標的分子の分離・検出方法
【課題】フォトアプタマーを用いずに、フォトアプタマーのコンセプトを通常のアプタマーで実施することによって、標的分子を簡易かつ安価で効率よく検出する方法の提供。
【解決手段】試料中の標的分子を検出するための方法であって、（１）試料中の標的分子と、その標的分子と特異的に反応するアプタマー（フォトアプタマーを除く）を接触させる工程、（２）前記標的分子と前記アプタマーとを含む試料に対して２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射することにより、標的分子とアプタマーとの間の共有結合を促進させ、標的分子とアプタマーとの複合体を得る工程、および（３）前記工程（２）にて得られた、標的分子とアプタマーとの複合体を分離して標的分子を検出する工程、を含むことを特徴とする標的分子の検出方法。
【解決手段】試料中の標的分子を検出するための方法であって、（１）試料中の標的分子と、その標的分子と特異的に反応するアプタマー（フォトアプタマーを除く）を接触させる工程、（２）前記標的分子と前記アプタマーとを含む試料に対して２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射することにより、標的分子とアプタマーとの間の共有結合を促進させ、標的分子とアプタマーとの複合体を得る工程、および（３）前記工程（２）にて得られた、標的分子とアプタマーとの複合体を分離して標的分子を検出する工程、を含むことを特徴とする標的分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の蛋白質などの標的分子を分離、検出するための技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より蛋白質等の標的分子を分離する手法として、各種クロマトグラフィー、電気泳動などが知られている。これらの技術は標的物質に反応する分子（マーカー）を用いて標的分子に目印をつけ、マーカーと標的分子の複合体を検出する技術と組み合わせて利用されてきた。
【０００３】
例えば、ＥＬＩＳＡ法などにおいてマーカー分子として従来から利用されている抗体は、特異性は高いものの作成に時間と費用がかかるため、昨今ではＤＮＡもしくはＲＮＡからなるアプタマーと呼ばれる機能性分子を用いることがある。これらアプタマーは抗体と同じように標的分子に対し特異的に反応し、かつ化学的に合成可能である。
【０００４】
アプタマーが比較的合成の容易な分子であることを利用し、一部におよそ３１０ｎｍ程度の光励起により共有結合による架橋を促進する分子（光反応性官能基）を導入したものがフォトアプタマー（photoaptamer）と呼ばれるもので、これを用いた分離・検出技術も報告されている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６４５８５３９号
【特許文献２】米国特許第６５４４７７６号
【特許文献３】米国特許第５７６３１７７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のようなフォトアプタマーは、標的分子とアプタマーを共有結合によって強固に固定化することにより、分離、検出に係る処理の制限を軽減することができる点において優れている。特に洗浄においては、強力な洗浄を行っても標的分子とアプタマーの結合が外れないので、背景雑音となる非特異吸着を洗浄することができ、その結果として検出感度が高くなるなどの利点を有する。
【０００７】
しかしながら、フォトアプタマーを用いた分子デザインはアプタマーの機能向上を一部限定するもので、特異性の向上が阻害される可能性もあり、かつ作製が通常のアプタマーより複雑なためコストが増加する。
【０００８】
本発明は、このような事情に鑑み、これらフォトアプタマーと同じコンセプトを、低コストであり、かつ機能が限定されることのない通常のアプタマーで行うための技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、フォトアプタマーでない通常のアプタマーに、特定範囲の紫外線を照射することにより、そのアプタマーと標的分子間の共有結合が促進され、強固になることを見出し、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることによって本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の一態様に係る、試料中の標的分子を検出するための方法は、（１）試料中の標的分子と、その標的分子と特異的に反応するアプタマー（フォトアプタマーを除く）を接触させる工程、（２）前記標的分子と前記アプタマーとを含む試料に対して２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射することにより、標的分子とアプタマーとの間の共有結合を促進させ、標的分子とアプタマーとの複合体を得る工程、および（３）前記工程（２）にて得られた、標的分子とアプタマーとの複合体を分離して、標的分子を検出する工程、を含むことを特徴とする。
【００１１】
通常のアプタマーは前記範囲の紫外線に強い吸収を有するため、この範囲の波長で励起すると、特にアプタマーに含まれるチミンが近傍に存在するアミノ酸分子と共有結合するため、アプタマーと標的分子が強固な結合を有する複合体を形成することになる。また、これらの結合反応が起きるためには分子間距離が十分に近距離である必要があるため、非特異的吸着を形成している分子と複合体を形成することは一般的に困難である。よって、アプタマーが特異的に吸着する分子のみがアプタマーと架橋されることになる。
【００１２】
さらに、標的分子が蛋白質である場合、前記範囲の紫外線照射では蛋白質を分解する恐れがあるが、あらかじめアプタマーと特異的吸着をした蛋白質は分解される速度が吸着していない蛋白質よりも遅くなるため、アプタマーと反応しない蛋白質（夾雑物）は分解され、目的の分子のみが残る。よって、前記範囲の紫外線を高強度に照射するだけで、結合と分離を同時に行うことができる。
【００１３】
また、前記範囲の波長としては、水銀ランプなどの強い発光を用いることができ、励起光源は比較的安価に入手可能であるため、高価な光源設備も必要がない。
【００１４】
したがって、前記検出方法によれば、フォトアプタマーよりも安価で構成上の規制もない通常のアプタマーを用いて、上述したようなフォトアプタマーの利点を有しつつ、簡易かつ迅速に標的分子を分離・検出することができる。
【００１５】
さらに、前記検出方法において、前記（３）工程で、前記アプタマーと一部相補配列を持つＤＮＡを用いて、標的分子とアプタマーとの複合体を分離することが好ましい。
【００１６】
また、前記検出方法において、前記（３）工程で、標的分子とアプタマーとの複合体を分離する前に、ＤＮＡ分解酵素によって未反応のアプタマーを分解することが好ましい。こうして、未反応アプタマーの残渣を優先的に排除することにより、分離を行う際、例えばＤＮＡの相補鎖を利用したアフィニティークロマトに順ずる手法を用いる場合やＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションを行う場合における、未反応のアプタマーが競合することを抑えることができる。紫外線架橋によって作成した複合体は標的蛋白質とアプタマーが近距離を保つため、分解酵素との反応性が低く、基本的には未反応のアプタマーから優先的に分解されることとなる。
【００１７】
また、本実施形態の検出方法において検出される標的分子は、蛋白質であることが好適である。
【００１８】
さらに、本発明は、別の一態様として、標的分子に特異的に反応するアプタマー、２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射可能な光源、および標的分子とアプタマーとの複合体を分離する手段を含む、標的分子を検出するためのキットも提供する。
【発明の効果】
【００１９】
以上のように、本発明によれば、フォトアプタマーではない通常のアプタマーを用いて、簡易、安価かつ迅速に標的分子を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の分離工程における一例（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動）の結果のサンプルを示す。
【図２】図２は、実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（1-a）およびウェスタンブロッティング(1-b)の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係る実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
［標的分子の検出方法］
本実施形態に係る、試料中の標的分子の検出方法は、以下の工程を含む：
（１）試料中の標的分子と、その標的分子と特異的に反応するアプタマー（フォトアプタマーを除く）を接触させる工程、
（２）前記標的分子と前記アプタマーとを含む試料に対して２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射することにより、標的分子とアプタマーとの間の共有結合を促進させ、標的分子とアプタマーとの複合体を得る工程、および
（３）前記工程（２）にて得られた、標的分子とアプタマーとの複合体を分離して、標的分子を検出する工程。
【００２３】
以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
（１）接触工程
本工程は、試料中の標的分子と、その標的分子と特異的に反応するアプタマーを接触させる工程である。本工程における、標的分子とアプタマーを接触させる条件は、特に制限されないが、標的分子が変性などを起こさないような条件（温度、ｐＨなど）を採用することが好ましい。具体的には、例えば、適切な条件に調整した溶液（バッファーなど）中にて標的分子とアプタマーを混合することによって、両者を接触させる方法などが挙げられる。
【００２４】
（試料）
本実施形態において、「試料」とは、複数の分子を含有し、少なくとも一つの標的分子を含んでいる可能性のある、あらゆる溶液、物質、混合物などをさす。
【００２５】
（標的分子）
本実施形態における「標的分子」とは、試料中において分離・検出を所望する標的の分子を指し、特に限定はされない。例えば、蛋白質、糖、ヌクレオチド、ビタミン、基質などの分子が本実施形態の検出方法の標的となり得る。
【００２６】
なお、後述するように、特定範囲の紫外線照射により、アプタマーに含まれるチミン（Ｔ）と、近傍に存在するアミノ酸分子（中でも、リジン、チロシン、セリン、スレオニンなどのアミノ酸分子）との共有結合が促進されるため、標的分子中にこれらのアミノ酸分子が含まれていることが好ましい。よって、本実施形態における標的分子は、リジン、チロシン、セリン、スレオニンなどのアミノ酸分子を有する蛋白質であることが好ましい。
【００２７】
また、検出方法に適しているという観点からは、標的分子が水溶性蛋白質であることが好ましい。
【００２８】
さらに、本実施形態において標的分子として好ましい蛋白質の具体例としては、例えば、酵素、疾病マーカー、薬効作用を有する蛋白質などが挙げられる。なかでもトロンビン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、免疫グロブリン（ＩｇＥ）などが、標的分子として好適である。
【００２９】
また、標的分子を修飾して、標的分子とアプタマー間の相互作用が強くなるよう設計することも可能である。
【００３０】
（アプタマー）
本実施形態における「アプタマー」とは、特定の標的分子に結合する核酸リガンドをさし、フォトアプタマーを除くアプタマーであって、上述したような標的分子に特異的に反応するものであれば、特に限定なく本実施形態で用いることができる。
【００３１】
このようなアプタマーは、１９９０年にＧｏｌｄら（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．ａｎｄ Ｇｏｌｄ Ｌ．（１９９０）．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）によって初めてその概念が報告されている。
【００３２】
アプタマーは、化学的に合成が可能なことから抗体などのマーカー分子よりも低コストで用いることができ、さらに容易に化学修飾ができることや、容易に特定の構造を持つように設計できることなど、マーカー分子としての利点を多く有する。
【００３３】
本実施形態で用いられるアプタマーは、１５〜５０塩基程度の一本鎖ＤＮＡであることが好ましく、２０〜４０塩基程度の一本鎖ＤＮＡであることがより好ましい。
【００３４】
さらに、本実施形態に係るアプタマーの配列には、標的分子と結合する部分とは別に、制限酵素の切断配列、バッファ配列、またはタグ配列など、必要に応じた修飾のための配列などが含まれていてもよい。
【００３５】
また、後述するように、特定範囲の紫外線照射により、核酸塩基の１つであるチミン（Ｔ）と近傍にある所定のアミノ酸との共有結合が促進されるため、本実施形態で用いるアプタマーは、チミンを含む配列を有するアプタマーであることが好適である。
【００３６】
このようなアプタマーは、例えば、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法（前述のＧｏｌｄらの文献（１９９０）参照）などに記載の方法によって、獲得または同定され得る。
【００３７】
具体的には、例えば、ＳＥＬＥＸ法を用いた場合、標的分子を担体に固定化し、これに核酸ライブラリを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これを増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を１０回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得することが可能である。
【００３８】
さらに、特開２００７−１４２９２号公報には前記ＳＥＬＥＸ法をより効率よくしたアプタマーの同定方法が記載されているが、該文献記載の同定方法によってもアプタマーを同定・獲得することができる。
【００３９】
このようなＳＥＬＥＸ法やその改良法などにより、上述したような具体例以外にも、あらゆる分子に対して特異的に結合するアプタマーを得ることができると考えられるため、所望の標的分子などについてその活性を阻害するアプタマーを取得し、その配列に基づいてアプタマーを設計することもできる。
【００４０】
また、ＳＥＬＥＸ法などによって得られたアプタマー、または既知のアプタマーを用いて、進化模倣的アルゴリズムを使用することによって、標的分子に対してより高い結合能を示すアプタマーを得ることもできる（Ｋ． Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏ， Ｙ． Ｏｋｕｍｕｒａ， Ｋ． Ｓｕｍｉｋｕｒａ， Ｉ． Ｋａｒｕｂｅ， Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＤＮＡ ａｐｔａｍｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ−ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３ （２００５） ｅ１０８．参照）。
【００４１】
また、得られたアプタマーの標的分子との架橋（結合）効率は、例えば、後述する実施例１記載の方法などを用いて調べることができる。
【００４２】
本実施形態において使用できるアプタマーの具体例としては、前記標的分子と特異的に結合するアプタマー、例えば、トロンビン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、免疫グロブリン（ＩｇＥなど）などと特異的に結合するそれぞれのアプタマーが挙げられる。なお、例えば、トロンビンアプタマーは配列番号１、ＶＥＧＦアプタマーは配列番号２で表される塩基配列を有するものを使用することができる。
【００４３】
（２）複合体形成工程
次の工程（２）は、前記工程（１）で接触させた標的分子とアプタマーとを含む試料に対して、２４０〜２８０ｎｍの範囲の紫外線を照射する工程である。この工程により、標的分子とアプタマーとの間の共有結合を促進させ、標的分子とアプタマーとの複合体を得ることができる。
【００４４】
前記波長範囲で励起すると、アプタマー、特にそのアプタマーに含まれるチミン（Ｔ）が、近傍に存在するアミノ酸分子（中でも、リジン、チロシン、セリン、スレオニンなどのアミノ酸分子）と共有結合するため、結果としてアプタマーと標的分子が強固な結合を有する複合体を形成する。
【００４５】
また、前記反応が起きるためには分子間距離が十分に近距離である必要があるため、非特異的吸着を形成している分子と複合体を形成することは一般的に困難である。したがって、アプタマーが特異的に吸着する分子のみがアプタマーと結合（架橋）されることになる。特に結合能の高いアプタマーを用いることで、より特異性の高い結合（架橋）反応を行うことができ、フォトアプタマーの機能を代替することが可能である。
【００４６】
照射の波長範囲は、通常、２４０〜２８０ｎｍの範囲であり、好ましくは２４５〜２６５ｎｍの範囲である。照射波長が２４０ｎｍ未満であると、照射に対する光吸収の効率が小さく、架橋が十分に進まないため不適であり、２８０ｎｍを超えるとアプタマーの光吸収は小さくなる一方、蛋白質分子に対しては光吸収の効率が高くなり、試料へのダメージが大きくなるため好ましくない。特に２８０ｎｍを超える紫外線はタンパク質中のチロシン、トリプトファンの吸収強度が高く、標的分子の破壊が促進されるため適さない。
【００４７】
なお、標的分子が蛋白質である場合は、前記波長範囲の紫外線照射で蛋白質が分解される恐れがあるが、前記工程（１）によりあらかじめ標的分子（蛋白質）はアプタマーと吸着しているため、吸着している蛋白質の分解される速度は遅くなるため、アプタマーと反応しない蛋白質（夾雑物）のみが分解され、目的の標的分子（蛋白質）は全長を保ったまま得られる。つまり、本実施形態によれば、前記波長範囲の紫外線を高強度に照射するだけで、標的分子とアプタマーの結合および標的分子の分離を同時に行うことができるため、非常に迅速な検出が可能となる。
【００４８】
前記紫外線照射は、照射する紫外線の総量として１０Ｗ〜１０００Ｗ、より好ましくは１５Ｗ〜１５０Ｗであり、その際の紫外線強度密度は１００ｍＷ／ｃｍ２〜２０００ｍＷ／ｃｍ２が好ましい。紫外線総量が１０Ｗ以下であると標的分子とアプタマーとの間の共有結合が十分に促進されず、１０００Ｗ以上であると紫外線照射による標的分子の損傷が起こる恐れがあるので好ましくない。また、照射密度が１００ｍＷ／ｃｍ２よりも小さくなると照射時間が長く必要になり、２０００ｍＷ／ｃｍ２以上になると分子の損傷程度をコントロールすることが困難になる他、光源の入手も困難となるため、好ましくない。
【００４９】
本工程で紫外線照射に用いられる光源としては、前記波長範囲の紫外線を照射できることが可能な光源であれば、特に限定されずに用いることができる。具体例としては、水銀ランプ、ＬＥＤ、固体レーザ（ＹＡＧ4倍波）などの光源が挙げられ、入手容易性・コストなどの観点から、水銀ランプなどを用いることが好ましい。
【００５０】
本工程における、具体的な照射方法の一例としては、水銀ランプからバンドパスフィルターなどを用いて前記範囲の紫外線を取り出し、前記強度の範囲にて前記照射時間内で、前記工程（１）にて接触させた標的分子とアプタマーとを含む試料に対して照射する方法などが挙げられる。
【００５１】
以上より、本工程によって、標的分子と、その標的分子に特異的に反応するアプタマーとの強固な共有結合による複合体が得られる。
【００５２】
（３）分離・検出工程
次に、前記工程（２）で得られた標的分子とアプタマーの複合体を分離し、標的分子を検出する。試料中に標的分子が存在すれば、前記工程（２）における紫外線照射により、その標的分子と特異的に反応するアプタマーとの複合体が試料中に生成されるはずであるから、その複合体を分離することにより、迅速に試料中の標的分子の存在の有無を調べることができる。
【００５３】
前記複合体を分離する方法としては、特に限定はされないが、例えば、種々の電気泳動（１次元、２次元）、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど、公知の分離方法を適宜選択して用いることができる。
【００５４】
分離した分子の検出手法には、染色、蛍光、化学発光、吸光光度法、光熱変換法など、蛋白質あるいはＤＮＡを検出する一般的な手法を特に制限なく用いることができる。
【００５５】
例えば、より具体的な分離・検出工程の一実施形態として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル）電気泳動によって分離を行う場合を以下に説明する。
【００５６】
まず、標的分子およびその標的分子と特異的に反応するアプタマーを含む試料に上述の範囲の紫外線を照射した試料を架橋試料、照射しない試料を混合試料とする。
【００５７】
別途そのアプタマーと標的分子のみで作成しておいた紫外線架橋複合体（試料１）および非紫外線架橋複合体（試料２）を質量マーカーとし、得られた混合試料と架橋試料を適切な条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分離する。
【００５８】
すると、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の作用により、通常のアプタマー−標的分子の複合体は結合を失い、マーカーと同位置のバンドは消失あるいは淡くなるが、紫外線架橋された複合体はＳＤＳの作用後も結合を保持しているため、マーカーと同位置のバンドが消失することは無い。このように定性的には、得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのバンド濃淡を視覚的に判断することで試料中の標的分子の有無を判断することが出来る（図１参照）。
【００５９】
また、ＣＣＤ画像等で得られるバンドの濃淡を比較することで、試料中の標的分子の濃度を簡便に定量することができる。
【００６０】
例えば架橋試料のマーカー位置のバンド濃度をＬ、ネガティブコントロールに紫外線照射した試料のマーカー位置のバンド濃度をＮとすると、Ｌ−Ｎが紫外線架橋複合体量に相当する。マーカーに使用した試料１との濃度比から標的分子の量を検出することが可能である。
【００６１】
本実施形態における分離方法として、より好ましくは、前記複合体の分離・回収を容易にするため、前記アプタマーと一部相補配列を持つＤＮＡを用いて、前記複合体分離する方法が挙げられる。より具体的には、例えば、前記ＤＮＡの相補配列を利用したアフィニティークロマトグラフィー、あるいはＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションなどの公知の方法が挙げられる。なお、これらの方法を用いる場合、未反応のアプタマーが競合する可能性が十分に考えられるため、未反応アプタマーの残渣を優先的に排除して阻害を防ぐことが重要である。
【００６２】
そのために、標的分子とアプタマーとの複合体を分離する前に、ＤＮＡ分解酵素などを用いて未反応アプタマーを分解し排除することが好ましい。紫外線架橋によって作成された複合体は、標的蛋白質とアプタマーが近距離を保つため、分解酵素との反応性が低く、基本的には未反応のアプタマーから優先的に分解されることとなる。従って、通常のＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションのように、未反応の１本鎖ＤＮＡは１本鎖分解酵素を用いて分解することが可能である。
【００６３】
具体的には、例えば、後述の実施例３に記載したような方法を用いることができる。
【００６４】
[標的分子検出用キット]
本発明は、さらに、標的分子を検出するためのキットを提供する。本発明に係るキットの一実施形態としては、上述したアプタマーを含む標的分子検出用キットが挙げられる。このようなキットには、前記アプタマーに加え、標的分子、２４０〜２８０ｎｍの紫外線照射可能な光源、標的分子とアプタマーとの複合体を分離する手段（試薬、溶液、器機など）、及び使用のための説明書などが含まれていてもよい。なお、キットに包含されるアプタマーなどは、凍結乾燥させた試薬の形態や保存溶液中の溶液の形態など、種々の形態で提供され得る。
【実施例】
【００６５】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【００６６】
トロンビンを含む試料に対する分離、検出の実施形態を下記に説明する。
[実施例１]
（トロンビン−アプタマー複合体）
既知のトロンビンアプタマー（配列番号１）（K. Ikebukuro, Y. Okumura, K. Sumikura, I. Karube, A novel method of screening thrombin-inhibiting DNA aptamers using an evolution-mimicking algorithm, Nucleic Acids Res 33 (2005) e108.参照）を用いて、トロンビンとトロンビンアプタマーの反応性及びＵＶでの架橋を調べるために次の操作を行った。
【００６７】
まず、使用するトロンビンアプタマーをビオチン化し（以後、単にトロンビンアプタマーと呼称することもある）、調整したバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））中にてトロンビンとトロンビンアプタマーを混合し、１５〜３０分室温にてインキュベートした。液量は１００μＬとし、トロンビン終濃度３μＭ、トロンビンアプタマー終濃度１μＭに調整した。
【００６８】
調整した試料を、波長２５４ｎｍを透過する容器、例えば石英製のセルなどに移し、高圧水銀ランプからバンドパスフィルター２５４ｎｍ±１０ｎｍにて取り出した強度２００ｍＷ／ｃｍ２の励起光を照射した。ここでは１分、２分、５分照射した３種類のサンプルを準備した。それぞれのサンプルを２０μＬずつBioRad社製１５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｇｅｌにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロース膜へ転写した。
【００６９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は（図２、結果１−ａ）に示すとおりであり、紫外線照射時間が増加するとトロンビンのバンドが消失して分子量の大きい部分にスメアが見られるようになった。
【００７０】
さらに、これを詳細に確認するため、ウェスタンブロッティングを行った。まず、トランスファーバッファーとして、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１９２ｍＭ グリシン、２０％エタノールに調整したものを用い、９５Ｖで６０分間転写した。次に、ＴＢＳ−Ｔ中に調整した４％スキムミルクにて１時間ブロッキングを行った。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲートアビジンを室温にて１時間インキュベートし、Millipore社のImmobilon Wester chemiluminescent HRP substrateにて可視化した。
【００７１】
ウェスタンブロッティングの結果は（図２、結果１−ｂ）に示すとおりで、紫外線照射時間が増加するに従ってトロンビンとトロンビンアプタマーの複合体に相当するバンドが増加していることがわかる。また、対象として流したトロンビンアプタマーではバンドが見られないことから、アプタマーによるノイズではないことが確認できた。
【００７２】
[実施例２]
（標的分子の分離・検出）
実施例１で得られた紫外線架橋可能なトロンビンアプタマーを用いて分離、検出を行う手法を次に述べる。
【００７３】
トロンビンを含む試料を２分し、片方をトロンビンアプタマーおよびトロンビンを含む試料をトロンビンアプタマーの終濃度を１μｍとなるようにバッファー中（成分：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））に調整する。もう片方にはネガティブコントロールとなる配列（他蛋白質検出アプタマー（例えば、ＶＥＧＦアプタマー（配列番号２）、Hasegawa et al., Biotechnology Letter (2009)参照）、ポリＡなど）を混合し、同様の濃度で調整する。
【００７４】
トロンビンアプタマーを含む試料を測定試料、含まない試料をネガティブコントロールとする。
【００７５】
それぞれの試料を２５℃で５分間反応させた後、測定試料半分量とネガティブコントロール半分量に対し、高圧水銀ランプからバンドパスフィルター２５４ｎｍ±１０ｎｍにて取り出した励起光を強度２００ｍＷ／ｃｍ２で１０分間照射した。以後、紫外線を照射した試料を架橋試料、照射しない試料を混合試料と呼称する。
【００７６】
別途トロンビンアプタマーとトロンビンのみで作成しておいたトロンビン−トロンビンアプタマー紫外線架橋複合体（試料１）およびトロンビン−トロンビンアプマター複合体（試料２）を質量マーカーとし、得られた混合試料と架橋試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法で分離した（条件は実施例１と同じ）。
【００７７】
ＳＤＳの作用により、通常のアプタマー−トロンビンの複合体は結合を失い、マーカーと同位置のバンドは消失あるいは淡くなるが、紫外線架橋された複合体はＳＤＳの作用後も結合を保持しているため、マーカーと同位置のバンドが消失することは無い。このように定性的には、得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのバンド濃淡を視覚的に判断することで試料中のトロンビンの有無を判断することが出来る。
【００７８】
また、ＣＣＤ画像等で得られるバンドの濃淡を比較することで、試料中のトロンビン濃度を簡便に定量することができる。
【００７９】
例えば架橋試料のマーカー位置のバンド濃度をＬ、ネガティブコントロールに紫外線照射した試料のマーカー位置のバンド濃度をＮとすると、Ｌ−Ｎが紫外線架橋複合体量に相当する。マーカーに使用した試料１との濃度比からトロンビンの量を検出することが可能である。
【００８０】
[実施例３]
（アプタマーと相補配列を持つ配列を利用した分離）
アプタマーの配列を、標的分子と結合する部分とは別箇所に制限酵素の切断配列を含む２０〜５０塩基程度の配列を含むものとする。なお、ここではＳｍａ１（cccggg）の切断配列を利用する。
（アプタマー配列＋バッファー配列（例えば、caacaa）＋Ｓｍａ１＋バッファー配列）
ガラスビーズや磁性ビーズ等にＳｍａ１配列を含むアプタマー分子（以降、捕捉配列と称する）を固定する。固定方法は一般的に知られるものであれば特に問題なく、各社から発売されているキットを用いるものを用いてもかまわない。
【００８１】
ＤＮＡ分子の長さは制限酵素が基板に阻害されること無く働くことができる距離を保っておればよく、例えば５０塩基程度の長さを持った任意の１本鎖配列とする。これより短くなっても実施が不可能ではないが、場合によっては極端に反応が阻害される可能性がある。
【００８２】
次に、捕捉配列を固定したビーズおよびトロンビンを含む試料をバッファー中に懸濁する。懸濁後、２５℃で５分間反応させ、高圧水銀ランプからバンドパスフィルター２５４ｎｍ±１０ｎｍにて取り出した励起光を強度４００ｍＷ／ｃｍ２で２０分間照射する。以後、この処理を行ったサンプルを架橋試料と呼称する。
【００８３】
試料の量は特に限定されるものではないが実験の都合やサンプルの量を考慮すると、１０μＬ以上、１０ｍＬ未満が望ましい。
【００８４】
その後、ビーズを回収、洗浄することで、目的の蛋白質（ここではトロンビン）を回収することが可能となる。この際、アプタマーとトロンビンは強固に結合しているため、ビーズからＤＮＡがはがれない範囲内であれば、一般的な複合体回収では用いることの出来ない強固な洗浄・回収処理を行うことが出来る。
【００８５】
ここで、架橋試料に対し、捕捉配列の制限酵素サイト部分相補配列を含む相補配列を混合した試料を混合し、ハイブリダイゼーションを行うとＳｍａＩ認識２本鎖配列が作成される。ＳｍａＩ酵素を作用させることでビーズからアプタマー−トロンビン複合体を分離することが出来るため、濃縮することも可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の蛋白質などの標的分子を分離、検出するための技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より蛋白質等の標的分子を分離する手法として、各種クロマトグラフィー、電気泳動などが知られている。これらの技術は標的物質に反応する分子（マーカー）を用いて標的分子に目印をつけ、マーカーと標的分子の複合体を検出する技術と組み合わせて利用されてきた。
【０００３】
例えば、ＥＬＩＳＡ法などにおいてマーカー分子として従来から利用されている抗体は、特異性は高いものの作成に時間と費用がかかるため、昨今ではＤＮＡもしくはＲＮＡからなるアプタマーと呼ばれる機能性分子を用いることがある。これらアプタマーは抗体と同じように標的分子に対し特異的に反応し、かつ化学的に合成可能である。
【０００４】
アプタマーが比較的合成の容易な分子であることを利用し、一部におよそ３１０ｎｍ程度の光励起により共有結合による架橋を促進する分子（光反応性官能基）を導入したものがフォトアプタマー（photoaptamer）と呼ばれるもので、これを用いた分離・検出技術も報告されている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６４５８５３９号
【特許文献２】米国特許第６５４４７７６号
【特許文献３】米国特許第５７６３１７７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のようなフォトアプタマーは、標的分子とアプタマーを共有結合によって強固に固定化することにより、分離、検出に係る処理の制限を軽減することができる点において優れている。特に洗浄においては、強力な洗浄を行っても標的分子とアプタマーの結合が外れないので、背景雑音となる非特異吸着を洗浄することができ、その結果として検出感度が高くなるなどの利点を有する。
【０００７】
しかしながら、フォトアプタマーを用いた分子デザインはアプタマーの機能向上を一部限定するもので、特異性の向上が阻害される可能性もあり、かつ作製が通常のアプタマーより複雑なためコストが増加する。
【０００８】
本発明は、このような事情に鑑み、これらフォトアプタマーと同じコンセプトを、低コストであり、かつ機能が限定されることのない通常のアプタマーで行うための技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、フォトアプタマーでない通常のアプタマーに、特定範囲の紫外線を照射することにより、そのアプタマーと標的分子間の共有結合が促進され、強固になることを見出し、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることによって本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の一態様に係る、試料中の標的分子を検出するための方法は、（１）試料中の標的分子と、その標的分子と特異的に反応するアプタマー（フォトアプタマーを除く）を接触させる工程、（２）前記標的分子と前記アプタマーとを含む試料に対して２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射することにより、標的分子とアプタマーとの間の共有結合を促進させ、標的分子とアプタマーとの複合体を得る工程、および（３）前記工程（２）にて得られた、標的分子とアプタマーとの複合体を分離して、標的分子を検出する工程、を含むことを特徴とする。
【００１１】
通常のアプタマーは前記範囲の紫外線に強い吸収を有するため、この範囲の波長で励起すると、特にアプタマーに含まれるチミンが近傍に存在するアミノ酸分子と共有結合するため、アプタマーと標的分子が強固な結合を有する複合体を形成することになる。また、これらの結合反応が起きるためには分子間距離が十分に近距離である必要があるため、非特異的吸着を形成している分子と複合体を形成することは一般的に困難である。よって、アプタマーが特異的に吸着する分子のみがアプタマーと架橋されることになる。
【００１２】
さらに、標的分子が蛋白質である場合、前記範囲の紫外線照射では蛋白質を分解する恐れがあるが、あらかじめアプタマーと特異的吸着をした蛋白質は分解される速度が吸着していない蛋白質よりも遅くなるため、アプタマーと反応しない蛋白質（夾雑物）は分解され、目的の分子のみが残る。よって、前記範囲の紫外線を高強度に照射するだけで、結合と分離を同時に行うことができる。
【００１３】
また、前記範囲の波長としては、水銀ランプなどの強い発光を用いることができ、励起光源は比較的安価に入手可能であるため、高価な光源設備も必要がない。
【００１４】
したがって、前記検出方法によれば、フォトアプタマーよりも安価で構成上の規制もない通常のアプタマーを用いて、上述したようなフォトアプタマーの利点を有しつつ、簡易かつ迅速に標的分子を分離・検出することができる。
【００１５】
さらに、前記検出方法において、前記（３）工程で、前記アプタマーと一部相補配列を持つＤＮＡを用いて、標的分子とアプタマーとの複合体を分離することが好ましい。
【００１６】
また、前記検出方法において、前記（３）工程で、標的分子とアプタマーとの複合体を分離する前に、ＤＮＡ分解酵素によって未反応のアプタマーを分解することが好ましい。こうして、未反応アプタマーの残渣を優先的に排除することにより、分離を行う際、例えばＤＮＡの相補鎖を利用したアフィニティークロマトに順ずる手法を用いる場合やＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションを行う場合における、未反応のアプタマーが競合することを抑えることができる。紫外線架橋によって作成した複合体は標的蛋白質とアプタマーが近距離を保つため、分解酵素との反応性が低く、基本的には未反応のアプタマーから優先的に分解されることとなる。
【００１７】
また、本実施形態の検出方法において検出される標的分子は、蛋白質であることが好適である。
【００１８】
さらに、本発明は、別の一態様として、標的分子に特異的に反応するアプタマー、２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射可能な光源、および標的分子とアプタマーとの複合体を分離する手段を含む、標的分子を検出するためのキットも提供する。
【発明の効果】
【００１９】
以上のように、本発明によれば、フォトアプタマーではない通常のアプタマーを用いて、簡易、安価かつ迅速に標的分子を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の分離工程における一例（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動）の結果のサンプルを示す。
【図２】図２は、実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（1-a）およびウェスタンブロッティング(1-b)の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係る実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
［標的分子の検出方法］
本実施形態に係る、試料中の標的分子の検出方法は、以下の工程を含む：
（１）試料中の標的分子と、その標的分子と特異的に反応するアプタマー（フォトアプタマーを除く）を接触させる工程、
（２）前記標的分子と前記アプタマーとを含む試料に対して２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射することにより、標的分子とアプタマーとの間の共有結合を促進させ、標的分子とアプタマーとの複合体を得る工程、および
（３）前記工程（２）にて得られた、標的分子とアプタマーとの複合体を分離して、標的分子を検出する工程。
【００２３】
以下、それぞれの工程について詳細に説明する。
（１）接触工程
本工程は、試料中の標的分子と、その標的分子と特異的に反応するアプタマーを接触させる工程である。本工程における、標的分子とアプタマーを接触させる条件は、特に制限されないが、標的分子が変性などを起こさないような条件（温度、ｐＨなど）を採用することが好ましい。具体的には、例えば、適切な条件に調整した溶液（バッファーなど）中にて標的分子とアプタマーを混合することによって、両者を接触させる方法などが挙げられる。
【００２４】
（試料）
本実施形態において、「試料」とは、複数の分子を含有し、少なくとも一つの標的分子を含んでいる可能性のある、あらゆる溶液、物質、混合物などをさす。
【００２５】
（標的分子）
本実施形態における「標的分子」とは、試料中において分離・検出を所望する標的の分子を指し、特に限定はされない。例えば、蛋白質、糖、ヌクレオチド、ビタミン、基質などの分子が本実施形態の検出方法の標的となり得る。
【００２６】
なお、後述するように、特定範囲の紫外線照射により、アプタマーに含まれるチミン（Ｔ）と、近傍に存在するアミノ酸分子（中でも、リジン、チロシン、セリン、スレオニンなどのアミノ酸分子）との共有結合が促進されるため、標的分子中にこれらのアミノ酸分子が含まれていることが好ましい。よって、本実施形態における標的分子は、リジン、チロシン、セリン、スレオニンなどのアミノ酸分子を有する蛋白質であることが好ましい。
【００２７】
また、検出方法に適しているという観点からは、標的分子が水溶性蛋白質であることが好ましい。
【００２８】
さらに、本実施形態において標的分子として好ましい蛋白質の具体例としては、例えば、酵素、疾病マーカー、薬効作用を有する蛋白質などが挙げられる。なかでもトロンビン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、免疫グロブリン（ＩｇＥ）などが、標的分子として好適である。
【００２９】
また、標的分子を修飾して、標的分子とアプタマー間の相互作用が強くなるよう設計することも可能である。
【００３０】
（アプタマー）
本実施形態における「アプタマー」とは、特定の標的分子に結合する核酸リガンドをさし、フォトアプタマーを除くアプタマーであって、上述したような標的分子に特異的に反応するものであれば、特に限定なく本実施形態で用いることができる。
【００３１】
このようなアプタマーは、１９９０年にＧｏｌｄら（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．ａｎｄ Ｇｏｌｄ Ｌ．（１９９０）．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）によって初めてその概念が報告されている。
【００３２】
アプタマーは、化学的に合成が可能なことから抗体などのマーカー分子よりも低コストで用いることができ、さらに容易に化学修飾ができることや、容易に特定の構造を持つように設計できることなど、マーカー分子としての利点を多く有する。
【００３３】
本実施形態で用いられるアプタマーは、１５〜５０塩基程度の一本鎖ＤＮＡであることが好ましく、２０〜４０塩基程度の一本鎖ＤＮＡであることがより好ましい。
【００３４】
さらに、本実施形態に係るアプタマーの配列には、標的分子と結合する部分とは別に、制限酵素の切断配列、バッファ配列、またはタグ配列など、必要に応じた修飾のための配列などが含まれていてもよい。
【００３５】
また、後述するように、特定範囲の紫外線照射により、核酸塩基の１つであるチミン（Ｔ）と近傍にある所定のアミノ酸との共有結合が促進されるため、本実施形態で用いるアプタマーは、チミンを含む配列を有するアプタマーであることが好適である。
【００３６】
このようなアプタマーは、例えば、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法（前述のＧｏｌｄらの文献（１９９０）参照）などに記載の方法によって、獲得または同定され得る。
【００３７】
具体的には、例えば、ＳＥＬＥＸ法を用いた場合、標的分子を担体に固定化し、これに核酸ライブラリを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これを増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を１０回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得することが可能である。
【００３８】
さらに、特開２００７−１４２９２号公報には前記ＳＥＬＥＸ法をより効率よくしたアプタマーの同定方法が記載されているが、該文献記載の同定方法によってもアプタマーを同定・獲得することができる。
【００３９】
このようなＳＥＬＥＸ法やその改良法などにより、上述したような具体例以外にも、あらゆる分子に対して特異的に結合するアプタマーを得ることができると考えられるため、所望の標的分子などについてその活性を阻害するアプタマーを取得し、その配列に基づいてアプタマーを設計することもできる。
【００４０】
また、ＳＥＬＥＸ法などによって得られたアプタマー、または既知のアプタマーを用いて、進化模倣的アルゴリズムを使用することによって、標的分子に対してより高い結合能を示すアプタマーを得ることもできる（Ｋ． Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏ， Ｙ． Ｏｋｕｍｕｒａ， Ｋ． Ｓｕｍｉｋｕｒａ， Ｉ． Ｋａｒｕｂｅ， Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＤＮＡ ａｐｔａｍｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ−ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３ （２００５） ｅ１０８．参照）。
【００４１】
また、得られたアプタマーの標的分子との架橋（結合）効率は、例えば、後述する実施例１記載の方法などを用いて調べることができる。
【００４２】
本実施形態において使用できるアプタマーの具体例としては、前記標的分子と特異的に結合するアプタマー、例えば、トロンビン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、免疫グロブリン（ＩｇＥなど）などと特異的に結合するそれぞれのアプタマーが挙げられる。なお、例えば、トロンビンアプタマーは配列番号１、ＶＥＧＦアプタマーは配列番号２で表される塩基配列を有するものを使用することができる。
【００４３】
（２）複合体形成工程
次の工程（２）は、前記工程（１）で接触させた標的分子とアプタマーとを含む試料に対して、２４０〜２８０ｎｍの範囲の紫外線を照射する工程である。この工程により、標的分子とアプタマーとの間の共有結合を促進させ、標的分子とアプタマーとの複合体を得ることができる。
【００４４】
前記波長範囲で励起すると、アプタマー、特にそのアプタマーに含まれるチミン（Ｔ）が、近傍に存在するアミノ酸分子（中でも、リジン、チロシン、セリン、スレオニンなどのアミノ酸分子）と共有結合するため、結果としてアプタマーと標的分子が強固な結合を有する複合体を形成する。
【００４５】
また、前記反応が起きるためには分子間距離が十分に近距離である必要があるため、非特異的吸着を形成している分子と複合体を形成することは一般的に困難である。したがって、アプタマーが特異的に吸着する分子のみがアプタマーと結合（架橋）されることになる。特に結合能の高いアプタマーを用いることで、より特異性の高い結合（架橋）反応を行うことができ、フォトアプタマーの機能を代替することが可能である。
【００４６】
照射の波長範囲は、通常、２４０〜２８０ｎｍの範囲であり、好ましくは２４５〜２６５ｎｍの範囲である。照射波長が２４０ｎｍ未満であると、照射に対する光吸収の効率が小さく、架橋が十分に進まないため不適であり、２８０ｎｍを超えるとアプタマーの光吸収は小さくなる一方、蛋白質分子に対しては光吸収の効率が高くなり、試料へのダメージが大きくなるため好ましくない。特に２８０ｎｍを超える紫外線はタンパク質中のチロシン、トリプトファンの吸収強度が高く、標的分子の破壊が促進されるため適さない。
【００４７】
なお、標的分子が蛋白質である場合は、前記波長範囲の紫外線照射で蛋白質が分解される恐れがあるが、前記工程（１）によりあらかじめ標的分子（蛋白質）はアプタマーと吸着しているため、吸着している蛋白質の分解される速度は遅くなるため、アプタマーと反応しない蛋白質（夾雑物）のみが分解され、目的の標的分子（蛋白質）は全長を保ったまま得られる。つまり、本実施形態によれば、前記波長範囲の紫外線を高強度に照射するだけで、標的分子とアプタマーの結合および標的分子の分離を同時に行うことができるため、非常に迅速な検出が可能となる。
【００４８】
前記紫外線照射は、照射する紫外線の総量として１０Ｗ〜１０００Ｗ、より好ましくは１５Ｗ〜１５０Ｗであり、その際の紫外線強度密度は１００ｍＷ／ｃｍ２〜２０００ｍＷ／ｃｍ２が好ましい。紫外線総量が１０Ｗ以下であると標的分子とアプタマーとの間の共有結合が十分に促進されず、１０００Ｗ以上であると紫外線照射による標的分子の損傷が起こる恐れがあるので好ましくない。また、照射密度が１００ｍＷ／ｃｍ２よりも小さくなると照射時間が長く必要になり、２０００ｍＷ／ｃｍ２以上になると分子の損傷程度をコントロールすることが困難になる他、光源の入手も困難となるため、好ましくない。
【００４９】
本工程で紫外線照射に用いられる光源としては、前記波長範囲の紫外線を照射できることが可能な光源であれば、特に限定されずに用いることができる。具体例としては、水銀ランプ、ＬＥＤ、固体レーザ（ＹＡＧ4倍波）などの光源が挙げられ、入手容易性・コストなどの観点から、水銀ランプなどを用いることが好ましい。
【００５０】
本工程における、具体的な照射方法の一例としては、水銀ランプからバンドパスフィルターなどを用いて前記範囲の紫外線を取り出し、前記強度の範囲にて前記照射時間内で、前記工程（１）にて接触させた標的分子とアプタマーとを含む試料に対して照射する方法などが挙げられる。
【００５１】
以上より、本工程によって、標的分子と、その標的分子に特異的に反応するアプタマーとの強固な共有結合による複合体が得られる。
【００５２】
（３）分離・検出工程
次に、前記工程（２）で得られた標的分子とアプタマーの複合体を分離し、標的分子を検出する。試料中に標的分子が存在すれば、前記工程（２）における紫外線照射により、その標的分子と特異的に反応するアプタマーとの複合体が試料中に生成されるはずであるから、その複合体を分離することにより、迅速に試料中の標的分子の存在の有無を調べることができる。
【００５３】
前記複合体を分離する方法としては、特に限定はされないが、例えば、種々の電気泳動（１次元、２次元）、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど、公知の分離方法を適宜選択して用いることができる。
【００５４】
分離した分子の検出手法には、染色、蛍光、化学発光、吸光光度法、光熱変換法など、蛋白質あるいはＤＮＡを検出する一般的な手法を特に制限なく用いることができる。
【００５５】
例えば、より具体的な分離・検出工程の一実施形態として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル）電気泳動によって分離を行う場合を以下に説明する。
【００５６】
まず、標的分子およびその標的分子と特異的に反応するアプタマーを含む試料に上述の範囲の紫外線を照射した試料を架橋試料、照射しない試料を混合試料とする。
【００５７】
別途そのアプタマーと標的分子のみで作成しておいた紫外線架橋複合体（試料１）および非紫外線架橋複合体（試料２）を質量マーカーとし、得られた混合試料と架橋試料を適切な条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分離する。
【００５８】
すると、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の作用により、通常のアプタマー−標的分子の複合体は結合を失い、マーカーと同位置のバンドは消失あるいは淡くなるが、紫外線架橋された複合体はＳＤＳの作用後も結合を保持しているため、マーカーと同位置のバンドが消失することは無い。このように定性的には、得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのバンド濃淡を視覚的に判断することで試料中の標的分子の有無を判断することが出来る（図１参照）。
【００５９】
また、ＣＣＤ画像等で得られるバンドの濃淡を比較することで、試料中の標的分子の濃度を簡便に定量することができる。
【００６０】
例えば架橋試料のマーカー位置のバンド濃度をＬ、ネガティブコントロールに紫外線照射した試料のマーカー位置のバンド濃度をＮとすると、Ｌ−Ｎが紫外線架橋複合体量に相当する。マーカーに使用した試料１との濃度比から標的分子の量を検出することが可能である。
【００６１】
本実施形態における分離方法として、より好ましくは、前記複合体の分離・回収を容易にするため、前記アプタマーと一部相補配列を持つＤＮＡを用いて、前記複合体分離する方法が挙げられる。より具体的には、例えば、前記ＤＮＡの相補配列を利用したアフィニティークロマトグラフィー、あるいはＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションなどの公知の方法が挙げられる。なお、これらの方法を用いる場合、未反応のアプタマーが競合する可能性が十分に考えられるため、未反応アプタマーの残渣を優先的に排除して阻害を防ぐことが重要である。
【００６２】
そのために、標的分子とアプタマーとの複合体を分離する前に、ＤＮＡ分解酵素などを用いて未反応アプタマーを分解し排除することが好ましい。紫外線架橋によって作成された複合体は、標的蛋白質とアプタマーが近距離を保つため、分解酵素との反応性が低く、基本的には未反応のアプタマーから優先的に分解されることとなる。従って、通常のＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションのように、未反応の１本鎖ＤＮＡは１本鎖分解酵素を用いて分解することが可能である。
【００６３】
具体的には、例えば、後述の実施例３に記載したような方法を用いることができる。
【００６４】
[標的分子検出用キット]
本発明は、さらに、標的分子を検出するためのキットを提供する。本発明に係るキットの一実施形態としては、上述したアプタマーを含む標的分子検出用キットが挙げられる。このようなキットには、前記アプタマーに加え、標的分子、２４０〜２８０ｎｍの紫外線照射可能な光源、標的分子とアプタマーとの複合体を分離する手段（試薬、溶液、器機など）、及び使用のための説明書などが含まれていてもよい。なお、キットに包含されるアプタマーなどは、凍結乾燥させた試薬の形態や保存溶液中の溶液の形態など、種々の形態で提供され得る。
【実施例】
【００６５】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【００６６】
トロンビンを含む試料に対する分離、検出の実施形態を下記に説明する。
[実施例１]
（トロンビン−アプタマー複合体）
既知のトロンビンアプタマー（配列番号１）（K. Ikebukuro, Y. Okumura, K. Sumikura, I. Karube, A novel method of screening thrombin-inhibiting DNA aptamers using an evolution-mimicking algorithm, Nucleic Acids Res 33 (2005) e108.参照）を用いて、トロンビンとトロンビンアプタマーの反応性及びＵＶでの架橋を調べるために次の操作を行った。
【００６７】
まず、使用するトロンビンアプタマーをビオチン化し（以後、単にトロンビンアプタマーと呼称することもある）、調整したバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））中にてトロンビンとトロンビンアプタマーを混合し、１５〜３０分室温にてインキュベートした。液量は１００μＬとし、トロンビン終濃度３μＭ、トロンビンアプタマー終濃度１μＭに調整した。
【００６８】
調整した試料を、波長２５４ｎｍを透過する容器、例えば石英製のセルなどに移し、高圧水銀ランプからバンドパスフィルター２５４ｎｍ±１０ｎｍにて取り出した強度２００ｍＷ／ｃｍ２の励起光を照射した。ここでは１分、２分、５分照射した３種類のサンプルを準備した。それぞれのサンプルを２０μＬずつBioRad社製１５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｇｅｌにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロース膜へ転写した。
【００６９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は（図２、結果１−ａ）に示すとおりであり、紫外線照射時間が増加するとトロンビンのバンドが消失して分子量の大きい部分にスメアが見られるようになった。
【００７０】
さらに、これを詳細に確認するため、ウェスタンブロッティングを行った。まず、トランスファーバッファーとして、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１９２ｍＭ グリシン、２０％エタノールに調整したものを用い、９５Ｖで６０分間転写した。次に、ＴＢＳ−Ｔ中に調整した４％スキムミルクにて１時間ブロッキングを行った。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲートアビジンを室温にて１時間インキュベートし、Millipore社のImmobilon Wester chemiluminescent HRP substrateにて可視化した。
【００７１】
ウェスタンブロッティングの結果は（図２、結果１−ｂ）に示すとおりで、紫外線照射時間が増加するに従ってトロンビンとトロンビンアプタマーの複合体に相当するバンドが増加していることがわかる。また、対象として流したトロンビンアプタマーではバンドが見られないことから、アプタマーによるノイズではないことが確認できた。
【００７２】
[実施例２]
（標的分子の分離・検出）
実施例１で得られた紫外線架橋可能なトロンビンアプタマーを用いて分離、検出を行う手法を次に述べる。
【００７３】
トロンビンを含む試料を２分し、片方をトロンビンアプタマーおよびトロンビンを含む試料をトロンビンアプタマーの終濃度を１μｍとなるようにバッファー中（成分：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））に調整する。もう片方にはネガティブコントロールとなる配列（他蛋白質検出アプタマー（例えば、ＶＥＧＦアプタマー（配列番号２）、Hasegawa et al., Biotechnology Letter (2009)参照）、ポリＡなど）を混合し、同様の濃度で調整する。
【００７４】
トロンビンアプタマーを含む試料を測定試料、含まない試料をネガティブコントロールとする。
【００７５】
それぞれの試料を２５℃で５分間反応させた後、測定試料半分量とネガティブコントロール半分量に対し、高圧水銀ランプからバンドパスフィルター２５４ｎｍ±１０ｎｍにて取り出した励起光を強度２００ｍＷ／ｃｍ２で１０分間照射した。以後、紫外線を照射した試料を架橋試料、照射しない試料を混合試料と呼称する。
【００７６】
別途トロンビンアプタマーとトロンビンのみで作成しておいたトロンビン−トロンビンアプタマー紫外線架橋複合体（試料１）およびトロンビン−トロンビンアプマター複合体（試料２）を質量マーカーとし、得られた混合試料と架橋試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法で分離した（条件は実施例１と同じ）。
【００７７】
ＳＤＳの作用により、通常のアプタマー−トロンビンの複合体は結合を失い、マーカーと同位置のバンドは消失あるいは淡くなるが、紫外線架橋された複合体はＳＤＳの作用後も結合を保持しているため、マーカーと同位置のバンドが消失することは無い。このように定性的には、得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのバンド濃淡を視覚的に判断することで試料中のトロンビンの有無を判断することが出来る。
【００７８】
また、ＣＣＤ画像等で得られるバンドの濃淡を比較することで、試料中のトロンビン濃度を簡便に定量することができる。
【００７９】
例えば架橋試料のマーカー位置のバンド濃度をＬ、ネガティブコントロールに紫外線照射した試料のマーカー位置のバンド濃度をＮとすると、Ｌ−Ｎが紫外線架橋複合体量に相当する。マーカーに使用した試料１との濃度比からトロンビンの量を検出することが可能である。
【００８０】
[実施例３]
（アプタマーと相補配列を持つ配列を利用した分離）
アプタマーの配列を、標的分子と結合する部分とは別箇所に制限酵素の切断配列を含む２０〜５０塩基程度の配列を含むものとする。なお、ここではＳｍａ１（cccggg）の切断配列を利用する。
（アプタマー配列＋バッファー配列（例えば、caacaa）＋Ｓｍａ１＋バッファー配列）
ガラスビーズや磁性ビーズ等にＳｍａ１配列を含むアプタマー分子（以降、捕捉配列と称する）を固定する。固定方法は一般的に知られるものであれば特に問題なく、各社から発売されているキットを用いるものを用いてもかまわない。
【００８１】
ＤＮＡ分子の長さは制限酵素が基板に阻害されること無く働くことができる距離を保っておればよく、例えば５０塩基程度の長さを持った任意の１本鎖配列とする。これより短くなっても実施が不可能ではないが、場合によっては極端に反応が阻害される可能性がある。
【００８２】
次に、捕捉配列を固定したビーズおよびトロンビンを含む試料をバッファー中に懸濁する。懸濁後、２５℃で５分間反応させ、高圧水銀ランプからバンドパスフィルター２５４ｎｍ±１０ｎｍにて取り出した励起光を強度４００ｍＷ／ｃｍ２で２０分間照射する。以後、この処理を行ったサンプルを架橋試料と呼称する。
【００８３】
試料の量は特に限定されるものではないが実験の都合やサンプルの量を考慮すると、１０μＬ以上、１０ｍＬ未満が望ましい。
【００８４】
その後、ビーズを回収、洗浄することで、目的の蛋白質（ここではトロンビン）を回収することが可能となる。この際、アプタマーとトロンビンは強固に結合しているため、ビーズからＤＮＡがはがれない範囲内であれば、一般的な複合体回収では用いることの出来ない強固な洗浄・回収処理を行うことが出来る。
【００８５】
ここで、架橋試料に対し、捕捉配列の制限酵素サイト部分相補配列を含む相補配列を混合した試料を混合し、ハイブリダイゼーションを行うとＳｍａＩ認識２本鎖配列が作成される。ＳｍａＩ酵素を作用させることでビーズからアプタマー−トロンビン複合体を分離することが出来るため、濃縮することも可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的分子を検出するための方法であって、
（１）試料中の標的分子と、その標的分子と特異的に反応するアプタマー（フォトアプタマーを除く）を接触させる工程、
（２）前記標的分子と前記アプタマーとを含む試料に対して２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射することにより、標的分子とアプタマーとの間の共有結合を促進させ、標的分子とアプタマーとの複合体を得る工程、および
（３）前記工程（２）にて得られた、標的分子とアプタマーとの複合体を分離して、標的分子を検出する工程
を含むことを特徴とする標的分子の検出方法。
【請求項２】
前記（３）工程において、前記アプタマーと一部相補配列を持つＤＮＡを用いて、標的分子とアプタマーとの複合体を分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（３）工程において、標的分子とアプタマーとの複合体を分離する前に、ＤＮＡ分解酵素によって未反応のアプタマーを分解する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的分子が蛋白質である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
標的分子に特異的に反応するアプタマー、２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射可能な光源、および標的分子とアプタマーとの複合体を分離する手段を含む、標的分子を検出するためのキット。
【請求項１】
試料中の標的分子を検出するための方法であって、
（１）試料中の標的分子と、その標的分子と特異的に反応するアプタマー（フォトアプタマーを除く）を接触させる工程、
（２）前記標的分子と前記アプタマーとを含む試料に対して２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射することにより、標的分子とアプタマーとの間の共有結合を促進させ、標的分子とアプタマーとの複合体を得る工程、および
（３）前記工程（２）にて得られた、標的分子とアプタマーとの複合体を分離して、標的分子を検出する工程
を含むことを特徴とする標的分子の検出方法。
【請求項２】
前記（３）工程において、前記アプタマーと一部相補配列を持つＤＮＡを用いて、標的分子とアプタマーとの複合体を分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（３）工程において、標的分子とアプタマーとの複合体を分離する前に、ＤＮＡ分解酵素によって未反応のアプタマーを分解する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的分子が蛋白質である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
標的分子に特異的に反応するアプタマー、２４０〜２８０ｎｍの紫外線を照射可能な光源、および標的分子とアプタマーとの複合体を分離する手段を含む、標的分子を検出するためのキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２４４７５３（Ｐ２０１１−２４４７５３Ａ）
【公開日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２１９９０（Ｐ２０１０−１２１９９０）
【出願日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（０００００１１９９）株式会社神戸製鋼所 (5,860)
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（０００００１１９９）株式会社神戸製鋼所 (5,860)
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
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