範囲からも逸脱することなくここでなされ得ることは、本発明の教示の観点から当業者には容易に明らかである。
【０１５３】
参考文献：
Anzick, S. L., Kononen, J., Walker, R. L., Azorsa, D. O., Tanner, M. M., Guan, X. Y., Sauter, G., Kallioniemi, O. P., Trent, J. M., and Meltzer, P. S. (1997). AIB1, a steroid receptor coactivator amplified in breast and ovarian cancer. Science 277, 965-8.
Aronica SM, W. L. Kraus, B. S. Katzenellenbogen, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 8517-21 (1994).
Bression, D., Michard, M., Le Dafniet, M., Pagesy, P., and Peillon, F. (1986). Evidence for a specific estradiol binding site on rat pituitary membranes. Endocrinology 119, 1048-51.
Bunone G., P. Briand, R. Miksicek, D. Picard, EMBO J. 15, 2174-2183 (1996).
【０１５４】
Cantley LC, et al., Cell 64, 281-302 (1991).
Castoria G., et al., EMBO J. 18, 2500-2510 (1999).
Chen, Z., Yuhanna, I. S., Galcheva-Gargova, Z., Karas, R. H., Mendelsohn, M. E., and Shaul, P. W. (1999). Estrogen receptor alpha mediates the nongenomic activation of endothelial nitric oxide synthase by estrogen. J Clin Invest 103, 401-6.
Cheng, H., Nishio, H., Hatase, O., Ralph, S., and Wang, J. (1992). A synthetic peptide derived from p34cdc2 is a specific and efficient substrate of src-family tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 267, 9248-9256.
【０１５５】
Collins, P., and Webb, C. (1999). Estrogen hits the surface. Nature Medicine 5, 1130 - 1131.
Cooper, J. A., and Howell, B. (1993). The when and how of Src regulation. Cell 73, 1051-4.
Devergne, O., Hummel, M., Koeppen, H., Le Beau, M., Nathanson, E., Kieff, E., and Birkenbach, M. (1996). A novel interleukin-12 p40-related protein induced by latent Epstein- Barr virus infection in B lymphocytes [published erratum appears in J Virol 1996 Apr;70(4):2678]. J. Virol. 70, 1143-1153.
Downward J, Current Biology 7, R258-60 (1997).
【０１５６】
Endoh, H., Sasaki, H., Maruyama, K., Takeyama, K., Waga, I., Shimizu, T., Kato, S., and Kawashima, H. (1997). Rapid activation of MAP kinase by estrogen in the bone cell line. Biochem Biophys Res Commun 235, 99-102.
Evans RM 1988 The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science 240:889-895
Feng W, et al., Mol Endocrinol 15, 32-45 (2001).
Filardo, EJ, J. A. Quinn, K. I. Bland, A. R. Frackelton, Jr., Mol Endocrinol 14, 1649-1660 (2000).
【０１５７】
Franz,Mueller, Haartong, Frey and Katus (1997). Transgenic animal models: new avenues in cardiovascular disease physiology. J. Mol. Med. 75(2):115-119.
Glass, CK 1994 Differential recognition of target genes by nuclear receptor monomers, dimers, and heterodimers. Endocrine Reviews 15:391-407.
Goetz, R. M., Thatte, H. S., Prabhakar, P., Cho, M. R., Michel, T., and Golan, D. E. (1999). Estradiol induces the calcium-dependent translocation of endothelial nitric oxide synthase. PNAS 96, 2788-2793.
Heery, D. M., Kalkhoven, E., Hoare, S., and Parker, M. G. (1997). A signature motif in transcriptional co-activators mediates binding to nuclear receptors [see comments]. Nature 387, 733-6.
【０１５８】
Hong, H., Kohli, K., Garabedian, M. J., and Stallcup, M. R. (1997). GRIP1, a transcriptional coactivator for the AF-2 transactivation domain of steroid, thyroid, retinoid, and vitamin D receptors. Molecular & Cellular Biology 17, 2735-44.
Houthaeve T, G. H., Ashman K, Nillson T, Mann M. (1997). J Protein Chem 16, 343-348.
Hubbard SR, M. Mohammadi, J. Schlessinger, Journal of Biological Chemistry 273, 11987-90 (1998).
Ishii, T., Yanagawa, T., Kawane, T., Yuki, K., Seita, J., Yoshida, H., and Bannai, S. (1996). Murine peritoneal macrophages induce a novel 60-kDa protein with structural similarity to a tyrosine kinase p56lck-associated protein in response to oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun 226, 456-60.
【０１５９】
Joung, I., Strominger, J. L., and Shin, J. (1996). Molecular cloning of a phosphotyrosine-independent ligand of the p56lck SH2 domain. PNAS 93, 5991-5995.
Kato S, et al., Science 270, 1491-4 (1995).
Katzenellenbogen JA, O'Malley BW, Katzenellenbogen BS 1996 Tripartite steroid hormone receptor pharmacology: interaction with multiple effector sites as a basis for the cell- and promoter-specific action of these hormone. Mol Endocrinol 10:119-131.
Kristen D. Brubaker, C. V. G. (1999). Estrogen stimulates protein tyrosine phosphorylation and Src kinase activity in avian osteoclasts. Journal of Cellular Biochemistry, Volume 76, Issue 2, 2000. P 76, 206-216.
【０１６０】
Mangelsdorf, D. J., Thummel, C., Beato, M., Herrlich, P., Schutz, G., Umesono, K., Blumberg, B., Kastner, P., Mark, M., Chambon, P., and et al. (1995). The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell 83, 835-9.
Marcus, S. L., Winrow, C. J., Capone, J. P., and Rachubinski, R. A. (1996). A p56lck Ligand Serves as a Coactivator of an Orphan Nuclear Hormone Receptor. J. Biol. Chem. 271, 27197-27200.
Marshall CJ, Curr Opin Cell Biol 8, 197-204 (1996).
Matsuda M, B. J. Mayer, Y. Fukui, H. Hanafusa, Science 248, 1537-9 (1990).
【０１６１】
McKenna, N. J., Lanz, R. B., and O'Malley, B. W. (1999). Nuclear receptor coregulators: cellular and molecular biology. Endocrine Reviews 20, 321-44.
Migliaccio, A., Castoria, G., Di Domenico, M., de Falco, A., Bilancio, A., Lombardi, M., Barone, M. V., Ametrano, D., Zannini, M. S., Abbondanza, C., and Auricchio, F. (2000). Steroid-induced androgen receptor-oestradiol receptor {beta}-Src complex triggers prostate cancer cell proliferation. EMBO J. 19, 5406-5417.
Migliaccio, A., Di Domenico, M., Castoria, G., de Falco, A., Bontempo, P., Nola, E., and Auricchio, F. (1996). Tyrosine kinase/p21ras/MAP-kinase pathway activation by estradiol- receptor complex in MCF-7 cells. EMBO J. 15, 1292-1300.
【０１６２】
Migliaccio, A., Pagano, M., and Auricchio, F. (1993). Immediate and transient stimulation of protein tyrosine phosphorylation by estradiol in MCF-7 cells. Oncogene 8, 2183-91.
Migliaccio, A., Piccolo, D., Castoria, G., Di Domenico, M., Bilancio, A., Lombardi, M., Gong, W., Beato, M., and Auricchio, F. (1998). Activation of the Src/p21ras/ERk pathway by progesterone receptor via cross-talk with estrogen receptor. EMBO J. 17, 2008-2018.
Oursler, M. J. (1998). Estrogen regulation of gene expression in osteoblasts and osteoclasts. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression 8, 125-40.
【０１６３】
Pappas, T. C., Gametchu, B., and Watson, C. S. (1995). Membrane estrogen receptors identified by multiple antibody labeling and impeded-ligand binding. FASEB Journal 9, 404-10.
Park, I., Chung, J., Walsh, C., Yun, Y., Strominger, J., and Shin, J. (1995). Phosphotyrosine-Independent Binding of a 62-kDa Protein to the src Homology 2 (SH2) Domain of p56lck and Its Regulation by Phosphorylation of Ser- 59 in the lck Unique N-Terminal Region. PNAS 92, 12338-12342.
Parker, M. G., and White, R. (1996). Nuclear receptors spring into action [news; comment]. Nature Structural Biology 3, 113-5.
【０１６４】
Pietras, R. J., and Szego, C. M. (1979). Metabolic and proliferative responses to estrogen by hepatocytes selected for plasma membrane binding-sites specific for estradiol-17beta. Journal of Cellular Physiology 98, 145-59.
Pietras, R. S., C (1975). Endometrial cell calcium and oestrogen action. Nature 253, 357-359.
Pietras, R. S. C. (1977). Specific binding sites for estrogen at the outer surfaces of isolated endometrial cells. Nature 265, 69-72.
Puls, A., Schmidt, S., Grawe, F., and Stabel, S. (1997). Interaction of protein kinase C zeta with ZIP, a novel protein kinase C-binding protein. PNAS 94, 6191-6196.
【０１６５】
Razandi M, A. Pedram, G. L. Greene, E. R. Levin, Molecular Endocrinology 13, 307-19 (1999).
Revelli A, M. Massobrio, J. Tesarik, Endocr Rev 19, 3-17 (1998).
Sambrook, Fritsch and Maniatis. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Press (Cold Spring Harbor, New York). 1989.
Simoncini T., H.-M. A., Brazil D.P., Ley K., Chin W. W.&, and J.K., L. (2000). Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of
phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature 407, 538-541.
【０１６６】
Singer, C. A., Figueroa-Masot, X. A., Batchelor, R. H., and Dorsa, D. M. (1999). The mitogen-activated protein kinase pathway mediates estrogen neuroprotection after glutamate toxicity in primary cortical neurons. J Neurosci 19, 2455-63.
Torchia, J., Rose, D. W., Inostroza, J., Kamei, Y., Westin, S., Glass, C. K., and Rosenfeld, M. G. (1997). The transcriptional co-activator p/CIP binds CBP and mediates nuclear-receptor function [see comments]. Nature 387, 677-84.
Thomas, SM, Brugge, JS Annual Review of Cell & Developmental Biology 13, 513-609 (1997).
【０１６７】
Tsai M-J, O'Malley BW 1994 Molecular mechanisms of action of steroid/thyroid receptor superfamily members. Annu Rev Biochem 63:451-486.
Voegel, J. J., Heine, M. J., Tini, M., Vivat, V., Chambon, P., and Gronemeyer, H. (1998). The coactivator TIF2 contains three nuclear receptor-binding motifs and mediates transactivation through CBP binding-dependent and -independent pathways. EMBO Journal 17, 507-19.
Weiss, A., and Littman, D. R. (1994). Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 76, 263-74.
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１Ａ】図１は、ＭＮＡＲ、およびｐ１６０のアミノ酸配列を比較するアラインメントである。
【図１Ｂ】図１は、ＭＮＡＲ、およびｐ１６０のアミノ酸配列を比較するアラインメントである。
【図１Ｃ】図１は、ＭＮＡＲ、およびｐ１６０のアミノ酸配列を比較するアラインメントである。
【図２Ａ】図２は、エストロゲン受容体βとＭＮＡＲとの相互作用を示す。パネルＡは、ＭＣＦ−７細胞抽出物からプルダウンしたＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤによって得られた銀染色したゲルを示す。
【図２Ｂ】図２は、エストロゲン受容体βとＭＮＡＲとの相互作用を示す。パネルＡは、ＭＣＦ−７細胞抽出物からプルダウンしたＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤによって得られた銀染色したゲルを示す。得られたペプチドは、逆相ＨＰＬＣカラムを用いて精製し、質量分析に基づくミクロシークエンシングによって同定した。これらのペプチドの配列を、パネルＢに提供する。
【図３】図３は、実施例２における実験からのノーザンブロットによって評価した、種々の細胞株におけるＭＮＡＲの発現解析の結果を示す。
【図４】図４（ＡおよびＢ）は、実施例２における実験由来のノーザンブロットによって評価した、種々の組織におけるＭＮＡＲ発現分析の結果を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、フラッグタグ付けＭＮＡＲと、ＥＲα、およびＥＲβ、またはＥ２とリガンド結合された受容体、または４−ＯＨタモキシフェンとの相互作用を示す。また、全長フラッグ−ＭＮＡＲと、転写／翻訳されたアンドロゲン（ＡＲ）および糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）（その対応するリガンドの有無における）との相互作用の結果も、示される（図５Ｃ、および５Ｄ）。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例４の実験の結果を示す。ここでは、試験を行って１７βエストラジオールの有無における、ＳｒｃまたはＬｃｋと、ＭＮＡＲ、および／またはＥＲαとのインビトロにおける相互作用を評価する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例４の実験の結果を示す。ここでは、試験を行って１７βエストラジオールの有無における、ＳｒｃまたはＬｃｋと、ＭＮＡＲ、および／またはＥＲβとのインビトロにおける相互作用を評価する。
【図７】図７は、ＥＲ−ＭＮＡＲ−Ｓｒｃ相互作用の提唱されたモデルの模式図である。
【図８】図８は、ｃＳｒｃ酵素活性におけるＥＲ−ＭＮＡＲc複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析である。基質として酸変性エノラーゼを用いて、ＥＲの非存在（レーン１および３）、またはＥＲ（レーン３〜６）、Ｅ２（レーン３および５）、およびＭＮＡＲ（レーン２、５、および６）の存在下において、ｃＳｒｃ酵素活性を評価した。図８に示すデータは、ＭＮＡＲ自体がｃＳｒｃ酵素活性を強力に刺激することを示す。
【図９Ａ】図９は、実施例７の実験からの結果を示す一連のグラフである。ここで試験を行って、ＭＮＡＲがＥＲ媒介転写に影響するか否かを評価する。図９Ａは、ＥＲα、ＭＮＡＲ、および／またはＳＲＣ３の結果を示す。
【図９Ｂ】図９は、実施例７の実験からの結果を示す一連のグラフである。ここで試験を行って、ＭＮＡＲがＥＲ媒介転写に影響するか否かを評価する。図９Ｂは、細胞をＥ２か、Ｅ２に加えてＰＰ２か、またはＥ２に加えてＰＤ９８０５９かを用いて処理した場合のＥＲα、およびＭＮＡＲについての結果を示す。
【図９Ｃ】図９は、実施例７の実験からの結果を示す一連のグラフである。ここで試験を行って、ＭＮＡＲがＥＲ媒介転写に影響するか否かを評価する。図９Ｃは、アンチセンス（ＡＳ）か、Ｅ２か、Ｅ２に加えてコントロールか、またはＥ２に加えてアンチセンスかで処理したＭＣＦ−７細胞の結果を示す。それぞれＭＮＡＲ，ｐＳ２，およびカテプシンＤを標的するようにプライマー／プローブセットを設計する。
【図９Ｄ】図９は、実施例７の実験からの結果を示す一連のグラフである。ここで試験を行って、ＭＮＡＲがＥＲ媒介転写に影響するか否かを評価する。図９Ｄは、アンチセンス、またはＥ２で刺激した逆コントロールオリゴマーでトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞の抽出物の、ウサギポリクローナルＭＮＡＲ抗血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１０Ｂ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１０Ｃ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１０Ｄ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１０Ｅ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１０Ｆ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１１】図１１は、実施例９における実験由来のウエスタンブロットによって評価した、Ｅ２誘導性Ｅｒｋ活性化に対するＭＮＡＲの分析の結果を示す。
【図１２】ＭＮＡＲおよび１３ＭＮＡＲ変異体（変異体２〜１４）の構造−機能の組織化の模式図である。これらの変異体は、実施例１０の実験のもとで、ＨｅｐＧ２細胞中にトランスフェクトされたとき、生成されて、それらがＥＲ刺激転写を強化する能力について試験された。
【図１３】図１３は、ＭＮＡＲ欠失変異体（変異体２〜１４）の分析の結果を示す棒グラフである。これらの変異体は、実施例１０の実験においてｈｅｐＧ２細胞中にトランスフェクトされたとき、それらがＥＲ刺激転写を強化する能力について試験された。
【図１４】図１４は、ＰＸＸＰモチーフＭＮＡＲ変異体の分析の結果を示す棒グラフである。これらの変異体は、実施例１０の実験においてＨｅｐＧ２細胞中にトランスフェクトされたとき、それらがＥＲ転写活性を活性化する能力について試験された。
【図１５Ａ】図１５は、ヒトＭＮＡＲのポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、ヒトＭＮＡＲのポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１６】図１６は、ヒトＭＮＡＲのアミノ酸（配列番号２）を示す。
【図１７】図１７は、マウスＭＮＡＲのポリヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。
【図１８】図１８は、マウスＭＮＡＲのアミノ酸（配列番号１３）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学および内科の分野に関し、そして新規な核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）（これは、エストロゲンα（ＥＲα）、およびエストロゲンβ（ＥＲβ）の両方と相互作用する）に関する。より詳細には、本発明は、エストロゲン受容体の転写活性および／またはチロシンキナーゼのｓｒｃファミリーの活性化を調節するための新規な組成物、方法、ならびにアッセイに関する。本発明はまた、核内受容体（例えば、エストロゲン受容体）のゲノム活性と非ゲノム活性との間の区別のための、新規な組成物、方法、およびアッセイに関する。さらに、本発明は、ＭＮＡＲをコードする核酸、アンチセンス、核酸の組み換え発現、ならびに本発明の核酸および蛋白を利用する宿主細胞、組成物、およびアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
核ホルモン受容体は、リガンド誘導性転写因子のスーパーファミリーであり、これは、遺伝子発現のリガンド依存性転写制御に関与する、クラスである。受容体分子において立体配置的な変化を誘導する特定のリガンドの結合は、他の転写因子との受容体相互作用に影響し、そして最終的には前開始複合体の形成に影響する。このプロセスは、遺伝子転写の速度を調節する（D．J．Mangelsdorfら、Cell ８３：８３５〜９，１９９５（非特許文献１））。
【０００３】
核ホルモン受容体のスーパーファミリーとしては、ステロイドホルモン受容体、非ステロイドホルモン受容体、およびオーファン受容体が挙げられる。糖質コルチコイド（ＧＲ）、鉱質コルチコイド（ＭＲ）、プロゲスチン（ＰＲ）、アンドロゲン（ＡＲ）、およびエストロゲン（ＥＲ）の受容体は、古典的なステロイド受容体の例である。ステロイドホルモン受容体に加えて、この核ホルモン受容体のスーパーファミリーは、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、およびレチノイドのような非ステロイドホルモンの受容体からなる。さらに、いわゆる「オーファン」受容体をコードする、ある範囲の核内受容体様配列が、同定されている。これらのオーファン受容体は、核ホルモン受容体に構造的に関連しており、従って核ホルモン受容体として分類されるが、推定のリガンドは、まだ同定されていない（Cell，８３：８５１〜８５７，１９９５（非特許文献２））。
【０００４】
核ホルモン受容体のスーパーファミリーは、６つの別個の構造、かつ機能であるドメイン（Ａ〜Ｆ）を含むモジュール構造によって構造的かつ機能的に特徴付けられる。より詳細には、これらの受容体は、可変性のＮ末端領域（ドメインＡ／Ｂ）を有し；その後ろに、以下を有する：中心に位置した、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン（本明細書において以降では、ＤＢＤと呼ばれる；ドメインＣ）；可変性のヒンジ領域（ドメインＤ）；保存されたリガンド結合ドメイン（本明細書において以降はＬＢＤと呼ばれる；ドメインＥ）；および可変性のＣ末端領域（ドメインＦ）。Cell（前出）。
【０００５】
サイズおよび配列が高度に可変性であるＮ末端領域は、このスーパーファミリーの異なるメンバーの間でもあまり保存されていない。この受容体のこの部分は、転写活性化の調節に関与する。
【０００６】
ＤＢＤは、約６６〜７０のアミノ酸からなっており、ＤＮＡ結合活性を担う。このドメインは、クロマチン上の特定の標的遺伝子の転写制御単位内の、ホルモン反応性エレメント（本明細書において以降はＨＲＥと呼ばれる）と呼ばれる、ＤＮＡ配列に特異的な受容体を標的する。ＧＲ、ＭＲ、ＰＲ、およびＡＲのようなステロイド受容体は、同様のＨＲＥ ＤＮＡ配列を認識するが、ＥＲは、異なるＤＮＡ ＨＲＥ配列を認識する。ＤＮＡへの結合後、このステロイド受容体は、基礎的な転写機構の成分と、そして配列特異的な転写因子と相互作用して、これによって特定の標的遺伝子の発現を調節すると考えられる。
【０００７】
ＬＢＤは、この受容体のＣ末端部分に位置しており、主にリガンド結合活性を担う。このように、ＬＢＤは、ホルモンリガンドの認識および結合に必須であり、そしてさらに、転写活性化機能を有し、それによってこの受容体のホルモン応答の特異性および選択性を決定する。構造中では中程度に保存されているが、ＬＢＤは、核ホルモン受容体スーパーファミリーの個々のメンバーの間では相同性がかなり変化していることが公知である。
【０００８】
核内受容体のホルモンリガンドが細胞に進入し、かつＬＢＤによって認識されるとき、それは、特定の受容体蛋白に結合して、それによって受容体蛋白のアロステリックな改変を開始する。（Cell，前出）。この改変の結果として、リガンド／受容体複合体は、転写的に活性な状況に切り替わり、そしてそれ自体が、ＤＢＤの存在によって、クロマチンＤＮＡ上で対応するＨＲＥに高い親和性で結合し得る。このように、リガンド／受容体複合体は、特定の標的遺伝子の発現を調節する。このファミリーの受容体によって達成された多様性は、異なるリガンドに対して応答する能力に起因する。
【０００９】
ゲノム活性の調節に加えて、ホルモン受容体複合体は、重要かつ変化した非ゲノム効果を有し得る。この非ゲノム活性は、細胞内のセカンドメッセンジャーにおける高速かつ一過性の増大によって特徴付けられる。次に、これらのセカンドメッセンジャーは、増殖および分化のような細胞機能に影響する、多数の異なる経路およびカスケードに関与する。
【００１０】
より詳細には、ステロイドホルモン受容体は、胚の発生、成体の恒常性、および器官の生理学に関連する。種々の疾患および異常が、ステロイドホルモン作用における撹乱に帰せられる。ステロイド受容体は、非ゲノム活性のホルモン活性化転写モジュレーターとして、およびホルモン活性化合物刺激因子として、その影響を及ぼすので、これらの受容体を改変するか、これらの受容体と相互作用するか、またはこれらの受容体を調節するための種々のアプローチへのさらなる検討が、非常に重要な領域である。例えば、これらの受容体における変異および欠損、ならびにこれらの受容体の過剰刺激またはブロックによって、ホルモンシグナル伝達経路の基礎にある機構に対して良好な洞察が提供され得、これによって、ステロイド受容体に関連する疾患および異常の広範な種々の処置における効力の増大がもたらされる。
【００１１】
（エストロゲン受容体）
エストロゲン（Ｅ２）は、ＥＲとの相互作用を通じて、異なる組織において多くの生物学的効果を発揮する。アミノ酸配列解析、一過性のトランスフェクション研究、およびＥＲの変異分析によって、ＥＲが、上記の古典的なモジュール構造を有することが示される。ＥＲのＮ末端Ａ／Ｂドメインは、転写活性化機能１（ＴＡＦ−１）と呼ばれる、トランス活性化機能を含む。ＤＢＤは、２つのジンクフィンガーを含み、かつＤＮＡ認識を担う。ＬＢＤおよび二次トランス活性化機能（ＴＡＦ−２と呼ばれる）は、ＥＲのＣ末端に位置する。
【００１２】
ホルモンに対する結合の際、ＥＲは、活性化および形質転換の段階を経験する。活性化されたＥＲは、特定のエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）と相互作用する。このＥＲＥは、エストロゲン調節遺伝子のプロモーター領域に位置しており、かつその標的遺伝子転写に影響する。過去１０年間にわたって、多くの研究が、ＥＲ上のリガンド（アゴニスト／アンタゴニスト）の効果、およびＥＲの構造と機能との間の関係の両方の基本的な理解を提供してきた。それにもかかわらず、ＥＲの非ゲノム活性についての機能に関しては、ほとんど明らかになっていない。
【００１３】
ＥＲβは、ＥＲαと呼ばれる、さらに一般的に公知のエストロゲン受容体とは異なっていると考えられる。ＥＲαおよびＥＲβは、総称的に、本明細書においてＥＲと呼ばれる。ＥＲβのＤＢＤは、ＥＲαのＤＢＤに対して９０％同一である。しかし、ＥＲαのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）とＥＲβのリガンド結合ドメインとの間の全体的な相同性は、５５％未満である。ＥＲα同様に、ＥＲβは、リガンド依存性の様式でＥＲＥからの転写を刺激し得る。
【００１４】
エストロゲンは、細胞内セカンドメッセンジャー（カルシウムおよびｃＡＭＰを含む）のレベルの高速かつ一過性の増大を誘導すること、およびエストロゲンは、マイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＭＡＰＫ）およびホスホリパーゼＣの活性化を誘導することが確認されている（CollinsおよびWebb，１９９９）。実際、多くの研究によって、エストロゲンが、Ｓｒｃ／Ｒａｓ／ＭＡＰキナーゼリン酸化経路の迅速かつ一過性の活性化を誘導することが実証された。この経路の活性化によって、細胞増殖および分化を誘導する重要な細胞機能が誘引される。これらの急性の事象の時間経過は、ペプチドホルモンによって惹起されたものと似ており、これによって、これらの事象はエストロゲンの「古典的な（clasical）」ゲノム作用に関与しないという仮説が、支持される。
【００１５】
現在のデータによってまた、エストロゲン受容体と、マイトジェン活性化蛋白（ＭＡＰ）キナーゼシグナル伝達カスケードとの間の直接のリンクが示唆される。ＭＡＰキナーゼは、リン酸化され、かつ種々のシグナルに対する応答において活性化されるセリン−トレオニンキナーゼのファミリーである。これらの酵素は、細胞外シグナルを、複数の膜受容体から細胞内標的（転写因子、細胞骨格蛋白、および酵素を含む）に伝達する。ＭＡＰキナーゼファミリーは、細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）、ｐ３８、およびｃＪｕｎＮ末端キナーゼ（Ｒａｓ、Ｒａｆ、およびマイトジェン活性化蛋白キナーゼ（ＭＥＫ）の連続的活性化に関与する経路を通じてシグナル伝達する）を含む（S．M．Thomas，J．S．Brugge，Annual Review of Cell ＆ Developmental Biology １３，５１３〜６０９，１９９７（非特許文献３））。肺の内皮細胞、ニューロン細胞、骨芽細胞、および破骨細胞において、１７βエストラジオール（Ｅ２）は、ＭＡＰＫ経路を急速に活性化することが報告されている。
【００１６】
より詳細には、肺内皮細胞において、１７βエストラジオール（Ｅ２）は、一酸化窒素（ＮＯ）産生を急速に刺激することが報告されており、したがってこのことは、Ｅ２が血管の急性拡張を誘導する能力を説明する。Chenら（Chenら、１９９９）は最近、単離された肺内皮細胞において、Ｅ２が内皮一酸化窒素合成（ｅＮＯＳ）の急速な活性化合物を誘導することを報告している。ｅＮＯＳのエストロゲン活性化は、ＭＡＰキナーゼ経路の急速な活性化を通じて生じることが示された。コンプリメンタリーな研究によってまた、Ｅ２が、原形質膜から核に近い細胞内部位へのｅＮＯＳのカルシウム依存性転位を誘導すること（急速（５分以内）であり、受容体媒介性であるが、非ゲノムである作用）が示された（Goetzら、１９９９）。さらに、ホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ（３）Ｋ）のｐ８５α調節性サブユニットとのリガンド依存性ＥＲα相互作用は最近、エストロゲンの心血管保護効果の薬物治療に結び付けられた（Simoncini T、およびJ．K．、２０００）。エストロゲンを用いた刺激によって、ＥＲα関連ＰＩ（３）Ｋ活性が増大され、それによって蛋白キナーゼＢ／Ａｋｔ、および内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）の活性化がもたらされる。
【００１７】
ニューロン細胞において、Ｅ２によるＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の急速な活性化によって、グルタミン酸塩興奮毒性の後の一次皮質ニューロンにおける神経保護が生じる（Singerら、１９９９）。エストロゲンのこれらの神経保護効果（曝露の後５分以内に生じることが報告された）は、ＥＲ依存性の様式で、c−Ｓｒｃ−チロシンキナーゼの一過性の活性化、およびｐ２１（ｒａｓ）−グアニンヌクレオチド活性化蛋白のチロシンリン酸化を通じて媒介された。
【００１８】
同様に、骨芽細胞において、Ｅ２は、５分以内にＭＡＰキナーゼリン酸化、および活性化を誘導する（Endohら、１９９７）。従って、Ｅ２は、これらの細胞における細胞増殖および分化を調節し、骨形成の増大を導く。いくつかの研究によってまた、エストロゲンは、Ｓｒｃキナーゼの活性化を通じて、破骨細胞においてＭＡＰキナーゼ経路を活性化することが示される（Oursler，１９９８）。これはまた、ＭＡＰキナーゼ活性化が、骨再吸収に必要な酵素の調節に関与し得ることを示している（Kristen D．Brubaker，１９９９）。
【００１９】
ヒト乳癌由来細胞株であるＭＣＦ−７、およびＴ４７Ｄにおいて、ならびにヒト結腸癌由来細胞株であるＣａｃｏ−２において、Ｅ２は、Ｓｒｃ／Ｒａｓ／Ｅｒｋ経路を誘導するシグナルを活性化する（Migliaccioら、１９９３）、（Migliaccioら、１９９６）、（Migliaccioら、１９９８）、（Migliaccioら、２０００）。この活性化は、直接のＥＲ−Ｓｒｃ相互作用によって媒介される。興味深いことに、プロゲステロンはまた、Ｔ４７Ｄ細胞において同じ経路を活性化する（Migliaccioら、１９９８）。Ｓｒｃ／Ｒａｓ／Ｅｒｋシグナル伝達経路は、増殖因子の周知の標的である。重要なことに、この経路の活性化は、ＥＲとＳｒｃとの直接の相互作用を必要とする。この経路の活性化は、増殖または分化のような異なる細胞応答を誘発する［Cantley，１９９１］；［Marshall，１９９６］；Downward，１９９７］。ステロイドホルモンのような、エストロゲン受容体リガンドによるこの経路の活性化によって、細胞周期制御におけるその関与が詳細に説明される。
【００２０】
これらのデータによって、ＥＲの非転写活性／非ゲノム活性が、細胞増殖の刺激の原因であり得るという見解が支持される。しかし、このプロセスの分子機構の詳細はほとんど未知である。Ｓｒｃ活性化は、多数のヒト乳癌および結腸癌において以前に観察されている（［Rosen，１９８６］；［Ottenhoff−Kalff，１９９２］）。Ｓｒｃの活性化によって、トランスジェニックマウスにおける乳房腫瘍が誘導される（［Guy，１９９４］）。構成的に活性なＲａｓ変異体は、乳癌を含む全ての癌のうち２５〜３０％で見出されている（［Kasid，１９８７］）。
【００２１】
最近の研究によって、古典的なＥＲに無関係の原形質膜エストロゲン受容体の存在が示唆されている。この膜ＥＲのクローニングまたは単離は、達成されていないが、他の研究では、古典的なＥＲの小集団は、細胞膜に関連しており、かつエストロゲンの急速な効果の原因であることが示唆されている。
【００２２】
核内受容体自体の転写活性が、複数のシグナル伝達経路による緻密な調節のための標的である。これらの経路としては、神経伝達物質ドーパミン（［Power，１９９１］；［Smith，１９９３］）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）のような増殖因子、トランスホーミング成長因子−α（ＴＧＦ−ａ）、およびインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）（［Ignar−Trowbridge，１９９６］、［Aronica，１９９３］；［Bunone，１９９６］）によって、ならびにプロテインキナーゼＣのアクチベーター（［Aronica，１９９４］）によって刺激される経路が挙げられる。このような交差カップリングの分子機構は、少なくとも一部は、受容体リン酸化によって媒介されると考えられる。ＥＲは、ＥＧＦに対する応答においてＭＡＰキナーゼによってリン酸化され、それによってＡＦ１の刺激が生じることが実証されている（［Kato，１９９６（非特許文献２１）］；［Bunone，１９９６］）。他の研究によって、ＥＲ（［Auricchio，１９８７］；［Arnold，１９９５］；［Pietras，１９９５］）、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲβ）（［Lin，１９９２］）、ＲＡＲγ（［Rochette−Egly，１９９２］）、糖質コルチコイド受容体（［Rao，１９８７］）、およびオーファン受容体ＨＮＦ−４（［Ktistaki，１９９５］）がまた、チロシンリン酸化の標的であることが実証された。特定のチロシンリン酸化部位は、ヒトＥＲ（ｈＥＲ）のＡＦ２ドメイン内の、アミノ酸５３７で（Ｙ５３７）同定された（［Castoria，１９９３］；［Arnold，１９９５］）。このチロシンは、ＡＦ２配列のすぐＮ末端に位置しており、かつＥＲβを含む、多様な種由来の全ての公知のＥＲ配列において保存されている（［Kuiper，１９９６］；［Mosselman，１９９６］）。
【００２３】
Ｅ２の非ゲノム活性およびゲノム活性の分子機構は、十分解明されていないが、本発明によって、我々は、組織および遺伝子の選択性の活性を用いた新世代の治療法を創出することができるはずである。
【００２４】
いくつかのＥＲリガンドの組織選択性作用をさらに理解するために、本発明者らは、異なる細胞株においてＥＲ相互作用蛋白の発現および活性を評価した。アフィニティー精製および質量分析（ミクロシーケンシングに基づく）を用いて、本発明者らは、ＭＮＡＲ（核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター）と命名された新規なＥＲ相互作用蛋白を開発した。
【非特許文献１】D．J．Mangelsdorfら、Cell ８３：８３５〜９，１９９５
【非特許文献２】Cell，８３：８５１〜８５７，１９９５
【非特許文献３】S．M．Thomas，J．S．Brugge，Annual Review of Cell ＆ Developmental Biology １３，５１３〜６０９，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、新規な蛋白である、核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）、およびこの蛋白をコードする核酸を提供する。ＭＮＡＲ蛋白は、エストロゲン受容体のような核ホルモン受容体と相互作用し得る。概して、ＭＮＡＲの蛋白またはポリペプチドとは、ＭＮＡＲのアミノ酸配列をいう。特に好ましい実施形態において、ＭＮＡＲ蛋白は、ＥＲα、およびＥＲβと相互作用する。この相互作用はリガンド依存性である。ＭＮＡＲはまた、ＥＲおよびキナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーのメンバー）と複合体を形成する。ＳｒｃおよびＭＡＰキナーゼ活性は、ＥＲ転写活性の増強をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、（ａ）配列番号２の推定アミノ酸配列を有する、ＭＮＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む新規な核酸を提供する（図１２を参照のこと）。ヒトＭＮＡＲのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される（図１５を参照のこと）。ヒトＭＮＡＲのアミノ酸配列は、配列番号１３に示される（図１６を参照のこと）。マウスＭＮＡＲのヌクレオチド配列は、配列番号１２に示される（図１７を参照のこと）。マウスＭＮＡＲのアミノ酸配列は、配列番号１３に示される（図１８を参照のこと）。
【００２７】
本発明は、新規な単離された核酸であって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号１３のアミノ酸配列を含む、新規な蛋白である、核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｂ）高度にストリンジェントな条件下で、以下：（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列のある領域と、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列の少なくとも１００ヌクレオチドの配列と、（ｉｉｉ）または、（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖と、ハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１の配列、または配列番号１２の配列をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも８５％同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１の配列、または配列番号１２の配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの変種；ならびに
（ｅ）配列番号２０または２３のアミノ酸を含むポリヌクレオチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）のポリヌクレオチドの相補型またはアンチセンス型；
からなる群より選択されるポリヌクレオチドであって、ここでこのポリヌクレオチドは、ｐ１６０蛋白（図１）をコードしない、ポリヌクレオチド、
を含む、新規な単離された核酸配列を提供する。好ましい実施形態において、この単離された核酸は、このポリヌクレオチドの対立遺伝子変種を含む。
【００２８】
特定の実施形態において、この核酸は、発現制御配列（例えば、異種制御配列、または同種制御配列）に作動可能に連結される。本発明は、このような単離された核酸を用いて形質転換された宿主細胞（細菌、酵母、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）を提供する。
【００２９】
本発明はまた、ポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号１３のアミノ酸配列を含む、蛋白である、核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１４、１５、または１６のアミノ酸配列を含む、ＭＮＡＲフラグメントのアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の変種、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のフラグメント、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、に関する。
別の実施形態において、これらのポリペプチドは、配列番号１３または１４のアミノ酸配列に９０％、または９５％より多く同一である、アミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２、１３、１４、１５、１６、２０、または２２のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、１つ以上の核内受容体の存在下において、チロシンキナーゼの活性を刺激し得る。この核内受容体は、ステロイド核内受容体、および非ステロイド核内受容体、ならびにオーファン核内受容体から選択され得る。特定の実施形態において、この核内受容体は、エストロゲン受容体である。
【００３０】
別の実施形態は、ＭＮＡＲポリペプチドに対応するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメントを含む。
【００３１】
核内受容体のＭＮＡＲによる調節の観点において、本発明の多くの実施形態は、核内受容体の転写活性を調節する工程に関する。この工程は、核内受容体の遺伝子座に対してＭＮＡＲポリペプチドを提供することを含む。例えば、（ａ）請求項１に記載のＭＮＡＲの核酸配列を有する組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程；および（ｂ）；この核酸を発現するように形質転換されたこの宿主細胞を、核内受容体の存在下で培養する工程によって、核内受容体の転写活性を調節することができる。
【００３２】
本発明はまた、核内受容体の非ゲノム活性またはゲノム活性に影響する化合物を同定するための多くのアプローチを示す。１つの実施形態において、ゲノム活性に対して、非ゲノム活性を示す化合物を同定する方法は、ＭＮＡＲ−核内受容体複合体を含む細胞に対して試験化合物を投与する工程、およびこの試験化合物から生じる非ゲノム活性またはゲノム活性を測定する工程、を含む。これらの方法において、好ましくは、核内受容体の少なくとも１つのリガンドが細胞中に存在するか、またはキナーゼが存在するか、または両方ともが存在する。他の方法は、核内受容体上でＭＮＡＲの活性を調節する化合物についてのスクリーニングに関する。これは、以下の工程：（ａ）試験化合物と、ＭＮＡＲポリペプチドとを接触させる工程；および（ｂ）この試験化合物が、このポリペプチドに特異的に結合するか否かを決定する工程、を含む。さらに、核内受容体上でＭＮＡＲの活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法であって、この方法は、以下の工程（ａ）このポリペプチドおよび核内受容体を含む細胞に、試験化合物を添加する工程；ならびに（ｂ）この添加工程の前後でＭＮＡＲ活性を比較する工程、を含む方法を実施することができる。この方法に対するさらなるアプローチは、ＭＮＡＲ活性を欠くか、または有意に低下したＭＮＡＲ活性を有する変異細胞を含むコントロールに対して、試験化合物を投与することを含む。これらの方法のいずれかにおいて、当業者は、コントロールを用いて、ある化合物の非ゲノム活性（またはゲノム活性）を評価し得る。この評価は、ＭＮＡＲおよび核内受容体の存在下で、ある細胞に対してある化合物を投与する工程、次いでＭＮＡＲの非存在下でこの実験を繰り返す工程、ならびに非ゲノム活性のレベルを比較する工程による。好ましい方法は、ＭＮＡＲ、核内受容体、またはその両方を過剰発現する細胞を使用する。ある化合物のゲノム活性は、レポーターと作動可能に結合した核レポーターを有することによって検出される。
【００３３】
本発明の特定の実施形態はまた、非ゲノム活性に対して、選択的ゲノム活性を有する化合物を同定する方法に関しており、この方法は、以下の工程：（ａ）ＭＮＡＲ−核内受容体複合体を含む細胞に対して試験化合物を添加する工程、および（ｂ）この試験化合物のこの添加の前後に非ゲノム活性に対してゲノム活性を比較する工程、を含む。選択的ゲノム活性は、従来の手段によって測定され得る。好ましくは、測定される非ゲノム活性の増大または正の影響は、ＭＮＡＲの非存在下において試験化合物を用いたゲノム活性と比べて（ここで、この試験化合物の添加後に非ゲノム活性の変化は観察されない）、ＭＮＡＲ核レポーターの存在下において、細胞に対するこの試験化合物の添加後に、２倍増大する。一方では、非ゲノム活性について試験化合物を選択する場合、ＭＮＡＲの非存在下において試験化合物を用いた非ゲノム活性と比べて（ここで、この試験化合物の添加後にゲノム活性の変化は観察されない）、ＭＮＡＲ核内受容体複合体の存在下において、細胞に対するこの試験化合物の添加後に、少なくとも約２倍増大しなければならない。ＭＮＡＲの存在下で核内受容体の転写活性が増大するか低下するかを決定することによって、この効果を測定することができる。
【００３４】
種々の細胞（健常、または疾患細胞）において、細胞にとって有益な状態または健常な状態が、非ゲノム活性またはゲノム活性に起因するか否かを理解することが有用であり得る。本発明は、ＭＮＡＲの存在下および非存在下において、細胞の所望の表現型を比較することによって、このような決定を可能にする。
【００３５】
本発明はまた、ヒト以外のトランスジェニック動物に関する。ここで１つ以上の細胞が、少なくとも１つの非機能性の内因性ＭＮＡＲポリヌクレオチド配列、少なくとも１つの非機能性内因性核内受容体、またはその両方を含む。好ましい実施形態において、このヒト以外のトランスジェニック哺乳動物は、ＥＲα、およびＥＲβの機能的な内因性形態を有さない。あるいは、トランスジェニック動物は、内因性ＭＮＡＲプロモーターの誘導性／抑制性プロモーターでの置換を含む。請求の範囲のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物は、この哺乳動物の少なくとも１つの細胞型において活性なプロモーターの制御下で、内因性選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。
【００３６】
本発明はまた、ＭＮＡＲの機能を破壊する化合物についてスクリーニングする方法に関する。この方法は、ＭＮＡＲと相互作用する化合物を同定するための蛋白間相互作用アッセイを用いることを含む。一旦、任意の周知のツーハイブリッドアッセイまたは他の従来のアッセイを使用すれば、蛋白間相互作用、および試験化合物（これは、天然の産物の単離物、低分子化合物、ペプチドなどであり得る）によるその破壊を研究することができる。
【００３７】
ＭＮＡＲ蛋白およびＭＮＡＲコード核酸は、哺乳動物の細胞および組織（例えば、ヒトおよびマウスの細胞および組織）から入手できる。組み換えＭＮＡＲ、および抗ＭＮＡＲ抗体は、薬物スクリーニング、診断、および治療法における用途を見出す。詳細には、Ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼ（遺伝子発現を調節するのに関与する）の酵素活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズするＥＲリガンドについて化合物をスクリーニングするための特定の生化学的アッセイを開発するのにおいて、ＭＮＡＲは、有用な試薬を提供する。さらに、種々の核内受容体リガンドについて化合物をスクリーニングするための特定の生化学的アッセイを開発するのにおいて、ＭＮＡＲは有用な試薬を提供する。従って、核内受容体（例えば、ＥＲ）、および／またはキナーゼに関与する任意の経路において効果を分析することができる。例えば、以下：（Ｉ）癌細胞における細胞周期刺激；（ＩＩ）骨の発達または調節のための細胞増殖、細胞分化、および細胞保護；（ＩＩＩ）神経細胞におけるＥＲリガンド／試験化合物の神経保護活性；ならびに（ＩＶ）内皮細胞の肺の指標、に対するＥＲリガンドまたは試験化合物の影響を決定するために、ＭＮＡＲを用いてアッセイを構成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
（特定の実施形態の詳細な説明）
（定義）
所定のＭＮＡＲ蛋白または、所定のＭＮＡＲに対して「実質的な機能的同一性」を有する蛋白の機能的類似体を、このようなＭＮＡＲに特異的な１つ以上の生化学的特性を示す蛋白として規定する。
【００３９】
「核酸分子」とは、一本鎖分子または二本鎖分子を意味し、そしてこれには、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、およびＲＮＡまたはＤＮＡ分子の類似体が挙げられる。
【００４０】
「転写調節」とは、転写の改変を意味し、そしてこれには、以下：転写開始の速度、転写のレベル、または調節性制御に対する転写／転写開始の反応性、の変化が挙げられる。
【００４１】
「細胞の新生物状態」とは、細胞（良性であっても悪性であってもよい）の任意の新しい増殖を意味する。
【００４２】
「実質的に純粋」、または「単離された」という用語は、ＭＮＡＲ蛋白、ＭＮＡＲ蛋白フラグメント、またはＭＮＡＲもしくはＭＮＡＲフラグメントをコードする核酸が、それが正常には、その天然の状態で伴っている、少なくともいくつかの物質を伴わないことを意味する。実質的に純粋なＭＮＡＲの組成物、またはその一部は、診断、治療、および研究用の試薬において有用な、賦形剤および添加物を含んでもよい。
【００４３】
「改変された発現状態」とは、天然に存在する状態のＭＮＡＲの発現が、天然に存在する状態と比較して、ＭＮＡＲ発現を増大または減少するように改変されていることを意味する。
【００４４】
「実質的な配列同一性」とは、蛋白または核酸の一部が、ＭＮＡＲ配列部分と、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、または９９％の配列同一性を示すことを意味する。この配列が本明細書に開示されるネイティブなＭＮＡＲ配列とは異なる場合、その相違は好ましくは保存的、すなわち、酸性アミノ酸の酸性アミノ酸置換であるか、または冗長性コドンを提供するヌクレオチド変化である。異なる配列は、重合体にわたって均一に分布されるのではなく、領域内で局所的に集合される。実質的に同一な配列は、比較的高いストリンジェンシーのもとで、相補的なＭＮＡＲコード配列に対してハイブリダイズする。高ストリンジェンシーなサザンハイブリダイゼーション条件を規定する目的で、Sambrookら（１９８９）第３８７〜３８９頁（参考として本明細書に援用される）が都合よく参照され得る。ここで、第１１頁における洗浄工程が、高ストリンジェンシーであると考えられる。
【００４５】
「融合蛋白またはポリペプチド」とは、第二のアミノ酸配列に融合した少なくとも第一のアミノ酸配列を含む、蛋白またはポリペプチドであって、ここでこのような融合は天然に存在する蛋白またはポリペプチドには生じない、蛋白またはポリペプチドを意味する。好ましくは、この融合蛋白またはポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸配列は、ＭＮＡＲのアミノ酸配列である。
【００４６】
「変異体または変異」とは、遺伝物質（例えば、ＤＮＡ）における任意の検出可能な変化、またはこのような変化の任意のプロセス、機構もしくは結果を意味する。これには、遺伝子変異（遺伝子の構造（例えば、ＤＮＡ配列）が改変されている）、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子またはＤＮＡ、および改変された遺伝子またはＤＮＡ配列によって発現される任意の発現産物（例えば、蛋白、ポリペプチド、または酵素）が挙げられる。
【００４７】
「変種」は、改変されたかまたは改変された遺伝子、ＤＮＡ配列、蛋白、ポリペプチド、酵素、細胞など（すなわち、任意の種類の変異体）を示すために用いられる。天然に存在する蛋白またはポリペプチドの変種は、例えば、天然に存在する蛋白またはポリペプチドにおける、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、改変、および／または挿入を含む。
【００４８】
「組み換え体」とは、任意の遺伝物質であって、その遺伝物質（例えば、ＤＮＡ配列）に、もともと生物学的にも天然にも存在しないある配列（例えば、全長または部分的ＤＮＡ配列）のその配列または鎖への挿入から、生物学的もしくは化学的に生じる遺伝物質（例えば、ＤＮＡ配列）、を意味する。
【００４９】
「蛋白またはポリペプチドフラグメント」とは、より大きい蛋白またはポリペプチドのうちのより小さい任意の部分であって、ここでこのフラグメントは好ましくは、少なくとも約８アミノ酸、そしてより好ましくは２５、５０、１００、または２００アミノ酸を有する部分、を意味する。
【００５０】
受容体の非ゲノム活性とは、「細胞に対して有益」であり、ここでこの細胞は、この細胞に対する増大した量のＭＮＡＲの導入の際、所望の活性または表現型の存在を示す。
【００５１】
受容体の非ゲノム活性とは、「細胞に対して有益でない」であり、ここでこの細胞は、この細胞に対する増大した量のＭＮＡＲの導入の際、所望の活性または表現型の非存在を示す。
【００５２】
（ＭＮＡＲの特徴づけ）
ＭＮＡＲの配列解析によって、ＭＮＡＲの分子のＮ末端部分に局在する複数のＬＸＸＬＬモチーフが明らかになった。他の転写因子における同様のモチーフは、核内受容体のリガンド結合ドメインの表面上の疎水性グルーブとの接触を形成することが以前に示された（（Heeryら、１９８７）、（Torchiaら、１９９７））。ＭＮＡＲ分子の別の重要な特徴は、プロリンリッチドメインである。このドメインは、ＳｒｃファミリーのプロテインキナーゼのＳＨ３ドメインとの相互作用のために利用され得る。初めに、本発明者らは、ＭＮＡＲが、核内受容体とＳｒｃキナーゼとの相互作用を増強し得ると仮定した。本発明者らのデータによって、エストロゲン受容体α、およびβが、ＭＮＡＲと相互作用すること、およびこの相互作用は、１７βエストラジオールによって増強されるが、４（ＯＨ）タモキシフェンでは増強されないことが示される。興味深いことに、ＭＮＡＲ−ＥＲ複合体は、インビトロおよびインビボの両方で、Ｓｒｃキナーゼの酵素活性と強力に相互作用し、かつこれを刺激する。重要なことに、ＭＮＡＲの過剰発現は、ＥＲ転写活性の増強をもたらす。本発明者らは、ＥＲのこの活性が、Ｓｒｃの下流のキナーゼの１つによる、ＥＲのリン酸化に起因すると予想する。従って、本発明者らは、ＭＮＡＲが、ＥＲとＳｒｃキナーゼとの相互作用を調節し、かつそれによってＥＲの非ゲノム活性を媒介すると提起する。
【００５３】
本発明者らのデータによって、ＥＲリガンドについて、本発明者らがアッセイすることを可能にする、ＥＲリガンドのゲノム活性と非ゲノム活性との間を区別し得る実験モデルの開発が支持される。ＥＲの転写活性に影響しないが、Ｓｒｃ酵素活性を刺激するリガンドは、重要な骨節約、ＣＮＳ防御的、かつ心保護的な活性を保有し得る。一方では、ＥＲの転写活性を選択的に制御する化合物は、かなりの選択性作用を有し、それによって多数の副作用を回避する。全体として、本発明者らが核内受容体リガンド、特にＥＲリガンドのゲノム活性および非ゲノム活性を分離する能力によって、本発明者らは、大いに集中した選択性の作用を用いて新世代の治療方法を創出することができるかもしれない。
【００５４】
本発明者らのデータによってまた、核内受容体リガンドのゲノム活性と非ゲノム活性との間を区別し得る核内受容体リガンドについて、本発明者らがアッセイすることを可能にする実験モデルの開発が支持される。種々の核内受容体の転写活性に影響しないが、Ｓｒｃ酵素活性、または他の非ゲノム酵素活性を刺激するリガンドは、重要な治療的特性、または活性を保有する。一方では、核内受容体の転写活性を選択的に制御する化合物は、かなりの選択性作用を有し、それによって多数の副作用を回避する。全体として、本発明者らが核内受容体リガンドのゲノム活性および非ゲノム活性を分離する能力によって、本発明者らは、大いに集中した選択性の作用を用いて新世代の治療方法を創出することができるかもしれない。
【００５５】
（ＭＮＡＲをコードする核酸配列、および対応するＭＮＡＲ蛋白）
生物学的に活性なＭＮＡＲ，またはそのＭＮＡＲフラグメントは、ＭＮＡＲの機能（例えば、ＥＲとの複合体を特異的に形成する能力、またはＥＲの転写活性を調節もしくは強化する能力）のうち１つ以上を保持する。生物学的活性についての例示的なアッセイを、以下、および実施例に記載している。特異的な結合は、ＭＮＡＲ（例えば）を、成分の混合物と接触させること、およびＭＮＡＲに優先的に結合する成分を同定することによって、経験的に決定される。特異的な結合は、多数の方法（酵母および哺乳動物のハイブリッドシステム、ならびに競合的結合研究が挙げられるがこれらに限定されない）によって都合よく示され得る。例えば、ＥＲまたはＭＮＡＲについての、可能性のある活性化補助因子、受容体、および／またはリガンドを同定するために、酵母ツーハイブリッドアッセイを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【００５６】
キナーゼとＭＮＡＲ−ＥＲ複合体との間の相互作用の分析に加えて、ＭＮＡＲを同様のストラテジーで用いて、ＥＲリガンドと、他の公知の転写因子を有するＥＲ（他の核内受容体を含む）との間の相互作用を評価し、かつ新規な相互作用する蛋白を同定し得る。例えば、ＭＮＡＲ−ＥＲの相互作用は、１７β−エストラジオールによって増強され得るので、試験因子（化合物であっても、蛋白であっても、ペプチドであってもよい）の効果を評価することができる。さらに、Ｓｒｃの有無において、ＭＮＡＲとＥＲとの間の直接の相互作用を実証するために、酵母ツーハイブリッドシステム、哺乳動物ツーハイブリッドシステム、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、または他のアッセイを用いてもよい。同様に、ＭＮＡＲ−ＥＲ複合体、またはＭＮＡＲ−ＥＲ−Ｓｒｃ複合体と相互作用する公知の蛋白および新規の蛋白について広範にスクリーニングするために、これらのアッセイシステムを用いることができた。
【００５７】
本発明は、組み換え産生されたＭＮＡＲ蛋白、ＭＮＡＲ類似体、およびそれらのフラグメントを提供する。これらの組み換え産物は、本明細書に開示されるか、または引用された、さもなければ当業者に公知である、物理的技術、化学的技術、および分子技術によって容易に改変される。本発明の特定の実施形態に従って、ＭＮＡＲコード配列のフラグメントは、異種配列と接合されて融合蛋白を生成する。このような融合蛋白は、インビトロおよびインビボでＥＲ活性を調節するのにおいて特に有用である。
【００５８】
ＭＮＡＲはさらに、当該分野で公知の方法によって改変され得る。例えば、ＭＮＡＲは、リン酸化されても、脱リン酸化されても、グリコシル化されても、脱グリコシル化されても、放射性標識があっても、放射性標識がなくても、その他でもよい。セリン残基、トレオニン残基、およびチロシン残基は特に、有用なリン酸化部分を提供し得る。特に有用なのは、ＭＮＡＲの溶解性、膜輸送能力、安定性、ならびに結合特性および親和性を変更する改変である。いくつかの例としては、脂肪酸アシル化、蛋白分解、および結合を安定化する、核内受容体転写因子相互作用ドメインにおける変異が挙げられる。特に、ＬＸＸＬＬモチーフのうちの１つのプロリンリッチ領域を改変してもよい。
【００５９】
実質的に純粋もしくは単離された、ＭＮＡＲ蛋白、またはＭＮＡＲ部分（核酸によってコードされる）は、一般に、このＭＮＡＲコード核酸に対して少なくとも約１％；好ましくは少なくとも約１０％；より好ましくは少なくとも約５０％；そして最も好ましくは少なくとも９０％相同性である。核酸重量のパーセンテージは、ＭＮＡＲまたはＭＮＡＲ部分をコードする核酸（選択的スプライシング型または部分的転写型のような、別の型および類似体を含む）の重量を、存在する総核酸重量で割ることによって決定される。
【００６０】
本発明はまた、以下を提供する：転位、転換、欠失、挿入、または他の改変（例えば、選択的スプライシング、およびこのような別の型）によって改変されたＭＮＡＲ配列、ゲノムＭＮＡＲ配列、ＭＮＡＲ遺伝子隣接配列（ＭＮＡＲ調節配列、および他の非転写ＭＮＡＲ配列を含む）、ＭＮＡＲのｍＲＮＡ配列、ならびにＭＮＡＲコード配列に相補的なＲＮＡおよびＤＮＡのアンチセンス配列、異種ＭＮＡＲをコードする配列、および合成ヌクレオチドを含むＭＮＡＲ配列。ここで、例えば、リン酸基の酸素は、イオウ、メチルなどで置換されてもよい。
【００６１】
改変されたＭＮＡＲコード配列、または関連の配列は、ＭＮＡＲ様の機能を有する蛋白をコードする。一般に、その少なくとも一部と、ＭＮＡＲの一部との間には、特に保存的置換、特にプロリンリッチ領域、およびＬＸＸＬＬモチーフ内において、ならびに蛋白間相互作用、特にＭＮＡＥ−ＥＲもしくはＭＮＡＲ−ＥＲ−キナーゼ相互作用、特にＭＮＡＲ−核内受容体、もしくはＭＮＡＲ−核内受容体−キナーゼ相互作用に関与する蛋白ドメインをコードする領域内において、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％の実質的な配列同一性が存在する。
【００６２】
ＭＮＡＲは、本明細書において記載されるか、さもなければ当該分野で公知の方法によって、別の精製、生合成、改変、または用途に供されてもよい。例えば、そのアミノ酸は、多数の方法（安定性、溶解度、結合親和性、特異性、およびメチル化を改変する工程が挙げられるがこれらに限定されない）で改変されてもよい。本発明のアミノ酸配列はまた、検出可能なシグナルを提供し得る標識を用いて、直接または間接的に、改変されてもよい。例示的な標識としては、放射性同位体、蛍光剤、およびビオチン化が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
ＭＮＡＲの少なくとも一部をコードする核酸を用いて、そのＭＮＡＲと相互作用する核因子および核薬剤を同定する。この同定には、Current Protocols in Molecular Biologyにおいて記載されたとおり、酵母または哺乳動物の細胞における発現スクリーニングを用いる（「Protein Expression」第１６章（２００２）を参照のこと）。ＭＮＡＲと相互作用するこれらの核因子および核薬剤を同定する方法の１つは、哺乳動物、または酵母のツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイを利用することである。（例えば、以下を参照のこと：Fields S．ら（１９９４）Trends Genet．１０：２８６〜２９２；Young Pら（１９９２）Current Biology ３：４０８〜４２０；Zervosら（１９９３）Cell ７２：２２３〜２３２；Maduraら（１９９３）J．Biol．Chem．２６８：１２０４６〜１２０５４；Bartelら（１９９３）Biotechniques １４：９２０〜９２４；およびIwabuchiら（１９９３）Oncogene ８：１６９３〜１６９６）。本明細書において例証されたように、転写因子（例えば、Ｇａｌ４）の活性化ドメインをコードするＤＮＡと連結された、融合遺伝子のｃＤＮＡを含有する酵母ｃＤＮＡライブラリーを、ＭＮＡＲの一部、および転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードする融合遺伝子を用いてトランスフェクトした。ＭＮＡＲ結合蛋白をコードするクローンは、転写因子の相補性を提供して、レポーター遺伝子の転写を通じて同定される。例えば、FieldsおよびSong（１９８９）Nature ３４０，２４５〜２４６、およびChienら（１９９１）Proc．Natl．Acad．Sci USA ８８，９５７８〜９５８２を参照のこと。
【００６４】
本発明はまた、ＭＮＡＲ、またはその一部、またはその類似体をコードし、かつ必要に応じてＥＲおよび／またはキナーゼをコードする核酸を含むベクターを提供する。多数のベクター（これとしては、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる）が、種々の真核生物宿主、および原核生物宿主における発現について記載されている。ベクターは、しばしば、クローニングまたは発現のための１つ以上の複製システム、宿主での選択のための１つ以上のマーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）、および１つ以上の発現カセットを備える。挿入されたＭＮＡＲコード配列は、合成されてもよいし、天然の供給源から単離されてもよいし、ハイブリッドとして調製されてもよいし、それ以外でもよい。転写調節配列に対する、このコード配列の連結は、公知の方法によって達成され得る。有利には、ベクターは、ＭＮＡＲコード部分に対して作動可能に連結されたプロモーターを備え得る。
【００６５】
適切な宿主細胞を、任意の適切な方法（エレクトロポレーション、ＣａＣｌ２媒介性ＤＮＡ取り込み、ウイルス感染、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル、または他の確立された方法を含む）によって、形質転換／トランスフェクト／感染させてもよい。あるいは、１つ以上のＭＮＡＲをコードする核酸は、組み換え事象によって細胞に導入されてもよい。例えば、ある配列を、細胞中にマイクロインジェクションして、それによって、ＭＮＡＲをコードする内因性遺伝子、その類似体もしくは偽遺伝子、またはＭＮＡＲコード遺伝子に対して実質的な同一性を有する配列の部位での相同組み換えを達成し得る。非相同組み換え、相同組み換えによる内因性遺伝子の欠失（特に多能性細胞などにおける）のような、他の組み換えベースの方法によってさらなる適用が提供される。
【００６６】
適切な宿主細胞としては、細菌、古細菌、真菌、特に酵母、ならびに植物および動物の細胞、特に哺乳動物細胞が挙げられる。特に興味があるのは、E．coli、B．Subtilis、Saccharomyces cerevisiae、Ａ５４９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｈｅｐ２細胞、ならびに骨細胞、および不死化された哺乳動物骨髄性細胞株およびリンパ細胞株である。好ましい宿主細胞株としては、ＭＣＦ−７細胞、およびＴ４７Ｄ細胞のようなヒト癌細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。理想的には、このような発現系は、市販されているＴＥＴ オン／オフシステムのような誘導性の発現ストラテジーを利用する。このような細胞株は、非ゲノムＥＲ活性におけるＭＮＡＲの役割を規定するために、そしてＭＮＡＲ−ＥＲ相互作用を調節する潜在的な化合物の効果を評価するために有用である。多数の転写開始のエレメント／領域、および終止調節のエレメント／領域が単離されており、そして種々の宿主における異種蛋白の転写および翻訳に有効であることが示されている。これらの領域、単離の方法、操作の様式などの例は、当該分野で公知である。適切な発現制御配列、および宿主細胞／クローニングビヒクルの組み合わせは周知であり、かつSambrookら（１９８９）に記載されている。
【００６７】
オリゴヌクレオチドをコードするＭＮＡＲはまた、他のＭＮＡＲ，または転写因子の活性化補助因子を同定するために用いられ得る。例えば、３２Ｐ−標識されたＭＮＡＲコード核酸を用いて、ＭＮＡＲ関連ドメインを有する蛋白をコードする類似のｃＤＮＡを同定するために、低ストリンジェンシーにおいてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。さらに、本明細書に開示された配列を用いる縮重オリゴヌクレオチドプローブによるＰＣＲ増幅によって、ＭＮＡＲ関連蛋白を単離する。ＭＮＡＲをクローニングするための他の実験方法もまた、以下の実施例に記載されている。本明細書に開示される本発明を実施するための他の有用なクローニング、発現、および遺伝子操作技術は、当業者に公知である。
【００６８】
本明細書に開示される組成物および方法は、遺伝子治療を達成するために用いられてもよい。例えば、Gutierrezら（１９９２）Lancet．３３９，７１５〜７２１を参照のこと。例えば、ＭＮＡＲの発現または調節の改変を達成し得る遺伝子調節配列に対して作動可能に連結されたＭＮＡＲ配列を用いて、細胞をトランスフェクトする。ＭＮＡＲ翻訳を調節するために、ＭＮＡＲ相補性アンチセンスポリヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクトしてもよい。
【００６９】
アンチセンス調節は、遺伝子調節配列に作動可能に連結されたＭＮＡＲアンチセンス配列を使用し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０の長さのヌクレオチド配列であり得る。アンチセンス核酸は、化学合成、および酵素連結反応（当該分野で公知の手順を用いる）を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または種々の改変されたヌクレオチド（この分子の生物学的活性を増大するように、またはアンチセンスとセンスの核酸との間で形成された二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された）を用いて化学的に合成されてもよい。例えば、ホスホロチオエート誘導体、およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る。あるいは、アンチセンス核酸は、発現ベクターを用いて生物学的に生成されてもよい。この発現ベクターには、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされている（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のＲＮＡである）。本発明においては、その遺伝子の転写がＭＮＡＲコードｍＲＮＡに結合し得るアンチセンス転写物を生じるように配向されたプロモーター配列とともにＭＮＡＲ配列を含むベクターを用いて、細胞がトランスフェクトされる。転写は、構成的であっても誘導性であってもよく、そしてベクターは、安定な染色体外の維持または組み込みをもたらし得る。あるいは、ＭＮＡＲの少なくとも一部をコードするゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡに結合する一本鎖アンチセンス核酸配列は、ＭＮＡＲ発現の実質的な減少を生じる濃度で標的細胞に投与され得る。
【００７０】
（核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター、および治療因子を同定するためのアッセイ）
本発明は、核内受容体（例えば、ＥＲ）のゲノム活性または非ゲノム活性を調節するのに有用な因子を同定するための方法および組成物を提供する。このような因子は、広範な疾患（癌、心血管疾患、微生物および真菌の感染、ならびに特に免疫疾患、骨保護、などが挙げられるがこれらに限定されない）の診断または処置において有用である。ヒト細胞において、核内受容体（例えば、ＥＲ）のゲノム活性に対する、核内受容体（例えば、ＥＲ）の非ゲノム活性を通じて作用する化合物をスクリーニングするための迅速かつ簡便なハイスループット生化学アッセイを開発する能力によって、薬物開発の新しい道筋が開かれる。さらに、本発明は、細胞内の疾患状態、または細胞の有益な細胞状態が、核内受容体（例えば、ＥＲ）のゲノム活性／経路によって達成されるか、非ゲノム活性／経路によって達成されるかを決定するためのツールを提供する。すなわち、核内受容体（例えば、ＥＲ）の非ゲノム活性、または核内受容体（例えば、ＥＲ）のゲノム活性が低下／増強されるとき、癌細胞が増殖するか否かを決定することができる。一般に、本発明は、核内受容体（例えば、ＥＲ）のゲノム／非ゲノム活性を必要とするとして、多くの細胞型を分類する工程を提供する。
【００７１】
本明細書において参考として援用される、Young、およびOzenberger（米国特許第５，９８９，８０８号）によって開示されるように、通常のアッセイは、酵母ツーハイブリッドアッセイを含む。ツーハイブリッドアッセイは、本発明の低分子化合物、またはペプチド、または蛋白についてスクリーニングするために用いられてもよい。
【００７２】
代表的には、見込みのある因子を、合成化合物または天然化合物の大きいライブラリーからスクリーニングする。例えば、糖類、ペプチド、および核酸ベースの化合物のランダムな合成および定方向の合成には多くの手段が利用可能である（例えば、Lamら（１９９１）Nature ３５４、８２〜８６を参照のこと）。あるいは、ライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に改変される。このような改変の例は、本明細書に開示される。
【００７３】
ＭＮＡＲまたはＭＮＡＲコード核酸を使用する広範なアッセイを用いて、有用な因子を同定する。このアッセイはまた、核内受容体、ステロイド受容体、オーファン受容体、ＥＲ、ＥＲＥ（エストロゲン応答エレメント）、ＥＲリガンド、キナーゼ、およびこのようなキナーゼのインヒビターから選択される１つ以上を使用してもよい。例えば、蛋白結合アッセイ、核酸結合アッセイ、およびゲルシフトアッセイは有用なアプローチである。例示的なアッセイは、固定されたＭＮＡＲに結合している標識された核内受容体（例えば、ＥＲ）、標識されたＭＮＡＲ、または固定された核内受容体（例えば、ＥＲ）に結合しているＭＮＡＲペプチドなどをアッセイする工程を含む。多くの適切なアッセイが、大量薬物スクリーニングに適切な、大規模化されたハイスループット用法を受け入れやすい。用いられる特定のアッセイは、ＭＮＡＲ相互作用の特定の性質によって決定される。アッセイは、単一のＭＮＡＲ，ＭＮＡＲフラグメント、ＭＮＡＲ融合産物、部分的ＭＮＡＲ複合体、またはＭＮＡＲ核酸を含む完全な基礎的な転写複合体を使用し得る。
【００７４】
有用な因子は、代表的には、ＭＮＡＲ、ＭＮＡＲ−核内受容体複合体、またはＭＮＡＲ−ＥＲ複合体に結合するかまたはそれらの会合を改変する因子である。好ましい因子としては、ＭＮＡＲ遺伝子の発現を調節し得る因子、特に核内受容体スーパーファミリーのメンバーによって転写された遺伝子が挙げられる。
【００７５】
有用な因子は、多くの化学的クラス内で見出されるが、代表的にはそれらは、有機化合物（好ましくは低分子有機化合物）である。低分子有機化合物は、５０を超えるが約２，５００未満、好ましくは約７５０未満、より好ましくは約２５０未満の分子量を有する。例示的なクラスとしては、ペプチド、糖類、ステロイド、などが挙げられる。
【００７６】
選択された因子は、効率性、安定性、薬学的適合性、などを増強するために改変されてもよい。因子の構造的特定は、さらなる因子を特定、生成、またはスクリーニングするために用いられ得る。例えば、ペプチド因子が同定される場合、それらのペプチドは、その安定性を増強するための種々の方法で、例えば、天然にないアミノ酸（例えば、Ｄアミノ酸、特にＤ−アラニン）を用いて、このアミノ末端またはカルボキシ末端を官能化すること（例えば、アミノ基についてはアシル化またはアルキル化、そしてカルボキシル基については、エステル化、またはアミド化）などによって、改変され得る。安定化の他の方法としては、例えば、リポソームなどにおけるカプセル化が挙げられ得る。
【００７７】
因子は、当業者に公知の種々の方法で調製され得る。例えば、約６０アミノ酸未満のペプチドは、従来の市販の自動シンセサイザーを用いて、今日では容易に合成され得る。あるいは、ペプチド（ならびに蛋白および核酸因子）は、公知の組み換え技術によって容易に産生される。
【００７８】
これらのアッセイシステムはまた、潜在的な治療剤（ペプチドおよび化学的リガンドを含む）をスクリーニングするために用いられ得る。ＭＮＡＲ機能のこのような潜在的な治療剤、活性化因子、またはインヒビターは、ＭＮＡＲと、核内受容体（例えば、ＥＲ）、もしくはキナーゼ（「クラスＩ」）のいずれかとの間の相互作用を調節するか、またはＭＮＡＲ、もしくは核内受容体（例えば、ＥＲ）、もしくはキナーゼ（「クラスＩＩ」）の活性を調節することによって作用し得る。ツーハイブリッドアッセイ、免疫沈降アッセイ、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを含むがこれらに限定されない相互作用アッセイが、（「クラスＩ」）治療剤を同定するために用いられ得る。例えば、化合物またはペプチドは、それらがＭＮＡＲと核内受容体（例えば、ＥＲ）との間の相互作用を調節する能力について、ＳＰＲによってスクリーニングされ得る。哺乳動物トランスフェクションアッセイ（ここで核内受容体（例えば、ＥＲ）転写活性が観察される）を含むがこれに限定されない活性アッセイを用いて、「クラスＩＩ」の化合物を同定し得る。例えば、化合物は、それらが核内受容体（例えば、ＥＲ）活性の強化を調節する能力について、ＭＮＡＲによってスクリーニングされ得る。このような化合物は、ＭＮＡＲと核内受容体（例えば、ＥＲ）との相互作用を調節し得るか、またはそれらの化合物は、ＭＮＡＲ、もしくは核内受容体（例えば、ＥＲ）の公知の活性もしくは未知の活性（転写の活性またはキナーゼの酵素活性を評価するために用いられ得る、アッセイを含む）を調節し得る。
【００７９】
治療用途のために、本明細書に開示される組成物および選択された因子は、その化合物の性質に依存する、任意の都合の良い方法で投与され得る。低分子量の因子については、経口投与が好ましく、そして腸溶性コーティング（その化合物が胃の環境に曝された後に保持しているとは予想されない）が必要とされ得る。一般に、投与された量は、慣用的な用量応答実験によって経験的に決定される。代表的には、量は、レシピエントの体重あたりで、約１〜１０００μｇ／ｋｇに及ぶ。大型の蛋白は好ましくは、非経口的に、好都合には生理学的に受容可能なキャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、生理食塩水、脱イオン水など）中で投与される。代表的には、このような組成物は、血液、または滑液のような、保持されている生理学的液体に添加される。他の添加物としては、安定化剤、殺菌剤などが挙げられ得る。これらの添加物は、従来の量で存在する。
【００８０】
ＭＮＡＲはまた、検出可能なシグナルを提供し得る標識を用いて直接または間接的に改変され得る。例示的な標識としては、放射性同位体、蛍光剤などが挙げられる。あるいは、ＭＮＡＲは、３５Ｓ−メチオニンのような標識されたアミノ酸の存在下で発現され得る。このような標識されたＭＮＡＲおよびその類似体は、例えば、ＭＮＡＲと相互作用する蛋白について、発現スクリーニングアッセイにおけるプローブとして、または例えば、薬物スクリーニングアッセイにおいてＥＲに結合するＭＮＡＲ、もしくは他のＥＲと相互作用する蛋白、もしくは転写因子として有用である。
【００８１】
他の核蛋白からＭＮＡＲを識別し得る特定のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、Harlow、およびLane、Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，１９８８、本明細書に援用された他の参考文献に開示された方法および組成物、ならびに当該分野で公知の免疫学的技術およびハイブリドーマ技術を用いて、容易に作成される。詳細には、ＭＮＡＲおよびその類似体およびフラグメントはまた、マウスおよびウサギのような実験動物において抗ＭＮＡＲ抗体を惹起するのに、そして細胞融合または形質転換によるモノクローナル抗体の生成に有用である。
【００８２】
抗ＭＮＡＲ抗体、およびそのフラグメント（Ｆａｂなど）は、転写複合体におけるＭＮＡＲの役割を調節すること、ＭＮＡＲ発現ライブラリーをスクリーニングすること、などに有用である。さらに、これらの抗体は、ＭＮＡＲの構造的類似体を同定、単離、および精製するのに用いられ得る。抗ＭＮＡＲ抗体はまた、種々の細胞周期段階の間の感染、サイトカインによる誘導、プロテインキナーゼＣおよびＡのようなプロテインキナーゼ、などのような、種々の条件下におけるＭＮＡＲの細胞下局在化のために有用である。他の例示的な適用としては、インビトロ転写抽出物を免疫枯渇するためにＭＮＡＲ特異的抗体（モノクローナル抗体、またはＭＮＡＲ由来ペプチド特異的抗体を含む）を用いる工程、ならびにＭＮＡＲ（類似体を含む）、またはＭＮＡＲと相互作用する他の核因子を精製するために免疫親和性クロマトグラフィーを用いる工程が挙げられる。
【００８３】
組成物はまた、例えば、ＭＮＡＲまたはＭＮＡＲコード核酸を改変することによる、疾患における治療行為のために提供される。オリゴペプチドは、純粋な形態で合成され得、そして診断および治療において多くの用途を見出し得る。これらのポリペプチドは、例えば、ＭＮＡＲ相互作用蛋白を用いてネイティブなＭＮＡＲ相互作用を調節するために用いられ得る。このオリゴペプチドは一般に、６アミノ酸より大きく、かつ約６０アミノ酸未満、より通常には約３０アミノ酸未満であるが、大きいオリゴペプチドが使用されてもよい。ＭＮＡＲまたはその一部は、一般には約５０％を超えて、通常は約９０％を超えて純粋な精製型で用いられ得る。このような純度までこのようなペプチドを精製するための方法としては、本明細書で開示されるか、さもなければ当業者に公知の種々の形態のクロマトグラフィーによる分離、化学的分離、および電気泳動による分離が挙げられる。
【００８４】
（トランスジェニック動物およびトランスジェニック細胞）
動物モデルは、例えば、コレステロールレベル、コレステロール吸収、および胆汁酸合成に対する影響について、化合物をスクリーニングするために有用なビヒクルとして役立つ。トランスジェニック動物（操作されたゲノムを有する動物と規定される）は、特定の適用において特に有用であることが証明されるかもしれない。本出願において、関心は、ＥＲ活性の調節または他の核内受容体、およびＥＲの非ゲノム活性に影響するのにおけるＭＮＡＲの役割に集中している。従って、本発明の実施形態は、ＭＮＡＲ活性を欠くトランスジェニックマウス、および核内受容体活性、ＥＲ活性、またはキナーゼ活性を欠くかもしれないトランスジェニック動物を含む。上記の１つ以上を欠いている動物は、ＭＮＡＲ、ＥＲ、キナーゼについての化合物またはリガンドの特異性を決定するために有用である。これらの動物は、このシグナル伝達経路の生物学を解明するのに有用なだけでなく、潜在的な治療組成物、および処置方法を検討するのにおけるツールとしても有用である。
【００８５】
これらの理由によって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも１つの非機能性の内因性ＭＮＡＲ（および／またはＥＲ、および／またはキナーゼ）を有する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物が、改変されたＭＮＡＲおよびＥＲの両方を有し得、これによって、機能的なＭＮＡＲ−ＥＲ複合体を欠く細胞を提供することがさらに意図される。非機能性の特質は、ＭＮＡＲ調節領域において、遺伝子コード配列の中断、蛋白産物を短縮するナンセンス変異、遺伝子コード配列の欠失、または改変を含んでもよい。動物における発現のための異臭遺伝子を設計するのにおいて、遺伝子発現の効率を妨害する配列（例えば、コード配列、プロモーター、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ポリメラーゼＩＩ終止配列、ヘアピン、コンセンサススプライス部位、など）が排除されてもよい。
【００８６】
トランスジェニックのアプローチおよび技術における現在の進歩によって、遺伝子付加、遺伝子欠失、または遺伝子改変を介した、種々の動物ゲノムの操作が可能になった（Franzら、１９９７）。非ヒト動物における、ヒトのヘモグロビン（本明細書において参考として詳細に援用される、米国特許第５，６０２，３０６号）、およびフィブリノーゲン（本明細書において参考として詳細に援用される、米国特許第５，６３９，９４０号）のトランスジェニック合成がまた開示されている。その各々は、その全体が参考として本明細書において詳細に援用されている。トランスジェニックマウスモデルの構築は現在、アルツハイマー病のための可能性のある処置をアッセイするために用いられている（本明細書においてその全体が参考として詳細に援用される、米国特許第５，７２０，９３６号）。トランスジェニックのＭＮＡＲノックアウトおよびＥＲノックアウト動物モデルにおいて、ＭＮＡＲ、および／またはＥＲに特異的なリガンドの効果を研究するためのモデルとして、トランスジェニック動物が価値のある情報をもたらすことが、本発明において意図される。
【００８７】
（結論）
本発明は、蛋白である核内受容体の非ゲノム活性モジュレーター（ＭＮＡＲ）の分子クローニング、構造分析、および特徴づけに基づく。本発明は、ヒトＭＮＡＲが、核ホルモン受容体と相互作用して、複合体を形成して、Ｓｒｃ蛋白キナーゼの酵素活性に影響することを実証する。
【００８８】
ＥＲの細胞表面と、細胞内シグナル伝達経路との間のクロストークは、２０年より昔に初めて実証された（Pietras，１９７５）（Pietras，１９７７）。それ以来、多数の報告が、血管構造、乳房、骨、子宮、およびニューロン組織において存在する急速なエストロゲン効果を確認したが、その効果は、エストロゲン受容体の「ゲノム」作用では説明できない。反応性細胞におけるエストロゲンの生物学的活性は、特定の高親和性受容体（排他的にその核に位置する）を通してだけでなく、エストロゲンと細胞表面受容体との相互作用を通じても媒介される。この受容体の性質が論議される。いくつかの証拠によって、固有の膜受容体の存在が支持される。他の証拠によって、細胞表面と核エストロゲン受容体との間の同一性、または強力な類似性が支持される（Pietras、およびSzego、１９７９）、（Bressionら、１９８６）、（Pappasら、１９９５）。
【００８９】
ＥＲαｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ細胞による実験に基づく重要な証拠によって、古典的なエストロゲン受容体が、チロシンリン酸化反応／ｐ２１ｒａｓ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を導くプロセスにおいて、ｃＳｒｃを活性化し得ることが明確に実証された（Migliaccioら、１９９６）。
【００９０】
ＭＣＦ７細胞においてＥＲ相互作用蛋白のスペクトルを評価して、本発明者らは、新規なＥＲ−相互作用蛋白であるＭＮＡＲを発見した。本発明者らは、ＥＲα、およびＥＲβの両方が、ＭＮＡＲと相互作用して、この相互作用の親和性が、１７βエストラジオールによって増強され、かつ４（ＯＨ）タモキシフェンによって減少されることを示した（図３）。
【００９１】
ＭＮＡＲに相同な蛋白であるｐ１６０は、ＬｃｋのＳＨ２ドメインによるプルダウンアプローチを用いて最近単離された。本発明者らのデータによって、ＭＮＡＲは、ＭＣＦ７細胞において発現されたこの蛋白の主な形態であることが示される（図２）。
【００９２】
次に、本発明者らは、ＭＮＡＲが、Ｓｒｃファミリーのキナーゼとのエストロゲン受容体の相互作用に影響するか否かを評価した。本発明者らのデータによって、ＥＲαおよびＥＲβの両方が、部分的に精製されたｃＳｒｃと相互作用して、この相互作用は、１７βエストラジオールによって増強されないことが示される（図４Ａ、およびＢ）。この結果は、以前に報告されたデータ（Migliaccioら、２０００）、（Migliaccioら、１９９８）と矛盾しない。なぜなら、本発明者らは、インビトロで転写／翻訳されたＥＲおよびＭＮＡＲを用い、そしてまたｃＳｒｃを精製したからである。同時にMigliaccioら（Migliaccioら、２０００）、（Migliaccioら、１９９８）は、ＭＮＡＲを含み得る細胞集出物からＳｒｃ相互作用蛋白、またはＥＲ相互作用蛋白をプルダウンすることによって彼らの実験を実施した。重要なことに、ＭＮＡＲの存在において、エストロゲン受容体は、リガンド依存性の様式でｃＳｒｃおよびＬｃｋと相互作用する（図４Ａ、およびＢ）。本発明者らはまた、ＭＮＡＲ自体は、低い親和性でｃＳｒｃまたはＬｃｋに結合することを観察した。従って、本発明者らの結果によって、ＥＲおよびＭＮＡＲは、Ｓｒｃファミリーキナーゼに対して相乗作用的に結合することが示唆される。基礎的な条件下で、Ｓｒｃファミリーキナーゼの触媒性ドメインは、分子内相互作用によって不活性な状態に強制される。Ｃ末端リン酸化チロシンに対するＳＨ２ドメインの結合は、この分子を阻害された高次構造にロックする（［Matsuda，１９９０］）。このリンカー領域のプロリンリッチドメインに対するＳＨ３ドメインの結合はまた、キナーゼ不活性化に重要である（［Superti−Furga，１９９３］）。完全な触媒活性には、これらの制限の解除が必要である。Ｓｒｃのキナーゼ活性は、ホスホチロシン含有配列に対するＳＨ２ドメインの結合によって、およびプロリンリッチ配列に対するＳＨ３ドメインの結合によって増強され得る（［Hubbard，１９９８］）。本発明者らは、次に、ＥＲ−ＭＮＡＲ結合がｃＳｒｃ活性化をもたらすか否かを検討した。本発明者らの結果によって、ＭＮＡＲは、ｃＳｒｃ触媒性活性を強力に増強し、この活性は、ＥＲ−Ｅ２の付加によってさらに刺激され得ることが示唆される（図５）。ＥＲαのホスホチロシン５３７は、ＥＲとＳｒｃのＳＨ２ドメインとの相互作用に必須の残基として同定された（Migliaccioら、１９９８））。本発明者らは、ＥＲが、ＭＮＡＲ分子のＬＸＸＬＬモチーフと相互作用し、そしてＥＲのホスホチロシン５３７が、ＳｒｃのＳＨ２ドメインと相互作用することを提示する。同時に、ＭＮＡＲのプロリンリッチドメインは、おそらくＳｒｃのＳＨ３ドメインと相互作用する。この複合体の形成は、ｃＳｒｃ活性化を導く。
【００９３】
ＥＧＦに応答するｃＳｒｃの活性化は、ＭＡＰキナーゼによるＥＲリン酸化、およびＥＲ媒介転写の刺激を促進することが以前に示されている（［Kato，１９９６］；［Bunone，１９９６］）。本発明者らの結果によって、おそらくｃＳｒｃ媒介リン酸化カスケードの活性化を通じた、ＭＮＡＲの過剰発現が、ＥＲ転写活性を増強することが示される（図６Ａ）。ＳｒｃインヒビターであるＰＰ２およびゲニステインの存在におけるＭＮＡＲ誘導性ＥＲ活性化の減弱（図６Ｂ）によって、ＭＮＡＲが、ｃＳｒｃ媒介リン酸化カスケードを介してＥＲと相互作用するという見解が支持される。
【００９４】
本発明者らの研究は、ＥＲとＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼとの間のクロストークを調節し、これによってエストロゲンおよび可能性としては他のステロイドの非ゲノム活性を調節する新しいＥＲ相互作用蛋白を記載する。この非ゲノム活性は、重要な機構（これによってエストロゲンが細胞の成長および増殖を調節する）を示す。従ってＭＮＡＲは、より選択性の作用を有する新しいエストロゲンの開発のための重要な標的を意味し得る。
【００９５】
上記の結論は、以下の実施例によって支持される。以下の実施例は、例示の目的で示されるものであって、限定の目的ではない。
【００９６】
（実施例）
（機器および試薬）。１７β−エストラジオール（Ｅ２）および４（ＯＨ）タモキシフェンは、Sigmaから入手した。ＩＣＩ−１８２，７８０は、AstraZeneca Pharmaceuticals（Wlimington．DE）から提供された。５’ＲＡＣＥプライマーは、マラソンｃＤＮＡキット（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）からであった。精製したｃＳｒｃ、またはＬｃｋは、Upstate（Charlottesville，VA）からであった。ｐ３４cdc２由来のビオチン化ペプチドは、Wyeth ResearchのPeptide Chemistryグループによって合成された。グルタチオンアガロースビーズは、Sigma−Aldrich（St．Louis，MO）から入手した。抗ホスホチロシン抗体、およびSuperSignal Elisa Picoペルオキシダーゼ基質は、Perbio Science AB（Pierce，Rockford，IL）からであった。ＳｒｃインヒビターＰＰ２は、Calbiochem−Novobiochem Corporation（San Diego，CA）からであった。
【００９７】
（方法１：）
（ＮＭＡＲの単離および同定）。ＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤ、およびＧＳＴ−ＥＲα―ＬＢＤを、ＢＬ２１（ＤＥ３）E．coli中で発現させた（ＧＳＴは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである）。ＬＢ中の細胞培養物を、ＯＤ０．６で、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導し、２５℃で３時間インキュベートし、そして細胞を遠心分離によってペレットにした。細菌細胞を、５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２、５００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ中で超音波処理して、４０，０００ｇで３０分間、遠心分離した。ＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤ、およびＧＳＴ−ＥＲα−ＬＢＤを固定するために、細胞抽出物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２，１８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００５％ ＮＰ４０（結合緩衝液）中に含有される５０％のグルタチオンアガローススラリーとともに、４℃でインキュベートした。製造業者の指示に従って、NE−PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Perbio Science AB，Pierce，Rockford，IL）を用いて、ＭＣＦ７細胞抽出物を調製した。１７βエストラジオール（０．１μＭ）とともに、または１７βエストラジオールなしで、ＧＳＴ、またはＧＳＴ−ＥＲ−ＬＢＤ融合蛋白のいずれかとともに、０．５ｍｇのＭＣＦ７細胞抽出物を、４℃でインキュベートさせた。結合した材料を、煮沸して２×ＳＤＳ緩衝液中のアガロースビーズを除いて、１０％ＰＡＡゲル上で精製した。このゲルを銀染色した。
【００９８】
（方法２：）
（精製した蛋白の質量分析解析）。電気泳動によって精製した蛋白サンプルを、手動的に切り出し、次いで還元して、アルキル化して、自動ゲル内トリプシン消化ロボット（Houthaeve T，１９９７）を用いて、インサイチュでトリプシン（Promega，Madison，WI）を用いて消化した。消化後、Savant Speed Vac Concentrator（ThermoQuest，Holdbrook，NY）を用いて、ペプチド抽出物を、１０〜２０μlの最終容積まで遠心分離した。自動化マイクロエレクトロスプレー逆相ＨＰＬＣ上で、ペプチド抽出物を分析した。要するに、マイクロエレクトロスプレーの接触面（interface）は、Picofrit溶融シリカスプレーニードル、長さ５０ｃｍ×内径７５μｍ、１０ｃｍの長さまで１０μｍ Ｃ１８逆相ビーズ（YMC、Wilmington，NC）を充填された８μｍの開口部直径（New Objuctive，Cambridge MA）から構成された。Picofritニードルは、質量分析検出器の前面に配置された手製の基礎の上に保持された光ファイバーホルダー（Melles Griot，Irvine，CA）に装着された。このカラムの後ろは、チタンユニオンによって垂直にされ、電気スプレー接触面のための電気的接触を供給する。このユニオンを、ＦＡＭＯＳオートサンプラー（LC−Packings，San Francisco，CA）に配管している溶融シリカキャピラリー（ＦＳＣ）の長さにそって連結し、そのオートサンプラーを、ＨＰＬＣ溶媒ポンプ（ＡＢＩ １４０Ｃ、Perkin−Elmer，Norwalk，CT）に連結した。ＨＰＬＣ溶媒ポンプは、５０μL／分の流量を送液し、この流量を、ＰＥＥＫマイクロタイトスプリッティングティー（Upchurch Scientific，Oak Harbor，WA）を用いて２５０ｎＬ／分に低下させ、次いで、ＦＳＣトランスファーラインを用いて、このオートサンプラーに送液した。このＬＣポンプおよびオートサンプラーを、その内蔵のユーザープログラムを用いて各々制御した。サンプルをプラスチックのオートサンプラーのバイアル中に入れ、密閉して、５μｌサンプルループを用いて注入した。表面消化物から抽出したペプチドを、Savant Speed Vac Concentrator（ThermoQuest，Holdbrook，NY）を用いて１０倍に濃縮し、次いで０〜５０％の溶媒Ｂ（Ａ：０．１Ｍ ＨｏＡｃ，Ｂ：９０％ ＭｅＣＮ／０．１Ｍ ＨｏＡｃ）の５０分の勾配を用いて、マイクロエレクトロスプレーＨＰＬＣシステムによって分離した。１．５ｋＶのスプレー電圧で作動するFinnigan LCQ−ＤＥＣＡイオントラップ質量分析計（ThermoQuest，San Jose，CA）上で、かつ１２５℃の加熱キャピラリー温度を用いて、ペプチド分析を行った。この装置に備わったデータ獲得ソフトウェアを用いて、自動化ＭＳ／ＭＳ様式でデータを獲得した。この獲得方法は、１ＭＳスキャン（３７５〜６００ｍ／ｚ）、その後にＭＳスキャンにおける上位の２つの最も豊富なイオンのＭＳスキャンを含んだ。次いで、この装置は、第二のＭＳスキャン（６００〜１０００ｍ／ｚ）、その後にそのスキャンにおける上位の２つの最も豊富なイオンのＭＳ／ＭＳスキャンを行った。この動的な排除、および同位体排除機能を使用して、分析されるペプチドイオンの数を増やした（設定：３amu＝排除幅、３分＝排除期間、３０秒＝排除前期間、３ａｍｕ＝同位体排除幅）。ＮＣＢＩゲノムセンターから入手した蛋白の非冗長性（重複のない）（ＮＲ）データベースを用いる、Finnigan Bioworksデータ分析パッケージ（ThermoQuest，San Jose，CA）に組み込まれたＳＥＱＵＥＳＴコンピュータープログラム（（Houthaeve T，１９９７））を用いて、ＭＳ／ＭＳデータの自動化分析を実施した。
【００９９】
（方法３：）
（ＭＮＡＲのクローニング：）ＭＮＡＲのＮ末端部分、中間部分、およびＣ末端部分をクローニングするために、オリゴヌクレオチドの３つの対を設計して用いた。オリゴ＃１：ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＴＧＡＧ（配列番号３）、およびオリゴ＃２：ＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＧＣ（配列番号４）を用いて、Ｎ末端部分をクローニングした。オリゴ＃３：ＧＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧ（配列番号５）、およびオリゴ＃４：ＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣ（配列番号６）を用いて中間部分をクローニングした。オリゴ＃５：ＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧ（配列番号７）、およびオリゴ＃６：ＧＣＴＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧ（配列番号８）を用いて、Ｃ末端部分をクローニングした。１×１０７個のＭＣＦ７細胞を、プロトコールに従って、総ＲＮＡ単離のために、Trizol（Life Technologies，Rockville，MD）中で溶解した。ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen，Valencia，CA）を用いるＲＴ−ＰＣＲ反応物中で、４０ｎｇの総ＲＮＡ、および４００ｎＭのオリゴを用いて、ＭＮＡＲを増幅した。この増幅は、５０℃で３０分で開始し、続いて９５℃で１５分、次いで９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒、および７２℃での伸長７分の３０サイクルであった。個々の産物をｐＴ−Ａｄｖベクター（Invitrogen，Carlsbad，CA）中にクローニングして、配列決定した。制限酵素消化および連結によって、全長ＭＮＡＲを構築した。プロトコール（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）に従って、ヒトリンパ球マラソンｃＤＮＡライブラリーから、オリゴ＃１および＃６を用いることによって、ＭＮＡＲをまた、独立してクローニングした。ＭＣＦ−７からクローニングしたＭＮＡＲは、マラソンｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたＭＮＡＲに同一であった。さらなる配列情報を得るために、オリゴ＃７ＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧ（配列番号９）、およびマラソンｃＤＮＡキット（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）由来のアダプタープライマー１オリゴを用いて５’ＲＡＣＥを実施した。
【０１００】
（方法４：）
（ＭＮＡＲ発現の解析）ＨｅｐＧ２細胞、ＳａＯＳ２細胞、ＨＯＢｓ０２／０２細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＭＤＡ２３１細胞、イシカワ細胞、Ｉ−１０細胞、ＬＮＣａＰＬＮ３細胞、ＬＮＣａＰＦＧＣ細胞、ＪＣＡ細胞、ＴＳＵＰＲＬ細胞由来の総ＲＮＡ（１０μｇ）を、トリドール（Trizol）によって調製し、ゲル上で分離し、膜に転写して、クローニングされたＭＮＡＲのヌクレオチド３６７〜４００に相当する放射性標識したオリゴ＃７を用いてプローブした。ジンバンク（Genbank）配列に寄託されたヌクレオチド１４８０〜１５０９に対応する別のオリゴプローブ＃８：ＣＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＡＡＧＡＧＴ（配列番号１０）を用いて、別のノーザンにおいてＭＣＦ−７ ＲＮＡをプローブした。
【０１０１】
第二のＭＮＡＲ発現解析を実施した。ＭＮＡＲのヌクレオチド３６７〜３９３に相当する放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブを、Perfect Hybridization緩衝液（Sigma−Aldrich，St．Louis，MO）に含有されるヒト複数組織ノーザンブロットＩＩ（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）に対して、４２℃でハイブリダイズさせた。そのブロットを０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で４２℃で３回洗浄して、フィルムに曝露した。コントロールとして、β−アクチンプローブを用いた。
【０１０２】
（方法５：）
（一過性トランスフェクション解析：）１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、ＨｅｐＧ２細胞、およびＣＯＳ−７細胞を、慣用的に維持した。フェノールレッドを含有せず、１０％チャコール剥離血清を補充したＤＭＥＭ中で９６ウェルプレートに、１ウェルあたり５０，０００個のＨｅｐＧ２細胞、または１ウェルあたり３０，０００個のＣＯＳ−７細胞を播種した。プロトコールに従って、０．５μｌのリポフェクタミン２０００（Life Technologies，Rockville，MD）を用いて、１００ｎｇの２×ＥＲＥ−ｔｋ−ｌｕｃレポーター、１０ｎｇのｐＣＭＶ−β−ｇａｌ内部コントロール、１ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１ ＥＲα発現ベクター、または５ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１ＥＲβ発現ベクターのいずれかを、漸増する量のｐｃＤＮＡ３．１ＭＮＡＲ、またはｐｃＤＮＡ３．１ＳＲＣ３発現プラスミドの有無において、トランスフェクトした。１０−８Ｍ １７ｂ−エストラジオール、タモキシフェン、またはＩＣＩのいずれかを用いて細胞を２４時間刺激し、その後ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ活性について処理した。
【０１０３】
（方法６：）
（ＭＮＡＲ−ＥＲ相互作用の解析：）
ＭＮＡＲ−核内受容体相互作用解析を実施した。全長フラッグ−ＭＮＡＲを過剰発現するＳＦ９細胞抽出物を、インビトロにおいて、転写され／翻訳された［３５Ｓ］標識全長ＥＲα（図５Ａ）、ＥＲβ（図５Ｂ）、アンドロゲン（ＡＲ）（図５Ｃ）、および糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）（図５Ｄ）とともに、それらの対応するリガンド（全て１μＭで）の有無において、インキュベートした。抗ＦＬＡＧセファロースビーズを用いて、形成された複合体を単離し、２×ＳＤＳ緩衝液中で煮沸して、ＳＤＳゲルにロードした。そのゲルを乾燥して、オートラジオグラフィーに供した。
【０１０４】
（方法７：）
（ＥＲ−ＭＮＡＲ−ｃＳｒｃの相互作用の解析）１μＭ Ｅ２の存在下（図６Ａ、レーン３、５、７、および９）、または非存在下（図６Ａ、レーン２、４、６、および８）において、ＭＮＡＲの存在下（図６Ａ、レーン４、５、および８、９）、または非存在下（図６Ａ、レーン２、３、および６、７）において、インビトロで転写／翻訳されたＥＲαを、精製したｃＳｒｃ（図６Ａ、レーン２〜５）、またはＬｃｋ（図６Ａ，レーン６〜９）とともにインキュベートした。抗ｃＳｒｃ抗体または抗Ｌｃｋ抗体、およびプロテインＡアガロースを用いたプルダウンによって、形成された複合体を単離し、２×ＳＤＳ緩衝液中で煮沸して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ゲルを乾燥させて、オートラジオグラフィーに供した。
【０１０５】
（方法８：）
（ｃＳｒｃ酵素活性の解析）基質として酸性化したエノラーゼを用いて、ＥＲの非存在下（図８、レーン１および２）、または存在下（図８、レーン３〜６）、１７βエストラジオール（図８、レーン３および５）、およびＭＮＡＲ（図８、レーン２、５、および６）の存在下で、ｃＳｒｃチロシンキナーゼ活性を評価した。反応の前に、蛋白を４℃で１時間インキュベートした。［３２Ｐ］−γＡＴＰの添加によって、リン酸化反応を開始して、３０℃で１０分間継続した。２×ＳＤＳ緩衝液の添加によって、反応を停止した。リン酸化した蛋白を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、乾燥したゲルをオートラジオグラフィーに供した。
【０１０６】
（方法９：）
（ＥＲ媒介性転写に対するＭＮＡＲの効果）
Ａ−ＨｅｐＧ２細胞を、ＥＲα、ＭＮＡＲ，および／またはＳＲＣ３の発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。ルシフェラーゼ遺伝子発現（２×ＥＲＥ−ｔｋ−レポーターによって駆動された）を、Ｅ２、４（ＯＨ）−タモキシフェン、またはＩＣＩ １８２，７８０（全て１０ｎＭ）を用いて処理した細胞中で評価した。Ｂ−ＨｅｐＧ２細胞を、ＥＲα、およびＭＮＡＲの発現ベクターを用いてトランスフェクトした。ルシフェラーゼ遺伝子発現（２×ＥＲＥ−ｔｋ−レポーターによって駆動された）を、１０ｎＭのＥ２か、１０ｎＭのＥ２とそれに加えて１μＭのＰＰ２か、または１μＭのＰＤ９８０５９かを用いて処理した細胞中で評価した。Ｃ−ＭＣＦ−７細胞を、Sequitur，Inc．（Natick，MA）からの１００ｎＭのアンチセンス（ＡＳ）ＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＡ（配列番号１１）、または１μｇ／ｍｌのリポフェクタミン２０００を複合体化したリバースコントロール（Ｃ）オリゴマーを用いて、白色培地中でトランスフェクトした。２４時間後、細胞を１０ｎＭ Ｅ２を用いて刺激し、その２４時間後、細胞をグアニジウム緩衝液中で溶解して、溶解物から総ＲＮＡを単離した。ＭＮＡＲ、ｐＳ２、およびカテプシンＤを標的するために設計したプライマー／プローブのセットを用いてTaqMan解析を実施した。Ｄ−１００ｎＭのアンチセンス（ＡＳ）−１、またはリバースコントロール（Ｃ）−２オリゴマー（１０ｎＭのＥ２を用いて刺激した）を用いてトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞の抽出物を、ウサギポリクローナルＭＮＡＲ抗血清を用いるウエスタンブロット解析のために用いた。ＭＮＡＲのアミノ酸５０９〜５２０（ＳＨＲＫＧＤＳＮＡＮＳＤ）（配列番号３１）をコードする１１マーのペプチドに対して、ＭＮＡＲ抗血清を生成した。
【０１０７】
（方法１０：）
（ＭＮＡＲ、およびＥＲの相互作用、およびＳｒｃキナーゼ活性化）
ＭＮＡＲ、およびＥＲαは、Ｓｒｃと相互作用して、内因性蛋白のリン酸化反応を促進する。ＦＬＡＧ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いてトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞、またはＦＬＡＧ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いてトランスフェクトしていないＭＣＦ−７細胞を、Ｅ２（１０ｎＭ）を用いて処理しない（図１０、レーン１、および３）か、またはＥ２（１０ｎＭ）を用いて５分間処理した（レーン２、および４）。対応する抗体を用いて細胞抽出物から、フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ）、ｃＳｒｃ（パネルＢ）、またはＥＲα（パネルＣ、Ｄ、およびＥ）を、免疫沈降させた。免疫沈降物を［３２Ｐ］−γＡＴＰを用いて３０分間、３０℃（パネルＡ〜Ｃ）、または［３２Ｐ］−γＡＴＰおよびエノラーゼを用いて（パネルＤ）インキュベートした。２×ＳＤＳ緩衝液中での煮沸によってキナーゼ反応を停止した。リン酸化した材料をＳＤＳゲル上にロードして、次いで乾燥してオートラジオグラフィーに供した。フラッグ−ＭＮＡＲでトランスフェクトしていない、Ｅ２を用いて処理していない細胞（１）、およびＥ２を用いて処理した細胞（２）からＥＲαプルダウンによって得た材料を、ＭＮＡＲ−抗血清を用いてプローブした（パネルＥ）。
【０１０８】
（方法１１：）
（Ｅ２誘導性のＥｒｋキナーゼ１および２活性化に対してＭＮＡＲは影響する）
エストラジオールによるＳｒｃの活性化が、Ｒａｓ／Ｅｒｋ５キナーゼ経路を誘発することは以前に報告されている。本発明者らは、ＭＮＡＲ誘導性Ｓｒｃ活性化がＥｒｋキナーゼ１および２の活性化を導き得ると予想した。本発明者らは、ＭＣＦ７細胞、ＭＮＡＲを過剰発現する細胞、およびＭＮＡＲ発現がＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１１）を用いた処理によって実質的に減弱された細胞における、Ｅ２によるＥｒｋ活性化のレベルを評価した。リン酸化したＥｒｋ１および２を認識する抗体を用いて、Ｅｒｋ１および２のリン酸化のＥ２誘導性刺激を検出した。ＭＮＡＲ発現プラスミド（図１１、レーン１および２）、またはＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチド１００ｎＭ（図１１、レーン５および６）を用いてトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞の抽出物（図１１、レーン３、および４）；Ｅ２（１０ｎＭ）を用いて刺激していない（図１１、レーン１、３、および５）、または５分間刺激した（図１１、レーン２、４、および６）ＭＣＦ７細胞の抽出物を、ウエスタンブロット分析のために用いた。このウエスタンブロット分析には、リン酸化したＥｒｋ１および２に対する抗体（パネルＡ）；Ｅｒｋ１／２抗体（パネルＢ）；ＭＮＡＲ抗体（パネルＣ）を用いた。ＭＮＡＲ抗血清オリゴヌクレオチド（配列番号１１）は、Sequitur Inc．（Natick，MA）で開発された。
【０１０９】
（方法１２：）
（ＭＮＡＲの構造−機能解析）
ＭＮＡＲ配列解析によって、ＭＮＡＲ分子のＮ末端部分は、核ホルモンレポーターとの相互作用に重要であることが以前に見出された複数のＬＸＸＬＬモチーフを含むが、ＭＮＡＲはＣ末端では、プロリンおよびグルタミン酸の両方がリッチな領域を含むことが明らかになった。エストロゲン受容体およびｃ−Ｓｒｃチロシンキナーゼとの相互作用を担うＭＮＡＲの領域を描写するため、本発明者らは、ＭＮＡＲ欠失変異体の機能的評価を実施した（図１２）。適切なフラグメントを増幅すること、およびそれらを適切な発現ベクター中にクローニングすることによって、特別に設計したオリゴヌクレオチドを用いて、ＭＮＡＲの一連のＣ末端短縮を生成した。ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされた場合、これらの変異体が、ＥＲ刺激された転写物を増強する能力について、これらの変異体を試験した。
【０１１０】
（方法１３：）
（キナーゼ活性に影響する化合物についてのスクリーニング）
以下のとおり化合物をスクリーニングする。用いた反応緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ Ｎａ３ＶＯ４である。基質ペプチドを得て、６ｍｇを１．７ｍＬのＲＢ中に溶解し、−２０℃で保存する。用いられるＡＴＰは、最終濃度４００μＭである。インヒビターは、例えば、ピセアタノール−３ｍＭ（４℃で保存し、かつ遮光する）を用いるべきである。
【０１１１】
まず、ＥＲを、Ｅ２とともにインキュベーションする。例えば、１０μｌの市販のＥＲ（Panvera）を、４０μｌのＲＢおよび０．５μｌのＥ２（１０−６Ｍ）とともにインキュベートする。その混合物を室温で１時間インキュベートする。
【０１１２】
次に、その混合物をＭＮＡＲ、Ｅ２、およびＥＲの有無の状態に置く。その溶液を室温で３０分間インキュベートする。
【０１１３】
各々のチューブに、１０μｌのＡＴＰ（最終濃度４００μＭ）を、１０μｌの基質ペプチドとともに添加する。これを３０℃で６０分間インキュベートする。
【０１１４】
１０μｌの３ｍＭ ピセアタノールを添加して反応を停止する。ここで、この溶液を室温で５分間インキュベートする。
【０１１５】
希釈およびペプチドの固定を実施する。１０μｌの反応液を２０ｍｌのＨ２Ｏで希釈する。２００μｌの希釈液をNeutrAvidin Plateのウェルに添加する。
【０１１６】
２００μｌのＰＢＳを添加することによって洗浄（各々３分間、５回）を実施する。その後に抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体を添加する。その抗体をＰＢＳおよびＢＳＡ中で希釈して、溶液をカバーして、３７℃で１時間インキュベートさせる。その混合物を上記と同様に洗浄する。
【０１１７】
次に、ＨＲＰプロトコールを用いて、１００μｌのPierce基質を添加すること、およびVictorで読み取ることによって基質反応を行う。
【実施例１】
【０１１８】
（ＭＮＡＲの単離および同定、ＭＮＡＲをコードするｃＤＮＡのクローニング）
ＥＲリガンドの組織選択性作用をさらによく理解するために、本発明者らは、異なる細胞株においてＥＲ相互作用蛋白の発現および活性を評価するためのプロテオミクスアプローチを確立した。本発明者らは、ＧＳＴプルダウンアプローチを用いてＭＮＡＲを同定した。ＧＳＴ−ＥＲβリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を、ＭＣＦ−７細胞抽出物とともにインキュベートした。図２Ａは、プルダウン実験によって得られた画分の銀染色を示す。ＧＳＴ−ＥＲβ−Ｅ２と特異的に相互作用するが、ＧＳＴ−ＥＲβ、またはＧＳＴ単独とは相互作用しない多数の蛋白を検出した。
【０１１９】
対応するバンドを切り出して、トリプシンで消化し、濃縮して、マイクロエレクトロスプレーＨＰＬＣシステムによって分離した。Finnigan LCQ−ＤＥＣＡイオントラップ質量分析計（ThermoQuest，San Jose，CA）上でペプチド分析を行った。ＮＣＢＩゲノムセンターから入手した蛋白の非冗長性（重複のない）データベースを用い、Finnigan Bioworksデータ解析パッケージ（ThermoQuest，San Jose，CA）中に組み込まれたＳＥＱＵＥＳＴコンピューターアルゴリズム（［Houthaeve T，１９９７］）を用いて、質量分析データの自動解析を実施した。
【０１２０】
図２Ａは、上記で方法１において概説されたような実験工程から得られる、銀染色されたゲルを示す。細胞抽出物をグルタチオンビーズ−１、リガンドの非存在下−２、または両方とも１０−７ＭのＥ２の存在下−３、または４（ＯＨ）タモキシフェンの存在下−４において、細菌で発現されたＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤ融合蛋白とともにインキュベートした。抗ＧＳＴアガロースを用いてＥＲ相互作用蛋白を単離して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。対応するバンドを含有するゲル領域を切り出して、トリプシン消化に供した。
【０１２１】
リガンド依存性相互作用を表す蛋白に相当するバンドを切り出して、トリプシンで消化して、質量分析に基づくペプチドのマイクロシーケンシングを用いて同定した。公知であり十分特徴付けられた活性化補助因子（例えば、ＳＲＣ３、およびＤＲＩＰ２０５）と一緒に、本発明者らは、ＥＲと相互作用することが以前に示された蛋白を同定した。この蛋白は、Ｅ２の存在下でＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤと相互作用し、かつ約１２０ｋＤａの見かけの分子量を有した（図２Ａ）。
【０１２２】
ペプチド配列解析によって、この蛋白が、ｐ５６lck（Ｌｃｋ）のＳｒｃ相同性ドメイン２（ＳＨ２）を用いたプルダウンによって以前に単離された、プロリンおよびグルタミン酸リッチな蛋白であるｐ１６０（Genbank U８８１５３）に関連し得ることが明らかになった（２１）。図２Ｂは、質量分析、およびＭＮＡＲ分子におけるペプチドの位置によって同定されたペプチドの配列を示す。
【０１２３】
ＮＣＩデータベースを検索することによって、本発明者らはまた、この蛋白にマッチしたいくつかのＥＳＴを同定した。それらの１つであるＡＬ０３９３９は、Ｎ末端でマッチし、そして５’配列をさらに１００ｂｐ伸長した。整列された配列を用いて、ＭＣＦ−７細胞からこの蛋白をクローニングするためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した（２２）。
【０１２４】
しかし、クローニングされた蛋白の配列（図１を参照のこと）は、ｐ１６０（Genbank U８８１５３）とは実質的に異なった。２つの配列の間を識別するため、そしてｐ１６０とも呼ばれる核内受容体活性化補助因子のファミリー（（Voegelら、１９９８）、（Hongら、１９９７）、（Anzickら、１９９７）、［Suen，１９９８］）との混同を避けるため、本発明者らがＭＣＦ７細胞からクローニングしたこの蛋白を、本発明者らは、ＭＮＡＲと命名した。
【０１２５】
ＭＮＡＲおよびｐ１６０の配列アラインメント（図１Ａ）によって、ＭＮＡＲが、ｐ１６０（Genbank U８８１５３）に存在するヌクレオチドの１０７５〜１５１０、および３１２５〜３１５１を含まないことが示された。さらに、ｐ１６０配列と比べて、１０個の単一塩基対のギャップ、および１個の二重塩基対のギャップが存在した。
【０１２６】
ＭＮＡＲはまた、ヒトリンパ球マラソンｃＤＮＡライブラリー（Invitrogen）から独立してクローニングされた。重要なことに、ＭＣＦ−７細胞からクローニングされたＭＮＡＲは、マラソンｃＤＮＡライブラリーを用いてクローニングされたＭＮＡＲと同一であった。さらなる配列情報を得るために、本発明者らは、マラソンｃＤＮＡキット（Clontech）由来のプライマーを用いて５’ＲＡＣＥを実施した。５’ＲＡＣＥを用いて、ＭＮＡＲの推定開始コドンの５’側の３つのリーディングフレームの全てにおいて、終止コドンを見出した。ＭＮＡＲクローンの概念上の翻訳によって、計算上の分子量が１１９．６ｋＤａである１１３０個のアミノ酸の蛋白を生じた。このクローンは、質量分析の解析によって最初に同定されたペプチド配列を全て含んだ（図２Ｂ）。
【０１２７】
配列の解析によって、ＭＮＡＲ分子のＮ末端部分に局在する複数のＬＸＸＬＬモチーフが明らかになった。本発明者らは、それを、仮定的に、核内受容体相互作用ドメイン（ＮＲＩＤ）と呼ぶ。他の転写因子における類似のモチーフは、核ホルモン受容体のリガンド結合ドメインの表面上の疎水性グルーブと相互作用することが示されている（Heeryら、１９９７）、（Torchiaら、１９９７）（２３）。ＭＮＡＲ分子の興味深い特徴は、ＭＮＡＲ分子のＣ末端部分に局在する、伸長したプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）、およびグルタミン酸リッチドメイン（ＥＲＤ）である。これらのドメインに対する相同性は、ＮＣＩデータベースにおいては見出されなかった。
【実施例２】
【０１２８】
（ＭＮＡＲ発現の解析）ＨｅｐＧ２、ＳａＯＳ２、ＨＯＢｓ０２／０２、ＣＯＳ−７、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ２３１、イシカワ、Ｉ−１０、ＬＮＣａＰＬＮ３、ＬＮＣａＰＦＧＣ、ＪＣＡ、ＴＳＵＰＲＬの各細胞株におけるＭＮＡＲ発現を、ノーザンブロット解析を用いて評価した。この目的のために、本発明者らは、ＭＮＡＲの配列と、寄託されたｐ１６０（GenbankU８８１５３）の配列との間に共通する、ＭＮＡＲのＮ末端部分由来のオリゴペプチドを用いた。ほとんど全ての細胞株において、ＭＮＡＲ ｍＲＮＡの発現を、４ｋｂのバンドの存在によって評価されるとおり、検出した（図３）。ＭＮＡＲ発現のレベルは、異なる細胞株の中で有意に異なった。ＭＮＡＲ発現は、肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、および前立腺細胞（ＬＮＣａＰＬＮ３、ＬＮＣａＰＦＧＣ、ＪＣＡ、ＴＳＵＰＲＬ）中で高く、そしてＥＲを発現しない乳房腫瘍細胞（Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ２３１）においては低度〜検出不能であった（図３）。ｐ１６０が、ＭＣＦ−７細胞中で発現されるか否かを評価するために、本発明者らは、ＭＮＡＲ配列を欠いており、Genbankに対して寄託されたｐ１６０配列のヌクレオチド１４８０〜１５０９によってコードされる、ｐ１６０の領域に対するオリゴ−プローブを用いたノーザンブロット解析を用いた。このプローブを用いて、本発明者らは、どのようなメッセージも検出できなかった（データ示さず）。この結果によって、ＭＣＦ−７細胞中で発現したこの蛋白のほとんどの型は、ＭＮＡＲと十分にマッチするが、ｐ１６０をコードするｍＲＮＡは、発現されないか、非常に低いレベルで発現されることが示される。
【０１２９】
異なる組織におけるＭＮＡＲ分布を、ノーザンブロットによって解析した。ここでも、本発明者らは、ＭＮＡＲと寄託されたｐ１６０配列（GenbankU８８１５３）との間で共通である、ＭＮＡＲのＮ末端部分由来のオリゴプローブを用いた。またここでも、ＭＮＡＲ ｍＲＮＡの発現は、４ｋｂのバンドの存在による評価として（図４）、ほとんど全ての組織において検出された（図４）。ＭＮＡＲ発現のレベルは、異なる組織の間では変動すると考えられる。
【実施例３】
【０１３０】
（ＭＮＡＲは、エストロゲン受容体と特異的に相互作用する）
全長フラッグ−ＭＮＡＲを用いて、本発明者らは、ＭＮＡＲとエストロゲン受容体との相互作用が、ＥＲリガンドによって影響されるか否かをさらに評価した。バキュロウイルス発現系を用いて、ＳＦ９細胞において過剰発現された全長フラッグ−ＭＮＡＲを、インビトロで転写／翻訳された、リガンドが結合していない全長のＥＲαおよびβ、またはＥ２もしくは４−ＯＨタモキシフェンとリガンド結合した受容体、を用いるプルダウン実験において用いた。形成された複合体を、抗フラッグセファロースビーズを用いて単離した。
【０１３１】
図５Ａ、および５Ｂによって、ＥＲαおよびβが、ＭＮＡＲと相互作用すること、ならびにこの相互作用は、Ｅ２によって増強されて、４（ＯＨ）タモキシフェンによって阻害されることが明らかになった。本発明者らは、また、他のいくつかの核ホルモン受容体とのＭＮＡＲの相互作用を評価した。全長フラッグ−ＭＮＡＲを、転写／翻訳されたアンドロゲン（ＡＲ）、および糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）とともに、それらの対応するホルモンの有無において、インキュベートした。このデータによって、ＡＲおよびＧＲのリガンドは、ＭＮＡＲと独立して相互作用することが示された（図５Ｂ、および５Ｃ）。この相互作用は、これらの受容体リガンドの非ゲノム活性を説明し得る。これらおよび他の核ホルモン受容体のＭＮＡＲとのクロストーク、ならびにＳｒｃリン酸化カスケードの詳細な検討は、将来の検討のための重要な課題である。
【実施例４】
【０１３２】
（ＭＮＡＲのｃ−ＳｒｃおよびＬｃｋとの相互作用は、Ｅ２リガンド結合エストロゲン受容体によって増強される）ＭＮＡＲに対して相同な蛋白であるｐ１６０が、ｐ５６lck（Ｌｃｋ）のＳＨ２ドメインを用いたプルダウンを介して最初に同定されたことを考慮して、本発明者らは、次に、ＭＮＡＲが、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼのメンバーと相互作用し、ＥＲとのそれらの相互作用に影響するか否かを検討した。
【０１３３】
この疑問に取り組むため、本発明者らは、インビトロで転写／翻訳されたエストロゲン受容体であるＥＲα、ＥＲβ、およびＭＮＡＲを用いた。１７βエストラジオール（Ｅ２）の存在の有無において、ＥＲを、単独でかまたはＭＮＡＲと一緒に、市販の部分的に生成されたｃＳｒｃまたはＬｃｋ（Upstate Biotechnology）とともにインキュベートした。形成された複合体を、抗c−Ｓｒｃ、または抗Ｌｃｋ抗体、およびプロテインＡセファロースを用いてプルダウンし、次いでＳＤＳゲル上で分離した。
【０１３４】
このデータは、ＥＲαが、ｃＳｒｃおよびＬｃｋと相互作用することを示す（図６Ａ、レーン２、および３、６および７）。驚くべきことに、この相互作用は、Ｅ２によって阻害された。ＥＲαを、ＭＮＡＲおよびｃＳｒｃの両方（図６Ａ、レーン４、および５）、またはＬｃｋ（図６Ａ、レーン８、および９）とともにインキュベートした場合、リガンド結合していないＥＲα（図６Ａ、レーン４、および８）と比べて、Ｅ２の存在下において（図６Ａ、レーン５、および９）、Ｓｒｃ−ＥＲ−ＭＮＡＲ複合体形成の有意な刺激が検出された。ＭＮＡＲ自体は、ｃＳｒｃまたはＬｃｋと十分相互作用せず（図６Ａ、レーン１１）、ＥＲとのｃＳｒｃおよび／またはＬｃｋの相互作用は、Ｅ２によって阻害される（図６Ａ、レーン３）ので、本発明者らは、全ての３つの蛋白が、Ｅ２の存在下で強力に相互作用すること、およびＭＮＡＲが、ＥＲ−Ｓｒｃ相互作用に対して重要であることを結論する。ＥＲβについても同一のデータが得られた（図６Ｂ）。
【０１３５】
Auricchioおよび共同研究者による以前の研究によって、ＥＲがＳｒｃのＳＨ２ドメインに直接結合すること、およびこの結合は、Ｅ２によって増強されることが示唆された。本発明者らのデータと、彼らのデータとの間の明白な不一致について可能性のある説明は、ＥＲ−Ｓｒｃ相互作用を評価するために、彼らが細胞抽出物からのＳｒｃプルダウンを用いたという事実に依存するかもしれない。ＭＮＡＲは、これらの抽出物に存在する可能性が最も高く、ＥＲ−Ｓｒｃ複合体形成を媒介した。
【０１３６】
基礎的な条件下では、Ｓｒｃの触媒性ドメインは、分子内相互作用を通じて不活性状態に強制される。Ｃ末端リン酸化チロシンに対するＳＨ２ドメインの結合、およびＳｒｃリンカー中のプロリンリッチ領域に対するＳＨ３ドメインの結合によって、この分子は阻害された高次構造にロックされる（図７）。完全な触媒性活性には、これらの拘束の解放が必要である。
【０１３７】
Ｓｒｃのキナーゼ活性は、ＳＨ２ドメインに対するホスホチロシン含有配列の結合、およびＳＨ３ドメインに対するプロリンリッチ配列の結合によって増強され得る。ＭＮＡＲが、伸長したプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）を含むこと、およびＥＲのリガンド結合ドメインが、リン酸化され得るチロシン残基を含むことを考慮して、本発明者らは、これらの相互作用がＳｒｃ活性化をもたらし得ると仮定した（図７を参照のこと）。
【実施例５】
【０１３８】
（ＭＮＡＲは、ＥＲ駆動トランス活性化を刺激する）ＥＧＦに対する応答におけるｃＳｒｃの活性化は、ＥＲリン酸化を促進すること、およびＭＡＰキナーゼによって他の転写因子のリン酸化を促進すること（これによってＥＲ媒介性転写を刺激する）が、以前に示されている（［Kato，１９９６］；［Bunone，１９９６］）。ＭＮＡＲが、ＥＲの転写活性に影響するか否かを評価するため、ＥＲα（図６Ａ），またはＥＲβ（図６Ｂ）、およびＭＮＡＲを用いてＣＯＳ７細胞を同時トランスフェクトした。２×ＥＲＥ−ｔｋ−レポーターによって駆動されたルシフェラーゼ遺伝子発現を、１７βエストラジオールで処理された細胞、および処理されていない細胞において評価した。本発明者らのデータによって、ＭＮＡＲ発現の増大は、ＥＲαおよびＥＲβの転写活性の刺激に相関することが示される（図６Ａ、および６Ｂ）。次に、本発明者らは、ｃＳｒｃインヒビターが、ＭＮＡＲ促進ＥＲ活性化に影響するか否かを評価した。ＥＲα、およびＭＮＡＲを用いてトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞（図８）を、１７βエストラジオール単独か、１７βエストラジオールおよびＳｒｃの選択性インヒビターであるＰＰ２（Calbiochem）か、またはゲニステインを用いて２４時間処理した。以前の実験（図８）においてと同様に、ＭＮＡＲは、Ｅ２誘導性ＥＲα活性化を刺激した。同時に、ＳｒｃインヒビターであるＰＰ２およびゲニステインは、ＭＮＡＲ刺激を阻害した（図８）。これらのデータによって、ＥＲ活性のＭＮＡＲ誘導性刺激は、リン酸化カスケードの活性化とリンクしていることが示される。
【実施例６】
【０１３９】
（ＭＮＡＲ過剰発現は、ＥＲの転写活性に影響する）
ＭＮＡＲ過剰発現がＥＲの転写活性に影響するか否かを評価するため、ＥＲαおよびＭＮＡＲの発現のためのプラスミドを用いて、ＨｅｐＧ２細胞を一過性に同時トランスフェクトした。２×ＥＲＥ−ｔｋレポーターによって制御したルシフェラーゼ遺伝子発現を、Ｅ２、４（ＯＨ）−タモキシフェン、またはＩＣＩ １８２，７８０（全て１０ｎＭ）で処理した細胞中で評価した。
【０１４０】
この結果（図９Ａ）によって、ＭＮＡＲ発現が増大することは、ＥＲα転写活性の刺激と十分に相関することが示される。ＥＲ転写活性の同様の刺激が、ＥＲ活性化補助因子ＳＲＣ３の過剰発現によって観察された。本発明者らのデータによってまた、４（ＯＨ）−タモキシフェン、およびＩＣＩ １８２，７８０は、ＥＲ活性のＮＭＡＲ刺激を支持しないことが示される。ＥＲβを用いて同様の結果が観察された（データ示さず）。
【０１４１】
ｃＳｒｃ活性化が、ＥＲ活性のＭＮＡＲ刺激の原因である否かを検討するため、ＥＲα、ＭＮＡＲ、および２×ＥＲＥ−ｔｋ−レポーターのプラスミドを用いてトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞（図９Ｂ）を、Ｅ２単独を用いるか、またはＥ２と、ｃＳｒｃインヒビターであるＰＰ２、もしくはＭＥＫキナーゼインヒビターであるＰＤ９８０５９のいずれかを用いて処理した。本発明者らは、ＰＰ２およびＰＤ９８０５９が両方ともＥＲ活性のＭＮＡＲ刺激を抑止することを見出した。これらの結果によって、ＥＲ転写活性のＭＮＡＲ促進性刺激は、ＭＡＰキナーゼリン酸化カスケードの活性化にリンクしていることが示される。本発明者らは、以前に記載されたように、ＳｒｃおよびＭＥＫキナーゼの下流の、ＥｒｋによるＥＲリン酸化が、ＥＲ転写活性の増強の原因であり得ると仮定する。さらに、Ｓｒｃ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化が、ＥＲ転写活性に重要である、いくつかの他の転写因子のリン酸化をもたらすことは、あり得る。重要なことに、これらのデータによってまた、リン酸化カスケードの活性化を通じた核ホルモン受容体のいわゆる「非ゲノム」作用が、転写因子の活性を調節し得、それによって最終的に遺伝子発現に影響し得ることが示唆される。本発明者らは、この機構が、ＭＮＡＲと相互作用し得る核内受容体と、リン酸化によって活性が調節される他の転写因子との間のクロストークを設け得ると推測する。
【実施例７】
【０１４２】
（ＭＮＡＲは、ＥＲ媒介性遺伝子発現に影響する）
本発明者らは、次にアンチセンスアプローチを用いて、遺伝子転写のエストロゲン調節におけるＭＮＡＲの役割を評価した。TaqMan（図９Ｃ）、およびウエスタンブロット（図９Ｄ）解析によって評価されるように、ＭＣＦ−７細胞におけるＭＮＡＲ発現を有意に阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１１）が、開発された（Sequitur Inc．，Natick，MA）。ＭＣＦ−７細胞を１００ｎＭのアンチセンスまたはリバースコントロールオリゴマーを用いてトランスフェクトした。２４時間後、１０ｎＭのＥ２を用いて細胞を刺激して、その２４時間後、細胞を溶解して総ＲＮＡを単離した。ＭＮＡＲ、ｐＳ２、およびカテプシンＤを標的するために設計されたプライマー／プローブセットを用いて、TaqMan解析を実施した（２つの遺伝子は、ＭＣＦ−７細胞においてエストロゲンによって調節されることが公知）。図９Ｃは、ＭＮＡＲ、ｐＳ２、およびカテプシンＤのｍＲＮＡ発現のレベル（ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対して正規化した）を示す。興味深いことに、ＭＮＰＡ ｍＲＮＡの発現は、Ｅ２処理によって実質的に刺激された。本発明者らのデータによって、ＭＮＡＲ発現の減少は、Ｅ２刺激性のｐＳ２およびカテプシンＤの発現の劇的な低下をもたらすことが示される。重要なことに、ＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらの遺伝子発現の基本的なレベルに有意に影響しない。本発明者らは、ＥＲリン酸化がおそらくｐＳ２およびカテプシンＤのＥ２媒介性発現に重要であると予想する。これらのデータによって、ＭＮＡＲは遺伝子発現のＥＲ調節に必須であるという、本発明者らの見解が支持される。
【実施例８】
【０１４３】
（ＭＣＦ−７細胞における、ＭＮＡＲおよびＥＲの相互作用、ならびにＳｒｃキナーゼ活性化）
本発明者らは、ＭＮＡＲおよびＥＲがＭＣＦ−７細胞において相互作用して、Ｓｒｃキナーゼを活性化するか否かを評価した。フラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞を、１０ｎＭのＥ２を用いて５分間、処理した。フラッグ−ＭＮＡＲ（図１０、パネルＡ）、ＥＲα（図１０、パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（図１０、パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。Ｅｒα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（図１０、パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が明確に検出された。フラッグ−ＭＮＡＲを用いてトランスフェクトされていないＭＣＦ７細胞がこの実験に用いられたことを考慮すれば、このデータによって、内因性ＭＮＡＲおよびＥＲαが、ＭＣＦ７細胞において相互作用することが確認される。免疫沈降物を［３２Ｐ］−γＡＴＰとともに３０℃で３０分間インキュベートした。２×ＳＤＳ緩衝液中での煮沸によって反応を停止して、ＳＤＳ ＰＡＡＧ上で分離した。いくつかの内因性蛋白の強力なＭＮＡＲ依存性およびＥ２依存性のリン酸化が検出された。ｃＳｒｃ、ＥＲ，およびＭＮＡＲと同時沈降した、約３４ｋＤａの見かけの分子量を有する内因性蛋白のリン酸化が特に明白であった（図１０を参照のこと）。
【０１４４】
重要なことに、ＭＮＡＲでトランスフェクトされていない細胞から抗Ｓｒｃ抗体および抗ＥＲ抗体を用いて同時沈降した物質中で、この蛋白のリン酸化が検出された（図１０、レーン１および２）。このリン酸化は、Ｅ２の存在下（図１０、レーン２）で刺激され、次いでＭＮＡＲでトランスフェクトされた細胞中で劇的に増強された（図１０、レーン３および４）。これらのデータによって、ＭＮＡＲ、ＥＲ、およびｃＳｒｃがＭＣＦ−７細胞中で相互作用し、そしてＭＮＡＲ−ＥＲ複合体が、ｃＳｒｃキナーゼ活性を強力に刺激する（これがＭＣＦ−７細胞中においていくつかの内因性蛋白のリン酸化を促進する）という本発明者らの見解が強力に支持される。エノラーゼをＳｒｃ基質として用いた場合、同一のリン酸化パターンが検出された（図１０、パネルＤ）。
【実施例９】
【０１４５】
（ＭＮＡＲは、Ｅ２誘導性Ｅｒｋキナーゼ１および２活性化に影響する）
本発明者らは、次に、ＭＣＦ７細胞（図１１、レーン３および４）、ＭＮＡＲを過剰発現する細胞（図１１、レーン１および２）、およびＭＮＡＲ発現がＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理によって実質的に減弱された細胞（図１１、レーン５および６）において、Ｅ２によるＥｒｋ活性化のレベルを評価した。リン酸化したＥｒｋ１および２を認識する抗体を用いて、Ｅｒｋ１および２のリン酸化の強力なＥ２誘導性刺激を明確に検出した（図１１、パネルＡ）。この活性化は有意に、ＭＮＡＲを過剰発現する細胞（図１１、パネルＡ，レーン１および２）において増強されて、ＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理された細胞（図１１、パネルＡ，レーン５および６）において減弱された。ＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理でも、Ｅ２を用いた短時間処理でも、Ｅｒｋ１および２の総レベルには影響しなかった（図１１、パネルＢ）。ウエスタンブロット解析によって、ＭＮＡＲレベルが、ＭＮＡＲ発現プラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞において強力に増大されること（図１１、パネルＣ、レーン１および２）、そしてＭＮＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチド（図１１、レーン５および６）を用いて処理された細胞において減少されること（図１１、パネルＣ、レーン５、および６）が示された。これらのデータによって、ＭＮＡＲは、ｃＳｒｃおよびＥｒｋ１および２キナーゼのＥ２誘導性刺激を制御することが示される。
【実施例１０】
【０１４６】
（ＭＮＡＲの構造−機能の組織化）
ＭＮＡＲ配列解析によって、ＭＮＡＲ分子のＮ末端部分は、核ホルモンレポーターとの相互作用に重要であることが見出された複数のＬＸＸＬＬモチーフを含むことが明らかになった。ＭＮＡＲはＣ末端では、プロリンおよびグルタミン酸の両方がリッチな領域を含む。エストロゲン受容体およびc−Ｓｒｃチロシンキナーゼとの相互作用を担うＭＮＡＲの領域を描写するため、ＭＮＡＲ欠失変異体の機能的評価を実施した（図１２）。適切なフラグメントを増幅すること、およびそれらを適切な発現ベクター中にクローニングすることによって、特別に設計したオリゴヌクレオチドを用いて、ＭＮＡＲの一連のＣ末端短縮を生成した。ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされた場合、これらの変異体が、ＥＲ刺激された転写物を増強する能力について、これらの変異体を試験した。
【０１４７】
アミノ酸１〜４６９（変異体２、配列番号１４）、アミノ酸１〜２７８（変異体３、配列番号１５）、およびアミノ酸１〜１８９（変異体４、配列番号１６）を含むＭＮＡＲ変異体は依然として、ＥＲ転写活性を増強し得るが、ＭＮＡＲ分子のＣ末端部分（アミノ酸５５５〜１１３１（変異体９、配列番号１７）、アミノ酸５９５〜９６２（変異体１０、配列番号１８）、およびアミノ酸５９５〜８８７（変異体１１、配列番号１９））を含有する変異体は、不活性である。これらのデータによって、ＥＲ転写活性を刺激するのに必要かつ十分であるこのドメインが、アミノ酸１と１８９との間のＮＲＩＤのＮ末端部分に局在することが示唆される（図１３）。この領域は、ＬＸＸＬＬモチーフ：４番目（アミノ酸１５４〜１５９）（配列番号２０）、５番目（アミノ酸１７６〜１８１）（配列番号２１）、および６番目（アミノ酸１８１〜１８５）（配列番号２２）を含む（図１２）。これらのモチーフが、エストロゲン受容体との相互作用の原因であることを評価するため、本発明者らは、変異されたこれらの３つのＬＸＸＬＬモチーフを、個々にまたは組み合わせて有するＭＮＡＲの変異体を作成した。
【０１４８】
ＭＮＡＲは、ＬＸＸＬＬモチーフを利用してエストロゲン受容体と相互作用するが、ＭＮＡＲは、ＰＸＸＰモチーフを用いてＥｒｃと相互作用する。ＭＮＡＲは、Ｎ末端部分内にこれらのＰＸＸＰモチーフのうちの３つを含む。欠失分析によれば、最初の２つのＰＸＸＰモチーフを失っているＭＮＡＲの構築物は、トランスフェクションアッセイにおいてエストロゲン受容体活性を刺激できない（図１３）。このことは、これらの最初の２つのＰＸＸＰモチーフが、Ｓｒｃとの相互作用に十分であることを示唆する。これらのモチーフの変異によって、最初のＰＸＸＰモチーフ（アミノ酸５５〜５８）（ＰＸＸＰ変異体１、配列番号２３）は、ＥＲ転写活性を活性化するのに必要かつ十分であるが、第二のＰＸＸＰモチーフ（アミノ酸６４〜６７）（ＰＸＸＰ変異体２、配列番号３２）は、除去可能であることが明らかになった（図１４）。
【０１４９】
本研究において作成されたさらなる変異体は以下のとおりであった：アミノ酸１〜１２０を有する変異体５（配列番号２４）；アミノ酸１〜７９を有する変異体６（配列番号２５）；アミノ酸１〜４０を有する変異体７（配列番号２６）；アミノ酸１９０〜４６９を有する変異体８（配列番号２７）；アミノ酸８８８〜１１３１を有する変異体１２（配列番号２８）；アミノ酸８０〜５９４を有する変異体１３（配列番号２９）；アミノ酸８０〜５７４を有する変異体１４（配列番号３０）。これらの変異体の各々は、上記に列挙した他の変異体とともに、図１２に模式的に図示されており、ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトされた場合、ＥＲ刺激性転写を増強する能力について解析された（図１３）。
【０１５０】
結論として、本発明者らは、エストロゲン受容体αおよびβとＭＮＡＲとの相互作用が、Ｅ２によって増強されるが、４（ＯＨ）タモキシフェンによっては増強されないことを実証する。本発明者らはまた、ＭＮＡＲ−ＥＲ複合体が、Ｓｒｃ酵素活性を劇的に刺激するＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼであるｐ６０ｓｒｃ（Ｓｒｃ）およびｐ５６lck（Ｌｃｋ）と相互作用することを示す。本発明者らはまた、ＭＮＡＲが、Ｓｒｃリン酸化カスケードの活性化を通じて、ＥＲ転写活性に影響して、最終的にはＥＲ媒介性遺伝子発現に影響することを示す。詳細には、本発明者らは、Ｅ２を用いたＭＣＦ−７細胞の短時間処理が、ＭＮＡＲ−Ｓｒｃ−ＥＲ複合体形成、Ｓｒｃの活性化、およびいくつかの内因性蛋白のリン酸化をもたらすことを実証する。一過性にトランスフェクトされた細胞における増強されたＭＮＡＲ発現は、ＥＲ転写活性の刺激をもたらす。ＳｒｃおよびＭＥＫキナーゼの特定のインヒビターは、ＭＮＡＲがＥＲ転写活性を増強する能力をブロックするので、本発明者らは、ＥＲのこの活性化は、Ｓｒｃキナーゼの活性化によって促進されたＭＡＰキナーゼリン酸化カスケードの刺激に起因すると結論する。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる、ＭＣＦ−７細胞からのＭＮＡＲの欠失は、ＥＲ媒介性遺伝子発現を阻害し、このことは、ＭＮＡＲがＥＲ調節性遺伝子発現に関与することを支持する。これらのデータによって、ＭＮＡＲは、ＳｒｃファミリーチロシンキナーゼとのＥＲのクロストークを調節し、それによってエストロゲン受容体の非ゲノム活性を媒介することが明らかになる。
【０１５１】
これらの研究によって、核内受容体との相互作用におけるＭＮＡＲの重要性が実証される。ＭＮＡＲは、核内受容体の非ゲノム活性に対してゲノム活性を選択的に調節する化合物を開発する手段を提供する。
【０１５２】
本明細書において引用された全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が参考として援用されることが詳細にかつ個々に示されたかのように、本明細書において参考として援用される。前述の本発明は、理解を明確にするための例示および実施例によって詳細に記載されているが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の趣旨からも範囲からも逸脱することなくここでなされ得ることは、本発明の教示の観点から当業者には容易に明らかである。
【０１５３】
参考文献：
Anzick, S. L., Kononen, J., Walker, R. L., Azorsa, D. O., Tanner, M. M., Guan, X. Y., Sauter, G., Kallioniemi, O. P., Trent, J. M., and Meltzer, P. S. (1997). AIB1, a steroid receptor coactivator amplified in breast and ovarian cancer. Science 277, 965-8.
Aronica SM, W. L. Kraus, B. S. Katzenellenbogen, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 8517-21 (1994).
Bression, D., Michard, M., Le Dafniet, M., Pagesy, P., and Peillon, F. (1986). Evidence for a specific estradiol binding site on rat pituitary membranes. Endocrinology 119, 1048-51.
Bunone G., P. Briand, R. Miksicek, D. Picard, EMBO J. 15, 2174-2183 (1996).
【０１５４】
Cantley LC, et al., Cell 64, 281-302 (1991).
Castoria G., et al., EMBO J. 18, 2500-2510 (1999).
Chen, Z., Yuhanna, I. S., Galcheva-Gargova, Z., Karas, R. H., Mendelsohn, M. E., and Shaul, P. W. (1999). Estrogen receptor alpha mediates the nongenomic activation of endothelial nitric oxide synthase by estrogen. J Clin Invest 103, 401-6.
Cheng, H., Nishio, H., Hatase, O., Ralph, S., and Wang, J. (1992). A synthetic peptide derived from p34cdc2 is a specific and efficient substrate of src-family tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 267, 9248-9256.
【０１５５】
Collins, P., and Webb, C. (1999). Estrogen hits the surface. Nature Medicine 5, 1130 - 1131.
Cooper, J. A., and Howell, B. (1993). The when and how of Src regulation. Cell 73, 1051-4.
Devergne, O., Hummel, M., Koeppen, H., Le Beau, M., Nathanson, E., Kieff, E., and Birkenbach, M. (1996). A novel interleukin-12 p40-related protein induced by latent Epstein- Barr virus infection in B lymphocytes [published erratum appears in J Virol 1996 Apr;70(4):2678]. J. Virol. 70, 1143-1153.
Downward J, Current Biology 7, R258-60 (1997).
【０１５６】
Endoh, H., Sasaki, H., Maruyama, K., Takeyama, K., Waga, I., Shimizu, T., Kato, S., and Kawashima, H. (1997). Rapid activation of MAP kinase by estrogen in the bone cell line. Biochem Biophys Res Commun 235, 99-102.
Evans RM 1988 The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science 240:889-895
Feng W, et al., Mol Endocrinol 15, 32-45 (2001).
Filardo, EJ, J. A. Quinn, K. I. Bland, A. R. Frackelton, Jr., Mol Endocrinol 14, 1649-1660 (2000).
【０１５７】
Franz,Mueller, Haartong, Frey and Katus (1997). Transgenic animal models: new avenues in cardiovascular disease physiology. J. Mol. Med. 75(2):115-119.
Glass, CK 1994 Differential recognition of target genes by nuclear receptor monomers, dimers, and heterodimers. Endocrine Reviews 15:391-407.
Goetz, R. M., Thatte, H. S., Prabhakar, P., Cho, M. R., Michel, T., and Golan, D. E. (1999). Estradiol induces the calcium-dependent translocation of endothelial nitric oxide synthase. PNAS 96, 2788-2793.
Heery, D. M., Kalkhoven, E., Hoare, S., and Parker, M. G. (1997). A signature motif in transcriptional co-activators mediates binding to nuclear receptors [see comments]. Nature 387, 733-6.
【０１５８】
Hong, H., Kohli, K., Garabedian, M. J., and Stallcup, M. R. (1997). GRIP1, a transcriptional coactivator for the AF-2 transactivation domain of steroid, thyroid, retinoid, and vitamin D receptors. Molecular & Cellular Biology 17, 2735-44.
Houthaeve T, G. H., Ashman K, Nillson T, Mann M. (1997). J Protein Chem 16, 343-348.
Hubbard SR, M. Mohammadi, J. Schlessinger, Journal of Biological Chemistry 273, 11987-90 (1998).
Ishii, T., Yanagawa, T., Kawane, T., Yuki, K., Seita, J., Yoshida, H., and Bannai, S. (1996). Murine peritoneal macrophages induce a novel 60-kDa protein with structural similarity to a tyrosine kinase p56lck-associated protein in response to oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun 226, 456-60.
【０１５９】
Joung, I., Strominger, J. L., and Shin, J. (1996). Molecular cloning of a phosphotyrosine-independent ligand of the p56lck SH2 domain. PNAS 93, 5991-5995.
Kato S, et al., Science 270, 1491-4 (1995).
Katzenellenbogen JA, O'Malley BW, Katzenellenbogen BS 1996 Tripartite steroid hormone receptor pharmacology: interaction with multiple effector sites as a basis for the cell- and promoter-specific action of these hormone. Mol Endocrinol 10:119-131.
Kristen D. Brubaker, C. V. G. (1999). Estrogen stimulates protein tyrosine phosphorylation and Src kinase activity in avian osteoclasts. Journal of Cellular Biochemistry, Volume 76, Issue 2, 2000. P 76, 206-216.
【０１６０】
Mangelsdorf, D. J., Thummel, C., Beato, M., Herrlich, P., Schutz, G., Umesono, K., Blumberg, B., Kastner, P., Mark, M., Chambon, P., and et al. (1995). The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell 83, 835-9.
Marcus, S. L., Winrow, C. J., Capone, J. P., and Rachubinski, R. A. (1996). A p56lck Ligand Serves as a Coactivator of an Orphan Nuclear Hormone Receptor. J. Biol. Chem. 271, 27197-27200.
Marshall CJ, Curr Opin Cell Biol 8, 197-204 (1996).
Matsuda M, B. J. Mayer, Y. Fukui, H. Hanafusa, Science 248, 1537-9 (1990).
【０１６１】
McKenna, N. J., Lanz, R. B., and O'Malley, B. W. (1999). Nuclear receptor coregulators: cellular and molecular biology. Endocrine Reviews 20, 321-44.
Migliaccio, A., Castoria, G., Di Domenico, M., de Falco, A., Bilancio, A., Lombardi, M., Barone, M. V., Ametrano, D., Zannini, M. S., Abbondanza, C., and Auricchio, F. (2000). Steroid-induced androgen receptor-oestradiol receptor {beta}-Src complex triggers prostate cancer cell proliferation. EMBO J. 19, 5406-5417.
Migliaccio, A., Di Domenico, M., Castoria, G., de Falco, A., Bontempo, P., Nola, E., and Auricchio, F. (1996). Tyrosine kinase/p21ras/MAP-kinase pathway activation by estradiol- receptor complex in MCF-7 cells. EMBO J. 15, 1292-1300.
【０１６２】
Migliaccio, A., Pagano, M., and Auricchio, F. (1993). Immediate and transient stimulation of protein tyrosine phosphorylation by estradiol in MCF-7 cells. Oncogene 8, 2183-91.
Migliaccio, A., Piccolo, D., Castoria, G., Di Domenico, M., Bilancio, A., Lombardi, M., Gong, W., Beato, M., and Auricchio, F. (1998). Activation of the Src/p21ras/ERk pathway by progesterone receptor via cross-talk with estrogen receptor. EMBO J. 17, 2008-2018.
Oursler, M. J. (1998). Estrogen regulation of gene expression in osteoblasts and osteoclasts. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression 8, 125-40.
【０１６３】
Pappas, T. C., Gametchu, B., and Watson, C. S. (1995). Membrane estrogen receptors identified by multiple antibody labeling and impeded-ligand binding. FASEB Journal 9, 404-10.
Park, I., Chung, J., Walsh, C., Yun, Y., Strominger, J., and Shin, J. (1995). Phosphotyrosine-Independent Binding of a 62-kDa Protein to the src Homology 2 (SH2) Domain of p56lck and Its Regulation by Phosphorylation of Ser- 59 in the lck Unique N-Terminal Region. PNAS 92, 12338-12342.
Parker, M. G., and White, R. (1996). Nuclear receptors spring into action [news; comment]. Nature Structural Biology 3, 113-5.
【０１６４】
Pietras, R. J., and Szego, C. M. (1979). Metabolic and proliferative responses to estrogen by hepatocytes selected for plasma membrane binding-sites specific for estradiol-17beta. Journal of Cellular Physiology 98, 145-59.
Pietras, R. S., C (1975). Endometrial cell calcium and oestrogen action. Nature 253, 357-359.
Pietras, R. S. C. (1977). Specific binding sites for estrogen at the outer surfaces of isolated endometrial cells. Nature 265, 69-72.
Puls, A., Schmidt, S., Grawe, F., and Stabel, S. (1997). Interaction of protein kinase C zeta with ZIP, a novel protein kinase C-binding protein. PNAS 94, 6191-6196.
【０１６５】
Razandi M, A. Pedram, G. L. Greene, E. R. Levin, Molecular Endocrinology 13, 307-19 (1999).
Revelli A, M. Massobrio, J. Tesarik, Endocr Rev 19, 3-17 (1998).
Sambrook, Fritsch and Maniatis. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Press (Cold Spring Harbor, New York). 1989.
Simoncini T., H.-M. A., Brazil D.P., Ley K., Chin W. W.&, and J.K., L. (2000). Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of
phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature 407, 538-541.
【０１６６】
Singer, C. A., Figueroa-Masot, X. A., Batchelor, R. H., and Dorsa, D. M. (1999). The mitogen-activated protein kinase pathway mediates estrogen neuroprotection after glutamate toxicity in primary cortical neurons. J Neurosci 19, 2455-63.
Torchia, J., Rose, D. W., Inostroza, J., Kamei, Y., Westin, S., Glass, C. K., and Rosenfeld, M. G. (1997). The transcriptional co-activator p/CIP binds CBP and mediates nuclear-receptor function [see comments]. Nature 387, 677-84.
Thomas, SM, Brugge, JS Annual Review of Cell & Developmental Biology 13, 513-609 (1997).
【０１６７】
Tsai M-J, O'Malley BW 1994 Molecular mechanisms of action of steroid/thyroid receptor superfamily members. Annu Rev Biochem 63:451-486.
Voegel, J. J., Heine, M. J., Tini, M., Vivat, V., Chambon, P., and Gronemeyer, H. (1998). The coactivator TIF2 contains three nuclear receptor-binding motifs and mediates transactivation through CBP binding-dependent and -independent pathways. EMBO Journal 17, 507-19.
Weiss, A., and Littman, D. R. (1994). Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 76, 263-74.
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１Ａ】図１は、ＭＮＡＲ、およびｐ１６０のアミノ酸配列を比較するアラインメントである。
【図１Ｂ】図１は、ＭＮＡＲ、およびｐ１６０のアミノ酸配列を比較するアラインメントである。
【図１Ｃ】図１は、ＭＮＡＲ、およびｐ１６０のアミノ酸配列を比較するアラインメントである。
【図２Ａ】図２は、エストロゲン受容体βとＭＮＡＲとの相互作用を示す。パネルＡは、ＭＣＦ−７細胞抽出物からプルダウンしたＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤによって得られた銀染色したゲルを示す。
【図２Ｂ】図２は、エストロゲン受容体βとＭＮＡＲとの相互作用を示す。パネルＡは、ＭＣＦ−７細胞抽出物からプルダウンしたＧＳＴ−ＥＲβ−ＬＢＤによって得られた銀染色したゲルを示す。得られたペプチドは、逆相ＨＰＬＣカラムを用いて精製し、質量分析に基づくミクロシークエンシングによって同定した。これらのペプチドの配列を、パネルＢに提供する。
【図３】図３は、実施例２における実験からのノーザンブロットによって評価した、種々の細胞株におけるＭＮＡＲの発現解析の結果を示す。
【図４】図４（ＡおよびＢ）は、実施例２における実験由来のノーザンブロットによって評価した、種々の組織におけるＭＮＡＲ発現分析の結果を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、フラッグタグ付けＭＮＡＲと、ＥＲα、およびＥＲβ、またはＥ２とリガンド結合された受容体、または４−ＯＨタモキシフェンとの相互作用を示す。また、全長フラッグ−ＭＮＡＲと、転写／翻訳されたアンドロゲン（ＡＲ）および糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）（その対応するリガンドの有無における）との相互作用の結果も、示される（図５Ｃ、および５Ｄ）。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例４の実験の結果を示す。ここでは、試験を行って１７βエストラジオールの有無における、ＳｒｃまたはＬｃｋと、ＭＮＡＲ、および／またはＥＲαとのインビトロにおける相互作用を評価する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例４の実験の結果を示す。ここでは、試験を行って１７βエストラジオールの有無における、ＳｒｃまたはＬｃｋと、ＭＮＡＲ、および／またはＥＲβとのインビトロにおける相互作用を評価する。
【図７】図７は、ＥＲ−ＭＮＡＲ−Ｓｒｃ相互作用の提唱されたモデルの模式図である。
【図８】図８は、ｃＳｒｃ酵素活性におけるＥＲ−ＭＮＡＲc複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析である。基質として酸変性エノラーゼを用いて、ＥＲの非存在（レーン１および３）、またはＥＲ（レーン３〜６）、Ｅ２（レーン３および５）、およびＭＮＡＲ（レーン２、５、および６）の存在下において、ｃＳｒｃ酵素活性を評価した。図８に示すデータは、ＭＮＡＲ自体がｃＳｒｃ酵素活性を強力に刺激することを示す。
【図９Ａ】図９は、実施例７の実験からの結果を示す一連のグラフである。ここで試験を行って、ＭＮＡＲがＥＲ媒介転写に影響するか否かを評価する。図９Ａは、ＥＲα、ＭＮＡＲ、および／またはＳＲＣ３の結果を示す。
【図９Ｂ】図９は、実施例７の実験からの結果を示す一連のグラフである。ここで試験を行って、ＭＮＡＲがＥＲ媒介転写に影響するか否かを評価する。図９Ｂは、細胞をＥ２か、Ｅ２に加えてＰＰ２か、またはＥ２に加えてＰＤ９８０５９かを用いて処理した場合のＥＲα、およびＭＮＡＲについての結果を示す。
【図９Ｃ】図９は、実施例７の実験からの結果を示す一連のグラフである。ここで試験を行って、ＭＮＡＲがＥＲ媒介転写に影響するか否かを評価する。図９Ｃは、アンチセンス（ＡＳ）か、Ｅ２か、Ｅ２に加えてコントロールか、またはＥ２に加えてアンチセンスかで処理したＭＣＦ−７細胞の結果を示す。それぞれＭＮＡＲ，ｐＳ２，およびカテプシンＤを標的するようにプライマー／プローブセットを設計する。
【図９Ｄ】図９は、実施例７の実験からの結果を示す一連のグラフである。ここで試験を行って、ＭＮＡＲがＥＲ媒介転写に影響するか否かを評価する。図９Ｄは、アンチセンス、またはＥ２で刺激した逆コントロールオリゴマーでトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞の抽出物の、ウサギポリクローナルＭＮＡＲ抗血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１０Ｂ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１０Ｃ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１０Ｄ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１０Ｅ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１０Ｆ】図１０は、Ｅ２で処理されていないフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクター、およびＥ２で処理されたフラッグ−ＭＮＡＲ発現ベクターを用いて、トランスフェクトされていないＭＣＦ−７細胞、および／またはトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のＳＤＳゲル分析を示す。フラッグ−ＭＮＡＲ（パネルＡ），ＥＲα（パネルＣ、およびＤ）、およびｃＳｒｃ（パネルＢ）を、それらの対応する抗体を用いて、細胞抽出物から免疫沈降させた。ＥＲα抗血清を用いて沈殿させた材料を、ウサギポリクローナル抗体である、抗ＭＮＡＲ抗体を用いてプローブした（パネルＥ）。ＥＲα−ＭＮＡＲ相互作用のＥ２増強が、明確に検出された。
【図１１】図１１は、実施例９における実験由来のウエスタンブロットによって評価した、Ｅ２誘導性Ｅｒｋ活性化に対するＭＮＡＲの分析の結果を示す。
【図１２】ＭＮＡＲおよび１３ＭＮＡＲ変異体（変異体２〜１４）の構造−機能の組織化の模式図である。これらの変異体は、実施例１０の実験のもとで、ＨｅｐＧ２細胞中にトランスフェクトされたとき、生成されて、それらがＥＲ刺激転写を強化する能力について試験された。
【図１３】図１３は、ＭＮＡＲ欠失変異体（変異体２〜１４）の分析の結果を示す棒グラフである。これらの変異体は、実施例１０の実験においてｈｅｐＧ２細胞中にトランスフェクトされたとき、それらがＥＲ刺激転写を強化する能力について試験された。
【図１４】図１４は、ＰＸＸＰモチーフＭＮＡＲ変異体の分析の結果を示す棒グラフである。これらの変異体は、実施例１０の実験においてＨｅｐＧ２細胞中にトランスフェクトされたとき、それらがＥＲ転写活性を活性化する能力について試験された。
【図１５Ａ】図１５は、ヒトＭＮＡＲのポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、ヒトＭＮＡＲのポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１６】図１６は、ヒトＭＮＡＲのアミノ酸（配列番号２）を示す。
【図１７】図１７は、マウスＭＮＡＲのポリヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。
【図１８】図１８は、マウスＭＮＡＲのアミノ酸（配列番号１３）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＮＡＲのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
ゲノム活性に対して非ゲノム活性を示す化合物を同定する方法であって、ＭＮＡＲ−核内受容体の複合体を含む細胞に試験化合物を投与し、該試験化合物から由来の非ゲノム活性またはゲノム活性を測定することを含む、方法。
【請求項３】
ＥＲの少なくとも１つのリガンドが細胞中に存在するか、またはキナーゼが存在するか、または両方ともが存在する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
一の化合物の非ゲノム活性を検出する方法であって、ＭＮＡＲ−核内受容体の存在下、およびＭＮＡＲの非存在下において、一の化合物を細胞に投与し、非ゲノム活性のレベルを比較することを含む、方法。
【請求項５】
一の化合物のゲノム活性を検出する方法であって、ＭＮＡＲ−核内受容体の複合体を含む細胞にある化合物を投与し、ＭＮＡＲの非存在下でのゲノム活性のレベルと比較することを含む、方法。
【請求項６】
ＭＮＡＲ−ＥＲ細胞がＭＮＡＲを過剰発現する、請求項５に記載の化合物のゲノム活性を検出する方法。
【請求項７】
ＭＮＡＲ−ＥＲ細胞がＥＲを過剰発現する、請求項５に記載の化合物のゲノム活性を検出する方法。
【請求項８】
ＥＲが受容体に作動可能に結合する、請求項５に記載の化合物のゲノム活性を検出する方法。
【請求項９】
非ゲノム活性に対して選択的ゲノム活性を有する化合物を同定する方法であって、（ａ）ＭＮＡＲ−核内受容体の複合体を含む細胞に試験化合物を添加し；（ｂ）試験化合物の添加の前後にて非ゲノム活性に対するゲノム活性を比較する工程を含む、方法。
【請求項１０】
ＭＮＡＲの非存在下での、試験化合物を用いたゲノム活性と比較した場合に、ＭＮＡＲ−核内受容体の存在下、試験化合物を細胞に添加した後での選択的ゲノム活性が２倍に増大して測定され、かつ試験化合物の添加後に非ゲノム活性における変化が観察されないところの、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＭＮＡＲの非存在下での、試験化合物を用いた非ゲノム活性と比較した場合に、ＭＮＡＲ−核内受容体の複合体の存在下、試験化合物を細胞に添加した後での非ゲノム活性が２倍に増大し、かつ試験化合物の添加後にゲノム活性における変化が観察されないところの、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
核内受容体の非ゲノム活性を調節する化合物を同定する方法であって、ＭＮＡＲの存在下で核内受容体の転写活性における増大または低下を測定することを含む、方法。
【請求項１３】
細胞の望ましい表現型が核内受容体の非ゲノム活性またはゲノム活性によって影響を受けるかを測定する方法であって、該細胞が添加量のＭＮＡＲに曝露される場合に、細胞の選択された表現型の効果が増大するか低下するかを測定し；ついで、望ましい表現型の有無を検出することを含み、ここで添加したＭＮＡＲの存在下にて望ましい活性または表現型が存在しないことは、核内受容体の非ゲノム活性の増大が望ましい表現型に負に影響する（すなわち、非ゲノム活性は細胞にとって有益ではない）ことを示し、かつ望ましい表現型が増大することは、核内受容体の非ゲノム活性の増大が該細胞に正に影響することを示す、ことを含む、方法。
【請求項１４】
核内受容体の非ゲノム活性を調節する化合物を同定する方法であって、核内受容体の転写活性の増大または低下を測定し、キナーゼが、ＭＮＡＲおよび核内受容体の存在によって影響を受けて、酵素活性が増大するか、または低下するかを測定することを含む、方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの非機能性の内因性ＭＮＡＲポリヌクレオチド配列を含む、１またはそれ以上の細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１６】
マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ウシおよびヒツジからなる群より選択される、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１７】
少なくとも１つの非機能性内因性核内受容体を含む、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１８】
非機能性内因性受容体がステロイド受容体である、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１９】
非機能性内因性受容体が非ステロイド受容体である、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２０】
非機能性内因性受容体がオーファン受容体である、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２１】
非機能性内因性レセプタがエストロゲン受容体である、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２２】
ＥＲαおよびＥＲβの内因性形態が非機能性である、請求項２１記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２３】
ＭＮＡＲコード化配列の中断を含む、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２４】
ＭＮＡＲおよびＥＲコード配列の中断を含む、請求項２１記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２５】
ナンセンスＭＮＡＲ変異を含む、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２６】
ＭＮＡＲおよびＥＲのナンセンス変異を含む、請求項２１記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２７】
ＭＮＡＲコード化配列の欠失を含む、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２８】
ＭＮＡＲを非機能性にさせる、ＭＮＡＲ遺伝子の調節領域における改変を含む、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２９】
内因性ＭＮＡＲプロモーターの代わりに誘導性／抑制性プロモーターを用いることを含む、請求項２８記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３０】
内因性ＭＮＡＲプロモーターの代わりの少なくとも１つの誘導性／抑制性プロモーター、およびエストロゲン受容体を含む、請求項２９記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３１】
哺乳動物の細胞が、該哺乳動物の少なくとも１つの細胞型にて活性なプロモーターの制御下、さらに内因性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１５〜３０のいずれか１項記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３２】
ＭＮＡＲの機能を破壊する化合物をスクリーニングする方法であって、ＭＮＡＲと相互作用する化合物を同定するのに蛋白−蛋白の相互作用アッセイを用いることを含む、方法。
【請求項３３】
ＭＮＡＲの機能を破壊する化合物をスクリーニングする方法であって、ＭＮＡＲと相互作用する蛋白を同定するためのツーハイブリッドアッセイを用いることを含む、方法。
【請求項３４】
ツーハイブリッドが酵母または哺乳動物細胞において実施される、請求項３３記載の方法。
【請求項１】
ＭＮＡＲのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
ゲノム活性に対して非ゲノム活性を示す化合物を同定する方法であって、ＭＮＡＲ−核内受容体の複合体を含む細胞に試験化合物を投与し、該試験化合物から由来の非ゲノム活性またはゲノム活性を測定することを含む、方法。
【請求項３】
ＥＲの少なくとも１つのリガンドが細胞中に存在するか、またはキナーゼが存在するか、または両方ともが存在する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
一の化合物の非ゲノム活性を検出する方法であって、ＭＮＡＲ−核内受容体の存在下、およびＭＮＡＲの非存在下において、一の化合物を細胞に投与し、非ゲノム活性のレベルを比較することを含む、方法。
【請求項５】
一の化合物のゲノム活性を検出する方法であって、ＭＮＡＲ−核内受容体の複合体を含む細胞にある化合物を投与し、ＭＮＡＲの非存在下でのゲノム活性のレベルと比較することを含む、方法。
【請求項６】
ＭＮＡＲ−ＥＲ細胞がＭＮＡＲを過剰発現する、請求項５に記載の化合物のゲノム活性を検出する方法。
【請求項７】
ＭＮＡＲ−ＥＲ細胞がＥＲを過剰発現する、請求項５に記載の化合物のゲノム活性を検出する方法。
【請求項８】
ＥＲが受容体に作動可能に結合する、請求項５に記載の化合物のゲノム活性を検出する方法。
【請求項９】
非ゲノム活性に対して選択的ゲノム活性を有する化合物を同定する方法であって、（ａ）ＭＮＡＲ−核内受容体の複合体を含む細胞に試験化合物を添加し；（ｂ）試験化合物の添加の前後にて非ゲノム活性に対するゲノム活性を比較する工程を含む、方法。
【請求項１０】
ＭＮＡＲの非存在下での、試験化合物を用いたゲノム活性と比較した場合に、ＭＮＡＲ−核内受容体の存在下、試験化合物を細胞に添加した後での選択的ゲノム活性が２倍に増大して測定され、かつ試験化合物の添加後に非ゲノム活性における変化が観察されないところの、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＭＮＡＲの非存在下での、試験化合物を用いた非ゲノム活性と比較した場合に、ＭＮＡＲ−核内受容体の複合体の存在下、試験化合物を細胞に添加した後での非ゲノム活性が２倍に増大し、かつ試験化合物の添加後にゲノム活性における変化が観察されないところの、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
核内受容体の非ゲノム活性を調節する化合物を同定する方法であって、ＭＮＡＲの存在下で核内受容体の転写活性における増大または低下を測定することを含む、方法。
【請求項１３】
細胞の望ましい表現型が核内受容体の非ゲノム活性またはゲノム活性によって影響を受けるかを測定する方法であって、該細胞が添加量のＭＮＡＲに曝露される場合に、細胞の選択された表現型の効果が増大するか低下するかを測定し；ついで、望ましい表現型の有無を検出することを含み、ここで添加したＭＮＡＲの存在下にて望ましい活性または表現型が存在しないことは、核内受容体の非ゲノム活性の増大が望ましい表現型に負に影響する（すなわち、非ゲノム活性は細胞にとって有益ではない）ことを示し、かつ望ましい表現型が増大することは、核内受容体の非ゲノム活性の増大が該細胞に正に影響することを示す、ことを含む、方法。
【請求項１４】
核内受容体の非ゲノム活性を調節する化合物を同定する方法であって、核内受容体の転写活性の増大または低下を測定し、キナーゼが、ＭＮＡＲおよび核内受容体の存在によって影響を受けて、酵素活性が増大するか、または低下するかを測定することを含む、方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの非機能性の内因性ＭＮＡＲポリヌクレオチド配列を含む、１またはそれ以上の細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１６】
マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ウシおよびヒツジからなる群より選択される、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１７】
少なくとも１つの非機能性内因性核内受容体を含む、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１８】
非機能性内因性受容体がステロイド受容体である、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１９】
非機能性内因性受容体が非ステロイド受容体である、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２０】
非機能性内因性受容体がオーファン受容体である、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２１】
非機能性内因性レセプタがエストロゲン受容体である、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２２】
ＥＲαおよびＥＲβの内因性形態が非機能性である、請求項２１記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２３】
ＭＮＡＲコード化配列の中断を含む、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２４】
ＭＮＡＲおよびＥＲコード配列の中断を含む、請求項２１記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２５】
ナンセンスＭＮＡＲ変異を含む、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２６】
ＭＮＡＲおよびＥＲのナンセンス変異を含む、請求項２１記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２７】
ＭＮＡＲコード化配列の欠失を含む、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２８】
ＭＮＡＲを非機能性にさせる、ＭＮＡＲ遺伝子の調節領域における改変を含む、請求項１５記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２９】
内因性ＭＮＡＲプロモーターの代わりに誘導性／抑制性プロモーターを用いることを含む、請求項２８記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３０】
内因性ＭＮＡＲプロモーターの代わりの少なくとも１つの誘導性／抑制性プロモーター、およびエストロゲン受容体を含む、請求項２９記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３１】
哺乳動物の細胞が、該哺乳動物の少なくとも１つの細胞型にて活性なプロモーターの制御下、さらに内因性選択マーカー遺伝子を含む、請求項１５〜３０のいずれか１項記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３２】
ＭＮＡＲの機能を破壊する化合物をスクリーニングする方法であって、ＭＮＡＲと相互作用する化合物を同定するのに蛋白−蛋白の相互作用アッセイを用いることを含む、方法。
【請求項３３】
ＭＮＡＲの機能を破壊する化合物をスクリーニングする方法であって、ＭＮＡＲと相互作用する蛋白を同定するためのツーハイブリッドアッセイを用いることを含む、方法。
【請求項３４】
ツーハイブリッドが酵母または哺乳動物細胞において実施される、請求項３３記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２００８−１５６３６０（Ｐ２００８−１５６３６０Ａ）
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３９２（Ｐ２００８−３３９２）
【出願日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【分割の表示】特願２００４−５２２００９（Ｐ２００４−５２２００９）の分割
【原出願日】平成１４年４月４日（２００２．４．４）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【分割の表示】特願２００４−５２２００９（Ｐ２００４−５２２００９）の分割
【原出願日】平成１４年４月４日（２００２．４．４）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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