検査素子、検査キット、検査装置、および検査方法
【課題】本発明の実施形態は、測定精度が高く、且つ検査時間が短い検査素子、検査キット、検査装置、および検査方法を提供する。
【解決手段】実施形態によれば、透光性を有する基部と、前記基部の主面に互いに距離をあけて配設された一対の光学要素部と、前記基部の主面に設けられた光導波路部と、前記光導波路部の前記基部が設けられた側とは反対側の主面であって、前記光学要素部同士の間に設けられた検出部と、一端が前記検出部の主面より突出して設けられた枠状の保持部と、を備え、前記検出部は、発色剤と、前記発色剤を保持する膜形成体と、を有することを特徴とする検査素子が提供される。
【解決手段】実施形態によれば、透光性を有する基部と、前記基部の主面に互いに距離をあけて配設された一対の光学要素部と、前記基部の主面に設けられた光導波路部と、前記光導波路部の前記基部が設けられた側とは反対側の主面であって、前記光学要素部同士の間に設けられた検出部と、一端が前記検出部の主面より突出して設けられた枠状の保持部と、を備え、前記検出部は、発色剤と、前記発色剤を保持する膜形成体と、を有することを特徴とする検査素子が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、検査素子、検査キット、検査装置、および検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
透明シート上に発色部、反射部、反応部、展開部が順次積層された構成を有する検査素子が知られている。
この様な検査素子においては、乾燥状態の試薬類を含んだ反応部に検体液を導入し、検体液と試薬類とが反応して生成された反応生成物を発色剤に導入することで生じる吸光度変化量を測定するようにしている。
【０００３】
この場合、測定対象が酵素であり、その活性を定量化するような場合には、反応部に複数の試薬類を多量に含ませる必要がある。そのため、散乱体が形成されて吸光度変化量の測定誤差が大きくなったり、反応生成物などの拡散速度が遅くなり検査時間が長くなったりするおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−２６６７９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の実施形態は、測定精度が高く、且つ検査時間が短い検査素子、検査キット、検査装置、および検査方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態によれば、透光性を有する基部と、前記基部の主面に互いに距離をあけて配設された一対の光学要素部と、前記基部の主面に設けられた光導波路部と、前記光導波路部の前記基部が設けられた側とは反対側の主面であって、前記光学要素部同士の間に設けられた検出部と、一端が前記検出部の主面より突出して設けられた枠状の保持部と、を備え、前記検出部は、発色剤と、前記発色剤を保持する膜形成体と、を有することを特徴とする検査素子が提供される。
【０００７】
また、他の実施形態によれば、上記の検査素子と、測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、を含む溶液と、を備えたことを特徴とする検査キットが提供される。
【０００８】
また、他の実施形態によれば、上記の検査素子と、測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、を備えたことを特徴とする検査キットが提供される。
【０００９】
また、他の実施形態によれば、上記の検査素子に設けられた一方の光学要素部に光を入射させる投光部と、他方の光学要素部からの光を受光して光の強度に応じた電気信号に変換する受光部と、を備えたことを特徴とする検査装置が提供される。
【００１０】
また、他の実施形態によれば、少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、前記酵素を含む検体液と、を混合し、上記の検査素子に設けられた保持部の内部に前記混合された液体を所定量供給し、前記検査素子の検出部に設けられた発色剤が発色することで生じる吸光度変化量を求め、前記吸光度変化量に基づいて酵素活性を求めること、を特徴とする検査方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本実施の形態に係る検査素子について例示をするための模式断面図である。
【図２】反応の様子を例示するための模式図である。
【図３】吸光度の経時的な変化を例示するための模式グラフ図である。
【図４】酵素活性（ＡＬＴ（ＧＰＴ）活性）と吸光度変化量との関係を例示するための模式グラフ図である。
【図５】本実施の形態に係る検査装置について例示をするための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照しつつ、実施の形態について例示をする。なお、各図面中、同様の構成要素には同一の符号を付して詳細な説明は適宜省略する。
図１は、本実施の形態に係る検査素子について例示をするための模式断面図である。
図１に示すように、検査素子１には、基部２、光導波路部３、光学要素部４、検出部５、保持部６、保護部７が設けられている。
【００１３】
基部２は、平板状を呈し、透光性の材料から形成されている。基部２は、例えば、ガラス（例えば、無アルカリガラス）または石英などから形成されるものとすることができる。光導波路部３は、基部２より高い屈折率を有し、基部２の一方の主面上に設けられている。すなわち、光導波路部３は、基部２の主面と、後述する一対の光学要素部４と、を覆うように設けられている。光導波路部３は、高分子樹脂などから形成され、３μｍ〜３００μｍの範囲で設定されるほぼ均一な厚みの膜状体とすることができる。
【００１４】
光学要素部４は、基部２の光導波路部３が設けられた側の主面の両端部付近に一対設けられている。すなわち、光学要素部４は、基部２の主面に互いに距離をあけて一対配設されている。図１に例示をした光学要素部４は、光導波路部３に光を導入、出射させる際に回折格子として機能する。そのため、光学要素部４は、基部２より高い屈折率を有し所定のピッチ寸法で格子状に設けられている。例えば、光学要素部４は、ピッチ寸法を１μｍとし、格子状に設けられたものとすることができる。ただし、ピッチ寸法はこれに限定されるわけではなく適宜変更することができる。
【００１５】
光学要素部４は、例えば、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化錫（ＳｎＯ２）、酸化亜鉛、ニオブ酸リチウム、ガリウム砒素（ＧａＡｓ）、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）、ポリイミドなどから形成されるものとすることができる。なお、回折格子として機能する光学要素部４を例示したが、光を光導波路部３内に導入させることができる光学要素を適宜選択することができる。例えば、光学要素部は、光導波路部３に光を導入、出射させる際にプリズムとして機能するものとすることができる。
【００１６】
検出部５は、膜状を呈し、光導波路部３の基部２が設けられた側とは反対側の主面の中央部分に設けられている。すなわち、検出部５は、光導波路部３の基部２が設けられた側とは反対側の主面であって、光学要素部４同士の間に設けられている。検出部５は、発色剤と発色剤を保持する膜形成体とを有するものとすることができる。
膜形成体は、多孔質組織を有するものとすることができ、多孔質組織内の空孔に発色剤を保持するようにしたものなどを例示することができる。膜形成体の材料としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを例示することができる。
検出部５は、例えば、水とアルコールなどの水溶性有機溶媒との混合溶媒に、発色剤、造膜用高分子などを均質に混合した前駆溶液を膜状に乾燥させることで形成するようにすることができる。
【００１７】
反応生成物として過酸化水素などの過酸化物が生成される場合には、検出部５に含まれる発色剤をベンジジン系発色剤とすることができる。ベンジジン系発色剤としては、例えば、４−クロロ−１−ナフトール、３，３’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（以下、適宜、ＴＭＢＺと称する）、ＴＭＢＺの塩酸塩（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン・２ＨＣｌ・２Ｈ２Ｏ）などを例示することができる。この場合、水への溶解度が低く、生体への有害性が極めて低いＴＭＢＺを用いるようにすることもできる。
また、反応生成物としてＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）などが生成される場合には、検出部５に含まれる発色剤をテトラゾリウム塩などとすることができる。
【００１８】
ここで、検出部を膜形成体と発色剤と試薬類とから形成されるものとすれば、検体液を検出部に供給するだけで検査を行うことができる。
この場合、酵素活性を定量化するような反応系においては、２段階以上の素反応を経て最終的に生成された物質を定量する必要がある。
そのため、複数の試薬類を高濃度で用いることになり、複数の試薬類を検出部に含ませることが必要となる。
しかしながら、複数の試薬類を検出部に含ませるようにすることは困難である。
何故なら複数の試薬類を検出部に含ませることができたとしても試薬類の量が多いので、試薬類が結晶化、析出するなどして散乱体が形成されるおそれがある。そして、散乱体が形成されると後述する吸光度変化量の測定において測定誤差が大きくなるおそれがある。
【００１９】
また、この様な検出部とすれば、検体液に元々含まれる水分が反応場となり各素反応が進行することになる。そのような場合には、溶媒の粘性などによって変化する反応生成物の拡散速度の影響によって反応速度も変化することが想定され、複数の素反応をトータルした反応速度は検体の個体差による影響を少なからず受けることが予想される。そのため、反応生成物の拡散速度が遅くなり検査時間が長くなるおそれがある。また、発色剤と複数の試薬類とを含む検出部とすれば、検査素子の大型化を招くことにもなる。
【００２０】
そのため、本実施の形態においては、検出部５を発色剤と発色剤を保持する膜形成体とから形成されたものとしている。そして、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる試薬類は後述する溶液に含ませるようにし、この溶液を反応場としている。なお、この溶液に関する詳細は後述する。
【００２１】
また、検出部５を膜形成体と発色剤と発色反応促進剤とから形成されたものとすることもできる。すなわち、検出部５は、発色反応促進剤をさらに有し、膜形成体により発色剤と発色反応促進剤とが保持されたものとすることもできる。この場合、発色剤の他に発色反応促進剤が加えられることになるが、複数の試薬類を検出部に含ませる場合と比べてその量が少ないため前述した問題の発生を抑制することができる。ただし、検出部５を形成する際に用いられる前駆溶液中に発色反応促進剤を溶解させた際に、発色反応促進剤の活性が低下しないものとすることが好ましい。
【００２２】
反応生成物として過酸化水素などの過酸化物が生成される場合には、例えば、発色反応促進剤をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）などとすることができる。
反応生成物としてＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）などが生成される場合には、例えば、発色反応促進剤をジアホラーゼなどとすることができる。
なお、発色剤、発色反応促進剤は例示をしたものに限定されるわけではなく、測定対象に応じて適宜変更することができる。
【００２３】
この場合、検体液に元々含まれる水分を反応場とする場合と比べて、検出部５の上方に保持する溶液の量が多くなる。そのため、保持部６を設けることで検出部５の上方に所定量の溶液が保持できるようになっている。
保持部６は、枠状を呈し、検出部５を囲むようにして設けられている。保持部６の一方の端部は光導波路部３の主面に液密に設けられ、他方の端部は検出部５の主面から突出するようにして設けられている。そのため、検出部５の上方に後述する溶液を保持する保持空間６ａが形成されることになる。
【００２４】
この場合、保持部６により保持される液の体積を所定の値以上とすることが好ましい。 本発明者らの得た知見によれば、保持部６により保持される液の体積を１０μＬ（マイクロリットル）以上とすることが好ましい。
そのため、保持空間６ａの体積は１０μＬ（マイクロリットル）以上とすることができる。すなわち、保持部６の一端は、検出部５の上方に１０μＬ以上の体積の空間（保持空間６ａ）が形成されるように検出部５の主面より突出している。
【００２５】
保護部７は、光導波路部３の両端部であって光学要素部４が形成されている領域に対向する部分を覆うようにして設けられている。すなわち、保持部６の外側の光導波路部３の主面を覆うようにして設けられている。
保護部７は、光導波路部３を形成する材料よりも低屈折率の材料から形成されている。また、保持部６に保持される液に対する耐性の高い材料から形成されている。保護部７は、例えば、フッ素樹脂などから形成されるものとすることができる。
【００２６】
本実施の形態によれば、後述する溶液中に測定対象となる酵素に対する基質や試薬類を含ませるようにしている。そのため、酵素活性を定量化する場合のように複数の試薬類を高濃度で用いることが必要となる場合であっても測定精度を向上させることができ、且つ検査時間を短縮することができる。また、検出部５を大型化することなく対応することができる。
すなわち、溶液を反応場とすることができるので、試薬類の量が多い場合であっても試薬類が結晶化、析出するなどして散乱体が形成されることを抑制することができる。そのため、測定精度を向上させることができる。
また、溶液を反応場とすることができるので、溶媒の粘性などによって変化する反応生成物の拡散速度の影響を抑制することができる。そのため、反応生成物の拡散速度を速くすることができるので、酵素活性に関する検査の時間を大幅に短縮することができる。
また、検出部５には、発色剤、または発色剤と発色反応促進剤が含まれているだけのため、測定対象となる所定の酵素に対して検査素子１の共通化を図ることができる。
【００２７】
次に、本実施の形態に係る検査キットについて例示をする。
本実施の形態に係る検査キットは、前述した検査素子１と、少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と緩衝液とを含む溶液と、を個別に備えたキットとすることができる。 なお、溶液を構成する要素（例えば、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる試薬類、緩衝液など）が個別に組み合わされたものが溶液の代わりに備えられたキットとすることもできる。例えば、前述した検査素子１と、測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、を個別に備えたキットとすることもできる。また、素反応をさせる際に用いられる試薬類をさらに備えたものとすることもできる。
【００２８】
緩衝液は、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる試薬類を溶解させるために用いられる。この場合、緩衝液は、試薬類などの活性の低下抑制の観点から有機溶剤でないものとすることが好ましい。ただし、緩衝液は、試薬類などの活性が保たれる程度に有機溶剤を含んだものとすることができる。
【００２９】
また、緩衝液は、水素イオン指数（ｐＨ）の変動を抑制することができるものであることが好ましい。
この場合、緩衝液の水素イオン指数は、ｐＨ３．５〜１０．０、好ましくはｐＨ４．５〜９．０の範囲となるようにすることができる。
【００３０】
緩衝液は、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、各種グッド緩衝液などとすることができる。
例えば、緩衝液は、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸二ナトリウム／塩酸緩衝液、クエン酸二水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、コハク酸／四ホウ酸ナトリウム緩衝液、クエン酸水素カリウム／四ホウ酸ナトリウム緩衝液、リン酸水素二ナトリウム／クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム／塩酸緩衝液、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液などとすることができる。
【００３１】
溶液は、測定対象となる酵素に対する基質の他に、素反応をさせる際に用いられる試薬類を緩衝液にさらに溶解させたものとすることもできる。すなわち、溶液は、素反応をさせる際に用いられる試薬類をさらに含んだものとすることもできる。
【００３２】
また、検体液中に含まれる測定対象となる酵素以外の物質によって、素反応が過大となり、あるいは素反応が阻害されるような場合には、その影響を最小限化するための添加剤をさらに追加することもできる。
【００３３】
この場合、素反応をさせる際に用いられる試薬類は、測定対象となる酵素に応じて適宜選択するようにすることができる。
表１は、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる試薬類、発色剤、発色反応促進剤を例示するためのものである。
【表１】
図２は、反応の様子を例示するための模式図である。
なお、図２は、一例として、３段階の反応を経て反応生成物が生成される場合を例示するものである。
測定対象となる酵素を含む検体液が溶液中に導入されると、表１の上段から順に素反応が進行し、反応生成物（表１、図２に例示をしたものでは生成物３）が生成される。
すなわち、測定対象となる酵素と測定対象となる酵素に対する基質とが反応して生成物１が生成される。次に、生成された生成物１と試薬１とが反応して生成物２が生成される。次に、生成された生成物２と試薬２とが反応して生成物３（反応生成物）が生成される。そして、生成された生成物３（反応生成物）により発色剤が発色する。この際、発色反応促進剤により発色剤の発色が促進される。
【００３４】
例えば、反応生成物として過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が生成される場合には、生成された過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とが反応してラジカル酸素原子（Ｏ＊）が生成される。この生成されたラジカル酸素原子（Ｏ＊）により発色剤が酸化され、例えば、ＴＭＢＺの−ＮＨ２基が＝ＮＨ基に酸化され、青緑色に発色し、さらに不溶化して検出部５の表面に沈澱する。
この発色により生じる吸光度変化量を測定することで酵素活性を定量化することができる。
【００３５】
図３は、吸光度の経時的な変化を例示するための模式グラフ図である。
図３に例示をしたものにおいては、市販の標準血清（リキッドアブノーマル、デンカ生研（株））を０．２Ｍリン酸バッファ（ｐＨ６．２）で２０倍あるいは１００倍に希釈した液に、ＡＬＴ（ＧＰＴ）に対する基質であるＬ−アラニン、α-ケトグルタル酸を最終濃度で２００ｍＭ、素反応をさせる際に用いられる試薬類であるピルビン酸オキシダーゼを最終濃度で１０ｍＭ添加した。また、酵素活性が２Ｕ／Ｌ、０．４Ｕ／Ｌとなるように混合したものを用いた。なお、酵素活性が０Ｕ／Ｌの液（ブランクの液）は、血清の代わりに同量の生理食塩水を用いた液とした。
【００３６】
図３から分かるように、保持空間６ａに酵素活性が０Ｕ／Ｌの液を供給してから３０秒程度で吸光度の変化率が概ね一定になる。
そこで、液供給から３０秒後における吸光度と、６０秒後における吸光度との差から、吸光度変化量ΔＡと酵素活性（ＡＬＴ（ＧＰＴ）活性）との関係を求めるようにした。
【００３７】
図４は、酵素活性（ＡＬＴ（ＧＰＴ）活性）と吸光度変化量との関係を例示するための模式グラフ図である。
図４に示すように、酵素活性（ＡＬＴ（ＧＰＴ）活性）と吸光度変化量との間には所定の関係がある。そのため、発色により生じる吸光度変化量を測定することで酵素活性を定量化することができる。この場合、各酵素における酵素活性と吸光度変化量との関係を予め求めて検量線としておけば、吸光度変化量の測定値から各酵素における酵素活性を容易に定量化することができる。
【００３８】
また、液供給から３０秒後における吸光度と、６０秒後における吸光度との差から、吸光度変化量を求めればよいので、６０秒程度で酵素活性を定量化することができる。そのため、酵素活性に関する検査の時間を大幅に短縮することができる。
【００３９】
本実施の形態によれば、溶液中に測定対象となる酵素に対する基質や試薬類を含ませることができる。そのため、酵素活性を定量化する場合のように複数の試薬類を高濃度で用いることが必要となる場合であっても測定精度を向上させることができ、且つ検査時間を短縮することができる。また、検出部５を大型化することなく対応することができる。
すなわち、溶液を反応場とすることができるので、試薬類の量が多い場合であっても試薬類が結晶化、析出するなどして散乱体が形成されることを抑制することができる。そのため、測定精度を向上させることができる。
また、溶液を反応場とすることができるので、溶媒の粘性などによって変化する反応生成物の拡散速度の影響を抑制することができる。そのため、反応生成物の拡散速度を速くすることができるので、酵素活性に関する検査の時間を大幅に短縮することができる。
また、検出部５には、発色剤、または発色剤と発色反応促進剤が含まれているだけのため、測定対象となる所定の酵素に対して検査素子１の共通化を図ることができる。
【００４０】
次に、本実施の形態に係る検査装置について例示をする。
図５は、本実施の形態に係る検査装置について例示をするための模式図である。
図５に示すように、検査装置１００には、検査部２０、溶液反応部３０、制御部４０が設けられている。
【００４１】
検査部２０は、前述した検査素子１を着脱可能となっている。
この場合、検査素子１は、使い捨てとすることができ、検査毎に交換されるものとすることができる。
検査部２０には、投光部２１、受光部２２が設けられている。すなわち、検査素子１に設けられた一方の光学要素部４に光を入射させる投光部２１と、他方の光学要素部４からの光を受光して光の強度に応じた電気信号に変換する受光部２２と、が設けられている。 投光部２１は、例えば、レーザダイオードなどとすることができる。受光部２２は、例えば、フォトダイオードなどとすることができる。
【００４２】
投光部２１は、一方の光学要素部４に光を入射させることができる位置に設けられている。受光部２２は、他方の光学要素部４からの光を受光することができる位置に設けられている。
ここで、投光部２１から出射し基部２を介して光学要素部４に入射した光は、光学要素部４と光導波路部３との界面で回折され、さらに光導波路部３と基部２および検出部５との界面で複数回反射しながら伝播する。この様に入射した光は、光導波路部３内を反射して伝搬するが、その際、エバネッセント波（evanescent wave）が生じる。エバネッセント波とは、光が光導波路部３と外部との界面において全反射する際、その界面に発生して表面だけを伝わる電磁波をいう。このエバネッセント波が到達する距離は、光導波路部３の表面から波長程度（１μｍ以下）の長さである。
【００４３】
そして、エバネッセント波が光導波路部３と検出部５との界面において屈折する際に、前述した検出部５の発色剤が発色することで生じる吸光度変化量に応じてエバネッセント波が吸収される。
この様にして光導波路部３内を伝播した光は、他方の光学要素部４から基部２を介して外部に出射される。外部に出射された光は、受光部２２により受光され、受光された光の強度に応じた電気信号に変換される。変換された電気信号は、制御部４０に送られる。
【００４４】
この場合、受光部２２により受光される光の強度は、検出部５の発色剤が発色することで生じる吸光度変化量に応じて変化した値（エバネッセント波の吸収に応じて変化した値）となるので、その変化率などから酵素活性を定量化することができる。
【００４５】
溶液反応部３０には、供給部３１、溶液収納部３２、検体液収納部３３、混合部３４が設けられている。
供給部３１には、ノズル３１ａが設けられ、ノズル３１ａには可撓生の配管３１ｃを介してポンプなどの吸引部３１ｂが接続されている。また、図示しない移動部によりノズル３１ａの位置を変化させることができるようになっている。この場合、図中の破線に示すようにノズル３１ａを移動させて、溶液収納部３２、検体液収納部３３、混合部３４、保持空間６ａにおいて溶液などの液体の吸引、吐出をさせることができるようになっている。
【００４６】
溶液収納部３２は、前述した溶液を収納する。例えば、測定対象となる酵素に対する基質を緩衝液に溶解させたもの、測定対象となる酵素に対する基質と素反応をさせる際に用いられる試薬類を緩衝液に溶解させたものなどを収納する。
検体液収納部３３は、測定対象となる酵素を含む検体液を収納する。例えば、希釈された血液や血清などの検体液を収納する。
【００４７】
混合部３４には、収納部３４ａと攪拌部３４ｂが設けられている。
収納部３４ａには、供給部３１により所定量の溶液と、検体液とが供給され、攪拌部３４ｂにより溶液と検体液とが攪拌される。
すなわち、混合部３４は、少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、酵素を含む検体液と、を混合する。
【００４８】
制御部４０は、検査部２０、溶液反応部３０に設けられた各要素の動作を制御する。また、受光部２２から送られてきた電気信号に基づいて、酵素活性を定量化する。
【００４９】
この場合、以下の（１）式により所定の時間後の吸光度Ａを演算し、さらに吸光度変化量ΔＡを演算するようにすることができる。例えば、（１）式により液供給から３０秒後における吸光度Ａ（３０）と、６０秒後における吸光度Ａ（６０）とを演算し、さらに吸光度Ａ（３０）と吸光度Ａ（６０）との差から吸光度変化量ΔＡを演算するようにすることができる。
そして、前述したように、予め求められた検量線などに基づいて、吸光度変化量ΔＡから酵素活性を求めるようにすることができる。
【００５０】
Ａ(ｔ１)＝−ｌｏｇ(Ｉ(ｔ１)／Ｉ(ｔ０)) ・・・（１）
ここで、Ａ(ｔ１)はｔ＝ｔ０を初期値とした場合のｔ１秒後の吸光度、Ｉ(ｔ０)は時間ｔ０における光検出強度（例えば、受光部２２の出力値）、Ｉ(ｔ１)はｔ＝ｔ０を初期値とした場合のｔ１秒後の光検出強度（例えば、受光部２２の出力値）である。
【００５１】
次に、検査装置１００の作用について例示をする。
まず、作業者などにより溶液収納部３２に溶液が供給され、検体液収納部３３に希釈された血液や血清などの検体液が供給される。また、検査部２０に検査素子１が装着される。
【００５２】
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を溶液収納部３２内の溶液中に入れる。そして、吸引部３１ｂを作動させることで所定量の溶液を吸引する。
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を収納部３４ａ内に入れる。そして、吸引部３１ｂを作動させることで溶液を収納部３４ａ内に吐出する。
【００５３】
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を検体液収納部３３内の検体液中に入れる。そして、吸引部３１ｂを作動させることで所定量の検体液を吸引する。
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を収納部３４ａ内に入れる。そして、吸引部３１ｂを作動させることで検体液を収納部３４ａ内に吐出する。
【００５４】
収納部３４ａ内に所定量の溶液と検体液とが供給されると、検体液に含まれる酵素と、溶液に含まれる測定対象となる酵素に対する基質や試薬類との素反応が進行し、反応生成物が生成される。この際、攪拌部３４ｂにより溶液と検体液とが攪拌されることで素反応の進行が促進される。
【００５５】
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を収納部３４ａ内の液体中に入れる。そして、吸引部３１ｂを作動させることで所定量の液体を吸引する。この場合、この液体には生成された反応生成物が含まれている。
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を保持空間６ａの直上に位置決めする。そして、吸引部３１ｂを作動させることで反応生成物が含まれている液体を保持空間６ａ内に吐出する。保持空間６ａ内に吐出された液体に含まれている反応生成物により検出部５に設けられた発色剤が発色する。この際、発色反応促進剤が含まれている場合には発色反応促進剤により発色剤の発色が促進される。
【００５６】
次に、投光部２１からレーザ光などの光を出射させ、光導波路部３内を反射して伝搬させることでエバネッセント波を発生させる。そして、エバネッセント波が光導波路部３と検出部５との界面において屈折する際には、前述した検出部５の発色剤が発色することで生じる吸光度変化量に応じてエバネッセント波が吸収される。
【００５７】
光導波路部３内を伝播した光は、他方の光学要素部４から基部２を介して外部に出射され、受光部２２により受光される。受光部２２により受光された光の強度は、検出部５の発色剤が発色することで生じる吸光度変化量に応じて変化した値となるので、その変化率などから酵素活性を定量化する。
【００５８】
なお、前述したものの場合には、測定対象となる酵素に対する基質を緩衝液に溶解させたものや、測定対象となる酵素に対する基質と素反応をさせる際に用いられる試薬類を緩衝液に溶解させたものを溶液収納部３２に収納する場合を例示したがこれに限定されるわけではない。例えば、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる各試薬類をそれぞれ緩衝液に溶解させたものを個別に収納し、供給部３１により各溶液を収納部３４ａに個別に供給するようにしてもよい。
【００５９】
また、溶液反応部３０は必ずしも必要ではなく、例えば、作業者が前述した溶液と検体液とを混合させて、生成された反応生成物を含む液体を保持空間６ａ内に供給するようにしてもよい。
また、制御部４０も必ずしも必要ではなく、例えば、受光部２２から送られてきた電気信号を別途設けられた演算手段などで演算するようにしてもよい。
【００６０】
また、ノズル３１ａの内部や可撓生の配管３１ｃの内部などを洗浄する洗浄手段を適宜設けるようにすることができる。例えば、洗浄水などを吸引させてノズル３１ａの内部や可撓生の配管３１ｃの内部などを洗浄したり、可撓生の配管３１ｃに洗浄水などを導入してノズル３１ａの内部や可撓生の配管３１ｃの内部などを洗浄したりすることができる。
【００６１】
本実施の形態によれば、溶液中に測定対象となる酵素に対する基質や試薬類を含ませることができる。そのため、酵素活性を定量化する場合のように複数の試薬類を高濃度で用いることが必要となる場合であっても測定精度を向上させることができ、且つ検査時間を短縮することができる。また、検出部５を大型化することなく対応することができる。
すなわち、溶液を反応場とすることができるので、試薬類の量が多い場合であっても試薬類が結晶化、析出するなどして散乱体が形成されることを抑制することができる。そのため、測定精度を向上させることができる。
また、溶液を反応場とすることができるので、溶媒の粘性などによって変化する反応生成物の拡散速度の影響を抑制することができる。そのため、反応生成物の拡散速度を速くすることができるので、酵素活性に関する検査の時間を大幅に短縮することができる。
また、検出部５には、発色剤、または発色剤と発色反応促進剤が含まれているだけのため、測定対象となる所定の酵素に対して検査素子１の共通化を図ることができる。
【００６２】
次に、本実施の形態に係る検査方法について例示をする。
本実施の形態に係る検査方法においては、前述した検査素子１、検査キット、検査装置１００を用いることができる。
ここでは一例として、前述した検査キットを用いる場合を例示する。
まず、前述した溶液を分注する。
この場合、溶液は、少なくとも測定対象となる酵素に対する基質が緩衝液に溶解されたものとすることができる。また、溶液は、測定対象となる酵素に対する基質の他に、素反応をさせる際に用いられる試薬類を緩衝液にさらに溶解させたものとすることもできる。また、検体液中に含まれる測定対象となる酵素以外の物質によって、素反応が過大となり、あるいは素反応が阻害されるような場合には、その影響を最小限化するための添加剤をさらに追加することもできる。
溶液を構成する要素（例えば、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる試薬類、緩衝液など）が個別に組み合わされたものが溶液の代わりに備えられたキットである場合には、これらを用いて溶液を作成する。
【００６３】
次に、溶液に検体液を導入する。
検体液は、例えば、測定対象となる酵素が含まれた血液や血清などを所定の倍率に希釈したものとすることができる。
溶液に検体液を導入すると、素反応が進行して反応生成物が生成される。
この場合、溶液に検体液を導入した後に攪拌することで、素反応の進行を促進させるようにすることができる。
【００６４】
次に、反応生成物が含まれている液体を検査素子１の保持空間６ａ内に所定量供給する。この反応生成物により検出部５に設けられた発色剤が発色する。この際、発色反応促進剤が含まれている場合には発色反応促進剤により発色剤の発色が促進される。
【００６５】
次に、発色剤が発色することで生じる吸光度変化量を求め、予め求められた検量線などに基づいて、吸光度変化量から酵素活性を求める。
吸光度変化量は、例えば、前述した検査部２０を用いて光検出強度を検出することで吸光度を求め、所定の時間における吸光度の差から求めるようにすることができる。
すなわち、少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、酵素を含む検体液と、を混合し、検査素子１に設けられた保持部６の内部に混合された液体を所定量供給し、検査素子１の検出部５に設けられた発色剤が発色することで生じる吸光度変化量を求め、吸光度変化量に基づいて酵素活性を求めるようにすることができる。
なお、吸光度変化量の演算、検量線に基づいて吸光度変化量から酵素活性を求めることなどは、前述したものと同様のため詳細な説明は省略する。
【００６６】
本実施の形態によれば、溶液中に測定対象となる酵素に対する基質や試薬類を含ませることができる。そのため、酵素活性を定量化する場合のように複数の試薬類を高濃度で用いることが必要となる場合であっても測定精度を向上させることができ、且つ検査時間を短縮することができる。
すなわち、溶液を反応場とすることができるので、試薬類の量が多い場合であっても試薬類が結晶化、析出するなどして散乱体が形成されることを抑制することができる。そのため、測定精度を向上させることができる。
また、溶液を反応場とすることができるので、溶媒の粘性などによって変化する反応生成物の拡散速度の影響を抑制することができる。そのため、反応生成物の拡散速度を速くすることができるので、酵素活性に関する検査の時間を大幅に短縮することができる。
【００６７】
以上、実施の形態について例示をした。しかし、本発明はこれらの記述に限定されるものではない。
前述の実施の形態に関して、当業者が適宜、構成要素の追加、削除若しくは設計変更を行ったもの、または、工程の追加、省略若しくは条件変更を行ったものも、本発明の特徴を備えている限り、本発明の範囲に包含される。
例えば、検査素子１、検査キット、検査装置１００が備える各要素の形状、寸法、材質、配置、数などは、例示をしたものに限定されるわけではなく適宜変更することができる。
また、前述した各実施の形態が備える各要素は、可能な限りにおいて組み合わせることができ、これらを組み合わせたものも本発明の特徴を含む限り本発明の範囲に包含される。
【符号の説明】
【００６８】
１ 検査素子、２ 基部、３ 光導波路部、４ 光学要素部、５ 検出部、６ 保持部、６ａ 保持空間、２０ 検査部、２１ 投光部、２２ 受光部、３０ 溶液反応部、３１ 供給部、３１ａ ノズル、３１ｂ 吸引部、３２ 溶液収納部、３３ 検体液収納部、３４ 混合部、３４ａ 収納部、３４ｂ 攪拌部、４０ 制御部、１００ 検査装置
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、検査素子、検査キット、検査装置、および検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
透明シート上に発色部、反射部、反応部、展開部が順次積層された構成を有する検査素子が知られている。
この様な検査素子においては、乾燥状態の試薬類を含んだ反応部に検体液を導入し、検体液と試薬類とが反応して生成された反応生成物を発色剤に導入することで生じる吸光度変化量を測定するようにしている。
【０００３】
この場合、測定対象が酵素であり、その活性を定量化するような場合には、反応部に複数の試薬類を多量に含ませる必要がある。そのため、散乱体が形成されて吸光度変化量の測定誤差が大きくなったり、反応生成物などの拡散速度が遅くなり検査時間が長くなったりするおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−２６６７９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の実施形態は、測定精度が高く、且つ検査時間が短い検査素子、検査キット、検査装置、および検査方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態によれば、透光性を有する基部と、前記基部の主面に互いに距離をあけて配設された一対の光学要素部と、前記基部の主面に設けられた光導波路部と、前記光導波路部の前記基部が設けられた側とは反対側の主面であって、前記光学要素部同士の間に設けられた検出部と、一端が前記検出部の主面より突出して設けられた枠状の保持部と、を備え、前記検出部は、発色剤と、前記発色剤を保持する膜形成体と、を有することを特徴とする検査素子が提供される。
【０００７】
また、他の実施形態によれば、上記の検査素子と、測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、を含む溶液と、を備えたことを特徴とする検査キットが提供される。
【０００８】
また、他の実施形態によれば、上記の検査素子と、測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、を備えたことを特徴とする検査キットが提供される。
【０００９】
また、他の実施形態によれば、上記の検査素子に設けられた一方の光学要素部に光を入射させる投光部と、他方の光学要素部からの光を受光して光の強度に応じた電気信号に変換する受光部と、を備えたことを特徴とする検査装置が提供される。
【００１０】
また、他の実施形態によれば、少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、前記酵素を含む検体液と、を混合し、上記の検査素子に設けられた保持部の内部に前記混合された液体を所定量供給し、前記検査素子の検出部に設けられた発色剤が発色することで生じる吸光度変化量を求め、前記吸光度変化量に基づいて酵素活性を求めること、を特徴とする検査方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本実施の形態に係る検査素子について例示をするための模式断面図である。
【図２】反応の様子を例示するための模式図である。
【図３】吸光度の経時的な変化を例示するための模式グラフ図である。
【図４】酵素活性（ＡＬＴ（ＧＰＴ）活性）と吸光度変化量との関係を例示するための模式グラフ図である。
【図５】本実施の形態に係る検査装置について例示をするための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面を参照しつつ、実施の形態について例示をする。なお、各図面中、同様の構成要素には同一の符号を付して詳細な説明は適宜省略する。
図１は、本実施の形態に係る検査素子について例示をするための模式断面図である。
図１に示すように、検査素子１には、基部２、光導波路部３、光学要素部４、検出部５、保持部６、保護部７が設けられている。
【００１３】
基部２は、平板状を呈し、透光性の材料から形成されている。基部２は、例えば、ガラス（例えば、無アルカリガラス）または石英などから形成されるものとすることができる。光導波路部３は、基部２より高い屈折率を有し、基部２の一方の主面上に設けられている。すなわち、光導波路部３は、基部２の主面と、後述する一対の光学要素部４と、を覆うように設けられている。光導波路部３は、高分子樹脂などから形成され、３μｍ〜３００μｍの範囲で設定されるほぼ均一な厚みの膜状体とすることができる。
【００１４】
光学要素部４は、基部２の光導波路部３が設けられた側の主面の両端部付近に一対設けられている。すなわち、光学要素部４は、基部２の主面に互いに距離をあけて一対配設されている。図１に例示をした光学要素部４は、光導波路部３に光を導入、出射させる際に回折格子として機能する。そのため、光学要素部４は、基部２より高い屈折率を有し所定のピッチ寸法で格子状に設けられている。例えば、光学要素部４は、ピッチ寸法を１μｍとし、格子状に設けられたものとすることができる。ただし、ピッチ寸法はこれに限定されるわけではなく適宜変更することができる。
【００１５】
光学要素部４は、例えば、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化錫（ＳｎＯ２）、酸化亜鉛、ニオブ酸リチウム、ガリウム砒素（ＧａＡｓ）、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）、ポリイミドなどから形成されるものとすることができる。なお、回折格子として機能する光学要素部４を例示したが、光を光導波路部３内に導入させることができる光学要素を適宜選択することができる。例えば、光学要素部は、光導波路部３に光を導入、出射させる際にプリズムとして機能するものとすることができる。
【００１６】
検出部５は、膜状を呈し、光導波路部３の基部２が設けられた側とは反対側の主面の中央部分に設けられている。すなわち、検出部５は、光導波路部３の基部２が設けられた側とは反対側の主面であって、光学要素部４同士の間に設けられている。検出部５は、発色剤と発色剤を保持する膜形成体とを有するものとすることができる。
膜形成体は、多孔質組織を有するものとすることができ、多孔質組織内の空孔に発色剤を保持するようにしたものなどを例示することができる。膜形成体の材料としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを例示することができる。
検出部５は、例えば、水とアルコールなどの水溶性有機溶媒との混合溶媒に、発色剤、造膜用高分子などを均質に混合した前駆溶液を膜状に乾燥させることで形成するようにすることができる。
【００１７】
反応生成物として過酸化水素などの過酸化物が生成される場合には、検出部５に含まれる発色剤をベンジジン系発色剤とすることができる。ベンジジン系発色剤としては、例えば、４−クロロ−１−ナフトール、３，３’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（以下、適宜、ＴＭＢＺと称する）、ＴＭＢＺの塩酸塩（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン・２ＨＣｌ・２Ｈ２Ｏ）などを例示することができる。この場合、水への溶解度が低く、生体への有害性が極めて低いＴＭＢＺを用いるようにすることもできる。
また、反応生成物としてＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）などが生成される場合には、検出部５に含まれる発色剤をテトラゾリウム塩などとすることができる。
【００１８】
ここで、検出部を膜形成体と発色剤と試薬類とから形成されるものとすれば、検体液を検出部に供給するだけで検査を行うことができる。
この場合、酵素活性を定量化するような反応系においては、２段階以上の素反応を経て最終的に生成された物質を定量する必要がある。
そのため、複数の試薬類を高濃度で用いることになり、複数の試薬類を検出部に含ませることが必要となる。
しかしながら、複数の試薬類を検出部に含ませるようにすることは困難である。
何故なら複数の試薬類を検出部に含ませることができたとしても試薬類の量が多いので、試薬類が結晶化、析出するなどして散乱体が形成されるおそれがある。そして、散乱体が形成されると後述する吸光度変化量の測定において測定誤差が大きくなるおそれがある。
【００１９】
また、この様な検出部とすれば、検体液に元々含まれる水分が反応場となり各素反応が進行することになる。そのような場合には、溶媒の粘性などによって変化する反応生成物の拡散速度の影響によって反応速度も変化することが想定され、複数の素反応をトータルした反応速度は検体の個体差による影響を少なからず受けることが予想される。そのため、反応生成物の拡散速度が遅くなり検査時間が長くなるおそれがある。また、発色剤と複数の試薬類とを含む検出部とすれば、検査素子の大型化を招くことにもなる。
【００２０】
そのため、本実施の形態においては、検出部５を発色剤と発色剤を保持する膜形成体とから形成されたものとしている。そして、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる試薬類は後述する溶液に含ませるようにし、この溶液を反応場としている。なお、この溶液に関する詳細は後述する。
【００２１】
また、検出部５を膜形成体と発色剤と発色反応促進剤とから形成されたものとすることもできる。すなわち、検出部５は、発色反応促進剤をさらに有し、膜形成体により発色剤と発色反応促進剤とが保持されたものとすることもできる。この場合、発色剤の他に発色反応促進剤が加えられることになるが、複数の試薬類を検出部に含ませる場合と比べてその量が少ないため前述した問題の発生を抑制することができる。ただし、検出部５を形成する際に用いられる前駆溶液中に発色反応促進剤を溶解させた際に、発色反応促進剤の活性が低下しないものとすることが好ましい。
【００２２】
反応生成物として過酸化水素などの過酸化物が生成される場合には、例えば、発色反応促進剤をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）などとすることができる。
反応生成物としてＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）などが生成される場合には、例えば、発色反応促進剤をジアホラーゼなどとすることができる。
なお、発色剤、発色反応促進剤は例示をしたものに限定されるわけではなく、測定対象に応じて適宜変更することができる。
【００２３】
この場合、検体液に元々含まれる水分を反応場とする場合と比べて、検出部５の上方に保持する溶液の量が多くなる。そのため、保持部６を設けることで検出部５の上方に所定量の溶液が保持できるようになっている。
保持部６は、枠状を呈し、検出部５を囲むようにして設けられている。保持部６の一方の端部は光導波路部３の主面に液密に設けられ、他方の端部は検出部５の主面から突出するようにして設けられている。そのため、検出部５の上方に後述する溶液を保持する保持空間６ａが形成されることになる。
【００２４】
この場合、保持部６により保持される液の体積を所定の値以上とすることが好ましい。 本発明者らの得た知見によれば、保持部６により保持される液の体積を１０μＬ（マイクロリットル）以上とすることが好ましい。
そのため、保持空間６ａの体積は１０μＬ（マイクロリットル）以上とすることができる。すなわち、保持部６の一端は、検出部５の上方に１０μＬ以上の体積の空間（保持空間６ａ）が形成されるように検出部５の主面より突出している。
【００２５】
保護部７は、光導波路部３の両端部であって光学要素部４が形成されている領域に対向する部分を覆うようにして設けられている。すなわち、保持部６の外側の光導波路部３の主面を覆うようにして設けられている。
保護部７は、光導波路部３を形成する材料よりも低屈折率の材料から形成されている。また、保持部６に保持される液に対する耐性の高い材料から形成されている。保護部７は、例えば、フッ素樹脂などから形成されるものとすることができる。
【００２６】
本実施の形態によれば、後述する溶液中に測定対象となる酵素に対する基質や試薬類を含ませるようにしている。そのため、酵素活性を定量化する場合のように複数の試薬類を高濃度で用いることが必要となる場合であっても測定精度を向上させることができ、且つ検査時間を短縮することができる。また、検出部５を大型化することなく対応することができる。
すなわち、溶液を反応場とすることができるので、試薬類の量が多い場合であっても試薬類が結晶化、析出するなどして散乱体が形成されることを抑制することができる。そのため、測定精度を向上させることができる。
また、溶液を反応場とすることができるので、溶媒の粘性などによって変化する反応生成物の拡散速度の影響を抑制することができる。そのため、反応生成物の拡散速度を速くすることができるので、酵素活性に関する検査の時間を大幅に短縮することができる。
また、検出部５には、発色剤、または発色剤と発色反応促進剤が含まれているだけのため、測定対象となる所定の酵素に対して検査素子１の共通化を図ることができる。
【００２７】
次に、本実施の形態に係る検査キットについて例示をする。
本実施の形態に係る検査キットは、前述した検査素子１と、少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と緩衝液とを含む溶液と、を個別に備えたキットとすることができる。 なお、溶液を構成する要素（例えば、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる試薬類、緩衝液など）が個別に組み合わされたものが溶液の代わりに備えられたキットとすることもできる。例えば、前述した検査素子１と、測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、を個別に備えたキットとすることもできる。また、素反応をさせる際に用いられる試薬類をさらに備えたものとすることもできる。
【００２８】
緩衝液は、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる試薬類を溶解させるために用いられる。この場合、緩衝液は、試薬類などの活性の低下抑制の観点から有機溶剤でないものとすることが好ましい。ただし、緩衝液は、試薬類などの活性が保たれる程度に有機溶剤を含んだものとすることができる。
【００２９】
また、緩衝液は、水素イオン指数（ｐＨ）の変動を抑制することができるものであることが好ましい。
この場合、緩衝液の水素イオン指数は、ｐＨ３．５〜１０．０、好ましくはｐＨ４．５〜９．０の範囲となるようにすることができる。
【００３０】
緩衝液は、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、各種グッド緩衝液などとすることができる。
例えば、緩衝液は、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸二ナトリウム／塩酸緩衝液、クエン酸二水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、コハク酸／四ホウ酸ナトリウム緩衝液、クエン酸水素カリウム／四ホウ酸ナトリウム緩衝液、リン酸水素二ナトリウム／クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム／塩酸緩衝液、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液などとすることができる。
【００３１】
溶液は、測定対象となる酵素に対する基質の他に、素反応をさせる際に用いられる試薬類を緩衝液にさらに溶解させたものとすることもできる。すなわち、溶液は、素反応をさせる際に用いられる試薬類をさらに含んだものとすることもできる。
【００３２】
また、検体液中に含まれる測定対象となる酵素以外の物質によって、素反応が過大となり、あるいは素反応が阻害されるような場合には、その影響を最小限化するための添加剤をさらに追加することもできる。
【００３３】
この場合、素反応をさせる際に用いられる試薬類は、測定対象となる酵素に応じて適宜選択するようにすることができる。
表１は、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる試薬類、発色剤、発色反応促進剤を例示するためのものである。
【表１】
図２は、反応の様子を例示するための模式図である。
なお、図２は、一例として、３段階の反応を経て反応生成物が生成される場合を例示するものである。
測定対象となる酵素を含む検体液が溶液中に導入されると、表１の上段から順に素反応が進行し、反応生成物（表１、図２に例示をしたものでは生成物３）が生成される。
すなわち、測定対象となる酵素と測定対象となる酵素に対する基質とが反応して生成物１が生成される。次に、生成された生成物１と試薬１とが反応して生成物２が生成される。次に、生成された生成物２と試薬２とが反応して生成物３（反応生成物）が生成される。そして、生成された生成物３（反応生成物）により発色剤が発色する。この際、発色反応促進剤により発色剤の発色が促進される。
【００３４】
例えば、反応生成物として過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が生成される場合には、生成された過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）とが反応してラジカル酸素原子（Ｏ＊）が生成される。この生成されたラジカル酸素原子（Ｏ＊）により発色剤が酸化され、例えば、ＴＭＢＺの−ＮＨ２基が＝ＮＨ基に酸化され、青緑色に発色し、さらに不溶化して検出部５の表面に沈澱する。
この発色により生じる吸光度変化量を測定することで酵素活性を定量化することができる。
【００３５】
図３は、吸光度の経時的な変化を例示するための模式グラフ図である。
図３に例示をしたものにおいては、市販の標準血清（リキッドアブノーマル、デンカ生研（株））を０．２Ｍリン酸バッファ（ｐＨ６．２）で２０倍あるいは１００倍に希釈した液に、ＡＬＴ（ＧＰＴ）に対する基質であるＬ−アラニン、α-ケトグルタル酸を最終濃度で２００ｍＭ、素反応をさせる際に用いられる試薬類であるピルビン酸オキシダーゼを最終濃度で１０ｍＭ添加した。また、酵素活性が２Ｕ／Ｌ、０．４Ｕ／Ｌとなるように混合したものを用いた。なお、酵素活性が０Ｕ／Ｌの液（ブランクの液）は、血清の代わりに同量の生理食塩水を用いた液とした。
【００３６】
図３から分かるように、保持空間６ａに酵素活性が０Ｕ／Ｌの液を供給してから３０秒程度で吸光度の変化率が概ね一定になる。
そこで、液供給から３０秒後における吸光度と、６０秒後における吸光度との差から、吸光度変化量ΔＡと酵素活性（ＡＬＴ（ＧＰＴ）活性）との関係を求めるようにした。
【００３７】
図４は、酵素活性（ＡＬＴ（ＧＰＴ）活性）と吸光度変化量との関係を例示するための模式グラフ図である。
図４に示すように、酵素活性（ＡＬＴ（ＧＰＴ）活性）と吸光度変化量との間には所定の関係がある。そのため、発色により生じる吸光度変化量を測定することで酵素活性を定量化することができる。この場合、各酵素における酵素活性と吸光度変化量との関係を予め求めて検量線としておけば、吸光度変化量の測定値から各酵素における酵素活性を容易に定量化することができる。
【００３８】
また、液供給から３０秒後における吸光度と、６０秒後における吸光度との差から、吸光度変化量を求めればよいので、６０秒程度で酵素活性を定量化することができる。そのため、酵素活性に関する検査の時間を大幅に短縮することができる。
【００３９】
本実施の形態によれば、溶液中に測定対象となる酵素に対する基質や試薬類を含ませることができる。そのため、酵素活性を定量化する場合のように複数の試薬類を高濃度で用いることが必要となる場合であっても測定精度を向上させることができ、且つ検査時間を短縮することができる。また、検出部５を大型化することなく対応することができる。
すなわち、溶液を反応場とすることができるので、試薬類の量が多い場合であっても試薬類が結晶化、析出するなどして散乱体が形成されることを抑制することができる。そのため、測定精度を向上させることができる。
また、溶液を反応場とすることができるので、溶媒の粘性などによって変化する反応生成物の拡散速度の影響を抑制することができる。そのため、反応生成物の拡散速度を速くすることができるので、酵素活性に関する検査の時間を大幅に短縮することができる。
また、検出部５には、発色剤、または発色剤と発色反応促進剤が含まれているだけのため、測定対象となる所定の酵素に対して検査素子１の共通化を図ることができる。
【００４０】
次に、本実施の形態に係る検査装置について例示をする。
図５は、本実施の形態に係る検査装置について例示をするための模式図である。
図５に示すように、検査装置１００には、検査部２０、溶液反応部３０、制御部４０が設けられている。
【００４１】
検査部２０は、前述した検査素子１を着脱可能となっている。
この場合、検査素子１は、使い捨てとすることができ、検査毎に交換されるものとすることができる。
検査部２０には、投光部２１、受光部２２が設けられている。すなわち、検査素子１に設けられた一方の光学要素部４に光を入射させる投光部２１と、他方の光学要素部４からの光を受光して光の強度に応じた電気信号に変換する受光部２２と、が設けられている。 投光部２１は、例えば、レーザダイオードなどとすることができる。受光部２２は、例えば、フォトダイオードなどとすることができる。
【００４２】
投光部２１は、一方の光学要素部４に光を入射させることができる位置に設けられている。受光部２２は、他方の光学要素部４からの光を受光することができる位置に設けられている。
ここで、投光部２１から出射し基部２を介して光学要素部４に入射した光は、光学要素部４と光導波路部３との界面で回折され、さらに光導波路部３と基部２および検出部５との界面で複数回反射しながら伝播する。この様に入射した光は、光導波路部３内を反射して伝搬するが、その際、エバネッセント波（evanescent wave）が生じる。エバネッセント波とは、光が光導波路部３と外部との界面において全反射する際、その界面に発生して表面だけを伝わる電磁波をいう。このエバネッセント波が到達する距離は、光導波路部３の表面から波長程度（１μｍ以下）の長さである。
【００４３】
そして、エバネッセント波が光導波路部３と検出部５との界面において屈折する際に、前述した検出部５の発色剤が発色することで生じる吸光度変化量に応じてエバネッセント波が吸収される。
この様にして光導波路部３内を伝播した光は、他方の光学要素部４から基部２を介して外部に出射される。外部に出射された光は、受光部２２により受光され、受光された光の強度に応じた電気信号に変換される。変換された電気信号は、制御部４０に送られる。
【００４４】
この場合、受光部２２により受光される光の強度は、検出部５の発色剤が発色することで生じる吸光度変化量に応じて変化した値（エバネッセント波の吸収に応じて変化した値）となるので、その変化率などから酵素活性を定量化することができる。
【００４５】
溶液反応部３０には、供給部３１、溶液収納部３２、検体液収納部３３、混合部３４が設けられている。
供給部３１には、ノズル３１ａが設けられ、ノズル３１ａには可撓生の配管３１ｃを介してポンプなどの吸引部３１ｂが接続されている。また、図示しない移動部によりノズル３１ａの位置を変化させることができるようになっている。この場合、図中の破線に示すようにノズル３１ａを移動させて、溶液収納部３２、検体液収納部３３、混合部３４、保持空間６ａにおいて溶液などの液体の吸引、吐出をさせることができるようになっている。
【００４６】
溶液収納部３２は、前述した溶液を収納する。例えば、測定対象となる酵素に対する基質を緩衝液に溶解させたもの、測定対象となる酵素に対する基質と素反応をさせる際に用いられる試薬類を緩衝液に溶解させたものなどを収納する。
検体液収納部３３は、測定対象となる酵素を含む検体液を収納する。例えば、希釈された血液や血清などの検体液を収納する。
【００４７】
混合部３４には、収納部３４ａと攪拌部３４ｂが設けられている。
収納部３４ａには、供給部３１により所定量の溶液と、検体液とが供給され、攪拌部３４ｂにより溶液と検体液とが攪拌される。
すなわち、混合部３４は、少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、酵素を含む検体液と、を混合する。
【００４８】
制御部４０は、検査部２０、溶液反応部３０に設けられた各要素の動作を制御する。また、受光部２２から送られてきた電気信号に基づいて、酵素活性を定量化する。
【００４９】
この場合、以下の（１）式により所定の時間後の吸光度Ａを演算し、さらに吸光度変化量ΔＡを演算するようにすることができる。例えば、（１）式により液供給から３０秒後における吸光度Ａ（３０）と、６０秒後における吸光度Ａ（６０）とを演算し、さらに吸光度Ａ（３０）と吸光度Ａ（６０）との差から吸光度変化量ΔＡを演算するようにすることができる。
そして、前述したように、予め求められた検量線などに基づいて、吸光度変化量ΔＡから酵素活性を求めるようにすることができる。
【００５０】
Ａ(ｔ１)＝−ｌｏｇ(Ｉ(ｔ１)／Ｉ(ｔ０)) ・・・（１）
ここで、Ａ(ｔ１)はｔ＝ｔ０を初期値とした場合のｔ１秒後の吸光度、Ｉ(ｔ０)は時間ｔ０における光検出強度（例えば、受光部２２の出力値）、Ｉ(ｔ１)はｔ＝ｔ０を初期値とした場合のｔ１秒後の光検出強度（例えば、受光部２２の出力値）である。
【００５１】
次に、検査装置１００の作用について例示をする。
まず、作業者などにより溶液収納部３２に溶液が供給され、検体液収納部３３に希釈された血液や血清などの検体液が供給される。また、検査部２０に検査素子１が装着される。
【００５２】
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を溶液収納部３２内の溶液中に入れる。そして、吸引部３１ｂを作動させることで所定量の溶液を吸引する。
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を収納部３４ａ内に入れる。そして、吸引部３１ｂを作動させることで溶液を収納部３４ａ内に吐出する。
【００５３】
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を検体液収納部３３内の検体液中に入れる。そして、吸引部３１ｂを作動させることで所定量の検体液を吸引する。
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を収納部３４ａ内に入れる。そして、吸引部３１ｂを作動させることで検体液を収納部３４ａ内に吐出する。
【００５４】
収納部３４ａ内に所定量の溶液と検体液とが供給されると、検体液に含まれる酵素と、溶液に含まれる測定対象となる酵素に対する基質や試薬類との素反応が進行し、反応生成物が生成される。この際、攪拌部３４ｂにより溶液と検体液とが攪拌されることで素反応の進行が促進される。
【００５５】
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を収納部３４ａ内の液体中に入れる。そして、吸引部３１ｂを作動させることで所定量の液体を吸引する。この場合、この液体には生成された反応生成物が含まれている。
次に、図示しない移動部によりノズル３１ａを移動させて、ノズル３１ａの先端部を保持空間６ａの直上に位置決めする。そして、吸引部３１ｂを作動させることで反応生成物が含まれている液体を保持空間６ａ内に吐出する。保持空間６ａ内に吐出された液体に含まれている反応生成物により検出部５に設けられた発色剤が発色する。この際、発色反応促進剤が含まれている場合には発色反応促進剤により発色剤の発色が促進される。
【００５６】
次に、投光部２１からレーザ光などの光を出射させ、光導波路部３内を反射して伝搬させることでエバネッセント波を発生させる。そして、エバネッセント波が光導波路部３と検出部５との界面において屈折する際には、前述した検出部５の発色剤が発色することで生じる吸光度変化量に応じてエバネッセント波が吸収される。
【００５７】
光導波路部３内を伝播した光は、他方の光学要素部４から基部２を介して外部に出射され、受光部２２により受光される。受光部２２により受光された光の強度は、検出部５の発色剤が発色することで生じる吸光度変化量に応じて変化した値となるので、その変化率などから酵素活性を定量化する。
【００５８】
なお、前述したものの場合には、測定対象となる酵素に対する基質を緩衝液に溶解させたものや、測定対象となる酵素に対する基質と素反応をさせる際に用いられる試薬類を緩衝液に溶解させたものを溶液収納部３２に収納する場合を例示したがこれに限定されるわけではない。例えば、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる各試薬類をそれぞれ緩衝液に溶解させたものを個別に収納し、供給部３１により各溶液を収納部３４ａに個別に供給するようにしてもよい。
【００５９】
また、溶液反応部３０は必ずしも必要ではなく、例えば、作業者が前述した溶液と検体液とを混合させて、生成された反応生成物を含む液体を保持空間６ａ内に供給するようにしてもよい。
また、制御部４０も必ずしも必要ではなく、例えば、受光部２２から送られてきた電気信号を別途設けられた演算手段などで演算するようにしてもよい。
【００６０】
また、ノズル３１ａの内部や可撓生の配管３１ｃの内部などを洗浄する洗浄手段を適宜設けるようにすることができる。例えば、洗浄水などを吸引させてノズル３１ａの内部や可撓生の配管３１ｃの内部などを洗浄したり、可撓生の配管３１ｃに洗浄水などを導入してノズル３１ａの内部や可撓生の配管３１ｃの内部などを洗浄したりすることができる。
【００６１】
本実施の形態によれば、溶液中に測定対象となる酵素に対する基質や試薬類を含ませることができる。そのため、酵素活性を定量化する場合のように複数の試薬類を高濃度で用いることが必要となる場合であっても測定精度を向上させることができ、且つ検査時間を短縮することができる。また、検出部５を大型化することなく対応することができる。
すなわち、溶液を反応場とすることができるので、試薬類の量が多い場合であっても試薬類が結晶化、析出するなどして散乱体が形成されることを抑制することができる。そのため、測定精度を向上させることができる。
また、溶液を反応場とすることができるので、溶媒の粘性などによって変化する反応生成物の拡散速度の影響を抑制することができる。そのため、反応生成物の拡散速度を速くすることができるので、酵素活性に関する検査の時間を大幅に短縮することができる。
また、検出部５には、発色剤、または発色剤と発色反応促進剤が含まれているだけのため、測定対象となる所定の酵素に対して検査素子１の共通化を図ることができる。
【００６２】
次に、本実施の形態に係る検査方法について例示をする。
本実施の形態に係る検査方法においては、前述した検査素子１、検査キット、検査装置１００を用いることができる。
ここでは一例として、前述した検査キットを用いる場合を例示する。
まず、前述した溶液を分注する。
この場合、溶液は、少なくとも測定対象となる酵素に対する基質が緩衝液に溶解されたものとすることができる。また、溶液は、測定対象となる酵素に対する基質の他に、素反応をさせる際に用いられる試薬類を緩衝液にさらに溶解させたものとすることもできる。また、検体液中に含まれる測定対象となる酵素以外の物質によって、素反応が過大となり、あるいは素反応が阻害されるような場合には、その影響を最小限化するための添加剤をさらに追加することもできる。
溶液を構成する要素（例えば、測定対象となる酵素に対する基質、素反応をさせる際に用いられる試薬類、緩衝液など）が個別に組み合わされたものが溶液の代わりに備えられたキットである場合には、これらを用いて溶液を作成する。
【００６３】
次に、溶液に検体液を導入する。
検体液は、例えば、測定対象となる酵素が含まれた血液や血清などを所定の倍率に希釈したものとすることができる。
溶液に検体液を導入すると、素反応が進行して反応生成物が生成される。
この場合、溶液に検体液を導入した後に攪拌することで、素反応の進行を促進させるようにすることができる。
【００６４】
次に、反応生成物が含まれている液体を検査素子１の保持空間６ａ内に所定量供給する。この反応生成物により検出部５に設けられた発色剤が発色する。この際、発色反応促進剤が含まれている場合には発色反応促進剤により発色剤の発色が促進される。
【００６５】
次に、発色剤が発色することで生じる吸光度変化量を求め、予め求められた検量線などに基づいて、吸光度変化量から酵素活性を求める。
吸光度変化量は、例えば、前述した検査部２０を用いて光検出強度を検出することで吸光度を求め、所定の時間における吸光度の差から求めるようにすることができる。
すなわち、少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、酵素を含む検体液と、を混合し、検査素子１に設けられた保持部６の内部に混合された液体を所定量供給し、検査素子１の検出部５に設けられた発色剤が発色することで生じる吸光度変化量を求め、吸光度変化量に基づいて酵素活性を求めるようにすることができる。
なお、吸光度変化量の演算、検量線に基づいて吸光度変化量から酵素活性を求めることなどは、前述したものと同様のため詳細な説明は省略する。
【００６６】
本実施の形態によれば、溶液中に測定対象となる酵素に対する基質や試薬類を含ませることができる。そのため、酵素活性を定量化する場合のように複数の試薬類を高濃度で用いることが必要となる場合であっても測定精度を向上させることができ、且つ検査時間を短縮することができる。
すなわち、溶液を反応場とすることができるので、試薬類の量が多い場合であっても試薬類が結晶化、析出するなどして散乱体が形成されることを抑制することができる。そのため、測定精度を向上させることができる。
また、溶液を反応場とすることができるので、溶媒の粘性などによって変化する反応生成物の拡散速度の影響を抑制することができる。そのため、反応生成物の拡散速度を速くすることができるので、酵素活性に関する検査の時間を大幅に短縮することができる。
【００６７】
以上、実施の形態について例示をした。しかし、本発明はこれらの記述に限定されるものではない。
前述の実施の形態に関して、当業者が適宜、構成要素の追加、削除若しくは設計変更を行ったもの、または、工程の追加、省略若しくは条件変更を行ったものも、本発明の特徴を備えている限り、本発明の範囲に包含される。
例えば、検査素子１、検査キット、検査装置１００が備える各要素の形状、寸法、材質、配置、数などは、例示をしたものに限定されるわけではなく適宜変更することができる。
また、前述した各実施の形態が備える各要素は、可能な限りにおいて組み合わせることができ、これらを組み合わせたものも本発明の特徴を含む限り本発明の範囲に包含される。
【符号の説明】
【００６８】
１ 検査素子、２ 基部、３ 光導波路部、４ 光学要素部、５ 検出部、６ 保持部、６ａ 保持空間、２０ 検査部、２１ 投光部、２２ 受光部、３０ 溶液反応部、３１ 供給部、３１ａ ノズル、３１ｂ 吸引部、３２ 溶液収納部、３３ 検体液収納部、３４ 混合部、３４ａ 収納部、３４ｂ 攪拌部、４０ 制御部、１００ 検査装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透光性を有する基部と、
前記基部の主面に互いに距離をあけて配設された一対の光学要素部と、
前記基部の主面に設けられた光導波路部と、
前記光導波路部の前記基部が設けられた側とは反対側の主面であって、前記光学要素部同士の間に設けられた検出部と、
一端が前記検出部の主面より突出して設けられた枠状の保持部と、
を備え、
前記検出部は、発色剤と、前記発色剤を保持する膜形成体と、を有することを特徴とする検査素子。
【請求項２】
前記保持部の一端は、前記検出部の上方に１０μＬ以上の体積の空間が形成されるように前記検出部の主面より突出したこと、を特徴とする請求項１記載の検査素子。
【請求項３】
前記検出部は、発色反応促進剤をさらに有し、前記膜形成体により前記発色剤と前記発色反応促進剤とが保持されたことを特徴とする請求項１または２に記載の検査素子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の検査素子と、
測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、を含む溶液と、
を備えたことを特徴とする検査キット。
【請求項５】
前記溶液は、素反応をさせる際に用いられる試薬類をさらに含んだこと、を特徴とする請求項４記載の検査キット。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の検査素子と、
測定対象となる酵素に対する基質と、
緩衝液と、
を備えたことを特徴とする検査キット。
【請求項７】
素反応をさせる際に用いられる試薬類をさらに備えたこと、を特徴とする請求項６記載の検査キット。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の検査素子に設けられた一方の光学要素部に光を入射させる投光部と、他方の光学要素部からの光を受光して光の強度に応じた電気信号に変換する受光部と、を備えたことを特徴とする検査装置。
【請求項９】
少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、前記酵素を含む検体液と、を混合する混合部をさらに備えたこと、を特徴とする請求項８記載の検査装置。
【請求項１０】
少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、前記酵素を含む検体液と、を混合し、請求項１〜３のいずれか１つに記載の検査素子に設けられた保持部の内部に前記混合された液体を所定量供給し、前記検査素子の検出部に設けられた発色剤が発色することで生じる吸光度変化量を求め、前記吸光度変化量に基づいて酵素活性を求めること、を特徴とする検査方法。
【請求項１】
透光性を有する基部と、
前記基部の主面に互いに距離をあけて配設された一対の光学要素部と、
前記基部の主面に設けられた光導波路部と、
前記光導波路部の前記基部が設けられた側とは反対側の主面であって、前記光学要素部同士の間に設けられた検出部と、
一端が前記検出部の主面より突出して設けられた枠状の保持部と、
を備え、
前記検出部は、発色剤と、前記発色剤を保持する膜形成体と、を有することを特徴とする検査素子。
【請求項２】
前記保持部の一端は、前記検出部の上方に１０μＬ以上の体積の空間が形成されるように前記検出部の主面より突出したこと、を特徴とする請求項１記載の検査素子。
【請求項３】
前記検出部は、発色反応促進剤をさらに有し、前記膜形成体により前記発色剤と前記発色反応促進剤とが保持されたことを特徴とする請求項１または２に記載の検査素子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の検査素子と、
測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、を含む溶液と、
を備えたことを特徴とする検査キット。
【請求項５】
前記溶液は、素反応をさせる際に用いられる試薬類をさらに含んだこと、を特徴とする請求項４記載の検査キット。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の検査素子と、
測定対象となる酵素に対する基質と、
緩衝液と、
を備えたことを特徴とする検査キット。
【請求項７】
素反応をさせる際に用いられる試薬類をさらに備えたこと、を特徴とする請求項６記載の検査キット。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の検査素子に設けられた一方の光学要素部に光を入射させる投光部と、他方の光学要素部からの光を受光して光の強度に応じた電気信号に変換する受光部と、を備えたことを特徴とする検査装置。
【請求項９】
少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、前記酵素を含む検体液と、を混合する混合部をさらに備えたこと、を特徴とする請求項８記載の検査装置。
【請求項１０】
少なくとも測定対象となる酵素に対する基質と、緩衝液と、前記酵素を含む検体液と、を混合し、請求項１〜３のいずれか１つに記載の検査素子に設けられた保持部の内部に前記混合された液体を所定量供給し、前記検査素子の検出部に設けられた発色剤が発色することで生じる吸光度変化量を求め、前記吸光度変化量に基づいて酵素活性を求めること、を特徴とする検査方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−５５２５７（Ｐ２０１２−５５２５７Ａ）
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０３１１８（Ｐ２０１０−２０３１１８）
【出願日】平成２２年９月１０日（２０１０．９．１０）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１０日（２０１０．９．１０）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
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