新規な組換え七面鳥ヘルペスウイルス、及びそれを利用した家禽用ワクチン
【課題】 鶏伝染性気管支炎に対するワクチン効果を有する組換え七面鳥ヘルペスウイルスを得る。
【解決手段】 鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子がプロモーターとともに、ゲノムに挿入された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。プロモーターとしては、サイトメガロウイルスの初期プロモーター、鶏βアクチン遺伝子のプロモーター、及びマレック病ウイルスのＵＬ５０遺伝子のプロモーターからなる群より選択されたものであるのが好ましく、前記各蛋白質をコードする遺伝子が、七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ４５とＵＬ４６のオープン・リーディング・フレームの間に挿入されていることが好ましい。
【解決手段】 鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子がプロモーターとともに、ゲノムに挿入された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。プロモーターとしては、サイトメガロウイルスの初期プロモーター、鶏βアクチン遺伝子のプロモーター、及びマレック病ウイルスのＵＬ５０遺伝子のプロモーターからなる群より選択されたものであるのが好ましく、前記各蛋白質をコードする遺伝子が、七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＬ４５とＵＬ４６のオープン・リーディング・フレームの間に挿入されていることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、七面鳥ヘルペスウイルス（以下、ＨＶＴということがある）ゲノムの非必須領域に鶏伝染性気管支炎ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：以下、ＩＢＶということがある）のスパイク蛋白質、メンブレン蛋白質、及びエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子がプロモーターとともに挿入された新規な組換え七面鳥ヘルペスウイルス、及びそれを利用した家禽用ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性気管支炎（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ：以下ＩＢということがある）は、１９３１年に米国ではじめて報告された、伝染性の激しい呼吸器病である。病原体である鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）に感染した場合に起こる鶏の疾病で、潜伏期間３６時間で呼吸器症状や産卵低下などの産卵障害、さらに腎炎を引き起こす株もある。不顕性感染に終わることも珍しくないが、６週齢以下では致死率は高くなる。組織学的には、気管、腎臓、卵管 等の上皮細胞が変性破壊される。この病気は養鶏産業を営むほとんどの国々で発生、蔓延している。
【０００３】
ＩＢＶはコロナウイルス科に属する１本鎖のＲＮＡウイルスで、外膜を保有している。ウイルス粒子は４つの構造蛋白質、その内３つが外膜を構成するスパイク（Ｓ）蛋白質（糖蛋白質）、メンブレン（Ｍ）蛋白質（糖蛋白質）、エンベロープ（Ｅ）蛋白質であり、もう一つがヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質である。
【０００４】
ＩＢＶは鶏が自然宿主であり、監視伝染病の対象である。多くの血清型が存在すると考えられている。代表的な血清型として、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（通称Ｍａｓｓ）タイプ、Ａｒｋａｎｓａｓ（通称Ａｒｋ）タイプ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ（通称Ｃｏｎｎ）タイプがあるが、血清型と病型の間には明らかな関係は認められていない。
【０００５】
本症には数多くの生ワクチンと不活化ワクチンがあるが、野外で流行しているウイルスとワクチンウイルスとの血清型の違いなどから予防効果は完全ではない。それらは、いずれも、鶏伝染性気管支炎ウイルスを発育鶏卵で増殖させて得たウイルスを原料としており、製造コスト
の面で発育鶏卵を用いない製造方法が望まれていた。
【０００６】
遺伝子組換え技術の進展により、ＩＢワクチンを遺伝子組換えで製造しようとする試みがなされてきた。古くは、スパイク蛋白質をワクシニアウイルスで発現させた報告（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７）６８：２２９１−２２９８）がある。しかし、この報告では、接種したマウスにＳ蛋白質に対する抗体価を上昇させたとあるが、その後、鶏でワクチン効果があったという報告はなされていない。
他にも鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）やヘルペスウイルスをベクターとしてスパイク蛋白質を発現させた文献や特許がある（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ ４６：８３１−８３８（２００２）、米国特許第５３１０６７１号公報、特開平０５−１０３６６７号公報）が、十分なワクチン効果があったという報告はない。また、ＩＢＶのＳとＭ蛋白質をコードする遺伝子を挿入した組換え七面鳥ヘルペスウイルス（以下、「ＨＶＴ」ということがある）の報告がある（米国特許５９６１９８２号公報）が、ワクチン効果のデータはない。
【０００７】
遺伝子組換えワクチンの成功例の多くの報告は、ウイルス様粒子を作らせることで成し遂げられてきた。例えば、エイズウイルス（ＨＩＶ）のウイルス様粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）６４：２６５３−２６５９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）７０：２６４３−２６４９）ロタウイルスのウイルス様粒子（Ｖａｃｃｉｎｅ （１９９８）１６：５０７−５１６）、ヒトパピローマウイルス（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７：３６７４−３６７９）などの例が挙げられる。しかしながら、組換えＩＢＶワクチンに関しては、このようなウイルス様粒子の形成に成功したという報告はない。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５３１０６７１号公報
【特許文献２】特開平０５−１０３６６７号公報
【特許文献３】米国特許第５９６１９８２号公報
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：２２９１−２２９８（１９８７）
【非特許文献２】Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ ４６：８３１−８３８（２００２）
【非特許文献３】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４：２６５３−２６５９（１９９０）
【非特許文献４】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：２６４３−２６４９ （１９９６）
【非特許文献５】Ｖａｃｃｉｎｅ １６：５０７−５１６ （１９９８）
【非特許文献６】Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６７：３６７４−３６７９（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上述の従来技術の問題点に鑑みて、鶏伝染性気管支炎に対するワクチン効果を有する組換え七面鳥ヘルペスウイルス、及びそれを利用した家禽用ワクチンを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＩＢＶのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子がプロモーターとともに、そのゲノムに挿入された組換え七面鳥ヘルペスウイルスを作製し、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスがワクチンとして使用できることを見出し、本発明を完成したものである。
【００１２】
かくして本発明によれば、鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質（以下、「Ｓ蛋白質」という）をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質（以下、「Ｍ蛋白質」という）をコードする遺伝子、及びエンベロープ蛋白質（以下、「Ｅ蛋白質」という）をコードする遺伝子がプロモーターとともに、ゲノムに挿入された組換え七面鳥ヘルペスウイルスが提供され、プロモーターが、サイトメガロウイルスの初期プロモーター、鶏βアクチン遺伝子のプロモーター、及びマレック病ウイルスのＵＬ５０遺伝子のプロモーターからなる群より選択されたものである前記組換え七面鳥ヘルペスウイルスが提供され、また、前記Ｓ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子が七面鳥ヘルペスウイルスのＵＬ４５とＵＬ４６のオープン・リーディング・フレームの間に挿入されたものである前記組換え七面鳥ヘルペスウイルスが提供され、更に、当該組換え七面鳥ヘルペスウイルスを有効成分とする家禽用ワクチンが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明を詳述する。
鶏伝染性気管支炎ウイルス
本発明において、Ｓ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子の由来となる鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）は、細胞・微生物・遺伝子バンクであるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣなどから有償または無償で入手できるものの他、ＩＢＶ感染鶏から直接得られたものであってもよい。その血清型も特に限定されないが、広く分布していることから、ＭａｓｓタイプかＡｒｋタイプのウイルスが望ましく、特に望ましくはＭａｓｓタイプである。ウイルス株も特に限定されないが、具体的にはＭａｓｓ４１株、ＭａｓｓＨ１２０株、Ａｒｋ ＤＰＩ株などが挙げられる。
【００１４】
鶏伝染性気管支炎ウイルス由来の蛋白質をコードする遺伝子
鶏伝染性気管支炎ウイルス由来のＳ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子は、上記の鶏伝染性気管支炎ウイルスのゲノムであるＲＮＡから調製されたｃＤＮＡのＳ蛋白質、Ｍ蛋白質、及びＥ蛋白質にそれぞれ該当する遺伝子であれば、特に限定されない。
これらの遺伝子は、ウイルスゲノム由来のｃＤＮＡの配列をそのまま用いることもできるが、相同ベクターへサブクローニングしやすい様に、終止コドンや制限酵素サイトを付加するなど改変して用いても良い。具体的には、Ｓ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子として、それぞれ配列番号１、３及び５の配列が挙げられる。これらは、Ｍａｓｓ４１株由来の特に好ましい例であるが、これに限定されるものではなく、１又は複数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。例えば、Ｍａｓｓ４１株のＳ蛋白質とＡｒｋＤＰＩ株のＳ蛋白質との相同性は８６．６％である。即ち、Ｍａｓｓ ４１株の蛋白質との相同性が８５％以上であれば、本願発明に用いることができる。ここで、相同性は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ；http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）の相同性検索「Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）」によって求められる値である。
【００１５】
七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）
本発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスの親株として使用する七面鳥ヘルペスウイルスは、細胞・微生物・遺伝子バンクであるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などから有償または無償で入手できるものの他、ＨＶＴ感染鶏から直接得られたものであってもよい。ＨＶＴの好ましい例としては、ガンマヘルペスウイルス亜科に属し、生来非病原性であり、かつ非腫瘍性のウイルスで家禽用のワクチンとして用いられているものが挙げられる。具体的には、ＦＣ１２６（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８４Ｂ）、ＰＢ−ＴＨＶ１、Ｈ−２、ＹＴ−７、ＷＴＨＶ−１、ＨＰＲＳ−２６などが挙げられ、例えば、ＦＣ１２６株を好適に使用することができる。
【００１６】
プロモーター
本発明で用いるプロモーターについては、組換えＨＶＴが感染細胞内で、プロモーターとして機能する（即ち、ｍＲＮＡ合成のためのＲＮＡポリメラーゼを結合させ、転写を促す能力を有する）遺伝子であれば特に限定されない。具体的にはＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）プロモーターや、Ｒｏｕｓｅ Ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０ ｅａｒｌｙプロモーターの如く異種ウイルスプロモーターやＭＤＶのゲノム配列（ジーンバンクのアクセッション番号：ＡＦ２４３４３８）の９１８２７番目から９２１９６番目までの塩基領域、あるいは鶏細胞由来のβ−アクチンプロモーター（鶏β−アクチンプロモーター）などが例示される。挿入する鶏伝染性気管支炎ウイルス由来のＳ、Ｍ及びＥ蛋白質をコードする遺伝子の３つにそれぞれ別なプロモーターを付けてＨＶＴゲノムに挿入するのが、組換えＨＶＴの安定性の点から好ましい。
【００１７】
非必須領域
鶏伝染性気管支炎ウイルス由来のＳ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子を挿入する鳥類ヘルペスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域は、公知の組み換え鳥類ヘルペスウイルスで使用された領域（公知の非必須領域）のほか、新たに見出した非必須領域も使用できる。
公知の非必須領域の具体例としては、ＷＯ８９／０１０４０号公報で用いられたＵＬ４３遺伝子、ＷＯ９３／２５６６５号公報で用いられたＵＳ２遺伝子、国際公開ＷＯ９９／１８２１５号公報に示されたＵＬ４４からＵＬ４６のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）間領域などが例示され、特に好ましい領域は、ＵＬ４５とＵＬ４６のＯＲＦ間領域である。
新たな非必須領域を見つける方法は特に制限されず、たとえば次のような一般的方法が挙げられる。すなわち、鳥類ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ断片をクローニングし、その制限酵素地図を作成し、その適当な制限酵素サイトにプロモーターとともにマーカー遺伝子を組み込んだ組み換えプラスミドを構築して、後述する一般的な組み換え鳥類ヘルペスウイルスの作製方法でもって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも安定な組み換え鳥類ヘルペスウイルスが得られるかどうかを調べれば良い。
【００１８】
組換え七面鳥ヘルペスウイルスの作製方法
組換え七面鳥ヘルペスウイルスの作製方法は、既に知られている一般的な方法でよい。その一例は次の如くである。（１）まず、上述した非必須領域を含む七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ断片がクローニングされたプラスミドを得、このプラスミド中のＨＶＴゲノム領域の非必須領域に、上述したＩＢＶのＳ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子（いずれも、通常はｃＤＮＡ）を、それぞれプロモーターとともに挿入した組換えプラスミドを構築する。（２）構築した組換えプラスミドを七面鳥ヘルペスウイルス感染ＣＥＦ細胞に導入する、あるいは、七面鳥ヘルペスウイルスから調製した感染性ゲノムＤＮＡとともに組換えプラスミドをＣＥＦ細胞に導入する。これらの導入方法はエレクトロポレーションなど一般的に用いられている方法でよい。（３）組換えプラスミドを導入したＣＥＦ細胞を培養ディッシュにまき、プラークが十分大きくなるまで培養する。（４）このプラークには組換えウイルスと野生型ウイルスが混合して存在しているので、ここから目的とする組換えウイルスを純化する。この純化の方法も特に限定されるものではないが、たとえばプラークの出現したＣＥＦ細胞を適当に希釈し、９６ウェル培養プレートにまき、ＩＢＶのＭａｓｓ４１株を過免疫した鶏から調製した抗Ｍ４１鶏血清を１次抗体とした抗原抗体反応により、Ｓ蛋白質を発現する組換えウイルスのプラークを検出するという方法、あるいは、ＧＦＰ蛋白質のようなマーカー蛋白質の遺伝子も一緒に挿入されえている場合には、蛍光顕微鏡でＧＦＰ蛋白質を発現する組換えウイルスのプラークを検出するという方法が例示される。
【００１９】
ＩＢＶワクチン
本発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、鶏伝染性気管支炎の原因ウイルスであるＩＢＶのＳ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子を有することから、鶏用の鶏伝染性気管支炎ワクチンとして利用される上、七面鳥ヘルペスウイルスとしてＭＤＶワクチンとして広く利用されているＦＣ１２６株を使用した場合は、鶏伝染性気管支炎と同時にマレック病にも有効な鶏多価ワクチンとなる。
本発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスを主成分とするワクチンは、本発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルス以外に、保存安定剤、ｐＨ調整剤、免疫応答工場のためのアジュバント、細胞、培地成分など、薬理学的に問題のない成分を含んでいても構わない。更に、組換えウイルス以外の成分として、他の組み換えあるいは非組み換えウイルスを混合しても良い。具体的には、ＭＤＶ−１又はＭＤＶ−２のワクチン株を本発明の組換えＨＶＴに混合して使用することがその一例として挙げられる。
本発明のワクチンの調製方法は特に限定されないが、たとえば次の方法によって調製される。本発明の組み換えＨＶＴを当該ウイルスが増殖可能なＣＥＦ細胞などに感染させ増殖させた後、感染細胞をスクレーパーまたはトリプシンではがし、遠心分離によって細胞と上清に分離する。得られた細胞を１０％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む培養用培地に懸濁させ液体窒素中に保存する。
【００２０】
本発明のワクチンの鶏への投与方法も特に限定されず、マレック病ワクチンとして用いられている一般的な方法が使用できる。即ち、１０〜１０５ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、好ましくは１０２〜１０４ＰＦＵ／ｄｏｓｅになるように適量のリン酸緩衝液などに溶かして、初日齢の鶏の頸部皮下に、あるいは孵化前の卵に注射や接種用機器を使って投与することができる。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明のプラスミド構築は特に記載がない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．Ｎ．Ｙ．１９８９）記載の標準的な分子生物学手法を用いて行った。尚、制限酵素断片はアガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、カタログ番号＃２８７０４）を使って精製した。
【００２２】
１．ＩＢＶ由来のｃＤＮＡの調製
ＩＢＶのＭａｓｓタイプの野外分離株Ｍａｓｓ＃１４（バイオミューン社製）からＲＮＡを以下の様にして回収した。まず、保存してあったウイルス（１チューブ）を超遠心分離チューブに移し、２８ｍｌのＰＢＳを添加して４３２０００×ｇ、１時間の超遠心分離にかけた。遠心分離後、上清を捨て沈殿物に０．６ｍｌのＲＬＴバッファー（ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙミニキット、カタログ＃：７４１０４）を加えて２０ゲージ針の注射器でその沈殿物をホモジナイズした。その後、０．６ｍｌの７０％エタノールを加えて混合した。それらを２本のＲＮｅａｓｙ スピンカラム（上記ミニキットに同梱）にのせて、エッペンドルフ遠心機で１０，０００回転、１５秒間遠心分離した。カラムを通過した液を捨て、カラムに０．７ｍｌのＲＷ１バッファー（上記ミニキットに同梱）をのせて再び１５秒間遠心分離した。更に、０．５ｍｌのＲＰＥバッファー（上記ミニキットに同梱）で２回カラムを洗浄した。その後、エッペンドルフ遠心機で１４，０００回転、１分間遠心分離してカラムに残っている液を除き、カラムを新しいチューブの上に設置して、３０μｌの滅菌水を加えて１０，０００回転１分間遠心して、ＲＮＡを回収した。
【００２３】
回収したウイルスＲＮＡからのｃＤＮＡ合成は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製ＲＴ−ＰＣＲキット、カタログ＃：１１９０４−０１８）を用いて以下のようにして行った。回収したＲＮＡ液の８μｌに、ランダムヘキサマーを１μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰを１μｌ加えて６５℃で５分間置いた後、氷冷した。これに、１０×ＲＴバッファーを２μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、０．１ｍＭ ＤＴＴを２μｌ、ＲＮａｓｅＯｕｔ液（２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ塩化カリウム）を１μｌ加えて、２５℃に２分間置いた後、酵素Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴを１μｌ加えた。２５℃に１０分間置いた後、４２℃で５０分間静置し、７０℃で１５分間、その後４℃に移した。ここにＥ．ＣｏｌｉＲＮａｓｅＨ（２単位／μｌ）を１μｌ加えて、３７℃で２０分間静置した。以上の操作によってＩＢＶウイルスのｃＤＮＡを調製した。
【００２４】
２．ＩＢＶの各蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
実施例１で調製したｃＤＮＡをテンプレートとして用い、Ｓ蛋白質をコードする遺伝子のＰＣＲクローニングを実施した。使用したＰＣＲプライマーはＸＢＡ−ＭＡＳＳ−Ｓ（配列番号７）と、ＭＡＳＳ―ＳＡＬ−Ｓ（配列番号８）で、酵素は、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製、製品名「ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ」）を用いた。ＰＣＲの結果、３．５ｋｂｐのＤＮＡが増幅され、ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン社、製品名「ＴＯＰＯ ＴＡ ＰＣＲ２．１ ミニプレップ」）にメーカー推奨の方法に従ってプローニングした。
得られた形質転換株からミニプレップ法でプラスミドＤＮＡを調整し、制限酵素ＳａｌＩで切断して、アガロースゲル電気泳動で切断パターンを確認した。
その結果からＳ蛋白をコードする遺伝子がクローニングされているプラスミドｐＣＲ２．１−Ｓ（ｍａｓｓ）として２クローン（＃７と＃８）が得られた。
【００２５】
この２クローンを塩基配列解析した。使用したシーケンスプライマーは、市販のＴ７プロモータープライマー（東洋紡績、カタログ番号：ＰＲＭ−１０２）とＰ８プライマー（東洋紡績、カタログ番号：ＰＲＭ−００８）以外に、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ２（配列番号９）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ２（配列番号１０）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ３（配列番号１１）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ３（配列番号１２）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ４（配列番号１３）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ５（配列番号１４）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ６（配列番号１５）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ４（配列番号１６）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ５（配列番号１７）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ６（配列番号１８）のシーケンスプライマーを使用した。
【００２６】
塩基配列解析の結果、クローン＃８は３，４８９塩基であり、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているＭａｓｓ４１株（アクセッション＃：ＡＹ８５１２９５）のＳ蛋白質をコードする遺伝子と比較すると、４塩基（Ｃ１８９６Ｔ、Ａ２２４１Ｇ、Ａ２６７９Ｇ、Ｔ３４４４Ｃ）の変異しかなく、これらは全てアミノ酸が変わらないサイレント変異であることがわかった。クローニングされたＳ蛋白をコードする遺伝子配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２７】
Ｍ蛋白質をコードする遺伝子とＥ蛋白質をコードする遺伝子のＰＣＲクローニングに使用したプライマーは次の通り。
Ｍ蛋白質をコードする遺伝子のクローニング用ＰＣＲプライマーは、ＸｂａＭＡＳＳ＿Ｍ（配列番号１９）とＭＡＳＳ＿ＭＳａｌ（配列番号２０）、ＰＣＲで増幅させたＤＮＡをＴＯＰＯクローニングベクターにライゲーションして、３つの候補クローン（＃７，１１，１２）をシーケンスしたところ、＃１１のクローンのみ、２箇所にサイレントな塩基の違いがあるだけで、＃１１のクローンはアミノ酸配列がＭａｓｓ４１株と同じであった。
＃１１クローンのＭ蛋白質をコードする遺伝子のＯＲＦは６７８ｂｐ（配列番号３）でアミノ酸配列を配列番号４に示す。このプラスミドをｐＣＲ２．１−Ｍ（ｍａｓｓ）と命名した。
【００２８】
一方、Ｅ蛋白質をコードする遺伝子のクローニングにＰＣＲプライマーＸｂａＭＡＳＳ＿Ｅ（配列番号２１）とＭＡＳＳ＿ＥＳａｌ（配列番号２２）を用いた。こちらもＰＣＲで増幅させたＤＮＡをＴＯＰＯクローニングベクターにライゲーションして、２つの候補クローン得た。ｐＣＲ２．１−Ｅ（ｍａｓｓ）クローン＃４と＃５である。この２クローンは向きが逆であったが同一配列であり、ＧｅｎｅＢａｎｋのＭａｓｓ４１株（ＡＹ８５１２９５）とは、１塩基（１アミノ酸）のみ異なっていた（Ｔ１５７Ｇ、Ｌ５３Ｖ）。Ｅ蛋白質をコードする遺伝子のＯＲＦは３３０ｂｐであり、塩基配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００２９】
３．ＩＢＶの各蛋白質をコードする遺伝子が真核細胞中で働くプロモーターとともに挿入されたプラスミドＤＮＡの構築
３−１．ｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）の作製
米国特許第６６３２６６４号の実施例１に記載されているように七面鳥ヘルペスウイルスＦＣ１２６株（以下、単に「ＨＶＴ」と略す）のＤＮＡを調製した。外来遺伝子を挿入するためのＳｆｉＩ制限酵素サイトを導入するため、２組のＰＣＲプライマーセットとＨＶＴのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
一つのセットは、ＨＶＴ４５Ｓｐｈ（配列番号２３）と４５ＳｆｉＩＲ（配列番号２４）、もう一つのセットは、４６ＳｆｉＦ（配列番号２５）とＨＶＴ４６Ｘｈｏ（配列番号２６）のセットである。それぞれのＰＣＲ産物（０．４ｋｂｐと０．６ｋｂｐ）が増幅されたのを確認後、その産物を１：１の割合になるように混合し、ＨＶＴ４５ＳｐｈとＨＶＴ４６ＸｈｏのプライマーセットでＰＣＲを再度実施した。
その結果、０．９８ｋｂｐの断片が増幅された。この増幅断片をＳｐｈＩとＸｈｏＩで二重切断して、同じくＳｐｈＩとＸｈｏＩで二重切断したｐＮＺ４５／４６ＳｆｉＩ（米国特許６６３２６６４の実施例２）とライゲーションさせ、ｐ４６Ｓｆｉ（５４９１ｂｐ）を構築した。
【００３０】
合成オリゴヌクレオチドＳｆｉ−ｐｏｌＡ−Ｓａｌ−Ｐｓｔ−Ｓｆｉ−Ｕ（配列番号２７）とＳｆｉ−ｐｏｌＡ−Ｓａｌ−Ｐｓｔ−Ｓｆｉ−Ｌ（配列番号２８）をアニーリングさせて、制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６Ｓｆｉにライゲーションしてｐ４６Ｓｆｉ−ｐＡ（５５４３ｂｐ）を作製した。
米国特許第７１５３５１１号に記載されているプラスミドｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡをＰｓｔＩとＳａｌＩで切断して得た鶏βアクチン（Ｂａｃ）プロモーター断片（１．５７ｋｂｐ）を１．２％アガロースゲルから回収した。プラスミドｐ４６Ｓｆｉ−ｐＡをＰｓｔＩとＳａｌＩで二重切断し、回収したＢａｃプロモーター断片とライゲーションして、ｐ４６Ｂａｃ（７１０１ｂｐ）を作製した。
【００３１】
米国特許第６８６６８５２号の実施例１に記載されたプラスミドｐＧＩＣＯＡをＰｓｔＩとＸｂａＩで二重切断してアガロースゲルから回収したＢａｃプロモーターのコア領域（約３００塩基）を、ｐ４６ＢａｃをＰｓｔＩとＸｂａＩで切断した断片とライゲーションしてｐ４６Ｃｏａ（５８２２ｂｐ）を作製した。
プラスミドｐＣＲ２．１−Ｍ（ｍａｓｓ）をＸｂａＩとＳａｌＩで切断して、アガロースゲルから回収したＭ蛋白質をコードする遺伝子（６７８ｂｐ）を、同じくＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断したプラスミドｐ４６Ｃｏａとライゲーションしてｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）（６５１１ｂｐ）（図１）を作製した。
【００３２】
３−２．ｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の作製
サイトメガロウイルスのＩＥプロモーターは市販プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン社；カタログ＃：２１２２０９）から得た。このプロモーター内には、制限酵素ＢｇｌＩの認識サイトが３箇所ある。プラスミド構築にはこのサイトが邪魔になるので、このサイトをつぶす為に４つのプライマーセットを用いたＰＣＲを使ってインビトロ変異を行った。プライマーセットは、（ア）ＰｒＣＭＶ１（配列番号２９）とＰｒＣＭＶ３（配列番号３０）のセット、（イ）ＰｒＣＭＶ４（配列番号３１）とＰｒＣＭＶ５（配列番号３２）のセット、（ウ）ＰｒＣＭＶ６（配列番号３３）とＰｒＣＭＶ２（配列番号３４）のセット、（エ）ＰｒＣＭＶｏ１（配列番号３５）とＰｒＣＭＶＲ１（配列番号３６）のセットである。プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶを鋳型にして、この４つのプライマーセットでそれぞれＰＣＲを行い、これらのＰＣＲ産物を混合して、ＰｒＣＭＶ１とＰｒＣＭＶＲ１で２回目のＰＣＲを行って３箇所の塩基配列を変更したＣＭＶプロモーターのＤＮＡ断片（６０４ｂｐ）を産生した。このＣＭＶプロモーターの配列は配列番号３７である。
【００３３】
このＣＭＶプロモーター断片をＰｓｔＩとＸｂａＩで切断し、同じくＰｓｔＩとＸｂａＩで切断したプラスミドｐＵＣ１８ｐｏｌＡＳｆｉ（米国特許第６８６６８５２号）に挿入してｐＧＩＣＭＶ（−）（３３２１ｂｐ）を作製した。ＳＶ４０ポリＡシグナル配列は、ｐＢＫ−ＣＭＶを鋳型としてＰｏｌｙＡ−ＳａｌＫｐｎ（配列番号３８）とＰｏｌｙＡ−ＳｆｉＦ２（配列番号３９）のプライマーセットでＰＣＲ増幅して得、ＳａｌＩとＳｆｉＩで二重切断して回収した断片を、同じくＳａｌＩとＳｆｉＩで二重切断したｐＧＩＣＭＶ（−）とライゲーションしてプラスミドｐＧＩＣＭＶｐＡ（３３５４ｂｐ）を作製した。
【００３４】
ＣＭＶプロモーターからｐｏｌｙＡまでの断片の末端を修飾するため、ｐＧＩＣＭＶｐＡを鋳型としてＰｒＣＭＶ１Ｂｇｌ（配列番号４０）とＰｏｌＡ−ＳｆｉＲ（配列番号４１）のプライマーセットでＰＣＲを行った。９５５ｂｐの増幅産物をＢｇｌＩで切断し、ＳｆｉＩで切断したｐ４６Ｓｆｉに挿入してｐ４６ＣＭＶを作製した。
プラスミドｐＣＲ２．１−Ｓ（ｍａｓｓ）をＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断して得た、約３．５ｋｂｐのＳ蛋白質をコードする遺伝子を、同じくＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断したｐ４６ＣＭＶとライゲーションして、ｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）（図２）を構築した。
【００３５】
３−３． ｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の作製
ｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）を制限酵素ＢｇｌＩで切断後、アガロースゲルから回収した約４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）とライゲーションして、プラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）（図３）を作製した。
【００３６】
３−４． ｐＰｍｄ５０Ｅ（ｍａｓｓ）ｍｄ５１ＧＦＰの作製
マレック病ワクチンとして市販されているＣＶＩ９８８株を直径１５ｃｍの培養皿のＣＥＦ細胞に感染させウイルスを増やした後、ＰＢＳで洗浄後、リシスバッファー（０．５％ＳＤＳ、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌプロテナーゼ）を４ｍｌ加えて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃）で４時間インキュベートし、細胞溶解物を５０ｍｌファルコンチューブに移し、等量のフェノール（ＴＥ飽和）を加え、１５分間ゆっくり回転し、混合した。次に、１５００×ｇ、５分間、遠心後、水層をピペットでゆっくり吸い取り、新しいチューブに移した。クロロフォルム：イソアミルアルコール＝２４：１を等量加え、１５分間ゆっくり混合した。その後、１５００×ｇ、５分間遠心し、水層をピペットでゆっくり吸い取り、新しいチューブに移し、１００％エタノールを水層の倍量加え、良く混ぜてから１５００×ｇ、５分間遠心した。その沈殿を７０％エタノールでリンスしたのち軽く風乾してＭＤＶのゲノムＤＮＡを含む核酸画分を調製した。
上記で調製したＭＤＶのゲノムＤＮＡ画分をテンプレートにして、ＭＤ５０Ｆ（配列番号４２）とＭＤ５１Ｒ（配列番号４３）のプライマーセットでＰＣＲを行い、ＭＤＶのゲノム配列の９１７０９番目から９２２６１番目までのＤＮＡ領域を増幅させ、それをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐベクター（ストラタジーン社）にライゲーションし、ＪＭ１０９を形質転換した。そうして、得られた形質転換株３株からプラスミドを調製して、挿入ＤＮＡの塩基配列分析を行った。３株のうち、２株の挿入ＤＮＡの塩基配列が完全に一致した。それらのプラスミドをｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５０（３４９３ｂｐ）と命名した。
【００３７】
ｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５０Ｆを制限酵素ＫｐｎＩで切断後、更にＳａｌＩで切断して回収したプラスミドに、Ａｄ＿Ｋｐ−Ｂｇ−ＳａＵ（配列番号４４）と、Ａｄ＿Ｋｐ−Ｂｇ−ＳａＬ（配列番号４５）の２つの合成ヌクレオチドをアニールさせた合成ＤＮＡアダプターを挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＰｍｄ５０Ｍ１（３５１６ｂｐ）と命名した。
ｐＰｍｄ５０Ｍ１をそれぞれ制限酵素ＳａｃＩで切断後、更にＮｏｔＩで切断して回収したプラスミドに、Ａｄ＿Ｎｏ−Ｓｆ−ＳａＵ（配列番号４６）と、Ａｄ＿Ｎｏ−Ｓｆ−ＳａＬ（配列番号４７）の２つの合成ヌクレオチドをアニールさせた合成ＤＮＡアダプターを挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＰｍｄ５０Ｍ２（３５４２ｂｐ）と命名した。
【００３８】
次いで、ｐＰｍｄ５０Ｍ２を制限酵素ＮｃｏＩとＮｏｔＩで二重切断して回収したプラスミドに、Ａｄ＿Ｎｃ−Ｂｇ−Ｘｈ−ＮｏＵ（配列番号４８）と、Ａｄ＿Ｎｃ−Ｂｇ−Ｘｈ−ＮｏＬ（配列番号４９）の２つの合成ヌクレオチドをアニールさせた合成ＤＮＡアダプターを挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＰｍｄ５０Ｍ３（３０６０ｂｐ）と命名した。
ｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５０をテンプレートにして、Ｐｍｄ５０Ｆ（配列番号５０）とＰｍｄ５１Ｒ（配列番号５１）のＰＣＲプライマーでＰＣＲを実施した。増幅されたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＮｃｏＩで二重切断して得られた約３８０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＮｃｏＩで二重切断したｐＰｍｄ５０Ｍ３とライゲーションして、ｐＰｍｄ５０Ｆ（３４０９ｂｐ）を構築した。このｐＰｍｄ５０ＦのＫｐｎＩサイトからＳａｃＩサイトまでの塩基配列が、配列番号５２である。
オワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質ＧＦＰ遺伝子を持った市販プラスミドベクターｐＧＦＰ（クロンテック社、カタログ番号：６０９７−１）をテンプレートにして、ＧＦＰＢｓｐＦ（配列番号５３）とＧＦＰＳａｌＲ（配列番号５４）のプライマーセットでＰＣＲを実施した。増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｌＩで二重切断し、ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重切断したｐＰｍｄ５０ＦとライゲーションしてｐＰｍｄ５１ＧＦＰを作製した。
次に、ｐＣＲ２．１−Ｅ（ｍａｓｓ）（クローン＃５）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで二重切断し、同じくＢａｍＨＩとＳａｌＩで二重切断したｐＰｍｄ５１ＧＦＰにライゲーションして、プラスミドｐＰｍｄ５０Ｅ（ｍａｓｓ）ｍｄ５１ＧＦＰ（４６８５ｂｐ）（図４）を構築した。
【００３９】
３−５． ｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳｍｄ５０Ｅｍｄ５１ＧＦＰの作製
プラスミドｐＰｍｄ５０Ｅ（ｍａｓｓ）ｍｄ５１ＧＦＰを制限酵素ＢｇｌＩで切断後、アガロースゲルから回収した約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）とライゲーションしてプラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳｍｄ５０Ｅｍｄ５１ＧＦＰ（１２７２７ｂｐ）（図５）を得た。
【００４０】
４．組換えＨＶＴの作製と純化
４−１．ｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓの作製と純化
Ｍｏｒｇａｎらの方法（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３４：３４５−３５１（１９９０）によって、親株ＨＶＴ（ＦＣ１２６株）のＤＮＡを調製し、前記３．２で構築したプラスミドｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）とともに電気穿孔法を用いてＣＥＦ細胞に導入し、Ｓ蛋白質に対する抗体を用いて組み換えＨＶＴの純化を行った。その具体的方法は以下の通りである。
【００４１】
１×１０７個の鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を０．１ｍｌのＭＥＦ−１バッファー（アマクサバイオシステムズ社、カタログＮｏ．ＶＰＤ−１００４）に懸濁し、組換えプラスミドｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）のＤＮＡ１μｇと５μｇのＨＶＴゲノムＤＮＡを加え、室温で遺伝子導入装置（アマクサバイオシステムズ社、製品名「Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」）のプログラムＡ−２３を用いて遺伝子導入した。直ちに４％牛血清を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５とＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍと（ともにＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製、カタログ番号＃４１３００−０３９、＃２１５００−０６１）を同容量比で混合した培地（以下、ＬＭ（＋）培地と略す）を加え、直径６０ｍｍの細胞培養ディシュで、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６日、培養した。この細胞を適当に希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁したＣＥＦと混ぜ、９６ウェル培養プレートに分注し、プラークが出るまで培養した。プレートの各ウェルの細胞をトリプシン処理して、新鮮なＣＥＦ細胞を追加して９６ウェル培養プレート２枚の各ウェルに移した。こうして作製したレプリカプレートをプラークが出現するまで培養した。その後、その１枚のプレートの細胞をメタノールで固定し、抗Ｍ４１鶏抗血清（ＳＰＡＦＡＳ社製）を１次抗体とした抗原抗体反応により、Ｓ蛋白質を発現する組換えＨＶＴが存在しているかどうかの確認を行った。組換えＨＶＴの確認されたウェルに相当するレプリカより細胞を回収、希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁した新鮮なＣＥＦ細胞とまぜて９６穴プレートに分注し、培養した。この、希釈・レプリカの作製・組換えＨＶＴの確認の繰り返しを、１ウェルから由来する全てのプラークがほぼ１００％組換えＨＶＴであることを確認できるまで行った。この組み換えＨＶＴを１０５ｐｆｕ程度までＣＥＦで増殖後、超音波破砕処理を行い、遠心上清を、９６穴プレートのＣＥＦ細胞に感染させた。１週間培養後、再び、この操作を繰り返して組み換えＨＶＴが１００％になるまで繰り返した。こうして純化した組換えＨＶＴウイルスをｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓと命名した。
【００４２】
４−２．ｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍの作製と純化
組換えプラスミドをｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の代わりに、ｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）を用いる以外は、上記４−１．と同様にして、組換えＨＶＴを純化し、これをｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍと命名した。
【００４３】
４−３．ｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍ＋Ｅの作製と純化
１×１０７個のＣＥＦ細胞を０．１ｍｌのＭＥＦ−１バッファーに懸濁し、組換えプラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳｍｄ５０Ｅｍｄ５１ＧＦＰのＤＮＡ１μｇと５μｇのＨＶＴゲノムＤＮＡを加え、前述と同じ遺伝子導入装置を用いて遺伝子導入した。直ちにＬＭ（＋）培地を加え、直径６０ｍｍの細胞培養ディシュで、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６日、培養した。この細胞を適当に希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁したＣＥＦと混ぜ、９６ウェル培養プレートに分注し、プラークがでるまで培養した。この９６ウェル培養プレートを蛍光顕微鏡下で観察し、ＧＦＰ蛋白質が発現しているＨＶＴのプラークを探した。ＧＦＰ蛋白質の発現を示す緑色の蛍光を発する組換えＨＶＴが確認されたウェルより細胞を回収、希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁した新鮮なＣＥＦ細胞とまぜて９６ウェル培養プレートに分注し培養した。この一連の操作の繰り返しによって、ほぼ１００％組換えＨＶＴであることを確認した。この組み換えＨＶＴを１０５ｐｆｕ程度までＣＥＦ細胞内で増殖後、超音波破砕処理を行い、遠心上清を、９６ウェル培養プレートのＣＥＦ細胞に感染させた。１週間培養後、再び、この操作を繰り返して組み換えＨＶＴが１００％になるまで繰り返した。こうして純化した組換えＨＶＴウイルスをｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍ＋Ｅと命名した。
【００４４】
５．組換えＨＶＴの発現蛋白質の確認（ブラック・プラーク・アッセイ）
上記４で作製した各組換えＨＶＴをＣＥＦ細胞と混合させて、それぞれ６ウェル培養プレートで培養し、３日後、ＰＢＳにて２回細胞を洗浄後、−２０℃のメタノール：アセトン（２：１）を５００μｌ／ウェル加えて、室温で５分間放置した。この後ＰＢＳにて２回洗浄し、一次抗体と反応させた。一次抗体として用いたのは（１）ＩＢＶの血清型Ｍａｓｓ株に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）１５８８（コーネル大学より分与された。参考論文はＡｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９２）３６：９０３−９１５）、（２）抗Ｍ４１鶏血清、（３）プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−３（アマシャムバイオサイエンス社製、カタログＮｏ．２７−４５９９−０１）を使って大腸菌で発現させたＭ蛋白質の９７番目から２２５番目までの領域の組換え蛋白を鶏に免疫して得た鶏血清（抗Ｍ鶏血清）、（４）同じ大腸菌発現ベクターを使って、Ｅ蛋白質の３番目から１０８番目までの領域の組換え蛋白質を鶏に免疫して得た鶏血清（抗Ｅ鶏血清）を用いた。３７℃で１時間放置後、ＰＢＳで２回洗浄し、２次抗体として５０００倍稀釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ（ベクターラボラトリー社製、カタログＮｏ．ＢＡ−９２００）又はビオチン化抗鶏ＩｇＧ抗体（ベクターラボラトリー社、ＢＡ−９０１０）と反応させた。再び１時間放置後、ＰＢＳで２回洗浄し、ベクターステインＡＢＣ−ＡＬＰ（ベクターラボラトリー社製、ＡＫ−５０００）液で３０分間放置した。ＰＢＳ洗浄後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ロッシュダイアゴノスティックス、カタログＮｏ．１１６８１４５１００１）にて発色させた。検鏡しながら反応の進行を確認し、呈色反応は試薬を捨てて水に置換して停止させた。プラークが黒く染まったものを陽性（＋）、染まらなかったものを（−）として、結果を表１に示した。
【００４５】
表１に示すようにｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍ＋Ｅ感染ＣＥＦ細胞のみ、Ｓ蛋白質に対するモノクローナル抗体（１５８８）や抗Ｅ鶏血清と反応した。１５８８は血清特異的なモノクローナル抗体であるとともに、ウエスタンブロットでは反応しないことから、Ｓ蛋白質の立体構造を認識していると考えられている（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９９２）３６：９０３−９１５）。このモノクローナル抗体に反応したということは、ｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍ＋Ｅ感染細胞で発現するスパイク蛋白質は立体構造上、ＩＢＶのＭａｓｓ株のＳ蛋白質と類似した構造をとっていることを示唆しており、他の組換えＨＶＴでは、そのようなＳ蛋白質の立体構造はとれないということがわかった。
【００４６】
【表１】
【００４７】
６．組換え体のワクチン効果動物試験
日生研から購入したＳＰＦ卵から生まれた雛に、表２で示す各組換えＨＶＴを３×１０３／羽ずつ皮下接種した（各群１０羽）。４週間後に採血してＭａｓｓ４１株を抗原として挽いたＥＬＩＳＡプレート（ＳＰＡＦＡＳ社製）を使って抗体価を測定した。５００倍希釈した鶏から採取した血清と１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）でよく洗浄後、４０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗鶏ＩｇＧ羊血清（ＢＥＴＨＹＬ社）と１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで再びよく洗浄後、基質（バイオラッド社、カタログ番号１７２−１０６４）を添加して１５分間反応させた。吸光度が０．２以上になったものを陽性とし、陽性となった鶏数をカウントした。結果を表２に示した。
【００４８】
ＩＢＶに対する中和抗体（ＶＮ）の有無も測定した。１０３ＥＩＤ５０のＭａｓｓ４１株を１０倍ずつ段階希釈した鶏血清（上記採取した血清プール）と混合し、１時間静置した。それを１０日胚のＳＰＦ受精卵に接種して、７日後、卵から胎児を取り出し生死を判定した。５０％中和抗体価（ＮＩ）をＲｅｅｄらの方法（Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．（１９３８）２７：４９３−４９７）で算出した。結果を表２に示した。
表２に示すように、ｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍ＋ＥのみＩＢＶに対する抗体が検出され、中和抗体も認められた。
【００４９】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、プラスミドｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）の模式図である。
【図２】図２は、プラスミドｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の模式図である。
【図３】図３は、プラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の模式図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＰｍｄ５０Ｅ（ｍａｓｓ）ｍｄ５１ＧＦＰの模式図である。
【図５】図５は、プラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳｍｄ５０Ｅｍｄ５１ＧＦＰの模式図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、七面鳥ヘルペスウイルス（以下、ＨＶＴということがある）ゲノムの非必須領域に鶏伝染性気管支炎ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：以下、ＩＢＶということがある）のスパイク蛋白質、メンブレン蛋白質、及びエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子がプロモーターとともに挿入された新規な組換え七面鳥ヘルペスウイルス、及びそれを利用した家禽用ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性気管支炎（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ：以下ＩＢということがある）は、１９３１年に米国ではじめて報告された、伝染性の激しい呼吸器病である。病原体である鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）に感染した場合に起こる鶏の疾病で、潜伏期間３６時間で呼吸器症状や産卵低下などの産卵障害、さらに腎炎を引き起こす株もある。不顕性感染に終わることも珍しくないが、６週齢以下では致死率は高くなる。組織学的には、気管、腎臓、卵管 等の上皮細胞が変性破壊される。この病気は養鶏産業を営むほとんどの国々で発生、蔓延している。
【０００３】
ＩＢＶはコロナウイルス科に属する１本鎖のＲＮＡウイルスで、外膜を保有している。ウイルス粒子は４つの構造蛋白質、その内３つが外膜を構成するスパイク（Ｓ）蛋白質（糖蛋白質）、メンブレン（Ｍ）蛋白質（糖蛋白質）、エンベロープ（Ｅ）蛋白質であり、もう一つがヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質である。
【０００４】
ＩＢＶは鶏が自然宿主であり、監視伝染病の対象である。多くの血清型が存在すると考えられている。代表的な血清型として、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（通称Ｍａｓｓ）タイプ、Ａｒｋａｎｓａｓ（通称Ａｒｋ）タイプ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ（通称Ｃｏｎｎ）タイプがあるが、血清型と病型の間には明らかな関係は認められていない。
【０００５】
本症には数多くの生ワクチンと不活化ワクチンがあるが、野外で流行しているウイルスとワクチンウイルスとの血清型の違いなどから予防効果は完全ではない。それらは、いずれも、鶏伝染性気管支炎ウイルスを発育鶏卵で増殖させて得たウイルスを原料としており、製造コスト
の面で発育鶏卵を用いない製造方法が望まれていた。
【０００６】
遺伝子組換え技術の進展により、ＩＢワクチンを遺伝子組換えで製造しようとする試みがなされてきた。古くは、スパイク蛋白質をワクシニアウイルスで発現させた報告（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７）６８：２２９１−２２９８）がある。しかし、この報告では、接種したマウスにＳ蛋白質に対する抗体価を上昇させたとあるが、その後、鶏でワクチン効果があったという報告はなされていない。
他にも鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）やヘルペスウイルスをベクターとしてスパイク蛋白質を発現させた文献や特許がある（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ ４６：８３１−８３８（２００２）、米国特許第５３１０６７１号公報、特開平０５−１０３６６７号公報）が、十分なワクチン効果があったという報告はない。また、ＩＢＶのＳとＭ蛋白質をコードする遺伝子を挿入した組換え七面鳥ヘルペスウイルス（以下、「ＨＶＴ」ということがある）の報告がある（米国特許５９６１９８２号公報）が、ワクチン効果のデータはない。
【０００７】
遺伝子組換えワクチンの成功例の多くの報告は、ウイルス様粒子を作らせることで成し遂げられてきた。例えば、エイズウイルス（ＨＩＶ）のウイルス様粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）６４：２６５３−２６５９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）７０：２６４３−２６４９）ロタウイルスのウイルス様粒子（Ｖａｃｃｉｎｅ （１９９８）１６：５０７−５１６）、ヒトパピローマウイルス（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７：３６７４−３６７９）などの例が挙げられる。しかしながら、組換えＩＢＶワクチンに関しては、このようなウイルス様粒子の形成に成功したという報告はない。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５３１０６７１号公報
【特許文献２】特開平０５−１０３６６７号公報
【特許文献３】米国特許第５９６１９８２号公報
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８：２２９１−２２９８（１９８７）
【非特許文献２】Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ ４６：８３１−８３８（２００２）
【非特許文献３】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４：２６５３−２６５９（１９９０）
【非特許文献４】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：２６４３−２６４９ （１９９６）
【非特許文献５】Ｖａｃｃｉｎｅ １６：５０７−５１６ （１９９８）
【非特許文献６】Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６７：３６７４−３６７９（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上述の従来技術の問題点に鑑みて、鶏伝染性気管支炎に対するワクチン効果を有する組換え七面鳥ヘルペスウイルス、及びそれを利用した家禽用ワクチンを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＩＢＶのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子がプロモーターとともに、そのゲノムに挿入された組換え七面鳥ヘルペスウイルスを作製し、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスがワクチンとして使用できることを見出し、本発明を完成したものである。
【００１２】
かくして本発明によれば、鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質（以下、「Ｓ蛋白質」という）をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質（以下、「Ｍ蛋白質」という）をコードする遺伝子、及びエンベロープ蛋白質（以下、「Ｅ蛋白質」という）をコードする遺伝子がプロモーターとともに、ゲノムに挿入された組換え七面鳥ヘルペスウイルスが提供され、プロモーターが、サイトメガロウイルスの初期プロモーター、鶏βアクチン遺伝子のプロモーター、及びマレック病ウイルスのＵＬ５０遺伝子のプロモーターからなる群より選択されたものである前記組換え七面鳥ヘルペスウイルスが提供され、また、前記Ｓ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子が七面鳥ヘルペスウイルスのＵＬ４５とＵＬ４６のオープン・リーディング・フレームの間に挿入されたものである前記組換え七面鳥ヘルペスウイルスが提供され、更に、当該組換え七面鳥ヘルペスウイルスを有効成分とする家禽用ワクチンが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明を詳述する。
鶏伝染性気管支炎ウイルス
本発明において、Ｓ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子の由来となる鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）は、細胞・微生物・遺伝子バンクであるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣなどから有償または無償で入手できるものの他、ＩＢＶ感染鶏から直接得られたものであってもよい。その血清型も特に限定されないが、広く分布していることから、ＭａｓｓタイプかＡｒｋタイプのウイルスが望ましく、特に望ましくはＭａｓｓタイプである。ウイルス株も特に限定されないが、具体的にはＭａｓｓ４１株、ＭａｓｓＨ１２０株、Ａｒｋ ＤＰＩ株などが挙げられる。
【００１４】
鶏伝染性気管支炎ウイルス由来の蛋白質をコードする遺伝子
鶏伝染性気管支炎ウイルス由来のＳ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子は、上記の鶏伝染性気管支炎ウイルスのゲノムであるＲＮＡから調製されたｃＤＮＡのＳ蛋白質、Ｍ蛋白質、及びＥ蛋白質にそれぞれ該当する遺伝子であれば、特に限定されない。
これらの遺伝子は、ウイルスゲノム由来のｃＤＮＡの配列をそのまま用いることもできるが、相同ベクターへサブクローニングしやすい様に、終止コドンや制限酵素サイトを付加するなど改変して用いても良い。具体的には、Ｓ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子として、それぞれ配列番号１、３及び５の配列が挙げられる。これらは、Ｍａｓｓ４１株由来の特に好ましい例であるが、これに限定されるものではなく、１又は複数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。例えば、Ｍａｓｓ４１株のＳ蛋白質とＡｒｋＤＰＩ株のＳ蛋白質との相同性は８６．６％である。即ち、Ｍａｓｓ ４１株の蛋白質との相同性が８５％以上であれば、本願発明に用いることができる。ここで、相同性は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ；http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）の相同性検索「Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）」によって求められる値である。
【００１５】
七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）
本発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスの親株として使用する七面鳥ヘルペスウイルスは、細胞・微生物・遺伝子バンクであるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などから有償または無償で入手できるものの他、ＨＶＴ感染鶏から直接得られたものであってもよい。ＨＶＴの好ましい例としては、ガンマヘルペスウイルス亜科に属し、生来非病原性であり、かつ非腫瘍性のウイルスで家禽用のワクチンとして用いられているものが挙げられる。具体的には、ＦＣ１２６（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８４Ｂ）、ＰＢ−ＴＨＶ１、Ｈ−２、ＹＴ−７、ＷＴＨＶ−１、ＨＰＲＳ−２６などが挙げられ、例えば、ＦＣ１２６株を好適に使用することができる。
【００１６】
プロモーター
本発明で用いるプロモーターについては、組換えＨＶＴが感染細胞内で、プロモーターとして機能する（即ち、ｍＲＮＡ合成のためのＲＮＡポリメラーゼを結合させ、転写を促す能力を有する）遺伝子であれば特に限定されない。具体的にはＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）プロモーターや、Ｒｏｕｓｅ Ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０ ｅａｒｌｙプロモーターの如く異種ウイルスプロモーターやＭＤＶのゲノム配列（ジーンバンクのアクセッション番号：ＡＦ２４３４３８）の９１８２７番目から９２１９６番目までの塩基領域、あるいは鶏細胞由来のβ−アクチンプロモーター（鶏β−アクチンプロモーター）などが例示される。挿入する鶏伝染性気管支炎ウイルス由来のＳ、Ｍ及びＥ蛋白質をコードする遺伝子の３つにそれぞれ別なプロモーターを付けてＨＶＴゲノムに挿入するのが、組換えＨＶＴの安定性の点から好ましい。
【００１７】
非必須領域
鶏伝染性気管支炎ウイルス由来のＳ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子を挿入する鳥類ヘルペスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域は、公知の組み換え鳥類ヘルペスウイルスで使用された領域（公知の非必須領域）のほか、新たに見出した非必須領域も使用できる。
公知の非必須領域の具体例としては、ＷＯ８９／０１０４０号公報で用いられたＵＬ４３遺伝子、ＷＯ９３／２５６６５号公報で用いられたＵＳ２遺伝子、国際公開ＷＯ９９／１８２１５号公報に示されたＵＬ４４からＵＬ４６のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）間領域などが例示され、特に好ましい領域は、ＵＬ４５とＵＬ４６のＯＲＦ間領域である。
新たな非必須領域を見つける方法は特に制限されず、たとえば次のような一般的方法が挙げられる。すなわち、鳥類ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ断片をクローニングし、その制限酵素地図を作成し、その適当な制限酵素サイトにプロモーターとともにマーカー遺伝子を組み込んだ組み換えプラスミドを構築して、後述する一般的な組み換え鳥類ヘルペスウイルスの作製方法でもって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも安定な組み換え鳥類ヘルペスウイルスが得られるかどうかを調べれば良い。
【００１８】
組換え七面鳥ヘルペスウイルスの作製方法
組換え七面鳥ヘルペスウイルスの作製方法は、既に知られている一般的な方法でよい。その一例は次の如くである。（１）まず、上述した非必須領域を含む七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ断片がクローニングされたプラスミドを得、このプラスミド中のＨＶＴゲノム領域の非必須領域に、上述したＩＢＶのＳ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子（いずれも、通常はｃＤＮＡ）を、それぞれプロモーターとともに挿入した組換えプラスミドを構築する。（２）構築した組換えプラスミドを七面鳥ヘルペスウイルス感染ＣＥＦ細胞に導入する、あるいは、七面鳥ヘルペスウイルスから調製した感染性ゲノムＤＮＡとともに組換えプラスミドをＣＥＦ細胞に導入する。これらの導入方法はエレクトロポレーションなど一般的に用いられている方法でよい。（３）組換えプラスミドを導入したＣＥＦ細胞を培養ディッシュにまき、プラークが十分大きくなるまで培養する。（４）このプラークには組換えウイルスと野生型ウイルスが混合して存在しているので、ここから目的とする組換えウイルスを純化する。この純化の方法も特に限定されるものではないが、たとえばプラークの出現したＣＥＦ細胞を適当に希釈し、９６ウェル培養プレートにまき、ＩＢＶのＭａｓｓ４１株を過免疫した鶏から調製した抗Ｍ４１鶏血清を１次抗体とした抗原抗体反応により、Ｓ蛋白質を発現する組換えウイルスのプラークを検出するという方法、あるいは、ＧＦＰ蛋白質のようなマーカー蛋白質の遺伝子も一緒に挿入されえている場合には、蛍光顕微鏡でＧＦＰ蛋白質を発現する組換えウイルスのプラークを検出するという方法が例示される。
【００１９】
ＩＢＶワクチン
本発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、鶏伝染性気管支炎の原因ウイルスであるＩＢＶのＳ蛋白質をコードする遺伝子、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子、及びＥ蛋白質をコードする遺伝子を有することから、鶏用の鶏伝染性気管支炎ワクチンとして利用される上、七面鳥ヘルペスウイルスとしてＭＤＶワクチンとして広く利用されているＦＣ１２６株を使用した場合は、鶏伝染性気管支炎と同時にマレック病にも有効な鶏多価ワクチンとなる。
本発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスを主成分とするワクチンは、本発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルス以外に、保存安定剤、ｐＨ調整剤、免疫応答工場のためのアジュバント、細胞、培地成分など、薬理学的に問題のない成分を含んでいても構わない。更に、組換えウイルス以外の成分として、他の組み換えあるいは非組み換えウイルスを混合しても良い。具体的には、ＭＤＶ−１又はＭＤＶ−２のワクチン株を本発明の組換えＨＶＴに混合して使用することがその一例として挙げられる。
本発明のワクチンの調製方法は特に限定されないが、たとえば次の方法によって調製される。本発明の組み換えＨＶＴを当該ウイルスが増殖可能なＣＥＦ細胞などに感染させ増殖させた後、感染細胞をスクレーパーまたはトリプシンではがし、遠心分離によって細胞と上清に分離する。得られた細胞を１０％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む培養用培地に懸濁させ液体窒素中に保存する。
【００２０】
本発明のワクチンの鶏への投与方法も特に限定されず、マレック病ワクチンとして用いられている一般的な方法が使用できる。即ち、１０〜１０５ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、好ましくは１０２〜１０４ＰＦＵ／ｄｏｓｅになるように適量のリン酸緩衝液などに溶かして、初日齢の鶏の頸部皮下に、あるいは孵化前の卵に注射や接種用機器を使って投与することができる。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明のプラスミド構築は特に記載がない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．Ｎ．Ｙ．１９８９）記載の標準的な分子生物学手法を用いて行った。尚、制限酵素断片はアガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、カタログ番号＃２８７０４）を使って精製した。
【００２２】
１．ＩＢＶ由来のｃＤＮＡの調製
ＩＢＶのＭａｓｓタイプの野外分離株Ｍａｓｓ＃１４（バイオミューン社製）からＲＮＡを以下の様にして回収した。まず、保存してあったウイルス（１チューブ）を超遠心分離チューブに移し、２８ｍｌのＰＢＳを添加して４３２０００×ｇ、１時間の超遠心分離にかけた。遠心分離後、上清を捨て沈殿物に０．６ｍｌのＲＬＴバッファー（ＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙミニキット、カタログ＃：７４１０４）を加えて２０ゲージ針の注射器でその沈殿物をホモジナイズした。その後、０．６ｍｌの７０％エタノールを加えて混合した。それらを２本のＲＮｅａｓｙ スピンカラム（上記ミニキットに同梱）にのせて、エッペンドルフ遠心機で１０，０００回転、１５秒間遠心分離した。カラムを通過した液を捨て、カラムに０．７ｍｌのＲＷ１バッファー（上記ミニキットに同梱）をのせて再び１５秒間遠心分離した。更に、０．５ｍｌのＲＰＥバッファー（上記ミニキットに同梱）で２回カラムを洗浄した。その後、エッペンドルフ遠心機で１４，０００回転、１分間遠心分離してカラムに残っている液を除き、カラムを新しいチューブの上に設置して、３０μｌの滅菌水を加えて１０，０００回転１分間遠心して、ＲＮＡを回収した。
【００２３】
回収したウイルスＲＮＡからのｃＤＮＡ合成は、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製ＲＴ−ＰＣＲキット、カタログ＃：１１９０４−０１８）を用いて以下のようにして行った。回収したＲＮＡ液の８μｌに、ランダムヘキサマーを１μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰを１μｌ加えて６５℃で５分間置いた後、氷冷した。これに、１０×ＲＴバッファーを２μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、０．１ｍＭ ＤＴＴを２μｌ、ＲＮａｓｅＯｕｔ液（２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ塩化カリウム）を１μｌ加えて、２５℃に２分間置いた後、酵素Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴを１μｌ加えた。２５℃に１０分間置いた後、４２℃で５０分間静置し、７０℃で１５分間、その後４℃に移した。ここにＥ．ＣｏｌｉＲＮａｓｅＨ（２単位／μｌ）を１μｌ加えて、３７℃で２０分間静置した。以上の操作によってＩＢＶウイルスのｃＤＮＡを調製した。
【００２４】
２．ＩＢＶの各蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
実施例１で調製したｃＤＮＡをテンプレートとして用い、Ｓ蛋白質をコードする遺伝子のＰＣＲクローニングを実施した。使用したＰＣＲプライマーはＸＢＡ−ＭＡＳＳ−Ｓ（配列番号７）と、ＭＡＳＳ―ＳＡＬ−Ｓ（配列番号８）で、酵素は、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製、製品名「ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ」）を用いた。ＰＣＲの結果、３．５ｋｂｐのＤＮＡが増幅され、ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン社、製品名「ＴＯＰＯ ＴＡ ＰＣＲ２．１ ミニプレップ」）にメーカー推奨の方法に従ってプローニングした。
得られた形質転換株からミニプレップ法でプラスミドＤＮＡを調整し、制限酵素ＳａｌＩで切断して、アガロースゲル電気泳動で切断パターンを確認した。
その結果からＳ蛋白をコードする遺伝子がクローニングされているプラスミドｐＣＲ２．１−Ｓ（ｍａｓｓ）として２クローン（＃７と＃８）が得られた。
【００２５】
この２クローンを塩基配列解析した。使用したシーケンスプライマーは、市販のＴ７プロモータープライマー（東洋紡績、カタログ番号：ＰＲＭ−１０２）とＰ８プライマー（東洋紡績、カタログ番号：ＰＲＭ−００８）以外に、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ２（配列番号９）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ２（配列番号１０）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ３（配列番号１１）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ３（配列番号１２）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ４（配列番号１３）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ５（配列番号１４）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｆ６（配列番号１５）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ４（配列番号１６）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ５（配列番号１７）、Ｍａｓｓ−Ｓ−Ｒ６（配列番号１８）のシーケンスプライマーを使用した。
【００２６】
塩基配列解析の結果、クローン＃８は３，４８９塩基であり、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているＭａｓｓ４１株（アクセッション＃：ＡＹ８５１２９５）のＳ蛋白質をコードする遺伝子と比較すると、４塩基（Ｃ１８９６Ｔ、Ａ２２４１Ｇ、Ａ２６７９Ｇ、Ｔ３４４４Ｃ）の変異しかなく、これらは全てアミノ酸が変わらないサイレント変異であることがわかった。クローニングされたＳ蛋白をコードする遺伝子配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２７】
Ｍ蛋白質をコードする遺伝子とＥ蛋白質をコードする遺伝子のＰＣＲクローニングに使用したプライマーは次の通り。
Ｍ蛋白質をコードする遺伝子のクローニング用ＰＣＲプライマーは、ＸｂａＭＡＳＳ＿Ｍ（配列番号１９）とＭＡＳＳ＿ＭＳａｌ（配列番号２０）、ＰＣＲで増幅させたＤＮＡをＴＯＰＯクローニングベクターにライゲーションして、３つの候補クローン（＃７，１１，１２）をシーケンスしたところ、＃１１のクローンのみ、２箇所にサイレントな塩基の違いがあるだけで、＃１１のクローンはアミノ酸配列がＭａｓｓ４１株と同じであった。
＃１１クローンのＭ蛋白質をコードする遺伝子のＯＲＦは６７８ｂｐ（配列番号３）でアミノ酸配列を配列番号４に示す。このプラスミドをｐＣＲ２．１−Ｍ（ｍａｓｓ）と命名した。
【００２８】
一方、Ｅ蛋白質をコードする遺伝子のクローニングにＰＣＲプライマーＸｂａＭＡＳＳ＿Ｅ（配列番号２１）とＭＡＳＳ＿ＥＳａｌ（配列番号２２）を用いた。こちらもＰＣＲで増幅させたＤＮＡをＴＯＰＯクローニングベクターにライゲーションして、２つの候補クローン得た。ｐＣＲ２．１−Ｅ（ｍａｓｓ）クローン＃４と＃５である。この２クローンは向きが逆であったが同一配列であり、ＧｅｎｅＢａｎｋのＭａｓｓ４１株（ＡＹ８５１２９５）とは、１塩基（１アミノ酸）のみ異なっていた（Ｔ１５７Ｇ、Ｌ５３Ｖ）。Ｅ蛋白質をコードする遺伝子のＯＲＦは３３０ｂｐであり、塩基配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００２９】
３．ＩＢＶの各蛋白質をコードする遺伝子が真核細胞中で働くプロモーターとともに挿入されたプラスミドＤＮＡの構築
３−１．ｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）の作製
米国特許第６６３２６６４号の実施例１に記載されているように七面鳥ヘルペスウイルスＦＣ１２６株（以下、単に「ＨＶＴ」と略す）のＤＮＡを調製した。外来遺伝子を挿入するためのＳｆｉＩ制限酵素サイトを導入するため、２組のＰＣＲプライマーセットとＨＶＴのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
一つのセットは、ＨＶＴ４５Ｓｐｈ（配列番号２３）と４５ＳｆｉＩＲ（配列番号２４）、もう一つのセットは、４６ＳｆｉＦ（配列番号２５）とＨＶＴ４６Ｘｈｏ（配列番号２６）のセットである。それぞれのＰＣＲ産物（０．４ｋｂｐと０．６ｋｂｐ）が増幅されたのを確認後、その産物を１：１の割合になるように混合し、ＨＶＴ４５ＳｐｈとＨＶＴ４６ＸｈｏのプライマーセットでＰＣＲを再度実施した。
その結果、０．９８ｋｂｐの断片が増幅された。この増幅断片をＳｐｈＩとＸｈｏＩで二重切断して、同じくＳｐｈＩとＸｈｏＩで二重切断したｐＮＺ４５／４６ＳｆｉＩ（米国特許６６３２６６４の実施例２）とライゲーションさせ、ｐ４６Ｓｆｉ（５４９１ｂｐ）を構築した。
【００３０】
合成オリゴヌクレオチドＳｆｉ−ｐｏｌＡ−Ｓａｌ−Ｐｓｔ−Ｓｆｉ−Ｕ（配列番号２７）とＳｆｉ−ｐｏｌＡ−Ｓａｌ−Ｐｓｔ−Ｓｆｉ−Ｌ（配列番号２８）をアニーリングさせて、制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６Ｓｆｉにライゲーションしてｐ４６Ｓｆｉ−ｐＡ（５５４３ｂｐ）を作製した。
米国特許第７１５３５１１号に記載されているプラスミドｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡをＰｓｔＩとＳａｌＩで切断して得た鶏βアクチン（Ｂａｃ）プロモーター断片（１．５７ｋｂｐ）を１．２％アガロースゲルから回収した。プラスミドｐ４６Ｓｆｉ−ｐＡをＰｓｔＩとＳａｌＩで二重切断し、回収したＢａｃプロモーター断片とライゲーションして、ｐ４６Ｂａｃ（７１０１ｂｐ）を作製した。
【００３１】
米国特許第６８６６８５２号の実施例１に記載されたプラスミドｐＧＩＣＯＡをＰｓｔＩとＸｂａＩで二重切断してアガロースゲルから回収したＢａｃプロモーターのコア領域（約３００塩基）を、ｐ４６ＢａｃをＰｓｔＩとＸｂａＩで切断した断片とライゲーションしてｐ４６Ｃｏａ（５８２２ｂｐ）を作製した。
プラスミドｐＣＲ２．１−Ｍ（ｍａｓｓ）をＸｂａＩとＳａｌＩで切断して、アガロースゲルから回収したＭ蛋白質をコードする遺伝子（６７８ｂｐ）を、同じくＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断したプラスミドｐ４６Ｃｏａとライゲーションしてｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）（６５１１ｂｐ）（図１）を作製した。
【００３２】
３−２．ｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の作製
サイトメガロウイルスのＩＥプロモーターは市販プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン社；カタログ＃：２１２２０９）から得た。このプロモーター内には、制限酵素ＢｇｌＩの認識サイトが３箇所ある。プラスミド構築にはこのサイトが邪魔になるので、このサイトをつぶす為に４つのプライマーセットを用いたＰＣＲを使ってインビトロ変異を行った。プライマーセットは、（ア）ＰｒＣＭＶ１（配列番号２９）とＰｒＣＭＶ３（配列番号３０）のセット、（イ）ＰｒＣＭＶ４（配列番号３１）とＰｒＣＭＶ５（配列番号３２）のセット、（ウ）ＰｒＣＭＶ６（配列番号３３）とＰｒＣＭＶ２（配列番号３４）のセット、（エ）ＰｒＣＭＶｏ１（配列番号３５）とＰｒＣＭＶＲ１（配列番号３６）のセットである。プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶを鋳型にして、この４つのプライマーセットでそれぞれＰＣＲを行い、これらのＰＣＲ産物を混合して、ＰｒＣＭＶ１とＰｒＣＭＶＲ１で２回目のＰＣＲを行って３箇所の塩基配列を変更したＣＭＶプロモーターのＤＮＡ断片（６０４ｂｐ）を産生した。このＣＭＶプロモーターの配列は配列番号３７である。
【００３３】
このＣＭＶプロモーター断片をＰｓｔＩとＸｂａＩで切断し、同じくＰｓｔＩとＸｂａＩで切断したプラスミドｐＵＣ１８ｐｏｌＡＳｆｉ（米国特許第６８６６８５２号）に挿入してｐＧＩＣＭＶ（−）（３３２１ｂｐ）を作製した。ＳＶ４０ポリＡシグナル配列は、ｐＢＫ−ＣＭＶを鋳型としてＰｏｌｙＡ−ＳａｌＫｐｎ（配列番号３８）とＰｏｌｙＡ−ＳｆｉＦ２（配列番号３９）のプライマーセットでＰＣＲ増幅して得、ＳａｌＩとＳｆｉＩで二重切断して回収した断片を、同じくＳａｌＩとＳｆｉＩで二重切断したｐＧＩＣＭＶ（−）とライゲーションしてプラスミドｐＧＩＣＭＶｐＡ（３３５４ｂｐ）を作製した。
【００３４】
ＣＭＶプロモーターからｐｏｌｙＡまでの断片の末端を修飾するため、ｐＧＩＣＭＶｐＡを鋳型としてＰｒＣＭＶ１Ｂｇｌ（配列番号４０）とＰｏｌＡ−ＳｆｉＲ（配列番号４１）のプライマーセットでＰＣＲを行った。９５５ｂｐの増幅産物をＢｇｌＩで切断し、ＳｆｉＩで切断したｐ４６Ｓｆｉに挿入してｐ４６ＣＭＶを作製した。
プラスミドｐＣＲ２．１−Ｓ（ｍａｓｓ）をＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断して得た、約３．５ｋｂｐのＳ蛋白質をコードする遺伝子を、同じくＸｂａＩとＳａｌＩで二重切断したｐ４６ＣＭＶとライゲーションして、ｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）（図２）を構築した。
【００３５】
３−３． ｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の作製
ｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）を制限酵素ＢｇｌＩで切断後、アガロースゲルから回収した約４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）とライゲーションして、プラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）（図３）を作製した。
【００３６】
３−４． ｐＰｍｄ５０Ｅ（ｍａｓｓ）ｍｄ５１ＧＦＰの作製
マレック病ワクチンとして市販されているＣＶＩ９８８株を直径１５ｃｍの培養皿のＣＥＦ細胞に感染させウイルスを増やした後、ＰＢＳで洗浄後、リシスバッファー（０．５％ＳＤＳ、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌプロテナーゼ）を４ｍｌ加えて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃）で４時間インキュベートし、細胞溶解物を５０ｍｌファルコンチューブに移し、等量のフェノール（ＴＥ飽和）を加え、１５分間ゆっくり回転し、混合した。次に、１５００×ｇ、５分間、遠心後、水層をピペットでゆっくり吸い取り、新しいチューブに移した。クロロフォルム：イソアミルアルコール＝２４：１を等量加え、１５分間ゆっくり混合した。その後、１５００×ｇ、５分間遠心し、水層をピペットでゆっくり吸い取り、新しいチューブに移し、１００％エタノールを水層の倍量加え、良く混ぜてから１５００×ｇ、５分間遠心した。その沈殿を７０％エタノールでリンスしたのち軽く風乾してＭＤＶのゲノムＤＮＡを含む核酸画分を調製した。
上記で調製したＭＤＶのゲノムＤＮＡ画分をテンプレートにして、ＭＤ５０Ｆ（配列番号４２）とＭＤ５１Ｒ（配列番号４３）のプライマーセットでＰＣＲを行い、ＭＤＶのゲノム配列の９１７０９番目から９２２６１番目までのＤＮＡ領域を増幅させ、それをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐベクター（ストラタジーン社）にライゲーションし、ＪＭ１０９を形質転換した。そうして、得られた形質転換株３株からプラスミドを調製して、挿入ＤＮＡの塩基配列分析を行った。３株のうち、２株の挿入ＤＮＡの塩基配列が完全に一致した。それらのプラスミドをｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５０（３４９３ｂｐ）と命名した。
【００３７】
ｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５０Ｆを制限酵素ＫｐｎＩで切断後、更にＳａｌＩで切断して回収したプラスミドに、Ａｄ＿Ｋｐ−Ｂｇ−ＳａＵ（配列番号４４）と、Ａｄ＿Ｋｐ−Ｂｇ−ＳａＬ（配列番号４５）の２つの合成ヌクレオチドをアニールさせた合成ＤＮＡアダプターを挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＰｍｄ５０Ｍ１（３５１６ｂｐ）と命名した。
ｐＰｍｄ５０Ｍ１をそれぞれ制限酵素ＳａｃＩで切断後、更にＮｏｔＩで切断して回収したプラスミドに、Ａｄ＿Ｎｏ−Ｓｆ−ＳａＵ（配列番号４６）と、Ａｄ＿Ｎｏ−Ｓｆ−ＳａＬ（配列番号４７）の２つの合成ヌクレオチドをアニールさせた合成ＤＮＡアダプターを挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＰｍｄ５０Ｍ２（３５４２ｂｐ）と命名した。
【００３８】
次いで、ｐＰｍｄ５０Ｍ２を制限酵素ＮｃｏＩとＮｏｔＩで二重切断して回収したプラスミドに、Ａｄ＿Ｎｃ−Ｂｇ−Ｘｈ−ＮｏＵ（配列番号４８）と、Ａｄ＿Ｎｃ−Ｂｇ−Ｘｈ−ＮｏＬ（配列番号４９）の２つの合成ヌクレオチドをアニールさせた合成ＤＮＡアダプターを挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＰｍｄ５０Ｍ３（３０６０ｂｐ）と命名した。
ｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５０をテンプレートにして、Ｐｍｄ５０Ｆ（配列番号５０）とＰｍｄ５１Ｒ（配列番号５１）のＰＣＲプライマーでＰＣＲを実施した。増幅されたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＮｃｏＩで二重切断して得られた約３８０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＮｃｏＩで二重切断したｐＰｍｄ５０Ｍ３とライゲーションして、ｐＰｍｄ５０Ｆ（３４０９ｂｐ）を構築した。このｐＰｍｄ５０ＦのＫｐｎＩサイトからＳａｃＩサイトまでの塩基配列が、配列番号５２である。
オワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質ＧＦＰ遺伝子を持った市販プラスミドベクターｐＧＦＰ（クロンテック社、カタログ番号：６０９７−１）をテンプレートにして、ＧＦＰＢｓｐＦ（配列番号５３）とＧＦＰＳａｌＲ（配列番号５４）のプライマーセットでＰＣＲを実施した。増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｌＩで二重切断し、ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重切断したｐＰｍｄ５０ＦとライゲーションしてｐＰｍｄ５１ＧＦＰを作製した。
次に、ｐＣＲ２．１−Ｅ（ｍａｓｓ）（クローン＃５）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで二重切断し、同じくＢａｍＨＩとＳａｌＩで二重切断したｐＰｍｄ５１ＧＦＰにライゲーションして、プラスミドｐＰｍｄ５０Ｅ（ｍａｓｓ）ｍｄ５１ＧＦＰ（４６８５ｂｐ）（図４）を構築した。
【００３９】
３−５． ｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳｍｄ５０Ｅｍｄ５１ＧＦＰの作製
プラスミドｐＰｍｄ５０Ｅ（ｍａｓｓ）ｍｄ５１ＧＦＰを制限酵素ＢｇｌＩで切断後、アガロースゲルから回収した約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）とライゲーションしてプラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳｍｄ５０Ｅｍｄ５１ＧＦＰ（１２７２７ｂｐ）（図５）を得た。
【００４０】
４．組換えＨＶＴの作製と純化
４−１．ｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓの作製と純化
Ｍｏｒｇａｎらの方法（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３４：３４５−３５１（１９９０）によって、親株ＨＶＴ（ＦＣ１２６株）のＤＮＡを調製し、前記３．２で構築したプラスミドｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）とともに電気穿孔法を用いてＣＥＦ細胞に導入し、Ｓ蛋白質に対する抗体を用いて組み換えＨＶＴの純化を行った。その具体的方法は以下の通りである。
【００４１】
１×１０７個の鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を０．１ｍｌのＭＥＦ−１バッファー（アマクサバイオシステムズ社、カタログＮｏ．ＶＰＤ−１００４）に懸濁し、組換えプラスミドｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）のＤＮＡ１μｇと５μｇのＨＶＴゲノムＤＮＡを加え、室温で遺伝子導入装置（アマクサバイオシステムズ社、製品名「Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ」）のプログラムＡ−２３を用いて遺伝子導入した。直ちに４％牛血清を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５とＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍと（ともにＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製、カタログ番号＃４１３００−０３９、＃２１５００−０６１）を同容量比で混合した培地（以下、ＬＭ（＋）培地と略す）を加え、直径６０ｍｍの細胞培養ディシュで、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６日、培養した。この細胞を適当に希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁したＣＥＦと混ぜ、９６ウェル培養プレートに分注し、プラークが出るまで培養した。プレートの各ウェルの細胞をトリプシン処理して、新鮮なＣＥＦ細胞を追加して９６ウェル培養プレート２枚の各ウェルに移した。こうして作製したレプリカプレートをプラークが出現するまで培養した。その後、その１枚のプレートの細胞をメタノールで固定し、抗Ｍ４１鶏抗血清（ＳＰＡＦＡＳ社製）を１次抗体とした抗原抗体反応により、Ｓ蛋白質を発現する組換えＨＶＴが存在しているかどうかの確認を行った。組換えＨＶＴの確認されたウェルに相当するレプリカより細胞を回収、希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁した新鮮なＣＥＦ細胞とまぜて９６穴プレートに分注し、培養した。この、希釈・レプリカの作製・組換えＨＶＴの確認の繰り返しを、１ウェルから由来する全てのプラークがほぼ１００％組換えＨＶＴであることを確認できるまで行った。この組み換えＨＶＴを１０５ｐｆｕ程度までＣＥＦで増殖後、超音波破砕処理を行い、遠心上清を、９６穴プレートのＣＥＦ細胞に感染させた。１週間培養後、再び、この操作を繰り返して組み換えＨＶＴが１００％になるまで繰り返した。こうして純化した組換えＨＶＴウイルスをｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓと命名した。
【００４２】
４−２．ｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍの作製と純化
組換えプラスミドをｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の代わりに、ｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）を用いる以外は、上記４−１．と同様にして、組換えＨＶＴを純化し、これをｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍと命名した。
【００４３】
４−３．ｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍ＋Ｅの作製と純化
１×１０７個のＣＥＦ細胞を０．１ｍｌのＭＥＦ−１バッファーに懸濁し、組換えプラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳｍｄ５０Ｅｍｄ５１ＧＦＰのＤＮＡ１μｇと５μｇのＨＶＴゲノムＤＮＡを加え、前述と同じ遺伝子導入装置を用いて遺伝子導入した。直ちにＬＭ（＋）培地を加え、直径６０ｍｍの細胞培養ディシュで、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６日、培養した。この細胞を適当に希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁したＣＥＦと混ぜ、９６ウェル培養プレートに分注し、プラークがでるまで培養した。この９６ウェル培養プレートを蛍光顕微鏡下で観察し、ＧＦＰ蛋白質が発現しているＨＶＴのプラークを探した。ＧＦＰ蛋白質の発現を示す緑色の蛍光を発する組換えＨＶＴが確認されたウェルより細胞を回収、希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁した新鮮なＣＥＦ細胞とまぜて９６ウェル培養プレートに分注し培養した。この一連の操作の繰り返しによって、ほぼ１００％組換えＨＶＴであることを確認した。この組み換えＨＶＴを１０５ｐｆｕ程度までＣＥＦ細胞内で増殖後、超音波破砕処理を行い、遠心上清を、９６ウェル培養プレートのＣＥＦ細胞に感染させた。１週間培養後、再び、この操作を繰り返して組み換えＨＶＴが１００％になるまで繰り返した。こうして純化した組換えＨＶＴウイルスをｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍ＋Ｅと命名した。
【００４４】
５．組換えＨＶＴの発現蛋白質の確認（ブラック・プラーク・アッセイ）
上記４で作製した各組換えＨＶＴをＣＥＦ細胞と混合させて、それぞれ６ウェル培養プレートで培養し、３日後、ＰＢＳにて２回細胞を洗浄後、−２０℃のメタノール：アセトン（２：１）を５００μｌ／ウェル加えて、室温で５分間放置した。この後ＰＢＳにて２回洗浄し、一次抗体と反応させた。一次抗体として用いたのは（１）ＩＢＶの血清型Ｍａｓｓ株に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）１５８８（コーネル大学より分与された。参考論文はＡｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９２）３６：９０３−９１５）、（２）抗Ｍ４１鶏血清、（３）プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−３（アマシャムバイオサイエンス社製、カタログＮｏ．２７−４５９９−０１）を使って大腸菌で発現させたＭ蛋白質の９７番目から２２５番目までの領域の組換え蛋白を鶏に免疫して得た鶏血清（抗Ｍ鶏血清）、（４）同じ大腸菌発現ベクターを使って、Ｅ蛋白質の３番目から１０８番目までの領域の組換え蛋白質を鶏に免疫して得た鶏血清（抗Ｅ鶏血清）を用いた。３７℃で１時間放置後、ＰＢＳで２回洗浄し、２次抗体として５０００倍稀釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ（ベクターラボラトリー社製、カタログＮｏ．ＢＡ−９２００）又はビオチン化抗鶏ＩｇＧ抗体（ベクターラボラトリー社、ＢＡ−９０１０）と反応させた。再び１時間放置後、ＰＢＳで２回洗浄し、ベクターステインＡＢＣ−ＡＬＰ（ベクターラボラトリー社製、ＡＫ−５０００）液で３０分間放置した。ＰＢＳ洗浄後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ロッシュダイアゴノスティックス、カタログＮｏ．１１６８１４５１００１）にて発色させた。検鏡しながら反応の進行を確認し、呈色反応は試薬を捨てて水に置換して停止させた。プラークが黒く染まったものを陽性（＋）、染まらなかったものを（−）として、結果を表１に示した。
【００４５】
表１に示すようにｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍ＋Ｅ感染ＣＥＦ細胞のみ、Ｓ蛋白質に対するモノクローナル抗体（１５８８）や抗Ｅ鶏血清と反応した。１５８８は血清特異的なモノクローナル抗体であるとともに、ウエスタンブロットでは反応しないことから、Ｓ蛋白質の立体構造を認識していると考えられている（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９９２）３６：９０３−９１５）。このモノクローナル抗体に反応したということは、ｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍ＋Ｅ感染細胞で発現するスパイク蛋白質は立体構造上、ＩＢＶのＭａｓｓ株のＳ蛋白質と類似した構造をとっていることを示唆しており、他の組換えＨＶＴでは、そのようなＳ蛋白質の立体構造はとれないということがわかった。
【００４６】
【表１】
【００４７】
６．組換え体のワクチン効果動物試験
日生研から購入したＳＰＦ卵から生まれた雛に、表２で示す各組換えＨＶＴを３×１０３／羽ずつ皮下接種した（各群１０羽）。４週間後に採血してＭａｓｓ４１株を抗原として挽いたＥＬＩＳＡプレート（ＳＰＡＦＡＳ社製）を使って抗体価を測定した。５００倍希釈した鶏から採取した血清と１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）でよく洗浄後、４０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗鶏ＩｇＧ羊血清（ＢＥＴＨＹＬ社）と１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで再びよく洗浄後、基質（バイオラッド社、カタログ番号１７２−１０６４）を添加して１５分間反応させた。吸光度が０．２以上になったものを陽性とし、陽性となった鶏数をカウントした。結果を表２に示した。
【００４８】
ＩＢＶに対する中和抗体（ＶＮ）の有無も測定した。１０３ＥＩＤ５０のＭａｓｓ４１株を１０倍ずつ段階希釈した鶏血清（上記採取した血清プール）と混合し、１時間静置した。それを１０日胚のＳＰＦ受精卵に接種して、７日後、卵から胎児を取り出し生死を判定した。５０％中和抗体価（ＮＩ）をＲｅｅｄらの方法（Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．（１９３８）２７：４９３−４９７）で算出した。結果を表２に示した。
表２に示すように、ｒＨＶＴ／ＩＢ＿Ｓ＋Ｍ＋ＥのみＩＢＶに対する抗体が検出され、中和抗体も認められた。
【００４９】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、プラスミドｐ４６ＣｏａＭ（ｍａｓｓ）の模式図である。
【図２】図２は、プラスミドｐ４６ｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の模式図である。
【図３】図３は、プラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳ（ｍａｓｓ）の模式図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＰｍｄ５０Ｅ（ｍａｓｓ）ｍｄ５１ＧＦＰの模式図である。
【図５】図５は、プラスミドｐ４６ＣｏａＭｃｍｖＳｍｄ５０Ｅｍｄ５１ＧＦＰの模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子がプロモーターとともに、ゲノムに挿入された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。
【請求項２】
プロモーターが、サイトメガロウイルスの初期プロモーター、鶏βアクチン遺伝子のプロモーター、及びマレック病ウイルスのＵＬ５０遺伝子のプロモーターからなる群より選択されたものである請求項１記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルス。
【請求項３】
スパイク蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子が七面鳥ヘルペスウイルスのＵＬ４５とＵＬ４６のオープン・リーディング・フレームの間に挿入されたものである請求項１又は２記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載された組換え七面鳥ヘルペスウイルスを有効成分とする家禽用ワクチン。
【請求項１】
鶏伝染性気管支炎ウイルスのスパイク蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子がプロモーターとともに、ゲノムに挿入された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。
【請求項２】
プロモーターが、サイトメガロウイルスの初期プロモーター、鶏βアクチン遺伝子のプロモーター、及びマレック病ウイルスのＵＬ５０遺伝子のプロモーターからなる群より選択されたものである請求項１記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルス。
【請求項３】
スパイク蛋白質をコードする遺伝子、メンブレン蛋白質をコードする遺伝子、及びエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子が七面鳥ヘルペスウイルスのＵＬ４５とＵＬ４６のオープン・リーディング・フレームの間に挿入されたものである請求項１又は２記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載された組換え七面鳥ヘルペスウイルスを有効成分とする家禽用ワクチン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−１９５１３６（Ｐ２００９−１９５１３６Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３８６１４（Ｐ２００８−３８６１４）
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【出願人】（０００２２９１１７）日本ゼオン株式会社 (1,870)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【出願人】（０００２２９１１７）日本ゼオン株式会社 (1,870)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]