標的化イムノリポソームの調製法
標的化された治療用リポソーム組成物の調製に使用するための標的化リガンドが結合したアビジン−脂質小胞の調製法が開示される。各小胞は、小胞がさらにビオチン化された標的化リガンドと連結するために使用できるように、多くの遊離部位のビオチン−結合部位を保持するポリマーに結合したビオチンに連結されたアビジン分子を含んでなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、標的化した脂質にカプセル化された薬剤の送達系の調製法、およびその方法により調製された生成物に関する。さらに本発明は、標的化された薬剤を封入したリポソーム製剤の調製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リポソーム技術におけるＳＴＥＡＬＴＨ（商標）銘柄のような長期循環型リポソームは、感染、炎症および腫瘍の部位へ標的化された薬剤の適切な送達系であることが証明された。これらのＰＥＧ化され、立体的に安定化されたリポソームは、網−内皮系により迅速に取り込まれる裸のリポソーム薬剤粒子よりも、ヒトにおけるそれらの血液循環半減期に実質的な改善を示した（非特許文献１；非特許文献２）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーのリン脂質の極性ヘッドへのコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、それらの裸の対応物よりも水性環境中でさらに溶解性のＰＥＧ化リポソームを生じる。リポソーム表面を囲む親水性ＰＥＧ分子は、構造を立体的に安定とし、そして免疫原性を低くし、リポソームがマクロファージに取り込まれることを防ぎ、したがってその循環時間を延ばす。
【０００３】
薬剤の部位特異的送達は、治療的効果を上げ、そして毒性を下げることができる。抗体または抗体フラグメント、炭水化物、酵素および他のリガンドを用いた標的化リポソームの多くの例が報告されてきた。これらの取り組みは、薬剤の脳、肺、腫瘍または免疫系の細胞への送達を含む応用に、進歩した部位特異的リポソーム薬剤担体技術を有する。抗体を結合したリポソーム（イムノリポソーム）は、標的化がモノクローナル抗体の高い結合親和性ならびにその特異的抗原に対する高い選択性により媒介されるので、特にこの目的によく適している。また標的化リポソームの全体的な治療効力は、標的組織を貫通するか、またはそうではなく所望の標的細胞に到達し、そしてリポソームの積載物を送達するための送達媒体（ｖｅｃｔｏｒ）の能力に依存する。イムノリポソームによる特異的細胞への薬剤送達は、ガンおよび他の疾患の処置および標的化作用物質のさらなる探査に有望な取り組みとなることが証明され、ならびにこれらの試薬の製造法における改善が保証される。
【０００４】
イムノリポソームは、全抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂ）または再工作された結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）に結合されたリポソームである。リポソームと抗体との間のリンカーとして、立体的に安定化されたリポソームのＰＥＧ鎖を使用することは、ＰＥＧが抗体をリポソームの脂質層から遮蔽することにより立体障害が減少するので、強化された抗体−抗原結合を生じることが観察された。ＰＥＧポリマーをタンパク質（ＰＥＧ化）および他の生体分子へ付ける方法は、当該技術分野では周知である。
【０００５】
抗体をＰＥＧ−被覆リポソームに、抗体のＰＥＧの遊離末端への共有結合を介して付ける方法が記載された（非特許文献３；非特許文献４）。１つの方法では、リポソーム−ＰＥＧ−抗体結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）がリポソーム形成時に脂質組成物に含まれる。この取り組みは、抗体リガンドの幾つかがリポソームの内部水性区分に面し、意図する標的との相互作用に利用できないという不利益を有する。別の取り組みでは、抗体がＰＥＧ化され、結合体が精製され、そして続いて前形成されたリポソームに挿入される。代替的な手順では、リポソームが例えばＰＥＧ−マレイミドをその表面に包含することにより前活性化される。次いで活性化されたリポソームは、結合すべき標的化リガンドに接触させられ、次いで未反応ヘッド基がクエンチされなければならず、そして生じた混合物は未反応リポソームおよび非結合タンパク質から精製されなければならない。これらの取り組みでは、各標的化リガンドに特異的な多段階工程が考案され、そして至適化されなければならない。
【０００６】
目的の標的化リガンドに容易に付けることができる汎用的なＰＥＧ修飾化リポソーム組成物を開発する取り組みがなされてきた。そのような汎用的薬剤輸送媒体を調製することの１つの提案は、リポソームに標的化リガンドを連結するための基本として、ビオチン−アビジン結合の高い親和性を使用することであった。特許文献１および非特許文献５を参照にされたい。しかしこれらの方法は、処理法における特定の制限、またはリポソーム組成物または標的化リガンドのいずれかの選択に課される制限のいずれかを受ける。したがって、ストレプトアビジン−ビオチンを連結したリポソームの作成に関して改善された方法が必要である。
【参考文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，１７１，５７８号明細書
【非特許文献１】Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６６（１），２９−３６，１９９１
【非特許文献２】Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１２８（１），４４−４９，１９９２
【非特許文献３】Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２３７：９９−１０８，１９９５
【非特許文献４】Ｂｌｕｍｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１４９：１８０−１８４，１９９３
【非特許文献５】Ｓｃｈｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３７７：６１−６７，２００４
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明の１つの観点は：ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞の懸濁液を調製し；そしてビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞懸濁液を、過剰なアビジンまたはその改変体と接触させてビオチン−結合部位を提示するアビジンを連結した脂質構造を形成することを含んでなる、アビジンを連結した脂質小胞の調製法である。
【０００９】
本発明の別の観点は、本発明の方法により調製されるアビジンを連結した脂質小胞であり、ここで小胞はその表面上に結合したアビジンを提示し、この表面上に結合したアビジンは、該脂質構造に非共有的に付いており、そしてさらにビオチンまたはビオチン化化合物へ結合する能力を保持している。
【００１０】
本発明のさらに別の観点は、封入された薬剤に応答する状態に罹患している個体を処置するための、本発明の方法により調製されるリガンドを標的化するアビジンを連結した脂質小胞の使用法である。
【００１１】
発明の詳細な説明
限定するわけではないが本明細書に引用する特許および特許出願を含むすべての公報は参照により全部、説明のように本明細書に編入する。
【００１２】
本明細書で使用する「抗体」という用語は広い概念を意味し、そしてポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体および抗体フラグメントを含む免疫グロブリンまたは抗体分子を含む。
【００１３】
本明細書で使用する「アビジン」とは、ビオチン分子に対して複数の大変高い親和性結合部位を含んでなる多量体アビジン化合物を意味し、そしてピアスバイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社（ロックフォード、イリノイ州）からＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）という銘柄で販売されているビオチン結合タンパク質、および重要な立体配置およびアビジンとのアミノ酸の類似性、ならびにビオチンに対して高い親和性を有するストレプトミセス アビジニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）により生産されるタンパク質であるストレプトアビジンを含む。ストレプトアビジンはグリコシル化されてはおらず、そして組織に対して低い非特異的結合を現すと報告されている。
【００１４】
「ビオチン化合物」とは「ビオチン」（ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリン−４−吉草酸）を指し：分子量２４４ｇ／モル、Ｂ−複合ビタミンとしても知られ、そしてそのアビジン−結合類似体を含む。
【００１５】
「結合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」とは、共有的に付いている（ａｔｔａｃｈｅｄ）ことを意味する（例えば、架橋結合剤を介して）。
【００１６】
「連結された（ｃｏｕｐｌｅｄ）」または「結合された（ｂｏｕｎｄ）」とは、結合対のメンバーが複数の荷電した相互作用（イオン結合）、および結合したメンバーが別個の分子実体を維持するようなファンデルワールス力を含む非イオン的または疎水的相互作用を介するような非共有的に会合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ことを意味する。
【００１７】
「脂質小胞」とは、極性のヘッド基に付き、１もしくは２個の疎水性アシル炭化水素鎖を含む小胞を形成する両新媒性脂質を含んでなる任意の安定なミセルまたはリポソーム組成物を指し、そしてその極性のヘッド基にアミン、酸、エステル、アルデヒドまたはアルコールのような化学的に反応性の基を含むことができる。
【００１８】
「前形成されたリポソーム」とは、完全な、前以て形成された単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）または多重層ラメラ小胞（ＭＬＶ）の脂質小胞を指す。
【００１９】
「治療用リポソーム組成物」とは、リポソームの水性空間またはリポソームの脂質二重層に封入された治療薬を含むリポソームを指す。
【００２０】
本発明は、ストレプトアビジンを提示する立体的に安定化された薬剤物質を含有する小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）または多重層ラメラ小胞（ＭＬＶ）を調製するために、ミセル転移法と組み合わせた非共有（アビジン−ビオチン）連結法に関する。この方法は標的化された脂質小胞の調製を提供し、そしてさらに複数の標的化分子を立体的に安定なリポソームに簡単に連結するための試薬を提供する。ペプチド、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、抗体または酵素のような標的化リガンドはこの媒体に、ビオチン化およびさらにビオチン結合することができる前形成されたストレプトアビジンを連結した脂質小胞との会合を介して容易に結合することができる。このように１つの態様では、ペイロードとして様々な活性基（ａｃｔｉｖｅ）を持つ前形成された立体的に安定化されたリポソームを、部位特異的治療を行うため所望するように標的化することができる。
【００２１】
アビジンを連結した脂質小胞は、ミセルまたは単ラメラ小胞（ＳＵＶ）の状態で、前形成されたリポソームと混合され、そしてアビジンを連結した脂質がこれによりリポソームの脂質層または小葉（ｌｅａｆｌｅｔ）に取り込まれる。アビジンを連結したリポソームの標的化は、直接的であり、しかも再生可能である。
【００２２】
ストレプトアビジンはストレプトアビジンがアビジンの塩基性のｐＩ１０に比べて、ｐＩ５〜６の一層低い等電点を有するので、アビジンを連結した脂質を形成するために有用である。さらにストレプトアビジンは糖タンパク質ではく、これは細胞上のマンノース受容体のような炭水化物の受容体への非特異的結合の可能性を下げる。
【００２３】
連結法および本発明の方法を実施するために有用な成分を含むキットの成分、および本発明の方法により形成された生成物をこれから以下に詳細に記載する。
【００２４】
標的化複合体の調製
本発明は、標的化された治療用リポソーム組成物の調製に使用するため標的化リガンドが結合したアビジン−脂質複合体の丈夫な（ｒｏｂｕｓｔ）調製法を提供する。各複合体は（ｉ）極性のヘッド基および疎水性のテイルを有する脂質、（ｉｉ）近位末端および遠位末端を有する親水性ポリマー、このポリマーはその近位末端で脂質のヘッド基に付く、（ｉｉｉ）ポリマーの遠位末端に付いたビオチン、（ｉｖ）ポリマーを結合したビオチンに連結するアビジン分子、および（ｖ）ビオチン化され、該アビジン上の遊離部位（この遊離部位は該ポリマーに結合したビオチンには結合しないと定義される）へのビオチン基の親和性結合によりアビジン分子に連結される標的化リガンドから構成される。
【００２５】
本発明の１つの態様では、ビオチン化されたＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥのような脂質化ポリマーに結合したビオチンが、アビジンをリポソームにつなぐ捕捉試薬として使用される。アビジンを連結した脂質は、アビジンあたり２〜３個のビオチン分子のビオチン結合能を有する。ビオチン化されたＰＥＧ−ＤＳＰＥは、リポソームに取り込まれることがこれまでに証明された（Ｓｃｈｎｙｄｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７７：６１−６７（２００４）；Ｋｕｌｌｂｅｒｇ，Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７３７−７４３（２００２））。
【００２６】
本発明のアビジンを連結した脂質は、アビジン分子を脂質化ポリマーを結合したビオチンと、ミセルの状態で、または前形成された治療用リポソームに前以て挿入された状態で、生じるアビジンを連結したミセルが複数のビオチン−結合部位をそれらの外側の親水性表面に保持するように、ビオチンに対してモル過剰なアビジンとを接触させることにより調製される。本発明の一態様では、ミセル内またはリポソーム内に包埋されたビオチン分子に対するアビジンのモル比は、４：１である。
【００２７】
結合体に有用な脂質の例には、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル−ホスファチジルコリン、モノガラクトシルジアシルグリセロールまたはジガラクトシルジアシルグリセロールがある。
【００２８】
結合体中の親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミドおよび親水性ペプチド配列からなる群から選択される。
【００２９】
結合体の標的化リガンドは、標的部位に特異性を有する任意の分子であることができ、この部位は治療に関連する膜、細胞、組織または臓器または個体であり、そしてさらに本明細書中の以下に記載する。
【００３０】
別の態様では、標的化結合体の選択には、標的化リガンドが、標的細胞上に発現される細胞表面の受容体に結合する能力を測定することを含む。
【００３１】
別の態様では、標的化結合体の選択は（ｉ）標的化リガンドが、特異的な細胞型である標的部位上に発現される細胞表面の受容体に結合する能力、および（ｉｉ）標的細胞が、標的細胞と標的化リガンドとの間を結合することにより標的細胞に結合したリポソームをインターナライズする能力に基づく。
【００３２】
別の態様では、各々が標的に対して独自の結合特異性または親和性を有する複数の標的化結合体は、付く標的化リガンドに複数の特異性または親和性を有するストレプトアビジンを結合したリポソームの調製物を形成するための使用に選択される。
【００３３】
このように、汎用的な薬剤輸送媒体としてストレプトアビジンを結合したリポソームの新規設計により、リポソームに基づく送達系を洗練するための用途の多いプラットフォームを提供する。
【００３４】
標的化リガンド
「標的」は、ビオチン化化合物が結合することが望まれるインビボの部位を意味する。実際の結合部位は、臓器、組織、細胞または膜上であることができる。例示的な標的は充実性腫瘍（例えば脳またはＣＮＳ（グリア芽腫）、肺（小細胞および非小細胞（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ））、卵巣、前立腺、胸および結腸の癌腫、ならびに他の癌腫および肉腫）、あるいはリンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫）、白血病（例えば急性リンパ性白血病）および骨髄腫（例えば多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病）のような液性腫瘍、ならびに既知または未知の原発性腫瘍から生じる二次的または転移性腫瘍であり、含まれるのは宿主生物の肺、脳および骨に生じる二次的または転移性腫瘍である。別の例示的標的は、感染の部位（例えばバクテリア、ウイルス（例えばＨＩＶ、ヘルペス、肝炎）、および病原性真菌（カンジダ種：Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）であり、含まれる感染性生物は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である）である。
【００３５】
標的化リガンドは、所望する標的と会合する結合パートナーに関するリガンドである。一つの態様では、標的化リガンドは増殖因子受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する。そのような受容体は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ癌遺伝子のｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質産物、上皮成長因子受容体、塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体および血管内皮増殖因子受容体から選択される。別の態様では、標的化リガンドはトランスフェリン受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７またはＣＤ４０のようなＢ−細胞受容体；ＣＤ４のようなＴ細胞受容体、Ｅ−セレクチン受容体；Ｌ−セレクチン受容体；Ｐ−セレクチン受容体；葉酸受容体；インテグリンを含むアルファＶ−サブユニットのようなαβ型インテグリン受容体；およびＣＣＲ２受容体のようなケモカイン受容体から選択される受容体に結合する。
【００３６】
標的化リガンドは、タンパク質、あるいは葉酸、ピリドキサールリン酸、ビタミンＢ１２、シアリルルイスｘ、トランスフェリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）またはその断片、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、ＲＧＤペプチド、ＮＧＲペプチドまたはＣＣＬ２のようなケモカインのような低分子リガンドであることができる。
【００３７】
【表１】
【００３８】
例示的リガンドは、抗体または抗体フラグメントであり、それらには増殖因子受容体の細胞外ドメインに高い特異性および親和性で結合するものを含む。例示的受容体には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ癌遺伝子のｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質産物、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、塩基性繊維芽細胞増殖因子（塩基性ＦＧＦ）受容体および血管内皮増殖因子受容体，Ｅ−、Ｌ−およびＰ−セレクチン受容体、葉酸受容体、ＣＤ４受容体、ＣＤ１９受容体、α／βインテグリン受容体およびケモカイン受容体がある。
【００３９】
別の態様では、リポソームは標的化リガンドの１より多くの特異性を提示することができる。多標的型リポソームの一観点では、同じかまたは異なる細胞型上に、または成長もしくは分化の１より多くの段階であることができる細胞上に提示され得る多くの結合部位に、脂質にカプセル化された薬剤を向けることが望まれることに基づき標的化剤が選択される。例えば脂質にカプセル化された薬剤は、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）およびＨｅｒ２（ＥＲＢＢ２）に向けた標的化リガンドを含んでなることができ、すなわちＨｅｒ２−陽性およびＨｅｒ２−陰性の両方の乳癌細胞を標的とする。
【００４０】
抗体
本出願で記載する抗体は、限定するわけではないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、齧歯類、霊長類またはその任意の組み合わせのような任意の哺乳動物を含むか、またはそれに由来することができ、そして単離されたヒト、霊長類、齧歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化および／またはＣＤＲ移植化またはＣＤＲ適合化抗体、免疫グロブリン、その分解産物および部分および改変体を含む。
【００４１】
本発明の態様に有用な抗体は、当該技術分野で周知な幾つかの方法で誘導化することができる。一つの観点では、抗体は当該技術分野で周知なハイブリドーマ技術（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．、編集、分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン ウィリー ＆ サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）社、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、抗体、ア ラボラトリー マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）：Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．、編集、免疫学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ジョン ウィリー ＆ サンズ社、ニューヨーク州（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．、タンパク質科学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ジョン ウィリー ＆ サンズ、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９９７−２００１）を参照にされたい）を使用して得ることができる。
【００４２】
また抗体はそのようなドメインまたは成分のライブラリー、例えばファージライブラリーを選択することから得ることもできる。ファージライブラリーは無作為なオリゴヌクレオチドのライブラリー、または免疫感作した動物またはヒトのＢ細胞に由来するような目的配列を含むポリヌクレオチドのライブラリーを挿入することにより作成することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７）。抗体ファージライブラリーは、重（Ｈ）および軽（Ｌ）鎖可変領域対を１つのファージに含み、単鎖ＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメントの発現を可能とする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ｅｔ ａｌ．２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２１（８）３７１−８）。ファジェミドライブラリーの多様性は、さらに望ましいヒトモノクローナル抗体を生産し、そして続いて同定するために、ライブラリーのモノクローナル抗体の免疫特異性を上げ、かつ／または改変するように操作することができる。例えば重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖免疫グロブリン分子をコードする遺伝子を無作為に混合して（シャッフル）、新たなＨＬ対を集成した免疫グロブリン分子に作成することができる。さらにＨおよびＬ鎖のいずれかまたは両方をコードする遺伝子を、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異させ、そして続いて所望する親和性および中和能力についてスクリーニングすることができる。また抗体ライブラリーは、１もしくは複数のヒトの骨格配列を選択し、そしてヒト抗体のレパートリーに由来するＣＤＲカセットの集合を導入するか、あるいは設計した変異を介して合成的に作成することもできる（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ ２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５９８−６０２）。多様性の位置はＣＤＲに限定されず、そして可変領域の骨格セグメントを含むことができ、またはペプチドのような他の抗体可変領域以外を含んでもよい。
【００４３】
抗体の可変領域以外で含むことができる他の標的結合成分は、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイおよびバクテリアディスプレイである。リボソームディスプレイは、タンパク質をＲＮＡに付けたままｍＲＮＡをそれらのコグネイトタンパク質に翻訳する方法である。核酸のコード配列は、ＲＴ−ＰＣＲにより回収される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，９０２２）。酵母ディスプレイは、膜に会合したアルファ−アグルチニン酵母接着受容体、ａｇａ１およびａｇａ２、交配系の一部の融合タンパク質の構築に基づく（Ｂｒｏｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：５５３−７）。バクテリアディスプレイは、細胞膜または細胞壁と会合する輸送されたバクテリアタンパク質に対する標的の融合に基づく（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ２００２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，７９：４９６−５０３）。
【００４４】
ハイブリドーマ技術との比較では、ファージおよび他の抗体ディスプレイ法は、インビトロの抗原標的に対する選択を操作する好機を可能とし、そして宿主が抗原に、またはその逆に及ぼす影響の可能性に限定されない。
【００４５】
標的化リガンドのビオチン化
標的化リガンドが抗体またはそのフラグメントのようなタンパク質である場合、ビオチンはタンパク質中に存在するアミノ残基に、リシン残基のイプシロン−アミノ基として、またはアミノ末端のアルファ位に当該技術分野で知られている方法により都合よく結合される。カルボジイミド、ジマレイミド、ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−シクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、６−ヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）、Ｎ３ＳおよびＮ２Ｓ２のような種々の連結または架橋結合剤を周知の手順で使用して、ビオチンアミド類似体またはビオチン化合物を合成することができる。例えばビオチンはＤＴＰＡを介して、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ Ａｐｐｌ Ｒａｄｉａｔ Ｉｓｏｔｏｐ ３３：３２７（１９８２）の二環式無水物法（ｂｉｃｙｃｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）使用して結合することができる。モノ−ビオチン化された標的化リガンドを主に生成するために、標的化リガンドに対するビオチンの比は小さいべきであり、典型的には２：１である。
【００４６】
ビオチンを標的化リガンドに付けるために有用な他の化合物には、「ビオシチン（ｂｉｏｃｙｔｉｎ）」、ビオチンのリシン結合体、またはカダベリン−ビオチン（Ｎ−（５−アミノペンチル）ビオチンアミド）；ビオチンエチレンジアミン；あるいはスルホスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（これはピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州から購入することができる）、および（６−（（ビオチノイル）アミノ）ヘキサン酸スクシンイミジルエステル）、Ｎ−（５−（６−（（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ペンチルマレイミド）；およびビオチウム（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ヘイワード、カリフォルニア州から入手可能な他のもののようなビオチンの活性化試薬形を含む。
【００４７】
ビオチン化された標的化リガンドを調製するための別の方法は、ビオチンを認識ドメイン中の特異的なリシン残基、ＭＫＭモチーフに酵素的に付加することができるビオチンリガーゼ（大腸菌のＢｉｒＡタンパク質、ＥＣ６．３．４．１０）用の認識ドメインを含有する融合ポリペプチドを組換え的に工作することによる。この認識ドメインは高度に保存されているので、様々な種に由来するビオチン化タンパク質から誘導化することができる（Ｃｒｏｎａｎ Ｊｒ．，ＪＥ．１９９０．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１０３２７−１０３３３：ＵＳ４８３９２９３）。
【００４８】
合成されたビオチン化された標的化剤は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのような標準法を使用して特性決定することができる。いったん調製すれば、候補のビオチン誘導体は、アビジンに結合する能力についてスクリーニングすることができる。さらに安定性は、化合物を個体に投与し、様々な時点での血液サンプルを得（例えば３０分、１時間、２４時間）、そして血液サンプルをビオチン化合物および／または代謝産物について分析することにより試験することができる。
【００４９】
治療薬を含有する脂質小胞
リポソームならびに他のミセル状脂質小胞は、薬剤送達媒体として作用するために、標的化リガンドを包含するための本発明の方法に含まれる。リポソームの調製法および薬剤装填手順およびその他は、当該技術分野では周知である。リポソームは非極性および極性化合物の両方を、生物適合性および生分解性脂質二重層との相互作用を介して、または水性の芯内にそれぞれ蓄えることができる。
【００５０】
本発明の組成物における使用に適する脂質には、小胞形成脂質を含む。そのような小胞形成脂質は、（ａ）ジグリセリドおよびリン脂質により例示されるような、水中で単ラメラまたは二重層小胞を自然に形成することができるもの、あるいは（ｂ）単ラメラ、二重層化、またはラフトを含む脂質構造に安定に取り込まれるものである。
【００５１】
この種の小胞形成脂質は典型的には２つの炭化水素鎖、通常はアシル鎖および極性もしくは非極性のいずれかのヘッド基を有する。様々な合成の小胞形成脂質および自然に存在する小胞形成脂質があり、それらにはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンのようなリン脂質を含み、ここで２つの炭化水素鎖は典型的には約１４〜２２個の間の炭素原子長であり、そして異なる程度の不飽和度を有する。アシル鎖が異なる程度の飽和度を有する上記の脂質およびリン脂質は市販されているか、または公開されている方法に従い調製することができる。他の適切な脂質には糖脂質、セレブロシドおよびコレステロールのようなステロールがある。
【００５２】
またカチオン性脂質も本発明のリポソームでの使用に適しており、ここでカチオン性脂質は脂質組成物のわずかな成分として含まれるか、あるいは主要な、もしくは唯一の成分として含まれることができる。そのようなカチオン性脂質は典型的にはステロール、アシルまたはジアシル鎖のような脂肪親和性リガンドを有し、そしてここで脂質は全体として正味の正電荷を有する。典型的には脂質のヘッド基は正の荷電を持つ。カチオン性脂質の例には、１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３，−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム−クロライド（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；およびジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）を含む。
【００５３】
カチオン性の小胞形成脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような中性脂質、またはポリリシンまたは他のポリアミン脂質のようなカチオン性脂質で誘導化されたリン脂質のような両親媒性脂質でもよい。例えば中性脂質（ＤＯＰＥ）はポリリシンで誘導化されて、カチオン性脂質を形成することができる。
【００５４】
別の態様では、小胞形成脂質は血清中でのリポソームの安定性を制御するために、記載するような標的化結合体の挿入に効果的な条件を制御するために、そしてリポソームに封入された作用物質の放出速度を制御するために、特定の流動性または堅さ（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）の程度を達成するために選択される。
【００５５】
より堅い脂質二重層、または液体結晶の二重層を有するリポソームは、比較的堅い脂質、例えば比較的高い相転移温度、例えば最高６０℃を有する脂質の包含により達成される。堅さ、すなわち飽和の脂質は、脂質二重層において膜のより高い堅さに貢献する。コレステロールのような他の脂質成分も、脂質二重層構造の膜の堅さに貢献することが知られている。
【００５６】
一方、脂質の流動性は比較的流動性の脂質、典型的には比較的低い液体から液体−結晶への相転移温度、例えば室温以下を持つ脂質相を有するものの包含により達成される。
【００５７】
本発明の方法の一つの態様では、本発明の標的化された治療用リポソーム組成物が前形成されたリポソームおよび標的化複合体を使用して調製され、これは結合体のリポソーム二重層への挿入を達成するために効果的な条件下で一緒にインキュベーションされる。さらに具体的には、２つの成分は標的化リガンドがリポソーム表面から外側に向き、したがってそのコグネイト受容体と相互作用できるように結合体の挿入を達成する条件下で一緒にインキュベーションされる。
【００５８】
約２℃〜８０℃の相転移温度を有する小胞形成脂質が、本組成物の前形成リポソーム成分での使用に適している。例えば脂質であるジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）は６２℃の相転移温度を有し、そして脂質が水素化されたダイズのホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）は、５８℃の相転移温度を有する。多くの脂質の相転移温度は、アバンティの極性脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）のカタログおよび脂質の温度屈性相転移データベース（Ｌｉｐｉｄ Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｐｉｃ Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ）（ＬＩＰＩＤＡＴ、ＮＩＳＴスタンダード レファレンス データベース３４）のような様々な出典の表にまとめられている。
【００５９】
本発明の一つの態様では、約３０〜７０℃の間の相転移温度を有する小胞形成脂質が使用される。別の態様では、リポソームの形成に使用する脂質は、２０℃、１０℃、または最も典型的には５℃の範囲内の相転移温度を有するものであり、この温度に標的化リガンドアビジン−脂質複合体のリガンドがその結合活性に影響することなく加熱され得る。
【００６０】
標的化複合体のリポソームへの挿入を達成するために効果的な条件は、幾つかの変数に基づき決定されると考えられ、それらには望ましい挿入速度（ここで、より高いインキュベーション温度がより速い挿入速度を達成できる）、リガンドがその活性に影響を及ぼされずに無事に加熱され得る温度、および脂質および脂質組成物のより程度が低い相転移温度を含む。挿入は、ポリエチレングリコールおよびエタノールのような両親媒性溶媒のような溶媒、または界面活性剤の存在により変動し得るとも考え知れる。
【００６１】
本発明の一態様では、前形成されたリポソームは親水性ポリマーで誘導化された小胞形成脂質も含む。例えば米国特許第５，０１３，５５６号明細書に記載されたように、そのような誘導化脂質をリポソームに含めることは、リポソームの周囲に親水性のポリマー鎖の表面コーティングを形成する。親水性ポリマー鎖の表面コーティングは、そのようなコーティングが無いリポソームと比べた時、非免疫原性の外面の提示により、リポソームのインビボでの血液循環半減期を上げるために効果的である。またそのようなリポソームは構造的に安定化され、そして立体的にも安定化されたリポソームとして知られている。
【００６２】
親水性ポリマーでの誘導化に適切な小胞形成脂質には、上に列挙した任意の脂質、そして特にジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）のようなリン脂質を含む。
【００６３】
小胞形成脂質を用いた誘導化に適切な親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミドおよび親水性ペプチド配列を含む。ポリマーはホモポリマーとして、またはブロックもしくはランダムコポリマーとして使用することができる。
【００６４】
例示的な親水性ポリマー鎖は、５００〜１０，０００ダルトンの間、より典型的には１，０００〜５，０００ダルトンの間の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧのメトキシまたはエトキシ−キャップ化類似体も有用な親水性ポリマーであり、様々なポリマーサイズ、例えば１２０〜２０，０００ダルトンで市販されている。
【００６５】
親水性ポリマーで誘導化された小胞形成脂質の調製は、例えば米国特許第５，３９５，６１９号明細書に記載された。そのような誘導化脂質を含むリポソームの調製も記載され、ここで典型的には１〜２０モルパーセントのそのような誘導化脂質がリポソーム製剤に含まれる。
【００６６】
別の態様では、リポソームはジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）：コレステロール（５２：４５のモル比）からなり、そしてさらに全脂質に対して３モル％のＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥを含む。リポソームは、記載されているように（Ｈｕｗｙｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４１６４−１４１６９）、凍結−解凍サイクルおよび押出しにより調製される。本質的に脂質は最初にクロロホルムまたはクロロホルム／メタノール２：１容量／容量に溶解される。脂質フィルムは、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（ブッキ（Ｂｕｃｈｉ）、スイス）を使用した真空蒸発により調製される。乾燥した脂質フィルムは１０ｍＭの最終脂質濃度が達成されるように、４０℃で０．０１ＭのＰＢＳまたは６５ｏで０．３Ｍのクエン塩（ｐＨ４．０）中で脱水される。脂質は５回の凍結−解凍サイクル、続いて押出し機（アバンティポーラーリピッド、アラバスター、アリゾナ州）を使用した２０℃で１００ｎｍの孔サイズのポリカーボネート膜を通す押し出し（５回）にかけられる。押出しは５０ｎｍのポリカーボネート膜を使用して９回繰り返される。この手順で、１５０ｎｍの小胞直径のＰＥＧ誘導化リポソームが生成する。以前に示されたように（Ｓｃｈｎｙｄｅｒ，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３７７：６１−６７）、ビオチン化された装填リポソームは、ＰＥＧ−ＤＳＰＥの一部をリンカー脂質（ビオチン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）に置き換え、そして水和工程でカルボキシ−フルオロスクシン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｃｉｎ）を加えることにより調製することができる。
【００６７】
ストレプトアビシンを連結した脂質ミセルのリポソームへの挿入は、ストレプトアビシンを連結した脂質ミセルを前形成されたリポソームと、時間（１、２または４時間）および温度（３７℃、５０℃または６０℃）を変えて混合することにより開始される。転移は加熱ブロック中で行われる。ＰＥＦ−ＤＳＰＥミセルをリポソームに転移する手順は、以前に報告された（Ｋｕｌｌｂｅｒｇ，Ｅ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７３７−７４３（２００２））。
【００６８】
治療薬
「治療薬」は宿主に対して生物学的効果を有することができる作用物質である。例として治療薬は腫瘍または感染の樹立または増殖（全身的もしくは局所的）を防止することができる。例には抗生物質、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌・カビ剤、毒素（例えばリシン）、放射性核種（例えばＩ−１３１、Ｙ−９０、Ｓｍ−１５３）、ホルモンアンタゴニスト（例えばタモキシフェン）、白金錯体（例えばシスプラチン）、オリゴヌクレオチド（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはサイレンシング（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチド配列）、化学療法用ヌクレオチドおよびヌクレオシド類似体（例えばカペシタビン、ジェムシタビン）、ホウ素含有化合物（例えばカルボラン）、光力学的剤（例えばローダミン１２３）、エンジイン（例えばカリケアミシン）、およびカンプトテシン（例えばＣＰＴ−１１、ＳＮ−３８、Ｃ９）およびチロシンキナーゼインヒビター（例えばイマチニブメシレート）を含む。腫瘍の樹立または増殖を処置または防止するための態様において、治療薬はドキソルビシン、タキサンまたはシスプラチンである。バクテリア感染の樹立または増殖を処置または防止するための別の例示的態様において、治療薬はキナロン（例えばレボフロキサシン）、マクロライド（例えばアジスロマイシン）、またはセファロスポリン（例えばセフロキシム）抗生物質である。ウイルス感染の樹立または増殖を処置または防止するための例示的態様において、治療薬は逆転写酵素インヒビターである。菌・カビの感染の樹立または増殖を処置または防止するための例示的態様において、治療薬はアンホテリシンＢまたはナイスタチンである。
【００６９】
新生物障害を有する個体を処置する目的で、一つの態様では封入された治療薬は細胞傷害剤である。細胞傷害剤は新生物疾患の兆候を標的とするリポソームに封入された作用物質として特に有用である。薬剤はドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンおよびその類似体から選択されるアントラサイクリン系抗生物質であることができる。細胞傷害剤はジェムシタビン、カペシタビンおよびリバビリンから選択されるヌクレオシド類似体であることができる。また細胞傷害剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オルマプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金化合物であることができる。細胞傷害剤は、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシンおよび９−ニトロカンプトテシンからなる群から選択されるトポイソメラーゼインヒビターであることができる。細胞傷害剤は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンレウロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、ビンロジシン（ｖｉｎｒｏｄｉｓｉｎｅ）、ビノレルビンおよびビンデシンからなる群から選択されるビンカアルカロイドであることができる。
【００７０】
別の態様では、封入された作用物質は核酸である。核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイム、または標的細胞によりインターナライズされた時、治療用遺伝子の発現が治療用遺伝子産物の生成を達成する治療用遺伝子を含むプラスミドであることができる。
【００７１】
別の態様では、封入された作用物質はＨＩＶ感染を処置し、そしてＨＩＶの複製を阻害するために有用である。封入された作用物質はヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素インヒビター、非−ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素インヒビター、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター、ＨＩＶインテグラーゼインヒビター、ＨＩＶ融合インヒビター、免疫調節物質、ＣＣＲ５アンタゴニストから選択され、そして抗感染剤が特許請求される。ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素インヒビターは、アバカビル、アシクロビル、ジダノシン、エムトリシタビン、ラミブジン、ジドブジン、スタブジン、アタザナビルおよびテノホビルから選択され得る。非ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素インヒビターは、エファビレンズ、ネビラピンおよびカラノライド（ｃａｌａｎｏｌｉｄｅ）であることができる。ＨＩＶプロテアーゼインヒビターはアンプレナビル、ネルフィナビル、ロピナビル、サキナビル、アタザナビル、インジナビル、チプラナビルおよびフォサムプレナビルカルシウムであることができる。ＨＩＶ融合インヒビターはエンフルビルチド、Ｔ−１２４９およびＡＭＤ−３１００であることができる。ＣＣＲ５アンタゴニストはＴＡＫ−７７９、ＳＣ−３５１１２５、ＳＣＨ−Ｄ、ＵＫ−４２７８５７、ＰＲＯ−１４０およびＧＷ−８７３１４０であることができる。
【００７２】
ＨＩＶプロテアーゼインヒビターであるインジナビルを含有する抗ＨＬＡ−ＤＲ被覆化リポソームが開示された（Ｇａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５５８：１９８−２１０）。
【００７３】
本発明の一つの観点では、第一線の治療として使用されるか、または特に新生物疾患およびＨＩＶ感染の処置のための他の種類または治療的処置と一緒に（事前に、同時に、または後に）与えられるか、あるいは免疫抑制剤であることができる免疫系のモジュレーターが提供される。免疫モジュレーターは、ＩＦＮアルファ、ＩＮＦベータまたはＩＦＮガンマ−型のインターフェロンを含むインターフェロン（ＩＦＮ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＴＮＦアルファおよびＩＬ−２から選択することができる。本発明の免疫抑制剤は、シクロスポリン、シロリムスおよびマイコフェノール酸モフェチルから選択することができる。
【００７４】
キット
本発明のビオチンを結合するアビジン−脂質構造は、標的化脂質小胞、特に標的化された立体的に安定化されたリポソームを調製するキットの成分として都合よく使用される。標的化脂質構造は、ビオチン化された標的化分子をリポソームのようなビオチンを結合するアビジン−脂質構造と混合することにより形成される。本発明の態様では、リポソームは立体的に安定化されたリポソームであり、そして標的化剤は標的化細胞型の表面上の受容体に向けられた抗体フラグメントである。
【００７５】
選択法
治療用の標的化リポソーム組成物は、以下の成分から調製される。特定の状態、例えば肺の充実性腫瘍、バクテリア感染またはウイルス感染に罹患している個体に特異的な組成物は、調製した結合体の選択からビオチン化された標的化リガンドを選択することにより調製される。標的化結合体は、リガンド−受容体の結合対に関する当業者の知識、あるいは適切な患者のサンプル、例えば流体サンプル、生検等を得ることによるいずれかに従い、選択される。サンプルは種々の受容体の発現について当該技術分野で知られている手段により試験して、適切な標的化リガンドを決定する。
【００７６】
前形成された治療薬が封入されたリポソーム組成物は、特定の状態の処置に適する治療薬に関する当業者の知識に基づき選択される。あるいは治療用リポソーム組成物は化学的感受性試験を行った後に選択して、封入された薬剤が患者の生検または流体サンプルから得た問題の細胞に及ぼす効果を決定する。
【００７７】
標的化結合体および前形成されたリポソーム組成物の選択後、その個体用の標的−細胞を感作する治療用リポソーム組成物は、２つの成分を合わせることにより調製される。記載のように、成分はビオチンを結合した標的化リガンドの、両親媒性脂質化ポリマー結合したビオチンへ連結したアビジンの遊離部位への親和性結合を行うための条件下で合わせられ、これがリポソーム二重層に挿入されて標的化細胞を感作するリポソームを作成する。連結が完成した後、組成物が患者に投与される。
【００７８】
本発明の治療用リポソームは、静脈内（ｉ．ｖ．）注入により、皮下（ｓ．ｃ．）注射により、局所的適用により患者に投与され、経口摂取され得る。
【００７９】
本発明をこれから以下の具体的な非限定的実施例を参照にして説明する。
【実施例】
【００８０】
実施例１
アビジンを連結したミセルの調製
ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥ、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）２０００］（アバンティ ポーラー リピッド社、アラバスター、アラバマ州）の５マイクロモルを、１ｍｌのエタノール／ｄＨ２Ｏ（５０：５０、容量／容量）に溶解した。ストレプトアビジン（ピアス バイオテクノロジー、ロックフォード、イリノイ州）を２０ｍＭのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２に１ｍｇ／ｍｌ（２０ｕＭ）の濃度で再構成した。ストレプトアビジンをビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥと４：１のモル比で混合した（図１に関して）。２５℃で１時間、穏やかに振盪しながらインキュベーションした後、反応混合物をＧＦ−２５０ゲル濾過クロマトグラフィーにより２ｍｌ／分の流速で精製し、そして２１４ｎｍでＵＶ検出した。画分を集め、そして２８０ｎｍでのＵＶの吸収測定およびＳＥＬＤＩ−ＭＳ光度計により分析した。
【００８１】
比較には、３種のサンプル；脂質（ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥ）、ストレプトアビジンおよびストレプトアビジンを結合したビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥを調製し、そしてＧＦ−２５０調製カラムを使用してゲル濾過クロマトグラフィーにより分析した。結果は、ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥのみに関する保持時間が約２２分（図２Ａ）であることを示した。ストレプトアビジンの保持時間は約２４分（図２Ｂ）であった。ストレプトアビジンを結合した脂質は、１５分で溶出した（図２Ｃ）。これらの溶出プロファイルは、ストレプトアビジンを結合した脂質がリン脂質単独および非結合ストレプトアビジンタンパク質からゲル濾過クロマトグラフィーにより分離できることを明らかにした。ストレプトアビジンを結合した脂質から集めて生じた画分は、２８０ｎｍでのＵＶ吸収を測定すことにより、およびＳＥＬＤＩ−ＭＳにより分析した（データは示さず）。
【００８２】
実施例２
アビジンを連結したミセルから治療用リポソームの形成
アルザ コーポレーション（ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（マウンテンビュー、カリフォルニア州）により提供されるＤＯＸＩＬ（商標）は、ポリエチレングリコールをコーティングしたリポソームにカプセル化されたドキソルビシンの製剤である（Ｍａｒｉｎａ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：４１３−４１８（２００２））。ストレプトアビジンを連結した脂質ミセルの前形成されたリポソームへの挿入は、ストレプトアビジンを連結した脂質ミセルのアリコートとＤｏｘｉｌリポソームとを、５０℃で２時間混合することにより開始した。反応物中の全脂質濃度は１０ｍＭであった。全脂質に対して３モル％のストレプトアビジンを結合した脂質を、リポソームへの包含に適用した。転移は加熱ブロックで行った。ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセルをリポソームに転移するこの手順は、すでに報告されている（Ｋｕｌｌｂｅｒｇ，Ｅ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７３７−７４３（２０００２））。転移反応後、ストレプトアビジンを連結したリポソームは、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂゲル（アマシャム：Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む小さいカラム（ＰＤ−１０）でゲル濾過により精製し、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）で溶出した。ストレプトアビジンを連結したリポソーム画分は、溶出した画分（各０．５ｍｌ）について２８０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することにより決定した。リポソームに封入されたドキソルビシンの各画分について、ドキソルビシン濃度は４９５ｎｍ（ε＝１２，５００）の最大吸収でＵＶ測定により定量した（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１２：６９３−７００（２００４））。
【００８３】
ストレプトアビジンを結合したＤＯＸＩＬ（商標）リポソームの安定性を試験するために、細胞傷害アッセイを２種の腫瘍細胞、ＭＤ−ＭＢＡ２３１（乳癌細胞）およびＡ４３１（類表皮癌細胞）を使用して行った。対数成長期の腫瘍細胞は、０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して回収した。１×１０５細胞／ｍｌの細胞懸濁液を作成した。０．１ｍｌ中に１万個の細胞を９６ウェルプレートに加えた。接着のために一晩インキュベーションした後（約１８時間）、培養基を回収し、そして細胞を遊離のドキソルビシン（ＤＯＸ）またはストレプトアビジンを結合したＤｏｘｉｌリポソームのいずれかとインキュベーションした。両試薬を成長培地で１：５の順次濃度、１８、３．６、０．７３、０．１４４、０．０２８８、０．００５７６および０μｇ／ｍｌ［ＤＯＸ］に希釈した。各濃度について０．１ｍｌを細胞が接着したウェルに３連で加えた。細胞を試験物質と３７℃で１時間、インキュベーションした。インキュベーションの終わりに、細胞を３回、２００μｌの成長培地で洗浄し、次いで１００μｌの新鮮な培地と７２時間インキュベーションした。７２時間のインキュベーション後、生きている細胞の量をＡＴＰｌｉｔｅ（商標）ルミネッセンスアッセイ系（パーキンエルマーライフ アンド アナリティカル サイエンス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、シェルトン、コネチカット州）を使用して測定した。アッセイは製造元のプロトコールに従い行った。細胞傷害性のデータでは、１時間の処理時間の後に遊離のドキソルビシンによる細胞生存能に及ぼす濃度効果が示されたが、ストレプトアビジンを結合したＤｏｘｉｌリポソームで処理した細胞の細胞傷害効果は示されなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。これらの結果は、腫瘍細胞との１時間のインキュベーション後、ストレプトアビジンを結合したリポソームからカプセル化されたドキソルビシンの漏出がないことを示唆している。したがって、安定化された結合体が形成された。
【００８４】
実施例３
ストレプトアビジンを連結した脂質リンカーの静的光散乱法による特性決定
ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥおよびストレプトアビジンを連結した脂質リンカーは、溶液分子量測定のために静的光散乱法（ＳＬＳ）に連結されたサイズ排除カラム（ＳＥＣ）により特性決定された。種々の量で装填したビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥのサンプル（３μｇ〜２００μｇの範囲）は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ポンプを使用してＰＢＳで前平衡化されたｓｕｐｅｒｐｏｓｅ−１２カラムに注入された。溶出ピークは２８０ｎｍでＵＶ検出器（アギレント：Ａｇｉｌｅｎｔ）；６９０ｎｍでＯｐｔｉｌａｂ−ＲＥＸ屈折率（ＲＩ）検出器（ワイアット：Ｗｙａｔｔ）；およびＤＡＷＮ−ＥＯＳ光散乱検出器（ワイアット）により監視した。２５μｇおよび５０μｇのストレプトアビジンを含有するストレプトアビジンを連結した脂質−リンカー（バイオ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル）を上記のように分析した。
【００８５】
溶出したビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥピークは、アストラ（Ａｓｔｒａ）ソフトウェア（ワイアット）、屈折率シグナルおよび０．１４５ｍｌ／ｇのｄｎ／ｄｃ値を使用することにより処理した。ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥは２８０ｎｍで最少吸収を有し、そしてＭＷ決定には使用されなかった。すべてのビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥ注入物は類似の保持時間、そして〜２３８ｋＤａのＭＷに単一ピークで溶出した。図４はこのカラムでのビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥの１回の注入の結果を示す。脂質単独の保持時間は約３９分であり、そしてそのピークは屈折率により検出することができる。光散乱から算出された２３８ｋＤａのＭＷは、〜７９単量体単位（脂質単量体あたり３０１６．８１Ｄａ）からなるミセル形成と合致する。
【００８６】
ストレプトアビジンを連結したリンカー脂質ミセルは、静的光散乱に連結されたＳＥＣにより、アストラソフトウェアをＵＶ２８０ｎｍおよびＲＩシグナル、ストレプトアビジンに関する０．１８５ｍｌ／ｇ、ストレプトアビジンを連結した脂質に関する０．１６５ｍｌ／ｇのｄｎ／ｄｃ値、およびストレプトアビジンに関して１．７１ｍｌ／ｍｇ，ｃｍの吸光係数と一緒に使用して分析した。図３は、ＳＥＣからの２５μｇ（下の第１ピークの追跡）および５０μｇ（上の第１ピークの追跡）のピークの溶出プロファイルを示し、算出された分子量が重なった。サンプルは主に１つの主要ピーク（ｒ．ｔ．＝２３分）からなるが、第２のより小さいピーク（ｒ．ｔ．＝２８分）も存在する。この溶出ピークはＵＶ２８０および屈折率の両方により検出することができる。第１および第２ピークについて予想される分子量は、大変大きいと思われる。２５μｇおよび５０μｇの装填量を比較すると、各装填量で見かけの分子量が上がり、２５μｇでは飽和に達しないことが示唆される。正確な分子量は構造的確認無しには評価できない。これらの結果は、ストレプトアビジンを会合した脂質複合体が形成され、ストレプトアビジンを連結した脂質−リンカー、そしてビオチン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質ミセル（ｒ．ｔ．＝４０分）から分離できることを証明した。
【００８７】
実施例４
連結したストレプトアビジン−脂質
ストレプトアビジンを連結した脂質（ＳＡ−脂質）が、特異的な細胞表面受容体結合をすることができるビオチン化リガンドを運ぶことができるのかどうかを評価するために、ビオチン化されたマウス表皮増殖因子（ｂ−ｍＥＧＦ）を標的化リガンドとして選択した。５３個のアミノ酸を含むマウスＥＧＦは、ペプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）（ロッキーヒル、ニュージャージー州）から購入した。２５０μｇのＥＧＦを３００μｌのＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４に溶解した。ビオチン化直前に、２．２ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）を４００μｌの超純水に溶解した。モノ−ビオチン化ｍＥＧＦを得るために、２倍モル過剰のビオチンをｍＥＧＦと室温で３０分間インキュベーションした。３０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を標識混合物に加えてこの反応をクエンチした。ビオチン化ｍＥＧＦは質量分析により特性決定され、そして最終産物は主にモノ−ビオチン化ｍＥＧＦを有するが、幾らかの未反応および大変少量のジ−ビオチン化ｍＥＧＦが存在することが示された（図５Ａ〜Ｂ）。ビオチン化マウス−ＥＧＦペプチドを持つＳＡ−脂質は、高レベルでヒトＥＧＦ受容体を細胞表面上に発現する２種類のヒト腫瘍細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（乳癌細胞）およびＡ４３１（類表皮癌細胞）を使用して試験した。
【００８８】
ヒトＥＧＦＲと交差反応性のビオチン化ｍＥＧＦは、ＳＡ−脂質と１：１のモル比で室温にて２時間インキュベーションした。次いでサンプル混合物または裸のＳＡ−脂質を、ＭＤＡ−ＭＢ２３１またはＡ４３１腫瘍細胞と４℃で１時間インキュベーションした。標的化した脂質粒子の結合を評価するために、次いで腫瘍細胞はＭＤＡ−ＭＢ２３１の場合にはＦＩＴＣに結合したヤギ抗−ストレプトアビジン（ベクターラボラトリー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ベーリンガム、カリフォルニア州）、またはヤギ抗−ｍＥＧＦ（ペプロテック社、ロッキーヒル、ニュージャージー州）と、続いてＰＥに結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ウエストグローブ、ペンシルバニア州）と４℃で４５分間インキュベーションし；あるいはＡ４３１腫瘍細胞の場合には、ウサギ抗−ｍＥＧＦ（ＲＤＬ、フランダース、ニュージャージー州）、続いてＡＰＣに結合したロバ抗−ウサギＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチ、ウエストグローブ、ペンシルバニア州）と４℃で４５分間インキュベーションした。インキュベーション後、腫瘍細胞を２回、フローステイニング（ｆｌｏｗ ｓｔａｉｎｉｎｇ）バッファー（１％ＢＳＡ、０．０９％アジ化ナトリウムを含むｄＰＢＳ）で洗浄した。最後に腫瘍細胞はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ、フランクリンレイク、ニュージャージー州）により得て、表面に結合したストレプトアビジンまたは腫瘍細胞上のｍＥＧＦを検出した。
【００８９】
図４はストレプトアビジンおよびｍＥＧＦペプチドの両方が細胞表面上で特異的抗体により検出されたことを証明する。さらにこれらの結果は、ビオチン化ｍＥＧＦがＳＡ−脂質により捕捉でき、そしてこの複合体が恐らくＥＧＦ受容体結合を介してＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞表面上に結合できることを示す。さらにＡ４３１腫瘍細胞が評価された。図５はストレプトアビジンおよびｍＥＧＦペプチドがｍＥＧＦ／ＳＡ−脂質処理細胞上で特異的抗体を使用して検出されたが（図５Ａ）、裸のＳＡ−脂質で処理した細胞では検出されなかったことを示す（図５Ｂ）。しかし約３〜５％のＡ４３１細胞群が、ウサギ抗ｍＥＧＦ、続いてロバ抗−ウサギＩｇＧ−ＡＰＣで陽性に染色された（図５Ｂおよび５Ｃ）。この観察はＡ４３１細胞がＥＧＦを内的に発現できることを示唆している。まとめると、腫瘍細胞結合データはＳＡ−脂質がリガンド送達媒体であり、そして細胞表面受容体を標的とすることができることを証明する。
【００９０】
本発明は今、完全に記載され、当業者にはそれに対する多くの変更および修飾が添付する特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされ得ることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】方法を概略的に表しており：工程ｉ）では、両親媒性ビオチン−ポリマー−脂質が自己会合（ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｅ）してミセルを形成するか、あるいはさらに封入する薬剤を含むことができる前形成されたリポソームの脂質層に事前に包含されており；工程ｉｉ）では、非共有結合を介して多数のビオチン結合部位を持つアビジンを、ビオチン化脂質小胞と接触させてストレプトアビジンを会合した脂質小胞を形成し、これは遊離のビオチン結合部位を保持し；これにより工程ｉｉｉ）でビオチン化された標的化リガンドを結合させて標的化リガンドが連結されたアビジン−脂質小胞を形成することができる。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、ビオチン−ＰＥＧ−リン脂質単独および非結合ストレプトアビジンタンパク質からゲル濾過クロマトグラフィーにより分離されたストレプトアビジンを結合した脂質の溶出プロファイルを表すクロマトグラフィーの追跡であり：ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥの溶出プロファイル（２Ａ）、ストレプトアビジンの溶出プロファイル（２Ｂ）、および混合物中、４：１のモル比で脂質に結合したストレプトアビジン（２Ｃ）である。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、同じ試薬で処理したＭＤ−ＭＢＡ２３１ヒト胸部腫瘍細胞（Ａ）およびＡ４３１ヒト類表皮腫細胞（Ｂ）に及ぼす遊離ドキソルビシンおよびストレプトアビジンを結合したＤＯＸＩＬ（商標）銘柄のリポソームに関する細胞傷害性アッセイのグラフによる結果である。
【図４】ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２／ＰＢＳ）で同じ条件下、２５μｇ（下の第１ピークの追跡）および５０μｇ（上の第１ピークの追跡）のストレプトアビジンを使用して形成したストレプトアビジン−リポソームの溶出プロファイル（屈折率シグナル）、および重なっているのは、単独で注入した１２５μｇのビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥの溶出ピークであり、静的光散乱法により算出されたＭＷを示す。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ビオチン化マウスＥＧＦの質量分析からの追跡を示す；ビオチン化前のマウスＥＧＦ（Ａ）およびビオチン化ｍＥＧＦ（Ｂ）。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍細胞に結合したストレプトアビジン−リポソームで捕捉されたビオチン化ｍＥＧＦ（ｂ−ｍＥＧＦ／ＳＡ−脂質複合体）のフローサイトメトリー分析について使用したヒストグラムであり：ＦＩＴＣに結合したヤギ抗−ストレプトアビジンを使用して検出した（Ａ）か；またはヤギ−抗ＥＧＦ、続いてＰＥに結合したロバ抗−ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）により検出した（Ｂ）。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、Ａ４３１腫瘍細胞に結合したｂ−ｍＥＧＦ／ＳＡ−脂質複合体のフローサイトメトリー分析からの散乱図であり：Ａ４３１腫瘍細胞はＡ）ｂ−ｍＥＧＦ／ＳＡ−脂質；Ｂ）裸のＳＡ−リポソームで処理され；Ｃ）ウサギ抗−ｍＥＧＦおよび抗−ウサギＩｇＧ−ＡＰＣで染色された未処理細胞；およびＤ）ヤギ抗−ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色された未処理細胞である。
【図１−１】
【図１−２】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、標的化した脂質にカプセル化された薬剤の送達系の調製法、およびその方法により調製された生成物に関する。さらに本発明は、標的化された薬剤を封入したリポソーム製剤の調製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リポソーム技術におけるＳＴＥＡＬＴＨ（商標）銘柄のような長期循環型リポソームは、感染、炎症および腫瘍の部位へ標的化された薬剤の適切な送達系であることが証明された。これらのＰＥＧ化され、立体的に安定化されたリポソームは、網−内皮系により迅速に取り込まれる裸のリポソーム薬剤粒子よりも、ヒトにおけるそれらの血液循環半減期に実質的な改善を示した（非特許文献１；非特許文献２）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーのリン脂質の極性ヘッドへのコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、それらの裸の対応物よりも水性環境中でさらに溶解性のＰＥＧ化リポソームを生じる。リポソーム表面を囲む親水性ＰＥＧ分子は、構造を立体的に安定とし、そして免疫原性を低くし、リポソームがマクロファージに取り込まれることを防ぎ、したがってその循環時間を延ばす。
【０００３】
薬剤の部位特異的送達は、治療的効果を上げ、そして毒性を下げることができる。抗体または抗体フラグメント、炭水化物、酵素および他のリガンドを用いた標的化リポソームの多くの例が報告されてきた。これらの取り組みは、薬剤の脳、肺、腫瘍または免疫系の細胞への送達を含む応用に、進歩した部位特異的リポソーム薬剤担体技術を有する。抗体を結合したリポソーム（イムノリポソーム）は、標的化がモノクローナル抗体の高い結合親和性ならびにその特異的抗原に対する高い選択性により媒介されるので、特にこの目的によく適している。また標的化リポソームの全体的な治療効力は、標的組織を貫通するか、またはそうではなく所望の標的細胞に到達し、そしてリポソームの積載物を送達するための送達媒体（ｖｅｃｔｏｒ）の能力に依存する。イムノリポソームによる特異的細胞への薬剤送達は、ガンおよび他の疾患の処置および標的化作用物質のさらなる探査に有望な取り組みとなることが証明され、ならびにこれらの試薬の製造法における改善が保証される。
【０００４】
イムノリポソームは、全抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂ）または再工作された結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）に結合されたリポソームである。リポソームと抗体との間のリンカーとして、立体的に安定化されたリポソームのＰＥＧ鎖を使用することは、ＰＥＧが抗体をリポソームの脂質層から遮蔽することにより立体障害が減少するので、強化された抗体−抗原結合を生じることが観察された。ＰＥＧポリマーをタンパク質（ＰＥＧ化）および他の生体分子へ付ける方法は、当該技術分野では周知である。
【０００５】
抗体をＰＥＧ−被覆リポソームに、抗体のＰＥＧの遊離末端への共有結合を介して付ける方法が記載された（非特許文献３；非特許文献４）。１つの方法では、リポソーム−ＰＥＧ−抗体結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）がリポソーム形成時に脂質組成物に含まれる。この取り組みは、抗体リガンドの幾つかがリポソームの内部水性区分に面し、意図する標的との相互作用に利用できないという不利益を有する。別の取り組みでは、抗体がＰＥＧ化され、結合体が精製され、そして続いて前形成されたリポソームに挿入される。代替的な手順では、リポソームが例えばＰＥＧ−マレイミドをその表面に包含することにより前活性化される。次いで活性化されたリポソームは、結合すべき標的化リガンドに接触させられ、次いで未反応ヘッド基がクエンチされなければならず、そして生じた混合物は未反応リポソームおよび非結合タンパク質から精製されなければならない。これらの取り組みでは、各標的化リガンドに特異的な多段階工程が考案され、そして至適化されなければならない。
【０００６】
目的の標的化リガンドに容易に付けることができる汎用的なＰＥＧ修飾化リポソーム組成物を開発する取り組みがなされてきた。そのような汎用的薬剤輸送媒体を調製することの１つの提案は、リポソームに標的化リガンドを連結するための基本として、ビオチン−アビジン結合の高い親和性を使用することであった。特許文献１および非特許文献５を参照にされたい。しかしこれらの方法は、処理法における特定の制限、またはリポソーム組成物または標的化リガンドのいずれかの選択に課される制限のいずれかを受ける。したがって、ストレプトアビジン−ビオチンを連結したリポソームの作成に関して改善された方法が必要である。
【参考文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，１７１，５７８号明細書
【非特許文献１】Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６６（１），２９−３６，１９９１
【非特許文献２】Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１２８（１），４４−４９，１９９２
【非特許文献３】Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２３７：９９−１０８，１９９５
【非特許文献４】Ｂｌｕｍｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１４９：１８０−１８４，１９９３
【非特許文献５】Ｓｃｈｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３７７：６１−６７，２００４
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明の１つの観点は：ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞の懸濁液を調製し；そしてビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞懸濁液を、過剰なアビジンまたはその改変体と接触させてビオチン−結合部位を提示するアビジンを連結した脂質構造を形成することを含んでなる、アビジンを連結した脂質小胞の調製法である。
【０００９】
本発明の別の観点は、本発明の方法により調製されるアビジンを連結した脂質小胞であり、ここで小胞はその表面上に結合したアビジンを提示し、この表面上に結合したアビジンは、該脂質構造に非共有的に付いており、そしてさらにビオチンまたはビオチン化化合物へ結合する能力を保持している。
【００１０】
本発明のさらに別の観点は、封入された薬剤に応答する状態に罹患している個体を処置するための、本発明の方法により調製されるリガンドを標的化するアビジンを連結した脂質小胞の使用法である。
【００１１】
発明の詳細な説明
限定するわけではないが本明細書に引用する特許および特許出願を含むすべての公報は参照により全部、説明のように本明細書に編入する。
【００１２】
本明細書で使用する「抗体」という用語は広い概念を意味し、そしてポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体および抗体フラグメントを含む免疫グロブリンまたは抗体分子を含む。
【００１３】
本明細書で使用する「アビジン」とは、ビオチン分子に対して複数の大変高い親和性結合部位を含んでなる多量体アビジン化合物を意味し、そしてピアスバイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社（ロックフォード、イリノイ州）からＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）という銘柄で販売されているビオチン結合タンパク質、および重要な立体配置およびアビジンとのアミノ酸の類似性、ならびにビオチンに対して高い親和性を有するストレプトミセス アビジニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）により生産されるタンパク質であるストレプトアビジンを含む。ストレプトアビジンはグリコシル化されてはおらず、そして組織に対して低い非特異的結合を現すと報告されている。
【００１４】
「ビオチン化合物」とは「ビオチン」（ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾリン−４−吉草酸）を指し：分子量２４４ｇ／モル、Ｂ−複合ビタミンとしても知られ、そしてそのアビジン−結合類似体を含む。
【００１５】
「結合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」とは、共有的に付いている（ａｔｔａｃｈｅｄ）ことを意味する（例えば、架橋結合剤を介して）。
【００１６】
「連結された（ｃｏｕｐｌｅｄ）」または「結合された（ｂｏｕｎｄ）」とは、結合対のメンバーが複数の荷電した相互作用（イオン結合）、および結合したメンバーが別個の分子実体を維持するようなファンデルワールス力を含む非イオン的または疎水的相互作用を介するような非共有的に会合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ことを意味する。
【００１７】
「脂質小胞」とは、極性のヘッド基に付き、１もしくは２個の疎水性アシル炭化水素鎖を含む小胞を形成する両新媒性脂質を含んでなる任意の安定なミセルまたはリポソーム組成物を指し、そしてその極性のヘッド基にアミン、酸、エステル、アルデヒドまたはアルコールのような化学的に反応性の基を含むことができる。
【００１８】
「前形成されたリポソーム」とは、完全な、前以て形成された単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）または多重層ラメラ小胞（ＭＬＶ）の脂質小胞を指す。
【００１９】
「治療用リポソーム組成物」とは、リポソームの水性空間またはリポソームの脂質二重層に封入された治療薬を含むリポソームを指す。
【００２０】
本発明は、ストレプトアビジンを提示する立体的に安定化された薬剤物質を含有する小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）または多重層ラメラ小胞（ＭＬＶ）を調製するために、ミセル転移法と組み合わせた非共有（アビジン−ビオチン）連結法に関する。この方法は標的化された脂質小胞の調製を提供し、そしてさらに複数の標的化分子を立体的に安定なリポソームに簡単に連結するための試薬を提供する。ペプチド、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、抗体または酵素のような標的化リガンドはこの媒体に、ビオチン化およびさらにビオチン結合することができる前形成されたストレプトアビジンを連結した脂質小胞との会合を介して容易に結合することができる。このように１つの態様では、ペイロードとして様々な活性基（ａｃｔｉｖｅ）を持つ前形成された立体的に安定化されたリポソームを、部位特異的治療を行うため所望するように標的化することができる。
【００２１】
アビジンを連結した脂質小胞は、ミセルまたは単ラメラ小胞（ＳＵＶ）の状態で、前形成されたリポソームと混合され、そしてアビジンを連結した脂質がこれによりリポソームの脂質層または小葉（ｌｅａｆｌｅｔ）に取り込まれる。アビジンを連結したリポソームの標的化は、直接的であり、しかも再生可能である。
【００２２】
ストレプトアビジンはストレプトアビジンがアビジンの塩基性のｐＩ１０に比べて、ｐＩ５〜６の一層低い等電点を有するので、アビジンを連結した脂質を形成するために有用である。さらにストレプトアビジンは糖タンパク質ではく、これは細胞上のマンノース受容体のような炭水化物の受容体への非特異的結合の可能性を下げる。
【００２３】
連結法および本発明の方法を実施するために有用な成分を含むキットの成分、および本発明の方法により形成された生成物をこれから以下に詳細に記載する。
【００２４】
標的化複合体の調製
本発明は、標的化された治療用リポソーム組成物の調製に使用するため標的化リガンドが結合したアビジン−脂質複合体の丈夫な（ｒｏｂｕｓｔ）調製法を提供する。各複合体は（ｉ）極性のヘッド基および疎水性のテイルを有する脂質、（ｉｉ）近位末端および遠位末端を有する親水性ポリマー、このポリマーはその近位末端で脂質のヘッド基に付く、（ｉｉｉ）ポリマーの遠位末端に付いたビオチン、（ｉｖ）ポリマーを結合したビオチンに連結するアビジン分子、および（ｖ）ビオチン化され、該アビジン上の遊離部位（この遊離部位は該ポリマーに結合したビオチンには結合しないと定義される）へのビオチン基の親和性結合によりアビジン分子に連結される標的化リガンドから構成される。
【００２５】
本発明の１つの態様では、ビオチン化されたＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥのような脂質化ポリマーに結合したビオチンが、アビジンをリポソームにつなぐ捕捉試薬として使用される。アビジンを連結した脂質は、アビジンあたり２〜３個のビオチン分子のビオチン結合能を有する。ビオチン化されたＰＥＧ−ＤＳＰＥは、リポソームに取り込まれることがこれまでに証明された（Ｓｃｈｎｙｄｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７７：６１−６７（２００４）；Ｋｕｌｌｂｅｒｇ，Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７３７−７４３（２００２））。
【００２６】
本発明のアビジンを連結した脂質は、アビジン分子を脂質化ポリマーを結合したビオチンと、ミセルの状態で、または前形成された治療用リポソームに前以て挿入された状態で、生じるアビジンを連結したミセルが複数のビオチン−結合部位をそれらの外側の親水性表面に保持するように、ビオチンに対してモル過剰なアビジンとを接触させることにより調製される。本発明の一態様では、ミセル内またはリポソーム内に包埋されたビオチン分子に対するアビジンのモル比は、４：１である。
【００２７】
結合体に有用な脂質の例には、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル−ホスファチジルコリン、モノガラクトシルジアシルグリセロールまたはジガラクトシルジアシルグリセロールがある。
【００２８】
結合体中の親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミドおよび親水性ペプチド配列からなる群から選択される。
【００２９】
結合体の標的化リガンドは、標的部位に特異性を有する任意の分子であることができ、この部位は治療に関連する膜、細胞、組織または臓器または個体であり、そしてさらに本明細書中の以下に記載する。
【００３０】
別の態様では、標的化結合体の選択には、標的化リガンドが、標的細胞上に発現される細胞表面の受容体に結合する能力を測定することを含む。
【００３１】
別の態様では、標的化結合体の選択は（ｉ）標的化リガンドが、特異的な細胞型である標的部位上に発現される細胞表面の受容体に結合する能力、および（ｉｉ）標的細胞が、標的細胞と標的化リガンドとの間を結合することにより標的細胞に結合したリポソームをインターナライズする能力に基づく。
【００３２】
別の態様では、各々が標的に対して独自の結合特異性または親和性を有する複数の標的化結合体は、付く標的化リガンドに複数の特異性または親和性を有するストレプトアビジンを結合したリポソームの調製物を形成するための使用に選択される。
【００３３】
このように、汎用的な薬剤輸送媒体としてストレプトアビジンを結合したリポソームの新規設計により、リポソームに基づく送達系を洗練するための用途の多いプラットフォームを提供する。
【００３４】
標的化リガンド
「標的」は、ビオチン化化合物が結合することが望まれるインビボの部位を意味する。実際の結合部位は、臓器、組織、細胞または膜上であることができる。例示的な標的は充実性腫瘍（例えば脳またはＣＮＳ（グリア芽腫）、肺（小細胞および非小細胞（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ））、卵巣、前立腺、胸および結腸の癌腫、ならびに他の癌腫および肉腫）、あるいはリンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫）、白血病（例えば急性リンパ性白血病）および骨髄腫（例えば多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病）のような液性腫瘍、ならびに既知または未知の原発性腫瘍から生じる二次的または転移性腫瘍であり、含まれるのは宿主生物の肺、脳および骨に生じる二次的または転移性腫瘍である。別の例示的標的は、感染の部位（例えばバクテリア、ウイルス（例えばＨＩＶ、ヘルペス、肝炎）、および病原性真菌（カンジダ種：Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）であり、含まれる感染性生物は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である）である。
【００３５】
標的化リガンドは、所望する標的と会合する結合パートナーに関するリガンドである。一つの態様では、標的化リガンドは増殖因子受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する。そのような受容体は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ癌遺伝子のｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質産物、上皮成長因子受容体、塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体および血管内皮増殖因子受容体から選択される。別の態様では、標的化リガンドはトランスフェリン受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７またはＣＤ４０のようなＢ−細胞受容体；ＣＤ４のようなＴ細胞受容体、Ｅ−セレクチン受容体；Ｌ−セレクチン受容体；Ｐ−セレクチン受容体；葉酸受容体；インテグリンを含むアルファＶ−サブユニットのようなαβ型インテグリン受容体；およびＣＣＲ２受容体のようなケモカイン受容体から選択される受容体に結合する。
【００３６】
標的化リガンドは、タンパク質、あるいは葉酸、ピリドキサールリン酸、ビタミンＢ１２、シアリルルイスｘ、トランスフェリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）またはその断片、塩基性繊維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、ＲＧＤペプチド、ＮＧＲペプチドまたはＣＣＬ２のようなケモカインのような低分子リガンドであることができる。
【００３７】
【表１】
【００３８】
例示的リガンドは、抗体または抗体フラグメントであり、それらには増殖因子受容体の細胞外ドメインに高い特異性および親和性で結合するものを含む。例示的受容体には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ癌遺伝子のｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質産物、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、塩基性繊維芽細胞増殖因子（塩基性ＦＧＦ）受容体および血管内皮増殖因子受容体，Ｅ−、Ｌ−およびＰ−セレクチン受容体、葉酸受容体、ＣＤ４受容体、ＣＤ１９受容体、α／βインテグリン受容体およびケモカイン受容体がある。
【００３９】
別の態様では、リポソームは標的化リガンドの１より多くの特異性を提示することができる。多標的型リポソームの一観点では、同じかまたは異なる細胞型上に、または成長もしくは分化の１より多くの段階であることができる細胞上に提示され得る多くの結合部位に、脂質にカプセル化された薬剤を向けることが望まれることに基づき標的化剤が選択される。例えば脂質にカプセル化された薬剤は、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）およびＨｅｒ２（ＥＲＢＢ２）に向けた標的化リガンドを含んでなることができ、すなわちＨｅｒ２−陽性およびＨｅｒ２−陰性の両方の乳癌細胞を標的とする。
【００４０】
抗体
本出願で記載する抗体は、限定するわけではないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、齧歯類、霊長類またはその任意の組み合わせのような任意の哺乳動物を含むか、またはそれに由来することができ、そして単離されたヒト、霊長類、齧歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化および／またはＣＤＲ移植化またはＣＤＲ適合化抗体、免疫グロブリン、その分解産物および部分および改変体を含む。
【００４１】
本発明の態様に有用な抗体は、当該技術分野で周知な幾つかの方法で誘導化することができる。一つの観点では、抗体は当該技術分野で周知なハイブリドーマ技術（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．、編集、分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン ウィリー ＆ サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）社、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、抗体、ア ラボラトリー マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）：Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．、編集、免疫学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ジョン ウィリー ＆ サンズ社、ニューヨーク州（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．、タンパク質科学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ジョン ウィリー ＆ サンズ、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９９７−２００１）を参照にされたい）を使用して得ることができる。
【００４２】
また抗体はそのようなドメインまたは成分のライブラリー、例えばファージライブラリーを選択することから得ることもできる。ファージライブラリーは無作為なオリゴヌクレオチドのライブラリー、または免疫感作した動物またはヒトのＢ細胞に由来するような目的配列を含むポリヌクレオチドのライブラリーを挿入することにより作成することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７）。抗体ファージライブラリーは、重（Ｈ）および軽（Ｌ）鎖可変領域対を１つのファージに含み、単鎖ＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメントの発現を可能とする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ｅｔ ａｌ．２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２１（８）３７１−８）。ファジェミドライブラリーの多様性は、さらに望ましいヒトモノクローナル抗体を生産し、そして続いて同定するために、ライブラリーのモノクローナル抗体の免疫特異性を上げ、かつ／または改変するように操作することができる。例えば重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖免疫グロブリン分子をコードする遺伝子を無作為に混合して（シャッフル）、新たなＨＬ対を集成した免疫グロブリン分子に作成することができる。さらにＨおよびＬ鎖のいずれかまたは両方をコードする遺伝子を、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異させ、そして続いて所望する親和性および中和能力についてスクリーニングすることができる。また抗体ライブラリーは、１もしくは複数のヒトの骨格配列を選択し、そしてヒト抗体のレパートリーに由来するＣＤＲカセットの集合を導入するか、あるいは設計した変異を介して合成的に作成することもできる（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ ２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５９８−６０２）。多様性の位置はＣＤＲに限定されず、そして可変領域の骨格セグメントを含むことができ、またはペプチドのような他の抗体可変領域以外を含んでもよい。
【００４３】
抗体の可変領域以外で含むことができる他の標的結合成分は、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイおよびバクテリアディスプレイである。リボソームディスプレイは、タンパク質をＲＮＡに付けたままｍＲＮＡをそれらのコグネイトタンパク質に翻訳する方法である。核酸のコード配列は、ＲＴ−ＰＣＲにより回収される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，９０２２）。酵母ディスプレイは、膜に会合したアルファ−アグルチニン酵母接着受容体、ａｇａ１およびａｇａ２、交配系の一部の融合タンパク質の構築に基づく（Ｂｒｏｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：５５３−７）。バクテリアディスプレイは、細胞膜または細胞壁と会合する輸送されたバクテリアタンパク質に対する標的の融合に基づく（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ２００２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，７９：４９６−５０３）。
【００４４】
ハイブリドーマ技術との比較では、ファージおよび他の抗体ディスプレイ法は、インビトロの抗原標的に対する選択を操作する好機を可能とし、そして宿主が抗原に、またはその逆に及ぼす影響の可能性に限定されない。
【００４５】
標的化リガンドのビオチン化
標的化リガンドが抗体またはそのフラグメントのようなタンパク質である場合、ビオチンはタンパク質中に存在するアミノ残基に、リシン残基のイプシロン−アミノ基として、またはアミノ末端のアルファ位に当該技術分野で知られている方法により都合よく結合される。カルボジイミド、ジマレイミド、ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−シクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、６−ヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）、Ｎ３ＳおよびＮ２Ｓ２のような種々の連結または架橋結合剤を周知の手順で使用して、ビオチンアミド類似体またはビオチン化合物を合成することができる。例えばビオチンはＤＴＰＡを介して、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ Ａｐｐｌ Ｒａｄｉａｔ Ｉｓｏｔｏｐ ３３：３２７（１９８２）の二環式無水物法（ｂｉｃｙｃｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）使用して結合することができる。モノ−ビオチン化された標的化リガンドを主に生成するために、標的化リガンドに対するビオチンの比は小さいべきであり、典型的には２：１である。
【００４６】
ビオチンを標的化リガンドに付けるために有用な他の化合物には、「ビオシチン（ｂｉｏｃｙｔｉｎ）」、ビオチンのリシン結合体、またはカダベリン−ビオチン（Ｎ−（５−アミノペンチル）ビオチンアミド）；ビオチンエチレンジアミン；あるいはスルホスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（これはピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ州から購入することができる）、および（６−（（ビオチノイル）アミノ）ヘキサン酸スクシンイミジルエステル）、Ｎ−（５−（６−（（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ペンチルマレイミド）；およびビオチウム（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ヘイワード、カリフォルニア州から入手可能な他のもののようなビオチンの活性化試薬形を含む。
【００４７】
ビオチン化された標的化リガンドを調製するための別の方法は、ビオチンを認識ドメイン中の特異的なリシン残基、ＭＫＭモチーフに酵素的に付加することができるビオチンリガーゼ（大腸菌のＢｉｒＡタンパク質、ＥＣ６．３．４．１０）用の認識ドメインを含有する融合ポリペプチドを組換え的に工作することによる。この認識ドメインは高度に保存されているので、様々な種に由来するビオチン化タンパク質から誘導化することができる（Ｃｒｏｎａｎ Ｊｒ．，ＪＥ．１９９０．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１０３２７−１０３３３：ＵＳ４８３９２９３）。
【００４８】
合成されたビオチン化された標的化剤は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのような標準法を使用して特性決定することができる。いったん調製すれば、候補のビオチン誘導体は、アビジンに結合する能力についてスクリーニングすることができる。さらに安定性は、化合物を個体に投与し、様々な時点での血液サンプルを得（例えば３０分、１時間、２４時間）、そして血液サンプルをビオチン化合物および／または代謝産物について分析することにより試験することができる。
【００４９】
治療薬を含有する脂質小胞
リポソームならびに他のミセル状脂質小胞は、薬剤送達媒体として作用するために、標的化リガンドを包含するための本発明の方法に含まれる。リポソームの調製法および薬剤装填手順およびその他は、当該技術分野では周知である。リポソームは非極性および極性化合物の両方を、生物適合性および生分解性脂質二重層との相互作用を介して、または水性の芯内にそれぞれ蓄えることができる。
【００５０】
本発明の組成物における使用に適する脂質には、小胞形成脂質を含む。そのような小胞形成脂質は、（ａ）ジグリセリドおよびリン脂質により例示されるような、水中で単ラメラまたは二重層小胞を自然に形成することができるもの、あるいは（ｂ）単ラメラ、二重層化、またはラフトを含む脂質構造に安定に取り込まれるものである。
【００５１】
この種の小胞形成脂質は典型的には２つの炭化水素鎖、通常はアシル鎖および極性もしくは非極性のいずれかのヘッド基を有する。様々な合成の小胞形成脂質および自然に存在する小胞形成脂質があり、それらにはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンのようなリン脂質を含み、ここで２つの炭化水素鎖は典型的には約１４〜２２個の間の炭素原子長であり、そして異なる程度の不飽和度を有する。アシル鎖が異なる程度の飽和度を有する上記の脂質およびリン脂質は市販されているか、または公開されている方法に従い調製することができる。他の適切な脂質には糖脂質、セレブロシドおよびコレステロールのようなステロールがある。
【００５２】
またカチオン性脂質も本発明のリポソームでの使用に適しており、ここでカチオン性脂質は脂質組成物のわずかな成分として含まれるか、あるいは主要な、もしくは唯一の成分として含まれることができる。そのようなカチオン性脂質は典型的にはステロール、アシルまたはジアシル鎖のような脂肪親和性リガンドを有し、そしてここで脂質は全体として正味の正電荷を有する。典型的には脂質のヘッド基は正の荷電を持つ。カチオン性脂質の例には、１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３，−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム−クロライド（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；およびジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）を含む。
【００５３】
カチオン性の小胞形成脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような中性脂質、またはポリリシンまたは他のポリアミン脂質のようなカチオン性脂質で誘導化されたリン脂質のような両親媒性脂質でもよい。例えば中性脂質（ＤＯＰＥ）はポリリシンで誘導化されて、カチオン性脂質を形成することができる。
【００５４】
別の態様では、小胞形成脂質は血清中でのリポソームの安定性を制御するために、記載するような標的化結合体の挿入に効果的な条件を制御するために、そしてリポソームに封入された作用物質の放出速度を制御するために、特定の流動性または堅さ（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）の程度を達成するために選択される。
【００５５】
より堅い脂質二重層、または液体結晶の二重層を有するリポソームは、比較的堅い脂質、例えば比較的高い相転移温度、例えば最高６０℃を有する脂質の包含により達成される。堅さ、すなわち飽和の脂質は、脂質二重層において膜のより高い堅さに貢献する。コレステロールのような他の脂質成分も、脂質二重層構造の膜の堅さに貢献することが知られている。
【００５６】
一方、脂質の流動性は比較的流動性の脂質、典型的には比較的低い液体から液体−結晶への相転移温度、例えば室温以下を持つ脂質相を有するものの包含により達成される。
【００５７】
本発明の方法の一つの態様では、本発明の標的化された治療用リポソーム組成物が前形成されたリポソームおよび標的化複合体を使用して調製され、これは結合体のリポソーム二重層への挿入を達成するために効果的な条件下で一緒にインキュベーションされる。さらに具体的には、２つの成分は標的化リガンドがリポソーム表面から外側に向き、したがってそのコグネイト受容体と相互作用できるように結合体の挿入を達成する条件下で一緒にインキュベーションされる。
【００５８】
約２℃〜８０℃の相転移温度を有する小胞形成脂質が、本組成物の前形成リポソーム成分での使用に適している。例えば脂質であるジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）は６２℃の相転移温度を有し、そして脂質が水素化されたダイズのホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）は、５８℃の相転移温度を有する。多くの脂質の相転移温度は、アバンティの極性脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）のカタログおよび脂質の温度屈性相転移データベース（Ｌｉｐｉｄ Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｐｉｃ Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ）（ＬＩＰＩＤＡＴ、ＮＩＳＴスタンダード レファレンス データベース３４）のような様々な出典の表にまとめられている。
【００５９】
本発明の一つの態様では、約３０〜７０℃の間の相転移温度を有する小胞形成脂質が使用される。別の態様では、リポソームの形成に使用する脂質は、２０℃、１０℃、または最も典型的には５℃の範囲内の相転移温度を有するものであり、この温度に標的化リガンドアビジン−脂質複合体のリガンドがその結合活性に影響することなく加熱され得る。
【００６０】
標的化複合体のリポソームへの挿入を達成するために効果的な条件は、幾つかの変数に基づき決定されると考えられ、それらには望ましい挿入速度（ここで、より高いインキュベーション温度がより速い挿入速度を達成できる）、リガンドがその活性に影響を及ぼされずに無事に加熱され得る温度、および脂質および脂質組成物のより程度が低い相転移温度を含む。挿入は、ポリエチレングリコールおよびエタノールのような両親媒性溶媒のような溶媒、または界面活性剤の存在により変動し得るとも考え知れる。
【００６１】
本発明の一態様では、前形成されたリポソームは親水性ポリマーで誘導化された小胞形成脂質も含む。例えば米国特許第５，０１３，５５６号明細書に記載されたように、そのような誘導化脂質をリポソームに含めることは、リポソームの周囲に親水性のポリマー鎖の表面コーティングを形成する。親水性ポリマー鎖の表面コーティングは、そのようなコーティングが無いリポソームと比べた時、非免疫原性の外面の提示により、リポソームのインビボでの血液循環半減期を上げるために効果的である。またそのようなリポソームは構造的に安定化され、そして立体的にも安定化されたリポソームとして知られている。
【００６２】
親水性ポリマーでの誘導化に適切な小胞形成脂質には、上に列挙した任意の脂質、そして特にジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）のようなリン脂質を含む。
【００６３】
小胞形成脂質を用いた誘導化に適切な親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミドおよび親水性ペプチド配列を含む。ポリマーはホモポリマーとして、またはブロックもしくはランダムコポリマーとして使用することができる。
【００６４】
例示的な親水性ポリマー鎖は、５００〜１０，０００ダルトンの間、より典型的には１，０００〜５，０００ダルトンの間の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧのメトキシまたはエトキシ−キャップ化類似体も有用な親水性ポリマーであり、様々なポリマーサイズ、例えば１２０〜２０，０００ダルトンで市販されている。
【００６５】
親水性ポリマーで誘導化された小胞形成脂質の調製は、例えば米国特許第５，３９５，６１９号明細書に記載された。そのような誘導化脂質を含むリポソームの調製も記載され、ここで典型的には１〜２０モルパーセントのそのような誘導化脂質がリポソーム製剤に含まれる。
【００６６】
別の態様では、リポソームはジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）：コレステロール（５２：４５のモル比）からなり、そしてさらに全脂質に対して３モル％のＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥを含む。リポソームは、記載されているように（Ｈｕｗｙｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４１６４−１４１６９）、凍結−解凍サイクルおよび押出しにより調製される。本質的に脂質は最初にクロロホルムまたはクロロホルム／メタノール２：１容量／容量に溶解される。脂質フィルムは、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（ブッキ（Ｂｕｃｈｉ）、スイス）を使用した真空蒸発により調製される。乾燥した脂質フィルムは１０ｍＭの最終脂質濃度が達成されるように、４０℃で０．０１ＭのＰＢＳまたは６５ｏで０．３Ｍのクエン塩（ｐＨ４．０）中で脱水される。脂質は５回の凍結−解凍サイクル、続いて押出し機（アバンティポーラーリピッド、アラバスター、アリゾナ州）を使用した２０℃で１００ｎｍの孔サイズのポリカーボネート膜を通す押し出し（５回）にかけられる。押出しは５０ｎｍのポリカーボネート膜を使用して９回繰り返される。この手順で、１５０ｎｍの小胞直径のＰＥＧ誘導化リポソームが生成する。以前に示されたように（Ｓｃｈｎｙｄｅｒ，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３７７：６１−６７）、ビオチン化された装填リポソームは、ＰＥＧ−ＤＳＰＥの一部をリンカー脂質（ビオチン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）に置き換え、そして水和工程でカルボキシ−フルオロスクシン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｃｉｎ）を加えることにより調製することができる。
【００６７】
ストレプトアビシンを連結した脂質ミセルのリポソームへの挿入は、ストレプトアビシンを連結した脂質ミセルを前形成されたリポソームと、時間（１、２または４時間）および温度（３７℃、５０℃または６０℃）を変えて混合することにより開始される。転移は加熱ブロック中で行われる。ＰＥＦ−ＤＳＰＥミセルをリポソームに転移する手順は、以前に報告された（Ｋｕｌｌｂｅｒｇ，Ｅ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７３７−７４３（２００２））。
【００６８】
治療薬
「治療薬」は宿主に対して生物学的効果を有することができる作用物質である。例として治療薬は腫瘍または感染の樹立または増殖（全身的もしくは局所的）を防止することができる。例には抗生物質、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌・カビ剤、毒素（例えばリシン）、放射性核種（例えばＩ−１３１、Ｙ−９０、Ｓｍ−１５３）、ホルモンアンタゴニスト（例えばタモキシフェン）、白金錯体（例えばシスプラチン）、オリゴヌクレオチド（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはサイレンシング（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチド配列）、化学療法用ヌクレオチドおよびヌクレオシド類似体（例えばカペシタビン、ジェムシタビン）、ホウ素含有化合物（例えばカルボラン）、光力学的剤（例えばローダミン１２３）、エンジイン（例えばカリケアミシン）、およびカンプトテシン（例えばＣＰＴ−１１、ＳＮ−３８、Ｃ９）およびチロシンキナーゼインヒビター（例えばイマチニブメシレート）を含む。腫瘍の樹立または増殖を処置または防止するための態様において、治療薬はドキソルビシン、タキサンまたはシスプラチンである。バクテリア感染の樹立または増殖を処置または防止するための別の例示的態様において、治療薬はキナロン（例えばレボフロキサシン）、マクロライド（例えばアジスロマイシン）、またはセファロスポリン（例えばセフロキシム）抗生物質である。ウイルス感染の樹立または増殖を処置または防止するための例示的態様において、治療薬は逆転写酵素インヒビターである。菌・カビの感染の樹立または増殖を処置または防止するための例示的態様において、治療薬はアンホテリシンＢまたはナイスタチンである。
【００６９】
新生物障害を有する個体を処置する目的で、一つの態様では封入された治療薬は細胞傷害剤である。細胞傷害剤は新生物疾患の兆候を標的とするリポソームに封入された作用物質として特に有用である。薬剤はドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンおよびイダルビシンおよびその類似体から選択されるアントラサイクリン系抗生物質であることができる。細胞傷害剤はジェムシタビン、カペシタビンおよびリバビリンから選択されるヌクレオシド類似体であることができる。また細胞傷害剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オルマプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金化合物であることができる。細胞傷害剤は、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシンおよび９−ニトロカンプトテシンからなる群から選択されるトポイソメラーゼインヒビターであることができる。細胞傷害剤は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンレウロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、ビンロジシン（ｖｉｎｒｏｄｉｓｉｎｅ）、ビノレルビンおよびビンデシンからなる群から選択されるビンカアルカロイドであることができる。
【００７０】
別の態様では、封入された作用物質は核酸である。核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイム、または標的細胞によりインターナライズされた時、治療用遺伝子の発現が治療用遺伝子産物の生成を達成する治療用遺伝子を含むプラスミドであることができる。
【００７１】
別の態様では、封入された作用物質はＨＩＶ感染を処置し、そしてＨＩＶの複製を阻害するために有用である。封入された作用物質はヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素インヒビター、非−ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素インヒビター、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター、ＨＩＶインテグラーゼインヒビター、ＨＩＶ融合インヒビター、免疫調節物質、ＣＣＲ５アンタゴニストから選択され、そして抗感染剤が特許請求される。ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素インヒビターは、アバカビル、アシクロビル、ジダノシン、エムトリシタビン、ラミブジン、ジドブジン、スタブジン、アタザナビルおよびテノホビルから選択され得る。非ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素インヒビターは、エファビレンズ、ネビラピンおよびカラノライド（ｃａｌａｎｏｌｉｄｅ）であることができる。ＨＩＶプロテアーゼインヒビターはアンプレナビル、ネルフィナビル、ロピナビル、サキナビル、アタザナビル、インジナビル、チプラナビルおよびフォサムプレナビルカルシウムであることができる。ＨＩＶ融合インヒビターはエンフルビルチド、Ｔ−１２４９およびＡＭＤ−３１００であることができる。ＣＣＲ５アンタゴニストはＴＡＫ−７７９、ＳＣ−３５１１２５、ＳＣＨ−Ｄ、ＵＫ−４２７８５７、ＰＲＯ−１４０およびＧＷ−８７３１４０であることができる。
【００７２】
ＨＩＶプロテアーゼインヒビターであるインジナビルを含有する抗ＨＬＡ−ＤＲ被覆化リポソームが開示された（Ｇａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５５８：１９８−２１０）。
【００７３】
本発明の一つの観点では、第一線の治療として使用されるか、または特に新生物疾患およびＨＩＶ感染の処置のための他の種類または治療的処置と一緒に（事前に、同時に、または後に）与えられるか、あるいは免疫抑制剤であることができる免疫系のモジュレーターが提供される。免疫モジュレーターは、ＩＦＮアルファ、ＩＮＦベータまたはＩＦＮガンマ−型のインターフェロンを含むインターフェロン（ＩＦＮ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＴＮＦアルファおよびＩＬ−２から選択することができる。本発明の免疫抑制剤は、シクロスポリン、シロリムスおよびマイコフェノール酸モフェチルから選択することができる。
【００７４】
キット
本発明のビオチンを結合するアビジン−脂質構造は、標的化脂質小胞、特に標的化された立体的に安定化されたリポソームを調製するキットの成分として都合よく使用される。標的化脂質構造は、ビオチン化された標的化分子をリポソームのようなビオチンを結合するアビジン−脂質構造と混合することにより形成される。本発明の態様では、リポソームは立体的に安定化されたリポソームであり、そして標的化剤は標的化細胞型の表面上の受容体に向けられた抗体フラグメントである。
【００７５】
選択法
治療用の標的化リポソーム組成物は、以下の成分から調製される。特定の状態、例えば肺の充実性腫瘍、バクテリア感染またはウイルス感染に罹患している個体に特異的な組成物は、調製した結合体の選択からビオチン化された標的化リガンドを選択することにより調製される。標的化結合体は、リガンド−受容体の結合対に関する当業者の知識、あるいは適切な患者のサンプル、例えば流体サンプル、生検等を得ることによるいずれかに従い、選択される。サンプルは種々の受容体の発現について当該技術分野で知られている手段により試験して、適切な標的化リガンドを決定する。
【００７６】
前形成された治療薬が封入されたリポソーム組成物は、特定の状態の処置に適する治療薬に関する当業者の知識に基づき選択される。あるいは治療用リポソーム組成物は化学的感受性試験を行った後に選択して、封入された薬剤が患者の生検または流体サンプルから得た問題の細胞に及ぼす効果を決定する。
【００７７】
標的化結合体および前形成されたリポソーム組成物の選択後、その個体用の標的−細胞を感作する治療用リポソーム組成物は、２つの成分を合わせることにより調製される。記載のように、成分はビオチンを結合した標的化リガンドの、両親媒性脂質化ポリマー結合したビオチンへ連結したアビジンの遊離部位への親和性結合を行うための条件下で合わせられ、これがリポソーム二重層に挿入されて標的化細胞を感作するリポソームを作成する。連結が完成した後、組成物が患者に投与される。
【００７８】
本発明の治療用リポソームは、静脈内（ｉ．ｖ．）注入により、皮下（ｓ．ｃ．）注射により、局所的適用により患者に投与され、経口摂取され得る。
【００７９】
本発明をこれから以下の具体的な非限定的実施例を参照にして説明する。
【実施例】
【００８０】
実施例１
アビジンを連結したミセルの調製
ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥ、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）２０００］（アバンティ ポーラー リピッド社、アラバスター、アラバマ州）の５マイクロモルを、１ｍｌのエタノール／ｄＨ２Ｏ（５０：５０、容量／容量）に溶解した。ストレプトアビジン（ピアス バイオテクノロジー、ロックフォード、イリノイ州）を２０ｍＭのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２に１ｍｇ／ｍｌ（２０ｕＭ）の濃度で再構成した。ストレプトアビジンをビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥと４：１のモル比で混合した（図１に関して）。２５℃で１時間、穏やかに振盪しながらインキュベーションした後、反応混合物をＧＦ−２５０ゲル濾過クロマトグラフィーにより２ｍｌ／分の流速で精製し、そして２１４ｎｍでＵＶ検出した。画分を集め、そして２８０ｎｍでのＵＶの吸収測定およびＳＥＬＤＩ−ＭＳ光度計により分析した。
【００８１】
比較には、３種のサンプル；脂質（ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥ）、ストレプトアビジンおよびストレプトアビジンを結合したビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥを調製し、そしてＧＦ−２５０調製カラムを使用してゲル濾過クロマトグラフィーにより分析した。結果は、ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥのみに関する保持時間が約２２分（図２Ａ）であることを示した。ストレプトアビジンの保持時間は約２４分（図２Ｂ）であった。ストレプトアビジンを結合した脂質は、１５分で溶出した（図２Ｃ）。これらの溶出プロファイルは、ストレプトアビジンを結合した脂質がリン脂質単独および非結合ストレプトアビジンタンパク質からゲル濾過クロマトグラフィーにより分離できることを明らかにした。ストレプトアビジンを結合した脂質から集めて生じた画分は、２８０ｎｍでのＵＶ吸収を測定すことにより、およびＳＥＬＤＩ−ＭＳにより分析した（データは示さず）。
【００８２】
実施例２
アビジンを連結したミセルから治療用リポソームの形成
アルザ コーポレーション（ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（マウンテンビュー、カリフォルニア州）により提供されるＤＯＸＩＬ（商標）は、ポリエチレングリコールをコーティングしたリポソームにカプセル化されたドキソルビシンの製剤である（Ｍａｒｉｎａ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：４１３−４１８（２００２））。ストレプトアビジンを連結した脂質ミセルの前形成されたリポソームへの挿入は、ストレプトアビジンを連結した脂質ミセルのアリコートとＤｏｘｉｌリポソームとを、５０℃で２時間混合することにより開始した。反応物中の全脂質濃度は１０ｍＭであった。全脂質に対して３モル％のストレプトアビジンを結合した脂質を、リポソームへの包含に適用した。転移は加熱ブロックで行った。ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセルをリポソームに転移するこの手順は、すでに報告されている（Ｋｕｌｌｂｅｒｇ，Ｅ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７３７−７４３（２０００２））。転移反応後、ストレプトアビジンを連結したリポソームは、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂゲル（アマシャム：Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む小さいカラム（ＰＤ−１０）でゲル濾過により精製し、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）で溶出した。ストレプトアビジンを連結したリポソーム画分は、溶出した画分（各０．５ｍｌ）について２８０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することにより決定した。リポソームに封入されたドキソルビシンの各画分について、ドキソルビシン濃度は４９５ｎｍ（ε＝１２，５００）の最大吸収でＵＶ測定により定量した（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１２：６９３−７００（２００４））。
【００８３】
ストレプトアビジンを結合したＤＯＸＩＬ（商標）リポソームの安定性を試験するために、細胞傷害アッセイを２種の腫瘍細胞、ＭＤ−ＭＢＡ２３１（乳癌細胞）およびＡ４３１（類表皮癌細胞）を使用して行った。対数成長期の腫瘍細胞は、０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して回収した。１×１０５細胞／ｍｌの細胞懸濁液を作成した。０．１ｍｌ中に１万個の細胞を９６ウェルプレートに加えた。接着のために一晩インキュベーションした後（約１８時間）、培養基を回収し、そして細胞を遊離のドキソルビシン（ＤＯＸ）またはストレプトアビジンを結合したＤｏｘｉｌリポソームのいずれかとインキュベーションした。両試薬を成長培地で１：５の順次濃度、１８、３．６、０．７３、０．１４４、０．０２８８、０．００５７６および０μｇ／ｍｌ［ＤＯＸ］に希釈した。各濃度について０．１ｍｌを細胞が接着したウェルに３連で加えた。細胞を試験物質と３７℃で１時間、インキュベーションした。インキュベーションの終わりに、細胞を３回、２００μｌの成長培地で洗浄し、次いで１００μｌの新鮮な培地と７２時間インキュベーションした。７２時間のインキュベーション後、生きている細胞の量をＡＴＰｌｉｔｅ（商標）ルミネッセンスアッセイ系（パーキンエルマーライフ アンド アナリティカル サイエンス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、シェルトン、コネチカット州）を使用して測定した。アッセイは製造元のプロトコールに従い行った。細胞傷害性のデータでは、１時間の処理時間の後に遊離のドキソルビシンによる細胞生存能に及ぼす濃度効果が示されたが、ストレプトアビジンを結合したＤｏｘｉｌリポソームで処理した細胞の細胞傷害効果は示されなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。これらの結果は、腫瘍細胞との１時間のインキュベーション後、ストレプトアビジンを結合したリポソームからカプセル化されたドキソルビシンの漏出がないことを示唆している。したがって、安定化された結合体が形成された。
【００８４】
実施例３
ストレプトアビジンを連結した脂質リンカーの静的光散乱法による特性決定
ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥおよびストレプトアビジンを連結した脂質リンカーは、溶液分子量測定のために静的光散乱法（ＳＬＳ）に連結されたサイズ排除カラム（ＳＥＣ）により特性決定された。種々の量で装填したビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥのサンプル（３μｇ〜２００μｇの範囲）は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ポンプを使用してＰＢＳで前平衡化されたｓｕｐｅｒｐｏｓｅ−１２カラムに注入された。溶出ピークは２８０ｎｍでＵＶ検出器（アギレント：Ａｇｉｌｅｎｔ）；６９０ｎｍでＯｐｔｉｌａｂ−ＲＥＸ屈折率（ＲＩ）検出器（ワイアット：Ｗｙａｔｔ）；およびＤＡＷＮ−ＥＯＳ光散乱検出器（ワイアット）により監視した。２５μｇおよび５０μｇのストレプトアビジンを含有するストレプトアビジンを連結した脂質−リンカー（バイオ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル）を上記のように分析した。
【００８５】
溶出したビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥピークは、アストラ（Ａｓｔｒａ）ソフトウェア（ワイアット）、屈折率シグナルおよび０．１４５ｍｌ／ｇのｄｎ／ｄｃ値を使用することにより処理した。ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥは２８０ｎｍで最少吸収を有し、そしてＭＷ決定には使用されなかった。すべてのビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥ注入物は類似の保持時間、そして〜２３８ｋＤａのＭＷに単一ピークで溶出した。図４はこのカラムでのビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥの１回の注入の結果を示す。脂質単独の保持時間は約３９分であり、そしてそのピークは屈折率により検出することができる。光散乱から算出された２３８ｋＤａのＭＷは、〜７９単量体単位（脂質単量体あたり３０１６．８１Ｄａ）からなるミセル形成と合致する。
【００８６】
ストレプトアビジンを連結したリンカー脂質ミセルは、静的光散乱に連結されたＳＥＣにより、アストラソフトウェアをＵＶ２８０ｎｍおよびＲＩシグナル、ストレプトアビジンに関する０．１８５ｍｌ／ｇ、ストレプトアビジンを連結した脂質に関する０．１６５ｍｌ／ｇのｄｎ／ｄｃ値、およびストレプトアビジンに関して１．７１ｍｌ／ｍｇ，ｃｍの吸光係数と一緒に使用して分析した。図３は、ＳＥＣからの２５μｇ（下の第１ピークの追跡）および５０μｇ（上の第１ピークの追跡）のピークの溶出プロファイルを示し、算出された分子量が重なった。サンプルは主に１つの主要ピーク（ｒ．ｔ．＝２３分）からなるが、第２のより小さいピーク（ｒ．ｔ．＝２８分）も存在する。この溶出ピークはＵＶ２８０および屈折率の両方により検出することができる。第１および第２ピークについて予想される分子量は、大変大きいと思われる。２５μｇおよび５０μｇの装填量を比較すると、各装填量で見かけの分子量が上がり、２５μｇでは飽和に達しないことが示唆される。正確な分子量は構造的確認無しには評価できない。これらの結果は、ストレプトアビジンを会合した脂質複合体が形成され、ストレプトアビジンを連結した脂質−リンカー、そしてビオチン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質ミセル（ｒ．ｔ．＝４０分）から分離できることを証明した。
【００８７】
実施例４
連結したストレプトアビジン−脂質
ストレプトアビジンを連結した脂質（ＳＡ−脂質）が、特異的な細胞表面受容体結合をすることができるビオチン化リガンドを運ぶことができるのかどうかを評価するために、ビオチン化されたマウス表皮増殖因子（ｂ−ｍＥＧＦ）を標的化リガンドとして選択した。５３個のアミノ酸を含むマウスＥＧＦは、ペプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）（ロッキーヒル、ニュージャージー州）から購入した。２５０μｇのＥＧＦを３００μｌのＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４に溶解した。ビオチン化直前に、２．２ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）を４００μｌの超純水に溶解した。モノ−ビオチン化ｍＥＧＦを得るために、２倍モル過剰のビオチンをｍＥＧＦと室温で３０分間インキュベーションした。３０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を標識混合物に加えてこの反応をクエンチした。ビオチン化ｍＥＧＦは質量分析により特性決定され、そして最終産物は主にモノ−ビオチン化ｍＥＧＦを有するが、幾らかの未反応および大変少量のジ−ビオチン化ｍＥＧＦが存在することが示された（図５Ａ〜Ｂ）。ビオチン化マウス−ＥＧＦペプチドを持つＳＡ−脂質は、高レベルでヒトＥＧＦ受容体を細胞表面上に発現する２種類のヒト腫瘍細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（乳癌細胞）およびＡ４３１（類表皮癌細胞）を使用して試験した。
【００８８】
ヒトＥＧＦＲと交差反応性のビオチン化ｍＥＧＦは、ＳＡ−脂質と１：１のモル比で室温にて２時間インキュベーションした。次いでサンプル混合物または裸のＳＡ−脂質を、ＭＤＡ−ＭＢ２３１またはＡ４３１腫瘍細胞と４℃で１時間インキュベーションした。標的化した脂質粒子の結合を評価するために、次いで腫瘍細胞はＭＤＡ−ＭＢ２３１の場合にはＦＩＴＣに結合したヤギ抗−ストレプトアビジン（ベクターラボラトリー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ベーリンガム、カリフォルニア州）、またはヤギ抗−ｍＥＧＦ（ペプロテック社、ロッキーヒル、ニュージャージー州）と、続いてＰＥに結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ウエストグローブ、ペンシルバニア州）と４℃で４５分間インキュベーションし；あるいはＡ４３１腫瘍細胞の場合には、ウサギ抗−ｍＥＧＦ（ＲＤＬ、フランダース、ニュージャージー州）、続いてＡＰＣに結合したロバ抗−ウサギＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチ、ウエストグローブ、ペンシルバニア州）と４℃で４５分間インキュベーションした。インキュベーション後、腫瘍細胞を２回、フローステイニング（ｆｌｏｗ ｓｔａｉｎｉｎｇ）バッファー（１％ＢＳＡ、０．０９％アジ化ナトリウムを含むｄＰＢＳ）で洗浄した。最後に腫瘍細胞はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ、フランクリンレイク、ニュージャージー州）により得て、表面に結合したストレプトアビジンまたは腫瘍細胞上のｍＥＧＦを検出した。
【００８９】
図４はストレプトアビジンおよびｍＥＧＦペプチドの両方が細胞表面上で特異的抗体により検出されたことを証明する。さらにこれらの結果は、ビオチン化ｍＥＧＦがＳＡ−脂質により捕捉でき、そしてこの複合体が恐らくＥＧＦ受容体結合を介してＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞表面上に結合できることを示す。さらにＡ４３１腫瘍細胞が評価された。図５はストレプトアビジンおよびｍＥＧＦペプチドがｍＥＧＦ／ＳＡ−脂質処理細胞上で特異的抗体を使用して検出されたが（図５Ａ）、裸のＳＡ−脂質で処理した細胞では検出されなかったことを示す（図５Ｂ）。しかし約３〜５％のＡ４３１細胞群が、ウサギ抗ｍＥＧＦ、続いてロバ抗−ウサギＩｇＧ−ＡＰＣで陽性に染色された（図５Ｂおよび５Ｃ）。この観察はＡ４３１細胞がＥＧＦを内的に発現できることを示唆している。まとめると、腫瘍細胞結合データはＳＡ−脂質がリガンド送達媒体であり、そして細胞表面受容体を標的とすることができることを証明する。
【００９０】
本発明は今、完全に記載され、当業者にはそれに対する多くの変更および修飾が添付する特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされ得ることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】方法を概略的に表しており：工程ｉ）では、両親媒性ビオチン−ポリマー−脂質が自己会合（ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｅ）してミセルを形成するか、あるいはさらに封入する薬剤を含むことができる前形成されたリポソームの脂質層に事前に包含されており；工程ｉｉ）では、非共有結合を介して多数のビオチン結合部位を持つアビジンを、ビオチン化脂質小胞と接触させてストレプトアビジンを会合した脂質小胞を形成し、これは遊離のビオチン結合部位を保持し；これにより工程ｉｉｉ）でビオチン化された標的化リガンドを結合させて標的化リガンドが連結されたアビジン−脂質小胞を形成することができる。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、ビオチン−ＰＥＧ−リン脂質単独および非結合ストレプトアビジンタンパク質からゲル濾過クロマトグラフィーにより分離されたストレプトアビジンを結合した脂質の溶出プロファイルを表すクロマトグラフィーの追跡であり：ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥの溶出プロファイル（２Ａ）、ストレプトアビジンの溶出プロファイル（２Ｂ）、および混合物中、４：１のモル比で脂質に結合したストレプトアビジン（２Ｃ）である。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、同じ試薬で処理したＭＤ−ＭＢＡ２３１ヒト胸部腫瘍細胞（Ａ）およびＡ４３１ヒト類表皮腫細胞（Ｂ）に及ぼす遊離ドキソルビシンおよびストレプトアビジンを結合したＤＯＸＩＬ（商標）銘柄のリポソームに関する細胞傷害性アッセイのグラフによる結果である。
【図４】ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２／ＰＢＳ）で同じ条件下、２５μｇ（下の第１ピークの追跡）および５０μｇ（上の第１ピークの追跡）のストレプトアビジンを使用して形成したストレプトアビジン−リポソームの溶出プロファイル（屈折率シグナル）、および重なっているのは、単独で注入した１２５μｇのビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥの溶出ピークであり、静的光散乱法により算出されたＭＷを示す。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ビオチン化マウスＥＧＦの質量分析からの追跡を示す；ビオチン化前のマウスＥＧＦ（Ａ）およびビオチン化ｍＥＧＦ（Ｂ）。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍細胞に結合したストレプトアビジン−リポソームで捕捉されたビオチン化ｍＥＧＦ（ｂ−ｍＥＧＦ／ＳＡ−脂質複合体）のフローサイトメトリー分析について使用したヒストグラムであり：ＦＩＴＣに結合したヤギ抗−ストレプトアビジンを使用して検出した（Ａ）か；またはヤギ−抗ＥＧＦ、続いてＰＥに結合したロバ抗−ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）により検出した（Ｂ）。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、Ａ４３１腫瘍細胞に結合したｂ−ｍＥＧＦ／ＳＡ−脂質複合体のフローサイトメトリー分析からの散乱図であり：Ａ４３１腫瘍細胞はＡ）ｂ−ｍＥＧＦ／ＳＡ−脂質；Ｂ）裸のＳＡ−リポソームで処理され；Ｃ）ウサギ抗−ｍＥＧＦおよび抗−ウサギＩｇＧ−ＡＰＣで染色された未処理細胞；およびＤ）ヤギ抗−ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色された未処理細胞である。
【図１−１】
【図１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アビジンを連結した脂質小胞の調製法であって：
（ｉ）ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞の懸濁液を調製し；そして
（ｉｉ）ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞懸濁液を、過剰なアビジンまたはその改変体と接触させて、ビオチン−結合部位を提示するアビジンを連結した脂質小胞を形成する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
さらに（ｉｉｉ）アビジンを連結した脂質小胞を、ビオチン化された標的化リガンドと接触させる工程を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞がビオチン化ポリ（エチレングリコール）−リン脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ビオチン化ポリ（エチレングリコール）−リン脂質が、ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞懸濁液がミセル懸濁液である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞懸濁液がリポソーム懸濁液である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リポソームが薬剤を封入したリポソームである請求項１または６に記載の方法。
【請求項８】
リポソームがドキソルビシンを封入したリポソームである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アビジンが、非グリコシル化アビジンである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ビオチンに対して過剰なアビジンがモル基準で４：１である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
脂質小胞がその表面に結合したアビジンを提示し、表面に結合したアビジンが該脂質小胞に非共有的に付いており、そしてさらにビオチンまたはビオチン化化合物に結合する能力を保持している、請求項１に記載の方法により調製されるアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１２】
アビジンが、脂質小胞と一体化して結合しているビオチンに非共有的に結合している、請求項１１に記載のアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１３】
ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−（ＤＳＰＥ）を含んでなる請求項１２に記載のアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１４】
結合したビオチンがリポソームの構造と一体化している請求項１３に記載のアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１５】
結合したビオチンが封入された薬剤を含んでなるリポソームの構造と一体化している、請求項１４に記載のアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１６】
アビジンがさらにビオチン化された標的化リガンドに連結されている、請求項１４または１５に記載のアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１７】
ビオチン化された標的化リガンドがＥＧＦＲに結合する請求項１６に記載のリガンドを標的化したアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１８】
請求項１１に記載の調製された脂質小胞、および標的化されるリポソーム小胞を調製するためのビオチン化された標的化リガンドを含んでなるキット。
【請求項１９】
個体に投与する治療用リポソームを調製するための請求項１８に記載のキットの使用法。
【請求項２０】
標的リポソーム薬剤の治療的効力を調査する目的の実験用組成物を調製するための請求項１８に記載のキットの使用法。
【請求項２１】
個体に投与する治療用リポソームを調製するための請求項１８に記載のキットの使用法であって、ビオチン化された結合体が、該個体に由来する生検検体上の受容体の存在または不存在を調査した結果に基づき選択される上記方法。
【請求項２２】
個体に投与する治療用リポソームを調製するための請求項１８に記載のキットの使用法であって、ビオチン化結合体が生検検体上の受容体の存在または不存在を調査した結果に基づき選択され、そして該リポソーム中に封入された治療用の作用物質が、封入された作用物質に対する標的部位の細胞の感度に基づき選択される上記使用。
【請求項２３】
封入された薬剤に応答する状態に罹患している個体を処置するための、請求項１１に記載のリガンドを標的化したアビジンを連結した脂質小胞の使用法。
【請求項１】
アビジンを連結した脂質小胞の調製法であって：
（ｉ）ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞の懸濁液を調製し；そして
（ｉｉ）ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞懸濁液を、過剰なアビジンまたはその改変体と接触させて、ビオチン−結合部位を提示するアビジンを連結した脂質小胞を形成する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
さらに（ｉｉｉ）アビジンを連結した脂質小胞を、ビオチン化された標的化リガンドと接触させる工程を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞がビオチン化ポリ（エチレングリコール）−リン脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ビオチン化ポリ（エチレングリコール）−リン脂質が、ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞懸濁液がミセル懸濁液である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ビオチン−ポリマーを結合した脂質小胞懸濁液がリポソーム懸濁液である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リポソームが薬剤を封入したリポソームである請求項１または６に記載の方法。
【請求項８】
リポソームがドキソルビシンを封入したリポソームである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アビジンが、非グリコシル化アビジンである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ビオチンに対して過剰なアビジンがモル基準で４：１である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
脂質小胞がその表面に結合したアビジンを提示し、表面に結合したアビジンが該脂質小胞に非共有的に付いており、そしてさらにビオチンまたはビオチン化化合物に結合する能力を保持している、請求項１に記載の方法により調製されるアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１２】
アビジンが、脂質小胞と一体化して結合しているビオチンに非共有的に結合している、請求項１１に記載のアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１３】
ビオチン−ＰＥＧ（２０００）−（ＤＳＰＥ）を含んでなる請求項１２に記載のアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１４】
結合したビオチンがリポソームの構造と一体化している請求項１３に記載のアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１５】
結合したビオチンが封入された薬剤を含んでなるリポソームの構造と一体化している、請求項１４に記載のアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１６】
アビジンがさらにビオチン化された標的化リガンドに連結されている、請求項１４または１５に記載のアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１７】
ビオチン化された標的化リガンドがＥＧＦＲに結合する請求項１６に記載のリガンドを標的化したアビジンを連結した脂質小胞。
【請求項１８】
請求項１１に記載の調製された脂質小胞、および標的化されるリポソーム小胞を調製するためのビオチン化された標的化リガンドを含んでなるキット。
【請求項１９】
個体に投与する治療用リポソームを調製するための請求項１８に記載のキットの使用法。
【請求項２０】
標的リポソーム薬剤の治療的効力を調査する目的の実験用組成物を調製するための請求項１８に記載のキットの使用法。
【請求項２１】
個体に投与する治療用リポソームを調製するための請求項１８に記載のキットの使用法であって、ビオチン化された結合体が、該個体に由来する生検検体上の受容体の存在または不存在を調査した結果に基づき選択される上記方法。
【請求項２２】
個体に投与する治療用リポソームを調製するための請求項１８に記載のキットの使用法であって、ビオチン化結合体が生検検体上の受容体の存在または不存在を調査した結果に基づき選択され、そして該リポソーム中に封入された治療用の作用物質が、封入された作用物質に対する標的部位の細胞の感度に基づき選択される上記使用。
【請求項２３】
封入された薬剤に応答する状態に罹患している個体を処置するための、請求項１１に記載のリガンドを標的化したアビジンを連結した脂質小胞の使用法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５１２６９６（Ｐ２００９−５１２６９６Ａ）
【公表日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３６６４２（Ｐ２００８−５３６６４２）
【出願日】平成１８年１０月２０日（２００６．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６０１１０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４８１２１
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２０日（２００６．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６０１１０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４８１２１
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
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