植物から組換えタンパク質を精製するための非変性プロセス
本発明は、植物、植物由来組織または植物細胞で産生された高価値の異種タンパク質のタンパク質精製のための改善法に関する。本発明は、植物で産生された異種タンパク質の下流プロセシングのコストを減少させ、そしてその品質を改善することを目的とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は生化学およびタンパク質技術の分野にあり、そしてトランスジェニック植物材料からの異種タンパク質の単離および精製の改善法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
タンパク質に基づく生物薬剤は、深刻な疾患に対する、より特異的で、そして組織特異的であるか、または細胞特異的な薬剤治療を提供するのに、きわめて有望である（概説に関しては、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇｓ” Ｐ． Ｂｕｃｋｅｌ監修 ２００１を参照されたい）。
【０００３】
先行技術および適用の多くの例によって、こうした生物薬剤の産生のための細菌などの微生物、および動物細胞の使用が示されてきており、このうちインスリンが注目すべき例である。
【０００４】
文献中の多くの例によって、高価値の異種ポリペプチドまたは生物薬剤を発現し、そして製造するためのトランスジェニック植物または植物細胞培養物の利用が示されてきている。こうした植物に基づく製造プロセスを、分子農業と呼ぶことも可能である。
【０００５】
産生生物として植物を使用することによって、価値あるタンパク質の産生を、より経済的にすることも可能である。タンパク質製造の宿主生物として用いる植物の栽培コストは、原核生物産生系、動物細胞培養などのバイオリアクターに基づく、大部分の産生系に比較して、かなり低くなることも可能である。しかし、上記産生系のすべてに関して、異種タンパク質の精製は、依然として要求が厳しく、そして費用がかかる課題である。したがって、植物に基づく産生系に関しては、下流プロセシングが、高価値の異種タンパク質を産生する際の産生コストの大部分を生じる。
【０００６】
タンパク質精製および単離は、遺伝子技術の使用によって、多様な宿主生物中で集積し、そして産生されたタンパク質の下流プロセシングの重要なプロセスである。宿主生物からのタンパク質の精製は、非常に困難で、複雑であり、そして高価である可能性もある。産生宿主生物からの目的のタンパク質の分離および精製のため、商業的には、多様なクロマトグラフィー戦略が用いられる。クロマトグラフィー戦略は、混入または内因性タンパク質および目的の異種タンパク質間の、大きさ、可溶性、電荷、疎水性、およびアフィニティーなどの物理化学的相違に頼ることも可能である。
【０００７】
多数の工程からなるクロマトグラフィー戦略の組み合わせは、いくつかの高価なクロマトグラフィー・マトリックス、およびカラム、制御装置などからなる必要なハードウェアを必要とし、そして各工程で産物収量の損失が付随し、そしてその結果、経済的損失が生じる。関与するクロマトグラフィー工程に加えて、下流プロセシングは、典型的には、多数のろ過工程および遠心分離工程を伴う。その結果、精製および下流プロセシングのコストのため、タンパク質に基づくバイオテクノロジー製品の精製は手が届かないほど高額になりうる。産業タンパク質などの、より価値が低い、タンパク質に基づくいくつかの製品に関しては、下流プロセシングのコストのため、使用およびマーケティングが抑制される可能性もあり、未精製でそしてあまり明確でない製品を生じる可能性もある。ほとんどのバイオテクノロジー製品に関しては、明らかに、精製コストが、製造コストの大きな割合を占める。
【０００８】
混入物質からの目的のタンパク質の分離を達成する特殊化クロマトグラフィー・マトリックスのコストは、その産生に伴う複雑なカップリング化学反応の結果、高い。いくつかの一般的なクロマトグラフィー法は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーである。マトリックスにカップリングされたリガンドには、多様な強度の陰イオン交換体としての多様なジエチルアミノエチル基または第四アミノエチル基、並びに陽イオン交換体としてのカルボキシメチル置換基およびスルホネート基およびホスフェート（Ｓｃｏｐｅｓ、１９９３）、疎水性相互作用クロマトグラフィー用の架橋アガロース・マトリックスにカップリングした疎水性アルキル基、フェニル基またはブチル基（疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ） 番号１８−１０２０−９０、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、あるいはシリカまたは合成有機ポリマーで構成される多孔不溶性ビーズ化マトリックスに移植されたリガンドとしての疎水性ｎ−アルキル基（逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、コード番号１８−１１１３４−１６、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が含まれることも可能である。これらのマトリックスは化学的に複雑であるため、精製法中に、マトリックスからのリガンドおよび他の物質の望ましくない浸出が引き起こされる可能性もあり、この場合は、予防手段、監視、または目的のタンパク質からの浸出物の除去が必要となり、すでに高価な下流プロセシングのコストがさらに上がることになる。
【０００９】
アフィニティー・クロマトグラフィーは、剤および特異的リガンド間の特異的アフィニティーに基づき、しばしば天然タンパク質−リガンド相互作用を模倣しているため、最も強力な精製原理のうちの１つである。いくつかの異なる種類のアフィニティー吸着剤が利用可能であり、あるものは特定のタンパク質に非常に特異的であり、他のものは特定のタンパク質よりもタンパク質種に結合する。多くの場合、アフィニティー・クロマトグラフィーは、そのリガンドに結合するタンパク質を特異的に選び出す吸着剤に対する、固定化されたリガンドの使用を意味する。アフィニティー吸着剤へのリガンドのカップリングは、吸着剤の臭化シアン活性化、トシル活性化、またはビニルスルホン活性化などのカップリング化学反応の使用を伴う。カラムマトリックスにカップリングしたリガンドは、タンパク質性起源のものであることもまたはないことも可能である。前者の例は、限定されるわけではないが、？−グロブリンへのアフィニティーを有し、したがって抗体の精製に有用な固定化プロテインＡまたはプロテインＧ、および糖タンパク質に対するアフィニティーを持つレクチンである。後者の例として、マトリックスにカップリングした固定化グルタチオンは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ・ドメインを含有する融合タンパク質に結合する。固定化金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、マトリックスへの金属キレートリガンドの固定に基づき、そしてカラム上に固定された金属イオンおよびタンパク質上の塩基性基、主にヒスチジン残基の間の弱い配位結合の形成に頼る。商業的なクローニングベクターは、一連のヒスチジン残基、Ｈｉｓ−タグとイン・フレームで、ｃＤＮＡのクローニングを提供し、このタグが、ＩＭＡＣを用いて、生じた融合タンパク質を精製するのを可能にする。ＩＭＡＣはタンパク質の小規模精製に広く用いられているが、混入タンパク質中の天然ヒスチジン残基がＩＭＡＣにおいて結合を生じる可能性もあるため、ＩＭＡＣは非特異的だが選択的な方法である（Ｓｃｏｐｅｓ １９９３）。融合タンパク質を生じる、商業的発現ベクターにおいて、いくつかの異なる種類のタグまたは結合ドメインが利用可能であり、この場合、タグ／結合ドメインが、カラムマトリックス上にカップリングしたリガンドに、融合タンパク質を結合させる。
【００１０】
これらのマトリックス−リガンド系を用いて、高特異性のタンパク質結合を達成することも可能である。上述の場合は、複雑なカップリング化学反応を伴って、不活性マトリックス上にリガンドを固定する。その結果、アフィニティー・マトリックスのコストのため、しばしば、この強力な技術の産業規模の適用が抑制されることもありうる。さらに、クロマトグラフィー法の大部分の他の種類でのように、マトリックスへのリガンドのカップリングの安定性が問題になり、そして浸出が非常に懸念される。ＩＭＡＣにおける重金属浸出は、細心の注意を払うべき生物活性タンパク質の多くの精製プロセスにおいて、許容し得ない、そして深刻な混入を生じる可能性もあり、そして精製中のタンパク質を不活性にする可能性もある（Ｓｃｏｐｅｓ、１９９３）。
【００１１】
リガンドへのタンパク質の結合アフィニティーが非常に強いため、溶出条件には、リガンド−タンパク質結合を破壊するために、精製中の価値あるタンパク質を部分的に変性させる、劇的な条件が必要である場合が珍しくないことは、本発明に特に関連する。この限定されない例は、プロテインＡ−アフィニティー・マトリックスからの抗体の溶出であり、これは、カラムから抗体が遊離するのに、低いｐＨでの変性を必要とする。精製されるタンパク質活性を喪失させるリスクがあり、タンパク質を再フォールディングするために過剰な工程が加えられ、そして続いて、再フォールディングしたタンパク質産物に活性解析が必要であり、そしてコストがさらに加算されることを伴うため、タンパク質精製プロセスに変性工程を含むのは望ましくない。
【００１２】
植物からの大規模精製にアフィニティーに基づくクロマトグラフィーを使用するのを可能にするため、商業的に入手可能な現在の手段より単純で、そしてより経済的であり、関与するカップリング化学反応がより少なく、そして製薬産業標準の品質必要条件に適合する、非変性タンパク質精製プロセスを開発することが非常に望ましい。
【００１３】
植物に基づくタンパク質産生は、文献の例に示されてきているように、経済的な方式で、大規模にタンパク質を製造するのにきわめて有望である（概説にはＨａｍｍｏｎｄ １９９９を参照されたい）。植物を用いた分子農業に伴う栽培コストは、伝統的なバイオリアクターに基づく方法よりもかなり安価である。植物に基づく産生の上流事象は、特に有望であるようだが、下流プロセシングは、その他のタンパク質産生産業と同じ困難に直面している。
【００１４】
多糖および多糖結合タンパク質は、アフィニティー・クロマトグラフィー工程の設計と組み合わせて使用可能である（例えばＢｏｒａｓｔｏｎら、２００１を参照されたい）。
先行技術の例（米国特許第６，３３１，４１６号）では、Ｓｈａｎｉらは、宿主植物細胞壁のあまり明確でないセルロースに結合する多糖結合ドメインを持つ組換えタンパク質を発現する方法、および宿主植物セルロースへのこのタンパク質のアフィニティーを利用して、可溶性混入タンパク質から分離可能な細胞壁−タンパク質複合体を生じる、タンパク質精製プロセスを記載する。結合強度は、セルロース性植物物質からタンパク質を遊離させるのに、タンパク質を変性させ、精製中の組換えタンパク質の活性に負の影響を有する劇的な条件が必要でありうる程度である可能性もある。したがって、植物材料からタンパク質を精製する方法を提示したものの、リガンド／細胞壁結合を破壊するのに厳しい条件が必要であり、これには抗体−プロテインＡ溶出に関して上述したものに匹敵する厄介な問題および懸念が伴う。
【００１５】
植物からの大規模精製のために、アフィニティーに基づくクロマトグラフィーを使用するのを可能にするため、商業的に入手可能な現在の手段より単純で、そしてより経済的であり、関与するカップリング化学反応がより少なく、そして製薬産業標準の品質必要条件に適合する、非変性タンパク質精製プロセスを開発することが非常に望ましい。
【００１６】
炭水化物結合ドメインＣＢＭ９−２は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）キシラナーゼ１０Ａ由来である（Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒら １９９５：Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５（３）， ４３１−４４４）。ＣＢＭ９−２ゲノムＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｚ４６２６４として入手可能であり、そしてＣＢＭのファミリーＩＸに属し、そして溶出剤として１Ｍグルコースを用いた非変性溶出条件、および非結晶セルロースとともに結晶セルロースに対する非常に特異的なアフィニティーを含めて、高分解能アフィニティー精製に魅力的ないくつかの特性を有する（Ｂｏｒａｓｔｏｎら ２００１：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０， ６２４０−６２４７）。
【００１７】
トランスジェニック植物からの発現組換えタンパク質の回収および精製は、おそらく、タンパク質産生のための現実的な代替系として植物を確立する際に、最も重要な要因であろう。プロセシング工程の数を最小限にし、そして各工程をはるかに効率的に行うことが必須である（Ｍｏｌｏｎｅｙ ２０００）。
【００１８】
このことから、トランスジェニック植物材料から異種タンパク質を、効率的に、単純に、そして経済的に精製するための下流プロセスに関する、認識されている必要性が強まる。さらに、目的のタンパク質の生物活性を安定させ、そして収量を改善するため、穏やかで、目的のタンパク質を変性させない条件からなる下流プロセス（特に穏やかな溶出条件を持つ特異的アフィニティー精製法）の必要性がある。
【００１９】
上に詳述する限界を持たない非変性タンパク質精製プロセスは、植物からの生物薬剤の産生に伴う産生コストを有意に低下させることも可能であり、そしてその下流プロセシングが、これまでは手が届かないくらい複雑で高価であった、価値ある異種タンパク質の精製を可能にするであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
発明の概要および目的
本発明の主な目的は、植物、植物由来組織または植物細胞で産生された高価値の異種タンパク質のタンパク質精製のための、改善された非変性法を提供することである。
【００２１】
本発明は、植物で産生された異種タンパク質の下流プロセシングのコストを減少させ、そしてその品質を改善することを目的とする。
精製プロセスの重要な工程は、細胞壁断片由来のＣＢＭ融合タンパク質としての目的のタンパク質およびあまり明確でない他の植物由来固体物の分離であり、これは本発明のＣＢＭ−融合タンパク質がこれらの構成要素に結合しないためである。この工程は、アフィニティー・クロマトグラフィー工程の前に別個に行うことも可能であるし、またアフィニティー・クロマトグラフィー工程と同時に行うことも可能である。
【００２２】
第一の側面において、本発明は、セルロース結合性モジュール（ＣＢＭ）を含む可溶性異種融合タンパク質を発現しているトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞から、前記融合タンパク質を産生し、そして精製する、非変性法を提供し、該方法は：
トランスジェニック植物材料を破壊し；
前記の破壊した植物材料から可溶性融合タンパク質を液相に抽出してタンパク質抽出物を得るために、植物材料に抽出液を添加し、それによって可溶性植物材料および不溶性植物材料の混合物を生成し；
細胞壁材料および固体物を含む不溶性植物材料を、目的の前記融合タンパク質を含む前記タンパク質抽出物から分離し；
前記タンパク質抽出物を、前記融合タンパク質に結合する多糖マトリックスに接触させ；
結合した融合タンパク質を伴うマトリックスを、１以上の適切な水溶液、例えば１以上の緩衝溶液で洗浄し、すなわち洗浄は、勾配を用いて１つの工程で行うことも、または一連の異なる洗浄溶液として行うことも可能である；そして
特徴的に穏やかな条件下で、マトリックスからの前記融合タンパク質の遊離を達成する条件を調節することによって、前記多糖マトリックスから融合タンパク質を溶出する
ことを含む。
【００２３】
典型的には、トランスジェニック植物または植物細胞は、双子葉植物および単子葉植物の群より選択され、そして好ましい態様において、前記植物細胞またはトランスジェニック植物は、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、ナタネ（ｒａｐｅ ｓｅｅｄ）、ダイズ（ｓｏｙ ｂｅａｎ）、レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ）、アルファルファ（ａｌｆａｌｆａ）、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、コムギ（ｗｈｅａｔ）、カラスムギ（ｏａｔ）およびイネ（ｒｉｃｅ）の群より選択される。
【００２４】
いくつかの態様において、分離工程は、吸着流動床（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＥＢＡ）、充填モード・クロマトグラフィー、沈殿、ろ過、遠心分離、またはその組み合わせのいずれかから選択される方法を含む。
【００２５】
多糖マトリックスへの融合タンパク質のアフィニティー結合工程は、好ましくは、クロマトグラフィー工程を含む。
しかし、特定の有用な態様において、目的のタンパク質であるＣＢＭ−融合タンパク質からの細胞壁断片およびあまり明確でない他の植物由来固体物の前記分離、並びに多糖マトリックスへの該ＣＢＭ融合タンパク質のアフィニティー結合は、適切で安価な多糖マトリックスを伴う吸着流動床クロマトグラフィー（ＥＢＡ）を用いた、単一の強力な精製工程で行うことも可能である。この特徴は、下流プロセシングを経済的に合理化し、そして改善する。
【００２６】
本発明の好適な態様において、多糖マトリックスはセルロースを含み、そして好ましくは、薬学的に適合するセルロースを含む。ＣＢＭ−融合タンパク質が結合するセルロース性マトリックスが、こうしたよく定義された薬剤等級のものであると、精製された異種タンパク質の多様な高品質の使用が可能になる。多糖マトリックスとして使用するのに有用な薬学的に適合するセルロース材料はＡｖｉｃｅｌ（商標）（ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ペンシルバニア州）を含む。
【００２７】
本発明記載のアフィニティー・クロマトグラフィーに用いる多糖マトリックスは、複雑なカップリング化学反応も、また浸出する可能性があるリガンドの固定も必要としない。多糖マトリックスは、構造的支持および剛性の両方を提供し、一方でアフィニティー吸着剤自体を構成する。それによって、植物由来異種タンパク質の、より経済的でそしてより安全なタンパク質精製が可能になる。
【００２８】
記載するプロセスが、例えば農業、化学産業または製薬産業において、すべて、精製異種タンパク質の異なる最終用途にしたがう、異なる品質の異なる多糖マトリックスに受け入れられることが、本発明のさらなる利点である。薬剤等級の多糖から作成されるアフィニティー吸着剤は、製薬産業内のバルク材料（ｂｕｌｋ ｍａｔｅｒｉａｌ）であり、そして商業的に入手可能ないかなるアフィニティー・クロマトグラフィー媒体よりかなり安価である。したがって、本発明に記載するプロセスを用いて、非常に高品質のアフィニティー・マトリックスを経済的に作成することも可能であり、植物由来材料から、高価値のタンパク質をより経済的に下流プロセシングすることが可能になる。
【００２９】
本発明のさらなる利点は、植物由来のＣＢＭ−融合タンパク質が多糖クロマトグラフィー・マトリックスにひとたび結合し、そしてマトリックスを洗浄して、いかなる混入内因性植物タンパク質も取り除いたならば、典型的には、ＣＢＭに付着したいかなる融合パートナータンパク質の活性および構造も保護する、中性条件または酸性条件下、そして好ましくは可溶性炭水化物（糖）の添加を伴う、非変性の穏やかな条件を用いて、カラムから融合タンパク質を溶出させることも可能であることである。糖は、ＣＢＭの結合部位に関して、セルロースと競合し、そして適切な濃度で、結合したＣＢＭ融合タンパク質すべてを実質的に遊離させるであろう。
【００３０】
本発明の方法に用いられ、そして目的の異種タンパク質に融合される、好ましいＣＢＭは、適切な多糖マトリックスに十分に強く結合して、高収量の結合したＣＢＭ融合タンパク質を得て、そして上記のような穏やかな条件によって遊離することを可能にする、望ましい結合特性を有するものであるということになる。ＣＢＭ９−２は、これらの望ましい特性を有することが見出されている。こうした特性を持つ他のＣＢＭの使用もまた、本発明の範囲内である。例えば、望ましい特性を有するＣＢＭをコードする配列、例えば結合特性に重要なＣＢＭ９−２中のモチーフに類似であることが見出された配列モチーフに関して、入手可能な遺伝子データベースを検索することによって、こうしたＣＢＭを見出すことも可能である。また、本発明にしたがう適切なＣＢＭを得るため、当該技術分野に周知の点突然変異技術を用いて、存在するＣＢＭを修飾して、その結合特性を修飾することも可能である。
【００３１】
多糖アフィニティー・マトリックスから融合タンパク質が溶出されたら、タンパク質の望ましい型および使用に応じて、場合によって１以上のさらなる精製工程または単離工程に供することも可能である。
【００３２】
有用な態様において、トランスジェニック植物または植物細胞は、ＣＢＭをコードする核酸配列を含み、好ましくは、ＣＢＭは熱安定性であり、そして上昇した温度で可溶性のままである。この文脈において、用語、熱安定性は、タンパク質が、上昇した温度、すなわち約２５℃より高い温度、そして典型的には約３７℃より高い温度、４０℃〜１００℃の範囲を含む温度で、可溶性であり、正しくフォールディングされ、そして活性であり続けることを示す。
【００３３】
こうした好ましいＣＢＭをコードする遺伝子を、好熱性細菌、藻類および真菌を含む、好熱性生物から得ることも可能であり、そして前記ＣＢＭを含む融合タンパク質を発現するような方式で、宿主植物または植物細胞に導入することも可能である。用語、好熱性は、本明細書において、４０℃を超える温度で最適に増殖する生物を指す。好ましいＣＢＭは、サーモトガ・マリティマ由来のキシラナーゼ１０Ａ遺伝子にコードされ、好ましくは、ＣＢＭをコードする宿主植物または植物細胞内の領域は、前記遺伝子の領域である。特定の態様において、ＣＢＭをコードする前記領域は、配列番号１として示す配列を含むか、あるいは同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または前記アミノ酸配列と実質的な配列同一性を持つアミノ酸配列をコードする配列を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの態様において、プロセス中、可溶性融合タンパク質を含むタンパク質抽出物を３７℃〜１００℃の範囲の温度に、例えば５０〜８０℃の範囲の温度に、１分間〜１２０分間の範囲などの期間、加熱することが有用である可能性もある。この目的のため、好熱性供給源由来などの熱安定性ＣＢＭが特に有用である。いくつかの有用な態様において、熱安定性ＣＢＭは、上昇した温度で、付着した異種タンパク質の溶解度を促進することも可能であり、この特徴を用いて、他の熱不安定性植物タンパク質を含有する抽出物をＣＢＭ−融合タンパク質に関して濃縮することも可能である。こうした加熱の間、内因性植物タンパク質の一部が不活性化され、そして／または変性される可能性もあり、そしてしたがって、タンパク質抽出物からこれらを容易に分離することも可能である。好ましくは、固体物の分離、および加熱した抽出物からの前記ＣＢＭ融合タンパク質のアフィニティー結合を同時に行うための、多糖マトリックスを伴う吸着流動床を含むプロセス工程に、前記の加熱した抽出物を供することも可能である。
【００３５】
本発明の非常に有用な態様において、前記融合タンパク質は、タンパク質分解性切断部位、好ましくは特異的プロテアーゼに認識され、そして切断される、タンパク質分解性切断部位を含む一連のアミノ酸に遮断される、ＣＢＭおよび目的の異種ポリペプチドを含む。こうした切断部位を有することによって、融合タンパク質中の融合パートナーをＣＢＭから容易に切り落として、ＣＢＭを伴わない、望ましい精製異種タンパク質を得ることも可能である。特異的プロテアーゼを伴う、こうした精製の成功を、本出願者の同時係属出願「組換えタンパク質のタンパク質分解性切断および精製」に開示し、該出願は、本出願と同時に出願され、そして本明細書に完全に援用される。
【００３６】
本発明は、限定されるわけではないが、農業、化学産業およびタンパク質に基づく薬剤製造などの目的のため、大規模な異種タンパク質産生に伴う下流プロセシングの欠点に取り組んで成功している。特に、本発明は、伴うプロセシング工程がより少なく、製薬産業内での使用に受け入れられる、より安全でそしてより経済的なアフィニティー・クロマトグラフィー原理、高価値の異種タンパク質の活性を維持する穏やかな溶出条件をうまく利用した植物由来セルロース性材料などのバイオマスからＣＢＭ−融合タンパク質を分離する新規プロセスを提供し、そして出願者の同時係属出願「組換えタンパク質のタンパク質分解性切断および精製」では、プロセス中、高価値の特異的プロテアーゼをリサイクルすることを可能にするプロセス工程を含む。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
発明の詳細な説明
これ以降、本発明をより詳細に記載する。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解され、そして用いられるのと同じ意味を有する。
【００３８】
用語「ポリペプチド」は、本明細書において、単量体または多量体のアミノ酸ポリマーいずれかを指し、そして特定の長さのアミノ酸のポリマーを指すのではない。したがって、例えば、用語、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、および酵素は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語にはまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等の発現後修飾を伴うポリペプチドも含まれる。
【００３９】
用語「目的の異種ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」は、本明細書において、本発明の方法または組成物を用いて、植物細胞または植物組織で発現されることが意図されるポリペプチドいずれかを指す。限定されない例として、本発明にしたがって、薬理学的ポリペプチド（例えば医学的使用のためのもの）または産業ポリペプチド（例えば酵素）を産生することも可能である。
【００４０】
用語「下流プロセシング」は、バイオテクノロジー産物を、意図される使用に適した型に単離し、そして精製することを指す。
用語「融合パートナー」は、本明細書において、ＣＢＭに連結された異種タンパク質を指す。
【００４１】
図５は、実施例４から得た結果を示す。グラフは、対照試料のＥＬＩＳＡ読み取り値、およびＣＢＭ９−２に融合させ、そして本明細書記載の精製プロセスの規模縮小型にしたがって精製した、目的の異種タンパク質（ＨｏｘＢ４）を含有する試料の最小読み取り値を示す。柱は、（ａ）溶出緩衝液、（ｂ）トランスジェニック種子から抽出した融合タンパク質、および（ｃ）非トランスジェニック種子から抽出したタンパク質のＥＬＩＳＡ測定値を示す。
【００４２】
発明の詳細な説明
これ以降、本発明をより詳細に記載する。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解され、そして用いられるのと同じ意味を有する。
【００４３】
用語「ポリペプチド」は、本明細書において、単量体または多量体のアミノ酸ポリマーいずれかを指し、そして特定の長さのアミノ酸のポリマーを指すのではない。したがって、例えば、用語、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、および酵素は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語にはまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等の発現後修飾を伴うポリペプチドも含まれる。
【００４４】
用語「目的の異種ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」は、本明細書において、本発明の方法または組成物を用いて、植物細胞または植物組織で発現されることが意図されるポリペプチドいずれかを指す。限定されない例として、本発明にしたがって、薬理学的ポリペプチド（例えば医学的使用のためのもの）または産業ポリペプチド（例えば酵素）を産生することも可能である。
【００４５】
用語「下流プロセシング」は、バイオテクノロジー産物を、意図される使用に適した型に単離し、そして精製することを指す。
用語「融合パートナー」は、本明細書において、ＣＢＭに連結された異種タンパク質を指す。
【００４６】
用語「ＣＢＭ融合タンパク質」は、異種タンパク質に連結されたＣＢＭからなる分子、そして本発明で提示される背景において、別に記載しない限り、タンパク質分解性切断部位を持たない分子を指す。
【００４７】
用語「機能可能であるように連結された」は、プロモーター（核酸発現調節配列、または整列した転写因子結合部位）および第二の核酸配列間の機能可能な連結を指し、ここでプロモーターは第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００４８】
用語「変性された」は、タンパク質の天然構造、そしてしたがって活性が破壊され、そしてタンパク質がアンフォールディングされるかまたは誤ってフォールディングされて、天然三次元構造が変化した、タンパク質の状態を指す。
【００４９】
用語「発現」および「産生」は、遺伝子産物の生合成を指し、前記遺伝子産物の転写および翻訳が含まれる。
「分子農業」は、野外または閉ざされた施設において、いずれかの種類の植物を用いて、その組織中で異種タンパク質を発現させ、そして産生する作業を指す。
【００５０】
用語「トランスジェニック」は、非天然核酸配列が導入され、そしてしたがってその遺伝子型が改変され、子孫も同様であって、該非天然核酸が存在する、細胞、細胞株、組織植物部分、器官または生物いずれかを指す。典型的には、遺伝子操作プロセスによって、非天然核酸配列を遺伝子型に導入するか、またはこうしたプロセスによって、親細胞または植物の遺伝子型に導入し、そして続いて、有性交配または無性増殖によって、後の世代に伝える。
【００５１】
「実質的配列同一性」は、本発明の背景において、少なくとも５０％の配列同一性、そしてより好ましくは、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％または９９％の配列同一性を示す。配列解析のためのアルゴリズムが当該技術分野に知られ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３−１０に記載されるＢＬＡＳＴなどがある。一般的に、例えば「スコアリング・マトリックス」および「ギャップ・ペナルティ」に関するデフォルト・セッティングを並列に用いる。
【００５２】
用語「形質転換」または「形質転換された」は、宿主細胞への核酸断片の導入に用いた技術とは関わりなく、宿主生物のＤＮＡゲノムへの核酸配列の導入を指す。
「好熱性」は、最適増殖温度が４５℃を超える生物を指す。
【００５３】
用語「ＧＭＰ」（優良医薬品製造基準）は、生物薬剤および他の薬剤、並びに医学的装置が製造される方式を指示する。ＧＭＰ要件には、標準的操作法、無菌条件、材料および装置の検証、並びに訓練された人員が含まれる。
【００５４】
本発明において、遺伝子操作可能な単子葉植物および双子葉植物が使用可能である。好ましくは、植物は単子葉植物であり、より好ましくはオオムギであり、そして最も好ましくはオオムギ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓである。遺伝的に形質転換可能な植物は、コード領域のＤＮＡ配列を含む、非天然ＤＮＡ配列を導入し、発現させ、安定して維持し、そして続く子孫の世代に伝えることが可能な植物である。遺伝子操作および形質転換法を用いて、例えばビアラホスまたはバスタなどを含む除草剤、またはハイグロマイシンなどの抗生物質を選択可能マーカーとして用いる、オオムギ植物が産生されてきている。
【００５５】
方法
限定することを意図しない、以下の実施例を調べると、一般の当業者には、本発明のさらなる目的、利点、および新規特徴が、明らかになるであろう。さらに、上述のような、そして請求項に請求するような本発明の多様な態様および側面各々は、以下の実施例に実験的裏付けを見出す。
【００５６】
本発明の好ましい態様のみを特に例示するが、本発明の精神および意図される範囲から逸脱することなく、上記例に記載するような本発明の多くの修飾および変型が生じることを、当業者は予期するであろう。
【００５７】
精製プロセスの概略図を例示する図１を参照すると、以下のようにプロセスを記載することも可能である：
（１）プロセスの出発材料は、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物由来の材料、またはトランスジェニック植物細胞であり、限定されるわけではないが、植物細胞の懸濁培養物とともに、カルスの未分化細胞も含まれる。材料は、限定されるわけではないが、アグロバクテリウムが仲介する形質転換または微粒子銃が仲介する形質転換または植物ウイルスベクターが仲介する形質転換などの、当業者に知られるプロセスを通じて、植物細胞に導入されている、ＣＢＭオープンリーディングフレームに機能可能であるように連結された異種遺伝子（単数または複数）を、調節された方式で発現するという意味でトランスジェニックである。出発材料は、好ましくは、本発明が記載するプロセスを開始する前に、当業者によってＲＮＡまたはタンパク質レベルの解析によって判断されるように、融合タンパク質が満足できる発現レベルであることに基づいて選択される。
【００５８】
（２）トランスジェニック材料の破壊は、乾燥状態または湿った状態で、植物組織および植物細胞のホモジナイズを生じる、当業者に知られる方法いずれかによって達成される。植物材料の供給源に適したものから、多様な方法を選択することも可能である。したがって、種子に関しては、トランスジェニック植物組織を破壊するには、製粉が優れた方法であり、一方、葉およびより柔らかい緑色組織に関しては、限定されるわけではないが、Ｗａｒｉｎｇブレンダー、Ｓｏｒｖａｌｌ ＯｍｎｉｍｉｘｅｒまたはＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーなどの装置でホモジナイズを達成可能である。植物組織および植物細胞を破壊する装置は、商業的に入手可能であり、そして必要に応じたスケールアップが容易である。植物供給源からの可溶性タンパク質の一般的な抽出法は、Ｓ． Ｒｏｅに監修される刊行物、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， 第２版（２００１）において、Ｇ． Ｐａｕｌ Ｐｏｗｅｌｌに記載される。植物供給源から可溶性タンパク質を抽出する、単純でそして成功する方法は、徹底的に混合しながら、破壊されたホモジナイズ植物組織に、低塩緩衝液などの単純な緩衝液を添加することである。通常、大部分の植物組織からの精製を最適にするのには、精製しようとする異種タンパク質に負の影響を有しうる植物組織由来のフェノール成分を隔離する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）ため、酸化による黒ずみ（ｔａｎｎｉｎｇ）に対する予防措置、例えばポリビニルピロリドンの添加（１％ ｗ／ｖ）が十分である。タンパク質分解は、植物供給源ではいつも問題を引き起こすわけではない。しかし、タンパク質分解が懸念される場合は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼ阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤を、抽出緩衝液に添加することも可能である。緩衝溶液の存在下または非存在下で、植物材料の破壊を行うことも可能である。抽出溶液は、限定されるわけではないが、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を含有することもまたは含有しないことも可能である。可溶性植物タンパク質は、ＣＢＭ−融合タンパク質とともに、液相に存在するであろう。
【００５９】
（３）植物材料と液体の混合は、液相に水溶性融合タンパク質を抽出するために必須である。添加される液体は、ｐＨを調節するため、好ましくは約５．２〜８．３の範囲内に調節するため、緩衝剤を含有することもまたは含有しないことも可能であり、目的のタンパク質に応じて、（２）に記載するような還元剤または隔離剤いずれを含有することもまたはしないことも可能である。最も単純な形では、液体は水であることも可能である。破壊され、そしてホモジナイズされた植物材料を液体と徹底的に混合した後、液相は、ＣＢＭ−融合タンパク質を含有する。
【００６０】
（４）（Ａ）ある程度、ホモジナイズ・レベルに応じて、破壊された植物材料および抽出液の混合物を、吸着流動床（ＥＢＡ）カラムに直接適用することも可能である。このアプローチでは、多糖性のアフィニティー吸着マトリックスの流動床を通る液体の流れとして、混合物をカラムに適用する。カラムを通じた流動中、液相中の融合タンパク質は、多糖マトリックスに曝露され、そして多糖吸着媒体へのＣＢＭの選択的アフィニティーを通じて、選択的に吸着される。限定されるわけではないが細胞壁断片および他の個体などの粒子は、あらゆる可溶性植物タンパク質とともに、フロースルー液中にあり、ＥＢＡカラムから洗い流される（ｆｌｕｓｈｅｄ ａｗａｙ）。
【００６１】
４（Ｂ）あるいは、当業者に知られる多様な方法を通じて、アフィニティー結合工程前に、混合物中の固体物の大部分を液体から分離することも可能であり、これらには、限定されるわけではないが、沈殿、ろ過、遠心分離、および沈降が含まれる。上述のように、固体物を廃棄し、そしてＣＢＭ−融合タンパク質を含有する液体を、場合による加熱工程４（Ｃ）に供するか、またはアフィニティー結合工程（５）に直接適用する。
【００６２】
４（Ｃ）アフィニティー工程（５）の前の混合物または液体の加熱は、場合によるが、全体としてのＣＢＭ−融合タンパク質が上昇した温度で可溶性のままである一方、可溶性植物タンパク質が変性し、そして沈殿することも可能であり、そして内因性植物プロテアーゼが熱で不活性化されうる場合、さらなる精製工程として働くことも可能である。この目的のため、ＣＢＭ−融合タンパク質の性質を考慮に入れた加熱法は、プロセス中、５０〜１００℃の範囲に、２分間〜６０分間の範囲のなどの期間、加熱することを伴うことも可能である。これらの態様において、好熱起源のＣＢＭが特に有益である。
【００６３】
（５）マトリックスへのアフィニティー結合。植物由来ＣＢＭ−融合タンパク質を含有する液体タンパク質抽出物を、ＣＢＭがアフィニティーを有する多糖マトリックスと接触させる。接触は、限定されるわけではないが、多糖マトリックスを伴う充填クロマトグラフィー・カラムなどの多様な方式で達成されることも可能であり、この場合は、多糖マトリックスの密度を指す、充填モードまたは流動（ｅｘｐａｎｄｅｄ）モードいずれかのカラムを通じて液体を流し、あるいはバッチ・モードで達成することも可能であり、この場合は、適切な容器中で多糖マトリックスを液体と混合し、続いてマトリックスおよび吸着したＣＢＭ−融合タンパク質を回収する。多糖マトリックスは、限定されるわけではないが、Ａｖｉｃｅｌなどのセルロース性起源のものであることも可能であるし、または不溶性キシランなどのキシラン性（ｘｙｌａｎｏｉｃ）起源のものであることも可能である。Ｂｏｒａｓｔｏｎら（２００１）による最近の刊行物において、ＣＢＭ９−２の結合特異性および熱力学が詳細に研究されてきている。しかし、驚くべきことに、先行技術で示されていたのとは対照的に、本明細書に記載するような本発明の方法にしたがうと、ＣＢＭ９−２が植物細胞壁構成要素には結合せずに容易に可溶性となる一方、本明細書のアフィニティー吸着工程（５）に用いるような多糖マトリックスに、特異的で優れた結合を保持することが、見出されてきている。上述のように、この驚くべき性質は、植物由来ＣＢＭ−融合タンパク質の下流プロセシングにいくつかの利点を導入し、非常に改善された、下流プロセシング法が提供される。
【００６４】
（６）マトリックスの洗浄。ＣＢＭ−融合タンパク質が結合した多糖アフィニティー吸着剤を、数カラム体積（アフィニティー・マトリックスをクロマトグラフィー・カラムに入れた場合に該当する定量的表現）の水溶液（例えば水）、あるいは限定されるわけではないが、リン酸緩衝生理食塩水またはＴｒｉｓに基づく緩衝液などの緩衝液で洗浄することも可能である。洗浄工程の効率を改善するため、限定されるわけではないが、マトリックスから、弱いが非特異的に結合した混入タンパク質を遊離させるのに用いられる、数カラム体積の塩濃度または界面活性剤の勾配または段階的な変化などの手段によって、洗浄緩衝液の組成を調節することも可能である。
【００６５】
（７）マトリックスからの融合タンパク質の遊離。本明細書に記載するような望ましい結合特性を持つＣＢＭを用いることによって、限定されるわけではないが、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、およびセロビオースなどの競合する糖にＣＢＭ−融合タンパク質を曝露することで、アフィニティー・マトリックスからのＣＢＭ−融合タンパク質の溶出を達成することも可能である。溶出工程のため、これらの糖または他の類似の糖、あるいはその組み合わせいずれかを、適切な量、例えば１ｍＭ〜１Ｍの濃度範囲で、溶出緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水またはＴｒｉｓに基づく緩衝液に添加することも可能である。糖濃度は、例えば２５ｍＭ〜１Ｍの範囲、例えば５０〜５００ｍＭの範囲であることも可能である。これらの糖は、低コストのバルク化学薬品として商業的に入手可能であり、これによって、本発明記載の下流プロセシングの全体の経済性がさらに改善される。
【００６６】
（８）融合タンパク質の単離／精製。いくつかの場合、ＣＢＭ−融合タンパク質のさらなる精製／単離が好適であるかまたは必要とされる可能性もある。限定されるわけではないが、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーなどの当業者に知られる一般的に利用可能なクロマトグラフィー法いずれを用いて、こうしたさらなる単離を達成することも可能である。
【００６７】
（９）最終産物。最終産物は、この場合、非常に精製された型のＣＢＭ−融合タンパク質であり、ＣＢＭ−融合タンパク質の場合によるタンパク質分解性切断の準備ができているか、あるいはいくつかの場合に必要であるかまたは好適である可能性もあるさらなる精製／単離の準備ができている。このさらなる単離は、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程であることも可能である。
【００６８】
非常に精製された型は、必要に応じて、さらなる配合および最終的な型でのパッケージングの準備ができている。
限定することを意図しない、以下の実施例を調べると、一般の当業者には、本発明のさらなる目的、利点、および新規特徴が、明らかになるであろう。さらに、上述のような、そして請求項に請求するような本発明の多様な態様および側面各々は、以下の実施例に実験的裏付けを見出す。
【実施例】
【００６９】
実施例
（実施例１）
バイオマス相互作用研究：ＣＢＭ９−２および製粉オオムギ種子
乾燥オオムギ種子を、細かい粉になるまで、Ｒｅｔｓｃｈ製粉装置中で細かく粉砕した。バイオマス相互作用研究に干渉しうるすべての水溶性構成要素を、試料から取り除く手段として、５ｍｌの低塩緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０２）を用い、種子から水溶性構成要素を抽出するため、製粉した種子１ｇを用いた。混合物をボルテックスし、そして５分間反転させ（ｔｕｍｂｌｅｄ）液体および製粉したオオムギ種子材料が完全に混合されていることを確実にした。この混合に続いて、試料を５０００ｘｇで４分間遠心分離して、固体物をペレットにした。遠心分離後、上清を廃棄した。低塩緩衝液を用いて、この手順を３回繰り返し、各遠心分離後、上清を廃棄した。次いで、高塩緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０２、１Ｍ ＮａＣｌ）を用いて、洗浄手順を３回繰り返し、前と同様、上清を廃棄した。生じた洗浄固体物は、大部分の植物細胞壁断片および不溶性デンプンに相当する。洗浄した固体物を、上述のような低塩緩衝液で３回洗浄して平衡化して、アフィニティー・クロマトグラフィーにおいて、セルロース性マトリックスへのＣＢＭ９−２のアフィニティー結合を支持するのと同じ条件を得た。バイオマス相互作用研究前の固体物の代表的な試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために取り置いた（レーン３）。細菌で産生し、セルロース（Ａｖｉｃｅｌ（商標））−アフィニティー・カラム上で精製したＣＢＭ９−２（Ｏ．Ｄ．＠２８０ｎｍ ０．３９４）１０μｌを、後のＳＤＳ−ＰＡＧＥのために取り置いた（レーン２）。精製されたＣＢＭ９−２は、あらかじめ、タンパク質のセルロース結合アフィニティー特性を回復するように、ＣＢＭ９−２に結合したいかなるグルコースも脱着するための立証された方法として、希釈および限外ろ過モジュール中の濃縮の繰り返し（４ｘ）に供されていた。
【００７０】
精製されたＣＢＭ９−２ ２ｍｌを、製粉オオムギ種子から得た、洗浄し、平衡化した固体物に添加し、そして混合物を振盪しながら室温で６０分間インキュベーションした。インキュベーション後、混合物を５０００ｘｇで１０分間回転して落とし、そして続いて上清を１３，０００ｘｇで５分間遠心分離して清澄にした。バイオマス相互作用由来の清澄化上清１０μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために取り置いた（レーン４）。続いて、製粉オオムギ種子固体物からなるペレットを、上述のように、低塩緩衝液で５回洗浄し、そして高塩緩衝液で５回洗浄した。１０μｌの最初の低塩緩衝液洗浄物（レーン５）および５回目の低塩緩衝液洗浄物（レーン６）を、続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために調製した。製粉オオムギ種子固体物から、結合したいかなるＣＢＭ９−２も溶出させるため、１ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．０２中の１Ｍグルコース）を固体物に添加し、そして１５分間混合しながらインキュベーションし、その後、５０００ｘｇで５分間遠心分離して、そして上清（溶出液）を除去した。溶出液１０μｌの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために調製した（レーン７）。バイオマス相互作用研究および溶出後の固体物由来の代表的な試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために取り置いた（レーン８）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために調製したバイオマス相互作用アッセイ由来の試料を、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌｓ均質１２．５）上で泳動した。泳動完了後、ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、そして脱染色した。結果を図２に例示する。
【００７１】
これらの結果は、ＣＢＭ９−２が植物由来細胞壁断片または製粉オオムギ種子由来の他の不溶性固体物に、有意には結合しないことを示す。
（実施例２）
製粉オオムギ種子抽出物からのＣＢＭ９−２の精製
商業的に入手可能な製粉装置（Ａａｒｓｌｅｖ Ｍａｓｋｉｎｆａｂｒｉｋ， Ｅｒｈｖｅｒｖｓｖａｎｇｅｎ １１， ５７９２ Ａａｒｓｌｅｖ， ＤＫ）を用いて、オオムギ種子を細かく挽いて粉にした。低塩緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０２）中、オオムギ粉：緩衝液がそれぞれ２：３の体積比で、生じたオオムギ粉を湿らせた。液体と粉を容器中で徹底的に混合し、そして４℃で一晩沈降させた。細菌から精製したＣＢＭ９−２をオオムギ種子上清に添加した。翌日、ＣＢＭ９−２を含有するスパイク処理した上清（１００ｍｌ）を、セルロース（Ａｖｉｃｅｌ（商標））を含有するＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）クロマトグラフィー・カラムに装填した。装填適用は、流動床モードで流速１８４ｃｍ／時間で行い、その後、５カラム体積の高塩緩衝液（５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．０２中の１Ｍ ＮａＣｌ）、その後、５カラム体積の低塩緩衝液（５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．０２）の洗浄工程を行った。流動床カラムは、沈降を可能にし（沈降した床の高さ＝２０ｃｍ）、そして９２ｃｍ／時間、溶出緩衝液：５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．０２中の１Ｍグルコース３００ｍｌで溶出を行った。溶出条件は、ＣＢＭ９−２タンパク質を含有する小さいピークを生じた（図３を参照されたい）。
【００７２】
これによって、上に記載する方法を用いると、まず；ＣＢＭ９−２は、溶液中、製粉オオムギ種子由来の細胞壁断片およびあまり明確でない他の固体物には付着しないままであり、次に；本発明に記載するように、多糖アフィニティー・クロマトグラフィーを用いて、製粉オオムギ種子抽出物からＣＢＭ９−２を捕捉することも可能であり；第三に；これは、よく定義された薬剤等級セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）をマトリックスとして使用することによって実行可能であり、そして第四に；アフィニティー・クロマトグラフィー工程は、本発明に記載するような流動床モードで実行可能であり、第五に；オオムギ種子抽出物から精製したＣＢＭ９−２は、本発明に記載するように、いかなる変性工程も回避した穏やかな条件下で、マトリックスから溶出させることも可能であることが示された。本明細書に上述するのとまさに同じ条件および方法を適用して、トランスジェニック製粉種子からＣＢＭ９−２融合タンパク質を精製することも可能である。記載する多糖アフィニティー・クロマトグラフィーは、本発明に記載するように、プロテアーゼ−ＣＢＭを分離し、そしてタンパク質分解性切断反応後、目的のタンパク質からＣＢＭを切除するのにも有効である。
【００７３】
（実施例３）
抽出物中のＣＢＭ９−２の熱安定性および濃縮
１．５グラムの製粉オオムギを、７．５ｍｌの低塩緩衝液（５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．０２）に溶解した。反転装置中で溶液を１時間連続して混合し、そして６０００ｒｐｍで１０分間回転して落とした。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで、タンパク質含量に関して、上清（抽出物）を測定し、そして可溶性種子タンパク質１．９３ｍｇ／ｍｌを含有することを見出した。抽出物３５０μｌを精製ＣＢＭ９−２タンパク質（０．２３８ｍｇ／ｍｌ）３５０μｌと混合し、そしてエッペンドルフ試験管にアリコットし、これを続いて、水槽中で異なる温度（室温、５０℃、６０℃、７０℃および９０℃）に１０分間曝露した。熱処理後、試料を１１，０００ｒｐｍで１０分間回転して落とし、そして異なる熱処理由来の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。熱安定性試験由来の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に調製し、そしてＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌｓ均質１２．５）上で泳動した。泳動完了後、ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、そして脱染色した。結果を図４に例示する。熱に曝露したＣＢＭ９−２に関するさらなる試験を行って、ＣＢＭ９−２がセルロースに結合する能力が、熱への曝露によって、いかなる点でも不都合に影響を受けないことを確認した。
【００７４】
結果は、可溶性オオムギ種子タンパク質が溶液から次第に失われるのに対して、ＣＢＭ９−２は、全温度範囲中、可溶性のままであったことを示す。これは、本発明が記載する精製プロセスの抽出段階中、ＣＢＭおよびＣＢＭ−融合タンパク質を濃縮する目的で、好適に熱を適用可能であることを示す。
【００７５】
（実施例４）
製粉された単一のオオムギ種子抽出物からのＣＢＭ９−２に付着した異種タンパク質の精製
上述の精製法の規模縮小型において、異種タンパク質を発現しているトランスジェニック・オオムギ植物の単一の種子を用いた。室温で３０秒間〜５分間の範囲でインキュベーションした。青色が発色したら、１００μｌの０．２Ｍ硫酸を添加した。色は黄色になり、そしてマイクロプレート読み取り装置中、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７６】
個々のトランスジェニック・オオムギ種子由来の単一種子抽出物のＥＬＩＳＡ解析の結果を図５に示す。
ＣＢＭ９−２に特異的であることがあらかじめ示されたＥＬＩＳＡ解析は、まず；個々の種子中の異種融合タンパク質集積を達成し、そして検証可能であり；上述の方法は、小規模の場合であっても、切断部位を持つ異種融合タンパク質を単離するよう働き、精製プロセスの規模変更が可能であることを裏付け；ＣＢＭ９−２に付着した目的の異種タンパク質が、抽出中、溶液において維持されることに成功し、そしてあまり明確でない植物細胞壁セルロースに結合したために失われることがないことを示し；再生工程を伴わない、特異抗体による溶出後に認識されるように、異種融合タンパク質が、クロマトグラフィー・プロセス中、変性に曝露されないことを示し、上に議論するように、いくつかの他のより厳しいアフィニティー・クロマトグラフィー法よりも本発明が好適であることを強調し；上述の精製法が、ＣＢＭ９−２に付着したいかなる異種融合タンパク質にも適用可能であることを示す。
【００７７】
（実施例５）
ＣＢＭ−プロテアーゼの精製および活性測定
ＣＢＭ９−２タグが付着した部位特異的プロテアーゼを産生するため、以下の方法にしたがった：
構造的プロモーター直後のエンテロキナーゼｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡに付着した、ＣＢＭ９−２に対応するｃＤＮＡ、小胞体（ＥＲ）にターゲティングするシグナル配列、および該タンパク質をＥＲに保持する保持シグナルで構成される発現構築物を所持するバイナリー・プラスミドを含有するように、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＡＧＬ０を構築した。このアグロバクテリウム株を選択条件下、ＹＥＢ培地中で、まず１０ｍｌ中、Ｏ．Ｄ．６００が０．８になるまで２８℃で２日間増殖させた。小規模培養物を、２０μＭアセトシリンゴンを含有する５００ｍｌ培養に１：５０に希釈し、２８℃で２〜３日間、そして激しく振盪しながらＯ．Ｄ．６００ｎｍが２．５になるまで培養した。この細菌を６，０００ｒｐｍで１０分間回転して落とし、そしてＯＤ６００が２．５になるようにＭＳ溶液（５５ｇ／ｌスクロースを含有する）中に再懸濁した。アセトシリンゴン（１０ｍＭ）を最終濃度２００μＭになるように添加した。次いで、細菌懸濁物を室温に１時間維持し、そしてＴｗｅｅｎ−２０（１０％）を最終濃度０．００５％になるように添加した。
【００７８】
レタスにおけるＣＢＭ−プロテアーゼの一過性発現のため、アグロバクテリウム細菌懸濁物を含有するボウル中に植物を１５秒間浸した。
続いて植物を真空チャンバーに入れ、そして０．４バール圧を２０分間適用し、その後、吸気口を開放して、圧を迅速に均一にした。水道水のボウルに連続して浸漬することによって、葉表面の過剰な細菌を洗い落とした。レタス植物を１６時間明期／８時間暗期の光周期、２２℃で、増殖チャンバーに４日間入れた。
【００７９】
葉組織を切り取ることによって植物を採取し、そして続いて凍結させ、そして８６℃に維持した。乳鉢および液体窒素を用いて、非常に細かい粉末が得られるまで、植物をホモジナイズした。低塩抽出緩衝液およびレタス粉末、それぞれ１．２：１（体積：体積）を添加することによって、粉末になったレタス葉材料を抽出し、そして室温で時々混合しながらタンパク質を３０分間抽出した。
【００８０】
続いて抽出物を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、液相から固体物材料および細胞壁断片を分離した。上清をデカントし、そして先に記載するように再び回転した。透明な上清を、上述のようなセルロース性マトリックス（Ａｖｉｃｅｌ（商標））を含有する充填床カラムに装填した。ＣＢＭ−プロテアーゼはセルロース性マトリックスに特異的に付着し、そしてそれぞれ５カラム体積の高塩および低塩洗浄緩衝液で洗浄した後、穏やかな非変性条件下で、すなわち１Ｍグルコース溶液を用いて、単一ピークとして、ＣＢＭ−プロテアーゼをカラムから溶出させた。
【００８１】
続いて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮装置（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５−Ｂｉｏｍａｘ−５）を用いて、ピークを濃縮した。
標準的アプローチ（Ｇｒａｎｔ＆ Ｈｅｒｍｏｎ−Ｔａｙｌｏｒ、１９７９）にしたがい、特異的合成基質を用いてエンテロキナーゼ活性をアッセイする：合成基質：Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−β−ナフチルアミド（ＧＤ４Ｋ−ｎａ）；アッセイ条件３７℃。反応体積は１．５ｍｌである。反応混合物は：２５μｌの１０ｍＭ ＧＤ４Ｋ−ｎａ（０．５ｍＭ）、１２５μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４（２５ｍＭ）、５０μｌの１００％ ＤＭＳＯ（１０％）、５０μｌの１００ｍＭ ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）、（２０〜１００）μｌエンテロキナーゼ、２５０μｌ蒸留水―（２０〜１００）μｌからなる。λｅｘ＝３３７ｎｍおよびλｅｍ＝４２０ｎｍ間の蛍光の増分からβ−ナフチルアミン形成速度を決定した。これを５分間連続して監視した。
【００８２】
活性測定の結果、記載するように産生し、そして精製したＣＢＭ−エンテロキナーゼが活性であることが示され；エンテロキナーゼ活性は、ブランクの０．０００１ｃｐｓ／分／μｇに比較して、４４２．７ｃｐｓ／分／μｇと測定された。
【００８３】
本実施例はまず；プロテアーゼ−ＣＢＭを植物において産生可能であり、この場合はレタス中で一過性に産生可能であり、そして上述の精製法を用いて、ＣＢＭ−プロテアーゼを成功裡に単離し、そして精製することが可能であることを示す。さらに、本実施例は、融合タンパク質のＣＢＭ９−２アフィニティー・タグが完全に機能し；ＣＢＭ−プロテアーゼがセルロース性マトリックスに有効に付着し、そして本発明が記載する穏やかな溶出条件下で、マトリックスから溶出可能であることを示し、そして溶出したプロテアーゼが完全に活性であることを示す。酵素活性は、部分的変性または完全な変性に特に感受性であり、こうした変性は容易に活性損失を生じるため、酵素的に活性である精製産物は、それ自体、その精製法が非変性特性を持つ証拠を提供する。これは、本発明の構成要素が、すべて機能し、そしてその振る舞いおよび性能が、上述の本発明が記載するような方式で、容易に適用可能であり、供給源いずれかの異種タンパク質の下流プロセシングの特異性、経済性および効率の大きな改善を構成するプロセスを生じるようなものであることを示す。
【００８４】
参考文献
【００８５】
【化１】
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、精製プロセスの好ましい態様の概略図である。
【図２】図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析による、実施例１から得た結果を示す。レーン１：分子量サイズマーカー、レーン２：精製ＣＢＭ９−２、レーン３：製粉したオオムギ種子由来の洗浄した固体物、レーン４：バイオマス相互作用後の上清、レーン５：低塩緩衝液での最初の洗浄液、レーン６：高塩緩衝液での５回目の洗浄液。
【図３】図３は、実施例２に詳細に記載するような、本発明の方法にしたがった、製粉オオムギ種子抽出物からのＣＢＭ９−２の精製の成功を示す。この図は、２００ｍｌセルロースを用いた、吸着流動床（ＥＢＡ）カラムのクロマトグラフィー・プロフィールを示す。
【図４】図４は、実施例３から得た結果、抽出物中のＣＢＭ９−２の熱安定性および濃縮を示す。この図は、異なる温度に供したオオムギ抽出物中のＣＢＭ９−２の熱安定性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１：１０〜２００ｋＤａの分子量サイズマーカー、レーン２：室温（ＲＴ）のオオムギ種子抽出物、レーン３：精製ＣＢＭ９−２（ＲＴ）、レーン４：ＣＢＭ９−２＋オオムギ種子抽出物（５０℃）、レーン５：ＣＢＭ９−２＋オオムギ種子抽出物（６０℃）、レーン６：ＣＢＭ９−２＋オオムギ種子抽出物（７０℃）、レーン７：ＣＢＭ９−２＋オオムギ種子抽出物（９０℃）。
【図５】図５は、実施例４から得た結果を示す。グラフは、対照試料のＥＬＩＳＡ読み取り値、およびＣＢＭ９−２に融合させ、そして本明細書記載の精製プロセスの規模縮小型にしたがって精製した、目的の異種タンパク質（ＨｏｘＢ４）を含有する試料の最小読み取り値を示す。柱は、（ａ）溶出緩衝液、（ｂ）トランスジェニック種子から抽出した融合タンパク質、および（ｃ）非トランスジェニック種子から抽出したタンパク質のＥＬＩＳＡ測定値を示す。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は生化学およびタンパク質技術の分野にあり、そしてトランスジェニック植物材料からの異種タンパク質の単離および精製の改善法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
タンパク質に基づく生物薬剤は、深刻な疾患に対する、より特異的で、そして組織特異的であるか、または細胞特異的な薬剤治療を提供するのに、きわめて有望である（概説に関しては、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇｓ” Ｐ． Ｂｕｃｋｅｌ監修 ２００１を参照されたい）。
【０００３】
先行技術および適用の多くの例によって、こうした生物薬剤の産生のための細菌などの微生物、および動物細胞の使用が示されてきており、このうちインスリンが注目すべき例である。
【０００４】
文献中の多くの例によって、高価値の異種ポリペプチドまたは生物薬剤を発現し、そして製造するためのトランスジェニック植物または植物細胞培養物の利用が示されてきている。こうした植物に基づく製造プロセスを、分子農業と呼ぶことも可能である。
【０００５】
産生生物として植物を使用することによって、価値あるタンパク質の産生を、より経済的にすることも可能である。タンパク質製造の宿主生物として用いる植物の栽培コストは、原核生物産生系、動物細胞培養などのバイオリアクターに基づく、大部分の産生系に比較して、かなり低くなることも可能である。しかし、上記産生系のすべてに関して、異種タンパク質の精製は、依然として要求が厳しく、そして費用がかかる課題である。したがって、植物に基づく産生系に関しては、下流プロセシングが、高価値の異種タンパク質を産生する際の産生コストの大部分を生じる。
【０００６】
タンパク質精製および単離は、遺伝子技術の使用によって、多様な宿主生物中で集積し、そして産生されたタンパク質の下流プロセシングの重要なプロセスである。宿主生物からのタンパク質の精製は、非常に困難で、複雑であり、そして高価である可能性もある。産生宿主生物からの目的のタンパク質の分離および精製のため、商業的には、多様なクロマトグラフィー戦略が用いられる。クロマトグラフィー戦略は、混入または内因性タンパク質および目的の異種タンパク質間の、大きさ、可溶性、電荷、疎水性、およびアフィニティーなどの物理化学的相違に頼ることも可能である。
【０００７】
多数の工程からなるクロマトグラフィー戦略の組み合わせは、いくつかの高価なクロマトグラフィー・マトリックス、およびカラム、制御装置などからなる必要なハードウェアを必要とし、そして各工程で産物収量の損失が付随し、そしてその結果、経済的損失が生じる。関与するクロマトグラフィー工程に加えて、下流プロセシングは、典型的には、多数のろ過工程および遠心分離工程を伴う。その結果、精製および下流プロセシングのコストのため、タンパク質に基づくバイオテクノロジー製品の精製は手が届かないほど高額になりうる。産業タンパク質などの、より価値が低い、タンパク質に基づくいくつかの製品に関しては、下流プロセシングのコストのため、使用およびマーケティングが抑制される可能性もあり、未精製でそしてあまり明確でない製品を生じる可能性もある。ほとんどのバイオテクノロジー製品に関しては、明らかに、精製コストが、製造コストの大きな割合を占める。
【０００８】
混入物質からの目的のタンパク質の分離を達成する特殊化クロマトグラフィー・マトリックスのコストは、その産生に伴う複雑なカップリング化学反応の結果、高い。いくつかの一般的なクロマトグラフィー法は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーである。マトリックスにカップリングされたリガンドには、多様な強度の陰イオン交換体としての多様なジエチルアミノエチル基または第四アミノエチル基、並びに陽イオン交換体としてのカルボキシメチル置換基およびスルホネート基およびホスフェート（Ｓｃｏｐｅｓ、１９９３）、疎水性相互作用クロマトグラフィー用の架橋アガロース・マトリックスにカップリングした疎水性アルキル基、フェニル基またはブチル基（疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ） 番号１８−１０２０−９０、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、あるいはシリカまたは合成有機ポリマーで構成される多孔不溶性ビーズ化マトリックスに移植されたリガンドとしての疎水性ｎ−アルキル基（逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、コード番号１８−１１１３４−１６、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が含まれることも可能である。これらのマトリックスは化学的に複雑であるため、精製法中に、マトリックスからのリガンドおよび他の物質の望ましくない浸出が引き起こされる可能性もあり、この場合は、予防手段、監視、または目的のタンパク質からの浸出物の除去が必要となり、すでに高価な下流プロセシングのコストがさらに上がることになる。
【０００９】
アフィニティー・クロマトグラフィーは、剤および特異的リガンド間の特異的アフィニティーに基づき、しばしば天然タンパク質−リガンド相互作用を模倣しているため、最も強力な精製原理のうちの１つである。いくつかの異なる種類のアフィニティー吸着剤が利用可能であり、あるものは特定のタンパク質に非常に特異的であり、他のものは特定のタンパク質よりもタンパク質種に結合する。多くの場合、アフィニティー・クロマトグラフィーは、そのリガンドに結合するタンパク質を特異的に選び出す吸着剤に対する、固定化されたリガンドの使用を意味する。アフィニティー吸着剤へのリガンドのカップリングは、吸着剤の臭化シアン活性化、トシル活性化、またはビニルスルホン活性化などのカップリング化学反応の使用を伴う。カラムマトリックスにカップリングしたリガンドは、タンパク質性起源のものであることもまたはないことも可能である。前者の例は、限定されるわけではないが、？−グロブリンへのアフィニティーを有し、したがって抗体の精製に有用な固定化プロテインＡまたはプロテインＧ、および糖タンパク質に対するアフィニティーを持つレクチンである。後者の例として、マトリックスにカップリングした固定化グルタチオンは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ・ドメインを含有する融合タンパク質に結合する。固定化金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、マトリックスへの金属キレートリガンドの固定に基づき、そしてカラム上に固定された金属イオンおよびタンパク質上の塩基性基、主にヒスチジン残基の間の弱い配位結合の形成に頼る。商業的なクローニングベクターは、一連のヒスチジン残基、Ｈｉｓ−タグとイン・フレームで、ｃＤＮＡのクローニングを提供し、このタグが、ＩＭＡＣを用いて、生じた融合タンパク質を精製するのを可能にする。ＩＭＡＣはタンパク質の小規模精製に広く用いられているが、混入タンパク質中の天然ヒスチジン残基がＩＭＡＣにおいて結合を生じる可能性もあるため、ＩＭＡＣは非特異的だが選択的な方法である（Ｓｃｏｐｅｓ １９９３）。融合タンパク質を生じる、商業的発現ベクターにおいて、いくつかの異なる種類のタグまたは結合ドメインが利用可能であり、この場合、タグ／結合ドメインが、カラムマトリックス上にカップリングしたリガンドに、融合タンパク質を結合させる。
【００１０】
これらのマトリックス−リガンド系を用いて、高特異性のタンパク質結合を達成することも可能である。上述の場合は、複雑なカップリング化学反応を伴って、不活性マトリックス上にリガンドを固定する。その結果、アフィニティー・マトリックスのコストのため、しばしば、この強力な技術の産業規模の適用が抑制されることもありうる。さらに、クロマトグラフィー法の大部分の他の種類でのように、マトリックスへのリガンドのカップリングの安定性が問題になり、そして浸出が非常に懸念される。ＩＭＡＣにおける重金属浸出は、細心の注意を払うべき生物活性タンパク質の多くの精製プロセスにおいて、許容し得ない、そして深刻な混入を生じる可能性もあり、そして精製中のタンパク質を不活性にする可能性もある（Ｓｃｏｐｅｓ、１９９３）。
【００１１】
リガンドへのタンパク質の結合アフィニティーが非常に強いため、溶出条件には、リガンド−タンパク質結合を破壊するために、精製中の価値あるタンパク質を部分的に変性させる、劇的な条件が必要である場合が珍しくないことは、本発明に特に関連する。この限定されない例は、プロテインＡ−アフィニティー・マトリックスからの抗体の溶出であり、これは、カラムから抗体が遊離するのに、低いｐＨでの変性を必要とする。精製されるタンパク質活性を喪失させるリスクがあり、タンパク質を再フォールディングするために過剰な工程が加えられ、そして続いて、再フォールディングしたタンパク質産物に活性解析が必要であり、そしてコストがさらに加算されることを伴うため、タンパク質精製プロセスに変性工程を含むのは望ましくない。
【００１２】
植物からの大規模精製にアフィニティーに基づくクロマトグラフィーを使用するのを可能にするため、商業的に入手可能な現在の手段より単純で、そしてより経済的であり、関与するカップリング化学反応がより少なく、そして製薬産業標準の品質必要条件に適合する、非変性タンパク質精製プロセスを開発することが非常に望ましい。
【００１３】
植物に基づくタンパク質産生は、文献の例に示されてきているように、経済的な方式で、大規模にタンパク質を製造するのにきわめて有望である（概説にはＨａｍｍｏｎｄ １９９９を参照されたい）。植物を用いた分子農業に伴う栽培コストは、伝統的なバイオリアクターに基づく方法よりもかなり安価である。植物に基づく産生の上流事象は、特に有望であるようだが、下流プロセシングは、その他のタンパク質産生産業と同じ困難に直面している。
【００１４】
多糖および多糖結合タンパク質は、アフィニティー・クロマトグラフィー工程の設計と組み合わせて使用可能である（例えばＢｏｒａｓｔｏｎら、２００１を参照されたい）。
先行技術の例（米国特許第６，３３１，４１６号）では、Ｓｈａｎｉらは、宿主植物細胞壁のあまり明確でないセルロースに結合する多糖結合ドメインを持つ組換えタンパク質を発現する方法、および宿主植物セルロースへのこのタンパク質のアフィニティーを利用して、可溶性混入タンパク質から分離可能な細胞壁−タンパク質複合体を生じる、タンパク質精製プロセスを記載する。結合強度は、セルロース性植物物質からタンパク質を遊離させるのに、タンパク質を変性させ、精製中の組換えタンパク質の活性に負の影響を有する劇的な条件が必要でありうる程度である可能性もある。したがって、植物材料からタンパク質を精製する方法を提示したものの、リガンド／細胞壁結合を破壊するのに厳しい条件が必要であり、これには抗体−プロテインＡ溶出に関して上述したものに匹敵する厄介な問題および懸念が伴う。
【００１５】
植物からの大規模精製のために、アフィニティーに基づくクロマトグラフィーを使用するのを可能にするため、商業的に入手可能な現在の手段より単純で、そしてより経済的であり、関与するカップリング化学反応がより少なく、そして製薬産業標準の品質必要条件に適合する、非変性タンパク質精製プロセスを開発することが非常に望ましい。
【００１６】
炭水化物結合ドメインＣＢＭ９−２は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）キシラナーゼ１０Ａ由来である（Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒら １９９５：Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５（３）， ４３１−４４４）。ＣＢＭ９−２ゲノムＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｚ４６２６４として入手可能であり、そしてＣＢＭのファミリーＩＸに属し、そして溶出剤として１Ｍグルコースを用いた非変性溶出条件、および非結晶セルロースとともに結晶セルロースに対する非常に特異的なアフィニティーを含めて、高分解能アフィニティー精製に魅力的ないくつかの特性を有する（Ｂｏｒａｓｔｏｎら ２００１：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０， ６２４０−６２４７）。
【００１７】
トランスジェニック植物からの発現組換えタンパク質の回収および精製は、おそらく、タンパク質産生のための現実的な代替系として植物を確立する際に、最も重要な要因であろう。プロセシング工程の数を最小限にし、そして各工程をはるかに効率的に行うことが必須である（Ｍｏｌｏｎｅｙ ２０００）。
【００１８】
このことから、トランスジェニック植物材料から異種タンパク質を、効率的に、単純に、そして経済的に精製するための下流プロセスに関する、認識されている必要性が強まる。さらに、目的のタンパク質の生物活性を安定させ、そして収量を改善するため、穏やかで、目的のタンパク質を変性させない条件からなる下流プロセス（特に穏やかな溶出条件を持つ特異的アフィニティー精製法）の必要性がある。
【００１９】
上に詳述する限界を持たない非変性タンパク質精製プロセスは、植物からの生物薬剤の産生に伴う産生コストを有意に低下させることも可能であり、そしてその下流プロセシングが、これまでは手が届かないくらい複雑で高価であった、価値ある異種タンパク質の精製を可能にするであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
発明の概要および目的
本発明の主な目的は、植物、植物由来組織または植物細胞で産生された高価値の異種タンパク質のタンパク質精製のための、改善された非変性法を提供することである。
【００２１】
本発明は、植物で産生された異種タンパク質の下流プロセシングのコストを減少させ、そしてその品質を改善することを目的とする。
精製プロセスの重要な工程は、細胞壁断片由来のＣＢＭ融合タンパク質としての目的のタンパク質およびあまり明確でない他の植物由来固体物の分離であり、これは本発明のＣＢＭ−融合タンパク質がこれらの構成要素に結合しないためである。この工程は、アフィニティー・クロマトグラフィー工程の前に別個に行うことも可能であるし、またアフィニティー・クロマトグラフィー工程と同時に行うことも可能である。
【００２２】
第一の側面において、本発明は、セルロース結合性モジュール（ＣＢＭ）を含む可溶性異種融合タンパク質を発現しているトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞から、前記融合タンパク質を産生し、そして精製する、非変性法を提供し、該方法は：
トランスジェニック植物材料を破壊し；
前記の破壊した植物材料から可溶性融合タンパク質を液相に抽出してタンパク質抽出物を得るために、植物材料に抽出液を添加し、それによって可溶性植物材料および不溶性植物材料の混合物を生成し；
細胞壁材料および固体物を含む不溶性植物材料を、目的の前記融合タンパク質を含む前記タンパク質抽出物から分離し；
前記タンパク質抽出物を、前記融合タンパク質に結合する多糖マトリックスに接触させ；
結合した融合タンパク質を伴うマトリックスを、１以上の適切な水溶液、例えば１以上の緩衝溶液で洗浄し、すなわち洗浄は、勾配を用いて１つの工程で行うことも、または一連の異なる洗浄溶液として行うことも可能である；そして
特徴的に穏やかな条件下で、マトリックスからの前記融合タンパク質の遊離を達成する条件を調節することによって、前記多糖マトリックスから融合タンパク質を溶出する
ことを含む。
【００２３】
典型的には、トランスジェニック植物または植物細胞は、双子葉植物および単子葉植物の群より選択され、そして好ましい態様において、前記植物細胞またはトランスジェニック植物は、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、ナタネ（ｒａｐｅ ｓｅｅｄ）、ダイズ（ｓｏｙ ｂｅａｎ）、レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ）、アルファルファ（ａｌｆａｌｆａ）、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、コムギ（ｗｈｅａｔ）、カラスムギ（ｏａｔ）およびイネ（ｒｉｃｅ）の群より選択される。
【００２４】
いくつかの態様において、分離工程は、吸着流動床（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＥＢＡ）、充填モード・クロマトグラフィー、沈殿、ろ過、遠心分離、またはその組み合わせのいずれかから選択される方法を含む。
【００２５】
多糖マトリックスへの融合タンパク質のアフィニティー結合工程は、好ましくは、クロマトグラフィー工程を含む。
しかし、特定の有用な態様において、目的のタンパク質であるＣＢＭ−融合タンパク質からの細胞壁断片およびあまり明確でない他の植物由来固体物の前記分離、並びに多糖マトリックスへの該ＣＢＭ融合タンパク質のアフィニティー結合は、適切で安価な多糖マトリックスを伴う吸着流動床クロマトグラフィー（ＥＢＡ）を用いた、単一の強力な精製工程で行うことも可能である。この特徴は、下流プロセシングを経済的に合理化し、そして改善する。
【００２６】
本発明の好適な態様において、多糖マトリックスはセルロースを含み、そして好ましくは、薬学的に適合するセルロースを含む。ＣＢＭ−融合タンパク質が結合するセルロース性マトリックスが、こうしたよく定義された薬剤等級のものであると、精製された異種タンパク質の多様な高品質の使用が可能になる。多糖マトリックスとして使用するのに有用な薬学的に適合するセルロース材料はＡｖｉｃｅｌ（商標）（ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ペンシルバニア州）を含む。
【００２７】
本発明記載のアフィニティー・クロマトグラフィーに用いる多糖マトリックスは、複雑なカップリング化学反応も、また浸出する可能性があるリガンドの固定も必要としない。多糖マトリックスは、構造的支持および剛性の両方を提供し、一方でアフィニティー吸着剤自体を構成する。それによって、植物由来異種タンパク質の、より経済的でそしてより安全なタンパク質精製が可能になる。
【００２８】
記載するプロセスが、例えば農業、化学産業または製薬産業において、すべて、精製異種タンパク質の異なる最終用途にしたがう、異なる品質の異なる多糖マトリックスに受け入れられることが、本発明のさらなる利点である。薬剤等級の多糖から作成されるアフィニティー吸着剤は、製薬産業内のバルク材料（ｂｕｌｋ ｍａｔｅｒｉａｌ）であり、そして商業的に入手可能ないかなるアフィニティー・クロマトグラフィー媒体よりかなり安価である。したがって、本発明に記載するプロセスを用いて、非常に高品質のアフィニティー・マトリックスを経済的に作成することも可能であり、植物由来材料から、高価値のタンパク質をより経済的に下流プロセシングすることが可能になる。
【００２９】
本発明のさらなる利点は、植物由来のＣＢＭ−融合タンパク質が多糖クロマトグラフィー・マトリックスにひとたび結合し、そしてマトリックスを洗浄して、いかなる混入内因性植物タンパク質も取り除いたならば、典型的には、ＣＢＭに付着したいかなる融合パートナータンパク質の活性および構造も保護する、中性条件または酸性条件下、そして好ましくは可溶性炭水化物（糖）の添加を伴う、非変性の穏やかな条件を用いて、カラムから融合タンパク質を溶出させることも可能であることである。糖は、ＣＢＭの結合部位に関して、セルロースと競合し、そして適切な濃度で、結合したＣＢＭ融合タンパク質すべてを実質的に遊離させるであろう。
【００３０】
本発明の方法に用いられ、そして目的の異種タンパク質に融合される、好ましいＣＢＭは、適切な多糖マトリックスに十分に強く結合して、高収量の結合したＣＢＭ融合タンパク質を得て、そして上記のような穏やかな条件によって遊離することを可能にする、望ましい結合特性を有するものであるということになる。ＣＢＭ９−２は、これらの望ましい特性を有することが見出されている。こうした特性を持つ他のＣＢＭの使用もまた、本発明の範囲内である。例えば、望ましい特性を有するＣＢＭをコードする配列、例えば結合特性に重要なＣＢＭ９−２中のモチーフに類似であることが見出された配列モチーフに関して、入手可能な遺伝子データベースを検索することによって、こうしたＣＢＭを見出すことも可能である。また、本発明にしたがう適切なＣＢＭを得るため、当該技術分野に周知の点突然変異技術を用いて、存在するＣＢＭを修飾して、その結合特性を修飾することも可能である。
【００３１】
多糖アフィニティー・マトリックスから融合タンパク質が溶出されたら、タンパク質の望ましい型および使用に応じて、場合によって１以上のさらなる精製工程または単離工程に供することも可能である。
【００３２】
有用な態様において、トランスジェニック植物または植物細胞は、ＣＢＭをコードする核酸配列を含み、好ましくは、ＣＢＭは熱安定性であり、そして上昇した温度で可溶性のままである。この文脈において、用語、熱安定性は、タンパク質が、上昇した温度、すなわち約２５℃より高い温度、そして典型的には約３７℃より高い温度、４０℃〜１００℃の範囲を含む温度で、可溶性であり、正しくフォールディングされ、そして活性であり続けることを示す。
【００３３】
こうした好ましいＣＢＭをコードする遺伝子を、好熱性細菌、藻類および真菌を含む、好熱性生物から得ることも可能であり、そして前記ＣＢＭを含む融合タンパク質を発現するような方式で、宿主植物または植物細胞に導入することも可能である。用語、好熱性は、本明細書において、４０℃を超える温度で最適に増殖する生物を指す。好ましいＣＢＭは、サーモトガ・マリティマ由来のキシラナーゼ１０Ａ遺伝子にコードされ、好ましくは、ＣＢＭをコードする宿主植物または植物細胞内の領域は、前記遺伝子の領域である。特定の態様において、ＣＢＭをコードする前記領域は、配列番号１として示す配列を含むか、あるいは同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または前記アミノ酸配列と実質的な配列同一性を持つアミノ酸配列をコードする配列を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの態様において、プロセス中、可溶性融合タンパク質を含むタンパク質抽出物を３７℃〜１００℃の範囲の温度に、例えば５０〜８０℃の範囲の温度に、１分間〜１２０分間の範囲などの期間、加熱することが有用である可能性もある。この目的のため、好熱性供給源由来などの熱安定性ＣＢＭが特に有用である。いくつかの有用な態様において、熱安定性ＣＢＭは、上昇した温度で、付着した異種タンパク質の溶解度を促進することも可能であり、この特徴を用いて、他の熱不安定性植物タンパク質を含有する抽出物をＣＢＭ−融合タンパク質に関して濃縮することも可能である。こうした加熱の間、内因性植物タンパク質の一部が不活性化され、そして／または変性される可能性もあり、そしてしたがって、タンパク質抽出物からこれらを容易に分離することも可能である。好ましくは、固体物の分離、および加熱した抽出物からの前記ＣＢＭ融合タンパク質のアフィニティー結合を同時に行うための、多糖マトリックスを伴う吸着流動床を含むプロセス工程に、前記の加熱した抽出物を供することも可能である。
【００３５】
本発明の非常に有用な態様において、前記融合タンパク質は、タンパク質分解性切断部位、好ましくは特異的プロテアーゼに認識され、そして切断される、タンパク質分解性切断部位を含む一連のアミノ酸に遮断される、ＣＢＭおよび目的の異種ポリペプチドを含む。こうした切断部位を有することによって、融合タンパク質中の融合パートナーをＣＢＭから容易に切り落として、ＣＢＭを伴わない、望ましい精製異種タンパク質を得ることも可能である。特異的プロテアーゼを伴う、こうした精製の成功を、本出願者の同時係属出願「組換えタンパク質のタンパク質分解性切断および精製」に開示し、該出願は、本出願と同時に出願され、そして本明細書に完全に援用される。
【００３６】
本発明は、限定されるわけではないが、農業、化学産業およびタンパク質に基づく薬剤製造などの目的のため、大規模な異種タンパク質産生に伴う下流プロセシングの欠点に取り組んで成功している。特に、本発明は、伴うプロセシング工程がより少なく、製薬産業内での使用に受け入れられる、より安全でそしてより経済的なアフィニティー・クロマトグラフィー原理、高価値の異種タンパク質の活性を維持する穏やかな溶出条件をうまく利用した植物由来セルロース性材料などのバイオマスからＣＢＭ−融合タンパク質を分離する新規プロセスを提供し、そして出願者の同時係属出願「組換えタンパク質のタンパク質分解性切断および精製」では、プロセス中、高価値の特異的プロテアーゼをリサイクルすることを可能にするプロセス工程を含む。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
発明の詳細な説明
これ以降、本発明をより詳細に記載する。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解され、そして用いられるのと同じ意味を有する。
【００３８】
用語「ポリペプチド」は、本明細書において、単量体または多量体のアミノ酸ポリマーいずれかを指し、そして特定の長さのアミノ酸のポリマーを指すのではない。したがって、例えば、用語、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、および酵素は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語にはまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等の発現後修飾を伴うポリペプチドも含まれる。
【００３９】
用語「目的の異種ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」は、本明細書において、本発明の方法または組成物を用いて、植物細胞または植物組織で発現されることが意図されるポリペプチドいずれかを指す。限定されない例として、本発明にしたがって、薬理学的ポリペプチド（例えば医学的使用のためのもの）または産業ポリペプチド（例えば酵素）を産生することも可能である。
【００４０】
用語「下流プロセシング」は、バイオテクノロジー産物を、意図される使用に適した型に単離し、そして精製することを指す。
用語「融合パートナー」は、本明細書において、ＣＢＭに連結された異種タンパク質を指す。
【００４１】
図５は、実施例４から得た結果を示す。グラフは、対照試料のＥＬＩＳＡ読み取り値、およびＣＢＭ９−２に融合させ、そして本明細書記載の精製プロセスの規模縮小型にしたがって精製した、目的の異種タンパク質（ＨｏｘＢ４）を含有する試料の最小読み取り値を示す。柱は、（ａ）溶出緩衝液、（ｂ）トランスジェニック種子から抽出した融合タンパク質、および（ｃ）非トランスジェニック種子から抽出したタンパク質のＥＬＩＳＡ測定値を示す。
【００４２】
発明の詳細な説明
これ以降、本発明をより詳細に記載する。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解され、そして用いられるのと同じ意味を有する。
【００４３】
用語「ポリペプチド」は、本明細書において、単量体または多量体のアミノ酸ポリマーいずれかを指し、そして特定の長さのアミノ酸のポリマーを指すのではない。したがって、例えば、用語、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、および酵素は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語にはまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等の発現後修飾を伴うポリペプチドも含まれる。
【００４４】
用語「目的の異種ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」は、本明細書において、本発明の方法または組成物を用いて、植物細胞または植物組織で発現されることが意図されるポリペプチドいずれかを指す。限定されない例として、本発明にしたがって、薬理学的ポリペプチド（例えば医学的使用のためのもの）または産業ポリペプチド（例えば酵素）を産生することも可能である。
【００４５】
用語「下流プロセシング」は、バイオテクノロジー産物を、意図される使用に適した型に単離し、そして精製することを指す。
用語「融合パートナー」は、本明細書において、ＣＢＭに連結された異種タンパク質を指す。
【００４６】
用語「ＣＢＭ融合タンパク質」は、異種タンパク質に連結されたＣＢＭからなる分子、そして本発明で提示される背景において、別に記載しない限り、タンパク質分解性切断部位を持たない分子を指す。
【００４７】
用語「機能可能であるように連結された」は、プロモーター（核酸発現調節配列、または整列した転写因子結合部位）および第二の核酸配列間の機能可能な連結を指し、ここでプロモーターは第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００４８】
用語「変性された」は、タンパク質の天然構造、そしてしたがって活性が破壊され、そしてタンパク質がアンフォールディングされるかまたは誤ってフォールディングされて、天然三次元構造が変化した、タンパク質の状態を指す。
【００４９】
用語「発現」および「産生」は、遺伝子産物の生合成を指し、前記遺伝子産物の転写および翻訳が含まれる。
「分子農業」は、野外または閉ざされた施設において、いずれかの種類の植物を用いて、その組織中で異種タンパク質を発現させ、そして産生する作業を指す。
【００５０】
用語「トランスジェニック」は、非天然核酸配列が導入され、そしてしたがってその遺伝子型が改変され、子孫も同様であって、該非天然核酸が存在する、細胞、細胞株、組織植物部分、器官または生物いずれかを指す。典型的には、遺伝子操作プロセスによって、非天然核酸配列を遺伝子型に導入するか、またはこうしたプロセスによって、親細胞または植物の遺伝子型に導入し、そして続いて、有性交配または無性増殖によって、後の世代に伝える。
【００５１】
「実質的配列同一性」は、本発明の背景において、少なくとも５０％の配列同一性、そしてより好ましくは、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９５％または９９％の配列同一性を示す。配列解析のためのアルゴリズムが当該技術分野に知られ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３−１０に記載されるＢＬＡＳＴなどがある。一般的に、例えば「スコアリング・マトリックス」および「ギャップ・ペナルティ」に関するデフォルト・セッティングを並列に用いる。
【００５２】
用語「形質転換」または「形質転換された」は、宿主細胞への核酸断片の導入に用いた技術とは関わりなく、宿主生物のＤＮＡゲノムへの核酸配列の導入を指す。
「好熱性」は、最適増殖温度が４５℃を超える生物を指す。
【００５３】
用語「ＧＭＰ」（優良医薬品製造基準）は、生物薬剤および他の薬剤、並びに医学的装置が製造される方式を指示する。ＧＭＰ要件には、標準的操作法、無菌条件、材料および装置の検証、並びに訓練された人員が含まれる。
【００５４】
本発明において、遺伝子操作可能な単子葉植物および双子葉植物が使用可能である。好ましくは、植物は単子葉植物であり、より好ましくはオオムギであり、そして最も好ましくはオオムギ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓである。遺伝的に形質転換可能な植物は、コード領域のＤＮＡ配列を含む、非天然ＤＮＡ配列を導入し、発現させ、安定して維持し、そして続く子孫の世代に伝えることが可能な植物である。遺伝子操作および形質転換法を用いて、例えばビアラホスまたはバスタなどを含む除草剤、またはハイグロマイシンなどの抗生物質を選択可能マーカーとして用いる、オオムギ植物が産生されてきている。
【００５５】
方法
限定することを意図しない、以下の実施例を調べると、一般の当業者には、本発明のさらなる目的、利点、および新規特徴が、明らかになるであろう。さらに、上述のような、そして請求項に請求するような本発明の多様な態様および側面各々は、以下の実施例に実験的裏付けを見出す。
【００５６】
本発明の好ましい態様のみを特に例示するが、本発明の精神および意図される範囲から逸脱することなく、上記例に記載するような本発明の多くの修飾および変型が生じることを、当業者は予期するであろう。
【００５７】
精製プロセスの概略図を例示する図１を参照すると、以下のようにプロセスを記載することも可能である：
（１）プロセスの出発材料は、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物由来の材料、またはトランスジェニック植物細胞であり、限定されるわけではないが、植物細胞の懸濁培養物とともに、カルスの未分化細胞も含まれる。材料は、限定されるわけではないが、アグロバクテリウムが仲介する形質転換または微粒子銃が仲介する形質転換または植物ウイルスベクターが仲介する形質転換などの、当業者に知られるプロセスを通じて、植物細胞に導入されている、ＣＢＭオープンリーディングフレームに機能可能であるように連結された異種遺伝子（単数または複数）を、調節された方式で発現するという意味でトランスジェニックである。出発材料は、好ましくは、本発明が記載するプロセスを開始する前に、当業者によってＲＮＡまたはタンパク質レベルの解析によって判断されるように、融合タンパク質が満足できる発現レベルであることに基づいて選択される。
【００５８】
（２）トランスジェニック材料の破壊は、乾燥状態または湿った状態で、植物組織および植物細胞のホモジナイズを生じる、当業者に知られる方法いずれかによって達成される。植物材料の供給源に適したものから、多様な方法を選択することも可能である。したがって、種子に関しては、トランスジェニック植物組織を破壊するには、製粉が優れた方法であり、一方、葉およびより柔らかい緑色組織に関しては、限定されるわけではないが、Ｗａｒｉｎｇブレンダー、Ｓｏｒｖａｌｌ ＯｍｎｉｍｉｘｅｒまたはＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーなどの装置でホモジナイズを達成可能である。植物組織および植物細胞を破壊する装置は、商業的に入手可能であり、そして必要に応じたスケールアップが容易である。植物供給源からの可溶性タンパク質の一般的な抽出法は、Ｓ． Ｒｏｅに監修される刊行物、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， 第２版（２００１）において、Ｇ． Ｐａｕｌ Ｐｏｗｅｌｌに記載される。植物供給源から可溶性タンパク質を抽出する、単純でそして成功する方法は、徹底的に混合しながら、破壊されたホモジナイズ植物組織に、低塩緩衝液などの単純な緩衝液を添加することである。通常、大部分の植物組織からの精製を最適にするのには、精製しようとする異種タンパク質に負の影響を有しうる植物組織由来のフェノール成分を隔離する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）ため、酸化による黒ずみ（ｔａｎｎｉｎｇ）に対する予防措置、例えばポリビニルピロリドンの添加（１％ ｗ／ｖ）が十分である。タンパク質分解は、植物供給源ではいつも問題を引き起こすわけではない。しかし、タンパク質分解が懸念される場合は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼ阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤を、抽出緩衝液に添加することも可能である。緩衝溶液の存在下または非存在下で、植物材料の破壊を行うことも可能である。抽出溶液は、限定されるわけではないが、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を含有することもまたは含有しないことも可能である。可溶性植物タンパク質は、ＣＢＭ−融合タンパク質とともに、液相に存在するであろう。
【００５９】
（３）植物材料と液体の混合は、液相に水溶性融合タンパク質を抽出するために必須である。添加される液体は、ｐＨを調節するため、好ましくは約５．２〜８．３の範囲内に調節するため、緩衝剤を含有することもまたは含有しないことも可能であり、目的のタンパク質に応じて、（２）に記載するような還元剤または隔離剤いずれを含有することもまたはしないことも可能である。最も単純な形では、液体は水であることも可能である。破壊され、そしてホモジナイズされた植物材料を液体と徹底的に混合した後、液相は、ＣＢＭ−融合タンパク質を含有する。
【００６０】
（４）（Ａ）ある程度、ホモジナイズ・レベルに応じて、破壊された植物材料および抽出液の混合物を、吸着流動床（ＥＢＡ）カラムに直接適用することも可能である。このアプローチでは、多糖性のアフィニティー吸着マトリックスの流動床を通る液体の流れとして、混合物をカラムに適用する。カラムを通じた流動中、液相中の融合タンパク質は、多糖マトリックスに曝露され、そして多糖吸着媒体へのＣＢＭの選択的アフィニティーを通じて、選択的に吸着される。限定されるわけではないが細胞壁断片および他の個体などの粒子は、あらゆる可溶性植物タンパク質とともに、フロースルー液中にあり、ＥＢＡカラムから洗い流される（ｆｌｕｓｈｅｄ ａｗａｙ）。
【００６１】
４（Ｂ）あるいは、当業者に知られる多様な方法を通じて、アフィニティー結合工程前に、混合物中の固体物の大部分を液体から分離することも可能であり、これらには、限定されるわけではないが、沈殿、ろ過、遠心分離、および沈降が含まれる。上述のように、固体物を廃棄し、そしてＣＢＭ−融合タンパク質を含有する液体を、場合による加熱工程４（Ｃ）に供するか、またはアフィニティー結合工程（５）に直接適用する。
【００６２】
４（Ｃ）アフィニティー工程（５）の前の混合物または液体の加熱は、場合によるが、全体としてのＣＢＭ−融合タンパク質が上昇した温度で可溶性のままである一方、可溶性植物タンパク質が変性し、そして沈殿することも可能であり、そして内因性植物プロテアーゼが熱で不活性化されうる場合、さらなる精製工程として働くことも可能である。この目的のため、ＣＢＭ−融合タンパク質の性質を考慮に入れた加熱法は、プロセス中、５０〜１００℃の範囲に、２分間〜６０分間の範囲のなどの期間、加熱することを伴うことも可能である。これらの態様において、好熱起源のＣＢＭが特に有益である。
【００６３】
（５）マトリックスへのアフィニティー結合。植物由来ＣＢＭ−融合タンパク質を含有する液体タンパク質抽出物を、ＣＢＭがアフィニティーを有する多糖マトリックスと接触させる。接触は、限定されるわけではないが、多糖マトリックスを伴う充填クロマトグラフィー・カラムなどの多様な方式で達成されることも可能であり、この場合は、多糖マトリックスの密度を指す、充填モードまたは流動（ｅｘｐａｎｄｅｄ）モードいずれかのカラムを通じて液体を流し、あるいはバッチ・モードで達成することも可能であり、この場合は、適切な容器中で多糖マトリックスを液体と混合し、続いてマトリックスおよび吸着したＣＢＭ−融合タンパク質を回収する。多糖マトリックスは、限定されるわけではないが、Ａｖｉｃｅｌなどのセルロース性起源のものであることも可能であるし、または不溶性キシランなどのキシラン性（ｘｙｌａｎｏｉｃ）起源のものであることも可能である。Ｂｏｒａｓｔｏｎら（２００１）による最近の刊行物において、ＣＢＭ９−２の結合特異性および熱力学が詳細に研究されてきている。しかし、驚くべきことに、先行技術で示されていたのとは対照的に、本明細書に記載するような本発明の方法にしたがうと、ＣＢＭ９−２が植物細胞壁構成要素には結合せずに容易に可溶性となる一方、本明細書のアフィニティー吸着工程（５）に用いるような多糖マトリックスに、特異的で優れた結合を保持することが、見出されてきている。上述のように、この驚くべき性質は、植物由来ＣＢＭ−融合タンパク質の下流プロセシングにいくつかの利点を導入し、非常に改善された、下流プロセシング法が提供される。
【００６４】
（６）マトリックスの洗浄。ＣＢＭ−融合タンパク質が結合した多糖アフィニティー吸着剤を、数カラム体積（アフィニティー・マトリックスをクロマトグラフィー・カラムに入れた場合に該当する定量的表現）の水溶液（例えば水）、あるいは限定されるわけではないが、リン酸緩衝生理食塩水またはＴｒｉｓに基づく緩衝液などの緩衝液で洗浄することも可能である。洗浄工程の効率を改善するため、限定されるわけではないが、マトリックスから、弱いが非特異的に結合した混入タンパク質を遊離させるのに用いられる、数カラム体積の塩濃度または界面活性剤の勾配または段階的な変化などの手段によって、洗浄緩衝液の組成を調節することも可能である。
【００６５】
（７）マトリックスからの融合タンパク質の遊離。本明細書に記載するような望ましい結合特性を持つＣＢＭを用いることによって、限定されるわけではないが、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、およびセロビオースなどの競合する糖にＣＢＭ−融合タンパク質を曝露することで、アフィニティー・マトリックスからのＣＢＭ−融合タンパク質の溶出を達成することも可能である。溶出工程のため、これらの糖または他の類似の糖、あるいはその組み合わせいずれかを、適切な量、例えば１ｍＭ〜１Ｍの濃度範囲で、溶出緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水またはＴｒｉｓに基づく緩衝液に添加することも可能である。糖濃度は、例えば２５ｍＭ〜１Ｍの範囲、例えば５０〜５００ｍＭの範囲であることも可能である。これらの糖は、低コストのバルク化学薬品として商業的に入手可能であり、これによって、本発明記載の下流プロセシングの全体の経済性がさらに改善される。
【００６６】
（８）融合タンパク質の単離／精製。いくつかの場合、ＣＢＭ−融合タンパク質のさらなる精製／単離が好適であるかまたは必要とされる可能性もある。限定されるわけではないが、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーなどの当業者に知られる一般的に利用可能なクロマトグラフィー法いずれを用いて、こうしたさらなる単離を達成することも可能である。
【００６７】
（９）最終産物。最終産物は、この場合、非常に精製された型のＣＢＭ−融合タンパク質であり、ＣＢＭ−融合タンパク質の場合によるタンパク質分解性切断の準備ができているか、あるいはいくつかの場合に必要であるかまたは好適である可能性もあるさらなる精製／単離の準備ができている。このさらなる単離は、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程であることも可能である。
【００６８】
非常に精製された型は、必要に応じて、さらなる配合および最終的な型でのパッケージングの準備ができている。
限定することを意図しない、以下の実施例を調べると、一般の当業者には、本発明のさらなる目的、利点、および新規特徴が、明らかになるであろう。さらに、上述のような、そして請求項に請求するような本発明の多様な態様および側面各々は、以下の実施例に実験的裏付けを見出す。
【実施例】
【００６９】
実施例
（実施例１）
バイオマス相互作用研究：ＣＢＭ９−２および製粉オオムギ種子
乾燥オオムギ種子を、細かい粉になるまで、Ｒｅｔｓｃｈ製粉装置中で細かく粉砕した。バイオマス相互作用研究に干渉しうるすべての水溶性構成要素を、試料から取り除く手段として、５ｍｌの低塩緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０２）を用い、種子から水溶性構成要素を抽出するため、製粉した種子１ｇを用いた。混合物をボルテックスし、そして５分間反転させ（ｔｕｍｂｌｅｄ）液体および製粉したオオムギ種子材料が完全に混合されていることを確実にした。この混合に続いて、試料を５０００ｘｇで４分間遠心分離して、固体物をペレットにした。遠心分離後、上清を廃棄した。低塩緩衝液を用いて、この手順を３回繰り返し、各遠心分離後、上清を廃棄した。次いで、高塩緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０２、１Ｍ ＮａＣｌ）を用いて、洗浄手順を３回繰り返し、前と同様、上清を廃棄した。生じた洗浄固体物は、大部分の植物細胞壁断片および不溶性デンプンに相当する。洗浄した固体物を、上述のような低塩緩衝液で３回洗浄して平衡化して、アフィニティー・クロマトグラフィーにおいて、セルロース性マトリックスへのＣＢＭ９−２のアフィニティー結合を支持するのと同じ条件を得た。バイオマス相互作用研究前の固体物の代表的な試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために取り置いた（レーン３）。細菌で産生し、セルロース（Ａｖｉｃｅｌ（商標））−アフィニティー・カラム上で精製したＣＢＭ９−２（Ｏ．Ｄ．＠２８０ｎｍ ０．３９４）１０μｌを、後のＳＤＳ−ＰＡＧＥのために取り置いた（レーン２）。精製されたＣＢＭ９−２は、あらかじめ、タンパク質のセルロース結合アフィニティー特性を回復するように、ＣＢＭ９−２に結合したいかなるグルコースも脱着するための立証された方法として、希釈および限外ろ過モジュール中の濃縮の繰り返し（４ｘ）に供されていた。
【００７０】
精製されたＣＢＭ９−２ ２ｍｌを、製粉オオムギ種子から得た、洗浄し、平衡化した固体物に添加し、そして混合物を振盪しながら室温で６０分間インキュベーションした。インキュベーション後、混合物を５０００ｘｇで１０分間回転して落とし、そして続いて上清を１３，０００ｘｇで５分間遠心分離して清澄にした。バイオマス相互作用由来の清澄化上清１０μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために取り置いた（レーン４）。続いて、製粉オオムギ種子固体物からなるペレットを、上述のように、低塩緩衝液で５回洗浄し、そして高塩緩衝液で５回洗浄した。１０μｌの最初の低塩緩衝液洗浄物（レーン５）および５回目の低塩緩衝液洗浄物（レーン６）を、続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために調製した。製粉オオムギ種子固体物から、結合したいかなるＣＢＭ９−２も溶出させるため、１ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．０２中の１Ｍグルコース）を固体物に添加し、そして１５分間混合しながらインキュベーションし、その後、５０００ｘｇで５分間遠心分離して、そして上清（溶出液）を除去した。溶出液１０μｌの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために調製した（レーン７）。バイオマス相互作用研究および溶出後の固体物由来の代表的な試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために取り置いた（レーン８）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために調製したバイオマス相互作用アッセイ由来の試料を、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌｓ均質１２．５）上で泳動した。泳動完了後、ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、そして脱染色した。結果を図２に例示する。
【００７１】
これらの結果は、ＣＢＭ９−２が植物由来細胞壁断片または製粉オオムギ種子由来の他の不溶性固体物に、有意には結合しないことを示す。
（実施例２）
製粉オオムギ種子抽出物からのＣＢＭ９−２の精製
商業的に入手可能な製粉装置（Ａａｒｓｌｅｖ Ｍａｓｋｉｎｆａｂｒｉｋ， Ｅｒｈｖｅｒｖｓｖａｎｇｅｎ １１， ５７９２ Ａａｒｓｌｅｖ， ＤＫ）を用いて、オオムギ種子を細かく挽いて粉にした。低塩緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０２）中、オオムギ粉：緩衝液がそれぞれ２：３の体積比で、生じたオオムギ粉を湿らせた。液体と粉を容器中で徹底的に混合し、そして４℃で一晩沈降させた。細菌から精製したＣＢＭ９−２をオオムギ種子上清に添加した。翌日、ＣＢＭ９−２を含有するスパイク処理した上清（１００ｍｌ）を、セルロース（Ａｖｉｃｅｌ（商標））を含有するＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）クロマトグラフィー・カラムに装填した。装填適用は、流動床モードで流速１８４ｃｍ／時間で行い、その後、５カラム体積の高塩緩衝液（５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．０２中の１Ｍ ＮａＣｌ）、その後、５カラム体積の低塩緩衝液（５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．０２）の洗浄工程を行った。流動床カラムは、沈降を可能にし（沈降した床の高さ＝２０ｃｍ）、そして９２ｃｍ／時間、溶出緩衝液：５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．０２中の１Ｍグルコース３００ｍｌで溶出を行った。溶出条件は、ＣＢＭ９−２タンパク質を含有する小さいピークを生じた（図３を参照されたい）。
【００７２】
これによって、上に記載する方法を用いると、まず；ＣＢＭ９−２は、溶液中、製粉オオムギ種子由来の細胞壁断片およびあまり明確でない他の固体物には付着しないままであり、次に；本発明に記載するように、多糖アフィニティー・クロマトグラフィーを用いて、製粉オオムギ種子抽出物からＣＢＭ９−２を捕捉することも可能であり；第三に；これは、よく定義された薬剤等級セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）をマトリックスとして使用することによって実行可能であり、そして第四に；アフィニティー・クロマトグラフィー工程は、本発明に記載するような流動床モードで実行可能であり、第五に；オオムギ種子抽出物から精製したＣＢＭ９−２は、本発明に記載するように、いかなる変性工程も回避した穏やかな条件下で、マトリックスから溶出させることも可能であることが示された。本明細書に上述するのとまさに同じ条件および方法を適用して、トランスジェニック製粉種子からＣＢＭ９−２融合タンパク質を精製することも可能である。記載する多糖アフィニティー・クロマトグラフィーは、本発明に記載するように、プロテアーゼ−ＣＢＭを分離し、そしてタンパク質分解性切断反応後、目的のタンパク質からＣＢＭを切除するのにも有効である。
【００７３】
（実施例３）
抽出物中のＣＢＭ９−２の熱安定性および濃縮
１．５グラムの製粉オオムギを、７．５ｍｌの低塩緩衝液（５０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．０２）に溶解した。反転装置中で溶液を１時間連続して混合し、そして６０００ｒｐｍで１０分間回転して落とした。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで、タンパク質含量に関して、上清（抽出物）を測定し、そして可溶性種子タンパク質１．９３ｍｇ／ｍｌを含有することを見出した。抽出物３５０μｌを精製ＣＢＭ９−２タンパク質（０．２３８ｍｇ／ｍｌ）３５０μｌと混合し、そしてエッペンドルフ試験管にアリコットし、これを続いて、水槽中で異なる温度（室温、５０℃、６０℃、７０℃および９０℃）に１０分間曝露した。熱処理後、試料を１１，０００ｒｐｍで１０分間回転して落とし、そして異なる熱処理由来の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。熱安定性試験由来の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に調製し、そしてＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌｓ均質１２．５）上で泳動した。泳動完了後、ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、そして脱染色した。結果を図４に例示する。熱に曝露したＣＢＭ９−２に関するさらなる試験を行って、ＣＢＭ９−２がセルロースに結合する能力が、熱への曝露によって、いかなる点でも不都合に影響を受けないことを確認した。
【００７４】
結果は、可溶性オオムギ種子タンパク質が溶液から次第に失われるのに対して、ＣＢＭ９−２は、全温度範囲中、可溶性のままであったことを示す。これは、本発明が記載する精製プロセスの抽出段階中、ＣＢＭおよびＣＢＭ−融合タンパク質を濃縮する目的で、好適に熱を適用可能であることを示す。
【００７５】
（実施例４）
製粉された単一のオオムギ種子抽出物からのＣＢＭ９−２に付着した異種タンパク質の精製
上述の精製法の規模縮小型において、異種タンパク質を発現しているトランスジェニック・オオムギ植物の単一の種子を用いた。室温で３０秒間〜５分間の範囲でインキュベーションした。青色が発色したら、１００μｌの０．２Ｍ硫酸を添加した。色は黄色になり、そしてマイクロプレート読み取り装置中、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７６】
個々のトランスジェニック・オオムギ種子由来の単一種子抽出物のＥＬＩＳＡ解析の結果を図５に示す。
ＣＢＭ９−２に特異的であることがあらかじめ示されたＥＬＩＳＡ解析は、まず；個々の種子中の異種融合タンパク質集積を達成し、そして検証可能であり；上述の方法は、小規模の場合であっても、切断部位を持つ異種融合タンパク質を単離するよう働き、精製プロセスの規模変更が可能であることを裏付け；ＣＢＭ９−２に付着した目的の異種タンパク質が、抽出中、溶液において維持されることに成功し、そしてあまり明確でない植物細胞壁セルロースに結合したために失われることがないことを示し；再生工程を伴わない、特異抗体による溶出後に認識されるように、異種融合タンパク質が、クロマトグラフィー・プロセス中、変性に曝露されないことを示し、上に議論するように、いくつかの他のより厳しいアフィニティー・クロマトグラフィー法よりも本発明が好適であることを強調し；上述の精製法が、ＣＢＭ９−２に付着したいかなる異種融合タンパク質にも適用可能であることを示す。
【００７７】
（実施例５）
ＣＢＭ−プロテアーゼの精製および活性測定
ＣＢＭ９−２タグが付着した部位特異的プロテアーゼを産生するため、以下の方法にしたがった：
構造的プロモーター直後のエンテロキナーゼｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡに付着した、ＣＢＭ９−２に対応するｃＤＮＡ、小胞体（ＥＲ）にターゲティングするシグナル配列、および該タンパク質をＥＲに保持する保持シグナルで構成される発現構築物を所持するバイナリー・プラスミドを含有するように、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＡＧＬ０を構築した。このアグロバクテリウム株を選択条件下、ＹＥＢ培地中で、まず１０ｍｌ中、Ｏ．Ｄ．６００が０．８になるまで２８℃で２日間増殖させた。小規模培養物を、２０μＭアセトシリンゴンを含有する５００ｍｌ培養に１：５０に希釈し、２８℃で２〜３日間、そして激しく振盪しながらＯ．Ｄ．６００ｎｍが２．５になるまで培養した。この細菌を６，０００ｒｐｍで１０分間回転して落とし、そしてＯＤ６００が２．５になるようにＭＳ溶液（５５ｇ／ｌスクロースを含有する）中に再懸濁した。アセトシリンゴン（１０ｍＭ）を最終濃度２００μＭになるように添加した。次いで、細菌懸濁物を室温に１時間維持し、そしてＴｗｅｅｎ−２０（１０％）を最終濃度０．００５％になるように添加した。
【００７８】
レタスにおけるＣＢＭ−プロテアーゼの一過性発現のため、アグロバクテリウム細菌懸濁物を含有するボウル中に植物を１５秒間浸した。
続いて植物を真空チャンバーに入れ、そして０．４バール圧を２０分間適用し、その後、吸気口を開放して、圧を迅速に均一にした。水道水のボウルに連続して浸漬することによって、葉表面の過剰な細菌を洗い落とした。レタス植物を１６時間明期／８時間暗期の光周期、２２℃で、増殖チャンバーに４日間入れた。
【００７９】
葉組織を切り取ることによって植物を採取し、そして続いて凍結させ、そして８６℃に維持した。乳鉢および液体窒素を用いて、非常に細かい粉末が得られるまで、植物をホモジナイズした。低塩抽出緩衝液およびレタス粉末、それぞれ１．２：１（体積：体積）を添加することによって、粉末になったレタス葉材料を抽出し、そして室温で時々混合しながらタンパク質を３０分間抽出した。
【００８０】
続いて抽出物を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、液相から固体物材料および細胞壁断片を分離した。上清をデカントし、そして先に記載するように再び回転した。透明な上清を、上述のようなセルロース性マトリックス（Ａｖｉｃｅｌ（商標））を含有する充填床カラムに装填した。ＣＢＭ−プロテアーゼはセルロース性マトリックスに特異的に付着し、そしてそれぞれ５カラム体積の高塩および低塩洗浄緩衝液で洗浄した後、穏やかな非変性条件下で、すなわち１Ｍグルコース溶液を用いて、単一ピークとして、ＣＢＭ−プロテアーゼをカラムから溶出させた。
【００８１】
続いて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濃縮装置（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５−Ｂｉｏｍａｘ−５）を用いて、ピークを濃縮した。
標準的アプローチ（Ｇｒａｎｔ＆ Ｈｅｒｍｏｎ−Ｔａｙｌｏｒ、１９７９）にしたがい、特異的合成基質を用いてエンテロキナーゼ活性をアッセイする：合成基質：Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−β−ナフチルアミド（ＧＤ４Ｋ−ｎａ）；アッセイ条件３７℃。反応体積は１．５ｍｌである。反応混合物は：２５μｌの１０ｍＭ ＧＤ４Ｋ−ｎａ（０．５ｍＭ）、１２５μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４（２５ｍＭ）、５０μｌの１００％ ＤＭＳＯ（１０％）、５０μｌの１００ｍＭ ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）、（２０〜１００）μｌエンテロキナーゼ、２５０μｌ蒸留水―（２０〜１００）μｌからなる。λｅｘ＝３３７ｎｍおよびλｅｍ＝４２０ｎｍ間の蛍光の増分からβ−ナフチルアミン形成速度を決定した。これを５分間連続して監視した。
【００８２】
活性測定の結果、記載するように産生し、そして精製したＣＢＭ−エンテロキナーゼが活性であることが示され；エンテロキナーゼ活性は、ブランクの０．０００１ｃｐｓ／分／μｇに比較して、４４２．７ｃｐｓ／分／μｇと測定された。
【００８３】
本実施例はまず；プロテアーゼ−ＣＢＭを植物において産生可能であり、この場合はレタス中で一過性に産生可能であり、そして上述の精製法を用いて、ＣＢＭ−プロテアーゼを成功裡に単離し、そして精製することが可能であることを示す。さらに、本実施例は、融合タンパク質のＣＢＭ９−２アフィニティー・タグが完全に機能し；ＣＢＭ−プロテアーゼがセルロース性マトリックスに有効に付着し、そして本発明が記載する穏やかな溶出条件下で、マトリックスから溶出可能であることを示し、そして溶出したプロテアーゼが完全に活性であることを示す。酵素活性は、部分的変性または完全な変性に特に感受性であり、こうした変性は容易に活性損失を生じるため、酵素的に活性である精製産物は、それ自体、その精製法が非変性特性を持つ証拠を提供する。これは、本発明の構成要素が、すべて機能し、そしてその振る舞いおよび性能が、上述の本発明が記載するような方式で、容易に適用可能であり、供給源いずれかの異種タンパク質の下流プロセシングの特異性、経済性および効率の大きな改善を構成するプロセスを生じるようなものであることを示す。
【００８４】
参考文献
【００８５】
【化１】
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、精製プロセスの好ましい態様の概略図である。
【図２】図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析による、実施例１から得た結果を示す。レーン１：分子量サイズマーカー、レーン２：精製ＣＢＭ９−２、レーン３：製粉したオオムギ種子由来の洗浄した固体物、レーン４：バイオマス相互作用後の上清、レーン５：低塩緩衝液での最初の洗浄液、レーン６：高塩緩衝液での５回目の洗浄液。
【図３】図３は、実施例２に詳細に記載するような、本発明の方法にしたがった、製粉オオムギ種子抽出物からのＣＢＭ９−２の精製の成功を示す。この図は、２００ｍｌセルロースを用いた、吸着流動床（ＥＢＡ）カラムのクロマトグラフィー・プロフィールを示す。
【図４】図４は、実施例３から得た結果、抽出物中のＣＢＭ９−２の熱安定性および濃縮を示す。この図は、異なる温度に供したオオムギ抽出物中のＣＢＭ９−２の熱安定性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１：１０〜２００ｋＤａの分子量サイズマーカー、レーン２：室温（ＲＴ）のオオムギ種子抽出物、レーン３：精製ＣＢＭ９−２（ＲＴ）、レーン４：ＣＢＭ９−２＋オオムギ種子抽出物（５０℃）、レーン５：ＣＢＭ９−２＋オオムギ種子抽出物（６０℃）、レーン６：ＣＢＭ９−２＋オオムギ種子抽出物（７０℃）、レーン７：ＣＢＭ９−２＋オオムギ種子抽出物（９０℃）。
【図５】図５は、実施例４から得た結果を示す。グラフは、対照試料のＥＬＩＳＡ読み取り値、およびＣＢＭ９−２に融合させ、そして本明細書記載の精製プロセスの規模縮小型にしたがって精製した、目的の異種タンパク質（ＨｏｘＢ４）を含有する試料の最小読み取り値を示す。柱は、（ａ）溶出緩衝液、（ｂ）トランスジェニック種子から抽出した融合タンパク質、および（ｃ）非トランスジェニック種子から抽出したタンパク質のＥＬＩＳＡ測定値を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース結合性モジュール（ＣＢＭ）を含む可溶性異種融合タンパク質を発現しているトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞から、前記融合タンパク質を産生し、そして精製する方法であって
（ａ）トランスジェニック植物材料を破壊し；
（ｂ）前記の破壊した植物材料から可溶性融合タンパク質を液相に抽出してタンパク質抽出物を得るために、植物材料に抽出液を添加し、それによって可溶性植物材料および不溶性植物材料の混合物を生成し；
（ｃ）細胞壁材料および固体物を含む不溶性植物材料を、目的の前記融合タンパク質を含む前記タンパク質抽出物から分離し；
（ｄ）前記タンパク質抽出物を、前記融合タンパク質に結合する多糖マトリックスに接触させ；
（ｅ）結合した融合タンパク質を伴うマトリックスを、１以上の適切な水溶液で洗浄し；そして
（ｆ）前記多糖マトリックスからの前記融合タンパク質の遊離を達成する条件を調節することによって、前記マトリックスから融合タンパク質を溶出し、
それによって実質的に精製された可溶性異種融合タンパク質を得る
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
前記トランスジェニック植物または植物細胞が、双子葉植物および単子葉植物の群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物細胞またはトランスジェニック植物が、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、ナタネ（ｒａｐｅ ｓｅｅｄ）、ダイズ（ｓｏｙ ｂｅａｎ）、アルファルファ（ａｌｆａｌｆａ）、レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ）、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、コムギ（ｗｈｅａｔ）、カラスムギ（ｏａｔ）およびイネ（ｒｉｃｅ）を含む植物群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
分離工程（ｃ）が、吸着流動床（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＥＢＡ）、沈殿、ろ過、遠心分離、またはその組み合わせのいずれかから選択される方法を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）における前記多糖マトリックスへのアフィニティー結合が、クロマトグラフィー工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質抽出物からの細胞壁材料および固体物の分離、並びに多糖マトリックス上への前記ＣＢＭ融合タンパク質のアフィニティー結合を同時に行うための手段として、多糖マトリックスを伴う吸着流動床を含む、プロセス工程中の工程（ｃ）および（ｄ）を組み合わせた、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
マトリックスからの前記融合タンパク質の溶出を達成する前記条件が、中性条件または酸性条件であることも可能な非変性条件であるか、あるいは炭水化物への曝露を伴うか、あるいはその組み合わせのいずれかである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記多糖マトリックスがセルロースを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記セルロースマトリックスが、薬学的に適合するセルロースを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記セルロースがＡｖｉｃｅｌ（商標）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスジェニック植物または植物細胞が、ＣＢＭをコードする核酸配列を含む、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＢＭが熱安定性であり、そして上昇した温度で可溶性のままである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＢＭをコードする前記領域が、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のキシラナーゼ１０Ａ遺伝子の領域である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＢＭをコードする前記領域が、配列番号１として示す配列を含むか、あるいは前記配列と同一のアミノ酸配列、または前記配列と実質的な配列同一性を持つアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
プロセス中、前記タンパク質抽出物を、３７℃〜１００℃の範囲の温度に、１分間〜１２０分間の範囲の期間、加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
固体物の分離および加熱した抽出物由来の前記ＣＢＭ融合タンパク質のアフィニティー結合を同時に行うための、多糖マトリックスを伴う吸着流動床を含むプロセス工程に、前記の加熱した抽出物を供する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
前記異種融合タンパク質がプロテアーゼを含む、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼが哺乳動物エンテロキナーゼ（ＥＫ）またはそのエンテロキナーゼ活性部分である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＫがウシＥＫ触媒性ドメイン（ＥＫｃ）を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウシＥＫｃが配列番号２として示す核酸配列にコードされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、タンパク質分解性切断部位に遮断される、ＣＢＭおよび目的の異種ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
セルロース結合性モジュール（ＣＢＭ）を含む可溶性異種融合タンパク質を発現しているトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞から、前記融合タンパク質を産生し、そして精製する方法であって
（ａ）トランスジェニック植物材料を破壊し；
（ｂ）前記の破壊した植物材料から可溶性融合タンパク質を液相に抽出してタンパク質抽出物を得るために、植物材料に抽出液を添加し、それによって可溶性植物材料および不溶性植物材料の混合物を生成し；
（ｃ）細胞壁材料および固体物を含む不溶性植物材料を、目的の前記融合タンパク質を含む前記タンパク質抽出物から分離し；
（ｄ）前記タンパク質抽出物を、前記融合タンパク質に結合する多糖マトリックスに接触させ；
（ｅ）結合した融合タンパク質を伴うマトリックスを、１以上の適切な水溶液で洗浄し；そして
（ｆ）前記多糖マトリックスからの前記融合タンパク質の遊離を達成する条件を調節することによって、前記マトリックスから融合タンパク質を溶出し、
それによって実質的に精製された可溶性異種融合タンパク質を得る
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
前記トランスジェニック植物または植物細胞が、双子葉植物および単子葉植物の群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物細胞またはトランスジェニック植物が、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、ナタネ（ｒａｐｅ ｓｅｅｄ）、ダイズ（ｓｏｙ ｂｅａｎ）、アルファルファ（ａｌｆａｌｆａ）、レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ）、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、コムギ（ｗｈｅａｔ）、カラスムギ（ｏａｔ）およびイネ（ｒｉｃｅ）を含む植物群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
分離工程（ｃ）が、吸着流動床（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＥＢＡ）、沈殿、ろ過、遠心分離、またはその組み合わせのいずれかから選択される方法を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）における前記多糖マトリックスへのアフィニティー結合が、クロマトグラフィー工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質抽出物からの細胞壁材料および固体物の分離、並びに多糖マトリックス上への前記ＣＢＭ融合タンパク質のアフィニティー結合を同時に行うための手段として、多糖マトリックスを伴う吸着流動床を含む、プロセス工程中の工程（ｃ）および（ｄ）を組み合わせた、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
マトリックスからの前記融合タンパク質の溶出を達成する前記条件が、中性条件または酸性条件であることも可能な非変性条件であるか、あるいは炭水化物への曝露を伴うか、あるいはその組み合わせのいずれかである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記多糖マトリックスがセルロースを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記セルロースマトリックスが、薬学的に適合するセルロースを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記セルロースがＡｖｉｃｅｌ（商標）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスジェニック植物または植物細胞が、ＣＢＭをコードする核酸配列を含む、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＢＭが熱安定性であり、そして上昇した温度で可溶性のままである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＢＭをコードする前記領域が、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のキシラナーゼ１０Ａ遺伝子の領域である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＢＭをコードする前記領域が、配列番号１として示す配列を含むか、あるいは前記配列と同一のアミノ酸配列、または前記配列と実質的な配列同一性を持つアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
プロセス中、前記タンパク質抽出物を、３７℃〜１００℃の範囲の温度に、１分間〜１２０分間の範囲の期間、加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
固体物の分離および加熱した抽出物由来の前記ＣＢＭ融合タンパク質のアフィニティー結合を同時に行うための、多糖マトリックスを伴う吸着流動床を含むプロセス工程に、前記の加熱した抽出物を供する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
前記異種融合タンパク質がプロテアーゼを含む、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼが哺乳動物エンテロキナーゼ（ＥＫ）またはそのエンテロキナーゼ活性部分である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＫがウシＥＫ触媒性ドメイン（ＥＫｃ）を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウシＥＫｃが配列番号２として示す核酸配列にコードされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が、タンパク質分解性切断部位に遮断される、ＣＢＭおよび目的の異種ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５０３２１１（Ｐ２００７−５０３２１１Ａ）
【公表日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２４５２８（Ｐ２００６−５２４５２８）
【出願日】平成１６年８月２７日（２００４．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＳ２００４／００００１０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１７６２
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５０６０６６８４７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月２７日（２００４．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＳ２００４／００００１０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１７６２
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５０６０６６８４７）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]