核酸の放出性に優れたリポソームベクター
【課題】 本発明は、ポリロタキサンと核酸との複合体を封入した細胞導入効率ならびに封入物の放出効率に優れた新たなリポソームベクターを開発することを目的とする。
【解決手段】 本発明は、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンと核酸との複合体が封入されてなるリポソームベクターであって、前記ポリロタキサンが正の電荷を有する置換基によって修飾されることで４０〜６０の正の電荷を有している、前記リポソームベクターに関する。本発明のリポソームベクターは、細胞内における封入された核酸の放出効率に優れており、生体に投与された核酸の発現効率が高められることで、従来のリポソームベクターよりも優れた治療効果を期待することができる。
【解決手段】 本発明は、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンと核酸との複合体が封入されてなるリポソームベクターであって、前記ポリロタキサンが正の電荷を有する置換基によって修飾されることで４０〜６０の正の電荷を有している、前記リポソームベクターに関する。本発明のリポソームベクターは、細胞内における封入された核酸の放出効率に優れており、生体に投与された核酸の発現効率が高められることで、従来のリポソームベクターよりも優れた治療効果を期待することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内部に封入された核酸の細胞内における放出性に優れたリポソームベクターとその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームを用いて薬物や核酸を生体に投与するに際して、薬物等の効果を発揮させるためには、リポソームが細胞に効率的に導入されることと同時に、細胞内に導入されたリポソームからその内部に封入された薬物等が効果的に放出されることが重要である。
【０００３】
リポソームが細胞に導入される効率を細胞導入効率と表せば、この細胞導入効率を高める方法として、リポソームの表面を複数のアルギニン残基からなるペプチド、例えばアルギニン８残基からなるオクタアルギニンペプチド（以下、Ｒ８ペプチドと称する）で修飾する方法が開発されている（非特許文献１）。このＲ８ペプチドで表面が修飾されたリポソームの細胞導入効率は、Ｒ８ペプチドを持たないリポソームのそれの１００倍ほどである。この様な機能が付加されたリポソームは、多機能性エンベロープ型ナノ構造体（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｔｙｐｅ ｎａｎｏ ｄｅｖｉｃｅ；Ｒ８−ＭＥＮＤ）とも呼ばれている。
【０００４】
一方、細胞内に導入されたリポソームの内部から封入された物質を放出させる効率を放出効率と表せば、この放出効率を高める技術は開発途上にある。特に封入物が核酸等の負に帯電した高分子化合物である場合、かかる高分子化合物を凝集化素子と呼ばれる物質を利用して凝縮化することが行われるが、この様な場合には、いったん凝縮化された物質を改めて解放させ、さらにリポソームを構成する脂質膜から細胞内部に放出させなければならない。従って、凝縮化素子を用いてリポソーム内に封入された物質に関するリポソームからの前記放出効率は、凝縮化素子からの物質の解放能（以下、デコンデンス能と表す）によっても影響を受ける。
【０００５】
リポソームに封入される物質、例えば核酸等に用いられる凝縮化素子の例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、プロタミン等のポリアミノ酸化合物や、ポリエチレンイミン等のポリカチオン性ポリマー等を挙げることができる。
【０００６】
本発明者らは、ポリＬ−リジンやプロタミン等のポリアミノ酸化合物とは異なる新たな凝縮化素子として、ポリロタキサンと呼ばれる化合物を開発した（非特許文献２、特許文献１、特許文献２）。ポリロタキサンは、両端に加水分解性の結合を介して嵩高い官能基が結合された線状高分子が複数の環状分子を貫通してなる構造を有する包接化合物である。
【０００７】
ポリロタキサンは核酸等の負に荷電している化合物と静電的に結合して複合体を形成する性質を有しているが、この複合体が細胞質等の生理的条件下に置かれると、負に荷電している化合物が複合体から遊離される。これは、生理的条件下でポリロタキサンの両端にある加水分解性の結合が切断されて嵩高い基が離脱し、線状分子に貫通されることで密に近接していた環状分子が互いに離れることによるものと推察されている。
【０００８】
この様に、ポリロタキサンは核酸を凝縮化して複合体を形成する能力を有する一方、良好なデコンデンス能も有しており、細胞内の生理条件下で封入物を放出させる必要のあるリポソームにとって有益な物質である。しかし、ポリロタキサンのデコンデンス能とリポソームからの放出効率との関連については未だ十分な知見は蓄えられてはいない。
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｏｇｕｒｅら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２００４年、第９８巻、第３１７−３２３頁
【非特許文献２】Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６年、第１巻、第６号、第２８６１−２８６９頁
【特許文献１】国際特許出願公開ＷＯ２００２／０２１５９号パンフレット
【特許文献２】日本特許第４１０４５５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ポリロタキサンと核酸との複合体を封入した細胞導入効率ならびに封入物の放出効率に優れた新たなリポソームベクターを開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ポリロタキサンと核酸との複合体を封入したリポソームの作製に際して、ポリロタキサンと核酸との複合体の高いデコンデンス能とリポソームからの封入物の高い放出効率とが必ずしも一致しないこと、特に一定数の正の電荷を有するポリロタキサンがピーク的に最も高い放出効率を示すことを見いだし、以下の各発明を完成させた。
【００１２】
複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンと核酸との複合体が封入されてなるリポソームベクターであって、前記ポリロタキサンが正の電荷を有する置換基によって修飾されることで４０〜６０の正の電荷を有している、前記リポソームベクター。
【００１３】
環状分子が環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン及び環状ポリアミンよりなる群から選ばれる１種以上である、請求項１に記載のリポソームベクター。
【００１４】
環状分子がα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンよりなる群から選ばれる１種以上である、請求項２に記載のリポソームベクター。
【００１５】
シクロデキストリンがα−シクロデキストリンである、請求項３に記載のリポソームベクター。
【００１６】
線状分子がポリアルキレングリコールもしくはその２種以上の共重合体又はポリアルキルビニルエーテルである、請求項１〜４の何れかに記載のリポソームベクター。
【００１７】
ポリアルキレングリコールが分子量１０００〜１０００００のポリエチレングリコールである、請求項５に記載のリポソームベクター。
【００１８】
前記嵩高い置換基がベンジルオキシカルボニルチロシンである、請求項１〜６の何れかに記載のリポソームベクター。
【００１９】
前記ポリロタキサンの正の電荷が核酸の負電荷の０．３〜０．６倍又は３〜６倍である、請求項１〜７の何れかに記載のリポソームベクター。
【００２０】
正の電荷を有する置換基がモノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、イミノ基及びグアニジノ基よりなる群から選ばれる一種以上である、請求項１〜８の何れかに記載のリポソームベクター。
【００２１】
正の電荷を有する置換基がジメチルアミノエチル基である、請求項９に記載のリポソームベクター。
【００２２】
細胞膜透過性ペプチドをさらに脂質膜表面に有する、請求項１〜１０の何れかに記載のリポソームベクター。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のリポソームベクターは、細胞内における封入された核酸の放出効率に優れており、生体に投与された核酸の発現効率が高められることで、従来のリポソームベクターよりも優れた治療効果を期待することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンと核酸との複合体が封入されてなるリポソームベクターであって、前記ポリロタキサンが正の電荷を有する置換基によって修飾されることで４０〜６０の正の電荷を有している、前記リポソームベクターに関する。
【００２５】
前記ポリロタキサンを構成する環状分子としては、α、β又はγ−シクロデキストリンや、これらと類似の環状構造を持つものであってよく、そのような環状構造としては環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、環状ポリアミン、環状フラクタン等が挙げることができるがこれらに特に限定されるものではない。また、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンその他グルコース単位からなる環状オリゴ糖であればよいが、好ましくはα−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリン、より好ましくはα−シクロデキストリン（以下、α−ＣＤと表す）である。
【００２６】
前記ポリロタキサンを構成する線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体等のポリアルキレングリコール、ポリアミノ酸、多糖類及びポリメチルビニルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上を例示することができる。本発明においては、後に説明する嵩高い置換基の導入が行えるポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコールが好ましい。
【００２７】
ポリアルキレングリコールは、アルキレンオキサイドの付加重合によって得られるオリゴマーであればよく、本発明ではポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、これらのブロック共重合体等を使用することができる。またオリゴマーの分子量は１０００〜１０００００の範囲であることが好ましく、より好ましくは１０００〜４００００である。本発明の包接化合物を構成する好ましいポリアルキレングリコールは、分子量１０００〜１０００００のポリエチレングリコールである。以下、ポリエチレングリコールをＰＥＧと表す。
【００２８】
本発明にいう加水分解性結合としては、生体内で加水分解する結合であればどのような結合であってもよいが、エステル結合、シッフ塩基結合、カーバメート結合、ペプチド結合、エーテル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合等の各種の加水分解性の結合であってよい。このうち、生体内で速やかに非酵素的に加水分解することを考慮すればエステル結合又はジスルフィド結合であることが好ましい。
【００２９】
前記ポリロタキサンを構成する生体親和性基の嵩高い置換基としては、生体に対する親和性（生体に対する安全性）の高い基であって、線状分子から環状分子が抜け落ちるのを防止できる嵩高さを有する限りどのような基であってもよく、アミノ酸、ペプチド、単糖類、オリゴ糖類又はそれらの誘導体等を挙げることができる。アミノ酸としては、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジンを挙げることができる。このうち、ベンゼン環を有するアミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等が好ましい。
【００３０】
また、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フレオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジルエステル（ＯＢｚ）基、第三ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）基、アミノ酸第三ブチルエステル（ＯＢｕ基）等の１以上のベンゼン環を有する基又は１以上の第三ブチルを有する基で修飾されたアミノ酸、例えばＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン等も利用することができる。さらに、アミノ酸の複数がペプチド結合して形成されたペプチド、オリゴ糖類、デキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、でんぷん、さらにはオリゴ糖類、多糖若しくは単糖をアセチル化やイソプロピル化等によって化学修飾した糖誘導体も利用可能である。
【００３１】
前記ポリロタキサンの好ましい具体例としては、上記線状分子がＰＥＧ４０００、上記環状分子がα−ＣＤ、上記加水分解性結合がジスルフィド結合、上記嵩高い置換基を有する生体内分解性基がＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンであることが特に好ましい。なお、α−ＣＤをＰＥＧに貫通させる場合、α−ＣＤとＰＥＧの繰り返し単位（エチレンオキシド単位）の比の化学量論数は１：２といわれている。
【００３２】
本発明におけるポリロタキサンは、窒素原子を含む正に荷電した置換基で修飾されていることが好ましい。窒素原子は正に荷電してカチオン化する性質を有していることから、負電荷を有している核酸の凝集効果が向上する。正の電荷を有する置換基は、包接体中のシクロデキストリンに対して導入されることが好ましく、また置換基としては、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジメチルアミノエチル基等のジアルキルアミノ基、イミノ基、グアニジノ基等を挙げることができるが、ジアルキルアミノ基、特にジメチルアミノエチル基が好ましい。
【００３３】
本発明におけるポリロタキサンは、典型的には非特許文献２又は特許文献に詳細に記載された方法によって作製することができる。この非特許文献２及び特許文献の記載の全ては本明細書に参照して取り込まれるが、その作製方法は、両末端にアミノ基が導入されたＰＥＧとα−ＣＤとを混合して両者からなる包接体を形成させる工程ａ）、前記包接体を適当な縮合剤とα−ＣＤの環状構造における環の内径よりも嵩高い置換基を有する化合物と共に有機溶媒に懸濁してＰＥＧの末端に前記置換基を導入する工程ｂ）、及び前記工程ａ）ｂ）によって作製されるポリロタキサンに正の電荷を有する置換基を導入する工程ｃ）を経て作製される。
【００３４】
本発明で使用されるポリロタキサンにおける正の電荷を有する置換基の数は４０〜６０である。かかる数の置換基は、工程ａ）ｂ）により作製される包接体と正の電荷を有する置換基を導入するための前記置換基を供与することのできる化合物との反応モル比を調節すればよい。例えば、環状分子あたりの正の電荷を有する置換基の数を１〜６にするには、環状分子１モル等量に対して２〜１２モル等量の前記置換基を供与することのできる化合物を反応させればよい。
【００３５】
本発明で使用されるポリロタキサンと核酸との複合体は、適当な水性溶媒中で両者を混合することで容易に作成することができる。特に、ポリロタキサンの正の電荷が核酸の負の電荷の０．３〜０．６倍または３〜６倍となるように両者の混合量を調節することが好ましい。以下、この混合比をＮ／Ｐ比と表すこととする。両者の具体的な混合量は、ポリロタキサンの正電荷を有する置換基の数と核酸の分子量によって定められる。
【００３６】
複合体の形成は、アガロースゲル電気泳動、粒子径、ゼータ電位を測定することで確認すればよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、非天然塩基を含む人工的な核酸その他、いずれも利用することができるが、細胞内、特に核内において複合体からデコンデンスされ、リポソームから放出された後に遺伝情報を発現することができる遺伝子単位を含む核酸であることが好ましい。遺伝子にコードされる遺伝情報には特に制限はない。
【００３７】
本発明で使用されるポリロタキサンの代表的な例は、両末端にジスルフィド結合を介してベンジルカルボニルチロシンが結合した分子量１０００〜１０００００のＰＥＧによって、４０〜６０のジメチルアミノエチル基で修飾された１８〜２９個のα−シクロデキストリン分子を貫通してなる構造を有する、図１に模式的に表される様な構造を有する。
【００３８】
本発明のリポソームベクターは、上記の複合体を封入した脂質膜構造体という構成を有するリポソームベクターである。かかるリポソームは、リン脂質、糖脂質、ステロール、長鎖脂肪族アルコール又はグリセリン脂肪酸エステル等の、脂質膜構造体の構成成分として一般に使用される脂質を用い、一般的な方法によって製造することができる。
【００３９】
リン脂質としては、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン）、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジルエチレングリコール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、又はそれらの水素添加物、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）等を挙げることができる。上記のリン脂質は、リポソームの主要な構成成分として用いられる。その使用量は、リポソームの総脂質に対する量として１０〜１００％（モル比）であることが好ましく、５０〜８０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものではない。
【００４０】
糖脂質としては、セファリン、セレブロシド、セラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド等の糖脂質が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を使用することができる。
【００４１】
ステロールとしては、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロール等を挙げることができる。これらのステロールは、一般には脂質二重層を物理的又は化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために用いられる。その使用量は、リポソームの総脂質に対する量として５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものでない。
【００４２】
長鎖脂肪酸又は長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０〜２０の脂肪酸またはそのアルコールを使用することができる。好ましい例としては、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、アラキジン酸、リノール酸、パルミトイル酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコール等を挙げることができる。その使用量は、リポソームの総脂質に対する量として５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものでない。
【００４３】
グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができる。その使用量は、リポソームの総脂質に対する量として５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものでない。
【００４４】
本発明のリポソームの脂質膜には、上記の脂質の他に、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等の抗酸化剤、ステアリルアミン、オレイルアミン等の正電荷を付与する荷電物質、ジセチルホスフェート等の負電荷を付与する荷電物質、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等の膜タンパク質を含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。
【００４５】
また、国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０３２５９３号パンフレットに開示されているポリアルギニンペプチド等の細胞膜透過性ペプチド、国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０３２５９３号パンフレットに開示されているＧＡＬＡペプチド等のｐＨ応答性膜融合性ペプチド、その他の脂質膜構造体に機能を付加することのできるペプチドを、それぞれの特許文献に記載されている態様、使用量、製造方法等に準じて、本発明のリポソームにおいて使用してもよい。特に好ましいペプチドはポリアルギニンペプチドである。
【００４６】
本発明のリポソームをエンドサイトーシスによって細胞内に移行させる場合には、リポソームはその膜の構成成分としてカチオン性脂質を含ませることが望ましい。カチオン性脂質としては、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−オレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモールコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、ＤＯＳＰＡ）等が挙げられる。
【００４７】
なお、本発明のリポソームに、例えば前記ポリアルギニンペプチドを付加する等をした場合には、リポソームはマクロピノサイトーシスによって細胞内に移行するものとなり、上記カチオン性脂質が脂質膜構造体に含まれている必要は必ずしもない。すなわち、前記ポリアルギニンペプチドを付加した場合の本発明のリポソームの脂質膜は、カチオン性脂質及び非カチオン性脂質のいずれか一方で構成されていてもよいし、両方で構成されていてもよく、オリゴエチレングリコールはそれらの脂質に結合させて使用すればよい。なお、カチオン性脂質は細胞毒性を有するので、本発明のリポソームの細胞毒性を低減させる点からは、脂質二重層に含まれるカチオン性脂質の量を出来る限り少なくすることが好ましく、脂質二重層を構成する総脂質に対するカチオン性脂質の割合は０〜４０％（モル比）であることが好ましく、０〜２０％（モル比）であることがさらに好ましい。
【００４８】
上記の「非カチオン性脂質」とは、中性脂質又はアニオン性脂質を意味し、中性脂質の例としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド等が挙げられ、アニオン性脂質の例としては、例えば、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等が挙げられる。
【００４９】
本発明のリポソームを構成する脂質膜は、ポリアルギニンペプチド等の機能性分子で修飾された脂質を複数種類含んでいてもよく、またその様な機能性分子で修飾されていない脂質を成分として同時に含んでいてもよい。例えば、修飾された脂質と非修飾脂質、一の機能性分子で修飾された脂質と別の機能性分子で修飾された脂質等、脂質の組合せは任意に選択することができる。
【００５０】
後の実施例において詳細に述べるように、先に説明した複合体を封入した本発明のリポソームは、その内部に封入される核酸を効率的に細胞内、特に核において放出することができ、核酸の発現転写効率を飛躍的に高めることができる。従って、本発明のリポソームベクターは脂質膜構造体に封入された核酸の細胞内転写促進剤として利用することができる。
【００５１】
本発明のリポソームベクターは、脂質一重膜の形態でも、脂質多重膜の形態でもいずれでも良いが、封入された核酸の放出効率の点から一重膜あるいは二重膜であることが好ましい。本発明のリポソームベクターは、脂質一重膜からなるリポソームである限り、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）等のいずれであってもよい。よって、本発明のリポソームのサイズは特に限定されるものではないが、直径５０〜１００ｎｍであることが好ましく、直径１００〜３００ｎｍであることがさらに好ましい。なお、一重あるいは二重の脂質膜を有するリポソームは、適当な大きさのフィルターを繰り返し通すことで作製することができ、これらは当業者が通常なしえる作業である。
【００５２】
本発明のリポソームベクターは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。例えば水和法の場合、前記の脂質を有機溶剤に溶解した有機溶液を蒸発除去することにより脂質膜を得た後、脂質膜を前記複合体を含む溶液で水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、前記複合体を封入したリポソームを製造することができる。
【００５３】
なお、ポリアルギニンペプチドやＧＡＬＡペプチド等の機能性分子を本発明のリポソームに付加する場合は、前記の方法によってリポソームを作製した後にリポソーム表面にこれらのペプチドを導入すればよい。
【００５４】
上記の方法において、有機溶媒として、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、メタノール、エタノール等の低級アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類等を、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００５５】
本発明の脂質膜構造体には、前記ポリロタキサンと核酸との複合体の他に、薬剤、核酸、ペプチド、タンパク質、糖又はこれらの複合体等の種々の生理活性物質を封入することができ、診断、治療等の目的に応じて適宜選択することができる。生理活性物質が水溶性である場合には、脂質膜構造体の製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に生理活性物質を添加することにより、脂質膜構造体内部の水相に生理活性物質を封入することができる。また、生理活性物質が脂溶性である場合には、脂質膜構造体の製造にあたり使用される有機溶剤に生理活性物質を添加することにより、脂質膜構造体の膜に生理活性物質を封入することができる。
【００５６】
本発明のリポソームベクターは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。また本発明の脂質膜構造体は、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で使用することもできる。乾燥させた脂質膜構造体は、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液とすることができる。
【００５７】
本発明のリポソームベクターは、インビボ及びインビトロのいずれにおいても使用することができる。インビボにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられる。投与量及び投与回数は、リポソームベクターに封入された薬剤の種類や量等に応じて適宜調節することができる。この様なリポソームベクターは、０〜４０℃という広範な温度域（効果的な温度域は４〜３７℃）において使用することができるので、目的に応じた温度条件を設定することができる。
【００５８】
本発明のリポソームベクターは、核酸の細胞内送達用ベクター又は核内送達用ベクターとして使用することができる。目的物質を送達すべき細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、目的物質を送達すべき細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
【００５９】
以下、実施例を示して本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定して解釈されるものではない。
【実施例】
【００６０】
＜実施例１＞
１）ポリロタキサンの合成
【００６１】
１）−１ 両末端にアミノ基を有するＰＥＧの合成
分子量４０００のＰＥＧ（３３ｇ，１０ｍｍｏｌ）と無水コハク酸（２０ｇ，２００ｍｍｏｌ）をトルエン（２２０ｍｌ）に溶解させ、この溶液を１５０℃で５時間還流させた。反応終了後、過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、濾別・減圧乾燥して粗生成物を得た。これをジクロロメタンに溶解させ、不溶物を遠心分離により除去し、過剰のジエチルエーテルに注ぎ込んで、濾別・減圧乾燥後に両末端にカルボキシル基を有するＰＥＧ（化合物Ａ）を白色粉末として得た。
【００６２】
この化合物Ａ（２０ｇ，５．７ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）（１７．１ｇ，１４８．２ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサンとジクロロメタンの混合溶液（３５０ｍｌ，体積比１：１）に溶解させ、氷冷後ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２３．５ｇ，１１４ｍｍｏｌ）を加えた。氷冷したまま１時間攪拌し、その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロヘキシルウレアを濾別し、濾液は濃縮してから過剰のジエチルエーテルに注ぎ込んだ。濾別・減圧乾燥後にカルボキシル基が活性化されたＰＥＧ（化合物Ｂ）を白色粉末として得た。
【００６３】
次いで、エチレンジアミン（０．４ｍｌ，６ｍｍｏｌ）を溶解させたジクロロメタン（７５ｍｌ）に、化合物Ｂ（１０ｇ，２．７ｍｍｏｌ）を溶解させたジクロロメタン（７５ｍｌ）を滴下し、滴下終了後から室温で１時間攪拌した。反応終了後、溶液を過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、濾別・減圧乾燥後に両末端にアミノ基を有するＰＥＧ（化合物Ｃ）を白色粉末として得た。
【００６４】
１）−２ 擬ポリロタキサンの調製
α−ＣＤの飽和水溶液３１１ｍｌ（４８ｇ、４９．２ｍｍｏｌ）に、上記の化合物Ｃの水溶液（４ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を、α−ＣＤ：化合物Ｃ＝６：１となるように室温で滴下した。１時間超音波を照射しながら攪拌し、その後室温で２４時間攪拌した。遠心分離により白色の沈殿物を回収し、５０℃で減圧乾燥を行い、白色粉末の擬ポリロタキサンＡを得た。
【００６５】
なお擬ポリロタキサンとは、線状高分子であるＰＥＧと環状分子であるα−ＣＤとからなる包接体であって、線状高分子の両末端が未だ嵩高い置換基でキャップされていないものをいう。
【００６６】
また、上記と同様にして、α−ＣＤ：擬ポリロタキサンを４５：１に調節して、一分子あたりのα−ＣＤの数が２９である擬ポリロタキサンＢを得た。
【００６７】
１）−３ 末端キャップ剤の調製
α−ＣＤの脱離を防止する嵩高い置換基としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｚはベンジルオキシカルボニル基を表す）を導入するために、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅのカルボキシル基の活性化を行った。すなわち、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ（１００ｇ，３３４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（８００ｍｌ）に溶解させ、氷冷しながらＨＯＳｕ（３８．４２ｇ，３３４ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後にＤＣＣ（７５．７ｇ，３６７ｍｍｏｌ）を溶解させた１，４−ジオキサン溶液（２００ｍｌ）をゆっくり加え、氷冷したまま１時間攪拌し、その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロヘキシルウレアを濾別し、濾液は濃縮してから過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、濾別・減圧乾燥後に粗生成物を得た。室温でできるだけ飽和濃度になるように粗生成物をジクロロメタンに溶解させた後、石油エーテルを適量加え冷蔵し、再結晶を行った。結晶を濾別・減圧乾燥して白色針状結晶のＺ−Ｌ−Ｐｈｅのスクシンイミドエステル（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ）を得た。
【００６８】
１）−４ ポリロタキサンの調製
Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ（８０ｇ，２００ｍｍｏｌ）をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）（６０ｍｌ）に溶解させ、１）−２の２種の擬ポリロタキサンＡとＢ（４５ｇ、２ｍｍｏｌ）をそれぞれ加えた。この不均一溶液を室温で攪拌しながら、均一になるように少しずつＤＭＳＯを加えて９６時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、粗生成物を得た。粗生成物をアセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の順で洗浄して不純物（未反応Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ、α−ＣＤ、化合物Ｃ等）を除去し、濾別・減圧乾燥して生分解性のポリロタキサンＡとＢを白色粉末として得た。
【００６９】
ポリロタキサンＡとＢの合成の確認は、１Ｈ−ＮＭＲにより行った。またポリロタキサンのα−ＣＤ貫通数を１Ｈ−ＮＭＲでのＰＥＧのプロトンとα−ＣＤの１位のプロトンとの積分比から求めたところ、ポリロタキサンＡは１８、ポリロタキサンＢは２９であった。
【００７０】
この２種のポリロタキサンＡとＢそれぞれ１モル等量に対して、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミンを３、５、８、１６モル等量反応させて、ジメチルアミノエチル基が１６、４６、７６又は９９導入されたポリロタキサンＡ（それぞれ１６ＤＭＡＥ１８ＣＤ、４６ＤＭＡＥ１８ＣＤ、７６ＤＭＡＥ１８ＣＤ、９９ＤＭＡＥ１８ＣＤと表す）と、ジメチルアミノエチル基が３５、５２、１１０又は１８０導入されたポリロタキサンＢ（それぞれ３５ＤＭＡＥ２９ＣＤ、５２ＤＭＡＥ２９ＣＤ、１１０ＤＭＡＥ２９ＣＤ、１８０ＤＭＡＥ２９ＣＤと表す）を合成した。
【００７１】
２）ポリロタキサンとプラスミドＤＮＡとの複合体の調製
ＥＧＦＰとルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドｐＥＧＦＰＬｕｃ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用意し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４に濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）となるように溶解した。また前記１）で合成した各種ポリロタキサンを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４に適当な濃度で溶解した（１６ＤＭＡＥ１８ＣＤ（２．４ｍｇ／ｍＬ）、４６ＤＭＡＥ１８ＣＤ（０．９７ｍｇ／ｍＬ）、７６ＤＭＡＥ１８ＣＤ（０．６８ｍｇ／ｍＬ）、９９ＤＭＡＥ１８ＣＤ（０．５７ｍｇ／ｍＬ）、３５ＤＭＡＥ２９ＣＤ（１．７ｍｇ／ｍＬ）、５２ＤＭＡＥ２９ＣＤ（１．２ｍｇ／ｍＬ）、１１０ＤＭＡＥ２９ＣＤ（０．６７ｍｇ／ｍＬ）、１８０ＤＭＡＥ２９ＣＤ（０．４７ｍｇ／ｍＬ））これらの溶液を等量ずつ混合して、ポリロタキサンとプラスミドＤＮＡとからなる複合体を調製した。この時、包接化合物と核酸との複合体のＮ／Ｐ比はいずれも５となる。
【００７２】
３）複合体の粒子特性
前記２）で得られた複合体の粒子径（図２）及びゼータ電位（図３）を、それぞれ動的光散乱法及び電気泳動法を利用した光散乱測定機（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ、Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）で測定した。その結果を図２（粒子径）と図３（ゼータ電位）に示す。
【００７３】
この測定から、導入されたカチオン数が多くなると複合体の粒子形が小さくなり、かつゼータ電位が増加するという傾向が認められた。
【００７４】
４）リポソームの作製
ＤＯＰＥ／ＰＡ＝７：２のクロロホルム溶液２５０μＬ（全脂質濃度０．５５ｍＭ）を試験管内で蒸発させて脂質膜を形成させた後、前記２）で得られた複合体を含む溶液２５０μＬを加えて室温で１５分間ボルテックスして水和した。これを試験管のままバスタイプソニケーター（ＡＵ−２５Ｃ、Ａｉｗａ社）に置いて３０秒間超音波処理して、前記２）で得られた複合体が封入されたリポソームを作製した。さらに、超音波処理後の試験管にステアリル化オクタアルギニン（ＳＴＲ−Ｒ８）／水溶液を全脂質濃度の２０ｍｏｌ％となるように加えてインキュベーションして、表面にＳＴＲ−Ｒ８が組み込まれた、種々の複合体を含む８種類のリポソームを作製した。
【００７５】
＜実施例２＞
１）複合体からの遺伝子放出能の評価
実施例１の２）で調製した各種ポリロタキサンとｐＤＮＡとからなる８種類の複合体溶液（各ｐＤＮＡ１００ｎｇ、２．５μＬ）を用意した。これに、水７．５μＬを加えて３７℃で１時間インキュベーションしたサンプル（コントロール）、終濃度１０ｍＭとなるようにＤＴＴを加えて３７℃で１時間インキュベーションしたサンプル（放出サンプル）、終濃度１０ｍＭとなるようにＤＴＴを加えて３７℃で１時間インキュベーションした後にポリアスパラギン酸（終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加えてさらに室温で２０分間インキュベーションしたサンプル（置換サンプル）を用意した。
【００７６】
上記のサンプルをそれぞれ１％アガロースゲルにアプライして電気泳動を行った。泳動後のゲルをＥｔＢｒで染色してＤＮＡを可視化すると共に、ＩｍａｇｅＪを用いてバンドにおけるスーパーコイルのバンド強度を数値化し、コントロールとして泳動したｐＤＮＡのバンド強度を１００％として、下記式に従って各複合体からの核酸放出能（Ｒｅｌｅａｓｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を算出した。
【００７７】
核酸放出能（ＲＥ）＝（サンプル中のｐＤＮＡのバンド強度）／（コントロールとして
泳動したｐＤＮＡ１００ｎｇのバンド強度）×１００
【００７８】
この実験の結果、ポリロタキサンの正電荷数とポリロタキサンと核酸との複合体からの核酸のデコンデンス能との間には、ポリロタキサンの正電荷数が９９である場合に特異的なピークが存在することが確認された（図４）。
【００７９】
２）細胞内でのリポソームの核酸放出能の確認
４×１０４ｃｅｌｌｓのマウス胎児線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）／ＤＭＥＭ培地を２４ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベーション後、実施例１の４）で作製された各リポソーム（ｐＤＮＡ量として０．５μｇ）／ＤＭＥＭ培地０．２５ｍＬをウェルに添加して、３７℃で３時間インキュベーションした。
【００８０】
３時間後に１０％血清を含む新鮮な培地に交換してさらに２１時間インキュベーションした後、細胞を０．５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、７５μＬのｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加えて細胞を溶解した。−８０℃で２０分間インキュベーションした後、１５，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、５０μＬの上澄み（細胞溶解液）を回収した。
【００８１】
ルシフェラーゼ活性は、細胞溶解液２０μＬにｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（ｐｒｏｍｅｇａ社）５０μＬを加え、ルミノメーター（ＡＴＴＯ社）を用いて測定した。また細胞溶解液のタンパク質濃度はＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて測定した。また、上記操作におけるコントロールとして、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド用いた。この結果を図５に示す。
【００８２】
この結果、形質転換された細胞内におけるルシフェラーゼ活性強度には、前記１）で確認された最も高いデコンデンス能を示す正電荷数が９９であるポリロタキサンではなく、またＣＤ分子が１８である場合２９である場合にもよらず、正電荷数が４６、５２であるポリロタキサンを含むリポソームがもっとも高いルシフェラーゼ活性を示すことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明で使用される包接化合物の構造を表した模式図である。図中、＋が正の電荷を有する置換基を、円柱がシクロデキストリン分子を、楕円が嵩高い置換基を、棒線がポリアルキレングリコール鎖を、それぞれ示す。
【図２】実施例１の２）で得られた各種複合体の粒子径を表すグラフである。
【図３】実施例１の２）で得られた各種複合体のゼータ電位を表すグラフである。
【図４】実施例１の２）で得られた各種複合体からの核酸（プラスミドＤＮＡ）のデコンデンス能を表したグラフである。
【図５】実施例１で作製した各種リポソームを導入した細胞におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を表したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内部に封入された核酸の細胞内における放出性に優れたリポソームベクターとその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームを用いて薬物や核酸を生体に投与するに際して、薬物等の効果を発揮させるためには、リポソームが細胞に効率的に導入されることと同時に、細胞内に導入されたリポソームからその内部に封入された薬物等が効果的に放出されることが重要である。
【０００３】
リポソームが細胞に導入される効率を細胞導入効率と表せば、この細胞導入効率を高める方法として、リポソームの表面を複数のアルギニン残基からなるペプチド、例えばアルギニン８残基からなるオクタアルギニンペプチド（以下、Ｒ８ペプチドと称する）で修飾する方法が開発されている（非特許文献１）。このＲ８ペプチドで表面が修飾されたリポソームの細胞導入効率は、Ｒ８ペプチドを持たないリポソームのそれの１００倍ほどである。この様な機能が付加されたリポソームは、多機能性エンベロープ型ナノ構造体（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｔｙｐｅ ｎａｎｏ ｄｅｖｉｃｅ；Ｒ８−ＭＥＮＤ）とも呼ばれている。
【０００４】
一方、細胞内に導入されたリポソームの内部から封入された物質を放出させる効率を放出効率と表せば、この放出効率を高める技術は開発途上にある。特に封入物が核酸等の負に帯電した高分子化合物である場合、かかる高分子化合物を凝集化素子と呼ばれる物質を利用して凝縮化することが行われるが、この様な場合には、いったん凝縮化された物質を改めて解放させ、さらにリポソームを構成する脂質膜から細胞内部に放出させなければならない。従って、凝縮化素子を用いてリポソーム内に封入された物質に関するリポソームからの前記放出効率は、凝縮化素子からの物質の解放能（以下、デコンデンス能と表す）によっても影響を受ける。
【０００５】
リポソームに封入される物質、例えば核酸等に用いられる凝縮化素子の例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、プロタミン等のポリアミノ酸化合物や、ポリエチレンイミン等のポリカチオン性ポリマー等を挙げることができる。
【０００６】
本発明者らは、ポリＬ−リジンやプロタミン等のポリアミノ酸化合物とは異なる新たな凝縮化素子として、ポリロタキサンと呼ばれる化合物を開発した（非特許文献２、特許文献１、特許文献２）。ポリロタキサンは、両端に加水分解性の結合を介して嵩高い官能基が結合された線状高分子が複数の環状分子を貫通してなる構造を有する包接化合物である。
【０００７】
ポリロタキサンは核酸等の負に荷電している化合物と静電的に結合して複合体を形成する性質を有しているが、この複合体が細胞質等の生理的条件下に置かれると、負に荷電している化合物が複合体から遊離される。これは、生理的条件下でポリロタキサンの両端にある加水分解性の結合が切断されて嵩高い基が離脱し、線状分子に貫通されることで密に近接していた環状分子が互いに離れることによるものと推察されている。
【０００８】
この様に、ポリロタキサンは核酸を凝縮化して複合体を形成する能力を有する一方、良好なデコンデンス能も有しており、細胞内の生理条件下で封入物を放出させる必要のあるリポソームにとって有益な物質である。しかし、ポリロタキサンのデコンデンス能とリポソームからの放出効率との関連については未だ十分な知見は蓄えられてはいない。
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｏｇｕｒｅら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２００４年、第９８巻、第３１７−３２３頁
【非特許文献２】Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６年、第１巻、第６号、第２８６１−２８６９頁
【特許文献１】国際特許出願公開ＷＯ２００２／０２１５９号パンフレット
【特許文献２】日本特許第４１０４５５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ポリロタキサンと核酸との複合体を封入した細胞導入効率ならびに封入物の放出効率に優れた新たなリポソームベクターを開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ポリロタキサンと核酸との複合体を封入したリポソームの作製に際して、ポリロタキサンと核酸との複合体の高いデコンデンス能とリポソームからの封入物の高い放出効率とが必ずしも一致しないこと、特に一定数の正の電荷を有するポリロタキサンがピーク的に最も高い放出効率を示すことを見いだし、以下の各発明を完成させた。
【００１２】
複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンと核酸との複合体が封入されてなるリポソームベクターであって、前記ポリロタキサンが正の電荷を有する置換基によって修飾されることで４０〜６０の正の電荷を有している、前記リポソームベクター。
【００１３】
環状分子が環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン及び環状ポリアミンよりなる群から選ばれる１種以上である、請求項１に記載のリポソームベクター。
【００１４】
環状分子がα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンよりなる群から選ばれる１種以上である、請求項２に記載のリポソームベクター。
【００１５】
シクロデキストリンがα−シクロデキストリンである、請求項３に記載のリポソームベクター。
【００１６】
線状分子がポリアルキレングリコールもしくはその２種以上の共重合体又はポリアルキルビニルエーテルである、請求項１〜４の何れかに記載のリポソームベクター。
【００１７】
ポリアルキレングリコールが分子量１０００〜１０００００のポリエチレングリコールである、請求項５に記載のリポソームベクター。
【００１８】
前記嵩高い置換基がベンジルオキシカルボニルチロシンである、請求項１〜６の何れかに記載のリポソームベクター。
【００１９】
前記ポリロタキサンの正の電荷が核酸の負電荷の０．３〜０．６倍又は３〜６倍である、請求項１〜７の何れかに記載のリポソームベクター。
【００２０】
正の電荷を有する置換基がモノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、イミノ基及びグアニジノ基よりなる群から選ばれる一種以上である、請求項１〜８の何れかに記載のリポソームベクター。
【００２１】
正の電荷を有する置換基がジメチルアミノエチル基である、請求項９に記載のリポソームベクター。
【００２２】
細胞膜透過性ペプチドをさらに脂質膜表面に有する、請求項１〜１０の何れかに記載のリポソームベクター。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のリポソームベクターは、細胞内における封入された核酸の放出効率に優れており、生体に投与された核酸の発現効率が高められることで、従来のリポソームベクターよりも優れた治療効果を期待することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンと核酸との複合体が封入されてなるリポソームベクターであって、前記ポリロタキサンが正の電荷を有する置換基によって修飾されることで４０〜６０の正の電荷を有している、前記リポソームベクターに関する。
【００２５】
前記ポリロタキサンを構成する環状分子としては、α、β又はγ−シクロデキストリンや、これらと類似の環状構造を持つものであってよく、そのような環状構造としては環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、環状ポリアミン、環状フラクタン等が挙げることができるがこれらに特に限定されるものではない。また、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンその他グルコース単位からなる環状オリゴ糖であればよいが、好ましくはα−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリン、より好ましくはα−シクロデキストリン（以下、α−ＣＤと表す）である。
【００２６】
前記ポリロタキサンを構成する線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体等のポリアルキレングリコール、ポリアミノ酸、多糖類及びポリメチルビニルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上を例示することができる。本発明においては、後に説明する嵩高い置換基の導入が行えるポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコールが好ましい。
【００２７】
ポリアルキレングリコールは、アルキレンオキサイドの付加重合によって得られるオリゴマーであればよく、本発明ではポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、これらのブロック共重合体等を使用することができる。またオリゴマーの分子量は１０００〜１０００００の範囲であることが好ましく、より好ましくは１０００〜４００００である。本発明の包接化合物を構成する好ましいポリアルキレングリコールは、分子量１０００〜１０００００のポリエチレングリコールである。以下、ポリエチレングリコールをＰＥＧと表す。
【００２８】
本発明にいう加水分解性結合としては、生体内で加水分解する結合であればどのような結合であってもよいが、エステル結合、シッフ塩基結合、カーバメート結合、ペプチド結合、エーテル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合等の各種の加水分解性の結合であってよい。このうち、生体内で速やかに非酵素的に加水分解することを考慮すればエステル結合又はジスルフィド結合であることが好ましい。
【００２９】
前記ポリロタキサンを構成する生体親和性基の嵩高い置換基としては、生体に対する親和性（生体に対する安全性）の高い基であって、線状分子から環状分子が抜け落ちるのを防止できる嵩高さを有する限りどのような基であってもよく、アミノ酸、ペプチド、単糖類、オリゴ糖類又はそれらの誘導体等を挙げることができる。アミノ酸としては、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジンを挙げることができる。このうち、ベンゼン環を有するアミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等が好ましい。
【００３０】
また、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フレオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジルエステル（ＯＢｚ）基、第三ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）基、アミノ酸第三ブチルエステル（ＯＢｕ基）等の１以上のベンゼン環を有する基又は１以上の第三ブチルを有する基で修飾されたアミノ酸、例えばＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン等も利用することができる。さらに、アミノ酸の複数がペプチド結合して形成されたペプチド、オリゴ糖類、デキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、でんぷん、さらにはオリゴ糖類、多糖若しくは単糖をアセチル化やイソプロピル化等によって化学修飾した糖誘導体も利用可能である。
【００３１】
前記ポリロタキサンの好ましい具体例としては、上記線状分子がＰＥＧ４０００、上記環状分子がα−ＣＤ、上記加水分解性結合がジスルフィド結合、上記嵩高い置換基を有する生体内分解性基がＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンであることが特に好ましい。なお、α−ＣＤをＰＥＧに貫通させる場合、α−ＣＤとＰＥＧの繰り返し単位（エチレンオキシド単位）の比の化学量論数は１：２といわれている。
【００３２】
本発明におけるポリロタキサンは、窒素原子を含む正に荷電した置換基で修飾されていることが好ましい。窒素原子は正に荷電してカチオン化する性質を有していることから、負電荷を有している核酸の凝集効果が向上する。正の電荷を有する置換基は、包接体中のシクロデキストリンに対して導入されることが好ましく、また置換基としては、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジメチルアミノエチル基等のジアルキルアミノ基、イミノ基、グアニジノ基等を挙げることができるが、ジアルキルアミノ基、特にジメチルアミノエチル基が好ましい。
【００３３】
本発明におけるポリロタキサンは、典型的には非特許文献２又は特許文献に詳細に記載された方法によって作製することができる。この非特許文献２及び特許文献の記載の全ては本明細書に参照して取り込まれるが、その作製方法は、両末端にアミノ基が導入されたＰＥＧとα−ＣＤとを混合して両者からなる包接体を形成させる工程ａ）、前記包接体を適当な縮合剤とα−ＣＤの環状構造における環の内径よりも嵩高い置換基を有する化合物と共に有機溶媒に懸濁してＰＥＧの末端に前記置換基を導入する工程ｂ）、及び前記工程ａ）ｂ）によって作製されるポリロタキサンに正の電荷を有する置換基を導入する工程ｃ）を経て作製される。
【００３４】
本発明で使用されるポリロタキサンにおける正の電荷を有する置換基の数は４０〜６０である。かかる数の置換基は、工程ａ）ｂ）により作製される包接体と正の電荷を有する置換基を導入するための前記置換基を供与することのできる化合物との反応モル比を調節すればよい。例えば、環状分子あたりの正の電荷を有する置換基の数を１〜６にするには、環状分子１モル等量に対して２〜１２モル等量の前記置換基を供与することのできる化合物を反応させればよい。
【００３５】
本発明で使用されるポリロタキサンと核酸との複合体は、適当な水性溶媒中で両者を混合することで容易に作成することができる。特に、ポリロタキサンの正の電荷が核酸の負の電荷の０．３〜０．６倍または３〜６倍となるように両者の混合量を調節することが好ましい。以下、この混合比をＮ／Ｐ比と表すこととする。両者の具体的な混合量は、ポリロタキサンの正電荷を有する置換基の数と核酸の分子量によって定められる。
【００３６】
複合体の形成は、アガロースゲル電気泳動、粒子径、ゼータ電位を測定することで確認すればよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、非天然塩基を含む人工的な核酸その他、いずれも利用することができるが、細胞内、特に核内において複合体からデコンデンスされ、リポソームから放出された後に遺伝情報を発現することができる遺伝子単位を含む核酸であることが好ましい。遺伝子にコードされる遺伝情報には特に制限はない。
【００３７】
本発明で使用されるポリロタキサンの代表的な例は、両末端にジスルフィド結合を介してベンジルカルボニルチロシンが結合した分子量１０００〜１０００００のＰＥＧによって、４０〜６０のジメチルアミノエチル基で修飾された１８〜２９個のα−シクロデキストリン分子を貫通してなる構造を有する、図１に模式的に表される様な構造を有する。
【００３８】
本発明のリポソームベクターは、上記の複合体を封入した脂質膜構造体という構成を有するリポソームベクターである。かかるリポソームは、リン脂質、糖脂質、ステロール、長鎖脂肪族アルコール又はグリセリン脂肪酸エステル等の、脂質膜構造体の構成成分として一般に使用される脂質を用い、一般的な方法によって製造することができる。
【００３９】
リン脂質としては、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン）、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジルエチレングリコール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、又はそれらの水素添加物、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）等を挙げることができる。上記のリン脂質は、リポソームの主要な構成成分として用いられる。その使用量は、リポソームの総脂質に対する量として１０〜１００％（モル比）であることが好ましく、５０〜８０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものではない。
【００４０】
糖脂質としては、セファリン、セレブロシド、セラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド等の糖脂質が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を使用することができる。
【００４１】
ステロールとしては、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロール等を挙げることができる。これらのステロールは、一般には脂質二重層を物理的又は化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために用いられる。その使用量は、リポソームの総脂質に対する量として５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものでない。
【００４２】
長鎖脂肪酸又は長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０〜２０の脂肪酸またはそのアルコールを使用することができる。好ましい例としては、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、アラキジン酸、リノール酸、パルミトイル酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコール等を挙げることができる。その使用量は、リポソームの総脂質に対する量として５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものでない。
【００４３】
グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができる。その使用量は、リポソームの総脂質に対する量として５〜４０％（モル比）であることが好ましく、１０〜３０％（モル比）であることがさらに好ましいが、これらの値に特に限定されるものでない。
【００４４】
本発明のリポソームの脂質膜には、上記の脂質の他に、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等の抗酸化剤、ステアリルアミン、オレイルアミン等の正電荷を付与する荷電物質、ジセチルホスフェート等の負電荷を付与する荷電物質、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等の膜タンパク質を含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。
【００４５】
また、国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０３２５９３号パンフレットに開示されているポリアルギニンペプチド等の細胞膜透過性ペプチド、国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０３２５９３号パンフレットに開示されているＧＡＬＡペプチド等のｐＨ応答性膜融合性ペプチド、その他の脂質膜構造体に機能を付加することのできるペプチドを、それぞれの特許文献に記載されている態様、使用量、製造方法等に準じて、本発明のリポソームにおいて使用してもよい。特に好ましいペプチドはポリアルギニンペプチドである。
【００４６】
本発明のリポソームをエンドサイトーシスによって細胞内に移行させる場合には、リポソームはその膜の構成成分としてカチオン性脂質を含ませることが望ましい。カチオン性脂質としては、例えば、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−オレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモールコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、ＤＯＳＰＡ）等が挙げられる。
【００４７】
なお、本発明のリポソームに、例えば前記ポリアルギニンペプチドを付加する等をした場合には、リポソームはマクロピノサイトーシスによって細胞内に移行するものとなり、上記カチオン性脂質が脂質膜構造体に含まれている必要は必ずしもない。すなわち、前記ポリアルギニンペプチドを付加した場合の本発明のリポソームの脂質膜は、カチオン性脂質及び非カチオン性脂質のいずれか一方で構成されていてもよいし、両方で構成されていてもよく、オリゴエチレングリコールはそれらの脂質に結合させて使用すればよい。なお、カチオン性脂質は細胞毒性を有するので、本発明のリポソームの細胞毒性を低減させる点からは、脂質二重層に含まれるカチオン性脂質の量を出来る限り少なくすることが好ましく、脂質二重層を構成する総脂質に対するカチオン性脂質の割合は０〜４０％（モル比）であることが好ましく、０〜２０％（モル比）であることがさらに好ましい。
【００４８】
上記の「非カチオン性脂質」とは、中性脂質又はアニオン性脂質を意味し、中性脂質の例としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド等が挙げられ、アニオン性脂質の例としては、例えば、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等が挙げられる。
【００４９】
本発明のリポソームを構成する脂質膜は、ポリアルギニンペプチド等の機能性分子で修飾された脂質を複数種類含んでいてもよく、またその様な機能性分子で修飾されていない脂質を成分として同時に含んでいてもよい。例えば、修飾された脂質と非修飾脂質、一の機能性分子で修飾された脂質と別の機能性分子で修飾された脂質等、脂質の組合せは任意に選択することができる。
【００５０】
後の実施例において詳細に述べるように、先に説明した複合体を封入した本発明のリポソームは、その内部に封入される核酸を効率的に細胞内、特に核において放出することができ、核酸の発現転写効率を飛躍的に高めることができる。従って、本発明のリポソームベクターは脂質膜構造体に封入された核酸の細胞内転写促進剤として利用することができる。
【００５１】
本発明のリポソームベクターは、脂質一重膜の形態でも、脂質多重膜の形態でもいずれでも良いが、封入された核酸の放出効率の点から一重膜あるいは二重膜であることが好ましい。本発明のリポソームベクターは、脂質一重膜からなるリポソームである限り、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）等のいずれであってもよい。よって、本発明のリポソームのサイズは特に限定されるものではないが、直径５０〜１００ｎｍであることが好ましく、直径１００〜３００ｎｍであることがさらに好ましい。なお、一重あるいは二重の脂質膜を有するリポソームは、適当な大きさのフィルターを繰り返し通すことで作製することができ、これらは当業者が通常なしえる作業である。
【００５２】
本発明のリポソームベクターは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。例えば水和法の場合、前記の脂質を有機溶剤に溶解した有機溶液を蒸発除去することにより脂質膜を得た後、脂質膜を前記複合体を含む溶液で水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、前記複合体を封入したリポソームを製造することができる。
【００５３】
なお、ポリアルギニンペプチドやＧＡＬＡペプチド等の機能性分子を本発明のリポソームに付加する場合は、前記の方法によってリポソームを作製した後にリポソーム表面にこれらのペプチドを導入すればよい。
【００５４】
上記の方法において、有機溶媒として、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、メタノール、エタノール等の低級アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類等を、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００５５】
本発明の脂質膜構造体には、前記ポリロタキサンと核酸との複合体の他に、薬剤、核酸、ペプチド、タンパク質、糖又はこれらの複合体等の種々の生理活性物質を封入することができ、診断、治療等の目的に応じて適宜選択することができる。生理活性物質が水溶性である場合には、脂質膜構造体の製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に生理活性物質を添加することにより、脂質膜構造体内部の水相に生理活性物質を封入することができる。また、生理活性物質が脂溶性である場合には、脂質膜構造体の製造にあたり使用される有機溶剤に生理活性物質を添加することにより、脂質膜構造体の膜に生理活性物質を封入することができる。
【００５６】
本発明のリポソームベクターは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。また本発明の脂質膜構造体は、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で使用することもできる。乾燥させた脂質膜構造体は、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液とすることができる。
【００５７】
本発明のリポソームベクターは、インビボ及びインビトロのいずれにおいても使用することができる。インビボにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられる。投与量及び投与回数は、リポソームベクターに封入された薬剤の種類や量等に応じて適宜調節することができる。この様なリポソームベクターは、０〜４０℃という広範な温度域（効果的な温度域は４〜３７℃）において使用することができるので、目的に応じた温度条件を設定することができる。
【００５８】
本発明のリポソームベクターは、核酸の細胞内送達用ベクター又は核内送達用ベクターとして使用することができる。目的物質を送達すべき細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、目的物質を送達すべき細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
【００５９】
以下、実施例を示して本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定して解釈されるものではない。
【実施例】
【００６０】
＜実施例１＞
１）ポリロタキサンの合成
【００６１】
１）−１ 両末端にアミノ基を有するＰＥＧの合成
分子量４０００のＰＥＧ（３３ｇ，１０ｍｍｏｌ）と無水コハク酸（２０ｇ，２００ｍｍｏｌ）をトルエン（２２０ｍｌ）に溶解させ、この溶液を１５０℃で５時間還流させた。反応終了後、過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、濾別・減圧乾燥して粗生成物を得た。これをジクロロメタンに溶解させ、不溶物を遠心分離により除去し、過剰のジエチルエーテルに注ぎ込んで、濾別・減圧乾燥後に両末端にカルボキシル基を有するＰＥＧ（化合物Ａ）を白色粉末として得た。
【００６２】
この化合物Ａ（２０ｇ，５．７ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）（１７．１ｇ，１４８．２ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサンとジクロロメタンの混合溶液（３５０ｍｌ，体積比１：１）に溶解させ、氷冷後ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２３．５ｇ，１１４ｍｍｏｌ）を加えた。氷冷したまま１時間攪拌し、その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロヘキシルウレアを濾別し、濾液は濃縮してから過剰のジエチルエーテルに注ぎ込んだ。濾別・減圧乾燥後にカルボキシル基が活性化されたＰＥＧ（化合物Ｂ）を白色粉末として得た。
【００６３】
次いで、エチレンジアミン（０．４ｍｌ，６ｍｍｏｌ）を溶解させたジクロロメタン（７５ｍｌ）に、化合物Ｂ（１０ｇ，２．７ｍｍｏｌ）を溶解させたジクロロメタン（７５ｍｌ）を滴下し、滴下終了後から室温で１時間攪拌した。反応終了後、溶液を過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、濾別・減圧乾燥後に両末端にアミノ基を有するＰＥＧ（化合物Ｃ）を白色粉末として得た。
【００６４】
１）−２ 擬ポリロタキサンの調製
α−ＣＤの飽和水溶液３１１ｍｌ（４８ｇ、４９．２ｍｍｏｌ）に、上記の化合物Ｃの水溶液（４ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を、α−ＣＤ：化合物Ｃ＝６：１となるように室温で滴下した。１時間超音波を照射しながら攪拌し、その後室温で２４時間攪拌した。遠心分離により白色の沈殿物を回収し、５０℃で減圧乾燥を行い、白色粉末の擬ポリロタキサンＡを得た。
【００６５】
なお擬ポリロタキサンとは、線状高分子であるＰＥＧと環状分子であるα−ＣＤとからなる包接体であって、線状高分子の両末端が未だ嵩高い置換基でキャップされていないものをいう。
【００６６】
また、上記と同様にして、α−ＣＤ：擬ポリロタキサンを４５：１に調節して、一分子あたりのα−ＣＤの数が２９である擬ポリロタキサンＢを得た。
【００６７】
１）−３ 末端キャップ剤の調製
α−ＣＤの脱離を防止する嵩高い置換基としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ、Ｚはベンジルオキシカルボニル基を表す）を導入するために、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅのカルボキシル基の活性化を行った。すなわち、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ（１００ｇ，３３４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（８００ｍｌ）に溶解させ、氷冷しながらＨＯＳｕ（３８．４２ｇ，３３４ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後にＤＣＣ（７５．７ｇ，３６７ｍｍｏｌ）を溶解させた１，４−ジオキサン溶液（２００ｍｌ）をゆっくり加え、氷冷したまま１時間攪拌し、その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロヘキシルウレアを濾別し、濾液は濃縮してから過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、濾別・減圧乾燥後に粗生成物を得た。室温でできるだけ飽和濃度になるように粗生成物をジクロロメタンに溶解させた後、石油エーテルを適量加え冷蔵し、再結晶を行った。結晶を濾別・減圧乾燥して白色針状結晶のＺ−Ｌ−Ｐｈｅのスクシンイミドエステル（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ）を得た。
【００６８】
１）−４ ポリロタキサンの調製
Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ（８０ｇ，２００ｍｍｏｌ）をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）（６０ｍｌ）に溶解させ、１）−２の２種の擬ポリロタキサンＡとＢ（４５ｇ、２ｍｍｏｌ）をそれぞれ加えた。この不均一溶液を室温で攪拌しながら、均一になるように少しずつＤＭＳＯを加えて９６時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を過剰のジエチルエーテルに注ぎ込み、粗生成物を得た。粗生成物をアセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の順で洗浄して不純物（未反応Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ、α−ＣＤ、化合物Ｃ等）を除去し、濾別・減圧乾燥して生分解性のポリロタキサンＡとＢを白色粉末として得た。
【００６９】
ポリロタキサンＡとＢの合成の確認は、１Ｈ−ＮＭＲにより行った。またポリロタキサンのα−ＣＤ貫通数を１Ｈ−ＮＭＲでのＰＥＧのプロトンとα−ＣＤの１位のプロトンとの積分比から求めたところ、ポリロタキサンＡは１８、ポリロタキサンＢは２９であった。
【００７０】
この２種のポリロタキサンＡとＢそれぞれ１モル等量に対して、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミンを３、５、８、１６モル等量反応させて、ジメチルアミノエチル基が１６、４６、７６又は９９導入されたポリロタキサンＡ（それぞれ１６ＤＭＡＥ１８ＣＤ、４６ＤＭＡＥ１８ＣＤ、７６ＤＭＡＥ１８ＣＤ、９９ＤＭＡＥ１８ＣＤと表す）と、ジメチルアミノエチル基が３５、５２、１１０又は１８０導入されたポリロタキサンＢ（それぞれ３５ＤＭＡＥ２９ＣＤ、５２ＤＭＡＥ２９ＣＤ、１１０ＤＭＡＥ２９ＣＤ、１８０ＤＭＡＥ２９ＣＤと表す）を合成した。
【００７１】
２）ポリロタキサンとプラスミドＤＮＡとの複合体の調製
ＥＧＦＰとルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドｐＥＧＦＰＬｕｃ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用意し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４に濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）となるように溶解した。また前記１）で合成した各種ポリロタキサンを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４に適当な濃度で溶解した（１６ＤＭＡＥ１８ＣＤ（２．４ｍｇ／ｍＬ）、４６ＤＭＡＥ１８ＣＤ（０．９７ｍｇ／ｍＬ）、７６ＤＭＡＥ１８ＣＤ（０．６８ｍｇ／ｍＬ）、９９ＤＭＡＥ１８ＣＤ（０．５７ｍｇ／ｍＬ）、３５ＤＭＡＥ２９ＣＤ（１．７ｍｇ／ｍＬ）、５２ＤＭＡＥ２９ＣＤ（１．２ｍｇ／ｍＬ）、１１０ＤＭＡＥ２９ＣＤ（０．６７ｍｇ／ｍＬ）、１８０ＤＭＡＥ２９ＣＤ（０．４７ｍｇ／ｍＬ））これらの溶液を等量ずつ混合して、ポリロタキサンとプラスミドＤＮＡとからなる複合体を調製した。この時、包接化合物と核酸との複合体のＮ／Ｐ比はいずれも５となる。
【００７２】
３）複合体の粒子特性
前記２）で得られた複合体の粒子径（図２）及びゼータ電位（図３）を、それぞれ動的光散乱法及び電気泳動法を利用した光散乱測定機（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ、Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）で測定した。その結果を図２（粒子径）と図３（ゼータ電位）に示す。
【００７３】
この測定から、導入されたカチオン数が多くなると複合体の粒子形が小さくなり、かつゼータ電位が増加するという傾向が認められた。
【００７４】
４）リポソームの作製
ＤＯＰＥ／ＰＡ＝７：２のクロロホルム溶液２５０μＬ（全脂質濃度０．５５ｍＭ）を試験管内で蒸発させて脂質膜を形成させた後、前記２）で得られた複合体を含む溶液２５０μＬを加えて室温で１５分間ボルテックスして水和した。これを試験管のままバスタイプソニケーター（ＡＵ−２５Ｃ、Ａｉｗａ社）に置いて３０秒間超音波処理して、前記２）で得られた複合体が封入されたリポソームを作製した。さらに、超音波処理後の試験管にステアリル化オクタアルギニン（ＳＴＲ−Ｒ８）／水溶液を全脂質濃度の２０ｍｏｌ％となるように加えてインキュベーションして、表面にＳＴＲ−Ｒ８が組み込まれた、種々の複合体を含む８種類のリポソームを作製した。
【００７５】
＜実施例２＞
１）複合体からの遺伝子放出能の評価
実施例１の２）で調製した各種ポリロタキサンとｐＤＮＡとからなる８種類の複合体溶液（各ｐＤＮＡ１００ｎｇ、２．５μＬ）を用意した。これに、水７．５μＬを加えて３７℃で１時間インキュベーションしたサンプル（コントロール）、終濃度１０ｍＭとなるようにＤＴＴを加えて３７℃で１時間インキュベーションしたサンプル（放出サンプル）、終濃度１０ｍＭとなるようにＤＴＴを加えて３７℃で１時間インキュベーションした後にポリアスパラギン酸（終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を加えてさらに室温で２０分間インキュベーションしたサンプル（置換サンプル）を用意した。
【００７６】
上記のサンプルをそれぞれ１％アガロースゲルにアプライして電気泳動を行った。泳動後のゲルをＥｔＢｒで染色してＤＮＡを可視化すると共に、ＩｍａｇｅＪを用いてバンドにおけるスーパーコイルのバンド強度を数値化し、コントロールとして泳動したｐＤＮＡのバンド強度を１００％として、下記式に従って各複合体からの核酸放出能（Ｒｅｌｅａｓｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を算出した。
【００７７】
核酸放出能（ＲＥ）＝（サンプル中のｐＤＮＡのバンド強度）／（コントロールとして
泳動したｐＤＮＡ１００ｎｇのバンド強度）×１００
【００７８】
この実験の結果、ポリロタキサンの正電荷数とポリロタキサンと核酸との複合体からの核酸のデコンデンス能との間には、ポリロタキサンの正電荷数が９９である場合に特異的なピークが存在することが確認された（図４）。
【００７９】
２）細胞内でのリポソームの核酸放出能の確認
４×１０４ｃｅｌｌｓのマウス胎児線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）／ＤＭＥＭ培地を２４ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベーション後、実施例１の４）で作製された各リポソーム（ｐＤＮＡ量として０．５μｇ）／ＤＭＥＭ培地０．２５ｍＬをウェルに添加して、３７℃で３時間インキュベーションした。
【００８０】
３時間後に１０％血清を含む新鮮な培地に交換してさらに２１時間インキュベーションした後、細胞を０．５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、７５μＬのｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加えて細胞を溶解した。−８０℃で２０分間インキュベーションした後、１５，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、５０μＬの上澄み（細胞溶解液）を回収した。
【００８１】
ルシフェラーゼ活性は、細胞溶解液２０μＬにｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（ｐｒｏｍｅｇａ社）５０μＬを加え、ルミノメーター（ＡＴＴＯ社）を用いて測定した。また細胞溶解液のタンパク質濃度はＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて測定した。また、上記操作におけるコントロールとして、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド用いた。この結果を図５に示す。
【００８２】
この結果、形質転換された細胞内におけるルシフェラーゼ活性強度には、前記１）で確認された最も高いデコンデンス能を示す正電荷数が９９であるポリロタキサンではなく、またＣＤ分子が１８である場合２９である場合にもよらず、正電荷数が４６、５２であるポリロタキサンを含むリポソームがもっとも高いルシフェラーゼ活性を示すことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明で使用される包接化合物の構造を表した模式図である。図中、＋が正の電荷を有する置換基を、円柱がシクロデキストリン分子を、楕円が嵩高い置換基を、棒線がポリアルキレングリコール鎖を、それぞれ示す。
【図２】実施例１の２）で得られた各種複合体の粒子径を表すグラフである。
【図３】実施例１の２）で得られた各種複合体のゼータ電位を表すグラフである。
【図４】実施例１の２）で得られた各種複合体からの核酸（プラスミドＤＮＡ）のデコンデンス能を表したグラフである。
【図５】実施例１で作製した各種リポソームを導入した細胞におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を表したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンと核酸との複合体が封入されてなるリポソームベクターであって、前記ポリロタキサンが正の電荷を有する置換基によって修飾されることで４０〜６０の正の電荷を有している、前記リポソームベクター。
【請求項２】
環状分子が環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン及び環状ポリアミンよりなる群から選ばれる１種以上である、請求項１に記載のリポソームベクター。
【請求項３】
環状分子がα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンよりなる群から選ばれる１種以上である、請求項２に記載のリポソームベクター。
【請求項４】
シクロデキストリンがα−シクロデキストリンである、請求項３に記載のリポソームベクター。
【請求項５】
線状分子がポリアルキレングリコールもしくはその２種以上の共重合体又はポリアルキルビニルエーテルである、請求項１〜４の何れかに記載のリポソームベクター。
【請求項６】
ポリアルキレングリコールが分子量１０００〜１０００００のポリエチレングリコールである、請求項５に記載のリポソームベクター。
【請求項７】
前記嵩高い置換基がベンジルオキシカルボニルチロシンである、請求項１〜６の何れかに記載のリポソームベクター。
【請求項８】
前記ポリロタキサンの正の電荷が核酸の負電荷の０．３〜０．６倍又は３〜６倍である、請求項１〜７の何れかに記載のリポソームベクター。
【請求項９】
正の電荷を有する置換基がモノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、イミノ基及びグアニジノ基よりなる群から選ばれる一種以上である、請求項１〜８の何れかに記載のリポソームベクター。
【請求項１０】
正の電荷を有する置換基がジメチルアミノエチル基である、請求項９に記載のリポソームベクター。
【請求項１１】
細胞膜透過性ペプチドをさらに脂質膜表面に有する、請求項１〜１０の何れかに記載のリポソームベクター。
【請求項１】
複数の環状分子を貫通させた線状分子の両末端に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入されたポリロタキサンと核酸との複合体が封入されてなるリポソームベクターであって、前記ポリロタキサンが正の電荷を有する置換基によって修飾されることで４０〜６０の正の電荷を有している、前記リポソームベクター。
【請求項２】
環状分子が環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン及び環状ポリアミンよりなる群から選ばれる１種以上である、請求項１に記載のリポソームベクター。
【請求項３】
環状分子がα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンよりなる群から選ばれる１種以上である、請求項２に記載のリポソームベクター。
【請求項４】
シクロデキストリンがα−シクロデキストリンである、請求項３に記載のリポソームベクター。
【請求項５】
線状分子がポリアルキレングリコールもしくはその２種以上の共重合体又はポリアルキルビニルエーテルである、請求項１〜４の何れかに記載のリポソームベクター。
【請求項６】
ポリアルキレングリコールが分子量１０００〜１０００００のポリエチレングリコールである、請求項５に記載のリポソームベクター。
【請求項７】
前記嵩高い置換基がベンジルオキシカルボニルチロシンである、請求項１〜６の何れかに記載のリポソームベクター。
【請求項８】
前記ポリロタキサンの正の電荷が核酸の負電荷の０．３〜０．６倍又は３〜６倍である、請求項１〜７の何れかに記載のリポソームベクター。
【請求項９】
正の電荷を有する置換基がモノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、イミノ基及びグアニジノ基よりなる群から選ばれる一種以上である、請求項１〜８の何れかに記載のリポソームベクター。
【請求項１０】
正の電荷を有する置換基がジメチルアミノエチル基である、請求項９に記載のリポソームベクター。
【請求項１１】
細胞膜透過性ペプチドをさらに脂質膜表面に有する、請求項１〜１０の何れかに記載のリポソームベクター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１２６５０５（Ｐ２０１０−１２６５０５Ａ）
【公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０５１６５（Ｐ２００８−３０５１６５）
【出願日】平成２０年１１月２８日（２００８．１１．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度科学技術総合研究委託事業「科学技術連携施策群の効果的・効率的な推進 １遺伝子可視化法による遺伝子ベクター創製」，産業技術強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２８日（２００８．１１．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度科学技術総合研究委託事業「科学技術連携施策群の効果的・効率的な推進 １遺伝子可視化法による遺伝子ベクター創製」，産業技術強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【Ｆターム（参考）】
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