末梢血白血球における、Ｆｃ受容体を介した腫瘍壊死因子スーパーファミリーｍＲＮＡ発現
腫瘍壊死因子スーパーファミリーである（「ＴＮＦＳＦ」）−２、ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５の発現の変化に関与する、関節リウマチの治療に対する患者の反応性を予測するための方法を開示する。このような治療法の有効性をモニターするための方法もまた開示される。さらに、関節リウマチの治療において使用するための化合物のスクリーニング方法が開示される。関節リウマチ患者において、長期にわたり疾病の状態をモニターするための方法もまた開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は２００７年１１月１４日に提出した米国仮出願第６１／００２，９６７号の非仮出願であり、かつ２００８年１０月７日に提出した米国特許出願第１２／２９６，４２３号の一部継続出願である。該米国特許出願第１２／２９６，４２３号は、２００７年４月５日に提出した国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８５５９号の国内段階であり、該国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８５５９号は２００６年４月７日に提出した米国仮出願第６０／７９０，５１１号に基づく優先権を主張する
【０００２】
＜技術分野＞
本開示は、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバーまたはサイトカインに関係する関節リウマチの治療に対する患者の反応性を予測するための方法、このような治療法の有効性をモニターするための方法、および関節リウマチの治療において使用するための化合物のスクリーニング方法に関する。本開示はまた、関節リウマチ患者において疾患の状態をモニターするための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は、ホスト細胞に反応する抗体または自己反応性の免疫エフェクターＴ細胞のいずれかの産生により特徴付けられる。自己抗体はしばしば、重症筋無力症における抗アセチルコリン受容体抗体および全身性エリテマトーデスにおける抗ＤＮＡ抗体のような、自己免疫疾患の特定の型において同定される。しかしながら、このような自己抗体は自己免疫疾患の多くの型において見られることはない。さらに、自己抗体はしばしば健常人の間でも検出されるが、このような抗体は自己免疫疾患を引き起こさない。従って自己免疫疾患の病因には、自己抗体に加え、明らかにさらなる未同定の機構が関与している。
【０００４】
自己抗体が標的ホスト細胞に一旦結合すると、ホスト細胞の死を導くＣ５−９膜攻撃複合体を標的細胞膜上に形成するため、補体カスケードが活性化されると考えられる（Ｅｓｓｅｒ， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ８７， ２２９ （１９９４）を参照）。Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、もしくはＣ５ａのような副生成物としての走化性因子は、病変部へさらなる白血球を動員する（Ｈｕｇｌｉ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １， ３２１ （１９８１）を参照）。病変部へ補充された白血球または天然に存在する白血球は、Ｆｃ受容体（「ＦｃＲ」）を通して抗体結合細胞（免疫複合体）を認識する。免疫複合体により一旦ＦｃＲが架橋されると、白血球がＴＮＦ−αを放出し（Ｄｅｂｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１， １１９７ （１９８８）を参照）、これがホスト細胞表面の特異的受容体に結合してアポトーシスまたは細胞損傷を引き起こす（Ｍｉｃｈｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １１４， １８１ （２００３）を参照）。活性化されたＦｃＲはまた、走化性サイトカインの放出を開始して、病変部へ異なる白血球サブセットを動員する（Ｃｈａｎｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９， １８９ （１９８９）を参照）。これはＦｃＲ関連自己免疫疾患の分子機構についての一般的な仮説である。
【０００５】
関節リウマチ（「ＲＡ」）は、消化管の炎症を伴う免疫疾患である。臨床的に十分特徴付けられているにも関わらず、その病因はよく分かっていない。ＲＡは通常、対称的な分布の末梢関節に関与する持続的炎症性の滑膜炎により特徴付けられる。これは軟骨破壊、骨侵食、および関節の完全性における変化を導き得る。ＲＡの原因は未だ不明であるが、滑膜中にＣＤ４＋Ｔ細胞が優勢であること、ＲＡ患者の血液および血清中における可溶性
ＩＬ−２受容体（活性化Ｔ細胞から産生される）の増加、およびＴ細胞の除去による疾病の顕著な寛解から、この疾病においてＣＤ４＋Ｔ細胞が重要な役割を果たしていることが強く推測される。ＲＡは関節内におけるＴＮＦ−α（ＴＮＦＳＦ−２としても知られる）の蓄積に付随する。通常ＴＮＦ−αは、冒された領域における炎症の原因となる感染およびその他の侵入者と戦うための白血球の移動に役立つ。健常体は過剰なＴＮＦ−αを除去できるが、関節リウマチ患者の体はそれができない。結果として、冒された領域へさらに多くの白血球が移動する。特にリウマチ性の関節におけるこのＴＮＦ−αの蓄積は、炎症、疼痛、および組織損傷の原因となる。
【０００６】
ＩｇＧ Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）は、様々な炎症反応を誘発する免疫複合体（ＩＣ）（エピトープと、このエピトープに対して作られた抗体との組み合わせ）と反応することが知られている。特定の抗原は完全に特徴付けられていないが、ＩＣはＲＡ患者の関節病変部において頻繁に確認される。ＩＣはまた、炎症を確立する補体カスケード、同様に様々な白血球のＦｃγＲへの結合による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）も活性化することが知られている。これまでに、局所浸潤性の白血球が滑液から採取され、研究されてきた。しかしながら、これらの採取物は新規の細胞および消耗した細胞の両方を含むため、結果の解釈が困難であった。末梢血白血球はそれらが疾病部位に遊走する際、ＲＡの病因に主要な役割を果たすことから、このような機能をｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣する多数の実験が行われてきた。典型的には、単核白血球が分離され、培養液に懸濁され、様々な刺激物質またはエフェクター細胞と共にＣＯ2インキュベーター内でインキュベートされる。しかしながらこのようなアッセイが行われる条件は、異なる細胞集団との連絡、赤血球からの酸素供給、同様に血漿タンパク質およびその他の成分との複雑な相互作用が欠如していることから、生理的条件には近くない。長いインキュベーション期間の間には、第二の反応が起こり得る。さらに、労働集約型の技術および実験ごとの実質的な変動のため、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の診断検査における応用は少ない。
【０００７】
ＲＡの治療は鎮痛、炎症の縮小、関節構造の保護、機能の維持、および全身性病変の制御に焦点を合わせる。選択肢は、アスピリンおよびその他の非ステロイド性抗炎症剤；メトトレキサート、金化合物、Ｄ−ペニシラミン、抗マラリア剤、およびスルファサラジンのような抗リウマチ剤；グルココルチコイド；インフリキシマブおよびエタネルセプトのようなＴＮＦ−α中和薬；ならびにアザチオプリン、レフルノミド、シクロスポリン、およびシクロホスファミドのような免疫抑制剤を含む。治療的選択肢の選択はＲＡ患者における疾病状態の評価に依存するため、疾病状態を評価し、かつ疾病の進行をモニターする新しい方法の開発が望ましいであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】末梢全血中のヒト白血球における、様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡの、ＦｃγＲを介した遺伝子発現の定量結果を示す。
【図１Ｂ】末梢全血中のヒト白血球における、様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡの、ＦｃγＲを介した遺伝子発現の定量結果を示す。
【図１Ｃ】末梢全血中のヒト白血球における、様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡの、ＦｃγＲを介した遺伝子発現の定量結果を示す。
【図２Ａ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【図２Ｂ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【図２Ｃ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【図３Ａ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの比較上の増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【図３Ｂ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの比較上の増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【図３Ｃ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの比較上の増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
好ましい実施形態の詳細な説明
本開示は、特定の治療法に対してＲＡ患者が適した候補であるか否かの評価における、特定の細胞刺激に応答した白血球内の差次的ｍＲＮＡ転写パターンの使用に関する。本開示はまた、ＲＡ患者に施した治療法が有効であるか否かの評価における、このような差次的転写パターンの使用にも関する。本開示はまた、ＲＡ患者の治療に使用するための候補となる薬剤のスクリーニングにおける、このような差次的転写パターンの使用にも関する。本開示はまた、患者のＲＡの状態の長期にわたる評価および疾病の進行のモニターにおける、このような差次的転写パターンの使用にも関する。
【００１０】
上記のようにＲＡの病理学は、ＲＡ患者の免疫細胞のＦｃγＲとＩＣの間の相互作用に関連する可能性がある。この可能性をさらに評価するため、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ、ＩＣの標準的モデル）を用い、健常成人コントロールおよびＲＡ患者両方におけるヒト全血中のＦｃγＲを刺激した。使用できるその他の刺激剤は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、および熱凝集ＩｇＭを含む。
【００１１】
ＨＡＧを直接ヘパリン化全血中に加え、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の様々なメンバーのｍＲＮＡレベルにおける変化を評価した。ＦｃγＲＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ、およびＩＩＩ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＵｎｉＧｅｎｅデータベース）のような複数のＦｃγＲが存在するが、ＨＡＧは全てのＦｃγＲサブタイプと反応できる普遍的な刺激として作用する。ＨＡＧの刺激に起因する、ＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡメンバー（例えばＧｅｎｅＢａｎｋ ＵｎｉＧｅｎｅデータベースを参照）のｍＲＮＡレベルにおける変化を定量化した。
【００１２】
前述のように、ＦｃγＲを介する機能はＩｇＧのＦｃ部の４種のサブクラス（ＩｇＧ１〜４）、ＦｃγＲの複数のクラス（ＦｃγＲＩａ−ｃ、ＦｃγＲＩＩａ−ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａ−ｂ）、ＦｃγＲを有する白血球の異なるサブセット、および様々な下流の細胞内シグナルカスケードから成る。さらに、これらのタンパク質は複数の転写物変異体
および様々な遺伝的多型性を有する。疾病状態におけるＦｃγＲの機能の変化は、どのようなレベルでも起こり得る。しかしながら、各個体において各因子を特徴付けることは現実的ではないであろう。本開示は、個々の細胞分析、様々な遺伝子の遺伝子型同定、および細胞内シグナルカスケードの変動のような、様々な下流アッセイの利益を享受し得る個人を同定するためのスクリーニング手段としての全血（ｅｘ ｖｉｖｏ状態での付随物を含む）の使用を意図する。ＩＣはＴＮＦＳＦ−２（＝ＴＮＦ−α）およびＴＮＦＳＦ−１５（＝ＴＬ１Ａ）ｍＲＮＡを誘導することが知られているため、全ての腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）メンバーはこの方法によりスクリーニングされた。
【００１３】
用いられた方法は以下の通りである。様々なＴＮＦＳＦ遺伝子のヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋのＵｎｉＧｅｎｅデータベースから検索した。各遺伝子に対するＰＣＲプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、フォスターシティー、カリフォルニア州）およびＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ（ＲＮＡｔｕｒｅ、アーバイン、カリフォルニア州）（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６７， ７５９ （１９９４）； Ｈｙｎｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０， １０９０ （１９９６）を参照）により設計した。配列の概要を以下の表１に示す。オリゴヌクレオチドはＩＤＴ（コーラルヴィル、アイオワ州）つくばオリゴサービス（筑波、日本）、ニッポンイージーティー（富山、日本）および北海道システム・サイエンス（札幌、日本）によって合成された。
表１．プライマー配列
【００１４】
【表１】
【００１５】
熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）は、ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍＬヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス）を６３℃において１５分間加熱することにより調製した（Ｏｓｔｒｅｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １５， ３１１ （１９８７）を参照）。８ウェルストリップマイクロチューブ内に１．４μｌのＨＡＧまたはコントロール（リン酸緩衝食塩水）を加え、使用まで−２０℃で保存した。７０μｌの新鮮なヘパリン化全血（ＩＣによる刺激までに４℃で保持されていた）を各ウェルへ３通りに加え、蓋を閉めて３７℃で４時間インキュベートした。血液サンプルは同日、採血によって処理した。処理後、各血液サンプルを使用まで−８０℃で凍結保存した。
【００１６】
ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡは、Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ５２， ６３４ （２００６） に説明される以下の方法によって全血から調製した。参照としてここに取り込まれる米国特許出願第１０／７９６，２９８号に開示される方法もまた用いられてよい。簡単に述べると、白血球を９６−ウェルフィルタープレート内へ捕獲するため、５０μｌの全血をその中へ移した。これらのフィルタープレート
を採取プレート上に配置し、１５０μｌの１．５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４を加えた。４℃における１２０ｘｇ、１分間の遠心に続き、５０μｌの血液サンプルを各ウェルに加えて直ちに４℃で１２０ｘｇ、２分間遠心し、続いて各ウェルを３００μｌのＰＢＳで４℃、２０００ｘｇ、５分間の遠心により１回洗浄した。その後、１％ ２−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）、０．５ｍｇ／ｍｌ プロテナーゼＫ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州、米国）、０．１ｍｇ／ｍｌ サケ精子（５ Ｐｒｉｍｅ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ／Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ、ウェストベリー、ニューヨーク州、米国）、０．１ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）、各１０ｍＭの特異的逆方向プライマーの混合物、および標準的なＲＮＡ３４オリゴヌクレオチドを追加した溶解緩衝液の原液６０μｌをフィルタープレートへ加え、続いて３７℃で１０分間インキュベートした。その後フィルタープレートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、ＲＮＡｔｕｒｅ）（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５７， ５１９ （１９９２）； Ｈａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４４， ２２５６ （１９９８）（両方とも参照としてここに取り込まれる）を参照）上に配置し、４℃、２０００ｘｇにおいて５分間遠心した。４℃における一晩の保存後、マイクロプレートを１００μｌの単純な溶解緩衝液で３回洗浄し、続いて１５０μｌの洗浄緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で４℃において３回洗浄した。ｃＤＮＡは、１ｘＲＴ−緩衝液、各１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、４単位のｒＲＮａｓｉｎ、および８０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）（プライマーを含まない）を含む緩衝液を加え、３７℃で２時間インキュベートすることにより、各ウェル３０μｌの溶液中で直接合成した。溶液中には特定のプライマーにより刺激されたｃＤＮＡが存在し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）により刺激されたｃＤＮＡはマイクロプレート内に固定されたままであった（Ｈｕｇｌｉ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １， ３２１ （１９８１）を参照）。ＳＹＢＲグリーンＰＣＲのため（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４， ９５４ （１９９８）（参照としてここに取り込まれる）を参照）、ｃＤＮＡを水中で４倍希釈し、３８４ウェルＰＣＲプレートに４μｌのｃＤＮＡ溶液を直接移し、５μｌのｉＴａｑ ＳＹＢＲマスターミックス（Ｂｉｏ Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）および１μｌのオリゴヌクレオチド混合物（各１５μＭの順方向および逆方向プライマー）を加え、ＰＣＲをＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（ＡＢＩ）内で、９５℃１０分間の１サイクル、続く９５℃３０秒間および６０℃１分間の４５サイクルにより行った。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲもまた用いられてよく、この場合３８４ウェルＰＣＲプレートにｃＤＮＡ溶液を直接移し、５μｌのＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（ＡＢＩ）および１μｌのオリゴヌクレオチド混合物（各１５μＭの順方向および逆方向プライマー、および３〜６μＭのＴａｑＭａｎプローブ）を加え、ＰＣＲをＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（ＡＢＩ）内で、９５℃１０分間の１サイクル、続く９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、および６０〜６５℃１分間の４５サイクルにより行う。各遺伝子は個別に増幅された。
【００１７】
ＳＹＢＲグリーンＰＣＲの条件下でプライマーダイマーが産生されなかったことを確認するため、１ｘＲＴ緩衝液を陰性コントロールとして使用した。さらに、ＰＣＲシグナルが単一のＰＣＲ産物由来であることを確認するため、それぞれの場合において融解曲線を分析した。分析ソフトウェア（ＳＤＳ、ＡＢＩ）により、一定量のＰＣＲ産物（蛍光）の産生のために必要とされたＰＣＲサイクル数であるサイクル閾値（Ｃｔ）を決定した。ΔＣｔを算出するため、ＨＡＧにより処理した３通りのサンプルのＣｔ値をＰＢＳコントロールのＣｔ値の平均によってそれぞれ通分し、未刺激サンプルに比較した刺激サンプルの増加倍率（以下、単に「増加倍率」とする）を、各ＰＣＲサイクルの効率が１００％であったと仮定することにより、２＾（−ΔＣｔ）として算出した。
【００１８】
図１Ａ−１Ｃは、末梢血白血球における、ＦｃγＲを介したｍＲＮＡ発現を示す。各デ
ータ点は、３通りの一定分量の全血からの平均＋標準偏差（図１Ａ）、または平均（図１Ｂ、１Ｃ）を示す。
【００１９】
図１Ａは発現動態の分析結果を示す。ヘパリン化全血各７０μｌの一定分量の３通りをＰＢＳ、または２００μｇ／ｍｌの熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）と混合し、３７℃において０〜８時間インキュベートした。その後ＴＮＦＳＦ−２（＝ＴＮＦ−α、●）、ＴＮＦＳＦ−８（▲）、またはＴＮＦＳＦ−１５（＝ＴＬ１Ａ、◆）、およびβ−アクチン（△）のｍＲＮＡを定量化し、増加倍率（ｙ軸）を上記のように算出した。図１Ａに示すようにＴＮＦＳＦ−２の誘導は非常に迅速であり、ピークが３０分前後で、４時間前後の大きな持続性のピークがそれに続く。ＴＮＦＳＦ−２とは対照的に、ＴＮＦＳＦ−８（図１Ａ、▲）およびＴＮＦＳＦ−１５（＝ＴＬ１Ａ）（図１Ａ、◆）はゆっくりと増加し、ピークは４時間前後であった。ＨＡＧとの８時間のインキュベーションの間にハウスキーピング遺伝子（β−アクチン）は誘導されなかった（図１Ａ、△）。従って、ＴＮＦＳＦ−２、−８および−１５のｍＲＮＡを分析するためのＨＡＧとのインキュベーションは４時間に固定した。薬物誘導性の変化を同定するためのタンパク質検出が少なくとも一晩のインキュベーションを必要とすることから、この短いインキュベーション（４時間）は、ｍＲＮＡに基づくアッセイの利点の一つである。
【００２０】
図１Ｂは容量反応を示す。ヘパリン化全血を０〜８００μｇ／ｍｌのＨＡＧと共に３７℃で４時間インキュベートし、その後様々なｍＲＮＡを定量化した（各シンボルは図１Ａのように定義される）。ＨＡＧにより誘導されたＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−８およびＴＮＦＳＦ−１５は、１０μｇ／ｍｌのＨＡＧから用量依存性であり、１００〜２００μｇ／ｍｌにおいて飽和するが、β−アクチンは変化しないことが確認された。
【００２１】
図１Ｃは、同個体から一週間以内に２回採血し、ＨＡＧにより誘導されたＴＮＦＳＦ−２（●）、ＴＮＦＳＦ−８（▲）、ＴＮＦＳＦ−１５（◆）ｍＲＮＡおよび外部コントロールｍＲＮＡ（合成ＲＮＡ３４）（○）を定量化して得られた結果を示す。図１Ｃに示すように誘導には再現性があり、８健常人の間での１日目と２日目の間のｒ2値は０．９２７（ｎ＝３２、ｐ＜０．００１）であった（図１Ｃ）。溶解緩衝液中に加えた外部合成ＲＮＡの増加倍率（ＲＮＡ３４、図１Ｃ、○）は常に１．５未満であり、これは各実験においてアッセイが適切に行われたことを示唆する。
【００２２】
ｍＲＮＡ分析に使用する実際の血液量は５０μｌであったが、このアッセイでは一反応あたり７０μｌの全血を使用した（２０μｌは８ウェルストリップからフィルタープレートへ移動する間の予備である）。従って各試験は４２０μｌ（７０μｌ／ウェルｘ２（ＨＡＧおよびＰＢＳ）ｘ３（３通り））程度の少ない全血を消費した。５０μｌの全血／ウェルから、ＲＴ−ＰＣＲ（３０μｌのｃＤＮＡに９０μｌの水を加える（１：４希釈）、４μｌのｃＤＮＡ／ＰＣＲ）により３０の異なるｍＲＮＡを定量化した。１：４希釈のｃＤＮＡからであっても、様々なＴＮＦＳＦｍＲＮＡの測定は達成された。個体間でのヘマトクリットの変動のために血清量が予測できない血清に基づく試験とは異なり、全血は操作が容易である。
【００２３】
表２は、末梢全血中のヒト白血球におけるＦｃＲを介したＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡの遺伝子発現の分析結果を示す。ここに示した結果は、ＨＡＧ刺激への応答によって２よりも大きい増加倍率を示す被験者として定義される、「応答者」被験者のパーセンテージとして表現される。健常被験者とＲＡ患者の間で陽性反応の頻度をそれぞれのＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡについて比較するため、χ2検定を用いた。２つの集団（陽性および陰性反応）が存在したことから、ｔ−検定は増加倍率が２を超える被験者に対してのみ適用した。
【００２４】
【表２】
【００２５】
表２に示すように、ＨＡＧは全ての健常ドナー、および６１人中５９人のＲＡ患者にＴＮＦＳＦ−１５（＝ＴＬ１Ａ）ｍＲＮＡを誘導した（増加倍率＞２）。これらの結果は最近出版された報告により、ｅｘ ｖｉｖｏ状態で再現された（Ｐｒｅｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ＴＬ１Ａ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＦｃｇａｍｍａＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７８，
４０３３ （２００７）； Ｃａｓｓａｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｌｕｂｌｅ
ＴＮＦ−ｌｉｋｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ （ＴＬ１Ａ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ
ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７８， ７３２５ （２００７）（両方が参照としてここに取り込まれる）を参照）。ＨＡＧはまた、ＴＮＦＳＦ−２（ＴＮＦ−α）ｍＲＮＡを誘導することも知られている（Ｓａｔｏｈ
ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ ｉｎ
ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄ． ５， １４０ （１９８６）； Ｃｈｏｕｃｈａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩＩ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｌｖｅｏｌｉｔｉｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６， ５１９３ （２００１）（両方が参照としてここに取り込まれる）を参照）。しかしながら表２に示すように、ＴＮＦＳＦ−２は全ての個体には誘導されないことが見出され、半分を超える被験者が反応しなかった。さらに、ＨＡＧ刺激は１／３を超えるコントロールおよびＲＡ患者にＴＮＦＳＦ−８（＝ＣＤ１５３、ＣＤ３０リガンド）およびＴＮＦＳＦ−１４（＝ＬＩＧＨＴ）ｍＲＮＡを誘導し、かつ数例にＴＮＦＳＦ−１（＝リンホトキシンα、ＬＴＡ）、ＴＮＦＳＦ−３（＝リンホトキシンβ、ＬＴＢ）、ＴＮＦＳＦ−４（＝ＣＤ２５２、ＣＤ１３４リガンド）、ＴＮＦＳＦ−６（＝Ｆａｓリガンド）、ＴＮＦＳＦ−７（＝ＣＤ７０、ＣＤ２７リガンド）およびＴＮＦＳＦ−９を誘導したが、ＴＮＦＳＦ−５（＝ＣＤ１５４、ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ−１２（＝ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ−１３（＝ＣＤ２５６）およびＴＮＦＳＦ−１３Ｂ（＝ＣＤ２５７）は全く誘導されないか、わずかに誘導された。図１Ａおよび１Ｂに示すように、飽和は２００μｇ／ｍｌのＨＡＧとの４時間のインキュベーションにおいて達成されたことから、この個体ごとの変動
、あるいは刺激開始から４時間の応答者および非応答者の存在には意味がある。このｅｘ
ｖｉｖｏアッセイは様々な下流のアッセイのスクリーニングプラットフォームとして有用であると期待される。
【００２６】
リウマチ因子（ＲＦ）（２型（ポリクローナルＩｇＧに対するモノクローナルＩｇＭ）または３型（ポリクローナルＩｇＧに対するポリクローナルＩｇＭ）クリオグロブリンのいずれか）に対する試験は、ＲＡが疑われる症例における標準的な診断法である。ＨＡＧ刺激によるＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−８、およびＴＮＦＳＦ−１５誘導の結果をＲＦレベルにより分類して相互関係を模索した。結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。ＨＡＧにより誘導されたＴＮＦＳＦ−２（Ａ）、ＴＮＦＳＦ−８（Ｂ）、およびＴＮＦＳＦ−１５（Ｃ）ｍＲＮＡを、４０人の健常成人志願者（コントロール）、およびそれぞれＲＦ＜３０、３０〜１００、および＞１００ＩＵ／ｍｌを有する６１人のＲＡ患者から定量化した。２つの集団（増加倍率＞２の応答者、および非応答者）が観察されたことから、ｔ−検定は応答者集団にのみ適用した。χ2検定による分析では、これら４群の間の有意な相違は明らかではなかった。
【００２７】
図２に示すように、ＲＦの量によるＲＡ患者の分類はＴＮＦＳＦ誘導における著しい相違を明らかにした。図２Ｃに示すように、ＲＦ＞１００ＩＵ／ｍｌのＲＡ患者におけるＴＮＦＳＦ−１５の増加倍率は、コントロール（ｐ＝０．０１）およびＲＦ＜３０ＩＵ／ｍｌのＲＡ患者（ｐ＝０．０４）各々のそれよりも有意に少なかった。これはおそらくＲＦがＩＣの天然型であり、ｅｘ ｖｉｖｏでＨＡＧを添加したときにも全血中に存在したという事実に起因する。ＲＡ患者の大部分はＨＡＧ刺激への反応を維持した。このことは、長期間のＲＦへの曝露にもかかわらず、ＲＡ患者の末梢血中の循環白血球はなおＩＣを活性化できることを示す。高ＲＦを有するＲＡ患者に見られる減少したＴＮＦＳＦ−１５の応答は、末梢血白血球のＴＮＦＳＦ−１５受容体機能が何故か減少していることを示し得る。
【００２８】
ＲＦによるＦｃγＲの活性化を考慮し、ＴＮＦＳＦ−１５ ｍＲＮＡの基線レベルがＲＦへの持続的曝露によって上昇するか否かについての評価を行った。結果は、表２に示すようにＴＮＦＳＦ−５、−１３、および−１３ＢのｍＲＮＡはＨＡＧにより誘導されなかったため、これら３種のＴＮＦＳＦに比較したＴＮＦＳＦ−１５の相対的発現を算出することにより、Ｃｔに関して測定した。しかしながら、ＲＡ患者におけるＴＮＦＳＦ−１５の基線レベルは、３通りの算出全てにおいて、コントロール被験者との有意な相違は見られなかった。
【００２９】
図３は、図２に示す結果を、ＴＮＦＳＦ−２および−８（Ａ）、ＴＮＦＳＦ−２および−１５（Ｂ）、ならびにＴＮＦＳＦ−８および−１５（Ｃ）をコントロール（○）およびＲＡ（●）それぞれと比較することにより、ｘ−ｙグラフに変換して得られた結果を示す。図３Ｃに示すように、ＴＮＦＳＦ−１５の増加倍率はＲＡ（●）および健常被験者（○）の両方においてＴＮＦＳＦ−８のそれとよく相関しており、ｒ2値はそれぞれ０．４８（ｎ＝６１、ｐ＜０．００１）および０．２７（ｎ＝３８、ｐ＜０．００１）であった。しかしながらＴＮＦＳＦ−８の増加倍率は低めで、かつ陽性応答者の集団はＴＮＦＳＦ−１５のそれに比べて小さかったことから、ＲＡ患者をＲＦの量により分類した場合であっても、コントロールとＲＡの間にＴＮＦＳＦ−８についての著しい相違は見られなかった（図２Ｂ）。しかしながら図２Ａに示すように、ＴＮＦＳＦ−１５とは対照的に、ＲＦ＜３０および＜１００のＲＡ患者におけるＴＮＦＳＦ−２の増加倍率は健常被験者のそれよりも有意に（ｐ＜０．０３、０．０５）高かった。ＴＮＦＳＦ−２の増加倍率はＴＮＦＳＦ−８（図３Ａ）（コントロールおよびＲＡそれぞれ、ｒ2＝０．０３および０．０２）およびＴＮＦＳＦ−１５（図３Ｂ）（コントロールおよびＲＡそれぞれ、ｒ2＝０．１１および０．００３）のそれとは相関しておらず、ＴＮＦＳＦ−２およびＴＮＦＳＦ−８／
−１５は異なる経路由来であることが示唆される。このことは、ＴＮＦＳＦ−２およびＴＮＦＳＦ−８／−１５の動態が異なるという図１Ａに示される証拠により、さらに確認された。
【００３０】
ＴＮＦＳＦ−２（＝ＴＮＦ−α）は、ＲＡの病因に関与する炎症性サイトカインの一つであり、ＲＡの滑液中に存在する（Ｓａｘｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３１， １０４１ （１９８８）（参照としてここに取り込まれる）を参照）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ＴＮＦ−α転写物が滑膜組織マクロファージに存在することが示されてきた（ＭａｃＮａｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＩＬ−１ ａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５， ４１５４ （１９９０）（参照としてここに取り込まれる）を参照）。さらに、抗−ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（インフリキシマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ）およびＴＮＦ−αの作用を遮断する可溶性ＴＮＦ受容体（エタネルセプト、Ｅｎｂｒｅｌ）が、ＲＡ患者において臨床的有効性を示した（Ｗｅａｖｅｒ， Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｗ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ （Ｏｘｆｏｒｄ） ４３ Ｓｕｐｐｌ． ３：ｉｉｉ１７−ｉｉｉ２３ （２００４）（参照としてここに取り込まれる）を参照）。従って、我々のｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおいてＲＡ患者に見られた、ＨＡＧにより誘導されるＴＮＦ−α誘導の上昇は極めて妥当である。無論ｍＲＮＡの誘導は、選択的スプライシング、翻訳後修飾、および阻害性のカスケードにより、タンパク質合成ならびにそれに続く生物学的および臨床的結果に常には対応しない。しかしながらこのｅｘ ｖｉｖｏシミュレーションは、受容体および付随するタンパク質の遺伝的多型性のような、様々な下流の分子アッセイの開始点のスクリーニング手段として有効となるであろう。
【００３１】
また、ＨＡＧにより誘導されたＴＮＦＳＦ−２ ｍＲＮＡの、応答者（増加倍率＞＝２）および非応答者（増加倍率＜２）の間での患者の臨床的特徴も比較した。結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
表３に示すように、ＲＦ＜３０ＩＵ／ｍｌ群の応答者集団は、非応答者の集団よりも有意に若かった（ｐ＝０．０４）。年齢、性別、罹病期間、ＣＲＰ、腫脹関節の数、および圧痛のある関節の数のようなその他の臨床パラメータについては、全てのＲＦ群において応答者と非応答者の間に有意な違いはなかった（表３）。興味深いことに全ての患者を組み合わせた場合、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体または可溶性ＴＮＦ受容体のような生物学的薬剤で処置した患者の数は、非応答者集団よりも応答者集団において有意に多かった（ｐ＝０．０２）（表３）。これらの抗ＴＮＦ−α薬剤の使用は、未知の負のフィードバック機構を通してＦｃγＲを介するＴＮＦ−αの作用を増大し得るか、またはこれらの患者は生物学的治療法のよい候補者であり得る。ＨＡＧにより誘導されるＴＮＦ−αｍＲＮＡに応答を示すＲＡ患者は、ＲＡ病理学においてＴＮＦ−αが有意に関与する可能性がさらにあり、それ故、これらの生物学的薬剤のよい候補者である可能性がさらにある。生物学的薬物は非常に高価であり、全ての患者に有効ではなく、かつ時折望ましくない副作用を示すため、これらの薬物に応答する可能性のある患者の同定は、個別化された医学としての臨床的有用性をもつであろう。
【００３４】
細胞毒性試験は一般に、ＲＡにおいて起こると信じられている免疫システムの活性に起因する、実際の細胞死を研究するために用いられてきた。細胞毒性試験は一般に、51Ｃｒ負荷細胞とエフェクター細胞とを様々な比においてインキュベートすること、ならびに死滅または損傷した細胞から放出された51Ｃｒの放射活性量を定量化することにより行われる（Ｄｕｎｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，
３９ （１９７４）を参照）。ある場合には、放射性物質は蛍光定量物質のような非放射性物質に置き換えられているが（Ｋｒｕｇｅｒ−Ｋｒａｓａｇａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５６， １ （１９９２）を参照）、基本的原理は変化していない。従って細胞毒性試験の結果は実際の細胞死を反映する。
【００３５】
しかしながら、細胞毒性試験は非生理的な実験条件下で行われ、このような研究過程において複雑な細胞と細胞、および細胞と血漿の相互作用を評価することは困難である。さらに、細胞毒性試験はどのＴＮＦＳＦメンバーが細胞死の原因であるかを示さない。単一のエフェクター細胞は多数の標的細胞の死滅には十分でないことから、一旦エフェクター細胞が標的細胞を認識すると、エフェクター細胞の機能は標的を死滅させることのみではなく、その他のエフェクター細胞を動員することでもある。この動員機能は走化性因子の放出に代表されると考えられている。エフェクター細胞から放出されるこのような走化性因子の同一性は、古典的な細胞毒性試験によっては明らかにされないであろう。しかしながら本開示中で説明されるアッセイシステムは、エフェクター細胞における遺伝子発現の多数のクラスを同時に同定可能である。
【００３６】
全血の使用は、分離された白血球の培養液中での使用よりも好ましい。その理由は、前者は後者よりもさらに生理的であり、かつ白血球の全集団をスクリーニングできることである。全血の長めのインキュベーションはさらなるアーチファクトを生じ得る。従って理想的な方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏからｅｘ ｖｉｖｏへの切り替えによる短期間のインキュベーションの間に、全血中でキラーの初期シグナルおよび動員シグナルを同定することである。ｍＲＮＡの転写は、タンパク質合成または最終の生物学的結果のいずれよりも早期の出来事である。従って、ｍＲＮＡは論理にかなった標的である。
【００３７】
本方法は全血を使用することから、ＴＮＦＳＦ非活性化治療法に対する可能な応答性を評価し、かつ治療的応答をモニターする、ＲＡの診断試験として使用されてよい。特に、ＲＡを有するヒトがＴ細胞刺激に応答して転写されたｍＲＮＡを標的とする治療法に応答する可能性があるか否かを決定する方法の好ましい実施形態においては、前述のようにＲＡ患者から全血を採取し、血液サンプルをＨＡＧ刺激へ、かつ必要に応じてコントロール刺激（ＰＢＳ）へ供する。ＴＮＦＳＦ−２，ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５ｍＲＮＡの量は上記のサンプル中で測定されてよい。ＨＡＧによる刺激後、これらのうち１以上のｍＲＮＡのレベルが有意に上昇している（示したように、例えば増加倍率が２を超える）ＲＡ患者は、これらのｍＲＮＡを標的とした治療法のよい候補である。
【００３８】
さらに、ＴＮＦＳＦ−２，ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５ｍＲＮＡのうちの１以上を標的にしたＲＡ治療法の有効性を患者において評価する方法の好ましい実施形態においては、処置開始前に、ＨＡＧ刺激後の全血中のｍＲＮＡ量のコントロール刺激後の量に対する第一の比を求める。処置開始後に、ＨＡＧ刺激後の全血中のｍＲＮＡ量のコントロール刺激後の量に対する第二の比を求める。第一の比が第二の比よりも大きいような、比における有意な相違により、治療法の有効性が示される。このような治療法は例えば、インフリキシマブまたはエタネルセプトの投与を含んでよい。
【００３９】
重要なことには、このｅｘ ｖｉｖｏ法はＴＮＦＳＦ−２，ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５ｍＲＮＡのうちの１以上、特に疾病病理学に関わることが知られているＴＮＦＳＦ−２の、抗ＦｃＲを介した発現を阻害する化合物のスクリーニングに使用できる
。このような化合物は、これらの新しい薬物候補が白血球におけるｍＲＮＡ産生を転写レベルで遮断し得ることから、興味あるものとなるであろう。このことは、ＲＡに対する薬剤の発展に対し新しい戦略を提供するであろう。
【００４０】
開示されたシステムを用い、それによりＲＡ治療のための推定される薬剤を同定する薬物化合物のスクリーニング方法の実施形態において、全血は反応者であるＲＡ患者から得られ、ここで反応者は、その白血球がＨＡＧのようなＴ細胞刺激に曝露されたとき、ＲＡに付随するｍＲＮＡのレベルにおいて少なくとも２倍の増加を示す個体である。ＨＡＧ刺激後の被験者の全血中のｍＲＮＡ量のコントロール刺激後の量に対する第一の比を算出した。被験者からのさらなる全血サンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで薬物化合物へ曝露し、その後上記のように差次的に刺激した。その後これら曝露したサンプルの、ＨＡＧ刺激後の全血中のｍＲＮＡ量のコントロール刺激後の量に対する第二の比を算出した。第一の比が第二の比よりも大きいような、比における有意な相違により、薬物化合物がＲＡの有望な治療法としてのさらなる検討のための候補であることが示される。
【００４１】
加えて、患者から得られた白血球を含むサンプル中のＴＮＦＳＦ−２，ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５ｍＲＮＡのうちの１以上のレベルを測定することにより、ＲＡ患者の疾病状態をモニターする方法の好ましい実施形態において、第一の時に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの熱凝集ＩｇＧ抗体を用いたＴ細胞刺激またはその他の刺激後の全血中のｍＲＮＡ量の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのコントロール刺激後の量に対する第一の比を得る。前記第一の時に続く第二の時に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞刺激後の全血中のｍＲＮＡ量の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのコントロール刺激後の量に対する第二の比を得る。比における有意な相違により、疾病状態の変化が示される。例えば、第二の比が第一よりも大きな場合には疾病の進行が示されるが、第一の比がより大きな場合には疾病の退行が示される。
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は２００７年１１月１４日に提出した米国仮出願第６１／００２，９６７号の非仮出願であり、かつ２００８年１０月７日に提出した米国特許出願第１２／２９６，４２３号の一部継続出願である。該米国特許出願第１２／２９６，４２３号は、２００７年４月５日に提出した国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８５５９号の国内段階であり、該国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８５５９号は２００６年４月７日に提出した米国仮出願第６０／７９０，５１１号に基づく優先権を主張する
【０００２】
＜技術分野＞
本開示は、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバーまたはサイトカインに関係する関節リウマチの治療に対する患者の反応性を予測するための方法、このような治療法の有効性をモニターするための方法、および関節リウマチの治療において使用するための化合物のスクリーニング方法に関する。本開示はまた、関節リウマチ患者において疾患の状態をモニターするための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患は、ホスト細胞に反応する抗体または自己反応性の免疫エフェクターＴ細胞のいずれかの産生により特徴付けられる。自己抗体はしばしば、重症筋無力症における抗アセチルコリン受容体抗体および全身性エリテマトーデスにおける抗ＤＮＡ抗体のような、自己免疫疾患の特定の型において同定される。しかしながら、このような自己抗体は自己免疫疾患の多くの型において見られることはない。さらに、自己抗体はしばしば健常人の間でも検出されるが、このような抗体は自己免疫疾患を引き起こさない。従って自己免疫疾患の病因には、自己抗体に加え、明らかにさらなる未同定の機構が関与している。
【０００４】
自己抗体が標的ホスト細胞に一旦結合すると、ホスト細胞の死を導くＣ５−９膜攻撃複合体を標的細胞膜上に形成するため、補体カスケードが活性化されると考えられる（Ｅｓｓｅｒ， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ８７， ２２９ （１９９４）を参照）。Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、もしくはＣ５ａのような副生成物としての走化性因子は、病変部へさらなる白血球を動員する（Ｈｕｇｌｉ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １， ３２１ （１９８１）を参照）。病変部へ補充された白血球または天然に存在する白血球は、Ｆｃ受容体（「ＦｃＲ」）を通して抗体結合細胞（免疫複合体）を認識する。免疫複合体により一旦ＦｃＲが架橋されると、白血球がＴＮＦ−αを放出し（Ｄｅｂｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１， １１９７ （１９８８）を参照）、これがホスト細胞表面の特異的受容体に結合してアポトーシスまたは細胞損傷を引き起こす（Ｍｉｃｈｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １１４， １８１ （２００３）を参照）。活性化されたＦｃＲはまた、走化性サイトカインの放出を開始して、病変部へ異なる白血球サブセットを動員する（Ｃｈａｎｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９， １８９ （１９８９）を参照）。これはＦｃＲ関連自己免疫疾患の分子機構についての一般的な仮説である。
【０００５】
関節リウマチ（「ＲＡ」）は、消化管の炎症を伴う免疫疾患である。臨床的に十分特徴付けられているにも関わらず、その病因はよく分かっていない。ＲＡは通常、対称的な分布の末梢関節に関与する持続的炎症性の滑膜炎により特徴付けられる。これは軟骨破壊、骨侵食、および関節の完全性における変化を導き得る。ＲＡの原因は未だ不明であるが、滑膜中にＣＤ４＋Ｔ細胞が優勢であること、ＲＡ患者の血液および血清中における可溶性
ＩＬ−２受容体（活性化Ｔ細胞から産生される）の増加、およびＴ細胞の除去による疾病の顕著な寛解から、この疾病においてＣＤ４＋Ｔ細胞が重要な役割を果たしていることが強く推測される。ＲＡは関節内におけるＴＮＦ−α（ＴＮＦＳＦ−２としても知られる）の蓄積に付随する。通常ＴＮＦ−αは、冒された領域における炎症の原因となる感染およびその他の侵入者と戦うための白血球の移動に役立つ。健常体は過剰なＴＮＦ−αを除去できるが、関節リウマチ患者の体はそれができない。結果として、冒された領域へさらに多くの白血球が移動する。特にリウマチ性の関節におけるこのＴＮＦ−αの蓄積は、炎症、疼痛、および組織損傷の原因となる。
【０００６】
ＩｇＧ Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）は、様々な炎症反応を誘発する免疫複合体（ＩＣ）（エピトープと、このエピトープに対して作られた抗体との組み合わせ）と反応することが知られている。特定の抗原は完全に特徴付けられていないが、ＩＣはＲＡ患者の関節病変部において頻繁に確認される。ＩＣはまた、炎症を確立する補体カスケード、同様に様々な白血球のＦｃγＲへの結合による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）も活性化することが知られている。これまでに、局所浸潤性の白血球が滑液から採取され、研究されてきた。しかしながら、これらの採取物は新規の細胞および消耗した細胞の両方を含むため、結果の解釈が困難であった。末梢血白血球はそれらが疾病部位に遊走する際、ＲＡの病因に主要な役割を果たすことから、このような機能をｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣する多数の実験が行われてきた。典型的には、単核白血球が分離され、培養液に懸濁され、様々な刺激物質またはエフェクター細胞と共にＣＯ2インキュベーター内でインキュベートされる。しかしながらこのようなアッセイが行われる条件は、異なる細胞集団との連絡、赤血球からの酸素供給、同様に血漿タンパク質およびその他の成分との複雑な相互作用が欠如していることから、生理的条件には近くない。長いインキュベーション期間の間には、第二の反応が起こり得る。さらに、労働集約型の技術および実験ごとの実質的な変動のため、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の診断検査における応用は少ない。
【０００７】
ＲＡの治療は鎮痛、炎症の縮小、関節構造の保護、機能の維持、および全身性病変の制御に焦点を合わせる。選択肢は、アスピリンおよびその他の非ステロイド性抗炎症剤；メトトレキサート、金化合物、Ｄ−ペニシラミン、抗マラリア剤、およびスルファサラジンのような抗リウマチ剤；グルココルチコイド；インフリキシマブおよびエタネルセプトのようなＴＮＦ−α中和薬；ならびにアザチオプリン、レフルノミド、シクロスポリン、およびシクロホスファミドのような免疫抑制剤を含む。治療的選択肢の選択はＲＡ患者における疾病状態の評価に依存するため、疾病状態を評価し、かつ疾病の進行をモニターする新しい方法の開発が望ましいであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】末梢全血中のヒト白血球における、様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡの、ＦｃγＲを介した遺伝子発現の定量結果を示す。
【図１Ｂ】末梢全血中のヒト白血球における、様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡの、ＦｃγＲを介した遺伝子発現の定量結果を示す。
【図１Ｃ】末梢全血中のヒト白血球における、様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡの、ＦｃγＲを介した遺伝子発現の定量結果を示す。
【図２Ａ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【図２Ｂ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【図２Ｃ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【図３Ａ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの比較上の増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【図３Ｂ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの比較上の増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【図３Ｃ】関節リウマチ患者およびコントロール患者の全血における、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）刺激により誘導された様々なＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡレベルの比較上の増加倍率を、前記患者由来の無刺激全血に比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
好ましい実施形態の詳細な説明
本開示は、特定の治療法に対してＲＡ患者が適した候補であるか否かの評価における、特定の細胞刺激に応答した白血球内の差次的ｍＲＮＡ転写パターンの使用に関する。本開示はまた、ＲＡ患者に施した治療法が有効であるか否かの評価における、このような差次的転写パターンの使用にも関する。本開示はまた、ＲＡ患者の治療に使用するための候補となる薬剤のスクリーニングにおける、このような差次的転写パターンの使用にも関する。本開示はまた、患者のＲＡの状態の長期にわたる評価および疾病の進行のモニターにおける、このような差次的転写パターンの使用にも関する。
【００１０】
上記のようにＲＡの病理学は、ＲＡ患者の免疫細胞のＦｃγＲとＩＣの間の相互作用に関連する可能性がある。この可能性をさらに評価するため、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ、ＩＣの標準的モデル）を用い、健常成人コントロールおよびＲＡ患者両方におけるヒト全血中のＦｃγＲを刺激した。使用できるその他の刺激剤は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、コンカナバリン−Ａ（ＣｏｎＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ジャカリン、フコイダン、熱凝集ＩｇＥ、熱凝集ＩｇＡ、および熱凝集ＩｇＭを含む。
【００１１】
ＨＡＧを直接ヘパリン化全血中に加え、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の様々なメンバーのｍＲＮＡレベルにおける変化を評価した。ＦｃγＲＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ、およびＩＩＩ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＵｎｉＧｅｎｅデータベース）のような複数のＦｃγＲが存在するが、ＨＡＧは全てのＦｃγＲサブタイプと反応できる普遍的な刺激として作用する。ＨＡＧの刺激に起因する、ＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡメンバー（例えばＧｅｎｅＢａｎｋ ＵｎｉＧｅｎｅデータベースを参照）のｍＲＮＡレベルにおける変化を定量化した。
【００１２】
前述のように、ＦｃγＲを介する機能はＩｇＧのＦｃ部の４種のサブクラス（ＩｇＧ１〜４）、ＦｃγＲの複数のクラス（ＦｃγＲＩａ−ｃ、ＦｃγＲＩＩａ−ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａ−ｂ）、ＦｃγＲを有する白血球の異なるサブセット、および様々な下流の細胞内シグナルカスケードから成る。さらに、これらのタンパク質は複数の転写物変異体
および様々な遺伝的多型性を有する。疾病状態におけるＦｃγＲの機能の変化は、どのようなレベルでも起こり得る。しかしながら、各個体において各因子を特徴付けることは現実的ではないであろう。本開示は、個々の細胞分析、様々な遺伝子の遺伝子型同定、および細胞内シグナルカスケードの変動のような、様々な下流アッセイの利益を享受し得る個人を同定するためのスクリーニング手段としての全血（ｅｘ ｖｉｖｏ状態での付随物を含む）の使用を意図する。ＩＣはＴＮＦＳＦ−２（＝ＴＮＦ−α）およびＴＮＦＳＦ−１５（＝ＴＬ１Ａ）ｍＲＮＡを誘導することが知られているため、全ての腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）メンバーはこの方法によりスクリーニングされた。
【００１３】
用いられた方法は以下の通りである。様々なＴＮＦＳＦ遺伝子のヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋのＵｎｉＧｅｎｅデータベースから検索した。各遺伝子に対するＰＣＲプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、フォスターシティー、カリフォルニア州）およびＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ（ＲＮＡｔｕｒｅ、アーバイン、カリフォルニア州）（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６７， ７５９ （１９９４）； Ｈｙｎｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０， １０９０ （１９９６）を参照）により設計した。配列の概要を以下の表１に示す。オリゴヌクレオチドはＩＤＴ（コーラルヴィル、アイオワ州）つくばオリゴサービス（筑波、日本）、ニッポンイージーティー（富山、日本）および北海道システム・サイエンス（札幌、日本）によって合成された。
表１．プライマー配列
【００１４】
【表１】
【００１５】
熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）は、ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｍＬヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス）を６３℃において１５分間加熱することにより調製した（Ｏｓｔｒｅｉｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １５， ３１１ （１９８７）を参照）。８ウェルストリップマイクロチューブ内に１．４μｌのＨＡＧまたはコントロール（リン酸緩衝食塩水）を加え、使用まで−２０℃で保存した。７０μｌの新鮮なヘパリン化全血（ＩＣによる刺激までに４℃で保持されていた）を各ウェルへ３通りに加え、蓋を閉めて３７℃で４時間インキュベートした。血液サンプルは同日、採血によって処理した。処理後、各血液サンプルを使用まで−８０℃で凍結保存した。
【００１６】
ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡは、Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ５２， ６３４ （２００６） に説明される以下の方法によって全血から調製した。参照としてここに取り込まれる米国特許出願第１０／７９６，２９８号に開示される方法もまた用いられてよい。簡単に述べると、白血球を９６−ウェルフィルタープレート内へ捕獲するため、５０μｌの全血をその中へ移した。これらのフィルタープレート
を採取プレート上に配置し、１５０μｌの１．５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４を加えた。４℃における１２０ｘｇ、１分間の遠心に続き、５０μｌの血液サンプルを各ウェルに加えて直ちに４℃で１２０ｘｇ、２分間遠心し、続いて各ウェルを３００μｌのＰＢＳで４℃、２０００ｘｇ、５分間の遠心により１回洗浄した。その後、１％ ２−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）、０．５ｍｇ／ｍｌ プロテナーゼＫ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州、米国）、０．１ｍｇ／ｍｌ サケ精子（５ Ｐｒｉｍｅ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ／Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ、ウェストベリー、ニューヨーク州、米国）、０．１ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）、各１０ｍＭの特異的逆方向プライマーの混合物、および標準的なＲＮＡ３４オリゴヌクレオチドを追加した溶解緩衝液の原液６０μｌをフィルタープレートへ加え、続いて３７℃で１０分間インキュベートした。その後フィルタープレートをオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、ＲＮＡｔｕｒｅ）（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５７， ５１９ （１９９２）； Ｈａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４４， ２２５６ （１９９８）（両方とも参照としてここに取り込まれる）を参照）上に配置し、４℃、２０００ｘｇにおいて５分間遠心した。４℃における一晩の保存後、マイクロプレートを１００μｌの単純な溶解緩衝液で３回洗浄し、続いて１５０μｌの洗浄緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で４℃において３回洗浄した。ｃＤＮＡは、１ｘＲＴ−緩衝液、各１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、４単位のｒＲＮａｓｉｎ、および８０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）（プライマーを含まない）を含む緩衝液を加え、３７℃で２時間インキュベートすることにより、各ウェル３０μｌの溶液中で直接合成した。溶液中には特定のプライマーにより刺激されたｃＤＮＡが存在し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）により刺激されたｃＤＮＡはマイクロプレート内に固定されたままであった（Ｈｕｇｌｉ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １， ３２１ （１９８１）を参照）。ＳＹＢＲグリーンＰＣＲのため（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４， ９５４ （１９９８）（参照としてここに取り込まれる）を参照）、ｃＤＮＡを水中で４倍希釈し、３８４ウェルＰＣＲプレートに４μｌのｃＤＮＡ溶液を直接移し、５μｌのｉＴａｑ ＳＹＢＲマスターミックス（Ｂｉｏ Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）および１μｌのオリゴヌクレオチド混合物（各１５μＭの順方向および逆方向プライマー）を加え、ＰＣＲをＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（ＡＢＩ）内で、９５℃１０分間の１サイクル、続く９５℃３０秒間および６０℃１分間の４５サイクルにより行った。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲもまた用いられてよく、この場合３８４ウェルＰＣＲプレートにｃＤＮＡ溶液を直接移し、５μｌのＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（ＡＢＩ）および１μｌのオリゴヌクレオチド混合物（各１５μＭの順方向および逆方向プライマー、および３〜６μＭのＴａｑＭａｎプローブ）を加え、ＰＣＲをＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（ＡＢＩ）内で、９５℃１０分間の１サイクル、続く９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、および６０〜６５℃１分間の４５サイクルにより行う。各遺伝子は個別に増幅された。
【００１７】
ＳＹＢＲグリーンＰＣＲの条件下でプライマーダイマーが産生されなかったことを確認するため、１ｘＲＴ緩衝液を陰性コントロールとして使用した。さらに、ＰＣＲシグナルが単一のＰＣＲ産物由来であることを確認するため、それぞれの場合において融解曲線を分析した。分析ソフトウェア（ＳＤＳ、ＡＢＩ）により、一定量のＰＣＲ産物（蛍光）の産生のために必要とされたＰＣＲサイクル数であるサイクル閾値（Ｃｔ）を決定した。ΔＣｔを算出するため、ＨＡＧにより処理した３通りのサンプルのＣｔ値をＰＢＳコントロールのＣｔ値の平均によってそれぞれ通分し、未刺激サンプルに比較した刺激サンプルの増加倍率（以下、単に「増加倍率」とする）を、各ＰＣＲサイクルの効率が１００％であったと仮定することにより、２＾（−ΔＣｔ）として算出した。
【００１８】
図１Ａ−１Ｃは、末梢血白血球における、ＦｃγＲを介したｍＲＮＡ発現を示す。各デ
ータ点は、３通りの一定分量の全血からの平均＋標準偏差（図１Ａ）、または平均（図１Ｂ、１Ｃ）を示す。
【００１９】
図１Ａは発現動態の分析結果を示す。ヘパリン化全血各７０μｌの一定分量の３通りをＰＢＳ、または２００μｇ／ｍｌの熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）と混合し、３７℃において０〜８時間インキュベートした。その後ＴＮＦＳＦ−２（＝ＴＮＦ−α、●）、ＴＮＦＳＦ−８（▲）、またはＴＮＦＳＦ−１５（＝ＴＬ１Ａ、◆）、およびβ−アクチン（△）のｍＲＮＡを定量化し、増加倍率（ｙ軸）を上記のように算出した。図１Ａに示すようにＴＮＦＳＦ−２の誘導は非常に迅速であり、ピークが３０分前後で、４時間前後の大きな持続性のピークがそれに続く。ＴＮＦＳＦ−２とは対照的に、ＴＮＦＳＦ−８（図１Ａ、▲）およびＴＮＦＳＦ−１５（＝ＴＬ１Ａ）（図１Ａ、◆）はゆっくりと増加し、ピークは４時間前後であった。ＨＡＧとの８時間のインキュベーションの間にハウスキーピング遺伝子（β−アクチン）は誘導されなかった（図１Ａ、△）。従って、ＴＮＦＳＦ−２、−８および−１５のｍＲＮＡを分析するためのＨＡＧとのインキュベーションは４時間に固定した。薬物誘導性の変化を同定するためのタンパク質検出が少なくとも一晩のインキュベーションを必要とすることから、この短いインキュベーション（４時間）は、ｍＲＮＡに基づくアッセイの利点の一つである。
【００２０】
図１Ｂは容量反応を示す。ヘパリン化全血を０〜８００μｇ／ｍｌのＨＡＧと共に３７℃で４時間インキュベートし、その後様々なｍＲＮＡを定量化した（各シンボルは図１Ａのように定義される）。ＨＡＧにより誘導されたＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−８およびＴＮＦＳＦ−１５は、１０μｇ／ｍｌのＨＡＧから用量依存性であり、１００〜２００μｇ／ｍｌにおいて飽和するが、β−アクチンは変化しないことが確認された。
【００２１】
図１Ｃは、同個体から一週間以内に２回採血し、ＨＡＧにより誘導されたＴＮＦＳＦ−２（●）、ＴＮＦＳＦ−８（▲）、ＴＮＦＳＦ−１５（◆）ｍＲＮＡおよび外部コントロールｍＲＮＡ（合成ＲＮＡ３４）（○）を定量化して得られた結果を示す。図１Ｃに示すように誘導には再現性があり、８健常人の間での１日目と２日目の間のｒ2値は０．９２７（ｎ＝３２、ｐ＜０．００１）であった（図１Ｃ）。溶解緩衝液中に加えた外部合成ＲＮＡの増加倍率（ＲＮＡ３４、図１Ｃ、○）は常に１．５未満であり、これは各実験においてアッセイが適切に行われたことを示唆する。
【００２２】
ｍＲＮＡ分析に使用する実際の血液量は５０μｌであったが、このアッセイでは一反応あたり７０μｌの全血を使用した（２０μｌは８ウェルストリップからフィルタープレートへ移動する間の予備である）。従って各試験は４２０μｌ（７０μｌ／ウェルｘ２（ＨＡＧおよびＰＢＳ）ｘ３（３通り））程度の少ない全血を消費した。５０μｌの全血／ウェルから、ＲＴ−ＰＣＲ（３０μｌのｃＤＮＡに９０μｌの水を加える（１：４希釈）、４μｌのｃＤＮＡ／ＰＣＲ）により３０の異なるｍＲＮＡを定量化した。１：４希釈のｃＤＮＡからであっても、様々なＴＮＦＳＦｍＲＮＡの測定は達成された。個体間でのヘマトクリットの変動のために血清量が予測できない血清に基づく試験とは異なり、全血は操作が容易である。
【００２３】
表２は、末梢全血中のヒト白血球におけるＦｃＲを介したＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡの遺伝子発現の分析結果を示す。ここに示した結果は、ＨＡＧ刺激への応答によって２よりも大きい増加倍率を示す被験者として定義される、「応答者」被験者のパーセンテージとして表現される。健常被験者とＲＡ患者の間で陽性反応の頻度をそれぞれのＴＮＦＳＦ ｍＲＮＡについて比較するため、χ2検定を用いた。２つの集団（陽性および陰性反応）が存在したことから、ｔ−検定は増加倍率が２を超える被験者に対してのみ適用した。
【００２４】
【表２】
【００２５】
表２に示すように、ＨＡＧは全ての健常ドナー、および６１人中５９人のＲＡ患者にＴＮＦＳＦ−１５（＝ＴＬ１Ａ）ｍＲＮＡを誘導した（増加倍率＞２）。これらの結果は最近出版された報告により、ｅｘ ｖｉｖｏ状態で再現された（Ｐｒｅｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ＴＬ１Ａ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＦｃｇａｍｍａＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７８，
４０３３ （２００７）； Ｃａｓｓａｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｌｕｂｌｅ
ＴＮＦ−ｌｉｋｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ （ＴＬ１Ａ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ
ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７８， ７３２５ （２００７）（両方が参照としてここに取り込まれる）を参照）。ＨＡＧはまた、ＴＮＦＳＦ−２（ＴＮＦ−α）ｍＲＮＡを誘導することも知られている（Ｓａｔｏｈ
ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ ｉｎ
ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄ． ５， １４０ （１９８６）； Ｃｈｏｕｃｈａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩＩ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｌｖｅｏｌｉｔｉｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６， ５１９３ （２００１）（両方が参照としてここに取り込まれる）を参照）。しかしながら表２に示すように、ＴＮＦＳＦ−２は全ての個体には誘導されないことが見出され、半分を超える被験者が反応しなかった。さらに、ＨＡＧ刺激は１／３を超えるコントロールおよびＲＡ患者にＴＮＦＳＦ−８（＝ＣＤ１５３、ＣＤ３０リガンド）およびＴＮＦＳＦ−１４（＝ＬＩＧＨＴ）ｍＲＮＡを誘導し、かつ数例にＴＮＦＳＦ−１（＝リンホトキシンα、ＬＴＡ）、ＴＮＦＳＦ−３（＝リンホトキシンβ、ＬＴＢ）、ＴＮＦＳＦ−４（＝ＣＤ２５２、ＣＤ１３４リガンド）、ＴＮＦＳＦ−６（＝Ｆａｓリガンド）、ＴＮＦＳＦ−７（＝ＣＤ７０、ＣＤ２７リガンド）およびＴＮＦＳＦ−９を誘導したが、ＴＮＦＳＦ−５（＝ＣＤ１５４、ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ−１２（＝ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ−１３（＝ＣＤ２５６）およびＴＮＦＳＦ−１３Ｂ（＝ＣＤ２５７）は全く誘導されないか、わずかに誘導された。図１Ａおよび１Ｂに示すように、飽和は２００μｇ／ｍｌのＨＡＧとの４時間のインキュベーションにおいて達成されたことから、この個体ごとの変動
、あるいは刺激開始から４時間の応答者および非応答者の存在には意味がある。このｅｘ
ｖｉｖｏアッセイは様々な下流のアッセイのスクリーニングプラットフォームとして有用であると期待される。
【００２６】
リウマチ因子（ＲＦ）（２型（ポリクローナルＩｇＧに対するモノクローナルＩｇＭ）または３型（ポリクローナルＩｇＧに対するポリクローナルＩｇＭ）クリオグロブリンのいずれか）に対する試験は、ＲＡが疑われる症例における標準的な診断法である。ＨＡＧ刺激によるＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−８、およびＴＮＦＳＦ−１５誘導の結果をＲＦレベルにより分類して相互関係を模索した。結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。ＨＡＧにより誘導されたＴＮＦＳＦ−２（Ａ）、ＴＮＦＳＦ−８（Ｂ）、およびＴＮＦＳＦ−１５（Ｃ）ｍＲＮＡを、４０人の健常成人志願者（コントロール）、およびそれぞれＲＦ＜３０、３０〜１００、および＞１００ＩＵ／ｍｌを有する６１人のＲＡ患者から定量化した。２つの集団（増加倍率＞２の応答者、および非応答者）が観察されたことから、ｔ−検定は応答者集団にのみ適用した。χ2検定による分析では、これら４群の間の有意な相違は明らかではなかった。
【００２７】
図２に示すように、ＲＦの量によるＲＡ患者の分類はＴＮＦＳＦ誘導における著しい相違を明らかにした。図２Ｃに示すように、ＲＦ＞１００ＩＵ／ｍｌのＲＡ患者におけるＴＮＦＳＦ−１５の増加倍率は、コントロール（ｐ＝０．０１）およびＲＦ＜３０ＩＵ／ｍｌのＲＡ患者（ｐ＝０．０４）各々のそれよりも有意に少なかった。これはおそらくＲＦがＩＣの天然型であり、ｅｘ ｖｉｖｏでＨＡＧを添加したときにも全血中に存在したという事実に起因する。ＲＡ患者の大部分はＨＡＧ刺激への反応を維持した。このことは、長期間のＲＦへの曝露にもかかわらず、ＲＡ患者の末梢血中の循環白血球はなおＩＣを活性化できることを示す。高ＲＦを有するＲＡ患者に見られる減少したＴＮＦＳＦ−１５の応答は、末梢血白血球のＴＮＦＳＦ−１５受容体機能が何故か減少していることを示し得る。
【００２８】
ＲＦによるＦｃγＲの活性化を考慮し、ＴＮＦＳＦ−１５ ｍＲＮＡの基線レベルがＲＦへの持続的曝露によって上昇するか否かについての評価を行った。結果は、表２に示すようにＴＮＦＳＦ−５、−１３、および−１３ＢのｍＲＮＡはＨＡＧにより誘導されなかったため、これら３種のＴＮＦＳＦに比較したＴＮＦＳＦ−１５の相対的発現を算出することにより、Ｃｔに関して測定した。しかしながら、ＲＡ患者におけるＴＮＦＳＦ−１５の基線レベルは、３通りの算出全てにおいて、コントロール被験者との有意な相違は見られなかった。
【００２９】
図３は、図２に示す結果を、ＴＮＦＳＦ−２および−８（Ａ）、ＴＮＦＳＦ−２および−１５（Ｂ）、ならびにＴＮＦＳＦ−８および−１５（Ｃ）をコントロール（○）およびＲＡ（●）それぞれと比較することにより、ｘ−ｙグラフに変換して得られた結果を示す。図３Ｃに示すように、ＴＮＦＳＦ−１５の増加倍率はＲＡ（●）および健常被験者（○）の両方においてＴＮＦＳＦ−８のそれとよく相関しており、ｒ2値はそれぞれ０．４８（ｎ＝６１、ｐ＜０．００１）および０．２７（ｎ＝３８、ｐ＜０．００１）であった。しかしながらＴＮＦＳＦ−８の増加倍率は低めで、かつ陽性応答者の集団はＴＮＦＳＦ−１５のそれに比べて小さかったことから、ＲＡ患者をＲＦの量により分類した場合であっても、コントロールとＲＡの間にＴＮＦＳＦ−８についての著しい相違は見られなかった（図２Ｂ）。しかしながら図２Ａに示すように、ＴＮＦＳＦ−１５とは対照的に、ＲＦ＜３０および＜１００のＲＡ患者におけるＴＮＦＳＦ−２の増加倍率は健常被験者のそれよりも有意に（ｐ＜０．０３、０．０５）高かった。ＴＮＦＳＦ−２の増加倍率はＴＮＦＳＦ−８（図３Ａ）（コントロールおよびＲＡそれぞれ、ｒ2＝０．０３および０．０２）およびＴＮＦＳＦ−１５（図３Ｂ）（コントロールおよびＲＡそれぞれ、ｒ2＝０．１１および０．００３）のそれとは相関しておらず、ＴＮＦＳＦ−２およびＴＮＦＳＦ−８／
−１５は異なる経路由来であることが示唆される。このことは、ＴＮＦＳＦ−２およびＴＮＦＳＦ−８／−１５の動態が異なるという図１Ａに示される証拠により、さらに確認された。
【００３０】
ＴＮＦＳＦ−２（＝ＴＮＦ−α）は、ＲＡの病因に関与する炎症性サイトカインの一つであり、ＲＡの滑液中に存在する（Ｓａｘｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３１， １０４１ （１９８８）（参照としてここに取り込まれる）を参照）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ＴＮＦ−α転写物が滑膜組織マクロファージに存在することが示されてきた（ＭａｃＮａｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＩＬ−１ ａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５， ４１５４ （１９９０）（参照としてここに取り込まれる）を参照）。さらに、抗−ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（インフリキシマブ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ）およびＴＮＦ−αの作用を遮断する可溶性ＴＮＦ受容体（エタネルセプト、Ｅｎｂｒｅｌ）が、ＲＡ患者において臨床的有効性を示した（Ｗｅａｖｅｒ， Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｗ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ （Ｏｘｆｏｒｄ） ４３ Ｓｕｐｐｌ． ３：ｉｉｉ１７−ｉｉｉ２３ （２００４）（参照としてここに取り込まれる）を参照）。従って、我々のｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおいてＲＡ患者に見られた、ＨＡＧにより誘導されるＴＮＦ−α誘導の上昇は極めて妥当である。無論ｍＲＮＡの誘導は、選択的スプライシング、翻訳後修飾、および阻害性のカスケードにより、タンパク質合成ならびにそれに続く生物学的および臨床的結果に常には対応しない。しかしながらこのｅｘ ｖｉｖｏシミュレーションは、受容体および付随するタンパク質の遺伝的多型性のような、様々な下流の分子アッセイの開始点のスクリーニング手段として有効となるであろう。
【００３１】
また、ＨＡＧにより誘導されたＴＮＦＳＦ−２ ｍＲＮＡの、応答者（増加倍率＞＝２）および非応答者（増加倍率＜２）の間での患者の臨床的特徴も比較した。結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
表３に示すように、ＲＦ＜３０ＩＵ／ｍｌ群の応答者集団は、非応答者の集団よりも有意に若かった（ｐ＝０．０４）。年齢、性別、罹病期間、ＣＲＰ、腫脹関節の数、および圧痛のある関節の数のようなその他の臨床パラメータについては、全てのＲＦ群において応答者と非応答者の間に有意な違いはなかった（表３）。興味深いことに全ての患者を組み合わせた場合、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体または可溶性ＴＮＦ受容体のような生物学的薬剤で処置した患者の数は、非応答者集団よりも応答者集団において有意に多かった（ｐ＝０．０２）（表３）。これらの抗ＴＮＦ−α薬剤の使用は、未知の負のフィードバック機構を通してＦｃγＲを介するＴＮＦ−αの作用を増大し得るか、またはこれらの患者は生物学的治療法のよい候補者であり得る。ＨＡＧにより誘導されるＴＮＦ−αｍＲＮＡに応答を示すＲＡ患者は、ＲＡ病理学においてＴＮＦ−αが有意に関与する可能性がさらにあり、それ故、これらの生物学的薬剤のよい候補者である可能性がさらにある。生物学的薬物は非常に高価であり、全ての患者に有効ではなく、かつ時折望ましくない副作用を示すため、これらの薬物に応答する可能性のある患者の同定は、個別化された医学としての臨床的有用性をもつであろう。
【００３４】
細胞毒性試験は一般に、ＲＡにおいて起こると信じられている免疫システムの活性に起因する、実際の細胞死を研究するために用いられてきた。細胞毒性試験は一般に、51Ｃｒ負荷細胞とエフェクター細胞とを様々な比においてインキュベートすること、ならびに死滅または損傷した細胞から放出された51Ｃｒの放射活性量を定量化することにより行われる（Ｄｕｎｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，
３９ （１９７４）を参照）。ある場合には、放射性物質は蛍光定量物質のような非放射性物質に置き換えられているが（Ｋｒｕｇｅｒ−Ｋｒａｓａｇａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５６， １ （１９９２）を参照）、基本的原理は変化していない。従って細胞毒性試験の結果は実際の細胞死を反映する。
【００３５】
しかしながら、細胞毒性試験は非生理的な実験条件下で行われ、このような研究過程において複雑な細胞と細胞、および細胞と血漿の相互作用を評価することは困難である。さらに、細胞毒性試験はどのＴＮＦＳＦメンバーが細胞死の原因であるかを示さない。単一のエフェクター細胞は多数の標的細胞の死滅には十分でないことから、一旦エフェクター細胞が標的細胞を認識すると、エフェクター細胞の機能は標的を死滅させることのみではなく、その他のエフェクター細胞を動員することでもある。この動員機能は走化性因子の放出に代表されると考えられている。エフェクター細胞から放出されるこのような走化性因子の同一性は、古典的な細胞毒性試験によっては明らかにされないであろう。しかしながら本開示中で説明されるアッセイシステムは、エフェクター細胞における遺伝子発現の多数のクラスを同時に同定可能である。
【００３６】
全血の使用は、分離された白血球の培養液中での使用よりも好ましい。その理由は、前者は後者よりもさらに生理的であり、かつ白血球の全集団をスクリーニングできることである。全血の長めのインキュベーションはさらなるアーチファクトを生じ得る。従って理想的な方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏからｅｘ ｖｉｖｏへの切り替えによる短期間のインキュベーションの間に、全血中でキラーの初期シグナルおよび動員シグナルを同定することである。ｍＲＮＡの転写は、タンパク質合成または最終の生物学的結果のいずれよりも早期の出来事である。従って、ｍＲＮＡは論理にかなった標的である。
【００３７】
本方法は全血を使用することから、ＴＮＦＳＦ非活性化治療法に対する可能な応答性を評価し、かつ治療的応答をモニターする、ＲＡの診断試験として使用されてよい。特に、ＲＡを有するヒトがＴ細胞刺激に応答して転写されたｍＲＮＡを標的とする治療法に応答する可能性があるか否かを決定する方法の好ましい実施形態においては、前述のようにＲＡ患者から全血を採取し、血液サンプルをＨＡＧ刺激へ、かつ必要に応じてコントロール刺激（ＰＢＳ）へ供する。ＴＮＦＳＦ−２，ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５ｍＲＮＡの量は上記のサンプル中で測定されてよい。ＨＡＧによる刺激後、これらのうち１以上のｍＲＮＡのレベルが有意に上昇している（示したように、例えば増加倍率が２を超える）ＲＡ患者は、これらのｍＲＮＡを標的とした治療法のよい候補である。
【００３８】
さらに、ＴＮＦＳＦ−２，ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５ｍＲＮＡのうちの１以上を標的にしたＲＡ治療法の有効性を患者において評価する方法の好ましい実施形態においては、処置開始前に、ＨＡＧ刺激後の全血中のｍＲＮＡ量のコントロール刺激後の量に対する第一の比を求める。処置開始後に、ＨＡＧ刺激後の全血中のｍＲＮＡ量のコントロール刺激後の量に対する第二の比を求める。第一の比が第二の比よりも大きいような、比における有意な相違により、治療法の有効性が示される。このような治療法は例えば、インフリキシマブまたはエタネルセプトの投与を含んでよい。
【００３９】
重要なことには、このｅｘ ｖｉｖｏ法はＴＮＦＳＦ−２，ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５ｍＲＮＡのうちの１以上、特に疾病病理学に関わることが知られているＴＮＦＳＦ−２の、抗ＦｃＲを介した発現を阻害する化合物のスクリーニングに使用できる
。このような化合物は、これらの新しい薬物候補が白血球におけるｍＲＮＡ産生を転写レベルで遮断し得ることから、興味あるものとなるであろう。このことは、ＲＡに対する薬剤の発展に対し新しい戦略を提供するであろう。
【００４０】
開示されたシステムを用い、それによりＲＡ治療のための推定される薬剤を同定する薬物化合物のスクリーニング方法の実施形態において、全血は反応者であるＲＡ患者から得られ、ここで反応者は、その白血球がＨＡＧのようなＴ細胞刺激に曝露されたとき、ＲＡに付随するｍＲＮＡのレベルにおいて少なくとも２倍の増加を示す個体である。ＨＡＧ刺激後の被験者の全血中のｍＲＮＡ量のコントロール刺激後の量に対する第一の比を算出した。被験者からのさらなる全血サンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏで薬物化合物へ曝露し、その後上記のように差次的に刺激した。その後これら曝露したサンプルの、ＨＡＧ刺激後の全血中のｍＲＮＡ量のコントロール刺激後の量に対する第二の比を算出した。第一の比が第二の比よりも大きいような、比における有意な相違により、薬物化合物がＲＡの有望な治療法としてのさらなる検討のための候補であることが示される。
【００４１】
加えて、患者から得られた白血球を含むサンプル中のＴＮＦＳＦ−２，ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５ｍＲＮＡのうちの１以上のレベルを測定することにより、ＲＡ患者の疾病状態をモニターする方法の好ましい実施形態において、第一の時に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの熱凝集ＩｇＧ抗体を用いたＴ細胞刺激またはその他の刺激後の全血中のｍＲＮＡ量の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのコントロール刺激後の量に対する第一の比を得る。前記第一の時に続く第二の時に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞刺激後の全血中のｍＲＮＡ量の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのコントロール刺激後の量に対する第二の比を得る。比における有意な相違により、疾病状態の変化が示される。例えば、第二の比が第一よりも大きな場合には疾病の進行が示されるが、第一の比がより大きな場合には疾病の退行が示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチ患者が抗ＴＮＦ治療法に応答する可能性があるか否かを決定する方法であって、
前記患者由来の第一のサンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
刺激後に、第一のサンプル中の腫瘍壊死因子スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定すること：
第二のサンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること：
第二のサンプル中の前記ｍＲＮＡの量を測定すること；
第一のサンプル中のｍＲＮＡ量の第二のサンプル中のｍＲＮＡ量に対する比を決定すること；および
該比が約２：１又はそれ以上の場合に、患者が該治療法に応答する可能性があると決定することを含む方法。
【請求項２】
該ｍＲＮＡがＴＮＦＳＦ−２をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一のサンプル中の白血球を刺激することが第一のサンプルに熱凝集ヒトＩｇＧを混合することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一および第二のサンプルのうち少なくとも１つが全血を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
コントロール刺激がリン酸緩衝食塩水である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該治療法がインフリキシマブおよびエタネルセプトから成る群より選択される薬剤の投与を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
関節リウマチ患者が、抗ＦｃＲを介した腫瘍壊死因子スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する治療法に応答する可能性があるか否かを決定する方法であって、
前記患者由来の第一のサンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
刺激後に、第一のサンプル中の腫瘍壊死因子スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定すること：
第二のサンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること：
第二のサンプル中の前記ｍＲＮＡの量を測定すること；
第一のサンプル中のｍＲＮＡ量の第二のサンプル中のｍＲＮＡ量に対する比を決定すること；および
該比が約２：１又はそれ以上の場合に、患者が該治療法に応答する可能性があると決定することを含む方法。
【請求項８】
該ｍＲＮＡがＴＮＦＳＦ−２をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第一のサンプル中の白血球の刺激が第一のサンプルに熱凝集ヒトＩｇＧを混合すること含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第一および第二のサンプルのうち少なくとも１つが全血を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
コントロール刺激がリン酸緩衝食塩水である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
関節リウマチを治療するための候補薬剤を同定する方法であって、
熱凝集ヒトＩｇＧに曝露したとき、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）タンパク質をコードするｍＲＮＡの転写が少なくとも１．５倍増加する白血球を有するヒト由来の白血球を含む、第一、第二、第三、および第四のサンプルを得ること；
第一のサンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
第二のサンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること：
刺激後の、第一および第二のサンプル中のｍＲＮＡの量を測定すること；
第三および第四のサンプルを薬剤に曝露すること；
曝露後の第三サンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
第四サンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること：
刺激後の第三および第四サンプル中のｍＲＮＡレベルを測定すること；および
第一のサンプルから得られたデータを第三サンプルから得られたデータに比較することおよび第二のサンプルから得られたデータを第四サンプルから得られたデータに比較することを含み、比較データ間の有意な相違により候補薬剤が示唆される、方法。
【請求項１３】
第一および第二のサンプル中のｍＲＮＡ量の測定後、第一のサンプル中のｍＲＮＡ量の第二のサンプル中のｍＲＮＡ量に対する第一の比が算出され；
第三および第四サンプル中のｍＲＮＡレベルの測定後、第三サンプル中のｍＲＮＡ量の第四サンプル中のｍＲＮＡ量に対する第二の比が算出され；かつ
第一および第二の比が比較され、比の間が有意に相違する候補薬剤を示唆する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該ＴＮＦＳＦタンパク質がＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第一および第三サンプル中の白血球を刺激することがサンプルに熱凝集ヒトＩｇＧを混合することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
コントロール刺激がリン酸緩衝食塩水である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
第一、第二、第三、および第四サンプルのうち少なくとも１つが全血を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
比における有意な相違は、第一の比が第二の比よりも大である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
該ｍＲＮＡがＴＮＦＳＦ−２をコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
該ＴＮＦＳＦタンパク質がＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
第一および第三サンプル中の白血球を刺激することがサンプルに熱凝集ヒトＩｇＧを混合すること含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
コントロール刺激がリン酸緩衝食塩水である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
第一、第二、第三、および第四サンプルのうち少なくとも１つが全血を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
該ｍＲＮＡがＴＮＦＳＦ−２をコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
患者の関節リウマチの状態を評価する方法であって、
白血球を含み、かつ患者から第一の時に得られた第一のサンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
刺激後に第一のサンプル中の腫瘍壊死因子スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）タンパク質をコードするｍＲＮＡ量を測定すること；
患者から前記第一の時に得られた白血球を含む第二のサンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること；
刺激後に第二のサンプル中のｍＲＮＡ量を測定すること；
第一のサンプル中のｍＲＮＡ量の第二のサンプル中のｍＲＮＡ量に対する第一の比を決定すること；
白血球を含み、かつ前記第一の時に続く第二の時に患者から得られた第三サンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
刺激後に第三サンプル中のｍＲＮＡ量を測定すること；
患者から前記第二の時に得られた白血球を含む第四サンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること；
刺激後に第四サンプル中のｍＲＮＡ量を測定すること；
第三サンプル中のｍＲＮＡ量の第四サンプル中のｍＲＮＡ量に対する第二の比を決定すること；および
第一および第二の比を比較し、第一および第二の比における有意な相違が疾病状態の変化を示唆することを含む方法。
【請求項２６】
該ＴＮＦＳＦタンパク質がＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第一および第三サンプル中の白血球を刺激することがサンプルにヒト熱凝集ＩｇＧを混合することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
コントロール刺激がリン酸緩衝食塩水である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
第一、第二、第三、および第四サンプルのうち少なくとも１つが全血を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
第二の比が第一の比よりも、比における有意な相違が大きく、かつ疾病状態の変化が疾病の進行である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
第一の比が第二の比よりも、比における有意な相違が大きく、かつ疾病状態の変化が疾病の退行である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
該ｍＲＮＡがＴＮＦＳＦ−２をコードする、請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
関節リウマチ患者が抗ＴＮＦ治療法に応答する可能性があるか否かを決定する方法であって、
前記患者由来の第一のサンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
刺激後に、第一のサンプル中の腫瘍壊死因子スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定すること：
第二のサンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること：
第二のサンプル中の前記ｍＲＮＡの量を測定すること；
第一のサンプル中のｍＲＮＡ量の第二のサンプル中のｍＲＮＡ量に対する比を決定すること；および
該比が約２：１又はそれ以上の場合に、患者が該治療法に応答する可能性があると決定することを含む方法。
【請求項２】
該ｍＲＮＡがＴＮＦＳＦ−２をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一のサンプル中の白血球を刺激することが第一のサンプルに熱凝集ヒトＩｇＧを混合することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一および第二のサンプルのうち少なくとも１つが全血を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
コントロール刺激がリン酸緩衝食塩水である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該治療法がインフリキシマブおよびエタネルセプトから成る群より選択される薬剤の投与を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
関節リウマチ患者が、抗ＦｃＲを介した腫瘍壊死因子スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する治療法に応答する可能性があるか否かを決定する方法であって、
前記患者由来の第一のサンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
刺激後に、第一のサンプル中の腫瘍壊死因子スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定すること：
第二のサンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること：
第二のサンプル中の前記ｍＲＮＡの量を測定すること；
第一のサンプル中のｍＲＮＡ量の第二のサンプル中のｍＲＮＡ量に対する比を決定すること；および
該比が約２：１又はそれ以上の場合に、患者が該治療法に応答する可能性があると決定することを含む方法。
【請求項８】
該ｍＲＮＡがＴＮＦＳＦ−２をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第一のサンプル中の白血球の刺激が第一のサンプルに熱凝集ヒトＩｇＧを混合すること含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第一および第二のサンプルのうち少なくとも１つが全血を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
コントロール刺激がリン酸緩衝食塩水である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
関節リウマチを治療するための候補薬剤を同定する方法であって、
熱凝集ヒトＩｇＧに曝露したとき、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）タンパク質をコードするｍＲＮＡの転写が少なくとも１．５倍増加する白血球を有するヒト由来の白血球を含む、第一、第二、第三、および第四のサンプルを得ること；
第一のサンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
第二のサンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること：
刺激後の、第一および第二のサンプル中のｍＲＮＡの量を測定すること；
第三および第四のサンプルを薬剤に曝露すること；
曝露後の第三サンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
第四サンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること：
刺激後の第三および第四サンプル中のｍＲＮＡレベルを測定すること；および
第一のサンプルから得られたデータを第三サンプルから得られたデータに比較することおよび第二のサンプルから得られたデータを第四サンプルから得られたデータに比較することを含み、比較データ間の有意な相違により候補薬剤が示唆される、方法。
【請求項１３】
第一および第二のサンプル中のｍＲＮＡ量の測定後、第一のサンプル中のｍＲＮＡ量の第二のサンプル中のｍＲＮＡ量に対する第一の比が算出され；
第三および第四サンプル中のｍＲＮＡレベルの測定後、第三サンプル中のｍＲＮＡ量の第四サンプル中のｍＲＮＡ量に対する第二の比が算出され；かつ
第一および第二の比が比較され、比の間が有意に相違する候補薬剤を示唆する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該ＴＮＦＳＦタンパク質がＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第一および第三サンプル中の白血球を刺激することがサンプルに熱凝集ヒトＩｇＧを混合することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
コントロール刺激がリン酸緩衝食塩水である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
第一、第二、第三、および第四サンプルのうち少なくとも１つが全血を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
比における有意な相違は、第一の比が第二の比よりも大である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
該ｍＲＮＡがＴＮＦＳＦ−２をコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
該ＴＮＦＳＦタンパク質がＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
第一および第三サンプル中の白血球を刺激することがサンプルに熱凝集ヒトＩｇＧを混合すること含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
コントロール刺激がリン酸緩衝食塩水である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
第一、第二、第三、および第四サンプルのうち少なくとも１つが全血を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
該ｍＲＮＡがＴＮＦＳＦ−２をコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
患者の関節リウマチの状態を評価する方法であって、
白血球を含み、かつ患者から第一の時に得られた第一のサンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
刺激後に第一のサンプル中の腫瘍壊死因子スーパーファミリー（「ＴＮＦＳＦ」）タンパク質をコードするｍＲＮＡ量を測定すること；
患者から前記第一の時に得られた白血球を含む第二のサンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること；
刺激後に第二のサンプル中のｍＲＮＡ量を測定すること；
第一のサンプル中のｍＲＮＡ量の第二のサンプル中のｍＲＮＡ量に対する第一の比を決定すること；
白血球を含み、かつ前記第一の時に続く第二の時に患者から得られた第三サンプル中の白血球のＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激すること；
刺激後に第三サンプル中のｍＲＮＡ量を測定すること；
患者から前記第二の時に得られた白血球を含む第四サンプル中の白血球をｉｎ ｖｉｔｒｏでコントロール刺激に曝露すること；
刺激後に第四サンプル中のｍＲＮＡ量を測定すること；
第三サンプル中のｍＲＮＡ量の第四サンプル中のｍＲＮＡ量に対する第二の比を決定すること；および
第一および第二の比を比較し、第一および第二の比における有意な相違が疾病状態の変化を示唆することを含む方法。
【請求項２６】
該ＴＮＦＳＦタンパク質がＴＮＦＳＦ−２、ＴＮＦＳＦ−８、またはＴＮＦＳＦ−１５である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第一および第三サンプル中の白血球を刺激することがサンプルにヒト熱凝集ＩｇＧを混合することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
コントロール刺激がリン酸緩衝食塩水である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
第一、第二、第三、および第四サンプルのうち少なくとも１つが全血を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
第二の比が第一の比よりも、比における有意な相違が大きく、かつ疾病状態の変化が疾病の進行である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
第一の比が第二の比よりも、比における有意な相違が大きく、かつ疾病状態の変化が疾病の退行である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
該ｍＲＮＡがＴＮＦＳＦ−２をコードする、請求項２６に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５０２５３５（Ｐ２０１１−５０２５３５Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３４１２７（Ｐ２０１０−５３４１２７）
【出願日】平成２０年１１月１１日（２００８．１１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３１３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７０４４２
【国際公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【出願人】（０００００４４５５）日立化成工業株式会社 (4,649)
【出願人】（５００２９４９５８）ヒタチ ケミカル リサーチ センター インコーポレイテッド (27)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１１日（２００８．１１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３１３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７０４４２
【国際公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【出願人】（０００００４４５５）日立化成工業株式会社 (4,649)
【出願人】（５００２９４９５８）ヒタチ ケミカル リサーチ センター インコーポレイテッド (27)
【Ｆターム（参考）】
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