染色体プロファイリングのための方法と装置
間期染色体プロファイル生成のための方法及び装置。その方法は、プロファイリングのための染色体を有する細胞を含むサンプルの確保、ＤＮＡプローグが前記染色体上のほぼ等距離位置に少なくとも１つの染色をマーキング出来る種固有のＤＮＡプローグ；サンプルのＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション；サンプルの比色分析のための染色体上に区分比カラーバンドを生成するための複数酵素の使用；及び染色体プロフィールを決定するための視覚分析の使用、からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は細胞遺伝学分野、特に染色体プロファイリングに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞遺伝学は細胞ライフサイクルの中期段階の間の染色体研究の分野である。染色体が縮合の最高点にあり、そして正常及び病気の状態の両方における研究に最も都合がよいのはこの段階である。現在細胞遺伝学分野（世界的に）において最も頻繁に使用される技術は短期（１０日以内）又は長期（４５日迄）のテスト用に提供される試料培養である。試料は末梢血、骨髄、羊水、固形組織、受胎産物、胸膜液等のような多くの変化タイプを含む。培養成功の後、色々なプロセスにより、テストされる個々の物が遺伝子異常を有すかを決定するため、中期染色体を一般的に確保し読み取る。このプロセスは全く複雑で、極めて多くの時間と専門知識は勿論のこと多くの化学物質と試薬の使用を必要とする。
【０００３】
以下を含む色々な診断目的のために染色体研究は頻繁に必要とされる：
（１）出産診断
（２）末梢血（異常表現型特性、知能発育不全のある患者、原因が遺伝子かどうかを決定するための多くの流産問題は勿論のこと不妊症問題を有する夫婦のためのテスト；
（３）白血病／リンパ腫診断（薬手順の管理は勿論のこと正確な診断の両方に不可欠な）；
（４）固形腫瘍診断と治療管理（膀胱、前立腺、腎臓、胸、肺等を含む癌のための）
【０００４】
約１５年間、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）と称する技術を使用して染色体／核型情報を得てきた。しかしこの技術は限られている。ＦＩＳＨ技術を利用して、完全な核型情報を得ることはできない。著しい量のＦＩＳＨ試験が間期段階核に使用されてきたが、これでは色を更なる培養なく、通常の細胞遺伝学技術により見ることはできない。最近より完全な染色体分析又は核型情報が多重ＦＩＳＨ（Ｍ−ＦＩＳＨ）技術の使用で可能となった。この技術に関する問題は、テスト用染色体を得るためには、なお１つの培養を必要とすることであった。その時だけ新しい又は疑いのない変化の検知は勿論のこと、疑わしい異常をＭ‐ＦＩＳＨは証明することができた。
【０００５】
ごく最近、多色バンド（ＭＣＧ）、多色染色体バーコード技法、異種間カラーバンド技術（ｒｅ−ＦＩＳＨ），分光カラーバンド技術（ＳＣＡＮ）のような数種の多色分バンド技術が開発された。これら技術全ての中で、ＭＣＧのみ間期染色体に適用されてきた。
【０００６】
殆どのＦＩＳＨベースの技術は疾病固有のプローブを使用する。疾病固有のプローブが生成される場合、プローブセットは転座、欠失、反転、増幅又は他の既知染色体異常のような固有変性の現存知識に限定される。疑わしい遺伝子異常の予備知識なしに、細胞遺伝学は未知又は疑わしくない遺伝子の不調の診断を行うことが出来なかった。全染色体ペイントを利用することにより予め検知されない転座を認識することが可能になる。しかしこれは非常に退屈なプロセスであり、２４の別々の染色体ペイントプローブセットの使用を必要とした。更にこのプロセスは遺伝子異常の単一タイプの情報のみ、即ち２つの異なる染色体間の転座の情報のみを生成する。疾病プロセスでは、しばしば遺伝子変性は、転座、欠失又は反転を含む多くの発現からなる。これらの他の変化、特に染色体間変化が現在の染色体ペイントプローブセットにより全て検出できるわけではない。代わりに、それらは又別のセットの又は多くのセットの疾病固有プローブを必要とし、これは普通の臨床細胞遺伝学研究所にとって法外な費用となる。
【０００７】
中期染色体研究のための上記技術には、多くの付加的欠点が存在する。これらは以下を含む；個々の染色体認識のために得られた非常に複雑なカラーバンド・パターン；バンドパターンを翻訳するためのフィルタ、ダイクロニックミラー、ＣＣＤカメラ、高性能コンピュータソフトウェア、インフェロメータ及び他の特別な装置のような非常に高価な装置の使用を必要とする技術；完全核型情報、即ちロバートソン転座のようなあるタイプの異常検出を提供しない技術；蛍光は消え、結果としてのバンドパターンは永久ではない、蛍光色素ベースである各技術；コンピュータソフトウェアの使用により割り当てられた擬似色であり、簡単な人の観察では翻訳できない結果のバンドパターン；研究の場で有効な臨床細胞遺伝学研究所での通常使用には実用的でない技術；及び、マーカ染色体は診断と多くの臨床状況での予後の両方を有すので、特に重要である、構造的に変性し、一般にトレースできないマーカ染色体。
【０００８】
１つの遺伝子異常は遺伝子診断で特に重要であり、この異常をロバートソン転座と称する。ロバートソン転座はそれらのセントロメアにより結合し、その結果核型では１つ少ないセントロメアになる末端動原体型染色体間の転座である。ロバートソン転座は特に出産診断において臨床的に重要である。片親ダイソミー（ＵＰＤ）と呼ばれる病状は染色体１３、１４、１５に存在する。出産診断で検知される胎児におけるＵＰＤは重度の臨床的発現の一因となり、乳児死亡率を著しく向上させる。
【０００９】
この開示で引用される文献や資料は説明した明らかな教示と矛盾しない程度まで、その全体を参考として本明細書に組み込まれる。
【発明の開示】
【００１０】
従って、染色体プロファイリングのための方法と装置の提供がこの発明の目的である。
【００１１】
この発明の態様は以下を含む間期染色体プロファイリングを発生させるための方法を含む、即ち、プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；染色体上のほぼ等距離位置にある少なくとも１つの染色体のマーキングが可能な種固有ＤＮＡプローブの確保；サンプルとＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション；サンプルの比色分析用染色体上に区分カラーバンドを生成させるための複数酵素の使用；比色分析に基づく染色体プロファイリングを決定するための視覚分析の使用；
【００１２】
方法は更にin situハイブリダイゼーションを意図する。典型的実施形態でin situハイブリダイゼーションはスライド上で発生できる。このスライドは例えば、前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズし、そして分析するための一連のウエルからなる。
【００１３】
この発明の別の実施形態で、視覚分析手段は光学顕微鏡、又はＣＣＤカメラを含む。
【００１４】
本発明の態様は以下を意図する、即ち羊水からのテストサンプルを得ること；末梢血；胸膜液；骨髄；腫瘍組織；分析用染色体を有する細胞を含む受胎産物又は他の発生源。
【００１５】
本発明の態様による方法は例えば転座又は特にロバートソン転座のような染色体異常の視覚検出を含む。
【００１６】
本発明の態様による方法は例えば完全な核型を生成することを意図する。
【００１７】
本発明は又以下のステップを含む比色in situハイブリダイゼーション法を含む、即ち、プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；染色体上のほぼ等距離位置に染色体をマーキングすることができる種固有ＤＮＡプローブの確保；ＤＮＡプローブとサンプルのin situハイブリダイゼーション；比色分析用染色体上に区分カラーバンドを生成するための複数酵素の使用；及び前記染色体のプロファイルを決定するため視覚分析の使用。
【００１８】
この方法は更にスライド上のサンプルをin situハイブリダイゼーションするステップを含み、このスライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズしそして分析するため一連のウエルを含む。
【００１９】
本発明は又以下のステップからなる染色体中のロバートソン転座を視覚検出する方法を含む。即ち
プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
各染色体上のほぼ等距離位置に少なくとも２つの染色体をマーキングすることができるＤＮＡプローブの確保；
前記ＤＮＡプローブとサンプルのハイブリダイゼーション；
比色分析用染色体上に区分カラーバンドを生成するための複数酵素の使用；及び
ロバートソン転座が前記染色体間に発生しているかどうかを決定するための視覚分析の使用。
【００２０】
本発明によると、この方法は又前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズしそして分析するための一連のウエルを含むスライド上でin situでサンプルをハイブリダイズすることを含む。この方法は又光学顕微鏡又はＣＣＤカメラを利用する視覚分析を含む。
【００２１】
この方法は又、サンプルの複製起点が；羊水；末梢血；胸膜液；骨髄；腫瘍組織；及び受胎産物；から構成されるグループから選択される、ＤＮＡサンプルを意図する。
【００２２】
この発明の追加の実施形態で、マーカ染色体の検出方法は以下のステップを含む；
プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
各染色体上のほぼ等距離位置に少なくとも２つの染色体をマーキングすることができるヒトＤＮＡプローブの確保；
ＤＮＡプローブとサンプルのハイブリダイゼーション；および
染色体の比色分析用染色体上に区分カラーバンドを生成するための複数酵素の使用；
【００２３】
マーカ染色体検出方法はＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイゼーション及び分析用の一連のウエルを含むスライド上サンプルのin situハイブリダイゼーションを含む。この検出は光学顕微鏡又はＣＣＤカメラを利用する視覚分析により行うことができる。
【００２４】
検出用ＤＮＡサンプルは以下の１つから作り出す；羊水；末梢血；胸膜液；骨髄；腫瘍組織；及び受胎産物。
【００２５】
この発明の別の態様は以下のステップを含む染色体のラベリング法を意図する；ラベリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保、ほぼ等距離位置に染色体をラベリングできる種固有ＤＮＡプローブの確保、染色体がラベリングされるＤＮＡとプローブ染色体のハイブリダイゼーション。
【００２６】
この方法はスライド上での染色体のin situハイブリダイゼーションを含み、このスライドがＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズしそして分析するための一連のウエルを含む。この方法は更に以下から構成されるグループから選択されるＤＮＡ複製起点を意図する；羊水；末梢血；胸膜液；骨髄；腫瘍組織；及び受胎産物。
【００２７】
この発明の態様による典型的実施形態で、間期染色体プロファイリング用キットは、染色体上のほぼ等距離位置に少なくとも１つの染色体をマーキングできる複数種固有ＤＮＡプローブ、比色分析用染色体上に区分カラーバンドを生成するための複数の酵素、及び染色体をプローブセットとin situハイブリダイゼーションするための染色体上の区分カラーバンド生成のための複数酵素、を含む。
【００２８】
このキットは更に例えば顕微鏡又はカメラのような１つの染色体の比色分析用視覚分析手段を含む。
【００２９】
この発明の態様による別実施形態は、複数の種固有ＤＮＡプローブを含むプローブセットを含み、このＤＮＡプローブは染色体上のほぼ等距離位置で少なくとも１つの染色体をマーキングするように設計される。プローブセットは更に前記染色体上にカラーバンドを生成するための複数酵素を含む。本発明の態様による更なる実施形態は、in situ間期染色体ハイブリダイゼーションが起こる複数のウエルを更に有するガラススライドを有する、in situ間期染色体用スライドを含む。
【００３０】
付加的細胞培養の必要なく、完全な染色体と細胞／種タイプからの核型情報を得るため、間期染色体プロファイリング（ＩＣＰ）を使用する染色体プロファイリングの確保方法を上で記述した。これは間期核上での専用ＤＮＡプローブセットとＣＩＳＨ技術を組み合わせることにより達成される。明細書で開示される方法を利用して、全染色体異常の約９９％を検出することができ、そして結果は４８時間より短い回転時間（ＴＡＴ）で生成される。
【００３１】
本発明は、複数スライド上のハイブリダイゼーションチャンバーで間期細胞中の個々のヒト染色体を観察することにより完全ヒト核型情報を確保するための方法と装置に関する。ＩＣＰは固有の又は疑いのある疾病の存在に関する予備知識を必要とせず、既知又は未知の遺伝子変化を検出し、そして単一テストで完全な核型を提供する。更にＩＣＰは細胞培養を必要とせず、そして間期核におけるほぼ全てのタイプの染色体変化のための検出メカニズムを提供する。
【００３２】
この発明の更なる目的と利点は以下の本発明の詳細開示と同様の参照番号は同様の特性又は要素を意味する付属図面を参照することにより明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
さて図１に関して、各染色体はＩＣＰカラーバンド・イデオグラムにより表示される。セントロメア／ペリセントロメア領域は黒；短腕テロメアは青；及び長腕テメロアは赤である。末端動原体型染色体１４、１５、２１に対し、ＩＣＰイデオグラムは２つの部分、左と右に分割される。左イデオグラムは染色体が第１に導入された場合のカラーバンドを表し、右イデオグラムは染色体が第２に導入された場合のカラーバンドを表す。第１と第２という言葉はスライド１上末端動原体型染色体組み合わせの夫々の染色体の順を意味する。染色体１３と２２に関し、それらが夫々常に第１と第２に導入されるので、ＩＣＰカラーバンドは１つだけしか存在しない。図２は４００バンドレベルの伝統的Ｇバンドイデオグラムを示す。
【００３４】
例えばヒト染色体のような各染色体は色々な染色体上に固有ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーションにより間期において確認することができる。これらの配列は染色体セントロメア又はテロメア又はセントロメアとテロメア間にある領域固有の領域上に配置することができる。染色体上の配列空間は染色体の短腕と長腕の全長に基づきほぼ等距離になるよう設計される。ほぼ等距離概念を使用して、ヒト染色体腕は全て３グループ：グループ１（小）、グループ２（中）、グループ３（大）の１つに分類できる。各グループ内では、個々のバンドは、ほぼ同一距離を隔て配置される。この間隔は開示の着色技術と共に各染色体に固有のカラーバンド・パターンを生成する。染色体はそれらの寸法に基づき数グループに分類され、そして各グループ内の染色体は確認を容易にするため同一色配列パターンを有する。
【００３５】
各染色体腕は区分カラーバンド「署名」を有する。この署名からの少しの変化は遺伝子変化（即ち染色体異常）を示す。一般に、染色体のセントロメアは黒に着色され、そして１つはセントロメアから腕端へ進むので、カラーバンドは染色体端部（テロメア）バンドを強調するために使用される２つの主色の比率を変化させた混合物により生成される。例により、もし短腕テロメアが青に着色され、かつ長腕テロメアが赤に着色されておれば、セントロメアとテロメア間のカラーバンドは濃赤、濃青、薄青、紫及び赤褐色のような赤と青の混合度合いを変えることができる。この色区分で、染色体変化はＦＩＳＨベースの検出器、フィルタ、ダイクロニックミラー、ＣＣＤカメラ、高性能コンピュータソフトウェア又は干渉分光装置の分野で現在使用されている方法により色処理を使わず、簡単な光学顕微鏡下で間期細胞中に容易に確認できる。
【００３６】
別の実施形態で、染色体を区分色着色部位の間で染色体の短腕及び長腕に沿って付加的等距離位置で黒又は他の区分色に着色することができる。このような付加的着色は、使用者が確認できるような目標を提供することは勿論のこと、分解能を向上させることにより遺伝子異常の視覚検出をより容易にする。本明細書で使用されるように、色区分バンドは主バンドと称し、そして例えば黒バンドのような付加ソリッドバンドはミラーバンドと称する。
【００３７】
染色体の短腕と長腕間の更なる区分を提供するため、短腕と長腕のミラーバンドを着色し夫々の染色体腕間で異なるバンド厚さを提供する。例えば短腕ミラーバンドを着色し染色体の長腕上のミラーバンドより薄い均一厚さを有するミラーバンドを提供することができる。この着色により単一染色体を含む異常の検出がより容易になる。
【００３８】
ＦＩＳＨと異なり、この発明はハイブリダイゼーション配列の検出には比色in situハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）に依存する。この発明態様によると、特定比率でのＤＮＡプローブと結合される特定酵素の混合により色々な色が生成される。これにより間期細胞における染色体の同一部位での順次又は同時酵素反応が可能となる。
【００３９】
現在、この分野のＦＩＳＨベースの取り組みは、特定ＤＮＡプローブを利用して中期染色体又は間期核のいずれかを使用して既知の遺伝子異常を検出する。診断を確立するため、特定セットのプローブから始め、もしある結果が「正」であれば、テストを終了する。しかし臨床医師からの初期「実用的診断」は非常に頻繁に間違っており、研究者はＤＮＡプローブセットを多数回、順に適用することを強いられる。これは単に時間がかかるだけでなく、非常に費用がかかる。最も悪いことは、核型を完成させそして適切な診断を提供するために必要な順次ハイブリダイゼーションを推進するのに利用できるテスト材料（即ち中期又は間期染色体）の量が不足することである。
【００４０】
古典的細胞遺伝学分析は以下の理由で標準となっている。
それは疾病に関する予備知識が不要である。
既知だけでなく未知の遺伝子異常の検出が可能である。
１つの試験で完全な核型を生成する。
しかしこの方法は培養を必要とし、結果として長い回転時間がかかる。更に固形腫瘍や受胎産物のような組織タイプに対し、培養成功率は非常に低く、この結果関係する情報は殆ど又は全く得られない。更にマーカ染色体確認はしばしば困難で、標準Ｇバンド法では困難である。この発明は細胞培養を必要とせず、４８時間以内に間期核における全タイプの染色体変化を高い信頼性で検出するメカニズムを提供することによりこれらの難問を克服する。
【００４１】
ＩＣＰは試料の特定遺伝子異常に関する既知の予備知識なしに単一万能プローブセットの使用により殆ど全ての染色体異常の特性化を容易にする。この特性化は間期細胞でハイブリダイゼーションチャンバー（スライド）上の指定部位又はウエルにおいて一時に１染色体上に起こる。例によりハイブリダイゼーションチャンバーは各々が１０個のウエルを含む３個のスライドのセットからなる。スライド１はロバートソン転座（末端動原体型染色体間の転座即ち、染色体１３、１４、１５、２１、２２）を検出するため使用される。スライド２は染色体１〜１０の特性化に使用される。スライド３は染色体１１、１２、１６〜２０、Ｘ、Ｙの特性化に使用される。本発明の一態様で、２個のウエルを更なるテストのため態と黒にして置くことができる。ＩＣＰ技術は多くの異なるプローブセットとの不必要なハイブリダイゼーションを排除し、これにより２８個のウエルからの結果を組み合わせることにより完全な核型情報の組み合わせを可能にする。
【００４２】
本発明の一態様で、ＩＣＰ技術は以下のステップにより進行する；
ＤＮＡプローブの生成
in situハイブリダイゼーション
ＤＮＡハイブリダイゼーションの比色検出、及び
顕微鏡分析
ステップ１はＤＮＰ、ビオチン、フルオレッセインなどのようなラベルでラベリングされた２４個のヒト染色体からのＤＮＡプローブの使用からなる。このプローブは、ハイブリダイゼーションを望む染色体の正確な部分を確保するため、染色体の微量切除又は技術的に既知の他の方法により特別に生成することができる。例えばプローブの生成を微量切除技術、プラスミド、コスミド、遺伝子情報からの計算による方法、合成等を利用して行うことができる。ステップ２では、各ウエルの間期細胞を検出されるべき染色体又は異常に特有の単一セットのＤＮＡプローブで一晩ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションはＤＮＡプローブが核膜を貫通し、ＤＮＡ変性が２本のＤＮＡストランドを分離させることができるように、酵素による前処理のような標準in situハイブリダイゼーションを使用して行うことができる。ステップ３では、各特定ラベルを標準検出技術により検出する。この検出は順次又は同時である。個々の染色体長に沿って異なるバンドでの所定の色比率に基づき、例えば２つの酵素反応のような２色の混合が新しい検出可能色を生成する。染色体上のバンドの色々な色を予め決めることができ、図１に示すように、比較分析を容易にするためイデオグラム上で表示することができる。ステップ４によると、個々の染色体バンド上での色の進展を簡単な標準的光学顕微鏡を使用して肉眼で観察し理解することができる。
【００４３】
出産診断ＴＡＴは特に重要で、テストに関連する期待する両親により経験される著しい量の心配が存在する。決定と妊娠管理のためには、結果を得るための期限は妊娠期間２４週以内である。通常状況では、標準染色体テストを妊娠１６〜２０週頃に実施し、その結果は１０〜１４日後に判明する。従って遅い羊水穿刺テストは一般に望ましくない。ある臨床状況では、染色体テストを妊娠の最後の２〜３週間以内に行うことが望ましい。状況によっては、結果は緊急に得る必要がある。早期の羊水穿刺テスト（即ち１２週）では、結果は通常１０〜１４日よりかなり長い時間を必要とする。これは通常、テストに利用できる細胞の数が少ないためである。この各状況においては、古典的細胞遺伝学では一般にマーカ染色体の性質を確認することができない。その結果付加的な時間と費用のかかる特別な調査が必要となる。伝統的なＦＩＳＨテストを４８時間以内に行うことができるが、範囲は非常に限られ、片親ダイソミー（ＵＰＤ）のような状況による死亡率を潜在的に増加させるロバートソン転座の検出を含む完全な染色体情報を生成することはできない。
【００４４】
末梢血染色体テストを、遺伝子診断を達成するため、例えば、知能障害又は不妊組織又は多くの流産をした夫婦のような異常表現型特性を有する患者に行うことができる。一般に現在の手順を使用して、このようなテストのためのＴＡＴは通常５日であるが、しかし標準的な染色体調査ではマーカ染色体及び染色体のアンバランス再配列を確認できない。このような状況ではＴＡＴを増加させ、費用追加が必要な付加テストを必要とする。ある状況では通常テストでは見逃される異常には染色体末端（即ち微妙な再配列）が含まれる。現在これらの異常の検出には、如何なる診断組織が存在するかを解決するためには費用のかかるＦＩＳＨテストが必要である。
【００４５】
例えば突発性知能障害（ＩＤ）のような状況を有する患者において、約５〜９％は顕微鏡以下のサブテロメア再配列を有し、これは古典的細胞遺伝学では検出できない。更にＩＤ進行性障害を有する正常核型の全患者の約７％においては、サブテロメア再配列がある。ある場合は、付加細胞を標準テストで分析する必要があり、これには著しく費用がかかる。
【００４６】
白血病／リンパ腫瘍癌テストで、染色体情報は正確な診断に不可欠なだけではなく、異なる投薬計画手順の管理に不可欠である。医師はしばしば結果が重要な治療決定を行うのを待つことができる。現在の手順で、ＴＡＴは通常５日である。現在のテストの１つの主な欠点は標準的染色体調査では染色体のテロメアを含む先に述べた微妙な再配列は勿論のこと、マーカ及び誘導染色体の確認ができないことである。これらの状況は付加テストが必要となりＴＡＴと費用の増加となる。正常／異常結果となるある場合で、より多くの細胞を費用を又増加させる通常テストにより分析する必要がある。残念なことに、多くの場合染色体を有する付加的細胞はテストに簡単に利用できない。約５〜１０％の場合は、培養不成功により染色体結果が全く利用できない。
【００４７】
固形腫瘍と患者管理における染色体情報の重要性は急速に増加している。膀胱、前立腺、腎臓、胸、肺等のような固形組織の癌で、標準的な染色体調査は３０日以上かかり、テストの７０〜８０％以上で結果が得られない。これは調査失敗になりやすい。上記の白血病やリンパ腫と同様に、マーカと誘導染色体確認は標準染色体テストではできない。
【００４８】
染色体情報は遺伝子診断の達成のため、及び未来の妊娠決定のため患者に助言するため流産物質上で得ることができる。現在の手順を使用して、このような組織上での遺伝子テストのためのＴＡＴは３０〜４５日になる。より重要なことは、２０〜４０％の場合において、結果は欠陥サンプルにより標準染色体テストによって結果を得ることはできない。従って遺伝子異常を適切に診断し、そして患者に助言するためには、付加テストが一般に必要となる。このような付加テストは必要な費用と時間を結果として増加させる。
【００４９】
ＩＣＰは、タイミングよくそしてコスト効率のよい方法で、臨床的細胞遺伝学及び医学界の満たされないニーズを提供することにより、現在の手順の限界により生成される隙間を埋める。
【００５０】
以下は本発明を実施するための手順を示す例である。これらの例は明らかな変更を含むと解釈されるべきで、限定するものではない。
例１‐ハイブリダイゼーションチャンバーの使用
【００５１】
現在の手順では２４個の異なる色を使用して中期染色体に基づき多色核種を確保する。中期染色体を生成するため、例えば末梢血、骨髄、羊水、固形塊等のような色々なタイプの試料からの材料を培養しなければならない。完全な核型情報を確保するため２０個の細胞を調査することが一般に必要である。利用できる細胞の量はしばしば限定される。本発明迄、材料源を効果的に利用するために利用できる方法はなかったので、調査に提供される資料に存在する遺伝子変化の完全な特性化が達成できる。染色体の特定セットを調査できる技術的にいくつかの方法が存在するが、これらの方法は全く限定されている。上で論じたように、疑わしい遺伝子異常を事前に知らねばならず、そして限定された情報だけがこのようなテストにより得ることができる。試料に存在する特定の遺伝子変化の予備知識なく、単一万能プローブセットでこの発明を使用して、ほぼ全ての染色体変化を完全に特性化できる。これはハイブリダイゼーションチャンバー上の指定部位又はウエルで、間期細胞において一時に１つの染色体に実施することができる。
【００５２】
本発明の一態様において、ハイブリダイゼーションチャンバーは１セットのスライドから構成され、そして図に示すように、各スライドはウエルを含むことができる。例によって、スライド１はロバートソン転座といわれる染色体再配列の特別タイプを検出するためのスライドである。ロバートソン転座はそれらのセントロメアにより結合する末端動原体型染色体間の転座であり、結果として核型で１つ少ないセントロメアになる。例えば、ロバートソン転座が染色体１４と２１の間でバランスした形で起こる場合、核型には１つの正常２１、１つの正常１４及び結合染色体１４／２１があり、これにより染色体の全数は４６から４５へ変化する。ヒトゲノム（染色体１３、１４、１５、２１、２２）には５個の末端動原体型染色体があり、この５個のいずれの１つも、同一染色体、即ち２１／２１結合染色体となる染色体のコピー間の再配列を含むこのタイプの再配列に参加する。この再配列はバランスした又はアンバランスな核型となる。アンバランス型では、全染色体数は一般に４６であるが、核型には末端動原体型染色体の１つの３つのコピーがあるようである。
【００５３】
現在のＦＩＳＨ法を使用して、ダウン症を有する患者からの臨床サンプル上にダウン症固有領域、即ち２１、ｑ２２の３個のコピーが一般に検出される。この結果は染色体２１の３個のコピーを有するダウン症の自由形式には充分であり、そしてロバートソン転座は存在しない。しかし、ダウン症の同一臨床表現型は染色体２１と１つの他の末端動原体型染色体を含むロバートソン再配列から発生する。これは技術的な現在の方法を使用しても検出できない。これは、再発危険値はダウン症の自由形式とロバートソン形式の間では全く異なるので、遺伝子助言と次の妊娠管理に対し重要な臨床的意味を有する。従って、価値ある情報は失われる。この限界をこの発明により克服することができる。
【００５４】
染色体２１以外の染色体を含むロバートソン転座は又妊娠診断において臨床的に重要である。片親ダイソミー（ＵＰＤ）と呼ばれる病状は染色体が１３、１４、１５に対し存在する。バランスしたロバートソン転座が末端動原体間に起こり、そして含まれる染色体が１３、１４、１５の場合、担体はＵＰＤに対する危険が増加する。妊娠診断で検出される胎児のＵＰＤは重症の臨床的発現の一因となり、死亡率を著しく高める。この発明まで、ロバートソン転座を検出し、そして潜在的ＵＰＤを確認する唯一の方法は標準細胞遺伝学によっていた。ＩＣＰは間期細胞中の全ロバートソン転座を検出し、これにより出産診断で妊娠管理のための価値ある情報を提供することによりこれを克服する。
【００５５】
スライド２は染色体１〜１０用ウエルを備える。スライド３は染色体１１、１２、１６、１７、１８、１９、２０、付加ウエルを更なるテストのためにわざと黒にしたＸ／Ｙ、のためのウエルを備える。各ウエルに２５〜３０個の間期細胞を注意深く配置することにより、不必要なハイブリダイゼーションを除去できるので不良試料でも調査でき、ウエルからの結果を組み合わせることにより完全な核型情報を組み合わせることができる。
例２‐ＤＮＡプローブセット
【００５６】
プローブセットは２４の染色体の各々に対しＤＮＡプローブの固有に設計された組み合わせから構成される。各ヒト染色体はセントロメアとセントロメアに取り付けられた短腕と長腕を含む。染色体は全て腕の端部に各染色体固有のテロメアと称する固有ＤＮＡ配列を含む。末端動原体型染色体だけはセントロメアと長腕を有する。その短腕は変化し、遺伝子がない場合もあり、臨床的意味はない。このため、末端動原体型短腕を検出するようにプローブは設計されない。
【００５７】
さて図１に関して、この発明に基づくカラーバンド・パターンを図示する。比較のため、標準Ｇバンド（即ちｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）を含む。イデオグラムは染色体上のバンド全ての図表示である。現在のＧ‐バンドイデオグラムに基づき、各ヒト染色体は個々の単位長が与えられる。例えば最大のヒト染色体である染色体１は、７３の単位長を有し、その短腕は３６の単位長、そして長腕は３７である；染色体２は６８の単位長を有し短腕と長腕は夫々２７と４１である。全染色体の単位長はイデオグラム上に描写される。
【００５８】
現在の手順では、染色体分類は一般にＧ‐バンドパターンに基づき、そして染色体はＡ〜Ｇ及び性染色体に分類される。染色体１〜３はグループＡに、３〜４はグループＢに、６〜１２とＸはＣに、１３〜１５はＤに、１６〜１８はＦに、そしてＹ染色体を含む１９〜２０はＧに分類される。個々の染色体上のバンドは一般に化学的着色により生成され、染色体上の固定位置を有し変化させることはできない。従って２つの自然に接近して配置されるＧ‐バンド間に入る染色体変化の確認はしばしば困難である。この問題は、短腕と長腕の全体寸法に基づき互いにほぼ等距離位置に「バンド」を間隔をあけて並べることによりこの発明により克服できる。これは間期核における染色体変化の確認を容易にする。
【００５９】
ほぼ等距離染色体ハイブリダイゼーションの概念を利用して、ヒト染色体腕を以下の３グループに分類することができる、即ち単位長４‐６のグループ１（小）；単位長７〜１９のグループ２（中）；単位長２０〜４１のグループ３（大）。各グループ内では、個々のバンドをほぼ同一距離をあけて配置する。例によると、短腕は５本のバンドを有し、長腕も５本のバンドを有する。セントロメアバンドに関し、染色体１は全体で１１（５＋１＋５）のカラーバンドを有する。従ってこのＩＣＰ発明を使用して間期細胞におけるヒト染色体１を見ると、短腕の端部から始めて、それがセントロメアに達する迄カラーバンド、「無色」バンド、カラーバンド、無色バンド等が観察され、そしてこのパターンは、それがカラーバンドを備える長腕の端部に達する迄続くだろう。有色と無色の全バンドを計算して、正常な染色体１は合計２１バンドを有する。このタイプの分解能は培養後しか確保できない中期染色体を必要とする標準Ｇ‐バンドパターンに等しいかこれよりよい。上記モデルに続く別の例によると、染色体１８はグループ１の短腕とグループ２の長腕を有し、染色体Ｙはグループ１短腕とグループ１長腕を有する。
【００６０】
染色体１に関する更なる例として、小バンドをカラーバンド間の中間位置に着色することができる。このような小バンド着色は、例えば８本の付加バンドを追加し、染色体上の全着色バンド数を１９とする。
【００６１】
図１に見るごとく、ヒト染色体に対応するカラーバンド・パターンで分類法を図示する。一般にそして図示だけの目的で、セントロメアバンドを黒に着色し、そしてセントロメアから短腕の端部へ進むにつれ、カラーバンドを染色体端部（テロメア）バンドを目立たせるために使用される２種の主色の比率を変化させた混合物により生成することができる。本発明の一態様で、短腕テロメアを青に着色し、長腕テロメアバンドを赤に着色する。本発明の別の態様では、染色体１、５、９、１６、１９に対し、ペリセントロメアバンド、即ちセントロメアに隣接するバンドをセントロメアの代わりに使用することができる。
【００６２】
図示だけの目的で、例として染色体１を使用して、セントロメアを黒、短腕の次のバンドを濃赤色にする１青：９赤にする。次のバンドは薄青色にする７青：３赤にする。次のバンドは紫色にする５青：５赤にする。次のバンドは赤褐色にする３青：７赤にする。最後に、テロメアバンドはテロメアの端部を表示する１００％青にする。セントロメアとテロメア間の３：７、５：５、７：３のこのバンド順は長腕の主色に関して反転させることができる。従って、セントロメアが黒で始まる染色体１の長腕は３赤：７青（赤褐色）；５赤：５青（紫）；７赤：３青（薄青）、そして最後にテロメアバンドは赤（１００％）となる。短腕から長腕への全染色体を簡単に読み取ると、青、赤褐色、紫、薄青、濃赤、黒、赤褐色、紫、薄青及び赤である。この議論からみられるように、各腕はその区分カラーバンド「署名」を有し、この署名からの変化があればそれは遺伝子変化を示すことになる。
【００６３】
この発明の態様によると、染色体変化のＦＩＳＨに基づく検出に現在技術的に使用されるようなフィルタ、ダイクロイックミラー、ＣＣＤカメラ、高性能コンピュータソフトウエア、インフェロメータ等による色処理の必要なく、簡単な光学顕微鏡の下で間期細胞中に容易に変化を確認できる。この発明によるカラーバンドは、腕のサイズ、色配列のずれ、カラーバンドの喪失又は余分なカラーバンド、無色バンドの単位サイズの減少又は拡大に拘らず、互いにほぼ等距離にあるので、色配列のずれは染色体異常を示す。この方法をほぼ全てのヒト染色体の数及び構造的異常の両方を検出するのに使用できる。染色体異常、特にＩＣＰを使用したマーカ染色体確認の数例について以下に論ずる。現在の手順では、マーカ染色体は中期染色体でのみ確認することができる。この発明を利用して、マーカ染色体を間期核にて確認することができる。この結果は時間と費用の著しい節約となる。
例‐３ ＣＩＳＨ法
【００６４】
この発明は比色in situハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）を利用する。ＣＩＳＨの使用は多くの利点がある。最も重要な利点は細胞遺伝学研究所での利用可能装置の実用性及びＦＩＳＨに基づく装置に関連する異常な費用の回避である。ＦＩＳＨに基づく取り組みは研究環境で十分である一方、ＣＩＳＨは日常の臨床細胞遺伝学及び他の病理学研究所にとって独特の位置にある。上記のように、染色体異常は、操作の必要なく、簡単な光学顕微鏡下で間期細胞に容易に確認できる。ＣＩＳＨ法の利用では多色ＦＩＳＨ法におけるような擬似色表示はない。更に視野に見えるものは一般にテストで生ずるもの、真の色表示である。上記の色は例えば、隣接する色を識別できる通常の「色覚異常」の人の目に対し設計される。これは、技術者のようなその分野によく精通している人でないような人に対してさえ、現在の細胞遺伝学分析に付加的機会を開く。従ってよく精通した技術者は費用がかかり、かつ見つけるのは困難なので、著しく経済的なかつ時間的な節約の機会を与える。
【００６５】
現在のＣＩＳＨ手順は反応の場に固有の色を生成するため全酵素反応だけを利用する。異なる色を生成するため、明細書で述べたような特定比率でＤＮＡプローブと対になった固有の酵素の混合物は開示していない。間期核における異なる部位での順次酵素反応についてはこの分野の専門家には知られていたが、この発明まで同一部位（即ち、間期核の任意の部位）における順次酵素反応は可能でなかった。ＦＩＳＨと比較したＣＩＳＨの主な欠点は反応部位における信号の分解能（即ち輝度）であった。ここ数年、いくつかの進歩がＣＩＳＨ分野で行われ、反応部位での信号の増幅が望めば、今や可能となっている。更にＤＮＡプローブ準備段階の間に、酵素が後に付着する多くのリガンドの組み込みで、カラーバンドの信号強度は向上した。
【００６６】
ＣＩＳＨ法は恒久的である利点を有する。生成される色反応は恒久的であり、後の使用に保存できる。他方、ＦＩＳＨ信号は急速に消滅し、レトロスペクティブ分析には全く有効でない。新しい遺伝子変化が患者（即ち、治療の間）に発見されると、臨床相関を確立するため、以前のハイブリダイゼーションスライドを有することが比較のために使用するのに極めて有効である。
例４‐実施例
【００６７】
現在の細胞遺伝学手順はこの領域の側面を守るプローブの設計に染色体における自然の切断点に依存している。例えば染色体９と２２間の転座のような白血病固有の転座を検出するため、プローブはバンド９ｑ３４（ａｂｌ遺伝子）とバンド２２ｑ１１．２（ｂｃｒ遺伝子）の染色体９上の切断点を検出するように設計される。２２用の赤と９用の緑の２色を使用して、正常な間期反応は２つの赤点と２つの緑点として現れる一方、緑／赤融合により転座は１つの緑、１つの赤そして１つの黄に起こる。例によって、この発明を利用すると、同一転座は染色体９が２つの断片に、そして染色体２２が２つの断片に転移するように現れる。夫々のスライド上の染色体９ウエルにおける結果のカラーバンド・パターンは；短腕テロメアから始めて青、赤褐色、黒、紫、１つの隣接ストレッチとしての薄青及びこのストレッチから離れた赤、即ち染色体９上にａｂｌ遺伝子が存在する薄青と赤の間の切断点を表示する赤の転移、を表す。同じウエルの非分離色配列は正常な染色体９を表す。同様に染色体２２上のカラーバンド・パターンは紫から分離した赤、赤と紫間の切断を示す濃青ストレッチである。染色体２２上のｂｃｒ遺伝子は２色のバンド赤と紫の間にある。再度、赤、紫、濃青の非分離色パターンは正常な染色体２２を表す。染色体２２のセントロメアは染色体１４と異種ハイブリダイゼーションをするので、２つの付加の個々の赤信号が存在する。染色体１４のハイブリダイゼーションウエルは又２つの別の赤と青点を有する。もしＩＣＰスライドの読み取りの進行で、これがその試料における唯一の遺伝子変化であれば、染色体２２を含む全てのウエルは上記パターンを示し、染色体９を含むウエルは上記色パターンを有し、そして他の染色体は全て隣接カラーバンド・パターンの２つのストレッチを有するだろう。患者の性別によっては、ＸＸ又はＸＹ染色体カラーパターンをＸとＹ染色体プローブを含むウエルにおいて読み取られるだろう。この例から分かるように、病状の予備知識はＩＣＰ法の使用には不要である。
【００６８】
この発明の態様による実施形態で、９：２２転座の上記例のような簡単な転座では、転座の確認は目視手段にて達成できる。全てのヒト染色体遺伝子における中間部黒小バンドを含む、各個々のカラーバンドは赤又は青バンドとしてキットで入手できる。先に述べたように、オプションそして／または確認テスト用にハイブリダイゼーションチャンバーに故意に空の溝又はウエルを置く。こうして染色体９上の切断点の両側で非セントロメア又は非テロメアの１つを選択し、そしてそれをハイブリダイゼーションチャンバーへ入れると、転座を抱く間期細胞は赤、赤、青、青、のカラーパターンを有する。青と赤の並列は転座を表示する。この色仕組みで転座を抱かない細胞は赤、赤、青、青、と読み取られるだろう。セントロメアバンドは導入されないので、染色体２２の異種ハイブリダイゼーションは従って除かれるだろう。
【００６９】
例により、この色仕組みは含まれる染色体バンドに関係なく、ほぼ全ての簡単な転座の証明に使用することができる。２つ以上の染色体を含む複雑な転座でも上記方法を使用した系統的付加ハイブリダイゼーションにより検出し、かつ診断できる。
例５‐マーカ染色体確認
【００７０】
臨床細胞遺伝学の定義によるマーカ染色体は標準Ｇ‐バンド技術によりセントロメアの複製起点及びその染色体上の付加材料が確認できないことを意味する。しかしこれらのマーカ染色体は疾病の発生そして／又は進行において重要な役割を果たす。中期染色体と２４色ＦＩＳＨ技術を使用して、一般にはマーカ染色体の性質を確認できる。しかし間期核における確認は非常に難題で、現在の手順の使用では行うことができない。
【００７１】
マーカ染色体の例を以下に記述する：
染色体３のセントロメアの所有；３の短腕の全て；染色体７長腕からの２つのバンド；及び染色体１０からの長腕テロメア。これは非常に複雑なマーカで癌細胞遺伝子学、特に固形腫瘍細胞遺伝学において、通常このタイプの状況に出くわす。
【００７２】
明細書に述べたようなこの発明の技術を利用して、ＩＣＰモデルにおいて、３個のスライド技術を利用してハイブリダイゼーションを完了し、以下に結果を記す；スライド１は平凡（即ち正常）；スライド２は１〜２、４〜６、８〜９（即ち正常）；スライド３は平凡（即ち正常）。スライド２上で染色体３用のハイブリダイゼーションウエルにおいて、異常カラーバンド・パターンを読み取る。２つの正常隣接カラーバンドに加え、もう１つのセントロメアと短腕バンドが存在するようである。２つの隣接カラーバンドに加え染色体７ウエルで２つの別の隣接するカラーバンドが存在するだろう。最後に、染色体１０の長腕テロメア構成がバランスしているかどうかにより、染色体１０ウエルで２つの隣接カラーバンドと別のテロメア分離バンド又はカラーバンドの１つの隣接ストレッチと第２色バンド配列からのテロメアバンドの転移のいずれかを観察できる。図６は３つの異なる間期細胞におけるマーカ染色体を示す。
【００７３】
この発明の態様によると、ＩＣＰモデルでマーカ染色体を「再構築」できる。３から中心部断片をそして７と１０から中心部外断片を採取し、それら全てを共に間期細胞でハイブリダイズすることにより、これら断片の全てが「疑わしい」マーカを形成したかどうかを確認することができる。もし隣接カラーバンド配列が見つかれば、結果は「正」のようである。更に正常染色体３、７、１０上の対応するバンドも目立つようで、これによりマーカ染色体の性質を確認する。図７は明細書で論じた残りのカラーバンドを備える「再構築マーカ」を示す。
表Ａ
【００７４】
表Ａはこの発明の態様によるスライド１上の末端動原体型染色体組み合わせを示す。染色体が第１に導入されたか、第２に導入されたかにより、セントロメアは赤又は青色を呈し、残りの色配列はイデオグラム上に示すようになる。イデオグラム上の染色体の左への色配列は第１に表現され、右の配列は組み合わせで第２に表示される。染色体１３と２２については、それらは常に第１に又は第２のいずれかにのみ導入されるので１色のみが表示される。
【００７５】
染色体１３と２１のセントロメアはウエル＃３にて異種ハイブリダイゼーションされるので、全てのセントロメアは紫（赤＋青）になる。これは、これら２つの染色体間の転座があるかどうかに関係なく正しい。バランス状態で転座があれば、このウエルの間期細胞に１つ少ないセントロメア（即ち、４の代わりに３）となる一方、アンバランス状態では、その数は４のままである。同じ一般ルールを染色体１４と２２にも同様に適用する。従ってウエル＃７の間期細胞は同様に染色体１３と２１にも作用する。バランス及びアンバランス状態共にロバートソン転座の存在を表すセントロメアのない両染色体からのより大きい隣接色ストレッチが存在するようである。＃３と＃７用を除く全ウエルにおいて、２つ以上の異種ハイブリダイゼーションを表す別のセントロメアが存在するようである。この設計は遺伝子異常を相互参照する多くの機会を保障する。
例７‐細胞測定技術
【００７６】
この発明の態様によると、ＩＣＰは、例えば末梢血、骨髄、吸引物、羊水、絨毛、胸膜液、リンパ節生検、固形腫瘍塊、受胎産物等のような全てのタイプの試料の調査を受け入れる。これらのタイプの試料の中で、血液、骨髄、羊水及び胸膜液のような「液体」資料は単一細胞を含む。残りの試料は結合された細胞集合体からなる組織である。ＩＣＰを実行するためには、単一の間期細胞を必要とする。こうして、この発明の別態様により、ハイブリダイゼーションチャンバースライド上の各ウエルに２５〜３０個の細胞を正確に加える又は乗せる方法を考察できる。
【００７７】
現在の手順はコレギナーゼとトリプシンのような酵素を利用するそれらのような単一細胞懸濁液に固形組織を分解するために存在する。上で論じたように、液体試料は、単一細胞を得るためこのタイプの処理を必要としない。一旦単一細胞懸濁液がこの試料タイプから得られたら、各「ピペットの一滴」が２５〜３０個の細胞を含むように細胞濃度を調節する。例えば、１ｍｌの試料が１０００個の細胞を含み、そして各１ｍｌが１０ピペット滴を含む場合、各１滴は１００個の細胞を含む。各ウエルは一般にＩＣＰ用の１滴のみを受けるので、試料は適当に薄め、この場合は３．５〜４倍に薄め、これにより各１滴が所望の細胞濃度になる。もし最初の容量がピペット１滴あたり１０個
の細胞であれば、試料を遠沈させ、余分な容量を除去して２．５〜３倍に濃縮し、これにより、各ピペットの１滴が所望の細胞濃度となる。
【００７８】
この技術は小容量の「欠陥」試料をこの発明の下で完全に分析することができることを保証する一方、技術的な他の方法は完全な核型情報を補足できない。
例８‐低張処理
【００７９】
殆どのＦＩＳＨ手順は現在、低張処理をしない試料からの塗布標本を使用するだけである。ＫＣＩやクエン酸ナトリウムのような低張処理の発見は最新細胞遺伝学分野を生んだ。中間細胞の適切な「膨張」はそれらが顕微鏡スライド上に落ちる時、中期染色体の分離を保証する。同様に、間期染色体の適切な分離は多色バンド配列の成功的描写には不可欠である。異なる濃度で異なる低張溶液で実験することにより、ハイブリダイゼーションウエルの顕微鏡スライド上にそれを固定する前に、間期を適切に「膨張させる」ことが可能なようである。
例９‐ＩＣＰ手順
【００８０】
ヒトＤＮＡプローブの生成；
【００８１】
１）各染色体上に、ＤＮＡプローブハイブリダイゼーションの部位を標準Ｇバンドイデオグラム上に示す。先に開示したように、染色体１は１９のＤＮＡプローブを有する：
1個のぺリセントロメア、４個の色付き短腕＋５個の黒短腕＋１個の短腕テロメア、３個の色付き長腕＋４個の黒長腕＋１個の長腕テロメア。
【００８２】
２）各染色体バンドは例えば標準Ｇ‐バンド中期染色体調合液から技術的に知られる他の技術を使用して微量切除又は分離される。
【００８３】
３）各微量切除染色体バンドをＴｅｌｅｎｉｕｓ（１９９２）により一般に記述されるようなＤＯＰ‐ＰＣＲ技術により増幅する。
【００８４】
４）これらのプローブからの反復配列を、Ｃｒａｉｇ（１９９７）により一般的に記述される、アビジン磁気ビードが続くビオチンラベルのＣｏｔ‐１ＤＮＡを使用して除去できる。
【００８５】
５）第１ＤＯＰ‐ＰＣＲサイクルからの繰り返し自由なプローブをリールＬｉｅｈｒ（２００２）により記述される手順を使用して更なる増幅期間に曝する。
【００８６】
６）標準的超音波処理技術を使用して、プローブ長を約２００ｂｐ〜６００ｂｐの間に調整できる。又プローブのより小さい断片をＶｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ Ｎｉｃｋｉｔキットのような、キットとしての標準技術を利用して生成することができる。
【００８７】
７）ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓＦａｓｔＴａｇのような標準ラベリング手法又は技術を使用して、ＤＮＡ断片を例えばＤＮＰ、ビオチン、フルオレッセイン等のようなラベルでラベリングできる。
【００８８】
８）ラベルは所定手順に応じて選択される。
【００８９】
９）例えばＦａｓｔＴａｇ技術は、ハイブリダイゼーションの部位におけるより高い感度を達成するため、ＤＮＡストランドによる多くの部位でラベルを組み込むことができる。
【００９０】
１０）２４のヒト染色体からのＤＮＡプローブは次にハイブリダイゼーションチャンバーのスライド上の間期細胞にin situハイブリダイゼーションの準備ができる。
【００９１】
１１）セントロメアとテロメアＤＮＡプローブを生成し、又は経済的に入手可能なプローブを利用できる。プローブは、ラベルの必要のないそして上記のようなＩＣＰ目的で確保でき、適切なラベルをＤＮＡへ組み込むことができる。
【００９２】
in situハイブリダイゼーション：
【００９３】
１）単一細胞懸濁液を３個のハイブリダイゼーションチャンバーでスライド上の各ウエル上に配置する。懸濁液を低張溶液で処理し、３：１のメタノール：酢酸溶液で固定する。
【００９４】
２）各ウエルの間期細胞を例えばＤＮＡストランドを分離するＤＮＡ変性が行われる、ＤＮＡプローブが核膜を貫通できるように酵素の事前処理のような標準in situハイブリダイゼーション技術を使用してそのウエル固有の単一セットのＤＮＡプローブでハイブリダイズすることができる。
【００９５】
３）ハイブリダイゼーションは一晩で起こる。
【００９６】
４）スライドからハイブリダイズされなかった余分なプローブを除去するためハイブリダイゼーション後洗浄を行うことができる。
【００９７】
ＤＮＡハイブリダイゼーションの比色検出（ＣＩＳＨ）
【００９８】
１）ラベルビオチンは、ブドウ糖オキシダーゼ固有のＴＮＢ基質と反応後、ブドウ糖オキシダーゼ酵素に隣接するアビジン‐Ｄにより検出できる。これはＤＮＡハイブリダイゼーションの部位（即ち、全染色体上の短腕および長腕上の中間部位置は勿論のこと、セントロメア及びペリセントロメアバンドで）で黒沈殿物を生成できる。
【００９９】
２）ラベルフルオレッセインを、ペルオキシダーゼ固有の例えばＮｏｖａＲｅｄのような基質との反応後に、抗‐フルオレッセイン、抗体隣接ペロキシダーゼ酵素により検出することができる。これはＤＮＡハイブリダイゼーションの部位即ち、長腕テロメアにそして全染色体上で染色体を通し、他のバンドで赤い沈殿物を生成する。
【０１００】
３）ラベルＤＮＰを例えばアルカリホスファターゼ固有のベクトル青のような基質と反応すると抗ＤＮＰ抗体隣接アルカリホスフォターゼにより検出できる。これはＤＮＡハイブリダイゼーションの部位、即ち短腕テロメアと全染色体上の染色体を通して他のバンドで青い沈殿物を生成する。
【０１０１】
４）その間で必要な阻止と洗浄ステップで３反応が順に実行される。市販の基質使用はＶｅｎｄｏｒ社の手順に従う。
【０１０２】
５）順序は以下である；ビオチン、フルオレッセインそしてＤＮＰ検出。
【０１０３】
６）別の方法では、酵素が異なり、基質はこれら夫々の酵素に固有であるため、３反応全てを同時に達成することが可能である。
【０１０４】
７）先に開示したように、末端動原体型染色体セントロメアは例えば青又は赤（黒は除き）のような着色ができる。同様の適応は、全染色体再配列の適切な確認を保障するため、末端動原体型長腕バンドは勿論のこと、染色体１０、１２とＹの上のあるバンドに対し行うことができる。
【０１０５】
８）スライドを例えばメチルグリーン（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）のような対比色で対比着色を行うことができ、メチルグリーンはそれが３主色（黒、青、赤）に対し特別な対比を提供するので使用する。
【０１０６】
９）個々の染色体の長さに沿った異なるバンドで既定比率の色に基づき２色（２つの酵素反応）の混合物が新しい検出可能色を生成する。全ヒト染色体上の全バンドのための色組み合わせ例を図１に示す。
【０１０７】
顕微鏡分析：
【０１０８】
１）個々の染色体バンドの色発現で、間期染色体を他の更なる助けもなく、簡単な標準的光学顕微鏡を使用して観察できる。ＣＣＤカメラを目の助けに使用できるが、しかし必要ではない。
【０１０９】
２）スライド１から始めて、各間期細胞における色パターンを記録できる。イデオグラムからの期待正常色パターンに基づき、夫々の末端動原型染色体の正常、または異常状態を決定できる。一般に、各ウエルから２０個の間期細胞を記録することができる。
【０１１０】
３）スライド２と３上の残りの染色体に対し、同じ分析を繰り返し、即ち２０の間期細胞を使用して各染色体の正常及び異常状態を記録し、この結果を組み合わせ、テストした個々の完全な核型プロファイルを得る。
【０１１１】
４）もし例えばモザイク正常及び異常細胞の疑い、簡単又は複雑な転座の証明、マーカ染色体等のような追加分析が指示されると、スライド＃３上のような空のウエルを確認試験に使用できる。必要であれば、確認試験の設計に応じ完全に別のスライドを使用できる。
【０１１２】
５）染色体のバンドパターンはいずれも簡単なデジタル写真により記録することができる。
【０１１３】
６）簡単なモザイク現象は顕微鏡分析で容易に検出できる。複雑な明らかに同類クローンモザイクでさえ証明できる。以下の例はこの発明の態様による証明手順を示す。
例１０‐核型分析
【０１１４】
例として、以下の結果を有する核型を分析する；＋８／ｔ（９；２２）／ｔ（９；２２）、＋８／正常。
【０１１５】
慢性顆粒球性白血病のこの場合、２つのクローン異常がある；上で論じたように、この疾病特有の変化であるｔ（９；２２）。トリソミー８（＋８）は進んだ疾病進行を示す。しかしトリソミー８は「無関係」クローンとして単独で存在できる。このように同一クローンがｔ（９；２２）と＋８の両方を有するかどうかを確立することは臨床的に非常に重要である。
【０１１６】
例によって、最初のＩＣＰ通常反応で、ｔ（９；２２）備える１０個の細胞；＋８を備える５個の細胞；染色体８の正常な１５個の細胞及び染色体９と２２の正常な１０個の細胞がある。各所で説明しているように、転座証明は赤：青実験により行われ、ここでは赤：青並列は転座を表示したが、別の赤と青は転座を示さない。この結果を染色体８セントロメア（黒）用プローブと組み合わせることにより、結果は以下のようになる；ｔ（９；２２）を有する５個の細胞；ｔ（９；２２）と＋を有する５個の細胞；染色体８、９、２２が正常な１０個の細胞。これらの結果は、＋８は疾病進行の一部であり、独立した事象ではないことを明確に示している。もしそれが独立事象であれば、組み合わせ結果を有する細胞を観察できないだろう。
【０１１７】
さて図１４に関してこの発明の態様によるハイブリダイゼーションスライドを図示し、大体参照番号１０により参照される。スライド１０は本体２０、複数ウエル２２及び確認ラベル領域２４からなる。本体２０はその上でハイブリダイゼーションを行うのに十分なガラス又は他の半透明な材料からなる。ウエル２２はその上でウエル２２を分離するための印刷領域からなる。ウエル２２は又サンプルを受け、そしてハイブリダイズするための研磨圧入、鋳型圧入等からなる。確認ラベル領域２４はラベル又は他の確認手段を受けるための透明領域又はすりガラス領域からなる。
【０１１８】
以下の表は標準Ｇ‐バンドを利用した技術を明細書で開示した技術を利用して得た結果の比較のため使用者が簡単に参照することを提供する。
【０１１９】
以下の表は標準Ｇバンド法と比較した間期染色体プロファイル（ＩＣＰ）を示す。参照を容易にするため、以下の省略を行う；Ｑ＝長腕；Ｐ＝短腕；ｐ＝セントロメア近接；ｑ＝セントロメア遠位；Ｔｅｒ＝テロメア；ｍａ＝主バンド；及びｍｉ＝小バンド
【０１２０】
表１−染色体１
【０１２１】
表２−染色体２
【０１２２】
表３−染色体３
【０１２３】
表４−染色体４
【０１２４】
表５−染色体５
【０１２５】
表６−染色体６
【０１２６】
表７−染色体７
【０１２７】
表８−染色体８
【０１２８】
表９−染色体９
【０１２９】
表１０−染色体１０
【０１３０】
表１１−染色体１１
【０１３１】
表１２−染色体１２
【０１３２】
表１３−染色体１３
【０１３３】
表１４−染色体１４
【０１３４】
表１５−染色体１5
【０１３５】
表１６−染色体１６
【０１３６】
表１７−染色体１７
【０１３７】
表１８−染色体１８
【０１３８】
表１９−染色体１９
【０１３９】
表２０−染色体２０
【０１４０】
表２１−染色体２１
【０１４１】
表２２−染色体２２
【０１４２】
表Ｘ−染色体Ｘ
【０１４３】
表Ｙ−染色体Ｙ
【０１４４】
先の開示は本発明を実施するための本発明により考察された最良モードを提示し、この技術に精通する人がそれを実施できることを意図するが、修正と変更を含む方法はこの技術に精通する人には明らかであろう。従ってそれは限定されると解釈されるべきで、このような前記の明らかな変更を含むべきで、以下の特許請求の精神及び範囲によってのみ限定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
特許又は出願書類は少なくとも１枚の図面そして／又は色付き顕微鏡写真を含む。この特許又は色付き図面を備える特許出願公報のコピーは要求及び必要費用の支払いにより当局から提供されるだろう。
【図１ａ】この発明態様による典型的結果カラーバンドを示す間期染色体プロファイルイデオグラムである。
【図１ｂ】この発明態様による典型的結果カラーバンドを示す間期染色体プロファイルイデオグラムである。
【図２ａ】ａ、ｂは、４００バンドレベルの従来技術Ｇ‐バンドイデオグラムである。
【図３】ａ−ｄは、この発明態様による間期染色体プロファイル（ＩＣＰ）とＧ‐バンドイデオグラムの並列比較である。
【図４】ａとｂは、この発明態様による夫々染色体９と２２間の転座を示す顕微鏡視野の図である。
【図５】ａ、ｂは、この発明態様による証明目的のための夫々、転座、不転座を示す顕微鏡視野の図である。
【図６】ａ、ｂ、ｃは、この発明態様による、夫々染色体３、７、１０のマーカ染色体確認の図である。
【図７】この発明態様による染色体３、７、１０を含むマーカ染色体確認からの結果としての顕微鏡視野の図である。
【図８】この発明態様による染色体１３の中間部欠失を示す顕微鏡視野の図である。
【図９】この発明態様による染色体１４と２１のロバートソン転座を示す顕微鏡の図である。
【図１０】この発明態様による染色体８の短腕の偏動原体逆位を示す顕微鏡視野の図である。
【図１１】この発明態様による染色体１６の動原体を挟まない逆位を示す顕微鏡視野の図である。
【０１４６】
【図１２】ａ、ｂは、この発明態様による夫々染色体１７と１９を含む挿入転座を示す顕微鏡視野の図である。
【０１４７】
【図１３】ａ、ｂは、従来技術の比色in situハイブリダイゼーションの顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【０１４８】
10：スライド
20：本体
22：ウエル
24：確認ラベル領域
参考文献
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【技術分野】
【０００１】
この発明は細胞遺伝学分野、特に染色体プロファイリングに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞遺伝学は細胞ライフサイクルの中期段階の間の染色体研究の分野である。染色体が縮合の最高点にあり、そして正常及び病気の状態の両方における研究に最も都合がよいのはこの段階である。現在細胞遺伝学分野（世界的に）において最も頻繁に使用される技術は短期（１０日以内）又は長期（４５日迄）のテスト用に提供される試料培養である。試料は末梢血、骨髄、羊水、固形組織、受胎産物、胸膜液等のような多くの変化タイプを含む。培養成功の後、色々なプロセスにより、テストされる個々の物が遺伝子異常を有すかを決定するため、中期染色体を一般的に確保し読み取る。このプロセスは全く複雑で、極めて多くの時間と専門知識は勿論のこと多くの化学物質と試薬の使用を必要とする。
【０００３】
以下を含む色々な診断目的のために染色体研究は頻繁に必要とされる：
（１）出産診断
（２）末梢血（異常表現型特性、知能発育不全のある患者、原因が遺伝子かどうかを決定するための多くの流産問題は勿論のこと不妊症問題を有する夫婦のためのテスト；
（３）白血病／リンパ腫診断（薬手順の管理は勿論のこと正確な診断の両方に不可欠な）；
（４）固形腫瘍診断と治療管理（膀胱、前立腺、腎臓、胸、肺等を含む癌のための）
【０００４】
約１５年間、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）と称する技術を使用して染色体／核型情報を得てきた。しかしこの技術は限られている。ＦＩＳＨ技術を利用して、完全な核型情報を得ることはできない。著しい量のＦＩＳＨ試験が間期段階核に使用されてきたが、これでは色を更なる培養なく、通常の細胞遺伝学技術により見ることはできない。最近より完全な染色体分析又は核型情報が多重ＦＩＳＨ（Ｍ−ＦＩＳＨ）技術の使用で可能となった。この技術に関する問題は、テスト用染色体を得るためには、なお１つの培養を必要とすることであった。その時だけ新しい又は疑いのない変化の検知は勿論のこと、疑わしい異常をＭ‐ＦＩＳＨは証明することができた。
【０００５】
ごく最近、多色バンド（ＭＣＧ）、多色染色体バーコード技法、異種間カラーバンド技術（ｒｅ−ＦＩＳＨ），分光カラーバンド技術（ＳＣＡＮ）のような数種の多色分バンド技術が開発された。これら技術全ての中で、ＭＣＧのみ間期染色体に適用されてきた。
【０００６】
殆どのＦＩＳＨベースの技術は疾病固有のプローブを使用する。疾病固有のプローブが生成される場合、プローブセットは転座、欠失、反転、増幅又は他の既知染色体異常のような固有変性の現存知識に限定される。疑わしい遺伝子異常の予備知識なしに、細胞遺伝学は未知又は疑わしくない遺伝子の不調の診断を行うことが出来なかった。全染色体ペイントを利用することにより予め検知されない転座を認識することが可能になる。しかしこれは非常に退屈なプロセスであり、２４の別々の染色体ペイントプローブセットの使用を必要とした。更にこのプロセスは遺伝子異常の単一タイプの情報のみ、即ち２つの異なる染色体間の転座の情報のみを生成する。疾病プロセスでは、しばしば遺伝子変性は、転座、欠失又は反転を含む多くの発現からなる。これらの他の変化、特に染色体間変化が現在の染色体ペイントプローブセットにより全て検出できるわけではない。代わりに、それらは又別のセットの又は多くのセットの疾病固有プローブを必要とし、これは普通の臨床細胞遺伝学研究所にとって法外な費用となる。
【０００７】
中期染色体研究のための上記技術には、多くの付加的欠点が存在する。これらは以下を含む；個々の染色体認識のために得られた非常に複雑なカラーバンド・パターン；バンドパターンを翻訳するためのフィルタ、ダイクロニックミラー、ＣＣＤカメラ、高性能コンピュータソフトウェア、インフェロメータ及び他の特別な装置のような非常に高価な装置の使用を必要とする技術；完全核型情報、即ちロバートソン転座のようなあるタイプの異常検出を提供しない技術；蛍光は消え、結果としてのバンドパターンは永久ではない、蛍光色素ベースである各技術；コンピュータソフトウェアの使用により割り当てられた擬似色であり、簡単な人の観察では翻訳できない結果のバンドパターン；研究の場で有効な臨床細胞遺伝学研究所での通常使用には実用的でない技術；及び、マーカ染色体は診断と多くの臨床状況での予後の両方を有すので、特に重要である、構造的に変性し、一般にトレースできないマーカ染色体。
【０００８】
１つの遺伝子異常は遺伝子診断で特に重要であり、この異常をロバートソン転座と称する。ロバートソン転座はそれらのセントロメアにより結合し、その結果核型では１つ少ないセントロメアになる末端動原体型染色体間の転座である。ロバートソン転座は特に出産診断において臨床的に重要である。片親ダイソミー（ＵＰＤ）と呼ばれる病状は染色体１３、１４、１５に存在する。出産診断で検知される胎児におけるＵＰＤは重度の臨床的発現の一因となり、乳児死亡率を著しく向上させる。
【０００９】
この開示で引用される文献や資料は説明した明らかな教示と矛盾しない程度まで、その全体を参考として本明細書に組み込まれる。
【発明の開示】
【００１０】
従って、染色体プロファイリングのための方法と装置の提供がこの発明の目的である。
【００１１】
この発明の態様は以下を含む間期染色体プロファイリングを発生させるための方法を含む、即ち、プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；染色体上のほぼ等距離位置にある少なくとも１つの染色体のマーキングが可能な種固有ＤＮＡプローブの確保；サンプルとＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション；サンプルの比色分析用染色体上に区分カラーバンドを生成させるための複数酵素の使用；比色分析に基づく染色体プロファイリングを決定するための視覚分析の使用；
【００１２】
方法は更にin situハイブリダイゼーションを意図する。典型的実施形態でin situハイブリダイゼーションはスライド上で発生できる。このスライドは例えば、前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズし、そして分析するための一連のウエルからなる。
【００１３】
この発明の別の実施形態で、視覚分析手段は光学顕微鏡、又はＣＣＤカメラを含む。
【００１４】
本発明の態様は以下を意図する、即ち羊水からのテストサンプルを得ること；末梢血；胸膜液；骨髄；腫瘍組織；分析用染色体を有する細胞を含む受胎産物又は他の発生源。
【００１５】
本発明の態様による方法は例えば転座又は特にロバートソン転座のような染色体異常の視覚検出を含む。
【００１６】
本発明の態様による方法は例えば完全な核型を生成することを意図する。
【００１７】
本発明は又以下のステップを含む比色in situハイブリダイゼーション法を含む、即ち、プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；染色体上のほぼ等距離位置に染色体をマーキングすることができる種固有ＤＮＡプローブの確保；ＤＮＡプローブとサンプルのin situハイブリダイゼーション；比色分析用染色体上に区分カラーバンドを生成するための複数酵素の使用；及び前記染色体のプロファイルを決定するため視覚分析の使用。
【００１８】
この方法は更にスライド上のサンプルをin situハイブリダイゼーションするステップを含み、このスライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズしそして分析するため一連のウエルを含む。
【００１９】
本発明は又以下のステップからなる染色体中のロバートソン転座を視覚検出する方法を含む。即ち
プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
各染色体上のほぼ等距離位置に少なくとも２つの染色体をマーキングすることができるＤＮＡプローブの確保；
前記ＤＮＡプローブとサンプルのハイブリダイゼーション；
比色分析用染色体上に区分カラーバンドを生成するための複数酵素の使用；及び
ロバートソン転座が前記染色体間に発生しているかどうかを決定するための視覚分析の使用。
【００２０】
本発明によると、この方法は又前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズしそして分析するための一連のウエルを含むスライド上でin situでサンプルをハイブリダイズすることを含む。この方法は又光学顕微鏡又はＣＣＤカメラを利用する視覚分析を含む。
【００２１】
この方法は又、サンプルの複製起点が；羊水；末梢血；胸膜液；骨髄；腫瘍組織；及び受胎産物；から構成されるグループから選択される、ＤＮＡサンプルを意図する。
【００２２】
この発明の追加の実施形態で、マーカ染色体の検出方法は以下のステップを含む；
プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
各染色体上のほぼ等距離位置に少なくとも２つの染色体をマーキングすることができるヒトＤＮＡプローブの確保；
ＤＮＡプローブとサンプルのハイブリダイゼーション；および
染色体の比色分析用染色体上に区分カラーバンドを生成するための複数酵素の使用；
【００２３】
マーカ染色体検出方法はＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイゼーション及び分析用の一連のウエルを含むスライド上サンプルのin situハイブリダイゼーションを含む。この検出は光学顕微鏡又はＣＣＤカメラを利用する視覚分析により行うことができる。
【００２４】
検出用ＤＮＡサンプルは以下の１つから作り出す；羊水；末梢血；胸膜液；骨髄；腫瘍組織；及び受胎産物。
【００２５】
この発明の別の態様は以下のステップを含む染色体のラベリング法を意図する；ラベリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保、ほぼ等距離位置に染色体をラベリングできる種固有ＤＮＡプローブの確保、染色体がラベリングされるＤＮＡとプローブ染色体のハイブリダイゼーション。
【００２６】
この方法はスライド上での染色体のin situハイブリダイゼーションを含み、このスライドがＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズしそして分析するための一連のウエルを含む。この方法は更に以下から構成されるグループから選択されるＤＮＡ複製起点を意図する；羊水；末梢血；胸膜液；骨髄；腫瘍組織；及び受胎産物。
【００２７】
この発明の態様による典型的実施形態で、間期染色体プロファイリング用キットは、染色体上のほぼ等距離位置に少なくとも１つの染色体をマーキングできる複数種固有ＤＮＡプローブ、比色分析用染色体上に区分カラーバンドを生成するための複数の酵素、及び染色体をプローブセットとin situハイブリダイゼーションするための染色体上の区分カラーバンド生成のための複数酵素、を含む。
【００２８】
このキットは更に例えば顕微鏡又はカメラのような１つの染色体の比色分析用視覚分析手段を含む。
【００２９】
この発明の態様による別実施形態は、複数の種固有ＤＮＡプローブを含むプローブセットを含み、このＤＮＡプローブは染色体上のほぼ等距離位置で少なくとも１つの染色体をマーキングするように設計される。プローブセットは更に前記染色体上にカラーバンドを生成するための複数酵素を含む。本発明の態様による更なる実施形態は、in situ間期染色体ハイブリダイゼーションが起こる複数のウエルを更に有するガラススライドを有する、in situ間期染色体用スライドを含む。
【００３０】
付加的細胞培養の必要なく、完全な染色体と細胞／種タイプからの核型情報を得るため、間期染色体プロファイリング（ＩＣＰ）を使用する染色体プロファイリングの確保方法を上で記述した。これは間期核上での専用ＤＮＡプローブセットとＣＩＳＨ技術を組み合わせることにより達成される。明細書で開示される方法を利用して、全染色体異常の約９９％を検出することができ、そして結果は４８時間より短い回転時間（ＴＡＴ）で生成される。
【００３１】
本発明は、複数スライド上のハイブリダイゼーションチャンバーで間期細胞中の個々のヒト染色体を観察することにより完全ヒト核型情報を確保するための方法と装置に関する。ＩＣＰは固有の又は疑いのある疾病の存在に関する予備知識を必要とせず、既知又は未知の遺伝子変化を検出し、そして単一テストで完全な核型を提供する。更にＩＣＰは細胞培養を必要とせず、そして間期核におけるほぼ全てのタイプの染色体変化のための検出メカニズムを提供する。
【００３２】
この発明の更なる目的と利点は以下の本発明の詳細開示と同様の参照番号は同様の特性又は要素を意味する付属図面を参照することにより明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
さて図１に関して、各染色体はＩＣＰカラーバンド・イデオグラムにより表示される。セントロメア／ペリセントロメア領域は黒；短腕テロメアは青；及び長腕テメロアは赤である。末端動原体型染色体１４、１５、２１に対し、ＩＣＰイデオグラムは２つの部分、左と右に分割される。左イデオグラムは染色体が第１に導入された場合のカラーバンドを表し、右イデオグラムは染色体が第２に導入された場合のカラーバンドを表す。第１と第２という言葉はスライド１上末端動原体型染色体組み合わせの夫々の染色体の順を意味する。染色体１３と２２に関し、それらが夫々常に第１と第２に導入されるので、ＩＣＰカラーバンドは１つだけしか存在しない。図２は４００バンドレベルの伝統的Ｇバンドイデオグラムを示す。
【００３４】
例えばヒト染色体のような各染色体は色々な染色体上に固有ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーションにより間期において確認することができる。これらの配列は染色体セントロメア又はテロメア又はセントロメアとテロメア間にある領域固有の領域上に配置することができる。染色体上の配列空間は染色体の短腕と長腕の全長に基づきほぼ等距離になるよう設計される。ほぼ等距離概念を使用して、ヒト染色体腕は全て３グループ：グループ１（小）、グループ２（中）、グループ３（大）の１つに分類できる。各グループ内では、個々のバンドは、ほぼ同一距離を隔て配置される。この間隔は開示の着色技術と共に各染色体に固有のカラーバンド・パターンを生成する。染色体はそれらの寸法に基づき数グループに分類され、そして各グループ内の染色体は確認を容易にするため同一色配列パターンを有する。
【００３５】
各染色体腕は区分カラーバンド「署名」を有する。この署名からの少しの変化は遺伝子変化（即ち染色体異常）を示す。一般に、染色体のセントロメアは黒に着色され、そして１つはセントロメアから腕端へ進むので、カラーバンドは染色体端部（テロメア）バンドを強調するために使用される２つの主色の比率を変化させた混合物により生成される。例により、もし短腕テロメアが青に着色され、かつ長腕テロメアが赤に着色されておれば、セントロメアとテロメア間のカラーバンドは濃赤、濃青、薄青、紫及び赤褐色のような赤と青の混合度合いを変えることができる。この色区分で、染色体変化はＦＩＳＨベースの検出器、フィルタ、ダイクロニックミラー、ＣＣＤカメラ、高性能コンピュータソフトウェア又は干渉分光装置の分野で現在使用されている方法により色処理を使わず、簡単な光学顕微鏡下で間期細胞中に容易に確認できる。
【００３６】
別の実施形態で、染色体を区分色着色部位の間で染色体の短腕及び長腕に沿って付加的等距離位置で黒又は他の区分色に着色することができる。このような付加的着色は、使用者が確認できるような目標を提供することは勿論のこと、分解能を向上させることにより遺伝子異常の視覚検出をより容易にする。本明細書で使用されるように、色区分バンドは主バンドと称し、そして例えば黒バンドのような付加ソリッドバンドはミラーバンドと称する。
【００３７】
染色体の短腕と長腕間の更なる区分を提供するため、短腕と長腕のミラーバンドを着色し夫々の染色体腕間で異なるバンド厚さを提供する。例えば短腕ミラーバンドを着色し染色体の長腕上のミラーバンドより薄い均一厚さを有するミラーバンドを提供することができる。この着色により単一染色体を含む異常の検出がより容易になる。
【００３８】
ＦＩＳＨと異なり、この発明はハイブリダイゼーション配列の検出には比色in situハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）に依存する。この発明態様によると、特定比率でのＤＮＡプローブと結合される特定酵素の混合により色々な色が生成される。これにより間期細胞における染色体の同一部位での順次又は同時酵素反応が可能となる。
【００３９】
現在、この分野のＦＩＳＨベースの取り組みは、特定ＤＮＡプローブを利用して中期染色体又は間期核のいずれかを使用して既知の遺伝子異常を検出する。診断を確立するため、特定セットのプローブから始め、もしある結果が「正」であれば、テストを終了する。しかし臨床医師からの初期「実用的診断」は非常に頻繁に間違っており、研究者はＤＮＡプローブセットを多数回、順に適用することを強いられる。これは単に時間がかかるだけでなく、非常に費用がかかる。最も悪いことは、核型を完成させそして適切な診断を提供するために必要な順次ハイブリダイゼーションを推進するのに利用できるテスト材料（即ち中期又は間期染色体）の量が不足することである。
【００４０】
古典的細胞遺伝学分析は以下の理由で標準となっている。
それは疾病に関する予備知識が不要である。
既知だけでなく未知の遺伝子異常の検出が可能である。
１つの試験で完全な核型を生成する。
しかしこの方法は培養を必要とし、結果として長い回転時間がかかる。更に固形腫瘍や受胎産物のような組織タイプに対し、培養成功率は非常に低く、この結果関係する情報は殆ど又は全く得られない。更にマーカ染色体確認はしばしば困難で、標準Ｇバンド法では困難である。この発明は細胞培養を必要とせず、４８時間以内に間期核における全タイプの染色体変化を高い信頼性で検出するメカニズムを提供することによりこれらの難問を克服する。
【００４１】
ＩＣＰは試料の特定遺伝子異常に関する既知の予備知識なしに単一万能プローブセットの使用により殆ど全ての染色体異常の特性化を容易にする。この特性化は間期細胞でハイブリダイゼーションチャンバー（スライド）上の指定部位又はウエルにおいて一時に１染色体上に起こる。例によりハイブリダイゼーションチャンバーは各々が１０個のウエルを含む３個のスライドのセットからなる。スライド１はロバートソン転座（末端動原体型染色体間の転座即ち、染色体１３、１４、１５、２１、２２）を検出するため使用される。スライド２は染色体１〜１０の特性化に使用される。スライド３は染色体１１、１２、１６〜２０、Ｘ、Ｙの特性化に使用される。本発明の一態様で、２個のウエルを更なるテストのため態と黒にして置くことができる。ＩＣＰ技術は多くの異なるプローブセットとの不必要なハイブリダイゼーションを排除し、これにより２８個のウエルからの結果を組み合わせることにより完全な核型情報の組み合わせを可能にする。
【００４２】
本発明の一態様で、ＩＣＰ技術は以下のステップにより進行する；
ＤＮＡプローブの生成
in situハイブリダイゼーション
ＤＮＡハイブリダイゼーションの比色検出、及び
顕微鏡分析
ステップ１はＤＮＰ、ビオチン、フルオレッセインなどのようなラベルでラベリングされた２４個のヒト染色体からのＤＮＡプローブの使用からなる。このプローブは、ハイブリダイゼーションを望む染色体の正確な部分を確保するため、染色体の微量切除又は技術的に既知の他の方法により特別に生成することができる。例えばプローブの生成を微量切除技術、プラスミド、コスミド、遺伝子情報からの計算による方法、合成等を利用して行うことができる。ステップ２では、各ウエルの間期細胞を検出されるべき染色体又は異常に特有の単一セットのＤＮＡプローブで一晩ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションはＤＮＡプローブが核膜を貫通し、ＤＮＡ変性が２本のＤＮＡストランドを分離させることができるように、酵素による前処理のような標準in situハイブリダイゼーションを使用して行うことができる。ステップ３では、各特定ラベルを標準検出技術により検出する。この検出は順次又は同時である。個々の染色体長に沿って異なるバンドでの所定の色比率に基づき、例えば２つの酵素反応のような２色の混合が新しい検出可能色を生成する。染色体上のバンドの色々な色を予め決めることができ、図１に示すように、比較分析を容易にするためイデオグラム上で表示することができる。ステップ４によると、個々の染色体バンド上での色の進展を簡単な標準的光学顕微鏡を使用して肉眼で観察し理解することができる。
【００４３】
出産診断ＴＡＴは特に重要で、テストに関連する期待する両親により経験される著しい量の心配が存在する。決定と妊娠管理のためには、結果を得るための期限は妊娠期間２４週以内である。通常状況では、標準染色体テストを妊娠１６〜２０週頃に実施し、その結果は１０〜１４日後に判明する。従って遅い羊水穿刺テストは一般に望ましくない。ある臨床状況では、染色体テストを妊娠の最後の２〜３週間以内に行うことが望ましい。状況によっては、結果は緊急に得る必要がある。早期の羊水穿刺テスト（即ち１２週）では、結果は通常１０〜１４日よりかなり長い時間を必要とする。これは通常、テストに利用できる細胞の数が少ないためである。この各状況においては、古典的細胞遺伝学では一般にマーカ染色体の性質を確認することができない。その結果付加的な時間と費用のかかる特別な調査が必要となる。伝統的なＦＩＳＨテストを４８時間以内に行うことができるが、範囲は非常に限られ、片親ダイソミー（ＵＰＤ）のような状況による死亡率を潜在的に増加させるロバートソン転座の検出を含む完全な染色体情報を生成することはできない。
【００４４】
末梢血染色体テストを、遺伝子診断を達成するため、例えば、知能障害又は不妊組織又は多くの流産をした夫婦のような異常表現型特性を有する患者に行うことができる。一般に現在の手順を使用して、このようなテストのためのＴＡＴは通常５日であるが、しかし標準的な染色体調査ではマーカ染色体及び染色体のアンバランス再配列を確認できない。このような状況ではＴＡＴを増加させ、費用追加が必要な付加テストを必要とする。ある状況では通常テストでは見逃される異常には染色体末端（即ち微妙な再配列）が含まれる。現在これらの異常の検出には、如何なる診断組織が存在するかを解決するためには費用のかかるＦＩＳＨテストが必要である。
【００４５】
例えば突発性知能障害（ＩＤ）のような状況を有する患者において、約５〜９％は顕微鏡以下のサブテロメア再配列を有し、これは古典的細胞遺伝学では検出できない。更にＩＤ進行性障害を有する正常核型の全患者の約７％においては、サブテロメア再配列がある。ある場合は、付加細胞を標準テストで分析する必要があり、これには著しく費用がかかる。
【００４６】
白血病／リンパ腫瘍癌テストで、染色体情報は正確な診断に不可欠なだけではなく、異なる投薬計画手順の管理に不可欠である。医師はしばしば結果が重要な治療決定を行うのを待つことができる。現在の手順で、ＴＡＴは通常５日である。現在のテストの１つの主な欠点は標準的染色体調査では染色体のテロメアを含む先に述べた微妙な再配列は勿論のこと、マーカ及び誘導染色体の確認ができないことである。これらの状況は付加テストが必要となりＴＡＴと費用の増加となる。正常／異常結果となるある場合で、より多くの細胞を費用を又増加させる通常テストにより分析する必要がある。残念なことに、多くの場合染色体を有する付加的細胞はテストに簡単に利用できない。約５〜１０％の場合は、培養不成功により染色体結果が全く利用できない。
【００４７】
固形腫瘍と患者管理における染色体情報の重要性は急速に増加している。膀胱、前立腺、腎臓、胸、肺等のような固形組織の癌で、標準的な染色体調査は３０日以上かかり、テストの７０〜８０％以上で結果が得られない。これは調査失敗になりやすい。上記の白血病やリンパ腫と同様に、マーカと誘導染色体確認は標準染色体テストではできない。
【００４８】
染色体情報は遺伝子診断の達成のため、及び未来の妊娠決定のため患者に助言するため流産物質上で得ることができる。現在の手順を使用して、このような組織上での遺伝子テストのためのＴＡＴは３０〜４５日になる。より重要なことは、２０〜４０％の場合において、結果は欠陥サンプルにより標準染色体テストによって結果を得ることはできない。従って遺伝子異常を適切に診断し、そして患者に助言するためには、付加テストが一般に必要となる。このような付加テストは必要な費用と時間を結果として増加させる。
【００４９】
ＩＣＰは、タイミングよくそしてコスト効率のよい方法で、臨床的細胞遺伝学及び医学界の満たされないニーズを提供することにより、現在の手順の限界により生成される隙間を埋める。
【００５０】
以下は本発明を実施するための手順を示す例である。これらの例は明らかな変更を含むと解釈されるべきで、限定するものではない。
例１‐ハイブリダイゼーションチャンバーの使用
【００５１】
現在の手順では２４個の異なる色を使用して中期染色体に基づき多色核種を確保する。中期染色体を生成するため、例えば末梢血、骨髄、羊水、固形塊等のような色々なタイプの試料からの材料を培養しなければならない。完全な核型情報を確保するため２０個の細胞を調査することが一般に必要である。利用できる細胞の量はしばしば限定される。本発明迄、材料源を効果的に利用するために利用できる方法はなかったので、調査に提供される資料に存在する遺伝子変化の完全な特性化が達成できる。染色体の特定セットを調査できる技術的にいくつかの方法が存在するが、これらの方法は全く限定されている。上で論じたように、疑わしい遺伝子異常を事前に知らねばならず、そして限定された情報だけがこのようなテストにより得ることができる。試料に存在する特定の遺伝子変化の予備知識なく、単一万能プローブセットでこの発明を使用して、ほぼ全ての染色体変化を完全に特性化できる。これはハイブリダイゼーションチャンバー上の指定部位又はウエルで、間期細胞において一時に１つの染色体に実施することができる。
【００５２】
本発明の一態様において、ハイブリダイゼーションチャンバーは１セットのスライドから構成され、そして図に示すように、各スライドはウエルを含むことができる。例によって、スライド１はロバートソン転座といわれる染色体再配列の特別タイプを検出するためのスライドである。ロバートソン転座はそれらのセントロメアにより結合する末端動原体型染色体間の転座であり、結果として核型で１つ少ないセントロメアになる。例えば、ロバートソン転座が染色体１４と２１の間でバランスした形で起こる場合、核型には１つの正常２１、１つの正常１４及び結合染色体１４／２１があり、これにより染色体の全数は４６から４５へ変化する。ヒトゲノム（染色体１３、１４、１５、２１、２２）には５個の末端動原体型染色体があり、この５個のいずれの１つも、同一染色体、即ち２１／２１結合染色体となる染色体のコピー間の再配列を含むこのタイプの再配列に参加する。この再配列はバランスした又はアンバランスな核型となる。アンバランス型では、全染色体数は一般に４６であるが、核型には末端動原体型染色体の１つの３つのコピーがあるようである。
【００５３】
現在のＦＩＳＨ法を使用して、ダウン症を有する患者からの臨床サンプル上にダウン症固有領域、即ち２１、ｑ２２の３個のコピーが一般に検出される。この結果は染色体２１の３個のコピーを有するダウン症の自由形式には充分であり、そしてロバートソン転座は存在しない。しかし、ダウン症の同一臨床表現型は染色体２１と１つの他の末端動原体型染色体を含むロバートソン再配列から発生する。これは技術的な現在の方法を使用しても検出できない。これは、再発危険値はダウン症の自由形式とロバートソン形式の間では全く異なるので、遺伝子助言と次の妊娠管理に対し重要な臨床的意味を有する。従って、価値ある情報は失われる。この限界をこの発明により克服することができる。
【００５４】
染色体２１以外の染色体を含むロバートソン転座は又妊娠診断において臨床的に重要である。片親ダイソミー（ＵＰＤ）と呼ばれる病状は染色体が１３、１４、１５に対し存在する。バランスしたロバートソン転座が末端動原体間に起こり、そして含まれる染色体が１３、１４、１５の場合、担体はＵＰＤに対する危険が増加する。妊娠診断で検出される胎児のＵＰＤは重症の臨床的発現の一因となり、死亡率を著しく高める。この発明まで、ロバートソン転座を検出し、そして潜在的ＵＰＤを確認する唯一の方法は標準細胞遺伝学によっていた。ＩＣＰは間期細胞中の全ロバートソン転座を検出し、これにより出産診断で妊娠管理のための価値ある情報を提供することによりこれを克服する。
【００５５】
スライド２は染色体１〜１０用ウエルを備える。スライド３は染色体１１、１２、１６、１７、１８、１９、２０、付加ウエルを更なるテストのためにわざと黒にしたＸ／Ｙ、のためのウエルを備える。各ウエルに２５〜３０個の間期細胞を注意深く配置することにより、不必要なハイブリダイゼーションを除去できるので不良試料でも調査でき、ウエルからの結果を組み合わせることにより完全な核型情報を組み合わせることができる。
例２‐ＤＮＡプローブセット
【００５６】
プローブセットは２４の染色体の各々に対しＤＮＡプローブの固有に設計された組み合わせから構成される。各ヒト染色体はセントロメアとセントロメアに取り付けられた短腕と長腕を含む。染色体は全て腕の端部に各染色体固有のテロメアと称する固有ＤＮＡ配列を含む。末端動原体型染色体だけはセントロメアと長腕を有する。その短腕は変化し、遺伝子がない場合もあり、臨床的意味はない。このため、末端動原体型短腕を検出するようにプローブは設計されない。
【００５７】
さて図１に関して、この発明に基づくカラーバンド・パターンを図示する。比較のため、標準Ｇバンド（即ちｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）を含む。イデオグラムは染色体上のバンド全ての図表示である。現在のＧ‐バンドイデオグラムに基づき、各ヒト染色体は個々の単位長が与えられる。例えば最大のヒト染色体である染色体１は、７３の単位長を有し、その短腕は３６の単位長、そして長腕は３７である；染色体２は６８の単位長を有し短腕と長腕は夫々２７と４１である。全染色体の単位長はイデオグラム上に描写される。
【００５８】
現在の手順では、染色体分類は一般にＧ‐バンドパターンに基づき、そして染色体はＡ〜Ｇ及び性染色体に分類される。染色体１〜３はグループＡに、３〜４はグループＢに、６〜１２とＸはＣに、１３〜１５はＤに、１６〜１８はＦに、そしてＹ染色体を含む１９〜２０はＧに分類される。個々の染色体上のバンドは一般に化学的着色により生成され、染色体上の固定位置を有し変化させることはできない。従って２つの自然に接近して配置されるＧ‐バンド間に入る染色体変化の確認はしばしば困難である。この問題は、短腕と長腕の全体寸法に基づき互いにほぼ等距離位置に「バンド」を間隔をあけて並べることによりこの発明により克服できる。これは間期核における染色体変化の確認を容易にする。
【００５９】
ほぼ等距離染色体ハイブリダイゼーションの概念を利用して、ヒト染色体腕を以下の３グループに分類することができる、即ち単位長４‐６のグループ１（小）；単位長７〜１９のグループ２（中）；単位長２０〜４１のグループ３（大）。各グループ内では、個々のバンドをほぼ同一距離をあけて配置する。例によると、短腕は５本のバンドを有し、長腕も５本のバンドを有する。セントロメアバンドに関し、染色体１は全体で１１（５＋１＋５）のカラーバンドを有する。従ってこのＩＣＰ発明を使用して間期細胞におけるヒト染色体１を見ると、短腕の端部から始めて、それがセントロメアに達する迄カラーバンド、「無色」バンド、カラーバンド、無色バンド等が観察され、そしてこのパターンは、それがカラーバンドを備える長腕の端部に達する迄続くだろう。有色と無色の全バンドを計算して、正常な染色体１は合計２１バンドを有する。このタイプの分解能は培養後しか確保できない中期染色体を必要とする標準Ｇ‐バンドパターンに等しいかこれよりよい。上記モデルに続く別の例によると、染色体１８はグループ１の短腕とグループ２の長腕を有し、染色体Ｙはグループ１短腕とグループ１長腕を有する。
【００６０】
染色体１に関する更なる例として、小バンドをカラーバンド間の中間位置に着色することができる。このような小バンド着色は、例えば８本の付加バンドを追加し、染色体上の全着色バンド数を１９とする。
【００６１】
図１に見るごとく、ヒト染色体に対応するカラーバンド・パターンで分類法を図示する。一般にそして図示だけの目的で、セントロメアバンドを黒に着色し、そしてセントロメアから短腕の端部へ進むにつれ、カラーバンドを染色体端部（テロメア）バンドを目立たせるために使用される２種の主色の比率を変化させた混合物により生成することができる。本発明の一態様で、短腕テロメアを青に着色し、長腕テロメアバンドを赤に着色する。本発明の別の態様では、染色体１、５、９、１６、１９に対し、ペリセントロメアバンド、即ちセントロメアに隣接するバンドをセントロメアの代わりに使用することができる。
【００６２】
図示だけの目的で、例として染色体１を使用して、セントロメアを黒、短腕の次のバンドを濃赤色にする１青：９赤にする。次のバンドは薄青色にする７青：３赤にする。次のバンドは紫色にする５青：５赤にする。次のバンドは赤褐色にする３青：７赤にする。最後に、テロメアバンドはテロメアの端部を表示する１００％青にする。セントロメアとテロメア間の３：７、５：５、７：３のこのバンド順は長腕の主色に関して反転させることができる。従って、セントロメアが黒で始まる染色体１の長腕は３赤：７青（赤褐色）；５赤：５青（紫）；７赤：３青（薄青）、そして最後にテロメアバンドは赤（１００％）となる。短腕から長腕への全染色体を簡単に読み取ると、青、赤褐色、紫、薄青、濃赤、黒、赤褐色、紫、薄青及び赤である。この議論からみられるように、各腕はその区分カラーバンド「署名」を有し、この署名からの変化があればそれは遺伝子変化を示すことになる。
【００６３】
この発明の態様によると、染色体変化のＦＩＳＨに基づく検出に現在技術的に使用されるようなフィルタ、ダイクロイックミラー、ＣＣＤカメラ、高性能コンピュータソフトウエア、インフェロメータ等による色処理の必要なく、簡単な光学顕微鏡の下で間期細胞中に容易に変化を確認できる。この発明によるカラーバンドは、腕のサイズ、色配列のずれ、カラーバンドの喪失又は余分なカラーバンド、無色バンドの単位サイズの減少又は拡大に拘らず、互いにほぼ等距離にあるので、色配列のずれは染色体異常を示す。この方法をほぼ全てのヒト染色体の数及び構造的異常の両方を検出するのに使用できる。染色体異常、特にＩＣＰを使用したマーカ染色体確認の数例について以下に論ずる。現在の手順では、マーカ染色体は中期染色体でのみ確認することができる。この発明を利用して、マーカ染色体を間期核にて確認することができる。この結果は時間と費用の著しい節約となる。
例‐３ ＣＩＳＨ法
【００６４】
この発明は比色in situハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）を利用する。ＣＩＳＨの使用は多くの利点がある。最も重要な利点は細胞遺伝学研究所での利用可能装置の実用性及びＦＩＳＨに基づく装置に関連する異常な費用の回避である。ＦＩＳＨに基づく取り組みは研究環境で十分である一方、ＣＩＳＨは日常の臨床細胞遺伝学及び他の病理学研究所にとって独特の位置にある。上記のように、染色体異常は、操作の必要なく、簡単な光学顕微鏡下で間期細胞に容易に確認できる。ＣＩＳＨ法の利用では多色ＦＩＳＨ法におけるような擬似色表示はない。更に視野に見えるものは一般にテストで生ずるもの、真の色表示である。上記の色は例えば、隣接する色を識別できる通常の「色覚異常」の人の目に対し設計される。これは、技術者のようなその分野によく精通している人でないような人に対してさえ、現在の細胞遺伝学分析に付加的機会を開く。従ってよく精通した技術者は費用がかかり、かつ見つけるのは困難なので、著しく経済的なかつ時間的な節約の機会を与える。
【００６５】
現在のＣＩＳＨ手順は反応の場に固有の色を生成するため全酵素反応だけを利用する。異なる色を生成するため、明細書で述べたような特定比率でＤＮＡプローブと対になった固有の酵素の混合物は開示していない。間期核における異なる部位での順次酵素反応についてはこの分野の専門家には知られていたが、この発明まで同一部位（即ち、間期核の任意の部位）における順次酵素反応は可能でなかった。ＦＩＳＨと比較したＣＩＳＨの主な欠点は反応部位における信号の分解能（即ち輝度）であった。ここ数年、いくつかの進歩がＣＩＳＨ分野で行われ、反応部位での信号の増幅が望めば、今や可能となっている。更にＤＮＡプローブ準備段階の間に、酵素が後に付着する多くのリガンドの組み込みで、カラーバンドの信号強度は向上した。
【００６６】
ＣＩＳＨ法は恒久的である利点を有する。生成される色反応は恒久的であり、後の使用に保存できる。他方、ＦＩＳＨ信号は急速に消滅し、レトロスペクティブ分析には全く有効でない。新しい遺伝子変化が患者（即ち、治療の間）に発見されると、臨床相関を確立するため、以前のハイブリダイゼーションスライドを有することが比較のために使用するのに極めて有効である。
例４‐実施例
【００６７】
現在の細胞遺伝学手順はこの領域の側面を守るプローブの設計に染色体における自然の切断点に依存している。例えば染色体９と２２間の転座のような白血病固有の転座を検出するため、プローブはバンド９ｑ３４（ａｂｌ遺伝子）とバンド２２ｑ１１．２（ｂｃｒ遺伝子）の染色体９上の切断点を検出するように設計される。２２用の赤と９用の緑の２色を使用して、正常な間期反応は２つの赤点と２つの緑点として現れる一方、緑／赤融合により転座は１つの緑、１つの赤そして１つの黄に起こる。例によって、この発明を利用すると、同一転座は染色体９が２つの断片に、そして染色体２２が２つの断片に転移するように現れる。夫々のスライド上の染色体９ウエルにおける結果のカラーバンド・パターンは；短腕テロメアから始めて青、赤褐色、黒、紫、１つの隣接ストレッチとしての薄青及びこのストレッチから離れた赤、即ち染色体９上にａｂｌ遺伝子が存在する薄青と赤の間の切断点を表示する赤の転移、を表す。同じウエルの非分離色配列は正常な染色体９を表す。同様に染色体２２上のカラーバンド・パターンは紫から分離した赤、赤と紫間の切断を示す濃青ストレッチである。染色体２２上のｂｃｒ遺伝子は２色のバンド赤と紫の間にある。再度、赤、紫、濃青の非分離色パターンは正常な染色体２２を表す。染色体２２のセントロメアは染色体１４と異種ハイブリダイゼーションをするので、２つの付加の個々の赤信号が存在する。染色体１４のハイブリダイゼーションウエルは又２つの別の赤と青点を有する。もしＩＣＰスライドの読み取りの進行で、これがその試料における唯一の遺伝子変化であれば、染色体２２を含む全てのウエルは上記パターンを示し、染色体９を含むウエルは上記色パターンを有し、そして他の染色体は全て隣接カラーバンド・パターンの２つのストレッチを有するだろう。患者の性別によっては、ＸＸ又はＸＹ染色体カラーパターンをＸとＹ染色体プローブを含むウエルにおいて読み取られるだろう。この例から分かるように、病状の予備知識はＩＣＰ法の使用には不要である。
【００６８】
この発明の態様による実施形態で、９：２２転座の上記例のような簡単な転座では、転座の確認は目視手段にて達成できる。全てのヒト染色体遺伝子における中間部黒小バンドを含む、各個々のカラーバンドは赤又は青バンドとしてキットで入手できる。先に述べたように、オプションそして／または確認テスト用にハイブリダイゼーションチャンバーに故意に空の溝又はウエルを置く。こうして染色体９上の切断点の両側で非セントロメア又は非テロメアの１つを選択し、そしてそれをハイブリダイゼーションチャンバーへ入れると、転座を抱く間期細胞は赤、赤、青、青、のカラーパターンを有する。青と赤の並列は転座を表示する。この色仕組みで転座を抱かない細胞は赤、赤、青、青、と読み取られるだろう。セントロメアバンドは導入されないので、染色体２２の異種ハイブリダイゼーションは従って除かれるだろう。
【００６９】
例により、この色仕組みは含まれる染色体バンドに関係なく、ほぼ全ての簡単な転座の証明に使用することができる。２つ以上の染色体を含む複雑な転座でも上記方法を使用した系統的付加ハイブリダイゼーションにより検出し、かつ診断できる。
例５‐マーカ染色体確認
【００７０】
臨床細胞遺伝学の定義によるマーカ染色体は標準Ｇ‐バンド技術によりセントロメアの複製起点及びその染色体上の付加材料が確認できないことを意味する。しかしこれらのマーカ染色体は疾病の発生そして／又は進行において重要な役割を果たす。中期染色体と２４色ＦＩＳＨ技術を使用して、一般にはマーカ染色体の性質を確認できる。しかし間期核における確認は非常に難題で、現在の手順の使用では行うことができない。
【００７１】
マーカ染色体の例を以下に記述する：
染色体３のセントロメアの所有；３の短腕の全て；染色体７長腕からの２つのバンド；及び染色体１０からの長腕テロメア。これは非常に複雑なマーカで癌細胞遺伝子学、特に固形腫瘍細胞遺伝学において、通常このタイプの状況に出くわす。
【００７２】
明細書に述べたようなこの発明の技術を利用して、ＩＣＰモデルにおいて、３個のスライド技術を利用してハイブリダイゼーションを完了し、以下に結果を記す；スライド１は平凡（即ち正常）；スライド２は１〜２、４〜６、８〜９（即ち正常）；スライド３は平凡（即ち正常）。スライド２上で染色体３用のハイブリダイゼーションウエルにおいて、異常カラーバンド・パターンを読み取る。２つの正常隣接カラーバンドに加え、もう１つのセントロメアと短腕バンドが存在するようである。２つの隣接カラーバンドに加え染色体７ウエルで２つの別の隣接するカラーバンドが存在するだろう。最後に、染色体１０の長腕テロメア構成がバランスしているかどうかにより、染色体１０ウエルで２つの隣接カラーバンドと別のテロメア分離バンド又はカラーバンドの１つの隣接ストレッチと第２色バンド配列からのテロメアバンドの転移のいずれかを観察できる。図６は３つの異なる間期細胞におけるマーカ染色体を示す。
【００７３】
この発明の態様によると、ＩＣＰモデルでマーカ染色体を「再構築」できる。３から中心部断片をそして７と１０から中心部外断片を採取し、それら全てを共に間期細胞でハイブリダイズすることにより、これら断片の全てが「疑わしい」マーカを形成したかどうかを確認することができる。もし隣接カラーバンド配列が見つかれば、結果は「正」のようである。更に正常染色体３、７、１０上の対応するバンドも目立つようで、これによりマーカ染色体の性質を確認する。図７は明細書で論じた残りのカラーバンドを備える「再構築マーカ」を示す。
表Ａ
【００７４】
表Ａはこの発明の態様によるスライド１上の末端動原体型染色体組み合わせを示す。染色体が第１に導入されたか、第２に導入されたかにより、セントロメアは赤又は青色を呈し、残りの色配列はイデオグラム上に示すようになる。イデオグラム上の染色体の左への色配列は第１に表現され、右の配列は組み合わせで第２に表示される。染色体１３と２２については、それらは常に第１に又は第２のいずれかにのみ導入されるので１色のみが表示される。
【００７５】
染色体１３と２１のセントロメアはウエル＃３にて異種ハイブリダイゼーションされるので、全てのセントロメアは紫（赤＋青）になる。これは、これら２つの染色体間の転座があるかどうかに関係なく正しい。バランス状態で転座があれば、このウエルの間期細胞に１つ少ないセントロメア（即ち、４の代わりに３）となる一方、アンバランス状態では、その数は４のままである。同じ一般ルールを染色体１４と２２にも同様に適用する。従ってウエル＃７の間期細胞は同様に染色体１３と２１にも作用する。バランス及びアンバランス状態共にロバートソン転座の存在を表すセントロメアのない両染色体からのより大きい隣接色ストレッチが存在するようである。＃３と＃７用を除く全ウエルにおいて、２つ以上の異種ハイブリダイゼーションを表す別のセントロメアが存在するようである。この設計は遺伝子異常を相互参照する多くの機会を保障する。
例７‐細胞測定技術
【００７６】
この発明の態様によると、ＩＣＰは、例えば末梢血、骨髄、吸引物、羊水、絨毛、胸膜液、リンパ節生検、固形腫瘍塊、受胎産物等のような全てのタイプの試料の調査を受け入れる。これらのタイプの試料の中で、血液、骨髄、羊水及び胸膜液のような「液体」資料は単一細胞を含む。残りの試料は結合された細胞集合体からなる組織である。ＩＣＰを実行するためには、単一の間期細胞を必要とする。こうして、この発明の別態様により、ハイブリダイゼーションチャンバースライド上の各ウエルに２５〜３０個の細胞を正確に加える又は乗せる方法を考察できる。
【００７７】
現在の手順はコレギナーゼとトリプシンのような酵素を利用するそれらのような単一細胞懸濁液に固形組織を分解するために存在する。上で論じたように、液体試料は、単一細胞を得るためこのタイプの処理を必要としない。一旦単一細胞懸濁液がこの試料タイプから得られたら、各「ピペットの一滴」が２５〜３０個の細胞を含むように細胞濃度を調節する。例えば、１ｍｌの試料が１０００個の細胞を含み、そして各１ｍｌが１０ピペット滴を含む場合、各１滴は１００個の細胞を含む。各ウエルは一般にＩＣＰ用の１滴のみを受けるので、試料は適当に薄め、この場合は３．５〜４倍に薄め、これにより各１滴が所望の細胞濃度になる。もし最初の容量がピペット１滴あたり１０個
の細胞であれば、試料を遠沈させ、余分な容量を除去して２．５〜３倍に濃縮し、これにより、各ピペットの１滴が所望の細胞濃度となる。
【００７８】
この技術は小容量の「欠陥」試料をこの発明の下で完全に分析することができることを保証する一方、技術的な他の方法は完全な核型情報を補足できない。
例８‐低張処理
【００７９】
殆どのＦＩＳＨ手順は現在、低張処理をしない試料からの塗布標本を使用するだけである。ＫＣＩやクエン酸ナトリウムのような低張処理の発見は最新細胞遺伝学分野を生んだ。中間細胞の適切な「膨張」はそれらが顕微鏡スライド上に落ちる時、中期染色体の分離を保証する。同様に、間期染色体の適切な分離は多色バンド配列の成功的描写には不可欠である。異なる濃度で異なる低張溶液で実験することにより、ハイブリダイゼーションウエルの顕微鏡スライド上にそれを固定する前に、間期を適切に「膨張させる」ことが可能なようである。
例９‐ＩＣＰ手順
【００８０】
ヒトＤＮＡプローブの生成；
【００８１】
１）各染色体上に、ＤＮＡプローブハイブリダイゼーションの部位を標準Ｇバンドイデオグラム上に示す。先に開示したように、染色体１は１９のＤＮＡプローブを有する：
1個のぺリセントロメア、４個の色付き短腕＋５個の黒短腕＋１個の短腕テロメア、３個の色付き長腕＋４個の黒長腕＋１個の長腕テロメア。
【００８２】
２）各染色体バンドは例えば標準Ｇ‐バンド中期染色体調合液から技術的に知られる他の技術を使用して微量切除又は分離される。
【００８３】
３）各微量切除染色体バンドをＴｅｌｅｎｉｕｓ（１９９２）により一般に記述されるようなＤＯＰ‐ＰＣＲ技術により増幅する。
【００８４】
４）これらのプローブからの反復配列を、Ｃｒａｉｇ（１９９７）により一般的に記述される、アビジン磁気ビードが続くビオチンラベルのＣｏｔ‐１ＤＮＡを使用して除去できる。
【００８５】
５）第１ＤＯＰ‐ＰＣＲサイクルからの繰り返し自由なプローブをリールＬｉｅｈｒ（２００２）により記述される手順を使用して更なる増幅期間に曝する。
【００８６】
６）標準的超音波処理技術を使用して、プローブ長を約２００ｂｐ〜６００ｂｐの間に調整できる。又プローブのより小さい断片をＶｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ Ｎｉｃｋｉｔキットのような、キットとしての標準技術を利用して生成することができる。
【００８７】
７）ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓＦａｓｔＴａｇのような標準ラベリング手法又は技術を使用して、ＤＮＡ断片を例えばＤＮＰ、ビオチン、フルオレッセイン等のようなラベルでラベリングできる。
【００８８】
８）ラベルは所定手順に応じて選択される。
【００８９】
９）例えばＦａｓｔＴａｇ技術は、ハイブリダイゼーションの部位におけるより高い感度を達成するため、ＤＮＡストランドによる多くの部位でラベルを組み込むことができる。
【００９０】
１０）２４のヒト染色体からのＤＮＡプローブは次にハイブリダイゼーションチャンバーのスライド上の間期細胞にin situハイブリダイゼーションの準備ができる。
【００９１】
１１）セントロメアとテロメアＤＮＡプローブを生成し、又は経済的に入手可能なプローブを利用できる。プローブは、ラベルの必要のないそして上記のようなＩＣＰ目的で確保でき、適切なラベルをＤＮＡへ組み込むことができる。
【００９２】
in situハイブリダイゼーション：
【００９３】
１）単一細胞懸濁液を３個のハイブリダイゼーションチャンバーでスライド上の各ウエル上に配置する。懸濁液を低張溶液で処理し、３：１のメタノール：酢酸溶液で固定する。
【００９４】
２）各ウエルの間期細胞を例えばＤＮＡストランドを分離するＤＮＡ変性が行われる、ＤＮＡプローブが核膜を貫通できるように酵素の事前処理のような標準in situハイブリダイゼーション技術を使用してそのウエル固有の単一セットのＤＮＡプローブでハイブリダイズすることができる。
【００９５】
３）ハイブリダイゼーションは一晩で起こる。
【００９６】
４）スライドからハイブリダイズされなかった余分なプローブを除去するためハイブリダイゼーション後洗浄を行うことができる。
【００９７】
ＤＮＡハイブリダイゼーションの比色検出（ＣＩＳＨ）
【００９８】
１）ラベルビオチンは、ブドウ糖オキシダーゼ固有のＴＮＢ基質と反応後、ブドウ糖オキシダーゼ酵素に隣接するアビジン‐Ｄにより検出できる。これはＤＮＡハイブリダイゼーションの部位（即ち、全染色体上の短腕および長腕上の中間部位置は勿論のこと、セントロメア及びペリセントロメアバンドで）で黒沈殿物を生成できる。
【００９９】
２）ラベルフルオレッセインを、ペルオキシダーゼ固有の例えばＮｏｖａＲｅｄのような基質との反応後に、抗‐フルオレッセイン、抗体隣接ペロキシダーゼ酵素により検出することができる。これはＤＮＡハイブリダイゼーションの部位即ち、長腕テロメアにそして全染色体上で染色体を通し、他のバンドで赤い沈殿物を生成する。
【０１００】
３）ラベルＤＮＰを例えばアルカリホスファターゼ固有のベクトル青のような基質と反応すると抗ＤＮＰ抗体隣接アルカリホスフォターゼにより検出できる。これはＤＮＡハイブリダイゼーションの部位、即ち短腕テロメアと全染色体上の染色体を通して他のバンドで青い沈殿物を生成する。
【０１０１】
４）その間で必要な阻止と洗浄ステップで３反応が順に実行される。市販の基質使用はＶｅｎｄｏｒ社の手順に従う。
【０１０２】
５）順序は以下である；ビオチン、フルオレッセインそしてＤＮＰ検出。
【０１０３】
６）別の方法では、酵素が異なり、基質はこれら夫々の酵素に固有であるため、３反応全てを同時に達成することが可能である。
【０１０４】
７）先に開示したように、末端動原体型染色体セントロメアは例えば青又は赤（黒は除き）のような着色ができる。同様の適応は、全染色体再配列の適切な確認を保障するため、末端動原体型長腕バンドは勿論のこと、染色体１０、１２とＹの上のあるバンドに対し行うことができる。
【０１０５】
８）スライドを例えばメチルグリーン（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）のような対比色で対比着色を行うことができ、メチルグリーンはそれが３主色（黒、青、赤）に対し特別な対比を提供するので使用する。
【０１０６】
９）個々の染色体の長さに沿った異なるバンドで既定比率の色に基づき２色（２つの酵素反応）の混合物が新しい検出可能色を生成する。全ヒト染色体上の全バンドのための色組み合わせ例を図１に示す。
【０１０７】
顕微鏡分析：
【０１０８】
１）個々の染色体バンドの色発現で、間期染色体を他の更なる助けもなく、簡単な標準的光学顕微鏡を使用して観察できる。ＣＣＤカメラを目の助けに使用できるが、しかし必要ではない。
【０１０９】
２）スライド１から始めて、各間期細胞における色パターンを記録できる。イデオグラムからの期待正常色パターンに基づき、夫々の末端動原型染色体の正常、または異常状態を決定できる。一般に、各ウエルから２０個の間期細胞を記録することができる。
【０１１０】
３）スライド２と３上の残りの染色体に対し、同じ分析を繰り返し、即ち２０の間期細胞を使用して各染色体の正常及び異常状態を記録し、この結果を組み合わせ、テストした個々の完全な核型プロファイルを得る。
【０１１１】
４）もし例えばモザイク正常及び異常細胞の疑い、簡単又は複雑な転座の証明、マーカ染色体等のような追加分析が指示されると、スライド＃３上のような空のウエルを確認試験に使用できる。必要であれば、確認試験の設計に応じ完全に別のスライドを使用できる。
【０１１２】
５）染色体のバンドパターンはいずれも簡単なデジタル写真により記録することができる。
【０１１３】
６）簡単なモザイク現象は顕微鏡分析で容易に検出できる。複雑な明らかに同類クローンモザイクでさえ証明できる。以下の例はこの発明の態様による証明手順を示す。
例１０‐核型分析
【０１１４】
例として、以下の結果を有する核型を分析する；＋８／ｔ（９；２２）／ｔ（９；２２）、＋８／正常。
【０１１５】
慢性顆粒球性白血病のこの場合、２つのクローン異常がある；上で論じたように、この疾病特有の変化であるｔ（９；２２）。トリソミー８（＋８）は進んだ疾病進行を示す。しかしトリソミー８は「無関係」クローンとして単独で存在できる。このように同一クローンがｔ（９；２２）と＋８の両方を有するかどうかを確立することは臨床的に非常に重要である。
【０１１６】
例によって、最初のＩＣＰ通常反応で、ｔ（９；２２）備える１０個の細胞；＋８を備える５個の細胞；染色体８の正常な１５個の細胞及び染色体９と２２の正常な１０個の細胞がある。各所で説明しているように、転座証明は赤：青実験により行われ、ここでは赤：青並列は転座を表示したが、別の赤と青は転座を示さない。この結果を染色体８セントロメア（黒）用プローブと組み合わせることにより、結果は以下のようになる；ｔ（９；２２）を有する５個の細胞；ｔ（９；２２）と＋を有する５個の細胞；染色体８、９、２２が正常な１０個の細胞。これらの結果は、＋８は疾病進行の一部であり、独立した事象ではないことを明確に示している。もしそれが独立事象であれば、組み合わせ結果を有する細胞を観察できないだろう。
【０１１７】
さて図１４に関してこの発明の態様によるハイブリダイゼーションスライドを図示し、大体参照番号１０により参照される。スライド１０は本体２０、複数ウエル２２及び確認ラベル領域２４からなる。本体２０はその上でハイブリダイゼーションを行うのに十分なガラス又は他の半透明な材料からなる。ウエル２２はその上でウエル２２を分離するための印刷領域からなる。ウエル２２は又サンプルを受け、そしてハイブリダイズするための研磨圧入、鋳型圧入等からなる。確認ラベル領域２４はラベル又は他の確認手段を受けるための透明領域又はすりガラス領域からなる。
【０１１８】
以下の表は標準Ｇ‐バンドを利用した技術を明細書で開示した技術を利用して得た結果の比較のため使用者が簡単に参照することを提供する。
【０１１９】
以下の表は標準Ｇバンド法と比較した間期染色体プロファイル（ＩＣＰ）を示す。参照を容易にするため、以下の省略を行う；Ｑ＝長腕；Ｐ＝短腕；ｐ＝セントロメア近接；ｑ＝セントロメア遠位；Ｔｅｒ＝テロメア；ｍａ＝主バンド；及びｍｉ＝小バンド
【０１２０】
表１−染色体１
【０１２１】
表２−染色体２
【０１２２】
表３−染色体３
【０１２３】
表４−染色体４
【０１２４】
表５−染色体５
【０１２５】
表６−染色体６
【０１２６】
表７−染色体７
【０１２７】
表８−染色体８
【０１２８】
表９−染色体９
【０１２９】
表１０−染色体１０
【０１３０】
表１１−染色体１１
【０１３１】
表１２−染色体１２
【０１３２】
表１３−染色体１３
【０１３３】
表１４−染色体１４
【０１３４】
表１５−染色体１5
【０１３５】
表１６−染色体１６
【０１３６】
表１７−染色体１７
【０１３７】
表１８−染色体１８
【０１３８】
表１９−染色体１９
【０１３９】
表２０−染色体２０
【０１４０】
表２１−染色体２１
【０１４１】
表２２−染色体２２
【０１４２】
表Ｘ−染色体Ｘ
【０１４３】
表Ｙ−染色体Ｙ
【０１４４】
先の開示は本発明を実施するための本発明により考察された最良モードを提示し、この技術に精通する人がそれを実施できることを意図するが、修正と変更を含む方法はこの技術に精通する人には明らかであろう。従ってそれは限定されると解釈されるべきで、このような前記の明らかな変更を含むべきで、以下の特許請求の精神及び範囲によってのみ限定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
特許又は出願書類は少なくとも１枚の図面そして／又は色付き顕微鏡写真を含む。この特許又は色付き図面を備える特許出願公報のコピーは要求及び必要費用の支払いにより当局から提供されるだろう。
【図１ａ】この発明態様による典型的結果カラーバンドを示す間期染色体プロファイルイデオグラムである。
【図１ｂ】この発明態様による典型的結果カラーバンドを示す間期染色体プロファイルイデオグラムである。
【図２ａ】ａ、ｂは、４００バンドレベルの従来技術Ｇ‐バンドイデオグラムである。
【図３】ａ−ｄは、この発明態様による間期染色体プロファイル（ＩＣＰ）とＧ‐バンドイデオグラムの並列比較である。
【図４】ａとｂは、この発明態様による夫々染色体９と２２間の転座を示す顕微鏡視野の図である。
【図５】ａ、ｂは、この発明態様による証明目的のための夫々、転座、不転座を示す顕微鏡視野の図である。
【図６】ａ、ｂ、ｃは、この発明態様による、夫々染色体３、７、１０のマーカ染色体確認の図である。
【図７】この発明態様による染色体３、７、１０を含むマーカ染色体確認からの結果としての顕微鏡視野の図である。
【図８】この発明態様による染色体１３の中間部欠失を示す顕微鏡視野の図である。
【図９】この発明態様による染色体１４と２１のロバートソン転座を示す顕微鏡の図である。
【図１０】この発明態様による染色体８の短腕の偏動原体逆位を示す顕微鏡視野の図である。
【図１１】この発明態様による染色体１６の動原体を挟まない逆位を示す顕微鏡視野の図である。
【０１４６】
【図１２】ａ、ｂは、この発明態様による夫々染色体１７と１９を含む挿入転座を示す顕微鏡視野の図である。
【０１４７】
【図１３】ａ、ｂは、従来技術の比色in situハイブリダイゼーションの顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【０１４８】
10：スライド
20：本体
22：ウエル
24：確認ラベル領域
参考文献
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
間期染色体プロファイリングを生成する方法であって、
・プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
・前記染色体上の略等距離位置で少なくとも1つの染色体をマーキングできる種固有ＤＮＡプローブの確保；
・前記ＤＮＡプローブとの前記サンプルのハイブリダイゼーション；
・前記サンプルの比色分析用前記染色体上に区分主バンドを生成するための複数酵素の使用；
・前記染色体のプロファイルを決定するための視覚分析の使用；
からなる方法。
【請求項２】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイゼーションはin situハイブリダイゼーションである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記in situハイブリダイゼーションはスライド上で起こる、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記スライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズさせそして分析するための一連のウエルからなる、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記視覚分析は光学顕微鏡からなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記視覚分析はＣＣＤカメラからなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡサンプルの複製起点は羊水、末梢血、胸膜液、骨髄、腫瘍組織、及び受胎産物から構成されるグループから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記視覚分析は染色体異常を検出できる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記染色体異常は転座である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記転座はロバートソン転座からなる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記視覚分析は核型を生成する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
比色in situハイブリダイゼーションの方法であって、
・プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
・前記染色体上の略等距離位置で少なくとも1つの染色体をマーキングできる種固有ＤＮＡプローブの確保；
・前記ＤＮＡプローブとの前記サンプルのin situハイブリダイゼーション；
・前記サンプルの比色分析用前記染色体上に区分主バンドを生成するための複数酵素の使用；及び
・前記染色体のプロファイルを決定するための視覚分析の使用；
のステップからなる方法。
【請求項１７】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記in situハイブリダイゼーションはスライド上で起こる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記スライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズさせそして分析するための一連のウエルからなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
染色体のロバートソン転座を視覚的に検出する方法であって、
・プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
・前記各染色体上の略等距離位置で少なくとも２つの染色体をマーキングできるヒトＤＮＡプローブの確保；
・前記ＤＮＡプローブとの前記サンプルのハイブリダイゼーション；
・前記染色体の比色分析用前記染色体上に区分主バンドを生成するための複数酵素の使用；及び
・ロバートソン転座が前記染色体間に起こったかどうかを決定するための視覚分析の使用；
のステップからなる方法。
【請求項２４】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ハイブリダイゼーションはin situハイブリダイゼーションである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記in situハイブリダイゼーションはスライド上で起こる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記スライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズさせそして分析するための一連のウエルからなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記視覚分析は光学顕微鏡の利用からなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記視覚分析はＣＣＤカメラの利用からなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡサンプルの複製起点は羊水、末梢血、胸膜液、骨髄、腫瘍組織、及び受胎産物から構成されるグループから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
マーカ染色体を検出する方法であって、
・プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
・前記各染色体上の略等距離位置で少なくとも２つの染色体をマーキングできるヒトＤＮＡプローブの確保；
・前記ＤＮＡプローブとの前記サンプルのハイブリダイゼーション；及び
・前記染色体の比色分析用前記染色体上に区分主バンドを生成するための複数酵素の使用；
のステップからなる方法。
【請求項３５】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ハイブリダイゼーションはin situハイブリダイゼーションである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記in situハイブリダイゼーションはスライド上で起こる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記スライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズさせそして分析するための一連のウエルからなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記視覚分析は光学顕微鏡の利用からなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記視覚分析はＣＣＤカメラの利用からなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡサンプルの複製起点は羊水、末梢血、胸膜液、骨髄、腫瘍組織、及び受胎産物から構成されるグループから選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
染色体をラベリングする方法であって、
・ラベリング用の少なくとも１つの染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
・前記染色体上の略等距離位置で少なくとも1つの染色体をラベリングできる種固有ＤＮＡプローブの確保；
・前記染色体がラベリングされ、前記ＤＮＡプローブとの前記染色体のハイブリダイゼーション；
からなる方法。
【請求項４６】
前記ラベリングは区分着色からなり、これにより区分主バンドを生成する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記ハイブリダイゼーションはin situハイブリダイゼーションである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記in situハイブリダイゼーションはスライド上で起こる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記スライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズさせそして分析するための一連のウエルからなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＤＮＡサンプルの複製起点は羊水、末梢血、胸膜水、骨髄、腫瘍組織、及び受胎産物から構成されるグループから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
間期染色体プロファイリング用キットであって、
・前記少なくとも１つの染色体上の略等距離位置で少なくとも1つの染色体をマーキングできる複数の種固有ＤＮＡプローブ；及び
・前記染色体の比色分析用前記染色体上に区分主バンドを生成するための複数酵素；
からなるキット。
【請求項５６】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記プローブセットと前記少なくとも１つの染色体をin situハイブリダイゼーションさせるための複数スライドから更になる、請求項５５に記載のキット。
【請求項６１】
前記少なくとも１つの染色体の比色分析用視覚分析手段から更になる、請求項５５に記載のキット。
【請求項６２】
前記視覚分析手段は顕微鏡からなる、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記視覚分析手段はカメラからなる、請求項６１に記載のキット。
【請求項６４】
前記染色体上の略等距離位置に少なくとも１つの染色体をマーキングする様に設計された複数の種固有ＤＮＡプローブからなるプローブセット。
【請求項６５】
前記染色体上に色付き主バンドを生成するための複数酵素から更になる、請求項６４に記載のプローブセット。
【請求項６６】
付加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成させる、請求項６５に記載のプローブセット。
【請求項６７】
前記付加区分着色は黒色素からなる、請求項６６に記載のプローブセット。
【請求項６８】
前記主バンドと前記小バンドは１：１の比で存在する、請求項６６に記載のプローブセット。
【請求項６９】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するように着色される、請求項６６に記載のプローブセット。
【請求項７０】
in situハイブリダイゼーション用複数ウエルから更になるガラススライドからなるin situ間期染色体ハイブリダイゼーションのためのスライド。
【請求項１】
間期染色体プロファイリングを生成する方法であって、
・プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
・前記染色体上の略等距離位置で少なくとも1つの染色体をマーキングできる種固有ＤＮＡプローブの確保；
・前記ＤＮＡプローブとの前記サンプルのハイブリダイゼーション；
・前記サンプルの比色分析用前記染色体上に区分主バンドを生成するための複数酵素の使用；
・前記染色体のプロファイルを決定するための視覚分析の使用；
からなる方法。
【請求項２】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイゼーションはin situハイブリダイゼーションである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記in situハイブリダイゼーションはスライド上で起こる、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記スライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズさせそして分析するための一連のウエルからなる、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記視覚分析は光学顕微鏡からなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記視覚分析はＣＣＤカメラからなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡサンプルの複製起点は羊水、末梢血、胸膜液、骨髄、腫瘍組織、及び受胎産物から構成されるグループから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記視覚分析は染色体異常を検出できる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記染色体異常は転座である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記転座はロバートソン転座からなる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記視覚分析は核型を生成する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
比色in situハイブリダイゼーションの方法であって、
・プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
・前記染色体上の略等距離位置で少なくとも1つの染色体をマーキングできる種固有ＤＮＡプローブの確保；
・前記ＤＮＡプローブとの前記サンプルのin situハイブリダイゼーション；
・前記サンプルの比色分析用前記染色体上に区分主バンドを生成するための複数酵素の使用；及び
・前記染色体のプロファイルを決定するための視覚分析の使用；
のステップからなる方法。
【請求項１７】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記in situハイブリダイゼーションはスライド上で起こる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記スライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズさせそして分析するための一連のウエルからなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
染色体のロバートソン転座を視覚的に検出する方法であって、
・プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
・前記各染色体上の略等距離位置で少なくとも２つの染色体をマーキングできるヒトＤＮＡプローブの確保；
・前記ＤＮＡプローブとの前記サンプルのハイブリダイゼーション；
・前記染色体の比色分析用前記染色体上に区分主バンドを生成するための複数酵素の使用；及び
・ロバートソン転座が前記染色体間に起こったかどうかを決定するための視覚分析の使用；
のステップからなる方法。
【請求項２４】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ハイブリダイゼーションはin situハイブリダイゼーションである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記in situハイブリダイゼーションはスライド上で起こる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記スライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズさせそして分析するための一連のウエルからなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記視覚分析は光学顕微鏡の利用からなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記視覚分析はＣＣＤカメラの利用からなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡサンプルの複製起点は羊水、末梢血、胸膜液、骨髄、腫瘍組織、及び受胎産物から構成されるグループから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
マーカ染色体を検出する方法であって、
・プロファイリング用染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
・前記各染色体上の略等距離位置で少なくとも２つの染色体をマーキングできるヒトＤＮＡプローブの確保；
・前記ＤＮＡプローブとの前記サンプルのハイブリダイゼーション；及び
・前記染色体の比色分析用前記染色体上に区分主バンドを生成するための複数酵素の使用；
のステップからなる方法。
【請求項３５】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ハイブリダイゼーションはin situハイブリダイゼーションである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記in situハイブリダイゼーションはスライド上で起こる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記スライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズさせそして分析するための一連のウエルからなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記視覚分析は光学顕微鏡の利用からなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記視覚分析はＣＣＤカメラの利用からなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡサンプルの複製起点は羊水、末梢血、胸膜液、骨髄、腫瘍組織、及び受胎産物から構成されるグループから選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
染色体をラベリングする方法であって、
・ラベリング用の少なくとも１つの染色体を有する細胞を含むサンプルの確保；
・前記染色体上の略等距離位置で少なくとも1つの染色体をラベリングできる種固有ＤＮＡプローブの確保；
・前記染色体がラベリングされ、前記ＤＮＡプローブとの前記染色体のハイブリダイゼーション；
からなる方法。
【請求項４６】
前記ラベリングは区分着色からなり、これにより区分主バンドを生成する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記ハイブリダイゼーションはin situハイブリダイゼーションである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記in situハイブリダイゼーションはスライド上で起こる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記スライドは前記ＤＮＡプロファイルを受け、ハイブリダイズさせそして分析するための一連のウエルからなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＤＮＡサンプルの複製起点は羊水、末梢血、胸膜水、骨髄、腫瘍組織、及び受胎産物から構成されるグループから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
間期染色体プロファイリング用キットであって、
・前記少なくとも１つの染色体上の略等距離位置で少なくとも1つの染色体をマーキングできる複数の種固有ＤＮＡプローブ；及び
・前記染色体の比色分析用前記染色体上に区分主バンドを生成するための複数酵素；
からなるキット。
【請求項５６】
追加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記追加区分着色は黒い色素からなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記主バンドと前記小バンドは1：1の比で存在する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するため着色される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記プローブセットと前記少なくとも１つの染色体をin situハイブリダイゼーションさせるための複数スライドから更になる、請求項５５に記載のキット。
【請求項６１】
前記少なくとも１つの染色体の比色分析用視覚分析手段から更になる、請求項５５に記載のキット。
【請求項６２】
前記視覚分析手段は顕微鏡からなる、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記視覚分析手段はカメラからなる、請求項６１に記載のキット。
【請求項６４】
前記染色体上の略等距離位置に少なくとも１つの染色体をマーキングする様に設計された複数の種固有ＤＮＡプローブからなるプローブセット。
【請求項６５】
前記染色体上に色付き主バンドを生成するための複数酵素から更になる、請求項６４に記載のプローブセット。
【請求項６６】
付加区分着色を使用して前記染色体上の前記主バンド間に区分小バンドを生成させる、請求項６５に記載のプローブセット。
【請求項６７】
前記付加区分着色は黒色素からなる、請求項６６に記載のプローブセット。
【請求項６８】
前記主バンドと前記小バンドは１：１の比で存在する、請求項６６に記載のプローブセット。
【請求項６９】
前記染色体は長腕と短腕からなり、そして前記小バンドは夫々の染色体腕上に異なる小バンド厚さを提供するように着色される、請求項６６に記載のプローブセット。
【請求項７０】
in situハイブリダイゼーション用複数ウエルから更になるガラススライドからなるin situ間期染色体ハイブリダイゼーションのためのスライド。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１４】
【公表番号】特表２００８−５２６２２７（Ｐ２００８−５２６２２７Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５０３９３（Ｐ２００７−５５０３９３）
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４６６０１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７６１４２
【国際公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【出願人】（５０７２１３６２８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４６６０１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７６１４２
【国際公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【出願人】（５０７２１３６２８）
【Ｆターム（参考）】
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