検出対象物の検出方法およびそれに用いる検出用キット
【課題】 検出感度に優れ、且つ、操作が簡便な新たな検出方法を提供する。
【解決手段】 検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成し、前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する。そして、前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅し、前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する。前記検出対象物が抗原の場合、前記一次試薬は一次抗体であり、前記二次試薬は二次抗体であることが好ましい。前記核酸アプタマーとしては、例えば、前記二次抗体に特異的に結合可能な一本鎖核酸があげられ、好ましくは一本鎖ＲＮＡである。
【解決手段】 検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成し、前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する。そして、前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅し、前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する。前記検出対象物が抗原の場合、前記一次試薬は一次抗体であり、前記二次試薬は二次抗体であることが好ましい。前記核酸アプタマーとしては、例えば、前記二次抗体に特異的に結合可能な一本鎖核酸があげられ、好ましくは一本鎖ＲＮＡである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象物の検出方法およびそれに用いる検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中の検出対象物を検出する方法として、例えば、抗原抗体反応を利用したＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法が利用されており、特に、サンドイッチＥＬＩＳＡ法が汎用されている（非特許文献１）。前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、例えば、検出対象物が抗原の場合、前記抗原に結合可能な一次抗体と、前記抗原に結合可能であり且つ酵素で標識化された二次抗体を使用して、以下のように行うことができる。まず、前記一次抗体を固定化した反応容器に、前記抗原を含む検体を添加する。すると、前記固定化一次抗体と前記抗原との間で抗原抗体反応が起こり、前記固定化一次抗体に前記抗原が結合する。そして、前記未反応の抗原を除去した後、さらに、前記反応容器に、前記標識化二次抗体を添加する。この標識化二次抗体と前記固定化一次抗体に結合した前記抗原との間で抗原抗体反応が起こり、前記抗原に前記標識化二次抗体が結合して、複合体が形成される。この複合体では、抗原を前記一次抗体と前記二次抗体とが挟み込む状態となる。そして、前記未反応の前記標識化二次抗体を除去した後、前記標識化二次抗体における標識酵素の基質を添加して、酵素反応を行う。この酵素反応による発色や発光のシグナルを検出することで、前記複合体形成に関与した前記抗原を検出することができる。前記シグナルは、前記複合体を構成する前記抗原の量と相関性を示すことから、間接的に、前記固定化一次抗体と前記標識化二次抗体とにより複合体形成に関与した抗原量を算出できる。
【０００３】
しかしながら、このＥＬＩＳＡ法は、検出限界が、ｎｍｏｌ／Ｌからｐｍｏｌ／Ｌオーダーである。また、工程数も多く、操作が煩雑である。このため、例えば、ｆｍｏｌ／Ｌオーダーの低量の検出対象物を検出可能な検出感度に優れる簡便な検出系の開発が望まれている。
【０００４】
そこで、前述のＥＬＩＳＡ法と核酸増幅法とを組み合わせた新たな検出系として、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法が注目されている（非特許文献２）。Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲは、前記酵素で標識化した二次抗体に代えて、核酸で標識化した標識化二次抗体を使用する方法である。具体的には、前述のＥＬＩＳＡ法と同様に、固定化一次抗体に検出対象物である抗原を結合させた後、前記固定化一次抗体に結合した抗原に、前記標識化二次抗体を結合させ複合体を形成させる。そして、未反応の前記標識化二次抗体を除去した後、前記標識化二次抗体の核酸を、ＰＣＲによって増幅させる。前記複合体における前記標識化二次抗体の核酸は、前記複合体を構成する前記抗原の量と対応するため、前記核酸の増幅産物を検出することで、前記抗原を検出することができる。このＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法によれば、例えば、前述のＥＬＩＳＡ法と比較して、例えば、感度が１０〜１０，０００倍に向上し、ｆｍｏｌ／Ｌオーダー以下の検出が可能である（非特許文献３）。
【０００５】
しかしながら、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの場合、実用化するには、核酸で標識化した二次抗体の準備が、非常に煩雑で困難であるという問題がある。前記標識化二次抗体は、例えば、検出対象物を抗原とする二次抗体に、増幅用の核酸を、化学結合等で結合することにより調製する。しかし、前記二次抗体に前記核酸を標識化するにあたっては、両者が結合するように、例えば、予め、前記核酸をビオチンで修飾し、前記二次抗体をアビジンやストレプトアビジンで修飾する必要があり、煩雑である。また、この修飾化の条件設定自体が、非常に手間がかかるという問題もある。さらに、調製した前記標識化核酸が前記二次抗体に結合しても、実際の核酸増幅の段階において、前記標識化二次抗体における核酸の増幅反応が確認できない場合がある。また、前記核酸で標識化された二次抗体と標識化できなかった二次抗体とが混在するため、例えば、核酸増幅反応の検出において、バックグラウンドが高くなるという問題がある。そして、このバックグラウンドの問題を回避するには、前記標識化二次抗体と前記未標識二次抗体との混合物から、前記標識化二次抗体を精製する必要があるが、前記両者は、核酸の有無が異なるのみであって、分離が困難である。さらに、前記標識化二次抗体は、前記検出対象物ごとに調製する必要がある。このため、前記検出対象物に応じた二次抗体ごとに、前述のような核酸増幅の問題がない標識化、および、未標識二次抗体との分離が必要であり、様々な検出対象物に利用することが困難である。また、化学修飾や試薬によって、抗体の有する結合活性が減少または消失するおそれもある。
【０００６】
他方、抗体に代わる分子として、検出対象物に結合可能な核酸からなる核酸アプタマーが報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。この核酸アプタマーを利用する検出方法としては、例えば、ＥＬＯＮＡ法（非特許文献５、６、７）等がある。前記ＥＬＯＮＡ法は、前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、前記標識化二次抗体に代えて、酵素で標識化した核酸アプタマーを使用する方法である。しかしながら、前記核酸アプタマーを酵素で標識化するには、前述のＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲと同様に、例えば、予め、前記核酸アプタマーをビオチンで修飾し、前記酵素をアビジン等で修飾する必要があり、標識二次抗体の調製自体が煩雑であり、修飾化の条件設定に手間がかかるという問題がある。また、前記核酸アプタマーのビオチン化により、例えば、アプタマーの結合能が減少または消失する問題がある。また、前記固定化一次抗体に結合した検出対象物に、十分量の核酸アプタマーを添加する必要があるため、コスト高が問題となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（１９７１）８，８７１−４．
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ．（１９９２）２５８，１２０−１２２．
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ．（１９９０）２４９，５０５−５１０．
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ．（１９９０）３４６，８１８−８２２．
【非特許文献５】Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．（２００４）７６，５６０５−５６１０．
【非特許文献６】Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２０，４７３−４７７．
【非特許文献７】Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ．（２００８）３９０，９８９−１００７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明の目的は、検出感度に優れ、且つ、操作が簡便な新たな検出方法、ならびに、それに用いる検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の検出方法は、検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成する複合体形成工程、
前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する結合工程、
前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅する増幅工程、および、
前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の検出用キットは、検出対象物と結合可能な試薬に結合可能な核酸アプタマーを含み、本発明の検出方法に使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れた感度で、検出対象物の検出を行うことができる。また、本発明によれば、前記検出対象物に結合可能な二次試薬について、標識化が不要である。このため、操作も簡便に行うことができる。したがって、本発明によれば、検出感度に優れ、且つ、操作が簡便な検出対象物の検出を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の検出方法の一例において、各工程の概略を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の実施例１において、ＲＮＡアプタマーを用いたリアルタイムＰＣＲにおけるＲＮＡアプタマーＲ１８の分子数（コピー数）とＣｔ値との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例１において、ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる抗アクチンウサギＩｇＧの測定結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例２において、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによるヒトＶＥＧＦの測定結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例３において、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおける血清中ヒトＶＥＧＦの測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例４において作成した検量線を示すグラフであり、同図（Ａ）は、実施例１におけるＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる抗アクチンウサギＩｇＧの測定値を用いた検量線のグラフであり、同図（Ｂ）は、実施例２におけるサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによるヒトＶＥＧＦの測定値を用いた検量線のグラフである。
【図７】図７は、比較例において、ＥＬＩＳＡによるヒトＶＥＧＦの測定値を用いた検量線のグラフである。
【図８】図８は、配列番号４の塩基配列からなる核酸アプタマーの推定二次構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の検出方法は、前述のように、検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成する複合体形成工程、
前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する結合工程、
前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅する増幅工程、および、
前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明においては、前記検出対象物に結合した前記二次試薬に、前記核酸アプタマーを結合させ、前記核酸アプタマーの増幅によって検出対象物を検出することがポイントである。したがって、検出対象物の種類、一次試薬および二次試薬の種類、核酸アプタマーの種類は、何ら制限されない。
【００１５】
本発明の検出方法において、前記検出対象物が抗原の場合、前記一次試薬は一次抗体であることが好ましく、また、前記検出対象物が抗体の場合、前記一次試薬は一次抗原であることが好ましい。
【００１６】
本発明の検出方法において、前記二次試薬は二次抗体であることが好ましい。
【００１７】
本発明の検出方法において、前記一次試薬は、固相に固定化された固定化試薬であることが好ましい。
【００１８】
本発明の検出方法において、前記固相は、プレートまたはビーズであることが好ましい。
【００１９】
本発明の検出方法は、前記増幅工程に先立って、さらに、前記複合体における前記二次試薬に未結合の核酸アプタマーを除去する工程を含むことが好ましい。
【００２０】
本発明の検出方法において、前記複合体形成工程は、前記一次試薬に、前記検出対象物を反応させる工程と、前記検出対象物に、前記二次試薬を反応させる工程とを含むことが好ましく、前記一次試薬に前記検出対象物を反応させる工程の後に、前記検出対象物に、前記二次試薬を反応させる工程を行うことが好ましい。
【００２１】
本発明の検出方法において、前記アプタマーは、イムノグロブリンＧに結合可能なアプタマーであることが好ましく、前記イムノグロブリンＧは、ウサギ由来イムノグロブリンＧであることが好ましい。
【００２２】
本発明の検出方法において、前記核酸は、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましく、また、配列番号３および配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましい。
【００２３】
本発明の検出方法において、前記核酸増幅方法は、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ法）であることが好ましい。
【００２４】
以下に、本発明の検出方法について詳細に説明する。
【００２５】
本発明において、「結合」とは、例えば、会合、吸着等の意味も含む。また、「ポリヌクレオチド」とは、例えば、オリゴヌクレオチドの意味も含む。
【００２６】
（核酸アプタマー）
前記核酸アプタマーとは、特定の標的物質に特異的に結合可能な核酸分子であり、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸や、二本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸があげられる。前記核酸アプタマーが、後者の二本鎖核酸の場合、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖にすることが好ましい。前記核酸アプタマーは、例えば、自己アニーリングによる二次構造を有してもよく、前記二次構造としては、例えば、ステムループ構造があげられる。
【００２７】
本発明において、前記核酸アプタマーは、例えば、天然由来の核酸配列であってもよいし、合成した核酸配列であってもよい。合成方法は、何ら制限されず、例えば、ＤＮＡ合成機やＲＮＡ合成機により、ｄＮＴＰ等を材料として、末端塩基から化学合成する方法等があげられる。前記核酸アプタマーとしては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等があげられ、また、例えば、ＰＮＡ等のペプチド核酸を含んでもよい。前記核酸アプタマーは、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ等の天然核酸（非人工核酸）を含んでもよいし、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等の人工核酸を含んでもよい。
【００２８】
本発明において、前記核酸アプタマーは、前述のように、前記二次試薬に特異的に結合できればよいが、特に、前記一次試薬および検出対象物よりも、前記二次試薬に特異的に結合できることが好ましい。前記核酸アプタマーは、例えば、前記二次試薬の種類に応じて適宜調製できる。
【００２９】
前記核酸アプタマーの前記二次試薬に対する結合力は、特に制限されないが、例えば、解離定数（ＫＤ）が、１０μｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、特に好ましくは１ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００３０】
前記核酸アプタマーが結合する前記二次試薬の種類は、特に制限されないが、後述するように、例えば、抗体が好ましい。前記抗体としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の各種サブクラス（アイソタイプ）のイムノグロブリン（Ｉｇ）があげられる。また、前記抗体は、例えば、抗原を特異的に認識する、抗体の一部分または部分断片（以下、「抗体の機能的断片」ともいう）であってもよく、前記各種Ｉｇを酵素処理して得られる活性フラグメントがあげられる。前記活性フラグメントとしては、例えば、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、およびこれらの重合体等があげられる。前記抗体は、その由来も特に制限されず、例えば、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ラクダ、ロバ、ハムスター、モルモット等の哺乳動物、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類等があげられる。
【００３１】
前記核酸アプタマーが結合する前記二次抗体における結合部位は、特に制限されないが、例えば、Ｉｇの定常領域（Ｃ領域）内が好ましく、前記定常領域としては、例えば、可変領域（Ｖ領域）以外のＦａｂ領域やＦｃ領域等があげられる。前記定常領域は、例えば、Ｉｇのクラスごと、および、Ｉｇの由来生物ごとで、構造が類似している。したがって、具体例として、前記ウサギ由来ＩｇＧに結合可能な核酸アプタマーは、例えば、前記二次抗体における結合部位が定常領域であれば、異なる検出対象抗原に対する二次抗体であっても、同じ核酸アプタマーの使用が可能である。このため、検出対象物の種類ごとに、例えば、二次抗体だけでなく、核酸アプタマーを準備することが不要であり、より一層簡便、低コスト化を実現し、汎用性の高い検出が可能となる。なお、前記核酸アプタマーが結合する二次抗体は、一方で、検出対象物に特異的に結合可能であることが必要である。そこで、前記検出対象物が結合する前記二次抗体における結合部位は、例えば、Ｉｇの可変領域（Ｖ領域）内であることが好ましい。
【００３２】
前記核酸アプタマーの具体例を以下に例示するが、これらの例示によって、本発明は、何ら制限されない。前記二次試薬が、ウサギ由来のＩｇＧの場合、前記核酸アプタマーとしては、例えば、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を含む核酸があげられる。配列番号１および配列番号２の塩基配列において、両配列の異なる塩基のみに下線を付した。
（配列番号１）
5’- uucgauacgc cgugggguga cguuggcugc‐3’
（配列番号２）
5’- uucgauacgc cgugggguga cguuggcuac‐3’
【００３３】
また、前記核酸アプタマーとしては、前記配列番号１で表される塩基配列を含む核酸として、配列番号３で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸、前記配列番号２で表わされる塩基配列を含む核酸として、配列番号４で表わされる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。下記配列番号３および配列番号４の塩基配列において、下線部は、それぞれ、前記配列番号１および配列番号２の塩基配列に相当する。また、下記配列４に示す核酸アプタマーの推定二次構造を、図８に示す。
（配列番号３）
5’- gggagaauuc cgaccagaag uucgauacgc cgugggguga cguuggcugc ccuuuccucu cuccuccuuc uucu‐3’
（配列番号４）
5’- gggagaauuc cgaccagaag uucgauacgc cgugggguga cguuggcuac ccuuuccucu cuccuccuuc uucu‐3’
【００３４】
これらの他に、前記核酸アプタマーとしては、例えば、下記配列番号５〜９からなる群から選択された少なくとも一つの配列番号で表わされる塩基配列または前記塩基配列を含む核酸があげられる。下記配列番号５の塩基配列において、下線部は、前記配列番号１の塩基配列に相当する。なお、これらの配列番号１〜９の塩基配列において、ＵはＴであってもよい。
（配列番号５）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaaga aguucgauac gccguggggu gacguuggcu gcccuuuccu cucuccuccu ucuucu‐3’
（配列番号６）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagu uuuuaaaccg cgccuuggaa gcguacguug gccuuuccuc ucuccuccuu cuucu‐3’
（配列番号７）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagc aaauugccgg gccuuggaag ccaagucgcu uuccucucuc cuccuucuuc u‐3’
（配列番号８）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagc gcaagccggc ccuuggaagg cuagucgguc uuuccucucu ccuccuucuu cu‐3’
（配列番号９）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagu ucgauacgcc guggggugac guuggcuacc uuuccucucu ccuccuucuu cu‐3’
【００３５】
前記ウサギ由来ＩｇＧに対する核酸アプタマーは、例えば、前記ウサギＩｇＧに特異的に結合可能である限りにおいて、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなる核酸であってもよい。置換、付加、挿入もしくは欠失した前記塩基の数は、例えば、数個、好ましくは、１個〜２０個の範囲である。また、前記核酸アプタマーは、例えば、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸において、前記各塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなる核酸であってもよい。前記相同性は、例えば、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。また、前記核酸アプタマーは、例えば、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸において、前記各塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸であってもよい。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。
【００３６】
また、前記ウサギ由来ＩｇＧに対する核酸アプタマーは、例えば、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸と、実質的に同一な推定構造または構造モチーフを有する核酸であってもよい。前記「実質的な推定構造または構造モチーフを有する」とは、例えば、核酸の二次構造および二次構造のモチーフを予測するプログラムを使用し、複数の配列を含む配列群に見出される一定の同一性を有することを意味する。一定の同一性とは、例えば、配列間の相同性が７０以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上であり、特に好ましくは９９％以上である。前記プログラムとしては、例えば、Ｚｕｋｅｒｆｏｌｄプログラム等があげられる。
【００３７】
前記核酸アプタマーの製造方法は、特に制限されず、例えば、公知のＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法等があげられる。
【００３８】
ＳＥＬＥＸ法による核酸アプタマーの調製は、特に制限されないが、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、複数の核酸を含む核酸プールを準備し、前記核酸ライブラリーと標的物質である二次試薬とを結合（会合）させ、前記核酸プールと前記二次試薬との複合体を形成する。そして、前記複合体から、前記複合体の形成に関与した核酸プローブのみを回収することにより、前記二次試薬に特異的に結合可能な核酸アプタマーを調製できる。以下に、一例として、ＳＥＬＥＸ法を用いて、前記二次試薬に特異的に結合可能な核酸アプタマーを調製する方法をあげるが、本発明は、これらには何ら制限されない。
【００３９】
前記核酸プールとは、例えば、ランダム領域を有する核酸のライブラリー（混合物）である。前記ライブラリーにおける前記核酸は、例えば、ＲＮＡやＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記ランダム領域とは、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、および、ＵまたはＴの塩基をランダムに連結した領域であり、その長さは、例えば、２０〜１２０ｍｅｒである。前記核酸プールは、例えば、４２０〜４１２０種類（約１０１２〜１０７２種類）の核酸を含むことが好ましく、より好ましくは、４３０〜４６０種類（約１０１８〜１０３６種類）である。
【００４０】
前記核酸プールに含まれる前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記ランダム領域を有していればよく、その他の構造は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドは、前記ランダム領域に加えて、例えば、前記ランダム領域の５’末端および３’末端の少なくとも一方に、後述する核酸増幅で利用するプライマー領域、ポリメラーゼが認識するポリメラーゼ認識領域等を有することが好ましい。前記ポリメラーゼ認識領域は、例えば、アプタマー調製における後述の核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、前記ポリメラーゼの認識領域は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識領域」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識領域であるＴ７プロモーター等があげられる。前記ＲＮＡプールの具体例としては、例えば、５’末端側から、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と前記プライマー領域（以下、「５’末端側プライマー領域」ともいう）とを、この順序で連結し、前記５’末端側プライマー領域の３’末端側に、前記ランダム領域を連結し、さらに、前記ランダム領域の３’末端側にプライマー領域（以下、「３’末端側プライマー領域」ともいう）を連結した構造があげられる。前記ＲＮＡにおける前記５’末端側プライマー領域とは、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’末端に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、前記ＲＮＡプールは、例えば、さらに、標的物質である二次試薬への結合を補助する領域を有してもよい。また、前記核酸プールに含まれるポリヌクレオチドは、それぞれ、異なるランダム領域を有してもよいし、一部の配列が共通するランダム領域を有してもよい。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各領域は、例えば、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。
【００４１】
前記核酸プールの調製方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、例えば、ＤＮＡを含む初期プールを使用し、前記ＤＮＡを鋳型として調製できる。以下、核酸プールのＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ鎖をアンチセンス鎖、前記ＲＮＡのＵをＴに置換した配列を有するＤＮＡ鎖をセンス鎖ともいう。前記ＤＮＡを含む初期プールとしては、例えば、前記ＲＮＡプールにおける前記ランダム領域の相補鎖のＵをＴに置換したＤＮＡ（アンチセンス鎖）、および、前記ランダム領域のＵをＴに置換した配列を有するＤＮＡ（センス鎖）のいずれか一方を含むことが好ましい。この初期プールのＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行うことにより、ＲＮＡの核酸プールを調製できる。
【００４２】
また、前記ランダム領域のＵをＴに置換したＤＮＡを含む初期プールを準備し、これを鋳型として、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と、前記５’末端側プライマー領域に相補的な配列とを含むプライマーをアニーリングさせ、核酸増幅を行うことにより、ＲＮＡの核酸プールを調製することもできる。
【００４３】
そして、前記核酸プールと標的物質とを反応させ、前記核酸と前記標的物質との複合体を形成する。本発明においては、前記核酸アプタマーとして、前記二次試薬に特異的に結合する核酸アプタマーを使用することから、前記標識物質は、二次試薬が好ましい。前記アプタマーの調製において、前記核酸プールと反応させる前記二次試薬は、例えば、二次試薬そのものであってもよいし、二次試薬の分解物であってもよい。具体例としては、前記二次試薬が、後述するような抗体の場合、例えば、Ｉｇ等の抗体そのものであってもよいし、前記各種Ｉｇを酵素処理して得られる、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の前記Ｉｇの活性フラグメント等であってもよい。前記核酸プールと前記二次試薬との結合形式は、特に制限されず、例えば、水素結合等の分子間力等があげられる。前記核酸プールと前記二次試薬との結合処理は、例えば、前記両者を溶媒中で一定期間インキュベートする方法があげられる。前記溶媒としては、特に制限されないが、前記両者の結合等が保持されるものが好ましく、例えば、各種緩衝液があげられる。
【００４４】
続いて、前記核酸プールと標的物質との複合体を回収する。なお、前記複合体形成のために前記両者を反応させた反応液には、前記複合体の他に、例えば、前記複合体形成に関与しない核酸プール（以下、「未反応核酸プール」という）が含まれる。このため、例えば、前記反応液から、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを、分離することが好ましい。前記分離方法としては、特に制限されないが、例えば、前記標的物質と前記核酸プールとの吸着性の違いや、前記複合体と前記核酸プールとの分子量の違いを利用する方法等があげられる。
【００４５】
前者の吸着性の違いを利用する方法としては、例えば、以下の方法が例示できる。すなわち、まず、前記標的物質に吸着性を有する担体と、前記複合体を含む前記反応液とを接触させる。この際、前記未反応核酸プールは、前記担体に吸着せず、他方、前記標的物質と前記核酸プールとの複合体は、前記担体に吸着する。これによって、前記未反応核酸プールと前記複合体とを分離することができる。そして、前記未反応核酸プールを除去後、前記担体に吸着した前記複合体を回収すればよい。また、前記担体から前記複合体を回収する前に、例えば、前記未反応核酸プールを十分に除去するため、前記担体を洗浄することが好ましい。前記標的物質に吸着性を有する担体としては、特に制限されず、例えば、標的物質である二次試薬の種類に応じて適宜選択できる。前記標的物質である二次試薬が、例えば、抗体等のタンパク質の場合、前記吸着性を有する担体としては、例えば、ニトロセルロース膜等があげられる。
【００４６】
後者の分子量の違いを利用する方法としては、例えば、担体を使用する方法が例示できる。前記担体としては、例えば、前記核酸プールが通過し且つ前記複合体が通過できないようなサイズのポアを有する担体があげられる。このような担体を利用して、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを分離できる。前記分離は、例えば、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルを用いた電気的な分離であってもよい。
【００４７】
この他にも、例えば、前記複合体の形成時において、担体に固定化した二次試薬を使用する方法もあげられる。すなわち、前記二次試薬を予め担体に固定化し、前記担体と前記核酸プールとを接触させ、前記固定化二次試薬と核酸プールとの複合体を形成させる。そして、前記固定化二次試薬に結合していない未反応の核酸プールを除去した後、前記担体から、前記二次試薬と前記核酸プールとの複合体を解離させればよい。前記二次試薬の担体への固定化方法は、何ら制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、前記二次試薬にタグを結合しておき、前記タグとの結合基を有する担体に、前記タグを結合した二次試薬を接触させる方法があげられる。前記タグとしては、例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇ等があげられ、前記結合基としては、例えば、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）等の金属イオンがあげられる。前記担体の具体例としては、例えば、前記金属イオンをベースとするＮｉ−アガロース、Ｎｉ−セファロース等があげられる。
【００４８】
つぎに、回収した前記複合体から、前記複合体形成に関与した核酸プールを回収する。前記複合体形成に関与した核酸プールは、例えば、前記複合体について、前記標的物質と核酸プールとの結合を解除することによって回収できる。
【００４９】
続いて、回収した前記複合体形成に関与した核酸プールについて、核酸増幅を行う。前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、核酸プールの種類に応じて、公知の方法により行うことができる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によりＤＮＡの核酸増幅を行い、得られた増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡの転写を行うことができる。これによって、前述の前記複合体形成に関与したＲＮＡプールの増幅を行うことができる。
【００５０】
前記ＲＮＡプールが、例えば、前述のように、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域、前記５’末端側プライマー領域、前記ランダム領域および前記３’末端側プライマー領域を有する場合、これらの領域を利用する増幅方法があげられる。前記ＲＮＡを鋳型として前記ｃＤＮＡを調製するための逆転写反応では、例えば、プライマーとして、前記ＲＮＡプールの３’末端側プライマー領域に相補的な配列を含むポリヌクレオチドを使用することが好ましい。また、前記ｃＤＮＡを鋳型とするＤＮＡの増幅には、例えば、プライマーとして、前記５’末端側プライマー領域を含むポリヌクレオチドと、前記３’末端側プライマー領域の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有し、その３’側に、前記５’末端側プライマー領域を有することが好ましい。得られたＤＮＡの増幅産物を鋳型とするＲＮＡの増幅には、前記ＤＮＡ増幅産物を鋳型として、前記ＤＮＡに含まれる５’末端側プライマー領域および３’末端側プライマー領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅を行う。この際、プライマーとしては、例えば、前記５’末端側プライマー領域を含むポリヌクレオチドと、前記３’末端側プライマー領域の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有し、その３’側に、前記５’末端側プライマー領域を有することが好ましい。そして、得られた増幅産物を鋳型として、前記増幅産物に含まれるＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写反応を行うことによって、前記複合体形成に関与するＲＮＡプールの核酸増幅を行うことができる。増幅産物のうち、例えば、アンチセンス鎖のＤＮＡは、その３’末端側に、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有するため、この領域に前記ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが結合し、前記アンチセンス鎖を鋳型として、前記ＲＮＡを合成できる。前記逆転写反応に使用するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されないが、例えば、トリ骨髄芽球症ウィルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）等が使用できる。
【００５１】
なお、前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法や、各種等温増幅法等が採用できる。また、その条件も、特に制限されない。
【００５２】
このように、標的物質と複合体を形成した核酸プールを回収し、さらに、前述と同様にして、標的物質を用いた複合体の形成、複合体の回収、前記複合体形成に関与した核酸プールの分離、前記分離した核酸プールの増幅等を繰り返し行うことで、最終的に、標的物質である二次試薬に結合性を有する核酸アプタマーを得ることができる。
【００５３】
（一次試薬および二次試薬）
本発明において、前述のように、前記一次試薬は、前記検出対象物と結合可能な試薬であり、前記二次試薬は、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な試薬である。前記一次試薬および二次試薬は、それぞれ前記検出対象物と結合可能であればよく、その種類は、何ら制限されない。また、前記検出対象物の種類も、何ら制限されない。
【００５４】
本発明において、前記検出対象物と前記一次試薬との組み合わせ、および、前記検出対象物と前記二次試薬との組み合わせは、それぞれ特に制限されず、前記検出対象物と前記一次試薬および前記二次試薬とがそれぞれ結合可能であればよい。このような結合可能な組合せとしては、特に制限されないが、例えば、抗原と抗体、リガンドとレセプター、レクチンとそのレセプター、レクチンと糖鎖等の組み合わせがあげられ、いずれが検出対象物であってもよく、いずれが前記一次試薬および二次試薬であってもよい。また、前記一次試薬および前記二次試薬は、例えば、非核酸物質であることが好ましい。これらの中でも、組み合わせとしては、抗原と抗体との組み合わせが好ましく、例えば、前記検出対象物と前記一次試薬、前記検出対象物と前記二次試薬とが、それぞれ、抗原抗体反応で結合し、前記複合体を形成することが好ましい。このように、抗原と抗体との組み合わせであれば、いわゆる抗原抗体反応に基づくサンドイッチ法を利用することができる。なお、抗原とは、例えば、抗体に結合可能な抗原性を有する物質である。このため、本発明における抗原は、例えば、他の抗体に結合可能な抗原性を有していれば、他の抗原に結合可能な抗体であってもよい。
【００５５】
前記検出対象物と前記一次試薬との組み合わせ、および、前記検出対象物と前記二次試薬との組み合わせが、抗原と抗体との組み合わせの場合、前記一次試薬および前記二次試薬は、例えば、前記検出対象物の種類に応じて、以下の組み合わせがあげられる。前記検出対象物が抗原の場合、前記一次試薬は、前記検出対象物である前記抗原と結合可能な一次抗体が好ましく、前記二次試薬は、前記一次抗体とは別の部位で前記検出対象物である前記抗原と結合可能な二次抗体があげられる。一方、前記検出対象物が抗体の場合、前記一次試薬は、前記検出対象抗体と結合可能な一次抗原が好ましく、前記二次試薬は、前記検出対象抗体を抗原として結合可能な二次抗体があげられる。このような組合せによれば、例えば、前記検出対象物と前記一次試薬とが結合し、さらに、前記結合物における前記検出対象物に前記二次試薬が結合することで、複合体を形成できる。
【００５６】
本発明において、前記抗原とは、例えば、ハプテン等の意味も含む。
【００５７】
本発明において、前記抗体とは、特に制限されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のＩｇがあげられる。また、本発明において、前記抗体は、例えば、前記Ｉｇには制限されず、例えば、Ｉｇを酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の活性フラグメントであってもよい。本発明において、前記抗体は、例えば、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００５８】
また、前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。前記検出対象物が抗原の場合、例えば、検出精度を向上できることから、前記一次抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、前記二次抗体は、例えば、検出精度を向上できることから、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００５９】
前記一次抗体および二次抗体の調製方法は、特に制限されず、公知の方法があげられる。前記方法としては、例えば、動物への免疫感作を行う方法が一般的である。免疫感作させる宿主動物の種類は、特に制限されず、例えば、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ラクダ、ロバ、ハムスター、モルモット等の哺乳動物、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類等が使用できる。また、前記宿主動物に対する抗原の投与方法も、特に制限されず、例えば、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等が採用できる。そして、例えば、血清や腹水を回収することによって、目的の抗体を得ることができる。前記抗体は、例えば、前記血清や腹水をそのまま使用してもよいが、公知の方法により精製して使用することが好ましい。前記精製方法としては、特に制限されず、硫酸ナトリウムや硫酸アンモニウム等を用いる塩析法、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、分子ふるいクロマトグラフィー法、電気泳動法等があげられる。
【００６０】
前記一次抗体または二次抗体としてポリクローナル抗体を調製する場合は、前述のような免疫感作を行うことが好ましい。他方、前記一次抗体または二次抗体としてモノクローナル抗体を調製する場合は、例えば、免疫した宿主動物における脾臓細胞やリンパ球様細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを融合してハイブリドーマを調製することが好ましい。そして、前記ハイブリドーマを増殖させ、特異性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を単離することによって、モノクローナル抗体を得ることができる。
【００６１】
前記一次試薬は、例えば、固相に固定化された固定化試薬であることが好ましい。前記一次試薬を固定化することで、例えば、前記固定化された一次試薬に検出対象物を結合させた後、未反応の検出対象物の除去、不純物の除去、洗浄等が容易である。また、固定化された前記一次試薬に、さらに、前記二次試薬を結合させた後も、同様に、未反応の二次試薬の除去や洗浄が容易である。これによって、本発明の検出方法の精度を、さらに向上できる。
【００６２】
前記固相の形態としては、特に制限されず、例えば、ウェルプレート、マイクロプレート等のプレート、セルロース膜等のメンブレン、フィルム、試験管やマイクロチューブ等のチューブ、マイクロスフェアやビーズ等の粒子等があげられる。
【００６３】
前記固相は、例えば、不溶性であることが好ましい。前記不溶性材料としては、特に制限されないが、例えば、有機樹脂材料、無機材料等があげられる。前記有機樹脂材料は、例えば、天然物でもよく、合成物でもよく、具体例としては、アガロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、ポリスチレン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂、ポリフッ化ビニル、ポリアミンメチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、６−ナイロン、６，６−ナイロン、ラテックス等があげられる。前記無機材料としては、例えば、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂等があげられる。前記固相は、例えば、前記不溶性材料のいずれか一種類を含んでもよいし、二種類以上を含んでもよい。
【００６４】
前記固相が前記粒子の場合、例えば、磁性粒子が好ましい。前記固相が磁性粒子であれば、例えば、磁力によって、固定化された前記一次試薬に前記検出対象物が結合した前記磁性粒子や、前記検出対象物にさらに前記二次試薬が結合した前記磁性粒子を、容易に回収できる。
【００６５】
前記一次試薬は、例えば、前記固相に、直接結合してもよいし、間接的に結合してもよい。また、前記一次試薬の前記固相への固定化は、例えば、物理的な結合でも化学的な結合でもよく、具体例としては、吸着、共有結合等の化学結合等があげられる。
【００６６】
前記固相への前記一次試薬の固定化方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記方法としては、例えば、前記一次試薬を含む液体に、前記固相を浸漬する方法があげられる。前記液体は、例えば、前記一次試薬を溶媒に、溶解、分散または懸濁することによって調製できる。前記溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられ、前記緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、Ｇｏｏｄの緩衝液、ホウ酸緩衝液等があげられる。前記一次試薬を含む液体のｐＨは、特に制限されないが、例えば、７〜１０であることが好ましく、より好ましくは９．５である。浸漬条件は、特に制限されないが、例えば、温度４〜３７℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。
【００６７】
前記固相は、例えば、固定化させる一次試薬の種類に応じて、前記一次試薬を効率よく固定化するための前処理を施してもよい。前記前処理としては、例えば、前記一次試薬の官能基と結合可能な官能基を前記固相に付加する処理があげられる。また、前記一次試薬についても、例えば、前記固相の種類に応じて、効率良く固定化するための前処理を施してもよい。前記前処理としては、例えば、前記固相の官能基と結合可能な官能基を前記一次試薬に付加する処理があげられる。
【００６８】
また、前記固相は、例えば、前記一次試薬を固定化した後、必要に応じてブロッキング処理を施してもよい。前記固相の表面をブロッキング処理することによって、例えば、前記固相に対する前記二次試薬の非特異的な結合を抑制し、検出精度をさらに向上することができる。前記ブロッキングに使用する試薬は、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、脱脂粉乳等のブロッキング剤があげられる。
【００６９】
本発明においては、前記二次試薬としては、前述のＥＬＩＳＡ法やＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法とは異なり、例えば、未標識二次試薬が使用できる。このため、例えば、前記二次試薬の標識化処理や、未標識二次試薬と標識化二次試薬との分離等が不要である。これにより、例えば、より簡便な試薬調製が可能であり、未標識二次試薬の混在によるバックグラウンドの上昇を防止できる。
【００７０】
（検出対象物）
本発明においては、前記一次試薬と検出対象物と二次試薬との複合体に前記核酸アプタマーを結合させ、その核酸増幅により、前記検出対象物を間接的に検出することが特徴である。このため、本発明において、前記検出対象物の種類は、何ら制限されず、例えば、イオン、低分子化合物、無機化合物、有機化合物、ホルモン、ペプチド、タンパク質、糖類、脂質、ウィルス、細菌、細胞、生体組織等があげられる。
【００７１】
（核酸増幅法）
本発明において、核酸増幅法は、何ら制限されず、前記核酸アプタマーを増幅できる方法が採用できる。前記核酸アプタマーが、例えば、ＲＮＡアプタマーの場合、前記ＲＮＡアプタマーを鋳型として、逆転写反応によりＤＮＡを合成し、前記ＤＮＡを鋳型として増幅する方法があげられる。また、前記核酸アプタマーが、例えば、ＤＮＡアプタマーの場合、前記ＤＮＡアプタマーを鋳型として増幅する方法があげられる。前記核酸増幅法の具体例としては、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法や、等温増幅法等があげられる。また、前記核酸増幅反応の条件も何ら制限されない。
【００７２】
つぎに、本発明の検出方法について、抗原抗体反応を利用する形態の例を以下に示す。なお、本発明は、これらには何ら制限されない。
【００７３】
（第１の実施形態）
本実施形態は、検出対象物が抗原であり、一次試薬が固定化一次抗体、二次試薬が二次抗体である形態の一例である。なお、前述のように、前記一次抗体は、前記抗原に特異的に結合可能な抗体であり、前記二次抗体は、前記一次抗体とは異なる部位で前記抗原に特異的に結合可能な抗体である。
【００７４】
本実施形態について、図１を用いて説明する。図１は、本実施形態における検出方法の一例を示す概略図である。
【００７５】
まず、図１（Ａ）に示すように、固定化した一次抗体１１を準備する。前記固定化一次抗体１１は、前述のように、固相１に一次抗体１１が固定化されていればよく、例えば、前記固相の種類、固相への一次抗体の結合方法等は、何ら制限されない。
【００７６】
つぎに、前記固定化一次抗体に検体を接触させる。前記検体が検出対象抗原を含む場合、図１（Ｂ）に示すように、前記固定化一次抗体１１に前記検体中の検出対象抗原１２が結合する。なお、本発明において、前記固定化一次抗体１１は、前記検出対象抗原１２に対する抗体であればよく、所望の検出対象物に応じて、例えば、適宜調製したり、市販の抗体を使用することができる。
【００７７】
前記固定化と検出対象抗原との処理条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、処理時間は、例えば、５〜１２０分であり、好ましくは１５〜６０分である。
【００７８】
１反応系における前記一次抗体の量は、特に制限されず、例えば、添加する検体の量等に応じて適宜決定できる。具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記一次抗体は、例えば、０．１ピコモル〜１０ピコモルであることが好ましく、より好ましくは０．２ピコモル〜５ピコモルであり、特に好ましくは０．４ピコモル〜２ピコモルである。
【００７９】
前記検体としては、特に制限されず、前記検出対象抗原を含有すると考えられる検体があげられる。前記検体としては、例えば、生物由来検体や、環境由来検体、人為的な検体等があげられる。前記生物由来検体としては、例えば、ヒト等の哺乳類、鳥類、魚類、昆虫類、細菌や菌類等の微生物類等があげられる。前記環境由来検体としては、例えば、海水、土壌、下水等の排水等があげられる。人為的な検体としては、例えば、食品、飲料、合成物等があげられる。また、前記検体は、例えば、希釈された検体であってもよい。前記検体の形態は、特に制限されず、例えば、液体状、ゲル状、固体状、粉末状等があげられるが、前記一次抗体との接触性に優れることから、液体であることが好ましい。
【００８０】
前記検体を希釈する場合、その溶媒は、特に制限されないが、例えば、蒸留水等の水、生理食塩水、緩衝液等があげられ、前記緩衝液としては、例えば、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等があげられる。また、前記溶媒は、例えば、界面活性剤、塩等の添加剤を含んでもよい。前記界面活性剤としては、特に制限されず、例えば、Ｔｗｅｅｎ系等の非イオン性界面活性剤等があげられ、前記塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム等があげられる。
【００８１】
つぎに、前記一次抗体に結合した前記検出対象抗原に、さらに、二次抗体を接触させる。これにより、図１（Ｃ）に示すように、前記検出対象抗原１２に前記二次抗体１３が結合し、前記一次抗体１１と検出対象抗原１２と前記二次抗体１３とが結合した複合体２１が形成される。なお、本発明において、前記二次抗体は、前記検出対象抗原に対する抗体であればよく、所望の検出対象抗原に応じて、例えば、適宜調製したり、市販の抗体を使用することができる。
【００８２】
前記二次抗体と検出対象抗原との処理条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、処理時間は、例えば、５〜１２０分であり、好ましくは１５〜６０分である。また、前記二次抗体は、例えば、前記検出対象抗原との接触性に優れることから、前記二次抗体を含む液体として添加することが好ましい。前記液体は、例えば、前記二次抗体を溶媒に添加することで調製でき、前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、前述と同様の、水や緩衝液等の溶媒が使用できる。
【００８３】
１反応系における前記検体の添加量は、特に制限されないが、具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記検体の添加量は、例えば、１０〜１８０μＬであることが好ましく、より好ましくは２０〜１００μＬであり、特に好ましくは４０〜６０μＬである。
【００８４】
続いて、前記複合体に、前記二次抗体に特異的に結合可能な核酸アプタマーを接触させる。これにより、図１（Ｄ）に示すように、前記複合体２１における前記二次抗体１３に、前記核酸アプタマー１４が結合する。なお、本発明において、前記核酸アプタマーは、前記二次抗体に結合可能な抗体であればよく、所望の二次抗体に応じて、例えば、適宜調製したり、市販の核酸アプタマーを使用することができる。
【００８５】
前記複合体と前記核酸アプタマーとの処理条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、処理時間は、例えば、５〜１２０分であり、好ましくは１５〜６０分である。
【００８６】
１反応系における前記核酸アプタマーの量は、特に制限されず、例えば、前記一次抗体および前記二次抗体の添加量等に応じて適宜決定できる。具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記核酸アプタマーの添加量は、例えば、６×１０８〜６×１０１１分子（コピー数）であることが好ましく、より好ましくは６×１０９〜６×１０１０分子であり、特に好ましくは６×１０９分子である。
【００８７】
前記核酸アプタマーには、例えば、前記複合体への接触に先立って、変性処理を施してもよい。これによって、例えば、核酸同士のアニーリングを解除し、再び自己アニーリングして、目的の二次構造を形成することができる。前記変性処理の条件は、特に制限されないが、核酸アダプターの自己アニーリングを解除し、一本鎖核酸となる条件が好ましく、具体例としては、処理温度は、例えば、６５〜９５℃であり、好ましくは、７０〜９５℃であり、処理時間は、例えば、１〜３０分であり、好ましくは２〜５分である。
【００８８】
続いて、前記核酸アプタマーの増幅を行い、増幅産物を検出することで、検体中の検出対象物の検出を行う。前述のように、前記一次抗体と検出対象物と前記二次抗体との複合体が形成された場合、前記複合体の二次抗体には核酸アプタマーが結合している。このため、核酸増幅反応を行えば、図１（Ｅ）に示すように、前記二次抗体１３を介して前記複合体２１に結合した前記核酸アプタマー１４が増幅し、前記核酸アプタマー１４の増幅産物１５が得られる。前記核酸アプタマーの増幅は、前記検出対象物の存在を示し、前記増幅の程度が、前記検出対象物の量を示す。このため、本実施形態によれば、前記複合体における前記二次抗体に結合した核酸アダプターの増幅のみで、検出対象物の検出が可能であることから、操作を簡便に行うことができる。
【００８９】
前述のように、核酸アプタマーの増幅方法は、何ら制限されず、前記核酸アプタマーの種類に応じて適宜決定することができる。前記核酸アプタマーがＲＮＡアプタマーの場合、逆転写反応の後、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅を行うことが好ましく、具体例としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲがあげられる。前記核酸アプタマーがＤＮＡアプタマーの場合には、前記ＤＮＡアプタマーを鋳型として増幅を行うことが好ましく、具体例としては、ＰＣＲがあげられる。
【００９０】
前記核酸増幅は、例えば、プライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を用いて行うことができる。前記プライマーは、例えば、核酸アプタマーの種類や配列等に応じて適宜決定できる。前記ポリメラーゼは、例えば、核酸アプタマーの種類に応じて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等が使用できる。また、その他にも、核酸増幅に使用できる各種試薬を使用できる。
【００９１】
前記増幅産物の検出は、その目的に応じて、例えば、増幅産物の有無の検出（いわゆる定性）でもよいし、増幅産物の量の測定（いわゆる定量）であってもよい。
【００９２】
前記増幅産物の検出方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。検出方法としては、例えば、得られた増幅産物そのものを直接的に検出する方法と、得られた増幅産物を間接的に検出する方法とがあげられる。前記直接的な検出方法としては、例えば、反応系について、核酸に特異的な波長（２６０ｎｍ）における吸光度を測定する方法、反応系の電気泳動等を行う方法があげられる。前者の場合、例えば、反応開始から所定期間経過後に、反応系について前記波長の吸光度上昇が検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、吸光度の大きさによって、増幅産物の量を判断できる。また、後者の場合、反応開始から所定期間経過後に、反応液について、前記核酸アプタマーに対応する増幅産物の大きさを示す部分にバンドが検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、バンドの強度によって、増幅産物の量を判断できる。他方、間接的な検出方法としては、例えば、インターカレーターを使用する方法、５’末端が蛍光色素および３’末端がクエンチャーで標識化されたプローブを使用する方法等があげられる。前者の方法において、前記インターカレーターは、例えば、二本鎖核酸に挿入されて蛍光発光する化合物であり、具体例としては、ＳＹＢＲ（商標）ＧｒｅｅｎＩ等があげられる。この方法によると、鋳型の相補鎖が合成されると、前記鋳型と相補鎖とが二本鎖を形成し、前記二本鎖に前記インターカレーターが挿入し、蛍光を発する。したがって、例えば、反応開始から所定期間経過後に、反応系について、蛍光の発光が検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、蛍光強度によって、増幅産物の量を判断できる。また、後者の方法において、前記プローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブ等があげられる。一例として、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを用いた方法によると、例えば、前記プローブが鋳型に結合している際は、前記プローブの５’末端側の前記蛍光色素は３’末端側の前記クエンチャーにより蛍光が消光されている。しかし、鋳型にプライマーが結合し、伸長反応が進むことによって、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼが前記プローブに近づくと、前記プローブは、５’末端側から切断され、５’末端側の蛍光色素が遊離する。このため、前記クエンチャーによる消光効果が解除され、前記蛍光色素が発光する。したがって、前記蛍光色素の発光が検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、蛍光強度によって、増幅産物の量を判断できる。
【００９３】
前記増幅産物の検出において、前記増幅産物量は、例えば、増幅産物量そのものであってもよいし、前述のような、前記増幅産物量と相対関係を示す、吸光度（吸収強度）、蛍光強度等であってもよい。
【００９４】
前記増幅産物の検出は、例えば、経時的な検出（いわゆるリアルタイム検出）が好ましい。前記リアルタイム検出は、例えば、断続的に行ってもよいし、連続的に行ってもよい。前記断続的な検出としては、例えば、増幅反応の開始時と、開始時から所望の一定時間経過時とにおける検出があげられる。この検出によれば、開始時から一定時間の間に得られた増幅産物を検出することができる。また、前記連続的な検出は、例えば、一定時間経過ごとに検出するコンスタントな検出であってもよいし、ランダムな検出であってもよい。中でも、例えば、一定時間ごとの増幅産物の増加程度が確認できることから、コンスタントな検出であることが好ましい。本発明においては、具体例として、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ等が好ましい。
【００９５】
以上のように、前記複合体に結合した前記核酸アプタマーの増幅を検出することによって、間接的に、前記複合体における検出対象抗原の有無または量を判断することができる。
【００９６】
本実施形態は、例えば、さらに、各結合反応の後、未反応物質を除去する工程を含んでもよい。具体的には、例えば、前記一次抗体と検体との反応後、未反応の検出対象抗原を除去する工程を有してもよく、前記一次抗体に結合した検体と二次抗体との反応後、未反応の前記二次抗体を除去する工程を有してもよく、また、前記二次抗体と核酸アプタマーとの反応後、未反応の前記核酸アプタマーを除去する工程を有してもよい。本実施形態においては、前記一次抗体が固相に固定化されているため、例えば、前記固相の洗浄により、容易に、未反応物質を除去することができる。このように、未反応物質を除去することにより、例えば、本発明の検出精度をさらに向上することができる。
【００９７】
前記洗浄用の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、前述と同様の水や緩衝液等が使用できる。洗浄条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、洗浄回数は、例えば、３回以上であり、好ましくは３〜１０回である。洗浄１回あたりの前記洗浄用溶媒の量は、特に制限されないが、例えば、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記洗浄用溶媒の量は、例えば、１００〜２００μＬであることが好ましい。
【００９８】
前記洗浄方法は、特に制限されず、例えば、前記一次抗体が固定化された固相の種類に応じて適宜決定できる。前記固相が有底凹状の反応器の場合、例えば、前記凹状の内部に前記洗浄用溶媒を添加した後、除去すればよい。また、前記固相がビーズ状の固相の場合、例えば、前記洗浄用溶媒中に前記固相を浸漬した後、前記固相を回収すればよい。この際、例えば、ろ過により、前記固相と前記洗浄用溶媒とを分離してもよいし、前記固相が磁性を有する場合は、例えば、磁石等により前記固相を回収して、前記固相と前記洗浄用溶媒とを分離してもよい。
【００９９】
なお、前記一次抗体が、固定化されていない一次抗体であっても、例えば、電気泳動法、透析膜または限界ろ過膜等を用いたろ過方法等によって、前記未反応物質を除去することはできる。
【０１００】
（第２の実施形態）
本実施形態は、検出対象物が抗体であり、一次試薬が一次抗原であり、二次試薬が二次抗体である形態の一例である。なお、前述のように、前記一次抗原は、検出対象抗体に特異的に結合可能な抗原であり、前記二次抗体は、前記検出対象抗体に特異的に結合可能な抗体である。本実施形態においては、特に示さない限り、前記第１の実施形態と同様に行うことができる。
【０１０１】
本実施形態において、前記反応系における前記一次抗原の量は、特に制限されず、例えば、添加する検体の量等に応じて適宜決定できる。具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記一次抗原は、例えば、１〜１×１０１５分子であることが好ましく、より好ましくは１×１０２〜１×１０１４分子であり、特に好ましくは１×１０６〜１×１０１２分子である。
【０１０２】
本実施形態において、前記一次抗原は、前述のように、固定化一次抗原であることが好ましい。前記一次抗原を固相に固定化すれば、例えば、前記第１の実施形態と同様に、前記一次抗原と未反応の検出対象抗体、前記一次抗原に結合した検出対象抗体に未反応の二次抗体、さらに、前記一次抗原と検出対象抗体と前記二次抗体との複合体に未反応の核酸アプタマーを、容易に除去することができる。これらの未反応物質を除去することにより、例えば、本発明の検出精度をさらに向上することができる。
【０１０３】
本発明において、前記一次抗体と検出対象物との反応、前記検出対象物と前記二次抗体との反応、および、前記二次抗体と前記核酸アプタマーとの反応は、例えば、同時に行ってもよいし、別個に行ってもよい。中でも、例えば、未反応物質の除去が容易であることから、各反応は、別個に行うことが好ましい。
【０１０４】
つぎに、本発明の検出用キットは、前述のように、検出対象物と結合可能な試薬に結合可能な核酸アプタマーを含み、本発明の検出方法に使用することを特徴とする。
【０１０５】
本発明の検出用キットは、さらに、前記検出対象物と結合可能な前記試薬を含むことが好ましく、前記試薬は、前述の二次試薬であることが好ましい。
【０１０６】
本発明の検出用キットは、さらに、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物に結合可能な二次試薬とを含み、前記核酸アプタマーは、前記二次試薬に結合可能な核酸アプタマーであることが好ましい。
【０１０７】
本発明の検出用キットにおいて、前記一次試薬は、例えば、一次抗体または一次抗原である。
【０１０８】
本発明の検出用キットにおいて、前記二次試薬は、例えば、二次抗体である。
【０１０９】
本発明の検出用キットにおいて、前記一次試薬は、固相に固定化された固定化試薬であることが好ましく、前記固相は、例えば、プレート、メンブレン、チューブ、チップまたはビーズ等があげられる。
【０１１０】
本発明の検出用キットにおいて、前記アプタマーは、例えば、ＩｇＧに結合可能なアプタマーであり、前記ＩｇＧは、ウサギ由来ＩｇＧであることが好ましい。
【０１１１】
本発明の検出用キットにおいて、核酸は、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましく、また、配列番号３または配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましい。
【０１１２】
本発明の検出用キットにおいて、前記核酸アプタマー、前記一次試薬および前記二次試薬および前記アプタマーは、前記本発明の検出方法で述べた通りであり、また、前記本発明の検出方法と同様にして使用できる。
【０１１３】
本発明の検出用キットにおいて、前記核酸アプタマーと、前記一次試薬および前記二次試薬の少なくとも一方は、例えば、同じ容器に収容されてもよいが、それぞれ別個の容器に収容されていることが好ましい。本発明の検出用キットにおいて、前記一次試薬、前記二次試薬および前記核酸は、例えば、使用時に、前述のような添加割合となるように、それぞれ収容されていることが好ましい。
【０１１４】
本発明の検出用キットは、例えば、さらに、固相を有してもよく、前記固相に前記一次試薬が固定化されていることが好ましい。
【０１１５】
本発明の検出用キットは、例えば、さらに、核酸増幅に必要な試薬を適宜備えてもよい。また、本発明の検出用キットは、例えば、さらに、使用説明書を備えることが好ましい。
【実施例】
【０１１６】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
【０１１７】
ウサギ抗体ＲＮＡアプタマーの調製
下記実施例で使用する抗アクチンウサギＩｇＧに特異的に結合可能なＲＮＡアプタマーＲ１８（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７５，２１７−２２２，（２００８）．）を調製した。具体的には、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８の鋳型となるＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に用いた。前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、Ｔ７ ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅキット（商品名、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、３７℃で３時間行った。この反応産物を、１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、目的のＲＮＡアプタマーＲ１８を精製回収した。なお、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８の配列を配列番号４に示す。
【０１１８】
［実施例１］
１．リアルタイムＰＣＲによるＲＮＡアプタマーの定量法
前記ＲＮＡアプタマーＲ１８をＥＡＳＹ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）で、所定濃度（６×１０２〜６×１０１０分子）に希釈し、標準サンプルを作製した。そして、これらの標準サンプルについて、リアルタイムＰＣＲを行った。前記リアルタイムＰＣＲは、ＯｎｅＳｔｅｐ ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ ＩＩ（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）およびＡＢＩ ７３００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。各標準サンプルについて、前記リアルタイムＰＣＲを３回行い、前記３回の反応の平均値から、スレッシュホールドサイクル（Ｃｔ）値を求めた。前記ＰＣＲは、９５℃を５秒、５５℃を１５秒、７２℃を３１秒のＰＣＲプログラムで行った。
【０１１９】
これらの結果を、図２に示す。同図は、リアルタイムＰＣＲにおける前記標準サンプル中のＲＮＡアプタマーＲ１８の分子数（コピー数）とＣｔ値との関係を示すグラフである。同図において、横軸は、前記標準サンプルにおけるＲＮＡアプタマーＲ１８の分子数（コピー数）の常用対数値を示し、縦軸は、前記Ｃｔ値を示す。同図に示すように、前記標準サンプルにおけるＲＮＡアプタマーＲ１８が、６×１０２分子〜６×１０１０分子の範囲内で、「ｙ＝−３．２２６５ｘ＋４０．７７３」で表される検量線が得られた。この検量線の相関係数は、Ｒ＝０．９９９９（決定係数Ｒ２＝０．９９９７）であることから、ＲＮＡアプタマーとＣｔ値との相関性が極めて優れることがわかった。さらに、前記検量線の傾きは、−３．２２６５であり、これは、増幅効率を１００％と仮定した傾きの理論値−３．１６２３に近似している。このことから、ＲＮＡアプタマーのリアルタイムＰＣＲによる定量は、精度の高い定量性を持った検出系であることがわかった。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡアプタマーを十分に増幅することが可能であり、且つ、十分に優れた定量性を確保できることが確認できた。
【０１２０】
２．ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる抗アクチンウサギＩｇＧの検出
抗アクチンウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を所定濃度（１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）となるように、反応用バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ ホウ酸、ｐＨ９．４）で希釈した。前記ＩｇＧ希釈液を、ｅｘｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＣＲプレート（商品名、ＡｐｔａＲｅｓ社製）にウェルあたり４０μＬ添加し、４℃で終夜インキュベートした。前記プレートから液体を除去後、前記プレートをＨＢＳ−Ｔ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、さらに、前記プレートのウェルにブロッキング用バッファー１（０．１％ アセチル化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）および１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎを含むＨＢＳ−Ｔ）を添加し、室温で６０分間インキュベートした。他方、１００ｐｍｏｌ／Ｌの前記ＲＮＡアプタマーＲ１８を、９５℃、２分間の処理で変性させ、室温で５分間冷却した。そして、ブロッキング処理した前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、各ウェルに前記変性させたＲＮＡアプタマーＲ１８を添加し、室温で４５分間インキュベートし、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した。続いて、前述のリアルタイムＰＣＲと同様にして、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８の検出を行った。なお、抗アクチンウサギＩｇＧ未添加のサンプルのＣｔ値を１０として、各サンプルについて、得られたＣｔ値の正規化を行った。
【０１２１】
他方、比較として、ＲＮＡアプタマーを使用しないＥＬＩＳＡにより、前記抗アクチンウサギＩｇＧを検出した。前記ブロッキング用バッファー１に代えてブロッキング用バッファー２（１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＨＢＳ−Ｔ）を用いた以外は、前述と同様にして、抗アクチンウサギＩｇＧをウェルプレートに結合させた。前記プレートから液体を除去後、ＨＢＳ−Ｔで３回洗浄し、さらに、０．５μｇ／ｍＬ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗ウサギＩｇＧ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をウェルあたり１００μＬ添加し、室温で６０分間インキュベートした。前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、基質としてウェルあたり１００μＬの１−ｓｔｅｐ Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ（商品名、ＰＩＥＲＣＥ社製）を添加し、室温でインキュベートして発色させた。そして、前記プレートについて、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、発色を波長域４０５ｎｍおよび６５０ｎｍで検出した。波長域６５０ｎｍのシグナル値をバックグラウンドとして、波長域４０５ｎｍのシグナル値の正規化を行った。
【０１２２】
抗アクチンウサギＩｇＧ測定結果を図３に示す。同図において、○は、ＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる測定結果であり、□は、ＥＬＩＳＡの測定結果を示すグラフである。同図において、横軸は、ウェルあたりの抗アクチンウサギＩｇＧ添加量を示し、左の縦軸は、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおける、正規化したＣｔ値を示し、右の縦軸は、前記ＥＬＩＳＡにおける、正規化したシグナル値を示す。その結果、ＲＮＡアプタマーを用いたリアルタイムＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（○）によれば、ウェルあたり１０ｐｇ〜１，０００，０００ｐｇ（１μｇ）の抗アクチンウサギＩｇＧを検出できることがわかった。これに対して、ＥＬＩＳＡ（□）では、ウェルあたり１０００ｐｇの抗アクチンウサギＩｇＧが、検出限界であった。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたリアルタイムＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによれば、ＥＬＩＳＡの１００倍の感度でターゲット分子（抗アクチンウサギＩｇＧ）を検出できることがわかった。
【０１２３】
３．抗体ＲＮＡアプタマーの特異性の確認
ＲＮＡアプタマーＲ１８が、ウサギＩｇＧに特異的に結合することを確認した。ウサギＩｇＧ以外は、サンドイッチ法で一般に用いられる下記ＩｇＧを使用した。
マウスＩｇＧ（＃Ｉ２８０６、サンタクルズ社製）
ヤギＩｇＧ（＃ＡＰ１２４、ケミコン社製）
ヒトＩｇＧ（＃Ｐ８０−１０４、ＢＥＴＨＹＬ社製）
ニワトリＩｇＧ（＃ＣＧＨＬ−１０Ａ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）
ヒツジＩｇＧ（＃ＳＧＨＬ−１０Ａ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）
ラットＩｇＧ（＃ＳＣ−２０２６、サンタクルズ社製）
ウサギＩｇＧ（＃ＡＢ３２８２、ケミコン社製）
【０１２４】
各種生物由来のＩｇＧを、それぞれウェルあたり５０，０００ｐｇ（５０ｎｇ）となるように添加した以外は、実施例１と同様にして、各種生物由来ＩｇＧの検出を行った。なお、前記ＩｇＧ未添加のネガティブコントロール（ＮＣ）のシグナルをノイズとして、前記各種ＩｇＧ添加のシグナルに関して、シグナル／ノイズ比を算出した。
【０１２５】
これらの結果を、下記表１に示す。下記表１に示すように、ウサギＩｇＧは、他の生物種由来ＩｇＧと比べて極めて高いシグナルを示した。この結果から、ＲＮＡアプタマーＲ１８は、極めて特異的にウサギＩｇＧに結合できることがわかる。
【表１】
【０１２６】
［実施例２］
ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにより、ヒト血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）を検出した。
【０１２７】
ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ
抗アクチンウサギＩｇＧに代えて、０．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＶＥＧＦヤギＩｇＧ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、抗ヒトＶＥＧＦヤギＩｇＧをＰＣＲプレートに結合させ、ブロッキング処理を行った。前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、所定濃度（１μｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ）の抗原ヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）をウェルあたり１００μＬ添加した。そして、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＶＥＧＦウサギＩｇＧ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）をウェルあたり１００μＬ添加した。さらに、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、実施例１と同様にして変性させたＲＮＡアプタマーＲ１８をウェルあたり６×１０−１４分子となるようにウェルに添加し、室温で４５分間インキュベートした。そして、実施例１と同様、リアルタイムＰＣＲおよびデータ解析を行った。
【０１２８】
［比較例２］
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡキット（商品名、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を用いて、ヒトＶＥＧＦを検出した。発色の検出およびシグナル値の正規化は、前述したＥＬＩＳＡと同様に行った。なお、前記キットには、サンプルとして、所定濃度（１００ｆｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ）のＶＥＧＦ溶液１００ｍＬを使用した。
【０１２９】
ヒトＶＥＧＦ測定結果を、図４に示す。同図において、○は、実施例２におけるＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの測定結果を示すグラフであり、□は、比較例２におけるＥＬＩＳＡの測定結果を示すグラフである。同図において、横軸は、ウェルあたりのヒトＶＥＧＦ添加量を示し、左の縦軸は、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおける、正規化したＣｔ値を示し、右の縦軸は、前記ＥＬＩＳＡにおける、正規化したシグナル値を示す。その結果、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（○）によれば、ウェルあたり０．１ｐｇ〜１００，０００ｐｇのヒトＶＥＧＦを検出できることがわかった。これに対して、ＥＬＩＳＡ（□）では、ウェルあたり１０ｐｇのヒトＶＥＧＦが、検出限界であった。
【０１３０】
つぎに、実施例２のＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲについて、検出限界値を算出した。前記検出限界値は、独立した３回のバックグラウンドシグナル測定値から、標準偏差および平均値を求め、以下の計算式から算出した。
検出限界値＝（３×Ｓ０）＋Ｓ
Ｓ０：バックグラウンドシグナル標準偏差
Ｓ：バックグラウンドシグナル平均値
【０１３１】
実施例２のＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの検出限界値は、約０．１ｐｇであった。これに対して、比較例２のＥＬＩＳＡの検出限界値は、前述のように約１０ｐｇであった。この結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによれば、ＥＬＩＳＡの１００倍の感度でターゲット分子（ヒトＶＥＧＦ）を検出できることが確認された。
【０１３２】
［実施例３］
ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにより、血清中のヒトＶＥＧＦを検出した。変性させたＲＮＡアプタマーＲ１８をＰＣＲプレートウェルに添加する直前に、市販のヒトＶＥＧＦに代えて血清（ウシ血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加した以外は、実施例２と同様にして、ヒトＶＥＧＦを検出した。
【０１３３】
ヒト血清中のＶＥＧＦの測定結果を図５に示す。同図は、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの測定結果を示すグラフである。同図において、横軸は、ウェルあたりのヒトＶＥＧＦ添加量を示し、縦軸は、正規化したＣｔ値を示す。同図に示すように、血清を使用しても、ウェルあたり０．１ｐｇ〜１０，０００ｐｇのヒトＶＥＧＦを検出できた。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲは、検体が血清であっても、同様の検出限界での測定が可能であることがわかった。
【０１３４】
［実施例４］
実施例１および実施例２の測定値から、検量線を作成し、高精度定量が可能な検出対象物の濃度範囲を決定した。なお、高精度定量が可能と判断する基準は、所定の検出対象物の濃度範囲における検量線の決定係数Ｒ２が、０．９９以上であることとした。
【０１３５】
これらの結果を図６に示す。同図（Ａ）は、実施例１におけるＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる測定値を用いた検量線のグラフであり、同図（Ｂ）は、実施例２におけるサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる測定値を用いた検量線のグラフである。同図（Ａ）において、横軸は、ウェルあたりの抗アクチンウサギＩｇＧ添加量（常用対数）を示し、縦軸は、正規化したＣｔ値を示す。また、同図（Ｂ）において、横軸は、ウェルあたりのヒトＶＥＧＦ添加量（常用対数）を示し、縦軸は、正規化したＣｔ値を示す。同図（Ａ）に示すように、抗アクチンウサギＩｇＧ濃度範囲１ｐｇ〜１００，０００ｐｇにおける検量線の決定係数は、Ｒ２＝０．９９５７であり、０．９９以上であった。この結果から、検出対象物の濃度範囲１ｐｇ〜１００，０００ｐｇにおいて、ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる高精度定量が可能であることがわかった。また、同図（Ｂ）に示すように、ヒトＶＥＧＦ濃度範囲１ｐｇ〜１０，０００ｐｇにおける検量線の決定係数は、Ｒ２＝０．９９２５であり、０．９９以上であった。この結果から、検出対象物の濃度範囲１ｐｇ〜１０，０００ｐｇにおいて、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる高精度定量が可能であることがわかった。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いた検出法を用いると、例えば、４〜５オーダーの範囲で、高精度定量が可能であることがわかった。一方、ＥＬＩＳＡでは、図７に示すように、通常、２オーダーの範囲でしか高精度定量ができない。したがって、定量可能範囲の広さという点でも、ＲＮＡアプタマーを用いた検出方法は、ＥＬＩＳＡよりも優れていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明によれば、優れた感度で、検出対象物の検出を行うことができる。また、本発明によれば、前記検出対象物に結合可能な二次試薬として、標識化された二次試薬の使用が不要である。このため、前記標識化二次試薬の調製が不要であり、さらに、操作も簡便である。したがって、本発明によれば、検出感度に優れ、且つ、操作が簡便な検出対象物の検出を実現できる。
【符号の説明】
【０１３７】
１ 固相
１１ 一次抗体
１２ 検出対象抗原
１３ 二次抗体
１４ 核酸アプタマー
１５ 増幅産物
２１ 複合体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象物の検出方法およびそれに用いる検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中の検出対象物を検出する方法として、例えば、抗原抗体反応を利用したＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法が利用されており、特に、サンドイッチＥＬＩＳＡ法が汎用されている（非特許文献１）。前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、例えば、検出対象物が抗原の場合、前記抗原に結合可能な一次抗体と、前記抗原に結合可能であり且つ酵素で標識化された二次抗体を使用して、以下のように行うことができる。まず、前記一次抗体を固定化した反応容器に、前記抗原を含む検体を添加する。すると、前記固定化一次抗体と前記抗原との間で抗原抗体反応が起こり、前記固定化一次抗体に前記抗原が結合する。そして、前記未反応の抗原を除去した後、さらに、前記反応容器に、前記標識化二次抗体を添加する。この標識化二次抗体と前記固定化一次抗体に結合した前記抗原との間で抗原抗体反応が起こり、前記抗原に前記標識化二次抗体が結合して、複合体が形成される。この複合体では、抗原を前記一次抗体と前記二次抗体とが挟み込む状態となる。そして、前記未反応の前記標識化二次抗体を除去した後、前記標識化二次抗体における標識酵素の基質を添加して、酵素反応を行う。この酵素反応による発色や発光のシグナルを検出することで、前記複合体形成に関与した前記抗原を検出することができる。前記シグナルは、前記複合体を構成する前記抗原の量と相関性を示すことから、間接的に、前記固定化一次抗体と前記標識化二次抗体とにより複合体形成に関与した抗原量を算出できる。
【０００３】
しかしながら、このＥＬＩＳＡ法は、検出限界が、ｎｍｏｌ／Ｌからｐｍｏｌ／Ｌオーダーである。また、工程数も多く、操作が煩雑である。このため、例えば、ｆｍｏｌ／Ｌオーダーの低量の検出対象物を検出可能な検出感度に優れる簡便な検出系の開発が望まれている。
【０００４】
そこで、前述のＥＬＩＳＡ法と核酸増幅法とを組み合わせた新たな検出系として、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法が注目されている（非特許文献２）。Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲは、前記酵素で標識化した二次抗体に代えて、核酸で標識化した標識化二次抗体を使用する方法である。具体的には、前述のＥＬＩＳＡ法と同様に、固定化一次抗体に検出対象物である抗原を結合させた後、前記固定化一次抗体に結合した抗原に、前記標識化二次抗体を結合させ複合体を形成させる。そして、未反応の前記標識化二次抗体を除去した後、前記標識化二次抗体の核酸を、ＰＣＲによって増幅させる。前記複合体における前記標識化二次抗体の核酸は、前記複合体を構成する前記抗原の量と対応するため、前記核酸の増幅産物を検出することで、前記抗原を検出することができる。このＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法によれば、例えば、前述のＥＬＩＳＡ法と比較して、例えば、感度が１０〜１０，０００倍に向上し、ｆｍｏｌ／Ｌオーダー以下の検出が可能である（非特許文献３）。
【０００５】
しかしながら、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの場合、実用化するには、核酸で標識化した二次抗体の準備が、非常に煩雑で困難であるという問題がある。前記標識化二次抗体は、例えば、検出対象物を抗原とする二次抗体に、増幅用の核酸を、化学結合等で結合することにより調製する。しかし、前記二次抗体に前記核酸を標識化するにあたっては、両者が結合するように、例えば、予め、前記核酸をビオチンで修飾し、前記二次抗体をアビジンやストレプトアビジンで修飾する必要があり、煩雑である。また、この修飾化の条件設定自体が、非常に手間がかかるという問題もある。さらに、調製した前記標識化核酸が前記二次抗体に結合しても、実際の核酸増幅の段階において、前記標識化二次抗体における核酸の増幅反応が確認できない場合がある。また、前記核酸で標識化された二次抗体と標識化できなかった二次抗体とが混在するため、例えば、核酸増幅反応の検出において、バックグラウンドが高くなるという問題がある。そして、このバックグラウンドの問題を回避するには、前記標識化二次抗体と前記未標識二次抗体との混合物から、前記標識化二次抗体を精製する必要があるが、前記両者は、核酸の有無が異なるのみであって、分離が困難である。さらに、前記標識化二次抗体は、前記検出対象物ごとに調製する必要がある。このため、前記検出対象物に応じた二次抗体ごとに、前述のような核酸増幅の問題がない標識化、および、未標識二次抗体との分離が必要であり、様々な検出対象物に利用することが困難である。また、化学修飾や試薬によって、抗体の有する結合活性が減少または消失するおそれもある。
【０００６】
他方、抗体に代わる分子として、検出対象物に結合可能な核酸からなる核酸アプタマーが報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。この核酸アプタマーを利用する検出方法としては、例えば、ＥＬＯＮＡ法（非特許文献５、６、７）等がある。前記ＥＬＯＮＡ法は、前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、前記標識化二次抗体に代えて、酵素で標識化した核酸アプタマーを使用する方法である。しかしながら、前記核酸アプタマーを酵素で標識化するには、前述のＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲと同様に、例えば、予め、前記核酸アプタマーをビオチンで修飾し、前記酵素をアビジン等で修飾する必要があり、標識二次抗体の調製自体が煩雑であり、修飾化の条件設定に手間がかかるという問題がある。また、前記核酸アプタマーのビオチン化により、例えば、アプタマーの結合能が減少または消失する問題がある。また、前記固定化一次抗体に結合した検出対象物に、十分量の核酸アプタマーを添加する必要があるため、コスト高が問題となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（１９７１）８，８７１−４．
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ．（１９９２）２５８，１２０−１２２．
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ．（１９９０）２４９，５０５−５１０．
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ．（１９９０）３４６，８１８−８２２．
【非特許文献５】Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．（２００４）７６，５６０５−５６１０．
【非特許文献６】Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）２０，４７３−４７７．
【非特許文献７】Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ．（２００８）３９０，９８９−１００７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明の目的は、検出感度に優れ、且つ、操作が簡便な新たな検出方法、ならびに、それに用いる検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の検出方法は、検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成する複合体形成工程、
前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する結合工程、
前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅する増幅工程、および、
前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の検出用キットは、検出対象物と結合可能な試薬に結合可能な核酸アプタマーを含み、本発明の検出方法に使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れた感度で、検出対象物の検出を行うことができる。また、本発明によれば、前記検出対象物に結合可能な二次試薬について、標識化が不要である。このため、操作も簡便に行うことができる。したがって、本発明によれば、検出感度に優れ、且つ、操作が簡便な検出対象物の検出を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の検出方法の一例において、各工程の概略を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の実施例１において、ＲＮＡアプタマーを用いたリアルタイムＰＣＲにおけるＲＮＡアプタマーＲ１８の分子数（コピー数）とＣｔ値との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例１において、ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる抗アクチンウサギＩｇＧの測定結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例２において、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによるヒトＶＥＧＦの測定結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例３において、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおける血清中ヒトＶＥＧＦの測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例４において作成した検量線を示すグラフであり、同図（Ａ）は、実施例１におけるＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる抗アクチンウサギＩｇＧの測定値を用いた検量線のグラフであり、同図（Ｂ）は、実施例２におけるサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによるヒトＶＥＧＦの測定値を用いた検量線のグラフである。
【図７】図７は、比較例において、ＥＬＩＳＡによるヒトＶＥＧＦの測定値を用いた検量線のグラフである。
【図８】図８は、配列番号４の塩基配列からなる核酸アプタマーの推定二次構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の検出方法は、前述のように、検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成する複合体形成工程、
前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する結合工程、
前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅する増幅工程、および、
前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明においては、前記検出対象物に結合した前記二次試薬に、前記核酸アプタマーを結合させ、前記核酸アプタマーの増幅によって検出対象物を検出することがポイントである。したがって、検出対象物の種類、一次試薬および二次試薬の種類、核酸アプタマーの種類は、何ら制限されない。
【００１５】
本発明の検出方法において、前記検出対象物が抗原の場合、前記一次試薬は一次抗体であることが好ましく、また、前記検出対象物が抗体の場合、前記一次試薬は一次抗原であることが好ましい。
【００１６】
本発明の検出方法において、前記二次試薬は二次抗体であることが好ましい。
【００１７】
本発明の検出方法において、前記一次試薬は、固相に固定化された固定化試薬であることが好ましい。
【００１８】
本発明の検出方法において、前記固相は、プレートまたはビーズであることが好ましい。
【００１９】
本発明の検出方法は、前記増幅工程に先立って、さらに、前記複合体における前記二次試薬に未結合の核酸アプタマーを除去する工程を含むことが好ましい。
【００２０】
本発明の検出方法において、前記複合体形成工程は、前記一次試薬に、前記検出対象物を反応させる工程と、前記検出対象物に、前記二次試薬を反応させる工程とを含むことが好ましく、前記一次試薬に前記検出対象物を反応させる工程の後に、前記検出対象物に、前記二次試薬を反応させる工程を行うことが好ましい。
【００２１】
本発明の検出方法において、前記アプタマーは、イムノグロブリンＧに結合可能なアプタマーであることが好ましく、前記イムノグロブリンＧは、ウサギ由来イムノグロブリンＧであることが好ましい。
【００２２】
本発明の検出方法において、前記核酸は、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましく、また、配列番号３および配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましい。
【００２３】
本発明の検出方法において、前記核酸増幅方法は、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ法）であることが好ましい。
【００２４】
以下に、本発明の検出方法について詳細に説明する。
【００２５】
本発明において、「結合」とは、例えば、会合、吸着等の意味も含む。また、「ポリヌクレオチド」とは、例えば、オリゴヌクレオチドの意味も含む。
【００２６】
（核酸アプタマー）
前記核酸アプタマーとは、特定の標的物質に特異的に結合可能な核酸分子であり、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸や、二本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸があげられる。前記核酸アプタマーが、後者の二本鎖核酸の場合、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖にすることが好ましい。前記核酸アプタマーは、例えば、自己アニーリングによる二次構造を有してもよく、前記二次構造としては、例えば、ステムループ構造があげられる。
【００２７】
本発明において、前記核酸アプタマーは、例えば、天然由来の核酸配列であってもよいし、合成した核酸配列であってもよい。合成方法は、何ら制限されず、例えば、ＤＮＡ合成機やＲＮＡ合成機により、ｄＮＴＰ等を材料として、末端塩基から化学合成する方法等があげられる。前記核酸アプタマーとしては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等があげられ、また、例えば、ＰＮＡ等のペプチド核酸を含んでもよい。前記核酸アプタマーは、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ等の天然核酸（非人工核酸）を含んでもよいし、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等の人工核酸を含んでもよい。
【００２８】
本発明において、前記核酸アプタマーは、前述のように、前記二次試薬に特異的に結合できればよいが、特に、前記一次試薬および検出対象物よりも、前記二次試薬に特異的に結合できることが好ましい。前記核酸アプタマーは、例えば、前記二次試薬の種類に応じて適宜調製できる。
【００２９】
前記核酸アプタマーの前記二次試薬に対する結合力は、特に制限されないが、例えば、解離定数（ＫＤ）が、１０μｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍｏｌ／Ｌ以下であり、特に好ましくは１ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００３０】
前記核酸アプタマーが結合する前記二次試薬の種類は、特に制限されないが、後述するように、例えば、抗体が好ましい。前記抗体としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の各種サブクラス（アイソタイプ）のイムノグロブリン（Ｉｇ）があげられる。また、前記抗体は、例えば、抗原を特異的に認識する、抗体の一部分または部分断片（以下、「抗体の機能的断片」ともいう）であってもよく、前記各種Ｉｇを酵素処理して得られる活性フラグメントがあげられる。前記活性フラグメントとしては、例えば、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、およびこれらの重合体等があげられる。前記抗体は、その由来も特に制限されず、例えば、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ラクダ、ロバ、ハムスター、モルモット等の哺乳動物、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類等があげられる。
【００３１】
前記核酸アプタマーが結合する前記二次抗体における結合部位は、特に制限されないが、例えば、Ｉｇの定常領域（Ｃ領域）内が好ましく、前記定常領域としては、例えば、可変領域（Ｖ領域）以外のＦａｂ領域やＦｃ領域等があげられる。前記定常領域は、例えば、Ｉｇのクラスごと、および、Ｉｇの由来生物ごとで、構造が類似している。したがって、具体例として、前記ウサギ由来ＩｇＧに結合可能な核酸アプタマーは、例えば、前記二次抗体における結合部位が定常領域であれば、異なる検出対象抗原に対する二次抗体であっても、同じ核酸アプタマーの使用が可能である。このため、検出対象物の種類ごとに、例えば、二次抗体だけでなく、核酸アプタマーを準備することが不要であり、より一層簡便、低コスト化を実現し、汎用性の高い検出が可能となる。なお、前記核酸アプタマーが結合する二次抗体は、一方で、検出対象物に特異的に結合可能であることが必要である。そこで、前記検出対象物が結合する前記二次抗体における結合部位は、例えば、Ｉｇの可変領域（Ｖ領域）内であることが好ましい。
【００３２】
前記核酸アプタマーの具体例を以下に例示するが、これらの例示によって、本発明は、何ら制限されない。前記二次試薬が、ウサギ由来のＩｇＧの場合、前記核酸アプタマーとしては、例えば、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を含む核酸があげられる。配列番号１および配列番号２の塩基配列において、両配列の異なる塩基のみに下線を付した。
（配列番号１）
5’- uucgauacgc cgugggguga cguuggcugc‐3’
（配列番号２）
5’- uucgauacgc cgugggguga cguuggcuac‐3’
【００３３】
また、前記核酸アプタマーとしては、前記配列番号１で表される塩基配列を含む核酸として、配列番号３で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸、前記配列番号２で表わされる塩基配列を含む核酸として、配列番号４で表わされる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。下記配列番号３および配列番号４の塩基配列において、下線部は、それぞれ、前記配列番号１および配列番号２の塩基配列に相当する。また、下記配列４に示す核酸アプタマーの推定二次構造を、図８に示す。
（配列番号３）
5’- gggagaauuc cgaccagaag uucgauacgc cgugggguga cguuggcugc ccuuuccucu cuccuccuuc uucu‐3’
（配列番号４）
5’- gggagaauuc cgaccagaag uucgauacgc cgugggguga cguuggcuac ccuuuccucu cuccuccuuc uucu‐3’
【００３４】
これらの他に、前記核酸アプタマーとしては、例えば、下記配列番号５〜９からなる群から選択された少なくとも一つの配列番号で表わされる塩基配列または前記塩基配列を含む核酸があげられる。下記配列番号５の塩基配列において、下線部は、前記配列番号１の塩基配列に相当する。なお、これらの配列番号１〜９の塩基配列において、ＵはＴであってもよい。
（配列番号５）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaaga aguucgauac gccguggggu gacguuggcu gcccuuuccu cucuccuccu ucuucu‐3’
（配列番号６）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagu uuuuaaaccg cgccuuggaa gcguacguug gccuuuccuc ucuccuccuu cuucu‐3’
（配列番号７）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagc aaauugccgg gccuuggaag ccaagucgcu uuccucucuc cuccuucuuc u‐3’
（配列番号８）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagc gcaagccggc ccuuggaagg cuagucgguc uuuccucucu ccuccuucuu cu‐3’
（配列番号９）
5’-aguaauacga cucacuauag ggagaauucc gaccagaagu ucgauacgcc guggggugac guuggcuacc uuuccucucu ccuccuucuu cu‐3’
【００３５】
前記ウサギ由来ＩｇＧに対する核酸アプタマーは、例えば、前記ウサギＩｇＧに特異的に結合可能である限りにおいて、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなる核酸であってもよい。置換、付加、挿入もしくは欠失した前記塩基の数は、例えば、数個、好ましくは、１個〜２０個の範囲である。また、前記核酸アプタマーは、例えば、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸において、前記各塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなる核酸であってもよい。前記相同性は、例えば、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。また、前記核酸アプタマーは、例えば、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸において、前記各塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸であってもよい。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。
【００３６】
また、前記ウサギ由来ＩｇＧに対する核酸アプタマーは、例えば、前記配列番号（１）〜（９）の塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸と、実質的に同一な推定構造または構造モチーフを有する核酸であってもよい。前記「実質的な推定構造または構造モチーフを有する」とは、例えば、核酸の二次構造および二次構造のモチーフを予測するプログラムを使用し、複数の配列を含む配列群に見出される一定の同一性を有することを意味する。一定の同一性とは、例えば、配列間の相同性が７０以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上であり、特に好ましくは９９％以上である。前記プログラムとしては、例えば、Ｚｕｋｅｒｆｏｌｄプログラム等があげられる。
【００３７】
前記核酸アプタマーの製造方法は、特に制限されず、例えば、公知のＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法等があげられる。
【００３８】
ＳＥＬＥＸ法による核酸アプタマーの調製は、特に制限されないが、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、複数の核酸を含む核酸プールを準備し、前記核酸ライブラリーと標的物質である二次試薬とを結合（会合）させ、前記核酸プールと前記二次試薬との複合体を形成する。そして、前記複合体から、前記複合体の形成に関与した核酸プローブのみを回収することにより、前記二次試薬に特異的に結合可能な核酸アプタマーを調製できる。以下に、一例として、ＳＥＬＥＸ法を用いて、前記二次試薬に特異的に結合可能な核酸アプタマーを調製する方法をあげるが、本発明は、これらには何ら制限されない。
【００３９】
前記核酸プールとは、例えば、ランダム領域を有する核酸のライブラリー（混合物）である。前記ライブラリーにおける前記核酸は、例えば、ＲＮＡやＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記ランダム領域とは、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、および、ＵまたはＴの塩基をランダムに連結した領域であり、その長さは、例えば、２０〜１２０ｍｅｒである。前記核酸プールは、例えば、４２０〜４１２０種類（約１０１２〜１０７２種類）の核酸を含むことが好ましく、より好ましくは、４３０〜４６０種類（約１０１８〜１０３６種類）である。
【００４０】
前記核酸プールに含まれる前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記ランダム領域を有していればよく、その他の構造は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドは、前記ランダム領域に加えて、例えば、前記ランダム領域の５’末端および３’末端の少なくとも一方に、後述する核酸増幅で利用するプライマー領域、ポリメラーゼが認識するポリメラーゼ認識領域等を有することが好ましい。前記ポリメラーゼ認識領域は、例えば、アプタマー調製における後述の核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、前記ポリメラーゼの認識領域は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識領域」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識領域であるＴ７プロモーター等があげられる。前記ＲＮＡプールの具体例としては、例えば、５’末端側から、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と前記プライマー領域（以下、「５’末端側プライマー領域」ともいう）とを、この順序で連結し、前記５’末端側プライマー領域の３’末端側に、前記ランダム領域を連結し、さらに、前記ランダム領域の３’末端側にプライマー領域（以下、「３’末端側プライマー領域」ともいう）を連結した構造があげられる。前記ＲＮＡにおける前記５’末端側プライマー領域とは、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’末端に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、前記ＲＮＡプールは、例えば、さらに、標的物質である二次試薬への結合を補助する領域を有してもよい。また、前記核酸プールに含まれるポリヌクレオチドは、それぞれ、異なるランダム領域を有してもよいし、一部の配列が共通するランダム領域を有してもよい。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各領域は、例えば、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。
【００４１】
前記核酸プールの調製方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、例えば、ＤＮＡを含む初期プールを使用し、前記ＤＮＡを鋳型として調製できる。以下、核酸プールのＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ鎖をアンチセンス鎖、前記ＲＮＡのＵをＴに置換した配列を有するＤＮＡ鎖をセンス鎖ともいう。前記ＤＮＡを含む初期プールとしては、例えば、前記ＲＮＡプールにおける前記ランダム領域の相補鎖のＵをＴに置換したＤＮＡ（アンチセンス鎖）、および、前記ランダム領域のＵをＴに置換した配列を有するＤＮＡ（センス鎖）のいずれか一方を含むことが好ましい。この初期プールのＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行うことにより、ＲＮＡの核酸プールを調製できる。
【００４２】
また、前記ランダム領域のＵをＴに置換したＤＮＡを含む初期プールを準備し、これを鋳型として、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と、前記５’末端側プライマー領域に相補的な配列とを含むプライマーをアニーリングさせ、核酸増幅を行うことにより、ＲＮＡの核酸プールを調製することもできる。
【００４３】
そして、前記核酸プールと標的物質とを反応させ、前記核酸と前記標的物質との複合体を形成する。本発明においては、前記核酸アプタマーとして、前記二次試薬に特異的に結合する核酸アプタマーを使用することから、前記標識物質は、二次試薬が好ましい。前記アプタマーの調製において、前記核酸プールと反応させる前記二次試薬は、例えば、二次試薬そのものであってもよいし、二次試薬の分解物であってもよい。具体例としては、前記二次試薬が、後述するような抗体の場合、例えば、Ｉｇ等の抗体そのものであってもよいし、前記各種Ｉｇを酵素処理して得られる、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の前記Ｉｇの活性フラグメント等であってもよい。前記核酸プールと前記二次試薬との結合形式は、特に制限されず、例えば、水素結合等の分子間力等があげられる。前記核酸プールと前記二次試薬との結合処理は、例えば、前記両者を溶媒中で一定期間インキュベートする方法があげられる。前記溶媒としては、特に制限されないが、前記両者の結合等が保持されるものが好ましく、例えば、各種緩衝液があげられる。
【００４４】
続いて、前記核酸プールと標的物質との複合体を回収する。なお、前記複合体形成のために前記両者を反応させた反応液には、前記複合体の他に、例えば、前記複合体形成に関与しない核酸プール（以下、「未反応核酸プール」という）が含まれる。このため、例えば、前記反応液から、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを、分離することが好ましい。前記分離方法としては、特に制限されないが、例えば、前記標的物質と前記核酸プールとの吸着性の違いや、前記複合体と前記核酸プールとの分子量の違いを利用する方法等があげられる。
【００４５】
前者の吸着性の違いを利用する方法としては、例えば、以下の方法が例示できる。すなわち、まず、前記標的物質に吸着性を有する担体と、前記複合体を含む前記反応液とを接触させる。この際、前記未反応核酸プールは、前記担体に吸着せず、他方、前記標的物質と前記核酸プールとの複合体は、前記担体に吸着する。これによって、前記未反応核酸プールと前記複合体とを分離することができる。そして、前記未反応核酸プールを除去後、前記担体に吸着した前記複合体を回収すればよい。また、前記担体から前記複合体を回収する前に、例えば、前記未反応核酸プールを十分に除去するため、前記担体を洗浄することが好ましい。前記標的物質に吸着性を有する担体としては、特に制限されず、例えば、標的物質である二次試薬の種類に応じて適宜選択できる。前記標的物質である二次試薬が、例えば、抗体等のタンパク質の場合、前記吸着性を有する担体としては、例えば、ニトロセルロース膜等があげられる。
【００４６】
後者の分子量の違いを利用する方法としては、例えば、担体を使用する方法が例示できる。前記担体としては、例えば、前記核酸プールが通過し且つ前記複合体が通過できないようなサイズのポアを有する担体があげられる。このような担体を利用して、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを分離できる。前記分離は、例えば、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルを用いた電気的な分離であってもよい。
【００４７】
この他にも、例えば、前記複合体の形成時において、担体に固定化した二次試薬を使用する方法もあげられる。すなわち、前記二次試薬を予め担体に固定化し、前記担体と前記核酸プールとを接触させ、前記固定化二次試薬と核酸プールとの複合体を形成させる。そして、前記固定化二次試薬に結合していない未反応の核酸プールを除去した後、前記担体から、前記二次試薬と前記核酸プールとの複合体を解離させればよい。前記二次試薬の担体への固定化方法は、何ら制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、前記二次試薬にタグを結合しておき、前記タグとの結合基を有する担体に、前記タグを結合した二次試薬を接触させる方法があげられる。前記タグとしては、例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇ等があげられ、前記結合基としては、例えば、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）等の金属イオンがあげられる。前記担体の具体例としては、例えば、前記金属イオンをベースとするＮｉ−アガロース、Ｎｉ−セファロース等があげられる。
【００４８】
つぎに、回収した前記複合体から、前記複合体形成に関与した核酸プールを回収する。前記複合体形成に関与した核酸プールは、例えば、前記複合体について、前記標的物質と核酸プールとの結合を解除することによって回収できる。
【００４９】
続いて、回収した前記複合体形成に関与した核酸プールについて、核酸増幅を行う。前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、核酸プールの種類に応じて、公知の方法により行うことができる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によりＤＮＡの核酸増幅を行い、得られた増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡの転写を行うことができる。これによって、前述の前記複合体形成に関与したＲＮＡプールの増幅を行うことができる。
【００５０】
前記ＲＮＡプールが、例えば、前述のように、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域、前記５’末端側プライマー領域、前記ランダム領域および前記３’末端側プライマー領域を有する場合、これらの領域を利用する増幅方法があげられる。前記ＲＮＡを鋳型として前記ｃＤＮＡを調製するための逆転写反応では、例えば、プライマーとして、前記ＲＮＡプールの３’末端側プライマー領域に相補的な配列を含むポリヌクレオチドを使用することが好ましい。また、前記ｃＤＮＡを鋳型とするＤＮＡの増幅には、例えば、プライマーとして、前記５’末端側プライマー領域を含むポリヌクレオチドと、前記３’末端側プライマー領域の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有し、その３’側に、前記５’末端側プライマー領域を有することが好ましい。得られたＤＮＡの増幅産物を鋳型とするＲＮＡの増幅には、前記ＤＮＡ増幅産物を鋳型として、前記ＤＮＡに含まれる５’末端側プライマー領域および３’末端側プライマー領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅を行う。この際、プライマーとしては、例えば、前記５’末端側プライマー領域を含むポリヌクレオチドと、前記３’末端側プライマー領域の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有し、その３’側に、前記５’末端側プライマー領域を有することが好ましい。そして、得られた増幅産物を鋳型として、前記増幅産物に含まれるＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写反応を行うことによって、前記複合体形成に関与するＲＮＡプールの核酸増幅を行うことができる。増幅産物のうち、例えば、アンチセンス鎖のＤＮＡは、その３’末端側に、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有するため、この領域に前記ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが結合し、前記アンチセンス鎖を鋳型として、前記ＲＮＡを合成できる。前記逆転写反応に使用するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されないが、例えば、トリ骨髄芽球症ウィルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）等が使用できる。
【００５１】
なお、前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法や、各種等温増幅法等が採用できる。また、その条件も、特に制限されない。
【００５２】
このように、標的物質と複合体を形成した核酸プールを回収し、さらに、前述と同様にして、標的物質を用いた複合体の形成、複合体の回収、前記複合体形成に関与した核酸プールの分離、前記分離した核酸プールの増幅等を繰り返し行うことで、最終的に、標的物質である二次試薬に結合性を有する核酸アプタマーを得ることができる。
【００５３】
（一次試薬および二次試薬）
本発明において、前述のように、前記一次試薬は、前記検出対象物と結合可能な試薬であり、前記二次試薬は、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な試薬である。前記一次試薬および二次試薬は、それぞれ前記検出対象物と結合可能であればよく、その種類は、何ら制限されない。また、前記検出対象物の種類も、何ら制限されない。
【００５４】
本発明において、前記検出対象物と前記一次試薬との組み合わせ、および、前記検出対象物と前記二次試薬との組み合わせは、それぞれ特に制限されず、前記検出対象物と前記一次試薬および前記二次試薬とがそれぞれ結合可能であればよい。このような結合可能な組合せとしては、特に制限されないが、例えば、抗原と抗体、リガンドとレセプター、レクチンとそのレセプター、レクチンと糖鎖等の組み合わせがあげられ、いずれが検出対象物であってもよく、いずれが前記一次試薬および二次試薬であってもよい。また、前記一次試薬および前記二次試薬は、例えば、非核酸物質であることが好ましい。これらの中でも、組み合わせとしては、抗原と抗体との組み合わせが好ましく、例えば、前記検出対象物と前記一次試薬、前記検出対象物と前記二次試薬とが、それぞれ、抗原抗体反応で結合し、前記複合体を形成することが好ましい。このように、抗原と抗体との組み合わせであれば、いわゆる抗原抗体反応に基づくサンドイッチ法を利用することができる。なお、抗原とは、例えば、抗体に結合可能な抗原性を有する物質である。このため、本発明における抗原は、例えば、他の抗体に結合可能な抗原性を有していれば、他の抗原に結合可能な抗体であってもよい。
【００５５】
前記検出対象物と前記一次試薬との組み合わせ、および、前記検出対象物と前記二次試薬との組み合わせが、抗原と抗体との組み合わせの場合、前記一次試薬および前記二次試薬は、例えば、前記検出対象物の種類に応じて、以下の組み合わせがあげられる。前記検出対象物が抗原の場合、前記一次試薬は、前記検出対象物である前記抗原と結合可能な一次抗体が好ましく、前記二次試薬は、前記一次抗体とは別の部位で前記検出対象物である前記抗原と結合可能な二次抗体があげられる。一方、前記検出対象物が抗体の場合、前記一次試薬は、前記検出対象抗体と結合可能な一次抗原が好ましく、前記二次試薬は、前記検出対象抗体を抗原として結合可能な二次抗体があげられる。このような組合せによれば、例えば、前記検出対象物と前記一次試薬とが結合し、さらに、前記結合物における前記検出対象物に前記二次試薬が結合することで、複合体を形成できる。
【００５６】
本発明において、前記抗原とは、例えば、ハプテン等の意味も含む。
【００５７】
本発明において、前記抗体とは、特に制限されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のＩｇがあげられる。また、本発明において、前記抗体は、例えば、前記Ｉｇには制限されず、例えば、Ｉｇを酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の活性フラグメントであってもよい。本発明において、前記抗体は、例えば、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００５８】
また、前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。前記検出対象物が抗原の場合、例えば、検出精度を向上できることから、前記一次抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、前記二次抗体は、例えば、検出精度を向上できることから、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００５９】
前記一次抗体および二次抗体の調製方法は、特に制限されず、公知の方法があげられる。前記方法としては、例えば、動物への免疫感作を行う方法が一般的である。免疫感作させる宿主動物の種類は、特に制限されず、例えば、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ラクダ、ロバ、ハムスター、モルモット等の哺乳動物、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類等が使用できる。また、前記宿主動物に対する抗原の投与方法も、特に制限されず、例えば、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等が採用できる。そして、例えば、血清や腹水を回収することによって、目的の抗体を得ることができる。前記抗体は、例えば、前記血清や腹水をそのまま使用してもよいが、公知の方法により精製して使用することが好ましい。前記精製方法としては、特に制限されず、硫酸ナトリウムや硫酸アンモニウム等を用いる塩析法、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、分子ふるいクロマトグラフィー法、電気泳動法等があげられる。
【００６０】
前記一次抗体または二次抗体としてポリクローナル抗体を調製する場合は、前述のような免疫感作を行うことが好ましい。他方、前記一次抗体または二次抗体としてモノクローナル抗体を調製する場合は、例えば、免疫した宿主動物における脾臓細胞やリンパ球様細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを融合してハイブリドーマを調製することが好ましい。そして、前記ハイブリドーマを増殖させ、特異性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を単離することによって、モノクローナル抗体を得ることができる。
【００６１】
前記一次試薬は、例えば、固相に固定化された固定化試薬であることが好ましい。前記一次試薬を固定化することで、例えば、前記固定化された一次試薬に検出対象物を結合させた後、未反応の検出対象物の除去、不純物の除去、洗浄等が容易である。また、固定化された前記一次試薬に、さらに、前記二次試薬を結合させた後も、同様に、未反応の二次試薬の除去や洗浄が容易である。これによって、本発明の検出方法の精度を、さらに向上できる。
【００６２】
前記固相の形態としては、特に制限されず、例えば、ウェルプレート、マイクロプレート等のプレート、セルロース膜等のメンブレン、フィルム、試験管やマイクロチューブ等のチューブ、マイクロスフェアやビーズ等の粒子等があげられる。
【００６３】
前記固相は、例えば、不溶性であることが好ましい。前記不溶性材料としては、特に制限されないが、例えば、有機樹脂材料、無機材料等があげられる。前記有機樹脂材料は、例えば、天然物でもよく、合成物でもよく、具体例としては、アガロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、ポリスチレン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂、ポリフッ化ビニル、ポリアミンメチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、６−ナイロン、６，６−ナイロン、ラテックス等があげられる。前記無機材料としては、例えば、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂等があげられる。前記固相は、例えば、前記不溶性材料のいずれか一種類を含んでもよいし、二種類以上を含んでもよい。
【００６４】
前記固相が前記粒子の場合、例えば、磁性粒子が好ましい。前記固相が磁性粒子であれば、例えば、磁力によって、固定化された前記一次試薬に前記検出対象物が結合した前記磁性粒子や、前記検出対象物にさらに前記二次試薬が結合した前記磁性粒子を、容易に回収できる。
【００６５】
前記一次試薬は、例えば、前記固相に、直接結合してもよいし、間接的に結合してもよい。また、前記一次試薬の前記固相への固定化は、例えば、物理的な結合でも化学的な結合でもよく、具体例としては、吸着、共有結合等の化学結合等があげられる。
【００６６】
前記固相への前記一次試薬の固定化方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記方法としては、例えば、前記一次試薬を含む液体に、前記固相を浸漬する方法があげられる。前記液体は、例えば、前記一次試薬を溶媒に、溶解、分散または懸濁することによって調製できる。前記溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられ、前記緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、Ｇｏｏｄの緩衝液、ホウ酸緩衝液等があげられる。前記一次試薬を含む液体のｐＨは、特に制限されないが、例えば、７〜１０であることが好ましく、より好ましくは９．５である。浸漬条件は、特に制限されないが、例えば、温度４〜３７℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。
【００６７】
前記固相は、例えば、固定化させる一次試薬の種類に応じて、前記一次試薬を効率よく固定化するための前処理を施してもよい。前記前処理としては、例えば、前記一次試薬の官能基と結合可能な官能基を前記固相に付加する処理があげられる。また、前記一次試薬についても、例えば、前記固相の種類に応じて、効率良く固定化するための前処理を施してもよい。前記前処理としては、例えば、前記固相の官能基と結合可能な官能基を前記一次試薬に付加する処理があげられる。
【００６８】
また、前記固相は、例えば、前記一次試薬を固定化した後、必要に応じてブロッキング処理を施してもよい。前記固相の表面をブロッキング処理することによって、例えば、前記固相に対する前記二次試薬の非特異的な結合を抑制し、検出精度をさらに向上することができる。前記ブロッキングに使用する試薬は、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、脱脂粉乳等のブロッキング剤があげられる。
【００６９】
本発明においては、前記二次試薬としては、前述のＥＬＩＳＡ法やＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法とは異なり、例えば、未標識二次試薬が使用できる。このため、例えば、前記二次試薬の標識化処理や、未標識二次試薬と標識化二次試薬との分離等が不要である。これにより、例えば、より簡便な試薬調製が可能であり、未標識二次試薬の混在によるバックグラウンドの上昇を防止できる。
【００７０】
（検出対象物）
本発明においては、前記一次試薬と検出対象物と二次試薬との複合体に前記核酸アプタマーを結合させ、その核酸増幅により、前記検出対象物を間接的に検出することが特徴である。このため、本発明において、前記検出対象物の種類は、何ら制限されず、例えば、イオン、低分子化合物、無機化合物、有機化合物、ホルモン、ペプチド、タンパク質、糖類、脂質、ウィルス、細菌、細胞、生体組織等があげられる。
【００７１】
（核酸増幅法）
本発明において、核酸増幅法は、何ら制限されず、前記核酸アプタマーを増幅できる方法が採用できる。前記核酸アプタマーが、例えば、ＲＮＡアプタマーの場合、前記ＲＮＡアプタマーを鋳型として、逆転写反応によりＤＮＡを合成し、前記ＤＮＡを鋳型として増幅する方法があげられる。また、前記核酸アプタマーが、例えば、ＤＮＡアプタマーの場合、前記ＤＮＡアプタマーを鋳型として増幅する方法があげられる。前記核酸増幅法の具体例としては、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法や、等温増幅法等があげられる。また、前記核酸増幅反応の条件も何ら制限されない。
【００７２】
つぎに、本発明の検出方法について、抗原抗体反応を利用する形態の例を以下に示す。なお、本発明は、これらには何ら制限されない。
【００７３】
（第１の実施形態）
本実施形態は、検出対象物が抗原であり、一次試薬が固定化一次抗体、二次試薬が二次抗体である形態の一例である。なお、前述のように、前記一次抗体は、前記抗原に特異的に結合可能な抗体であり、前記二次抗体は、前記一次抗体とは異なる部位で前記抗原に特異的に結合可能な抗体である。
【００７４】
本実施形態について、図１を用いて説明する。図１は、本実施形態における検出方法の一例を示す概略図である。
【００７５】
まず、図１（Ａ）に示すように、固定化した一次抗体１１を準備する。前記固定化一次抗体１１は、前述のように、固相１に一次抗体１１が固定化されていればよく、例えば、前記固相の種類、固相への一次抗体の結合方法等は、何ら制限されない。
【００７６】
つぎに、前記固定化一次抗体に検体を接触させる。前記検体が検出対象抗原を含む場合、図１（Ｂ）に示すように、前記固定化一次抗体１１に前記検体中の検出対象抗原１２が結合する。なお、本発明において、前記固定化一次抗体１１は、前記検出対象抗原１２に対する抗体であればよく、所望の検出対象物に応じて、例えば、適宜調製したり、市販の抗体を使用することができる。
【００７７】
前記固定化と検出対象抗原との処理条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、処理時間は、例えば、５〜１２０分であり、好ましくは１５〜６０分である。
【００７８】
１反応系における前記一次抗体の量は、特に制限されず、例えば、添加する検体の量等に応じて適宜決定できる。具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記一次抗体は、例えば、０．１ピコモル〜１０ピコモルであることが好ましく、より好ましくは０．２ピコモル〜５ピコモルであり、特に好ましくは０．４ピコモル〜２ピコモルである。
【００７９】
前記検体としては、特に制限されず、前記検出対象抗原を含有すると考えられる検体があげられる。前記検体としては、例えば、生物由来検体や、環境由来検体、人為的な検体等があげられる。前記生物由来検体としては、例えば、ヒト等の哺乳類、鳥類、魚類、昆虫類、細菌や菌類等の微生物類等があげられる。前記環境由来検体としては、例えば、海水、土壌、下水等の排水等があげられる。人為的な検体としては、例えば、食品、飲料、合成物等があげられる。また、前記検体は、例えば、希釈された検体であってもよい。前記検体の形態は、特に制限されず、例えば、液体状、ゲル状、固体状、粉末状等があげられるが、前記一次抗体との接触性に優れることから、液体であることが好ましい。
【００８０】
前記検体を希釈する場合、その溶媒は、特に制限されないが、例えば、蒸留水等の水、生理食塩水、緩衝液等があげられ、前記緩衝液としては、例えば、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等があげられる。また、前記溶媒は、例えば、界面活性剤、塩等の添加剤を含んでもよい。前記界面活性剤としては、特に制限されず、例えば、Ｔｗｅｅｎ系等の非イオン性界面活性剤等があげられ、前記塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム等があげられる。
【００８１】
つぎに、前記一次抗体に結合した前記検出対象抗原に、さらに、二次抗体を接触させる。これにより、図１（Ｃ）に示すように、前記検出対象抗原１２に前記二次抗体１３が結合し、前記一次抗体１１と検出対象抗原１２と前記二次抗体１３とが結合した複合体２１が形成される。なお、本発明において、前記二次抗体は、前記検出対象抗原に対する抗体であればよく、所望の検出対象抗原に応じて、例えば、適宜調製したり、市販の抗体を使用することができる。
【００８２】
前記二次抗体と検出対象抗原との処理条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、処理時間は、例えば、５〜１２０分であり、好ましくは１５〜６０分である。また、前記二次抗体は、例えば、前記検出対象抗原との接触性に優れることから、前記二次抗体を含む液体として添加することが好ましい。前記液体は、例えば、前記二次抗体を溶媒に添加することで調製でき、前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、前述と同様の、水や緩衝液等の溶媒が使用できる。
【００８３】
１反応系における前記検体の添加量は、特に制限されないが、具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記検体の添加量は、例えば、１０〜１８０μＬであることが好ましく、より好ましくは２０〜１００μＬであり、特に好ましくは４０〜６０μＬである。
【００８４】
続いて、前記複合体に、前記二次抗体に特異的に結合可能な核酸アプタマーを接触させる。これにより、図１（Ｄ）に示すように、前記複合体２１における前記二次抗体１３に、前記核酸アプタマー１４が結合する。なお、本発明において、前記核酸アプタマーは、前記二次抗体に結合可能な抗体であればよく、所望の二次抗体に応じて、例えば、適宜調製したり、市販の核酸アプタマーを使用することができる。
【００８５】
前記複合体と前記核酸アプタマーとの処理条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、処理時間は、例えば、５〜１２０分であり、好ましくは１５〜６０分である。
【００８６】
１反応系における前記核酸アプタマーの量は、特に制限されず、例えば、前記一次抗体および前記二次抗体の添加量等に応じて適宜決定できる。具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記核酸アプタマーの添加量は、例えば、６×１０８〜６×１０１１分子（コピー数）であることが好ましく、より好ましくは６×１０９〜６×１０１０分子であり、特に好ましくは６×１０９分子である。
【００８７】
前記核酸アプタマーには、例えば、前記複合体への接触に先立って、変性処理を施してもよい。これによって、例えば、核酸同士のアニーリングを解除し、再び自己アニーリングして、目的の二次構造を形成することができる。前記変性処理の条件は、特に制限されないが、核酸アダプターの自己アニーリングを解除し、一本鎖核酸となる条件が好ましく、具体例としては、処理温度は、例えば、６５〜９５℃であり、好ましくは、７０〜９５℃であり、処理時間は、例えば、１〜３０分であり、好ましくは２〜５分である。
【００８８】
続いて、前記核酸アプタマーの増幅を行い、増幅産物を検出することで、検体中の検出対象物の検出を行う。前述のように、前記一次抗体と検出対象物と前記二次抗体との複合体が形成された場合、前記複合体の二次抗体には核酸アプタマーが結合している。このため、核酸増幅反応を行えば、図１（Ｅ）に示すように、前記二次抗体１３を介して前記複合体２１に結合した前記核酸アプタマー１４が増幅し、前記核酸アプタマー１４の増幅産物１５が得られる。前記核酸アプタマーの増幅は、前記検出対象物の存在を示し、前記増幅の程度が、前記検出対象物の量を示す。このため、本実施形態によれば、前記複合体における前記二次抗体に結合した核酸アダプターの増幅のみで、検出対象物の検出が可能であることから、操作を簡便に行うことができる。
【００８９】
前述のように、核酸アプタマーの増幅方法は、何ら制限されず、前記核酸アプタマーの種類に応じて適宜決定することができる。前記核酸アプタマーがＲＮＡアプタマーの場合、逆転写反応の後、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅を行うことが好ましく、具体例としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲがあげられる。前記核酸アプタマーがＤＮＡアプタマーの場合には、前記ＤＮＡアプタマーを鋳型として増幅を行うことが好ましく、具体例としては、ＰＣＲがあげられる。
【００９０】
前記核酸増幅は、例えば、プライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を用いて行うことができる。前記プライマーは、例えば、核酸アプタマーの種類や配列等に応じて適宜決定できる。前記ポリメラーゼは、例えば、核酸アプタマーの種類に応じて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等が使用できる。また、その他にも、核酸増幅に使用できる各種試薬を使用できる。
【００９１】
前記増幅産物の検出は、その目的に応じて、例えば、増幅産物の有無の検出（いわゆる定性）でもよいし、増幅産物の量の測定（いわゆる定量）であってもよい。
【００９２】
前記増幅産物の検出方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。検出方法としては、例えば、得られた増幅産物そのものを直接的に検出する方法と、得られた増幅産物を間接的に検出する方法とがあげられる。前記直接的な検出方法としては、例えば、反応系について、核酸に特異的な波長（２６０ｎｍ）における吸光度を測定する方法、反応系の電気泳動等を行う方法があげられる。前者の場合、例えば、反応開始から所定期間経過後に、反応系について前記波長の吸光度上昇が検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、吸光度の大きさによって、増幅産物の量を判断できる。また、後者の場合、反応開始から所定期間経過後に、反応液について、前記核酸アプタマーに対応する増幅産物の大きさを示す部分にバンドが検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、バンドの強度によって、増幅産物の量を判断できる。他方、間接的な検出方法としては、例えば、インターカレーターを使用する方法、５’末端が蛍光色素および３’末端がクエンチャーで標識化されたプローブを使用する方法等があげられる。前者の方法において、前記インターカレーターは、例えば、二本鎖核酸に挿入されて蛍光発光する化合物であり、具体例としては、ＳＹＢＲ（商標）ＧｒｅｅｎＩ等があげられる。この方法によると、鋳型の相補鎖が合成されると、前記鋳型と相補鎖とが二本鎖を形成し、前記二本鎖に前記インターカレーターが挿入し、蛍光を発する。したがって、例えば、反応開始から所定期間経過後に、反応系について、蛍光の発光が検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、蛍光強度によって、増幅産物の量を判断できる。また、後者の方法において、前記プローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブ等があげられる。一例として、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを用いた方法によると、例えば、前記プローブが鋳型に結合している際は、前記プローブの５’末端側の前記蛍光色素は３’末端側の前記クエンチャーにより蛍光が消光されている。しかし、鋳型にプライマーが結合し、伸長反応が進むことによって、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼが前記プローブに近づくと、前記プローブは、５’末端側から切断され、５’末端側の蛍光色素が遊離する。このため、前記クエンチャーによる消光効果が解除され、前記蛍光色素が発光する。したがって、前記蛍光色素の発光が検出されれば、増幅したことが確認でき、さらに、蛍光強度によって、増幅産物の量を判断できる。
【００９３】
前記増幅産物の検出において、前記増幅産物量は、例えば、増幅産物量そのものであってもよいし、前述のような、前記増幅産物量と相対関係を示す、吸光度（吸収強度）、蛍光強度等であってもよい。
【００９４】
前記増幅産物の検出は、例えば、経時的な検出（いわゆるリアルタイム検出）が好ましい。前記リアルタイム検出は、例えば、断続的に行ってもよいし、連続的に行ってもよい。前記断続的な検出としては、例えば、増幅反応の開始時と、開始時から所望の一定時間経過時とにおける検出があげられる。この検出によれば、開始時から一定時間の間に得られた増幅産物を検出することができる。また、前記連続的な検出は、例えば、一定時間経過ごとに検出するコンスタントな検出であってもよいし、ランダムな検出であってもよい。中でも、例えば、一定時間ごとの増幅産物の増加程度が確認できることから、コンスタントな検出であることが好ましい。本発明においては、具体例として、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ等が好ましい。
【００９５】
以上のように、前記複合体に結合した前記核酸アプタマーの増幅を検出することによって、間接的に、前記複合体における検出対象抗原の有無または量を判断することができる。
【００９６】
本実施形態は、例えば、さらに、各結合反応の後、未反応物質を除去する工程を含んでもよい。具体的には、例えば、前記一次抗体と検体との反応後、未反応の検出対象抗原を除去する工程を有してもよく、前記一次抗体に結合した検体と二次抗体との反応後、未反応の前記二次抗体を除去する工程を有してもよく、また、前記二次抗体と核酸アプタマーとの反応後、未反応の前記核酸アプタマーを除去する工程を有してもよい。本実施形態においては、前記一次抗体が固相に固定化されているため、例えば、前記固相の洗浄により、容易に、未反応物質を除去することができる。このように、未反応物質を除去することにより、例えば、本発明の検出精度をさらに向上することができる。
【００９７】
前記洗浄用の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、前述と同様の水や緩衝液等が使用できる。洗浄条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、４〜３７℃であり、好ましくは、２５〜３７℃であり、洗浄回数は、例えば、３回以上であり、好ましくは３〜１０回である。洗浄１回あたりの前記洗浄用溶媒の量は、特に制限されないが、例えば、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記洗浄用溶媒の量は、例えば、１００〜２００μＬであることが好ましい。
【００９８】
前記洗浄方法は、特に制限されず、例えば、前記一次抗体が固定化された固相の種類に応じて適宜決定できる。前記固相が有底凹状の反応器の場合、例えば、前記凹状の内部に前記洗浄用溶媒を添加した後、除去すればよい。また、前記固相がビーズ状の固相の場合、例えば、前記洗浄用溶媒中に前記固相を浸漬した後、前記固相を回収すればよい。この際、例えば、ろ過により、前記固相と前記洗浄用溶媒とを分離してもよいし、前記固相が磁性を有する場合は、例えば、磁石等により前記固相を回収して、前記固相と前記洗浄用溶媒とを分離してもよい。
【００９９】
なお、前記一次抗体が、固定化されていない一次抗体であっても、例えば、電気泳動法、透析膜または限界ろ過膜等を用いたろ過方法等によって、前記未反応物質を除去することはできる。
【０１００】
（第２の実施形態）
本実施形態は、検出対象物が抗体であり、一次試薬が一次抗原であり、二次試薬が二次抗体である形態の一例である。なお、前述のように、前記一次抗原は、検出対象抗体に特異的に結合可能な抗原であり、前記二次抗体は、前記検出対象抗体に特異的に結合可能な抗体である。本実施形態においては、特に示さない限り、前記第１の実施形態と同様に行うことができる。
【０１０１】
本実施形態において、前記反応系における前記一次抗原の量は、特に制限されず、例えば、添加する検体の量等に応じて適宜決定できる。具体例として、１ウェル容量が２００μＬのマイクロプレートを使用する場合、１ウェル当たりの前記一次抗原は、例えば、１〜１×１０１５分子であることが好ましく、より好ましくは１×１０２〜１×１０１４分子であり、特に好ましくは１×１０６〜１×１０１２分子である。
【０１０２】
本実施形態において、前記一次抗原は、前述のように、固定化一次抗原であることが好ましい。前記一次抗原を固相に固定化すれば、例えば、前記第１の実施形態と同様に、前記一次抗原と未反応の検出対象抗体、前記一次抗原に結合した検出対象抗体に未反応の二次抗体、さらに、前記一次抗原と検出対象抗体と前記二次抗体との複合体に未反応の核酸アプタマーを、容易に除去することができる。これらの未反応物質を除去することにより、例えば、本発明の検出精度をさらに向上することができる。
【０１０３】
本発明において、前記一次抗体と検出対象物との反応、前記検出対象物と前記二次抗体との反応、および、前記二次抗体と前記核酸アプタマーとの反応は、例えば、同時に行ってもよいし、別個に行ってもよい。中でも、例えば、未反応物質の除去が容易であることから、各反応は、別個に行うことが好ましい。
【０１０４】
つぎに、本発明の検出用キットは、前述のように、検出対象物と結合可能な試薬に結合可能な核酸アプタマーを含み、本発明の検出方法に使用することを特徴とする。
【０１０５】
本発明の検出用キットは、さらに、前記検出対象物と結合可能な前記試薬を含むことが好ましく、前記試薬は、前述の二次試薬であることが好ましい。
【０１０６】
本発明の検出用キットは、さらに、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物に結合可能な二次試薬とを含み、前記核酸アプタマーは、前記二次試薬に結合可能な核酸アプタマーであることが好ましい。
【０１０７】
本発明の検出用キットにおいて、前記一次試薬は、例えば、一次抗体または一次抗原である。
【０１０８】
本発明の検出用キットにおいて、前記二次試薬は、例えば、二次抗体である。
【０１０９】
本発明の検出用キットにおいて、前記一次試薬は、固相に固定化された固定化試薬であることが好ましく、前記固相は、例えば、プレート、メンブレン、チューブ、チップまたはビーズ等があげられる。
【０１１０】
本発明の検出用キットにおいて、前記アプタマーは、例えば、ＩｇＧに結合可能なアプタマーであり、前記ＩｇＧは、ウサギ由来ＩｇＧであることが好ましい。
【０１１１】
本発明の検出用キットにおいて、核酸は、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましく、また、配列番号３または配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有することが好ましい。
【０１１２】
本発明の検出用キットにおいて、前記核酸アプタマー、前記一次試薬および前記二次試薬および前記アプタマーは、前記本発明の検出方法で述べた通りであり、また、前記本発明の検出方法と同様にして使用できる。
【０１１３】
本発明の検出用キットにおいて、前記核酸アプタマーと、前記一次試薬および前記二次試薬の少なくとも一方は、例えば、同じ容器に収容されてもよいが、それぞれ別個の容器に収容されていることが好ましい。本発明の検出用キットにおいて、前記一次試薬、前記二次試薬および前記核酸は、例えば、使用時に、前述のような添加割合となるように、それぞれ収容されていることが好ましい。
【０１１４】
本発明の検出用キットは、例えば、さらに、固相を有してもよく、前記固相に前記一次試薬が固定化されていることが好ましい。
【０１１５】
本発明の検出用キットは、例えば、さらに、核酸増幅に必要な試薬を適宜備えてもよい。また、本発明の検出用キットは、例えば、さらに、使用説明書を備えることが好ましい。
【実施例】
【０１１６】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
【０１１７】
ウサギ抗体ＲＮＡアプタマーの調製
下記実施例で使用する抗アクチンウサギＩｇＧに特異的に結合可能なＲＮＡアプタマーＲ１８（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７５，２１７−２２２，（２００８）．）を調製した。具体的には、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８の鋳型となるＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に用いた。前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、Ｔ７ ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅキット（商品名、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、３７℃で３時間行った。この反応産物を、１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、目的のＲＮＡアプタマーＲ１８を精製回収した。なお、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８の配列を配列番号４に示す。
【０１１８】
［実施例１］
１．リアルタイムＰＣＲによるＲＮＡアプタマーの定量法
前記ＲＮＡアプタマーＲ１８をＥＡＳＹ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）で、所定濃度（６×１０２〜６×１０１０分子）に希釈し、標準サンプルを作製した。そして、これらの標準サンプルについて、リアルタイムＰＣＲを行った。前記リアルタイムＰＣＲは、ＯｎｅＳｔｅｐ ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ ＩＩ（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）およびＡＢＩ ７３００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。各標準サンプルについて、前記リアルタイムＰＣＲを３回行い、前記３回の反応の平均値から、スレッシュホールドサイクル（Ｃｔ）値を求めた。前記ＰＣＲは、９５℃を５秒、５５℃を１５秒、７２℃を３１秒のＰＣＲプログラムで行った。
【０１１９】
これらの結果を、図２に示す。同図は、リアルタイムＰＣＲにおける前記標準サンプル中のＲＮＡアプタマーＲ１８の分子数（コピー数）とＣｔ値との関係を示すグラフである。同図において、横軸は、前記標準サンプルにおけるＲＮＡアプタマーＲ１８の分子数（コピー数）の常用対数値を示し、縦軸は、前記Ｃｔ値を示す。同図に示すように、前記標準サンプルにおけるＲＮＡアプタマーＲ１８が、６×１０２分子〜６×１０１０分子の範囲内で、「ｙ＝−３．２２６５ｘ＋４０．７７３」で表される検量線が得られた。この検量線の相関係数は、Ｒ＝０．９９９９（決定係数Ｒ２＝０．９９９７）であることから、ＲＮＡアプタマーとＣｔ値との相関性が極めて優れることがわかった。さらに、前記検量線の傾きは、−３．２２６５であり、これは、増幅効率を１００％と仮定した傾きの理論値−３．１６２３に近似している。このことから、ＲＮＡアプタマーのリアルタイムＰＣＲによる定量は、精度の高い定量性を持った検出系であることがわかった。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡアプタマーを十分に増幅することが可能であり、且つ、十分に優れた定量性を確保できることが確認できた。
【０１２０】
２．ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる抗アクチンウサギＩｇＧの検出
抗アクチンウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を所定濃度（１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）となるように、反応用バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ ホウ酸、ｐＨ９．４）で希釈した。前記ＩｇＧ希釈液を、ｅｘｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＣＲプレート（商品名、ＡｐｔａＲｅｓ社製）にウェルあたり４０μＬ添加し、４℃で終夜インキュベートした。前記プレートから液体を除去後、前記プレートをＨＢＳ−Ｔ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、さらに、前記プレートのウェルにブロッキング用バッファー１（０．１％ アセチル化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）および１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎを含むＨＢＳ−Ｔ）を添加し、室温で６０分間インキュベートした。他方、１００ｐｍｏｌ／Ｌの前記ＲＮＡアプタマーＲ１８を、９５℃、２分間の処理で変性させ、室温で５分間冷却した。そして、ブロッキング処理した前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、各ウェルに前記変性させたＲＮＡアプタマーＲ１８を添加し、室温で４５分間インキュベートし、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した。続いて、前述のリアルタイムＰＣＲと同様にして、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８の検出を行った。なお、抗アクチンウサギＩｇＧ未添加のサンプルのＣｔ値を１０として、各サンプルについて、得られたＣｔ値の正規化を行った。
【０１２１】
他方、比較として、ＲＮＡアプタマーを使用しないＥＬＩＳＡにより、前記抗アクチンウサギＩｇＧを検出した。前記ブロッキング用バッファー１に代えてブロッキング用バッファー２（１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＨＢＳ−Ｔ）を用いた以外は、前述と同様にして、抗アクチンウサギＩｇＧをウェルプレートに結合させた。前記プレートから液体を除去後、ＨＢＳ−Ｔで３回洗浄し、さらに、０．５μｇ／ｍＬ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗ウサギＩｇＧ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をウェルあたり１００μＬ添加し、室温で６０分間インキュベートした。前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、基質としてウェルあたり１００μＬの１−ｓｔｅｐ Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ（商品名、ＰＩＥＲＣＥ社製）を添加し、室温でインキュベートして発色させた。そして、前記プレートについて、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、発色を波長域４０５ｎｍおよび６５０ｎｍで検出した。波長域６５０ｎｍのシグナル値をバックグラウンドとして、波長域４０５ｎｍのシグナル値の正規化を行った。
【０１２２】
抗アクチンウサギＩｇＧ測定結果を図３に示す。同図において、○は、ＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる測定結果であり、□は、ＥＬＩＳＡの測定結果を示すグラフである。同図において、横軸は、ウェルあたりの抗アクチンウサギＩｇＧ添加量を示し、左の縦軸は、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおける、正規化したＣｔ値を示し、右の縦軸は、前記ＥＬＩＳＡにおける、正規化したシグナル値を示す。その結果、ＲＮＡアプタマーを用いたリアルタイムＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（○）によれば、ウェルあたり１０ｐｇ〜１，０００，０００ｐｇ（１μｇ）の抗アクチンウサギＩｇＧを検出できることがわかった。これに対して、ＥＬＩＳＡ（□）では、ウェルあたり１０００ｐｇの抗アクチンウサギＩｇＧが、検出限界であった。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたリアルタイムＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによれば、ＥＬＩＳＡの１００倍の感度でターゲット分子（抗アクチンウサギＩｇＧ）を検出できることがわかった。
【０１２３】
３．抗体ＲＮＡアプタマーの特異性の確認
ＲＮＡアプタマーＲ１８が、ウサギＩｇＧに特異的に結合することを確認した。ウサギＩｇＧ以外は、サンドイッチ法で一般に用いられる下記ＩｇＧを使用した。
マウスＩｇＧ（＃Ｉ２８０６、サンタクルズ社製）
ヤギＩｇＧ（＃ＡＰ１２４、ケミコン社製）
ヒトＩｇＧ（＃Ｐ８０−１０４、ＢＥＴＨＹＬ社製）
ニワトリＩｇＧ（＃ＣＧＨＬ−１０Ａ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）
ヒツジＩｇＧ（＃ＳＧＨＬ−１０Ａ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）
ラットＩｇＧ（＃ＳＣ−２０２６、サンタクルズ社製）
ウサギＩｇＧ（＃ＡＢ３２８２、ケミコン社製）
【０１２４】
各種生物由来のＩｇＧを、それぞれウェルあたり５０，０００ｐｇ（５０ｎｇ）となるように添加した以外は、実施例１と同様にして、各種生物由来ＩｇＧの検出を行った。なお、前記ＩｇＧ未添加のネガティブコントロール（ＮＣ）のシグナルをノイズとして、前記各種ＩｇＧ添加のシグナルに関して、シグナル／ノイズ比を算出した。
【０１２５】
これらの結果を、下記表１に示す。下記表１に示すように、ウサギＩｇＧは、他の生物種由来ＩｇＧと比べて極めて高いシグナルを示した。この結果から、ＲＮＡアプタマーＲ１８は、極めて特異的にウサギＩｇＧに結合できることがわかる。
【表１】
【０１２６】
［実施例２］
ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにより、ヒト血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）を検出した。
【０１２７】
ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ
抗アクチンウサギＩｇＧに代えて、０．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＶＥＧＦヤギＩｇＧ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、抗ヒトＶＥＧＦヤギＩｇＧをＰＣＲプレートに結合させ、ブロッキング処理を行った。前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、所定濃度（１μｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ）の抗原ヒトＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）をウェルあたり１００μＬ添加した。そして、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＶＥＧＦウサギＩｇＧ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）をウェルあたり１００μＬ添加した。さらに、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、実施例１と同様にして変性させたＲＮＡアプタマーＲ１８をウェルあたり６×１０−１４分子となるようにウェルに添加し、室温で４５分間インキュベートした。そして、実施例１と同様、リアルタイムＰＣＲおよびデータ解析を行った。
【０１２８】
［比較例２］
Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡキット（商品名、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を用いて、ヒトＶＥＧＦを検出した。発色の検出およびシグナル値の正規化は、前述したＥＬＩＳＡと同様に行った。なお、前記キットには、サンプルとして、所定濃度（１００ｆｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ）のＶＥＧＦ溶液１００ｍＬを使用した。
【０１２９】
ヒトＶＥＧＦ測定結果を、図４に示す。同図において、○は、実施例２におけるＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの測定結果を示すグラフであり、□は、比較例２におけるＥＬＩＳＡの測定結果を示すグラフである。同図において、横軸は、ウェルあたりのヒトＶＥＧＦ添加量を示し、左の縦軸は、前記ＲＮＡアプタマーＲ１８を用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにおける、正規化したＣｔ値を示し、右の縦軸は、前記ＥＬＩＳＡにおける、正規化したシグナル値を示す。その結果、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（○）によれば、ウェルあたり０．１ｐｇ〜１００，０００ｐｇのヒトＶＥＧＦを検出できることがわかった。これに対して、ＥＬＩＳＡ（□）では、ウェルあたり１０ｐｇのヒトＶＥＧＦが、検出限界であった。
【０１３０】
つぎに、実施例２のＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲについて、検出限界値を算出した。前記検出限界値は、独立した３回のバックグラウンドシグナル測定値から、標準偏差および平均値を求め、以下の計算式から算出した。
検出限界値＝（３×Ｓ０）＋Ｓ
Ｓ０：バックグラウンドシグナル標準偏差
Ｓ：バックグラウンドシグナル平均値
【０１３１】
実施例２のＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの検出限界値は、約０．１ｐｇであった。これに対して、比較例２のＥＬＩＳＡの検出限界値は、前述のように約１０ｐｇであった。この結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによれば、ＥＬＩＳＡの１００倍の感度でターゲット分子（ヒトＶＥＧＦ）を検出できることが確認された。
【０１３２】
［実施例３］
ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲにより、血清中のヒトＶＥＧＦを検出した。変性させたＲＮＡアプタマーＲ１８をＰＣＲプレートウェルに添加する直前に、市販のヒトＶＥＧＦに代えて血清（ウシ血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加した以外は、実施例２と同様にして、ヒトＶＥＧＦを検出した。
【０１３３】
ヒト血清中のＶＥＧＦの測定結果を図５に示す。同図は、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲの測定結果を示すグラフである。同図において、横軸は、ウェルあたりのヒトＶＥＧＦ添加量を示し、縦軸は、正規化したＣｔ値を示す。同図に示すように、血清を使用しても、ウェルあたり０．１ｐｇ〜１０，０００ｐｇのヒトＶＥＧＦを検出できた。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲは、検体が血清であっても、同様の検出限界での測定が可能であることがわかった。
【０１３４】
［実施例４］
実施例１および実施例２の測定値から、検量線を作成し、高精度定量が可能な検出対象物の濃度範囲を決定した。なお、高精度定量が可能と判断する基準は、所定の検出対象物の濃度範囲における検量線の決定係数Ｒ２が、０．９９以上であることとした。
【０１３５】
これらの結果を図６に示す。同図（Ａ）は、実施例１におけるＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる測定値を用いた検量線のグラフであり、同図（Ｂ）は、実施例２におけるサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる測定値を用いた検量線のグラフである。同図（Ａ）において、横軸は、ウェルあたりの抗アクチンウサギＩｇＧ添加量（常用対数）を示し、縦軸は、正規化したＣｔ値を示す。また、同図（Ｂ）において、横軸は、ウェルあたりのヒトＶＥＧＦ添加量（常用対数）を示し、縦軸は、正規化したＣｔ値を示す。同図（Ａ）に示すように、抗アクチンウサギＩｇＧ濃度範囲１ｐｇ〜１００，０００ｐｇにおける検量線の決定係数は、Ｒ２＝０．９９５７であり、０．９９以上であった。この結果から、検出対象物の濃度範囲１ｐｇ〜１００，０００ｐｇにおいて、ＲＮＡアプタマーを用いたＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる高精度定量が可能であることがわかった。また、同図（Ｂ）に示すように、ヒトＶＥＧＦ濃度範囲１ｐｇ〜１０，０００ｐｇにおける検量線の決定係数は、Ｒ２＝０．９９２５であり、０．９９以上であった。この結果から、検出対象物の濃度範囲１ｐｇ〜１０，０００ｐｇにおいて、ＲＮＡアプタマーを用いたサンドイッチＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲによる高精度定量が可能であることがわかった。以上の結果から、ＲＮＡアプタマーを用いた検出法を用いると、例えば、４〜５オーダーの範囲で、高精度定量が可能であることがわかった。一方、ＥＬＩＳＡでは、図７に示すように、通常、２オーダーの範囲でしか高精度定量ができない。したがって、定量可能範囲の広さという点でも、ＲＮＡアプタマーを用いた検出方法は、ＥＬＩＳＡよりも優れていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明によれば、優れた感度で、検出対象物の検出を行うことができる。また、本発明によれば、前記検出対象物に結合可能な二次試薬として、標識化された二次試薬の使用が不要である。このため、前記標識化二次試薬の調製が不要であり、さらに、操作も簡便である。したがって、本発明によれば、検出感度に優れ、且つ、操作が簡便な検出対象物の検出を実現できる。
【符号の説明】
【０１３７】
１ 固相
１１ 一次抗体
１２ 検出対象抗原
１３ 二次抗体
１４ 核酸アプタマー
１５ 増幅産物
２１ 複合体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成する複合体形成工程、
前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する結合工程、
前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅する増幅工程、および、
前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する検出工程を含むことを特徴とする、検出対象物の検出方法。
【請求項２】
前記検出対象物が抗原であり、前記一次試薬が一次抗体である、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記検出対象物が抗体であり、前記一次試薬が一次抗原である、請求項１記載の検出方法。
【請求項４】
前記二次試薬が二次抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記一次試薬が、固相に固定化された固定化試薬である、請求項１から４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記固相が、プレート、メンブレン、チューブ、チップまたはビーズである、請求項５記載の検出方法。
【請求項７】
前記増幅工程に先立って、
さらに、前記複合体における前記二次試薬に未結合の核酸アプタマーを除去する工程を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項８】
前記複合体形成工程が、
前記一次試薬に前記検出対象物を反応させる工程、および
前記検出対象物に前記二次試薬を反応させる工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項９】
前記複合体形成工程において、
前記一次試薬に前記検出対象物を反応させる工程の後、
前記検出対象物に前記二次試薬を反応させる工程を行う、請求項８記載の検出方法。
【請求項１０】
前記核酸アプタマーが、イムノグロブリンＧに結合可能な核酸アプタマーである、請求項１から９のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記イムノグロブリンＧが、ウサギ由来イムノグロブリンＧである、請求項１０記載の検出方法。
【請求項１２】
前記核酸アプタマーが、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記核酸アプタマーが、配列番号３および配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記核酸アプタマーが、配列番号５〜配列番号９からなる群から選択された少なくとも一つの配列番号で表わされる塩基配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１５】
核酸増幅方法が、逆転写ポリメラーゼチェーンリアクション法またはポリメラーゼチェーンリアクション法である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１６】
検出対象物と結合可能な試薬に結合可能な核酸アプタマーを含み、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の検出方法に使用するための検出用キット。
【請求項１７】
さらに、前記検出対象物と結合可能な前記試薬を含む、請求項１６記載の検出用キット。
【請求項１８】
さらに、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物に結合可能な二次試薬とを含み、
前記核酸アプタマーは、前記二次試薬に結合可能な核酸アプタマーである、請求項１６記載の検出用キット。
【請求項１９】
前記一次試薬が一次抗体である、請求項１８記載の検出用キット。
【請求項２０】
前記一次試薬が一次抗原である、請求項１８記載の検出用キット。
【請求項２１】
前記二次試薬が二次抗体である、請求項１８から２０記載の検出用キット。
【請求項２２】
前記一次試薬が、固相に固定化された固定化試薬である、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の検出用キット。
【請求項２３】
前記固相が、プレート、メンブレン、チューブ、チップまたはビーズである、請求項２２記載の検出用キット。
【請求項２４】
前記核酸アプタマーが、イムノグロブリンＧに結合可能な核酸アプタマーである、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の検出用キット。
【請求項２５】
前記イムノグロブリンＧが、ウサギ由来イムノグロブリンＧである、請求項２４記載の検出用キット。
【請求項２６】
前記核酸アプタマーが、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の検出用キット。
【請求項２７】
前記核酸アプタマーが、配列番号３または配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の検出用キット。
【請求項２８】
前記核酸アプタマーが、配列番号５〜配列番号９からなる群から選択された少なくとも一つの配列番号で表わされる塩基配列を有する、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の検出用キット。
【請求項１】
検体中の検出対象物と、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物と結合可能な二次試薬との複合体を形成する複合体形成工程、
前記複合体における前記二次試薬に、前記二次試薬と結合可能な核酸アプタマーを結合する結合工程、
前記二次試薬に結合した前記核酸アプタマーを鋳型として、核酸増幅法により増幅する増幅工程、および、
前記核酸アプタマーの増幅産物を検出することにより、前記検出対象物を検出する検出工程を含むことを特徴とする、検出対象物の検出方法。
【請求項２】
前記検出対象物が抗原であり、前記一次試薬が一次抗体である、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記検出対象物が抗体であり、前記一次試薬が一次抗原である、請求項１記載の検出方法。
【請求項４】
前記二次試薬が二次抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記一次試薬が、固相に固定化された固定化試薬である、請求項１から４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記固相が、プレート、メンブレン、チューブ、チップまたはビーズである、請求項５記載の検出方法。
【請求項７】
前記増幅工程に先立って、
さらに、前記複合体における前記二次試薬に未結合の核酸アプタマーを除去する工程を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項８】
前記複合体形成工程が、
前記一次試薬に前記検出対象物を反応させる工程、および
前記検出対象物に前記二次試薬を反応させる工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項９】
前記複合体形成工程において、
前記一次試薬に前記検出対象物を反応させる工程の後、
前記検出対象物に前記二次試薬を反応させる工程を行う、請求項８記載の検出方法。
【請求項１０】
前記核酸アプタマーが、イムノグロブリンＧに結合可能な核酸アプタマーである、請求項１から９のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記イムノグロブリンＧが、ウサギ由来イムノグロブリンＧである、請求項１０記載の検出方法。
【請求項１２】
前記核酸アプタマーが、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記核酸アプタマーが、配列番号３および配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記核酸アプタマーが、配列番号５〜配列番号９からなる群から選択された少なくとも一つの配列番号で表わされる塩基配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１５】
核酸増幅方法が、逆転写ポリメラーゼチェーンリアクション法またはポリメラーゼチェーンリアクション法である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１６】
検出対象物と結合可能な試薬に結合可能な核酸アプタマーを含み、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の検出方法に使用するための検出用キット。
【請求項１７】
さらに、前記検出対象物と結合可能な前記試薬を含む、請求項１６記載の検出用キット。
【請求項１８】
さらに、前記検出対象物と結合可能な一次試薬と、前記一次試薬とは異なる部位で前記検出対象物に結合可能な二次試薬とを含み、
前記核酸アプタマーは、前記二次試薬に結合可能な核酸アプタマーである、請求項１６記載の検出用キット。
【請求項１９】
前記一次試薬が一次抗体である、請求項１８記載の検出用キット。
【請求項２０】
前記一次試薬が一次抗原である、請求項１８記載の検出用キット。
【請求項２１】
前記二次試薬が二次抗体である、請求項１８から２０記載の検出用キット。
【請求項２２】
前記一次試薬が、固相に固定化された固定化試薬である、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の検出用キット。
【請求項２３】
前記固相が、プレート、メンブレン、チューブ、チップまたはビーズである、請求項２２記載の検出用キット。
【請求項２４】
前記核酸アプタマーが、イムノグロブリンＧに結合可能な核酸アプタマーである、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の検出用キット。
【請求項２５】
前記イムノグロブリンＧが、ウサギ由来イムノグロブリンＧである、請求項２４記載の検出用キット。
【請求項２６】
前記核酸アプタマーが、配列番号１および配列番号２の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の検出用キット。
【請求項２７】
前記核酸アプタマーが、配列番号３または配列番号４の少なくとも一方で表わされる塩基配列を有する、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の検出用キット。
【請求項２８】
前記核酸アプタマーが、配列番号５〜配列番号９からなる群から選択された少なくとも一つの配列番号で表わされる塩基配列を有する、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の検出用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２２７０４８（Ｐ２０１０−２２７０４８Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７９９０２（Ｐ２００９−７９９０２）
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（０００２３２０９２）ＮＥＣソフト株式会社 (173)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（０００２３２０９２）ＮＥＣソフト株式会社 (173)
【Ｆターム（参考）】
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