新規ガン関連抗体及び抗原並びにガンの診断におけるそれらの使用
本発明は、配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに対し特異性を有する抗体に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ガン関連抗体及び抗原並びにガンの診断におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、既知の通り、致死の疾患であり、そして種々の国々における複数の研究者による検査及び研究の対象となっている。多くの場合、癌は進行した段階で初めて診断され、そして治療されることが観察されており、この時点で癌細胞は既に身体の至る所に浸潤して転移している。乳癌、肺癌、結腸癌及び卵巣癌を有する６０％超の患者は既に隠れているか、あるいは明白な転移性のコロニーを有している。この段階で、治療方法は成功が限定的なものとなっている。前癌状態であっても初期段階で癌を検出することは、現在又は将来の治療方法が真の治癒についてより高い可能性を有しうることを意味する。
【０００３】
卵巣癌は、この臨床的なジレンマの最たる例である。卵巣癌の２／３以上の症例が進行期で検出され、この時点でがん細胞は卵巣から周囲に拡散しており、そして腹腔膜を通じて広がっている[Gure, A. O. Altorki, N. K. Stockert E, Scanlan M. J., Old LJ, & Chen Y.T. (1998) Cancer Res 58, 1034-1341]。この段階での疾患は進行しているが、特定の又は特徴的な症候が生じることは稀である。その結果、卵巣癌は通常進行期で処置される。その結果、５年生存率は最良の外科的介入又は化学療法的介入を受ける最終段階の患者で３５〜４０％である。
【０００４】
対照的に、卵巣癌が卵巣に尚も限局している時に（ステージＩ）検出された場合、常用の治療は高い５年生存率（９５％）をもたらす。従って、卵巣癌の初期の検出には特定の症候、特定のバイオマーカー及び正確で且つ信頼性のある診断による非侵襲的方法、が欠けている。
【０００５】
癌を処置する伝統的な方法には、非侵襲的又は低侵襲的(mild invasive)な診断試験、生検、組織学的検査、の使用が含まれる。しかしながら、これらの試験はそれぞれ独自の限界を持っており、それ故癌の新規な診断方法及び処置方法が求められている。
【０００６】
上述のことを踏まると、容易に入手可能な体液及び組織で測定可能な、有効な臨床上有用なバイオマーカーを提供することが望ましい。臨床プロテオミクスは、血清がタンパク質についての豊富な情報の宝庫であって、血液が定期的に体内を灌流及び浸出する血液に何が遭遇しているかという痕跡を含んでいるため、かかるバイオマーカーの発見に好適である。
【０００７】
しかしながら、今日まで、早期な疾患の検出のための癌関連のバイオマーカーについてのサーチは疾患の経過の結果として血液循環中に隠れている血液中の過剰発現タンパク質を探す「ワン・アット・ア・タイム」アプローチであった［Adam, B.L., Vlahou, A., Semmes, OJ. & Wright, G.L. Jr. (2001) Proteomic approaches to biomarker discovery in prostate and bladder cancers. Proteomics 1, 1264-1270; Carter, D. et al. (2002) Purification and characterization of the mammaglobin/lipophilin B complex, a promising diagnostic marker for breast cancer, Biochemistry 41, 6714-6722; Rosty, C. et al (2002) Identification of hepatocarcinoma- intestinepancreas/ pancreatitis-associated protein 1 as a biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma by protein biochip technology. Cancer Res. 62, 2868-1875; Xiao, Z. et al. (2001) Quantitation of serum prostate-specific membrane antigen by a novel protein biochip immunoassay discriminates benign from malignant prostate disease. Cancer Res. 61, 6029-6033; Kim, J. H. et al (2002) Osteopontin as a potential diagnostic biomarker for ovarian cancer. JAMA 287, 1671-1679］。このように、これまでの技術は、組織特異的であって、特定の型の癌の同定を助けるマーカーを提供していた。それらのいずれも汎用的なマーカーとして働くこともなければ、汎用的に応用することもできない。
【０００８】
従って、当業界には、汎用的な用途を有するマーカーとして使用することができ、その結果あらゆるタイプの癌を検出するのに有用たり得る診断試薬を提供する必要性が存在している。かかる要求を満たすために、本発明は、配列番号２、そのイソ型又は配列番号２を含んでなるポリペプチドに対する新規抗体、及び癌診断におけるその使用、を提供する。
【０００９】
本発明の目的
本発明の主な目的は、癌の検出に有用な新規の診断薬を提供することである。更なる目的として、癌の検出のためのキット及び方法の提供がある。
【００１０】
本発明の説明
本発明者は、自身のある研究の間、精子関連抗原９（sperm associated antigen 9 (SPAG9)）をコードする新規遺伝子［本明細書では配列番号１と称する］を、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることで発見した。２５２３ｂｐのｃＤＮＡ［Shankar, Mohapatra and Suri (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 243, 561-565; Ace. No: X91879］は、５つのダイレクトリピート、３つのミラーリピート、３つの考えられるステムループ構造及び３つのパリンドロームモチーフを含んでいる。オープンリーディングフレームは、７６６アミノ酸のタンパク質をコードしている。推定のタンパク質の解析により、１）特徴的なロイシンジッパーモチーフ（ＬＺ）；２）広範なコイルドコイルドメイン（コイル）及び３）膜貫通ドメイン（Ｔ）、という複数の特徴が明らかとなった。ＳＰＡＧ９のアミノ酸配列（本明細書では配列番号２と称する）によって更にＪＮＫ結合ドメインに対するその一次配列の同一性が明らかとなった。その二次構造解析により、配列番号２がα−へリックス構造を有することが明らかとなった。ＣＤスペクトル解析は更に配列番号２の支配的なα−へリックス構造を裏付けた。タンデム質量分析による組換え配列番号２のオリゴマー凝集体のマイクロシークエンシングにより、そのアミノ酸配列、及び８３．９ｋＤａという単一の原子量が確認された。この研究はまた、配列番号１及び２が精子と卵子の相互作用における役割を果たしていることを明らかにした。前記配列番号１は、特定の機能を有する精巣特異的遺伝子の新規ファミリーの一員として報告され、考えられる避妊の標的として考えられた。
【００１１】
その後、本発明者がＭＡＰＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路）及びこの経路へのタンパク質の関与についての幾つかの無関係の研究に取り組んでいた間、本発明者は驚くべきことに、配列番号２がＪＮＫシグナル伝達経路と相互作用していることを発見した。事実、これはＪＮＫ１と比較してＪＮＫ３及びＪＮＫ２に対しより高い結合親和性を有していた。ｐ３８α又はＥＲＫ経路との相互作用は観察されなかった。前記のＭＡＰＫの研究は、配列番号２の分子が細胞成長及び細胞増殖を支える細胞シグナル伝達経路に関与しうることを示唆している。このことにより、本発明者は、精巣もほぼ癌細胞の増殖に似た細胞の連続的な増殖に関与しているため、癌組織における配列番号２の役割を更に研究することに至った。
【００１２】
驚くべきことに、本発明者は、配列番号１のヌクレオチドと種々の癌組織のＥＳＴとの相同性を見出した。事実、配列番号１の組織分布を、異なる組織を用いて研究した時、本発明者は更に、配列番号１のｍＲＮＡが正常な精巣組織で排他的に発現していることを見出した。しかしながら、種々の癌患者由来の生体試料により、癌組織、例えば、肺癌、乳癌、胃癌、子宮癌、食道癌、結腸癌、卵巣癌、精巣癌、頸癌、皮膚癌、前立腺癌、口腔癌、膀胱癌、子宮内膜癌、腎癌、肝癌、脳癌、外陰癌、膣癌、胆嚢癌、眼癌及び骨癌における配列番号２の存在が明らかとなった。
【００１３】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者は、前述の癌組織で発現した配列番号２のポリペプチドが免疫系で非自己タンパク質として認識されうること、そして患者の自己抗体反応を開始して、癌患者の血流中を循環する抗配列番号２抗体を生じさせうると考えている。かかる抗体は癌の早期検出のための基礎を提供しうる。
【００１４】
抗配列番号２抗体
従って、１つの観点において、本発明は、配列番号２、又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチドについて特異性を有する新規抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。前記抗体は、配列番号２の前記ポリペプチドに対して特異性を有するＩｇＧ抗体又はＩｇＭ抗体あるいは前記抗体の一本鎖抗体又はフラグメントでありうる。
【００１５】
かかる抗体は、癌に罹患している対象において見られるようであるため、マーカーとして働く。本発明の前記抗体は、「抗配列番号２抗体」と命名され、そして以後そのようなものとして称される。前述の抗配列番号２抗体には、その抗原結合フラグメントが含まれる。用語「抗体」には、本明細書で使用する場合、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体が含まれる。
【００１６】
本発明はまた、ポリクローナル抗配列番号２抗体の産生方法であって：
−配列番号２の精製したポリペプチドを準備し、又は配列番号１の核酸配列のクローニング及び適当な宿主における発現により、組換えによって前記ポリペプチドを合成する工程；
−配列番号２とアジュバントを混合して組成物を得る段階、
−当該組成物を動物に注入して免疫反応を起こす工程、及び
−血清を当該動物から回収して、生成したポリクローナル抗体を単離する工程、
を含んで成る方法、も提供する。
【００１７】
上述の方法において、動物由来の血清は、直接使用するか、あるいは種々の方法、例えばプロテインＡセファロース、抗原セファロース又は抗マウスＩｇセファロースを利用するアフィニティークロマトグラフィーによって、使用する前に精製してもよい。
【００１８】
抗体検出キット：
別の観点において、本発明は、癌の疑いがあるか、又は癌に罹患している対象の生体試料中の癌の検出に有用なキットを提供する。前記キットは、固体マトリックスとカップリングした本明細書に記載の配列番号２のポリペプチド配列又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチド、及び取扱説明書、を含んで成る。本明細書で言及する固体マトリックスには、ニトロセルロースペーパー、スライドガラス、マイクロタイタープレート及びウェルが含まれうる。
【００１９】
更に別の観点において、本発明は、癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；及び
−配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドに対して生成した抗体の、前記試料中での存在であって、癌の指標となる存在を検出する工程、
を含んで成る方法、を提供する。
【００２０】
別の観点において、本発明は、癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；
−前記試料と上述のキットとを接触させ、そして配列番号２又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチドと、抗配列番号２抗体との結合が、前記生体試料中に存在している場合、検出可能なシグナルを通じて、癌の指標となる結合を決定する工程、
を含んで成る方法、を提供する。
【００２１】
本明細書で言及する検出可能なシグナルとは、任意な検出シグナル、例えば発色及び蛍光発生でありうる。例えば、二次標識抗体（酵素と複合した抗体）であって、患者の試料中に存在している場合、抗配列番号２抗体と結合し、そして癌の検出のパラメーターとして使用されうる検出可能なシグナルを提供しうる抗体、を導入してもよい。
【００２２】
抗原検出キット：
抗原検出キットは、配列番号２を有するポリペプチド又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドと特異性を有する抗体を含んで成る。当該キットは癌の検出に有用である。
【００２３】
更に別の観点において、本発明は、癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体組織を準備する工程；
−配列番号２のポリペプチド又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチドの、前記組織における存在であって、癌の指標となる存在を検出する段階、
を含んで成る方法を提供する。
【００２４】
別の観点において。本発明は、癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体組織を準備する工程；
−前記組織と前述の抗原検出キットとを接触させ、そして配列番号２［又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチド］を有するポリペプチド配列と抗配列番号２抗体との結合であって、癌の指標となるものを、検出可能なシグナルを通じて、決定する工程、
を含んで成る方法を提供する。
【００２５】
本明細書で言及する検出可能なシグナルとは、任意な検出シグナル、例えば発色及び蛍光発生でありうる。例えば、二次標識抗体（酵素と複合した抗体）であって、患者の試料中に存在している場合、抗配列番号２抗体と結合し、そして癌の検出のパラメーターとして使用されうる検出可能なシグナルを提供しうる抗体、を導入してもよい。更に別の例は、前記試料中で利用される抗配列番号２抗体が、それ自体標識抗体（色又は蛍光のために標識されている）でありうること、そして生成した検出可能なシグナルが癌の検出のパラメーターとして使用されうるということである。
【００２６】
用語「生体試料」は、本明細書で使用する場合、癌の疑いがあるか、あるいは癌に罹患している対象から得られる体液又は組織を指す。例として、血液、血清、血漿、組織試料、尿及び唾液が含まれる。更に、「癌」とは、本明細書で使用する場合、外胚葉、内胚葉又は中胚葉起源の癌を指す。前記癌は任意の癌でよく、例えば肺癌、乳癌、胃癌、子宮癌、食道癌、結腸癌、卵巣癌、精巣癌、頸癌、皮膚癌、前立腺癌、口腔癌、膀胱癌、子宮内膜癌、腎癌、肝癌、脳癌、血液癌、外陰癌、膣癌、胆嚢癌、眼癌及び骨癌である。上文で言及した「対象」には、あらゆる哺乳類が含まれる。
【００２７】
本発明の幾つかの態様を以下の実施例及び図面により説明する。
【００２８】
以下の実施例は、単なる例示を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の発明の概念との調和において可能性のある種々の改変及び変更が本発明の範囲内にあるものとみなされる。
【００２９】
実施例１：抗体検出キット−組換え配列番号２タンパク質の調製
出願人は、本発明の発見に基づいて複数の研究を行い、そしてこれまでに配列番号２ポリペプチドを同定した。これは以下のようなラージスケールの発現及び精製にとって適当なベクターにおいてクローニングした。
【００３０】
抗原の調製：プラスミドの構築
組換え配列番号２タンパク質（７６６アミノ酸をコードする完全なオープンリーディングフレーム）をｐＥＴ２８ｂ（＋）発現ベクターにおいてクローニングするのに成功した。要約すると、配列番号１の完全なオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡを、適当なプライマーを用いて増幅した。生成物を制限酵素で消化し、そしてマルチクローニングサイトを含む消化したｐＥＴ２８ｂ（＋）(Novagen, Madison, USA)内に挿入することでｐＥＴ２８ｂ−配列番号２が得られた。
【００３１】
エスケリッチャ・コリ(Escherichia coli)における配列番号２のタンパク質の発現
コンピテント細胞を調製し、そしてｐＥＴ２８ｂ−配列番号２で形質転換した。形質転換細胞を使用してＥ．コリ細胞培養のためのＬＢ培地に接種した。組換え配列番号２の発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で誘導し、そしてその後精製した。
【００３２】
エスケリッチャ・コリで発現した配列番号２の精製
配列番号２を発現しているＥ．コリ培養物を採集し、ウレアを含むソニケーションバッファーを用いて洗浄して超音波処理した。超音波処理した上精を、硫酸ニッケルを充填したアガロースビーズカラム上に載せた。当該カラムを洗浄バッファーで洗浄し、そして溶出液を、溶出緩衝液を用いて回収した。精製した配列番号２の組換えタンパク質は、質量分析計でアミノ酸配列について解析した。アミノ酸配列解析により、組換え配列番号２タンパク質が公開されている推定のアミノ酸配列(EMBL Acc. No. 91879, Shankar et al., 1998).として発現したことが明らかとなった。
【００３３】
抗体検出キット：
固体マトリックスと結合した配列番号２を含んで成る抗体検出キットを以下の通り調製する：
【００３４】
精製した配列番号２のタンパク質を少量、ニトロセルロース膜上に載せ、メタノールで固定し、そして風乾した。ディップスティックをトランスファーバッファー中に浸し、そして再び風乾した。ドットブロット解析は、ポリエステル基材とニトロセルロース膜から作られたディップスティックを用いて実施した。
【００３５】
異なる癌患者由来の種々の生体試料中の抗配列番号２抗体を決定するために、配列番号２でコーティングしたストリップを患者の体液、例えば血清中、続いて二次抗体としての抗ヒトＨＲＰＯ（商業的な供給源から購入した）中に浸した。ディップスティックを取り出し、そしてＰＢＳバッファーで洗浄した。最後に、前記ストリップを０．０５％の３，３’−ジアミノベンジデン（ＤＡＢ）(Sigma)で処理した。
【００３６】
ドットブロット解析において、ニトロセルロース膜上の暗褐色反応の出現は、抗配列番号２抗体が試料中に存在していることを示唆している。癌患者から得た試料と比較した場合、正常なヒトの対象から得た試料は全く反応を示さなかった。結果を図１に示す。
【００３７】
図１に示した通り、癌患者由来の生体試料は健康な対象と比較した場合強力な反応を示す。レーン１は正常なヒト由来の血清との反応を表しており、ここでは何ら発色が認められない。レーン２は、頚癌の血清との反応を表しており、レーン３は膀胱癌患者の血清の反応を示しており、レーン４は結腸癌患者から得た血清の反応を表しており、レーン５は乳癌の血清の反応を示しており、そしてレーン６は卵巣癌由来の血清の反応性である。レーン２〜６にあるような暗褐色の発色は癌の指標となる。
【００３８】
ゲル電気泳動及びウェスタンブロット
抗配列番号２抗体の生体試料中での存在はまた、組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で流し、そしてニトロセルロースマトリックス上にトランスファーするというウェスタンブロット手順で検出することができる。
【００３９】
組換え配列番号２タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で流した。要約すると、タンパク質溶液をサンプルバッファーで希釈した。この試料を続いてポリアクリルアミドゲルに載せた。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーした。ブロッキングした膜を癌患者の血清でプローブし、そして次に抗ヒトＨＲＰＯ（商業的な供給源から購入）を二次抗体としてプローブした。最後に、ストリップを０．０５％ＤＡＢで処理した。
【００４０】
癌に罹患している患者の試料のウェスタンブロット解析は、癌試料と組換え配列番号２タンパク質との強力な反応を示した。組換え配列番号２の強力なバンドが、癌患者の試料で処理したニトロセルロース膜のストリップ上で観察され、一方、正常なヒトの対象の試料は、反応を全く示さなかった。この結果をコントロールと患者の試料とを比較したウェスタンブロット解析の図２に示す。図２に示す通り、レーン１は分子量マーカーを表し、レーン２は正常人から入手した試料を表し、レーン３は口腔癌の対象から入手した試料であり、レーン４は膀胱癌、レーン５は肺癌、レーン６は前立腺癌、レーン７は子宮癌、レーン８は卵巣癌、レーン９は結腸癌、そしてレーン１０は乳癌のものである。ウェスタンブロット解析において見られうるように、レーン３〜１０は正常人のレーン２に存在しない１７０ｋＤａのバンドの存在を示している。
【００４１】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
更に、生体試料中の抗ＳＰＡＧＥＥ９抗体の存在も以下の通りＥＬＩＳＡ技術によって検出することができる：
【００４２】
マイクロタイタープレート(Nunc, Rosaklide, Denmark)を、ＥＬＩＳＡアッセイのために組換え配列番号２タンパク質でコーティングした。ブロッキングの後、プレートを癌患者及び／又は健常者のコントロール由来の試料とインキュベートした。結合した抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼと複合させた抗ヒト免疫グロブリン（商業的な供給源より入手した）により明らかになった。酵素の活性化は、基質として０．０５％のオルトフェニレンジアミンを用いて実施した。癌患者と健康なコントロールの個体の抗体の反応は、個体の試料の吸光度の平均として表した。
【００４３】
図３は、癌患者の生体試料及び健常人の生体試料における抗体のタイターを示すＥＬＩＳＡアッセイである。吸光度の値はＹ軸上に表し、一方、異なる癌のタイプをＸ軸上に数字で表す。（１）は、正常な対象由来の血清から得られたタイターを表し（２）は、頸癌,から得られたタイターを表し、（３）は膀胱癌に罹患している患者由来のタイター値を表し、（４）は胃腸管癌、（５）は卵巣癌のものである。試験試料のタイター値は、推定のＥＬＩＳＡタイターが健常人の生体試料の平均＋２ＳＤ超である場合に癌を示しているとみなされる。癌患者の生体試料は、図に示した通り、癌の指標となる（＋２ＳＤが標準的なカットオフ値）、健常な試料の平均＋２ＳＤ超のより高いＥＬＩＳＡタイター値を示した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
実施例２：抗原検出キット：
抗配列番号２抗体の調製：組換え配列番号２タンパク質によるラットの免疫化
抗配列番号２抗体を生成するために、成体の雌性ラットを利用した。ラットを最初で且つ２回のブースター注射により異なる間隔で、配列番号２タンパク質で免疫化した。最初の免疫化は、アジュバントと混合した配列番号２で行った。次のブースター注射を隔週で実施し、ラットを出血させ、そして血清を取り出した。
【００４６】
ラット血清からの抗配列番号２抗体の精製
前記血清は直接使用することもでき、又はプロテインビーズを利用したアフィニティークロマトグラフィー等の種々の方法によって使用前に精製することもできる。プロテインＡビーズを含むカラムにラットの血清を載せ、そしてシェーカー上で一晩維持した。カラムを延伸し、そしてフロースルーを回収した。続いて、カラムを結合バッファーで洗浄し、そして最終的に溶出液を遠心後に回収した。抗体の濃度は、２８０ｎｍのＯＤを採ることで算出した。
【００４７】
このように、組織中の配列番号２タンパク質の検出のための抗配列番号２抗体を含んで成る抗原検出キットを調製した：実施した免疫組織化学解析の詳細は以下の通りである：
【００４８】
癌患者由来の組織を、標準的な免疫組織化学の手順を用いて、標準的な固定液によって固定した。生体組織の切片をラット抗配列番号２抗体と一緒にインキュベートし、そして次に西洋ワサビペルオキシダーゼと複合したヤギ抗イムノグロブリン（商業的な供給源より入手）で処理した。洗浄後、切片を０．０１％ＤＡＢで処理し、そしてMayerのヘマトキシリンで対比染色した。
【００４９】
図４は、正常で健康なコントロール及び異なる癌患者から得られた組織を比較した免疫組織化学解析を表す。正常な組織は左のレーン内にあり、一方、癌組織は右側に表されている。
【００５０】
（Ａ）は正常な対象から得られた頸部組織の免疫組織化学解析であり、（Ａ１）は頸癌に罹患した対象から得られた組織であり；（Ｂ）は正常な間葉組織の免疫組織化学であり、そして（Ｂ１）は間葉癌に罹患した対象から得られた組織であり；（Ｃ）は正常な舌組織であり、そして（Ｃ１）は舌の癌組織であり；（Ｄ）は正常な皮膚組織であり、そして（Ｄ１）は皮膚癌組織である。
【００５１】
配列番号２と抗配列番号２抗体との強い反応性が癌組織において観察されたが、正常で健康なコントロール由来の組織は反応性を全く示さなかった。癌組織における茶色の発色は所定の対象における癌を示すものである。
【００５２】
試験試料：
複数の癌組織を配列番号２のタンパク質の発現について試験した結果を以下に記載する：
【００５３】
【表２】
【００５４】
抗配列番号２抗体と癌組織との強い反応性は、種々の癌細胞における配列番号２の発現を証明した。配列番号２は正常な精巣において排他的に発現しているため、精巣以外の組織における配列番号２の存在は、組織における悪性腫瘍の開始／発生を説明するものである。
【００５５】
配列番号１ ヌクレオチド配列
【表３】
【００５６】
配列番号２ アミノ酸配列
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、コントロールと患者の試料とを比較したドットブロット解析である。
【図２】図２は、コントロールと患者の試料とを比較したウェスタンブロット解析である。
【図３】図３は、癌患者の生態資料及び健常者の生体試料における抗体のタイターを示すＥＬＩＳＡアッセイである。
【図４】図４は、正常で健康なコントロール及び異なる癌患者から得られる組織を比較した免疫組織化学解析を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ガン関連抗体及び抗原並びにガンの診断におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、既知の通り、致死の疾患であり、そして種々の国々における複数の研究者による検査及び研究の対象となっている。多くの場合、癌は進行した段階で初めて診断され、そして治療されることが観察されており、この時点で癌細胞は既に身体の至る所に浸潤して転移している。乳癌、肺癌、結腸癌及び卵巣癌を有する６０％超の患者は既に隠れているか、あるいは明白な転移性のコロニーを有している。この段階で、治療方法は成功が限定的なものとなっている。前癌状態であっても初期段階で癌を検出することは、現在又は将来の治療方法が真の治癒についてより高い可能性を有しうることを意味する。
【０００３】
卵巣癌は、この臨床的なジレンマの最たる例である。卵巣癌の２／３以上の症例が進行期で検出され、この時点でがん細胞は卵巣から周囲に拡散しており、そして腹腔膜を通じて広がっている[Gure, A. O. Altorki, N. K. Stockert E, Scanlan M. J., Old LJ, & Chen Y.T. (1998) Cancer Res 58, 1034-1341]。この段階での疾患は進行しているが、特定の又は特徴的な症候が生じることは稀である。その結果、卵巣癌は通常進行期で処置される。その結果、５年生存率は最良の外科的介入又は化学療法的介入を受ける最終段階の患者で３５〜４０％である。
【０００４】
対照的に、卵巣癌が卵巣に尚も限局している時に（ステージＩ）検出された場合、常用の治療は高い５年生存率（９５％）をもたらす。従って、卵巣癌の初期の検出には特定の症候、特定のバイオマーカー及び正確で且つ信頼性のある診断による非侵襲的方法、が欠けている。
【０００５】
癌を処置する伝統的な方法には、非侵襲的又は低侵襲的(mild invasive)な診断試験、生検、組織学的検査、の使用が含まれる。しかしながら、これらの試験はそれぞれ独自の限界を持っており、それ故癌の新規な診断方法及び処置方法が求められている。
【０００６】
上述のことを踏まると、容易に入手可能な体液及び組織で測定可能な、有効な臨床上有用なバイオマーカーを提供することが望ましい。臨床プロテオミクスは、血清がタンパク質についての豊富な情報の宝庫であって、血液が定期的に体内を灌流及び浸出する血液に何が遭遇しているかという痕跡を含んでいるため、かかるバイオマーカーの発見に好適である。
【０００７】
しかしながら、今日まで、早期な疾患の検出のための癌関連のバイオマーカーについてのサーチは疾患の経過の結果として血液循環中に隠れている血液中の過剰発現タンパク質を探す「ワン・アット・ア・タイム」アプローチであった［Adam, B.L., Vlahou, A., Semmes, OJ. & Wright, G.L. Jr. (2001) Proteomic approaches to biomarker discovery in prostate and bladder cancers. Proteomics 1, 1264-1270; Carter, D. et al. (2002) Purification and characterization of the mammaglobin/lipophilin B complex, a promising diagnostic marker for breast cancer, Biochemistry 41, 6714-6722; Rosty, C. et al (2002) Identification of hepatocarcinoma- intestinepancreas/ pancreatitis-associated protein 1 as a biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma by protein biochip technology. Cancer Res. 62, 2868-1875; Xiao, Z. et al. (2001) Quantitation of serum prostate-specific membrane antigen by a novel protein biochip immunoassay discriminates benign from malignant prostate disease. Cancer Res. 61, 6029-6033; Kim, J. H. et al (2002) Osteopontin as a potential diagnostic biomarker for ovarian cancer. JAMA 287, 1671-1679］。このように、これまでの技術は、組織特異的であって、特定の型の癌の同定を助けるマーカーを提供していた。それらのいずれも汎用的なマーカーとして働くこともなければ、汎用的に応用することもできない。
【０００８】
従って、当業界には、汎用的な用途を有するマーカーとして使用することができ、その結果あらゆるタイプの癌を検出するのに有用たり得る診断試薬を提供する必要性が存在している。かかる要求を満たすために、本発明は、配列番号２、そのイソ型又は配列番号２を含んでなるポリペプチドに対する新規抗体、及び癌診断におけるその使用、を提供する。
【０００９】
本発明の目的
本発明の主な目的は、癌の検出に有用な新規の診断薬を提供することである。更なる目的として、癌の検出のためのキット及び方法の提供がある。
【００１０】
本発明の説明
本発明者は、自身のある研究の間、精子関連抗原９（sperm associated antigen 9 (SPAG9)）をコードする新規遺伝子［本明細書では配列番号１と称する］を、ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることで発見した。２５２３ｂｐのｃＤＮＡ［Shankar, Mohapatra and Suri (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 243, 561-565; Ace. No: X91879］は、５つのダイレクトリピート、３つのミラーリピート、３つの考えられるステムループ構造及び３つのパリンドロームモチーフを含んでいる。オープンリーディングフレームは、７６６アミノ酸のタンパク質をコードしている。推定のタンパク質の解析により、１）特徴的なロイシンジッパーモチーフ（ＬＺ）；２）広範なコイルドコイルドメイン（コイル）及び３）膜貫通ドメイン（Ｔ）、という複数の特徴が明らかとなった。ＳＰＡＧ９のアミノ酸配列（本明細書では配列番号２と称する）によって更にＪＮＫ結合ドメインに対するその一次配列の同一性が明らかとなった。その二次構造解析により、配列番号２がα−へリックス構造を有することが明らかとなった。ＣＤスペクトル解析は更に配列番号２の支配的なα−へリックス構造を裏付けた。タンデム質量分析による組換え配列番号２のオリゴマー凝集体のマイクロシークエンシングにより、そのアミノ酸配列、及び８３．９ｋＤａという単一の原子量が確認された。この研究はまた、配列番号１及び２が精子と卵子の相互作用における役割を果たしていることを明らかにした。前記配列番号１は、特定の機能を有する精巣特異的遺伝子の新規ファミリーの一員として報告され、考えられる避妊の標的として考えられた。
【００１１】
その後、本発明者がＭＡＰＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路）及びこの経路へのタンパク質の関与についての幾つかの無関係の研究に取り組んでいた間、本発明者は驚くべきことに、配列番号２がＪＮＫシグナル伝達経路と相互作用していることを発見した。事実、これはＪＮＫ１と比較してＪＮＫ３及びＪＮＫ２に対しより高い結合親和性を有していた。ｐ３８α又はＥＲＫ経路との相互作用は観察されなかった。前記のＭＡＰＫの研究は、配列番号２の分子が細胞成長及び細胞増殖を支える細胞シグナル伝達経路に関与しうることを示唆している。このことにより、本発明者は、精巣もほぼ癌細胞の増殖に似た細胞の連続的な増殖に関与しているため、癌組織における配列番号２の役割を更に研究することに至った。
【００１２】
驚くべきことに、本発明者は、配列番号１のヌクレオチドと種々の癌組織のＥＳＴとの相同性を見出した。事実、配列番号１の組織分布を、異なる組織を用いて研究した時、本発明者は更に、配列番号１のｍＲＮＡが正常な精巣組織で排他的に発現していることを見出した。しかしながら、種々の癌患者由来の生体試料により、癌組織、例えば、肺癌、乳癌、胃癌、子宮癌、食道癌、結腸癌、卵巣癌、精巣癌、頸癌、皮膚癌、前立腺癌、口腔癌、膀胱癌、子宮内膜癌、腎癌、肝癌、脳癌、外陰癌、膣癌、胆嚢癌、眼癌及び骨癌における配列番号２の存在が明らかとなった。
【００１３】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者は、前述の癌組織で発現した配列番号２のポリペプチドが免疫系で非自己タンパク質として認識されうること、そして患者の自己抗体反応を開始して、癌患者の血流中を循環する抗配列番号２抗体を生じさせうると考えている。かかる抗体は癌の早期検出のための基礎を提供しうる。
【００１４】
抗配列番号２抗体
従って、１つの観点において、本発明は、配列番号２、又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチドについて特異性を有する新規抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。前記抗体は、配列番号２の前記ポリペプチドに対して特異性を有するＩｇＧ抗体又はＩｇＭ抗体あるいは前記抗体の一本鎖抗体又はフラグメントでありうる。
【００１５】
かかる抗体は、癌に罹患している対象において見られるようであるため、マーカーとして働く。本発明の前記抗体は、「抗配列番号２抗体」と命名され、そして以後そのようなものとして称される。前述の抗配列番号２抗体には、その抗原結合フラグメントが含まれる。用語「抗体」には、本明細書で使用する場合、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体が含まれる。
【００１６】
本発明はまた、ポリクローナル抗配列番号２抗体の産生方法であって：
−配列番号２の精製したポリペプチドを準備し、又は配列番号１の核酸配列のクローニング及び適当な宿主における発現により、組換えによって前記ポリペプチドを合成する工程；
−配列番号２とアジュバントを混合して組成物を得る段階、
−当該組成物を動物に注入して免疫反応を起こす工程、及び
−血清を当該動物から回収して、生成したポリクローナル抗体を単離する工程、
を含んで成る方法、も提供する。
【００１７】
上述の方法において、動物由来の血清は、直接使用するか、あるいは種々の方法、例えばプロテインＡセファロース、抗原セファロース又は抗マウスＩｇセファロースを利用するアフィニティークロマトグラフィーによって、使用する前に精製してもよい。
【００１８】
抗体検出キット：
別の観点において、本発明は、癌の疑いがあるか、又は癌に罹患している対象の生体試料中の癌の検出に有用なキットを提供する。前記キットは、固体マトリックスとカップリングした本明細書に記載の配列番号２のポリペプチド配列又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチド、及び取扱説明書、を含んで成る。本明細書で言及する固体マトリックスには、ニトロセルロースペーパー、スライドガラス、マイクロタイタープレート及びウェルが含まれうる。
【００１９】
更に別の観点において、本発明は、癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；及び
−配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドに対して生成した抗体の、前記試料中での存在であって、癌の指標となる存在を検出する工程、
を含んで成る方法、を提供する。
【００２０】
別の観点において、本発明は、癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；
−前記試料と上述のキットとを接触させ、そして配列番号２又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチドと、抗配列番号２抗体との結合が、前記生体試料中に存在している場合、検出可能なシグナルを通じて、癌の指標となる結合を決定する工程、
を含んで成る方法、を提供する。
【００２１】
本明細書で言及する検出可能なシグナルとは、任意な検出シグナル、例えば発色及び蛍光発生でありうる。例えば、二次標識抗体（酵素と複合した抗体）であって、患者の試料中に存在している場合、抗配列番号２抗体と結合し、そして癌の検出のパラメーターとして使用されうる検出可能なシグナルを提供しうる抗体、を導入してもよい。
【００２２】
抗原検出キット：
抗原検出キットは、配列番号２を有するポリペプチド又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドと特異性を有する抗体を含んで成る。当該キットは癌の検出に有用である。
【００２３】
更に別の観点において、本発明は、癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体組織を準備する工程；
−配列番号２のポリペプチド又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチドの、前記組織における存在であって、癌の指標となる存在を検出する段階、
を含んで成る方法を提供する。
【００２４】
別の観点において。本発明は、癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体組織を準備する工程；
−前記組織と前述の抗原検出キットとを接触させ、そして配列番号２［又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチド］を有するポリペプチド配列と抗配列番号２抗体との結合であって、癌の指標となるものを、検出可能なシグナルを通じて、決定する工程、
を含んで成る方法を提供する。
【００２５】
本明細書で言及する検出可能なシグナルとは、任意な検出シグナル、例えば発色及び蛍光発生でありうる。例えば、二次標識抗体（酵素と複合した抗体）であって、患者の試料中に存在している場合、抗配列番号２抗体と結合し、そして癌の検出のパラメーターとして使用されうる検出可能なシグナルを提供しうる抗体、を導入してもよい。更に別の例は、前記試料中で利用される抗配列番号２抗体が、それ自体標識抗体（色又は蛍光のために標識されている）でありうること、そして生成した検出可能なシグナルが癌の検出のパラメーターとして使用されうるということである。
【００２６】
用語「生体試料」は、本明細書で使用する場合、癌の疑いがあるか、あるいは癌に罹患している対象から得られる体液又は組織を指す。例として、血液、血清、血漿、組織試料、尿及び唾液が含まれる。更に、「癌」とは、本明細書で使用する場合、外胚葉、内胚葉又は中胚葉起源の癌を指す。前記癌は任意の癌でよく、例えば肺癌、乳癌、胃癌、子宮癌、食道癌、結腸癌、卵巣癌、精巣癌、頸癌、皮膚癌、前立腺癌、口腔癌、膀胱癌、子宮内膜癌、腎癌、肝癌、脳癌、血液癌、外陰癌、膣癌、胆嚢癌、眼癌及び骨癌である。上文で言及した「対象」には、あらゆる哺乳類が含まれる。
【００２７】
本発明の幾つかの態様を以下の実施例及び図面により説明する。
【００２８】
以下の実施例は、単なる例示を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の発明の概念との調和において可能性のある種々の改変及び変更が本発明の範囲内にあるものとみなされる。
【００２９】
実施例１：抗体検出キット−組換え配列番号２タンパク質の調製
出願人は、本発明の発見に基づいて複数の研究を行い、そしてこれまでに配列番号２ポリペプチドを同定した。これは以下のようなラージスケールの発現及び精製にとって適当なベクターにおいてクローニングした。
【００３０】
抗原の調製：プラスミドの構築
組換え配列番号２タンパク質（７６６アミノ酸をコードする完全なオープンリーディングフレーム）をｐＥＴ２８ｂ（＋）発現ベクターにおいてクローニングするのに成功した。要約すると、配列番号１の完全なオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡを、適当なプライマーを用いて増幅した。生成物を制限酵素で消化し、そしてマルチクローニングサイトを含む消化したｐＥＴ２８ｂ（＋）(Novagen, Madison, USA)内に挿入することでｐＥＴ２８ｂ−配列番号２が得られた。
【００３１】
エスケリッチャ・コリ(Escherichia coli)における配列番号２のタンパク質の発現
コンピテント細胞を調製し、そしてｐＥＴ２８ｂ−配列番号２で形質転換した。形質転換細胞を使用してＥ．コリ細胞培養のためのＬＢ培地に接種した。組換え配列番号２の発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で誘導し、そしてその後精製した。
【００３２】
エスケリッチャ・コリで発現した配列番号２の精製
配列番号２を発現しているＥ．コリ培養物を採集し、ウレアを含むソニケーションバッファーを用いて洗浄して超音波処理した。超音波処理した上精を、硫酸ニッケルを充填したアガロースビーズカラム上に載せた。当該カラムを洗浄バッファーで洗浄し、そして溶出液を、溶出緩衝液を用いて回収した。精製した配列番号２の組換えタンパク質は、質量分析計でアミノ酸配列について解析した。アミノ酸配列解析により、組換え配列番号２タンパク質が公開されている推定のアミノ酸配列(EMBL Acc. No. 91879, Shankar et al., 1998).として発現したことが明らかとなった。
【００３３】
抗体検出キット：
固体マトリックスと結合した配列番号２を含んで成る抗体検出キットを以下の通り調製する：
【００３４】
精製した配列番号２のタンパク質を少量、ニトロセルロース膜上に載せ、メタノールで固定し、そして風乾した。ディップスティックをトランスファーバッファー中に浸し、そして再び風乾した。ドットブロット解析は、ポリエステル基材とニトロセルロース膜から作られたディップスティックを用いて実施した。
【００３５】
異なる癌患者由来の種々の生体試料中の抗配列番号２抗体を決定するために、配列番号２でコーティングしたストリップを患者の体液、例えば血清中、続いて二次抗体としての抗ヒトＨＲＰＯ（商業的な供給源から購入した）中に浸した。ディップスティックを取り出し、そしてＰＢＳバッファーで洗浄した。最後に、前記ストリップを０．０５％の３，３’−ジアミノベンジデン（ＤＡＢ）(Sigma)で処理した。
【００３６】
ドットブロット解析において、ニトロセルロース膜上の暗褐色反応の出現は、抗配列番号２抗体が試料中に存在していることを示唆している。癌患者から得た試料と比較した場合、正常なヒトの対象から得た試料は全く反応を示さなかった。結果を図１に示す。
【００３７】
図１に示した通り、癌患者由来の生体試料は健康な対象と比較した場合強力な反応を示す。レーン１は正常なヒト由来の血清との反応を表しており、ここでは何ら発色が認められない。レーン２は、頚癌の血清との反応を表しており、レーン３は膀胱癌患者の血清の反応を示しており、レーン４は結腸癌患者から得た血清の反応を表しており、レーン５は乳癌の血清の反応を示しており、そしてレーン６は卵巣癌由来の血清の反応性である。レーン２〜６にあるような暗褐色の発色は癌の指標となる。
【００３８】
ゲル電気泳動及びウェスタンブロット
抗配列番号２抗体の生体試料中での存在はまた、組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で流し、そしてニトロセルロースマトリックス上にトランスファーするというウェスタンブロット手順で検出することができる。
【００３９】
組換え配列番号２タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で流した。要約すると、タンパク質溶液をサンプルバッファーで希釈した。この試料を続いてポリアクリルアミドゲルに載せた。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーした。ブロッキングした膜を癌患者の血清でプローブし、そして次に抗ヒトＨＲＰＯ（商業的な供給源から購入）を二次抗体としてプローブした。最後に、ストリップを０．０５％ＤＡＢで処理した。
【００４０】
癌に罹患している患者の試料のウェスタンブロット解析は、癌試料と組換え配列番号２タンパク質との強力な反応を示した。組換え配列番号２の強力なバンドが、癌患者の試料で処理したニトロセルロース膜のストリップ上で観察され、一方、正常なヒトの対象の試料は、反応を全く示さなかった。この結果をコントロールと患者の試料とを比較したウェスタンブロット解析の図２に示す。図２に示す通り、レーン１は分子量マーカーを表し、レーン２は正常人から入手した試料を表し、レーン３は口腔癌の対象から入手した試料であり、レーン４は膀胱癌、レーン５は肺癌、レーン６は前立腺癌、レーン７は子宮癌、レーン８は卵巣癌、レーン９は結腸癌、そしてレーン１０は乳癌のものである。ウェスタンブロット解析において見られうるように、レーン３〜１０は正常人のレーン２に存在しない１７０ｋＤａのバンドの存在を示している。
【００４１】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
更に、生体試料中の抗ＳＰＡＧＥＥ９抗体の存在も以下の通りＥＬＩＳＡ技術によって検出することができる：
【００４２】
マイクロタイタープレート(Nunc, Rosaklide, Denmark)を、ＥＬＩＳＡアッセイのために組換え配列番号２タンパク質でコーティングした。ブロッキングの後、プレートを癌患者及び／又は健常者のコントロール由来の試料とインキュベートした。結合した抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼと複合させた抗ヒト免疫グロブリン（商業的な供給源より入手した）により明らかになった。酵素の活性化は、基質として０．０５％のオルトフェニレンジアミンを用いて実施した。癌患者と健康なコントロールの個体の抗体の反応は、個体の試料の吸光度の平均として表した。
【００４３】
図３は、癌患者の生体試料及び健常人の生体試料における抗体のタイターを示すＥＬＩＳＡアッセイである。吸光度の値はＹ軸上に表し、一方、異なる癌のタイプをＸ軸上に数字で表す。（１）は、正常な対象由来の血清から得られたタイターを表し（２）は、頸癌,から得られたタイターを表し、（３）は膀胱癌に罹患している患者由来のタイター値を表し、（４）は胃腸管癌、（５）は卵巣癌のものである。試験試料のタイター値は、推定のＥＬＩＳＡタイターが健常人の生体試料の平均＋２ＳＤ超である場合に癌を示しているとみなされる。癌患者の生体試料は、図に示した通り、癌の指標となる（＋２ＳＤが標準的なカットオフ値）、健常な試料の平均＋２ＳＤ超のより高いＥＬＩＳＡタイター値を示した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
実施例２：抗原検出キット：
抗配列番号２抗体の調製：組換え配列番号２タンパク質によるラットの免疫化
抗配列番号２抗体を生成するために、成体の雌性ラットを利用した。ラットを最初で且つ２回のブースター注射により異なる間隔で、配列番号２タンパク質で免疫化した。最初の免疫化は、アジュバントと混合した配列番号２で行った。次のブースター注射を隔週で実施し、ラットを出血させ、そして血清を取り出した。
【００４６】
ラット血清からの抗配列番号２抗体の精製
前記血清は直接使用することもでき、又はプロテインビーズを利用したアフィニティークロマトグラフィー等の種々の方法によって使用前に精製することもできる。プロテインＡビーズを含むカラムにラットの血清を載せ、そしてシェーカー上で一晩維持した。カラムを延伸し、そしてフロースルーを回収した。続いて、カラムを結合バッファーで洗浄し、そして最終的に溶出液を遠心後に回収した。抗体の濃度は、２８０ｎｍのＯＤを採ることで算出した。
【００４７】
このように、組織中の配列番号２タンパク質の検出のための抗配列番号２抗体を含んで成る抗原検出キットを調製した：実施した免疫組織化学解析の詳細は以下の通りである：
【００４８】
癌患者由来の組織を、標準的な免疫組織化学の手順を用いて、標準的な固定液によって固定した。生体組織の切片をラット抗配列番号２抗体と一緒にインキュベートし、そして次に西洋ワサビペルオキシダーゼと複合したヤギ抗イムノグロブリン（商業的な供給源より入手）で処理した。洗浄後、切片を０．０１％ＤＡＢで処理し、そしてMayerのヘマトキシリンで対比染色した。
【００４９】
図４は、正常で健康なコントロール及び異なる癌患者から得られた組織を比較した免疫組織化学解析を表す。正常な組織は左のレーン内にあり、一方、癌組織は右側に表されている。
【００５０】
（Ａ）は正常な対象から得られた頸部組織の免疫組織化学解析であり、（Ａ１）は頸癌に罹患した対象から得られた組織であり；（Ｂ）は正常な間葉組織の免疫組織化学であり、そして（Ｂ１）は間葉癌に罹患した対象から得られた組織であり；（Ｃ）は正常な舌組織であり、そして（Ｃ１）は舌の癌組織であり；（Ｄ）は正常な皮膚組織であり、そして（Ｄ１）は皮膚癌組織である。
【００５１】
配列番号２と抗配列番号２抗体との強い反応性が癌組織において観察されたが、正常で健康なコントロール由来の組織は反応性を全く示さなかった。癌組織における茶色の発色は所定の対象における癌を示すものである。
【００５２】
試験試料：
複数の癌組織を配列番号２のタンパク質の発現について試験した結果を以下に記載する：
【００５３】
【表２】
【００５４】
抗配列番号２抗体と癌組織との強い反応性は、種々の癌細胞における配列番号２の発現を証明した。配列番号２は正常な精巣において排他的に発現しているため、精巣以外の組織における配列番号２の存在は、組織における悪性腫瘍の開始／発生を説明するものである。
【００５５】
配列番号１ ヌクレオチド配列
【表３】
【００５６】
配列番号２ アミノ酸配列
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、コントロールと患者の試料とを比較したドットブロット解析である。
【図２】図２は、コントロールと患者の試料とを比較したウェスタンブロット解析である。
【図３】図３は、癌患者の生態資料及び健常者の生体試料における抗体のタイターを示すＥＬＩＳＡアッセイである。
【図４】図４は、正常で健康なコントロール及び異なる癌患者から得られる組織を比較した免疫組織化学解析を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに対し特異性を有する抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体又は組換え抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドのアミノ酸配列から成るポリペプチドに対し特異性を有する抗体のフラグメント。
【請求項４】
請求項３に記載の抗体フラグメントの一本鎖。
【請求項５】
ＩｇＧ抗体又はＩｇＭ抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
癌の疑いがあるか、又は癌に罹患している対象の生体試料中の癌の検出のためのキットであって、固体マトリックスと任意にカップリングした配列番号２又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチドを有するポリペプチド配列、及び取扱説明書、を含んで成るキット。
【請求項７】
固体マトリックスがニトロセルロースペーパー、スライドガラス、マイクロタイタープレート及びウェルを含んで成る、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
癌の疑いがあるか、又は癌に罹患している対象の生体試料中の癌の検出のためのキットであって、請求項１及び３に記載の抗体又はフラグメントを含んで成るキット。
【請求項９】
前記抗体が標識抗体である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；及び
−配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドに対して生成した抗体の、前記試料中での存在を検出する工程、
を含んで成り、
前記抗体の存在が癌の指標となる、方法。
【請求項１１】
癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；及び
当該試料中の配列番号２のポリペプチド又はイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチド配列の存在を検出する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１２】
癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；
−前記試料と請求項６に記載のキットとを接触する工程、
−配列番号２又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチドと抗体との結合を、癌の指標となる検出可能なシグナルを通じて決定する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１３】
癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；
−前記組織と請求項８に記載のキットとを接触させる工程及び
−配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチド配列と、前記ポリペプチドに対して生成した抗体との結合を、癌の指標となる検出可能なシグナルを通じて決定する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１４】
前記癌が外胚葉、内胚葉又は中胚葉起源の癌である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
前記癌が、肺癌、乳癌、胃癌、食道癌、結腸癌、卵巣癌、精巣癌、頸癌、皮膚癌、前立腺癌、口腔癌、膀胱癌、肝癌、子宮内膜癌、腎癌、脳癌、外陰癌、膣癌、胆嚢癌、眼癌及び骨癌のいずれかである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
対象が哺乳類である、請求項１０、１１、１２又は１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
実質的に本明細書に記載し、そして例示した癌の検出のための抗配列番号２抗体、抗体及び抗原検出キット並びに癌の検出のための方法。
【請求項１】
配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドのアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドに対し特異性を有する抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体又は組換え抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドのアミノ酸配列から成るポリペプチドに対し特異性を有する抗体のフラグメント。
【請求項４】
請求項３に記載の抗体フラグメントの一本鎖。
【請求項５】
ＩｇＧ抗体又はＩｇＭ抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
癌の疑いがあるか、又は癌に罹患している対象の生体試料中の癌の検出のためのキットであって、固体マトリックスと任意にカップリングした配列番号２又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチドを有するポリペプチド配列、及び取扱説明書、を含んで成るキット。
【請求項７】
固体マトリックスがニトロセルロースペーパー、スライドガラス、マイクロタイタープレート及びウェルを含んで成る、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
癌の疑いがあるか、又は癌に罹患している対象の生体試料中の癌の検出のためのキットであって、請求項１及び３に記載の抗体又はフラグメントを含んで成るキット。
【請求項９】
前記抗体が標識抗体である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；及び
−配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチドに対して生成した抗体の、前記試料中での存在を検出する工程、
を含んで成り、
前記抗体の存在が癌の指標となる、方法。
【請求項１１】
癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；及び
当該試料中の配列番号２のポリペプチド又はイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチド配列の存在を検出する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１２】
癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；
−前記試料と請求項６に記載のキットとを接触する工程、
−配列番号２又はそのイソ型あるいは前記配列番号２を含んで成るポリペプチドと抗体との結合を、癌の指標となる検出可能なシグナルを通じて決定する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１３】
癌に罹患しているか、又は癌に罹患している疑いのある対象の癌を検出するための方法であって：
−癌の疑いのある対象の生体試料を準備する工程；
−前記組織と請求項８に記載のキットとを接触させる工程及び
−配列番号２又はそのイソ型あるいは配列番号２を含んで成るポリペプチド配列と、前記ポリペプチドに対して生成した抗体との結合を、癌の指標となる検出可能なシグナルを通じて決定する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１４】
前記癌が外胚葉、内胚葉又は中胚葉起源の癌である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
前記癌が、肺癌、乳癌、胃癌、食道癌、結腸癌、卵巣癌、精巣癌、頸癌、皮膚癌、前立腺癌、口腔癌、膀胱癌、肝癌、子宮内膜癌、腎癌、脳癌、外陰癌、膣癌、胆嚢癌、眼癌及び骨癌のいずれかである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
対象が哺乳類である、請求項１０、１１、１２又は１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
実質的に本明細書に記載し、そして例示した癌の検出のための抗配列番号２抗体、抗体及び抗原検出キット並びに癌の検出のための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５１５８７１（Ｐ２００８−５１５８７１Ａ）
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３５２６４（Ｐ２００７−５３５２６４）
【出願日】平成１７年１０月７日（２００５．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２９７２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３８１０１
【国際公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【出願人】（５９６１８４３４０）ナショナル インスティテュート オブ イミュノロジー (3)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月７日（２００５．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２９７２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３８１０１
【国際公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【出願人】（５９６１８４３４０）ナショナル インスティテュート オブ イミュノロジー (3)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ
【Ｆターム（参考）】
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