新規モデル細胞
【課題】 内毛根鞘特異的ケラチンタンパク質を発現する継代可能な上皮細胞株であって、内毛根鞘におけるフィラメント形成を研究する上でのモデル細胞を開発する。
【解決手段】 本発明は、内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する核酸および／または内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された細胞を提供する。
【解決手段】 本発明は、内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する核酸および／または内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された細胞を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内毛根鞘特異的タイプＩおよび／またはＩＩケラチンタンパク質を発現する細胞、ならびにこれらの細胞を用いて発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
種々の器官は、それぞれ特異的な形態を取ることにより、特徴的な機能を営み、個体全体の生命現象に参加している。器官において、形態形成と機能運営を担っているのは、多くの場合上皮細胞である。上皮細胞の動的な挙動は、細胞質にネットワーク状に配置された細胞骨格が直接支配しており、特に、ケラチン分子から成る中間径フィラメントのダイナミックな再編は、重要な役割を果たすことがわかっている。したがって、上皮細胞のケラチンフィラメントの再構成を追跡することにより、上皮細胞の機能や分化、ひいては器官全体の機能や分化を知る手がかりが得られる。
【０００３】
毛髪が中心から順に、毛髄質（メジュラ）、毛皮質（コルテックス）、毛小皮（キューティクル）から成ることは、化粧品等の宣伝を通じて広く一般の認知するところとなっている。毛髪を生じる器官である毛包は、毛髄質・毛皮質・毛小皮の外側に内毛根鞘、更にその外側に外毛根鞘が位置する同心円状構造を取る。内毛根鞘は内側から順に、内毛根鞘小皮（内毛根鞘キューティクル）、ハックスレイ（Ｈｕｘｌｅｙ）層、ヘンレ（Ｈｅｎｌｅ）層の３層から成る。内毛根鞘小皮は、扁平な角質細胞から成る組織であり、同じく扁平な角質細胞から成る毛小皮と「噛み合う」ことにより、毛髪が皮膚から抜け落ちないように固定する役割を果たすと考えられている。内毛根鞘（特に内毛根鞘小皮とヘンレ層）は、毛髪よりも早く（毛包の深部で）角化することから、内毛根鞘の役割の一つは、角化する前の柔らかい毛髪の断面形を規定することにあると考えられている。
【０００４】
個々の毛髪には寿命があり、際限なく伸び続けることはない。毛包の示す経時的な構造変化は毛周期と呼ばれ、成長期、退行期、休止期の３つのフェーズに分けられる。人間の場合、成長期は男性で３〜５年、女性で４〜６年とされており、この間、毛髪は約０．４５ｍｍ／日の速度で伸び続ける（日本人頭髪。男女差はないと言われている）。退行期（２〜３週間）を迎えた毛包では、細胞分裂が停止して広範なアポトーシスが起こり、休止期（３〜４ヶ月）に入る。退行期・休止期を経て成長期を迎えた毛包では、新しい毛髪が成長を始め、それに伴って古い毛髪が抜け落ちる。成長期の毛包における内毛根鞘細胞は、毛球（毛包の最深部）で幹細胞の細胞分裂により生じ、毛髪の伸長に伴って皮膚表面へ移動した後、最終的に毛小皮からも外毛根鞘からも剥がれて脱落する。分化した内毛根鞘細胞の形態学的特徴は、トリコヒアリンと呼ばれる顆粒を持つことであるが、トリコヒアリン顆粒の消失に伴って、内毛根鞘細胞は急速に角化することがわかっている。分子レベルでは、内毛根鞘特異的タイプＩケラチン（ＫＲＴ２５〜ＫＲＴ２８）とタイプＩＩケラチン（ＫＲＴ７１〜ＫＲＴ７４）が会合してケラチンフィラメントを形成し、更に、内毛根鞘特異的ケラチン付随タンパク質であるトリコヒアリンがケラチンフィラメントに結合して、フィラメントを束ねて補強すると同時にフィラメント同士を連結することによって、内毛根鞘特異的ネットワークが急速に発達し、角化すると考えられている。この際、元来不溶性であるトリコヒアリンは、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ）の作用で可溶化し、トランスグルタミナーゼ（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）の作用でケラチンフィラメントに結合することがわかっている（非特許文献１）。近年、成長期毛包に特異的に反応するモノクローナル抗体の認識する分子量２２０ｋＤのタンパク質が発見された（特許文献１）。この２２０ｋＤタンパク質はＡＨＦと名付けられ、内毛根鞘特異的に発現していることが明らかになった（非特許文献２）。トリコヒアリン遺伝子とＡＨＦ遺伝子は弱い相同性を示すことから、ＡＨＦは内毛根鞘特異的ケラチン付随タンパク質であろうと推定された。
【０００５】
内毛根鞘は毛髪を固定し、また、毛髪の断面形を規定する等の機能を果たす毛包内上皮組織であるが、内毛根鞘を構成する上皮細胞は、毛包から分離・純化して培養するのが難しく、また、継代操作により内毛根鞘特異的ケラチンの発現が劇的に低下してしまう。つまり、継代可能な上皮細胞株の中に、内毛根鞘特異的ケラチンを発現しているものは皆無である。理論上どのような上皮細胞株であっても、内毛根鞘ケラチンの遺伝子を外来的に導入すれば、細胞内で内毛根鞘ケラチンのネットワーク形成を解析することは可能と考えられるが、現在に至るまで、内毛根鞘特異的なケラチンタンパク質を発現する継代可能な細胞株は得られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２１０１６９
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tarcsa E, Marekov LN, Andreoli J, Idler WW, Candi E, Chung SI, Steinert PM. J Biol Chem. 1997 Oct 31;272(44):27893-901
【非特許文献２】Takebe K, Oka Y, Radisky D, Tsuda H, Tochigui K, Koshida S, Kogo K, Hirai Y. FASEB J. 2003 17:2037-47
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の解決課題は、内毛根鞘特異的ケラチンタンパク質を発現する継代可能な細胞株であって、内毛根鞘におけるフィラメント形成を研究する上でのモデル細胞を提供することである。さらには、これらのモデル細胞を用いて発毛に有効な因子のスクリーニングを可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った。そして、驚くべきことに、これまで、ケラチンフィラメント構造を有する継代可能な細胞を得ることは不可能であったが、細胞、特にＳＷ１３株の細胞に、内毛根鞘特異的タイプＩケラチンおよび／またはタイプＩＩケラチンをコードするＤＮＡ配列を含む核酸を導入することにより、内毛根鞘特異的ケラチンのフィラメント構造を有する継代可能な細胞を作製することに成功した。さらに本発明者らは、前記細胞におけるケラチンフィラメントとの関連を調べることによるスクリーニングの方法を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は：
（１）内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸および／または内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された細胞；
（２）前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号１に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、（１）記載の細胞；
（３）前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号２に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と８７％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、（１）記載の細胞；
（４）前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号３に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、（１）記載の細胞；
（５）前記内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号４に示すタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、（１）記載の細胞；
（６）（２）〜（４）のいずれか１つ記載の核酸、および（５）記載の核酸が導入された、（１）記載の細胞；
（７）さらにケラチン付随タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された、（１）〜（６）のいずれか１つ記載の細胞；
（８）ケラチン付随タンパク質がＡＨＦである、（７）記載の細胞；
（９）前記核酸のいずれかが標識された、（１）〜（８）のいずれか１つ記載の細胞；
（１０）前記細胞が内在性ケラチンを持たない細胞である、（１）〜（９）のいずれか１つ記載の細胞；
（１１）前記細胞がＳＷ１３株である、（１０）記載の細胞；
（１２）（２）〜（４）のいずれか１つ記載の核酸を含むベクター；
（１３）（５）記載の核酸を含むベクター；
（１４）発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（ａ）前記候補因子を（１）〜（１１）のいずれか１つ記載の細胞で発現させ、次いで
（ｂ）ケラチンフィラメントの形成について調べること
を特徴とする方法；ならびに
（１５）発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（ａ）前記候補因子を（１）〜（１１）のいずれか１つ記載の細胞に作用させ、次いで
（ｂ）ケラチンフィラメントの形成について調べること
を特徴とする方法
を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、上皮細胞、特に内毛根鞘細胞におけるケラチンフィラメント形成のメカニズムについて解析することができる。さらに内毛根鞘細胞のケラチンフィラメント形成に関わる因子であって、発毛に有効な因子をスクリーニングすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、タイプＩケラチン（ＫＲＴ２５）を発現するＳＷ１３細胞のＴ７タグでのケラチンの免疫染色写真である。
【図２】図２は、タイプＩケラチン（ＫＲＴ２７）を発現するＳＷ１３細胞のＴ７タグでのケラチンの免疫染色とＰＩ（ヨウ化プロピジウム）での核染色写真である。
【図３】図３は、ウエスタンブロッティングでのタイプＩケラチンを発現するＳＷ１３細胞のＴ７タグでのタイプＩケラチンの検出である。
【図４】図４は、タイプＩＩケラチン（ＫＲＴ７１）を発現するＳＷ１３細胞のＴ７タグでのケラチンの免疫染色とＰＩでの核染色写真である。
【図５】図５は、タイプＩＩケラチン（ＫＲＴ７１）を発現するＳＷ１３細胞のｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩでのケラチンの免疫染色とＰＩでの核染色写真である。
【図６】図６は、タイプＩ（ＫＲＴ２５）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチンを発現するＳＷ１３細胞でのＴ７タグでのケラチンフィラメントの免疫染色とＰＩでの核染色写真である。
【図７】図７は、タイプＩ（ＫＲＴ２５）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチンを発現するＳＷ１３細胞でのＴ７タグでのケラチンフィラメントの免疫染色写真である。
【図８】図８は、タイプＩ（ＫＲＴ２７）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチンを発現するＳＷ１３細胞でのＴ７タグでのケラチンフィラメントの免疫染色写真である。
【図９】図９は、タイプＩ（ＫＲＴ２７）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチンを発現するＳＷ１３細胞でのｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩでのケラチンフィラメントの免疫染色とＰＩでの核染色写真である
【図１０】図１０は、図９の拡大図である。
【図１１】図１１は、タイプＩ（ＫＲＴ２５）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチン及びＡＨＦを発現するＳＷ１３細胞でのＴ７タグでのケラチンの免疫染色とＡＨＦの検出写真である。
【図１２】図１２は、タイプＩ（ＫＲＴ２７）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチン及びＡＨＦを発現するＳＷ１３細胞でのＴ７タグでのケラチンの免疫染色とＡＨＦの検出写真である。
【図１３】図１３は、図１２に示す一部の拡大図である。
【図１４】図１４は、ＡＨＦを発現するＳＷ１３細胞でのビメンチンとＡＨＦの免疫染色である。
【図１５】図１５は、ヒトＫｒｔ２５とマウスｋｒｔ７１をＳＷ１３細胞に導入後、ＨａｌｏＴａｇ（商標）リガンドにてヒトＫＲＴ２５タンパク質を検出し（左図）、Ｔ７タグ抗体でマウスＫＲＴ７１タンパク質を検出し（中央図）、図を重ねたものである（右図）。
【図１６】図１６は、ヒトＫｒｔ２８とマウスｋｒｔ７１をＳＷ１３細胞に導入後、ＨａｌｏＴａｇ（商標）リガンドにてヒトＫＲＴ２８タンパク質を検出し（左図）、Ｔ７タグ抗体でマウスＫＲＴ７１タンパク質を検出し（中央図）、図を重ねたものである（右図）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、１の態様において、内毛根鞘特異的タイプＩおよび／またはＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された細胞を提供する。本発明に用いることができる細胞は、あらゆる種類の細胞であってもよいが、好ましくは上皮細胞である。本明細書において、上皮細胞とは、管腔臓器の粘膜を構成する狭義の上皮細胞のみならず、体表面を覆う表皮細胞、分泌腺を構成する腺細胞、更には、肝細胞や尿細管上皮細胞などの分泌や吸収を担う実質臓器の細胞も含めて言う。発生学的には三胚葉のいずれにも由来し、例えば、皮膚は外胚葉、消化管上皮は内胚葉、尿細管上皮は中胚葉に由来する。構造上の特徴として、極性（向き）を持つことが挙げられるが、上皮組織や細胞それぞれの形態および機能は多種多様である。
【００１４】
上皮細胞全体に共通する特徴として、ケラチンから成る細胞骨格を有する点が挙げられる。細胞骨格には径の太い順に、微小管、中間径フィラメント、アクチンフィラメントの３種類があり、上皮細胞の中間径フィラメントは例外なくケラチンフィラメントである（大部分の上皮細胞は、微小管および／またはアクチンフィラメントから成る細胞骨格も持っている）。上皮細胞がケラチンを含むことから、ケラチンに対する抗体を用いて、腫瘍が上皮由来であるか否か鑑別することができる。腫瘍の鑑別には、間葉系細胞に特徴的な中間径フィラメントを構成するビメンチンに対する抗体を併用することもある。
【００１５】
上皮細胞を特徴付けるケラチンタンパク質は、完全な分化状態を示さない腫瘍細胞においてさえ発現し続けるのが普通である。しかし、ほぼ全ての上皮細胞株は、それぞれ固有のタイプＩケラチンとタイプＩＩケラチンを発現しているため、これらの内在性ケラチンが、外来的に導入した内毛根鞘ケラチンのネットワーク形成に影響を及ぼす可能性を無視できない。上皮細胞株の内在性ケラチンと外来的に導入したケラチンとの干渉は、内毛根鞘ケラチンに限らず、あらゆるケラチンのフィラメントネットワーク形成を研究する上で障害となり得る。したがって、本発明に用いることができる細胞は、好ましくは内在性ケラチンを持たない細胞である。
【００１６】
細胞の継代操作を繰り返すうちに、ケラチンを全く発現しなくなった細胞株が、ごく稀に出現することがある。このような細胞株の最初の報告例は、ラットの肝癌に由来する株である（Venetianer A, Schiller DL, Magin T, Franke WW. Nature. 1983 Oct 20-26;305(5936):730-3）。この肝癌細胞株は、継代を繰り返すうちに肝細胞特異的機能を失うと共に、ケラチンを含む中間径フィラメント構成タンパク質を発現しなくなる。次の報告例は、ヒト副腎皮質腫瘍に由来するＳＷ１３株である（Hedberg KK, Chen LB. Exp Cell Res. 1986 Apr;163(2):509-17）。ＳＷ１３株では、免疫蛍光法、二次元電気泳動法、ウエスタンブロッティング法のいずれによっても、ケラチンを含む中間径フィラメント構成タンパク質を検出することができなかった。本明細書において、内在性ケラチンを持たない上皮由来細胞とは、免疫蛍光法、二次元電気泳動法、ウエスタンブロッティング法等の細胞学的・生化学的手法を以てしても、ケラチンフィラメントおよびケラチンタンパク質のいずれも検出することのできない上皮由来細胞を意味する。当業者は、分子生物学的手法、すなわち、ノザン・ブロッティング法や逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により、ケラチンをコードするメッセンジャーＲＮＡが検出限界以下であることを指標として、内在性ケラチンを持たない上皮由来細胞を選択することもできる。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写とＰＣＲを別々に行なう二段階法と同一反応系で行なう一段階法に大別される。二段階法では、逆転写反応にＭｏｌｏｎｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ （Ｍ−ＭＬＶ）やａｖｉａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）等のレトロウイルス由来の逆転写酵素またはこれらを改良した酵素を用いることができる。逆転写酵素用のプライマーは、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、遺伝子特異的プライマー（ＰＣＲ用プライマーの片方）の三者のうちいずれかを使用すればよい。一段階ＲＴ−ＰＣＲ法に用いるキットは各社から販売されており、例えば、インビトロジェン社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｍｕｎ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを挙げることができる。中には、東洋紡社のＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘシリーズのように、ＴｔｈポリメラーゼがＭｎ２＋存在下で逆転写活性を示すことを利用したキットもある。上述のごとく、本発明に用いられる細胞は、好ましくは上記のごとく内在性ケラチンを持たない細胞であり、より好ましくはラット肝癌細胞株またはＳＷ１３株であり、最も好ましくはＳＷ１３株である。
【００１７】
また、本発明に用いられる細胞は、あらゆる動物に由来する細胞を含み、例えば、ほ乳類に由来する細胞であってもよく、マウス、ラット、ハムスター、モルモットのごとき齧歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の有蹄類、イヌ、ネコ、ウサギなどの他のほ乳類、ならびに霊長類に由来する細胞が挙げられる。好ましくはヒト由来の細胞を本発明に用いる。
【００１８】
本発明における細胞は、タイプＩおよび／またはタイプＩＩケラチンタンパク質を発現するものである。例えば、本発明の細胞は、タイプＩおよび／またはタイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むものであってもよい。ここで、一般的に、タイプＩケラチンとは、タンパク質分子の等電点（ｐＩ）が酸性を示すケラチンであり、タイプＩＩケラチンとは、等電点が中性または塩基性を示すケラチンである。正常な上皮細胞で発現するケラチンは、比較的低分子のタイプＩケラチンと比較的高分子のタイプＩＩケラチンが対になっている。例えば、皮膚の角化細胞では、タイプＩのＫＲＴ１０（５６．５ｋＤ）とタイプＩＩのＫＲＴ１（６７ｋＤ）が発現している（Schweizer J, Bowden P, Coulombe P, Langbein L, Lane E, Magin T, Maltais L, Omary B, Parry D, Rogers M, Wright M. J Cell Biol. 2006 Jul;174(2):169-74）。なお、本明細書では、ケラチンタンパク質をＫＲＴ、ヒトのケラチン遺伝子をＫｒｔ、マウスのケラチン遺伝子をｋｒｔと表す。本明細書におけるケラチンは、毛髪や爪を構成する硬ケラチンを含む。なお、硬ケラチンに対して、粘膜細胞や表皮細胞のケラチンを軟ケラチンまたはサイトケラチンと呼ぶ。硬ケラチンは、ヒトやマウスの毛髪・体毛や爪の他に、サイの角、ヤマアラシの棘、馬の蹄などにも含まれる。内毛根鞘特異的ケラチンは、ゲノムＤＮＡシークエンシングから発見された遺伝子をコードするケラチンであり、塩基配列の相同性から、４種類のタイプＩケラチン（ヒト塩基配列Ｋｒｔ２５〜Ｋｒｔ２８、マウス塩基配列ｋｒｔ２５〜ｋｒｔ２８）と４種類のタイプＩＩケラチン（ヒト塩基配列Ｋｒｔ７１〜Ｋｒｔ７４、マウス塩基配列ｋｒｔ７１〜ｋｒｔ７４）がヒトとマウスで同定されている。ただし、ＫＲＴ２５、ＫＲＴ２７およびＫＲＴ２８は、内毛根鞘の他に毛髄質でも発現している（Langbein L, Rogers MA, Praetzei-Wunder S, Helmke B, Schirmacher P, Schweizer J. J Invest Dermatol. 2006 Nov;126(11):2377-86）。本明細書におけるケラチンタンパク質は、ヒトとマウス由来のものに限定されず、これら以外の動物種由来、例えば、サイ、ヤマアラシ、馬、チンパンジー、ニホンザル、ラット、モルモット、牛、羊、ヤギ、ウサギ、鶏、ガチョウなどのケラチンタンパク質を含む。
【００１９】
ケラチンタンパク質は、２分子のタイプＩケラチンと２分子のタイプＩＩケラチンが会合した４量体を基本単位として、フィラメントを形成する。ケラチンフィラメントの形成は、インビトロでも自然に進行する反応であり、培養細胞に導入して細胞内で形成させることもできる。本発明において、タイプＩケラチンとタイプＩＩケラチンは特に限定されず、サイトケラチン（軟ケラチン）であっても硬ケラチンであってもよい。ただし、正常な上皮細胞の機能や分化を研究する目的ならば、当該細胞で見られる組み合わせが適当であることは言うまでもない。例えば正常な皮膚の角化を研究する場合、角化表皮で見られるＫＲＴ１とＫＲＴ１０を組み合わせるのが適当である。正常な内毛根鞘の角化過程を解析する場合は、内毛根鞘特異的タイプＩケラチンであるＫＲＴ２５〜ＫＲＴ２８のうちの少なくとも１つおよび内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンであるＫＲＴ７１〜ＫＲＴ７４のうちの少なくとも１つを用いるのが適当である。内毛根鞘特異的タイプＩおよびタイプＩＩケラチンを発現する細胞は、内毛根鞘の機能・分化のみならず、毛包全体の機能・分化または毛周期を研究する上でも有用である。しかし、正常な上皮細胞では起こり得ない状況を人為的に作り出すこともまた、いわゆる対照（コントロール）として重要である。
【００２０】
したがって、本発明の細胞で発現させることができる好ましいケラチンタンパク質は、内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５〜ＫＲＴ２８および／またはタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１〜ＫＲＴ７４であり、好ましくはＫＲＴ２５、ＫＲＴ２７、ＫＲＴ２８およびＫＲＴ７１である。本発明において、導入されるケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸の組合せは、タイプＩおよびタイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸のうちの少なくとも１つが導入されていればよいが、好ましくは、タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸のうちの１つおよびタイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸のうちの１つが導入されることである。より好ましくは、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５、ＫＲＴ２７またはＫＲＴ２８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、およびタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入されることである。
【００２１】
本発明におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５のアミノ酸配列は、配列番号１に示すものが例示され、あるいは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する相同性が、６０％以上、例えば、６５％、７０％、７３％、または７５％以上のものであってもよく、好ましくは７５％以上のものである。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ジェネティクス製）などの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。加えて、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５は、マウス由来のものであるが、例えば、ヒト、ラット、ウシ、ネコなどの他の動物に由来するものであっても、これらの動物種におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５は、本明細書におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５に包含されうる。特に、本発明におけるマウスのＫＲＴ２５は、ヒトのＫＲＴ２５に対して７５％の相同性を有することから、ヒトのＫＲＴ２５も本発明に包含される。さらに、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５は、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５と同等の性質を有しているものであって、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。本明細書における同等の性質とは、ケラチンとして同等の生物学的、化学的、および物理学的特性を有することをいう。また、本明細書におけるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、同一のアミノ酸を示す異なるポリヌクレオチド配列、いわゆる縮重コドンをも含むものである。
【００２２】
本発明において、前記ハイブリダイズさせる条件は、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressの記載に従って、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイズの条件は、低ストリンジェントな条件であってもよいが、好ましくは高ストリンジェントな条件である。低ストリンジェントな条件とは、上記文献に従ってハイブリダイズさせた後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件である。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳの条件などを含む。ただし、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様の条件を実現することができる。
【００２３】
また、本発明に用いることができるＤＮＡ配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である配列番号５を含むものであってもよいが、前記アミノ酸配列をコードするものであればこれだけに限らない。
【００２４】
本発明におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７のアミノ酸配列は、配列番号２に示すものが例示され、あるいは、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する相同性が、７０％以上、例えば、７５％、８０％、８３％、８５％、または８７％以上のものであってもよく、好ましくは８７％以上のものである。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ジェネティクス製）などの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。加えて、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７は、マウス由来のものであるが、例えば、ヒト、ラット、ウシ、ネコなどの他の動物に由来するものであっても、これらの動物種におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７は、本明細書におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７に包含されうる。特に、本発明におけるマウスのＫＲＴ２７は、ヒトのＫＲＴ２７に対して８７％の相同性を有することから、ヒトのＫＲＴ２７も本発明に包含される。さらに、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７は、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７と同等の性質を有しているものであって、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸と前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００２５】
他に、本発明に用いることができるＤＮＡ配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である配列番号６を含むものであってもよいが、前記アミノ酸配列をコードするものであればこれだけに限らない。
【００２６】
本発明におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８のアミノ酸配列は、配列番号３に示すものが例示され、あるいは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する相同性が、７０％以上、例えば、７５％、８０％、８３％、または８５％以上のものであってもよく、好ましくは８５％以上のものである。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ジェネティクス製）などの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。加えて、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８は、ヒト由来のものであるが、例えば、マウス、ラット、ウシ、ネコなどの他の動物に由来するものであっても、これらの動物種におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８は、本明細書におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８に包含されうる。特に、本発明におけるヒトのＫＲＴ２８は、マウスのＫＲＴ２８に対して８５％の相同性を有することから、マウスのＫＲＴ２８も本発明に包含される。さらに、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８は、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８と同等の性質を有しているものであって、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸と前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００２７】
他に、本発明に用いることができるＤＮＡ配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である配列番号７を含むものであってもよいが、前記アミノ酸配列をコードするものであればこれだけに限らない。
【００２８】
本発明におけるタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１のアミノ酸配列は、配列番号４に示すものが例示され、あるいは、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する相同性が、８０％以上、例えば、８３％、８５％、８８％、または９０％以上のものであってもよく、好ましくは９０％以上のものである。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ジェネティクス製）などの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。加えて、本発明において、タイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１は、マウス由来のものであるが、例えば、ヒト、ラット、ウシ、ネコなどの他の動物に由来するものであっても、これらの動物種におけるタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１は、本明細書におけるタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１に包含されうる。特に、本発明におけるマウスのＫＲＴ７１は、ヒトのＫＲＴ７１に対して９０％の相同性を有することから、ヒトのＫＲＴ７１も本発明に包含される。さらに、本発明において、タイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１は、タイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１と同等の性質を有しているものであって、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸と前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００２９】
本発明に用いることができるＤＮＡ配列はまた、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である配列番号８を含むものであってもよいが、前記アミノ酸配列をコードするものであればこれだけに限らない。
【００３０】
さらに、本発明で用いられる上記ＤＮＡ配列を有する核酸は、下記の実施例で詳細に説明するように取得されてもよいが、一般的なクローニング技術を用いて当業者が適宜行うことができる。
【００３１】
本発明では、上記ケラチンタンパク質とともにケラチン付随タンパク質を細胞に発現させてもよい。具体的には、上記ケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸とともに、ケラチン付随タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入されてもよい。一般的に、上皮細胞、特に角化する上皮細胞では、ケラチン付随タンパク質がケラチンフィラメントに結合して、発達したネットワークを形成する現象が見られる。例えば表皮細胞では、ＫＲＴ１（タイプＩＩ）とＫＲＴ１０（タイプＩ）のフィラメントに、ケラチン付随タンパク質であるフィラグリンが結合して、フィラメントを束ねて補強すると同時にフィラメント同士を連結することによって、表皮細胞特異的なネットワークを形成する。またヒトの毛皮質では、ＫＲＴ３１〜ＫＲＴ４０（タイプＩ）とＫＲＴ８１〜ＫＲＴ８６（タイプＩＩ）のフィラメントに、ケラチン付随タンパク質である（超）高含硫タンパク質（（ｕｌｔｒａ−）ｈｉｇｈ ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）や高グリシン・チロシンタンパク質（ｈｉｇｈ ｇｌｙｃｉｎｅ／ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が結合して、毛皮質細胞特異的なネットワークを形成する（矢作彰一 フレグランス・ジャーナル ２００７年 ３５巻（１２号）３４−４０頁。ただし矢作は、（超）高含硫タンパク質と高グリシン・チロシンタンパク質に加えて、高グリシン・システイン・セリンタンパク質（ｈｉｇｈ ｇｌｙｃｉｎｅ／ｃｙｓｔｅｉｎ／ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を提唱している）。更にまた内毛根鞘細胞では、ＫＲＴ２５〜ＫＲＴ２８（タイプＩ）とＫＲＴ７１〜ＫＲＴ７４（タイプＩＩ）のフィラメントに、ケラチン付随タンパク質であるトリコヒアリンが結合して、内毛根鞘細胞特異的なネットワークを形成する。本発明において、タイプＩおよびタイプＩＩケラチンに加えてケラチン付随タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を導入してもよい。ただし、正常な上皮細胞の機能や分化を研究する目的ならば、当該細胞で見られる正常な組み合わせが適当であることは言うまでもない。例えば正常な毛皮質細胞の角化を研究する場合、ＫＲＴ３１〜ＫＲＴ４０の少なくとも１つとＫＲＴ８１〜ＫＲＴ８６の少なくとも１つに加えて、高含硫タンパク質および／または高グリシン・チロシンタンパク質（および／または高グリシン・システイン・セリンタンパク質）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を導入するのが適当である。
【００３２】
同様に、表皮細胞の角化を研究する場合は、ＫＲＴ１とＫＲＴ１０に加えてフィラグリンを、また、内毛根鞘細胞の角化を研究する場合は、ＫＲＴ２５〜ＫＲＴ２８の少なくとも１つとＫＲＴ７１〜ＫＲＴ７４の少なくとも１つに加えてトリコヒアリンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を導入することもできる。ただし、フィラグリンは、前駆体であるプロフィラグリンがペプチジルアルギニンデイミナーゼの作用を受け、更にプロテアーゼの作用を受けて断片化したものなので、プロフィラグリンと共にペプチジルアルギニンデイミナーゼとプロテアーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を導入する必要がある。また、トリコヒアリンは元来不溶性であり、可溶化にペプチジルアルギニンデイミナーゼが必須なので、トリコヒアリンと共にペプチジルアルギニンデイミナーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を導入する必要がある。（プロ）フィラグリンやトリコヒアリンに対して内毛根鞘特異的ＡＨＦは、翻訳後修飾を受けずに、ケラチン付随タンパク質として働くことが本発明において示された。本発明におけるＡＨＦは、配列番号２２に示すＡＨＦタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を用いて導入されてもよいが、ＡＨＦタンパク質のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含む核酸であれば、これに限定されない。
【００３３】
したがって、本発明では、タイプＩおよび／またはタイプＩＩケラチンとともに発現されうるケラチン付随タンパク質は、例えば、高含硫タンパク質、高グリシン・チロシンタンパク質、高グリシン・システイン・セリンタンパク質、フィラグリン、トリコヒアリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ、プロテアーゼ、ＡＨＦなどを含むが、好ましくはトリコヒアリンおよびＡＨＦであり、最も好ましくはＡＨＦである。これらのケラチン付随タンパク質は、これらケラチン付随タンパク質と同等の性質を有するものであって、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシなどのいかなる動物に由来するものであってもよいが、好ましくはヒトに由来するものである。
【００３４】
本発明では、上記タンパク質が標識されていてもよい。本発明における標識は、上記タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列にタグ配列を付加することであってもよいが、標識できればタグ以外の一般的に知られる配列を付加してもよい。本発明において、検出用のタグ配列は必須ではないが、タグ配列を用いない場合は、発現するタンパク質それぞれに対して抗体を準備する必要があるので、タグを付加するのが簡便である。本発明に用いることができるタグは、Ｔ７タグ、ＨＡタグ、ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩタグ、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ等が挙げられるが、標識を目的とする配列であればこれら以外の配列であってもよい。また、本発明において、上記タグ配列の付加される位置は、ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列のフレームが一致するように連結されていればいかなる位置であってもよいが、好ましくは上記核酸の５’末端または３’末端である。本発明において、上記タグ配列は、一般的な手法により上記ＤＮＡ配列に付加されてもよい。例えば、配列番号１５と１６（ＫＲＴ２５のアミノ酸配列のＮ末端側にＴ７タグ配列およびＣ末端にＨＡタグ）、配列番号１７と１８（ＫＲＴ２７のアミノ酸配列のＮ末端側にＴ７タグ配列およびＣ末端側にＨＡタグ配列）、配列番号１９と２０（ＫＲＴ７１のアミノ酸配列のＮ末端側にＴ７タグ配列およびＣ末端側にＨＡタグ配列）、あるいは配列番号１９と２１（ＫＲＴ７１のアミノ酸配列のＮ末端側にｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩおよびＣ末端側にＨＡタグ配列）の組合せのプライマーを用いるＰＣＲ法により付加されることを含むが、これだけに限らない。
【００３５】
本発明では、上記核酸が一般的に知られているベクターに組み込まれて導入されてもよい。本発明に用いられうるベクターとして、例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターであってもよく、あるいは一般的なプラスミドベクターであってもよい。本発明に用いることができるベクターは、好ましくは、レトロウイルスベクターであり、例えば、ｐＱＣＸＩＮ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック）である。一般的に、組換えウイルスは、安全性を高めたウイルスベクターを用いて作製することができ、このようなウイルスベクターには、特殊な宿主細胞（例えば、ウイルスの感染・増殖に必須なタンパク質を核染色体からトランスに供給する細胞など）を用いない限り、感染・増殖しないように改良したものも含まれる。ウイルスベクターは、感染後ウイルスゲノムが核染色体に組み込まれるタイプと、感染後ウイルスゲノムがエピゾームとして独立に存在するタイプとの２種類に大別できる。前者のレトロウイルスやアデノ随伴ウイルス等に由来するベクターは、外来遺伝子を永続的に発現させる場合に適しており、一方、後者のアデノウイルスやワクシニアウイルス等に由来するベクターは、外来遺伝子を一過性に発現させる場合に適している。外来遺伝子の発現効率は、一般に後者（特にアデノウイルスベクター）が高いとされている。当業者であれば、実験目的に合わせて適当なウイルスベクターを選択し、適切な封じ込め設備を備えた施設内で組換えウイルスを作製することができる（谷憲三朗、浅野茂隆編 遺伝子治療の新展開―ベクター開発と臨床応用の最前線（新臨床医のための分子医学シリーズ）羊土社 ２００１年）。
【００３６】
本発明において使用するベクターは、市販品に限定されず、基本的な構成要素として、大腸菌等の宿主内で働く複製領域（レプリコン）および抗生物質耐性等の選択マーカー、真核細胞内で働く転写開始領域（プロモーター）および転写終結領域（ｐｏｌｙＡ付加シグナル）を備えるものであればよいが、これら以外の要素が付加されていてもよい。レプリコンは、ＣｏｌＥ１（ｐＢＲ３２２）レプリコンやこれを改良したｐＵＣレプリコンが一般的であるが、これらに限定されない。抗生物質耐性マーカーは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等に対する耐性遺伝子が一般的である。真核細胞プロモーターは、サイトメガロウイルスやＳＶ４０等のウイルス由来プロモーターが一般的であるが、これらに限定されない。ｐｏｌｙＡ付加シグナルは、レトロウイルス３’−ＬＴＲや免疫グロブリン遺伝子に由来する配列が一般的である。これらの基本的な構成要素に加えて、クローニングを容易にするためのＭＣＳ、発現効率を上げるためのイントロン、トランスフェクション後の選択を可能にするトランスフェクタント選択マーカー（例えば、真核細胞プロモーター下流に位置するＧ４１８耐性またはネオマイシン耐性遺伝子等）などを持つベクターであってもよい。当業者であれば、ベクターへの（サブ）クローニング、形質転換した宿主の培養、宿主からの組換えＤＮＡ精製などの諸操作を適宜行なうことができる。
【００３７】
本発明において、上記核酸の細胞への導入は、当業者間において一般的な手法を用いて行われてもよい。例えば、上記核酸を上記ベクターに組み込んで、リポフェクトアミン（インビトロジェン社）等によるリポソーム法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法などにより実施することができるが、これらだけに限らない。また、本発明では、上記ケラチンタンパク質またはケラチン付随タンパク質を、タンパク質として細胞に導入してもよい。タンパク質を培養細胞に導入する手法としては、例えば、マイクロインジェクション法が挙げられるが、Ｐｒｏｆｅｃｔ（ナカライ社）等の試薬を用いてもよい。タンパク質のｍＲＮＡを試験管内転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）で合成した後、ｍＲＮＡをマイクロインジェクション法やリポソーム法で培養細胞に導入することもできる。ただし実際には、精製タンパク質やメッセンジャーＲＮＡでなく、組換えプラスミドＤＮＡや組換えウイルスを用いる手法が広く行なわれている。
【００３８】
また、本発明では、上記核酸が直接導入されてもよい。この場合、核酸の導入方法は、例えば、エレクトロポレーション等の物理的方法、ならびにＤＥＡＥ−デキストランやリポソーム、リン酸カルシウム等を用いる化学的方法を含むが、これらだけに限らない。
【００３９】
本発明において、目的の核酸が導入された細胞の選別は、抗生物質耐性マーカーのＤＮＡ配列をベクターに組み込んだ場合には、抗生物質を含む培地で細胞を培養することにより行われてもよいが、細胞の選別や細胞の培養条件などは、当業者が適宜選択することができる。
【００４０】
本発明のさらなる態様では、本発明は、発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法を提供する。すなわち、本発明は、工程（ａ）：発毛に有効な候補因子を前記細胞で発現させるか、または前記細胞に作用させることを含む。次いで、本発明は、工程（ｂ）：前記細胞でフィラメント形成について調べることを含む。ここで、候補因子とは、発毛に関連すると考えられる因子であれば、化合物、ポリペプチド、サイトカイン、タンパク質または核酸などのあらゆる物質であってもよい。候補因子として、好ましくはケラチンタンパク質と相互作用することが示唆される因子、例えば、トリコヒアリンおよびＡＨＦなどのケラチン付随タンパク質が挙げられる（Tarcsa E, Marekov LN, Andreoli J, Idler WW, Candi E, Chung SI, Steinert PM. J Biol Chem. 1997 Oct 31;272(44):27893-901
およびTakebe K, Oka Y, Radisky D, Tsuda H, Tochigui K, Koshida S, Kogo K, Hirai Y. FASEB J. 2003 17:2037-47）。本発明において、細胞で発現させるとは、上記候補因子を当業者間で一般的な手法を用いて候補因子を前記細胞において発現させることをいう。例えば、ＡＨＦタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するベクターを前記細胞に導入することを含むが、これだけに限らない。一方、本発明において、細胞に作用させるとは、候補因子の上記細胞への効果を調べるために、細胞の培地に候補因子を添加して細胞に接触させるか、あるいは細胞への注入を行うことなどをいう。候補因子を添加する量または注入する量は、当業者が適宜決めることができる。本発明では、ケラチン分子を指標として、ケラチンフィラメントの形成について調べることができる。例えば、金コロイド標識の抗ケラチン抗体による免疫電子顕微鏡観察によるフィラメントと候補因子の相互作用などであってもよいが、一般的なタンパク質間の相互作用を調べる手法であれば、特に限定されない。
【００４１】
本発明の別の態様では、本発明は、上記方法により発毛に有効な因子とされた候補因子を含む発毛剤を提供する。本発明において上記発毛剤は、前記因子の濃度、剤形および配合成分などは適宜選択し得る。従来の発毛剤を併用することができる。
【００４２】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、発毛剤の製造における、上記細胞の使用を提供する。
【００４３】
本発明のさらに１つの別の態様では、本発明は、上記細胞を移植する発毛の方法を提供する。前記方法は、上記細胞を動物の皮膚に移植することを含む。前記移植の方法は、一般的な手法を用いて行われてもよい。さらに、本発明における方法は、従来の発毛の方法を併用して行うこともできる。
【００４４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例によって限定されることはない。
【実施例１】
【００４５】
実施例１ 内毛根鞘タイプＩまたはタイプＩＩケラチンの細胞内での発現
ＳＷ１３細胞にて、内毛根鞘ケラチンタイプＩまたはタイプＩＩ単独での挙動を調べる為に、抗体のエピトープタグ付き内毛根鞘ケラチンタイプＩ（マウスｋｒｔ２５（NCBI Entrez GeneID 70810、配列番号５）または、マウスｋｒｔ２７（NCBI Entrez GeneID 16675、配列番号６））、内毛根鞘ケラチンタイプＩＩ（マウスｋｒｔ７１（NCBI Entrez GeneID 56735、配列番号８））それぞれ発現させた細胞を作製し、観察を行った。具体的な方法及び観察結果は、以下の通りである。毛周期が成長期（生後５週齢）のＣ３Ｈ／Ｈｅ Ｓｌｃ（日本エスエルシー）マウス背中からＴＯＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン）を添付のマニュアルに従って用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調整した。調整したｔｏｔａｌ ＲＮＡから、タカラバイオのＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０を用いオリゴｄＴからｃＤＮＡを合成した後、プライマー［ｋｒｔ２５プライマー（配列番号９と配列番号１０の組み合わせ）、ｋｒｔ２７プライマー（配列番号１１と配列番号１２の組み合わせ）、ｋｒｔ７１プライマー（配列番号１３と配列番号１４の組み合わせ）］にてＰＣＲを行うことにより、ケラチン遺伝子３種（ｋｒｔ２５、ｋｒｔ２７、ｋｒｔ７１）のｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲ条件は、９４℃１分した後、ｋｒｔ２５とｋｒｔ２７においては９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分 ３０サイクル、ｋｒｔ７１においては９４℃ ２分した後、９４℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃２分 ３０サイクルで目的のｃＤＮＡを増幅した。ｋｒｔ７１ ＰＣＲ産物はｐＣＲ−ｔｏｐｏ ベクター（インビトロジェン）にて挿入した。
【００４６】
内毛根鞘ケラチンをマウスからクローニングに使用したプライマーは以下の通りである。
ｋｒｔ２５プライマー（２種）
・（配列番号９、krt25-5'UTR1-F）5'-cacagttcagcgacacgcttgccc
・（配列番号１０、krt25-3'UTR1-R）5'-cacattgcatgccttgtcttcttt
ｋｒｔ２７プライマー（２種）
・（配列番号１１、krt27-5'UTR1-F）5'-agcactgcagagtgatcaccatgt
・（配列番号１２、krt27-3'UTR1-R）5'-tgaaactagagccgtctgctttag
ｋｒｔ７１プライマー（２種）
・（配列番号１３、krt71-5'-UTR-1）5'-cttcctcctgcacctttactccatcc
・（配列番号１４、krt71-3'-UTR-1）5'-tgagggatcgaggtcacaagaagc
【００４７】
ｋｒｔ７１ ＰＣＲ−ｔｏｐｏクローニング産物とｋｒｔ２５ ＰＣＲ増幅産物及びｋｒｔ２７ ＰＣＲ増幅産物は、ＴａＫａＲａ ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）にてタグ（Ｎ末端側にはＴ７タグ、Ｃ末端側にはＨＡタグ配列またはＮ末端側にはｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩタグ配列、Ｃ末端側にはＨＡタグ配列）付きケラチンＤＮＡ産物三種（ｋｒｔ２５、ｋｒｔ２７、ｋｒｔ７１）を９４℃ ３０秒、５７℃ ３０秒、７２℃ １分 ３０サイクルにて、以下の組み合わせのプライマーによって増幅させた。
【００４８】
・プライマーの組み合わせ
ＫＲＴ２５ Ｎ末端側にＴ７タグ配列、Ｃ末端側にＨＡタグ配列（配列番号１５と配列番号１６）
ＫＲＴ２７ Ｎ末端側にＴ７タグ配列、Ｃ末端側にＨＡタグ配列（配列番号１７と配列番号１８）
ＫＲＴ７１ Ｎ末端側にＴ７タグ、Ｃ末端側にＨＡタグ配列（配列番号１９と配列番号２０）
ＫＲＴ７１ Ｎ末端側にｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ、Ｃ末端側にＨＡタグ配列（配列番号１９と配列番号２１）
【００４９】
マウスからクローニングした内毛根鞘ケラチン遺伝子にタグ配列を付加させる際に使用したプライマーは以下の通りである。
・ｋｒｔ２５全長ｆｏｒｗａｒｄ側
（配列番号１５、T7-K25 pQCXIN-F）
5'-gggggcggccgcaccatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtatgtctcttcgcctttccag
・ｋｒｔ２５全長ｒｅｖｅｒｓｅ側
（配列番号１６、HA-K25-QCXIN-R）
5'-aaaagaattctcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtaattgctttgagatttctctt
・ｋｒｔ２７全長ｆｏｒｗａｒｄ側
（配列番号１７、T7-K27 pQCXIN-F）
5'-gggggcggccgcaccatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtatgtccgttcgcttttcttc
・ｋｒｔ２７全長ｒｅｖｅｒｓｅ側
（配列番号１８、HA-K27 pQCXIN-R）
5'-aaaagaattctcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtaagaagggatcctctgctcgg
・ｋｒｔ７１全長ｒｅｖｅｒｓｅ側
（配列番号１９、HA-K6irs1-QCKrt1）
5'-aaaagaattctcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtatcggccacctttcttggaggg
・ｋｒｔ７１全長ｆｏｒｗａｒｄ側
（配列番号２０、T7-K6irs1 pQCXIN）
5'-gggggcggccgcaccatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtatgagccgccaattcacctgc
・ｋｒｔ７１全長ｆｏｒｗａｒｄ側
（配列番号２１、strep-tagII-K6irs1 pQC）
5'-ggggggcggccgcctcgagaccatggctagctggagccacccgcagttcgaaaaaatgagccgccaattcacctgc
【００５０】
上記で得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ）で処理し、ＰＣＲ産物と同様な酵素処理をしたｐＱＣＸＩＮ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック）のマルチクローニングサイトに挿入することにより、組み換え発現ベクターを構築および遺伝子塩基配列を確認した後、宿主細胞であるＳＷ１３（増殖培地：ＦＣＳ １０％を添加したＬｅｉｂｏｖｉｚｔｓ Ｌ１５ 培地で培養したもの）にタグ付きｋｒｔ２５ベクターまたはｋｒｔ２７ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションにはリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いて添付の説明書に従って行った。トランスフェクション後は、Ｇ４１８ ６００ｎｇ／ｍｌを添加した培地で培養し、タグ付きＫＲＴ２５及びタグ付きＫＲＴ２７発現培養細胞（ケラチンタイプＩ発現細胞とする）を選択した。また、ＳＷ１３細胞にｋｒｔ７１をリポフェクトアミン２０００にて上記の手法で導入し、２日後までＳＷ１３増殖培地で培養した。培養細胞の観察は、検出する細胞を−２０℃に冷却したメタノールに浸した後、ＴｒｉｔｏｎＸを１％添加したＴＢＳにて洗浄した。この操作を２回繰り返した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク）でブロッキングした。その後、１／２０ ＴＢＳ希釈のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅにて希釈した抗タグ抗体［１／５００希釈 抗Ｔ７タグ抗体（ノバジェン）］溶液にて反応させた後、Ｔｗｅｅｎ ２０を１％添加したＴＢＳで２回洗浄し、１／２０ ＴＢＳ希釈のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅで希釈した蛍光付加２次抗体［１／１０００希釈 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（インビトロジェン）］で発色させた。なお、スライドガラスについて、ベクタシールド（ベクタ）にて、封入処理をし、カバーガラスを被せた。画像は、ＢｉｏＲａｄ社の共焦点レーザ顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２０００およびＬａｓｅｒＳｈａｒｐにより得た。ＳＷ１３にタグ付きタイプＩ内毛根鞘ケラチン（ＫＲＴ２５及びＫＲＴ２７）が安定的に発現する細胞株を抗Ｔ７タグまたはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（図１及び図２）、抗ＨＡタグ抗体（データは省略）を用いて免疫染色または核染色を試みた。しかし、検出出来なかったため抗ＨＡタグを用いて、ウエスタンブロッティングでタイプＩケラチンの確認を行った（図３）。タイプＩＩケラチンであるＫＲＴ７１をＳＷ１３細胞で発現させた後、Ｔ７タグ及びｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩで検出した図は、それぞれ図４及び図５に示した。なお、タイプＩＩケラチン単独で発現させたＳＷ１３細胞ではフィラメント状のケラチン繊維は正常に形成されなかったが、顆粒状のケラチン粒は検出された。
【実施例２】
【００５１】
実施例２ 内毛根鞘ケラチンタイプＩ及びタイプＩＩケラチンの細胞内での発現
ＳＷ１３細胞内でタイプＩ及びタイプＩＩ内毛根鞘ケラチンを発現させた細胞の挙動を確認するため、以下のとおり実験を行い、観察した。ＫＲＴ２５またはＫＲＴ２７が安定的に発現したＳＷ１３細胞にリポフェクトアミン２０００を用いて、ｐＱＣＸＩＮベクターに挿入したタグ付き（Ｔ７タグとＨＡタグまたはｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩとＨＡタグ）ｋｒｔ７１をトランスフェクションした。観察は、一次抗体として、１／５００希釈抗Ｔ７タグ抗体（または１／２００希釈抗ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ抗体）を用い、上記と同様の手法で、免疫染色または核染色を行った。その結果、実施例１のようにケラチン単独でトランスフェクションした場合とは異なり、タイプＩ及びタイプＩＩケラチン両方ともトランスフェクションした細胞ではフィラメント状のケラチンを確認した（図６〜１０）。
【実施例３】
【００５２】
実施例３ 内毛根鞘ケラチンタイプＩまたはタイプＩＩケラチン発現細胞内でのＡＨＦの発現
内毛根鞘ケラチンと相互作用すると予測されるタンパク質の解析のため、タイプＩケラチンが安定的に発現する細胞にタイプＩＩケラチンベクターをトランスフェクションしたＳＷ１３細胞にｐＡｄｅｎｏウイルスベクター（クロンテック）を用いてＡＨＦ遺伝子（ＤＮＡ配列については特開２００４−２６４０２４を参照のこと）を２日間感染させた。その後、一次抗体として、抗Ｔ７抗体及び抗ＡＨＦ抗体、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（インビトロジェン）とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（インビトロジェン）を用い、実施例１と同様な手法にて免疫染色を行った。その結果、ＡＨＦと内毛根鞘ケラチンフィラメントの局在が一致する箇所があり、ＡＨＦはＰＡＤ（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ）で修飾される前でもケラチンと相互作用することが明らかとなった（図１１〜図１３）。
【実施例４】
【００５３】
実施例４ ＳＷ１３細胞内でのＡＨＦとビメンチンの局在
実施例３の比較例として、ケラチンとは別種の中間系フィラメントであるビメンチンとＡＨＦとの局在を調査した。手法は、ｐＡｄｅｎｏベクターにてＳＷ１３細胞に導入したＡＨＦ遺伝子を実施例１と同様の手法で固定およびブロッキングし、一次抗体として抗ビメンチン抗体（１／２００ 希釈、シグマ）及び抗ＡＨＦ抗体（１／５００ 希釈）を使用し、蛍光標識付きの二次抗体で反応後、洗浄、封入し、観察を行った。その結果、実施例３とは異なり、ＡＨＦとビメンチンは局在が一致しなかった。このことから、ＡＨＦは、ケラチン特異的に相互作用するタンパク質であることが明らかとなった（図１４）。実施例３、４の結果より、本発明のケラチン発現細胞は、ケラチン及びケラチンと相互作用するタンパク質の局在を確認するツールとして極めて有効なものであること証明された。
【実施例５】
【００５４】
実施例５ ヒト内毛根鞘ケラチン発現細胞
ヒト内毛根鞘タイプＩケラチン［ヒトＫＲＴ２５（NCBI Entrez Gene ID 147183；配列番号２３）とヒトＫＲＴ２８（NCBI Entrez Gene ID 162605；配列番号７）］およびマウス内毛根鞘タイプＩＩケラチン［マウスｋｒｔ７１（NCBI Entrez GeneID 70810；配列番号８）］を含むプラスミドベクターをそれぞれ、リポフェクトアミン２０００でＳＷ１３細胞に導入し、３日間培養した。なお、ヒトＫＲＴ２５タンパク質とヒトＫＲＴ２８タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むベクターとして、ＨａｌｏＴａｇ配列を含むｐＦＮ２１Ａベクターをプロメガ社より購入した［ＫＲＴ２５(Product ID; FHC05779L）、ＫＲＴ２８（Product ID; FHC05780L））。また、マウスｋｒｔ７１を含むベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子に組み換えたＴ７タグおよびＨＡタグ付きｐＱＣＸＩＮベクターに挿入したものである。培養後、マウス内毛根鞘タイプＩＩケラチンに対する一次抗体として１／５００希釈のＴ７タグ抗体、２次抗体として１／１０００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（インビトロジェン）を用いて、実施例１と同様な方法で免疫染色を行った。また、二次抗体で反応させる際に、タイプＩケラチンのＨａｌｏＴａｇに対する標識付きリガンド（１／２００希釈ＨａｌｏＴａｇ（商標）リガンド）を同時に添加した。
その結果、ＳＷ１３細胞内でヒトタイプＩケラチンおよびマウスタイプＩＩケラチン両方とも検出でき、局在が一致することを確認した(図１５および図１６)。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、上皮細胞のフィラメント構造に関するモデル細胞を提供することから、発毛に関する基礎分野に利用可能である。さらに、本発明は、発毛に有効な分子を探索する医薬品等の分野にも利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、内毛根鞘特異的タイプＩおよび／またはＩＩケラチンタンパク質を発現する細胞、ならびにこれらの細胞を用いて発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
種々の器官は、それぞれ特異的な形態を取ることにより、特徴的な機能を営み、個体全体の生命現象に参加している。器官において、形態形成と機能運営を担っているのは、多くの場合上皮細胞である。上皮細胞の動的な挙動は、細胞質にネットワーク状に配置された細胞骨格が直接支配しており、特に、ケラチン分子から成る中間径フィラメントのダイナミックな再編は、重要な役割を果たすことがわかっている。したがって、上皮細胞のケラチンフィラメントの再構成を追跡することにより、上皮細胞の機能や分化、ひいては器官全体の機能や分化を知る手がかりが得られる。
【０００３】
毛髪が中心から順に、毛髄質（メジュラ）、毛皮質（コルテックス）、毛小皮（キューティクル）から成ることは、化粧品等の宣伝を通じて広く一般の認知するところとなっている。毛髪を生じる器官である毛包は、毛髄質・毛皮質・毛小皮の外側に内毛根鞘、更にその外側に外毛根鞘が位置する同心円状構造を取る。内毛根鞘は内側から順に、内毛根鞘小皮（内毛根鞘キューティクル）、ハックスレイ（Ｈｕｘｌｅｙ）層、ヘンレ（Ｈｅｎｌｅ）層の３層から成る。内毛根鞘小皮は、扁平な角質細胞から成る組織であり、同じく扁平な角質細胞から成る毛小皮と「噛み合う」ことにより、毛髪が皮膚から抜け落ちないように固定する役割を果たすと考えられている。内毛根鞘（特に内毛根鞘小皮とヘンレ層）は、毛髪よりも早く（毛包の深部で）角化することから、内毛根鞘の役割の一つは、角化する前の柔らかい毛髪の断面形を規定することにあると考えられている。
【０００４】
個々の毛髪には寿命があり、際限なく伸び続けることはない。毛包の示す経時的な構造変化は毛周期と呼ばれ、成長期、退行期、休止期の３つのフェーズに分けられる。人間の場合、成長期は男性で３〜５年、女性で４〜６年とされており、この間、毛髪は約０．４５ｍｍ／日の速度で伸び続ける（日本人頭髪。男女差はないと言われている）。退行期（２〜３週間）を迎えた毛包では、細胞分裂が停止して広範なアポトーシスが起こり、休止期（３〜４ヶ月）に入る。退行期・休止期を経て成長期を迎えた毛包では、新しい毛髪が成長を始め、それに伴って古い毛髪が抜け落ちる。成長期の毛包における内毛根鞘細胞は、毛球（毛包の最深部）で幹細胞の細胞分裂により生じ、毛髪の伸長に伴って皮膚表面へ移動した後、最終的に毛小皮からも外毛根鞘からも剥がれて脱落する。分化した内毛根鞘細胞の形態学的特徴は、トリコヒアリンと呼ばれる顆粒を持つことであるが、トリコヒアリン顆粒の消失に伴って、内毛根鞘細胞は急速に角化することがわかっている。分子レベルでは、内毛根鞘特異的タイプＩケラチン（ＫＲＴ２５〜ＫＲＴ２８）とタイプＩＩケラチン（ＫＲＴ７１〜ＫＲＴ７４）が会合してケラチンフィラメントを形成し、更に、内毛根鞘特異的ケラチン付随タンパク質であるトリコヒアリンがケラチンフィラメントに結合して、フィラメントを束ねて補強すると同時にフィラメント同士を連結することによって、内毛根鞘特異的ネットワークが急速に発達し、角化すると考えられている。この際、元来不溶性であるトリコヒアリンは、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ）の作用で可溶化し、トランスグルタミナーゼ（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）の作用でケラチンフィラメントに結合することがわかっている（非特許文献１）。近年、成長期毛包に特異的に反応するモノクローナル抗体の認識する分子量２２０ｋＤのタンパク質が発見された（特許文献１）。この２２０ｋＤタンパク質はＡＨＦと名付けられ、内毛根鞘特異的に発現していることが明らかになった（非特許文献２）。トリコヒアリン遺伝子とＡＨＦ遺伝子は弱い相同性を示すことから、ＡＨＦは内毛根鞘特異的ケラチン付随タンパク質であろうと推定された。
【０００５】
内毛根鞘は毛髪を固定し、また、毛髪の断面形を規定する等の機能を果たす毛包内上皮組織であるが、内毛根鞘を構成する上皮細胞は、毛包から分離・純化して培養するのが難しく、また、継代操作により内毛根鞘特異的ケラチンの発現が劇的に低下してしまう。つまり、継代可能な上皮細胞株の中に、内毛根鞘特異的ケラチンを発現しているものは皆無である。理論上どのような上皮細胞株であっても、内毛根鞘ケラチンの遺伝子を外来的に導入すれば、細胞内で内毛根鞘ケラチンのネットワーク形成を解析することは可能と考えられるが、現在に至るまで、内毛根鞘特異的なケラチンタンパク質を発現する継代可能な細胞株は得られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２１０１６９
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tarcsa E, Marekov LN, Andreoli J, Idler WW, Candi E, Chung SI, Steinert PM. J Biol Chem. 1997 Oct 31;272(44):27893-901
【非特許文献２】Takebe K, Oka Y, Radisky D, Tsuda H, Tochigui K, Koshida S, Kogo K, Hirai Y. FASEB J. 2003 17:2037-47
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の解決課題は、内毛根鞘特異的ケラチンタンパク質を発現する継代可能な細胞株であって、内毛根鞘におけるフィラメント形成を研究する上でのモデル細胞を提供することである。さらには、これらのモデル細胞を用いて発毛に有効な因子のスクリーニングを可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った。そして、驚くべきことに、これまで、ケラチンフィラメント構造を有する継代可能な細胞を得ることは不可能であったが、細胞、特にＳＷ１３株の細胞に、内毛根鞘特異的タイプＩケラチンおよび／またはタイプＩＩケラチンをコードするＤＮＡ配列を含む核酸を導入することにより、内毛根鞘特異的ケラチンのフィラメント構造を有する継代可能な細胞を作製することに成功した。さらに本発明者らは、前記細胞におけるケラチンフィラメントとの関連を調べることによるスクリーニングの方法を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は：
（１）内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸および／または内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された細胞；
（２）前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号１に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、（１）記載の細胞；
（３）前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号２に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と８７％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、（１）記載の細胞；
（４）前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号３に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、（１）記載の細胞；
（５）前記内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号４に示すタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、（１）記載の細胞；
（６）（２）〜（４）のいずれか１つ記載の核酸、および（５）記載の核酸が導入された、（１）記載の細胞；
（７）さらにケラチン付随タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された、（１）〜（６）のいずれか１つ記載の細胞；
（８）ケラチン付随タンパク質がＡＨＦである、（７）記載の細胞；
（９）前記核酸のいずれかが標識された、（１）〜（８）のいずれか１つ記載の細胞；
（１０）前記細胞が内在性ケラチンを持たない細胞である、（１）〜（９）のいずれか１つ記載の細胞；
（１１）前記細胞がＳＷ１３株である、（１０）記載の細胞；
（１２）（２）〜（４）のいずれか１つ記載の核酸を含むベクター；
（１３）（５）記載の核酸を含むベクター；
（１４）発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（ａ）前記候補因子を（１）〜（１１）のいずれか１つ記載の細胞で発現させ、次いで
（ｂ）ケラチンフィラメントの形成について調べること
を特徴とする方法；ならびに
（１５）発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（ａ）前記候補因子を（１）〜（１１）のいずれか１つ記載の細胞に作用させ、次いで
（ｂ）ケラチンフィラメントの形成について調べること
を特徴とする方法
を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、上皮細胞、特に内毛根鞘細胞におけるケラチンフィラメント形成のメカニズムについて解析することができる。さらに内毛根鞘細胞のケラチンフィラメント形成に関わる因子であって、発毛に有効な因子をスクリーニングすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、タイプＩケラチン（ＫＲＴ２５）を発現するＳＷ１３細胞のＴ７タグでのケラチンの免疫染色写真である。
【図２】図２は、タイプＩケラチン（ＫＲＴ２７）を発現するＳＷ１３細胞のＴ７タグでのケラチンの免疫染色とＰＩ（ヨウ化プロピジウム）での核染色写真である。
【図３】図３は、ウエスタンブロッティングでのタイプＩケラチンを発現するＳＷ１３細胞のＴ７タグでのタイプＩケラチンの検出である。
【図４】図４は、タイプＩＩケラチン（ＫＲＴ７１）を発現するＳＷ１３細胞のＴ７タグでのケラチンの免疫染色とＰＩでの核染色写真である。
【図５】図５は、タイプＩＩケラチン（ＫＲＴ７１）を発現するＳＷ１３細胞のｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩでのケラチンの免疫染色とＰＩでの核染色写真である。
【図６】図６は、タイプＩ（ＫＲＴ２５）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチンを発現するＳＷ１３細胞でのＴ７タグでのケラチンフィラメントの免疫染色とＰＩでの核染色写真である。
【図７】図７は、タイプＩ（ＫＲＴ２５）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチンを発現するＳＷ１３細胞でのＴ７タグでのケラチンフィラメントの免疫染色写真である。
【図８】図８は、タイプＩ（ＫＲＴ２７）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチンを発現するＳＷ１３細胞でのＴ７タグでのケラチンフィラメントの免疫染色写真である。
【図９】図９は、タイプＩ（ＫＲＴ２７）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチンを発現するＳＷ１３細胞でのｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩでのケラチンフィラメントの免疫染色とＰＩでの核染色写真である
【図１０】図１０は、図９の拡大図である。
【図１１】図１１は、タイプＩ（ＫＲＴ２５）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチン及びＡＨＦを発現するＳＷ１３細胞でのＴ７タグでのケラチンの免疫染色とＡＨＦの検出写真である。
【図１２】図１２は、タイプＩ（ＫＲＴ２７）とタイプＩＩ（ＫＲＴ７１）ケラチン及びＡＨＦを発現するＳＷ１３細胞でのＴ７タグでのケラチンの免疫染色とＡＨＦの検出写真である。
【図１３】図１３は、図１２に示す一部の拡大図である。
【図１４】図１４は、ＡＨＦを発現するＳＷ１３細胞でのビメンチンとＡＨＦの免疫染色である。
【図１５】図１５は、ヒトＫｒｔ２５とマウスｋｒｔ７１をＳＷ１３細胞に導入後、ＨａｌｏＴａｇ（商標）リガンドにてヒトＫＲＴ２５タンパク質を検出し（左図）、Ｔ７タグ抗体でマウスＫＲＴ７１タンパク質を検出し（中央図）、図を重ねたものである（右図）。
【図１６】図１６は、ヒトＫｒｔ２８とマウスｋｒｔ７１をＳＷ１３細胞に導入後、ＨａｌｏＴａｇ（商標）リガンドにてヒトＫＲＴ２８タンパク質を検出し（左図）、Ｔ７タグ抗体でマウスＫＲＴ７１タンパク質を検出し（中央図）、図を重ねたものである（右図）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、１の態様において、内毛根鞘特異的タイプＩおよび／またはＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された細胞を提供する。本発明に用いることができる細胞は、あらゆる種類の細胞であってもよいが、好ましくは上皮細胞である。本明細書において、上皮細胞とは、管腔臓器の粘膜を構成する狭義の上皮細胞のみならず、体表面を覆う表皮細胞、分泌腺を構成する腺細胞、更には、肝細胞や尿細管上皮細胞などの分泌や吸収を担う実質臓器の細胞も含めて言う。発生学的には三胚葉のいずれにも由来し、例えば、皮膚は外胚葉、消化管上皮は内胚葉、尿細管上皮は中胚葉に由来する。構造上の特徴として、極性（向き）を持つことが挙げられるが、上皮組織や細胞それぞれの形態および機能は多種多様である。
【００１４】
上皮細胞全体に共通する特徴として、ケラチンから成る細胞骨格を有する点が挙げられる。細胞骨格には径の太い順に、微小管、中間径フィラメント、アクチンフィラメントの３種類があり、上皮細胞の中間径フィラメントは例外なくケラチンフィラメントである（大部分の上皮細胞は、微小管および／またはアクチンフィラメントから成る細胞骨格も持っている）。上皮細胞がケラチンを含むことから、ケラチンに対する抗体を用いて、腫瘍が上皮由来であるか否か鑑別することができる。腫瘍の鑑別には、間葉系細胞に特徴的な中間径フィラメントを構成するビメンチンに対する抗体を併用することもある。
【００１５】
上皮細胞を特徴付けるケラチンタンパク質は、完全な分化状態を示さない腫瘍細胞においてさえ発現し続けるのが普通である。しかし、ほぼ全ての上皮細胞株は、それぞれ固有のタイプＩケラチンとタイプＩＩケラチンを発現しているため、これらの内在性ケラチンが、外来的に導入した内毛根鞘ケラチンのネットワーク形成に影響を及ぼす可能性を無視できない。上皮細胞株の内在性ケラチンと外来的に導入したケラチンとの干渉は、内毛根鞘ケラチンに限らず、あらゆるケラチンのフィラメントネットワーク形成を研究する上で障害となり得る。したがって、本発明に用いることができる細胞は、好ましくは内在性ケラチンを持たない細胞である。
【００１６】
細胞の継代操作を繰り返すうちに、ケラチンを全く発現しなくなった細胞株が、ごく稀に出現することがある。このような細胞株の最初の報告例は、ラットの肝癌に由来する株である（Venetianer A, Schiller DL, Magin T, Franke WW. Nature. 1983 Oct 20-26;305(5936):730-3）。この肝癌細胞株は、継代を繰り返すうちに肝細胞特異的機能を失うと共に、ケラチンを含む中間径フィラメント構成タンパク質を発現しなくなる。次の報告例は、ヒト副腎皮質腫瘍に由来するＳＷ１３株である（Hedberg KK, Chen LB. Exp Cell Res. 1986 Apr;163(2):509-17）。ＳＷ１３株では、免疫蛍光法、二次元電気泳動法、ウエスタンブロッティング法のいずれによっても、ケラチンを含む中間径フィラメント構成タンパク質を検出することができなかった。本明細書において、内在性ケラチンを持たない上皮由来細胞とは、免疫蛍光法、二次元電気泳動法、ウエスタンブロッティング法等の細胞学的・生化学的手法を以てしても、ケラチンフィラメントおよびケラチンタンパク質のいずれも検出することのできない上皮由来細胞を意味する。当業者は、分子生物学的手法、すなわち、ノザン・ブロッティング法や逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により、ケラチンをコードするメッセンジャーＲＮＡが検出限界以下であることを指標として、内在性ケラチンを持たない上皮由来細胞を選択することもできる。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写とＰＣＲを別々に行なう二段階法と同一反応系で行なう一段階法に大別される。二段階法では、逆転写反応にＭｏｌｏｎｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ （Ｍ−ＭＬＶ）やａｖｉａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）等のレトロウイルス由来の逆転写酵素またはこれらを改良した酵素を用いることができる。逆転写酵素用のプライマーは、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、遺伝子特異的プライマー（ＰＣＲ用プライマーの片方）の三者のうちいずれかを使用すればよい。一段階ＲＴ−ＰＣＲ法に用いるキットは各社から販売されており、例えば、インビトロジェン社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｍｕｎ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを挙げることができる。中には、東洋紡社のＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘシリーズのように、ＴｔｈポリメラーゼがＭｎ２＋存在下で逆転写活性を示すことを利用したキットもある。上述のごとく、本発明に用いられる細胞は、好ましくは上記のごとく内在性ケラチンを持たない細胞であり、より好ましくはラット肝癌細胞株またはＳＷ１３株であり、最も好ましくはＳＷ１３株である。
【００１７】
また、本発明に用いられる細胞は、あらゆる動物に由来する細胞を含み、例えば、ほ乳類に由来する細胞であってもよく、マウス、ラット、ハムスター、モルモットのごとき齧歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の有蹄類、イヌ、ネコ、ウサギなどの他のほ乳類、ならびに霊長類に由来する細胞が挙げられる。好ましくはヒト由来の細胞を本発明に用いる。
【００１８】
本発明における細胞は、タイプＩおよび／またはタイプＩＩケラチンタンパク質を発現するものである。例えば、本発明の細胞は、タイプＩおよび／またはタイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むものであってもよい。ここで、一般的に、タイプＩケラチンとは、タンパク質分子の等電点（ｐＩ）が酸性を示すケラチンであり、タイプＩＩケラチンとは、等電点が中性または塩基性を示すケラチンである。正常な上皮細胞で発現するケラチンは、比較的低分子のタイプＩケラチンと比較的高分子のタイプＩＩケラチンが対になっている。例えば、皮膚の角化細胞では、タイプＩのＫＲＴ１０（５６．５ｋＤ）とタイプＩＩのＫＲＴ１（６７ｋＤ）が発現している（Schweizer J, Bowden P, Coulombe P, Langbein L, Lane E, Magin T, Maltais L, Omary B, Parry D, Rogers M, Wright M. J Cell Biol. 2006 Jul;174(2):169-74）。なお、本明細書では、ケラチンタンパク質をＫＲＴ、ヒトのケラチン遺伝子をＫｒｔ、マウスのケラチン遺伝子をｋｒｔと表す。本明細書におけるケラチンは、毛髪や爪を構成する硬ケラチンを含む。なお、硬ケラチンに対して、粘膜細胞や表皮細胞のケラチンを軟ケラチンまたはサイトケラチンと呼ぶ。硬ケラチンは、ヒトやマウスの毛髪・体毛や爪の他に、サイの角、ヤマアラシの棘、馬の蹄などにも含まれる。内毛根鞘特異的ケラチンは、ゲノムＤＮＡシークエンシングから発見された遺伝子をコードするケラチンであり、塩基配列の相同性から、４種類のタイプＩケラチン（ヒト塩基配列Ｋｒｔ２５〜Ｋｒｔ２８、マウス塩基配列ｋｒｔ２５〜ｋｒｔ２８）と４種類のタイプＩＩケラチン（ヒト塩基配列Ｋｒｔ７１〜Ｋｒｔ７４、マウス塩基配列ｋｒｔ７１〜ｋｒｔ７４）がヒトとマウスで同定されている。ただし、ＫＲＴ２５、ＫＲＴ２７およびＫＲＴ２８は、内毛根鞘の他に毛髄質でも発現している（Langbein L, Rogers MA, Praetzei-Wunder S, Helmke B, Schirmacher P, Schweizer J. J Invest Dermatol. 2006 Nov;126(11):2377-86）。本明細書におけるケラチンタンパク質は、ヒトとマウス由来のものに限定されず、これら以外の動物種由来、例えば、サイ、ヤマアラシ、馬、チンパンジー、ニホンザル、ラット、モルモット、牛、羊、ヤギ、ウサギ、鶏、ガチョウなどのケラチンタンパク質を含む。
【００１９】
ケラチンタンパク質は、２分子のタイプＩケラチンと２分子のタイプＩＩケラチンが会合した４量体を基本単位として、フィラメントを形成する。ケラチンフィラメントの形成は、インビトロでも自然に進行する反応であり、培養細胞に導入して細胞内で形成させることもできる。本発明において、タイプＩケラチンとタイプＩＩケラチンは特に限定されず、サイトケラチン（軟ケラチン）であっても硬ケラチンであってもよい。ただし、正常な上皮細胞の機能や分化を研究する目的ならば、当該細胞で見られる組み合わせが適当であることは言うまでもない。例えば正常な皮膚の角化を研究する場合、角化表皮で見られるＫＲＴ１とＫＲＴ１０を組み合わせるのが適当である。正常な内毛根鞘の角化過程を解析する場合は、内毛根鞘特異的タイプＩケラチンであるＫＲＴ２５〜ＫＲＴ２８のうちの少なくとも１つおよび内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンであるＫＲＴ７１〜ＫＲＴ７４のうちの少なくとも１つを用いるのが適当である。内毛根鞘特異的タイプＩおよびタイプＩＩケラチンを発現する細胞は、内毛根鞘の機能・分化のみならず、毛包全体の機能・分化または毛周期を研究する上でも有用である。しかし、正常な上皮細胞では起こり得ない状況を人為的に作り出すこともまた、いわゆる対照（コントロール）として重要である。
【００２０】
したがって、本発明の細胞で発現させることができる好ましいケラチンタンパク質は、内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５〜ＫＲＴ２８および／またはタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１〜ＫＲＴ７４であり、好ましくはＫＲＴ２５、ＫＲＴ２７、ＫＲＴ２８およびＫＲＴ７１である。本発明において、導入されるケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸の組合せは、タイプＩおよびタイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸のうちの少なくとも１つが導入されていればよいが、好ましくは、タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸のうちの１つおよびタイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸のうちの１つが導入されることである。より好ましくは、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５、ＫＲＴ２７またはＫＲＴ２８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、およびタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入されることである。
【００２１】
本発明におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５のアミノ酸配列は、配列番号１に示すものが例示され、あるいは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する相同性が、６０％以上、例えば、６５％、７０％、７３％、または７５％以上のものであってもよく、好ましくは７５％以上のものである。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ジェネティクス製）などの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。加えて、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５は、マウス由来のものであるが、例えば、ヒト、ラット、ウシ、ネコなどの他の動物に由来するものであっても、これらの動物種におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５は、本明細書におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５に包含されうる。特に、本発明におけるマウスのＫＲＴ２５は、ヒトのＫＲＴ２５に対して７５％の相同性を有することから、ヒトのＫＲＴ２５も本発明に包含される。さらに、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５は、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５と同等の性質を有しているものであって、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。本明細書における同等の性質とは、ケラチンとして同等の生物学的、化学的、および物理学的特性を有することをいう。また、本明細書におけるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、同一のアミノ酸を示す異なるポリヌクレオチド配列、いわゆる縮重コドンをも含むものである。
【００２２】
本発明において、前記ハイブリダイズさせる条件は、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressの記載に従って、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイズの条件は、低ストリンジェントな条件であってもよいが、好ましくは高ストリンジェントな条件である。低ストリンジェントな条件とは、上記文献に従ってハイブリダイズさせた後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件である。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳの条件などを含む。ただし、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様の条件を実現することができる。
【００２３】
また、本発明に用いることができるＤＮＡ配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である配列番号５を含むものであってもよいが、前記アミノ酸配列をコードするものであればこれだけに限らない。
【００２４】
本発明におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７のアミノ酸配列は、配列番号２に示すものが例示され、あるいは、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する相同性が、７０％以上、例えば、７５％、８０％、８３％、８５％、または８７％以上のものであってもよく、好ましくは８７％以上のものである。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ジェネティクス製）などの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。加えて、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７は、マウス由来のものであるが、例えば、ヒト、ラット、ウシ、ネコなどの他の動物に由来するものであっても、これらの動物種におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７は、本明細書におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７に包含されうる。特に、本発明におけるマウスのＫＲＴ２７は、ヒトのＫＲＴ２７に対して８７％の相同性を有することから、ヒトのＫＲＴ２７も本発明に包含される。さらに、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７は、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７と同等の性質を有しているものであって、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸と前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００２５】
他に、本発明に用いることができるＤＮＡ配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である配列番号６を含むものであってもよいが、前記アミノ酸配列をコードするものであればこれだけに限らない。
【００２６】
本発明におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８のアミノ酸配列は、配列番号３に示すものが例示され、あるいは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する相同性が、７０％以上、例えば、７５％、８０％、８３％、または８５％以上のものであってもよく、好ましくは８５％以上のものである。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ジェネティクス製）などの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。加えて、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８は、ヒト由来のものであるが、例えば、マウス、ラット、ウシ、ネコなどの他の動物に由来するものであっても、これらの動物種におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８は、本明細書におけるタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８に包含されうる。特に、本発明におけるヒトのＫＲＴ２８は、マウスのＫＲＴ２８に対して８５％の相同性を有することから、マウスのＫＲＴ２８も本発明に包含される。さらに、本発明において、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８は、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８と同等の性質を有しているものであって、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸と前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００２７】
他に、本発明に用いることができるＤＮＡ配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である配列番号７を含むものであってもよいが、前記アミノ酸配列をコードするものであればこれだけに限らない。
【００２８】
本発明におけるタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１のアミノ酸配列は、配列番号４に示すものが例示され、あるいは、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する相同性が、８０％以上、例えば、８３％、８５％、８８％、または９０％以上のものであってもよく、好ましくは９０％以上のものである。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ジェネティクス製）などの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。加えて、本発明において、タイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１は、マウス由来のものであるが、例えば、ヒト、ラット、ウシ、ネコなどの他の動物に由来するものであっても、これらの動物種におけるタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１は、本明細書におけるタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１に包含されうる。特に、本発明におけるマウスのＫＲＴ７１は、ヒトのＫＲＴ７１に対して９０％の相同性を有することから、ヒトのＫＲＴ７１も本発明に包含される。さらに、本発明において、タイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１は、タイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１と同等の性質を有しているものであって、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸と前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００２９】
本発明に用いることができるＤＮＡ配列はまた、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である配列番号８を含むものであってもよいが、前記アミノ酸配列をコードするものであればこれだけに限らない。
【００３０】
さらに、本発明で用いられる上記ＤＮＡ配列を有する核酸は、下記の実施例で詳細に説明するように取得されてもよいが、一般的なクローニング技術を用いて当業者が適宜行うことができる。
【００３１】
本発明では、上記ケラチンタンパク質とともにケラチン付随タンパク質を細胞に発現させてもよい。具体的には、上記ケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸とともに、ケラチン付随タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入されてもよい。一般的に、上皮細胞、特に角化する上皮細胞では、ケラチン付随タンパク質がケラチンフィラメントに結合して、発達したネットワークを形成する現象が見られる。例えば表皮細胞では、ＫＲＴ１（タイプＩＩ）とＫＲＴ１０（タイプＩ）のフィラメントに、ケラチン付随タンパク質であるフィラグリンが結合して、フィラメントを束ねて補強すると同時にフィラメント同士を連結することによって、表皮細胞特異的なネットワークを形成する。またヒトの毛皮質では、ＫＲＴ３１〜ＫＲＴ４０（タイプＩ）とＫＲＴ８１〜ＫＲＴ８６（タイプＩＩ）のフィラメントに、ケラチン付随タンパク質である（超）高含硫タンパク質（（ｕｌｔｒａ−）ｈｉｇｈ ｓｕｌｆｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）や高グリシン・チロシンタンパク質（ｈｉｇｈ ｇｌｙｃｉｎｅ／ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が結合して、毛皮質細胞特異的なネットワークを形成する（矢作彰一 フレグランス・ジャーナル ２００７年 ３５巻（１２号）３４−４０頁。ただし矢作は、（超）高含硫タンパク質と高グリシン・チロシンタンパク質に加えて、高グリシン・システイン・セリンタンパク質（ｈｉｇｈ ｇｌｙｃｉｎｅ／ｃｙｓｔｅｉｎ／ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を提唱している）。更にまた内毛根鞘細胞では、ＫＲＴ２５〜ＫＲＴ２８（タイプＩ）とＫＲＴ７１〜ＫＲＴ７４（タイプＩＩ）のフィラメントに、ケラチン付随タンパク質であるトリコヒアリンが結合して、内毛根鞘細胞特異的なネットワークを形成する。本発明において、タイプＩおよびタイプＩＩケラチンに加えてケラチン付随タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を導入してもよい。ただし、正常な上皮細胞の機能や分化を研究する目的ならば、当該細胞で見られる正常な組み合わせが適当であることは言うまでもない。例えば正常な毛皮質細胞の角化を研究する場合、ＫＲＴ３１〜ＫＲＴ４０の少なくとも１つとＫＲＴ８１〜ＫＲＴ８６の少なくとも１つに加えて、高含硫タンパク質および／または高グリシン・チロシンタンパク質（および／または高グリシン・システイン・セリンタンパク質）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を導入するのが適当である。
【００３２】
同様に、表皮細胞の角化を研究する場合は、ＫＲＴ１とＫＲＴ１０に加えてフィラグリンを、また、内毛根鞘細胞の角化を研究する場合は、ＫＲＴ２５〜ＫＲＴ２８の少なくとも１つとＫＲＴ７１〜ＫＲＴ７４の少なくとも１つに加えてトリコヒアリンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を導入することもできる。ただし、フィラグリンは、前駆体であるプロフィラグリンがペプチジルアルギニンデイミナーゼの作用を受け、更にプロテアーゼの作用を受けて断片化したものなので、プロフィラグリンと共にペプチジルアルギニンデイミナーゼとプロテアーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を導入する必要がある。また、トリコヒアリンは元来不溶性であり、可溶化にペプチジルアルギニンデイミナーゼが必須なので、トリコヒアリンと共にペプチジルアルギニンデイミナーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を導入する必要がある。（プロ）フィラグリンやトリコヒアリンに対して内毛根鞘特異的ＡＨＦは、翻訳後修飾を受けずに、ケラチン付随タンパク質として働くことが本発明において示された。本発明におけるＡＨＦは、配列番号２２に示すＡＨＦタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を用いて導入されてもよいが、ＡＨＦタンパク質のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含む核酸であれば、これに限定されない。
【００３３】
したがって、本発明では、タイプＩおよび／またはタイプＩＩケラチンとともに発現されうるケラチン付随タンパク質は、例えば、高含硫タンパク質、高グリシン・チロシンタンパク質、高グリシン・システイン・セリンタンパク質、フィラグリン、トリコヒアリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ、プロテアーゼ、ＡＨＦなどを含むが、好ましくはトリコヒアリンおよびＡＨＦであり、最も好ましくはＡＨＦである。これらのケラチン付随タンパク質は、これらケラチン付随タンパク質と同等の性質を有するものであって、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシなどのいかなる動物に由来するものであってもよいが、好ましくはヒトに由来するものである。
【００３４】
本発明では、上記タンパク質が標識されていてもよい。本発明における標識は、上記タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列にタグ配列を付加することであってもよいが、標識できればタグ以外の一般的に知られる配列を付加してもよい。本発明において、検出用のタグ配列は必須ではないが、タグ配列を用いない場合は、発現するタンパク質それぞれに対して抗体を準備する必要があるので、タグを付加するのが簡便である。本発明に用いることができるタグは、Ｔ７タグ、ＨＡタグ、ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩタグ、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ等が挙げられるが、標識を目的とする配列であればこれら以外の配列であってもよい。また、本発明において、上記タグ配列の付加される位置は、ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列のフレームが一致するように連結されていればいかなる位置であってもよいが、好ましくは上記核酸の５’末端または３’末端である。本発明において、上記タグ配列は、一般的な手法により上記ＤＮＡ配列に付加されてもよい。例えば、配列番号１５と１６（ＫＲＴ２５のアミノ酸配列のＮ末端側にＴ７タグ配列およびＣ末端にＨＡタグ）、配列番号１７と１８（ＫＲＴ２７のアミノ酸配列のＮ末端側にＴ７タグ配列およびＣ末端側にＨＡタグ配列）、配列番号１９と２０（ＫＲＴ７１のアミノ酸配列のＮ末端側にＴ７タグ配列およびＣ末端側にＨＡタグ配列）、あるいは配列番号１９と２１（ＫＲＴ７１のアミノ酸配列のＮ末端側にｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩおよびＣ末端側にＨＡタグ配列）の組合せのプライマーを用いるＰＣＲ法により付加されることを含むが、これだけに限らない。
【００３５】
本発明では、上記核酸が一般的に知られているベクターに組み込まれて導入されてもよい。本発明に用いられうるベクターとして、例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターであってもよく、あるいは一般的なプラスミドベクターであってもよい。本発明に用いることができるベクターは、好ましくは、レトロウイルスベクターであり、例えば、ｐＱＣＸＩＮ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック）である。一般的に、組換えウイルスは、安全性を高めたウイルスベクターを用いて作製することができ、このようなウイルスベクターには、特殊な宿主細胞（例えば、ウイルスの感染・増殖に必須なタンパク質を核染色体からトランスに供給する細胞など）を用いない限り、感染・増殖しないように改良したものも含まれる。ウイルスベクターは、感染後ウイルスゲノムが核染色体に組み込まれるタイプと、感染後ウイルスゲノムがエピゾームとして独立に存在するタイプとの２種類に大別できる。前者のレトロウイルスやアデノ随伴ウイルス等に由来するベクターは、外来遺伝子を永続的に発現させる場合に適しており、一方、後者のアデノウイルスやワクシニアウイルス等に由来するベクターは、外来遺伝子を一過性に発現させる場合に適している。外来遺伝子の発現効率は、一般に後者（特にアデノウイルスベクター）が高いとされている。当業者であれば、実験目的に合わせて適当なウイルスベクターを選択し、適切な封じ込め設備を備えた施設内で組換えウイルスを作製することができる（谷憲三朗、浅野茂隆編 遺伝子治療の新展開―ベクター開発と臨床応用の最前線（新臨床医のための分子医学シリーズ）羊土社 ２００１年）。
【００３６】
本発明において使用するベクターは、市販品に限定されず、基本的な構成要素として、大腸菌等の宿主内で働く複製領域（レプリコン）および抗生物質耐性等の選択マーカー、真核細胞内で働く転写開始領域（プロモーター）および転写終結領域（ｐｏｌｙＡ付加シグナル）を備えるものであればよいが、これら以外の要素が付加されていてもよい。レプリコンは、ＣｏｌＥ１（ｐＢＲ３２２）レプリコンやこれを改良したｐＵＣレプリコンが一般的であるが、これらに限定されない。抗生物質耐性マーカーは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等に対する耐性遺伝子が一般的である。真核細胞プロモーターは、サイトメガロウイルスやＳＶ４０等のウイルス由来プロモーターが一般的であるが、これらに限定されない。ｐｏｌｙＡ付加シグナルは、レトロウイルス３’−ＬＴＲや免疫グロブリン遺伝子に由来する配列が一般的である。これらの基本的な構成要素に加えて、クローニングを容易にするためのＭＣＳ、発現効率を上げるためのイントロン、トランスフェクション後の選択を可能にするトランスフェクタント選択マーカー（例えば、真核細胞プロモーター下流に位置するＧ４１８耐性またはネオマイシン耐性遺伝子等）などを持つベクターであってもよい。当業者であれば、ベクターへの（サブ）クローニング、形質転換した宿主の培養、宿主からの組換えＤＮＡ精製などの諸操作を適宜行なうことができる。
【００３７】
本発明において、上記核酸の細胞への導入は、当業者間において一般的な手法を用いて行われてもよい。例えば、上記核酸を上記ベクターに組み込んで、リポフェクトアミン（インビトロジェン社）等によるリポソーム法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法などにより実施することができるが、これらだけに限らない。また、本発明では、上記ケラチンタンパク質またはケラチン付随タンパク質を、タンパク質として細胞に導入してもよい。タンパク質を培養細胞に導入する手法としては、例えば、マイクロインジェクション法が挙げられるが、Ｐｒｏｆｅｃｔ（ナカライ社）等の試薬を用いてもよい。タンパク質のｍＲＮＡを試験管内転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）で合成した後、ｍＲＮＡをマイクロインジェクション法やリポソーム法で培養細胞に導入することもできる。ただし実際には、精製タンパク質やメッセンジャーＲＮＡでなく、組換えプラスミドＤＮＡや組換えウイルスを用いる手法が広く行なわれている。
【００３８】
また、本発明では、上記核酸が直接導入されてもよい。この場合、核酸の導入方法は、例えば、エレクトロポレーション等の物理的方法、ならびにＤＥＡＥ−デキストランやリポソーム、リン酸カルシウム等を用いる化学的方法を含むが、これらだけに限らない。
【００３９】
本発明において、目的の核酸が導入された細胞の選別は、抗生物質耐性マーカーのＤＮＡ配列をベクターに組み込んだ場合には、抗生物質を含む培地で細胞を培養することにより行われてもよいが、細胞の選別や細胞の培養条件などは、当業者が適宜選択することができる。
【００４０】
本発明のさらなる態様では、本発明は、発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法を提供する。すなわち、本発明は、工程（ａ）：発毛に有効な候補因子を前記細胞で発現させるか、または前記細胞に作用させることを含む。次いで、本発明は、工程（ｂ）：前記細胞でフィラメント形成について調べることを含む。ここで、候補因子とは、発毛に関連すると考えられる因子であれば、化合物、ポリペプチド、サイトカイン、タンパク質または核酸などのあらゆる物質であってもよい。候補因子として、好ましくはケラチンタンパク質と相互作用することが示唆される因子、例えば、トリコヒアリンおよびＡＨＦなどのケラチン付随タンパク質が挙げられる（Tarcsa E, Marekov LN, Andreoli J, Idler WW, Candi E, Chung SI, Steinert PM. J Biol Chem. 1997 Oct 31;272(44):27893-901
およびTakebe K, Oka Y, Radisky D, Tsuda H, Tochigui K, Koshida S, Kogo K, Hirai Y. FASEB J. 2003 17:2037-47）。本発明において、細胞で発現させるとは、上記候補因子を当業者間で一般的な手法を用いて候補因子を前記細胞において発現させることをいう。例えば、ＡＨＦタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するベクターを前記細胞に導入することを含むが、これだけに限らない。一方、本発明において、細胞に作用させるとは、候補因子の上記細胞への効果を調べるために、細胞の培地に候補因子を添加して細胞に接触させるか、あるいは細胞への注入を行うことなどをいう。候補因子を添加する量または注入する量は、当業者が適宜決めることができる。本発明では、ケラチン分子を指標として、ケラチンフィラメントの形成について調べることができる。例えば、金コロイド標識の抗ケラチン抗体による免疫電子顕微鏡観察によるフィラメントと候補因子の相互作用などであってもよいが、一般的なタンパク質間の相互作用を調べる手法であれば、特に限定されない。
【００４１】
本発明の別の態様では、本発明は、上記方法により発毛に有効な因子とされた候補因子を含む発毛剤を提供する。本発明において上記発毛剤は、前記因子の濃度、剤形および配合成分などは適宜選択し得る。従来の発毛剤を併用することができる。
【００４２】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、発毛剤の製造における、上記細胞の使用を提供する。
【００４３】
本発明のさらに１つの別の態様では、本発明は、上記細胞を移植する発毛の方法を提供する。前記方法は、上記細胞を動物の皮膚に移植することを含む。前記移植の方法は、一般的な手法を用いて行われてもよい。さらに、本発明における方法は、従来の発毛の方法を併用して行うこともできる。
【００４４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例によって限定されることはない。
【実施例１】
【００４５】
実施例１ 内毛根鞘タイプＩまたはタイプＩＩケラチンの細胞内での発現
ＳＷ１３細胞にて、内毛根鞘ケラチンタイプＩまたはタイプＩＩ単独での挙動を調べる為に、抗体のエピトープタグ付き内毛根鞘ケラチンタイプＩ（マウスｋｒｔ２５（NCBI Entrez GeneID 70810、配列番号５）または、マウスｋｒｔ２７（NCBI Entrez GeneID 16675、配列番号６））、内毛根鞘ケラチンタイプＩＩ（マウスｋｒｔ７１（NCBI Entrez GeneID 56735、配列番号８））それぞれ発現させた細胞を作製し、観察を行った。具体的な方法及び観察結果は、以下の通りである。毛周期が成長期（生後５週齢）のＣ３Ｈ／Ｈｅ Ｓｌｃ（日本エスエルシー）マウス背中からＴＯＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン）を添付のマニュアルに従って用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調整した。調整したｔｏｔａｌ ＲＮＡから、タカラバイオのＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０を用いオリゴｄＴからｃＤＮＡを合成した後、プライマー［ｋｒｔ２５プライマー（配列番号９と配列番号１０の組み合わせ）、ｋｒｔ２７プライマー（配列番号１１と配列番号１２の組み合わせ）、ｋｒｔ７１プライマー（配列番号１３と配列番号１４の組み合わせ）］にてＰＣＲを行うことにより、ケラチン遺伝子３種（ｋｒｔ２５、ｋｒｔ２７、ｋｒｔ７１）のｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲ条件は、９４℃１分した後、ｋｒｔ２５とｋｒｔ２７においては９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分 ３０サイクル、ｋｒｔ７１においては９４℃ ２分した後、９４℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃２分 ３０サイクルで目的のｃＤＮＡを増幅した。ｋｒｔ７１ ＰＣＲ産物はｐＣＲ−ｔｏｐｏ ベクター（インビトロジェン）にて挿入した。
【００４６】
内毛根鞘ケラチンをマウスからクローニングに使用したプライマーは以下の通りである。
ｋｒｔ２５プライマー（２種）
・（配列番号９、krt25-5'UTR1-F）5'-cacagttcagcgacacgcttgccc
・（配列番号１０、krt25-3'UTR1-R）5'-cacattgcatgccttgtcttcttt
ｋｒｔ２７プライマー（２種）
・（配列番号１１、krt27-5'UTR1-F）5'-agcactgcagagtgatcaccatgt
・（配列番号１２、krt27-3'UTR1-R）5'-tgaaactagagccgtctgctttag
ｋｒｔ７１プライマー（２種）
・（配列番号１３、krt71-5'-UTR-1）5'-cttcctcctgcacctttactccatcc
・（配列番号１４、krt71-3'-UTR-1）5'-tgagggatcgaggtcacaagaagc
【００４７】
ｋｒｔ７１ ＰＣＲ−ｔｏｐｏクローニング産物とｋｒｔ２５ ＰＣＲ増幅産物及びｋｒｔ２７ ＰＣＲ増幅産物は、ＴａＫａＲａ ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）にてタグ（Ｎ末端側にはＴ７タグ、Ｃ末端側にはＨＡタグ配列またはＮ末端側にはｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩタグ配列、Ｃ末端側にはＨＡタグ配列）付きケラチンＤＮＡ産物三種（ｋｒｔ２５、ｋｒｔ２７、ｋｒｔ７１）を９４℃ ３０秒、５７℃ ３０秒、７２℃ １分 ３０サイクルにて、以下の組み合わせのプライマーによって増幅させた。
【００４８】
・プライマーの組み合わせ
ＫＲＴ２５ Ｎ末端側にＴ７タグ配列、Ｃ末端側にＨＡタグ配列（配列番号１５と配列番号１６）
ＫＲＴ２７ Ｎ末端側にＴ７タグ配列、Ｃ末端側にＨＡタグ配列（配列番号１７と配列番号１８）
ＫＲＴ７１ Ｎ末端側にＴ７タグ、Ｃ末端側にＨＡタグ配列（配列番号１９と配列番号２０）
ＫＲＴ７１ Ｎ末端側にｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ、Ｃ末端側にＨＡタグ配列（配列番号１９と配列番号２１）
【００４９】
マウスからクローニングした内毛根鞘ケラチン遺伝子にタグ配列を付加させる際に使用したプライマーは以下の通りである。
・ｋｒｔ２５全長ｆｏｒｗａｒｄ側
（配列番号１５、T7-K25 pQCXIN-F）
5'-gggggcggccgcaccatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtatgtctcttcgcctttccag
・ｋｒｔ２５全長ｒｅｖｅｒｓｅ側
（配列番号１６、HA-K25-QCXIN-R）
5'-aaaagaattctcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtaattgctttgagatttctctt
・ｋｒｔ２７全長ｆｏｒｗａｒｄ側
（配列番号１７、T7-K27 pQCXIN-F）
5'-gggggcggccgcaccatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtatgtccgttcgcttttcttc
・ｋｒｔ２７全長ｒｅｖｅｒｓｅ側
（配列番号１８、HA-K27 pQCXIN-R）
5'-aaaagaattctcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtaagaagggatcctctgctcgg
・ｋｒｔ７１全長ｒｅｖｅｒｓｅ側
（配列番号１９、HA-K6irs1-QCKrt1）
5'-aaaagaattctcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtatcggccacctttcttggaggg
・ｋｒｔ７１全長ｆｏｒｗａｒｄ側
（配列番号２０、T7-K6irs1 pQCXIN）
5'-gggggcggccgcaccatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtatgagccgccaattcacctgc
・ｋｒｔ７１全長ｆｏｒｗａｒｄ側
（配列番号２１、strep-tagII-K6irs1 pQC）
5'-ggggggcggccgcctcgagaccatggctagctggagccacccgcagttcgaaaaaatgagccgccaattcacctgc
【００５０】
上記で得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ）で処理し、ＰＣＲ産物と同様な酵素処理をしたｐＱＣＸＩＮ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック）のマルチクローニングサイトに挿入することにより、組み換え発現ベクターを構築および遺伝子塩基配列を確認した後、宿主細胞であるＳＷ１３（増殖培地：ＦＣＳ １０％を添加したＬｅｉｂｏｖｉｚｔｓ Ｌ１５ 培地で培養したもの）にタグ付きｋｒｔ２５ベクターまたはｋｒｔ２７ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションにはリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いて添付の説明書に従って行った。トランスフェクション後は、Ｇ４１８ ６００ｎｇ／ｍｌを添加した培地で培養し、タグ付きＫＲＴ２５及びタグ付きＫＲＴ２７発現培養細胞（ケラチンタイプＩ発現細胞とする）を選択した。また、ＳＷ１３細胞にｋｒｔ７１をリポフェクトアミン２０００にて上記の手法で導入し、２日後までＳＷ１３増殖培地で培養した。培養細胞の観察は、検出する細胞を−２０℃に冷却したメタノールに浸した後、ＴｒｉｔｏｎＸを１％添加したＴＢＳにて洗浄した。この操作を２回繰り返した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク）でブロッキングした。その後、１／２０ ＴＢＳ希釈のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅにて希釈した抗タグ抗体［１／５００希釈 抗Ｔ７タグ抗体（ノバジェン）］溶液にて反応させた後、Ｔｗｅｅｎ ２０を１％添加したＴＢＳで２回洗浄し、１／２０ ＴＢＳ希釈のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅで希釈した蛍光付加２次抗体［１／１０００希釈 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（インビトロジェン）］で発色させた。なお、スライドガラスについて、ベクタシールド（ベクタ）にて、封入処理をし、カバーガラスを被せた。画像は、ＢｉｏＲａｄ社の共焦点レーザ顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２０００およびＬａｓｅｒＳｈａｒｐにより得た。ＳＷ１３にタグ付きタイプＩ内毛根鞘ケラチン（ＫＲＴ２５及びＫＲＴ２７）が安定的に発現する細胞株を抗Ｔ７タグまたはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（図１及び図２）、抗ＨＡタグ抗体（データは省略）を用いて免疫染色または核染色を試みた。しかし、検出出来なかったため抗ＨＡタグを用いて、ウエスタンブロッティングでタイプＩケラチンの確認を行った（図３）。タイプＩＩケラチンであるＫＲＴ７１をＳＷ１３細胞で発現させた後、Ｔ７タグ及びｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩで検出した図は、それぞれ図４及び図５に示した。なお、タイプＩＩケラチン単独で発現させたＳＷ１３細胞ではフィラメント状のケラチン繊維は正常に形成されなかったが、顆粒状のケラチン粒は検出された。
【実施例２】
【００５１】
実施例２ 内毛根鞘ケラチンタイプＩ及びタイプＩＩケラチンの細胞内での発現
ＳＷ１３細胞内でタイプＩ及びタイプＩＩ内毛根鞘ケラチンを発現させた細胞の挙動を確認するため、以下のとおり実験を行い、観察した。ＫＲＴ２５またはＫＲＴ２７が安定的に発現したＳＷ１３細胞にリポフェクトアミン２０００を用いて、ｐＱＣＸＩＮベクターに挿入したタグ付き（Ｔ７タグとＨＡタグまたはｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩとＨＡタグ）ｋｒｔ７１をトランスフェクションした。観察は、一次抗体として、１／５００希釈抗Ｔ７タグ抗体（または１／２００希釈抗ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ抗体）を用い、上記と同様の手法で、免疫染色または核染色を行った。その結果、実施例１のようにケラチン単独でトランスフェクションした場合とは異なり、タイプＩ及びタイプＩＩケラチン両方ともトランスフェクションした細胞ではフィラメント状のケラチンを確認した（図６〜１０）。
【実施例３】
【００５２】
実施例３ 内毛根鞘ケラチンタイプＩまたはタイプＩＩケラチン発現細胞内でのＡＨＦの発現
内毛根鞘ケラチンと相互作用すると予測されるタンパク質の解析のため、タイプＩケラチンが安定的に発現する細胞にタイプＩＩケラチンベクターをトランスフェクションしたＳＷ１３細胞にｐＡｄｅｎｏウイルスベクター（クロンテック）を用いてＡＨＦ遺伝子（ＤＮＡ配列については特開２００４−２６４０２４を参照のこと）を２日間感染させた。その後、一次抗体として、抗Ｔ７抗体及び抗ＡＨＦ抗体、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（インビトロジェン）とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（インビトロジェン）を用い、実施例１と同様な手法にて免疫染色を行った。その結果、ＡＨＦと内毛根鞘ケラチンフィラメントの局在が一致する箇所があり、ＡＨＦはＰＡＤ（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ）で修飾される前でもケラチンと相互作用することが明らかとなった（図１１〜図１３）。
【実施例４】
【００５３】
実施例４ ＳＷ１３細胞内でのＡＨＦとビメンチンの局在
実施例３の比較例として、ケラチンとは別種の中間系フィラメントであるビメンチンとＡＨＦとの局在を調査した。手法は、ｐＡｄｅｎｏベクターにてＳＷ１３細胞に導入したＡＨＦ遺伝子を実施例１と同様の手法で固定およびブロッキングし、一次抗体として抗ビメンチン抗体（１／２００ 希釈、シグマ）及び抗ＡＨＦ抗体（１／５００ 希釈）を使用し、蛍光標識付きの二次抗体で反応後、洗浄、封入し、観察を行った。その結果、実施例３とは異なり、ＡＨＦとビメンチンは局在が一致しなかった。このことから、ＡＨＦは、ケラチン特異的に相互作用するタンパク質であることが明らかとなった（図１４）。実施例３、４の結果より、本発明のケラチン発現細胞は、ケラチン及びケラチンと相互作用するタンパク質の局在を確認するツールとして極めて有効なものであること証明された。
【実施例５】
【００５４】
実施例５ ヒト内毛根鞘ケラチン発現細胞
ヒト内毛根鞘タイプＩケラチン［ヒトＫＲＴ２５（NCBI Entrez Gene ID 147183；配列番号２３）とヒトＫＲＴ２８（NCBI Entrez Gene ID 162605；配列番号７）］およびマウス内毛根鞘タイプＩＩケラチン［マウスｋｒｔ７１（NCBI Entrez GeneID 70810；配列番号８）］を含むプラスミドベクターをそれぞれ、リポフェクトアミン２０００でＳＷ１３細胞に導入し、３日間培養した。なお、ヒトＫＲＴ２５タンパク質とヒトＫＲＴ２８タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸を含むベクターとして、ＨａｌｏＴａｇ配列を含むｐＦＮ２１Ａベクターをプロメガ社より購入した［ＫＲＴ２５(Product ID; FHC05779L）、ＫＲＴ２８（Product ID; FHC05780L））。また、マウスｋｒｔ７１を含むベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子に組み換えたＴ７タグおよびＨＡタグ付きｐＱＣＸＩＮベクターに挿入したものである。培養後、マウス内毛根鞘タイプＩＩケラチンに対する一次抗体として１／５００希釈のＴ７タグ抗体、２次抗体として１／１０００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（インビトロジェン）を用いて、実施例１と同様な方法で免疫染色を行った。また、二次抗体で反応させる際に、タイプＩケラチンのＨａｌｏＴａｇに対する標識付きリガンド（１／２００希釈ＨａｌｏＴａｇ（商標）リガンド）を同時に添加した。
その結果、ＳＷ１３細胞内でヒトタイプＩケラチンおよびマウスタイプＩＩケラチン両方とも検出でき、局在が一致することを確認した(図１５および図１６)。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、上皮細胞のフィラメント構造に関するモデル細胞を提供することから、発毛に関する基礎分野に利用可能である。さらに、本発明は、発毛に有効な分子を探索する医薬品等の分野にも利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
SEQ ID NO:9: 5' primer for krt25
SEQ ID NO:10: 3' primer for krt25
SEQ ID NO:11: 5' primer for krt27
SEQ ID NO:12: 3' primer for krt27
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SEQ ID NO:14: 3' primer for krt71
SEQ ID NO:15: forward primer for T7-krt25
SEQ ID NO:16: reverse primer for HA-krt25
SEQ ID NO:17: forward primer for T7-krt27
SEQ ID NO:18: reverse primer for HA-krt27
SEQ ID NO:19: reverse primer for HA-krt71
SEQ ID NO:20: forward primer for T7-krt71
SEQ ID NO:21: forward primer for strep-tagII-krt71
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸および／または内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された細胞。
【請求項２】
前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号１に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号２に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と８７％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、請求項１記載の細胞。
【請求項４】
前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号３に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、請求項１記載の細胞。
【請求項５】
前記内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号４に示すタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、請求項１記載の細胞。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか１項記載の核酸、および請求項５記載の核酸が導入された、請求項１記載の細胞。
【請求項７】
さらにケラチン付随タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された、請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞。
【請求項８】
ケラチン付随タンパク質がＡＨＦである、請求項７記載の細胞。
【請求項９】
前記核酸のいずれかが標識された、請求項１〜８のいずれか１項記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が内在性ケラチンを持たない細胞である、請求項１〜９のいずれか１項記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞がＳＷ１３株である、請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
請求項２〜４のいずれか１項記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項５記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４】
発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（ａ）前記候補因子を請求項１〜１１のいずれか１項記載の細胞で発現させ、次いで
（ｂ）ケラチンフィラメントの形成について調べること
を特徴とする方法。
【請求項１５】
発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（ａ）前記候補因子を請求項１〜１１のいずれか１項記載の細胞に作用させ、次いで
（ｂ）ケラチンフィラメントの形成について調べること
を特徴とする方法。
【請求項１】
内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸および／または内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された細胞。
【請求項２】
前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号１に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２５と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号２に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と８７％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２７と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、請求項１記載の細胞。
【請求項４】
前記内毛根鞘特異的タイプＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号３に示すタイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩケラチンタンパク質ＫＲＴ２８と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、請求項１記載の細胞。
【請求項５】
前記内毛根鞘特異的タイプＩＩケラチンタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が、
（ａ）配列番号４に示すタイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸、あるいは
（ｂ）前記アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、タイプＩＩケラチンタンパク質ＫＲＴ７１と同等の性質を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸
である、請求項１記載の細胞。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか１項記載の核酸、および請求項５記載の核酸が導入された、請求項１記載の細胞。
【請求項７】
さらにケラチン付随タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する核酸が導入された、請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞。
【請求項８】
ケラチン付随タンパク質がＡＨＦである、請求項７記載の細胞。
【請求項９】
前記核酸のいずれかが標識された、請求項１〜８のいずれか１項記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が内在性ケラチンを持たない細胞である、請求項１〜９のいずれか１項記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞がＳＷ１３株である、請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
請求項２〜４のいずれか１項記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項５記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４】
発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（ａ）前記候補因子を請求項１〜１１のいずれか１項記載の細胞で発現させ、次いで
（ｂ）ケラチンフィラメントの形成について調べること
を特徴とする方法。
【請求項１５】
発毛に有効な候補因子をスクリーニングする方法であって、下記工程：
（ａ）前記候補因子を請求項１〜１１のいずれか１項記載の細胞に作用させ、次いで
（ｂ）ケラチンフィラメントの形成について調べること
を特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−８１９３６（Ｐ２０１０−８１９３６Ａ）
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０２７１５（Ｐ２００９−２０２７１５）
【出願日】平成２１年９月２日（２００９．９．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年７月１７日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／１２０７７９７６４／ａｂｓｔｒａｃｔ」に発表
【出願人】（３０５００７５５１）株式会社毛髪クリニックリーブ２１ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２日（２００９．９．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年７月１７日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／１２０７７９７６４／ａｂｓｔｒａｃｔ」に発表
【出願人】（３０５００７５５１）株式会社毛髪クリニックリーブ２１ (6)
【Ｆターム（参考）】
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