柔軟性糖質を有するポリマー
流体中の糖質被検体の検出または測定用のセンサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするが、アッセイ成分は拡散させない材料によって保存されている検出可能なまたは測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、近接度に基づいた信号の発生／変調部分ペアの１つで標識化されている糖質結合分子と、糖質結合分子を結合するために、被検体と競合することができる糖質類縁体とを含み、該糖質類縁体は、モノマー単位の重合または共重合残基を含む柔軟性水溶性ポリマーであり、モノマー単位残基は、ペンダント糖質または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう１つであるペンダント部分とを有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖質または糖質様部分を有するポリマー、そのようなポリマーを製造する方法、そのようなポリマーを含むセンサー、ならびにそのようなセンサーを製造する方法およびそのようなセンサーを使用する方法に関する。
【０００２】
センサーは、光学技術を使用する、流体中の糖質、たとえば体液中のグルコースの測定またはモニタリングにおいて使用してもよい。
【０００３】
特に、センサーは、グルコース濃度を厳密にモニターしなければならない状況および／または糖尿病の管理のように、グルコース測定を繰り返して行わなければならない状況における用途に適切である。
【背景技術】
【０００４】
糖尿病の管理において、血中のグルコースの定期測定は、正確なインシュリン投与を確保するために、必要不可欠である。さらに、糖尿病患者の長期間の患者管理において、血糖値のより良い管理は、もし防止できなければ、網膜疾患、循環障害、およびしばしば糖尿病に伴う他の変性疾患の発症を遅らせる可能性があることが実証されている。したがって、糖尿病患者による血糖値の信頼のおける正確な自己モニタリングが必要である。
【０００５】
糖尿病患者において起こるであろう濃度、すなわち０〜３５ｍＭまたはそれより幾分高い範囲の血糖を測定することが望ましい。
【０００６】
現在、血糖は、糖尿病患者が、市販の比色定量試験片または電気化学的バイオセンサー（たとえば、酵素電極）を用いてモニターしているが、両方とも、ランセット型装置を常に使用し、測定のたびに適量の血液を取り出す必要がある。平均して、多数の糖尿病患者はそのような装置を使用して、１日に２回血糖の測定を行っている。しかし、米国立衛生研究所は、アメリカ糖尿病協会が支持する、血糖の試験は１日に少なくとも４回行うべきであるということを推奨してきた。血糖試験の回数の増加は、糖尿病患者に、特に指先から血液を取るために、ランセットを常用しなければならない長期間の糖尿病患者には、経済面でも、痛みおよび不快な面でも大きな負担をかけることになる。したがって、患者から採血しない、より優れた長期間のグルコースモニタリングシステムが明らかに必要である。
【０００７】
患者から採取する血液を必要としないグルコース測定技術に関して、数多くの提案がある。
【０００８】
皮下液中の被検体の濃度は、血液中の該被検体の濃度と相関することが観察されてきており、したがって、皮下位置に据えられる、グルコースモニタリングデバイスの使用がいくつか報告されている。遠隔的に問い合わせすることができるグルコース用競合結合アッセイの使用は、特に興味を引くものである。
【０００９】
競合的結合をアッセイする方法は、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペア（米国特許第６２３２１２０号で検討されている）を使用し、これは、典型的には、エネルギー移動供与体受容体ペア（エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分とを含む）である。エネルギー供与体部分は、光輝性（通常は蛍光性）である。
【００１０】
そのような方法において、エネルギー移動供与体−受容体ペアは、分析すべき試料（たとえば、皮下液）と接触させられる。次いで、該試料は照射され、得られた放射物を検出する。供与体−受容体ペアのエネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分のどちらかが、レセプター担体（たとえば糖質結合分子）に結合し、一方、供与体−受容体ペアのもう１つの部分（リガンド担体、たとえば糖質類縁体に結合されている）と、これと共に存在している任意の被検体（たとえば糖質）とが、レセプター担体上の部位への結合に関して競合する。供与体と受容体とが一緒にされた時、それらの間にエネルギー移動が起こり、これによって、エネルギー供与体部分の蛍光発光の検出可能な存続時間の変化（減少）が起こる。また、エネルギー供与体部分によって放出される一部の蛍光シグナルも消される。
【００１１】
寿命変化は、被検体の競合的結合によって、減少または消去される。したがって、見かけの発光寿命を測定することによって、たとえば、位相変調蛍光光度法または時間分解蛍光光度法（Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, 1983年，第３章参照）によって、サンプル中の被検体の量を決定することができる。
【００１２】
エネルギー移動の効率は、供与体の量子収率、供与体の発光スペクトルと受容体の吸収スペクトルとの重なり、ならびに供与体と受容体との間の相対距離および配置に依存することも注意すべきである。
【００１３】
欧州特許第０５６１６５３号には、先に記載した、受容体とリガンドとを問い合わせする方法が開示されている。
【００１４】
供与体−受容体エネルギー移動の例として、蛍光共鳴エネルギー移動（フェルスター共鳴エネルギー移動、ＦＲＥＴ）があり、これは、最初に励起された供与体（Ｄ）から受容体（Ａ）への励起状態エネルギーの非放射性移行である。供与体は、典型的には、より短い波長で放射し、その発光スペクトルは、受容体の吸収スペクトルと重なり合う。エネルギー移動は、光子が出現することなく起こり、供与体と受容体との間の長距離双極子−双極子相互作用の結果である。
【００１５】
ＦＲＥＴプロセスは光子の出現を伴わないので、用語共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）がより正確である。しかしＦＲＥＴもＲＥＴも互換的に使用されることが多い。
【００１６】
ＦＲＥＴの重要な特徴は、それが、生体高分子の寸法に匹敵する距離上で起こることである。フェルスター距離と呼ばれる、ＦＲＥＴが５０％効率の時の距離は、典型的には、２０〜６０Åの範囲である。２０〜９０Åの範囲のフェルスター距離は、競合的結合の研究には都合がよい。
【００１７】
供与体（Ｄ）による被検体結合部分のラベリングおよび受容体（Ａ）による被検体類縁体のラベリング、またはその逆によって、供与体−受容体応答に基づく測定可能な応答を生み出すことができるアッセイが作り出される。したがって、Ｄ−「被検体結合部分」のＡ−「被検体類縁体」への結合によって、供与体の強度または寿命が減少する結果となる。サンプル中の被検体は、Ｄ−「被検体結合部分」上の被検体結合部分を獲得するために競合し、Ｄ−「被検体結合部分」を受容体（Ａ）から放出する。したがって、供与体の強度減衰時間および位相角は、グルコース濃度が増えるに従って増加することが予測される。
【００１８】
これらの原理は、エネルギー移動によるグルコース感知において使用されてきた。
【００１９】
国際公開公報第９１／０９３１２号には、光学的手段によって遠隔的に問い合わせる、グルコースに基づく親和性アッセイ（エネルギー移動供与体−受容体ペアを組合わせた）を使用する、皮下方法およびデバイスが記載されている。国際公開公報第９７／１９１８８号、国際公開公報第００／０２０４８号、国際公開公報第０３／００６９９２号および国際公開公報第０２／３０２７５号の各例には、エネルギー移動によるグルコース感知が記載され、これは、遠隔的に読み取ることができる光信号を提供している。
【００２０】
当業者であれば、受容体が蛍光団になり得るであろうことは理解するであろう。エネルギー受容体部分の吸収スペクトル内の波長で、入射光のビームによる励起に続いてエネルギー受容体部分によって放射される任意の蛍光信号は、ＦＲＥＴプロセスに影響されない。したがって、内部参照信号として、エネルギー受容体部分によって、たとえばセンサーの連続キャリブレーションにおいて、放出される蛍光信号の強度を使用すること、またはセンサーが分解している範囲をモニターすることが可能であり、したがって、新しいセンサーを移植または注射する必要性を示す。許容しうるベースラインレベル未満のこの信号の下降は、新しいセンサーを移植または注射する必要性を示す。
【００２１】
しかし、エネルギー受容体部分は、非蛍光性染料であってもよい。この場合では、蛍光消光能力を持つ化合物を、特定のエネルギー受容体部分の代わりに使用する。強力かつ非特異性の蛍光消光物質の例は、Tyagiら、Nature Biotechnology (1998) 18：第４９頁にある。
【００２２】
先に検討したシステムは、糖質結合分子として、植物レクチンコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に依存している。本発明者らは、代わりにマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）のような動物レクチンを使用することができることを、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３１１４号明細書（国際公開公報第０６／０６１２０７号）（優先権主張の基礎出願）において示唆してきた。
【００２３】
用語「レクチン」は、明らかに糖質代謝に関与せず、免疫グロブリンの主要ないかなるクラスにも属さない任意の糖質結合タンパク質を含む。レクチン類は、糖質認識ドメイン（ＣＲＤ）を介して、糖質への選択的な結合を示す。
【００２４】
本発明者らは、ある糖質結合分子（特にレクチン）に関する糖質類縁体の結合力に影響を与えるパラメータとして
−糖質（または糖質模倣）部分の数、
−糖質結合分子に関する糖質（または糖質模倣）部分の親和力
−カルシウム濃度（少なくともＭＢＬに関する）
−糖質類縁体の柔軟性
が含まれることを認識している。
【００２５】
生理的カルシウム濃度は制御できない。しかし、他のパラメータは選択し、糖質類縁体に適切な測定範囲を与えることができる。アッセイ性能への糖質類縁体柔軟性の影響は、予め同定または対処されない。
【００２６】
最初の２つの変数の調整については、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３１１４号明細書（国際公開公報第０６／０６１２０７号）および国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３１１５号明細書（国際公開公報第０６／０６１２０８号）に検討されている。ＭＢＬおよび他のレクチン類への強い結合によって、数多くの部位での結合がもたらされる。各部位での結合は比較的弱い（低親和力）が、蓄積された効果は、強い結合（高結合力）である。したがって、結合部位が全て結合していない糖質類縁体は、結合部位を全て結合する糖質類縁体より、結合部位を全て結合する糖質被検体によって、容易に置き換わる。これは、ＭＢＬに対する親和力がグルコースが持つＭＢＬに対する親和力より高いマンノースを含有する糖質類縁体が、グルコースによって置き換えられうる理由を説明している。
【００２７】
先に開示したように、糖質類縁体（たとえば、米国特許第６２３２１３０号のもの）は、糖質と、エネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分とが複合した球状タンパク質を含む。そのような分子では、糖質と、エネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分とが位置を固定する。これは、複数の糖質部分がレクチンＣＲＤに結合することを可能にする構造を、糖質類縁体が必ずしも採用できるとは限らないことを意味する。
【００２８】
また、そのような糖質類縁体における、糖質とエネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分との相対的位置決めは、被検体類縁体と糖質結合部分とが結合した時、エネルギー供与体部分と受容体部分との間の最適相互作用を可能にしないかもしれない。これは、ＦＲＥＴに影響し、光信号を弱めるであろう。
【００２９】
最後に、これらの被検体類縁体は、生理的カルシウム濃度（典型的には、１．１５〜１．２９ｍＭ）で、レクチンに結合しないことが多い。ＭＢＬに対するマンノース複合糖質の最適な結合に必要なカルシウム濃度は、約２０ｍＭであることがわかっている。
【００３０】
糖質ポリマー（たとえば、場合によっては誘導化されたデキストランおよびマンナン）も、糖質類縁体として使用されてきた。国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３１１４号明細書（国際公開公報第０６／０６１２０７号）では、過ヨウ素酸塩の開裂を使用して、生理的カルシウム濃度でデキストランをＭＢＬに結合させることが開示されている。
【００３１】
しかし、そのようなデキストラン誘導体の合成は複雑である（特に、エネルギー供与体または受容体を糖質類縁体に結合させるために、アミン基を導入することが必要であるため、これが望ましくない沈殿を起こす架橋を誘発することになりうる）。
【００３２】
また、糖質部分が糖質ポリマーの骨格構造単位であるという事実は、糖質部分の数を容易に調整することができないことを意味する。あるデキストラン誘導体は、生理的グルコース濃度で、グルコースによって、容易に置き換わらず、したがって、アッセイ感度が低いことが本発明者らによって発見されている。
【００３３】
最後に、生理的カルシウム濃度でのＭＢＬへの結合は、まだ幾分弱い。
【特許文献１】欧州特許第０５６１６５３号
【特許文献２】国際公開公報第９１／０９３１２号
【特許文献３】国際公開公報第９７／１９１８８号
【特許文献４】国際公開公報第００／０２０４８号
【特許文献５】国際公開公報第０３／００６９９２号
【特許文献６】国際公開公報第０２／３０２７５号
【特許文献７】国際公開公報第０６／０６１２０７号
【特許文献８】国際公開公報第０６／０６１２０８号
【特許文献９】米国特許第６２３２１３０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
本発明者らは、今、グルコースまたは他の糖質の新しいタイプの類縁体を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
第一態様では、本発明は、流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、
近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの１つで標識化された糖質結合分子と；
糖質結合分子に結合するための被検体と競合することができる糖質類縁体であって、糖質類縁体は柔軟性のある水溶性ポリマーであり、
モノマー単位残基が、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう一方であるペンダント部分とを有する、モノマー単位の重合残基、および／または第一モノマー単位残基がペンダント糖質部分または糖質様部分を有し、第二モノマー単位残基が近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう一方であるペンダント部分を有する、第一モノマー単位および第二モノマー単位の共重合化残基を含む糖質類縁体と
を含むセンサーに関する。
【００３６】
第二態様では、本発明は、前記ポリマーを製造する方法であって、以下の工程の１つを含む方法に関する：
ａ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合すること；
ｂ）それぞれ糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合すること；
ｃ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いで、モノマー単位残基を、近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｄ）それぞれペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで第二モノマー単位残基を近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｅ）それぞれ、糖質部分または糖質様部分にリンクするためのペンダント官能基と近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いでモノマー単位残基を糖質部分または糖質様部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；または
ｆ）それぞれ糖質部分または糖質様部分にリンクさせるためのペンダント官能基を有する第一モノマー単位と、それぞれ近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで糖質または糖質様部分を持つ第一モノマー単位残基と、近接度に基づいた信号発生／変調部分を持つ第二モノマー単位残基とを反応させること。
【００３７】
ポリマーを製造する類似の方法であって、重合前に近接度に基づいた信号発生／変調部分が単一または第二モノマー単位中に存在し、重合後に糖質または糖質様部分が導入される方法も本発明の範囲内であるが、これは好ましくはない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
被検体は単糖類が好ましい。好ましい実施形態では、被検体はグルコースである。
【００３９】
好ましくは、センサーは、体液、たとえば皮下液中のグルコースの検出または測定に適している。センサーとしては、インビボでの使用に適することが望ましく、このことは以下でさらに詳しく検討する。
【００４０】
糖質類縁体は、生理的カルシウム濃度で、グルコースと競合できることが好ましい。
【００４１】
糖質類縁体
【００４２】
用語「糖質」は、糖類を含む。
【００４３】
アッセイは、０〜３５ｍＭのグルコースの範囲の少なくとも一部、たとえば、０〜２５ｍＭのグルコースの範囲の濃度で、血糖値を測定することができるのが好ましい。ＩＣ50値は約１５ｍＭグルコースであるのが適切である。アッセイは、２〜１０ｍＭのグルコースの範囲のグルコース濃度を測定することができるのがより好ましい。この範囲内でできる限り直線に近い投与量−応答曲線が望ましい。
【００４４】
タンパク質または多糖類の誘導体化より人工ポリマーの合成のほうが、アッセイ効率を向上させるために、ポリマーのパラメータ（たとえば、分子の柔軟性、水溶解性、分子量、糖質または糖質様部分の性質、糖質または糖質様部分の数、近接度に基づいた信号発生／変調部分の数）を簡単に調整させ、アッセイ効率を向上させる。多糖類と比較して、合成ポリマーは、糖質部分の数を、ポリマーの長さとは別個に調整することができるという利点がある。さらに、ポリマー中に２−ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）のような環を含有しないモノマー類を使用することで、デキストランと比べて、分子の回転的な柔軟性が増加する。
【００４５】
この理論に縛られるものではないが、先に記載したように、本発明者らは、近接度に基づいた信号発生／変調部分が結合部分に接近し、強い信号を発生することが重要であると考える。球状のリガンドは、結合部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分を、これらが近くなるよう、球面上に集める。直鎖状のデキストランでは、骨格は結合部分からなり、その結果、結合が近接度に基づいた信号発生／変調部分に近いかあるいは離れているかを調整することができない。合成ポリマーでは、これを、結合部分を近接度に基づいた信号発生／変調部分に配置することによって調整することができる。
【００４６】
したがって、ポリマーは、非糖質骨格を有することが好ましい。
【００４７】
用語「柔軟性のある」は、大きく単量体間回転し得るポリマーを含む。ポリマーは、ペンダント糖質部分や糖質様部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分以外は、嵩高い基（たとえば、環構造、ｔ−ブチル基または他の立体的に大きな基）は含まないのが好ましい。そのようなポリマーは、骨格構造中の二重結合が非常に少ない（たとえば、１０％未満）ことが好ましい。そのようなポリマーは、球状三級構造を持たないのが適切であるが、そのような構造を持っていてもよい。
【００４８】
ポリマーは、非分岐状であるのが好ましい。これによりポリマーの柔軟性が改良される。しかし、ポリマーは、ある程度分岐してもよく、また架橋してもよいが、ただし、これによってヒドロゲルが形成されないことが条件である。たとえば、全分子量が１００ｋＤａのポリマー中で、１〜５個の分岐が許容される。
【００４９】
用語「水溶性」は、室温での水溶性が少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、たとえば少なくとも１００ｍｇ／ｍｌのポリマーを含む。溶解度は、体温でより高くなる。以下で検討するように、体内でセンサーを使用する時、ポリマーが組織流に溶解するように、ポリマーは水溶性であることが重要である。ポリマーは、ＭＢＬなどの糖質結合分子に結合した時であっても、水溶性であるべきである。
【００５０】
ポリマーは、１以上５タイプまでのモノマー単位を含むのが好ましく、より好ましくは３以上のモノマー単位を含む。
【００５１】
ポリマーとしては、ペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位残基と、ぶら下がっている、近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する第二モノマー単位残基とを含むコポリマーが適切である。あるいは、またはそれに加えて、ペンダント糖質部分または糖質様部分およびぶら下がっている、近接度に基づいた信号発生／変調部分の両方を有する単一のモノマー単位残基を使用してもよい。第一および第二モノマー単位の使用が好ましい。そうすれば、糖質部分または糖質様部分と近接度に基づいた信号発生／変調部分との量を独立して制御することができる。
【００５２】
単一のモノマー単位の残渣が存在する場合、該単位のそれぞれが、ペンダント糖質または糖質様部分と、ペンダント近接度に基づいた信号発生／変調部分との両方を有し、第一モノマー単位残基および第二モノマー単位残基が存在する場合、第一の単位のそれぞれがペンダント糖質または糖質様部分を有し、第二の単位のそれぞれがペンダント近接度に基づいた信号発生／変調部分を有するのが好ましい。
【００５３】
第一モノマー単位残基および第二モノマー単位残基は、これらが先に説明した異なるペンダント基を有するのはもちろん、構造においても異なることが好ましい。
【００５４】
コポリマーとしては、ランダムコポリマーが好ましい。しかし、交互コポリマーを使用してもよい。大きなブロックを持つブロックコポリマーの使用は好ましくない。しかし、低分子量（たとえば、１〜３ｋＤａ）のブロックコポリマーは使用してもよい。
【００５５】
ＭＢＬを用いるアッセイにおいて糖質結合分子として使用する場合、該ポリマーは、０ｍＭのグルコースで、アミノデキストランの少なくとも５０％強くＭＢＬに結合するのが好ましく、より好ましくは、少なくともアミノデキストランと同じくらい強く結合するが、より簡単に抑制される。ポリマーは、０〜３５ｍＭのグルコースの範囲で簡単に抑制される（全位相応答の大部分）が特に望ましく、とりわけ２〜１５ｍＭの範囲が望ましい。これによって、特に生理学的に関心のあるグルコース濃度にわたりアッセイが提供され、これはアミノデキストランをグルコース類縁体として使用する類似のアッセイより感度が高い。
【００５６】
複数のタイプの糖質部分または糖質様部分を有するモノマー単位残基が存在してもよい。糖質部分または糖質様部分は異なってもよく、ＭＢＬに対し異なる親和性および類似のレクチンを有してもよい。
【００５７】
同様に、近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する複数の種類のモノマー単位残基を使用してもよい。近接度に基づいた信号発生／変調部分は異なってもよい。
【００５８】
必ずしも、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）が二重結合を含む必要はない。
【００５９】
そのようなポリマーの使用における適切な糖質部分の例として、単糖類およびオリゴ糖類が挙げられる。
【００６０】
糖質部分は、レクチン、特にＭＢＬおよび他のヒトまたはヒト化レクチンおよび／または植物レクチンコンカナバリンＡに対して高い親和力を持つことが好ましい。
【００６１】
本発明者により、ＭＢＬに対する通常の糖質部分の親和力は、以下であることが発見されている。
【００６２】
Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノースアミン、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ロイクロース、エルロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｌ−フコース＞ミオイノシトール、Ｄ−グルコース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−リボース、Ｄ−タガトース＞Ｄ−リキソース＞ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクトース。
【００６３】
糖質部分は、ＭＢＬに関する親和力が低いガラクトースでないことが好ましい。
【００６４】
コンカナバリンＡに関する通常の糖部分の親和力は、以下の通りである。(Van Dammeら, Handbook of Plant Lectins: Properties and Biomedical Applications, Wiley & Sons,1998,p.142)
【００６５】
マンノース＞グルコース＞Ｎ−アセチルグルコサミン。
【００６６】
適切な単糖類としては、場合によっては誘導化されたテトロース類、ペントース類、ヘキソース類、ヘプトース類または高級同族アルドース類またはケトース類、たとえば、場合によっては誘導化されたＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコースアミン、Ｌ−フコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−タガトースまたはＤ−ソルビトールである。
【００６７】
適切なオリゴマーとして、たとえば２〜５０個の糖質単位を含有する直鎖または分岐状のホモオリゴマーまたは混合オリゴマーであってもよい。
【００６８】
糖質結合分子としてＭＢＬと共にポリマーが使用される場合、１→３および１→４グリコシル化はＭＢＬ結合を妨害することが予想されるので、好ましいグリコシル化は、１→６または１→２である。たとえば、ノナ（１→６）−α−グルコース（デキストラン１５００Ｄａ）は、１，３−β−Ｄ−グルコース類（たとえば、ラミナナリヘキサオース（laminanarihexaose)）よりＭＢＬに対し結合力が高いことが予測される。適切なオリゴ糖として、パンノース（ｐａｎｎｏｓｅ）、マルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、Ｄ−ロイクロース、エルロース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノースまたは１〜２５０ｋＤａのデキストラン（好ましくは、１〜４０ｋＤａのデキストラン、たとえば、１ｋＤａ、１．５ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａまたは４０ｋＤａのデキストラン）が挙げられる。
【００６９】
糖質結合分子としてコンカナバリンＡとともにポリマーが使用される場合、１→６グリコシル化は、Ｃ６−ＯＨ水酸基を介してコンカナバリンＡ結合を妨害することが予想される。この場合、好ましい糖質部分として、場合によっては誘導化されているマンノース、マルトース、イソマルトース、グルコースおよびソホロース（ガラクトースではない）、特にα−Ｄ−マンノピラノシド類（α−Ｄ−Ｍａｎｐ）、α−Ｄ−グルコピラノシド類（α−Ｄ−Ｇｌｕｐ）およびα−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンピラノシド類（α−Ｄ−ＧｌｕＮＡｃｐ）が挙げられる。
【００７０】
ポリマーとして、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ロイクロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチル−マンノースアミン、Ｄ−アラビノース、ミオイノシトール、Ｄ−タガトース、エルロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リボース、Ｄ−ソルビトールから選択される少なくとも１種の糖質部分を含むのが好ましい。
【００７１】
該ポリマーとしては、少なくとも１種のグルコース部分および／または少なくとも１種のＮ−アセチルグルコサミン部分および／または少なくとも１種のマンノース部分を含むポリマーがより好ましく、これらの部分は、ＭＢＬおよび他の動物レクチンに対し高い親和力を有するからである。これらの部分は、Ｃ３およびＣ４水酸基を介してレクチンの結合部位に結合すると考えられる。
【００７２】
合成分岐状糖類の例として、デンドリマーを構成するために使用されるデンドリマー「ウェッジ」（たとえば、以下に示す、アミンリンカーを持つＴＲＩＳ誘導三糖類）がある。
【化１】
【００７３】
用語「糖質模倣物」として、糖質を正常に結合する部位に結合する非糖質分子、たとえば、グルコースと競合しＭＢＬに結合することができる非糖質分子が挙げられる。適切な糖質様部分として、Ｎ−アセチルグルコサミンを模倣するケラチンペプチド（ＳＦＧＳＧＦＧＧＧＹ）のようなペプチド類が挙げられる。ケラチンペプチドは、ＭＢＬを抑制できることが示されている(Mantactoら，2001、 J.Immunol. 166, 4148-4153)。
【００７４】
第一モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、糖質部分または糖質様部分の二重結合含有誘導体であるのが適切である。しかし、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、適切には重合後、糖質部分または糖質様部分がリンクし得る官能基を含む、二重結合含有分子であってもよい。
【００７５】
糖質部分または糖質様部分の二重結合含有誘導体は、糖質部分または糖質様部分のアリルまたはビニル含有誘導体であるのが好ましい。糖質部分または糖質様部分の他の適切な二重結合含有誘導体として、アリル誘導体の相同体、たとえば、３−ブテニルまたは４−ペンテニル誘導体、または４位に糖質部分または糖質様部分を持つスチレン誘導体が挙げられる。糖質部分または糖質様部分のさらに適切な二重結合含有誘導体として、ＨＥＡ、２−ヒドロキシエチルメタアクリレート（ＨＥＭＡ）またはビニルアルコール（ＶＡ）系誘導体が挙げられる。
【００７６】
糖質部分または糖質様部分は、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）のアミン、酸、アルコールアルキン、アジドおよび／またはスルホン官能基とリンクしてもよい。たとえば、モノマー単位中のアルコール基および糖質部分または糖質様部分中のアミン基は、ジビニルスルホンを使用してリンクしてもよい。糖質がマンノースの場合、これらはＭＢＬへの結合で重要なので、Ｃ３−ＯＨまたはＣ４−ＯＨ基を介して結合を形成することは好ましくない。この場合、ジビニルスルホン結合は不適切である。
【００７７】
アミノ誘導体化糖質部分は、二糖類の還元アミノ化によって製造することができる。これは糖質部分をそのアノマー位（Ｃ１）でリンクさせる。
【００７８】
糖質部分または糖質様部分は、フィッシャーグリコシド化によってアルコール基（たとえば、ＨＥＡ中）に結合することができる。
【００７９】
好ましい実施形態では、第一モノマー単位は、それぞれ、１−アリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、１−アリル−２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシドおよび／または１−アリル−α−Ｄ−グルコピラノシドである。
【００８０】
第二モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、適切には重合後、近接度に基づいた信号発生／変調部分部分がリンクし得る官能基を含む、二重結合含有分子が適切である。適切な官能基として、酸、アルコールおよび／またはスルホンが挙げられる。重合後の結合は、高価な近接度に基づいた信号発生／変調部分の損失を最小にするのを助ける。
【００８１】
しかし、第二モノマー単位（あるいは単一モノマー単位）は、近接度に基づいた信号発生／変調部分を含んでもよい。この場合、適切な重合性基および結合の上記の検討が適用される。
【００８２】
好ましい実施形態では、第二モノマー単位は、それぞれ、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドまたはその誘導体である。
【００８３】
好ましい実施形態では、単一モノマー単位は、それぞれ、リシンの誘導体を含む、二重結合含有糖質部分または糖質様部分である。例を以下に示す（多段反応スキーム）：
【化２】
【００８４】
（１）グルコサミド
【００８５】
この反応スキームにおける出発材料は、PolysSciences Europe (Eppelheim, Germany）を通じて入手可能なメタアクリロイル−Ｌ−リシンである。重合後、α−アミン基は、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクすることができる。
【００８６】
ポリマーは、さらに、ペンダント糖質部分、糖質様部分または近接度に基づいた信号発生／変調部分を有さない第三モノマー単位残基を含むのが好ましい。これは柔軟性を増やすのを助ける。
【００８７】
第三モノマー単位残基は、構造が、単一モノマー単位残基、第一モノマー単位残基および／または第二モノマー単位残基と異なることが好ましい。（これらが先に説明した異なるペンダント基を有することは言うまでもない。）
【００８８】
柔軟性は、ＨＥＡなどの立体障害のない第三モノマー単位を使用することによって増やす。また、柔軟性は、帯電していない第三モノマー単位を使用することによっても増やす。第三モノマー単位を含まないポリマーは、静電反発力のため、柔軟性の減少を最小限にするために不活性化する必要のある、プラスに帯電しているアンモニウム基を数多く持つ。
【００８９】
複数のタイプの第三モノマーをポリマーに含ませることができる。
【００９０】
第三モノマー単位は、それぞれ、たとえば水酸基などの親水性基を含む二重結合含有分子であるのが好ましい。第三モノマー単位として、スチレンなどの親油性二重結合含有分子であるのは好ましくない。
【００９１】
好ましい実施形態では、第三モノマー単位は、それぞれ、ＨＥＡ、ビニルピロリドン、ＭＭＡ、ＨＥＭＡ、ビニルアルコールおよび／またはエチレングリコールである。しかし、当業者であれば、使用することのできる親水性基を含む他の多くの二重結合含有分子があることを理解するであろう。
【００９２】
モノマー単位は付加重合によって反応するのが適切である。付加重合は、たとえば、過硫酸カリウム（ＰＰＳ）または他の過酸化化合物を使用する、遊離基開始重合であってもよい。
【００９３】
重合方法は、たとえばトルエンと水との混合物中での乳化重合（米国特許第４９５２６５６号に検討されている）であってもよい。界面活性剤は乳化重合反応混合物中に含有されるのが適切である。界面活性剤は、重合後に乳化除去および透析によって除去することができる。あるいは、重合は、単一相、たとえば水中で行ってもよい。
【００９４】
乳化重合は、単一相の重合と比較して、より低い平均分子量およびより狭い分子量分布を有するポリマーを与えると考えられる。
【００９５】
開始剤を加える前にモノマー単位を混合するのが適切である。
【００９６】
重合反応は２日未満かかるのが好ましい。重合の長さは、コポリマー生成物の分子量を制御するために使用することができる。
【００９７】
重合反応は、酸素がない条件、たとえば、窒素雰囲気下で行われるのが適切である。
【００９８】
重合反応は、０℃と１００℃との間の温度、たとえば、室温または６０℃で行われるのが適切である。
【００９９】
他の可能な重合として、縮合重合（たとえば、イオン縮合重合）、開環重合および原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）が挙げられる。当業者であれば、モノマー単位に性質が、重合の所望の方法に依存する（たとえば、二重結合含有モノマー単位は、縮合重合の必要はない）ことを理解するであろう。
【０１００】
単一モノマー単位を使用しない場合、第一モノマー単位は、反応混合物中に２０〜７０モル％（あるいは２０〜７０重量％）の量、たとえば、３０〜５０モル％（あるいは３０〜５０重量％）の量で存在してもよい。しかし、第一モノマー単位は、反応混合物中に、好ましくは７０モル％〜９０モル％の量、より好ましくは７５モル％〜８５モル％の量、たとえば、８０モル％存在する。そのような量の第一モノマー単位を使用することにより、ポリマー溶液の安定性が向上することが発見されている。発明者らが経験した安定性の問題は、溶解性に関連し、ポリマーの沈殿する傾向および乾燥後の溶解しない傾向に現れる。
【０１０１】
第二モノマー単位は、反応混合物中に５〜１５モル％（あるいは５〜１５重量％）の量で存在するのが好ましい。
【０１０２】
第三モノマー単位を使用する場合、それらは、反応混合物に、残りを構成する量、たとえば、０〜８０モル％（あるいは０〜８０重量％）の量で存在するのが好ましい。
【０１０３】
ポリマーの組成は、反応混合物中に存在するモノマー単位の量を正確に反映しないことは理解されるであろう。これは、他の要因（たとえば、立体障害および溶解性）の影響があるためである。
【０１０４】
ポリマー糖質の含有率は、１０〜２０重量％の範囲が適切である。しかし、ポリマー糖質含率は、４０〜５０重量％の範囲が好ましい。（これらの範囲は、特にマンノースに関して適切で、より高い糖質含率は、グルコースに適切である場合もある。）ポリマー糖質の含有率は、ある糖質類（マンノース、グルコース、ガラクトース、キシロース、フコースおよびガラクルトン酸を含む）に関しては、実施例Ａ７に記載するように測定することができるが、他のもの（Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルノイラミン酸を含む）はこの方法では測定できない。
【０１０５】
また、糖質類縁体は、２以上の分離した実体（これらは一緒に糖質類縁体として作用する）から構成されてもよいことも留意すべきである。特に、糖質類縁体は、少なくとも２個の糖質類縁体部分を持つ第一実体と、レクチンなどの糖質結合分子である第二実体とで構成されていてもよい。たとえば、受容体標識化されたＭＢＬおよび供与体標識化されたＭＢＬを、標識化されていない合成ポリマーとともにテンプレートとして使用し、ＦＲＥＴが起こるように、互いの接近性において供与体標識化されたＭＢＬおよび受容体標識化されたＭＢＬをもたらすことができる。（コンＡを使用する例が、Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉら（２００２）Chemistry and Biology 9,第ｌ６３頁にある）。（同様に、受容体標識化ポリマーおよび供与体標識化ポリマーも、標識されていない糖質結合分子とともに使用することができる。）
【０１０６】
糖質類縁体は、１種以上のエネルギー受容体部分（たとえば、以下で検討する、ＨＭＣＶ−１またはAlexa Fluor 594（商標））を含むことが好ましい。しかし、１種以上のエネルギー供与体部分を含んでもよい。
【０１０７】
近接度に基づいた信号発生／変調部分は、前記糖質または糖質様部分との関連で検討したように、糖質類縁体に結合されてもよい。
【０１０８】
好ましい実施形態では、活性化されたカルボン酸誘導体（たとえば、スクシンイミジルエステルのような活性エステル）であって、近接度に基づいた信号発生／変調部分に適切に結合されたカルボン酸誘導体は、モノマー単位またはポリマーに適切に結合された求核基（たとえばアミン）と反応する。そのような反応は、極性非プロトン溶剤（たとえばＤＭＳＯ）中で行ってもよい。反応温度は、０℃〜１００℃の範囲、たとえば、室温が適切である。
【０１０９】
近接度に基づいた信号発生／変調部分を結合する別の方法では、アジド基とアルキン基との間のフィスゲン１，３双極環状付加（B. Sharplessによって開発されたような）を使用する。
【０１１０】
糖質類縁体は、センサーからの逸脱を阻止するくらい高く、しかし糖質類縁体が糖質結合分子に結合した時、沈殿を起こさない程度に低い分子量を持つべきである。
【０１１１】
糖質類縁体の平均分子量は、２５〜２５０ｋＤａの範囲が好ましく、さらに好ましくは、１００〜２５０ｋＤａ、たとえば、１５０ｋＤａである。
【０１１２】
場合によっては、糖質類縁体および糖質結合分子は、互いに連結している。
【０１１３】
糖質結合分子
【０１１４】
糖質結合分子は、アッセイにおいて、少なくとも１０日間、安定した信号を提供するのが好ましく、少なくとも１４日間提供するのがさらに好ましい。センサーが人体内に挿入された時、安定した信号が提供されるのが、特に好ましい。
【０１１５】
糖質結合分子としては、レクチンが好ましく、動物レクチンがさらに好ましい。しかし、他の種類の糖質結合分子、たとえば抗体、またはコンカナバリンＡのような植物レクチンであってもよい。
【０１１６】
好ましくは、前記レクチンは、Ｃ型（カルシウム依存性）レクチンである。
【０１１７】
動物レクチンは、脊椎動物レクチン、たとえば、哺乳動物レクチンが好ましく、ヒトまたはヒト化レクチンがさらに好ましい。しかし、代わりに、トリレクチン、ウオレクチンまたは昆虫レクチンなどの無脊椎動物レクチンであってもよい。
【０１１８】
レクチンは人体由来のヒトレクチンが適切である。代わりに、レクチンは組換え製造されたレクチンであってもよい。
【０１１９】
さらなる代替例として、レクチンは、ヒト化動物レクチン、たとえば、ヒト化ウシレクチンであってもよい。これは、対応するヒトレクチンがあるところに適用される。レクチンは、抗体に類似の方法でヒト化してもよい。
【０１２０】
レクチンは多量体形態であるのが適切である。多量体レクチンは、人体または動物体由来であってもよい。あるいは、レクチンは、単量体形態であってもよい。単量体レクチンは、組換え方法によって、または人体もしくは動物体由来の天然多量体レクチンにおけるサブユニット間の結合を破壊させることによって形成してもよい。この例は米国特許第６２３２１３０号に記載されている。
【０１２１】
レクチンは３個以上のＣＲＤを有するのが好ましい。レクチンは６個以上のＣＲＤを有するのがさらに好ましい。
【０１２２】
レクチンはコレクチン（コラーゲン様レクチン）であるのが好ましい。これらは、コラーゲン様配列（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット）を持つＣ−型動物レクチンである。ＭＢＬはＣ−型コレクチンであり、一方でコンカナバリンＡはＣ−型レクチンである。単量体コレクチンＣＲＤは、コラゲナーゼの作用によって製造することができる。
【０１２３】
レクチンは、マンノース結合レクチン、コングルチニンまたはコレクチン−４３（たとえば、ウシＣＬ−４３）（全血清コレクチン）または肺界面活性タンパク質（肺コレクチン）が好ましい。
【０１２４】
レクチンは、実質的に三量体および／または四量体形態であるＭＢＬが適切である。
【０１２５】
あるいは、レクチンは、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄから選択される肺界面活性タンパク質であってもよい。これらのタンパク質は、ＭＢＬに類似する。
【０１２６】
他の適切な動物レクチンを、以下のリストに挙げる。
・ＰＣ−レクチン（米国特許公開公報第２００３０２１６３００号、米国特許公開公報第２００４０２６５８９８）
・ＣＴＬ−Ｉ（米国特許第１７９５２８／１０号）
・ケラチノサイト膜レクチン（Parfuemerie und Kosmetik74,164-80)
・ＣＤ９４(Eur J Immunol 25, 2433-7)
・Ｐ３５（同義語：ヒトＬ−フィコリン、レクチンのグループ）(Immunol Lett 67, 109-12)
・ＥＲＧＩＣ−５３（同義語：ＭＲ６０）（MoI Biol Cell, 7, 483-93)
・ＨＩＰ／ＰＡＰ(Eur J Biochem 267, 1665-71)
・ＣＬＥＣＳＦ８（Eur J Immunol 34, 210-20)
・ＤＣＬ（レクチンのグループ）（米国特許出願第００２３１９９６／ＵＳ号）
・ＧＬＵＴファミリータンパク質、特に、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４およびＧＬＵＴ１１（ＰＮＡＳ９７，１１２５−３０）
【０１２７】
さらに、適切な動物レクチンは、「Handbook of Animal Lectins: Properties and Biomedical Applications」, David C. Kilpatrick, Wiley 2000の付属書Ａ、ＢおよびＣに記載されている。
【０１２８】
糖質結合分子は、エネルギー供与体部分で標識化されているのが好ましい。
【０１２９】
検出
【０１３０】
適切な検出技術として、ＦＲＥＴ、蛍光エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光消光、リン光、ルミネセンス増強、ルミネセンス消光、回折またはプラズモン共鳴が挙げられる。
【０１３１】
光信号を発生する結合アッセイは、好ましくは、被検体の濃度変動の連続モニタリングが達成できるように、可逆的であるべきである。この可逆性は、アッセイの成分を消費しない、結合アッセイフォーマット使用の特別の利点である。
【０１３２】
検出可能なまたは測定可能な光信号は、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアを使用して発生させる。ペアの最初の構成要素が該ペアの第二の構成要素に接近した時、信号が発生しまたは変調される。
【０１３３】
近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアは、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分ペアであるのが好ましい。エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分は、それぞれ、供与体発色団および受容体発色団とも言う。蛍光を放射しないエネルギー受容体は、消光部分と言う。
【０１３４】
この場合、糖質結合分子を、エネルギー供与体およびエネルギー受容体部分ペアの１つで標識化し、糖質類縁体を、エネルギー供与体およびエネルギー受容体部分ペアのもう１つで標識化する。
【０１３５】
本発明のセンサーの最も好ましい実施形態は、前述のＦＲＥＴの技術を使用して光学読み出しを出すアッセイを組み込む。
【０１３６】
アッセイがインビボで使用される場合、供与体は５５０〜約７００ｎｍで蛍光を発し、受容体は約６５０ｎｍで光を吸収するのが望ましい。これにより、低波長での供与体蛍光とインビボ自己蛍光との間のオーバーラップを回避する。
【０１３７】
Alexa Fluor 594（商標）（たとえば、スクシンイミジルエステルとして）は、インビボで使用するための、適切な発光スペクトルを持つエネルギー供与体部分である。この染料は、５９４ｎｍで吸収し、６２０ｎｍで蛍光を発する。
【０１３８】
国際公開公報第０５／０５９０３７号に記載されているＨＭＣＶ染料は、本発明の用途にとって、適切なエネルギー受容体部分である。これらの染料は、安定化されたカルベニウムイオンである。例として、ヘキサメトキシ−クリスタルバイオレットスクシンイミジルエステル（ＨＭＣＶ−Ｉ）がある。
【０１３９】
あるいは、ＱＳＹ２１（商標）を、エネルギー供与体部分としてのAlexa Fluor 594（商標）とともに、エネルギー受容体部分として使用してもよい。
【０１４０】
蛍光寿命または蛍光強度の測定を行ってもよい。蛍光寿命は、位相変調技術（以下に検討）によって測定してもよい。
【０１４１】
好ましい実施形態では、糖質結合分子をエネルギー供与体部分としてAlexa Fluor 594で標識化し、糖質類縁体をエネルギー受容体部分としてＨＭＣＶ−Ｉで標識化し、蛍光寿命を位相変調技術によって測定する。
【０１４２】
アッセイ成分を保持する材料は、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分に十分な空間を提供し、互いに結合していない時は、エネルギー移動が中断できるように分離するのが好ましい。
【０１４３】
センサーの構造
【０１４４】
糖質結合分子のポリマーに対する比は、１〜１５（μＭ糖質結合分子）／（ｍｇ／ｍｌポリマー）が好ましく、１０（μＭ糖質結合分子）／（ｍｇ／ｍｌポリマー）が特に好ましい。
【０１４５】
ＭＢＬが糖質結合分子として使用される場合、比が１０（μＭ、ＭＢＬ）／（ｍｇ／ｍｌポリマー）になるまで、この比が上がるにつれ、アッセイ感度が増すことが発見されている。
【０１４６】
また、糖質結合分子のポリマーに対する比が高いものを使用すると、ポリマーは、アッセイの全強度を落とすことなく、ポリマーに含有されるべき信号変調部分の数をより大きくできる（したがって、位相シフトを増大し、その結果アッセイ感度を上昇さえる）。
【０１４７】
アッセイの成分は、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない孔径を有する材料によって保持されているのが好ましい。しかし、この選択性は、他の方法、たとえば、帯電していない材料の拡散を可能にする材料を使用することによっても達成される。
【０１４８】
アッセイの成分は、シェルまたはマトリックス材料によって保持されるのが好ましい。糖質類縁体および／または糖質結合分子は、この材料にグラフトされてもよい。材料は、国際公開公報第００／０２０４８号に記載のような生分解性であることはより好ましい。場合によっては、センサーは、国際公開公報第０３／００６９９２号に記載のような、生分解性材料のシェルによって保持された小粒子を含んでもよい。
【０１４９】
好ましい実施形態では、国際公開公報第２００５／１１０２０７号に記載されるような、グルコースをアッセイ成分に接触させながら、アッセイの成分を、アッセイ成分を封入する生分解性材料のシェルによって保持し、該生分解性材料は、疎水性および親水性単位を有するコポリマーを含む。
【０１５０】
１個以上のアッセイ成分チャンバーがシェル内に存在してもよい。
【０１５１】
コポリマーはランダムコポリマーが好ましい。
【０１５２】
コポリマーの透過性は、少なくとも５．０×１０-10ｃｍ2／ｓであるのが好ましい。
【０１５３】
用語「透過性」は、実験的に測定することができる水和コポリマーによる、被検体（グルコース）の全透過性を言うために使用する。
【０１５４】
一度体内に移植されると、該コポリマーは１週間から１年の期間、たとえば３０日間にわたって分解するのが好ましい。代表的なポリマー厚さである５μｍに関して、これは０．１７μｍ／日の分解速度に相当する。
【０１５５】
グルコースの移動性に関して、生分解性材料の分子量カットオフ限界は、２５０００Ｄａ以下が好ましい。より好ましくは、生分解性材料の分子量カットオフ限界は、１００００Ｄａ以下である。
【０１５６】
疎水単位の重量分率は、コポリマーの１０〜９０％が好ましく、より好ましくは、コポリマーの１０〜５０％である。
【０１５７】
各親水性単位の分子量は、２００〜１００００Ｄａが好ましく、より好ましくは４００〜４０００Ｄａである。
【０１５８】
コポリマーの親水性単位は、それぞれ、ポリエチレングリコールと二価の酸とのエステルを含むのが好ましい。ポリエチレングリコールの代わりのものとして、エチレングリコールとプロピレングリコールとの混合ポリマーを使用してもよく、および／またはポリエーテル骨格は、疎水性基および／または親水性基で置換されてもよい。ポリエチレングリコールのさらなる代わりのものとして、ポリテトラヒドロフラン（ポリ−ＴＨＦ）を使用してもよい。
【０１５９】
親水性単位は、テレフタル酸および／またはコハク酸を二価の酸として含むことが好ましい。他の適切な二価の酸として、シュウ酸、酒石酸、フタル酸、アスパラギン酸、マロン酸、およびオリゴマーまたはポリマーの二価の酸、たとえば、ポリ（ダイマー酸−セバシン酸）がである。好ましい実施形態では、二価の酸はテレフタル酸のみである。代わりの好ましい実施形態において、テレフタル酸のコハク酸に対するモル比は、１：２〜２：１であり、１：１が適切である。
【０１６０】
あるいは、コポリマーの親水性単位は、オリゴマーを含んでもよい。適切なオリゴマーは、ヒドロキシエチルメタアクリレート（ＨＥＭＡ）、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、糖質、エチレンオキサイドおよび／または２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸のオリゴマーである。親水性単位がＨＥＭＡを含む場合、生分解性結合（たとえば、テレフタレート結合などのエステル結合）がポリマー内にあり、生分解性が増す。
【０１６１】
各疎水性単位の分子量は、４００〜５０００Ｄａが好ましい。
【０１６２】
コポリマーの疎水性単位は、ブタン−１，４−ジオールと二価の酸とのエステルを含むのが好ましい。ブタン−１，４−ジオールの代わりとして、ペンタン−１，５−ジオールまたはヘキサン−１，６−ジオールを使用してもよい。
【０１６３】
疎水性単位が、二価の酸としてテレフタル酸および／またはコハク酸を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、テレフタル酸のコハク酸に対するモル比は、１：２〜２：であり、１：１が適切である。あるいは、疎水性単位は、二価の酸として、テレフタル酸のみを使用するのがよい。他の適切な二価の酸は先に記載されている。
【０１６４】
あるいはコポリマーの疎水性単位は、メチルメタアクリレート（ＭＭＡ）、ポリウレタンおよび／またはアミド（たとえば、ナイロン−６、オリゴ−Ｎ−三級ブチルアクリルアミドまたはオリゴ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のオリゴマーを含み得る。疎水性単位がＭＭＡを含む場合、生分解性結合（たとえば、テレフタレート結合などのエステル結合）は、ポリマー内に提供され、生分解性を増す。
【０１６５】
好ましいポリマーは、一般式：ａＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）ｂＰＢ（Ｔ／Ｓ）ｃ（式中、「ａ」は、ＰＥＧ鎖の分子量を示し、「ｂ」は、得られたポリマー中のＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）（ポリエチレングリコールテレフタレート／サクシニレート）の重量分率を示し、「ｃ」は、得られたポリマー中のＰＢ（Ｔ／Ｓ）（ポリブチレンテレフタレート／サクシニレート）の重量分率を示す）で表される。このようなポリマーの例として、６００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、２０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、４０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、１０００ＰＥＧＴ５０ＰＢＴ５０および１０００ＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）６０ＰＢ（Ｔ／Ｓ）４０（Ｔ／Ｓ ５０％）がある。ポリマーは、生分解性であり、高グルコース透過性を有し、その分子量カットオフ特性は、約２５０００Ｄａである。
【０１６６】
これらのポリマーのいくつかが米国特許第６３８３２２０号明細書および欧州特許第１２４７５２２号に開示されている。
【０１６７】
コポリマーの外皮の厚さは１〜５０μｍであるのが好ましい。
【０１６８】
第三の態様では、本発明は、本明細書で記載したセンサーを製造する方法に関する。
【０１６９】
ポリマーマイクロカプセルの製造のための化学的方法として、相分離（コアセルベーション）、溶剤蒸発および／または抽出が挙げられる。
【０１７０】
ポリマーマイクロカプセルを製造する適切な物理的方法として、噴霧乾燥、スプレー被覆、スプレー冷却、回転円盤式アトマイゼーション、流動床被覆、共押出し（たとえば、固定ノズル共押出し、遠心性ヘッド共押出しまたは水中ノズル共押出し）およびパンコーティングが挙げられる。
【０１７１】
センサー用途
【０１７２】
第四の態様では、本発明は、本明細書で記載したセンサーを使用して、糖質被検体を検出する方法であって、センサーを哺乳動物の皮膚に移植すること、および外部光学的手段を使用して糖質被検体を検出または測定することを含む方法に関する。
【０１７３】
第五の態様では、本発明は、前記センサーを使用して糖質被検体を検出する方法であって、哺乳動物の皮膚内または下に存在するセンサーの照射による外部光学的手段を使用して、糖質被検体を検出または測定することを含む方法に関する。
【０１７４】
該方法は、さらにセンサー中で生分解性材料を分解することを含むのが好ましい。
【０１７５】
センサーは、注射によって、好ましくはシリンジを用いて、あるいは他の方法で、特に国際公開公報第００／０２０４８号に記載されている任意の方法によって、皮膚内に導入してもよい。センサーは、患者への不快感を最小にするため、狭いゲージ針によって注射するのに適したサイズのものが好ましい。センサーの最高寸法は、２０μｍ〜１ｍｍが好ましい。しかし、大きな最高寸法を持つロッド型のセンサーを使用してもよい。
【０１７６】
センサーは、真皮の厚さ内あるいは皮下に導入してもよいし、表皮に導入してもよいが、後者の場合、もしかしたら、生分解性材料が分解する前に、表皮層の成長によって皮膚から排出される可能性がある。
【０１７７】
センサーは皮膚内に配置されるので、センサーにて発生する光信号は、経皮的に（すなわち、皮膚の上位層を通して）検出されるのが好ましく、したがって、センサーと感染をもたらし得る外部環境との間の任意の直接接触を未然に防ぐ必要がある。
【０１７８】
しかし、代わりに、皮膚を介して光を通すことなくセンサーが外部光学的手段によって照らされるのを可能にする、中空または透明手段（たとえば、針または光ファイバー）を介して検出を行ってもよい。
【０１７９】
一度センサーが皮膚の位置に置かれると、悪影響を起こすことなく必要な回数だけ被検体測定を行うことができる。もしグルコース測定がより頻繁に行われれば、厳密な制御を、血中のグルコースの濃度において維持することができ、不満足に調整された血糖に関連する状態を発症するリスク、たとえば、網膜疾患、腎臓疾患、神経障害、一般的な小血管および大血管損傷、および循環不良を減少させるであろうから、これは、長期間治療の糖尿病患者に対して特に有利である。
【０１８０】
本発明のセンサーは、それ自身は、アッセイの読み出しを問い合わせするために必要な光学成分のいかなるもの（これらは体とは別に備えられ、体の外に置かれるのが好ましい）も含まないので、センサーを、患者に対して最小の不快感で注射し得る形態で、簡単に備えることができる。
【０１８１】
ＦＲＥＴの技術を使用する、アッセイを導入するセンサーには、エネルギー供与体部分の吸収スペクトル内の波長で入射光を供給し、放射された蛍光の強度または励起状態の寿命を測定することによって、問い合わせすることができる。一般的に知られている方法は以下の通りである。
【０１８２】
１．定常状態の測定
２．タイムドメイン寿命の測定
ａ．信号光子の計測
ｂ．ストリークカメラ
ｃ．ゲート検出（パルスサンプリング）
ｄ．アップコンバージョン
３．周波数ドメイン寿命の測定
ａ．位相変調蛍光光度法（ヘテロダイン検出）
ｂ．位相敏感検波法（ホモダイン検出）
該原理の更なる説明は、Lakowicz, J.R.「Principles of Fluorescence Spectroscopy，第二編」，１９９９にある。
【０１８３】
アッセイを問い合わせするための好ましい方法は、位相変調蛍光光度法である。
【０１８４】
アッセイを問い合わせするための適切な光学セットアップ（図１）は、エネルギー供与体部分の発光スペクトル内で光を放射する、光放射ダイオード（ＬＥＤ）１１で構成される。ＬＥＤは、好ましくは４５°の範囲で、充分な位相シフトとなる周波数で、ＬＥＤを調整する、ドライバ回路１３によって動作される。３ｎｓの寿命を持つ蛍光団に関して、好ましい周波数は、５０ＭＨｚである。ＬＥＤにより放射された光は、励起フィルター１５によってフィルターをかけられ、ダイクロイックビームスプリッター１７によってセンサー１６に向けられ、レンズ１９によって、注射されたセンサー１６上のセンサー／皮膚に集束される。センサーによって放射された蛍光は、レンズ１９によって集められる。光はダイクロイックビームスプリッターを通り、発光フィルター２１によりフィルターをかけられる。フィルターをかけられた光は、レンズ２３によって検出器２５、この場合アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）に集束される。ＡＰＤは、ＡＰＤバイアス供給２７によって逆バイアスされ、これは、信号処理およびコントロールユニット２９によって制御される。ＡＰＤからの信号は、トランスインピーダンス増幅器３１によって増幅され、バンドパスフィルター３３によってフィルターをかけられ、第一アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）３５によってサンプリングされる。対応して、ＬＥＤへの変調されたドライブ信号を、第二ＡＤＣ３７によってサンプリングする。第一ＡＤＣ３５上にサンプリングされた信号は、以下である。
【０１８５】
Ｙ1（ｔ）＝Ａ1*ｓｉｎ（２*π*ｆ*ｔ＋φf1＋φ1）
【０１８６】
Ａ1は、アッセイから検出された信号の振幅であり、ｆは変調周波数であり、φf1は、供与体蛍光団によって導入された位相差であり、φ1は、電子的光学的セットアップによって導入された固定位相差である。
【０１８７】
第二ＡＤＣ３７上にサンプリングされた信号は以下の通りである。
【０１８８】
Ｙ2（ｔ）＝Ａ2*ｓｉｎ（２*π*ｆ*ｔ＋φ2）
【０１８９】
Ａ2は、ＬＥＤへの変調ドライブ信号の振幅であり、φ2は、電気的セットアップによって導入された固定位相差である。
【０１９０】
信号処理およびコントロールユニットは、２つのサンプリングされた信号を比較し、電子機器および工学機器によって導入された固定および公知の位相差を相殺することによって、エネルギー供与体部分によって導入された位相差φf1を導き出す。
【０１９１】
測定は、皮膚に近い蛍光光度計を保持することによって、およびセンサーを有するアラインメントにおいて行う。位相差は、相−被検体−校正関数、たとえば、
被検体濃度＝Ａ＋Ｂｘ／（ｋ＋ｘ）
（式中、Ａは被検体不在時の相であり、Ｂは最大応答時の相であり、ｘは測定相であり、ｋは、受容体と被検体類縁体との間の解離定数である）を使用することによって、被検体濃度に変換する。
【０１９２】
代替測定技術は、蛍光強度の測定である。
【０１９３】
この場合、光学的手段は、エネルギー供与体部分の吸収スペクトル内での波長で入射光の第一ビームを、好ましくは、エネルギー受容体部分の吸収スペクトル内での波長で入射光の第二ビームを（これはエネルギー受容体部分も蛍光団であることに適用される）供給する必要がある。さらに、光学的手段は、好ましくは、センサー内で発生する光信号を、２つの異なる波長、すなわち、エネルギー供与体部分の発光スペクトル内で波長１（被検体の測定に関して発生する信号）およびエネルギー受容体部分（被検体信号、内部参照またはキャリブレーション信号であり得る）の発光スペクトル内では波長２で、測定することができる必要がある。
【０１９４】
蛍光光度計は、以下のパラメータを別々に測定する。
【０１９５】
波長１（エネルギー供与体部分）で
励起光強度、Ｉ（１，０）
周囲の光強度、Ｉ（１，１）
組合わせた蛍光の強度および周囲の光、Ｉ（１，２）
波長２（エネルギー受容体部分）で
励起光強度、Ｉ（２，０）
周囲の光強度、Ｉ（２，１）
組合わせた蛍光の強度および周囲の光、Ｉ（２，２）
再び、測定を、皮膚に近い蛍光光度計を保持することによって、およびセンサーを有するアラインメントにおいて行う。センサー内に発生した蛍光信号の経皮的測定を行う時は、皮膚による信号の吸収を考慮することが必要である。ヒト皮膚の吸収率は、実験によって、４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲内で、最も低いことがわかっている。得られる最終出力は、２つの蛍光団からの蛍光強度の間の標準化された比であり、以下の関係（式１）によって規定される。
【０１９６】
最終出力＝（Ｉ（１，２）−Ｉ（１，１））*Ｉ（２，０）／（Ｉ（２，２）−Ｉ（２，１））*Ｉ（１，０）
（１）
【０１９７】
前記式１によって与えられる、光学的手段（たとえば、蛍光光度計）からの最終出力は、好ましくは国際公開公報第００／０２０４８号に規定されている原理に基づいて得ることができる、校正ダータを使用するコンピュータによって、被検体濃度に変換する。
【０１９８】
本発明のさらなる態様
【０１９９】
第六態様においては、本発明は、先に記載したポリマーに関する。
【０２００】
本発明の任意の態様に関連して記載した特徴は、本発明の他の態様に適用することができる。
【０２０１】
本発明を、実施例および図面を用いてさらに説明する。
【０２０２】
［実施例］
一般説明
【０２０３】
以下の材料を使用した。
【０２０４】
過ヨウ酸ナトリウム、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｏ−フェニレンジヒドロクロリド、ベンジルアミン、アンモニア、シアノホウ水素化ナトリウム（Sigma-Aldrich社）。
Ｎｕｎｃ Ｆ９６ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Nunc, Denmark）
ＰＤ−１０カラム、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Amersham bioscience）
デキストラン（Pharmacosmos, Denmark）
マンナン結合レクチン（数社の供給源、たとえば、Statens Serum Institute社、Copenhagen, Denmarkから入手可能）。コンカナバリンＡペルオキシダーゼ結合体（Sigma-Aldrich社，Ｌ６３９７）。
透析チューブSpectra/Por (Spectrum Laboratories社、California、 USA）。Float-A-Lyzer（商標）２５．０００ＭＷＣＯ再生セルロース透析チューブは、Spectrum Laboratories Europe (Breda, The Netherlands）から入手したものであった。
【０２０５】
ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）、アゾジイソブチロジニトリル（ＡＩＢＮ）および２−ヒドロキシエチルアクリレートは、Sigma-Aldrichから入手した。Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩は、PolysSciences Europe (Eppelheim, Germany）から入手した。２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（ＶＡ−０４４）は、Wako GmbH (Neuss, Germany）から入手した。
【０２０６】
アリルα−Ｄ−グルコピラノシドおよびアリル２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシドは、Glycon Biochemicals社、 Germanyから入手したものであった。アリルα−Ｄ−ガラクトピラノシドは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手したものであった。アリルα−Ｄ−マンノピラノシドは、実施例Ｃｌの方法によってここで生成した。
【０２０７】
他の記載がない限り、ＰＢＳは、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４であり、ＴＢＳは、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．４である。
【０２０８】
省略語：ＭＢＬ、マンナン結合レクチン；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＴＢＳ、ＴＲＩＳ緩衝食塩水；ＥＬＬＡ、酵素結合レクチンアッセイ
[実施例Ａ１]
【０２０９】
ＭＢＬの染色
ヒトＭＢＬを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１．２５ｍＭのＣａ2+を含む１０ｍＭのＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ８．７に緩衝液交換（透析法により）した。染色のために使用した染料は、Alexa Fluor（商標）５９４スクシンイミジルエステル（ＡＦ５９４−ＳＥ）（Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA）であった。染料を乾燥ＤＭＳＯに溶解し、炭酸水素緩衝液中のＭＢＬにゆっくり（１０分）加えた。反応を１時間行った。染色は、染料の１５倍モル過剰（ポリペプチド単位に関して）で行った。精製を、１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１．２５ｍＭＣａ2+に対する透析法によって行った。得られた、染色されたタンパク質のモル基準標識化度を、ＭＢＬの１サブユニット当たり染料２．３として、ＵＶ分光法によって決定した（ＭＢＬのサブユニットの分子量として２８ｋＤａを使用して計算）。
[実施例Ａ２]
【０２１０】
デキストランの生成
１５０ｋＤａデキストラン（６．００ｇ，０．４μｍｏｌ）を２５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、ｐＨ１１．５（６００ｍＬ）に溶解した。水素化ホウ素ナトリウム（３ｇ，０．０８ｍｏｌ）を加え、次いでジビニルスルホン（１５ｍｌ，０．１５ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分撹拌し、その後濃塩酸でｐＨ７．２に中和した。３０分撹拌した後、得られた混合物を水（３×２５Ｌ）中で透析した（ＭＷＣＯ１０−１２ｋＤａ）。内容物をエルレンマイヤーフラスコに移し、２４％アンモニア（２００ｍＬ）を加えた。２時間後、ｐＨを１０．５に調整し、反応物を一晩撹拌した。過剰のアンモニアを水（８×２５Ｌ）中で透析法（ＭＷＣＯ１０−１２ｋ）により除去し、内容物全てを凍結乾燥し、アミノデキストラン５．７５ｇ（アミノデキストラン、ＭＷ：１８５ｋＤａに対して７８％）を白色綿毛状物質として得た。元素分析を使用して、分子量、アミン導入率および導入されたジビニルスルホンの量の簡易評価を行った。
【０２１１】
Found Ｃ３９．８６；Ｈ６．２６；Ｎ０．１６；Ｓ３．０８％ Dextran １５０ｋ，〜２２ＤＶＳ−ＮＨ2，〜１６０ＤＶＳ−ＯＨ，ａｎｄ〜７２０Ｈ2Ｏ ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｃ３９．５５；Ｈ６．６０；Ｎ０．１６；Ｓ３．０７％
[実施例Ａ３]
【０２１２】
ヘキサ−メトキシ−クリスタルバイオレットスクシンイミジルエステル（ＨＭＣＶ−１）の生成
ＨＭＣＶ−１の合成：
【化３】
【０２１３】
スキーム１．Ｉ）４−（Ｎ−メチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（１当量）ジイソプロピルエチルアミン、アセトニトリル中、２０℃、２０時間、ＩＩジメチルアミン（過剰量）、ＩＩＩ）ＴＳＴＵ、ジイソプロピルエチルアミン、ｉアセトニトリル、２０℃、２時間
【０２１４】
４ａ （ＢＦ4-）：４−（メチルアミノ）酪酸塩酸塩（１．３６ｇ；８．８ｍｍｏｌ）、１（５．０ｇ；８．３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）をアセトニトリル（１２０ｍＬ）に溶解した。反応混合物を、乾燥窒素雰囲気中で、３０〜３５℃、２２時間撹拌した。ジメチルアミン（４０ｍＬの４０％溶液）水溶液を加え、反応混合物をさらに４日間撹拌した。溶剤および過剰のジメチルアミンを真空除去し、残った材料をクロロホルムに溶解した。クロロホルム溶液を食塩水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、その後、溶剤を蒸発させ、ＣＨ2Ｃｌ2／エーテルから生成物を再析出させた。収量：４．４ｇ（７０％）、暗青色の粉末
【０２１５】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ６２４（Ｍ＋）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ８．３４（ＩＨ，ｂｓ），６．０３（２Ｈ，ｓ），５．８３（４Ｈ，ｓ），３．４９（２Ｈ，ｍ），３．４６（６Ｈ，ｓ），３．４４（１２Ｈ，ｓ），３．１２（３Ｈ，ｓ（masked）），３．０８（１２Ｈ，ｓ），１．９４（２Ｈ，ｔ），１．７０（２Ｈ，ｍ）
【０２１６】
ＨＭＣＶ−１（Ｃｌ-）：ＴＳＴＵ（２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩；０．８ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１５ｍＬ）中の４ａ（０．９ｇ，１．２６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．５５ｇ，４．５ｍｍｏｌ）溶液に加えた。反応混合物を密閉したフラスコ内で２時間撹拌し、その後これを、ＨＣｌ水溶液（４ｍＬ，２Ｍ）で酸性化した、氷冷したほぼ飽和ＮａＣｌ溶液（約１５０ｍＬ）に注ぎ込んだ。水相をクロロホルム（２×１５０ｍＬ）で抽出した。組合わせたクロロホルム相を、食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶剤を蒸発させ、ＣＨ2Ｃｌ2／エーテルから再析出し、暗青色の粉末（０．８０ｇ，８４％）を得た。
【０２１７】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ７２１（Ｍ＋）
1Ｈ−ＭＭＲ 1Ｈ−ＮＭＲ ｂｒ．（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ５．８８（２Ｈ，ｓ），５．８５（４Ｈ，ｓ），３．６０（２Ｈ，Ｓ），３．４６（１２Ｈ，ｓ），３．４５（６Ｈ，ｓ），３．１５（１２Ｈ，ｓ），３．１２（３Ｈ，ｓ），２．８５（４Ｈ，ｓ），２．８０（２Ｈ，ｔ），１．９５（２Ｈ，ｍ）
[実施例Ａ４]
【０２１８】
４０モル％マンノースポリマーの合成
４０モル％マンノースポリマーを、以下のようにして生成した。アリルα−Ｄ−マンノピラノシド（１．７７ｇ，８．０ｍｍｏｌ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（１．３６ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（８９．６ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）および２，２'−アゾビス−［２−（２−イミダゾリン−
２−イル）−プロパン］２塩酸塩（２３．７ｍｇ，０．０７３ｍｍｏｌ）を、５０ｍｌの丸底フラスコに加え、次いで水（２８．８ｍｌ）を加えた。磁気攪拌下、室温で混合物を溶解した。５分間窒素でパージした後、混合物を６０℃に加熱し、その温度で１２時間重合した。冷却すると、僅かに黄色を帯びた粘稠な溶液を得た。この溶液を、一晩水に対して透析（２５ｋのＭＷＣＯ再生セルロース）し、凍結乾燥し、白色の綿毛状のポリマーを得た。
【０２１９】
このポリマーが乾燥し、空気に曝した後、ポリマーは、水に部分的にしか溶解しないものであった。
[実施例Ａ４ａ]
【０２２０】
８０モル％マンノースポリマーの合成
アリル−α−Ｄ−マンノピラノシドの量を３．５４ｇ（１６ｍｍｏｌ）とし、２−ヒドロキシエチルアクリレートの量を０．６８ｇ（５．８５ｍｍｏｌ）とした以外は実施例Ａ４と同様にして、８０モル％マンノースポリマーを生成した。
【０２２１】
このポリマーは、実施例Ａ４で生成したポリマーより溶解性があった。また、このポリマーが乾燥し空気に曝した後も、水に対し溶解性があった。
[実施例Ａ５]
【０２２２】
実施例Ａ４の４０モル％マンノースポリマーのＨＭＣＶ−１による標識化
実施例Ａ４のポリマー（２０ｍｇ）を１０ｍＭのカーボネート緩衝液（５００μｌ，ｐＨ８．６）に溶解し、実施例Ａ３で生成したヘキサメトキシクリスタルバイオレット−スクシンイミジルエステル（ＨＭＣＶ−１，６．１ｍｇ）のＤＭＳＯ（２００μｌ）溶液を加えた。混合物を室温で３時間緩やかに攪拌し、次いで１０ｍＭのＴＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４に対して透析し（１０ｋのＭＷＣＯ再生セルロース）、反応していない染料を除去した。０．０８５の重量基準の標識化度（「ＤＯＬ」）の値を得た。
【０２２３】
「ＤＯＬ」値は、以下の等式を使用して求めた。
「ＤＯＬ」＝［ＨＭＣＶ−１］（ｍｇ／ｍｌ）／［ポリマー］（ｍｇ／ｍｌ）
ここで、式中、ＨＭＣＶ−１の含有率は、吸光分光分析で求めた。
［ＨＭＣＶ−１］（ｍｇ／ｍｌ）＝［Ａ（６３２ｎｍ）／（ε（ＨＭＣＶ−１，６３２ｎｍ）*１）］*Ｍ（ＨＭＣＶ−１）
ε（ＨＭＣＶ−１，６３２ｎｍ）＝４２０００Ｍ-1*ｃｍ-1；Ｍ（ＨＭＣＶ−１）＝６６０．２ｇ／ｍｏｌ
[実施例Ａ５ａ]
【０２２４】
実施例Ａ４ａの８０モル％マンノースポリマーのＨＭＣＶ−１による標識化
実施例Ａ５の標識化方法を、実施例Ａ４ａの８０モル％マンノースポリマーについて行った。
[実施例Ａ６]
【０２２５】
実施例Ａ４の４０モル％マンノースポリマーに関するサイズ排除アッセイ
実施例Ａ４のポリマーの分子量を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して求めた。ＴＳＫゲルＧ４０００ＰＷXLカラム（７．８ｍｍ（内径）×３０．０ｃｍ（長さ）、Tosoh Biosciences社）を、Agilent １１００ＨＰＬＣシステム上で操作した。移動相（０．１％酢酸，５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ３．４）の定組成溶離（１．０ｍｌ／分で２５分間）を使用した。分子量は、ＨＭＣＶ結合アミノデキストラン標準に基づき、次の関係式：
を用いた。結果を図２に示す。
[実施例Ａ７]
【０２２６】
実施例Ａ４のポリマーのマンノース含有率の測定
このアッセイは、マンノース（８０％硫酸中）の対応する５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）への脱水反応に基づき、これは次に５％のフェノール溶液と反応し、加熱で色素原を生成する。この反応は、定量的であるので、マンノースの最初の濃度を、吸光分光分析で求めることができる。９６ウェルマイクロプレートを使用することにより、試料の高処理能力が可能になる。使用した方法は、Masukoら(2005) Anal. Biochem., 339,69-72によって修正されたものである。
【０２２７】
９６ウェルのマイクロプレートの１ウェル中の５０μｌの試料に１５０μｌの濃硫酸をすばやく加え、最大混合を起こし、次いで直ちに３０μｌの５％フェノール水溶液を加えた。水浴中でマイクロプレートを、９０℃で１５分間注意深く浮遊させることによって培養した後、別の水浴でプレートを５分間冷却し、ふき取って乾かし、マイクロプレートリーダーを使用して吸収を（４９０ｎｍ）測定した。試料は、標準曲線を作成するための水（５０μｌ／ウェル）中、マンノースの１２種の異なる濃度（０．００３、０．０２、０．０３、０．０５、０．１５、０．２、０．３、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０ｍＭ）と、実施例Ａ４のポリマー（５０μｌ／ウェル）の３種の異なる濃度（０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｍｌ）とで構成した。全測定を、１試料につき３回行った。
【０２２８】
結果を表１に示す。
【０２２９】
【表１】
[実施例Ａ７ａ]
【０２３０】
実施例Ａ４ａのポリマーのマンノース含有率の測定
実施例Ａ４ａのポリマーを、実施例Ａ７で記載した方法を使用して分析した。
【０２３１】
結果を表１ａに示す。
【表１ａ】
[実施例Ａ８]
【０２３２】
実施例Ａ４の４０モル％マンノースポリマーに関するＥＬＬＡアッセイ
ビオチン化ＭＢＬを、以下のように生成した。ビオチン−ＮＨＳ（２０μｌ，ＤＭＳＯ中７ｍｇ／ｍｌ，〜１０〜１５当量／ＭＢＬモノマー）を、ＭＢＬ（３ｍｌ，０．５３ｍｇ）のＰＢＳ（３ｍＬ）溶液に加えた。溶液を２時間緩やかに攪拌し、次いで透析チューブ（ＭＷＣＯ１０−１２Ｋ）に移し、ＴＢＳ（２×１Ｌ）に対して２４時間透析した。得られたＴＢＳ中のビオチン化ＭＢＬ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をさらに精製することなく使用した。
【０２３３】
以下に記載するＭＢＬ ＥＬＬＡアッセイで使用した塗布濃度がマイクロプレートを飽和するのに十分であることを確認するために、標準ＣｏｎＡ ＥＬＬＡアッセイを次のように行った。ＥＬＬＡアッセイにおいて使用したＰＢＳ緩衝液は、１０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ2、０．１ｍＭのＭｎＣｌ2で、ｐＨ７．４であった。
【０２３４】
９６ウェルマイクロタイタープレートに、５℃で一晩、ＰＢＳ中の抗体（実施例Ａ４で得たポリマーおよびアミノデキストラン）（１００μｌ，１００μｇ／ｍｌ，２倍希釈）のそれぞれの２カラムを塗布した。残った結合部位を、ＰＢＳ（１５０μｌ）中の０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの添加によってブロックした。次いで、ウェルを洗浄（２×２００μｌのＰＢＳ）した。ＰＢＳ中のＣｏｎＡ−ＨＲＰ、１％（ｗ／ｖ）（１００μｌ）を加え、１時間培養した。次いでプレートを空にし、洗浄（３×２００μｌのＰＢＳ）した。ＨＲＰの存在を、基質溶液（１ｍｇのｏ−フェニレンジヒドロクロリド）の添加によって可視化し、２分後１ＮのＨ2ＳＯ4でクエンチした。４９０ｎｍでの吸収を読むことによって発色を測定し、バックグラウンド除去は６３０ｎｍで読んだ。
【０２３５】
９６ウェルマイクロタイタープレートに、５℃で一晩、ＴＢＳ中の抗体（実施例Ａ４のポリマーおよびアミノデキストラン）（１００μｌ，１００μｇ／ｍｌ）のそれぞれの２カラムを塗布した。残った結合部位を、ＴＢＳ（１５０μｌ）中の０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの添加によってブロックした。次いで、ウェルを洗浄（２×２００μｌのＴＢＳ）した。ビオチン化ＭＢＬ（２μｇ／ｍｌ）によるグルコース（１００ｍＭ〜０ｍＭ）の希釈液を加え、全容量を１００μｌとした。２時間の培養の後、プレートを空にし、洗浄（２×２００μｌのＴＢＳ）した。ＴＢＳ中のストレプトアビジン−ＨＲＰ、０．１％（ｖ／ｖ）（１００μｌ）を加え、１時間培養した。次いで、プレートを空にし、洗浄（３×２００μｌのＴＢＳ）した。ＨＲＰの存在を、基質溶液（１ｍｇのｏ−フェニレンジヒドロクロリド）の添加によって可視化し、２分後、１ＮのＨ2ＳＯ4でクエンチした。４９０ｎｍでの吸収を読むことによって発色を測定し、バックグラウンド除去は６３０ｎｍで読んだ。
【０２３６】
結果を図３に示す。
[実施例Ａ８ａ]
【０２３７】
実施例Ａ４ａの８０モル％マンノースポリマーに関するＥＬＬＡアッセイ
実施例Ａ４ａのポリマーに関するＥＬＬＡアッセイを、実施例Ａ８で記載した方法を使用して行った。
【０２３８】
ＥＬＬＡアッセイにより得られたＩＣ５０値は、実施例Ａ８の値より非常に高かった。ＩＣ５０は、グルコース１６．８ｍＭ（Ａ８）であるのと比べて、グルコース５０〜８０ｍＭで変化した。
[実施例Ａ９]
【０２３９】
実施例Ａ５の４０モル％マンノース標識化ポリマーに関するＦＲＥＴアッセイ
測定を周波数領域法により行った。これらの測定に関しては、ＩＳＳ社，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ，ＵＳＡのＫＯＡＬＡ装置（ＫＯＡＬＡ自動化試料コンパートメント）を使用した。励起光源（図１中の１１）は黄色ＬＥＤであった。励起光は５４０〜５９０ｎｍバンドパスフィルター（図１中の１５）でフィルターにかけ、発光は、６１０〜６９０ｎｍバンドパスフィルター（図１中の２１）を使用して単離した。両フィルターともOmega Optical社、Brattleboro, VT, USAのものであった。
【０２４０】
多指数関数崩壊モデルは、ベストモデルは、蛍光発光崩壊を記載する。しかし、グルコースセンシングは、多指数関数崩壊を分析する必要がない。単一変調周波数での位相または変調測定は、グルコース濃度を測定するのに適している（L.Tolosa, H. Szmcinski, G. RaoおよびJ.R. Lakowicz (1997) Analytical Chemistry 250, 102-108)。PreciSenseアッセイケミストリに関する最適変調−周波数は、６１ＭＨｚであると考えられる。
【０２４１】
１０μＭの標識化ＭＢＬの５０μｌのアッセイケミストリ（実施例Ａ１において生成されたものであるが、１ＭＢＬサブユニット当たり０．５個の染料の標識化度を有する）と、２ｍｇ／ｍｌの標識化ポリマー（実施例Ａ５）とを混合し、混合後、少なくとも１時間放置した。次いで、アッセイケミストリ（５μｌ）をシリンジでセルロースファイバに移し、該ファイバを特注設計されたファイバーホルダーに設置した。ファイバーホルダーを標準蛍光発光セル（１０ｍｍ×１０ｍｍ）中に挿入した。つまり、該測定のために修正なしで標準の市販の装置を使用した。
【０２４２】
溶液は全て水浴で３４℃に予備加熱し、ＫＯＡＬＡ装置での測定は全て３４℃で記録した。蛍光発光セルを持つファイバおよびファイバ−ホルダー組立体を、ＫＯＡＬＡの試料ホルダー中に置き、グルコースを含有する緩衝液で蛍光発光セルを満たした。
【０２４３】
測定された位相は、少なくとも４０個の位相角記録の平均であった。測定が完了した後、ピペットを使用して蛍光発光セルを空にし、次の濃度のグルコースを含有する緩衝液で再び満たした。アッセイケミストリが平衡状態に達するように、測定の間に２０分間の遅延時間を置いた。
【０２４４】
グルコース用量反応曲線（図４）を作成するために、０、２．５、５、１０、３０、１００および５００ｍＭグルコースで位相を測定した。５００ｍＭグルコースで位相角を測定した後、ファイバを６０分かけて１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液で数回洗浄した。この時点で、０ｍＭのグルコースで最初に得られた位相角と同じ位相角を得た。これにより、アッセイ（データは示さず）の可逆性が立証された。
[実施例Ａ９ａ]
【０２４５】
実施例Ａ５およびＡ５ａの標識化ポリマーに関するＦＲＥＴアッセイ
実施例Ａ５およびＡ５ａの標識化ポリマーを使用して、実施例Ａ９に類似する方法を行った。ポリマーを、生分解性ポリマー中に封入し、小型化された時間分解蛍光光度計を用いて測定値を取った。グルコース濃度を、２日間の周期で２．５ｍＭ、５ｍＭ、１５ｍＭおよび３０ｍＭの間で変化させた。測定値を５分間隔で取り、最初の２．５ｍＭのグルコース濃度で測定した位相の値を、次の位相の値から差し引くことによって、位相シフトを計算した。
【０２４６】
結果を図４ａに示す。
【０２４７】
８０％マンノース標識化ポリマー（実施例Ａ５ａ）の位相シフトは、４０％マンノース標識化ポリマー（実施例Ａ５）より、約４０％大きかった。４０モル％マンノース標識化ポリマー（実施例Ａ５）の沈殿が観察された。８０％マンノース標識化ポリマー（実施例Ａ５ａ）の沈殿は観察されなかった。これは、８０モル％マンノース標識化ポリマーの応答が向上したことの関係があると考えられる。
【０２４８】
実施例Ａ４〜Ａ９の結果を、表２にまとめる。
【表２】
【０２４９】
実施例Ａ４ａ〜Ａ９ａの結果を表２ａにまとめる。
【表２ａ】
[実施例Ａ１０]
【０２５０】
センサーの形成と埋め込み
１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０ポリマー（８０重量％の親水性セグメントと２０重量％疎水性セグメントとの標的を用い、S.FakirovおよびT. Gogeva, Macromol. Chem. 191(1990) 603-614に記載のように生成）から、直径７００μｍのガラス棒を、１５％ｗ／ｗのポリマーのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液に浸漬し、室温で乾燥させることによって、ファイバを製造した。これにより、外径９００μｍ、内径７００μｍの中空ファイバを得た。該ファイバにアッセイケミストリ（実施例Ａ９）を満たした。ポリマーを溶融しファイバを閉じるために、ポリマーを加熱した。試験および埋め込みの前に、溶融されたファイバの漏れをテストした。
【０２５１】
この種類のファイバは、針を使用することにより、皮膚の上側に配置することができる。適切なサイズ（湿ったファイバを含有するのに十分な大きさ）の針を、約１ｍｍの深さで皮膚の表面に平行に置き、皮膚を通して影として見えるように針を置く。ファイバ（まだ湿っている）を針の内部に置き、針を取出す。
【０２５２】
通常、挿入が完了した後、挿入部位に出血は観察されない。ファイバが適所に置かれると、読み取り機をファイバの真上の位置に置き、測定を始めることができる。
[実施例Ｂ１]
【０２５３】
ポリマー合成
水溶性４０％マンノースコポリマーを、以下のようにして、乳化重合で生成した。機械的撹拌器と窒素管とを備える、２５０ｍｌの３つ首丸底フラスコに、Ｓｐａｎ８０界面活性剤（５．７ｇ；ＨＬＢ［親水性−親油性バランス］４．３、トルエンに対して１０％ｗ／ｗ）、ＡＩＢＮ（３０ｍｇ）およびトルエン（５７．３ｇ）を加えた。該フラスコを密封し、窒素でパージし、重合の間中窒素雰囲気下に保った。アリルα−Ｄ−マンノピラノシド（３．５２ｇ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（２．５５２ｇ）およびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（０．３５６ｇ）を水（１２．７ｇ）に溶解し、ろ過して、不溶物質を除去した。この混合物を、丸底フラスコ中で、ゴム膈膜を介して、激しく撹拌されている混合物に加えた。反応混合物を、室温で、安定な乳化物が形成されるまで（３０分）、次いで６０℃４時間、撹拌した。ＶＡ−０４４（１ｍｌ，６０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を、膈膜を通して注入し、重合を一晩（１７時間）続けた。反応混合物を室温まで冷却し、乳化物をアセトンの添加によって分離した。これによってポリマーの析出が起こり、析出物を集め、水に再び溶解し、アセトンの添加によって析出させた。生成物を一晩、真空乾燥し、３．２ｇ（５０％）の粗薄黄色ポリマーを得た。粗ポリマーの一部（１．０ｇ）を、水（１０ｍｌ）に溶解し、水中で透析（ＭＷＣＯ［分子量カットオフ］２５，０００）し、低分子量物質を除去した。凍結乾燥によって、０．４６ｇ（４６％）の綿毛状ポリマーを得た。
[実施例Ｂ２]
【０２５４】
実施例Ｂ１のポリマーの染色
一般的に、コポリマーの標識化は、Molecular Probes（製品情報ＭＰ００１４３，Ｒｅｖ．２００１年６月）によって提供される記載に従う。
【０２５５】
ポリマー（実施例Ｂ１）（８８．６ｍｇ）を、１０ｍＭのＮａＨＣＯ3溶液（３ｍｌ；ｐＨ８．５）に溶解した。ポリマー溶液を３つのエッペンドルフバイアルに３等分した。ＨＭＣＶ−１（実施例Ａ３）（１９．６ｍｇ；２６．１μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ（６００μｌ）に溶解した。染料を、第一バイアルは合計で１００μｌ、第二バイアルは２００μｌ、第三バイアルは３００μｌとなるように、１０μｌのアリコート中のポリマー溶液に、３０秒ごとに加えた。最後のアリコートの添加後、バイアルを１時間穏やかに撹拌し、数種の緩衝液変更のある１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液中で、透析法緩衝液に色が見えなくなる（通常、５００ｍｌおよび７２時間の緩衝液変更を６〜８回）まで、該溶液を透析（ＭＷＣＯ、１０−１２，０００）した。
[実施例Ｂ３]
【０２５６】
実施例Ｂ２のポリマーのＦＲＥＴアッセイ
１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（１２．５μＬ）中の染色したコポリマー溶液（実施例Ｂ２）（４μＬ）および染色したＭＢＬ溶液（実施例Ａ１）（８．５μＬ）を含むアッセイ化学検査物を混合し、混合後、少なくとも１時間放置した。次いで、アッセイ化学検査物を、シリンジを用いて、実施例Ａ９で使用したファイバーに移した。ファイバーを特注設計したファイバーホルダーに載せ、標準蛍光セル（１０ｍｍ×１０ｍｍ）にフィットさせた。
【０２５７】
時間分解蛍光光度法（周波数領域法）を用いて、グルコース反応を測定した。
[実施例Ｃ１]
【０２５８】
アリルα−Ｄ−マンノピラノシドおよびアミノデキストラン１５０ｋの合成
アリルα−Ｄ−マンノピラノシドの合成を、基本的に、Ｐｅｋａｒｉら（２００４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，６６（２２），７４３２−７４４２に記載のように行った。
【０２５９】
Ｄ−マンノース（１２．１ｇ，６７ｍｍｏｌ）を、ＢＦ3−ＯＥｔ2（０．５８ｍｌ）の存在下、乾燥アリルアルコール（１４０ｍｌ）中で一晩還流した。翌日、反応混合物を、Ｅｔ3Ｎ（１．８ｍｌ）で中和し、溶剤を蒸発させた。ドライカラムバキュームクロマトグラフィー（内径６ｃｍ；１００ｍｌ画分；ＤＣＭ中０〜４５％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）−１１画分，５％増加＋１００％）により、生成物９．３８ｇ（６３％）を無色シロップとして得た。ＴＬＣ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ，９：１）Ｒf０．３；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，１２８スキャン，７００μｌのＤ2Ｏ中４ｍｇ）δ３．２７（ｓ，２Ｈ，アリル），３．５２−４．２１（ｍ，６Ｈ），４．８４（ｂｓ，１Ｈ，αＨ），５．１６−５．３４（ｍ，２Ｈ，アリル），５．８２−５．９８（ｍ，１Ｈ，アリル）
【０２６０】
アミノデキストラン１５０ｋの合成は以下のように行った。デキストラン１５０ｋ（６．００ｇ，０．４μｍｏｌ）を２５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、ｐＨ１１．５（６００ｍＬ）に溶解した。水素化ホウ素ナトリウム（３ｇ，０．０８ｍｏｌ）、次いでジビニルスルホン（１５ｍｌ，０．１５ｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で３０分攪拌した後、濃ＨＣｌでｐＨ７．２の中性とした。３０分間攪拌した後、得られた混合物を水中（３×２５Ｌ）で透析（ＭＷＣＯ１０〜１２ｋ）した。次いで、内容物を三角フラスコに移し、２４％アンモニア（２００ｍＬ）を加えた。２時間後、ｐＨを１０．５に調整し、反応物を一晩攪拌した。過剰のアンモニアを水（８×２５Ｌ）中での透析（ＭＷＣＯ１０−１２ｋ）により除去し、全内容物を凍結乾燥し、アミノデキストラン５．７５ｇ（７８％，アミノデキストラン（１８５ｋのＭＷ）に対して）を白色綿毛状物質として得た。元素分析を使用し、分子量、アミン導入および導入されたジビニルスルホンの量の概算を行った。（測定値：Ｃ３９．８６；Ｈ６．２６；Ｎ０．１６；Ｓ３．０８％デキストラン１５０ｋ，〜２２ＤＶＳ−ＮＨ2，〜１６０ＤＶＳ−ＯＨおよび〜７２０Ｈ2Ｏ 要求値：Ｃ３９．５５；Ｈ６．６０；Ｎ０．１６；Ｓ３．０７％）
[実施例Ｃ２]
【０２６１】
ポリマーの合成
以下の例で、マンノース５０モル％共重合体をどのように生成したかを説明する。他のポリマー生成は、表３にまとめる。使用した単糖類およびそれらの分量を表４にまとめる。
【０２６２】
アリル−サッカライド（ＡＳ）およびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＮＡＭＨ）の母液（１００ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で生成した。
【０２６３】
スクリューキャッププラスチックチューブ中で、過硫酸カリウム（ＰＰＳ）（１５０ｍｇ）をＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．４；７．８ｍｌ）に溶解した。この溶液に、アリルα−Ｄ−マンノピラノシド（アリルサッカライド；ＡＳ）（２．２０ｍｌ；２２０ｍｇ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）（１１０μｌ）、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＮＡＭＨ）（８９μｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）（１００μｌ）をこの順番で加えた。混合物を、窒素で５分間パージし、溶解酸素を除去した。旋回シェーカー中で重合を室温で一晩行った。反応混合物をろ過し、メタノール（１００ｍｌ）中に析出させた。ポリマーを遠心分離（４０００ｒｐｍ，３分）で集め、次いでメタノール（３×１０ｍｌ）で洗浄した。最終的に得られたポリマーペレットをエクシケーターで一晩乾燥した。
【表３】
【表４】
[実施例Ｃ３]
【０２６４】
Ｃ２のポリマーに関するＥＬＬＡアッセイ
ＥＬＬＡアッセイで使用した緩衝液は、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ2（生理的カルシウム濃度を模倣）ｐＨ７．４であった。
【０２６５】
９６ウェルマイクロタイタープレートに、５℃で一晩、ＴＢＳ中の抗体（実施例Ｃ３のポリマー、実施例Ｃ１のアミノデキストラン）（１００μｌ，１００μｇ／ｍｌ）のそれぞれの２カラムを塗布した。残りの結合部位をＴＢＳ（１５０μｌ）中の０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの添加によりブロックした。次いで、ウェルを洗浄（２×２００μｌのＴＢＳ）した。ビオチン化ＭＢＬ（２μｇ／ｍｌ）によるグルコース（１００ｍＭ〜０ｍＭ）の希釈液を加え、全容量を１００μｌとした。２時間の培養の後、プレートを空にし、洗浄（２×２００μｌのＴＢＳ）した。
【０２６６】
ＴＢＳ中のストレプトアビジン−ＨＲＰ、０．１％（ｖ／ｖ）（１００μｌ）を加え、１時間培養した。次いで、プレートを空にし、洗浄（３×２００μｌのＴＢＳ）した。ＨＲＰの存在を、基質溶液（１ｍｇのｏ−フェニレンジヒドロクロリド）の添加によって可視化し、２分後、２Ｎの硫酸でクエンチした。４９０ｎｍでの吸収を読むことによって発色を測定し、バックグラウンド除去は６３０ｎｍで読んだ。結果を図１のグラフに示す。高い吸収は、ＭＢＬのリガンドに対する結合に対応する。ベースライン吸収は、ＭＢＬのリガンドに対する結合に対応する。
【０２６７】
図５、図５ａに示すように、モノマーサッカライド単位は、ＭＢＬに対しグルコース（ＩＣ50〜１８ｍＭ）より高い親和力を有することが必要であり、マンノース（ＩＣ50〜８ｍＭ）またはＮ−アセチルグルコサミン（ＩＣ5〜６ｍＭ）より高い親和力を有することが好ましい。ガラクトース（ＩＣ50〜３６ｍＭ）のようなより低い親和力のサッカライドモノマー単位は、生理的カルシウム濃度でＭＢＬ結合をもたらさない。
【０２６８】
３０％と５０％との間のマンノースモノマー単位を持つ共重合体は、０〜１０ｍＭグルコースの範囲で最も容易に抑制（最急勾配）されるので、これらの共重合体を使用することにより最高の結果が達成された。したがって、最適ステップ（実施例Ｃ４）では、マンノースモノマー単位の含有率が３０％〜５０％の範囲であるマンノース共重合体を合成した。
[実施例Ｃ４]
【０２６９】
ポリマーの合成（最適化）
生成方法は、実施例Ｃ２の方法と同じであった。ポリマー生成を表５にまとめる。反応試薬を図６に示す。ポリマー生成物の例を図７に示す。
【表５】
[実施例Ｃ５]
【０２７０】
実施例Ｃ５のポリマーに関するＥＬＬＡアッセイ（最適化）
ＥＬＬＡアッセイを実施例Ｃ３に記載のように行った。
【０２７１】
結果を図８に示す。
【０２７２】
図８は、３５モル％マンノース共重合体が最適化リガンドであることを示す。結合は、０ｍＭのグルコースで、ＭＢＬに対するアミノデキストランと同じくらい強いが、アミノデキストランの結合より容易に抑制される。抑制曲線から、アミノデキストランおよび最適化リガンドのＩＣ50値を計算することができる（表６）（ＩＣ50値は、この特定のアッセイに関してのみ有効である）。
【表６】
【図面の簡単な説明】
【０２７３】
【図１】アッセイを問い合わせするための適切な光学セットアップを示す。
【図２】実施例Ａ５で得たサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。
【図３】実施例Ａ８で得たＥＬＬＡアッセイの結果を示す。
【図４】実施例Ａ９で得たＦＲＥＴアッセイの結果を示す。
【図４ａ】実施例Ａ９ａで得たＦＲＥＴアッセイの結果を示す。
【図５】実施例Ｃ３で得たＥＬＬＡアッセイの結果を示す。
【図５ａ】実施例Ｃ３で得たＥＬＬＡアッセイの結果を示す。
【図６】実施例Ｃ４の反応原料を示す。
【図７】実施例Ｃ４のポリマー生成物の一例を示す。
【図８】実施例Ｃ５で得たＥＬＬＡアッセイの結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖質または糖質様部分を有するポリマー、そのようなポリマーを製造する方法、そのようなポリマーを含むセンサー、ならびにそのようなセンサーを製造する方法およびそのようなセンサーを使用する方法に関する。
【０００２】
センサーは、光学技術を使用する、流体中の糖質、たとえば体液中のグルコースの測定またはモニタリングにおいて使用してもよい。
【０００３】
特に、センサーは、グルコース濃度を厳密にモニターしなければならない状況および／または糖尿病の管理のように、グルコース測定を繰り返して行わなければならない状況における用途に適切である。
【背景技術】
【０００４】
糖尿病の管理において、血中のグルコースの定期測定は、正確なインシュリン投与を確保するために、必要不可欠である。さらに、糖尿病患者の長期間の患者管理において、血糖値のより良い管理は、もし防止できなければ、網膜疾患、循環障害、およびしばしば糖尿病に伴う他の変性疾患の発症を遅らせる可能性があることが実証されている。したがって、糖尿病患者による血糖値の信頼のおける正確な自己モニタリングが必要である。
【０００５】
糖尿病患者において起こるであろう濃度、すなわち０〜３５ｍＭまたはそれより幾分高い範囲の血糖を測定することが望ましい。
【０００６】
現在、血糖は、糖尿病患者が、市販の比色定量試験片または電気化学的バイオセンサー（たとえば、酵素電極）を用いてモニターしているが、両方とも、ランセット型装置を常に使用し、測定のたびに適量の血液を取り出す必要がある。平均して、多数の糖尿病患者はそのような装置を使用して、１日に２回血糖の測定を行っている。しかし、米国立衛生研究所は、アメリカ糖尿病協会が支持する、血糖の試験は１日に少なくとも４回行うべきであるということを推奨してきた。血糖試験の回数の増加は、糖尿病患者に、特に指先から血液を取るために、ランセットを常用しなければならない長期間の糖尿病患者には、経済面でも、痛みおよび不快な面でも大きな負担をかけることになる。したがって、患者から採血しない、より優れた長期間のグルコースモニタリングシステムが明らかに必要である。
【０００７】
患者から採取する血液を必要としないグルコース測定技術に関して、数多くの提案がある。
【０００８】
皮下液中の被検体の濃度は、血液中の該被検体の濃度と相関することが観察されてきており、したがって、皮下位置に据えられる、グルコースモニタリングデバイスの使用がいくつか報告されている。遠隔的に問い合わせすることができるグルコース用競合結合アッセイの使用は、特に興味を引くものである。
【０００９】
競合的結合をアッセイする方法は、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペア（米国特許第６２３２１２０号で検討されている）を使用し、これは、典型的には、エネルギー移動供与体受容体ペア（エネルギー供与体部分とエネルギー受容体部分とを含む）である。エネルギー供与体部分は、光輝性（通常は蛍光性）である。
【００１０】
そのような方法において、エネルギー移動供与体−受容体ペアは、分析すべき試料（たとえば、皮下液）と接触させられる。次いで、該試料は照射され、得られた放射物を検出する。供与体−受容体ペアのエネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分のどちらかが、レセプター担体（たとえば糖質結合分子）に結合し、一方、供与体−受容体ペアのもう１つの部分（リガンド担体、たとえば糖質類縁体に結合されている）と、これと共に存在している任意の被検体（たとえば糖質）とが、レセプター担体上の部位への結合に関して競合する。供与体と受容体とが一緒にされた時、それらの間にエネルギー移動が起こり、これによって、エネルギー供与体部分の蛍光発光の検出可能な存続時間の変化（減少）が起こる。また、エネルギー供与体部分によって放出される一部の蛍光シグナルも消される。
【００１１】
寿命変化は、被検体の競合的結合によって、減少または消去される。したがって、見かけの発光寿命を測定することによって、たとえば、位相変調蛍光光度法または時間分解蛍光光度法（Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, 1983年，第３章参照）によって、サンプル中の被検体の量を決定することができる。
【００１２】
エネルギー移動の効率は、供与体の量子収率、供与体の発光スペクトルと受容体の吸収スペクトルとの重なり、ならびに供与体と受容体との間の相対距離および配置に依存することも注意すべきである。
【００１３】
欧州特許第０５６１６５３号には、先に記載した、受容体とリガンドとを問い合わせする方法が開示されている。
【００１４】
供与体−受容体エネルギー移動の例として、蛍光共鳴エネルギー移動（フェルスター共鳴エネルギー移動、ＦＲＥＴ）があり、これは、最初に励起された供与体（Ｄ）から受容体（Ａ）への励起状態エネルギーの非放射性移行である。供与体は、典型的には、より短い波長で放射し、その発光スペクトルは、受容体の吸収スペクトルと重なり合う。エネルギー移動は、光子が出現することなく起こり、供与体と受容体との間の長距離双極子−双極子相互作用の結果である。
【００１５】
ＦＲＥＴプロセスは光子の出現を伴わないので、用語共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）がより正確である。しかしＦＲＥＴもＲＥＴも互換的に使用されることが多い。
【００１６】
ＦＲＥＴの重要な特徴は、それが、生体高分子の寸法に匹敵する距離上で起こることである。フェルスター距離と呼ばれる、ＦＲＥＴが５０％効率の時の距離は、典型的には、２０〜６０Åの範囲である。２０〜９０Åの範囲のフェルスター距離は、競合的結合の研究には都合がよい。
【００１７】
供与体（Ｄ）による被検体結合部分のラベリングおよび受容体（Ａ）による被検体類縁体のラベリング、またはその逆によって、供与体−受容体応答に基づく測定可能な応答を生み出すことができるアッセイが作り出される。したがって、Ｄ−「被検体結合部分」のＡ−「被検体類縁体」への結合によって、供与体の強度または寿命が減少する結果となる。サンプル中の被検体は、Ｄ−「被検体結合部分」上の被検体結合部分を獲得するために競合し、Ｄ−「被検体結合部分」を受容体（Ａ）から放出する。したがって、供与体の強度減衰時間および位相角は、グルコース濃度が増えるに従って増加することが予測される。
【００１８】
これらの原理は、エネルギー移動によるグルコース感知において使用されてきた。
【００１９】
国際公開公報第９１／０９３１２号には、光学的手段によって遠隔的に問い合わせる、グルコースに基づく親和性アッセイ（エネルギー移動供与体−受容体ペアを組合わせた）を使用する、皮下方法およびデバイスが記載されている。国際公開公報第９７／１９１８８号、国際公開公報第００／０２０４８号、国際公開公報第０３／００６９９２号および国際公開公報第０２／３０２７５号の各例には、エネルギー移動によるグルコース感知が記載され、これは、遠隔的に読み取ることができる光信号を提供している。
【００２０】
当業者であれば、受容体が蛍光団になり得るであろうことは理解するであろう。エネルギー受容体部分の吸収スペクトル内の波長で、入射光のビームによる励起に続いてエネルギー受容体部分によって放射される任意の蛍光信号は、ＦＲＥＴプロセスに影響されない。したがって、内部参照信号として、エネルギー受容体部分によって、たとえばセンサーの連続キャリブレーションにおいて、放出される蛍光信号の強度を使用すること、またはセンサーが分解している範囲をモニターすることが可能であり、したがって、新しいセンサーを移植または注射する必要性を示す。許容しうるベースラインレベル未満のこの信号の下降は、新しいセンサーを移植または注射する必要性を示す。
【００２１】
しかし、エネルギー受容体部分は、非蛍光性染料であってもよい。この場合では、蛍光消光能力を持つ化合物を、特定のエネルギー受容体部分の代わりに使用する。強力かつ非特異性の蛍光消光物質の例は、Tyagiら、Nature Biotechnology (1998) 18：第４９頁にある。
【００２２】
先に検討したシステムは、糖質結合分子として、植物レクチンコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に依存している。本発明者らは、代わりにマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）のような動物レクチンを使用することができることを、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３１１４号明細書（国際公開公報第０６／０６１２０７号）（優先権主張の基礎出願）において示唆してきた。
【００２３】
用語「レクチン」は、明らかに糖質代謝に関与せず、免疫グロブリンの主要ないかなるクラスにも属さない任意の糖質結合タンパク質を含む。レクチン類は、糖質認識ドメイン（ＣＲＤ）を介して、糖質への選択的な結合を示す。
【００２４】
本発明者らは、ある糖質結合分子（特にレクチン）に関する糖質類縁体の結合力に影響を与えるパラメータとして
−糖質（または糖質模倣）部分の数、
−糖質結合分子に関する糖質（または糖質模倣）部分の親和力
−カルシウム濃度（少なくともＭＢＬに関する）
−糖質類縁体の柔軟性
が含まれることを認識している。
【００２５】
生理的カルシウム濃度は制御できない。しかし、他のパラメータは選択し、糖質類縁体に適切な測定範囲を与えることができる。アッセイ性能への糖質類縁体柔軟性の影響は、予め同定または対処されない。
【００２６】
最初の２つの変数の調整については、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３１１４号明細書（国際公開公報第０６／０６１２０７号）および国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３１１５号明細書（国際公開公報第０６／０６１２０８号）に検討されている。ＭＢＬおよび他のレクチン類への強い結合によって、数多くの部位での結合がもたらされる。各部位での結合は比較的弱い（低親和力）が、蓄積された効果は、強い結合（高結合力）である。したがって、結合部位が全て結合していない糖質類縁体は、結合部位を全て結合する糖質類縁体より、結合部位を全て結合する糖質被検体によって、容易に置き換わる。これは、ＭＢＬに対する親和力がグルコースが持つＭＢＬに対する親和力より高いマンノースを含有する糖質類縁体が、グルコースによって置き換えられうる理由を説明している。
【００２７】
先に開示したように、糖質類縁体（たとえば、米国特許第６２３２１３０号のもの）は、糖質と、エネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分とが複合した球状タンパク質を含む。そのような分子では、糖質と、エネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分とが位置を固定する。これは、複数の糖質部分がレクチンＣＲＤに結合することを可能にする構造を、糖質類縁体が必ずしも採用できるとは限らないことを意味する。
【００２８】
また、そのような糖質類縁体における、糖質とエネルギー供与体部分またはエネルギー受容体部分との相対的位置決めは、被検体類縁体と糖質結合部分とが結合した時、エネルギー供与体部分と受容体部分との間の最適相互作用を可能にしないかもしれない。これは、ＦＲＥＴに影響し、光信号を弱めるであろう。
【００２９】
最後に、これらの被検体類縁体は、生理的カルシウム濃度（典型的には、１．１５〜１．２９ｍＭ）で、レクチンに結合しないことが多い。ＭＢＬに対するマンノース複合糖質の最適な結合に必要なカルシウム濃度は、約２０ｍＭであることがわかっている。
【００３０】
糖質ポリマー（たとえば、場合によっては誘導化されたデキストランおよびマンナン）も、糖質類縁体として使用されてきた。国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１３１１４号明細書（国際公開公報第０６／０６１２０７号）では、過ヨウ素酸塩の開裂を使用して、生理的カルシウム濃度でデキストランをＭＢＬに結合させることが開示されている。
【００３１】
しかし、そのようなデキストラン誘導体の合成は複雑である（特に、エネルギー供与体または受容体を糖質類縁体に結合させるために、アミン基を導入することが必要であるため、これが望ましくない沈殿を起こす架橋を誘発することになりうる）。
【００３２】
また、糖質部分が糖質ポリマーの骨格構造単位であるという事実は、糖質部分の数を容易に調整することができないことを意味する。あるデキストラン誘導体は、生理的グルコース濃度で、グルコースによって、容易に置き換わらず、したがって、アッセイ感度が低いことが本発明者らによって発見されている。
【００３３】
最後に、生理的カルシウム濃度でのＭＢＬへの結合は、まだ幾分弱い。
【特許文献１】欧州特許第０５６１６５３号
【特許文献２】国際公開公報第９１／０９３１２号
【特許文献３】国際公開公報第９７／１９１８８号
【特許文献４】国際公開公報第００／０２０４８号
【特許文献５】国際公開公報第０３／００６９９２号
【特許文献６】国際公開公報第０２／３０２７５号
【特許文献７】国際公開公報第０６／０６１２０７号
【特許文献８】国際公開公報第０６／０６１２０８号
【特許文献９】米国特許第６２３２１３０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
本発明者らは、今、グルコースまたは他の糖質の新しいタイプの類縁体を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
第一態様では、本発明は、流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない材料によって保持された検出可能または測定可能な光信号であり、アッセイ成分は、
近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの１つで標識化された糖質結合分子と；
糖質結合分子に結合するための被検体と競合することができる糖質類縁体であって、糖質類縁体は柔軟性のある水溶性ポリマーであり、
モノマー単位残基が、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう一方であるペンダント部分とを有する、モノマー単位の重合残基、および／または第一モノマー単位残基がペンダント糖質部分または糖質様部分を有し、第二モノマー単位残基が近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアのもう一方であるペンダント部分を有する、第一モノマー単位および第二モノマー単位の共重合化残基を含む糖質類縁体と
を含むセンサーに関する。
【００３６】
第二態様では、本発明は、前記ポリマーを製造する方法であって、以下の工程の１つを含む方法に関する：
ａ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合すること；
ｂ）それぞれ糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合すること；
ｃ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いで、モノマー単位残基を、近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｄ）それぞれペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで第二モノマー単位残基を近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｅ）それぞれ、糖質部分または糖質様部分にリンクするためのペンダント官能基と近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いでモノマー単位残基を糖質部分または糖質様部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；または
ｆ）それぞれ糖質部分または糖質様部分にリンクさせるためのペンダント官能基を有する第一モノマー単位と、それぞれ近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで糖質または糖質様部分を持つ第一モノマー単位残基と、近接度に基づいた信号発生／変調部分を持つ第二モノマー単位残基とを反応させること。
【００３７】
ポリマーを製造する類似の方法であって、重合前に近接度に基づいた信号発生／変調部分が単一または第二モノマー単位中に存在し、重合後に糖質または糖質様部分が導入される方法も本発明の範囲内であるが、これは好ましくはない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
被検体は単糖類が好ましい。好ましい実施形態では、被検体はグルコースである。
【００３９】
好ましくは、センサーは、体液、たとえば皮下液中のグルコースの検出または測定に適している。センサーとしては、インビボでの使用に適することが望ましく、このことは以下でさらに詳しく検討する。
【００４０】
糖質類縁体は、生理的カルシウム濃度で、グルコースと競合できることが好ましい。
【００４１】
糖質類縁体
【００４２】
用語「糖質」は、糖類を含む。
【００４３】
アッセイは、０〜３５ｍＭのグルコースの範囲の少なくとも一部、たとえば、０〜２５ｍＭのグルコースの範囲の濃度で、血糖値を測定することができるのが好ましい。ＩＣ50値は約１５ｍＭグルコースであるのが適切である。アッセイは、２〜１０ｍＭのグルコースの範囲のグルコース濃度を測定することができるのがより好ましい。この範囲内でできる限り直線に近い投与量−応答曲線が望ましい。
【００４４】
タンパク質または多糖類の誘導体化より人工ポリマーの合成のほうが、アッセイ効率を向上させるために、ポリマーのパラメータ（たとえば、分子の柔軟性、水溶解性、分子量、糖質または糖質様部分の性質、糖質または糖質様部分の数、近接度に基づいた信号発生／変調部分の数）を簡単に調整させ、アッセイ効率を向上させる。多糖類と比較して、合成ポリマーは、糖質部分の数を、ポリマーの長さとは別個に調整することができるという利点がある。さらに、ポリマー中に２−ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）のような環を含有しないモノマー類を使用することで、デキストランと比べて、分子の回転的な柔軟性が増加する。
【００４５】
この理論に縛られるものではないが、先に記載したように、本発明者らは、近接度に基づいた信号発生／変調部分が結合部分に接近し、強い信号を発生することが重要であると考える。球状のリガンドは、結合部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分を、これらが近くなるよう、球面上に集める。直鎖状のデキストランでは、骨格は結合部分からなり、その結果、結合が近接度に基づいた信号発生／変調部分に近いかあるいは離れているかを調整することができない。合成ポリマーでは、これを、結合部分を近接度に基づいた信号発生／変調部分に配置することによって調整することができる。
【００４６】
したがって、ポリマーは、非糖質骨格を有することが好ましい。
【００４７】
用語「柔軟性のある」は、大きく単量体間回転し得るポリマーを含む。ポリマーは、ペンダント糖質部分や糖質様部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分以外は、嵩高い基（たとえば、環構造、ｔ−ブチル基または他の立体的に大きな基）は含まないのが好ましい。そのようなポリマーは、骨格構造中の二重結合が非常に少ない（たとえば、１０％未満）ことが好ましい。そのようなポリマーは、球状三級構造を持たないのが適切であるが、そのような構造を持っていてもよい。
【００４８】
ポリマーは、非分岐状であるのが好ましい。これによりポリマーの柔軟性が改良される。しかし、ポリマーは、ある程度分岐してもよく、また架橋してもよいが、ただし、これによってヒドロゲルが形成されないことが条件である。たとえば、全分子量が１００ｋＤａのポリマー中で、１〜５個の分岐が許容される。
【００４９】
用語「水溶性」は、室温での水溶性が少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、たとえば少なくとも１００ｍｇ／ｍｌのポリマーを含む。溶解度は、体温でより高くなる。以下で検討するように、体内でセンサーを使用する時、ポリマーが組織流に溶解するように、ポリマーは水溶性であることが重要である。ポリマーは、ＭＢＬなどの糖質結合分子に結合した時であっても、水溶性であるべきである。
【００５０】
ポリマーは、１以上５タイプまでのモノマー単位を含むのが好ましく、より好ましくは３以上のモノマー単位を含む。
【００５１】
ポリマーとしては、ペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位残基と、ぶら下がっている、近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する第二モノマー単位残基とを含むコポリマーが適切である。あるいは、またはそれに加えて、ペンダント糖質部分または糖質様部分およびぶら下がっている、近接度に基づいた信号発生／変調部分の両方を有する単一のモノマー単位残基を使用してもよい。第一および第二モノマー単位の使用が好ましい。そうすれば、糖質部分または糖質様部分と近接度に基づいた信号発生／変調部分との量を独立して制御することができる。
【００５２】
単一のモノマー単位の残渣が存在する場合、該単位のそれぞれが、ペンダント糖質または糖質様部分と、ペンダント近接度に基づいた信号発生／変調部分との両方を有し、第一モノマー単位残基および第二モノマー単位残基が存在する場合、第一の単位のそれぞれがペンダント糖質または糖質様部分を有し、第二の単位のそれぞれがペンダント近接度に基づいた信号発生／変調部分を有するのが好ましい。
【００５３】
第一モノマー単位残基および第二モノマー単位残基は、これらが先に説明した異なるペンダント基を有するのはもちろん、構造においても異なることが好ましい。
【００５４】
コポリマーとしては、ランダムコポリマーが好ましい。しかし、交互コポリマーを使用してもよい。大きなブロックを持つブロックコポリマーの使用は好ましくない。しかし、低分子量（たとえば、１〜３ｋＤａ）のブロックコポリマーは使用してもよい。
【００５５】
ＭＢＬを用いるアッセイにおいて糖質結合分子として使用する場合、該ポリマーは、０ｍＭのグルコースで、アミノデキストランの少なくとも５０％強くＭＢＬに結合するのが好ましく、より好ましくは、少なくともアミノデキストランと同じくらい強く結合するが、より簡単に抑制される。ポリマーは、０〜３５ｍＭのグルコースの範囲で簡単に抑制される（全位相応答の大部分）が特に望ましく、とりわけ２〜１５ｍＭの範囲が望ましい。これによって、特に生理学的に関心のあるグルコース濃度にわたりアッセイが提供され、これはアミノデキストランをグルコース類縁体として使用する類似のアッセイより感度が高い。
【００５６】
複数のタイプの糖質部分または糖質様部分を有するモノマー単位残基が存在してもよい。糖質部分または糖質様部分は異なってもよく、ＭＢＬに対し異なる親和性および類似のレクチンを有してもよい。
【００５７】
同様に、近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する複数の種類のモノマー単位残基を使用してもよい。近接度に基づいた信号発生／変調部分は異なってもよい。
【００５８】
必ずしも、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）が二重結合を含む必要はない。
【００５９】
そのようなポリマーの使用における適切な糖質部分の例として、単糖類およびオリゴ糖類が挙げられる。
【００６０】
糖質部分は、レクチン、特にＭＢＬおよび他のヒトまたはヒト化レクチンおよび／または植物レクチンコンカナバリンＡに対して高い親和力を持つことが好ましい。
【００６１】
本発明者により、ＭＢＬに対する通常の糖質部分の親和力は、以下であることが発見されている。
【００６２】
Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノースアミン、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ロイクロース、エルロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｌ−フコース＞ミオイノシトール、Ｄ−グルコース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−リボース、Ｄ−タガトース＞Ｄ−リキソース＞ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクトース。
【００６３】
糖質部分は、ＭＢＬに関する親和力が低いガラクトースでないことが好ましい。
【００６４】
コンカナバリンＡに関する通常の糖部分の親和力は、以下の通りである。(Van Dammeら, Handbook of Plant Lectins: Properties and Biomedical Applications, Wiley & Sons,1998,p.142)
【００６５】
マンノース＞グルコース＞Ｎ−アセチルグルコサミン。
【００６６】
適切な単糖類としては、場合によっては誘導化されたテトロース類、ペントース類、ヘキソース類、ヘプトース類または高級同族アルドース類またはケトース類、たとえば、場合によっては誘導化されたＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコースアミン、Ｌ−フコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−タガトースまたはＤ−ソルビトールである。
【００６７】
適切なオリゴマーとして、たとえば２〜５０個の糖質単位を含有する直鎖または分岐状のホモオリゴマーまたは混合オリゴマーであってもよい。
【００６８】
糖質結合分子としてＭＢＬと共にポリマーが使用される場合、１→３および１→４グリコシル化はＭＢＬ結合を妨害することが予想されるので、好ましいグリコシル化は、１→６または１→２である。たとえば、ノナ（１→６）−α−グルコース（デキストラン１５００Ｄａ）は、１，３−β−Ｄ−グルコース類（たとえば、ラミナナリヘキサオース（laminanarihexaose)）よりＭＢＬに対し結合力が高いことが予測される。適切なオリゴ糖として、パンノース（ｐａｎｎｏｓｅ）、マルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、Ｄ−ロイクロース、エルロース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノースまたは１〜２５０ｋＤａのデキストラン（好ましくは、１〜４０ｋＤａのデキストラン、たとえば、１ｋＤａ、１．５ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａまたは４０ｋＤａのデキストラン）が挙げられる。
【００６９】
糖質結合分子としてコンカナバリンＡとともにポリマーが使用される場合、１→６グリコシル化は、Ｃ６−ＯＨ水酸基を介してコンカナバリンＡ結合を妨害することが予想される。この場合、好ましい糖質部分として、場合によっては誘導化されているマンノース、マルトース、イソマルトース、グルコースおよびソホロース（ガラクトースではない）、特にα−Ｄ−マンノピラノシド類（α−Ｄ−Ｍａｎｐ）、α−Ｄ−グルコピラノシド類（α−Ｄ−Ｇｌｕｐ）およびα−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンピラノシド類（α−Ｄ−ＧｌｕＮＡｃｐ）が挙げられる。
【００７０】
ポリマーとして、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ロイクロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチル−マンノースアミン、Ｄ−アラビノース、ミオイノシトール、Ｄ−タガトース、エルロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−パラチノース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リボース、Ｄ−ソルビトールから選択される少なくとも１種の糖質部分を含むのが好ましい。
【００７１】
該ポリマーとしては、少なくとも１種のグルコース部分および／または少なくとも１種のＮ−アセチルグルコサミン部分および／または少なくとも１種のマンノース部分を含むポリマーがより好ましく、これらの部分は、ＭＢＬおよび他の動物レクチンに対し高い親和力を有するからである。これらの部分は、Ｃ３およびＣ４水酸基を介してレクチンの結合部位に結合すると考えられる。
【００７２】
合成分岐状糖類の例として、デンドリマーを構成するために使用されるデンドリマー「ウェッジ」（たとえば、以下に示す、アミンリンカーを持つＴＲＩＳ誘導三糖類）がある。
【化１】
【００７３】
用語「糖質模倣物」として、糖質を正常に結合する部位に結合する非糖質分子、たとえば、グルコースと競合しＭＢＬに結合することができる非糖質分子が挙げられる。適切な糖質様部分として、Ｎ−アセチルグルコサミンを模倣するケラチンペプチド（ＳＦＧＳＧＦＧＧＧＹ）のようなペプチド類が挙げられる。ケラチンペプチドは、ＭＢＬを抑制できることが示されている(Mantactoら，2001、 J.Immunol. 166, 4148-4153)。
【００７４】
第一モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、糖質部分または糖質様部分の二重結合含有誘導体であるのが適切である。しかし、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、適切には重合後、糖質部分または糖質様部分がリンクし得る官能基を含む、二重結合含有分子であってもよい。
【００７５】
糖質部分または糖質様部分の二重結合含有誘導体は、糖質部分または糖質様部分のアリルまたはビニル含有誘導体であるのが好ましい。糖質部分または糖質様部分の他の適切な二重結合含有誘導体として、アリル誘導体の相同体、たとえば、３−ブテニルまたは４−ペンテニル誘導体、または４位に糖質部分または糖質様部分を持つスチレン誘導体が挙げられる。糖質部分または糖質様部分のさらに適切な二重結合含有誘導体として、ＨＥＡ、２−ヒドロキシエチルメタアクリレート（ＨＥＭＡ）またはビニルアルコール（ＶＡ）系誘導体が挙げられる。
【００７６】
糖質部分または糖質様部分は、第一モノマー単位（または単一モノマー単位）のアミン、酸、アルコールアルキン、アジドおよび／またはスルホン官能基とリンクしてもよい。たとえば、モノマー単位中のアルコール基および糖質部分または糖質様部分中のアミン基は、ジビニルスルホンを使用してリンクしてもよい。糖質がマンノースの場合、これらはＭＢＬへの結合で重要なので、Ｃ３−ＯＨまたはＣ４−ＯＨ基を介して結合を形成することは好ましくない。この場合、ジビニルスルホン結合は不適切である。
【００７７】
アミノ誘導体化糖質部分は、二糖類の還元アミノ化によって製造することができる。これは糖質部分をそのアノマー位（Ｃ１）でリンクさせる。
【００７８】
糖質部分または糖質様部分は、フィッシャーグリコシド化によってアルコール基（たとえば、ＨＥＡ中）に結合することができる。
【００７９】
好ましい実施形態では、第一モノマー単位は、それぞれ、１−アリル−α−Ｄ−マンノピラノシド、１−アリル−２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシドおよび／または１−アリル−α−Ｄ−グルコピラノシドである。
【００８０】
第二モノマー単位（または単一モノマー単位）は、それぞれ、適切には重合後、近接度に基づいた信号発生／変調部分部分がリンクし得る官能基を含む、二重結合含有分子が適切である。適切な官能基として、酸、アルコールおよび／またはスルホンが挙げられる。重合後の結合は、高価な近接度に基づいた信号発生／変調部分の損失を最小にするのを助ける。
【００８１】
しかし、第二モノマー単位（あるいは単一モノマー単位）は、近接度に基づいた信号発生／変調部分を含んでもよい。この場合、適切な重合性基および結合の上記の検討が適用される。
【００８２】
好ましい実施形態では、第二モノマー単位は、それぞれ、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドまたはその誘導体である。
【００８３】
好ましい実施形態では、単一モノマー単位は、それぞれ、リシンの誘導体を含む、二重結合含有糖質部分または糖質様部分である。例を以下に示す（多段反応スキーム）：
【化２】
【００８４】
（１）グルコサミド
【００８５】
この反応スキームにおける出発材料は、PolysSciences Europe (Eppelheim, Germany）を通じて入手可能なメタアクリロイル−Ｌ−リシンである。重合後、α−アミン基は、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクすることができる。
【００８６】
ポリマーは、さらに、ペンダント糖質部分、糖質様部分または近接度に基づいた信号発生／変調部分を有さない第三モノマー単位残基を含むのが好ましい。これは柔軟性を増やすのを助ける。
【００８７】
第三モノマー単位残基は、構造が、単一モノマー単位残基、第一モノマー単位残基および／または第二モノマー単位残基と異なることが好ましい。（これらが先に説明した異なるペンダント基を有することは言うまでもない。）
【００８８】
柔軟性は、ＨＥＡなどの立体障害のない第三モノマー単位を使用することによって増やす。また、柔軟性は、帯電していない第三モノマー単位を使用することによっても増やす。第三モノマー単位を含まないポリマーは、静電反発力のため、柔軟性の減少を最小限にするために不活性化する必要のある、プラスに帯電しているアンモニウム基を数多く持つ。
【００８９】
複数のタイプの第三モノマーをポリマーに含ませることができる。
【００９０】
第三モノマー単位は、それぞれ、たとえば水酸基などの親水性基を含む二重結合含有分子であるのが好ましい。第三モノマー単位として、スチレンなどの親油性二重結合含有分子であるのは好ましくない。
【００９１】
好ましい実施形態では、第三モノマー単位は、それぞれ、ＨＥＡ、ビニルピロリドン、ＭＭＡ、ＨＥＭＡ、ビニルアルコールおよび／またはエチレングリコールである。しかし、当業者であれば、使用することのできる親水性基を含む他の多くの二重結合含有分子があることを理解するであろう。
【００９２】
モノマー単位は付加重合によって反応するのが適切である。付加重合は、たとえば、過硫酸カリウム（ＰＰＳ）または他の過酸化化合物を使用する、遊離基開始重合であってもよい。
【００９３】
重合方法は、たとえばトルエンと水との混合物中での乳化重合（米国特許第４９５２６５６号に検討されている）であってもよい。界面活性剤は乳化重合反応混合物中に含有されるのが適切である。界面活性剤は、重合後に乳化除去および透析によって除去することができる。あるいは、重合は、単一相、たとえば水中で行ってもよい。
【００９４】
乳化重合は、単一相の重合と比較して、より低い平均分子量およびより狭い分子量分布を有するポリマーを与えると考えられる。
【００９５】
開始剤を加える前にモノマー単位を混合するのが適切である。
【００９６】
重合反応は２日未満かかるのが好ましい。重合の長さは、コポリマー生成物の分子量を制御するために使用することができる。
【００９７】
重合反応は、酸素がない条件、たとえば、窒素雰囲気下で行われるのが適切である。
【００９８】
重合反応は、０℃と１００℃との間の温度、たとえば、室温または６０℃で行われるのが適切である。
【００９９】
他の可能な重合として、縮合重合（たとえば、イオン縮合重合）、開環重合および原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）が挙げられる。当業者であれば、モノマー単位に性質が、重合の所望の方法に依存する（たとえば、二重結合含有モノマー単位は、縮合重合の必要はない）ことを理解するであろう。
【０１００】
単一モノマー単位を使用しない場合、第一モノマー単位は、反応混合物中に２０〜７０モル％（あるいは２０〜７０重量％）の量、たとえば、３０〜５０モル％（あるいは３０〜５０重量％）の量で存在してもよい。しかし、第一モノマー単位は、反応混合物中に、好ましくは７０モル％〜９０モル％の量、より好ましくは７５モル％〜８５モル％の量、たとえば、８０モル％存在する。そのような量の第一モノマー単位を使用することにより、ポリマー溶液の安定性が向上することが発見されている。発明者らが経験した安定性の問題は、溶解性に関連し、ポリマーの沈殿する傾向および乾燥後の溶解しない傾向に現れる。
【０１０１】
第二モノマー単位は、反応混合物中に５〜１５モル％（あるいは５〜１５重量％）の量で存在するのが好ましい。
【０１０２】
第三モノマー単位を使用する場合、それらは、反応混合物に、残りを構成する量、たとえば、０〜８０モル％（あるいは０〜８０重量％）の量で存在するのが好ましい。
【０１０３】
ポリマーの組成は、反応混合物中に存在するモノマー単位の量を正確に反映しないことは理解されるであろう。これは、他の要因（たとえば、立体障害および溶解性）の影響があるためである。
【０１０４】
ポリマー糖質の含有率は、１０〜２０重量％の範囲が適切である。しかし、ポリマー糖質含率は、４０〜５０重量％の範囲が好ましい。（これらの範囲は、特にマンノースに関して適切で、より高い糖質含率は、グルコースに適切である場合もある。）ポリマー糖質の含有率は、ある糖質類（マンノース、グルコース、ガラクトース、キシロース、フコースおよびガラクルトン酸を含む）に関しては、実施例Ａ７に記載するように測定することができるが、他のもの（Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルノイラミン酸を含む）はこの方法では測定できない。
【０１０５】
また、糖質類縁体は、２以上の分離した実体（これらは一緒に糖質類縁体として作用する）から構成されてもよいことも留意すべきである。特に、糖質類縁体は、少なくとも２個の糖質類縁体部分を持つ第一実体と、レクチンなどの糖質結合分子である第二実体とで構成されていてもよい。たとえば、受容体標識化されたＭＢＬおよび供与体標識化されたＭＢＬを、標識化されていない合成ポリマーとともにテンプレートとして使用し、ＦＲＥＴが起こるように、互いの接近性において供与体標識化されたＭＢＬおよび受容体標識化されたＭＢＬをもたらすことができる。（コンＡを使用する例が、Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉら（２００２）Chemistry and Biology 9,第ｌ６３頁にある）。（同様に、受容体標識化ポリマーおよび供与体標識化ポリマーも、標識されていない糖質結合分子とともに使用することができる。）
【０１０６】
糖質類縁体は、１種以上のエネルギー受容体部分（たとえば、以下で検討する、ＨＭＣＶ−１またはAlexa Fluor 594（商標））を含むことが好ましい。しかし、１種以上のエネルギー供与体部分を含んでもよい。
【０１０７】
近接度に基づいた信号発生／変調部分は、前記糖質または糖質様部分との関連で検討したように、糖質類縁体に結合されてもよい。
【０１０８】
好ましい実施形態では、活性化されたカルボン酸誘導体（たとえば、スクシンイミジルエステルのような活性エステル）であって、近接度に基づいた信号発生／変調部分に適切に結合されたカルボン酸誘導体は、モノマー単位またはポリマーに適切に結合された求核基（たとえばアミン）と反応する。そのような反応は、極性非プロトン溶剤（たとえばＤＭＳＯ）中で行ってもよい。反応温度は、０℃〜１００℃の範囲、たとえば、室温が適切である。
【０１０９】
近接度に基づいた信号発生／変調部分を結合する別の方法では、アジド基とアルキン基との間のフィスゲン１，３双極環状付加（B. Sharplessによって開発されたような）を使用する。
【０１１０】
糖質類縁体は、センサーからの逸脱を阻止するくらい高く、しかし糖質類縁体が糖質結合分子に結合した時、沈殿を起こさない程度に低い分子量を持つべきである。
【０１１１】
糖質類縁体の平均分子量は、２５〜２５０ｋＤａの範囲が好ましく、さらに好ましくは、１００〜２５０ｋＤａ、たとえば、１５０ｋＤａである。
【０１１２】
場合によっては、糖質類縁体および糖質結合分子は、互いに連結している。
【０１１３】
糖質結合分子
【０１１４】
糖質結合分子は、アッセイにおいて、少なくとも１０日間、安定した信号を提供するのが好ましく、少なくとも１４日間提供するのがさらに好ましい。センサーが人体内に挿入された時、安定した信号が提供されるのが、特に好ましい。
【０１１５】
糖質結合分子としては、レクチンが好ましく、動物レクチンがさらに好ましい。しかし、他の種類の糖質結合分子、たとえば抗体、またはコンカナバリンＡのような植物レクチンであってもよい。
【０１１６】
好ましくは、前記レクチンは、Ｃ型（カルシウム依存性）レクチンである。
【０１１７】
動物レクチンは、脊椎動物レクチン、たとえば、哺乳動物レクチンが好ましく、ヒトまたはヒト化レクチンがさらに好ましい。しかし、代わりに、トリレクチン、ウオレクチンまたは昆虫レクチンなどの無脊椎動物レクチンであってもよい。
【０１１８】
レクチンは人体由来のヒトレクチンが適切である。代わりに、レクチンは組換え製造されたレクチンであってもよい。
【０１１９】
さらなる代替例として、レクチンは、ヒト化動物レクチン、たとえば、ヒト化ウシレクチンであってもよい。これは、対応するヒトレクチンがあるところに適用される。レクチンは、抗体に類似の方法でヒト化してもよい。
【０１２０】
レクチンは多量体形態であるのが適切である。多量体レクチンは、人体または動物体由来であってもよい。あるいは、レクチンは、単量体形態であってもよい。単量体レクチンは、組換え方法によって、または人体もしくは動物体由来の天然多量体レクチンにおけるサブユニット間の結合を破壊させることによって形成してもよい。この例は米国特許第６２３２１３０号に記載されている。
【０１２１】
レクチンは３個以上のＣＲＤを有するのが好ましい。レクチンは６個以上のＣＲＤを有するのがさらに好ましい。
【０１２２】
レクチンはコレクチン（コラーゲン様レクチン）であるのが好ましい。これらは、コラーゲン様配列（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレット）を持つＣ−型動物レクチンである。ＭＢＬはＣ−型コレクチンであり、一方でコンカナバリンＡはＣ−型レクチンである。単量体コレクチンＣＲＤは、コラゲナーゼの作用によって製造することができる。
【０１２３】
レクチンは、マンノース結合レクチン、コングルチニンまたはコレクチン−４３（たとえば、ウシＣＬ−４３）（全血清コレクチン）または肺界面活性タンパク質（肺コレクチン）が好ましい。
【０１２４】
レクチンは、実質的に三量体および／または四量体形態であるＭＢＬが適切である。
【０１２５】
あるいは、レクチンは、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄから選択される肺界面活性タンパク質であってもよい。これらのタンパク質は、ＭＢＬに類似する。
【０１２６】
他の適切な動物レクチンを、以下のリストに挙げる。
・ＰＣ−レクチン（米国特許公開公報第２００３０２１６３００号、米国特許公開公報第２００４０２６５８９８）
・ＣＴＬ−Ｉ（米国特許第１７９５２８／１０号）
・ケラチノサイト膜レクチン（Parfuemerie und Kosmetik74,164-80)
・ＣＤ９４(Eur J Immunol 25, 2433-7)
・Ｐ３５（同義語：ヒトＬ−フィコリン、レクチンのグループ）(Immunol Lett 67, 109-12)
・ＥＲＧＩＣ−５３（同義語：ＭＲ６０）（MoI Biol Cell, 7, 483-93)
・ＨＩＰ／ＰＡＰ(Eur J Biochem 267, 1665-71)
・ＣＬＥＣＳＦ８（Eur J Immunol 34, 210-20)
・ＤＣＬ（レクチンのグループ）（米国特許出願第００２３１９９６／ＵＳ号）
・ＧＬＵＴファミリータンパク質、特に、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４およびＧＬＵＴ１１（ＰＮＡＳ９７，１１２５−３０）
【０１２７】
さらに、適切な動物レクチンは、「Handbook of Animal Lectins: Properties and Biomedical Applications」, David C. Kilpatrick, Wiley 2000の付属書Ａ、ＢおよびＣに記載されている。
【０１２８】
糖質結合分子は、エネルギー供与体部分で標識化されているのが好ましい。
【０１２９】
検出
【０１３０】
適切な検出技術として、ＦＲＥＴ、蛍光エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光消光、リン光、ルミネセンス増強、ルミネセンス消光、回折またはプラズモン共鳴が挙げられる。
【０１３１】
光信号を発生する結合アッセイは、好ましくは、被検体の濃度変動の連続モニタリングが達成できるように、可逆的であるべきである。この可逆性は、アッセイの成分を消費しない、結合アッセイフォーマット使用の特別の利点である。
【０１３２】
検出可能なまたは測定可能な光信号は、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアを使用して発生させる。ペアの最初の構成要素が該ペアの第二の構成要素に接近した時、信号が発生しまたは変調される。
【０１３３】
近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアは、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分ペアであるのが好ましい。エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分は、それぞれ、供与体発色団および受容体発色団とも言う。蛍光を放射しないエネルギー受容体は、消光部分と言う。
【０１３４】
この場合、糖質結合分子を、エネルギー供与体およびエネルギー受容体部分ペアの１つで標識化し、糖質類縁体を、エネルギー供与体およびエネルギー受容体部分ペアのもう１つで標識化する。
【０１３５】
本発明のセンサーの最も好ましい実施形態は、前述のＦＲＥＴの技術を使用して光学読み出しを出すアッセイを組み込む。
【０１３６】
アッセイがインビボで使用される場合、供与体は５５０〜約７００ｎｍで蛍光を発し、受容体は約６５０ｎｍで光を吸収するのが望ましい。これにより、低波長での供与体蛍光とインビボ自己蛍光との間のオーバーラップを回避する。
【０１３７】
Alexa Fluor 594（商標）（たとえば、スクシンイミジルエステルとして）は、インビボで使用するための、適切な発光スペクトルを持つエネルギー供与体部分である。この染料は、５９４ｎｍで吸収し、６２０ｎｍで蛍光を発する。
【０１３８】
国際公開公報第０５／０５９０３７号に記載されているＨＭＣＶ染料は、本発明の用途にとって、適切なエネルギー受容体部分である。これらの染料は、安定化されたカルベニウムイオンである。例として、ヘキサメトキシ−クリスタルバイオレットスクシンイミジルエステル（ＨＭＣＶ−Ｉ）がある。
【０１３９】
あるいは、ＱＳＹ２１（商標）を、エネルギー供与体部分としてのAlexa Fluor 594（商標）とともに、エネルギー受容体部分として使用してもよい。
【０１４０】
蛍光寿命または蛍光強度の測定を行ってもよい。蛍光寿命は、位相変調技術（以下に検討）によって測定してもよい。
【０１４１】
好ましい実施形態では、糖質結合分子をエネルギー供与体部分としてAlexa Fluor 594で標識化し、糖質類縁体をエネルギー受容体部分としてＨＭＣＶ−Ｉで標識化し、蛍光寿命を位相変調技術によって測定する。
【０１４２】
アッセイ成分を保持する材料は、エネルギー供与体部分およびエネルギー受容体部分に十分な空間を提供し、互いに結合していない時は、エネルギー移動が中断できるように分離するのが好ましい。
【０１４３】
センサーの構造
【０１４４】
糖質結合分子のポリマーに対する比は、１〜１５（μＭ糖質結合分子）／（ｍｇ／ｍｌポリマー）が好ましく、１０（μＭ糖質結合分子）／（ｍｇ／ｍｌポリマー）が特に好ましい。
【０１４５】
ＭＢＬが糖質結合分子として使用される場合、比が１０（μＭ、ＭＢＬ）／（ｍｇ／ｍｌポリマー）になるまで、この比が上がるにつれ、アッセイ感度が増すことが発見されている。
【０１４６】
また、糖質結合分子のポリマーに対する比が高いものを使用すると、ポリマーは、アッセイの全強度を落とすことなく、ポリマーに含有されるべき信号変調部分の数をより大きくできる（したがって、位相シフトを増大し、その結果アッセイ感度を上昇さえる）。
【０１４７】
アッセイの成分は、被検体の拡散は可能にするがアッセイ成分の拡散は可能にしない孔径を有する材料によって保持されているのが好ましい。しかし、この選択性は、他の方法、たとえば、帯電していない材料の拡散を可能にする材料を使用することによっても達成される。
【０１４８】
アッセイの成分は、シェルまたはマトリックス材料によって保持されるのが好ましい。糖質類縁体および／または糖質結合分子は、この材料にグラフトされてもよい。材料は、国際公開公報第００／０２０４８号に記載のような生分解性であることはより好ましい。場合によっては、センサーは、国際公開公報第０３／００６９９２号に記載のような、生分解性材料のシェルによって保持された小粒子を含んでもよい。
【０１４９】
好ましい実施形態では、国際公開公報第２００５／１１０２０７号に記載されるような、グルコースをアッセイ成分に接触させながら、アッセイの成分を、アッセイ成分を封入する生分解性材料のシェルによって保持し、該生分解性材料は、疎水性および親水性単位を有するコポリマーを含む。
【０１５０】
１個以上のアッセイ成分チャンバーがシェル内に存在してもよい。
【０１５１】
コポリマーはランダムコポリマーが好ましい。
【０１５２】
コポリマーの透過性は、少なくとも５．０×１０-10ｃｍ2／ｓであるのが好ましい。
【０１５３】
用語「透過性」は、実験的に測定することができる水和コポリマーによる、被検体（グルコース）の全透過性を言うために使用する。
【０１５４】
一度体内に移植されると、該コポリマーは１週間から１年の期間、たとえば３０日間にわたって分解するのが好ましい。代表的なポリマー厚さである５μｍに関して、これは０．１７μｍ／日の分解速度に相当する。
【０１５５】
グルコースの移動性に関して、生分解性材料の分子量カットオフ限界は、２５０００Ｄａ以下が好ましい。より好ましくは、生分解性材料の分子量カットオフ限界は、１００００Ｄａ以下である。
【０１５６】
疎水単位の重量分率は、コポリマーの１０〜９０％が好ましく、より好ましくは、コポリマーの１０〜５０％である。
【０１５７】
各親水性単位の分子量は、２００〜１００００Ｄａが好ましく、より好ましくは４００〜４０００Ｄａである。
【０１５８】
コポリマーの親水性単位は、それぞれ、ポリエチレングリコールと二価の酸とのエステルを含むのが好ましい。ポリエチレングリコールの代わりのものとして、エチレングリコールとプロピレングリコールとの混合ポリマーを使用してもよく、および／またはポリエーテル骨格は、疎水性基および／または親水性基で置換されてもよい。ポリエチレングリコールのさらなる代わりのものとして、ポリテトラヒドロフラン（ポリ−ＴＨＦ）を使用してもよい。
【０１５９】
親水性単位は、テレフタル酸および／またはコハク酸を二価の酸として含むことが好ましい。他の適切な二価の酸として、シュウ酸、酒石酸、フタル酸、アスパラギン酸、マロン酸、およびオリゴマーまたはポリマーの二価の酸、たとえば、ポリ（ダイマー酸−セバシン酸）がである。好ましい実施形態では、二価の酸はテレフタル酸のみである。代わりの好ましい実施形態において、テレフタル酸のコハク酸に対するモル比は、１：２〜２：１であり、１：１が適切である。
【０１６０】
あるいは、コポリマーの親水性単位は、オリゴマーを含んでもよい。適切なオリゴマーは、ヒドロキシエチルメタアクリレート（ＨＥＭＡ）、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、糖質、エチレンオキサイドおよび／または２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸のオリゴマーである。親水性単位がＨＥＭＡを含む場合、生分解性結合（たとえば、テレフタレート結合などのエステル結合）がポリマー内にあり、生分解性が増す。
【０１６１】
各疎水性単位の分子量は、４００〜５０００Ｄａが好ましい。
【０１６２】
コポリマーの疎水性単位は、ブタン−１，４−ジオールと二価の酸とのエステルを含むのが好ましい。ブタン−１，４−ジオールの代わりとして、ペンタン−１，５−ジオールまたはヘキサン−１，６−ジオールを使用してもよい。
【０１６３】
疎水性単位が、二価の酸としてテレフタル酸および／またはコハク酸を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、テレフタル酸のコハク酸に対するモル比は、１：２〜２：であり、１：１が適切である。あるいは、疎水性単位は、二価の酸として、テレフタル酸のみを使用するのがよい。他の適切な二価の酸は先に記載されている。
【０１６４】
あるいはコポリマーの疎水性単位は、メチルメタアクリレート（ＭＭＡ）、ポリウレタンおよび／またはアミド（たとえば、ナイロン−６、オリゴ−Ｎ−三級ブチルアクリルアミドまたはオリゴ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）のオリゴマーを含み得る。疎水性単位がＭＭＡを含む場合、生分解性結合（たとえば、テレフタレート結合などのエステル結合）は、ポリマー内に提供され、生分解性を増す。
【０１６５】
好ましいポリマーは、一般式：ａＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）ｂＰＢ（Ｔ／Ｓ）ｃ（式中、「ａ」は、ＰＥＧ鎖の分子量を示し、「ｂ」は、得られたポリマー中のＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）（ポリエチレングリコールテレフタレート／サクシニレート）の重量分率を示し、「ｃ」は、得られたポリマー中のＰＢ（Ｔ／Ｓ）（ポリブチレンテレフタレート／サクシニレート）の重量分率を示す）で表される。このようなポリマーの例として、６００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、２０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、４０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０、１０００ＰＥＧＴ５０ＰＢＴ５０および１０００ＰＥＧ（Ｔ／Ｓ）６０ＰＢ（Ｔ／Ｓ）４０（Ｔ／Ｓ ５０％）がある。ポリマーは、生分解性であり、高グルコース透過性を有し、その分子量カットオフ特性は、約２５０００Ｄａである。
【０１６６】
これらのポリマーのいくつかが米国特許第６３８３２２０号明細書および欧州特許第１２４７５２２号に開示されている。
【０１６７】
コポリマーの外皮の厚さは１〜５０μｍであるのが好ましい。
【０１６８】
第三の態様では、本発明は、本明細書で記載したセンサーを製造する方法に関する。
【０１６９】
ポリマーマイクロカプセルの製造のための化学的方法として、相分離（コアセルベーション）、溶剤蒸発および／または抽出が挙げられる。
【０１７０】
ポリマーマイクロカプセルを製造する適切な物理的方法として、噴霧乾燥、スプレー被覆、スプレー冷却、回転円盤式アトマイゼーション、流動床被覆、共押出し（たとえば、固定ノズル共押出し、遠心性ヘッド共押出しまたは水中ノズル共押出し）およびパンコーティングが挙げられる。
【０１７１】
センサー用途
【０１７２】
第四の態様では、本発明は、本明細書で記載したセンサーを使用して、糖質被検体を検出する方法であって、センサーを哺乳動物の皮膚に移植すること、および外部光学的手段を使用して糖質被検体を検出または測定することを含む方法に関する。
【０１７３】
第五の態様では、本発明は、前記センサーを使用して糖質被検体を検出する方法であって、哺乳動物の皮膚内または下に存在するセンサーの照射による外部光学的手段を使用して、糖質被検体を検出または測定することを含む方法に関する。
【０１７４】
該方法は、さらにセンサー中で生分解性材料を分解することを含むのが好ましい。
【０１７５】
センサーは、注射によって、好ましくはシリンジを用いて、あるいは他の方法で、特に国際公開公報第００／０２０４８号に記載されている任意の方法によって、皮膚内に導入してもよい。センサーは、患者への不快感を最小にするため、狭いゲージ針によって注射するのに適したサイズのものが好ましい。センサーの最高寸法は、２０μｍ〜１ｍｍが好ましい。しかし、大きな最高寸法を持つロッド型のセンサーを使用してもよい。
【０１７６】
センサーは、真皮の厚さ内あるいは皮下に導入してもよいし、表皮に導入してもよいが、後者の場合、もしかしたら、生分解性材料が分解する前に、表皮層の成長によって皮膚から排出される可能性がある。
【０１７７】
センサーは皮膚内に配置されるので、センサーにて発生する光信号は、経皮的に（すなわち、皮膚の上位層を通して）検出されるのが好ましく、したがって、センサーと感染をもたらし得る外部環境との間の任意の直接接触を未然に防ぐ必要がある。
【０１７８】
しかし、代わりに、皮膚を介して光を通すことなくセンサーが外部光学的手段によって照らされるのを可能にする、中空または透明手段（たとえば、針または光ファイバー）を介して検出を行ってもよい。
【０１７９】
一度センサーが皮膚の位置に置かれると、悪影響を起こすことなく必要な回数だけ被検体測定を行うことができる。もしグルコース測定がより頻繁に行われれば、厳密な制御を、血中のグルコースの濃度において維持することができ、不満足に調整された血糖に関連する状態を発症するリスク、たとえば、網膜疾患、腎臓疾患、神経障害、一般的な小血管および大血管損傷、および循環不良を減少させるであろうから、これは、長期間治療の糖尿病患者に対して特に有利である。
【０１８０】
本発明のセンサーは、それ自身は、アッセイの読み出しを問い合わせするために必要な光学成分のいかなるもの（これらは体とは別に備えられ、体の外に置かれるのが好ましい）も含まないので、センサーを、患者に対して最小の不快感で注射し得る形態で、簡単に備えることができる。
【０１８１】
ＦＲＥＴの技術を使用する、アッセイを導入するセンサーには、エネルギー供与体部分の吸収スペクトル内の波長で入射光を供給し、放射された蛍光の強度または励起状態の寿命を測定することによって、問い合わせすることができる。一般的に知られている方法は以下の通りである。
【０１８２】
１．定常状態の測定
２．タイムドメイン寿命の測定
ａ．信号光子の計測
ｂ．ストリークカメラ
ｃ．ゲート検出（パルスサンプリング）
ｄ．アップコンバージョン
３．周波数ドメイン寿命の測定
ａ．位相変調蛍光光度法（ヘテロダイン検出）
ｂ．位相敏感検波法（ホモダイン検出）
該原理の更なる説明は、Lakowicz, J.R.「Principles of Fluorescence Spectroscopy，第二編」，１９９９にある。
【０１８３】
アッセイを問い合わせするための好ましい方法は、位相変調蛍光光度法である。
【０１８４】
アッセイを問い合わせするための適切な光学セットアップ（図１）は、エネルギー供与体部分の発光スペクトル内で光を放射する、光放射ダイオード（ＬＥＤ）１１で構成される。ＬＥＤは、好ましくは４５°の範囲で、充分な位相シフトとなる周波数で、ＬＥＤを調整する、ドライバ回路１３によって動作される。３ｎｓの寿命を持つ蛍光団に関して、好ましい周波数は、５０ＭＨｚである。ＬＥＤにより放射された光は、励起フィルター１５によってフィルターをかけられ、ダイクロイックビームスプリッター１７によってセンサー１６に向けられ、レンズ１９によって、注射されたセンサー１６上のセンサー／皮膚に集束される。センサーによって放射された蛍光は、レンズ１９によって集められる。光はダイクロイックビームスプリッターを通り、発光フィルター２１によりフィルターをかけられる。フィルターをかけられた光は、レンズ２３によって検出器２５、この場合アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）に集束される。ＡＰＤは、ＡＰＤバイアス供給２７によって逆バイアスされ、これは、信号処理およびコントロールユニット２９によって制御される。ＡＰＤからの信号は、トランスインピーダンス増幅器３１によって増幅され、バンドパスフィルター３３によってフィルターをかけられ、第一アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）３５によってサンプリングされる。対応して、ＬＥＤへの変調されたドライブ信号を、第二ＡＤＣ３７によってサンプリングする。第一ＡＤＣ３５上にサンプリングされた信号は、以下である。
【０１８５】
Ｙ1（ｔ）＝Ａ1*ｓｉｎ（２*π*ｆ*ｔ＋φf1＋φ1）
【０１８６】
Ａ1は、アッセイから検出された信号の振幅であり、ｆは変調周波数であり、φf1は、供与体蛍光団によって導入された位相差であり、φ1は、電子的光学的セットアップによって導入された固定位相差である。
【０１８７】
第二ＡＤＣ３７上にサンプリングされた信号は以下の通りである。
【０１８８】
Ｙ2（ｔ）＝Ａ2*ｓｉｎ（２*π*ｆ*ｔ＋φ2）
【０１８９】
Ａ2は、ＬＥＤへの変調ドライブ信号の振幅であり、φ2は、電気的セットアップによって導入された固定位相差である。
【０１９０】
信号処理およびコントロールユニットは、２つのサンプリングされた信号を比較し、電子機器および工学機器によって導入された固定および公知の位相差を相殺することによって、エネルギー供与体部分によって導入された位相差φf1を導き出す。
【０１９１】
測定は、皮膚に近い蛍光光度計を保持することによって、およびセンサーを有するアラインメントにおいて行う。位相差は、相−被検体−校正関数、たとえば、
被検体濃度＝Ａ＋Ｂｘ／（ｋ＋ｘ）
（式中、Ａは被検体不在時の相であり、Ｂは最大応答時の相であり、ｘは測定相であり、ｋは、受容体と被検体類縁体との間の解離定数である）を使用することによって、被検体濃度に変換する。
【０１９２】
代替測定技術は、蛍光強度の測定である。
【０１９３】
この場合、光学的手段は、エネルギー供与体部分の吸収スペクトル内での波長で入射光の第一ビームを、好ましくは、エネルギー受容体部分の吸収スペクトル内での波長で入射光の第二ビームを（これはエネルギー受容体部分も蛍光団であることに適用される）供給する必要がある。さらに、光学的手段は、好ましくは、センサー内で発生する光信号を、２つの異なる波長、すなわち、エネルギー供与体部分の発光スペクトル内で波長１（被検体の測定に関して発生する信号）およびエネルギー受容体部分（被検体信号、内部参照またはキャリブレーション信号であり得る）の発光スペクトル内では波長２で、測定することができる必要がある。
【０１９４】
蛍光光度計は、以下のパラメータを別々に測定する。
【０１９５】
波長１（エネルギー供与体部分）で
励起光強度、Ｉ（１，０）
周囲の光強度、Ｉ（１，１）
組合わせた蛍光の強度および周囲の光、Ｉ（１，２）
波長２（エネルギー受容体部分）で
励起光強度、Ｉ（２，０）
周囲の光強度、Ｉ（２，１）
組合わせた蛍光の強度および周囲の光、Ｉ（２，２）
再び、測定を、皮膚に近い蛍光光度計を保持することによって、およびセンサーを有するアラインメントにおいて行う。センサー内に発生した蛍光信号の経皮的測定を行う時は、皮膚による信号の吸収を考慮することが必要である。ヒト皮膚の吸収率は、実験によって、４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲内で、最も低いことがわかっている。得られる最終出力は、２つの蛍光団からの蛍光強度の間の標準化された比であり、以下の関係（式１）によって規定される。
【０１９６】
最終出力＝（Ｉ（１，２）−Ｉ（１，１））*Ｉ（２，０）／（Ｉ（２，２）−Ｉ（２，１））*Ｉ（１，０）
（１）
【０１９７】
前記式１によって与えられる、光学的手段（たとえば、蛍光光度計）からの最終出力は、好ましくは国際公開公報第００／０２０４８号に規定されている原理に基づいて得ることができる、校正ダータを使用するコンピュータによって、被検体濃度に変換する。
【０１９８】
本発明のさらなる態様
【０１９９】
第六態様においては、本発明は、先に記載したポリマーに関する。
【０２００】
本発明の任意の態様に関連して記載した特徴は、本発明の他の態様に適用することができる。
【０２０１】
本発明を、実施例および図面を用いてさらに説明する。
【０２０２】
［実施例］
一般説明
【０２０３】
以下の材料を使用した。
【０２０４】
過ヨウ酸ナトリウム、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｏ−フェニレンジヒドロクロリド、ベンジルアミン、アンモニア、シアノホウ水素化ナトリウム（Sigma-Aldrich社）。
Ｎｕｎｃ Ｆ９６ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Nunc, Denmark）
ＰＤ−１０カラム、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Amersham bioscience）
デキストラン（Pharmacosmos, Denmark）
マンナン結合レクチン（数社の供給源、たとえば、Statens Serum Institute社、Copenhagen, Denmarkから入手可能）。コンカナバリンＡペルオキシダーゼ結合体（Sigma-Aldrich社，Ｌ６３９７）。
透析チューブSpectra/Por (Spectrum Laboratories社、California、 USA）。Float-A-Lyzer（商標）２５．０００ＭＷＣＯ再生セルロース透析チューブは、Spectrum Laboratories Europe (Breda, The Netherlands）から入手したものであった。
【０２０５】
ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）、アゾジイソブチロジニトリル（ＡＩＢＮ）および２−ヒドロキシエチルアクリレートは、Sigma-Aldrichから入手した。Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩は、PolysSciences Europe (Eppelheim, Germany）から入手した。２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（ＶＡ−０４４）は、Wako GmbH (Neuss, Germany）から入手した。
【０２０６】
アリルα−Ｄ−グルコピラノシドおよびアリル２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシドは、Glycon Biochemicals社、 Germanyから入手したものであった。アリルα−Ｄ−ガラクトピラノシドは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手したものであった。アリルα−Ｄ−マンノピラノシドは、実施例Ｃｌの方法によってここで生成した。
【０２０７】
他の記載がない限り、ＰＢＳは、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４であり、ＴＢＳは、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ７．４である。
【０２０８】
省略語：ＭＢＬ、マンナン結合レクチン；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＴＢＳ、ＴＲＩＳ緩衝食塩水；ＥＬＬＡ、酵素結合レクチンアッセイ
[実施例Ａ１]
【０２０９】
ＭＢＬの染色
ヒトＭＢＬを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１．２５ｍＭのＣａ2+を含む１０ｍＭのＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ８．７に緩衝液交換（透析法により）した。染色のために使用した染料は、Alexa Fluor（商標）５９４スクシンイミジルエステル（ＡＦ５９４−ＳＥ）（Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA）であった。染料を乾燥ＤＭＳＯに溶解し、炭酸水素緩衝液中のＭＢＬにゆっくり（１０分）加えた。反応を１時間行った。染色は、染料の１５倍モル過剰（ポリペプチド単位に関して）で行った。精製を、１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１．２５ｍＭＣａ2+に対する透析法によって行った。得られた、染色されたタンパク質のモル基準標識化度を、ＭＢＬの１サブユニット当たり染料２．３として、ＵＶ分光法によって決定した（ＭＢＬのサブユニットの分子量として２８ｋＤａを使用して計算）。
[実施例Ａ２]
【０２１０】
デキストランの生成
１５０ｋＤａデキストラン（６．００ｇ，０．４μｍｏｌ）を２５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、ｐＨ１１．５（６００ｍＬ）に溶解した。水素化ホウ素ナトリウム（３ｇ，０．０８ｍｏｌ）を加え、次いでジビニルスルホン（１５ｍｌ，０．１５ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分撹拌し、その後濃塩酸でｐＨ７．２に中和した。３０分撹拌した後、得られた混合物を水（３×２５Ｌ）中で透析した（ＭＷＣＯ１０−１２ｋＤａ）。内容物をエルレンマイヤーフラスコに移し、２４％アンモニア（２００ｍＬ）を加えた。２時間後、ｐＨを１０．５に調整し、反応物を一晩撹拌した。過剰のアンモニアを水（８×２５Ｌ）中で透析法（ＭＷＣＯ１０−１２ｋ）により除去し、内容物全てを凍結乾燥し、アミノデキストラン５．７５ｇ（アミノデキストラン、ＭＷ：１８５ｋＤａに対して７８％）を白色綿毛状物質として得た。元素分析を使用して、分子量、アミン導入率および導入されたジビニルスルホンの量の簡易評価を行った。
【０２１１】
Found Ｃ３９．８６；Ｈ６．２６；Ｎ０．１６；Ｓ３．０８％ Dextran １５０ｋ，〜２２ＤＶＳ−ＮＨ2，〜１６０ＤＶＳ−ＯＨ，ａｎｄ〜７２０Ｈ2Ｏ ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｃ３９．５５；Ｈ６．６０；Ｎ０．１６；Ｓ３．０７％
[実施例Ａ３]
【０２１２】
ヘキサ−メトキシ−クリスタルバイオレットスクシンイミジルエステル（ＨＭＣＶ−１）の生成
ＨＭＣＶ−１の合成：
【化３】
【０２１３】
スキーム１．Ｉ）４−（Ｎ−メチルアミノ）ブタン酸塩酸塩（１当量）ジイソプロピルエチルアミン、アセトニトリル中、２０℃、２０時間、ＩＩジメチルアミン（過剰量）、ＩＩＩ）ＴＳＴＵ、ジイソプロピルエチルアミン、ｉアセトニトリル、２０℃、２時間
【０２１４】
４ａ （ＢＦ4-）：４−（メチルアミノ）酪酸塩酸塩（１．３６ｇ；８．８ｍｍｏｌ）、１（５．０ｇ；８．３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）をアセトニトリル（１２０ｍＬ）に溶解した。反応混合物を、乾燥窒素雰囲気中で、３０〜３５℃、２２時間撹拌した。ジメチルアミン（４０ｍＬの４０％溶液）水溶液を加え、反応混合物をさらに４日間撹拌した。溶剤および過剰のジメチルアミンを真空除去し、残った材料をクロロホルムに溶解した。クロロホルム溶液を食塩水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、その後、溶剤を蒸発させ、ＣＨ2Ｃｌ2／エーテルから生成物を再析出させた。収量：４．４ｇ（７０％）、暗青色の粉末
【０２１５】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ６２４（Ｍ＋）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ８．３４（ＩＨ，ｂｓ），６．０３（２Ｈ，ｓ），５．８３（４Ｈ，ｓ），３．４９（２Ｈ，ｍ），３．４６（６Ｈ，ｓ），３．４４（１２Ｈ，ｓ），３．１２（３Ｈ，ｓ（masked）），３．０８（１２Ｈ，ｓ），１．９４（２Ｈ，ｔ），１．７０（２Ｈ，ｍ）
【０２１６】
ＨＭＣＶ−１（Ｃｌ-）：ＴＳＴＵ（２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩；０．８ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１５ｍＬ）中の４ａ（０．９ｇ，１．２６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．５５ｇ，４．５ｍｍｏｌ）溶液に加えた。反応混合物を密閉したフラスコ内で２時間撹拌し、その後これを、ＨＣｌ水溶液（４ｍＬ，２Ｍ）で酸性化した、氷冷したほぼ飽和ＮａＣｌ溶液（約１５０ｍＬ）に注ぎ込んだ。水相をクロロホルム（２×１５０ｍＬ）で抽出した。組合わせたクロロホルム相を、食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶剤を蒸発させ、ＣＨ2Ｃｌ2／エーテルから再析出し、暗青色の粉末（０．８０ｇ，８４％）を得た。
【０２１７】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ７２１（Ｍ＋）
1Ｈ−ＭＭＲ 1Ｈ−ＮＭＲ ｂｒ．（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ５．８８（２Ｈ，ｓ），５．８５（４Ｈ，ｓ），３．６０（２Ｈ，Ｓ），３．４６（１２Ｈ，ｓ），３．４５（６Ｈ，ｓ），３．１５（１２Ｈ，ｓ），３．１２（３Ｈ，ｓ），２．８５（４Ｈ，ｓ），２．８０（２Ｈ，ｔ），１．９５（２Ｈ，ｍ）
[実施例Ａ４]
【０２１８】
４０モル％マンノースポリマーの合成
４０モル％マンノースポリマーを、以下のようにして生成した。アリルα−Ｄ−マンノピラノシド（１．７７ｇ，８．０ｍｍｏｌ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（１．３６ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（８９．６ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）および２，２'−アゾビス−［２−（２−イミダゾリン−
２−イル）−プロパン］２塩酸塩（２３．７ｍｇ，０．０７３ｍｍｏｌ）を、５０ｍｌの丸底フラスコに加え、次いで水（２８．８ｍｌ）を加えた。磁気攪拌下、室温で混合物を溶解した。５分間窒素でパージした後、混合物を６０℃に加熱し、その温度で１２時間重合した。冷却すると、僅かに黄色を帯びた粘稠な溶液を得た。この溶液を、一晩水に対して透析（２５ｋのＭＷＣＯ再生セルロース）し、凍結乾燥し、白色の綿毛状のポリマーを得た。
【０２１９】
このポリマーが乾燥し、空気に曝した後、ポリマーは、水に部分的にしか溶解しないものであった。
[実施例Ａ４ａ]
【０２２０】
８０モル％マンノースポリマーの合成
アリル−α−Ｄ−マンノピラノシドの量を３．５４ｇ（１６ｍｍｏｌ）とし、２−ヒドロキシエチルアクリレートの量を０．６８ｇ（５．８５ｍｍｏｌ）とした以外は実施例Ａ４と同様にして、８０モル％マンノースポリマーを生成した。
【０２２１】
このポリマーは、実施例Ａ４で生成したポリマーより溶解性があった。また、このポリマーが乾燥し空気に曝した後も、水に対し溶解性があった。
[実施例Ａ５]
【０２２２】
実施例Ａ４の４０モル％マンノースポリマーのＨＭＣＶ−１による標識化
実施例Ａ４のポリマー（２０ｍｇ）を１０ｍＭのカーボネート緩衝液（５００μｌ，ｐＨ８．６）に溶解し、実施例Ａ３で生成したヘキサメトキシクリスタルバイオレット−スクシンイミジルエステル（ＨＭＣＶ−１，６．１ｍｇ）のＤＭＳＯ（２００μｌ）溶液を加えた。混合物を室温で３時間緩やかに攪拌し、次いで１０ｍＭのＴＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４に対して透析し（１０ｋのＭＷＣＯ再生セルロース）、反応していない染料を除去した。０．０８５の重量基準の標識化度（「ＤＯＬ」）の値を得た。
【０２２３】
「ＤＯＬ」値は、以下の等式を使用して求めた。
「ＤＯＬ」＝［ＨＭＣＶ−１］（ｍｇ／ｍｌ）／［ポリマー］（ｍｇ／ｍｌ）
ここで、式中、ＨＭＣＶ−１の含有率は、吸光分光分析で求めた。
［ＨＭＣＶ−１］（ｍｇ／ｍｌ）＝［Ａ（６３２ｎｍ）／（ε（ＨＭＣＶ−１，６３２ｎｍ）*１）］*Ｍ（ＨＭＣＶ−１）
ε（ＨＭＣＶ−１，６３２ｎｍ）＝４２０００Ｍ-1*ｃｍ-1；Ｍ（ＨＭＣＶ−１）＝６６０．２ｇ／ｍｏｌ
[実施例Ａ５ａ]
【０２２４】
実施例Ａ４ａの８０モル％マンノースポリマーのＨＭＣＶ−１による標識化
実施例Ａ５の標識化方法を、実施例Ａ４ａの８０モル％マンノースポリマーについて行った。
[実施例Ａ６]
【０２２５】
実施例Ａ４の４０モル％マンノースポリマーに関するサイズ排除アッセイ
実施例Ａ４のポリマーの分子量を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して求めた。ＴＳＫゲルＧ４０００ＰＷXLカラム（７．８ｍｍ（内径）×３０．０ｃｍ（長さ）、Tosoh Biosciences社）を、Agilent １１００ＨＰＬＣシステム上で操作した。移動相（０．１％酢酸，５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ３．４）の定組成溶離（１．０ｍｌ／分で２５分間）を使用した。分子量は、ＨＭＣＶ結合アミノデキストラン標準に基づき、次の関係式：
を用いた。結果を図２に示す。
[実施例Ａ７]
【０２２６】
実施例Ａ４のポリマーのマンノース含有率の測定
このアッセイは、マンノース（８０％硫酸中）の対応する５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）への脱水反応に基づき、これは次に５％のフェノール溶液と反応し、加熱で色素原を生成する。この反応は、定量的であるので、マンノースの最初の濃度を、吸光分光分析で求めることができる。９６ウェルマイクロプレートを使用することにより、試料の高処理能力が可能になる。使用した方法は、Masukoら(2005) Anal. Biochem., 339,69-72によって修正されたものである。
【０２２７】
９６ウェルのマイクロプレートの１ウェル中の５０μｌの試料に１５０μｌの濃硫酸をすばやく加え、最大混合を起こし、次いで直ちに３０μｌの５％フェノール水溶液を加えた。水浴中でマイクロプレートを、９０℃で１５分間注意深く浮遊させることによって培養した後、別の水浴でプレートを５分間冷却し、ふき取って乾かし、マイクロプレートリーダーを使用して吸収を（４９０ｎｍ）測定した。試料は、標準曲線を作成するための水（５０μｌ／ウェル）中、マンノースの１２種の異なる濃度（０．００３、０．０２、０．０３、０．０５、０．１５、０．２、０．３、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０ｍＭ）と、実施例Ａ４のポリマー（５０μｌ／ウェル）の３種の異なる濃度（０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｍｌ）とで構成した。全測定を、１試料につき３回行った。
【０２２８】
結果を表１に示す。
【０２２９】
【表１】
[実施例Ａ７ａ]
【０２３０】
実施例Ａ４ａのポリマーのマンノース含有率の測定
実施例Ａ４ａのポリマーを、実施例Ａ７で記載した方法を使用して分析した。
【０２３１】
結果を表１ａに示す。
【表１ａ】
[実施例Ａ８]
【０２３２】
実施例Ａ４の４０モル％マンノースポリマーに関するＥＬＬＡアッセイ
ビオチン化ＭＢＬを、以下のように生成した。ビオチン−ＮＨＳ（２０μｌ，ＤＭＳＯ中７ｍｇ／ｍｌ，〜１０〜１５当量／ＭＢＬモノマー）を、ＭＢＬ（３ｍｌ，０．５３ｍｇ）のＰＢＳ（３ｍＬ）溶液に加えた。溶液を２時間緩やかに攪拌し、次いで透析チューブ（ＭＷＣＯ１０−１２Ｋ）に移し、ＴＢＳ（２×１Ｌ）に対して２４時間透析した。得られたＴＢＳ中のビオチン化ＭＢＬ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をさらに精製することなく使用した。
【０２３３】
以下に記載するＭＢＬ ＥＬＬＡアッセイで使用した塗布濃度がマイクロプレートを飽和するのに十分であることを確認するために、標準ＣｏｎＡ ＥＬＬＡアッセイを次のように行った。ＥＬＬＡアッセイにおいて使用したＰＢＳ緩衝液は、１０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ2、０．１ｍＭのＭｎＣｌ2で、ｐＨ７．４であった。
【０２３４】
９６ウェルマイクロタイタープレートに、５℃で一晩、ＰＢＳ中の抗体（実施例Ａ４で得たポリマーおよびアミノデキストラン）（１００μｌ，１００μｇ／ｍｌ，２倍希釈）のそれぞれの２カラムを塗布した。残った結合部位を、ＰＢＳ（１５０μｌ）中の０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの添加によってブロックした。次いで、ウェルを洗浄（２×２００μｌのＰＢＳ）した。ＰＢＳ中のＣｏｎＡ−ＨＲＰ、１％（ｗ／ｖ）（１００μｌ）を加え、１時間培養した。次いでプレートを空にし、洗浄（３×２００μｌのＰＢＳ）した。ＨＲＰの存在を、基質溶液（１ｍｇのｏ−フェニレンジヒドロクロリド）の添加によって可視化し、２分後１ＮのＨ2ＳＯ4でクエンチした。４９０ｎｍでの吸収を読むことによって発色を測定し、バックグラウンド除去は６３０ｎｍで読んだ。
【０２３５】
９６ウェルマイクロタイタープレートに、５℃で一晩、ＴＢＳ中の抗体（実施例Ａ４のポリマーおよびアミノデキストラン）（１００μｌ，１００μｇ／ｍｌ）のそれぞれの２カラムを塗布した。残った結合部位を、ＴＢＳ（１５０μｌ）中の０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの添加によってブロックした。次いで、ウェルを洗浄（２×２００μｌのＴＢＳ）した。ビオチン化ＭＢＬ（２μｇ／ｍｌ）によるグルコース（１００ｍＭ〜０ｍＭ）の希釈液を加え、全容量を１００μｌとした。２時間の培養の後、プレートを空にし、洗浄（２×２００μｌのＴＢＳ）した。ＴＢＳ中のストレプトアビジン−ＨＲＰ、０．１％（ｖ／ｖ）（１００μｌ）を加え、１時間培養した。次いで、プレートを空にし、洗浄（３×２００μｌのＴＢＳ）した。ＨＲＰの存在を、基質溶液（１ｍｇのｏ−フェニレンジヒドロクロリド）の添加によって可視化し、２分後、１ＮのＨ2ＳＯ4でクエンチした。４９０ｎｍでの吸収を読むことによって発色を測定し、バックグラウンド除去は６３０ｎｍで読んだ。
【０２３６】
結果を図３に示す。
[実施例Ａ８ａ]
【０２３７】
実施例Ａ４ａの８０モル％マンノースポリマーに関するＥＬＬＡアッセイ
実施例Ａ４ａのポリマーに関するＥＬＬＡアッセイを、実施例Ａ８で記載した方法を使用して行った。
【０２３８】
ＥＬＬＡアッセイにより得られたＩＣ５０値は、実施例Ａ８の値より非常に高かった。ＩＣ５０は、グルコース１６．８ｍＭ（Ａ８）であるのと比べて、グルコース５０〜８０ｍＭで変化した。
[実施例Ａ９]
【０２３９】
実施例Ａ５の４０モル％マンノース標識化ポリマーに関するＦＲＥＴアッセイ
測定を周波数領域法により行った。これらの測定に関しては、ＩＳＳ社，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ，ＵＳＡのＫＯＡＬＡ装置（ＫＯＡＬＡ自動化試料コンパートメント）を使用した。励起光源（図１中の１１）は黄色ＬＥＤであった。励起光は５４０〜５９０ｎｍバンドパスフィルター（図１中の１５）でフィルターにかけ、発光は、６１０〜６９０ｎｍバンドパスフィルター（図１中の２１）を使用して単離した。両フィルターともOmega Optical社、Brattleboro, VT, USAのものであった。
【０２４０】
多指数関数崩壊モデルは、ベストモデルは、蛍光発光崩壊を記載する。しかし、グルコースセンシングは、多指数関数崩壊を分析する必要がない。単一変調周波数での位相または変調測定は、グルコース濃度を測定するのに適している（L.Tolosa, H. Szmcinski, G. RaoおよびJ.R. Lakowicz (1997) Analytical Chemistry 250, 102-108)。PreciSenseアッセイケミストリに関する最適変調−周波数は、６１ＭＨｚであると考えられる。
【０２４１】
１０μＭの標識化ＭＢＬの５０μｌのアッセイケミストリ（実施例Ａ１において生成されたものであるが、１ＭＢＬサブユニット当たり０．５個の染料の標識化度を有する）と、２ｍｇ／ｍｌの標識化ポリマー（実施例Ａ５）とを混合し、混合後、少なくとも１時間放置した。次いで、アッセイケミストリ（５μｌ）をシリンジでセルロースファイバに移し、該ファイバを特注設計されたファイバーホルダーに設置した。ファイバーホルダーを標準蛍光発光セル（１０ｍｍ×１０ｍｍ）中に挿入した。つまり、該測定のために修正なしで標準の市販の装置を使用した。
【０２４２】
溶液は全て水浴で３４℃に予備加熱し、ＫＯＡＬＡ装置での測定は全て３４℃で記録した。蛍光発光セルを持つファイバおよびファイバ−ホルダー組立体を、ＫＯＡＬＡの試料ホルダー中に置き、グルコースを含有する緩衝液で蛍光発光セルを満たした。
【０２４３】
測定された位相は、少なくとも４０個の位相角記録の平均であった。測定が完了した後、ピペットを使用して蛍光発光セルを空にし、次の濃度のグルコースを含有する緩衝液で再び満たした。アッセイケミストリが平衡状態に達するように、測定の間に２０分間の遅延時間を置いた。
【０２４４】
グルコース用量反応曲線（図４）を作成するために、０、２．５、５、１０、３０、１００および５００ｍＭグルコースで位相を測定した。５００ｍＭグルコースで位相角を測定した後、ファイバを６０分かけて１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液で数回洗浄した。この時点で、０ｍＭのグルコースで最初に得られた位相角と同じ位相角を得た。これにより、アッセイ（データは示さず）の可逆性が立証された。
[実施例Ａ９ａ]
【０２４５】
実施例Ａ５およびＡ５ａの標識化ポリマーに関するＦＲＥＴアッセイ
実施例Ａ５およびＡ５ａの標識化ポリマーを使用して、実施例Ａ９に類似する方法を行った。ポリマーを、生分解性ポリマー中に封入し、小型化された時間分解蛍光光度計を用いて測定値を取った。グルコース濃度を、２日間の周期で２．５ｍＭ、５ｍＭ、１５ｍＭおよび３０ｍＭの間で変化させた。測定値を５分間隔で取り、最初の２．５ｍＭのグルコース濃度で測定した位相の値を、次の位相の値から差し引くことによって、位相シフトを計算した。
【０２４６】
結果を図４ａに示す。
【０２４７】
８０％マンノース標識化ポリマー（実施例Ａ５ａ）の位相シフトは、４０％マンノース標識化ポリマー（実施例Ａ５）より、約４０％大きかった。４０モル％マンノース標識化ポリマー（実施例Ａ５）の沈殿が観察された。８０％マンノース標識化ポリマー（実施例Ａ５ａ）の沈殿は観察されなかった。これは、８０モル％マンノース標識化ポリマーの応答が向上したことの関係があると考えられる。
【０２４８】
実施例Ａ４〜Ａ９の結果を、表２にまとめる。
【表２】
【０２４９】
実施例Ａ４ａ〜Ａ９ａの結果を表２ａにまとめる。
【表２ａ】
[実施例Ａ１０]
【０２５０】
センサーの形成と埋め込み
１０００ＰＥＧＴ８０ＰＢＴ２０ポリマー（８０重量％の親水性セグメントと２０重量％疎水性セグメントとの標的を用い、S.FakirovおよびT. Gogeva, Macromol. Chem. 191(1990) 603-614に記載のように生成）から、直径７００μｍのガラス棒を、１５％ｗ／ｗのポリマーのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液に浸漬し、室温で乾燥させることによって、ファイバを製造した。これにより、外径９００μｍ、内径７００μｍの中空ファイバを得た。該ファイバにアッセイケミストリ（実施例Ａ９）を満たした。ポリマーを溶融しファイバを閉じるために、ポリマーを加熱した。試験および埋め込みの前に、溶融されたファイバの漏れをテストした。
【０２５１】
この種類のファイバは、針を使用することにより、皮膚の上側に配置することができる。適切なサイズ（湿ったファイバを含有するのに十分な大きさ）の針を、約１ｍｍの深さで皮膚の表面に平行に置き、皮膚を通して影として見えるように針を置く。ファイバ（まだ湿っている）を針の内部に置き、針を取出す。
【０２５２】
通常、挿入が完了した後、挿入部位に出血は観察されない。ファイバが適所に置かれると、読み取り機をファイバの真上の位置に置き、測定を始めることができる。
[実施例Ｂ１]
【０２５３】
ポリマー合成
水溶性４０％マンノースコポリマーを、以下のようにして、乳化重合で生成した。機械的撹拌器と窒素管とを備える、２５０ｍｌの３つ首丸底フラスコに、Ｓｐａｎ８０界面活性剤（５．７ｇ；ＨＬＢ［親水性−親油性バランス］４．３、トルエンに対して１０％ｗ／ｗ）、ＡＩＢＮ（３０ｍｇ）およびトルエン（５７．３ｇ）を加えた。該フラスコを密封し、窒素でパージし、重合の間中窒素雰囲気下に保った。アリルα−Ｄ−マンノピラノシド（３．５２ｇ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（２．５５２ｇ）およびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（０．３５６ｇ）を水（１２．７ｇ）に溶解し、ろ過して、不溶物質を除去した。この混合物を、丸底フラスコ中で、ゴム膈膜を介して、激しく撹拌されている混合物に加えた。反応混合物を、室温で、安定な乳化物が形成されるまで（３０分）、次いで６０℃４時間、撹拌した。ＶＡ−０４４（１ｍｌ，６０ｍｇ／ｍｌ）の溶液を、膈膜を通して注入し、重合を一晩（１７時間）続けた。反応混合物を室温まで冷却し、乳化物をアセトンの添加によって分離した。これによってポリマーの析出が起こり、析出物を集め、水に再び溶解し、アセトンの添加によって析出させた。生成物を一晩、真空乾燥し、３．２ｇ（５０％）の粗薄黄色ポリマーを得た。粗ポリマーの一部（１．０ｇ）を、水（１０ｍｌ）に溶解し、水中で透析（ＭＷＣＯ［分子量カットオフ］２５，０００）し、低分子量物質を除去した。凍結乾燥によって、０．４６ｇ（４６％）の綿毛状ポリマーを得た。
[実施例Ｂ２]
【０２５４】
実施例Ｂ１のポリマーの染色
一般的に、コポリマーの標識化は、Molecular Probes（製品情報ＭＰ００１４３，Ｒｅｖ．２００１年６月）によって提供される記載に従う。
【０２５５】
ポリマー（実施例Ｂ１）（８８．６ｍｇ）を、１０ｍＭのＮａＨＣＯ3溶液（３ｍｌ；ｐＨ８．５）に溶解した。ポリマー溶液を３つのエッペンドルフバイアルに３等分した。ＨＭＣＶ−１（実施例Ａ３）（１９．６ｍｇ；２６．１μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ（６００μｌ）に溶解した。染料を、第一バイアルは合計で１００μｌ、第二バイアルは２００μｌ、第三バイアルは３００μｌとなるように、１０μｌのアリコート中のポリマー溶液に、３０秒ごとに加えた。最後のアリコートの添加後、バイアルを１時間穏やかに撹拌し、数種の緩衝液変更のある１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液中で、透析法緩衝液に色が見えなくなる（通常、５００ｍｌおよび７２時間の緩衝液変更を６〜８回）まで、該溶液を透析（ＭＷＣＯ、１０−１２，０００）した。
[実施例Ｂ３]
【０２５６】
実施例Ｂ２のポリマーのＦＲＥＴアッセイ
１０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（１２．５μＬ）中の染色したコポリマー溶液（実施例Ｂ２）（４μＬ）および染色したＭＢＬ溶液（実施例Ａ１）（８．５μＬ）を含むアッセイ化学検査物を混合し、混合後、少なくとも１時間放置した。次いで、アッセイ化学検査物を、シリンジを用いて、実施例Ａ９で使用したファイバーに移した。ファイバーを特注設計したファイバーホルダーに載せ、標準蛍光セル（１０ｍｍ×１０ｍｍ）にフィットさせた。
【０２５７】
時間分解蛍光光度法（周波数領域法）を用いて、グルコース反応を測定した。
[実施例Ｃ１]
【０２５８】
アリルα−Ｄ−マンノピラノシドおよびアミノデキストラン１５０ｋの合成
アリルα−Ｄ−マンノピラノシドの合成を、基本的に、Ｐｅｋａｒｉら（２００４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，６６（２２），７４３２−７４４２に記載のように行った。
【０２５９】
Ｄ−マンノース（１２．１ｇ，６７ｍｍｏｌ）を、ＢＦ3−ＯＥｔ2（０．５８ｍｌ）の存在下、乾燥アリルアルコール（１４０ｍｌ）中で一晩還流した。翌日、反応混合物を、Ｅｔ3Ｎ（１．８ｍｌ）で中和し、溶剤を蒸発させた。ドライカラムバキュームクロマトグラフィー（内径６ｃｍ；１００ｍｌ画分；ＤＣＭ中０〜４５％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）−１１画分，５％増加＋１００％）により、生成物９．３８ｇ（６３％）を無色シロップとして得た。ＴＬＣ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ，９：１）Ｒf０．３；1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，１２８スキャン，７００μｌのＤ2Ｏ中４ｍｇ）δ３．２７（ｓ，２Ｈ，アリル），３．５２−４．２１（ｍ，６Ｈ），４．８４（ｂｓ，１Ｈ，αＨ），５．１６−５．３４（ｍ，２Ｈ，アリル），５．８２−５．９８（ｍ，１Ｈ，アリル）
【０２６０】
アミノデキストラン１５０ｋの合成は以下のように行った。デキストラン１５０ｋ（６．００ｇ，０．４μｍｏｌ）を２５０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、ｐＨ１１．５（６００ｍＬ）に溶解した。水素化ホウ素ナトリウム（３ｇ，０．０８ｍｏｌ）、次いでジビニルスルホン（１５ｍｌ，０．１５ｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で３０分攪拌した後、濃ＨＣｌでｐＨ７．２の中性とした。３０分間攪拌した後、得られた混合物を水中（３×２５Ｌ）で透析（ＭＷＣＯ１０〜１２ｋ）した。次いで、内容物を三角フラスコに移し、２４％アンモニア（２００ｍＬ）を加えた。２時間後、ｐＨを１０．５に調整し、反応物を一晩攪拌した。過剰のアンモニアを水（８×２５Ｌ）中での透析（ＭＷＣＯ１０−１２ｋ）により除去し、全内容物を凍結乾燥し、アミノデキストラン５．７５ｇ（７８％，アミノデキストラン（１８５ｋのＭＷ）に対して）を白色綿毛状物質として得た。元素分析を使用し、分子量、アミン導入および導入されたジビニルスルホンの量の概算を行った。（測定値：Ｃ３９．８６；Ｈ６．２６；Ｎ０．１６；Ｓ３．０８％デキストラン１５０ｋ，〜２２ＤＶＳ−ＮＨ2，〜１６０ＤＶＳ−ＯＨおよび〜７２０Ｈ2Ｏ 要求値：Ｃ３９．５５；Ｈ６．６０；Ｎ０．１６；Ｓ３．０７％）
[実施例Ｃ２]
【０２６１】
ポリマーの合成
以下の例で、マンノース５０モル％共重合体をどのように生成したかを説明する。他のポリマー生成は、表３にまとめる。使用した単糖類およびそれらの分量を表４にまとめる。
【０２６２】
アリル−サッカライド（ＡＳ）およびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＮＡＭＨ）の母液（１００ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で生成した。
【０２６３】
スクリューキャッププラスチックチューブ中で、過硫酸カリウム（ＰＰＳ）（１５０ｍｇ）をＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．４；７．８ｍｌ）に溶解した。この溶液に、アリルα−Ｄ−マンノピラノシド（アリルサッカライド；ＡＳ）（２．２０ｍｌ；２２０ｍｇ）、２−ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）（１１０μｌ）、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＮＡＭＨ）（８９μｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）（１００μｌ）をこの順番で加えた。混合物を、窒素で５分間パージし、溶解酸素を除去した。旋回シェーカー中で重合を室温で一晩行った。反応混合物をろ過し、メタノール（１００ｍｌ）中に析出させた。ポリマーを遠心分離（４０００ｒｐｍ，３分）で集め、次いでメタノール（３×１０ｍｌ）で洗浄した。最終的に得られたポリマーペレットをエクシケーターで一晩乾燥した。
【表３】
【表４】
[実施例Ｃ３]
【０２６４】
Ｃ２のポリマーに関するＥＬＬＡアッセイ
ＥＬＬＡアッセイで使用した緩衝液は、２０ｍＭのＴＲＩＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ2（生理的カルシウム濃度を模倣）ｐＨ７．４であった。
【０２６５】
９６ウェルマイクロタイタープレートに、５℃で一晩、ＴＢＳ中の抗体（実施例Ｃ３のポリマー、実施例Ｃ１のアミノデキストラン）（１００μｌ，１００μｇ／ｍｌ）のそれぞれの２カラムを塗布した。残りの結合部位をＴＢＳ（１５０μｌ）中の０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの添加によりブロックした。次いで、ウェルを洗浄（２×２００μｌのＴＢＳ）した。ビオチン化ＭＢＬ（２μｇ／ｍｌ）によるグルコース（１００ｍＭ〜０ｍＭ）の希釈液を加え、全容量を１００μｌとした。２時間の培養の後、プレートを空にし、洗浄（２×２００μｌのＴＢＳ）した。
【０２６６】
ＴＢＳ中のストレプトアビジン−ＨＲＰ、０．１％（ｖ／ｖ）（１００μｌ）を加え、１時間培養した。次いで、プレートを空にし、洗浄（３×２００μｌのＴＢＳ）した。ＨＲＰの存在を、基質溶液（１ｍｇのｏ−フェニレンジヒドロクロリド）の添加によって可視化し、２分後、２Ｎの硫酸でクエンチした。４９０ｎｍでの吸収を読むことによって発色を測定し、バックグラウンド除去は６３０ｎｍで読んだ。結果を図１のグラフに示す。高い吸収は、ＭＢＬのリガンドに対する結合に対応する。ベースライン吸収は、ＭＢＬのリガンドに対する結合に対応する。
【０２６７】
図５、図５ａに示すように、モノマーサッカライド単位は、ＭＢＬに対しグルコース（ＩＣ50〜１８ｍＭ）より高い親和力を有することが必要であり、マンノース（ＩＣ50〜８ｍＭ）またはＮ−アセチルグルコサミン（ＩＣ5〜６ｍＭ）より高い親和力を有することが好ましい。ガラクトース（ＩＣ50〜３６ｍＭ）のようなより低い親和力のサッカライドモノマー単位は、生理的カルシウム濃度でＭＢＬ結合をもたらさない。
【０２６８】
３０％と５０％との間のマンノースモノマー単位を持つ共重合体は、０〜１０ｍＭグルコースの範囲で最も容易に抑制（最急勾配）されるので、これらの共重合体を使用することにより最高の結果が達成された。したがって、最適ステップ（実施例Ｃ４）では、マンノースモノマー単位の含有率が３０％〜５０％の範囲であるマンノース共重合体を合成した。
[実施例Ｃ４]
【０２６９】
ポリマーの合成（最適化）
生成方法は、実施例Ｃ２の方法と同じであった。ポリマー生成を表５にまとめる。反応試薬を図６に示す。ポリマー生成物の例を図７に示す。
【表５】
[実施例Ｃ５]
【０２７０】
実施例Ｃ５のポリマーに関するＥＬＬＡアッセイ（最適化）
ＥＬＬＡアッセイを実施例Ｃ３に記載のように行った。
【０２７１】
結果を図８に示す。
【０２７２】
図８は、３５モル％マンノース共重合体が最適化リガンドであることを示す。結合は、０ｍＭのグルコースで、ＭＢＬに対するアミノデキストランと同じくらい強いが、アミノデキストランの結合より容易に抑制される。抑制曲線から、アミノデキストランおよび最適化リガンドのＩＣ50値を計算することができる（表６）（ＩＣ50値は、この特定のアッセイに関してのみ有効である）。
【表６】
【図面の簡単な説明】
【０２７３】
【図１】アッセイを問い合わせするための適切な光学セットアップを示す。
【図２】実施例Ａ５で得たサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。
【図３】実施例Ａ８で得たＥＬＬＡアッセイの結果を示す。
【図４】実施例Ａ９で得たＦＲＥＴアッセイの結果を示す。
【図４ａ】実施例Ａ９ａで得たＦＲＥＴアッセイの結果を示す。
【図５】実施例Ｃ３で得たＥＬＬＡアッセイの結果を示す。
【図５ａ】実施例Ｃ３で得たＥＬＬＡアッセイの結果を示す。
【図６】実施例Ｃ４の反応原料を示す。
【図７】実施例Ｃ４のポリマー生成物の一例を示す。
【図８】実施例Ｃ５で得たＥＬＬＡアッセイの結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、該センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするが、アッセイ成分は拡散させない材料によって保持されている、検出可能または測定可能な光信号であり、前記アッセイ成分は、
近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの１つで標識された糖質結合分子と；
該糖質結合分子と結合するために前記被検体と競合することができ、柔軟性水溶性ポリマーである糖質類縁体を含み、前記糖質類縁体は、
モノマー単位残基がペンダント糖質または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの残りの１つであるペンダント部分とを有する、モノマー単位の重合残基および／または
第一モノマー単位残基がペンダント糖質または糖質様部分を有し、第二モノマー単位残基が近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの残りの１つであるペンダント部分を有する、第一モノマー単位および第二モノマー単位の共重合残基を含む糖質類縁体とを含むセンサー。
【請求項２】
第一モノマー単位が、重合反応混合物中、２０〜７０モル％または７０〜９０モル％存在しおよび／または第二モノマー単位が、反応混合物中、５〜１５モル％存在する請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
糖質部分が、場合によっては誘導化されたマンノース、マルトース、イソマルトース、グルコース、ソホロースおよび／または２−アセチルグルコサミンから選択される請求項１または２に記載のセンサー。
【請求項４】
近接度に基づいた信号発生／変調部分が、第二モノマー単位のアミン、酸、アルコール、アルキン、アジドおよび／またはスルホン官能基に結合する請求項１〜３のいずれかに記載のセンサー。
【請求項５】
近接度に基づいた信号発生／変調部分が、エネルギー供与体またはエネルギー受容体である請求項１〜４のいずれかに記載のセンサー。
【請求項６】
さらに、糖質または糖質様部分も近接度に基づいた信号発生／変調部分も有しない第三モノマー単位の重合残基を含む請求項１〜５のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７】
第三モノマー単位が、反応混合物中、０〜８０モル％存在する請求項６に記載のセンサー。
【請求項８】
第三モノマー単位が、親水性基を含有する請求項６または７に記載のセンサー。
【請求項９】
第三モノマー単位が、２−ヒドロキシエチルアセテート、ビニルピロリドン、ＭＭＡ、ＨＥＭＡ、ビニルアルコールおよび／またはエチレングリコールを含む請求項８に記載のセンサー。
【請求項１０】
重合体平均分子量が、２０〜２５０ｋＤａの範囲内である請求項１〜９のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１１】
糖質被検体がグルコースであり、ポリマーが、生理的カルシウム濃度で、グルコースと競合することができる請求項１〜１０のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１２】
アッセイが、０〜３５ｍＭのグルコースの範囲の少なくとも一部の濃度で血糖値を測定することができる請求項１１に記載のセンサー。
【請求項１３】
糖質結合分子がレクチンである請求項１〜１２のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１４】
糖質結合分子が、マンノース結合レクチンまたはコンカナバリンＡである請求項１３に記載のセンサー。
【請求項１５】
アッセイの成分が、シェル材料またはマトリックス材料によって保持されている請求項１〜１４のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１６】
保持材料が生分解性である請求項１５に記載のセンサー。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のセンサーを製造する方法であって、相分離（コアセルベーション）、溶剤蒸発、抽出、噴霧乾燥、スプレー被覆、スプレー冷却、回転円盤式アトマイゼーション、流動床被覆、共押出しおよびパンコーティングの少なくとも１つを含む方法。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれかに記載のセンサーを使用して糖質被検体を検出する方法であって、該センサーを動物の皮膚に埋め込むステップと、外部の光学的手段を用い、糖質被検体の経皮的検出または測定を行うステップとを含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれかに記載のセンサーを使用して糖質被検体を検出する方法であって、外部の光学的手段を使用し、哺乳類の皮膚の中または下に存在する前記センサーの照射により、糖質被検体の経皮的検出または測定を行うステップを含む方法。
【請求項２０】
第一モノマー単位残基がペンダント糖質または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの残りの１つであるペンダント部分とを有する、第一モノマー単位の重合残基および／または第一モノマー単位残基がペンダント糖質または糖質様部分を有し、第二モノマー単位残基が近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの残りの１つであるペンダント部分を有する、第一モノマー単位および第二モノマー単位の共重合残基を含む柔軟性水溶性ポリマーを合成する方法であって、以下の手順の１つを含む方法:
ａ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合すること；
ｂ）それぞれ糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合すること；
ｃ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いで、モノマー単位残基を、近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｄ）それぞれペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで第二モノマー単位残基を近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｅ）それぞれ、糖質部分または糖質様部分にリンクするためのペンダント官能基と近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いでモノマー単位残基を糖質部分または糖質様部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；または
ｆ）それぞれ糖質部分または糖質様部分にリンクさせるためのペンダント官能基を有する第一モノマー単位と、それぞれ近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで糖質または糖質様部分を持つ第一モノマー単位残基と、近接度に基づいた信号発生／変調部分を持つ第二モノマー単位残基とを反応させること。
【請求項２１】
モノマー単位を付加重合によって反応する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
モノマー単位および／または第一モノマー単位が、アリルまたはビニルを含有する糖質または糖質様部分の誘導体である請求項２０または２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
モノマー単位および／または第二モノマー単位が、アミン官能基を含有する二重結合含有分子である請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
流体中の糖質被検体の検出または測定用センサーであって、該センサーは、競合結合アッセイの成分を含み、該アッセイの読み出しは、被検体の拡散は可能にするが、アッセイ成分は拡散させない材料によって保持されている、検出可能または測定可能な光信号であり、前記アッセイ成分は、
近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの１つで標識された糖質結合分子と；
該糖質結合分子と結合するために前記被検体と競合することができ、柔軟性水溶性ポリマーである糖質類縁体を含み、前記糖質類縁体は、
モノマー単位残基がペンダント糖質または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの残りの１つであるペンダント部分とを有する、モノマー単位の重合残基および／または
第一モノマー単位残基がペンダント糖質または糖質様部分を有し、第二モノマー単位残基が近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの残りの１つであるペンダント部分を有する、第一モノマー単位および第二モノマー単位の共重合残基を含む糖質類縁体とを含むセンサー。
【請求項２】
第一モノマー単位が、重合反応混合物中、２０〜７０モル％または７０〜９０モル％存在しおよび／または第二モノマー単位が、反応混合物中、５〜１５モル％存在する請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
糖質部分が、場合によっては誘導化されたマンノース、マルトース、イソマルトース、グルコース、ソホロースおよび／または２−アセチルグルコサミンから選択される請求項１または２に記載のセンサー。
【請求項４】
近接度に基づいた信号発生／変調部分が、第二モノマー単位のアミン、酸、アルコール、アルキン、アジドおよび／またはスルホン官能基に結合する請求項１〜３のいずれかに記載のセンサー。
【請求項５】
近接度に基づいた信号発生／変調部分が、エネルギー供与体またはエネルギー受容体である請求項１〜４のいずれかに記載のセンサー。
【請求項６】
さらに、糖質または糖質様部分も近接度に基づいた信号発生／変調部分も有しない第三モノマー単位の重合残基を含む請求項１〜５のいずれかに記載のセンサー。
【請求項７】
第三モノマー単位が、反応混合物中、０〜８０モル％存在する請求項６に記載のセンサー。
【請求項８】
第三モノマー単位が、親水性基を含有する請求項６または７に記載のセンサー。
【請求項９】
第三モノマー単位が、２−ヒドロキシエチルアセテート、ビニルピロリドン、ＭＭＡ、ＨＥＭＡ、ビニルアルコールおよび／またはエチレングリコールを含む請求項８に記載のセンサー。
【請求項１０】
重合体平均分子量が、２０〜２５０ｋＤａの範囲内である請求項１〜９のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１１】
糖質被検体がグルコースであり、ポリマーが、生理的カルシウム濃度で、グルコースと競合することができる請求項１〜１０のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１２】
アッセイが、０〜３５ｍＭのグルコースの範囲の少なくとも一部の濃度で血糖値を測定することができる請求項１１に記載のセンサー。
【請求項１３】
糖質結合分子がレクチンである請求項１〜１２のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１４】
糖質結合分子が、マンノース結合レクチンまたはコンカナバリンＡである請求項１３に記載のセンサー。
【請求項１５】
アッセイの成分が、シェル材料またはマトリックス材料によって保持されている請求項１〜１４のいずれかに記載のセンサー。
【請求項１６】
保持材料が生分解性である請求項１５に記載のセンサー。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のセンサーを製造する方法であって、相分離（コアセルベーション）、溶剤蒸発、抽出、噴霧乾燥、スプレー被覆、スプレー冷却、回転円盤式アトマイゼーション、流動床被覆、共押出しおよびパンコーティングの少なくとも１つを含む方法。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれかに記載のセンサーを使用して糖質被検体を検出する方法であって、該センサーを動物の皮膚に埋め込むステップと、外部の光学的手段を用い、糖質被検体の経皮的検出または測定を行うステップとを含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれかに記載のセンサーを使用して糖質被検体を検出する方法であって、外部の光学的手段を使用し、哺乳類の皮膚の中または下に存在する前記センサーの照射により、糖質被検体の経皮的検出または測定を行うステップを含む方法。
【請求項２０】
第一モノマー単位残基がペンダント糖質または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの残りの１つであるペンダント部分とを有する、第一モノマー単位の重合残基および／または第一モノマー単位残基がペンダント糖質または糖質様部分を有し、第二モノマー単位残基が近接度に基づいた信号発生／変調部分ペアの残りの１つであるペンダント部分を有する、第一モノマー単位および第二モノマー単位の共重合残基を含む柔軟性水溶性ポリマーを合成する方法であって、以下の手順の１つを含む方法:
ａ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合すること；
ｂ）それぞれ糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、ぶら下がっている近接度に基づいた信号発生／変調部分を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合すること；
ｃ）それぞれ、ペンダント糖質部分または糖質様部分と、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いで、モノマー単位残基を、近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｄ）それぞれペンダント糖質部分または糖質様部分を有する第一モノマー単位と、それぞれ、近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするためのペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで第二モノマー単位残基を近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；
ｅ）それぞれ、糖質部分または糖質様部分にリンクするためのペンダント官能基と近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基とを有するモノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを重合し、次いでモノマー単位残基を糖質部分または糖質様部分および近接度に基づいた信号発生／変調部分と反応させること；または
ｆ）それぞれ糖質部分または糖質様部分にリンクさせるためのペンダント官能基を有する第一モノマー単位と、それぞれ近接度に基づいた信号発生／変調部分にリンクするための異なるペンダント官能基を有する第二モノマー単位と、場合によっては第三モノマー単位とを共重合し、次いで糖質または糖質様部分を持つ第一モノマー単位残基と、近接度に基づいた信号発生／変調部分を持つ第二モノマー単位残基とを反応させること。
【請求項２１】
モノマー単位を付加重合によって反応する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
モノマー単位および／または第一モノマー単位が、アリルまたはビニルを含有する糖質または糖質様部分の誘導体である請求項２０または２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
モノマー単位および／または第二モノマー単位が、アミン官能基を含有する二重結合含有分子である請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図４ａ】
【図５】
【図５ａ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図４ａ】
【図５】
【図５ａ】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５１８６３５（Ｐ２００９−５１８６３５Ａ）
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３７１９（Ｐ２００８−５４３７１９）
【出願日】平成１８年１２月６日（２００６．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１７０８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６５６５３
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５０３１３６０４８）
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＥＣＩＳＥＮＳＥ Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月６日（２００６．１２．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１７０８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６５６５３
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（５０３１３６０４８）
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＥＣＩＳＥＮＳＥ Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】
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