新規ビフィドバクテリウム属微生物およびその利用
【課題】Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することができ、飲食品、医薬品等に利用可能な新規のビフィドバクテリウム属微生物を提供する。
【解決手段】特定の塩基配列を持つ１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含むビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物であって、マウス脾臓細胞、加熱殺菌した該微生物、トランスフォーミング増殖因子ベータおよびインターロイキン−６を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のインターロイキン−１７の産生量が、前記微生物を添加しない場合の３０％以下であるような微生物。
【解決手段】特定の塩基配列を持つ１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を含むビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物であって、マウス脾臓細胞、加熱殺菌した該微生物、トランスフォーミング増殖因子ベータおよびインターロイキン−６を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のインターロイキン−１７の産生量が、前記微生物を添加しない場合の３０％以下であるような微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ビフィドバクテリウム属微生物およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物は、全ての動物の腸管内に生息している微生物である。このビフィドバクテリウム属微生物には、整腸作用、免疫調節作用等の生理作用が知られている。
【０００３】
ビフィドバクテリウム属微生物の免疫調節作用は、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスを調整することにより行われることが知られている。しかし、免疫調節には、Ｔｈ１やＴｈ２だけでなくＴｈ１７等の関与も明らかにされてきたが、経口摂取可能な微生物の中には、Ｔｈ１７を調節できず、かえってＴｈ１７の分化を促進してしまうものがあり、ビフィドバクテリウム属微生物のＴｈ１７調節作用に関する知見は、ほとんどみられない。
【０００４】
Ｔｈ１７の分化が促進されると、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）が産生され、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、乾癬、１型糖尿病、気管支喘息等のＩＬ−１７との関連が示唆されている疾患が引き起こされる可能性がある。そのため、ＩＬ−１７の産生を抑制することができれば、それらの疾患の予防・治療に利用できると期待されている。
【０００５】
しかしながら、これまでＴｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することができるビフィドバクテリウム属微生物は、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）だけであるが（非特許文献１）、これの飲食品、医薬品等への利用も進んでいないのが実情であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tanabe, S., et al.: Int. J. Mol. Med., 22: 181-185,2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そのため、Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することができ、飲食品、医薬品等に利用可能な新規のビフィドバクテリウム属微生物の提供が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、乳児の糞便から、上記性質を有する新規のビフィドバクテリウム属微生物を見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含むビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物である。
【００１０】
また、本発明は上記ビフィドバクテリウム属微生物を含有することを特徴とする飲食品である。
【００１１】
更に、本発明はビフィドバクテリウム属微生物を含有することを特徴とする医薬品である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することができるものである。
【００１３】
従って、本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、ＩＬ−１７との関連が示唆されている疾患の予防・治療に用いることのできる飲食品、医薬品等となる。
【００１４】
また、本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、上記従来のビフィドバクテリウム属微生物と同様に、ンターフェロン−γの産生を促進し、かつ、インターロイキン−４の産生を抑制するので、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスをＴｈ１側に調整することができる。
【００１５】
従って、本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスがＴｈ２側になることと関連する疾患の予防・治療に用いることのできる飲食品、医薬品等となる。また、この場合には、本発明のビフィドバクテリウム属微生物がＴｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することができるため、従来の上記疾患の予防・治療に用いられる飲食品、医薬品等と比べて副作用が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】既知のビフィドバクテリウム属微生物と本発明のビフィドバクテリウム属微生物との関係を示した系統樹である。
【図２】ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株のＴｈ１７抑制活性を示す図面である（図２中、−は無刺激対照、＋は陰性対象）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の新規ビフィドバクテリウム属微生物は、乳児の糞便、腸管等から、例えば、以下の方法により得ることができる。
【００１８】
まず、健常な乳児の糞便の排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを糞便が凍結しない温度、例えば、７℃以下の冷蔵で運搬する。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＳ寒天培地もしくはＢＬ寒天培地（共に栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養する。培養後に得られたコロニーを釣菌し、分離培地と同じ条件で純化確認をする。純化確認した微生物を−８５℃で凍結保存する。
【００１９】
次に、上記で保存した微生物の１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列を例えば、以下の２７Ｆと７５Ｒのプライマーを用いコロニーＰＣＲによって、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、更に、２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）により全１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定する。ここで決定された塩基配列のうち、約１３００ｂｐの塩基長で、配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と９７％以上の相同性を示すものを選択し、その後、定法の性状試験（内村泰、岡田早苗、「乳酸菌実験マニュアル」、小崎道雄監修、初版、２９−７２、朝倉書店、１９９２）等を行い、以下の分類学的性質を有するものとして本発明の新規ビフィドバクテリウム属微生物が得られる。
【００２０】
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００２１】
＜分類学的性質＞
（１）微生物の形態
種類：桿菌
細胞のサイズ：長さ０.２〜０.３μｍ×幅１.０〜１.３μｍ
細胞の端：円形
細胞連鎖の様子：短い連鎖・単細胞のものもあり
芽胞：芽胞は形成しない
（２）コロニー形態＊
直径：１ｍｍ
色調：褐色
形：円形
隆起状態：半レンズ状
周縁：全縁
表面の形状等：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：バター様
＊微生物を嫌気条件下、ＢＬ培地で３７℃、４８時間培養した場合の形態。
（３）炭素源の資化性
糖類発酵性試験＊＊
Ｄ−キシロース ＋
Ｄ−リボース ＋
Ｄ−マンノース ｗｅａｋ
Ｄ−セロビオース ＋
Ｄ−トレハロース −
メレジトース −
デキストリン ｗｅａｋ
スターチ −
イヌリン ｗｅａｋ
マンニトール −
ソルビトール ＋
アラビノース ＋
グルコース ＋
フラクトース ＋
ガラクトース ＋
シュクロース ＋
マルトース ＋
ラクトース ＋
メリビオース ＋
ラフィノース ＋
サリシン ＋
グリセロール −
ラムノース −
糖類なし −
＊＊＋は資化性あり、−は資化性なし。
（４）酵素活性試験＊＊＊
アルカリフォスファターゼ −
エステラーゼ（Ｃ４） −
エステラーゼリパーゼ（Ｃ８） ＋
リパーゼ（Ｃ１４） −
ロイシンアリルアミダーゼ ＋
バリンアリルアミダーゼ −
シスチンアリルアミダーゼ −
トリプシン −
α−キモトリプシン −
酸性フォスファターゼ ＋
ナフトール−ＡＳ−ＢＩ −
−フォスフォヒドロラーゼ
α−ガラクトシダーゼ ＋
β−ガラクトシダーゼ ＋
β−グルクロニダーゼ −
α−グルコシダーゼ ＋
β−グルコシダーゼ ＋
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ −
α−マンノシダーゼ −
α−フコシダーゼ −
＊＊＊ＡＰＩ ＺＹＭ（bioMerieux Japan）を用いた。＋は資化性あり、−は資化性なし。
（５）培養条件
ＡＢＣＭ液体培地とＢＬ寒天培地が適する。嫌気培養を必要とし、アネロパック（三菱ガス化学）による嫌気システムでも、スチールウール法による炭酸ガス置換のどちらでも生育する。これらに準ずる嫌気培養しないと、まったく生育しない。ＡＢＣＭ液体培地の場合は３７℃、２４時間培養でＯＤ値は１.２以上となり、ＢＬ寒天培地の場合は３７℃、４８時間培養でコロニーが形成される。
（６）生育条件等
生育温度試験 １５℃ −
３７℃ ＋
４５℃ −
好気性試験 −
嫌気性試験 ＋
初発ｐＨ試験 ｐＨ４.５ −
ｐＨ７.２ ＋
ｐＨ８.０ ＋
ガス産生試験 −
（７）Ｇ＋Ｃ含量
５６±２ｍｏｌ％
（８）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の相同性
ビフィドバクテリウム属に該当する既知との近縁種の基準株は、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Bifidobacterium catenulatum）ＪＣＭ１１９４株 （９４％：１,３１６／１,３８８ｂｐ）、ビフィドバクテリウム・アングラータム（Bifidobacterium angulatum）ＪＣＭ７０９６株（９４％：１,３１０／１,３８９ｂｐ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）ＪＣＭ１１９５株（９４％：１,３２１／１,４０３ｂｐ）である。一般的に相同性が９７％未満であれば別種であるとされるが、最も近縁の上記３株であっても相同性は９４％であった。従って、配列表の配列番号１に示す配列に対し相同性が９７％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上であれば、本発明のビフィドバクテリウム属微生物に含まれる。
（９）ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、蛍光検出によるマイクロプレート法（Ezaki, T., et al.: Int. J. Syst. Bacteriol., 39: 224-229, 1989）により、上記近縁種の基準株とＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行った結果、ビフィドバクテリウム・カテヌラータムＪＣＭ１１９４株と１６％、ビフィドバクテリウム・アングラータムＪＣＭ７０９６株と２３％、ビフィドバクテリウム・デンティウムＪＣＭ１１９５株と２７％の相同性である。従って、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％あれば本発明のビフィドバクテリウム属微生物に含まれる。
（１０）系統解析
解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬ Ｗにより系統樹を作成した。図１は、既知のビフィドバクテリウム属微生物と本発明のビフィドバクテリウム属微生物との関係を示した系統樹である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、また括弧内の記号はアクセッションナンバーを表す。
（１１）ＩＬ−１７産生抑制作用
マウス脾臓細胞、加熱殺菌したビフィドバクテリウム属微生物、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）およびＩＬ−６を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のＩＬ−１７の産生量が、前記微生物を添加しない場合の３０％以下、好ましくは２０％以下である。
（１２）Ｔｈ１／Ｔｈ２調整作用
マウス脾臓細胞と、加熱殺菌したビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生量とインターロイキン−４（ＩＬ−４）の産生量の比が、前記微生物を添加しない場合の２倍以上、好ましくは１０倍以上である。
【００２２】
なお、本発明の新規ビフィドバクテリウム属微生物は、上記分類学的性質のうち、少なくとも以下の（イ）〜（ヘ）からなる群から選ばれる１種または２種以上、好ましくは全てにより従来のビフィドバクテリウム属微生物と区別することができる。
（イ）マウス脾臓細胞、加熱殺菌したビフィドバクテリウム属微生物、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のＩＬ−１７の産生量が、前記微生物を添加しない場合の３０％以下
（ロ）Ｇ＋Ｃ含量が５６±２ｍｏｌ％
（ハ）嫌気培養しないと生育しない
（ニ）消化管内で有害な酵素活性であるβ−グルクロニダーゼ活性はない
（ホ）芽胞は形成せず、桿状の細胞形態をとる
（ヘ）マウス脾臓細胞と、加熱殺菌したビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生量とインターロイキン−４（ＩＬ−４）の産生量の比が、前記微生物を添加しない場合の２倍以上
【００２３】
上記の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列および分類学的性質を有する新規ビフィドバクテリウム属微生物の一例としては、本発明者らが乳児の糞便から分離したビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株が挙げられる。このビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株は、平成２１年３月１７日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）へ寄託した（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７８９）。
【００２４】
上記した本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、公知の他のビフィドバクテリウム属微生物と同様に、これを含有させた各種飲食品、医薬品等に利用することができる。
【００２５】
上記飲食品としては、アメ、ガム、クッキー、せんべい等の菓子、清涼飲料、炭酸飲料、アルコール飲料等の飲料、麺、パン等の食品、ヨーグルト、豆乳ヨーグルト等の発酵乳製品等が挙げられ、特に発酵乳製品が好ましい。また、これらの飲食品は常法に従って製造することができる。
【００２６】
上記医薬品としては、生菌体、乾燥菌体またはそれらの粉砕物等を単独あるいは通常の医薬担体と混合して通常の錠剤、散剤、カプセル剤等が挙げられる。また、これらの医薬品は常法に従って製造することができる。
【００２７】
これらの飲食品および医薬品は、本発明のビフィドバクテリウム属微生物がＴｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することもできるので、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、乾癬、１型糖尿病、気管支喘息等のＩＬ−１７との関連が示唆されている疾患の予防・治療に利用できる。
【００２８】
また、本発明のビフィドバクテリウム属微生物が上記Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制するだけではなく、インターフェロン−γの産生を促進し、かつ、インターロイキン−４の産生を抑制するので、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスをＴｈ１側に調整することができる。そのため、上記飲食品および医薬品は花粉症、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患等のＴｈ１とＴｈ２のバランスがＴｈ２側になることと関連する疾患の予防・治療にも利用できる。しかも、この場合には、本発明のビフィドバクテリウム属微生物がＴｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することもできるため、従来の上記疾患の予防・治療に用いられる飲食品、医薬品等と比べて副作用が少ない。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３０】
実 施 例 １
ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株の分離：
健常な乳児（男：１才６ヶ月）の排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを７℃以下の冷蔵で運搬した。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＬ寒天培地（共に栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養した。
【００３１】
培養後に得られたコロニーを釣菌し、分離培地と同じ条件で純化確認をした。純化確認した微生物を−８５℃で凍結保存した。保存した微生物の１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列を以下のプライマーを用いてシークエンスし、ＢＬＡＳＴサーチ（ＤＤＢＪホームページ：http://www.ddbj.nig.ac.jp）することにより決定した。
【００３２】
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００３３】
上記で決定されたビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列（１,３９４ｂｐ）を配列表の配列番号１に示した。
【００３４】
実 施 例 ２
マウス脾臓細胞刺激試験（１）：
実施例１で得られたビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株を、ＡＢＣＭ液体培地（栄研化学株式会社）を用いて３７℃で２４時間嫌気培養した。これらの培養物は、３，０００×ｇ、１０分、４℃の遠心分離によって回収し、蒸留水で３回洗浄した。菌体は、１００℃、５０分間の熱処理によって殺菌し、凍結乾燥して保存した。
【００３５】
６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を１０％（Ｖ／Ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清、１０μＭの２−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを加えた１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、該培地を適宜希釈し１０７個／ｍｌとした脾臓細胞懸濁液に、２ｎｇのＴＧＦ−β、２０ｎｇのＩＬ−６及び加熱殺菌したビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株（加熱殺菌前の菌数１０７ＣＦＵ）を培地に加え、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で７２時間培養した。
【００３６】
培養後、上清中のＩＬ−１７濃度をバイオ−プレックスサスペンション アレイ システム（Bio-Plex Suspension Array System：BioRad Laboratories社製）を用いたマイクロビーズ法によって測定し、蛍光強度値を決定した。ＴＧＦ−β、ＩＬ−６及びビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株を加えなかったものを無刺激対照（−）、ＴＧＦ−β及びＩＬ−６は加えるがビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株を加えなかったものを陰性対照（＋）とした。試験の結果を図２に示した。
【００３７】
上記の試験の結果、ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株のＩＬ−１７の産生量は、陰性対照の１７.４％であった。
【００３８】
これより、ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株は、Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制するものであることが示された。
【００３９】
実 施 例 ３
ヨーグルトの製造：
１０質量％スキムミルクを、１１０℃で２０分間の滅菌を行い、試験管に１０ｍｌずつ分注した。この試験管を氷中で急冷により嫌気度を保ち、予めＭＲＳ液体培地（Ｏｘｏｉｄ）で培養しておいたラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）Ｂ５ｂ株（財団法人日本乳業技術協会（〒１０２−００７３東京都千代田区九段北１−１４−１９）の分譲株）の１０８レベルの菌液を０.５質量％量およびＡＢＣＭ液体培地（栄研化学）で培養しておいたビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株の１０８レベルの菌液を２質量％量、接種した。次いで、これを３７℃で１６時間培養し、ヨーグルトを製造した。このヨーグルトの生菌数は、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＢ５ｂ株が８.２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ、ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株が、５.６×１０７ＣＦＵ／ｍｌであった。また、このヨーグルトのｐＨは適度に低下し、風味も良好であった。
【００４０】
実 施 例 ４
マウス脾臓細胞刺激試験（２）：
６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を１０％（Ｖ／Ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清、１０μＭの２−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを加えた１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、該培地を適宜希釈し１０７個／ｍｌとした脾臓細胞懸濁液に、実施例２と同様にして加熱殺菌したビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株（加熱殺菌前の菌数１０７ＣＦＵ）を培地に加え、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で７２時間培養した。
【００４１】
培養後、上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４濃度をバイオ−プレックス サスペンション アレイ システム（Bio-Plex Suspension Array System：BioRad Laboratories社製）を用いたマイクロビーズ法によって測定し、蛍光強度値を決定した。ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株を加えなかったものを無刺激対照（−）とした。試験の結果を表１に示した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
上記試験の結果、ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株の添加により、上清中のＩＦＮ−γ濃度が上昇したが、ＩＬ−４濃度は減少した。ＩＦＮ−γはＴｈ１細胞の、またＩＬ−４はＴｈ２細胞の出す代表的なサイトカインであることから、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４比を算出して、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの指標とした。ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株の添加により、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスは１６５から２,８３２に上昇した。
【００４４】
これより、ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１側に調整する能力があることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制するものであるので、ＩＬ−１７との関連が示唆されている疾患の予防・治療に用いることのできる飲食品や医薬品に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ビフィドバクテリウム属微生物およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物は、全ての動物の腸管内に生息している微生物である。このビフィドバクテリウム属微生物には、整腸作用、免疫調節作用等の生理作用が知られている。
【０００３】
ビフィドバクテリウム属微生物の免疫調節作用は、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスを調整することにより行われることが知られている。しかし、免疫調節には、Ｔｈ１やＴｈ２だけでなくＴｈ１７等の関与も明らかにされてきたが、経口摂取可能な微生物の中には、Ｔｈ１７を調節できず、かえってＴｈ１７の分化を促進してしまうものがあり、ビフィドバクテリウム属微生物のＴｈ１７調節作用に関する知見は、ほとんどみられない。
【０００４】
Ｔｈ１７の分化が促進されると、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）が産生され、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、乾癬、１型糖尿病、気管支喘息等のＩＬ−１７との関連が示唆されている疾患が引き起こされる可能性がある。そのため、ＩＬ−１７の産生を抑制することができれば、それらの疾患の予防・治療に利用できると期待されている。
【０００５】
しかしながら、これまでＴｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することができるビフィドバクテリウム属微生物は、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）だけであるが（非特許文献１）、これの飲食品、医薬品等への利用も進んでいないのが実情であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tanabe, S., et al.: Int. J. Mol. Med., 22: 181-185,2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そのため、Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することができ、飲食品、医薬品等に利用可能な新規のビフィドバクテリウム属微生物の提供が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、乳児の糞便から、上記性質を有する新規のビフィドバクテリウム属微生物を見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含むビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物である。
【００１０】
また、本発明は上記ビフィドバクテリウム属微生物を含有することを特徴とする飲食品である。
【００１１】
更に、本発明はビフィドバクテリウム属微生物を含有することを特徴とする医薬品である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することができるものである。
【００１３】
従って、本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、ＩＬ−１７との関連が示唆されている疾患の予防・治療に用いることのできる飲食品、医薬品等となる。
【００１４】
また、本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、上記従来のビフィドバクテリウム属微生物と同様に、ンターフェロン−γの産生を促進し、かつ、インターロイキン−４の産生を抑制するので、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスをＴｈ１側に調整することができる。
【００１５】
従って、本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスがＴｈ２側になることと関連する疾患の予防・治療に用いることのできる飲食品、医薬品等となる。また、この場合には、本発明のビフィドバクテリウム属微生物がＴｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することができるため、従来の上記疾患の予防・治療に用いられる飲食品、医薬品等と比べて副作用が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】既知のビフィドバクテリウム属微生物と本発明のビフィドバクテリウム属微生物との関係を示した系統樹である。
【図２】ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株のＴｈ１７抑制活性を示す図面である（図２中、−は無刺激対照、＋は陰性対象）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の新規ビフィドバクテリウム属微生物は、乳児の糞便、腸管等から、例えば、以下の方法により得ることができる。
【００１８】
まず、健常な乳児の糞便の排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを糞便が凍結しない温度、例えば、７℃以下の冷蔵で運搬する。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＳ寒天培地もしくはＢＬ寒天培地（共に栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養する。培養後に得られたコロニーを釣菌し、分離培地と同じ条件で純化確認をする。純化確認した微生物を−８５℃で凍結保存する。
【００１９】
次に、上記で保存した微生物の１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列を例えば、以下の２７Ｆと７５Ｒのプライマーを用いコロニーＰＣＲによって、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、更に、２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）により全１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定する。ここで決定された塩基配列のうち、約１３００ｂｐの塩基長で、配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と９７％以上の相同性を示すものを選択し、その後、定法の性状試験（内村泰、岡田早苗、「乳酸菌実験マニュアル」、小崎道雄監修、初版、２９−７２、朝倉書店、１９９２）等を行い、以下の分類学的性質を有するものとして本発明の新規ビフィドバクテリウム属微生物が得られる。
【００２０】
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００２１】
＜分類学的性質＞
（１）微生物の形態
種類：桿菌
細胞のサイズ：長さ０.２〜０.３μｍ×幅１.０〜１.３μｍ
細胞の端：円形
細胞連鎖の様子：短い連鎖・単細胞のものもあり
芽胞：芽胞は形成しない
（２）コロニー形態＊
直径：１ｍｍ
色調：褐色
形：円形
隆起状態：半レンズ状
周縁：全縁
表面の形状等：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：バター様
＊微生物を嫌気条件下、ＢＬ培地で３７℃、４８時間培養した場合の形態。
（３）炭素源の資化性
糖類発酵性試験＊＊
Ｄ−キシロース ＋
Ｄ−リボース ＋
Ｄ−マンノース ｗｅａｋ
Ｄ−セロビオース ＋
Ｄ−トレハロース −
メレジトース −
デキストリン ｗｅａｋ
スターチ −
イヌリン ｗｅａｋ
マンニトール −
ソルビトール ＋
アラビノース ＋
グルコース ＋
フラクトース ＋
ガラクトース ＋
シュクロース ＋
マルトース ＋
ラクトース ＋
メリビオース ＋
ラフィノース ＋
サリシン ＋
グリセロール −
ラムノース −
糖類なし −
＊＊＋は資化性あり、−は資化性なし。
（４）酵素活性試験＊＊＊
アルカリフォスファターゼ −
エステラーゼ（Ｃ４） −
エステラーゼリパーゼ（Ｃ８） ＋
リパーゼ（Ｃ１４） −
ロイシンアリルアミダーゼ ＋
バリンアリルアミダーゼ −
シスチンアリルアミダーゼ −
トリプシン −
α−キモトリプシン −
酸性フォスファターゼ ＋
ナフトール−ＡＳ−ＢＩ −
−フォスフォヒドロラーゼ
α−ガラクトシダーゼ ＋
β−ガラクトシダーゼ ＋
β−グルクロニダーゼ −
α−グルコシダーゼ ＋
β−グルコシダーゼ ＋
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ −
α−マンノシダーゼ −
α−フコシダーゼ −
＊＊＊ＡＰＩ ＺＹＭ（bioMerieux Japan）を用いた。＋は資化性あり、−は資化性なし。
（５）培養条件
ＡＢＣＭ液体培地とＢＬ寒天培地が適する。嫌気培養を必要とし、アネロパック（三菱ガス化学）による嫌気システムでも、スチールウール法による炭酸ガス置換のどちらでも生育する。これらに準ずる嫌気培養しないと、まったく生育しない。ＡＢＣＭ液体培地の場合は３７℃、２４時間培養でＯＤ値は１.２以上となり、ＢＬ寒天培地の場合は３７℃、４８時間培養でコロニーが形成される。
（６）生育条件等
生育温度試験 １５℃ −
３７℃ ＋
４５℃ −
好気性試験 −
嫌気性試験 ＋
初発ｐＨ試験 ｐＨ４.５ −
ｐＨ７.２ ＋
ｐＨ８.０ ＋
ガス産生試験 −
（７）Ｇ＋Ｃ含量
５６±２ｍｏｌ％
（８）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の相同性
ビフィドバクテリウム属に該当する既知との近縁種の基準株は、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Bifidobacterium catenulatum）ＪＣＭ１１９４株 （９４％：１,３１６／１,３８８ｂｐ）、ビフィドバクテリウム・アングラータム（Bifidobacterium angulatum）ＪＣＭ７０９６株（９４％：１,３１０／１,３８９ｂｐ）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）ＪＣＭ１１９５株（９４％：１,３２１／１,４０３ｂｐ）である。一般的に相同性が９７％未満であれば別種であるとされるが、最も近縁の上記３株であっても相同性は９４％であった。従って、配列表の配列番号１に示す配列に対し相同性が９７％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上であれば、本発明のビフィドバクテリウム属微生物に含まれる。
（９）ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、蛍光検出によるマイクロプレート法（Ezaki, T., et al.: Int. J. Syst. Bacteriol., 39: 224-229, 1989）により、上記近縁種の基準株とＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行った結果、ビフィドバクテリウム・カテヌラータムＪＣＭ１１９４株と１６％、ビフィドバクテリウム・アングラータムＪＣＭ７０９６株と２３％、ビフィドバクテリウム・デンティウムＪＣＭ１１９５株と２７％の相同性である。従って、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％あれば本発明のビフィドバクテリウム属微生物に含まれる。
（１０）系統解析
解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬ Ｗにより系統樹を作成した。図１は、既知のビフィドバクテリウム属微生物と本発明のビフィドバクテリウム属微生物との関係を示した系統樹である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、また括弧内の記号はアクセッションナンバーを表す。
（１１）ＩＬ−１７産生抑制作用
マウス脾臓細胞、加熱殺菌したビフィドバクテリウム属微生物、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）およびＩＬ−６を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のＩＬ−１７の産生量が、前記微生物を添加しない場合の３０％以下、好ましくは２０％以下である。
（１２）Ｔｈ１／Ｔｈ２調整作用
マウス脾臓細胞と、加熱殺菌したビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生量とインターロイキン−４（ＩＬ−４）の産生量の比が、前記微生物を添加しない場合の２倍以上、好ましくは１０倍以上である。
【００２２】
なお、本発明の新規ビフィドバクテリウム属微生物は、上記分類学的性質のうち、少なくとも以下の（イ）〜（ヘ）からなる群から選ばれる１種または２種以上、好ましくは全てにより従来のビフィドバクテリウム属微生物と区別することができる。
（イ）マウス脾臓細胞、加熱殺菌したビフィドバクテリウム属微生物、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−６を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のＩＬ−１７の産生量が、前記微生物を添加しない場合の３０％以下
（ロ）Ｇ＋Ｃ含量が５６±２ｍｏｌ％
（ハ）嫌気培養しないと生育しない
（ニ）消化管内で有害な酵素活性であるβ−グルクロニダーゼ活性はない
（ホ）芽胞は形成せず、桿状の細胞形態をとる
（ヘ）マウス脾臓細胞と、加熱殺菌したビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生量とインターロイキン−４（ＩＬ−４）の産生量の比が、前記微生物を添加しない場合の２倍以上
【００２３】
上記の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列および分類学的性質を有する新規ビフィドバクテリウム属微生物の一例としては、本発明者らが乳児の糞便から分離したビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株が挙げられる。このビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株は、平成２１年３月１７日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）へ寄託した（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７８９）。
【００２４】
上記した本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、公知の他のビフィドバクテリウム属微生物と同様に、これを含有させた各種飲食品、医薬品等に利用することができる。
【００２５】
上記飲食品としては、アメ、ガム、クッキー、せんべい等の菓子、清涼飲料、炭酸飲料、アルコール飲料等の飲料、麺、パン等の食品、ヨーグルト、豆乳ヨーグルト等の発酵乳製品等が挙げられ、特に発酵乳製品が好ましい。また、これらの飲食品は常法に従って製造することができる。
【００２６】
上記医薬品としては、生菌体、乾燥菌体またはそれらの粉砕物等を単独あるいは通常の医薬担体と混合して通常の錠剤、散剤、カプセル剤等が挙げられる。また、これらの医薬品は常法に従って製造することができる。
【００２７】
これらの飲食品および医薬品は、本発明のビフィドバクテリウム属微生物がＴｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することもできるので、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、乾癬、１型糖尿病、気管支喘息等のＩＬ−１７との関連が示唆されている疾患の予防・治療に利用できる。
【００２８】
また、本発明のビフィドバクテリウム属微生物が上記Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制するだけではなく、インターフェロン−γの産生を促進し、かつ、インターロイキン−４の産生を抑制するので、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスをＴｈ１側に調整することができる。そのため、上記飲食品および医薬品は花粉症、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患等のＴｈ１とＴｈ２のバランスがＴｈ２側になることと関連する疾患の予防・治療にも利用できる。しかも、この場合には、本発明のビフィドバクテリウム属微生物がＴｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制することもできるため、従来の上記疾患の予防・治療に用いられる飲食品、医薬品等と比べて副作用が少ない。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３０】
実 施 例 １
ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株の分離：
健常な乳児（男：１才６ヶ月）の排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを７℃以下の冷蔵で運搬した。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＬ寒天培地（共に栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養した。
【００３１】
培養後に得られたコロニーを釣菌し、分離培地と同じ条件で純化確認をした。純化確認した微生物を−８５℃で凍結保存した。保存した微生物の１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列を以下のプライマーを用いてシークエンスし、ＢＬＡＳＴサーチ（ＤＤＢＪホームページ：http://www.ddbj.nig.ac.jp）することにより決定した。
【００３２】
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００３３】
上記で決定されたビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株の１６Ｓ ｒＤＮＡの配列（１,３９４ｂｐ）を配列表の配列番号１に示した。
【００３４】
実 施 例 ２
マウス脾臓細胞刺激試験（１）：
実施例１で得られたビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株を、ＡＢＣＭ液体培地（栄研化学株式会社）を用いて３７℃で２４時間嫌気培養した。これらの培養物は、３，０００×ｇ、１０分、４℃の遠心分離によって回収し、蒸留水で３回洗浄した。菌体は、１００℃、５０分間の熱処理によって殺菌し、凍結乾燥して保存した。
【００３５】
６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を１０％（Ｖ／Ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清、１０μＭの２−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを加えた１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、該培地を適宜希釈し１０７個／ｍｌとした脾臓細胞懸濁液に、２ｎｇのＴＧＦ−β、２０ｎｇのＩＬ−６及び加熱殺菌したビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株（加熱殺菌前の菌数１０７ＣＦＵ）を培地に加え、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で７２時間培養した。
【００３６】
培養後、上清中のＩＬ−１７濃度をバイオ−プレックスサスペンション アレイ システム（Bio-Plex Suspension Array System：BioRad Laboratories社製）を用いたマイクロビーズ法によって測定し、蛍光強度値を決定した。ＴＧＦ−β、ＩＬ−６及びビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株を加えなかったものを無刺激対照（−）、ＴＧＦ−β及びＩＬ−６は加えるがビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株を加えなかったものを陰性対照（＋）とした。試験の結果を図２に示した。
【００３７】
上記の試験の結果、ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株のＩＬ−１７の産生量は、陰性対照の１７.４％であった。
【００３８】
これより、ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株は、Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制するものであることが示された。
【００３９】
実 施 例 ３
ヨーグルトの製造：
１０質量％スキムミルクを、１１０℃で２０分間の滅菌を行い、試験管に１０ｍｌずつ分注した。この試験管を氷中で急冷により嫌気度を保ち、予めＭＲＳ液体培地（Ｏｘｏｉｄ）で培養しておいたラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）Ｂ５ｂ株（財団法人日本乳業技術協会（〒１０２−００７３東京都千代田区九段北１−１４−１９）の分譲株）の１０８レベルの菌液を０.５質量％量およびＡＢＣＭ液体培地（栄研化学）で培養しておいたビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株の１０８レベルの菌液を２質量％量、接種した。次いで、これを３７℃で１６時間培養し、ヨーグルトを製造した。このヨーグルトの生菌数は、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＢ５ｂ株が８.２×１０８ＣＦＵ／ｍｌ、ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株が、５.６×１０７ＣＦＵ／ｍｌであった。また、このヨーグルトのｐＨは適度に低下し、風味も良好であった。
【００４０】
実 施 例 ４
マウス脾臓細胞刺激試験（２）：
６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を１０％（Ｖ／Ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清、１０μＭの２−メルカプトエタノール、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを加えた１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、該培地を適宜希釈し１０７個／ｍｌとした脾臓細胞懸濁液に、実施例２と同様にして加熱殺菌したビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株（加熱殺菌前の菌数１０７ＣＦＵ）を培地に加え、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で７２時間培養した。
【００４１】
培養後、上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４濃度をバイオ−プレックス サスペンション アレイ システム（Bio-Plex Suspension Array System：BioRad Laboratories社製）を用いたマイクロビーズ法によって測定し、蛍光強度値を決定した。ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株を加えなかったものを無刺激対照（−）とした。試験の結果を表１に示した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
上記試験の結果、ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株の添加により、上清中のＩＦＮ−γ濃度が上昇したが、ＩＬ−４濃度は減少した。ＩＦＮ−γはＴｈ１細胞の、またＩＬ−４はＴｈ２細胞の出す代表的なサイトカインであることから、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４比を算出して、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの指標とした。ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株の添加により、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスは１６５から２,８３２に上昇した。
【００４４】
これより、ビフィドバクテリウム・エスピーＣＦＢ１株は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１側に調整する能力があることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明のビフィドバクテリウム属微生物は、Ｔｈ１７の分化を抑制し、ＩＬ−１７の産生を抑制するものであるので、ＩＬ−１７との関連が示唆されている疾患の予防・治療に用いることのできる飲食品や医薬品に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含むビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物。
【請求項２】
以下の（イ）〜（ヘ）からなる群から選ばれる分類学的性質の１種または２種以上を有する請求項１記載のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物。
（イ）マウス脾臓細胞、加熱殺菌したビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物、トランスフォーミング増殖因子ベータおよびインターロイキン−６を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のインターロイキン−１７の産生量が、前記微生物を添加しない場合の３０％以下
（ロ）Ｇ＋Ｃ含量が５６±２ｍｏｌ％
（ハ）嫌気培養しないと生育しない
（ニ）消化管内で有害な酵素活性であるβ−グルクロニダーゼ活性はない
（ホ）芽胞は形成せず、桿状の細胞形態をとる
（ヘ）マウス脾臓細胞と、加熱殺菌したビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のインターフェロン−γの産生量とインターロイキン−４の産生量の比が、前記微生物を添加しない場合の２倍以上
【請求項３】
上記ビフィドバクテリウム属微生物が、ビフィドバクテリウム・エスピー（Bifidobacterium sp.）ＣＦＢ１株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７８９）である請求項１または２に記載のビフィドバクテリウム属微生物。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れかに記載のビフィドバクテリウム属微生物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項５】
インターロイキン−１７の産生を抑制するものである請求項４記載の飲食品。
【請求項６】
インターフェロン−γの産生を促進し、かつ、インターロイキン−４の産生を抑制するものである請求項４または５記載の飲食品。
【請求項７】
発酵乳製品である請求項４ないし６の何れかに記載の飲食品。
【請求項８】
請求項１ないし３の何れかに記載のビフィドバクテリウム属微生物を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項９】
インターロイキン−１７の産生を抑制するものである請求項８記載の医薬品。
【請求項１０】
インターフェロン−γの産生を促進し、かつ、インターロイキン−４の産生を抑制するものである請求項８または９記載の医薬品。
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含むビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物。
【請求項２】
以下の（イ）〜（ヘ）からなる群から選ばれる分類学的性質の１種または２種以上を有する請求項１記載のビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物。
（イ）マウス脾臓細胞、加熱殺菌したビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物、トランスフォーミング増殖因子ベータおよびインターロイキン−６を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のインターロイキン−１７の産生量が、前記微生物を添加しない場合の３０％以下
（ロ）Ｇ＋Ｃ含量が５６±２ｍｏｌ％
（ハ）嫌気培養しないと生育しない
（ニ）消化管内で有害な酵素活性であるβ−グルクロニダーゼ活性はない
（ホ）芽胞は形成せず、桿状の細胞形態をとる
（ヘ）マウス脾臓細胞と、加熱殺菌したビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属微生物を混合したものを、７２時間培養した後、上清中のインターフェロン−γの産生量とインターロイキン−４の産生量の比が、前記微生物を添加しない場合の２倍以上
【請求項３】
上記ビフィドバクテリウム属微生物が、ビフィドバクテリウム・エスピー（Bifidobacterium sp.）ＣＦＢ１株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７８９）である請求項１または２に記載のビフィドバクテリウム属微生物。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れかに記載のビフィドバクテリウム属微生物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項５】
インターロイキン−１７の産生を抑制するものである請求項４記載の飲食品。
【請求項６】
インターフェロン−γの産生を促進し、かつ、インターロイキン−４の産生を抑制するものである請求項４または５記載の飲食品。
【請求項７】
発酵乳製品である請求項４ないし６の何れかに記載の飲食品。
【請求項８】
請求項１ないし３の何れかに記載のビフィドバクテリウム属微生物を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項９】
インターロイキン−１７の産生を抑制するものである請求項８記載の医薬品。
【請求項１０】
インターフェロン−γの産生を促進し、かつ、インターロイキン−４の産生を抑制するものである請求項８または９記載の医薬品。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２４６５２３（Ｐ２０１０−２４６５２３Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８６１６９（Ｐ２００９−２８６１６９）
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０７０４５８８９）クロスフィールドバイオ株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０７０４５８８９）クロスフィールドバイオ株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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