時間分解蛍光測定装置、及び方法
【課題】時間分解蛍光測定装置において、広い設置場所や煩雑な光軸調整を必要とすることなく、容易に光の分離数を増加させる。
【解決手段】測定対象物３０には、励起光が照射される。光学分離手段２１は、測定対象物３０から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離する。光学遅延手段２２は、分離された複数の部分光のそれぞれを、長さが相互に異なる複数の光ファイバを用いて相互に異なる遅延時間だけ遅延する。撮像手段２５は、光学遅延手段２２で遅延された複数の部分光のそれぞれの光強度を同時に所定時間幅の間だけ検出する。ＰＣ２６は、光検出手段での各部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【解決手段】測定対象物３０には、励起光が照射される。光学分離手段２１は、測定対象物３０から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離する。光学遅延手段２２は、分離された複数の部分光のそれぞれを、長さが相互に異なる複数の光ファイバを用いて相互に異なる遅延時間だけ遅延する。撮像手段２５は、光学遅延手段２２で遅延された複数の部分光のそれぞれの光強度を同時に所定時間幅の間だけ検出する。ＰＣ２６は、光検出手段での各部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時間分解蛍光測定装置及び方法に関し、更に詳しくは、時間領域測定法、特に時間ゲート法を用いて蛍光を測定する時間分解蛍光測定装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光を発する物質に可視光や紫外光を照射すると、蛍光が発することが知られている。蛍光を発する物質にパルス幅が短い光を照射すると、その照射後、ピコ秒からナノ秒オーダーにわたって蛍光が観察される。一般的に、この蛍光の発光強度は光照射直後で最大となり、その後、指数関数的に減衰していく。この指数関数における減衰定数が、蛍光寿命と呼ばれる。蛍光寿命を顕微鏡下で観測し、２次元的にマッピングを行う手法をＦＬＩＭ（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy）と呼ぶ。
【０００３】
ここで、蛍光寿命の特徴は、時間という定量性に優れた指標を基準にできることである。蛍光の特性を、蛍光の発光強度で定量化することもできるが、蛍光の発光強度は、蛍光を発する物質の濃度、退色、励起光の波長、強度、集光効率、検出器の感度、観測試料中での光の減衰、光学系の透過率など様々な要因による影響を受ける。一方、蛍光寿命は、測定条件に依存して変化し得る蛍光の発光強度とは異なり、蛍光を発する物質に固有な値となることから、定量的な議論が可能となる。蛍光寿命は、その分子の構造や電子状態に関し重要な情報を与えるほか、周囲の環境（イオン濃度、ｐＨ、酸素濃度、屈折率、粘性、温度など）に関する情報も提供する。
【０００４】
蛍光寿命を観測する方法は、大きく分けて２つある。１つは、パルス状の光を励起光に用いる時間領域測定法（time-domain measurement）であり、もう１つは、正弦波状に強度変調した光を励起光に用いる周波数領域測定法（frequency-domain measurement）である。時間領域測定法では、短パルスレーザを試料に入射し、その時間応答を高速な検出器で観測する。時間領域測定法における代表的な観測方法として、時間相関単一光子計数法（time-correlated single photon counting：ＴＣＳＰＣ）や、イメージインテンシファイア付きＣＣＤを用いた時間ゲート法、ストリークカメラを用い、時空間変換によってスペクトルと時間波形を一度に観測する手法が挙げられる。これらの方法に、アレイタイプの高感度検出器やスキャナミラーを組み合わせることで、蛍光寿命のマッピング、つまりイメージングが可能となる。
【０００５】
時間ゲート法では、蛍光発光の減衰曲線を時間軸方向にいくつかのウィンドウに分割し、パルス光を試料に照射した後、測定すべきウィンドウ（時間領域）に応じた遅延時間で検出器を一瞬だけオンにする。複数のウィンドウで蛍光の検出を行い、各ウィンドウ内の積分発光強度の値を時間に対してプロットし、積分発光強度が単一指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。時間ゲート法は、時間相関単一光子計数法に比べ、測定時間を短縮できる。しかし、例えば時間領域を４分割したと仮定した場合、４つのウィンドウのそれぞれにおいて積分発光強度を求めるためには、同一の測定箇所に対して最低でも４回測定を行うことが必要である。このため、例えば細胞などの時々刻々と変化するサンプルに対して、同一時刻での蛍光寿命測定は困難であった。また、何度もパルス光を照射することで蛍光物質の退色が生じ、また、測定箇所が細胞であれば細胞が損傷するなどの問題もあった。
【０００６】
上記問題点に対し、特許文献１には、一度の励起光で単一蛍光減衰曲線の２つのウィンドウにおける積分発光強度を測定する方法が開示されている。引用文献１に記載の時間分解イメージング装置は、光学分離系と、光学遅延系と、合成光学系とを有する。光学分離系は、測定対象で発生した蛍光を、第１の光と第２の光とに分離して出力する。光学分離系には、偏光解消板と偏光ビームスプリッターとが用いられる。測定対象で発生した蛍光は、偏光解消板により４５°の直線偏光又は円偏光となって偏光ビームスプリッターに入射する。偏光ビームスプリッターは、入射光のＳ成分を反射し、Ｐ成分を透過することで、第１の光と第２の光とを分離する。
【０００７】
第１の光は光学遅延系を介して合成光学系に出力され、第２の光はそのまま合成光学系に出力される。光学遅延系は、第１の光に対して、第２の光の光路長に比して長い光路長を設定する。合成光学系は、光学分離系が出力する第２の光、及び光学遅延系を通った第１の光それぞれが形成する測定対象の像を、結像面上の互いに重ならない領域に合成し、合成した像を撮像部に出力する。第１の光は光学遅延系で遅延が与えられた分だけ遅れるため、撮像部において、第１の光と第２の光とを同時刻に撮像することで、２つの時間領域における積分発光強度を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平９−４３１４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１では、一度の励起光で２つの時間領域における蛍光発光強度を検出でき、２つの時間領域における蛍光発光強度を用いて蛍光寿命を求めることができる。従って、光退色による蛍光強度の減少の影響を低減することができる。しかしながら、特許文献１では、蛍光減衰曲線を２点で近似し、単一指数関数と仮定して数値解析するため、蛍光が多成分を含むとき、それらを分離して蛍光寿命を求めることはできない。また、多成分を含む蛍光の蛍光寿命を、平均的な蛍光寿命として測定しても、大きな誤差が生じることになる。
【００１０】
特許文献１において、分離する光の数を２つから３以上に増やすことを考えると、光学分離系で蛍光を３以上の光に分離するためには、偏光解消板と偏光ビームスプリッターとの組を、複数段並べて使用する必要があり、広い設置面積が必要となる。また、分離する光の数が増える分だけ、光軸調整が煩雑になる。更に、蛍光は、多段階に配置された偏光解消板と偏光ビームスプリッターとの組を通る必要があり、各組の偏光解消板及び偏光ビームスプリッターにおいて蛍光の吸収や散乱が生じる。このため、段数が増えるほど、光の利用効率が下がるという問題もある。
【００１１】
本発明は、上記に鑑み、広い設置場所や煩雑な光軸調整を必要とすることなく、容易に光の分離数を増加させることができる時間分解蛍光測定装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、所定の波長の光を励起光として測定対象物に照射する光照射手段と、前記測定対象物から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離する光学分離手段と、前記分離された複数の部分光のそれぞれを、長さが相互に異なる複数の光ファイバを用いて相互に異なる遅延時間だけ遅延する光学遅延手段と、前記光学遅延手段で遅延された前記複数の部分光のそれぞれの光強度を同時に所定時間幅の間だけ検出する光検出手段と、前記光検出手段での各部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段とを備えたことを特徴とする時間分解蛍光測定装置を提供する。
【００１３】
本発明の時間分解蛍光測定装置では、前記光検出手段が、前記蛍光の相互に異なる時間領域に対応する時間領域の前記部分光を検出する構成とすることができる。
【００１４】
本発明の時間分解蛍光測定装置では、前記光ファイバが、コネクタを介して前記前記光学分離手段及び前記光検出手段に着脱可能に取り付けられる構成を採用できる。
【００１５】
前記光学分離手段は、前記測定対象物から発せられた蛍光の光スポット内に配置される複数のマイクロレンズを含むことができる。
【００１６】
前記光学分離手段が、前記測定対象物から発せられた蛍光を３以上の部分光に分離するものとすることができる。
【００１７】
前記光検出器は、ゲート機能を有するイメージインテンシファイアと電荷撮像素子とを含むことができる。
【００１８】
前記蛍光寿命算出手段は、前記光検出手段での前記複数の部分光の検出結果に基づいて複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度を求め、該求められた蛍光発光強度に基づいて前記蛍光寿命を算出してもよい。
【００１９】
前記蛍光寿命算出手段は、記複数の部分光間での光量の差、及び前記複数の光学遅延手段間での前記部分光の損失の差の少なくとも一方を補正した上で前記蛍光寿命を算出することができる。
【００２０】
本発明の時間分解蛍光測定装置は、前記励起光を前記測定対象物の表面上で走査する走査手段と、前記走査された励起光の各位置に対応する前記蛍光の発光強度、及び前記算出された蛍光寿命の少なくとも一方の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段とを更に備える構成とすることができる。
【００２１】
前記走査手段は、前記測定対象物の表面上に加えて、前記測定対象物上の前記励起光の集光位置を深さ方向にも走査し、前記蛍光画像生成手段は、前記蛍光画像を３次元情報として生成してもよい。
【００２２】
本発明は、本発明の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする顕微鏡システムを提供する。
【００２３】
また本発明は、本発明の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする内視鏡ファイバプローブシステムを提供する。
【００２４】
本発明は、更に、所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射するステップと、前記測定対象物から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離するステップと、前記分離された複数の部分光を、相互に異なる遅延時間だけ遅延するステップと、前記光学遅延手段で遅延された複数の部分光それぞれの強度を、所定時間幅の間だけ同時に検出するステップと、前記部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出するステップとを有することを特徴とする時間分解蛍光測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の時間分解蛍光測定装置及び方法では、レンズを用いて蛍光を複数の部分光に分離し、分離された複数の部分光を、長さが相互に異なる光ファイバを用いて相互に異なる遅延時間だけ遅延する。異なる遅延時間で遅延された複数の部分光を同時に所定時間幅で検出することで、複数の時間領域における蛍光発光強度を検出することができる。本発明においては、蛍光を部分光に分離する際にレンズを用いており、光スポット内に配置されるレンズの数を変えることで部分光の数を任意に増加させることができる。このため、広い設置面積を必要とすることなく、部分光の数を増加させることができる。また、本発明では光ファイバを用いて各部分光を遅延しており、部分光の数を増やしたいときは、それに応じて光ファイバの数を増やせばよい。このため、占有スペースを増大させることなく、遅延光路を追加できる。更に、本発明においては、レンズにより分離された部分光を光ファイバに入射する部分の光軸調整を行えばよく、煩雑な光軸調整を必要とせずに、容易に光の分離数を増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の位置実施形態の時間分解蛍光測定装置を示すブロック図。
【図２】蛍光寿命測定の動作手順を示すフローチャート。
【図３Ａ】光ファイバの入射端における各部分光の減衰特性を示す図。
【図３Ｂ】光ファイバの出射端における各部分光の減衰特性を示す図。
【図４】顕微鏡システムを示すブロック図。
【図５】内視鏡プローブシステムを示すブロック図。
【図６】内視鏡プローブの断面を示す斜視図。
【図７】光学分離手段と光学遅延手段との接続部分を示す斜視図。
【図８】光学分離手段と光学遅延手段との接続部分の別例を示す斜視図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、図面を参照し、本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明の一実施形態の時間分解蛍光測定装置を示す。時間分解蛍光測定装置１０は、レーザ光源１１、パルスピッカー１２、ミラー１３、ビームスプリッター１４、励起光検出手段１５、非線形光学結晶１６、ダイクロイックミラー１７、対物レンズ１８、励起光除去フィルター１９、分光器２０、光学分離手段２１、光学遅延手段２２、ゲート手段２３、ゲート制御手段２４、撮像手段２５、及びコンピュータ（ＰＣ：Personal Computer）２６を備える。
【００２８】
時間分解蛍光測定装置１０は、時間ゲート法を用いて蛍光寿命を求める。すなわち、蛍光発光の減衰曲線を数分割のウィンドウ（時間領域）に分割し、励起光としてパルス光を試料に照射した後、複数のウィンドウにおいて蛍光発光強度を検出し、各ウィンドウ内の蛍光発光強度の値（積分値）を時間に対してプロットし、積分発光強度が指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。なお、測定対象の光は、測定対象物から発せられた蛍光のみに限定されるわけではなく、それと類似した特徴を持つ光、例えばりん光でもよい。つまり、時間分解蛍光測定装置１０を用いてりん光の寿命を求めてもよい。
【００２９】
レーザ光源１１は、試料である測定対象物３０に照射される所定波長の励起光を生成する。レーザ光源１１には、例えばＴｉＳａレーザなどを用いることができる。レーザ光源１１は、パルス的なレーザ光を生成する。レーザ光源１１は、例えばピコ秒からフェムト秒のパルス時間であるパルス光をパルス励起光として生成する。パルスピッカー１２は、例えばレーザ光源１１が周期的に生成するパルス励起光を所定の割合で間引く。パルスピッカー１２がパルス励起光を間引くことで、測定対象物３０に所望の周期でパルス励起光を照射できる。レーザ光源１１がパルス励起光を生成する周期が所望の周期となっている場合、パルスピッカー１２は省いてもよい。
【００３０】
ビームスプリッター１４は、パルス励起光の一部を反射し、残りを透過する。励起光検出手段１５は、ビームスプリッター１４で反射した光を検出する。励起光検出手段１５にはフォトダイオードなどを用いることができる。非線形光学結晶１６は、ビームスプリッター１４を透過した光を入射し、入射光の波長の第２高調波又は第３高調波を発生する。ダイクロイックミラー１７は、励起光の波長帯域の光を透過し、測定対象物３０から発せられた蛍光の波長帯域の光を反射する。
【００３１】
対物レンズ１８は、ダイクロイックミラー１７を透過した励起光を、測定対象物３０上の所望の箇所に集光する。また対物レンズ１８は、測定対象物３０の励起光が照射された箇所で発生した蛍光を励起光とは逆向きに入射し、平行光化して出射する。励起光除去フィルター１９及び分光器２０は、入射光から、励起光の波長帯域の光を除去する。光学分離手段２１は、測定対象物から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離する。光学遅延手段２２は、分離された複数の部分光のそれぞれを、相互に異なる遅延時間だけ遅延する。
【００３２】
撮像手段２５は、光学分離手段２１で分離され、光学遅延手段２２で相互に異なる遅延時間だけ遅延された各部分光を検出する。ゲート手段２３は、光学遅延手段２２と撮像手段２５との間に配置され、光学遅延手段２２が出射する各部分光を、所定時間幅の間だけ撮像手段２５側に出射する。撮像手段２５は、遅延された複数の部分光のそれぞれの光強度を所定時間幅の間だけ同時に検出する。ゲート制御手段２４は、ゲート手段２３を駆動制御する。ＰＣ２６は、ゲート制御手段２４に対する制御指示、及び撮像手段２５の駆動などを行う。またＰＣ２６は、撮像手段２５での各部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００３３】
励起光照射から蛍光寿命算出までの一連の動作について説明する。レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、ミラー１３で反射して進行方向を変え、ビームスプリッター１４に入射して一部が反射し、残りがビームスプリッター１４を透過する。ビームスプリッター１４を透過した光は、測定対象物３０に照射される励起光となる。一方、ビームスプリッター１４で反射した光は、励起光が照射された旨を検出するために使用される。励起光検出手段１５は、ビームスプリッター１４で反射した光を検出し、励起光が検出された旨を表す信号をＰＣ２６に伝達する。ＰＣ２６は、励起光が検出された旨を表す信号を、測定の開始信号として用いる。
【００３４】
ビームスプリッター１４を透過した励起光は、非線形光学結晶１６に入射する。非線形光学結晶１６は、入射光の波長の第２高調波又は第３高調波を発生する。非線形光学結晶１６を出射した励起光は、ダイクロイックミラー１７に入射する。ダイクロイックミラー１７は、励起光の波長（波長帯域）の光を対物レンズ１８側に透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した励起光は、対物レンズ１８により、測定対象物３０の所望の箇所に集光される。なお、レーザ光源１１から対物レンズ１８に至る光路に配置された各部は、励起光を測定対象物３０に照射する励起光照射手段に相当する。
【００３５】
測定対象物３０の励起光が照射された箇所では、蛍光が発生する。測定対象物３０から発せされた蛍光は、対物レンズ１８を励起光とは逆向きに通り、ダイクロイックミラー１７に平行光として入射する。ダイクロイックミラー１７は入射した蛍光を反射し、その反射光は、励起光除去フィルター１９及び分光器２０に入射して、必要な波長のみが取りだされる。分光器２０に代えて、ローパスフィルターやバンドパスフィルターを用いてもよい。必要な波長成分が取り出された蛍光は、光学分離手段２１で、複数の部分光に分離される。
【００３６】
光学分離手段２１は、例えば分光器２０側から入射する蛍光の光スポット内に配置される複数のマイクロレンズを含む。光学分離手段２１に入射した光は、複数のマイクロレンズにより、各マイクロレンズの領域に対応した複数の部分光に分離される。光学分離手段２１が有するマイクロレンズの数、すなわち光学分離手段２１が分離する部分光の数は、３つ以上が好ましい。光学分離手段２１は、例えば９つのマイクロレンズが正方行列状に配置された３×３のマイクロレンズアレイとして構成される。その場合、光学分離手段２１は、蛍光を９つの部分光に分離する。各マイクロレンズは、蛍光の対応する領域の光を集光し、その光を光学遅延手段２２の入射端側に向けて出射する。
【００３７】
光学遅延手段２２は、例えば長さが相互に異なる複数の光ファイバを含む。光学遅延手段２２の入射端側から光ファイバに入射した部分光は、光ファイバを通る際に遅延が生じ、その出射光は、光ファイバの長さに応じた時間だけ遅延される。各部分光は、長さが異なる光ファイバを通ることで、異なる遅延時間だけ遅れて出射端から出射する。
【００３８】
ゲート手段２３は、光学遅延手段２２で遅延された複数の部分光を、時間ゲート法の１ウィンドウの時間幅に対応した所定時間幅の間だけ撮像手段２５側に出射する。ゲート手段２３は、光を増強する機能を持っていてもよい。例えばゲート手段２３に、ゲート機能付きのイメージインテンシファイアを用いることもできる。ゲート手段２３は、例えば光学分離手段２１で分離された部分光の数に対応した数のゲート機能付きイメージインテンシファイアを有する。例えば光学分離手段２１が３×３のマイクロレンズを有し、９つの部分光を出射するとき、ゲート手段２３は、各部分光に対応した３×３のゲート機能付きイメージインテンシファイアを有する。
【００３９】
撮像手段２５は、ゲート手段２３を介して各部分光を受光する。撮像手段２５は、例えば光学分離手段２１で分離された部分光の数に対応した数の電荷撮像素子（ＣＣＤイメージセンサ：Charge Coupled Device Image Sensor））を有する。例えば、光学分離手段２１が３×３のマイクロレンズを有し、９つの部分光を出射するとき、撮像手段２５は、各部分光に対応した３×３のＣＣＤを有する。ゲート手段２３が３×３のゲート機能付きイメージインテンシファイアを有するとき、各ＣＣＤは、対応するゲート機能付きイメージインテンシファイアを介して部分光を受光する。ゲート手段２３及び撮像手段２５は、測定対象物３０から発せられた蛍光を検出するための光検出手段に相当する。蛍光は、１つ又は複数の波長の蛍光として検出されてもよい。
【００４０】
ＰＣ２６は、励起光検出手段１５から励起光を検出した旨の信号を受け取ると、撮像手段２５を駆動する。またＰＣ２６は、信号を受け取った時点から所定時間の経過後に、ゲート制御手段２４を介し、所定時間幅だけ部分光をゲート手段２３から撮像手段２５側に出射させる。ゲート手段２３は、例えば９つのゲート機能付きイメージインテンシファイアから、同時に各部分光を出射する。撮像手段２５は、例えば９つのＣＣＤで、各ゲート機能付きイメージインテンシファイアから出射した光を同時に検出する。各部分光には異なる遅延時間が与えられているため、９つのＣＣＤは、相互に異なる時間領域における蛍光を検出することになる
【００４１】
ＰＣ２６は、蛍光寿命算出手段としても機能し、撮像手段２５で検出された各部分光の光強度に基づいて、蛍光寿命を算出する。より詳細には、ＰＣ２６は、各部分光の検出結果に基づいて、複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度を求め、求めた蛍光発光強度に基づいて蛍光寿命を算出する。
【００４２】
なお、光学分離手段２１にて蛍光を複数の部分光に分離するとき、蛍光のどの部分を分離するかに応じて、複数の部分光の光量の間に差が生じることがある。例えば光学分離手段２１にて３×３のマイクロレンズアレイを用いた場合、分離された９つの部分光のうち、蛍光の光スポットの中心に対応するマイクロレンズで分離された部分光の光量が最も多く、その他のマイクロレンズで分離された部分光の光量は、中心から分離された部分光の光量よりも少なくなる。部分光の光量の差が無視できない程度存在する場合、ＰＣ２６は、光学分離手段２１で分離された複数の部分光間での光量の差を補正した上で、蛍光寿命を算出すればよい。また、各部分光は長さが異なる光ファイバを通り、各部分光には、光ファイバの長さに応じた損失が生じる。ＰＣ２６は、必要に応じて、部分光の損失の差を補正した上で、蛍光寿命を算出すればよい。石英ファイバの場合、損失は１ｋｍで数％程度である。
【００４３】
図２は、蛍光寿命測定の動作手順を示す。レーザ光源１１は、パルス励起光を出射する（ステップＳ１）。このパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で間引かれた後、ミラー１３で反射してビームスプリッター１４に入射する。ビームスプリッター１４はパルス励起光の一部を反射し、残りを測定対象物３０方向に透過する。ビームスプリッター１４を透過した励起光は、非線形光学結晶１６及びダイクロイックミラー１７を通り、対物レンズ１８により測定対象物３０の所望の箇所に集光される。このとき測定対象物３０に照射される励起光は点光源であるとする。
【００４４】
測定対象物３０の励起光が照射された箇所では蛍光が発生する（ステップＳ２）。この蛍光は、対物レンズ１８を逆向きに通り、ダイクロイックミラー１７で反射し、励起光除去フィルター１９及び分光器２０を通って励起光の成分が除去される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、不所望な成分が除去された後、光学分離手段２１で複数の部分光に分離される。光学遅延手段２２は、分離された複数の部分光に対して、相互に異なる遅延時間を与える（ステップＳ３）。
【００４５】
一方、ビームスプリッター１４で反射した励起パルス光の一部は励起光検出手段１５に入射し、励起光検出手段１５は、励起光が照射された旨を検出する。励起光検出手段１５は、ＰＣ２６に励起光照射を検出した旨を通知し、ＰＣ２６は、励起光照射から所定時間の経過後に、ゲート制御手段２４に対して、部分光の出射を指示する。ゲート制御手段２４は、ゲート手段２３に対して信号を与え、光学遅延手段２２を介して入射する各部分光を、撮像手段２５側に、指定時間幅だけ同時に出射させる。撮像手段２５は、遅延された複数の部分光を同時に検出する（ステップＳ４）。
【００４６】
ＰＣ２６は、撮像手段２５における部分光の検出結果を演算処理し、蛍光減衰曲線と蛍光寿命の値とを計算する（ステップＳ５）。ＰＣ２６は、ステップＳ５において各部分光の検出光強度を時間軸に対してプロットし、積分発光強度が指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。部分光の分離数を増やすことで、時間ゲート法におけるウィンドウ分割数を増やすことができ、検出光強度の時間軸に対するプロット数を増やすことができる。ウィンドウ分割数を増やすことで、多成分解析も可能となる。
【００４７】
続いて、光学遅延手段２２について詳細に説明する。ここでは、一例として、光学遅延手段２２に、３×３の光ファイバ（遅延光路）を用いるものとして説明を行う。光学分離手段２１は、３×３のマイクロレンズアレイを有しているものとする。測定対象物３０から発せられた蛍光は平行光として分光器２０に入射し、分光器２０で必要な波長のみが取り出されて光学分離手段２１に入射する。光学分離手段２１は、３×３のマイクロレンズアレイにより、測定対象物３０から発せられた蛍光を、３×３の９つの部分光に分離する。分離された９つの部分光は、対応する光ファイバを透過し、出射端からゲート手段２３に出射する。
【００４８】
図３Ａは、光ファイバの入射端における各部分光の減衰特性を示す。図３Ａには、光ファイバ１から光ファイバ９までの９つの光ファイバに入射する部分光の、入射端における光強度と時間との関係が示されている。図３Ａにおいて、紙面向って左上の減衰特性は光ファイバ１の入射端での部分光に対応し、右下は光ファイバ９の入射端での部分光に対応している。各部分光は、測定対象物の蛍光から分離された光であるため、各部分光の時間軸に対する減衰特性は、理論上、蛍光の減衰特性と同一である。このため、蛍光から分離された９つの部分光の減衰特性は、基本的に同一の特性を示す。図３Ａ中に斜線で示す領域は、各部分光において、蛍光発光強度の検出を行うべき時間領域（ウィンドウ）を表している。
【００４９】
図３Ｂは、光ファイバの出射端における各部分光の減衰特性を示す。遅延光路として働く光ファイバの長さは相互に異なるため、光ファイバの出射端における部分光の減衰特性の時間軸は、光ファイバの長さに応じて遅れる。図３Ｂでは、光ファイバ１のファイバ長がもっと長く、以降順次にファイバ長が短くなっていき、光ファイバ９のファイバ長が最も短い。ファイバ長がもっと短い光ファイバ９を透過した部分光に対し、光ファイバ１〜８を透過した部分光はそれぞれ遅れ、それら部分光の減衰特性は、透過した光ファイバの長さ（遅延時間）の差の分だけ、光ファイバ９を透過した部分光の減衰特性に対して紙面向って右方向（時間が遅れる方向）にずれる。
【００５０】
各部分光は、ゲート手段２３に対して、図３Ｂに示す減衰特性で入射する。各部分光の減衰特性の時間軸は互いにずれているため、ゲート手段２３により、時間軸上のある時間領域だけ各部分光を通過させれば、一度のゲート通過のみで、蛍光減衰曲線の複数の時間領域の積分光強度を得ることができる。例えば、９つの部分光のうち、遅延光路（遅延時間）が最も長い光ファイバを透過した部分光がゲート手段２３に到達した後に、ゲート手段２３が所定時間幅だけ各部分光を撮像手段２５に通過させる。このようにすることで、撮像手段２５において、図３Ｂにおいて斜線で示す９つの時間領域における積分光強度を、一度のゲート通過で検出することができる。部分光の光強度が不十分な場合は、何度か励起して、蛍光強度を更に積算すればよい。
【００５１】
ここで、蛍光発光強度（部分光の光強度）の測定期間は、測定対象物に依存して変化し得る蛍光寿命の長さに応じて適宜設定すればよい。また、光学遅延手段２２にて各部分光をどの程度遅延させるかは、時間ゲート法における各ウィンドウを測定期間内のどの時間領域に割り当てるかに応じて適宜設定すればよい。例えば、蛍光発光強度を、測定期間にわたって等間隔で並ぶ９つのウィンドウで測定する場合、光学遅延手段２２において、最も短い遅延時間を基準にそこから測定期間の１／９ずつ順次に長くなる遅延時間で各部分光を遅延させればよい。
【００５２】
例えば屈折率が１の９つの光ファイバを用いて、蛍光発光強度（蛍光減衰曲線）を４５ｎｓｅｃの時間範囲で測定することを考える。各部分光は、屈折率１の媒質中を１秒間におよそ３０万ｋｍ進むことができる。ここから計算すると、各部分光が５ｎｓｅｃの時間で屈折率が１の光ファイバを進む距離はおよそ１．５ｍとなる。従って、光ファイバの長さを１．５ｍずつ変えると、光ファイバにおける遅延時間を５ｎｓｅｃずつ変えることができる。蛍光が光ファイバの長さ差分を進む時間は、時間ゲート法におけるウィンドウ間の時間差に対応する。上記の例では、ファイバ長を１．５ｍずつ変えることで、４５ｎｓｅｃの測定期間において、時間ゲート法におけるウィンドウを５ｎｓｅｃずつずらした９つのウィンドウで、蛍光寿命の測定が可能である。
【００５３】
図３Ｂに示す減衰特性が得られる光ファイバのセットを考えると、光ファイバ１〜８のファイバ長さは、ファイバ長が最も短い光ファイバ９のファイバ長から１．５ｍずつ長くなっていればよい。光ファイバ９のファイバ長を基準とすると、光ファイバ８のファイバ長はそれよりも１．５ｍ長く、光ファイバ７のファイバ長はそれより更に１．５ｍ長くなる。まとめると、各光ファイバのファイバ長は、光ファイバ９のファイバ長をＬとして、以下に示すようになる。
光ファイバ１：Ｌ＋１２．０ｍ
光ファイバ２：Ｌ＋１０．５ｍ
光ファイバ３：Ｌ＋９．０ｍ
光ファイバ４：Ｌ＋７．５ｍ
光ファイバ５：Ｌ＋６．０ｍ
光ファイバ６：Ｌ＋４．５ｍ
光ファイバ７：Ｌ＋３．０ｍ
光ファイバ８：Ｌ＋１．５ｍ
光ファイバ９：Ｌ
上記とは異なる長さの光ファイバのセットを用いることで、４５ｎｓｅｃとは異なる測定時間に対応することが可能である。
【００５４】
本実施形態では、光学分離手段２１は、レンズを用いて蛍光を複数の部分光に分離し、光学遅延手段２２は、部分光のそれぞれを、長さが相互に異なる複数の光ファイバを用いて相互に異なる遅延時間だけ遅延し、撮像手段２５は、異なる遅延時間で遅延された複数の部分光を同時に所定時間幅で検出する。本実施形態では、レンズを用いて蛍光を複数の部分光へ分離しており、光スポット内に配置されるレンズの数を変えることで、部分光の数を任意に増加させることができる。
【００５５】
特許文献１においては、蛍光の分離数を増加させるためには、複数の偏光解消板と偏光ビームスプリッターとの組を並べて配置する必要があり、広い設置面積が必要であった。本実施形態では、レンズの数を変えるだけで部分光の数を増やすことができ、広い設置面積を必要とすることなく、部分光の数を増加させることができる。また、本実施形態では、部分光の数を増やしたときでも、それに応じて光ファイバの数を増やせばよく、占有スペースを増大させることなく、遅延光路を追加できる。
【００５６】
また、本実施形態では、レンズにより分離された部分光を光ファイバに入射する部分の光軸調整を行えばよく、煩雑な光軸調整を必要とせずに、容易に光の分離数を増加させることができる。更に、特許文献１では多段階に偏光解消板と偏光ビームスプリッターとの組を配置する必要があり、その場合、各段において光の吸収や散乱が生じることから、段数を増やすほど光利用効率が悪化する。本実施形態では、分離数を増やすために多段階に偏光解消板と偏光ビームスプリッターとの組を配置する必要がなく、特許文献１に比して光利用効率を向上することができる。
【００５７】
ここで、通常の時間ゲート法において、例えば３つのウィンドウで積分蛍光発光強度を求めるためには、励起光パルスを最低でも３回照射する必要があった。本実施形態では、光学分離手段２１で蛍光を３以上の分割し、光学遅延手段２２で３以上の部分光をそれぞれ異なる遅延時間で遅延し、撮像手段２５で遅延された３以上の部分光を所定時間幅だけ同時に検出することで、最低限１回の励起光パルス照射で、３以上のウィンドウにおいて積分蛍光発光強度を求めることができる。本実施形態では、最低１つの励起光パルスで測定を完了できるため、細胞などの時々刻々と変化する試料の同一時刻での蛍光寿命測定が可能である。また、１パルス又は少ないパルス数で測定が可能であるため、光退色の影響を抑えることができる。
【００５８】
特許文献１では、時間領域の分割数が２つであるため、蛍光減衰曲線のフィッティング数が少なく、多成分の解析も困難であった。本実施形態では、例えば光学分離手段２１に３×３のマイクロレンズアレイを用いることで、蛍光を９つの部分光に分離することができ、最低限一度の励起光照射で、９つの時間領域における蛍光発光強度を検出することができる。更に光学分離手段２１に４×４のマイクロレンズアレイを用いることで、３×３のマイクロレンズアレイを用いる場合に比して、より多くの時間領域における蛍光発光強度を検出することができ、蛍光減衰曲線の近似の精度を上げることができる。マイクロレンズアレイにおけるマイクロレンズの配列数を５×５、６×６と増やしていくほど、更に近似の精度を向上できる。部分光の分離数を増やすほど、時間ゲート法におけるウィンドウの数を増やすことができ、蛍光減衰曲線をフィッティングする点の数を増やして、解析の精度を向上することができる。また、蛍光減衰曲線のフィッティング数を増やすことで、多成分の解析も可能となる。
【００５９】
本実施形態では、遅延光路に光ファイバを用いている。特許文献１では、遅延光路中に多数のミラーやレンズを配置しており、遅延時間を調整する際には、ミラーやレンズの位置、レンズの焦点距離などを適切に調整する必要があった。このため、容易に遅延時間を変更することができなかった。これに対し、本実施形態では、各光ファイバの長さを調整することで、簡易に部分光の遅延時間を調整することができる。例えば、複数の測定期間に対応して、複数の光ファイバの組を用意しておき、ターゲットとする蛍光に応じて光ファイバの組を付け替えて使用することも可能である。
【００６０】
なお、光学分離手段２１において、マイクロレンズの配置の仕方は任意であり、必ずしもマイクロレンズが正方行列状に配置されている必要はない。例えば光スポットの縦方向と横方向とで、マイクロレンズを配列する数が異なっていてもよい。また、マイクロレンズのピッチを行ごとに例えば１／２ずつずらして配置することもできる。マイクロレンズは、測定対象物から発せられた蛍光が、できるだけ多く部分光として分離されるように配置されることが好ましい。つまり、測定対象物から発せられた蛍光の光量と、分離された複数の部分光の光量の合計との差ができるだけ小さいことが好ましい。
【００６１】
時間分解蛍光測定装置１０は、図１に示す構成に加えて、測定対象物３０上で励起光の照射位置を走査する走査手段を有していてもよい。走査手段は、測定対象物３０の表面上で、例えば点光源である励起光の照射位置を互いに直交するｘ方向とｙ方向との２方向に走査する。走査手段には、例えばガルバノミラー、ポリゴンミラー、レゾナントミラー、ピエゾステージなどを用いることができる。ＰＣ２６（蛍光寿命算出手段）は、走査された各位置において、蛍光発光強度（減衰特性）と蛍光寿命とを求める。
【００６２】
ＰＣ２６は、蛍光寿命算出手段としての機能に加えて、走査された励起光の各位置に対応する蛍光の発光強度の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段として機能してもよい。ＰＣ２６は、蛍光発光強度に代えて、走査された各位置に対応して算出された蛍光寿命の分布を表す画像を蛍光画像として生成してもよい。または、ＰＣ２６は、発光強度と蛍光寿命の双方の分布を表す画像を蛍光画像として生成してもよい。ＰＣ２６は、生成した蛍光画像を、例えばディスプレイなどの表示装置に表示する。
【００６３】
上記の走査手段は、測定対象物３０の表面だけでなく、測定対象物３０に対する励起光の集光位置を深さ方向に走査してもよい。深さ方向の走査には、ピエゾステージ又は集光レンズ（対物レンズ１８）を用いることができる。蛍光寿命測定手段は、測定対象物の表面上の各位置だけではなく、深さ方向に走査された各位置についても、蛍光発光強度（減衰特性）と蛍光寿命とを求めればよい。また、蛍光画像生成手段は、測定対象物３０の表面上の２方向に深さ方向を加えて、蛍光画像を３次元情報として生成すればよい。
【００６４】
次いで、上記の時間分解蛍光計測装置を組み込んだ顕微鏡システムを説明する。図４は、顕微鏡システムを示す。顕微鏡システム１００の構成は、図１に示す時間分解蛍光測定装置１０を構成する手段のうちの一部が顕微鏡１０１に組み込まれている点を除けば、基本的に時間分解蛍光測定装置１０の構成と同様である。
【００６５】
レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で所望の繰り返し周波数に間引かれ、ミラー１３を介してビームスプリッター１４に入射し、２つの光に分離される。分離された光のうちの一方は、ビームスプリッター１４で反射して励起光検出手段１５に向かう。分離された光の他方は非線形光学結晶１６に入射し、非線形光学結晶１６により入射波長の第２高調波又は第３高調波が発生する。
【００６６】
非線形光学結晶１６により第２高調波又は第３高調波が発生した励起光は、顕微鏡１０１に導入される。導入された励起光は、励起フィルター１０２を介してダイクロイックミラー１７に入射し、ダイクロイックミラー１７を透過して、対物レンズ１８により、測定対象物３０の所望の箇所に照射される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、対物レンズ１８により平行光化され、ダイクロイックミラー１７を透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した光は、励起光除去フィルター１９を通り、ミラー１０３で反射して、顕微鏡１０１の外部に出射する。
【００６７】
顕微鏡１０１から出射した光は、分光器２０で分光され、光学分離手段２１で複数の部分光に分離される。分離された複数の部分光は、光学遅延手段２２においてそれぞれ異なる遅延時間だけ遅延される。異なる遅延時間で遅延された複数の部分光は、ゲート手段２３を介して、撮像手段２５で同時に検出される。ＰＣ２６は、撮像手段２５における複数の部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００６８】
励起光に点光源を用いる場合、励起光を、ガルバノミラー、ポリゴンミラー、レゾナントミラー、ピエゾステージなどの走査手段を用いて測定対象物３０の表面上を２次元走査すれば、２次元的に蛍光減衰曲線を得ることができ、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光にライン光源を用いる場合、励起光を１方向に走査することで、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光に面光源を用いる場合、走査手段を用いなくても、蛍光寿命の２次元画像を得ることができる。表面上の２方向に加えて、測定対象物３０に励起光を集光する集光レンズ又はピエゾステージにより深さ方向（Ｚ軸方向）にも走査を行うことで、３次元画像情報を得ることができる。
【００６９】
引き続き、上記の時間分解蛍光計測装置を組み込んだ内視鏡プローブシステムを説明する。図５は、内視鏡プローブシステムを示す。内視鏡プローブシステム２００の構成は、図１に示す時間分解蛍光測定装置１０を構成する手段のうちの一部が内視鏡プローブ装置２０１に組み込まれている点を除けば、基本的に時間分解蛍光測定装置１０の構成と同様である。
【００７０】
レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で所望の繰り返し周波数に間引かれ、ミラー１３を介してビームスプリッター１４に入射し、２つの光に分離される。分離された光のうちの一方は、ビームスプリッター１４で反射して励起光検出手段１５に向かう。分離された光の他方は非線形光学結晶１６に入射し、非線形光学結晶１６により入射波長の第２高調波又は第３高調波が発生する。
【００７１】
非線形光学結晶１６により第２高調波又は第３高調波が発生した励起光は、内視鏡プローブ装置２０１に導入される。導入された励起光は、励起フィルター２０２を介してダイクロイックミラー１７に入射し、ダイクロイックミラー１７を透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した励起光は、光ファイバ２０３を介して内視鏡プローブ２０４に導かれ、内視鏡プローブ２０４の先端から測定対象物３０の所望の箇所に照射される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、内視鏡プローブ２０４を逆向きに通り、光ファイバ２０３を経てダイクロイックミラー１７に入射する。
【００７２】
図６は、内視鏡プローブ２０４の断面を示す。内視鏡プローブ２０４は、内視鏡の鉗子口を通して、測定対象物３０である患部へと到達する。内視鏡プローブ２０４は、中央に形成された光ファイバ２０６と、周囲に形成された複数の光ファイバ２０７とを有する。中央に形成された光ファイバ２０６は、励起光を測定対象物３０（図５）まで導光する入射用として機能する。周囲に形成された複数の光ファイバ２０７は、測定対象物３０から発せられた蛍光を受光し、光ファイバ２０３側へ導光するための受光用として機能する。
【００７３】
図５に戻り、光ファイバ２０３側からダイクロイックミラー１７に入射した光は、励起光除去フィルター１９を通り、ミラー２０５で反射して、内視鏡プローブ装置２０１の外部に出射する。内視鏡プローブ装置２０１から出射した光は、分光器２０で分光され、光学分離手段２１で複数の部分光に分離される。分離された複数の部分光は、光学遅延手段２２においてそれぞれ異なる遅延時間だけ遅延される。異なる遅延時間で遅延された複数の部分光は、ゲート手段２３を介して、撮像手段２５で同時に検出される。ＰＣ２６は、撮像手段２５における複数の部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００７４】
励起光に点光源を用いる場合、励起光を、内視鏡先端設けたＭＥＭＳスキャナミラーなどの走査手段を用いて測定対象物３０の表面上を２次元走査すれば、２次元的に蛍光減衰曲線を得ることができ、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。また、ファイバハンドルなどで、測定対象物３０からの信号を２次元的に受光することで、２次元的に蛍光減衰曲線を得てもよい。励起光にライン光源を用いる場合、励起光を１方向に走査することで、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光に面光源を用いる場合、走査手段を用いなくても、蛍光寿命の２次元画像を得ることができる。表面上の２方向に加えて、測定対象物３０に励起光を集光する集光レンズなどにより深さ方向（Ｚ軸方向）にも走査を行うことで、３次元画像情報を得ることができる。
【００７５】
ここで、光学遅延手段２２は、光学分離手段２１との接続点、及びゲート手段２３との接続点にコネクタを有し、遅延光路を構成する光ファイバが着脱可能となっている構成を採用することができる。図７は、光学分離手段２１と光学遅延手段２２との接続部分を示す。図７においては、分光器２０（図１）と光学分離手段２１とが、１つのボックス５０内に収められている。励起光除去フィルター１９の出射光は、光ファイバ５１を介してボックス５０内の分光器２０に入射する。光ファイバ５１を用いて励起光除去フィルター１９の出射光を分光器２０に入射する構成は、特に、顕微鏡システム１００（図５）や内視鏡プローブシステム２００（図６）のように、顕微鏡１０１や内視鏡プローブ装置２０１から蛍光を取り出す構成において有効であると考えられる。
【００７６】
ボックス５０内に収められた光学分離手段２１は、３×３のマイクロレンズアレイを含むものとする。コネクタ５２は、光学遅延手段２２を構成する光ファイバ５３を取り付けるためのコネクタ部分である。コネクタ５２は、３×３の部分光に対応して、３×３の接続部分（光出射端子）を有する。各端子には、光ファイバ５３が着脱可能である。光学遅延手段２２とゲート手段２３との接続部分も、コネクタ５２と同様な構成になっている。コネクタ５２には、蛍光寿命測定時間に応じて、任意のファイバ長の光ファイバ５３を接続することができる。蛍光測定時間が異なる蛍光の蛍光寿命測定を行う場合は、コネクタ５２から光ファイバ５３を抜き、別の光ファイバ５３を挿入すればよい。長さが異なるファイバを付け替えれば、蛍光減衰曲線の測定時間領域を自由に変えることが可能である。
【００７７】
図８は、光学分離手段２１と光学遅延手段２２との接続部分の別例を示す。図７においては、光ファイバ５３が１本単位で着脱可能となっていた。これに代えて、例えば９本の光ファイバをコネクタ５４にまとめ、ボックス５０側のコネクタ５２と、光ファイバ５３側のコネクタ５４とを接続するようにしてもよい。例えば、複数の蛍光寿命測定期間に応じて、９本の光ファイバの組を複数個用意しておく。各組では、光ファイバのファイバ長の差分が異なる。蛍光寿命測定に際しては、用意しておいた複数の光ファイバの組のうち、ターゲットとなる蛍光の蛍光寿命に応じた蛍光寿命測定期間に対応した組を使用すればよい。
【００７８】
以下、実施例を説明する。メタノールを溶媒とし、アントラセンを溶かして５．０×１０−６ｍｏｌ／Ｌの溶液を作った。この溶液を、１０ｍｍ角の密閉可能な石英セルに適量入れ、窒素バブリングにより溶存酸素を除去した後に石英セルに後蓋をし、励起波長を３２５ｎｍ、蛍光波長を３６０〜５００ｎｍとして、時間分解蛍光測定装置１０（図１）を用いて蛍光寿命測定を行った。
【００７９】
蛍光減衰曲線は５０ｎｓｅｃ程度の時間範囲で測定し、光学遅延手段２２には屈折率が１．５の石英ガラスからなるファイバを４本用いた。光は、屈折率が１．５の媒質中を１秒間におよそ２０万ｋｍ進むことができる。ここから計算すると、光ファイバ中を進行する光が１２．５ｎｓｅｃ（１２．５ｎｓｅｃ×４＝５０ｎｓｅｃ）の時間で進む距離は、およそ２．５ｍとなる。５０ｎｓｅｃの測定期間で蛍光寿命を測定するために、４本の光ファイバの長さは２．５ｍずつ異なるように設定した。より詳細には、最もファイバ長が短いファイバ４の長さを１ｍとして、ファイバ３のファイバ長を１ｍ＋２．５ｍ、ファイバ２の長さを１ｍ＋５．０ｍ、ファイバ１の長さを１ｍ＋７．５ｍに設定した。
【００８０】
上記の装置を用い、時間ゲート法によるアントラセンの蛍光寿命測定を行った。時間軸に対して４点のプロットが得られ、この４点をフィッティングすることで、アントラセンの蛍光寿命はおよそ５．１ｎｓｅｃと求められた。
【００８１】
以上、本発明をその好適な実施形態に基づいて説明したが、本発明の時間分解蛍光測定装置及び方法は、上記実施形態にのみ限定されるものではなく、上記実施形態の構成から種々の修正及び変更を施したものも、本発明の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００８２】
１０：時間分解蛍光測定装置
１１：レーザ光源
１２：パルスピッカー
１３：ミラー
１４：ビームスプリッター
１５：励起光検出手段
１６：非線形光学結晶
１７：ダイクロイックミラー
１８：対物レンズ
１９：励起光除去フィルター
２０：分光器
２１：光学分離手段
２２：光学遅延手段
２３：ゲート手段
２４：ゲート制御手段
２５：撮像手段
２６：コンピュータ（ＰＣ）
３０：測定対象物
５０：ボックス
５１、５３：光ファイバ
５２、５４：コネクタ
１００：顕微鏡システム
１０１：顕微鏡
１０２：励起フィルター
１０３：ミラー
２００：内視鏡プローブシステム
２０１：内視鏡プローブ装置
２０２：励起フィルター
２０３：光ファイバ
２０４：内視鏡プローブ
２０５：ミラー
２０６、２０７：光ファイバ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時間分解蛍光測定装置及び方法に関し、更に詳しくは、時間領域測定法、特に時間ゲート法を用いて蛍光を測定する時間分解蛍光測定装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光を発する物質に可視光や紫外光を照射すると、蛍光が発することが知られている。蛍光を発する物質にパルス幅が短い光を照射すると、その照射後、ピコ秒からナノ秒オーダーにわたって蛍光が観察される。一般的に、この蛍光の発光強度は光照射直後で最大となり、その後、指数関数的に減衰していく。この指数関数における減衰定数が、蛍光寿命と呼ばれる。蛍光寿命を顕微鏡下で観測し、２次元的にマッピングを行う手法をＦＬＩＭ（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy）と呼ぶ。
【０００３】
ここで、蛍光寿命の特徴は、時間という定量性に優れた指標を基準にできることである。蛍光の特性を、蛍光の発光強度で定量化することもできるが、蛍光の発光強度は、蛍光を発する物質の濃度、退色、励起光の波長、強度、集光効率、検出器の感度、観測試料中での光の減衰、光学系の透過率など様々な要因による影響を受ける。一方、蛍光寿命は、測定条件に依存して変化し得る蛍光の発光強度とは異なり、蛍光を発する物質に固有な値となることから、定量的な議論が可能となる。蛍光寿命は、その分子の構造や電子状態に関し重要な情報を与えるほか、周囲の環境（イオン濃度、ｐＨ、酸素濃度、屈折率、粘性、温度など）に関する情報も提供する。
【０００４】
蛍光寿命を観測する方法は、大きく分けて２つある。１つは、パルス状の光を励起光に用いる時間領域測定法（time-domain measurement）であり、もう１つは、正弦波状に強度変調した光を励起光に用いる周波数領域測定法（frequency-domain measurement）である。時間領域測定法では、短パルスレーザを試料に入射し、その時間応答を高速な検出器で観測する。時間領域測定法における代表的な観測方法として、時間相関単一光子計数法（time-correlated single photon counting：ＴＣＳＰＣ）や、イメージインテンシファイア付きＣＣＤを用いた時間ゲート法、ストリークカメラを用い、時空間変換によってスペクトルと時間波形を一度に観測する手法が挙げられる。これらの方法に、アレイタイプの高感度検出器やスキャナミラーを組み合わせることで、蛍光寿命のマッピング、つまりイメージングが可能となる。
【０００５】
時間ゲート法では、蛍光発光の減衰曲線を時間軸方向にいくつかのウィンドウに分割し、パルス光を試料に照射した後、測定すべきウィンドウ（時間領域）に応じた遅延時間で検出器を一瞬だけオンにする。複数のウィンドウで蛍光の検出を行い、各ウィンドウ内の積分発光強度の値を時間に対してプロットし、積分発光強度が単一指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。時間ゲート法は、時間相関単一光子計数法に比べ、測定時間を短縮できる。しかし、例えば時間領域を４分割したと仮定した場合、４つのウィンドウのそれぞれにおいて積分発光強度を求めるためには、同一の測定箇所に対して最低でも４回測定を行うことが必要である。このため、例えば細胞などの時々刻々と変化するサンプルに対して、同一時刻での蛍光寿命測定は困難であった。また、何度もパルス光を照射することで蛍光物質の退色が生じ、また、測定箇所が細胞であれば細胞が損傷するなどの問題もあった。
【０００６】
上記問題点に対し、特許文献１には、一度の励起光で単一蛍光減衰曲線の２つのウィンドウにおける積分発光強度を測定する方法が開示されている。引用文献１に記載の時間分解イメージング装置は、光学分離系と、光学遅延系と、合成光学系とを有する。光学分離系は、測定対象で発生した蛍光を、第１の光と第２の光とに分離して出力する。光学分離系には、偏光解消板と偏光ビームスプリッターとが用いられる。測定対象で発生した蛍光は、偏光解消板により４５°の直線偏光又は円偏光となって偏光ビームスプリッターに入射する。偏光ビームスプリッターは、入射光のＳ成分を反射し、Ｐ成分を透過することで、第１の光と第２の光とを分離する。
【０００７】
第１の光は光学遅延系を介して合成光学系に出力され、第２の光はそのまま合成光学系に出力される。光学遅延系は、第１の光に対して、第２の光の光路長に比して長い光路長を設定する。合成光学系は、光学分離系が出力する第２の光、及び光学遅延系を通った第１の光それぞれが形成する測定対象の像を、結像面上の互いに重ならない領域に合成し、合成した像を撮像部に出力する。第１の光は光学遅延系で遅延が与えられた分だけ遅れるため、撮像部において、第１の光と第２の光とを同時刻に撮像することで、２つの時間領域における積分発光強度を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平９−４３１４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１では、一度の励起光で２つの時間領域における蛍光発光強度を検出でき、２つの時間領域における蛍光発光強度を用いて蛍光寿命を求めることができる。従って、光退色による蛍光強度の減少の影響を低減することができる。しかしながら、特許文献１では、蛍光減衰曲線を２点で近似し、単一指数関数と仮定して数値解析するため、蛍光が多成分を含むとき、それらを分離して蛍光寿命を求めることはできない。また、多成分を含む蛍光の蛍光寿命を、平均的な蛍光寿命として測定しても、大きな誤差が生じることになる。
【００１０】
特許文献１において、分離する光の数を２つから３以上に増やすことを考えると、光学分離系で蛍光を３以上の光に分離するためには、偏光解消板と偏光ビームスプリッターとの組を、複数段並べて使用する必要があり、広い設置面積が必要となる。また、分離する光の数が増える分だけ、光軸調整が煩雑になる。更に、蛍光は、多段階に配置された偏光解消板と偏光ビームスプリッターとの組を通る必要があり、各組の偏光解消板及び偏光ビームスプリッターにおいて蛍光の吸収や散乱が生じる。このため、段数が増えるほど、光の利用効率が下がるという問題もある。
【００１１】
本発明は、上記に鑑み、広い設置場所や煩雑な光軸調整を必要とすることなく、容易に光の分離数を増加させることができる時間分解蛍光測定装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、所定の波長の光を励起光として測定対象物に照射する光照射手段と、前記測定対象物から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離する光学分離手段と、前記分離された複数の部分光のそれぞれを、長さが相互に異なる複数の光ファイバを用いて相互に異なる遅延時間だけ遅延する光学遅延手段と、前記光学遅延手段で遅延された前記複数の部分光のそれぞれの光強度を同時に所定時間幅の間だけ検出する光検出手段と、前記光検出手段での各部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段とを備えたことを特徴とする時間分解蛍光測定装置を提供する。
【００１３】
本発明の時間分解蛍光測定装置では、前記光検出手段が、前記蛍光の相互に異なる時間領域に対応する時間領域の前記部分光を検出する構成とすることができる。
【００１４】
本発明の時間分解蛍光測定装置では、前記光ファイバが、コネクタを介して前記前記光学分離手段及び前記光検出手段に着脱可能に取り付けられる構成を採用できる。
【００１５】
前記光学分離手段は、前記測定対象物から発せられた蛍光の光スポット内に配置される複数のマイクロレンズを含むことができる。
【００１６】
前記光学分離手段が、前記測定対象物から発せられた蛍光を３以上の部分光に分離するものとすることができる。
【００１７】
前記光検出器は、ゲート機能を有するイメージインテンシファイアと電荷撮像素子とを含むことができる。
【００１８】
前記蛍光寿命算出手段は、前記光検出手段での前記複数の部分光の検出結果に基づいて複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度を求め、該求められた蛍光発光強度に基づいて前記蛍光寿命を算出してもよい。
【００１９】
前記蛍光寿命算出手段は、記複数の部分光間での光量の差、及び前記複数の光学遅延手段間での前記部分光の損失の差の少なくとも一方を補正した上で前記蛍光寿命を算出することができる。
【００２０】
本発明の時間分解蛍光測定装置は、前記励起光を前記測定対象物の表面上で走査する走査手段と、前記走査された励起光の各位置に対応する前記蛍光の発光強度、及び前記算出された蛍光寿命の少なくとも一方の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段とを更に備える構成とすることができる。
【００２１】
前記走査手段は、前記測定対象物の表面上に加えて、前記測定対象物上の前記励起光の集光位置を深さ方向にも走査し、前記蛍光画像生成手段は、前記蛍光画像を３次元情報として生成してもよい。
【００２２】
本発明は、本発明の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする顕微鏡システムを提供する。
【００２３】
また本発明は、本発明の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする内視鏡ファイバプローブシステムを提供する。
【００２４】
本発明は、更に、所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射するステップと、前記測定対象物から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離するステップと、前記分離された複数の部分光を、相互に異なる遅延時間だけ遅延するステップと、前記光学遅延手段で遅延された複数の部分光それぞれの強度を、所定時間幅の間だけ同時に検出するステップと、前記部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出するステップとを有することを特徴とする時間分解蛍光測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の時間分解蛍光測定装置及び方法では、レンズを用いて蛍光を複数の部分光に分離し、分離された複数の部分光を、長さが相互に異なる光ファイバを用いて相互に異なる遅延時間だけ遅延する。異なる遅延時間で遅延された複数の部分光を同時に所定時間幅で検出することで、複数の時間領域における蛍光発光強度を検出することができる。本発明においては、蛍光を部分光に分離する際にレンズを用いており、光スポット内に配置されるレンズの数を変えることで部分光の数を任意に増加させることができる。このため、広い設置面積を必要とすることなく、部分光の数を増加させることができる。また、本発明では光ファイバを用いて各部分光を遅延しており、部分光の数を増やしたいときは、それに応じて光ファイバの数を増やせばよい。このため、占有スペースを増大させることなく、遅延光路を追加できる。更に、本発明においては、レンズにより分離された部分光を光ファイバに入射する部分の光軸調整を行えばよく、煩雑な光軸調整を必要とせずに、容易に光の分離数を増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の位置実施形態の時間分解蛍光測定装置を示すブロック図。
【図２】蛍光寿命測定の動作手順を示すフローチャート。
【図３Ａ】光ファイバの入射端における各部分光の減衰特性を示す図。
【図３Ｂ】光ファイバの出射端における各部分光の減衰特性を示す図。
【図４】顕微鏡システムを示すブロック図。
【図５】内視鏡プローブシステムを示すブロック図。
【図６】内視鏡プローブの断面を示す斜視図。
【図７】光学分離手段と光学遅延手段との接続部分を示す斜視図。
【図８】光学分離手段と光学遅延手段との接続部分の別例を示す斜視図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、図面を参照し、本発明の実施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明の一実施形態の時間分解蛍光測定装置を示す。時間分解蛍光測定装置１０は、レーザ光源１１、パルスピッカー１２、ミラー１３、ビームスプリッター１４、励起光検出手段１５、非線形光学結晶１６、ダイクロイックミラー１７、対物レンズ１８、励起光除去フィルター１９、分光器２０、光学分離手段２１、光学遅延手段２２、ゲート手段２３、ゲート制御手段２４、撮像手段２５、及びコンピュータ（ＰＣ：Personal Computer）２６を備える。
【００２８】
時間分解蛍光測定装置１０は、時間ゲート法を用いて蛍光寿命を求める。すなわち、蛍光発光の減衰曲線を数分割のウィンドウ（時間領域）に分割し、励起光としてパルス光を試料に照射した後、複数のウィンドウにおいて蛍光発光強度を検出し、各ウィンドウ内の蛍光発光強度の値（積分値）を時間に対してプロットし、積分発光強度が指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。なお、測定対象の光は、測定対象物から発せられた蛍光のみに限定されるわけではなく、それと類似した特徴を持つ光、例えばりん光でもよい。つまり、時間分解蛍光測定装置１０を用いてりん光の寿命を求めてもよい。
【００２９】
レーザ光源１１は、試料である測定対象物３０に照射される所定波長の励起光を生成する。レーザ光源１１には、例えばＴｉＳａレーザなどを用いることができる。レーザ光源１１は、パルス的なレーザ光を生成する。レーザ光源１１は、例えばピコ秒からフェムト秒のパルス時間であるパルス光をパルス励起光として生成する。パルスピッカー１２は、例えばレーザ光源１１が周期的に生成するパルス励起光を所定の割合で間引く。パルスピッカー１２がパルス励起光を間引くことで、測定対象物３０に所望の周期でパルス励起光を照射できる。レーザ光源１１がパルス励起光を生成する周期が所望の周期となっている場合、パルスピッカー１２は省いてもよい。
【００３０】
ビームスプリッター１４は、パルス励起光の一部を反射し、残りを透過する。励起光検出手段１５は、ビームスプリッター１４で反射した光を検出する。励起光検出手段１５にはフォトダイオードなどを用いることができる。非線形光学結晶１６は、ビームスプリッター１４を透過した光を入射し、入射光の波長の第２高調波又は第３高調波を発生する。ダイクロイックミラー１７は、励起光の波長帯域の光を透過し、測定対象物３０から発せられた蛍光の波長帯域の光を反射する。
【００３１】
対物レンズ１８は、ダイクロイックミラー１７を透過した励起光を、測定対象物３０上の所望の箇所に集光する。また対物レンズ１８は、測定対象物３０の励起光が照射された箇所で発生した蛍光を励起光とは逆向きに入射し、平行光化して出射する。励起光除去フィルター１９及び分光器２０は、入射光から、励起光の波長帯域の光を除去する。光学分離手段２１は、測定対象物から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離する。光学遅延手段２２は、分離された複数の部分光のそれぞれを、相互に異なる遅延時間だけ遅延する。
【００３２】
撮像手段２５は、光学分離手段２１で分離され、光学遅延手段２２で相互に異なる遅延時間だけ遅延された各部分光を検出する。ゲート手段２３は、光学遅延手段２２と撮像手段２５との間に配置され、光学遅延手段２２が出射する各部分光を、所定時間幅の間だけ撮像手段２５側に出射する。撮像手段２５は、遅延された複数の部分光のそれぞれの光強度を所定時間幅の間だけ同時に検出する。ゲート制御手段２４は、ゲート手段２３を駆動制御する。ＰＣ２６は、ゲート制御手段２４に対する制御指示、及び撮像手段２５の駆動などを行う。またＰＣ２６は、撮像手段２５での各部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００３３】
励起光照射から蛍光寿命算出までの一連の動作について説明する。レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、ミラー１３で反射して進行方向を変え、ビームスプリッター１４に入射して一部が反射し、残りがビームスプリッター１４を透過する。ビームスプリッター１４を透過した光は、測定対象物３０に照射される励起光となる。一方、ビームスプリッター１４で反射した光は、励起光が照射された旨を検出するために使用される。励起光検出手段１５は、ビームスプリッター１４で反射した光を検出し、励起光が検出された旨を表す信号をＰＣ２６に伝達する。ＰＣ２６は、励起光が検出された旨を表す信号を、測定の開始信号として用いる。
【００３４】
ビームスプリッター１４を透過した励起光は、非線形光学結晶１６に入射する。非線形光学結晶１６は、入射光の波長の第２高調波又は第３高調波を発生する。非線形光学結晶１６を出射した励起光は、ダイクロイックミラー１７に入射する。ダイクロイックミラー１７は、励起光の波長（波長帯域）の光を対物レンズ１８側に透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した励起光は、対物レンズ１８により、測定対象物３０の所望の箇所に集光される。なお、レーザ光源１１から対物レンズ１８に至る光路に配置された各部は、励起光を測定対象物３０に照射する励起光照射手段に相当する。
【００３５】
測定対象物３０の励起光が照射された箇所では、蛍光が発生する。測定対象物３０から発せされた蛍光は、対物レンズ１８を励起光とは逆向きに通り、ダイクロイックミラー１７に平行光として入射する。ダイクロイックミラー１７は入射した蛍光を反射し、その反射光は、励起光除去フィルター１９及び分光器２０に入射して、必要な波長のみが取りだされる。分光器２０に代えて、ローパスフィルターやバンドパスフィルターを用いてもよい。必要な波長成分が取り出された蛍光は、光学分離手段２１で、複数の部分光に分離される。
【００３６】
光学分離手段２１は、例えば分光器２０側から入射する蛍光の光スポット内に配置される複数のマイクロレンズを含む。光学分離手段２１に入射した光は、複数のマイクロレンズにより、各マイクロレンズの領域に対応した複数の部分光に分離される。光学分離手段２１が有するマイクロレンズの数、すなわち光学分離手段２１が分離する部分光の数は、３つ以上が好ましい。光学分離手段２１は、例えば９つのマイクロレンズが正方行列状に配置された３×３のマイクロレンズアレイとして構成される。その場合、光学分離手段２１は、蛍光を９つの部分光に分離する。各マイクロレンズは、蛍光の対応する領域の光を集光し、その光を光学遅延手段２２の入射端側に向けて出射する。
【００３７】
光学遅延手段２２は、例えば長さが相互に異なる複数の光ファイバを含む。光学遅延手段２２の入射端側から光ファイバに入射した部分光は、光ファイバを通る際に遅延が生じ、その出射光は、光ファイバの長さに応じた時間だけ遅延される。各部分光は、長さが異なる光ファイバを通ることで、異なる遅延時間だけ遅れて出射端から出射する。
【００３８】
ゲート手段２３は、光学遅延手段２２で遅延された複数の部分光を、時間ゲート法の１ウィンドウの時間幅に対応した所定時間幅の間だけ撮像手段２５側に出射する。ゲート手段２３は、光を増強する機能を持っていてもよい。例えばゲート手段２３に、ゲート機能付きのイメージインテンシファイアを用いることもできる。ゲート手段２３は、例えば光学分離手段２１で分離された部分光の数に対応した数のゲート機能付きイメージインテンシファイアを有する。例えば光学分離手段２１が３×３のマイクロレンズを有し、９つの部分光を出射するとき、ゲート手段２３は、各部分光に対応した３×３のゲート機能付きイメージインテンシファイアを有する。
【００３９】
撮像手段２５は、ゲート手段２３を介して各部分光を受光する。撮像手段２５は、例えば光学分離手段２１で分離された部分光の数に対応した数の電荷撮像素子（ＣＣＤイメージセンサ：Charge Coupled Device Image Sensor））を有する。例えば、光学分離手段２１が３×３のマイクロレンズを有し、９つの部分光を出射するとき、撮像手段２５は、各部分光に対応した３×３のＣＣＤを有する。ゲート手段２３が３×３のゲート機能付きイメージインテンシファイアを有するとき、各ＣＣＤは、対応するゲート機能付きイメージインテンシファイアを介して部分光を受光する。ゲート手段２３及び撮像手段２５は、測定対象物３０から発せられた蛍光を検出するための光検出手段に相当する。蛍光は、１つ又は複数の波長の蛍光として検出されてもよい。
【００４０】
ＰＣ２６は、励起光検出手段１５から励起光を検出した旨の信号を受け取ると、撮像手段２５を駆動する。またＰＣ２６は、信号を受け取った時点から所定時間の経過後に、ゲート制御手段２４を介し、所定時間幅だけ部分光をゲート手段２３から撮像手段２５側に出射させる。ゲート手段２３は、例えば９つのゲート機能付きイメージインテンシファイアから、同時に各部分光を出射する。撮像手段２５は、例えば９つのＣＣＤで、各ゲート機能付きイメージインテンシファイアから出射した光を同時に検出する。各部分光には異なる遅延時間が与えられているため、９つのＣＣＤは、相互に異なる時間領域における蛍光を検出することになる
【００４１】
ＰＣ２６は、蛍光寿命算出手段としても機能し、撮像手段２５で検出された各部分光の光強度に基づいて、蛍光寿命を算出する。より詳細には、ＰＣ２６は、各部分光の検出結果に基づいて、複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度を求め、求めた蛍光発光強度に基づいて蛍光寿命を算出する。
【００４２】
なお、光学分離手段２１にて蛍光を複数の部分光に分離するとき、蛍光のどの部分を分離するかに応じて、複数の部分光の光量の間に差が生じることがある。例えば光学分離手段２１にて３×３のマイクロレンズアレイを用いた場合、分離された９つの部分光のうち、蛍光の光スポットの中心に対応するマイクロレンズで分離された部分光の光量が最も多く、その他のマイクロレンズで分離された部分光の光量は、中心から分離された部分光の光量よりも少なくなる。部分光の光量の差が無視できない程度存在する場合、ＰＣ２６は、光学分離手段２１で分離された複数の部分光間での光量の差を補正した上で、蛍光寿命を算出すればよい。また、各部分光は長さが異なる光ファイバを通り、各部分光には、光ファイバの長さに応じた損失が生じる。ＰＣ２６は、必要に応じて、部分光の損失の差を補正した上で、蛍光寿命を算出すればよい。石英ファイバの場合、損失は１ｋｍで数％程度である。
【００４３】
図２は、蛍光寿命測定の動作手順を示す。レーザ光源１１は、パルス励起光を出射する（ステップＳ１）。このパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で間引かれた後、ミラー１３で反射してビームスプリッター１４に入射する。ビームスプリッター１４はパルス励起光の一部を反射し、残りを測定対象物３０方向に透過する。ビームスプリッター１４を透過した励起光は、非線形光学結晶１６及びダイクロイックミラー１７を通り、対物レンズ１８により測定対象物３０の所望の箇所に集光される。このとき測定対象物３０に照射される励起光は点光源であるとする。
【００４４】
測定対象物３０の励起光が照射された箇所では蛍光が発生する（ステップＳ２）。この蛍光は、対物レンズ１８を逆向きに通り、ダイクロイックミラー１７で反射し、励起光除去フィルター１９及び分光器２０を通って励起光の成分が除去される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、不所望な成分が除去された後、光学分離手段２１で複数の部分光に分離される。光学遅延手段２２は、分離された複数の部分光に対して、相互に異なる遅延時間を与える（ステップＳ３）。
【００４５】
一方、ビームスプリッター１４で反射した励起パルス光の一部は励起光検出手段１５に入射し、励起光検出手段１５は、励起光が照射された旨を検出する。励起光検出手段１５は、ＰＣ２６に励起光照射を検出した旨を通知し、ＰＣ２６は、励起光照射から所定時間の経過後に、ゲート制御手段２４に対して、部分光の出射を指示する。ゲート制御手段２４は、ゲート手段２３に対して信号を与え、光学遅延手段２２を介して入射する各部分光を、撮像手段２５側に、指定時間幅だけ同時に出射させる。撮像手段２５は、遅延された複数の部分光を同時に検出する（ステップＳ４）。
【００４６】
ＰＣ２６は、撮像手段２５における部分光の検出結果を演算処理し、蛍光減衰曲線と蛍光寿命の値とを計算する（ステップＳ５）。ＰＣ２６は、ステップＳ５において各部分光の検出光強度を時間軸に対してプロットし、積分発光強度が指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を求める。部分光の分離数を増やすことで、時間ゲート法におけるウィンドウ分割数を増やすことができ、検出光強度の時間軸に対するプロット数を増やすことができる。ウィンドウ分割数を増やすことで、多成分解析も可能となる。
【００４７】
続いて、光学遅延手段２２について詳細に説明する。ここでは、一例として、光学遅延手段２２に、３×３の光ファイバ（遅延光路）を用いるものとして説明を行う。光学分離手段２１は、３×３のマイクロレンズアレイを有しているものとする。測定対象物３０から発せられた蛍光は平行光として分光器２０に入射し、分光器２０で必要な波長のみが取り出されて光学分離手段２１に入射する。光学分離手段２１は、３×３のマイクロレンズアレイにより、測定対象物３０から発せられた蛍光を、３×３の９つの部分光に分離する。分離された９つの部分光は、対応する光ファイバを透過し、出射端からゲート手段２３に出射する。
【００４８】
図３Ａは、光ファイバの入射端における各部分光の減衰特性を示す。図３Ａには、光ファイバ１から光ファイバ９までの９つの光ファイバに入射する部分光の、入射端における光強度と時間との関係が示されている。図３Ａにおいて、紙面向って左上の減衰特性は光ファイバ１の入射端での部分光に対応し、右下は光ファイバ９の入射端での部分光に対応している。各部分光は、測定対象物の蛍光から分離された光であるため、各部分光の時間軸に対する減衰特性は、理論上、蛍光の減衰特性と同一である。このため、蛍光から分離された９つの部分光の減衰特性は、基本的に同一の特性を示す。図３Ａ中に斜線で示す領域は、各部分光において、蛍光発光強度の検出を行うべき時間領域（ウィンドウ）を表している。
【００４９】
図３Ｂは、光ファイバの出射端における各部分光の減衰特性を示す。遅延光路として働く光ファイバの長さは相互に異なるため、光ファイバの出射端における部分光の減衰特性の時間軸は、光ファイバの長さに応じて遅れる。図３Ｂでは、光ファイバ１のファイバ長がもっと長く、以降順次にファイバ長が短くなっていき、光ファイバ９のファイバ長が最も短い。ファイバ長がもっと短い光ファイバ９を透過した部分光に対し、光ファイバ１〜８を透過した部分光はそれぞれ遅れ、それら部分光の減衰特性は、透過した光ファイバの長さ（遅延時間）の差の分だけ、光ファイバ９を透過した部分光の減衰特性に対して紙面向って右方向（時間が遅れる方向）にずれる。
【００５０】
各部分光は、ゲート手段２３に対して、図３Ｂに示す減衰特性で入射する。各部分光の減衰特性の時間軸は互いにずれているため、ゲート手段２３により、時間軸上のある時間領域だけ各部分光を通過させれば、一度のゲート通過のみで、蛍光減衰曲線の複数の時間領域の積分光強度を得ることができる。例えば、９つの部分光のうち、遅延光路（遅延時間）が最も長い光ファイバを透過した部分光がゲート手段２３に到達した後に、ゲート手段２３が所定時間幅だけ各部分光を撮像手段２５に通過させる。このようにすることで、撮像手段２５において、図３Ｂにおいて斜線で示す９つの時間領域における積分光強度を、一度のゲート通過で検出することができる。部分光の光強度が不十分な場合は、何度か励起して、蛍光強度を更に積算すればよい。
【００５１】
ここで、蛍光発光強度（部分光の光強度）の測定期間は、測定対象物に依存して変化し得る蛍光寿命の長さに応じて適宜設定すればよい。また、光学遅延手段２２にて各部分光をどの程度遅延させるかは、時間ゲート法における各ウィンドウを測定期間内のどの時間領域に割り当てるかに応じて適宜設定すればよい。例えば、蛍光発光強度を、測定期間にわたって等間隔で並ぶ９つのウィンドウで測定する場合、光学遅延手段２２において、最も短い遅延時間を基準にそこから測定期間の１／９ずつ順次に長くなる遅延時間で各部分光を遅延させればよい。
【００５２】
例えば屈折率が１の９つの光ファイバを用いて、蛍光発光強度（蛍光減衰曲線）を４５ｎｓｅｃの時間範囲で測定することを考える。各部分光は、屈折率１の媒質中を１秒間におよそ３０万ｋｍ進むことができる。ここから計算すると、各部分光が５ｎｓｅｃの時間で屈折率が１の光ファイバを進む距離はおよそ１．５ｍとなる。従って、光ファイバの長さを１．５ｍずつ変えると、光ファイバにおける遅延時間を５ｎｓｅｃずつ変えることができる。蛍光が光ファイバの長さ差分を進む時間は、時間ゲート法におけるウィンドウ間の時間差に対応する。上記の例では、ファイバ長を１．５ｍずつ変えることで、４５ｎｓｅｃの測定期間において、時間ゲート法におけるウィンドウを５ｎｓｅｃずつずらした９つのウィンドウで、蛍光寿命の測定が可能である。
【００５３】
図３Ｂに示す減衰特性が得られる光ファイバのセットを考えると、光ファイバ１〜８のファイバ長さは、ファイバ長が最も短い光ファイバ９のファイバ長から１．５ｍずつ長くなっていればよい。光ファイバ９のファイバ長を基準とすると、光ファイバ８のファイバ長はそれよりも１．５ｍ長く、光ファイバ７のファイバ長はそれより更に１．５ｍ長くなる。まとめると、各光ファイバのファイバ長は、光ファイバ９のファイバ長をＬとして、以下に示すようになる。
光ファイバ１：Ｌ＋１２．０ｍ
光ファイバ２：Ｌ＋１０．５ｍ
光ファイバ３：Ｌ＋９．０ｍ
光ファイバ４：Ｌ＋７．５ｍ
光ファイバ５：Ｌ＋６．０ｍ
光ファイバ６：Ｌ＋４．５ｍ
光ファイバ７：Ｌ＋３．０ｍ
光ファイバ８：Ｌ＋１．５ｍ
光ファイバ９：Ｌ
上記とは異なる長さの光ファイバのセットを用いることで、４５ｎｓｅｃとは異なる測定時間に対応することが可能である。
【００５４】
本実施形態では、光学分離手段２１は、レンズを用いて蛍光を複数の部分光に分離し、光学遅延手段２２は、部分光のそれぞれを、長さが相互に異なる複数の光ファイバを用いて相互に異なる遅延時間だけ遅延し、撮像手段２５は、異なる遅延時間で遅延された複数の部分光を同時に所定時間幅で検出する。本実施形態では、レンズを用いて蛍光を複数の部分光へ分離しており、光スポット内に配置されるレンズの数を変えることで、部分光の数を任意に増加させることができる。
【００５５】
特許文献１においては、蛍光の分離数を増加させるためには、複数の偏光解消板と偏光ビームスプリッターとの組を並べて配置する必要があり、広い設置面積が必要であった。本実施形態では、レンズの数を変えるだけで部分光の数を増やすことができ、広い設置面積を必要とすることなく、部分光の数を増加させることができる。また、本実施形態では、部分光の数を増やしたときでも、それに応じて光ファイバの数を増やせばよく、占有スペースを増大させることなく、遅延光路を追加できる。
【００５６】
また、本実施形態では、レンズにより分離された部分光を光ファイバに入射する部分の光軸調整を行えばよく、煩雑な光軸調整を必要とせずに、容易に光の分離数を増加させることができる。更に、特許文献１では多段階に偏光解消板と偏光ビームスプリッターとの組を配置する必要があり、その場合、各段において光の吸収や散乱が生じることから、段数を増やすほど光利用効率が悪化する。本実施形態では、分離数を増やすために多段階に偏光解消板と偏光ビームスプリッターとの組を配置する必要がなく、特許文献１に比して光利用効率を向上することができる。
【００５７】
ここで、通常の時間ゲート法において、例えば３つのウィンドウで積分蛍光発光強度を求めるためには、励起光パルスを最低でも３回照射する必要があった。本実施形態では、光学分離手段２１で蛍光を３以上の分割し、光学遅延手段２２で３以上の部分光をそれぞれ異なる遅延時間で遅延し、撮像手段２５で遅延された３以上の部分光を所定時間幅だけ同時に検出することで、最低限１回の励起光パルス照射で、３以上のウィンドウにおいて積分蛍光発光強度を求めることができる。本実施形態では、最低１つの励起光パルスで測定を完了できるため、細胞などの時々刻々と変化する試料の同一時刻での蛍光寿命測定が可能である。また、１パルス又は少ないパルス数で測定が可能であるため、光退色の影響を抑えることができる。
【００５８】
特許文献１では、時間領域の分割数が２つであるため、蛍光減衰曲線のフィッティング数が少なく、多成分の解析も困難であった。本実施形態では、例えば光学分離手段２１に３×３のマイクロレンズアレイを用いることで、蛍光を９つの部分光に分離することができ、最低限一度の励起光照射で、９つの時間領域における蛍光発光強度を検出することができる。更に光学分離手段２１に４×４のマイクロレンズアレイを用いることで、３×３のマイクロレンズアレイを用いる場合に比して、より多くの時間領域における蛍光発光強度を検出することができ、蛍光減衰曲線の近似の精度を上げることができる。マイクロレンズアレイにおけるマイクロレンズの配列数を５×５、６×６と増やしていくほど、更に近似の精度を向上できる。部分光の分離数を増やすほど、時間ゲート法におけるウィンドウの数を増やすことができ、蛍光減衰曲線をフィッティングする点の数を増やして、解析の精度を向上することができる。また、蛍光減衰曲線のフィッティング数を増やすことで、多成分の解析も可能となる。
【００５９】
本実施形態では、遅延光路に光ファイバを用いている。特許文献１では、遅延光路中に多数のミラーやレンズを配置しており、遅延時間を調整する際には、ミラーやレンズの位置、レンズの焦点距離などを適切に調整する必要があった。このため、容易に遅延時間を変更することができなかった。これに対し、本実施形態では、各光ファイバの長さを調整することで、簡易に部分光の遅延時間を調整することができる。例えば、複数の測定期間に対応して、複数の光ファイバの組を用意しておき、ターゲットとする蛍光に応じて光ファイバの組を付け替えて使用することも可能である。
【００６０】
なお、光学分離手段２１において、マイクロレンズの配置の仕方は任意であり、必ずしもマイクロレンズが正方行列状に配置されている必要はない。例えば光スポットの縦方向と横方向とで、マイクロレンズを配列する数が異なっていてもよい。また、マイクロレンズのピッチを行ごとに例えば１／２ずつずらして配置することもできる。マイクロレンズは、測定対象物から発せられた蛍光が、できるだけ多く部分光として分離されるように配置されることが好ましい。つまり、測定対象物から発せられた蛍光の光量と、分離された複数の部分光の光量の合計との差ができるだけ小さいことが好ましい。
【００６１】
時間分解蛍光測定装置１０は、図１に示す構成に加えて、測定対象物３０上で励起光の照射位置を走査する走査手段を有していてもよい。走査手段は、測定対象物３０の表面上で、例えば点光源である励起光の照射位置を互いに直交するｘ方向とｙ方向との２方向に走査する。走査手段には、例えばガルバノミラー、ポリゴンミラー、レゾナントミラー、ピエゾステージなどを用いることができる。ＰＣ２６（蛍光寿命算出手段）は、走査された各位置において、蛍光発光強度（減衰特性）と蛍光寿命とを求める。
【００６２】
ＰＣ２６は、蛍光寿命算出手段としての機能に加えて、走査された励起光の各位置に対応する蛍光の発光強度の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段として機能してもよい。ＰＣ２６は、蛍光発光強度に代えて、走査された各位置に対応して算出された蛍光寿命の分布を表す画像を蛍光画像として生成してもよい。または、ＰＣ２６は、発光強度と蛍光寿命の双方の分布を表す画像を蛍光画像として生成してもよい。ＰＣ２６は、生成した蛍光画像を、例えばディスプレイなどの表示装置に表示する。
【００６３】
上記の走査手段は、測定対象物３０の表面だけでなく、測定対象物３０に対する励起光の集光位置を深さ方向に走査してもよい。深さ方向の走査には、ピエゾステージ又は集光レンズ（対物レンズ１８）を用いることができる。蛍光寿命測定手段は、測定対象物の表面上の各位置だけではなく、深さ方向に走査された各位置についても、蛍光発光強度（減衰特性）と蛍光寿命とを求めればよい。また、蛍光画像生成手段は、測定対象物３０の表面上の２方向に深さ方向を加えて、蛍光画像を３次元情報として生成すればよい。
【００６４】
次いで、上記の時間分解蛍光計測装置を組み込んだ顕微鏡システムを説明する。図４は、顕微鏡システムを示す。顕微鏡システム１００の構成は、図１に示す時間分解蛍光測定装置１０を構成する手段のうちの一部が顕微鏡１０１に組み込まれている点を除けば、基本的に時間分解蛍光測定装置１０の構成と同様である。
【００６５】
レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で所望の繰り返し周波数に間引かれ、ミラー１３を介してビームスプリッター１４に入射し、２つの光に分離される。分離された光のうちの一方は、ビームスプリッター１４で反射して励起光検出手段１５に向かう。分離された光の他方は非線形光学結晶１６に入射し、非線形光学結晶１６により入射波長の第２高調波又は第３高調波が発生する。
【００６６】
非線形光学結晶１６により第２高調波又は第３高調波が発生した励起光は、顕微鏡１０１に導入される。導入された励起光は、励起フィルター１０２を介してダイクロイックミラー１７に入射し、ダイクロイックミラー１７を透過して、対物レンズ１８により、測定対象物３０の所望の箇所に照射される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、対物レンズ１８により平行光化され、ダイクロイックミラー１７を透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した光は、励起光除去フィルター１９を通り、ミラー１０３で反射して、顕微鏡１０１の外部に出射する。
【００６７】
顕微鏡１０１から出射した光は、分光器２０で分光され、光学分離手段２１で複数の部分光に分離される。分離された複数の部分光は、光学遅延手段２２においてそれぞれ異なる遅延時間だけ遅延される。異なる遅延時間で遅延された複数の部分光は、ゲート手段２３を介して、撮像手段２５で同時に検出される。ＰＣ２６は、撮像手段２５における複数の部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００６８】
励起光に点光源を用いる場合、励起光を、ガルバノミラー、ポリゴンミラー、レゾナントミラー、ピエゾステージなどの走査手段を用いて測定対象物３０の表面上を２次元走査すれば、２次元的に蛍光減衰曲線を得ることができ、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光にライン光源を用いる場合、励起光を１方向に走査することで、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光に面光源を用いる場合、走査手段を用いなくても、蛍光寿命の２次元画像を得ることができる。表面上の２方向に加えて、測定対象物３０に励起光を集光する集光レンズ又はピエゾステージにより深さ方向（Ｚ軸方向）にも走査を行うことで、３次元画像情報を得ることができる。
【００６９】
引き続き、上記の時間分解蛍光計測装置を組み込んだ内視鏡プローブシステムを説明する。図５は、内視鏡プローブシステムを示す。内視鏡プローブシステム２００の構成は、図１に示す時間分解蛍光測定装置１０を構成する手段のうちの一部が内視鏡プローブ装置２０１に組み込まれている点を除けば、基本的に時間分解蛍光測定装置１０の構成と同様である。
【００７０】
レーザ光源１１から出射したパルス励起光は、必要に応じてパルスピッカー１２で所望の繰り返し周波数に間引かれ、ミラー１３を介してビームスプリッター１４に入射し、２つの光に分離される。分離された光のうちの一方は、ビームスプリッター１４で反射して励起光検出手段１５に向かう。分離された光の他方は非線形光学結晶１６に入射し、非線形光学結晶１６により入射波長の第２高調波又は第３高調波が発生する。
【００７１】
非線形光学結晶１６により第２高調波又は第３高調波が発生した励起光は、内視鏡プローブ装置２０１に導入される。導入された励起光は、励起フィルター２０２を介してダイクロイックミラー１７に入射し、ダイクロイックミラー１７を透過する。ダイクロイックミラー１７を透過した励起光は、光ファイバ２０３を介して内視鏡プローブ２０４に導かれ、内視鏡プローブ２０４の先端から測定対象物３０の所望の箇所に照射される。測定対象物３０から発せられた蛍光は、内視鏡プローブ２０４を逆向きに通り、光ファイバ２０３を経てダイクロイックミラー１７に入射する。
【００７２】
図６は、内視鏡プローブ２０４の断面を示す。内視鏡プローブ２０４は、内視鏡の鉗子口を通して、測定対象物３０である患部へと到達する。内視鏡プローブ２０４は、中央に形成された光ファイバ２０６と、周囲に形成された複数の光ファイバ２０７とを有する。中央に形成された光ファイバ２０６は、励起光を測定対象物３０（図５）まで導光する入射用として機能する。周囲に形成された複数の光ファイバ２０７は、測定対象物３０から発せられた蛍光を受光し、光ファイバ２０３側へ導光するための受光用として機能する。
【００７３】
図５に戻り、光ファイバ２０３側からダイクロイックミラー１７に入射した光は、励起光除去フィルター１９を通り、ミラー２０５で反射して、内視鏡プローブ装置２０１の外部に出射する。内視鏡プローブ装置２０１から出射した光は、分光器２０で分光され、光学分離手段２１で複数の部分光に分離される。分離された複数の部分光は、光学遅延手段２２においてそれぞれ異なる遅延時間だけ遅延される。異なる遅延時間で遅延された複数の部分光は、ゲート手段２３を介して、撮像手段２５で同時に検出される。ＰＣ２６は、撮像手段２５における複数の部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する。
【００７４】
励起光に点光源を用いる場合、励起光を、内視鏡先端設けたＭＥＭＳスキャナミラーなどの走査手段を用いて測定対象物３０の表面上を２次元走査すれば、２次元的に蛍光減衰曲線を得ることができ、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。また、ファイバハンドルなどで、測定対象物３０からの信号を２次元的に受光することで、２次元的に蛍光減衰曲線を得てもよい。励起光にライン光源を用いる場合、励起光を１方向に走査することで、蛍光寿命の２次元画像情報を得ることができる。励起光に面光源を用いる場合、走査手段を用いなくても、蛍光寿命の２次元画像を得ることができる。表面上の２方向に加えて、測定対象物３０に励起光を集光する集光レンズなどにより深さ方向（Ｚ軸方向）にも走査を行うことで、３次元画像情報を得ることができる。
【００７５】
ここで、光学遅延手段２２は、光学分離手段２１との接続点、及びゲート手段２３との接続点にコネクタを有し、遅延光路を構成する光ファイバが着脱可能となっている構成を採用することができる。図７は、光学分離手段２１と光学遅延手段２２との接続部分を示す。図７においては、分光器２０（図１）と光学分離手段２１とが、１つのボックス５０内に収められている。励起光除去フィルター１９の出射光は、光ファイバ５１を介してボックス５０内の分光器２０に入射する。光ファイバ５１を用いて励起光除去フィルター１９の出射光を分光器２０に入射する構成は、特に、顕微鏡システム１００（図５）や内視鏡プローブシステム２００（図６）のように、顕微鏡１０１や内視鏡プローブ装置２０１から蛍光を取り出す構成において有効であると考えられる。
【００７６】
ボックス５０内に収められた光学分離手段２１は、３×３のマイクロレンズアレイを含むものとする。コネクタ５２は、光学遅延手段２２を構成する光ファイバ５３を取り付けるためのコネクタ部分である。コネクタ５２は、３×３の部分光に対応して、３×３の接続部分（光出射端子）を有する。各端子には、光ファイバ５３が着脱可能である。光学遅延手段２２とゲート手段２３との接続部分も、コネクタ５２と同様な構成になっている。コネクタ５２には、蛍光寿命測定時間に応じて、任意のファイバ長の光ファイバ５３を接続することができる。蛍光測定時間が異なる蛍光の蛍光寿命測定を行う場合は、コネクタ５２から光ファイバ５３を抜き、別の光ファイバ５３を挿入すればよい。長さが異なるファイバを付け替えれば、蛍光減衰曲線の測定時間領域を自由に変えることが可能である。
【００７７】
図８は、光学分離手段２１と光学遅延手段２２との接続部分の別例を示す。図７においては、光ファイバ５３が１本単位で着脱可能となっていた。これに代えて、例えば９本の光ファイバをコネクタ５４にまとめ、ボックス５０側のコネクタ５２と、光ファイバ５３側のコネクタ５４とを接続するようにしてもよい。例えば、複数の蛍光寿命測定期間に応じて、９本の光ファイバの組を複数個用意しておく。各組では、光ファイバのファイバ長の差分が異なる。蛍光寿命測定に際しては、用意しておいた複数の光ファイバの組のうち、ターゲットとなる蛍光の蛍光寿命に応じた蛍光寿命測定期間に対応した組を使用すればよい。
【００７８】
以下、実施例を説明する。メタノールを溶媒とし、アントラセンを溶かして５．０×１０−６ｍｏｌ／Ｌの溶液を作った。この溶液を、１０ｍｍ角の密閉可能な石英セルに適量入れ、窒素バブリングにより溶存酸素を除去した後に石英セルに後蓋をし、励起波長を３２５ｎｍ、蛍光波長を３６０〜５００ｎｍとして、時間分解蛍光測定装置１０（図１）を用いて蛍光寿命測定を行った。
【００７９】
蛍光減衰曲線は５０ｎｓｅｃ程度の時間範囲で測定し、光学遅延手段２２には屈折率が１．５の石英ガラスからなるファイバを４本用いた。光は、屈折率が１．５の媒質中を１秒間におよそ２０万ｋｍ進むことができる。ここから計算すると、光ファイバ中を進行する光が１２．５ｎｓｅｃ（１２．５ｎｓｅｃ×４＝５０ｎｓｅｃ）の時間で進む距離は、およそ２．５ｍとなる。５０ｎｓｅｃの測定期間で蛍光寿命を測定するために、４本の光ファイバの長さは２．５ｍずつ異なるように設定した。より詳細には、最もファイバ長が短いファイバ４の長さを１ｍとして、ファイバ３のファイバ長を１ｍ＋２．５ｍ、ファイバ２の長さを１ｍ＋５．０ｍ、ファイバ１の長さを１ｍ＋７．５ｍに設定した。
【００８０】
上記の装置を用い、時間ゲート法によるアントラセンの蛍光寿命測定を行った。時間軸に対して４点のプロットが得られ、この４点をフィッティングすることで、アントラセンの蛍光寿命はおよそ５．１ｎｓｅｃと求められた。
【００８１】
以上、本発明をその好適な実施形態に基づいて説明したが、本発明の時間分解蛍光測定装置及び方法は、上記実施形態にのみ限定されるものではなく、上記実施形態の構成から種々の修正及び変更を施したものも、本発明の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００８２】
１０：時間分解蛍光測定装置
１１：レーザ光源
１２：パルスピッカー
１３：ミラー
１４：ビームスプリッター
１５：励起光検出手段
１６：非線形光学結晶
１７：ダイクロイックミラー
１８：対物レンズ
１９：励起光除去フィルター
２０：分光器
２１：光学分離手段
２２：光学遅延手段
２３：ゲート手段
２４：ゲート制御手段
２５：撮像手段
２６：コンピュータ（ＰＣ）
３０：測定対象物
５０：ボックス
５１、５３：光ファイバ
５２、５４：コネクタ
１００：顕微鏡システム
１０１：顕微鏡
１０２：励起フィルター
１０３：ミラー
２００：内視鏡プローブシステム
２０１：内視鏡プローブ装置
２０２：励起フィルター
２０３：光ファイバ
２０４：内視鏡プローブ
２０５：ミラー
２０６、２０７：光ファイバ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の波長の光を励起光として測定対象物に照射する光照射手段と、
前記測定対象物から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離する光学分離手段と、
前記分離された複数の部分光のそれぞれを、長さが相互に異なる複数の光ファイバを用いて相互に異なる遅延時間だけ遅延する光学遅延手段と、
前記光学遅延手段で遅延された前記複数の部分光のそれぞれの光強度を同時に所定時間幅の間だけ検出する光検出手段と、
前記光検出手段での各部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段とを備えたことを特徴とする時間分解蛍光測定装置。
【請求項２】
前記光検出手段が、前記蛍光の相互に異なる時間領域に対応する時間領域の前記部分光を検出するものである請求項１に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項３】
前記光ファイバが、コネクタを介して前記前記光学分離手段及び前記光検出手段に着脱可能に取り付けられているものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項４】
前記光学分離手段が、前記測定対象物から発せられた蛍光の光スポット内に配置される複数のマイクロレンズを含むことを特徴とする請求項１から３何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項５】
前記光学分離手段が、前記測定対象物から発せられた蛍光を３以上の部分光に分離するものであることを特徴とする請求項１から４何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項６】
前記光検出器が、ゲート機能を有するイメージインテンシファイアと電荷撮像素子とを含むことを特徴とする請求項１から５何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項７】
前記蛍光寿命算出手段が、前記光検出手段での前記複数の部分光の検出結果に基づいて複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度を求め、該求められた蛍光発光強度に基づいて前記蛍光寿命を算出するものであることを特徴とする請求項１から６何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項８】
前記蛍光寿命算出手段が、記複数の部分光間での光量の差、及び前記複数の光学遅延手段間での前記部分光の損失の差の少なくとも一方を補正した上で前記蛍光寿命を算出するものであることを特徴とする請求項７に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項９】
前記励起光を前記測定対象物の表面上で走査する走査手段と、
前記走査された励起光の各位置に対応する前記蛍光の発光強度、及び前記算出された蛍光寿命の少なくとも一方の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段とを更に備えたことを特徴とする請求項１から８何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１０】
前記走査手段が、前記測定対象物の表面上に加えて、前記測定対象物上の前記励起光の集光位置を深さ方向にも走査し、前記蛍光画像生成手段が、前記蛍光画像を３次元情報として生成するものであることを特徴とする請求項９に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１１】
請求項１から１０何れかに記載の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１２】
請求項１から１０何れかに記載の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする内視鏡ファイバプローブシステム。
【請求項１３】
所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射するステップと、
前記測定対象物から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離するステップと、
前記分離された複数の部分光を、相互に異なる遅延時間だけ遅延するステップと、
前記光学遅延手段で遅延された複数の部分光それぞれの強度を、所定時間幅の間だけ同時に検出するステップと、
前記部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出するステップとを有することを特徴とする時間分解蛍光測定方法。
【請求項１】
所定の波長の光を励起光として測定対象物に照射する光照射手段と、
前記測定対象物から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離する光学分離手段と、
前記分離された複数の部分光のそれぞれを、長さが相互に異なる複数の光ファイバを用いて相互に異なる遅延時間だけ遅延する光学遅延手段と、
前記光学遅延手段で遅延された前記複数の部分光のそれぞれの光強度を同時に所定時間幅の間だけ検出する光検出手段と、
前記光検出手段での各部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出する蛍光寿命算出手段とを備えたことを特徴とする時間分解蛍光測定装置。
【請求項２】
前記光検出手段が、前記蛍光の相互に異なる時間領域に対応する時間領域の前記部分光を検出するものである請求項１に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項３】
前記光ファイバが、コネクタを介して前記前記光学分離手段及び前記光検出手段に着脱可能に取り付けられているものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項４】
前記光学分離手段が、前記測定対象物から発せられた蛍光の光スポット内に配置される複数のマイクロレンズを含むことを特徴とする請求項１から３何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項５】
前記光学分離手段が、前記測定対象物から発せられた蛍光を３以上の部分光に分離するものであることを特徴とする請求項１から４何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項６】
前記光検出器が、ゲート機能を有するイメージインテンシファイアと電荷撮像素子とを含むことを特徴とする請求項１から５何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項７】
前記蛍光寿命算出手段が、前記光検出手段での前記複数の部分光の検出結果に基づいて複数の時間領域のそれぞれにおける蛍光発光強度を求め、該求められた蛍光発光強度に基づいて前記蛍光寿命を算出するものであることを特徴とする請求項１から６何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項８】
前記蛍光寿命算出手段が、記複数の部分光間での光量の差、及び前記複数の光学遅延手段間での前記部分光の損失の差の少なくとも一方を補正した上で前記蛍光寿命を算出するものであることを特徴とする請求項７に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項９】
前記励起光を前記測定対象物の表面上で走査する走査手段と、
前記走査された励起光の各位置に対応する前記蛍光の発光強度、及び前記算出された蛍光寿命の少なくとも一方の分布を表す蛍光画像を生成する蛍光画像生成手段とを更に備えたことを特徴とする請求項１から８何れかに記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１０】
前記走査手段が、前記測定対象物の表面上に加えて、前記測定対象物上の前記励起光の集光位置を深さ方向にも走査し、前記蛍光画像生成手段が、前記蛍光画像を３次元情報として生成するものであることを特徴とする請求項９に記載の時間分解蛍光測定装置。
【請求項１１】
請求項１から１０何れかに記載の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項１２】
請求項１から１０何れかに記載の時間分解蛍光測定装置を備えたことを特徴とする内視鏡ファイバプローブシステム。
【請求項１３】
所定の波長を有する光を励起光として測定対象物に照射するステップと、
前記測定対象物から発せられた蛍光を、複数のレンズを用いて複数の部分光に分離するステップと、
前記分離された複数の部分光を、相互に異なる遅延時間だけ遅延するステップと、
前記光学遅延手段で遅延された複数の部分光それぞれの強度を、所定時間幅の間だけ同時に検出するステップと、
前記部分光の検出結果に基づいて、蛍光寿命を算出するステップとを有することを特徴とする時間分解蛍光測定方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１３２７４１（Ｐ２０１２−１３２７４１Ａ）
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８４１０４（Ｐ２０１０−２８４１０４）
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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