核酸の検出方法
【課題】本発明の目的は、明確にかつ再現性よく核酸配列を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【解決手段】二本鎖核酸を変性させて一本鎖核酸を形成せしめ、該一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）をハイブリダイズさせた後、該一本鎖核酸を鋳型として伸長反応を行い、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長産物と該一本鎖核酸の複合体（Ｐ）を形成せしめ、該複合体（Ｐ）の存在を検出する方法を提供する。
【解決手段】二本鎖核酸を変性させて一本鎖核酸を形成せしめ、該一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）をハイブリダイズさせた後、該一本鎖核酸を鋳型として伸長反応を行い、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長産物と該一本鎖核酸の複合体（Ｐ）を形成せしめ、該複合体（Ｐ）の存在を検出する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の伸長反応が起こりうる形態のオリゴヌクレオチドプローブを用いた核酸の検出方法に関するものである。本発明は、遺伝病の診断、感染症における起因物質の特定等に際して特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中に存在する特定の核酸配列を検出する技術は、特定臓器で発現・機能するタンパク質の核酸分子レベルでの解析、神経、脳あるいは免疫系での情報伝達におけるタンパク質の発現制御の研究等において重要であるのみならず、遺伝的疾患の変異遺伝子の検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出等遺伝子診断においても極めて重要である。
【０００３】
しかしながら、従来の技術は、煩雑で且つ多くの工程を含み、熟練を要するために、操作によってはかなりの時間が必要とされることが多い。
【０００４】
また、遺伝子診断などは確定診断として用いられるため誤りが許されず、さらに迅速性も要求されるために、迅速性を保ちながら高い精度有していなければならないが、従来の技術は、かかる要請を十分に満足するものとはいえない。
【０００５】
試料中に存在する特定の核酸分子を検出する代表的な技術としては、ハイブリダイゼーション法がある（例えば、非特許文献１参照）。核酸のハイブリダイゼーション分析は、多種類の核酸の中から非常に少数の標的核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）をプローブで検出する技術であるが、ハイブリダイゼーション法では、高感度なレポーター（酵素、蛍光色素、ラジオアイソトープ等）を用いても、低コピー数（１〜１０００個）の標的核酸分子を検出するのは困難である。さらに、ハイブリダイゼーション法には、非特異反応という大きな問題点が存在するため、特定の核酸分子を正確に検出する為には担体のブロッキング、非特異シグナルの除去等の操作が不可欠であり、多大な労力が必要となる。
【０００６】
また、過去において非特異反応の問題を解決するための方法として、標的核酸より調製した標識ＤＮＡに、同様に調製した非標識ＤＮＡを添加して非特異反応を抑制するコンペティティブハイブリダイゼーション法（例えば、特許文献１、非特許文献２参照）が開発された。しかしコンペティティブハイブリダイゼーション法は操作が煩雑であり、また検出感度の面でも十分とはいえないため、特に遺伝的疾患の変異遺伝子の検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出等遺伝子診断には適用できない。
【特許文献１】特許第２９８２３０４号公報
【非特許文献１】Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition、第１０章、第１０．１〜１０．５２頁（２００１年）
【非特許文献２】Nicolasら、Anal. Biochem. 第２０５巻、第１９３頁、（１９９２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上記のような問題点を解決して、明確にかつ再現性よく試料中の核酸配列を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１．二本鎖核酸中の標的核酸配列を検出する方法であって、少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする標的核酸配列検出方法。
（１）該二本鎖核酸を変性させ一本鎖核酸を形成せしめる第一工程、
（２）第一工程で得られうる一本鎖核酸に、該一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）をハイブリダイズさせ、該一本鎖核酸を鋳型として伸長反応を行い、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長産物と該一本鎖核酸の複合体（Ｐ）を形成せしめる第二工程、
（３）該複合体（Ｐ）の存在を検出する第三工程。
２．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）がリガンドにより標識されていることを特徴とする１の標的核酸配列検出方法。
３．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドがリガンドにより標識されていることを特徴とする１または２の標的核酸配列検出方法。
４．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の５’末端がリガンドにより標識されていることを特徴とする１〜３のいずれかの標的核酸配列検出方法。
５．リガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする２〜４のいずれかの標的核酸配列検出方法。
６．第三工程が、少なくとも以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含むことを特徴とする１〜５のいずれかの標的核酸配列検出方法。
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のリガンドを利用して複合体（Ｐ）を固相上に捕捉する工程、
（ｉｉ）固相上に捕捉された該複合体（Ｐ）を検出する工程。
７．（ｉ）の工程で、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とハイブリダイズしていない一本鎖核酸を除去する工程を含むことを特徴とする６の標的核酸配列検出方法。
８．第一工程において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していることを特徴とする１〜７のいずれかの標的核酸配列検出方法。
９．二本鎖核酸が、増幅反応により得られた二本鎖核酸であることを特徴とする１〜８のいずれかの標的核酸配列検出方法。
１０．増幅反応がＰＣＲであることを特徴とする９の標的核酸配列検出方法。
１１．増幅反応において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していることを特徴とする９または１０の標的核酸配列検出方法。
１２．増幅反応に使用されるプライマーのＴｍ値より、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のＴｍ値が低いことを特徴とする９〜１１のいずれかの標的核酸配列検出方法。
１３．第一工程における変性が熱変性であることを特徴とする１〜１２のいずれかの標的核酸配列検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、試料核酸中の核酸配列を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において「二本鎖核酸」とは、標的核酸配列すなわち解析の対象となる核酸配列を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸、増幅した核酸又はその断片に相補的な配列を有する核酸、などを指す。
【００１２】
該染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸は、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物などのあらゆる材料から調製することができる。該該染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸の調製法は特に限定されないが、例えば、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。
【００１３】
該増幅した核酸又はその断片に相補的な配列を有する核酸は、例えば、既知の増幅方法により調製してもよい。代表的な核酸増幅方法としては、ＰＣＲ（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition （Sambrookら、第８章、第８．１〜８．１２６頁、２００１年））、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Nature 第３５０巻、第９１頁（１９９１年））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁（１９９２年））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁（１９９３年））、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method：J Clin Microbiol. 第４２巻：第１，９５６頁（２００４年））、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids：Kekkaku. 第７８巻、第５３３頁（２００３年））などが挙げられる。
【００１４】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチドプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドプライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドプライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２のｎ乗倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００１５】
本発明において「標的核酸配列」とは、標的核酸すなわち解析の対象となる核酸配列を含む核酸の配列を指す。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、リボゾーム遺伝子、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、薬物代謝に関連する遺伝子としてＣＹＰ２Ｃ１９ （Cytochrome P450 2C19）遺伝子が挙げられる。
【００１６】
本発明において、増幅反応に使用される「プライマー」とは、対象となる核酸配列を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、既知の増幅方法であるＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮおよびＵＣＡＮ法に使用できるものであれば特に限定されるものではない。プライマー鎖長は、９〜３５塩基であればよく、好ましくは、１１〜３０塩基である。該プライマーは検出したい核酸配列に応じて、複数混在していても良い。例えば、対象となる核酸配列を含む染色体又はその断片から複数種類の核酸を同時に増幅するために、それぞれの核酸配列に対応したプライマーを混合して用いても良い。
【００１７】
本発明に用いられる二本鎖核酸を変性させて得られうる「一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）」は、二本鎖核酸中の標的核酸配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドを用いることができる。より好適には、二本鎖核酸中の標的核酸配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたものを用いることができる。
【００１８】
本発明において二本鎖核酸の「変性」とは、該二本鎖核酸のうち、少なくとも該検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とハイブリダイズ可能な領域において、該二本鎖核酸において形成されていた塩基対が解消され、一本鎖になっていることを指す。二本鎖核酸を変性させる方法としては、加熱による方法（熱変性）、ホルムアミドを添加する方法、など従来公知の方法を使用することができるが、簡便性の観点から熱変性が好ましい。
【００１９】
本発明の重要な開示の一つは、二本鎖核酸を変性させて得られうる一本鎖核酸に、該一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）をハイブリダイズさせる場合に、該一本鎖核酸を鋳型とする伸長反応を行って該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長産物と該一本鎖核酸の複合体（Ｐ）を形成せしめることによって、従来公知の該伸長反応を行わないハイブリダイゼーション法と比較して該複合体（Ｐ）の生成量が大幅に向上し、標的核酸を明確にまた簡便に検出できるような顕著な効果を見出したことにある。
【００２０】
また、二本鎖核酸を変性させて得られうる一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）として、二本鎖核酸中の標的核酸配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたものを用いる場合は、上記伸長反応を阻害しない位置にリガンドを結合させることが好ましい。該リガンドを結合させる位置としては、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドにリガンドを結合させることが好ましく、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の５’末端にリガンドを結合させることがより好ましい。
【００２１】
増幅反応において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していてもよい。その場合、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）は、増幅反応に使用されるプライマーを用いた増幅反応を阻害しないように設計するのが好ましい。さらに、非特異反応を抑制するため、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）から伸長した核酸が該増幅反応に用いられないように、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を設計することが好ましい。その一例として、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のＴｍ値を該増幅反応に使用されるプライマーのＴｍ値より低くなるように設計すればよい。
【００２２】
オリゴヌクレオチドプライマーのＴｍ値は、ハイブリッドを形成した２本鎖ＤＮＡ分子の５０％が乖離する温度のことであり、その計算方法としては、既知の方法であれば特に限定されないが、Ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄ、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法のいずれかにより求められたもので、本発明の特性を満たしていることが必要である。なお、特に好ましいＴｍ値はＮｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄで計算されたものである。該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）および該増幅反応に使用されるプライマーにおけるＴｍ値の差は１℃以上であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５℃以上である。なお、Ｔｍ値の差は５０℃以下であればよく、好ましくは４０℃以下がよい。プローブ鎖長は、５〜３０塩基であればよく、好ましくは、８〜２５塩基である。
【００２３】
本発明において、二本鎖核酸を変性させて得られうる一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）は、該二本鎖核酸の変性とは別、又は同時に作用させることが可能である。
【００２４】
別に作用させる場合には、一例として、上記二本鎖核酸の変性を行った後に該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を加え、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げることができる。
【００２５】
同時に作用させる場合には、一例として、上記二本鎖核酸および該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を混合した状態で、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げることができる。
【００２６】
核酸増幅法から複合体（Ｐ）を形成せしめるまでは、ホモジニアスな系で実施しても良い。例えば、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返し、核酸増幅反応を行う。その後、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げ、検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）と二本鎖核酸を変性させて得られうる一本鎖核酸をハイブリダイズせしめる。その後、反応系に存在する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより、一本鎖核酸を鋳型として検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長反応を行い、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長産物と該一本鎖核酸の複合体（Ｐ）を形成せしめる。その後、複合体（Ｐ）の検出を行えばよい。
【００２７】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、反応後に、二本鎖核酸の変性によって得られうる一本鎖核酸と、該一本鎖核酸の一部と相補的な検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を含む複合体（Ｐ）を形成する。
【００２８】
本発明では、形成された複合体（Ｐ）中に、該一本鎖核酸と該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が共存することを確認できればよい。例えば、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）として、二本鎖核酸中の標的核酸配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたものを用いることにより、該リガンドの捕捉剤が結合した固相上に該複合体（Ｐ）を捕捉し、検出することができる。
【００２９】
リガンドは核酸配列の検出を妨げるものでないのであれば、特に限定されるものではないが、好適には抗原、抗体、蛍光物質、発光団、および酵素、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンからなる群から選ぶことができる。好ましくは、抗原、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが良く、特に好ましくは抗原、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニンが良い。
【００３０】
固相としては金属板、木片、プラスチック板、ガラス板、ゴム板、発泡スチロール、フィルム、膜、通液性フィルター、ゲルなど、あらゆるものが使用できるが、膜、通液性フィルターが好ましい。必要に応じて、固相の表面および／または内部がリガンドの捕捉剤を補足可能な形態に修飾されていても良い。
【００３１】
リガンドの捕捉剤としては、抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンより適宜選択することが可能である。好ましくは抗体、アビジンがよく、特に好ましくはアビジンがよい。例えば、リガンドがビオチンの場合、リガンドの捕捉剤はアビジンであれば良い。
【００３２】
複合体（Ｐ）を検出する方法としては特に限定されないが、一例として、エチヂウムブロマイドまたはサイバーグリーンに代表される従来公知の二本鎖核酸に選択的に結合しうる物質を該複合体（Ｐ）に結合させ、紫外線を当てて発せられる蛍光を検出することができる。
【００３３】
また他の一例として、二本鎖核酸の変性によって得られうる一本鎖核酸にリガンドが結合している場合には、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を作用させて該複合体（Ｐ）を形成させた後に、該リガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を結合させ、該生理活性物質の標識を検出しても良い。
【００３４】
用いられる生理活性物質は該一本鎖核酸に結合しているリガンドに親和性を有するものであれば、特に限定されるものではないが、好適には抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンよりなる群より選ぶことができる。好ましくは抗体、アビジンがよく、特に好ましくは抗体がよい。例えば、該リガンドがＦＩＴＣの場合、生理活性物質は抗ＦＩＴＣ抗体であれば良い。
【００３５】
生理活性物質に結合される標識としては、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群より選ぶことができる。好ましくは蛍光化学物質、蛍光蛋白質、発光団、酵素、導電性物質がよく、さらに好ましくは蛍光化学物質、蛍光蛋白質、酵素がよく、特に好ましくは酵素がよい。
【００３６】
標識の検出は既知の方法であれば特に限定されるものではないが、標識が蛍光化学物質または蛍光蛋白質の場合、特定波長の光を照射し蛍光化学物質または蛍光蛋白質を励起させ、基底状態に変換される際に生じる特定波長の蛍光量を測定することが可能である。これらに用いられる蛍光化学物質としては、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＶＩＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＨＥＸ等が挙げられ、蛍光蛋白質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等を挙げることができる。標識が酵素である場合、酵素の基質を添加することによって生成される反応生成物を検出することによって測定が可能である。これらに用いられる酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとパラニトロフェニルリン酸、ＣＤＰ−ｓｔａｒ、ＡＭＰＰＤ、ＤＤＡＯｐｈｏｓｐａｔｅ、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ等の組み合わせ、パーオキシダーゼとＴＭＢ、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ（ロッシュ・ダイアグノスティックス）、ＳＡＴ−１（同仁化学）等の組み合わせ、ジアホラーゼとＮＴＢ等の組み合わせ、各種オキシダーゼと基質、各種デヒドロゲナーゼと基質の組み合わせ等、反応性生物が検出されるものであれば、これらに限定されることはなく用いることが可能である。標識が磁性体の場合、磁気を検出することによって測定が可能である。標識が導電性物質、電流値を検出することによって測定が可能である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
Cytochrome P450 2C19（ＣＹＰ２Ｃ１９）遺伝子の検出
（１）ＣＹＰ２Ｃ１９二本鎖核酸を調製するためのオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜４と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼した。
オリゴ１がセンス鎖、オリゴ２がアンチセンス鎖であり、オリゴ１およびオリゴ２が増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用され、オリゴ２の５’末端がＦＩＴＣにより標識されている。また、オリゴ３は５’末端をビオチンにより標識された検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）、オリゴ４は３’末端をビオチンにより標識された検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）である。
【００３９】
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｃ１９二本鎖核酸の調製
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を含む二本鎖核酸を調製した。
【００４０】
試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ２（５’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液 ２．５μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．５μｌ、
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １．３Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ
【００４１】
増幅条件
９５℃・５分
９５℃・３０秒、
６０℃・３０秒、
７２℃・３０秒（３５サイクル）
２５℃・１５分。
【００４２】
（３）ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の検出
調製したＣＹＰ２Ｃ１９二本鎖核酸を含む反応液に下記試薬を添加して、下記条件により二本鎖核酸へ検出プローブを結合させた。
【００４３】
試薬
以下の試薬を含む３０μｌ溶液を調製した。
検出プローブ反応液
オリゴ３（５’末端をビオチンにより標識）またはオリゴ４（３’末端をビオチンにより標識） ５ｐｍｏｌ、
ＰＣＲ産物 ２５μｌ
【００４４】
反応条件
９８℃・３分、
６５℃・１分、
５５℃・１分、
４５℃・１分、
３５℃・１分、
２５℃・１５分。
【００４５】
（４）通液性フィルターを用いた検出
検出プローブ反応液１５μｌをＰＯＤ標識抗ＦＩＴＣ抗体（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ製）の溶液３０μｌに加えて、室温にて５分間反応させた。これによって、増幅されたＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子断片にＰＯＤ標識抗ＦＩＴＣ抗体が結合する。この反応液をアビジンの結合した通液性フィルターに添加するとフィルター上に増幅されたＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子断片に結合したビオチン標識オリゴヌクレオチドであるオリゴ３または４が捕捉される。次に、上部より洗浄液およびＰＯＤ基質液を順次添加後、フィルター表面の発色を色彩色差計（ミノルタ製ＣＲ−２２１）にて測定した。測定にはＬａｂモードのａ値を使用し、測定値の補正には色彩色差計に添付の白色プレートを用いた。表１に、試料Ｎｏ．１〜７で示すサンプルおよび試料なしの場合について、得られた測定値を示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
上記のように、容易にかつ迅速に遺伝子を明確に検出することができた。オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）として、５’末端にリガンドを結合させ核酸の伸長反応が起こりうる形態に設計したオリゴ３において、特に明確に検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、試料核酸中の核酸配列を明確にまた簡便に検出が可能となり、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせず、迅速で容易に再現性の良い結果が得られることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の伸長反応が起こりうる形態のオリゴヌクレオチドプローブを用いた核酸の検出方法に関するものである。本発明は、遺伝病の診断、感染症における起因物質の特定等に際して特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中に存在する特定の核酸配列を検出する技術は、特定臓器で発現・機能するタンパク質の核酸分子レベルでの解析、神経、脳あるいは免疫系での情報伝達におけるタンパク質の発現制御の研究等において重要であるのみならず、遺伝的疾患の変異遺伝子の検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出等遺伝子診断においても極めて重要である。
【０００３】
しかしながら、従来の技術は、煩雑で且つ多くの工程を含み、熟練を要するために、操作によってはかなりの時間が必要とされることが多い。
【０００４】
また、遺伝子診断などは確定診断として用いられるため誤りが許されず、さらに迅速性も要求されるために、迅速性を保ちながら高い精度有していなければならないが、従来の技術は、かかる要請を十分に満足するものとはいえない。
【０００５】
試料中に存在する特定の核酸分子を検出する代表的な技術としては、ハイブリダイゼーション法がある（例えば、非特許文献１参照）。核酸のハイブリダイゼーション分析は、多種類の核酸の中から非常に少数の標的核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）をプローブで検出する技術であるが、ハイブリダイゼーション法では、高感度なレポーター（酵素、蛍光色素、ラジオアイソトープ等）を用いても、低コピー数（１〜１０００個）の標的核酸分子を検出するのは困難である。さらに、ハイブリダイゼーション法には、非特異反応という大きな問題点が存在するため、特定の核酸分子を正確に検出する為には担体のブロッキング、非特異シグナルの除去等の操作が不可欠であり、多大な労力が必要となる。
【０００６】
また、過去において非特異反応の問題を解決するための方法として、標的核酸より調製した標識ＤＮＡに、同様に調製した非標識ＤＮＡを添加して非特異反応を抑制するコンペティティブハイブリダイゼーション法（例えば、特許文献１、非特許文献２参照）が開発された。しかしコンペティティブハイブリダイゼーション法は操作が煩雑であり、また検出感度の面でも十分とはいえないため、特に遺伝的疾患の変異遺伝子の検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出等遺伝子診断には適用できない。
【特許文献１】特許第２９８２３０４号公報
【非特許文献１】Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition、第１０章、第１０．１〜１０．５２頁（２００１年）
【非特許文献２】Nicolasら、Anal. Biochem. 第２０５巻、第１９３頁、（１９９２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上記のような問題点を解決して、明確にかつ再現性よく試料中の核酸配列を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
１．二本鎖核酸中の標的核酸配列を検出する方法であって、少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする標的核酸配列検出方法。
（１）該二本鎖核酸を変性させ一本鎖核酸を形成せしめる第一工程、
（２）第一工程で得られうる一本鎖核酸に、該一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）をハイブリダイズさせ、該一本鎖核酸を鋳型として伸長反応を行い、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長産物と該一本鎖核酸の複合体（Ｐ）を形成せしめる第二工程、
（３）該複合体（Ｐ）の存在を検出する第三工程。
２．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）がリガンドにより標識されていることを特徴とする１の標的核酸配列検出方法。
３．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドがリガンドにより標識されていることを特徴とする１または２の標的核酸配列検出方法。
４．オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の５’末端がリガンドにより標識されていることを特徴とする１〜３のいずれかの標的核酸配列検出方法。
５．リガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする２〜４のいずれかの標的核酸配列検出方法。
６．第三工程が、少なくとも以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含むことを特徴とする１〜５のいずれかの標的核酸配列検出方法。
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のリガンドを利用して複合体（Ｐ）を固相上に捕捉する工程、
（ｉｉ）固相上に捕捉された該複合体（Ｐ）を検出する工程。
７．（ｉ）の工程で、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とハイブリダイズしていない一本鎖核酸を除去する工程を含むことを特徴とする６の標的核酸配列検出方法。
８．第一工程において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していることを特徴とする１〜７のいずれかの標的核酸配列検出方法。
９．二本鎖核酸が、増幅反応により得られた二本鎖核酸であることを特徴とする１〜８のいずれかの標的核酸配列検出方法。
１０．増幅反応がＰＣＲであることを特徴とする９の標的核酸配列検出方法。
１１．増幅反応において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していることを特徴とする９または１０の標的核酸配列検出方法。
１２．増幅反応に使用されるプライマーのＴｍ値より、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のＴｍ値が低いことを特徴とする９〜１１のいずれかの標的核酸配列検出方法。
１３．第一工程における変性が熱変性であることを特徴とする１〜１２のいずれかの標的核酸配列検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、試料核酸中の核酸配列を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において「二本鎖核酸」とは、標的核酸配列すなわち解析の対象となる核酸配列を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸、増幅した核酸又はその断片に相補的な配列を有する核酸、などを指す。
【００１２】
該染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸は、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物などのあらゆる材料から調製することができる。該該染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸の調製法は特に限定されないが、例えば、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。
【００１３】
該増幅した核酸又はその断片に相補的な配列を有する核酸は、例えば、既知の増幅方法により調製してもよい。代表的な核酸増幅方法としては、ＰＣＲ（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition （Sambrookら、第８章、第８．１〜８．１２６頁、２００１年））、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Nature 第３５０巻、第９１頁（１９９１年））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁（１９９２年））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁（１９９３年））、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method：J Clin Microbiol. 第４２巻：第１，９５６頁（２００４年））、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids：Kekkaku. 第７８巻、第５３３頁（２００３年））などが挙げられる。
【００１４】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチドプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドプライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドプライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２のｎ乗倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００１５】
本発明において「標的核酸配列」とは、標的核酸すなわち解析の対象となる核酸配列を含む核酸の配列を指す。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、リボゾーム遺伝子、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、薬物代謝に関連する遺伝子としてＣＹＰ２Ｃ１９ （Cytochrome P450 2C19）遺伝子が挙げられる。
【００１６】
本発明において、増幅反応に使用される「プライマー」とは、対象となる核酸配列を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、既知の増幅方法であるＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮおよびＵＣＡＮ法に使用できるものであれば特に限定されるものではない。プライマー鎖長は、９〜３５塩基であればよく、好ましくは、１１〜３０塩基である。該プライマーは検出したい核酸配列に応じて、複数混在していても良い。例えば、対象となる核酸配列を含む染色体又はその断片から複数種類の核酸を同時に増幅するために、それぞれの核酸配列に対応したプライマーを混合して用いても良い。
【００１７】
本発明に用いられる二本鎖核酸を変性させて得られうる「一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）」は、二本鎖核酸中の標的核酸配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドを用いることができる。より好適には、二本鎖核酸中の標的核酸配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたものを用いることができる。
【００１８】
本発明において二本鎖核酸の「変性」とは、該二本鎖核酸のうち、少なくとも該検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とハイブリダイズ可能な領域において、該二本鎖核酸において形成されていた塩基対が解消され、一本鎖になっていることを指す。二本鎖核酸を変性させる方法としては、加熱による方法（熱変性）、ホルムアミドを添加する方法、など従来公知の方法を使用することができるが、簡便性の観点から熱変性が好ましい。
【００１９】
本発明の重要な開示の一つは、二本鎖核酸を変性させて得られうる一本鎖核酸に、該一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）をハイブリダイズさせる場合に、該一本鎖核酸を鋳型とする伸長反応を行って該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長産物と該一本鎖核酸の複合体（Ｐ）を形成せしめることによって、従来公知の該伸長反応を行わないハイブリダイゼーション法と比較して該複合体（Ｐ）の生成量が大幅に向上し、標的核酸を明確にまた簡便に検出できるような顕著な効果を見出したことにある。
【００２０】
また、二本鎖核酸を変性させて得られうる一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）として、二本鎖核酸中の標的核酸配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたものを用いる場合は、上記伸長反応を阻害しない位置にリガンドを結合させることが好ましい。該リガンドを結合させる位置としては、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドにリガンドを結合させることが好ましく、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の５’末端にリガンドを結合させることがより好ましい。
【００２１】
増幅反応において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していてもよい。その場合、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）は、増幅反応に使用されるプライマーを用いた増幅反応を阻害しないように設計するのが好ましい。さらに、非特異反応を抑制するため、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）から伸長した核酸が該増幅反応に用いられないように、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を設計することが好ましい。その一例として、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のＴｍ値を該増幅反応に使用されるプライマーのＴｍ値より低くなるように設計すればよい。
【００２２】
オリゴヌクレオチドプライマーのＴｍ値は、ハイブリッドを形成した２本鎖ＤＮＡ分子の５０％が乖離する温度のことであり、その計算方法としては、既知の方法であれば特に限定されないが、Ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄ、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法のいずれかにより求められたもので、本発明の特性を満たしていることが必要である。なお、特に好ましいＴｍ値はＮｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｅｔｈｏｄで計算されたものである。該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）および該増幅反応に使用されるプライマーにおけるＴｍ値の差は１℃以上であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５℃以上である。なお、Ｔｍ値の差は５０℃以下であればよく、好ましくは４０℃以下がよい。プローブ鎖長は、５〜３０塩基であればよく、好ましくは、８〜２５塩基である。
【００２３】
本発明において、二本鎖核酸を変性させて得られうる一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）は、該二本鎖核酸の変性とは別、又は同時に作用させることが可能である。
【００２４】
別に作用させる場合には、一例として、上記二本鎖核酸の変性を行った後に該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を加え、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げることができる。
【００２５】
同時に作用させる場合には、一例として、上記二本鎖核酸および該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を混合した状態で、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げることができる。
【００２６】
核酸増幅法から複合体（Ｐ）を形成せしめるまでは、ホモジニアスな系で実施しても良い。例えば、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返し、核酸増幅反応を行う。その後、９８℃、３分の熱変性を行ってから徐々に室温付近まで温度を下げ、検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）と二本鎖核酸を変性させて得られうる一本鎖核酸をハイブリダイズせしめる。その後、反応系に存在する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより、一本鎖核酸を鋳型として検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長反応を行い、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長産物と該一本鎖核酸の複合体（Ｐ）を形成せしめる。その後、複合体（Ｐ）の検出を行えばよい。
【００２７】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、反応後に、二本鎖核酸の変性によって得られうる一本鎖核酸と、該一本鎖核酸の一部と相補的な検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を含む複合体（Ｐ）を形成する。
【００２８】
本発明では、形成された複合体（Ｐ）中に、該一本鎖核酸と該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が共存することを確認できればよい。例えば、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）として、二本鎖核酸中の標的核酸配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドにリガンドが結合されたものを用いることにより、該リガンドの捕捉剤が結合した固相上に該複合体（Ｐ）を捕捉し、検出することができる。
【００２９】
リガンドは核酸配列の検出を妨げるものでないのであれば、特に限定されるものではないが、好適には抗原、抗体、蛍光物質、発光団、および酵素、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンからなる群から選ぶことができる。好ましくは、抗原、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが良く、特に好ましくは抗原、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニンが良い。
【００３０】
固相としては金属板、木片、プラスチック板、ガラス板、ゴム板、発泡スチロール、フィルム、膜、通液性フィルター、ゲルなど、あらゆるものが使用できるが、膜、通液性フィルターが好ましい。必要に応じて、固相の表面および／または内部がリガンドの捕捉剤を補足可能な形態に修飾されていても良い。
【００３１】
リガンドの捕捉剤としては、抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンより適宜選択することが可能である。好ましくは抗体、アビジンがよく、特に好ましくはアビジンがよい。例えば、リガンドがビオチンの場合、リガンドの捕捉剤はアビジンであれば良い。
【００３２】
複合体（Ｐ）を検出する方法としては特に限定されないが、一例として、エチヂウムブロマイドまたはサイバーグリーンに代表される従来公知の二本鎖核酸に選択的に結合しうる物質を該複合体（Ｐ）に結合させ、紫外線を当てて発せられる蛍光を検出することができる。
【００３３】
また他の一例として、二本鎖核酸の変性によって得られうる一本鎖核酸にリガンドが結合している場合には、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）を作用させて該複合体（Ｐ）を形成させた後に、該リガンドに結合できかつ標識されてなる少なくとも１種類の生理活性物質を結合させ、該生理活性物質の標識を検出しても良い。
【００３４】
用いられる生理活性物質は該一本鎖核酸に結合しているリガンドに親和性を有するものであれば、特に限定されるものではないが、好適には抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質、アビジン、ビオチン、ジゴケシゲニンよりなる群より選ぶことができる。好ましくは抗体、アビジンがよく、特に好ましくは抗体がよい。例えば、該リガンドがＦＩＴＣの場合、生理活性物質は抗ＦＩＴＣ抗体であれば良い。
【００３５】
生理活性物質に結合される標識としては、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質よりなる群より選ぶことができる。好ましくは蛍光化学物質、蛍光蛋白質、発光団、酵素、導電性物質がよく、さらに好ましくは蛍光化学物質、蛍光蛋白質、酵素がよく、特に好ましくは酵素がよい。
【００３６】
標識の検出は既知の方法であれば特に限定されるものではないが、標識が蛍光化学物質または蛍光蛋白質の場合、特定波長の光を照射し蛍光化学物質または蛍光蛋白質を励起させ、基底状態に変換される際に生じる特定波長の蛍光量を測定することが可能である。これらに用いられる蛍光化学物質としては、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＶＩＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＨＥＸ等が挙げられ、蛍光蛋白質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等を挙げることができる。標識が酵素である場合、酵素の基質を添加することによって生成される反応生成物を検出することによって測定が可能である。これらに用いられる酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとパラニトロフェニルリン酸、ＣＤＰ−ｓｔａｒ、ＡＭＰＰＤ、ＤＤＡＯｐｈｏｓｐａｔｅ、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ等の組み合わせ、パーオキシダーゼとＴＭＢ、Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ（ロッシュ・ダイアグノスティックス）、ＳＡＴ−１（同仁化学）等の組み合わせ、ジアホラーゼとＮＴＢ等の組み合わせ、各種オキシダーゼと基質、各種デヒドロゲナーゼと基質の組み合わせ等、反応性生物が検出されるものであれば、これらに限定されることはなく用いることが可能である。標識が磁性体の場合、磁気を検出することによって測定が可能である。標識が導電性物質、電流値を検出することによって測定が可能である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
Cytochrome P450 2C19（ＣＹＰ２Ｃ１９）遺伝子の検出
（１）ＣＹＰ２Ｃ１９二本鎖核酸を調製するためのオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜４と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼した。
オリゴ１がセンス鎖、オリゴ２がアンチセンス鎖であり、オリゴ１およびオリゴ２が増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用され、オリゴ２の５’末端がＦＩＴＣにより標識されている。また、オリゴ３は５’末端をビオチンにより標識された検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）、オリゴ４は３’末端をビオチンにより標識された検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）である。
【００３９】
（２）ＰＣＲ法によるＣＹＰ２Ｃ１９二本鎖核酸の調製
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を含む二本鎖核酸を調製した。
【００４０】
試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ２（５’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液 ２．５μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．５μｌ、
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １．３Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ
【００４１】
増幅条件
９５℃・５分
９５℃・３０秒、
６０℃・３０秒、
７２℃・３０秒（３５サイクル）
２５℃・１５分。
【００４２】
（３）ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の検出
調製したＣＹＰ２Ｃ１９二本鎖核酸を含む反応液に下記試薬を添加して、下記条件により二本鎖核酸へ検出プローブを結合させた。
【００４３】
試薬
以下の試薬を含む３０μｌ溶液を調製した。
検出プローブ反応液
オリゴ３（５’末端をビオチンにより標識）またはオリゴ４（３’末端をビオチンにより標識） ５ｐｍｏｌ、
ＰＣＲ産物 ２５μｌ
【００４４】
反応条件
９８℃・３分、
６５℃・１分、
５５℃・１分、
４５℃・１分、
３５℃・１分、
２５℃・１５分。
【００４５】
（４）通液性フィルターを用いた検出
検出プローブ反応液１５μｌをＰＯＤ標識抗ＦＩＴＣ抗体（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ製）の溶液３０μｌに加えて、室温にて５分間反応させた。これによって、増幅されたＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子断片にＰＯＤ標識抗ＦＩＴＣ抗体が結合する。この反応液をアビジンの結合した通液性フィルターに添加するとフィルター上に増幅されたＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子断片に結合したビオチン標識オリゴヌクレオチドであるオリゴ３または４が捕捉される。次に、上部より洗浄液およびＰＯＤ基質液を順次添加後、フィルター表面の発色を色彩色差計（ミノルタ製ＣＲ−２２１）にて測定した。測定にはＬａｂモードのａ値を使用し、測定値の補正には色彩色差計に添付の白色プレートを用いた。表１に、試料Ｎｏ．１〜７で示すサンプルおよび試料なしの場合について、得られた測定値を示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
上記のように、容易にかつ迅速に遺伝子を明確に検出することができた。オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）として、５’末端にリガンドを結合させ核酸の伸長反応が起こりうる形態に設計したオリゴ３において、特に明確に検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、試料核酸中の核酸配列を明確にまた簡便に検出が可能となり、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせず、迅速で容易に再現性の良い結果が得られることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸中の標的核酸配列を検出する方法であって、少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする標的核酸配列検出方法。
（１）該二本鎖核酸を変性させ一本鎖核酸を形成せしめる第一工程、
（２）第一工程で得られうる一本鎖核酸に、該一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）をハイブリダイズさせ、該一本鎖核酸を鋳型として伸長反応を行い、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長産物と該一本鎖核酸の複合体（Ｐ）を形成せしめる第二工程、
（３）該複合体（Ｐ）の存在を検出する第三工程。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）がリガンドにより標識されていることを特徴とする請求項１に記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドがリガンドにより標識されていることを特徴とする請求項１または２に記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の５’末端がリガンドにより標識されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項５】
リガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項６】
第三工程が、少なくとも以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のリガンドを利用して複合体（Ｐ）を固相上に捕捉する工程、
（ｉｉ）固相上に捕捉された該複合体（Ｐ）を検出する工程。
【請求項７】
（ｉ）の工程で、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とハイブリダイズしていない一本鎖核酸を除去する工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項８】
第一工程において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項９】
二本鎖核酸が、増幅反応により得られた二本鎖核酸であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項１０】
増幅反応がＰＣＲであることを特徴とする請求項９に記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項１１】
増幅反応において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していることを特徴とする請求項９または１０に記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項１２】
増幅反応に使用されるプライマーのＴｍ値より、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のＴｍ値が低いことを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項１３】
第一工程における変性が熱変性であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項１】
二本鎖核酸中の標的核酸配列を検出する方法であって、少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする標的核酸配列検出方法。
（１）該二本鎖核酸を変性させ一本鎖核酸を形成せしめる第一工程、
（２）第一工程で得られうる一本鎖核酸に、該一本鎖核酸の一部と相補的な少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）をハイブリダイズさせ、該一本鎖核酸を鋳型として伸長反応を行い、該オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の伸長産物と該一本鎖核酸の複合体（Ｐ）を形成せしめる第二工程、
（３）該複合体（Ｐ）の存在を検出する第三工程。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）がリガンドにより標識されていることを特徴とする請求項１に記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の３’末端から２番目以降の少なくとも一つのヌクレオチドがリガンドにより標識されていることを特徴とする請求項１または２に記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）の５’末端がリガンドにより標識されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項５】
リガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項６】
第三工程が、少なくとも以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のリガンドを利用して複合体（Ｐ）を固相上に捕捉する工程、
（ｉｉ）固相上に捕捉された該複合体（Ｐ）を検出する工程。
【請求項７】
（ｉ）の工程で、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）とハイブリダイズしていない一本鎖核酸を除去する工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項８】
第一工程において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項９】
二本鎖核酸が、増幅反応により得られた二本鎖核酸であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項１０】
増幅反応がＰＣＲであることを特徴とする請求項９に記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項１１】
増幅反応において、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）が存在していることを特徴とする請求項９または１０に記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項１２】
増幅反応に使用されるプライマーのＴｍ値より、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｄ）のＴｍ値が低いことを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【請求項１３】
第一工程における変性が熱変性であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の標的核酸配列検出方法。
【公開番号】特開２００７−３３０１３４（Ｐ２００７−３３０１３４Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６４８７９（Ｐ２００６−１６４８７９）
【出願日】平成１８年６月１４日（２００６．６．１４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１４日（２００６．６．１４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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