核酸、メチル化状態及び核酸の突然変異体を検出するための、シグナリングペア及び疎水性ヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチド、ステムレスビーコン
本発明はシグナリングペア及び少なくとも疎水性ヌクレオチドを含む新規オリゴヌクレオチドに関する。前記オリゴヌクレオチドアナログは、存在、発現、メチル化及び／又は突然変異、特に単一の点突然変異、等の核酸配列の状態、並びに正しい標的と他の標的との間の差異がわずか１ヌクレオチドほどしか異ならない場合のある他の配列を検出する分野に関する。本発明はまた、オリゴヌクレオチドアナログ及び容易に入手可能な器具を用いることにより配列の相違の検出と条件の最適化とを行う新たな方法に関する。特に本発明は、シグナリングペア及び少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログ、例えばインターカレーターを含むヌクレオチドアナログ等を用いて、特異的に標的核酸の量を検出すること又は１ヌクレオチドほどしか異ならない場合のある他の配列に対して１個の配列を検出することに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列並びに少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドアナログが共有結合的にシグナリングペアに連結しており、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドが一般構造
Ｘ−Ｙ−Ｑ
[式中、
Ｘはヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ、又は核酸若しくは核酸アナログの主鎖に組み込まれ得る主鎖モノマー単位であり、
Ｑはワトソン・クリック水素結合には関与しない疎水性分子であり；そして、
Ｙは前記ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを連結するリンカー部分である］
を有し；そして、
ｎは少なくとも４の整数であり；そして、
前記の少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドが一方の末端から最大で９ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの位置に有り；そして、
前記シグナリングペアが２つの部分で構成されるシステムからなっており、ここで一方の部分が５’末端から最大で６ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの位置に有り、他方の部分が３’末端から最大で６ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの位置に有り；
前記シグナリングペアの前記部分が前記疎水性ヌクレオチドと同一ではなく、
前記シグナリングペアの１個の部分が突出末端として５’末端に位置している場合、５’末端の最初のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは疎水性ヌクレオチドではなく、前記シグナリングペアの１個の部分が突出末端として３’末端に位置している場合、３’末端の最初のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは疎水性ヌクレオチドではない
オリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２】
少なくとも１個の疎水性分子Ｑが、前記リンカーＹに結合する部位にメチル基が加わった際に０を超えるｌｏｇＰ値、例えば０．５超、例えば０．７５超、例えば１超、例えば１．２５超、例えば１．５超、例えば１．７５超、例えば２超、例えば２．５超、例えば３超、例えば４超、例えば５超を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３】
前記ｌｏｇＰ値がコンピュータプログラムＡＬＯＧＰＳ ２．１を用いて測定されたＡＬｏｇＰ値である請求項２記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項４】
少なくとも１個の疎水性分子Ｑが炭水化物類の鎖、ステロイド類、多環芳香族類（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅｓ）及び複素多環芳香族類（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅｓ）からなる群より選択される化学基を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項５】
少なくとも１個の疎水性分子Ｑが、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル（ｃａｒｂｏａｌｋｏｙｌ）、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル及びアミドからなる群より選択される１個又は複数によって任意に置換された多環芳香族類及び複素多環芳香族類からなる群より選択される、請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項６】
本発明の多環芳香族類又は複素多環芳香族類が１個、例えば２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個、例えば６個、例えば７個、例えば８個、例えば８個超の環からなっていてもよい請求項５記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項７】
少なくとも１個の疎水性分子Ｑがインターカレーター類及びマイナーグルーブ（副溝）バインダー類からなる群より選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項８】
少なくとも１個の疎水性分子Ｑがインターカレーター類からなる群より選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項９】
前記インターカレーター類がベンゼン、ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、ビフェニレン、アセナフチレン、フェナレン、ヘプタレン、フェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒａｎｅ）、フルオランテン、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン、フェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）、フルレン（ｆｌｕｒｅｎｅ）、ピセン、クリセン、ナフタセン（ｎａｐｈｔａｃｅｎｅ）、アクリドン類、ベンズアントラセン類、スチルベン類、オキサロ−ピリドカルバゾール類、アジドベンゼン類、ポルフィリン類及びソラーレン類並びにその誘導体からなる群より選択される請求項８記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１０】
少なくとも１個の疎水性基Ｑが：
からなる群より選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１１】
少なくとも１個の疎水性基がピレン又はピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（１Ｈ）−オン、又は７，９−ジメチル−ピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンを含む請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１２】
全ての疎水性分子Ｑが請求項２ないし１０のいずれか１項に記載の疎水性分子のいずれかから選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１３】
全ての疎水性分子Ｑがピレン又はピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（１Ｈ）−オン、又は７，９−ジメチル−ピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンである請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１４】
少なくとも１個の主鎖モノマー単位（Ｘ）が非環式主鎖モノマー単位類からなる群より選択される上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１５】
少なくとも１個の主鎖モノマー単位がホスホルアミダイト類からなる群より選択される請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１６】
少なくとも１個の主鎖モノマー単位がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、α−Ｄ−ＲＮＡ及びβ−Ｄ−ＲＮＡの主鎖モノマー単位からなる群より選択される請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１７】
１または複数個のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログがＤＮＡ及び／又は２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡヌクレオチドである請求項１ないし１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１８】
少なくとも１個の主鎖モノマー単位が核酸塩基又は核酸塩基アナログも含む請求項１６記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１９】
少なくとも１個のリンカーＹが少なくとも１個の主鎖モノマー単位の糖環、核酸塩基又はホスホルジエステル結合に結合する請求項１６記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２０】
少なくとも１個のリンカーＹがＣ、Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＰからなる群より選択されるｘ原子の鎖を含む請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２１】
前記鎖がＣ、Ｈ、Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＰからなる群より選択される１個又は複数で置換されている請求項２０記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２２】
前記シグナリングペアがこのペアの部分間の物理的距離に応じて検出可能なシグナルを変化させ得る請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２３】
前記検出可能なシグナルが蛍光である請求項２２記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２４】
前記シグナリングペアの前記部分が、前記シグナリングペアの部分が近接している場合に分子内エキシマー、分子内エキシプレックス、ＦＲＥＴ又は電荷移動錯体を形成し得る請求項１ないし２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２５】
前記シグナリングペアの一方の部分がフルオロフォアであり、前記シグナリングペアのもう一方の部分がクエンチャであり、前記フルオロフォア及び前記クエンチャが分子内ＦＲＥＴ複合体を形成し得る請求項１ないし２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２６】
前記シグナリングペアの一方の部分が突出末端として５’末端に位置しており、前記シグナリングペアのもう一方の部分が突出末端として３’末端に位置している請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２７】
ｎが少なくとも７の整数である請求項１ないし２６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドアナログが１から５個の間、例えば５から１０個の間、例えば１０から１５個の間、例えば１５から２０個の間の疎水性ヌクレオチドを有する請求項１ないし２７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが３個のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログあたり最大で１個の疎水性ヌクレオチドを有する請求項１ないし２８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドアナログが少なくとも２個の疎水性ヌクレオチドを有する上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３１】
全ての疎水性ヌクレオチドが少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドではないヌクレオチド又はヌクレオチドアナログによって分離されている請求項３０記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３２】
少なくとも２個の前記疎水性ヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドアナログの反対側半分に位置している請求項３０ないし３１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３３】
少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドが５’末端から９ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ以内に位置しており、少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドが３’末端から９ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ以内に位置している請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３４】
少なくとも２個の疎水性ヌクレオチドが前記シグナリングペアの各部分からおよそ同一の距離に位置している請求項３０ないし３３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３５】
前記疎水性ヌクレオチドの前記疎水性分子が互いに疎水性相互作用を行い、それによって前記シグナリングペアを例えば１００Å以内、例えば８０Å以内、例えば６０Å以内、例えば４０Å以内、例えば２０Å以内、例えば１５Å以内、例えば１０Å以内、例えば５Å以内に近接させ得る請求項３０ないし３３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３６】
前記シグナリングペアの一方の部分よりも５’末端に近く位置している疎水性ヌクレオチドが無く、前記シグナリングペアのもう一方の部分よりも３’末端に近く位置している疎水性ヌクレオチドが無い請求項３０ないし３５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドヌクレオチドアナログ。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドが固相に固定されている上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドがアレイの１コンポーネントである上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドアナログがその標的配列に対し、疎水性ヌクレオチドを有しない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと比較して同一の又はより高い親和性を有する、上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドが、前記の少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドを含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログよりもヌクレアーゼ分解を有意に受けにくい、上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドが水に可溶性である上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項４２】
前記オリゴヌクレオチドアナログ中の４個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列が、いずれも前記オリゴヌクレオチドアナログ中の他の４個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列と相補的ではない、上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項４３】
ａ）ｎ個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列並びに少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドアナログが２つの部分で構成されるシステムからなるシグナリングペアに共有結合的に連結しており、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドが一般構造
Ｘ−Ｙ−Ｑ
［式中、
Ｘはヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ、又は核酸若しくは核酸アナログの主鎖に組み込まれ得る主鎖モノマー単位であり、
Ｑは特定のワトソン・クリック水素結合には関与しない疎水性分子であり；そして、
Ｙは前記ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを連結するリンカー部分である］
を有し；そして、
ｎは少なくとも６の整数であり；そして、
前記ヌクレオチドアナログが標的配列にハイブリダイズしない場合の方が、前記ヌクレオチドアナログが標的配列にハイブリダイズする場合よりも、前記シグナリングペアの前記の２つの部分がより近接している
オリゴヌクレオチドアナログを提供し；そして、
ｂ）前記オリゴヌクレオチドアナログの標的配列を潜在的に含んだ核酸の混合物を提供し；そして、
ｃ）前記核酸及び前記オリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートし；そして、
ｄ）前記シグナリングペアの前記部分が近接しているかどうかを決定することによりハイブリダイゼーションを検出し；
ｅ）それによってハイブリダイゼーションを決定する
工程を含む、ハイブリダイゼーションを決定するための方法
【請求項４４】
前記ヌクレオチドアナログが請求項１ないし４２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログである請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記シグナリングペアの前記部分が互いの１００Å以内、例えば８０Å以内、例えば６０Å以内、例えば４０Å以内、例えば２０Å以内、例えば１５Å以内、例えば１０Å以内、例えば５Å以内にある場合に近接していると言われる請求項４３ないし４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１ないし４２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログと標的配列とのハイブリダイゼーションを増幅中に検出及び／又は定量する方法であって、前記方法が
ａ）標的配列を潜在的に含む核酸の混合物を提供し；そして、
ｂ）増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、１組のプライマー、及び請求項１ないし４２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアナログを提供し、ここで前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチドアナログは前記標的配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズすることが出来、前記増幅酵素が鋳型を標的とした様式でプライマーを伸長することが出来、前記増幅緩衝液が前記増幅酵素に対してこのような伸長をプライマー及び鋳型の存在下で行うための条件を提供し；そして、
ｃ）前記プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で前記プライマー及びオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物とともにインキュベートし；そして、
ｄ）前記標的配列を鋳型に用い、前記増幅酵素を使用して前記のハイブリダイズしたプライマーの３’末端を伸長し；そして、
ｅ）前記核酸、伸長産物及び前記オリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートし；そして、
ｆ）ハイブリダイゼーションを検出し、また任意にハイブリダイゼーションを定量し；そして、
ｇ）任意に工程ｃ）からｆ）までを反復する
工程を含む方法。
【請求項４７】
請求項１ないし４２のいずれか１項に記載の複数のオリゴヌクレオチドアナログが複数の標的又は変異配列の同時検出に用いられる請求項４３ないし４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
工程ｄ）、ｅ）及びｆ）の前記順番がｅ）、ｆ）及びｄ）に変わった請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
核酸の前記混合物が増幅の産物である請求項４３ないし４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的配列が増幅産物に含まれる請求項４３ないし４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記方法が「密閉チューブ」（均一）反応として行われる請求項４３ないし５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的配列がＤＮＡ又はＲＮＡからなる核酸である請求項４３ないし５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡが化学的に又は酵素的に処理された、例えば亜硫酸水素ナトリウムで処理された、ものである請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が生死を問わない細胞又は組織において標的配列を検出するために用いられる請求項４３ないし４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが前記細胞又は組織の標的配列を検出するために用いられる請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記シグナリングペアがこのペアの前記部分間の物理的な距離に応じて検出可能なシグナルを変化させ得、この検出可能なシグナルの変化を検出することによりハイブリダイゼーションが検出される請求項４３ないし５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記シグナリングペアがこのペアの前記部分間の物理的な距離に応じて検出可能なシグナルを変化させることができ、そして、この検出可能なシグナルの変化を定量することによりハイブリダイゼーションが定量される請求項４３ないし５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
所定の範囲を超えたシグナルがハイブリダイゼーションの指標となる請求項５６ないし５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
所定の範囲を下回るシグナルがハイブリダイゼーションの指標となる請求項５６ないし５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記の検出可能なシグナルの検出が前記オリゴヌクレオチドアナログのスペクトル特性の測定を含む請求項４３ないし５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記スペクトル特性が蛍光特性である請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
ハイブリダイゼーションの前記検出が融解温度及び／又は親和温度の測定を含む請求項４３ないし６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
所定の範囲を超えた融解又は親和温度がハイブリダイゼーションの指標である請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
ハイブリダイゼーションが、標的配列が前記鋳型中に存在することの指標である請求項４３ないし６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
高い融解温度が変異配列へのハイブリダイゼーションの指標であり、低い融解温度が標的配列へのハイブリダイゼーションの指標である請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
高い融解温度が前記標的配列へのハイブリダイゼーションの指標であり、低い融解温度が変異配列へのハイブリダイゼーションの指標である請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
前記シグナリングペアにより生成した検出可能なシグナルの強度が標的又は変異配列が存在する量と相関し得る請求項４３ないし６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記オリゴヌクレオチドアナログが前記方法全体にわたって安定である請求項４３ないし６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記オリゴヌクレオチドアナログがさらなる測定又は精度管理のために用いられ得る請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記増幅酵素がヌクレアーゼ活性を有する請求項４６ないし６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
ヌクレアーゼ活性が前記シグナリングペアの最も５’の部分を除去する請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記標的配列が少なくとも１個の多型サイトを有すると期待される請求項４３ないし７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記オリゴヌクレオチドアナログが前記標的配列に相補的であり、前記の少なくとも１個の多型サイトが前記オリゴヌクレオチドアナログの中央部分内に位置している請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
オリゴヌクレオチドアナログが前記標的配列に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドアナログが前記の少なくとも１個の多型サイトにＡ又はＣを有する請求項７２及び７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
請求項１ないし４０のいずれか１項に記載の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドアナログが提供され、前記オリゴヌクレオチドアナログの１種が前記標的配列の１個の遺伝子型に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドアナログの他のものが前記標的配列の他の遺伝子型に相補的である請求項７２記載の方法。
【請求項７６】
前記の第１のオリゴヌクレオチドアナログが前記の第２のオリゴヌクレオチドアナログとも相同相補的である請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
一方のオリゴヌクレオチドアナログが「Ｃ」−核酸塩基を前記多型サイトに有しており、他方のオリゴヌクレオチドアナログが「Ａ」−核酸塩基を前記多型サイトに有している請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
前記オリゴヌクレオチドアナログの前記シグナリングペアが互いに区別され得る検出可能なシグナルを生成する請求項７５ないし７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
オリゴヌクレオチドアナログの標的配列への親和温度を測定する方法であって、前記方法が請求項４３ないし７８のいずれか１項に記載の方法を実施することを含み、最後の工程の後に以下の工程が実施される方法：
ａ）前記混合液を変性し、前記親和温度を超える第一の所定の温度まで急速に冷却し；そして、
ｂ）前記シグナリングペアからの検出可能なシグナルを測定することによりハイブリダイゼーションを検出し、ここで前記シグナリングペアは前記ペアの前記部分間の物理的距離に応じて前記の検出可能なシグナルを変化させることが出来；そして
ｃ）前記混合物を変性し、第二の所定の温度まで急速に冷却し、ここで前記の第二の所定の温度は前記の第一の所定の温度よりも低く、
ｄ）前記の検出可能なシグナルを測定することによりハイブリダイゼーションを検出し。
ｅ）３）及び４）の工程を反復し、ここで前記の所定の温度は徐々に前記親和温度未満にまで下げられ、
ｆ）そして、前記核酸アナログの前記標的配列に対する前記親和温度を測定する。
【請求項８０】
標的配列の増幅のための方法であって、前記方法が
ａ）前記標的配列を任意に含んだ核酸の混合物を提供し；そして
ｂ）１組のプライマー、増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを提供し、ここで前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは前記標的配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズすることが出来、前記増幅酵素がヌクレアーゼ活性を有する場合は前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログがヌクレアーゼ抵抗性であり；そして、
ｃ）前記プライマー及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物とハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートし；そして、
ｄ）ハイブリダイゼーションを検出し；そして
ｅ）前記の所望の伸長温度に達するまで特定の間隔でハイブリダイゼーションを検出しながら徐々に温度を上昇させ、そして
ｆ）伸長反応を終了させ、生成したアンプリコンを変性し、所望の増幅が生ずるまで工程ｃ）からｆ）を反復する
工程を含む方法。
【請求項８１】
前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログが請求項１ないし４０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログである請求項７９及び８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記の漸進的な温度の変化が各回ごとに例えば０．５℃、例えば１℃、例えば２℃、例えば３℃、例えば４℃、例えば５℃、例えば５℃超である請求項７９ないし８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記方法が密閉されたチューブ内で実施される請求項７９ないし８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記の所定の温度への到達とハイブリダイゼーション検出との間の時間が、短いオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログにとって標的配列にアニールするのに十分である請求項７９ないし８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記の所定の温度への到達とハイブリダイゼーション検出との間の時間が例えば１秒、例えば２秒、例えば３秒、例えば４秒、例え５ば秒、例えば６秒、例えば７秒、例えば８秒、例えば９秒、例えば１０秒、例えば１１秒、例えば１２秒、例えば１３秒、例えば１４秒、例えば１５秒、例えば１秒と１５秒との間、例えば３秒と２０秒との間である請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
前記親和温度が標的配列とその変異配列とを識別するために用いられる請求項７９ないし８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
請求項１ないし４２のいずれか１項に記載の２種又はそれよりも多いオリゴヌクレオチドアナログが同一の密閉されたチューブ内で用いられる請求項７９ないし８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記オリゴヌクレオチドアナログの前記シグナリングペアが互いに区別され得る検出可能なシグナルを生成することが出来る請求項８７記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項８９】
少なくとも１種のオリゴヌクレオチドアナログが標的配列に相補的であり、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドアナログが変異配列に相補的である請求項８７記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１】
ｎ個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列並びに少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドアナログが共有結合的にシグナリングペアに連結しており、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドが一般構造
Ｘ−Ｙ−Ｑ
[式中、
Ｘはヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ、又は核酸若しくは核酸アナログの主鎖に組み込まれ得る主鎖モノマー単位であり、
Ｑはワトソン・クリック水素結合には関与しない疎水性分子であり；そして、
Ｙは前記ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを連結するリンカー部分である］
を有し；そして、
ｎは少なくとも４の整数であり；そして、
前記の少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドが一方の末端から最大で９ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの位置に有り；そして、
前記シグナリングペアが２つの部分で構成されるシステムからなっており、ここで一方の部分が５’末端から最大で６ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの位置に有り、他方の部分が３’末端から最大で６ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの位置に有り；
前記シグナリングペアの前記部分が前記疎水性ヌクレオチドと同一ではなく、
前記シグナリングペアの１個の部分が突出末端として５’末端に位置している場合、５’末端の最初のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは疎水性ヌクレオチドではなく、前記シグナリングペアの１個の部分が突出末端として３’末端に位置している場合、３’末端の最初のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは疎水性ヌクレオチドではない
オリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２】
少なくとも１個の疎水性分子Ｑが、前記リンカーＹに結合する部位にメチル基が加わった際に０を超えるｌｏｇＰ値、例えば０．５超、例えば０．７５超、例えば１超、例えば１．２５超、例えば１．５超、例えば１．７５超、例えば２超、例えば２．５超、例えば３超、例えば４超、例えば５超を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３】
前記ｌｏｇＰ値がコンピュータプログラムＡＬＯＧＰＳ ２．１を用いて測定されたＡＬｏｇＰ値である請求項２記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項４】
少なくとも１個の疎水性分子Ｑが炭水化物類の鎖、ステロイド類、多環芳香族類（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅｓ）及び複素多環芳香族類（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙａｒｏｍａｔｅｓ）からなる群より選択される化学基を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項５】
少なくとも１個の疎水性分子Ｑが、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル（ｃａｒｂｏａｌｋｏｙｌ）、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル及びアミドからなる群より選択される１個又は複数によって任意に置換された多環芳香族類及び複素多環芳香族類からなる群より選択される、請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項６】
本発明の多環芳香族類又は複素多環芳香族類が１個、例えば２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個、例えば６個、例えば７個、例えば８個、例えば８個超の環からなっていてもよい請求項５記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項７】
少なくとも１個の疎水性分子Ｑがインターカレーター類及びマイナーグルーブ（副溝）バインダー類からなる群より選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項８】
少なくとも１個の疎水性分子Ｑがインターカレーター類からなる群より選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項９】
前記インターカレーター類がベンゼン、ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、ビフェニレン、アセナフチレン、フェナレン、ヘプタレン、フェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒａｎｅ）、フルオランテン、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン、フェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）、フルレン（ｆｌｕｒｅｎｅ）、ピセン、クリセン、ナフタセン（ｎａｐｈｔａｃｅｎｅ）、アクリドン類、ベンズアントラセン類、スチルベン類、オキサロ−ピリドカルバゾール類、アジドベンゼン類、ポルフィリン類及びソラーレン類並びにその誘導体からなる群より選択される請求項８記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１０】
少なくとも１個の疎水性基Ｑが：
からなる群より選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１１】
少なくとも１個の疎水性基がピレン又はピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（１Ｈ）−オン、又は７，９−ジメチル−ピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンを含む請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１２】
全ての疎水性分子Ｑが請求項２ないし１０のいずれか１項に記載の疎水性分子のいずれかから選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１３】
全ての疎水性分子Ｑがピレン又はピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（１Ｈ）−オン、又は７，９−ジメチル−ピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンである請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１４】
少なくとも１個の主鎖モノマー単位（Ｘ）が非環式主鎖モノマー単位類からなる群より選択される上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１５】
少なくとも１個の主鎖モノマー単位がホスホルアミダイト類からなる群より選択される請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１６】
少なくとも１個の主鎖モノマー単位がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、α−Ｄ−ＲＮＡ及びβ−Ｄ−ＲＮＡの主鎖モノマー単位からなる群より選択される請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１７】
１または複数個のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログがＤＮＡ及び／又は２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡヌクレオチドである請求項１ないし１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１８】
少なくとも１個の主鎖モノマー単位が核酸塩基又は核酸塩基アナログも含む請求項１６記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項１９】
少なくとも１個のリンカーＹが少なくとも１個の主鎖モノマー単位の糖環、核酸塩基又はホスホルジエステル結合に結合する請求項１６記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２０】
少なくとも１個のリンカーＹがＣ、Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＰからなる群より選択されるｘ原子の鎖を含む請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２１】
前記鎖がＣ、Ｈ、Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＰからなる群より選択される１個又は複数で置換されている請求項２０記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２２】
前記シグナリングペアがこのペアの部分間の物理的距離に応じて検出可能なシグナルを変化させ得る請求項１ないし２１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２３】
前記検出可能なシグナルが蛍光である請求項２２記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２４】
前記シグナリングペアの前記部分が、前記シグナリングペアの部分が近接している場合に分子内エキシマー、分子内エキシプレックス、ＦＲＥＴ又は電荷移動錯体を形成し得る請求項１ないし２３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２５】
前記シグナリングペアの一方の部分がフルオロフォアであり、前記シグナリングペアのもう一方の部分がクエンチャであり、前記フルオロフォア及び前記クエンチャが分子内ＦＲＥＴ複合体を形成し得る請求項１ないし２４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２６】
前記シグナリングペアの一方の部分が突出末端として５’末端に位置しており、前記シグナリングペアのもう一方の部分が突出末端として３’末端に位置している請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２７】
ｎが少なくとも７の整数である請求項１ないし２６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドアナログが１から５個の間、例えば５から１０個の間、例えば１０から１５個の間、例えば１５から２０個の間の疎水性ヌクレオチドを有する請求項１ないし２７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが３個のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログあたり最大で１個の疎水性ヌクレオチドを有する請求項１ないし２８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドアナログが少なくとも２個の疎水性ヌクレオチドを有する上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３１】
全ての疎水性ヌクレオチドが少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドではないヌクレオチド又はヌクレオチドアナログによって分離されている請求項３０記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３２】
少なくとも２個の前記疎水性ヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドアナログの反対側半分に位置している請求項３０ないし３１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３３】
少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドが５’末端から９ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ以内に位置しており、少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドが３’末端から９ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ以内に位置している請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３４】
少なくとも２個の疎水性ヌクレオチドが前記シグナリングペアの各部分からおよそ同一の距離に位置している請求項３０ないし３３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３５】
前記疎水性ヌクレオチドの前記疎水性分子が互いに疎水性相互作用を行い、それによって前記シグナリングペアを例えば１００Å以内、例えば８０Å以内、例えば６０Å以内、例えば４０Å以内、例えば２０Å以内、例えば１５Å以内、例えば１０Å以内、例えば５Å以内に近接させ得る請求項３０ないし３３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３６】
前記シグナリングペアの一方の部分よりも５’末端に近く位置している疎水性ヌクレオチドが無く、前記シグナリングペアのもう一方の部分よりも３’末端に近く位置している疎水性ヌクレオチドが無い請求項３０ないし３５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドヌクレオチドアナログ。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドが固相に固定されている上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドがアレイの１コンポーネントである上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドアナログがその標的配列に対し、疎水性ヌクレオチドを有しない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログと比較して同一の又はより高い親和性を有する、上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドが、前記の少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドを含まない対応するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログよりもヌクレアーゼ分解を有意に受けにくい、上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドが水に可溶性である上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項４２】
前記オリゴヌクレオチドアナログ中の４個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列が、いずれも前記オリゴヌクレオチドアナログ中の他の４個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列と相補的ではない、上記請求項のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項４３】
ａ）ｎ個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列並びに少なくとも１個の疎水性ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドアナログが２つの部分で構成されるシステムからなるシグナリングペアに共有結合的に連結しており、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドが一般構造
Ｘ−Ｙ−Ｑ
［式中、
Ｘはヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ、又は核酸若しくは核酸アナログの主鎖に組み込まれ得る主鎖モノマー単位であり、
Ｑは特定のワトソン・クリック水素結合には関与しない疎水性分子であり；そして、
Ｙは前記ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを連結するリンカー部分である］
を有し；そして、
ｎは少なくとも６の整数であり；そして、
前記ヌクレオチドアナログが標的配列にハイブリダイズしない場合の方が、前記ヌクレオチドアナログが標的配列にハイブリダイズする場合よりも、前記シグナリングペアの前記の２つの部分がより近接している
オリゴヌクレオチドアナログを提供し；そして、
ｂ）前記オリゴヌクレオチドアナログの標的配列を潜在的に含んだ核酸の混合物を提供し；そして、
ｃ）前記核酸及び前記オリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートし；そして、
ｄ）前記シグナリングペアの前記部分が近接しているかどうかを決定することによりハイブリダイゼーションを検出し；
ｅ）それによってハイブリダイゼーションを決定する
工程を含む、ハイブリダイゼーションを決定するための方法
【請求項４４】
前記ヌクレオチドアナログが請求項１ないし４２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログである請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記シグナリングペアの前記部分が互いの１００Å以内、例えば８０Å以内、例えば６０Å以内、例えば４０Å以内、例えば２０Å以内、例えば１５Å以内、例えば１０Å以内、例えば５Å以内にある場合に近接していると言われる請求項４３ないし４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１ないし４２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログと標的配列とのハイブリダイゼーションを増幅中に検出及び／又は定量する方法であって、前記方法が
ａ）標的配列を潜在的に含む核酸の混合物を提供し；そして、
ｂ）増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、１組のプライマー、及び請求項１ないし４２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアナログを提供し、ここで前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチドアナログは前記標的配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズすることが出来、前記増幅酵素が鋳型を標的とした様式でプライマーを伸長することが出来、前記増幅緩衝液が前記増幅酵素に対してこのような伸長をプライマー及び鋳型の存在下で行うための条件を提供し；そして、
ｃ）前記プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で前記プライマー及びオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物とともにインキュベートし；そして、
ｄ）前記標的配列を鋳型に用い、前記増幅酵素を使用して前記のハイブリダイズしたプライマーの３’末端を伸長し；そして、
ｅ）前記核酸、伸長産物及び前記オリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートし；そして、
ｆ）ハイブリダイゼーションを検出し、また任意にハイブリダイゼーションを定量し；そして、
ｇ）任意に工程ｃ）からｆ）までを反復する
工程を含む方法。
【請求項４７】
請求項１ないし４２のいずれか１項に記載の複数のオリゴヌクレオチドアナログが複数の標的又は変異配列の同時検出に用いられる請求項４３ないし４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
工程ｄ）、ｅ）及びｆ）の前記順番がｅ）、ｆ）及びｄ）に変わった請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
核酸の前記混合物が増幅の産物である請求項４３ないし４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的配列が増幅産物に含まれる請求項４３ないし４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記方法が「密閉チューブ」（均一）反応として行われる請求項４３ないし５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的配列がＤＮＡ又はＲＮＡからなる核酸である請求項４３ないし５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡが化学的に又は酵素的に処理された、例えば亜硫酸水素ナトリウムで処理された、ものである請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記方法が生死を問わない細胞又は組織において標的配列を検出するために用いられる請求項４３ないし４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが前記細胞又は組織の標的配列を検出するために用いられる請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記シグナリングペアがこのペアの前記部分間の物理的な距離に応じて検出可能なシグナルを変化させ得、この検出可能なシグナルの変化を検出することによりハイブリダイゼーションが検出される請求項４３ないし５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記シグナリングペアがこのペアの前記部分間の物理的な距離に応じて検出可能なシグナルを変化させることができ、そして、この検出可能なシグナルの変化を定量することによりハイブリダイゼーションが定量される請求項４３ないし５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
所定の範囲を超えたシグナルがハイブリダイゼーションの指標となる請求項５６ないし５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
所定の範囲を下回るシグナルがハイブリダイゼーションの指標となる請求項５６ないし５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記の検出可能なシグナルの検出が前記オリゴヌクレオチドアナログのスペクトル特性の測定を含む請求項４３ないし５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記スペクトル特性が蛍光特性である請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
ハイブリダイゼーションの前記検出が融解温度及び／又は親和温度の測定を含む請求項４３ないし６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
所定の範囲を超えた融解又は親和温度がハイブリダイゼーションの指標である請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
ハイブリダイゼーションが、標的配列が前記鋳型中に存在することの指標である請求項４３ないし６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
高い融解温度が変異配列へのハイブリダイゼーションの指標であり、低い融解温度が標的配列へのハイブリダイゼーションの指標である請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
高い融解温度が前記標的配列へのハイブリダイゼーションの指標であり、低い融解温度が変異配列へのハイブリダイゼーションの指標である請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
前記シグナリングペアにより生成した検出可能なシグナルの強度が標的又は変異配列が存在する量と相関し得る請求項４３ないし６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記オリゴヌクレオチドアナログが前記方法全体にわたって安定である請求項４３ないし６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記オリゴヌクレオチドアナログがさらなる測定又は精度管理のために用いられ得る請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記増幅酵素がヌクレアーゼ活性を有する請求項４６ないし６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
ヌクレアーゼ活性が前記シグナリングペアの最も５’の部分を除去する請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記標的配列が少なくとも１個の多型サイトを有すると期待される請求項４３ないし７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記オリゴヌクレオチドアナログが前記標的配列に相補的であり、前記の少なくとも１個の多型サイトが前記オリゴヌクレオチドアナログの中央部分内に位置している請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
オリゴヌクレオチドアナログが前記標的配列に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドアナログが前記の少なくとも１個の多型サイトにＡ又はＣを有する請求項７２及び７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
請求項１ないし４０のいずれか１項に記載の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドアナログが提供され、前記オリゴヌクレオチドアナログの１種が前記標的配列の１個の遺伝子型に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドアナログの他のものが前記標的配列の他の遺伝子型に相補的である請求項７２記載の方法。
【請求項７６】
前記の第１のオリゴヌクレオチドアナログが前記の第２のオリゴヌクレオチドアナログとも相同相補的である請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
一方のオリゴヌクレオチドアナログが「Ｃ」−核酸塩基を前記多型サイトに有しており、他方のオリゴヌクレオチドアナログが「Ａ」−核酸塩基を前記多型サイトに有している請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
前記オリゴヌクレオチドアナログの前記シグナリングペアが互いに区別され得る検出可能なシグナルを生成する請求項７５ないし７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
オリゴヌクレオチドアナログの標的配列への親和温度を測定する方法であって、前記方法が請求項４３ないし７８のいずれか１項に記載の方法を実施することを含み、最後の工程の後に以下の工程が実施される方法：
ａ）前記混合液を変性し、前記親和温度を超える第一の所定の温度まで急速に冷却し；そして、
ｂ）前記シグナリングペアからの検出可能なシグナルを測定することによりハイブリダイゼーションを検出し、ここで前記シグナリングペアは前記ペアの前記部分間の物理的距離に応じて前記の検出可能なシグナルを変化させることが出来；そして
ｃ）前記混合物を変性し、第二の所定の温度まで急速に冷却し、ここで前記の第二の所定の温度は前記の第一の所定の温度よりも低く、
ｄ）前記の検出可能なシグナルを測定することによりハイブリダイゼーションを検出し。
ｅ）３）及び４）の工程を反復し、ここで前記の所定の温度は徐々に前記親和温度未満にまで下げられ、
ｆ）そして、前記核酸アナログの前記標的配列に対する前記親和温度を測定する。
【請求項８０】
標的配列の増幅のための方法であって、前記方法が
ａ）前記標的配列を任意に含んだ核酸の混合物を提供し；そして
ｂ）１組のプライマー、増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを提供し、ここで前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは前記標的配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズすることが出来、前記増幅酵素がヌクレアーゼ活性を有する場合は前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログがヌクレアーゼ抵抗性であり；そして、
ｃ）前記プライマー及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物とハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートし；そして、
ｄ）ハイブリダイゼーションを検出し；そして
ｅ）前記の所望の伸長温度に達するまで特定の間隔でハイブリダイゼーションを検出しながら徐々に温度を上昇させ、そして
ｆ）伸長反応を終了させ、生成したアンプリコンを変性し、所望の増幅が生ずるまで工程ｃ）からｆ）を反復する
工程を含む方法。
【請求項８１】
前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログが請求項１ないし４０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドアナログである請求項７９及び８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記の漸進的な温度の変化が各回ごとに例えば０．５℃、例えば１℃、例えば２℃、例えば３℃、例えば４℃、例えば５℃、例えば５℃超である請求項７９ないし８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記方法が密閉されたチューブ内で実施される請求項７９ないし８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記の所定の温度への到達とハイブリダイゼーション検出との間の時間が、短いオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログにとって標的配列にアニールするのに十分である請求項７９ないし８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記の所定の温度への到達とハイブリダイゼーション検出との間の時間が例えば１秒、例えば２秒、例えば３秒、例えば４秒、例え５ば秒、例えば６秒、例えば７秒、例えば８秒、例えば９秒、例えば１０秒、例えば１１秒、例えば１２秒、例えば１３秒、例えば１４秒、例えば１５秒、例えば１秒と１５秒との間、例えば３秒と２０秒との間である請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
前記親和温度が標的配列とその変異配列とを識別するために用いられる請求項７９ないし８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
請求項１ないし４２のいずれか１項に記載の２種又はそれよりも多いオリゴヌクレオチドアナログが同一の密閉されたチューブ内で用いられる請求項７９ないし８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記オリゴヌクレオチドアナログの前記シグナリングペアが互いに区別され得る検出可能なシグナルを生成することが出来る請求項８７記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【請求項８９】
少なくとも１種のオリゴヌクレオチドアナログが標的配列に相補的であり、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドアナログが変異配列に相補的である請求項８７記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００９−５２９３３７（Ｐ２００９−５２９３３７Ａ）
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８６４０（Ｐ２００８−５５８６４０）
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００７／０００１３４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０４３１８
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０８２７８６９７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００７／０００１３４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０４３１８
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０８２７８６９７）
【Ｆターム（参考）】
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