新規タンパク質、それをコードする遺伝子及びそれらの利用法
【課題】 本発明は、比較的低濃度でイネの２大病害であるいもち病菌や紋枯病菌などの植物病原菌の生長を抑止できる新規な抗菌タンパク質を検索、同定し、さらに当該タンパク質の遺伝子をクローニングすることを目的とする。
【解決手段】 本発明によれば、タモギタケの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分子量が約１５ｋＤａの成分の存在を示す、抗菌タンパク質、および当該タンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの利用法が提供される。
【解決手段】 本発明によれば、タモギタケの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分子量が約１５ｋＤａの成分の存在を示す、抗菌タンパク質、および当該タンパク質をコードする遺伝子並びにそれらの利用法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗菌活性を有する新規なタンパク質とその製造法、それをコードする遺伝子、及び上記タンパク質及び遺伝子の利用法に関するものである。詳細には、本発明は、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有するタモギタケ由来タンパク質、上記タンパク質をコードする遺伝子、並びに上記タンパク質及び上記遺伝子の利用法に関する。
【０００２】
本出願は、２００１年３月１２日に提出された日本特許出願 特願２００１−６８８９４号を基礎とする優先権主張出願である。当該日本特許出願の内容は全て本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
従来、植物病原菌に対して抗菌活性のある植物のタンパク質として、キチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼなどの溶菌酵素が知られている。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、これらの酵素は単独でも効果があるが（Ｓｃｈｌｕｍｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：ｐ．３６５−３６７）、一般に２種類以上の酵素を組み合わせることにより、より高い効果が出ることが知られている（Ｍａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８８：ｐ．９３６−９４２）。これら溶菌酵素が糸状菌の生育を抑制する濃度は一般的には、単独の場合数十〜数百μｇ／ｍｌ程度、組み合わせの場合でも各々数μｇ／ｍｌ程度を必要とすることが知られている。しかしながら、これらの溶菌酵素の中で、イネの重要病害であるいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に対して抗菌的に働くことが証明されたものは未だ報告されていない。
【０００４】
一方、ディフェンシンをはじめとする小分子量ＡＦＰ（Ａｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）も抗微生物活性をもつ。このうちイネのいもち病菌に抗菌的に働くものとして、Ｃａ−ＡＭＰ１（特表平８−５０５０４８）、ＣＢ−１（Ｏｉｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０：ｐ．４８１−４８３）、Ｒｓ−ＡＦＰ１とＲｓ−ＡＦＰ２（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：ｐ．１５３０１−１５３０９）、及びＡｃｅ−ＡＭＰ１（特表平９−５０１４２４）が報告されている。これらの低分子のペプチドは数μｇ／ｍｌ程度で上記病原菌を含む各種の植物病原菌の生育を５０％阻害する。
【０００５】
溶菌酵素あるいは低分子量抗菌ペプチドの遺伝子を単離、植物に導入し、病害抵抗性植物を作出しようという試みもなされている（Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：ｐ．１１９４−１１９７；Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：ｐ．５７３−５８８）。イネにおける研究では、最近イネ由来キチナーゼを過剰発現した形質転換イネのいもち病抵抗性が増強されたことが報告された（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９９：３８３−３９０）。
【０００６】
これらの他に遺伝子導入による病原菌抵抗性植物の作出例として、ＰＲタンパク質（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：ｐ．７３２７−７３３１）、グルコースオキシダーゼ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：ｐ．１３５７−１３６８）、スチルベンシンターゼ（Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６１：ｐ．１５３−１５６）などが報告されている。
【０００７】
しかし、現状では、必ずしも実用化レベルの抵抗性を付与された植物体が得られていないことが多い。この理由としては、導入した遺伝子の発現レベルが低いことがあげられるが、より本質的には、これまでに報告されている抗菌タンパク質自体の抗菌力が低いことによるものと考えられる。従って、従来の抗菌タンパク質よりさらに強力な抗菌タンパク質を同定して利用を図ることが望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の開示
本発明の目的の１つは、比較的低濃度でイネの重要病害であるいもち病菌をはじめとする様々な植物病原菌の生長を抑止できる新規な抗菌タンパク質を検索、同定することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、上記の新規タンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、その塩基配列を特定することである。
本発明のさらに別の目的は、本発明の遺伝子を宿主生物（微生物、動物または植物など）に導入して形質転換体を作出し、本発明の遺伝子の利用を図ることである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、本発明の抗菌タンパク質を含む抗菌剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の詳細な説明
上記課題を解決することを目的として、本発明者らは、先ず、いもち病菌に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性を検定するためのアッセイ系を確立した。
【００１２】
さらに、食用キノコの一つであるタモギタケからタンパク質を抽出し、イオン交換カラム、ゲル濾過カラムを組み合わせ、各画分を上記抗菌アッセイに供試することにより、抗菌タンパク画分を同定、抗菌タンパクを分離・精製した。さらに精製タンパクの部分アミノ酸配列を決定し、これをもとにオリゴＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲにより当該タンパクをコードする部分長ｃＤＮＡを得た。次いで、この部分長ｃＤＮＡををプローブとしてタモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより当該タンパクをコードする完全長のｃＤＮＡを同定し、全塩基配列を決定した。こうしてタモギタケ抗菌タンパクの全アミノ酸配列と、それをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を同定し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明の第１の側面によれば、タモギタケの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分子量が約１５ｋＤａである、抗菌タンパク質が提供される。
【００１４】
本発明の抗菌タンパク質は典型的には、本明細書中の配列表の配列番号２で表される１４３個のアミノ酸配列で特徴づけられる。本タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量がおよそ１５ｋＤａ（本明細書において後述する配列表の配列番号２の配列のうち第８番目から第１４３番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドに相当）と見積もられるポリペプチドが一つのユニットとなっている。また本タンパク質は、ゲル濾過カラムで分子量が約３０ｋＤａであることを特徴とするタンパク質として同定された。
【００１５】
本発明の抗菌タンパク質はまた、配列表の配列番号４で表される１４１個のアミノ酸を有するタンパク質を含む。配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質も、前記配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量がおよそ１５ｋＤａと見積もられるポリペプチドが一つのユニットとなっており、ゲル濾過カラムで分子量が約３０ｋＤａである。
【００１６】
本発明の抗菌タンパク質は、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列のみでなく、当該配列において１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列若しくはこの配列と５２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す抗菌タンパク質も含む。
【００１７】
本発明の抗菌タンパク質は、好ましくは、配列表の配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と５２％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１８】
本発明の抗菌タンパク質に関して、各々の具体的アミノ酸配列と「５２％以上の相同性を有するタンパク質」という定義は、少なくとも５２％の相同性を有していればよいことを意味するが、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が意図される。
【００１９】
本発明の第２の側面によれば、配列表の配列番号２又は４の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、例えば、配列番号２の部分アミノ酸配列８−１４３又は配列番号４の部分アミノ酸配列８−１４１からなるポリペプチド；並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に１〜複数個のアミノ酸変異を有するポリペプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと５２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリペプチド；の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質が提供される。
【００２０】
本発明の第３の側面によれば、タモギタケの水性抽出液から硫安７５％飽和を使用する硫安沈殿法で沈殿する画分を回収する工程；および
上記画分をイオン交換クロマトグラフィーにかけＮａＣｌ濃度５０ｍＭから６００ｍＭの濃度で溶出する画分を回収する工程；
を含む、本発明の抗菌タンパク質の製造方法が提供される。
【００２１】
本発明の第４の側面によれば、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の遺伝子は、典型的には、配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列（以下、本明細書中、単に「配列番号１又は３の塩基配列」という場合もある）、上記塩基配列中に１〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する。
【００２２】
本発明の遺伝子は、一般的には、配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する。
【００２３】
本発明の第５の側面によれば、タモギタケ由来の抗菌タンパク質を得るためのオリゴヌクレオチドであって、
配列表の配列番号１又は３に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列表の配列番号１０ないし１７の何れか１項に記載のヌクレオチド配列を有する。
本発明の第６の側面によれば、上記オリゴヌクレオチドの２種の組をプライマーとして用いて、タモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして増幅反応を行い本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の一部を増幅し、得られた増幅産物をプローブとして使用して上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして完全長ｃＤＮＡクローンを単離することを含む、本発明の遺伝子の単離方法が提供される。
【００２５】
本発明の第７の側面によれば、本発明の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。
本発明の組換えベクターにおいて、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。
本発明の第８の側面によれば、宿主生物に本発明の組換えベクターを導入して得られる形質転換体が提供される。
【００２６】
本発明の第９の側面によれば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤が提供される。
発明の実施の形態
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
【００２７】
タモギタケ由来抗菌タンパク質
本発明の第一の側面によれば、植物病原菌に対して抗菌効果のあるタモギタケ由来のタンパク質が提供される。本発明のタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の抗菌タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００２８】
本発明のタンパク質は典型的には、配列表の配列番号２に記載の１４３個のアミノ酸配列又は配列番号４に記載の１４１個のアミノ酸配列を有する。しかし、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１または複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。本発明のタンパク質は、クローニングされた遺伝子の塩基配列からの推測に基づいて、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくとも５２％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００２９】
また、一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９））に記載の部位特異的突然変異誘発法等が使用可能である。
【００３０】
本明細書において、相同性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。あるいは、ＧＥＮＥＴＹＸ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）やＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）のような遺伝子配列解析ソフトを用いて、配列情報を比較し、決定することが可能である。
【００３１】
本発明のタモギタケ由来抗菌タンパク質およびその遺伝子、さらにそのホモローグとそれにコードされるアミノ酸配列をもつタンパク質について、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った。本発明の第一のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果、ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓのストレプトアビジン ｖ２（寄託番号：Ｑ５３５３３， Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２６３：ｐ．６０−６６）、ストレプトアビジン ｖ１（寄託番号：Ｑ５３５３２）、ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ ｉｉのストレプトアビジン（寄託番号：Ｐ２２６２９， Ａｒｇａｒａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １４：ｐ．１８７１−１８８２）等が相同性を有するものとしてヒットした。相同性は３つともに１２８アミノ酸に渡り、それぞれ５０％、４９％、４９％であった。また、コアストレプトアビジンミュータントｗ７９ｆ（ＣｈａｉｎＢ）（Ｆｒｅｉｔａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：ｐ．１１５７−１１６６）と１２０アミノ酸に渡り、５１．７％の相同性を示した。
【００３２】
これらより低い相同性で卵白アビジン（Ｇｏｐｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：ｐ．３５９５−３６０６）やいくつかのアビジン関連タンパク質（Ｋｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２０：ｐ．６１５−６２１）もヒットした。以外のことから、本タンパク質は新規なタンパク質であると考えられる。
【００３３】
本発明の第２のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果では、ストレプトアビジン ｖ２、ｖ１、ストレプトアビジンとそれぞれ５０％、４８％、４８％の相同性を示した。
【００３４】
本抗菌タンパク質は食用キノコタモギタケから精製された新規なストレプトアビジン様タンパク質であるので「ｔａｍａｖｉｄｉｎ」と命名した。本明細書において、精製したタンパク質由来の遺伝子をｔａｍ１、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質をｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍ１のホモローグをｔａｍ２、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質をｔａｍａｖｉｄｉｎ２と呼ぶこととする。
【００３５】
また、配列番号２及び４のアミノ酸残基１−７は抗菌タンパク質の前駆体のリーダーペプチドの相当すると考えられる。よって、配列番号２のアミノ酸残基８−１４３及び配列番号４の８−１４１は、抗菌タンパク質の成熟型である。従って、本発明によれば、配列番号２の部分アミノ酸配列８−１４３又は配列番号４の部分アミノ酸配列８−１４１からなるポリペプチド、並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に１〜複数個のアミノ酸変異を有するポリペプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと５１％より高い相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであってイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリペプチド、の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質も提供される。
【００３６】
本発明のタンパク質の精製および単離は、硫安沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱ、Ｑ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＤＥＡＥなど）、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２等）などのタンパク質の精製および単離のために慣用される方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００３７】
例えば、下記の実施例において記載するように、細粉化したタモギタケを緩衝液で抽出した後、ろ過し、その上清に硫安（硫酸アンモニウム）を好適な濃度、例えば７５％飽和になるまで添加して静置することにより本発明のタンパク質を含む沈殿が得られる。この沈殿をさらに透析した後、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度のグラジェント（例えば、塩化ナトリウムで５０ｍＭから６００ｍＭ）で溶出し、所望のタンパク質を含む画分を抗菌活性を指標に回収する。さらにゲルろ過を行い、分子量３０ｋＤａ付近の画分を回収すればよい。限定されるわけではないが、本発明の抗菌タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量が約１５ｋＤａである。
【００３８】
あるいは、本発明による配列番号１のＤＮＡ配列の７１（若しくは９２）から５０２の配列から成るＤＮＡ配列、または配列番号３の２２６（若しくは２４７）から６５１の配列から成るＤＮＡ配列を、大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて公知の導入法を用いて導入、発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
【００３９】
本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや、ＰＣＲという遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種、好ましくは菌類、より好ましくはキノコ、カビ、酵母などの含まれる真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）、多くのキノコが属する担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、さらに好ましくはタモギタケの属するハラタケ類（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）のキノコ例えばヒラタケ、シイタケ、ナラタケ、マツタケ、シメジ類、エノキタケ、マイタケ、アンズタケ、エリンギタケなどから同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が単離され得ると考えられる。このような場合、それらの新規タンパク質も本発明の範囲に含まれるものである。
【００４０】
抗菌タンパク質遺伝子
本発明はまた、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子をも提供する。遺伝子の種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成ＤＮＡの何れでもよく、またゲノムＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローンの何れでもよい。
【００４１】
本発明の遺伝子は典型的には、配列番号１又は３に記載の塩基配列を有するが、これは本発明の一例を示すにすぎない下記の実施例で得られたクローンの塩基配列である。天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１又は３に記載の塩基配列を有する遺伝子のみに限定されるわけではなく、本発明の抗菌タンパク質をコードする全ての遺伝子を包含する。
【００４２】
特に、本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、そのような遺伝子も本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
タモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１の７１−５０２のＤＮＡ配列）および第２のタモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３の２２６−６５１のＤＮＡ配列）を用いたＧｅｎｅＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ検索では、非常に短い範囲（２３ｂｐ）で相同性の見られる配列がいくつか検出されたに過ぎず、ストレプトアビジンのＤＮＡ配列等は検出されてこなかった。これは、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡ配列はＤＮＡレベルではストレプトアビジンのＤＮＡ配列等と相同性があまり高くないことを意味する。
【００４４】
より詳細には、遺伝子配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒ３．２（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を用いて、本発明のタモギタケ抗菌タンパク質（ｔａｍａｖｉｄｉｎ１及び２）とストレプトアビジン（ストレプトアビジンはストレプトアビジンｖ２、ｖ１とそれぞれ９アミノ酸、１アミノ酸異なるだけである）のアミノ酸配列全体の相同性を解析した。その結果、本発明のｔａｍ１のコードするｔａｍａｖｉｄｉｎ１のアミノ酸配列で４６．７％、ｔａｍ２のコードするｔａｍａｖｉｄｉｎ２のアミノ酸配列で４８．１％の相同性（アミノ酸同一性）を示した。一方、ＤＮＡ配列（配列表の配列番号１および３）全体ではストレプトアビジンとの相同性はｔａｍ１で５３．８％、ｔａｍ２では５１．０％であった。またｔａｍ１にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で３１．２％、ＤＮＡ配列で４２．４％であり、ｔａｍ２にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で３６．２％、ＤＮＡ配列で４１．８％であった。なお、ｔａｍａｖｉｄｉｎ１とｔａｍａｖｉｄｉｎ２のアミノ酸配列間、並びにそれらをコードする遺伝子ｔａｍ１とｔａｍ２のＤＮＡ配列間の相同性はそれぞれ６５．５％、６４．５％であった。
【００４５】
ストレプトアビジンと比較した場合、本発明のｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍａｖｉｄｉｎ２はＮ末端側が３３アミノ酸短くなっているが、ビオチンとの結合に関与していると考えられているトリプトファン（Ｗ）残基（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ ２５６：ｐ．２７９−２８２）、チロシン（Ｙ）残基（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６９：ｐ．５２７−５３０）は全て保存されている（配列番号２のアミノ酸配列のうち第３４、第４５番目のＹ、第８２、第９８、第１１０番目のＷ、配列番号４のアミノ酸配列のうち、第３４、第４５番目のＹ、第８０、第９６、第１０８番目のＷ）。
【００４６】
また成熟タンパク質領域と考えられる部分（配列番号２のアミノ酸配列のうち第８番目から第１４３番目のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列のうち第８番目から第１４１番目のアミノ酸配列）の平均分子量はそれぞれ、１５１５８．４、１４７３２．２と算出され、成熟ストレプトアビジンや成熟アビジンの平均分子量（それぞれ１６４９０．６、１４３４２．９）と似ている。
【００４７】
ストレプトアビジンは放線菌Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ ｉｉ由来、アビジンは鳥類（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）の卵白由来である。これまでにストレプトアビジンによく似たタンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓから前述のストレプトアビジン ｖ１およびｖ２（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２６３：ｐ．６０−６６）が、またアビジン遺伝子のホモローグとして鳥類からアビジン関連遺伝子（ａｖｒ１−ａｖｒ５， Ｋｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２０：ｐ．６１５−６２１）が単離されている。ストレプトアビジンとストレプトアビジン ｖ１およびｖ２とのアミノ酸配列の違いはそれぞれ１アミノ酸、９アミノ酸であり、アビジンとアビジン関連タンパク質とのアミノ酸配列の相同性は６８−７８％、ＤＮＡ配列の相同性は８８−９２％である。ストレプトアビジンとアビジンの相同性はアミノ酸配列で２９．２％、ＤＮＡ配列で４６．８％である。
【００４８】
一方、本発明の抗菌タンパク質の好ましい一態様であるｔａｍａｖｉｄｉｎ１および２は担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）由来であり、先述のようにストレプトアビジンとのアミノ酸配列相同性はそれぞれ４６．７％、４８．１％、またアビジンとのアミノ酸配列相同性はそれぞれ３１．２％、３６．２％である。この様にｔａｍａｖｉｄｉｎ１、２は、放線菌のストレプトアビジンのグループ、鳥類のアビジンのグループとは異なる第３のグループを形成している。放線菌、鳥類以外からこのようなアビジン様タンパク質が単離されたのはこれが初めてである。ｔａｍａｖｉｄｉｎ１、２はキノコ類のアビジン様タンパク質であるが、他のキノコ類にも同様なタンパク質が含まれている可能性は高いと予測される。ｔａｍａｖｉｄｉｎ１、２のアミノ酸配列、ｔａｍ１、ｔａｍ２のＤＮＡ配列は、そのようなタンパク質およびその遺伝子をさらに検索、単離することに利用し得る。
【００４９】
相同遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９））に記載されているように、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃で、数時間から一晩などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは４５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または３０℃ないし４２℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。洗浄の条件としては、例えば０．２×ＳＳＣで４５℃ないし６８℃が挙げられる。ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子は全て本発明の範囲の中に含まれる。
【００５０】
核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，ｐ．１３５０−１３５４）、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（ウーら、１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，ｐ．５６０−５６９；バリンガーら、１９９０，Ｇｅｎｅ ８９，ｐ．１１７−１２２；バラニーら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，ｐ．１８９−１９３）および転写に基づく増幅（コーら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，ｐ．１１７３−１１７７）等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（ウォーカーら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，ｐ．３９２−３９６；ウォーカーら、１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０，ｐ．１６９１−１６９６）、自己保持配列複製（３ＳＲ）（グアテリら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，ｐ．１８７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リザイルディら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，ｐ．１１９７−１２０２）等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００５１】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００５２】
オリゴヌクレオチド
本発明によればまた、タモギタケ由来の抗菌タンパク質を得るためのオリゴヌクレオチドであって、
配列表の配列番号１または３に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば本発明の遺伝子を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼーション、あるいは適当な２種をプライマー対として用いたＰＣＲ等の増幅反応に用いることが可能である。
【００５３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列表の配列番号１０−１９の何れかに記載のヌクレオチド配列を有する。配列番号１０−１３のヌクレオチド配列は、配列番号９のアミノ酸配列に基づいて、そのタンパク質の一部をコードする遺伝子断片のクローニングのためのＰＣＲ用プライマーとして設計されたものであり、当該アミノ酸をコードすることが可能な全ての塩基をミックスしたプライマーである。配列番号１４−１７のヌクレオチドはｔａｍ１とｔａｍ２遺伝子の全塩基配列を解読するためにプライマーウォーク用として合成されたプライマーである。配列番号１８−１９のヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する組換えｔａｍａｖｉｄｉｎ２タンパク質を発現するための発現ベクターを構築するために、全ＯＲＦを増幅するために配列番号３に基づいて作成されたＰＣＲ用プライマーである。
【００５４】
本発明の遺伝子の部分断片は、上記オリゴヌクレオチドの適切な組み合せを使用してタモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことにより増幅させて単離することができる。かくして得られた増幅産物をプローブとして使用してさらにｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼーションなどでスクリーニングすることにより完全長のｃＤＮＡクローンを単離することができる。核酸増幅反応の手順及び条件、プラークハイブリダイゼーションの条件などは当業者に周知である。
【００５５】
例えば、限定されるわけではないが、ハイブリダイゼーションの条件としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． 上記）に記載されているように、温度条件が場合によっては室温程度、洗浄も例えば２´ＳＳＣなど通常よりも高い塩濃度で、温度も３７℃程度というようにかなりストリンジェンシーを低くとることが想定される。
【００５６】
組換え抗菌タンパク質の製造
本発明のタンパク質は極めて強力な抗菌活性をもつ。例えばイネのいもち病菌に対しては５０ｎｇ／ｍｌという非常に低い濃度で胞子の発芽を完全に抑制する（後述の実施例４を参照）。この濃度においては長時間のインキュベーションの後にも胞子の発芽はみられないことから、本発明のタンパク質のいもち病菌に対する効果は、生長の部分的阻害というよりはむしろ、殺菌効果であると考えられる。このような低い濃度（ナノグラムオーダー）で、病原菌の生育を完全に抑止できる抗菌タンパク質は本発明者の知る範囲では現在までに報告されていない。後述の実施例においては、抗菌タンパク質の精製のための抗菌アッセイのための植物病原菌としてイネの最重要病害であるいもち病菌を使用したが、同定したタモギタケ抗菌タンパク質が、これ以外の紋枯病菌等の植物病害にも大差ないレベルで抗菌効果を有している可能性は極めて高い。
【００５７】
このように本発明のタモギタケ由来の抗菌タンパク質は強い抗菌活性を有していることから、本発明のタンパク質は、抗菌剤や農薬などの薬剤としてそれが活性のある形で含まれるような製剤として利用することができる。この場合、本タンパク質は、例えば後述の実施例に従ってタモギタケよりイオン交換カラム、ゲル濾過カラムを用いて精製され得る。しかし、本発明のタモギタケ抗菌タンパク質をコードする配列番号１の７１−５０２又は配列番号３の２２６−６５１の塩基配列を有するＤＮＡを、大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入、発現させることにより、当該タンパクをより簡便かつ大量に製造することができる（実施例５）。
【００５８】
本発明によればまた、本発明の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、Ｅ−ｃｏｉｌ ＴＢ１，ＬＥ３９２またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
【００５９】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００６０】
べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるべクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＴｒｃ９９Ａなどが例示されるがこれらに限定されない。
【００６１】
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現べククーが有用である。発現べクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
【００６２】
形質転換体は、所望の発現べクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現べクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。
【００６３】
宿主細胞は、大腸菌、酵母、植物細胞または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。さらに、植物細胞に関しては、細胞培養が可能であれば特に限定されないが、例えば、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ由来の細胞などが例示される。
【００６４】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００６５】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５'側および３'側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００６６】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
【００６７】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｉｌではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬもしくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２もしくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
【００６８】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００６９】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００７０】
本発明の発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｉｌ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
【００７１】
本願発明のＤＮＡ断片を用いて病害抵抗性植物を作出する目的においては、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上、Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，２７１−２８２（１９９４））、ｐＳＢ４２４（Ｋｏｍａｒｉら， Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，１６５−１７４（１９９６））などが例示される。
【００７２】
形質転換植物は、上述のベクターのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の部位に本願発明のＤＮＡ断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調整することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子（本願発明のＤＮＡ配列またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネーターを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。
【００７３】
プロモーター、ターミネーターは植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている３５Ｓプロモーターの他に、アクチン、ユビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。しかしながら、より好適には誘導性のプロモーターを組み入れて用いてもよい。こうすることで病害虫が形質転換植物に接触した時にのみ、当該タンパクが生産され、抵抗性となる。用いられるべき誘導性プロモーターとしてはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、チオニン、オズモチンあるいは病害虫やストレスに反応するその他の遺伝子のプロモーターが考えられる。
【００７４】
植物への遺伝子導入法としては、アグロバクテリウムを用いる方法（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，ｐ．２７１−２８２（１９９４））、エレクトロポレーション法（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６））、ＰＥＧ法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，３，２７１７（１９８４））、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０２，１７９（１９８６））、微小物衝突法（ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，９２３（１９８８））などが挙げられるが、所望の植物に遺伝子を導入する方法であれば特に限定されない。また、宿主となる植物種も本発明の植物形質転換用ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される植物、例えば双子葉植物ではタバコ、アラビドプシス、トマト、キュウリ、ニンジン、ダイズ、バレイショ、テンサイ、カブ、ハクサイ、ナタネ、ワタ、ペチュニアなどが挙げられ、単子葉植物では、イネ、トウモロコシ、コムギなどが挙げられる。
【００７５】
本発明のタンパクは、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
【００７６】
培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパクが大量に生産されるように適宜選択される。限定されるわけではないが、例えば大腸菌での発現の場合、組換えタンパク質発現のための培養条件として、好ましくは４℃ないし４０℃の温度で培養し、０．０１ｍＭないし５．０ｍＭのＩＰＴＧによる誘導を行う。
【００７７】
本発明のタンパクは、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパクが宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０Ｍ〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパクが宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の精製、単離に供することができる。
【００７８】
精製・単離の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。例えば、限定するわけではないが、本明細書で後述する実施例４では、Ｎ−末端に６×ヒスチジンのタグを有する組換え抗菌タンパク質を発現させた。当該組換えタンパク質は、６×ヒスチジンに親和性を有するＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して精製した。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパクを生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。また、Ｈｏｆｍａｎｎらの文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：ｐ．４６６６−４６６８（１９８０））に記載されているように、イミノビオチンアフィニティーカラムを用いて精製する方法も適用することができるだろう。後述の実施例５では、５０ｍＬの大腸菌培養液から組換えｔａｍａｖｉｄｉｎ２タンパク質を１ｍｇの収量で得た。
【００７９】
上記のように遺伝子工学手法により得られた、あるいは天然源より精製された本発明の抗菌タンパク質は、抗菌活性を有する。抗菌活性は、限定されるわけではないが、例えば、マイクロタイタープレートに培地（例えば、１／２ ＰＤ培地、シュークロース−ペプトン培地等）に懸濁したいもち病菌の胞子を入れ、そこへ本発明の抗菌タンパク質を所期の濃度、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ−１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、２８℃で４８時間培養する。そして、いもち病菌の成長・増殖（例えば、菌糸の伸長）が、抗菌タンパク質を加えない場合と比較して抑制されるか否かを判断することによって、抗菌活性を測定することが可能である（実施例４）。
【００８０】
あるいは、下記の方法も使用可能である。シャーレに作成した寒天培地の中心にいもちの菌叢を置き、その周りに上述の濃度の本発明の抗菌タンパク質の水溶液の一定量を滴下し、２８℃で４８時間−１週間程度培養する。そして、抗菌タンパク質を滴下した部分におけるいもち病菌の菌糸の伸長が、滴下しない部分に比較して抑制されるか否かを判断することによって、抗菌活性を測定することが可能である。
【００８１】
抗菌剤
本発明のタンパクは強い抗菌活性をもつ。例えば我々の用いた抗菌アッセイではイネのいもち病菌に対して５０ｎｇ／ｍｌという低い濃度で菌糸の成長を抑制する。後述の実施例においては、抗菌アッセイ用の植物病原菌としてイネの最重要病害であるいもち病菌と紋枯病菌を使用し、本発明で同定したタモギタケ抗菌タンパクはこれらに対して抗菌作用を示した。本発明のタンパク質がいもち病菌以外の他の植物病原菌に対しても抗菌効果を有している可能性が高い。
【００８２】
このように本発明のタモギタケ由来の抗菌タンパク質は強い抗菌活性を有していることから、抗菌剤や農薬などの薬剤としてそれが活性のある形で含まれるような製剤として利用することができる。この場合、本発明のタンパクをコードするＤＮＡ配列を用いれば、先述のように例えば大腸菌や酵母などで機能する発現ベクターにそのＤＮＡを組み込んで大量に製造することができる。
【００８３】
本発明の抗菌タンパク質は新規なストレプトアビジン様タンパク質であることから、ビタミンの一種であるビオチン（ビタミンＨ）と結合することが示唆される。一方いもち病菌はその生育にビオチンが必要であることが知られている。これらのことから、本抗菌タンパク質はアッセイ培地に存在する遊離ビオチンと結合し、これが培地中のビオチン欠乏を引き起こし、結果としていもち病菌の生育が抑えられたことが示唆された。実際、後述する実施例４に記載されるように、アッセイ培地中にビオチンを過剰に添加すると本発明のｔａｍａｖｉｄｉｎ１の抗菌活性は消去された。さらに本発明者は市販のストレプトアビジンおよびアビジンにもｔａｍａｖｉｄｉｎ１と同様にイネいもち病菌に対する抗菌作用があることを見出し、この作用はやはりビオチンにより打ち消されることを明らかにした。
【００８４】
本発明によってビタミンの一種であるビオチンの量を制御することにより、病害抵抗性特にいもち病菌抵抗性を植物に付与できる可能性が示唆された。この様にビタミンを制御することによって病害抵抗性を付与できる可能性があることはこれまでに知られていなかった。これは全く新しい概念である。この概念も本発明に含まれる。例えば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む製剤の農薬としての利用が挙げられる。この場合、本発明の抗菌タンパク質以外のビオチン結合性タンパク質（例えばｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ ｉｉのストレプトアビジンや卵白アビジン、およびそれらのホモローグなど）も同じ概念に含まれる。
【００８５】
よって、本発明によれば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤が提供される。本発明の抗菌剤は通常、植物の全身または局所的に、散布することができる。
散布量は、植物の種類、生育段階、症状、散布方法、処理時間、散布するタンパク質の種類（全長のタンパク質、該タンパク質の一部を置換、欠失、挿入及び／又は付加したクンパク質など）、生育している場所の気候、生育している場所の土壌などにより異なるが、一日一回から複数回毎日ないし数日おきに散布することができる。散布量は種々の条件により変動する。本発明の抗菌剤の散布に際しては、必要に応じて、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤などを混合して散布することも可能である。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤として混合される。水性の希釈剤としては、例えば蒸留水、食塩水などが挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類などが挙げられる。
【００８６】
このような抗菌組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散別または安定化剤（例えばアルギニン、アスパラギン酸など）などの補助剤を含んでいてもよい。
これらは、必要に応じてバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた、例えば凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物の形態で製造し、使用前に無菌の蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
【００８７】
このようにして得られる抗菌剤の剤形としては、使用する用途に応じて決めればよく、上記のような添加物と混合し、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、乳剤等の形態により散布することができる。
【００８８】
また本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を植物に導入することで病害抵抗性植物を作成することも可能であろう。即ち、例えば植物で機能するプロモーターと本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を連結し、さらにその下流に植物で機能するターミネーターを付加したコンストラクトを植物に導入することで病害抵抗性植物の作成が可能である。この場合、ｔａｍａｖｉｄｉｎの植物細胞外への分泌を促すために、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の５’側に植物で機能する細胞外分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を付加することも可能である。あるいはまた植物細胞あるいは細胞外での抗菌タンパク質の蓄積を促すために遺伝子の使用コドン（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）をそのアミノ酸は変化させないように単子葉あるいは双子葉植物用に変化させることも可能である。このような組み合わせを用いた病害抵抗性植物の作出方法も本発明に含まれるものである。
【００８９】
ｔａｍａｖｉｄｉｎ、アビジン、ストレプトアビジン、あるいはそれらとよく似たタンパク質の病害抵抗性植物の作出への適用、およびイネ以外の植物への適用も本発明に含まれるものである。本発明において解析した病原菌はイネいもち病菌であるが、この病原菌以外にもビオチンをその生育に必要とするその他の、植物病原菌、病原細菌に効果を発揮する可能性は十分にあると考えられる。
【００９０】
さらに植物病原菌のみならず、ビオチンがその生育に必須である動物特にヒトや家畜の病原菌にも同様の効果を発揮することは当然考えられるので、本発明の抗菌タンパク質、アビジンまたはストレプトアビジン、およびそれらとよく似たタンパク質をそのような場面に治療薬として使用する場合、これは本発明の範疇に属するものである。
【００９１】
ストレプトアビジンに関しては既にそのＤＮＡ配列が開示されているが（Ｇａｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．ＷＯ／８６０２０７７）、先述のごとく本発明のｔａｍ１およびｔａｍ２のＤＮＡ配列は、通常のデータベース検索を行ってもストレプトアビジンのＤＮＡを抽出することはなく、核酸・アミノ酸配列解析ソフトを使用してストレプトアビジンとのＤＮＡの相同性を強制的に比較しても実際に５１．０〜５３．８％と高い値は示さなかった。
【００９２】
ストレプトアビジンやアビジンは、ビオチン、およびその誘導体と非常に強い結合能を有することから、分子生物学、生化学などの様々な場面において実験試薬として既に広く利用されている。例えば核酸やタンパク検出系への利用（Ｌｉａｎｇ．ＷＯ／９７０７２４４）や、ストレプトアビジンやアビジンを融合タンパク質として発現しビオチンとの結合能を用いて精製する方法（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ． ＥＰ８３５９３４、Ｋｏｐｅｔｚｋｉ． ＷＯ／９７１１１８６）などが挙げられる。本発明のｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍａｖｉｄｉｎ２もこれらの現在広く知られている、または報告されている使用方法に用いることが出来る。
【００９３】
植物に関連するストレプトアビジンあるいはアビジンについてはこれまでにアビジンを利用した雄性不稔植物の作出（Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ．ＷＯ／９６４０９４９）、ストレプトアビジンあるいはアビジンの殺虫タンパクとしての応用（Ｃｚａｐｌａ ｅｔ ａｌ．ＷＯ／９４００９９２）、植物におけるアビジンの生産（Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ＵＳ Ｐａｔ． Ｎｏ．５７６７３７９）などが報告されている。なおこれらの文献に記載されているストレプトアビジンあるいはアビジンの利用法が本発明のタモギタケ由来の抗菌タンパク質にも適用されうる。
【００９４】
先行技術文献
１． Ｓｃｈｌｕｍｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：ｐ．３６５−３６７
２． Ｍａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８８：ｐ．９３６−９４２
３． 特表平８−５０５０４８
４． Ｏｉｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０：ｐ．４８１−４８３
５． Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：ｐ．１５３０１−１５３０９
６． 特表平９−５０１４２４
７． Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：ｐ．１１９４−１１９７
８． Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：ｐ．５７３−５８８
９． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９９：３８３−３９０
１０． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：ｐ．７３２７−７３３１
１１． Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：ｐ．１３５７−１３６８
１２． Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６１：ｐ．１５３−１５６
１３． Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２６３：ｐ．６０−６６
１４． Ａｒｇａｒａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １４：ｐ．１８７１−１８８２
１５． Ｆｒｅｉｔａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：ｐ．１１５７−１１６６
１６． Ｇｏｐｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：ｐ．３５９５−３６０６
１７． Ｋｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２０：ｐ．６１５−６２１
１８． Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ ２５６：ｐ．２７９−２８２
１９． Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６９：ｐ．５２７−５３０
２０． Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：ｐ．４６６６−４６６８（１９８０）
２１． Ｇａｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．ＷＯ／８６０２０７７
２２． Ｌｉａｎｇ．ＷＯ／９７０７２４４
２３． Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ． ＥＰ８３５９３４
２４． Ｋｏｐｅｔｚｋｉ． ＷＯ／９７１１１８６
２５． Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ．ＷＯ／９６４０９４９
２６． Ｃｚａｐｌａ ｅｔ ａｌ．ＷＯ／９４００９９２
２７． Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ＵＳ Ｐａｔ． Ｎｏ．５７６７３７９
【発明の効果】
【００９５】
効果
本発明の配列番号２または４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはその一部の配列からなりかつビオチンまたはその誘導体と結合する能力を有するポリペプチドを含むことを特徴とするタンパク質成分を有効成分として含む製剤を作出すれば、抗菌剤としての利用が期待できる。
【００９６】
また、本発明の配列番号１の７１−５０２または９２−５０２の配列を有するＤＮＡ、あるいは配列番号３の２２６−６５１または２４７−６５１の配列を有するＤＮＡを、植物細胞の中で機能しうる適当な構成的プロモーター、器官・時期特異的プロモーター、あるいはストレスや病害虫に反応する誘導性のプロモーター配列と、植物細胞で機能しうるターミネター配列の発現カセットに組み込み、植物細胞に導入、再生個体を得ることにより、病害抵抗性植物を作出できる。この場合本発明抗菌タンパク質をコードするＤＮＡ配列に細胞内小器官への輸送シグナルあるいは細胞外分泌へのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を接続することも可能である。
【００９７】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを、大腸菌、酵母、植物あるいは昆虫や例えばアフリカツメガエルなどの動物細胞で外来タンパク質を発現させることの出来るベクターに組み込み、当該細胞内で、本発明タンパク質を生産、大量精製することが可能となる。この場合本発明抗菌タンパク質をコードするＤＮＡ配列に細胞内小器官への輸送シグナルあるいは細胞外分泌へのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を接続することも可能である。
【００９８】
本発明タンパク質とビオチンとの強い相互作用は、現在ストレプトアビジンやアビジンにおいて広く利用されているような様々な分析技術に応用することが可能となる。
【実施例】
【００９９】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例
実施例１ アッセイ系の構築
１）検定系の確立
病原菌の培養：イネいもち病菌（菌株ＴＵＳ−１、レース３３７；農林水産省東北農業試験場より分譲）はオートミル培地（Ｄｉｆｃｏ社製，１％ショ糖添加）上で培養して分生胞子を得て、接種源とした。胞子液は必要に応じて１０％グリセロールを加えて、−８０℃で保存した。
【０１００】
イネ紋枯病菌（菌株ＪＴ８７２）は１／２ジャガイモ煎汁培地（ＰＤ培地：Ｄｉｆｃｏ社製）で２日間培養し、５ｍｍ程度の菌糸塊３個をテフロンホモジナイザーで１／２ＰＤ培地とともに軽く磨砕して得られた断片化菌糸を接種源とした。
【０１０１】
上記の接種源を９６穴マイクロタイタープレート（コーニング社製）に１ウエル当たりいもち病菌分生胞子は約１，０００個、紋枯病菌は断片化菌糸が約３００個になる様に１００μｌの１／２ＰＤ培地とともに加え、２８℃の恒温器で４８時間培養した。菌の増殖はマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）で５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０２】
２）タモギタケからのタンパク質抽出
市販のタモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）子実体１００ｇをあらかじめハサミで細かく切断後、液体窒素を用いて凍結して乳鉢で細粉となるまで磨砕し、３００ｍｌの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液ｐＨ７．５を加えて緩やかに撹拌しながら４℃で３０分間抽出を行った。抽出液はミラクロスでろ過後、１０，０００´ｇ、２０分間の遠心を行った。上清に硫安を７５％飽和になるように加えて、一晩４℃で静置した。次に１５，０００´ｇ、２０分間の遠心で沈殿させて、沈殿物を３ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液、ｐＨ７．５に溶解し、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１ ＭＷＣＯ ６−８０００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を用いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液、ｐＨ７．５に対して透析を行った。不溶物を遠心によって除去しタモギタケタンパク質試料とした。タモギタケタンパク質試料のタンパク質濃度は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準タンパク質としてＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した。
【０１０３】
実施例２ 抗菌タンパクの精製
１）タモギタケ粗タンパク試料の抗菌活性
上記のいもち病菌、紋枯病菌の培養系に培養開始直後にタモギタケタンパク質試料を一定量加えて、培養２日後（４６−４８時間後）の吸光度を測定して抗菌性の有無について判定した。その結果、タモギタケの抽出物の中にはいもち病菌、紋枯病菌両菌に対して高い抗菌活性をもつ物質が含まれていることが明らかとなった。阻害の様式は、いもち病菌の場合、発芽の完全抑制や菌糸の生長阻害が観察され、紋枯病菌の場合は菌糸の生長阻害が観察された。いもち病菌の細胞の場合、その細胞質が細胞壁から離れ原形質分離様の様相を呈していた。
【０１０４】
検出された抗菌活性の性質をさらに詳しく解析するために、熱処理を行い残存活性を調査した。熱処理は６０、８０℃を１０分間行い抗菌アッセイを行った。活性の強さはタンパク質試料を希釈することにより推定した。その結果６０℃処理ではいもち、紋枯病菌両方に対する抗菌活性は無処理と同等の活性が保持されていた。一方８０℃処理では紋枯病菌に対する抗菌活性は消失した。ところがいもち病菌に対する抗菌活性は、８０℃処理によって原形質分離を起こさせる活性は消失したものの、菌糸の先端を膨張させて生長を停止させる新規な活性が存在することが明らかとなった（図１）。
【０１０５】
さらにタモギタケ粗タンパク試料熱処理画分に含まれるこれらの活性をつかさどる本体のおよその分子量を把握するため、限外濾過膜によりサンプルを分画し、抗菌活性を調査した。限外濾過膜はウルトラフリーＭＣ１０，０００ ＮＭＷＬ フィルターユニット（カットオフ分子量１００００、ミリポア社製）を用い、膜を通過した画分と膜を通過しなかった画分に分けてアッセイを行った。その結果全ての活性は膜不通過画分のみに存在していた。従って活性本体の分子量は少なくとも１００００以上であることが予想された。
【０１０６】
２）イオン交換カラムによる精製
次に抗菌タンパクの精製を行った。粗タンパク試料１５０ｍｇ／２０ｍｌをまず、イオン交換単体Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を充填した自製カラム（内径１．５ｃｍＸ長さ１０ｃｍ、単体容量１０ｍｌ）にかけ、抗菌タンパクを部分精製した。流速は２ｍｌ／分とし、基本緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０， ５０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，６００ｍＭ ＮａＣｌを、グラジェント（ＮａＣｌで５０ｍＭから６００ｍＭ）は、１００分間かけた。各画分（１２．５ｍｌ）の一部をいもち病菌に対する抗菌アッセイと、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供試した。各画分のタンパク質溶液に等量の２´ＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）を加え、９５℃で５分間処理した後、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２２７：ｐ．６８０−６８５．）の方法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。ゲルは１５％のＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用い、銀染色ＩＩキットワコー（和光純薬社製）によりタンパク質を検出した。タンパクのおよその分子量と量を見積もるため、分子量マーカー（ＬＭＷ マーカーキット：Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社製、分子量の大きい順に９４ｋＤａ、６７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａ、２０．１ｋＤａ、１４．４ｋＤａ）を泳動した。タンパク質の銀染色による電気泳動像と抗菌性の強さとの関係を図２に示した。
【０１０７】
抗菌活性としてＮａＣｌ濃度が１６０ｍＭのピークと、２４０ｍＭ〜２８０ｍＭのピークの二つが現れた。１６０ｍＭのピークに含まれるタンパク質は、菌糸の先端を膨張させて生長を停止させ、７０℃、１０分の処理でもその活性は失活しなかった。一方２４０ｍＭ〜２８０ｍＭのピークに含まれるタンパク質はいもち菌細胞に原形質分離を生じさせ、同熱処理により失活した。そこで前者の１６０ｍＭのピークに含まれる抗菌タンパク質の精製を試みた。
【０１０８】
ＮａＣｌ濃度が１２０ｍＭ〜２４０ｍＭに相当する画分を透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１ ＭＷＣＯ ６−８０００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）に移し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌに対して４℃で一晩透析を行った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（分画分子量１０，０００、Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮した後、７０°Ｃで３０分間熱処理を行った。遠心後上清を０．２２mｍでフィルター濾過した。このタンパクサンプル（約１０ｍｌ）をＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）による抗菌タンパクの分離精製に供試した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、基本緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５００ｍＭ ＮａＣｌを用い、グラジェント（ＮａＣｌで５０ｍＭから５００ｍＭ）は、試料を打った２０分後から４０分間かけた。各画分（１ｍｌ）の一部をいもち病菌に対する抗菌アッセイと、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供試した。
【０１０９】
まず、ＨＰＬＣのチャートと抗菌性の強さとの関係を図３に示した。その結果、イオン強度（ＮａＣｌ濃度）が２００ｍＭ〜２６０ｍＭ付近に抗菌タンパクの溶出ピークが現れた。
【０１１０】
電気泳動像と抗菌性の強さの関係を図４に示した。各レーンの上に表示した数字は図３の画分の番号に準じて表示した。抗菌性と関連すると考えられるタンパクのバンドを精査すると、約１５ｋＤの２つのバンドが有力候補として挙げられた（図４矢印）。このバンドの濃度と抗菌活性の度合いは正の相関関係にあるので、このバンドが抗菌タンパク質本体である可能性が示唆された。
【０１１１】
３）ゲルろ過カラムによる精製と分子量の推定
タモギタケ抗菌タンパクの精製、そしてｎａｔｉｖｅな状態での分子量を推定するため、上記のＭｏｎｏＱ画分の＃４１−４６をウルトラフリーＭＣ １０，０００ ＮＭＷＬ フィルターユニット（ミリポア社製）で濃縮し、ゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｏｓｅ６ ＨＲ １０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に供試した。流速は０．５ｍｌ／分とし、緩衝液は５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ６．０、５０ｍＭ ＮａＣｌを用いた。まずＧｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）によりタンパクの分子量とおよその溶出時間を把握した後、抗菌活性のあるＭｏｎｏＱ画分を打ち込んだ。
【０１１２】
その結果、Ａ２８０でタンパクをモニターすると３０ｋＤａを頂点とする鋭いピークが現れた（図５）。抗菌活性は３０ｋＤａのピークと近接したその前後に集中した。このことから、タモギタケの有する抗菌性は、ゲル濾過でおよそ３０ｋＤの分子量を有する単一のタンパク質に由来することが分かった。また、各フラクション（０．２５ｍｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後銀染色すると、３０ｋＤａ付近にのみ、図４で見られた１５ｋＤａのバンドが検出された（図６）。１５ｋＤａ以外のバンドは見られなかったことから、抗菌性に寄与しているのは１５ｋＤａのタンパク質であることが再度強く示唆された。分子量マーカー（２０．１ｋＤａのトリプシンインヒビター）から、デンシトメーターにより抗菌タンパクの量を推定し、イネいもち病菌に対する５０％生長阻害濃度を算出すると、およそ５０ｎｇ／ｍｌとなった。生重量１００ｇのタモギタケ子実体から上記の方法で精製され得る当該抗菌タンパク質の量はおよそ０．２ｍｇであった。
【０１１３】
実施例３ ｃＤＮＡの単離
１）タモギタケ抗菌タンパクのアミノ酸配列の解読
上記のＳｕｐｅｒｏｓｅ６画分をウルトラフリーＭＣ １０，０００ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した。トリスを除去し、グリシンを含まない緩衝液系でＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）へ転写し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で軽く染色した後、脱色した。その後、抗菌性に関与すると考えられた１５ｋＤａのタンパクバンドを切り出した。また１５ｋＤａのタンパク質をリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）若しくはＶ８プロテアーゼ（和光純薬工業社製）で部分消化した。
【０１１４】
その結果、リシルエンドペプチダーゼ消化からは１４ｋＤａが、若しくはＶ８プロテアーゼ消化からは１４ｋＤａと１２ｋＤａが得られた。これらのバンドを同様に泳動後膜に転写した。次いで、気相プロテインシークエンサー（ＨＰＧ１００５Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、Ｎ末端アミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。
【０１１５】
その結果、１５ｋＤａタンパクからは次のような４４アミノ酸：
Ｎ末端−Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Xaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg Tyr−Ｃ末端 （配列番号５）
が決定された（上記アミノ酸配列において、Ｘａａは未定、以下同様）。また、１４ｋＤａタンパクのリシルエンドペプチダーゼ消化物からは次のような５０アミノ酸：
Ｎ末端−Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val−Ｃ末端 （配列番号６）
また、１４ｋＤａタンパクのＶ８プロテアーゼ消化物からは次のような２１アミノ酸：
Ｎ末端−Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly−Ｃ末端 （配列番号７）
また、１２ｋＤａタンパクからは次のような２３アミノ酸
Ｎ末端−Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu Thr Ala Asn Xaa Asp Gly Xaa Leu−Ｃ末端 （配列番号８）
が決定された。
【０１１６】
最終的に次のような６９アミノ酸が決定された。
Ｎ末端−Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val−Ｃ末端 （配列番号９）
２）縮重プライマーの設計
１）で決定されたアミノ酸配列を基に、考えられる全ての塩基がミックスされた４つのプライマーを合成した。括弧内の数字は縮重度を示す。
ＴＭＲ１： 5'-acnggnacntggtayaayg-3’（２５６）
（配列番号９の２番目のアミノ酸残基Ｔｈｒないし８番目のＧｌｕに対応） （配列番号１０）
ＴＭＲ２： 5'-garytiggiwsnacnatgaa-3’（２５６）
（配列番号９の８番目のアミノ酸残基Ｇｌｕないし１４番目のＡｓｎに対応） （配列番号１１）
ＴＭＦ１： 5'-gtrttytcraaiswiacn-3’（１２８）
（配列番号９の５９番目のアミノ酸残基Ａｌａないし６５番目のＴｈｒに対応） （配列番号１２）
ＴＭＦ２： 5'-cciarigtnacnccytgncc-3’（２５６）
（配列番号９の５１番目のアミノ酸残基Ｇｌｙないし５７番目のＧｌｙに対応） （配列番号１３）
但し、上記において「ｉ」は「イノシン」を、「ｒ」は「ｇ又はａ」を、「ｙ」は「ｃ又はｔ」を、「ｗ」は「ａ又はｔ」を、「ｓ」は「ｇ又はｃ」を、そして「ｎ」は「ａ又はｇ又はｃ又はｔ」をそれぞれ表す。
【０１１７】
３）タモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーの構築
タモギタケ子実体からＳＤＳフェノール法で全核酸を抽出し、塩化リチウム沈殿により全ＲＮＡを回収した。ここからｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）によりタモギタケｍＲＮＡを調製した。子実体約５ｇから１０μｇのｍＲＮＡが得られた。このうち５μｇをＺＡＰ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に供試し、ｃＤＮＡを合成した。。ゲル濾過カラムによりおよそ０．５〜５ｋｂのｃＤＮＡを分画し、Ｕｎｉ−ＺＡＰ ＸＲ ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にライゲーションし、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）によりパッケージングを行った。全ての手順はキット添付の説明書に従った。構築したタモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーのタイターは、およそ３００万ｐｆｕと算出された。
【０１１８】
４）ＲＴ−ＰＣＲによるプローブの取得
２）で合成したプライマーを用いて３）で合成したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとなるタモギタケ抗菌タンパクの部分長ｃＤＮＡの増幅を試みた。反応条件は以下のように行った。５０μｌの反応液中に、ｃＤＮＡ １０ｎｇ，１０´Ｅｘ ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ，２．５ｍＭ 各ｄＮＴＰｓ ４μｌ，プライマー ５ピコモル／各配列，Ｅｘ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）＋Ｔａｑ ＳＴＡＲＴ 抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製） １μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ社）を用いて、９４℃ ３分を１回、９４℃ １分、５０℃ １分、７２℃ １分を３５ 回、７２℃ ６分を１回行った。その結果、ＴＭＲ１−ＴＭＲＦ１、ＴＭＲ１−ＴＭＲＦ２、ＴＭＲ２−ＴＭＲＦ１、ＴＭＲ２−ＴＭＲＦ２の全てのプライマー組み合わせにおいて、各々およそ１５０〜１９０ｂｐの産物が増幅された。
【０１１９】
これらのＰＣＲ産物をゲル精製し、ベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。これらのクローンの塩基配列を決定した結果、１）で決定されたアミノ酸配列と全く同じアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（ＴＭＲ２−ＴＭＲＦ１、ＴＭＲ２−ＴＭＲＦ２の組み合わせ由来。特にＴＭＲ２−ＴＭＲＦ２の組み合わせ由来のｃＤＮＡをＴＭ１００と命名）と、１）で決定されたアミノ酸配列と約７５％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（ＴＭＲ１−ＴＭＲＦ１、ＴＭＲ１−ＴＭＲＦ２の組み合わせ由来。特にＴＭＲ１−ＴＭＲＦ１の組み合わせ由来のｃＤＮＡをＴＭ７５と命名）の二種類が含まれていた。
【０１２０】
５）完全長ｃＤＮＡのスクリーニング
４）で得られたｃＤＮＡクローンＴＭ１００、ＴＭ７５をベクターから切り出し、これをプローブに用いてタモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１４×１０ｃｍの角形シャーレにＺＡＰ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の説明書きに従って、約２０，０００ｐｆｕのファージを宿主菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ ＭＲＦ’とともにプレーティングした。プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行いＤＮＡを変性させ、メンブレン上に固定させた。プローブはｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩＴＭ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて３２Ｐラベルした。ハイブリダイゼーションは０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５℃で一晩、洗浄の条件は４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５°Ｃ、２０分を２回行った。１次スクリーニングで約１６０，０００ｐｆｕのファージからＴＭ１００プローブで６００個、ＴＭ７５プローブで３０個のポジティブクローンが得られた。うちＴＭ１００プローブで２４個、ＴＭ７５プローブで１２個のクローンに関して、２次スクリーニング、プラークの精製を兼ねた３次スクリーニングを行い、選抜されたクローン全てについてＺＡＰ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の説明書きに従って、ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎを行った。その結果、ＴＭ１００プローブで１８個、ＴＭ７５プローブで１２個のクローンが、ファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫに組み込まれたｃＤＮＡとして回収された。これらのクローンに関して制限酵素分析によりインサート長を同定した。
【０１２１】
６）塩基配列の決定
上記の各ｃＤＮＡクローンについて、最長のクローンの全塩基配列を両鎖とも決定した。まず、Ｍ１３プライマー（ｔａｋａｒａ）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）でクローンの５’、３’両部分の塩基配列を決定した。
【０１２２】
次に、ＴＭ１００由来の最長クローンの５’部分の塩基配列情報を基に、プライマー
ＴＭ１００ｉｎＲＶ： gTC AAg gCg TTA CTC Tgg
（配列番号１４）
を、同３’部分の塩基配列情報を基にプライマー
ＴＭ１００ｉｎＦＷ： CTg ggT gAg gAT CAC CTC
（配列番号１５）
を、さらにＴＭ７５由来の最長クローンの５’部分の塩基配列情報を基に、プライマー
ＴＭ７５ｉｎＲＶ： gAT gTC TAC gTg CCC TAC
（配列番号１６）
を、同３’部分の塩基配列情報を基にプライマー
ＴＭ７５ｉｎＦＷ： ACg ACT CAg AgA AgA ACT g
（配列番号１７）
をそれぞれ合成し、配列決定に利用した。以上のようにしてＴＭ１００及びＴＭ７５由来の最長クローンについてＤＮＡの両鎖の配列を解読し、全塩基配列を決定した。
【０１２３】
その結果、タモギタケ抗菌タンパクをコードするｃＤＮＡ（ＴＭ１００プローブ由来）は全長６７１塩基からなり（配列番号１）、１４３個のアミノ酸をコードしていた（配列番号２）。精製タンパク質から決定されたＮ末端のアミノ酸は、配列番号２のアミノ酸配列の８−７６のアミノ酸残基に相当した。配列番号２のアミノ酸配列と精製タンパク質から直接決定された６７個のアミノ酸の相同性は、決定されなかった２個のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸配列では第６５番目のＷ、および第７３番目のＳに相当）以外の全てのアミノ酸が同一であった。このことから、クローニングしたｃＤＮＡはタモギタケ抗菌タンパクをコードする遺伝子に由来すると結論された。
【０１２４】
ｃＤＮＡ配列から決定されるタンパク質のＮ末端と、実際の精製タンパク質のＮ末端は一致せず、翻訳開始メチオニンの７アミノ酸後ろのＬ（ロイシン）が、精製タンパク質のＮ末端であった。このことから、タモギタケ抗菌タンパク質は、まず前駆体型として翻訳された後、Ｎ末のリーダー配列（７アミノ酸）が切り離されると推定された。推定成熟タンパクのアミノ酸配列（配列番号２のうち８−１４３の１３６個のアミノ酸配列）から遺伝子配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒ３．２（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて平均分子量を求めると１５１５８．４となり、等電点は６．２２と算出された。この分子量は精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見積もり（１５ｋＤａ）と良く一致した。また推定糖鎖付加部位が二カ所（配列番号２のアミノ酸残基２１、同７１のＮ）存在していた。
【０１２５】
一方、タモギタケ抗菌タンパクのホモローグをコードするｃＤＮＡ（ＴＭ７５由来）は全長８４０塩基からなり（配列番号３）、１４１個のアミノ酸をコードしていた（配列番号４）。このｃＤＮＡの５’側には３個のＡＴＧが存在するが、一つ目と二つ目のＡＴＧから翻訳を開始するとそれらのすぐ後ろに終止コドンが現われ、それぞれ１２個、３１個のアミノ酸しかコードできない。１４１個のアミノ酸をコードできるのは三番目のＡＴＧから翻訳が開始されたときのみである。またこのＡＴＧの１０２ｂｐ上流には同じ読み枠で終止コドンＴＧＡが位置していた。従って三番目のＡＴＧが翻訳開始コドンであることはほぼ確実である。
【０１２６】
推定成熟アミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸配列のうち８−１４１の残基からなる１３４個のアミノ酸配列）から推定される分子量は１４７３２．２、等電点は８．６２と算出された。また推定糖鎖付加部位が一カ所（配列番号４のアミノ酸番号１１５のＮ）存在していた。ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮを用いて本発明のタモギタケ抗菌タンパク質とそのホモローグの相同性を解析したところ、アミノ酸で６５．５％、ＤＮＡで６４．５％（ＯＲＦ部分は７２．２％）であった。
【０１２７】
本発明のタモギタケ由来抗菌タンパク質およびその遺伝子、さらにそのホモローグとそれにコードされるアミノ酸配列をもつタンパク質について、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った。本発明のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果、ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓのストレプトアビジン ｖ２（寄託番号：Ｑ５３５３３， Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２６３：ｐ．６０−６６．）、ｖ１（寄託番号：Ｑ５３５３２）、ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ ｉｉのストレプトアビジン（寄託番号： Ｐ２２６２９， Ａｒｇａｒａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １４：ｐ．１８７１−１８８２）等が相同性を有するものとしてヒットした。相同性は３つともに１２８アミノ酸に渡り、それぞれ５０％、４９％、４９％であった。これらより低い相同性で卵白アビジン（Ｇｏｐｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：ｐ．３５９５−３６０６．）やいくつかのアビジン関連タンパク質（Ｋｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２０：ｐ．６１５−６２１．）もヒットした。なお、ストレプトアビジンと１アミノ酸のみ異なり、Ｎ末端側、Ｃ末端側がそれぞれ３６アミノ酸分、２０アミノ酸分ストレプトアビジンよりも短くなっているコアストレプトアビジンミュータントｗ７９ｆ ＣｈａｉｎＢ（Ｆｒｅｉｔａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：ｐ．１１５７−１１６６）もヒットした。相同性は５１．７％であった。
【０１２８】
以上のことから、本タンパク質は新規なタンパク質であると考えられた。本発明の第２のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果では、ストレプトアビジン ｖ２、ｖ１、ストレプトアビジンとそれぞれ５０％、４８％、４８％の相同性を示した。
【０１２９】
一方、第１のタモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１の７１−５０２）および第２のタモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３の２２６−６５１）を用いた同データベース検索では、非常に短い範囲（２３ｂｐ）で相同性の見られる配列がいくつか検出されたに過ぎず、ストレプトアビジンのＤＮＡ配列等は検出されてこなかった。これは、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡ配列はＤＮＡレベルではストレプトアビジンのＤＮＡ配列等と相同性があまり高くないことを意味する。
【０１３０】
本抗菌タンパク質は食用キノコタモギタケから精製された新規なストレプトアビジン様タンパク質であるので’ｔａｍａｖｉｄｉｎ’と命名した。精製したタンパク質由来の遺伝子をｔａｍ１、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質をｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍ１のホモローグをｔａｍ２、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質をｔａｍａｖｉｄｉｎ２と呼ぶこととする。遺伝子配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒ３．２を用いて本発明のタモギタケ抗菌タンパク質とストレプトアビジン（ストレプトアビジンはストレプトアビジン ｖ２、ｖ１とそれぞれ９アミノ酸、１アミノ酸異なるだけである）のアミノ酸配列全体の相同性を解析したところ、ｔａｍ１のコードするｔａｍａｖｉｄｉｎ１のアミノ酸配列で４６．７％、ｔａｍ２のコードするｔａｍａｖｉｄｉｎ２のアミノ酸配列で４８．１％の相同性（アミノ酸同一性）を示した。一方、ＤＮＡ配列（配列番号１および３）全体ではストレプトアビジンとの相同性はｔａｍ１で５３．８％（ＯＲＦ部分では５６．８％）、ｔａｍ２では５１．０％（ＯＲＦ部分では５７．３％）であった。またｔａｍ１にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で３１．２％、ＤＮＡ配列で４２．４％であり、ｔａｍ２にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で３６．２％、ＤＮＡ配列で４１．８％であった。
【０１３１】
Ｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍａｖｉｄｉｎ２、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン Ｖ１、ストレプトアビジン Ｖ２、およびアビジンの成熟タンパク領域のアミノ酸配列の分子系統樹を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮを用いてＵＰＧＭＡ法により作成した。その結果、図７に示した通りｔａｍａｖｉｄｉｎ１およびｔａｍａｖｉｄｉｎ２は、ストレプトアビジンのグループおよびアビジンとは異なる第３のグループを形成していることが明らかとなった。
【０１３２】
ストレプトアビジンと比較した場合、本発明のｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍａｖｉｄｉｎ２はＮ末端側が３３アミノ酸短くなっているが、ビオチンとの結合に関与していると考えられているトリプトファン（Ｗ）残基（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５６：ｐ．２７９−２８２）、チロシン（Ｙ）残基（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６９：ｐ．５２７−５３０）は全て保存されている（配列番号２のアミノ酸配列のうち第３４、第４５番目のＹ、第８２、第９８、第１１０番目のＷ、配列表の配列番号４のアミノ酸配列のうち、第３４、第４５番目のＹ、第８０、第９６、第１０８番目のＷ）。
【０１３３】
また成熟タンパク質領域と考えられる部分（配列番号２のアミノ酸配列のうち８−１４３の配列、配列番号４のアミノ酸配列のうち８−１４１の配列）の平均分子量はそれぞれ１５１５８．４、１４７３２．２と算出され、成熟ストレプトアビジンや成熟アビジンの平均分子量（それぞれ１６４９０．６、１４３４２．９）と似ていた。これらのことは、ｔａｍ１にコードされているｔａｍａｖｉｄｉｎ１は勿論、ｔａｍ２にコードされているｔａｍａｖｉｄｉｎ２についてもビオチン結合能を有するタンパク質であることを強く示唆するものである。
【０１３４】
実施例４ ビオチン添加による抗菌活性消失実験
本発明の抗菌タンパク質は新規なストレプトアビジン様タンパク質であることから、ビタミンの一種であるＤ−ビオチン（ビタミンＨ、片山化学工業社製）と結合することが示唆される。一方いもち病菌はその生育にビオチンが必要であることが知られている。これらのことから、本抗菌タンパク質はアッセイ培地に存在する遊離ビオチンと結合し、これが培地中のビオチン欠乏を引き起こし、結果としていもち病菌の生育が抑えれると予測される。
【０１３５】
ビオチン添加による抗菌活性の消失実験の結果を図８に示す。具体的には、マイクロタイタープレートに１／２ ＰＤ培地に懸濁したいもち病菌の胞子を入れ、そこへ精製ｔａｍａｖｉｄｉｎ１を５０ｎｇ／ｍｌまたは１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加したウェル、さらに１０００ｎｇ／ｍｌのｔａｍａｖｉｄｉｎ１に加え１００ｎｇ／ｍｌの濃度のビオチンを加えたウェル、またタンパク質無添加の対照ウェルを設け、２８℃で４８時間培養した。
【０１３６】
その結果、図８に示されるようにｔａｍａｖｉｄｉｎ１添加ウェルでは、５０ｎｇ／ｍｌの濃度でもいもち病菌の菌糸の伸長はかなり抑えられた。これに対し、ｔａｍａｖｉｄｉｎ１（１０００ｎｇ／ｍｌ）とビオチンの両方を添加したウェル、および対照ウェルでは菌糸は正常に伸長した。このように実際にアッセイ培地中にビオチンを過剰に添加すると本抗菌タンパク質の抗菌活性は消去された。これは過剰に加えたビオチンのある一定量が、アッセイに使用したｔａｍａｖｉｄｉｎ１の殆どと結合しその抗菌性を不活化したためであると推論された。
【０１３７】
さらに市販の卵白アビジン（Ｓｉｇｍａ社製）、およびｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ アビジンｉｉのストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ社製）を用い、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で同様の試験を行った。その結果、両タンパクともに、いもち病菌に対して抗菌活性があり、その活性はビオチンで打ち消されることが明らかとなった（図８）。
【０１３８】
実施例５ 組換えＴａｍａｖｉｄｉｎ２タンパク質のビオチン結合活性
１）発現ベクターの構築
ｔａｍ２遺伝子は本発明のｔａｍ１遺伝子のホモログとして単離された遺伝子であるが、このｔａｍ２遺伝子によってコードされるｔａｍａｖｉｄｉｎ２が、実際にビオチン結合活性を示すか否かを調べた。具体的にはｔａｍ２遺伝子を大腸菌に組み込み、組換えｔａｍａｖｉｄｉｎ２を発現させ、このタンパク質がイミノビオチンカラムで精製されるか否かを調べた。
【０１３９】
先ず、実施例３で得られたｔａｍ２遺伝子の全ＯＲＦ（配列表の配列番号３のうち、第２２６番目から第６５１番目の塩基）をＰＣＲにより増幅させるため、一組のプライマー
ＴＭ７５Ｂｓｐ５： ５’−ACCAACATgTCAgACgTTCAA−３’
（配列番号１８）
ＴＭ７５Ｈｉｎ３： ５’−ATgAAAgCTTTTACTTCAACCTCgg−３’
（配列番号１９）
を合成した。ＴＭ７５Ｂｓｐ５には制限酵素ＢｓｐＬＵ １１Ｉの認識部位（下線で示した）が、ＴＭ７５Ｈｉｎ３には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位（下線で示した）がそれぞれ組み込まれている。これらのプライマーを使ってｔａｍ２遺伝子が組み込まれたプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、実施例３（６））を鋳型にＰＣＲを行なった。５０μｌの反応液中に、鋳型プラスミドＤＮＡ ５００ｎｇ，１０´Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ，２．５ｍＭ 各ｄＮＴＰｓ ４μｌ，各プライマー １０ｐｍｏｌｅｓ，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製） ０．５μｌ、をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ社製）を用いて、９４℃、３分を１回、９４℃、１分、５０℃、１分、７２℃、１分を１５回、７２℃、６分を１回行った。
【０１４０】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＬＵ １１Ｉ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ社製）で二重消化し、ゲル精製した。大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社製）を用いた。このベクターを制限酵素ＮｃｏＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＨｉｎｄＩＩＩで二重消化しゲル精製したものを、上述の制限酵素処理を施したＰＣＲ産物とライゲーションし、大腸菌ＴＢ１に組み込んだ。組み込んだｔａｍ２遺伝子の塩基配列を確認した。
【０１４１】
２）組換えタンパク質の発現とビオチンカラムによる精製
ｔａｍ２が組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００＝０．５程度になるまで菌を前培養した。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度で１ｍＭ加え、タンパク質発現を誘導し、３７℃でさらに４．５時間振盪培養した。培養スケールは５０ｍＬとし、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−b−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、和光純薬社製）を加えないものを対照とした。菌体を遠心分離によって集め、タンパク質精製まで−８０℃で保存した。
【０１４２】
Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２の精製は、Ｈｏｆｍａｎｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４６６６−４６６８（１９８０））を参考に、イミノビオチンによる精製を行なった。菌体を１．５ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＣＡＰＳ（３−［Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＳＩＧＭＡ社製）、ｐＨ１１，５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に懸濁し、ソニケーションにより菌体を破壊した。遠心後上清を総可溶性タンパク質とした。２−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製） ０．５ｍＬを直径０．５ｃｍ、長さ５ｃｍのカラムに充填し、緩衝液Ａで平衡化した。このイミノビオチンアガロースカラムに、総可溶性タンパク質を通過させた。カラムを５ｍＬの５０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１，５００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、１．５ｍＬの５０ｍＭ ＮＨ４ＯＡＣ ｐＨ４．０によりｔａｍａｖｉｄｉｎ２を溶出した。総可溶性タンパク質、カラム通過画分、洗浄画分、溶出画分を１５％ ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した。
【０１４３】
泳動後、タンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０（和光純薬社製）で染色した。結果を図９に示す。図９に示すように、１ｍＭのＩＰＴＧによってタンパク質発現誘導をかけた大腸菌の総可溶性タンパク質画分（Ｔ）に、発現誘導をかけなかった場合（Ｃ）には存在しない１５ｋＤａ付近のバンドが見られた。この分子量はｔａｍ２遺伝子のコードする１４１個のアミノ酸から推定される分子量１５４６７と良く一致した。
【０１４４】
さらにこの１５ｋＤａタンパク質は、イミノビオチンカラム通過画分（Ｆ）、同洗浄画分（Ｗ）には現れず、５０ｍＭ ＮＨ４ＯＡＣ ｐＨ４．０による溶出画分（Ｅ）に現れた。溶出画分ではこの１５ｋＤａタンパク質が主要要素となっていた。この結果から、ｔａｍ２にコードされるｔａｍａｖｉｄｉｎ２は、ビオチンに結合することが明らかとなった。しかも上記に示す方法で簡便に精製され得ることが明らかとなった。５０ｍＬの培養で得られる大腸菌発現組換えｔａｍａｖｉｄｉｎ２の収量はおよそ１ｍｇであった。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、本発明抗菌タンパク質によるいもち病菌の生育阻害の様相を示す（８０℃、１０分処理したタンパク質画分を添加した。培養開始４８時間後の結果）。
【図２】図２は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムによって分離されたタモギタケタンパク質の各画分の電気泳動像と抗菌性との関係を示す。Ｍは分子量マーカーを、ＦＴはカラム通過画分を示す。またレーン下の記号（−、＋、＋＋）は抗菌活性の強さを示す。括弧内の抗菌活性は本発明で精製したものとは別の抗菌活性を示す。
【図３】図３は、ＭｏｎｏＱカラムによるタモギタケ抗菌タンパクの分離のチャートと抗菌活性との関係を示す。抗菌活性を示した溶出位置を＋で示した。
【図４】図４は、ＭｏｎｏＱカラムによるタモギタケ抗菌タンパクの分離の電気泳動像と抗菌活性との関係を示す。レーン上の番号は図３の画分番号に一致し、Ｍは分子量マーカーを、ＯｒｉはＭｏｎｏＱにかけたＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分をそれぞれ示す。またレーン下の記号（−、＋、＋＋、＋＋＋）は抗菌活性の強さを示す。抗菌タンパク（１５ｋＤａ）を矢印で示した。
【図５】図５は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６によるタモギタケ抗菌タンパク質の精製チャートと抗菌活性との関係を示す。矢印はＧｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の溶出位置を示す。抗菌活性を示した画分の位置を＋で示した。
【図６】図６は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６によるタモギタケ抗菌タンパク質の精製の電気泳動像と抗菌活性との関係を示す。レーン上の番号は図５の画分番号に一致し、ＯｒｉはＳｕｐｅｒｏｓｅ ６にかけたＭｏｎｏＱ画分を、Ｍは分子量マーカーを示す。またレーン下の記号（−、＋、＋＋）は抗菌活性の強さを示す。抗菌タンパク質（１５ｋＤａ）を矢印で示した。
【図７】図７は、ｔａｍａｖｉｄｉｎ１とｔａｍａｖｉｄｉｎ２、ストレプトアビジンとそのホモローグ、アビジンのアミノ酸配列（成熟タンパク質領域）の分子系統樹を示す。
【図８】図８は、ビオチン添加による抗菌活性の消失実験の結果を示す。マイクロタイタープレートに１／２ ＰＤ培地に懸濁したいもち病菌の胞子を入れ、そこへ１０００ｎｇ／ｍｌの濃度の精製ｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ストレプトアビジン、アビジンを添加したウェル、さらに同濃度のそれらタンパク質に加え１００ｎｇ／ｍｌの濃度のビオチンを加えたウェル、さらにタンパク質無添加のウェルを作成し、２８°Ｃで４８時間培養した。５０ｎｇ／ｍｌの濃度の精製ｔａｍａｖｉｄｉｎを添加したウェルも同時に示した。
【図９】図９は、大腸菌発現組換えｔａｍａｖｉｄｉｎ２のイミノビオチンカラムによる精製を示す。ＣはＩＰＴＧ誘導をかけない大腸菌の総可溶性タンパク質画分を、Ｔは１ｍＭのＩＰＴＧによってタンパク質発現誘導をかけた大腸菌の総可溶性タンパク質画分を示す。Ｆは、１ｍＭのＩＰＴＧによって、タンパク質発現誘導をかけた大腸菌の総可溶性タンパク質のうちイミノビオチンカラムに結合せず、通過したタンパク質の画分を、Ｗは同カラムの洗浄処理によって溶出された画分を、Ｅは酸性緩衝液により溶出された画分をそれぞれ示す。Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２タンパク質（およそ１５ｋＤａ）を矢印で示し、分子量マーカー（ＬＭＷ マーカーキット：Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社製）をＭで示した。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗菌活性を有する新規なタンパク質とその製造法、それをコードする遺伝子、及び上記タンパク質及び遺伝子の利用法に関するものである。詳細には、本発明は、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有するタモギタケ由来タンパク質、上記タンパク質をコードする遺伝子、並びに上記タンパク質及び上記遺伝子の利用法に関する。
【０００２】
本出願は、２００１年３月１２日に提出された日本特許出願 特願２００１−６８８９４号を基礎とする優先権主張出願である。当該日本特許出願の内容は全て本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
従来、植物病原菌に対して抗菌活性のある植物のタンパク質として、キチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼなどの溶菌酵素が知られている。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、これらの酵素は単独でも効果があるが（Ｓｃｈｌｕｍｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：ｐ．３６５−３６７）、一般に２種類以上の酵素を組み合わせることにより、より高い効果が出ることが知られている（Ｍａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８８：ｐ．９３６−９４２）。これら溶菌酵素が糸状菌の生育を抑制する濃度は一般的には、単独の場合数十〜数百μｇ／ｍｌ程度、組み合わせの場合でも各々数μｇ／ｍｌ程度を必要とすることが知られている。しかしながら、これらの溶菌酵素の中で、イネの重要病害であるいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）に対して抗菌的に働くことが証明されたものは未だ報告されていない。
【０００４】
一方、ディフェンシンをはじめとする小分子量ＡＦＰ（Ａｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）も抗微生物活性をもつ。このうちイネのいもち病菌に抗菌的に働くものとして、Ｃａ−ＡＭＰ１（特表平８−５０５０４８）、ＣＢ−１（Ｏｉｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０：ｐ．４８１−４８３）、Ｒｓ−ＡＦＰ１とＲｓ−ＡＦＰ２（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：ｐ．１５３０１−１５３０９）、及びＡｃｅ−ＡＭＰ１（特表平９−５０１４２４）が報告されている。これらの低分子のペプチドは数μｇ／ｍｌ程度で上記病原菌を含む各種の植物病原菌の生育を５０％阻害する。
【０００５】
溶菌酵素あるいは低分子量抗菌ペプチドの遺伝子を単離、植物に導入し、病害抵抗性植物を作出しようという試みもなされている（Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：ｐ．１１９４−１１９７；Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：ｐ．５７３−５８８）。イネにおける研究では、最近イネ由来キチナーゼを過剰発現した形質転換イネのいもち病抵抗性が増強されたことが報告された（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９９：３８３−３９０）。
【０００６】
これらの他に遺伝子導入による病原菌抵抗性植物の作出例として、ＰＲタンパク質（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：ｐ．７３２７−７３３１）、グルコースオキシダーゼ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：ｐ．１３５７−１３６８）、スチルベンシンターゼ（Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６１：ｐ．１５３−１５６）などが報告されている。
【０００７】
しかし、現状では、必ずしも実用化レベルの抵抗性を付与された植物体が得られていないことが多い。この理由としては、導入した遺伝子の発現レベルが低いことがあげられるが、より本質的には、これまでに報告されている抗菌タンパク質自体の抗菌力が低いことによるものと考えられる。従って、従来の抗菌タンパク質よりさらに強力な抗菌タンパク質を同定して利用を図ることが望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の開示
本発明の目的の１つは、比較的低濃度でイネの重要病害であるいもち病菌をはじめとする様々な植物病原菌の生長を抑止できる新規な抗菌タンパク質を検索、同定することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、上記の新規タンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、その塩基配列を特定することである。
本発明のさらに別の目的は、本発明の遺伝子を宿主生物（微生物、動物または植物など）に導入して形質転換体を作出し、本発明の遺伝子の利用を図ることである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、本発明の抗菌タンパク質を含む抗菌剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の詳細な説明
上記課題を解決することを目的として、本発明者らは、先ず、いもち病菌に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌活性を検定するためのアッセイ系を確立した。
【００１２】
さらに、食用キノコの一つであるタモギタケからタンパク質を抽出し、イオン交換カラム、ゲル濾過カラムを組み合わせ、各画分を上記抗菌アッセイに供試することにより、抗菌タンパク画分を同定、抗菌タンパクを分離・精製した。さらに精製タンパクの部分アミノ酸配列を決定し、これをもとにオリゴＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲにより当該タンパクをコードする部分長ｃＤＮＡを得た。次いで、この部分長ｃＤＮＡををプローブとしてタモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより当該タンパクをコードする完全長のｃＤＮＡを同定し、全塩基配列を決定した。こうしてタモギタケ抗菌タンパクの全アミノ酸配列と、それをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を同定し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明の第１の側面によれば、タモギタケの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分子量が約１５ｋＤａである、抗菌タンパク質が提供される。
【００１４】
本発明の抗菌タンパク質は典型的には、本明細書中の配列表の配列番号２で表される１４３個のアミノ酸配列で特徴づけられる。本タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量がおよそ１５ｋＤａ（本明細書において後述する配列表の配列番号２の配列のうち第８番目から第１４３番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドに相当）と見積もられるポリペプチドが一つのユニットとなっている。また本タンパク質は、ゲル濾過カラムで分子量が約３０ｋＤａであることを特徴とするタンパク質として同定された。
【００１５】
本発明の抗菌タンパク質はまた、配列表の配列番号４で表される１４１個のアミノ酸を有するタンパク質を含む。配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質も、前記配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量がおよそ１５ｋＤａと見積もられるポリペプチドが一つのユニットとなっており、ゲル濾過カラムで分子量が約３０ｋＤａである。
【００１６】
本発明の抗菌タンパク質は、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列のみでなく、当該配列において１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列若しくはこの配列と５２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す抗菌タンパク質も含む。
【００１７】
本発明の抗菌タンパク質は、好ましくは、配列表の配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と５２％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１８】
本発明の抗菌タンパク質に関して、各々の具体的アミノ酸配列と「５２％以上の相同性を有するタンパク質」という定義は、少なくとも５２％の相同性を有していればよいことを意味するが、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が意図される。
【００１９】
本発明の第２の側面によれば、配列表の配列番号２又は４の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、例えば、配列番号２の部分アミノ酸配列８−１４３又は配列番号４の部分アミノ酸配列８−１４１からなるポリペプチド；並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に１〜複数個のアミノ酸変異を有するポリペプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと５２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリペプチド；の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質が提供される。
【００２０】
本発明の第３の側面によれば、タモギタケの水性抽出液から硫安７５％飽和を使用する硫安沈殿法で沈殿する画分を回収する工程；および
上記画分をイオン交換クロマトグラフィーにかけＮａＣｌ濃度５０ｍＭから６００ｍＭの濃度で溶出する画分を回収する工程；
を含む、本発明の抗菌タンパク質の製造方法が提供される。
【００２１】
本発明の第４の側面によれば、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の遺伝子は、典型的には、配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列（以下、本明細書中、単に「配列番号１又は３の塩基配列」という場合もある）、上記塩基配列中に１〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する。
【００２２】
本発明の遺伝子は、一般的には、配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する。
【００２３】
本発明の第５の側面によれば、タモギタケ由来の抗菌タンパク質を得るためのオリゴヌクレオチドであって、
配列表の配列番号１又は３に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列表の配列番号１０ないし１７の何れか１項に記載のヌクレオチド配列を有する。
本発明の第６の側面によれば、上記オリゴヌクレオチドの２種の組をプライマーとして用いて、タモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして増幅反応を行い本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の一部を増幅し、得られた増幅産物をプローブとして使用して上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして完全長ｃＤＮＡクローンを単離することを含む、本発明の遺伝子の単離方法が提供される。
【００２５】
本発明の第７の側面によれば、本発明の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。
本発明の組換えベクターにおいて、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。
本発明の第８の側面によれば、宿主生物に本発明の組換えベクターを導入して得られる形質転換体が提供される。
【００２６】
本発明の第９の側面によれば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤が提供される。
発明の実施の形態
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
【００２７】
タモギタケ由来抗菌タンパク質
本発明の第一の側面によれば、植物病原菌に対して抗菌効果のあるタモギタケ由来のタンパク質が提供される。本発明のタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の抗菌タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００２８】
本発明のタンパク質は典型的には、配列表の配列番号２に記載の１４３個のアミノ酸配列又は配列番号４に記載の１４１個のアミノ酸配列を有する。しかし、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１または複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。本発明のタンパク質は、クローニングされた遺伝子の塩基配列からの推測に基づいて、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくとも５２％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００２９】
また、一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９））に記載の部位特異的突然変異誘発法等が使用可能である。
【００３０】
本明細書において、相同性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。あるいは、ＧＥＮＥＴＹＸ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）やＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）のような遺伝子配列解析ソフトを用いて、配列情報を比較し、決定することが可能である。
【００３１】
本発明のタモギタケ由来抗菌タンパク質およびその遺伝子、さらにそのホモローグとそれにコードされるアミノ酸配列をもつタンパク質について、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った。本発明の第一のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果、ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓのストレプトアビジン ｖ２（寄託番号：Ｑ５３５３３， Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２６３：ｐ．６０−６６）、ストレプトアビジン ｖ１（寄託番号：Ｑ５３５３２）、ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ ｉｉのストレプトアビジン（寄託番号：Ｐ２２６２９， Ａｒｇａｒａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １４：ｐ．１８７１−１８８２）等が相同性を有するものとしてヒットした。相同性は３つともに１２８アミノ酸に渡り、それぞれ５０％、４９％、４９％であった。また、コアストレプトアビジンミュータントｗ７９ｆ（ＣｈａｉｎＢ）（Ｆｒｅｉｔａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：ｐ．１１５７−１１６６）と１２０アミノ酸に渡り、５１．７％の相同性を示した。
【００３２】
これらより低い相同性で卵白アビジン（Ｇｏｐｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：ｐ．３５９５−３６０６）やいくつかのアビジン関連タンパク質（Ｋｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２０：ｐ．６１５−６２１）もヒットした。以外のことから、本タンパク質は新規なタンパク質であると考えられる。
【００３３】
本発明の第２のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果では、ストレプトアビジン ｖ２、ｖ１、ストレプトアビジンとそれぞれ５０％、４８％、４８％の相同性を示した。
【００３４】
本抗菌タンパク質は食用キノコタモギタケから精製された新規なストレプトアビジン様タンパク質であるので「ｔａｍａｖｉｄｉｎ」と命名した。本明細書において、精製したタンパク質由来の遺伝子をｔａｍ１、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質をｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍ１のホモローグをｔａｍ２、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質をｔａｍａｖｉｄｉｎ２と呼ぶこととする。
【００３５】
また、配列番号２及び４のアミノ酸残基１−７は抗菌タンパク質の前駆体のリーダーペプチドの相当すると考えられる。よって、配列番号２のアミノ酸残基８−１４３及び配列番号４の８−１４１は、抗菌タンパク質の成熟型である。従って、本発明によれば、配列番号２の部分アミノ酸配列８−１４３又は配列番号４の部分アミノ酸配列８−１４１からなるポリペプチド、並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に１〜複数個のアミノ酸変異を有するポリペプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと５１％より高い相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであってイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリペプチド、の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質も提供される。
【００３６】
本発明のタンパク質の精製および単離は、硫安沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱ、Ｑ ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＤＥＡＥなど）、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２等）などのタンパク質の精製および単離のために慣用される方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００３７】
例えば、下記の実施例において記載するように、細粉化したタモギタケを緩衝液で抽出した後、ろ過し、その上清に硫安（硫酸アンモニウム）を好適な濃度、例えば７５％飽和になるまで添加して静置することにより本発明のタンパク質を含む沈殿が得られる。この沈殿をさらに透析した後、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度のグラジェント（例えば、塩化ナトリウムで５０ｍＭから６００ｍＭ）で溶出し、所望のタンパク質を含む画分を抗菌活性を指標に回収する。さらにゲルろ過を行い、分子量３０ｋＤａ付近の画分を回収すればよい。限定されるわけではないが、本発明の抗菌タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量が約１５ｋＤａである。
【００３８】
あるいは、本発明による配列番号１のＤＮＡ配列の７１（若しくは９２）から５０２の配列から成るＤＮＡ配列、または配列番号３の２２６（若しくは２４７）から６５１の配列から成るＤＮＡ配列を、大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて公知の導入法を用いて導入、発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
【００３９】
本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや、ＰＣＲという遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種、好ましくは菌類、より好ましくはキノコ、カビ、酵母などの含まれる真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）、多くのキノコが属する担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、さらに好ましくはタモギタケの属するハラタケ類（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）のキノコ例えばヒラタケ、シイタケ、ナラタケ、マツタケ、シメジ類、エノキタケ、マイタケ、アンズタケ、エリンギタケなどから同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が単離され得ると考えられる。このような場合、それらの新規タンパク質も本発明の範囲に含まれるものである。
【００４０】
抗菌タンパク質遺伝子
本発明はまた、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子をも提供する。遺伝子の種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成ＤＮＡの何れでもよく、またゲノムＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローンの何れでもよい。
【００４１】
本発明の遺伝子は典型的には、配列番号１又は３に記載の塩基配列を有するが、これは本発明の一例を示すにすぎない下記の実施例で得られたクローンの塩基配列である。天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１又は３に記載の塩基配列を有する遺伝子のみに限定されるわけではなく、本発明の抗菌タンパク質をコードする全ての遺伝子を包含する。
【００４２】
特に、本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、そのような遺伝子も本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
タモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１の７１−５０２のＤＮＡ配列）および第２のタモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３の２２６−６５１のＤＮＡ配列）を用いたＧｅｎｅＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ検索では、非常に短い範囲（２３ｂｐ）で相同性の見られる配列がいくつか検出されたに過ぎず、ストレプトアビジンのＤＮＡ配列等は検出されてこなかった。これは、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡ配列はＤＮＡレベルではストレプトアビジンのＤＮＡ配列等と相同性があまり高くないことを意味する。
【００４４】
より詳細には、遺伝子配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒ３．２（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）を用いて、本発明のタモギタケ抗菌タンパク質（ｔａｍａｖｉｄｉｎ１及び２）とストレプトアビジン（ストレプトアビジンはストレプトアビジンｖ２、ｖ１とそれぞれ９アミノ酸、１アミノ酸異なるだけである）のアミノ酸配列全体の相同性を解析した。その結果、本発明のｔａｍ１のコードするｔａｍａｖｉｄｉｎ１のアミノ酸配列で４６．７％、ｔａｍ２のコードするｔａｍａｖｉｄｉｎ２のアミノ酸配列で４８．１％の相同性（アミノ酸同一性）を示した。一方、ＤＮＡ配列（配列表の配列番号１および３）全体ではストレプトアビジンとの相同性はｔａｍ１で５３．８％、ｔａｍ２では５１．０％であった。またｔａｍ１にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で３１．２％、ＤＮＡ配列で４２．４％であり、ｔａｍ２にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で３６．２％、ＤＮＡ配列で４１．８％であった。なお、ｔａｍａｖｉｄｉｎ１とｔａｍａｖｉｄｉｎ２のアミノ酸配列間、並びにそれらをコードする遺伝子ｔａｍ１とｔａｍ２のＤＮＡ配列間の相同性はそれぞれ６５．５％、６４．５％であった。
【００４５】
ストレプトアビジンと比較した場合、本発明のｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍａｖｉｄｉｎ２はＮ末端側が３３アミノ酸短くなっているが、ビオチンとの結合に関与していると考えられているトリプトファン（Ｗ）残基（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ ２５６：ｐ．２７９−２８２）、チロシン（Ｙ）残基（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６９：ｐ．５２７−５３０）は全て保存されている（配列番号２のアミノ酸配列のうち第３４、第４５番目のＹ、第８２、第９８、第１１０番目のＷ、配列番号４のアミノ酸配列のうち、第３４、第４５番目のＹ、第８０、第９６、第１０８番目のＷ）。
【００４６】
また成熟タンパク質領域と考えられる部分（配列番号２のアミノ酸配列のうち第８番目から第１４３番目のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列のうち第８番目から第１４１番目のアミノ酸配列）の平均分子量はそれぞれ、１５１５８．４、１４７３２．２と算出され、成熟ストレプトアビジンや成熟アビジンの平均分子量（それぞれ１６４９０．６、１４３４２．９）と似ている。
【００４７】
ストレプトアビジンは放線菌Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ ｉｉ由来、アビジンは鳥類（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）の卵白由来である。これまでにストレプトアビジンによく似たタンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓから前述のストレプトアビジン ｖ１およびｖ２（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２６３：ｐ．６０−６６）が、またアビジン遺伝子のホモローグとして鳥類からアビジン関連遺伝子（ａｖｒ１−ａｖｒ５， Ｋｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２０：ｐ．６１５−６２１）が単離されている。ストレプトアビジンとストレプトアビジン ｖ１およびｖ２とのアミノ酸配列の違いはそれぞれ１アミノ酸、９アミノ酸であり、アビジンとアビジン関連タンパク質とのアミノ酸配列の相同性は６８−７８％、ＤＮＡ配列の相同性は８８−９２％である。ストレプトアビジンとアビジンの相同性はアミノ酸配列で２９．２％、ＤＮＡ配列で４６．８％である。
【００４８】
一方、本発明の抗菌タンパク質の好ましい一態様であるｔａｍａｖｉｄｉｎ１および２は担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）由来であり、先述のようにストレプトアビジンとのアミノ酸配列相同性はそれぞれ４６．７％、４８．１％、またアビジンとのアミノ酸配列相同性はそれぞれ３１．２％、３６．２％である。この様にｔａｍａｖｉｄｉｎ１、２は、放線菌のストレプトアビジンのグループ、鳥類のアビジンのグループとは異なる第３のグループを形成している。放線菌、鳥類以外からこのようなアビジン様タンパク質が単離されたのはこれが初めてである。ｔａｍａｖｉｄｉｎ１、２はキノコ類のアビジン様タンパク質であるが、他のキノコ類にも同様なタンパク質が含まれている可能性は高いと予測される。ｔａｍａｖｉｄｉｎ１、２のアミノ酸配列、ｔａｍ１、ｔａｍ２のＤＮＡ配列は、そのようなタンパク質およびその遺伝子をさらに検索、単離することに利用し得る。
【００４９】
相同遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９））に記載されているように、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃で、数時間から一晩などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは４５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または３０℃ないし４２℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。洗浄の条件としては、例えば０．２×ＳＳＣで４５℃ないし６８℃が挙げられる。ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子は全て本発明の範囲の中に含まれる。
【００５０】
核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，ｐ．１３５０−１３５４）、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（ウーら、１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，ｐ．５６０−５６９；バリンガーら、１９９０，Ｇｅｎｅ ８９，ｐ．１１７−１２２；バラニーら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，ｐ．１８９−１９３）および転写に基づく増幅（コーら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，ｐ．１１７３−１１７７）等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（ウォーカーら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，ｐ．３９２−３９６；ウォーカーら、１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０，ｐ．１６９１−１６９６）、自己保持配列複製（３ＳＲ）（グアテリら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，ｐ．１８７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リザイルディら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，ｐ．１１９７−１２０２）等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００５１】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００５２】
オリゴヌクレオチド
本発明によればまた、タモギタケ由来の抗菌タンパク質を得るためのオリゴヌクレオチドであって、
配列表の配列番号１または３に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば本発明の遺伝子を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼーション、あるいは適当な２種をプライマー対として用いたＰＣＲ等の増幅反応に用いることが可能である。
【００５３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列表の配列番号１０−１９の何れかに記載のヌクレオチド配列を有する。配列番号１０−１３のヌクレオチド配列は、配列番号９のアミノ酸配列に基づいて、そのタンパク質の一部をコードする遺伝子断片のクローニングのためのＰＣＲ用プライマーとして設計されたものであり、当該アミノ酸をコードすることが可能な全ての塩基をミックスしたプライマーである。配列番号１４−１７のヌクレオチドはｔａｍ１とｔａｍ２遺伝子の全塩基配列を解読するためにプライマーウォーク用として合成されたプライマーである。配列番号１８−１９のヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する組換えｔａｍａｖｉｄｉｎ２タンパク質を発現するための発現ベクターを構築するために、全ＯＲＦを増幅するために配列番号３に基づいて作成されたＰＣＲ用プライマーである。
【００５４】
本発明の遺伝子の部分断片は、上記オリゴヌクレオチドの適切な組み合せを使用してタモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことにより増幅させて単離することができる。かくして得られた増幅産物をプローブとして使用してさらにｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼーションなどでスクリーニングすることにより完全長のｃＤＮＡクローンを単離することができる。核酸増幅反応の手順及び条件、プラークハイブリダイゼーションの条件などは当業者に周知である。
【００５５】
例えば、限定されるわけではないが、ハイブリダイゼーションの条件としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． 上記）に記載されているように、温度条件が場合によっては室温程度、洗浄も例えば２´ＳＳＣなど通常よりも高い塩濃度で、温度も３７℃程度というようにかなりストリンジェンシーを低くとることが想定される。
【００５６】
組換え抗菌タンパク質の製造
本発明のタンパク質は極めて強力な抗菌活性をもつ。例えばイネのいもち病菌に対しては５０ｎｇ／ｍｌという非常に低い濃度で胞子の発芽を完全に抑制する（後述の実施例４を参照）。この濃度においては長時間のインキュベーションの後にも胞子の発芽はみられないことから、本発明のタンパク質のいもち病菌に対する効果は、生長の部分的阻害というよりはむしろ、殺菌効果であると考えられる。このような低い濃度（ナノグラムオーダー）で、病原菌の生育を完全に抑止できる抗菌タンパク質は本発明者の知る範囲では現在までに報告されていない。後述の実施例においては、抗菌タンパク質の精製のための抗菌アッセイのための植物病原菌としてイネの最重要病害であるいもち病菌を使用したが、同定したタモギタケ抗菌タンパク質が、これ以外の紋枯病菌等の植物病害にも大差ないレベルで抗菌効果を有している可能性は極めて高い。
【００５７】
このように本発明のタモギタケ由来の抗菌タンパク質は強い抗菌活性を有していることから、本発明のタンパク質は、抗菌剤や農薬などの薬剤としてそれが活性のある形で含まれるような製剤として利用することができる。この場合、本タンパク質は、例えば後述の実施例に従ってタモギタケよりイオン交換カラム、ゲル濾過カラムを用いて精製され得る。しかし、本発明のタモギタケ抗菌タンパク質をコードする配列番号１の７１−５０２又は配列番号３の２２６−６５１の塩基配列を有するＤＮＡを、大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入、発現させることにより、当該タンパクをより簡便かつ大量に製造することができる（実施例５）。
【００５８】
本発明によればまた、本発明の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．５３（１９８９）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、Ｅ−ｃｏｉｌ ＴＢ１，ＬＥ３９２またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
【００５９】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００６０】
べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるべクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＴｒｃ９９Ａなどが例示されるがこれらに限定されない。
【００６１】
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現べククーが有用である。発現べクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
【００６２】
形質転換体は、所望の発現べクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現べクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。
【００６３】
宿主細胞は、大腸菌、酵母、植物細胞または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。さらに、植物細胞に関しては、細胞培養が可能であれば特に限定されないが、例えば、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ由来の細胞などが例示される。
【００６４】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００６５】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５'側および３'側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００６６】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
【００６７】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｉｌではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬもしくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２もしくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
【００６８】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００６９】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００７０】
本発明の発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｉｌ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
【００７１】
本願発明のＤＮＡ断片を用いて病害抵抗性植物を作出する目的においては、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上、Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，２７１−２８２（１９９４））、ｐＳＢ４２４（Ｋｏｍａｒｉら， Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０，１６５−１７４（１９９６））などが例示される。
【００７２】
形質転換植物は、上述のベクターのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の部位に本願発明のＤＮＡ断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調整することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子（本願発明のＤＮＡ配列またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネーターを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。
【００７３】
プロモーター、ターミネーターは植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている３５Ｓプロモーターの他に、アクチン、ユビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。しかしながら、より好適には誘導性のプロモーターを組み入れて用いてもよい。こうすることで病害虫が形質転換植物に接触した時にのみ、当該タンパクが生産され、抵抗性となる。用いられるべき誘導性プロモーターとしてはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、チオニン、オズモチンあるいは病害虫やストレスに反応するその他の遺伝子のプロモーターが考えられる。
【００７４】
植物への遺伝子導入法としては、アグロバクテリウムを用いる方法（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６，ｐ．２７１−２８２（１９９４））、エレクトロポレーション法（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６））、ＰＥＧ法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，３，２７１７（１９８４））、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０２，１７９（１９８６））、微小物衝突法（ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，９２３（１９８８））などが挙げられるが、所望の植物に遺伝子を導入する方法であれば特に限定されない。また、宿主となる植物種も本発明の植物形質転換用ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される植物、例えば双子葉植物ではタバコ、アラビドプシス、トマト、キュウリ、ニンジン、ダイズ、バレイショ、テンサイ、カブ、ハクサイ、ナタネ、ワタ、ペチュニアなどが挙げられ、単子葉植物では、イネ、トウモロコシ、コムギなどが挙げられる。
【００７５】
本発明のタンパクは、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
【００７６】
培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパクが大量に生産されるように適宜選択される。限定されるわけではないが、例えば大腸菌での発現の場合、組換えタンパク質発現のための培養条件として、好ましくは４℃ないし４０℃の温度で培養し、０．０１ｍＭないし５．０ｍＭのＩＰＴＧによる誘導を行う。
【００７７】
本発明のタンパクは、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパクが宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０Ｍ〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパクが宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の精製、単離に供することができる。
【００７８】
精製・単離の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。例えば、限定するわけではないが、本明細書で後述する実施例４では、Ｎ−末端に６×ヒスチジンのタグを有する組換え抗菌タンパク質を発現させた。当該組換えタンパク質は、６×ヒスチジンに親和性を有するＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して精製した。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパクを生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。また、Ｈｏｆｍａｎｎらの文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：ｐ．４６６６−４６６８（１９８０））に記載されているように、イミノビオチンアフィニティーカラムを用いて精製する方法も適用することができるだろう。後述の実施例５では、５０ｍＬの大腸菌培養液から組換えｔａｍａｖｉｄｉｎ２タンパク質を１ｍｇの収量で得た。
【００７９】
上記のように遺伝子工学手法により得られた、あるいは天然源より精製された本発明の抗菌タンパク質は、抗菌活性を有する。抗菌活性は、限定されるわけではないが、例えば、マイクロタイタープレートに培地（例えば、１／２ ＰＤ培地、シュークロース−ペプトン培地等）に懸濁したいもち病菌の胞子を入れ、そこへ本発明の抗菌タンパク質を所期の濃度、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ−１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、２８℃で４８時間培養する。そして、いもち病菌の成長・増殖（例えば、菌糸の伸長）が、抗菌タンパク質を加えない場合と比較して抑制されるか否かを判断することによって、抗菌活性を測定することが可能である（実施例４）。
【００８０】
あるいは、下記の方法も使用可能である。シャーレに作成した寒天培地の中心にいもちの菌叢を置き、その周りに上述の濃度の本発明の抗菌タンパク質の水溶液の一定量を滴下し、２８℃で４８時間−１週間程度培養する。そして、抗菌タンパク質を滴下した部分におけるいもち病菌の菌糸の伸長が、滴下しない部分に比較して抑制されるか否かを判断することによって、抗菌活性を測定することが可能である。
【００８１】
抗菌剤
本発明のタンパクは強い抗菌活性をもつ。例えば我々の用いた抗菌アッセイではイネのいもち病菌に対して５０ｎｇ／ｍｌという低い濃度で菌糸の成長を抑制する。後述の実施例においては、抗菌アッセイ用の植物病原菌としてイネの最重要病害であるいもち病菌と紋枯病菌を使用し、本発明で同定したタモギタケ抗菌タンパクはこれらに対して抗菌作用を示した。本発明のタンパク質がいもち病菌以外の他の植物病原菌に対しても抗菌効果を有している可能性が高い。
【００８２】
このように本発明のタモギタケ由来の抗菌タンパク質は強い抗菌活性を有していることから、抗菌剤や農薬などの薬剤としてそれが活性のある形で含まれるような製剤として利用することができる。この場合、本発明のタンパクをコードするＤＮＡ配列を用いれば、先述のように例えば大腸菌や酵母などで機能する発現ベクターにそのＤＮＡを組み込んで大量に製造することができる。
【００８３】
本発明の抗菌タンパク質は新規なストレプトアビジン様タンパク質であることから、ビタミンの一種であるビオチン（ビタミンＨ）と結合することが示唆される。一方いもち病菌はその生育にビオチンが必要であることが知られている。これらのことから、本抗菌タンパク質はアッセイ培地に存在する遊離ビオチンと結合し、これが培地中のビオチン欠乏を引き起こし、結果としていもち病菌の生育が抑えられたことが示唆された。実際、後述する実施例４に記載されるように、アッセイ培地中にビオチンを過剰に添加すると本発明のｔａｍａｖｉｄｉｎ１の抗菌活性は消去された。さらに本発明者は市販のストレプトアビジンおよびアビジンにもｔａｍａｖｉｄｉｎ１と同様にイネいもち病菌に対する抗菌作用があることを見出し、この作用はやはりビオチンにより打ち消されることを明らかにした。
【００８４】
本発明によってビタミンの一種であるビオチンの量を制御することにより、病害抵抗性特にいもち病菌抵抗性を植物に付与できる可能性が示唆された。この様にビタミンを制御することによって病害抵抗性を付与できる可能性があることはこれまでに知られていなかった。これは全く新しい概念である。この概念も本発明に含まれる。例えば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む製剤の農薬としての利用が挙げられる。この場合、本発明の抗菌タンパク質以外のビオチン結合性タンパク質（例えばｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ ｉｉのストレプトアビジンや卵白アビジン、およびそれらのホモローグなど）も同じ概念に含まれる。
【００８５】
よって、本発明によれば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤が提供される。本発明の抗菌剤は通常、植物の全身または局所的に、散布することができる。
散布量は、植物の種類、生育段階、症状、散布方法、処理時間、散布するタンパク質の種類（全長のタンパク質、該タンパク質の一部を置換、欠失、挿入及び／又は付加したクンパク質など）、生育している場所の気候、生育している場所の土壌などにより異なるが、一日一回から複数回毎日ないし数日おきに散布することができる。散布量は種々の条件により変動する。本発明の抗菌剤の散布に際しては、必要に応じて、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤などを混合して散布することも可能である。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤として混合される。水性の希釈剤としては、例えば蒸留水、食塩水などが挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類などが挙げられる。
【００８６】
このような抗菌組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散別または安定化剤（例えばアルギニン、アスパラギン酸など）などの補助剤を含んでいてもよい。
これらは、必要に応じてバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた、例えば凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物の形態で製造し、使用前に無菌の蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
【００８７】
このようにして得られる抗菌剤の剤形としては、使用する用途に応じて決めればよく、上記のような添加物と混合し、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、乳剤等の形態により散布することができる。
【００８８】
また本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を植物に導入することで病害抵抗性植物を作成することも可能であろう。即ち、例えば植物で機能するプロモーターと本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を連結し、さらにその下流に植物で機能するターミネーターを付加したコンストラクトを植物に導入することで病害抵抗性植物の作成が可能である。この場合、ｔａｍａｖｉｄｉｎの植物細胞外への分泌を促すために、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の５’側に植物で機能する細胞外分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を付加することも可能である。あるいはまた植物細胞あるいは細胞外での抗菌タンパク質の蓄積を促すために遺伝子の使用コドン（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）をそのアミノ酸は変化させないように単子葉あるいは双子葉植物用に変化させることも可能である。このような組み合わせを用いた病害抵抗性植物の作出方法も本発明に含まれるものである。
【００８９】
ｔａｍａｖｉｄｉｎ、アビジン、ストレプトアビジン、あるいはそれらとよく似たタンパク質の病害抵抗性植物の作出への適用、およびイネ以外の植物への適用も本発明に含まれるものである。本発明において解析した病原菌はイネいもち病菌であるが、この病原菌以外にもビオチンをその生育に必要とするその他の、植物病原菌、病原細菌に効果を発揮する可能性は十分にあると考えられる。
【００９０】
さらに植物病原菌のみならず、ビオチンがその生育に必須である動物特にヒトや家畜の病原菌にも同様の効果を発揮することは当然考えられるので、本発明の抗菌タンパク質、アビジンまたはストレプトアビジン、およびそれらとよく似たタンパク質をそのような場面に治療薬として使用する場合、これは本発明の範疇に属するものである。
【００９１】
ストレプトアビジンに関しては既にそのＤＮＡ配列が開示されているが（Ｇａｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．ＷＯ／８６０２０７７）、先述のごとく本発明のｔａｍ１およびｔａｍ２のＤＮＡ配列は、通常のデータベース検索を行ってもストレプトアビジンのＤＮＡを抽出することはなく、核酸・アミノ酸配列解析ソフトを使用してストレプトアビジンとのＤＮＡの相同性を強制的に比較しても実際に５１．０〜５３．８％と高い値は示さなかった。
【００９２】
ストレプトアビジンやアビジンは、ビオチン、およびその誘導体と非常に強い結合能を有することから、分子生物学、生化学などの様々な場面において実験試薬として既に広く利用されている。例えば核酸やタンパク検出系への利用（Ｌｉａｎｇ．ＷＯ／９７０７２４４）や、ストレプトアビジンやアビジンを融合タンパク質として発現しビオチンとの結合能を用いて精製する方法（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ． ＥＰ８３５９３４、Ｋｏｐｅｔｚｋｉ． ＷＯ／９７１１１８６）などが挙げられる。本発明のｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍａｖｉｄｉｎ２もこれらの現在広く知られている、または報告されている使用方法に用いることが出来る。
【００９３】
植物に関連するストレプトアビジンあるいはアビジンについてはこれまでにアビジンを利用した雄性不稔植物の作出（Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ．ＷＯ／９６４０９４９）、ストレプトアビジンあるいはアビジンの殺虫タンパクとしての応用（Ｃｚａｐｌａ ｅｔ ａｌ．ＷＯ／９４００９９２）、植物におけるアビジンの生産（Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ＵＳ Ｐａｔ． Ｎｏ．５７６７３７９）などが報告されている。なおこれらの文献に記載されているストレプトアビジンあるいはアビジンの利用法が本発明のタモギタケ由来の抗菌タンパク質にも適用されうる。
【００９４】
先行技術文献
１． Ｓｃｈｌｕｍｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：ｐ．３６５−３６７
２． Ｍａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８８：ｐ．９３６−９４２
３． 特表平８−５０５０４８
４． Ｏｉｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０：ｐ．４８１−４８３
５． Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：ｐ．１５３０１−１５３０９
６． 特表平９−５０１４２４
７． Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：ｐ．１１９４−１１９７
８． Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：ｐ．５７３−５８８
９． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９９：３８３−３９０
１０． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：ｐ．７３２７−７３３１
１１． Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：ｐ．１３５７−１３６８
１２． Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６１：ｐ．１５３−１５６
１３． Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２６３：ｐ．６０−６６
１４． Ａｒｇａｒａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １４：ｐ．１８７１−１８８２
１５． Ｆｒｅｉｔａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：ｐ．１１５７−１１６６
１６． Ｇｏｐｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：ｐ．３５９５−３６０６
１７． Ｋｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２０：ｐ．６１５−６２１
１８． Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ ２５６：ｐ．２７９−２８２
１９． Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６９：ｐ．５２７−５３０
２０． Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：ｐ．４６６６−４６６８（１９８０）
２１． Ｇａｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．ＷＯ／８６０２０７７
２２． Ｌｉａｎｇ．ＷＯ／９７０７２４４
２３． Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ． ＥＰ８３５９３４
２４． Ｋｏｐｅｔｚｋｉ． ＷＯ／９７１１１８６
２５． Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ．ＷＯ／９６４０９４９
２６． Ｃｚａｐｌａ ｅｔ ａｌ．ＷＯ／９４００９９２
２７． Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ＵＳ Ｐａｔ． Ｎｏ．５７６７３７９
【発明の効果】
【００９５】
効果
本発明の配列番号２または４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはその一部の配列からなりかつビオチンまたはその誘導体と結合する能力を有するポリペプチドを含むことを特徴とするタンパク質成分を有効成分として含む製剤を作出すれば、抗菌剤としての利用が期待できる。
【００９６】
また、本発明の配列番号１の７１−５０２または９２−５０２の配列を有するＤＮＡ、あるいは配列番号３の２２６−６５１または２４７−６５１の配列を有するＤＮＡを、植物細胞の中で機能しうる適当な構成的プロモーター、器官・時期特異的プロモーター、あるいはストレスや病害虫に反応する誘導性のプロモーター配列と、植物細胞で機能しうるターミネター配列の発現カセットに組み込み、植物細胞に導入、再生個体を得ることにより、病害抵抗性植物を作出できる。この場合本発明抗菌タンパク質をコードするＤＮＡ配列に細胞内小器官への輸送シグナルあるいは細胞外分泌へのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を接続することも可能である。
【００９７】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを、大腸菌、酵母、植物あるいは昆虫や例えばアフリカツメガエルなどの動物細胞で外来タンパク質を発現させることの出来るベクターに組み込み、当該細胞内で、本発明タンパク質を生産、大量精製することが可能となる。この場合本発明抗菌タンパク質をコードするＤＮＡ配列に細胞内小器官への輸送シグナルあるいは細胞外分泌へのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を接続することも可能である。
【００９８】
本発明タンパク質とビオチンとの強い相互作用は、現在ストレプトアビジンやアビジンにおいて広く利用されているような様々な分析技術に応用することが可能となる。
【実施例】
【００９９】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例
実施例１ アッセイ系の構築
１）検定系の確立
病原菌の培養：イネいもち病菌（菌株ＴＵＳ−１、レース３３７；農林水産省東北農業試験場より分譲）はオートミル培地（Ｄｉｆｃｏ社製，１％ショ糖添加）上で培養して分生胞子を得て、接種源とした。胞子液は必要に応じて１０％グリセロールを加えて、−８０℃で保存した。
【０１００】
イネ紋枯病菌（菌株ＪＴ８７２）は１／２ジャガイモ煎汁培地（ＰＤ培地：Ｄｉｆｃｏ社製）で２日間培養し、５ｍｍ程度の菌糸塊３個をテフロンホモジナイザーで１／２ＰＤ培地とともに軽く磨砕して得られた断片化菌糸を接種源とした。
【０１０１】
上記の接種源を９６穴マイクロタイタープレート（コーニング社製）に１ウエル当たりいもち病菌分生胞子は約１，０００個、紋枯病菌は断片化菌糸が約３００個になる様に１００μｌの１／２ＰＤ培地とともに加え、２８℃の恒温器で４８時間培養した。菌の増殖はマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）で５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０２】
２）タモギタケからのタンパク質抽出
市販のタモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）子実体１００ｇをあらかじめハサミで細かく切断後、液体窒素を用いて凍結して乳鉢で細粉となるまで磨砕し、３００ｍｌの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液ｐＨ７．５を加えて緩やかに撹拌しながら４℃で３０分間抽出を行った。抽出液はミラクロスでろ過後、１０，０００´ｇ、２０分間の遠心を行った。上清に硫安を７５％飽和になるように加えて、一晩４℃で静置した。次に１５，０００´ｇ、２０分間の遠心で沈殿させて、沈殿物を３ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液、ｐＨ７．５に溶解し、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１ ＭＷＣＯ ６−８０００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を用いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液、ｐＨ７．５に対して透析を行った。不溶物を遠心によって除去しタモギタケタンパク質試料とした。タモギタケタンパク質試料のタンパク質濃度は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準タンパク質としてＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した。
【０１０３】
実施例２ 抗菌タンパクの精製
１）タモギタケ粗タンパク試料の抗菌活性
上記のいもち病菌、紋枯病菌の培養系に培養開始直後にタモギタケタンパク質試料を一定量加えて、培養２日後（４６−４８時間後）の吸光度を測定して抗菌性の有無について判定した。その結果、タモギタケの抽出物の中にはいもち病菌、紋枯病菌両菌に対して高い抗菌活性をもつ物質が含まれていることが明らかとなった。阻害の様式は、いもち病菌の場合、発芽の完全抑制や菌糸の生長阻害が観察され、紋枯病菌の場合は菌糸の生長阻害が観察された。いもち病菌の細胞の場合、その細胞質が細胞壁から離れ原形質分離様の様相を呈していた。
【０１０４】
検出された抗菌活性の性質をさらに詳しく解析するために、熱処理を行い残存活性を調査した。熱処理は６０、８０℃を１０分間行い抗菌アッセイを行った。活性の強さはタンパク質試料を希釈することにより推定した。その結果６０℃処理ではいもち、紋枯病菌両方に対する抗菌活性は無処理と同等の活性が保持されていた。一方８０℃処理では紋枯病菌に対する抗菌活性は消失した。ところがいもち病菌に対する抗菌活性は、８０℃処理によって原形質分離を起こさせる活性は消失したものの、菌糸の先端を膨張させて生長を停止させる新規な活性が存在することが明らかとなった（図１）。
【０１０５】
さらにタモギタケ粗タンパク試料熱処理画分に含まれるこれらの活性をつかさどる本体のおよその分子量を把握するため、限外濾過膜によりサンプルを分画し、抗菌活性を調査した。限外濾過膜はウルトラフリーＭＣ１０，０００ ＮＭＷＬ フィルターユニット（カットオフ分子量１００００、ミリポア社製）を用い、膜を通過した画分と膜を通過しなかった画分に分けてアッセイを行った。その結果全ての活性は膜不通過画分のみに存在していた。従って活性本体の分子量は少なくとも１００００以上であることが予想された。
【０１０６】
２）イオン交換カラムによる精製
次に抗菌タンパクの精製を行った。粗タンパク試料１５０ｍｇ／２０ｍｌをまず、イオン交換単体Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を充填した自製カラム（内径１．５ｃｍＸ長さ１０ｃｍ、単体容量１０ｍｌ）にかけ、抗菌タンパクを部分精製した。流速は２ｍｌ／分とし、基本緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０， ５０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，６００ｍＭ ＮａＣｌを、グラジェント（ＮａＣｌで５０ｍＭから６００ｍＭ）は、１００分間かけた。各画分（１２．５ｍｌ）の一部をいもち病菌に対する抗菌アッセイと、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供試した。各画分のタンパク質溶液に等量の２´ＳＤＳ泳動用緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）を加え、９５℃で５分間処理した後、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ ２２７：ｐ．６８０−６８５．）の方法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。ゲルは１５％のＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用い、銀染色ＩＩキットワコー（和光純薬社製）によりタンパク質を検出した。タンパクのおよその分子量と量を見積もるため、分子量マーカー（ＬＭＷ マーカーキット：Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社製、分子量の大きい順に９４ｋＤａ、６７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａ、２０．１ｋＤａ、１４．４ｋＤａ）を泳動した。タンパク質の銀染色による電気泳動像と抗菌性の強さとの関係を図２に示した。
【０１０７】
抗菌活性としてＮａＣｌ濃度が１６０ｍＭのピークと、２４０ｍＭ〜２８０ｍＭのピークの二つが現れた。１６０ｍＭのピークに含まれるタンパク質は、菌糸の先端を膨張させて生長を停止させ、７０℃、１０分の処理でもその活性は失活しなかった。一方２４０ｍＭ〜２８０ｍＭのピークに含まれるタンパク質はいもち菌細胞に原形質分離を生じさせ、同熱処理により失活した。そこで前者の１６０ｍＭのピークに含まれる抗菌タンパク質の精製を試みた。
【０１０８】
ＮａＣｌ濃度が１２０ｍＭ〜２４０ｍＭに相当する画分を透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ１ ＭＷＣＯ ６−８０００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）に移し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌに対して４℃で一晩透析を行った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（分画分子量１０，０００、Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮した後、７０°Ｃで３０分間熱処理を行った。遠心後上清を０．２２mｍでフィルター濾過した。このタンパクサンプル（約１０ｍｌ）をＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）による抗菌タンパクの分離精製に供試した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、基本緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出緩衝液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５００ｍＭ ＮａＣｌを用い、グラジェント（ＮａＣｌで５０ｍＭから５００ｍＭ）は、試料を打った２０分後から４０分間かけた。各画分（１ｍｌ）の一部をいもち病菌に対する抗菌アッセイと、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供試した。
【０１０９】
まず、ＨＰＬＣのチャートと抗菌性の強さとの関係を図３に示した。その結果、イオン強度（ＮａＣｌ濃度）が２００ｍＭ〜２６０ｍＭ付近に抗菌タンパクの溶出ピークが現れた。
【０１１０】
電気泳動像と抗菌性の強さの関係を図４に示した。各レーンの上に表示した数字は図３の画分の番号に準じて表示した。抗菌性と関連すると考えられるタンパクのバンドを精査すると、約１５ｋＤの２つのバンドが有力候補として挙げられた（図４矢印）。このバンドの濃度と抗菌活性の度合いは正の相関関係にあるので、このバンドが抗菌タンパク質本体である可能性が示唆された。
【０１１１】
３）ゲルろ過カラムによる精製と分子量の推定
タモギタケ抗菌タンパクの精製、そしてｎａｔｉｖｅな状態での分子量を推定するため、上記のＭｏｎｏＱ画分の＃４１−４６をウルトラフリーＭＣ １０，０００ ＮＭＷＬ フィルターユニット（ミリポア社製）で濃縮し、ゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｏｓｅ６ ＨＲ １０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に供試した。流速は０．５ｍｌ／分とし、緩衝液は５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ ｐＨ６．０、５０ｍＭ ＮａＣｌを用いた。まずＧｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）によりタンパクの分子量とおよその溶出時間を把握した後、抗菌活性のあるＭｏｎｏＱ画分を打ち込んだ。
【０１１２】
その結果、Ａ２８０でタンパクをモニターすると３０ｋＤａを頂点とする鋭いピークが現れた（図５）。抗菌活性は３０ｋＤａのピークと近接したその前後に集中した。このことから、タモギタケの有する抗菌性は、ゲル濾過でおよそ３０ｋＤの分子量を有する単一のタンパク質に由来することが分かった。また、各フラクション（０．２５ｍｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後銀染色すると、３０ｋＤａ付近にのみ、図４で見られた１５ｋＤａのバンドが検出された（図６）。１５ｋＤａ以外のバンドは見られなかったことから、抗菌性に寄与しているのは１５ｋＤａのタンパク質であることが再度強く示唆された。分子量マーカー（２０．１ｋＤａのトリプシンインヒビター）から、デンシトメーターにより抗菌タンパクの量を推定し、イネいもち病菌に対する５０％生長阻害濃度を算出すると、およそ５０ｎｇ／ｍｌとなった。生重量１００ｇのタモギタケ子実体から上記の方法で精製され得る当該抗菌タンパク質の量はおよそ０．２ｍｇであった。
【０１１３】
実施例３ ｃＤＮＡの単離
１）タモギタケ抗菌タンパクのアミノ酸配列の解読
上記のＳｕｐｅｒｏｓｅ６画分をウルトラフリーＭＣ １０，０００ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した。トリスを除去し、グリシンを含まない緩衝液系でＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）へ転写し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で軽く染色した後、脱色した。その後、抗菌性に関与すると考えられた１５ｋＤａのタンパクバンドを切り出した。また１５ｋＤａのタンパク質をリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）若しくはＶ８プロテアーゼ（和光純薬工業社製）で部分消化した。
【０１１４】
その結果、リシルエンドペプチダーゼ消化からは１４ｋＤａが、若しくはＶ８プロテアーゼ消化からは１４ｋＤａと１２ｋＤａが得られた。これらのバンドを同様に泳動後膜に転写した。次いで、気相プロテインシークエンサー（ＨＰＧ１００５Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、Ｎ末端アミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。
【０１１５】
その結果、１５ｋＤａタンパクからは次のような４４アミノ酸：
Ｎ末端−Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Xaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg Tyr−Ｃ末端 （配列番号５）
が決定された（上記アミノ酸配列において、Ｘａａは未定、以下同様）。また、１４ｋＤａタンパクのリシルエンドペプチダーゼ消化物からは次のような５０アミノ酸：
Ｎ末端−Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val−Ｃ末端 （配列番号６）
また、１４ｋＤａタンパクのＶ８プロテアーゼ消化物からは次のような２１アミノ酸：
Ｎ末端−Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly−Ｃ末端 （配列番号７）
また、１２ｋＤａタンパクからは次のような２３アミノ酸
Ｎ末端−Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu Thr Ala Asn Xaa Asp Gly Xaa Leu−Ｃ末端 （配列番号８）
が決定された。
【０１１６】
最終的に次のような６９アミノ酸が決定された。
Ｎ末端−Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val−Ｃ末端 （配列番号９）
２）縮重プライマーの設計
１）で決定されたアミノ酸配列を基に、考えられる全ての塩基がミックスされた４つのプライマーを合成した。括弧内の数字は縮重度を示す。
ＴＭＲ１： 5'-acnggnacntggtayaayg-3’（２５６）
（配列番号９の２番目のアミノ酸残基Ｔｈｒないし８番目のＧｌｕに対応） （配列番号１０）
ＴＭＲ２： 5'-garytiggiwsnacnatgaa-3’（２５６）
（配列番号９の８番目のアミノ酸残基Ｇｌｕないし１４番目のＡｓｎに対応） （配列番号１１）
ＴＭＦ１： 5'-gtrttytcraaiswiacn-3’（１２８）
（配列番号９の５９番目のアミノ酸残基Ａｌａないし６５番目のＴｈｒに対応） （配列番号１２）
ＴＭＦ２： 5'-cciarigtnacnccytgncc-3’（２５６）
（配列番号９の５１番目のアミノ酸残基Ｇｌｙないし５７番目のＧｌｙに対応） （配列番号１３）
但し、上記において「ｉ」は「イノシン」を、「ｒ」は「ｇ又はａ」を、「ｙ」は「ｃ又はｔ」を、「ｗ」は「ａ又はｔ」を、「ｓ」は「ｇ又はｃ」を、そして「ｎ」は「ａ又はｇ又はｃ又はｔ」をそれぞれ表す。
【０１１７】
３）タモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーの構築
タモギタケ子実体からＳＤＳフェノール法で全核酸を抽出し、塩化リチウム沈殿により全ＲＮＡを回収した。ここからｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）によりタモギタケｍＲＮＡを調製した。子実体約５ｇから１０μｇのｍＲＮＡが得られた。このうち５μｇをＺＡＰ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に供試し、ｃＤＮＡを合成した。。ゲル濾過カラムによりおよそ０．５〜５ｋｂのｃＤＮＡを分画し、Ｕｎｉ−ＺＡＰ ＸＲ ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にライゲーションし、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）によりパッケージングを行った。全ての手順はキット添付の説明書に従った。構築したタモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーのタイターは、およそ３００万ｐｆｕと算出された。
【０１１８】
４）ＲＴ−ＰＣＲによるプローブの取得
２）で合成したプライマーを用いて３）で合成したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとなるタモギタケ抗菌タンパクの部分長ｃＤＮＡの増幅を試みた。反応条件は以下のように行った。５０μｌの反応液中に、ｃＤＮＡ １０ｎｇ，１０´Ｅｘ ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ，２．５ｍＭ 各ｄＮＴＰｓ ４μｌ，プライマー ５ピコモル／各配列，Ｅｘ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）＋Ｔａｑ ＳＴＡＲＴ 抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製） １μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ社）を用いて、９４℃ ３分を１回、９４℃ １分、５０℃ １分、７２℃ １分を３５ 回、７２℃ ６分を１回行った。その結果、ＴＭＲ１−ＴＭＲＦ１、ＴＭＲ１−ＴＭＲＦ２、ＴＭＲ２−ＴＭＲＦ１、ＴＭＲ２−ＴＭＲＦ２の全てのプライマー組み合わせにおいて、各々およそ１５０〜１９０ｂｐの産物が増幅された。
【０１１９】
これらのＰＣＲ産物をゲル精製し、ベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。これらのクローンの塩基配列を決定した結果、１）で決定されたアミノ酸配列と全く同じアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（ＴＭＲ２−ＴＭＲＦ１、ＴＭＲ２−ＴＭＲＦ２の組み合わせ由来。特にＴＭＲ２−ＴＭＲＦ２の組み合わせ由来のｃＤＮＡをＴＭ１００と命名）と、１）で決定されたアミノ酸配列と約７５％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（ＴＭＲ１−ＴＭＲＦ１、ＴＭＲ１−ＴＭＲＦ２の組み合わせ由来。特にＴＭＲ１−ＴＭＲＦ１の組み合わせ由来のｃＤＮＡをＴＭ７５と命名）の二種類が含まれていた。
【０１２０】
５）完全長ｃＤＮＡのスクリーニング
４）で得られたｃＤＮＡクローンＴＭ１００、ＴＭ７５をベクターから切り出し、これをプローブに用いてタモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１４×１０ｃｍの角形シャーレにＺＡＰ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の説明書きに従って、約２０，０００ｐｆｕのファージを宿主菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ ＭＲＦ’とともにプレーティングした。プラークをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に接触させ、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行いＤＮＡを変性させ、メンブレン上に固定させた。プローブはｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩＴＭ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて３２Ｐラベルした。ハイブリダイゼーションは０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５℃で一晩、洗浄の条件は４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で６５°Ｃ、２０分を２回行った。１次スクリーニングで約１６０，０００ｐｆｕのファージからＴＭ１００プローブで６００個、ＴＭ７５プローブで３０個のポジティブクローンが得られた。うちＴＭ１００プローブで２４個、ＴＭ７５プローブで１２個のクローンに関して、２次スクリーニング、プラークの精製を兼ねた３次スクリーニングを行い、選抜されたクローン全てについてＺＡＰ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の説明書きに従って、ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎを行った。その結果、ＴＭ１００プローブで１８個、ＴＭ７５プローブで１２個のクローンが、ファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫに組み込まれたｃＤＮＡとして回収された。これらのクローンに関して制限酵素分析によりインサート長を同定した。
【０１２１】
６）塩基配列の決定
上記の各ｃＤＮＡクローンについて、最長のクローンの全塩基配列を両鎖とも決定した。まず、Ｍ１３プライマー（ｔａｋａｒａ）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）でクローンの５’、３’両部分の塩基配列を決定した。
【０１２２】
次に、ＴＭ１００由来の最長クローンの５’部分の塩基配列情報を基に、プライマー
ＴＭ１００ｉｎＲＶ： gTC AAg gCg TTA CTC Tgg
（配列番号１４）
を、同３’部分の塩基配列情報を基にプライマー
ＴＭ１００ｉｎＦＷ： CTg ggT gAg gAT CAC CTC
（配列番号１５）
を、さらにＴＭ７５由来の最長クローンの５’部分の塩基配列情報を基に、プライマー
ＴＭ７５ｉｎＲＶ： gAT gTC TAC gTg CCC TAC
（配列番号１６）
を、同３’部分の塩基配列情報を基にプライマー
ＴＭ７５ｉｎＦＷ： ACg ACT CAg AgA AgA ACT g
（配列番号１７）
をそれぞれ合成し、配列決定に利用した。以上のようにしてＴＭ１００及びＴＭ７５由来の最長クローンについてＤＮＡの両鎖の配列を解読し、全塩基配列を決定した。
【０１２３】
その結果、タモギタケ抗菌タンパクをコードするｃＤＮＡ（ＴＭ１００プローブ由来）は全長６７１塩基からなり（配列番号１）、１４３個のアミノ酸をコードしていた（配列番号２）。精製タンパク質から決定されたＮ末端のアミノ酸は、配列番号２のアミノ酸配列の８−７６のアミノ酸残基に相当した。配列番号２のアミノ酸配列と精製タンパク質から直接決定された６７個のアミノ酸の相同性は、決定されなかった２個のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸配列では第６５番目のＷ、および第７３番目のＳに相当）以外の全てのアミノ酸が同一であった。このことから、クローニングしたｃＤＮＡはタモギタケ抗菌タンパクをコードする遺伝子に由来すると結論された。
【０１２４】
ｃＤＮＡ配列から決定されるタンパク質のＮ末端と、実際の精製タンパク質のＮ末端は一致せず、翻訳開始メチオニンの７アミノ酸後ろのＬ（ロイシン）が、精製タンパク質のＮ末端であった。このことから、タモギタケ抗菌タンパク質は、まず前駆体型として翻訳された後、Ｎ末のリーダー配列（７アミノ酸）が切り離されると推定された。推定成熟タンパクのアミノ酸配列（配列番号２のうち８−１４３の１３６個のアミノ酸配列）から遺伝子配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒ３．２（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて平均分子量を求めると１５１５８．４となり、等電点は６．２２と算出された。この分子量は精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見積もり（１５ｋＤａ）と良く一致した。また推定糖鎖付加部位が二カ所（配列番号２のアミノ酸残基２１、同７１のＮ）存在していた。
【０１２５】
一方、タモギタケ抗菌タンパクのホモローグをコードするｃＤＮＡ（ＴＭ７５由来）は全長８４０塩基からなり（配列番号３）、１４１個のアミノ酸をコードしていた（配列番号４）。このｃＤＮＡの５’側には３個のＡＴＧが存在するが、一つ目と二つ目のＡＴＧから翻訳を開始するとそれらのすぐ後ろに終止コドンが現われ、それぞれ１２個、３１個のアミノ酸しかコードできない。１４１個のアミノ酸をコードできるのは三番目のＡＴＧから翻訳が開始されたときのみである。またこのＡＴＧの１０２ｂｐ上流には同じ読み枠で終止コドンＴＧＡが位置していた。従って三番目のＡＴＧが翻訳開始コドンであることはほぼ確実である。
【０１２６】
推定成熟アミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸配列のうち８−１４１の残基からなる１３４個のアミノ酸配列）から推定される分子量は１４７３２．２、等電点は８．６２と算出された。また推定糖鎖付加部位が一カ所（配列番号４のアミノ酸番号１１５のＮ）存在していた。ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮを用いて本発明のタモギタケ抗菌タンパク質とそのホモローグの相同性を解析したところ、アミノ酸で６５．５％、ＤＮＡで６４．５％（ＯＲＦ部分は７２．２％）であった。
【０１２７】
本発明のタモギタケ由来抗菌タンパク質およびその遺伝子、さらにそのホモローグとそれにコードされるアミノ酸配列をもつタンパク質について、ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った。本発明のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果、ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓのストレプトアビジン ｖ２（寄託番号：Ｑ５３５３３， Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２６３：ｐ．６０−６６．）、ｖ１（寄託番号：Ｑ５３５３２）、ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ ｉｉのストレプトアビジン（寄託番号： Ｐ２２６２９， Ａｒｇａｒａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １４：ｐ．１８７１−１８８２）等が相同性を有するものとしてヒットした。相同性は３つともに１２８アミノ酸に渡り、それぞれ５０％、４９％、４９％であった。これらより低い相同性で卵白アビジン（Ｇｏｐｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：ｐ．３５９５−３６０６．）やいくつかのアビジン関連タンパク質（Ｋｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２０：ｐ．６１５−６２１．）もヒットした。なお、ストレプトアビジンと１アミノ酸のみ異なり、Ｎ末端側、Ｃ末端側がそれぞれ３６アミノ酸分、２０アミノ酸分ストレプトアビジンよりも短くなっているコアストレプトアビジンミュータントｗ７９ｆ ＣｈａｉｎＢ（Ｆｒｅｉｔａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６：ｐ．１１５７−１１６６）もヒットした。相同性は５１．７％であった。
【０１２８】
以上のことから、本タンパク質は新規なタンパク質であると考えられた。本発明の第２のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果では、ストレプトアビジン ｖ２、ｖ１、ストレプトアビジンとそれぞれ５０％、４８％、４８％の相同性を示した。
【０１２９】
一方、第１のタモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１の７１−５０２）および第２のタモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３の２２６−６５１）を用いた同データベース検索では、非常に短い範囲（２３ｂｐ）で相同性の見られる配列がいくつか検出されたに過ぎず、ストレプトアビジンのＤＮＡ配列等は検出されてこなかった。これは、本発明の新規タンパク質をコードするＤＮＡ配列はＤＮＡレベルではストレプトアビジンのＤＮＡ配列等と相同性があまり高くないことを意味する。
【０１３０】
本抗菌タンパク質は食用キノコタモギタケから精製された新規なストレプトアビジン様タンパク質であるので’ｔａｍａｖｉｄｉｎ’と命名した。精製したタンパク質由来の遺伝子をｔａｍ１、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質をｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍ１のホモローグをｔａｍ２、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質をｔａｍａｖｉｄｉｎ２と呼ぶこととする。遺伝子配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒ３．２を用いて本発明のタモギタケ抗菌タンパク質とストレプトアビジン（ストレプトアビジンはストレプトアビジン ｖ２、ｖ１とそれぞれ９アミノ酸、１アミノ酸異なるだけである）のアミノ酸配列全体の相同性を解析したところ、ｔａｍ１のコードするｔａｍａｖｉｄｉｎ１のアミノ酸配列で４６．７％、ｔａｍ２のコードするｔａｍａｖｉｄｉｎ２のアミノ酸配列で４８．１％の相同性（アミノ酸同一性）を示した。一方、ＤＮＡ配列（配列番号１および３）全体ではストレプトアビジンとの相同性はｔａｍ１で５３．８％（ＯＲＦ部分では５６．８％）、ｔａｍ２では５１．０％（ＯＲＦ部分では５７．３％）であった。またｔａｍ１にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で３１．２％、ＤＮＡ配列で４２．４％であり、ｔａｍ２にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で３６．２％、ＤＮＡ配列で４１．８％であった。
【０１３１】
Ｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍａｖｉｄｉｎ２、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン Ｖ１、ストレプトアビジン Ｖ２、およびアビジンの成熟タンパク領域のアミノ酸配列の分子系統樹を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮを用いてＵＰＧＭＡ法により作成した。その結果、図７に示した通りｔａｍａｖｉｄｉｎ１およびｔａｍａｖｉｄｉｎ２は、ストレプトアビジンのグループおよびアビジンとは異なる第３のグループを形成していることが明らかとなった。
【０１３２】
ストレプトアビジンと比較した場合、本発明のｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ｔａｍａｖｉｄｉｎ２はＮ末端側が３３アミノ酸短くなっているが、ビオチンとの結合に関与していると考えられているトリプトファン（Ｗ）残基（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５６：ｐ．２７９−２８２）、チロシン（Ｙ）残基（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６９：ｐ．５２７−５３０）は全て保存されている（配列番号２のアミノ酸配列のうち第３４、第４５番目のＹ、第８２、第９８、第１１０番目のＷ、配列表の配列番号４のアミノ酸配列のうち、第３４、第４５番目のＹ、第８０、第９６、第１０８番目のＷ）。
【０１３３】
また成熟タンパク質領域と考えられる部分（配列番号２のアミノ酸配列のうち８−１４３の配列、配列番号４のアミノ酸配列のうち８−１４１の配列）の平均分子量はそれぞれ１５１５８．４、１４７３２．２と算出され、成熟ストレプトアビジンや成熟アビジンの平均分子量（それぞれ１６４９０．６、１４３４２．９）と似ていた。これらのことは、ｔａｍ１にコードされているｔａｍａｖｉｄｉｎ１は勿論、ｔａｍ２にコードされているｔａｍａｖｉｄｉｎ２についてもビオチン結合能を有するタンパク質であることを強く示唆するものである。
【０１３４】
実施例４ ビオチン添加による抗菌活性消失実験
本発明の抗菌タンパク質は新規なストレプトアビジン様タンパク質であることから、ビタミンの一種であるＤ−ビオチン（ビタミンＨ、片山化学工業社製）と結合することが示唆される。一方いもち病菌はその生育にビオチンが必要であることが知られている。これらのことから、本抗菌タンパク質はアッセイ培地に存在する遊離ビオチンと結合し、これが培地中のビオチン欠乏を引き起こし、結果としていもち病菌の生育が抑えれると予測される。
【０１３５】
ビオチン添加による抗菌活性の消失実験の結果を図８に示す。具体的には、マイクロタイタープレートに１／２ ＰＤ培地に懸濁したいもち病菌の胞子を入れ、そこへ精製ｔａｍａｖｉｄｉｎ１を５０ｎｇ／ｍｌまたは１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加したウェル、さらに１０００ｎｇ／ｍｌのｔａｍａｖｉｄｉｎ１に加え１００ｎｇ／ｍｌの濃度のビオチンを加えたウェル、またタンパク質無添加の対照ウェルを設け、２８℃で４８時間培養した。
【０１３６】
その結果、図８に示されるようにｔａｍａｖｉｄｉｎ１添加ウェルでは、５０ｎｇ／ｍｌの濃度でもいもち病菌の菌糸の伸長はかなり抑えられた。これに対し、ｔａｍａｖｉｄｉｎ１（１０００ｎｇ／ｍｌ）とビオチンの両方を添加したウェル、および対照ウェルでは菌糸は正常に伸長した。このように実際にアッセイ培地中にビオチンを過剰に添加すると本抗菌タンパク質の抗菌活性は消去された。これは過剰に加えたビオチンのある一定量が、アッセイに使用したｔａｍａｖｉｄｉｎ１の殆どと結合しその抗菌性を不活化したためであると推論された。
【０１３７】
さらに市販の卵白アビジン（Ｓｉｇｍａ社製）、およびｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ アビジンｉｉのストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ社製）を用い、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で同様の試験を行った。その結果、両タンパクともに、いもち病菌に対して抗菌活性があり、その活性はビオチンで打ち消されることが明らかとなった（図８）。
【０１３８】
実施例５ 組換えＴａｍａｖｉｄｉｎ２タンパク質のビオチン結合活性
１）発現ベクターの構築
ｔａｍ２遺伝子は本発明のｔａｍ１遺伝子のホモログとして単離された遺伝子であるが、このｔａｍ２遺伝子によってコードされるｔａｍａｖｉｄｉｎ２が、実際にビオチン結合活性を示すか否かを調べた。具体的にはｔａｍ２遺伝子を大腸菌に組み込み、組換えｔａｍａｖｉｄｉｎ２を発現させ、このタンパク質がイミノビオチンカラムで精製されるか否かを調べた。
【０１３９】
先ず、実施例３で得られたｔａｍ２遺伝子の全ＯＲＦ（配列表の配列番号３のうち、第２２６番目から第６５１番目の塩基）をＰＣＲにより増幅させるため、一組のプライマー
ＴＭ７５Ｂｓｐ５： ５’−ACCAACATgTCAgACgTTCAA−３’
（配列番号１８）
ＴＭ７５Ｈｉｎ３： ５’−ATgAAAgCTTTTACTTCAACCTCgg−３’
（配列番号１９）
を合成した。ＴＭ７５Ｂｓｐ５には制限酵素ＢｓｐＬＵ １１Ｉの認識部位（下線で示した）が、ＴＭ７５Ｈｉｎ３には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位（下線で示した）がそれぞれ組み込まれている。これらのプライマーを使ってｔａｍ２遺伝子が組み込まれたプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、実施例３（６））を鋳型にＰＣＲを行なった。５０μｌの反応液中に、鋳型プラスミドＤＮＡ ５００ｎｇ，１０´Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ，２．５ｍＭ 各ｄＮＴＰｓ ４μｌ，各プライマー １０ｐｍｏｌｅｓ，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製） ０．５μｌ、をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ社製）を用いて、９４℃、３分を１回、９４℃、１分、５０℃、１分、７２℃、１分を１５回、７２℃、６分を１回行った。
【０１４０】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＬＵ １１Ｉ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ社製）で二重消化し、ゲル精製した。大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社製）を用いた。このベクターを制限酵素ＮｃｏＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＨｉｎｄＩＩＩで二重消化しゲル精製したものを、上述の制限酵素処理を施したＰＣＲ産物とライゲーションし、大腸菌ＴＢ１に組み込んだ。組み込んだｔａｍ２遺伝子の塩基配列を確認した。
【０１４１】
２）組換えタンパク質の発現とビオチンカラムによる精製
ｔａｍ２が組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００＝０．５程度になるまで菌を前培養した。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度で１ｍＭ加え、タンパク質発現を誘導し、３７℃でさらに４．５時間振盪培養した。培養スケールは５０ｍＬとし、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−b−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、和光純薬社製）を加えないものを対照とした。菌体を遠心分離によって集め、タンパク質精製まで−８０℃で保存した。
【０１４２】
Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２の精製は、Ｈｏｆｍａｎｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４６６６−４６６８（１９８０））を参考に、イミノビオチンによる精製を行なった。菌体を１．５ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＣＡＰＳ（３−［Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＳＩＧＭＡ社製）、ｐＨ１１，５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に懸濁し、ソニケーションにより菌体を破壊した。遠心後上清を総可溶性タンパク質とした。２−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製） ０．５ｍＬを直径０．５ｃｍ、長さ５ｃｍのカラムに充填し、緩衝液Ａで平衡化した。このイミノビオチンアガロースカラムに、総可溶性タンパク質を通過させた。カラムを５ｍＬの５０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１，５００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、１．５ｍＬの５０ｍＭ ＮＨ４ＯＡＣ ｐＨ４．０によりｔａｍａｖｉｄｉｎ２を溶出した。総可溶性タンパク質、カラム通過画分、洗浄画分、溶出画分を１５％ ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した。
【０１４３】
泳動後、タンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０（和光純薬社製）で染色した。結果を図９に示す。図９に示すように、１ｍＭのＩＰＴＧによってタンパク質発現誘導をかけた大腸菌の総可溶性タンパク質画分（Ｔ）に、発現誘導をかけなかった場合（Ｃ）には存在しない１５ｋＤａ付近のバンドが見られた。この分子量はｔａｍ２遺伝子のコードする１４１個のアミノ酸から推定される分子量１５４６７と良く一致した。
【０１４４】
さらにこの１５ｋＤａタンパク質は、イミノビオチンカラム通過画分（Ｆ）、同洗浄画分（Ｗ）には現れず、５０ｍＭ ＮＨ４ＯＡＣ ｐＨ４．０による溶出画分（Ｅ）に現れた。溶出画分ではこの１５ｋＤａタンパク質が主要要素となっていた。この結果から、ｔａｍ２にコードされるｔａｍａｖｉｄｉｎ２は、ビオチンに結合することが明らかとなった。しかも上記に示す方法で簡便に精製され得ることが明らかとなった。５０ｍＬの培養で得られる大腸菌発現組換えｔａｍａｖｉｄｉｎ２の収量はおよそ１ｍｇであった。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、本発明抗菌タンパク質によるいもち病菌の生育阻害の様相を示す（８０℃、１０分処理したタンパク質画分を添加した。培養開始４８時間後の結果）。
【図２】図２は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムによって分離されたタモギタケタンパク質の各画分の電気泳動像と抗菌性との関係を示す。Ｍは分子量マーカーを、ＦＴはカラム通過画分を示す。またレーン下の記号（−、＋、＋＋）は抗菌活性の強さを示す。括弧内の抗菌活性は本発明で精製したものとは別の抗菌活性を示す。
【図３】図３は、ＭｏｎｏＱカラムによるタモギタケ抗菌タンパクの分離のチャートと抗菌活性との関係を示す。抗菌活性を示した溶出位置を＋で示した。
【図４】図４は、ＭｏｎｏＱカラムによるタモギタケ抗菌タンパクの分離の電気泳動像と抗菌活性との関係を示す。レーン上の番号は図３の画分番号に一致し、Ｍは分子量マーカーを、ＯｒｉはＭｏｎｏＱにかけたＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分をそれぞれ示す。またレーン下の記号（−、＋、＋＋、＋＋＋）は抗菌活性の強さを示す。抗菌タンパク（１５ｋＤａ）を矢印で示した。
【図５】図５は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６によるタモギタケ抗菌タンパク質の精製チャートと抗菌活性との関係を示す。矢印はＧｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の溶出位置を示す。抗菌活性を示した画分の位置を＋で示した。
【図６】図６は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６によるタモギタケ抗菌タンパク質の精製の電気泳動像と抗菌活性との関係を示す。レーン上の番号は図５の画分番号に一致し、ＯｒｉはＳｕｐｅｒｏｓｅ ６にかけたＭｏｎｏＱ画分を、Ｍは分子量マーカーを示す。またレーン下の記号（−、＋、＋＋）は抗菌活性の強さを示す。抗菌タンパク質（１５ｋＤａ）を矢印で示した。
【図７】図７は、ｔａｍａｖｉｄｉｎ１とｔａｍａｖｉｄｉｎ２、ストレプトアビジンとそのホモローグ、アビジンのアミノ酸配列（成熟タンパク質領域）の分子系統樹を示す。
【図８】図８は、ビオチン添加による抗菌活性の消失実験の結果を示す。マイクロタイタープレートに１／２ ＰＤ培地に懸濁したいもち病菌の胞子を入れ、そこへ１０００ｎｇ／ｍｌの濃度の精製ｔａｍａｖｉｄｉｎ１、ストレプトアビジン、アビジンを添加したウェル、さらに同濃度のそれらタンパク質に加え１００ｎｇ／ｍｌの濃度のビオチンを加えたウェル、さらにタンパク質無添加のウェルを作成し、２８°Ｃで４８時間培養した。５０ｎｇ／ｍｌの濃度の精製ｔａｍａｖｉｄｉｎを添加したウェルも同時に示した。
【図９】図９は、大腸菌発現組換えｔａｍａｖｉｄｉｎ２のイミノビオチンカラムによる精製を示す。ＣはＩＰＴＧ誘導をかけない大腸菌の総可溶性タンパク質画分を、Ｔは１ｍＭのＩＰＴＧによってタンパク質発現誘導をかけた大腸菌の総可溶性タンパク質画分を示す。Ｆは、１ｍＭのＩＰＴＧによって、タンパク質発現誘導をかけた大腸菌の総可溶性タンパク質のうちイミノビオチンカラムに結合せず、通過したタンパク質の画分を、Ｗは同カラムの洗浄処理によって溶出された画分を、Ｅは酸性緩衝液により溶出された画分をそれぞれ示す。Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２タンパク質（およそ１５ｋＤａ）を矢印で示し、分子量マーカー（ＬＭＷ マーカーキット：Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社製）をＭで示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タモギタケの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分子量が約１５ｋＤａの成分の存在を示す、抗菌タンパク質。
【請求項２】
Ｎ末端が、配列表の配列番号９記載のＮ末端アミノ酸配列：
Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val
（ここにおいてＸａａは不明である）
を有する、請求項１に記載の抗菌タンパク質。
【請求項３】
配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列若しくはこの配列と５２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す抗菌タンパク質。
【請求項４】
配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項３に記載の抗菌タンパク質。
【請求項５】
配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項３に記載の抗菌タンパク質。
【請求項６】
配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項３に記載の抗菌タンパク質。
【請求項７】
配列番号２または４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項３に記載の抗菌タンパク質。
【請求項８】
配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項３に記載の抗菌タンパク質。
【請求項９】
配列番号２の部分アミノ酸配列８−１４３又は配列番号４の部分アミノ酸配列８−１４１からなるポリペプチド、並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に１〜複数個のアミノ酸変異を有するポリペプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと５２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであってイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリペプチド、の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質。
【請求項１０】
タモギタケの水性抽出液から硫安７５％飽和を使用する硫安沈殿法で沈殿する画分を回収する工程；および
上記画分をイオン交換クロマトグラフィーにかけＮａＣｌ濃度５０ｍＭから６００Ｍの濃度で溶出する画分を回収する工程；
を含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の抗菌タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の抗菌タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列、上記塩基配列中に１〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する請求項１１に記載の遺伝子。
【請求項１３】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項１１又は１２に記載の遺伝子。
【請求項１４】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項１１又は１２に記載の遺伝子。
【請求項１５】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項１１又は１２に記載の遺伝子。
【請求項１６】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項１１又は１２に記載の遺伝子。
【請求項１７】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項１１又は１２に記載の遺伝子。
【請求項１８】
タモギタケ由来の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を得るためのオリゴヌクレオチドであって、
配列番号１又は３に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号１０ないし１９の何れかに記載のヌクレオチド配列を有する請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載のオリゴヌクレオチドの２種をプライマー対として用いて、タモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして核酸増幅反応を行い請求項１ないし９のいずれか１項に記載の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の一部を増幅し、得られた増幅産物をプローブとして使用して上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして完全長ｃＤＮＡクローンを単離することを含む、請求項１１ないし１７のいずれか１項に記載の遺伝子の単離方法。
【請求項２１】
請求項１１ないし１７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項２２】
ベクターが発現ベクターである請求項２１に記載の組換えベクター。
【請求項２３】
宿主生物に請求項２１または２２に記載の組換えベクターを導入して得られる形質転換体。
【請求項２４】
病害抵抗性植物である、請求項２３の形質転換体。
【請求項２５】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤。
【請求項２６】
請求項２３の形質転換体によって発現される、組換えタンパク質。
【請求項１】
タモギタケの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分子量が約１５ｋＤａの成分の存在を示す、抗菌タンパク質。
【請求項２】
Ｎ末端が、配列表の配列番号９記載のＮ末端アミノ酸配列：
Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val
（ここにおいてＸａａは不明である）
を有する、請求項１に記載の抗菌タンパク質。
【請求項３】
配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列若しくはこの配列と５２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す抗菌タンパク質。
【請求項４】
配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項３に記載の抗菌タンパク質。
【請求項５】
配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項３に記載の抗菌タンパク質。
【請求項６】
配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項３に記載の抗菌タンパク質。
【請求項７】
配列番号２または４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項３に記載の抗菌タンパク質。
【請求項８】
配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項３に記載の抗菌タンパク質。
【請求項９】
配列番号２の部分アミノ酸配列８−１４３又は配列番号４の部分アミノ酸配列８−１４１からなるポリペプチド、並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に１〜複数個のアミノ酸変異を有するポリペプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと５２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであってイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリペプチド、の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質。
【請求項１０】
タモギタケの水性抽出液から硫安７５％飽和を使用する硫安沈殿法で沈殿する画分を回収する工程；および
上記画分をイオン交換クロマトグラフィーにかけＮａＣｌ濃度５０ｍＭから６００Ｍの濃度で溶出する画分を回収する工程；
を含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の抗菌タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の抗菌タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列、上記塩基配列中に１〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する請求項１１に記載の遺伝子。
【請求項１３】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項１１又は１２に記載の遺伝子。
【請求項１４】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項１１又は１２に記載の遺伝子。
【請求項１５】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項１１又は１２に記載の遺伝子。
【請求項１６】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項１１又は１２に記載の遺伝子。
【請求項１７】
配列番号１の塩基７１−５０２の塩基配列又は配列番号３の塩基２２６−６５１の塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項１１又は１２に記載の遺伝子。
【請求項１８】
タモギタケ由来の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を得るためのオリゴヌクレオチドであって、
配列番号１又は３に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号１０ないし１９の何れかに記載のヌクレオチド配列を有する請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載のオリゴヌクレオチドの２種をプライマー対として用いて、タモギタケ子実体ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして核酸増幅反応を行い請求項１ないし９のいずれか１項に記載の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の一部を増幅し、得られた増幅産物をプローブとして使用して上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして完全長ｃＤＮＡクローンを単離することを含む、請求項１１ないし１７のいずれか１項に記載の遺伝子の単離方法。
【請求項２１】
請求項１１ないし１７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項２２】
ベクターが発現ベクターである請求項２１に記載の組換えベクター。
【請求項２３】
宿主生物に請求項２１または２２に記載の組換えベクターを導入して得られる形質転換体。
【請求項２４】
病害抵抗性植物である、請求項２３の形質転換体。
【請求項２５】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤。
【請求項２６】
請求項２３の形質転換体によって発現される、組換えタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−２０００３８（Ｐ２００８−２０００３８Ａ）
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１６２９（Ｐ２００８−２１６２９）
【出願日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【分割の表示】特願２００２−５７１８７２（Ｐ２００２−５７１８７２）の分割
【原出願日】平成１４年３月１２日（２００２．３．１２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（０００００４５６９）日本たばこ産業株式会社 (406)
【出願人】（５００３７１３０７）シンジェンタ リミテッド (141)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【分割の表示】特願２００２−５７１８７２（Ｐ２００２−５７１８７２）の分割
【原出願日】平成１４年３月１２日（２００２．３．１２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（０００００４５６９）日本たばこ産業株式会社 (406)
【出願人】（５００３７１３０７）シンジェンタ リミテッド (141)
【Ｆターム（参考）】
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