標的核酸の検出方法及びテストストリップ
【課題】核酸増幅産物から、イムノクロマトグラフィー法により標的核酸の有無を容易に検出可能な方法の提供。
【解決手段】試料中の標的核酸１−１を、それぞれ第１、第２標識物質１−４、１−５により末端が標識された第１、第２プライマー１−６を用いてＰＣＲ増幅する工程と、得られた増幅産物１−８を、アプライ領域１−１６、第１パートナー１−１１が固定されているテスト領域１−１８、及び第２パートナー１−１２が結合している着色粒子１−１０が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域１−１７を有するテストストリップ１−１５のアプライ領域に滴下し、展開後、テスト領域における着色粒子の集積を指標として標的核酸を検出する工程とを有し、前記ストリップが、アプライ領域とテスト領域の間に第１プライマーと特異的に結合するが第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域を有する標的核酸の検出方法。
【解決手段】試料中の標的核酸１−１を、それぞれ第１、第２標識物質１−４、１−５により末端が標識された第１、第２プライマー１−６を用いてＰＣＲ増幅する工程と、得られた増幅産物１−８を、アプライ領域１−１６、第１パートナー１−１１が固定されているテスト領域１−１８、及び第２パートナー１−１２が結合している着色粒子１−１０が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域１−１７を有するテストストリップ１−１５のアプライ領域に滴下し、展開後、テスト領域における着色粒子の集積を指標として標的核酸を検出する工程とを有し、前記ストリップが、アプライ領域とテスト領域の間に第１プライマーと特異的に結合するが第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域を有する標的核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ増幅により両端を異なる標識物質により標識した標的核酸を、イムノクロマトグラフィー法により検出する方法、及び、当該方法に用いられるテストストリップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子解析技術の進歩に伴い、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等の遺伝子診断が広がりつつある。特に臨床検査においては、血液等の臨床検体から遺伝子である核酸を、簡便に、かつ良好な感度及び精度で検査できることが重要であり、このため、簡便さ、感度、及び精度の全てが良好な核酸分析方法が求められている。
【０００３】
元来、臨床検体中の核酸は微量であり、増幅して分析することが一般的である。核酸の増幅方法としては、非特許文献１に示されるＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）法が汎用されている。分析対象である核酸（標的核酸）をＰＣＲ増幅した後、この増幅された標的核酸を検出する方法としては、イムノクロマトグラフィー法、ラテックス凝集法、サンドイッチ法等が挙げられる。中でも、イムノクロマトグラフィー法は操作が簡便であり、臨床検査にも好適である。
【０００４】
ＰＣＲ増幅した標的核酸をイムノクロマトグラフィー法を用いて検出する方法としては、例えば、まず、ＰＣＲ増幅により、標識化したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて標的核酸を増幅すると共に標識を導入し、この増幅産物からなる試料をイムノクロマトグラフ用のテストストリップにアプライし、毛細管現象を利用してテストストリップ中を展開させ、当該テストストリップのテスト領域の呈色により標的核酸の有無を目視で分析する方法がある（例えば、特許文献１〜３参照。）。より詳細には、標的核酸を含む可能性のある試料と、標識物質（第１の標識物質）で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーと、前記オリゴヌクレオチドプライマーと異種の標識物質（第２の標識物質）で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、標的核酸を増幅する核酸増幅工程、及び、前記核酸増幅工程で得られた増幅産物を、前記の各標識物質とそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いてテストストリップ上で核酸を分析する方法であり、テストストリップに試料がアプライされる側に、前記標識物質の何れか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子（コンジュゲート）を保持したコンジュゲート領域を設け、試料の流れの下流側にもう一方の標識物質と特異的に結合可能なパートナーが固定されたテスト領域を設けたテストストリップを用いて分析する。
【０００５】
図１は、このイムノクロマトグラフィー法を用いて検出する従来法を、模式的に示した図である。図１（Ａ）は、ＰＣＲ前のＰＣＲ反応溶液中の標的核酸及びＰＣＲ増幅に用いるオリゴヌクレオチドプライマーを示した模式図であり、図１（Ｂ）はＰＣＲ後のＰＣＲ反応溶液中の標的核酸等を示した模式図である。なお、本来、ＰＣＲ反応溶液には、ＰＣＲに必要な耐熱ポリメラーゼ等の酵素類や適当なバッファー類が含まれるが、これらは、本発明の本質には影響しないため、同図および以降の図においても、それらは省略して示す。
【０００６】
ＰＣＲ増幅前のＰＣＲ反応溶液には、標的核酸（１−１）、第１標識物質（１−４）で５’末端が標識化されたオリゴヌクレオチドからなる第１プライマー（１−２）、第１標識物質（１−４）とは異なる第２標識物質（１−５）で５’末端が標識化されたオリゴヌクレオチドからなる第２プライマー（１−３）が含まれる。これに対し、ＰＣＲ増幅後のＰＣＲ反応溶液には、図１（Ｂ）に示すように、第１標識物質（１−４）及び第２標識物質（１−５）により標識化された標的核酸の増幅産物（１−８）と鋳型である標的核酸（１−１）とに加えて、ＰＣＲに用いられなかった未反応の第１プライマー（１−６／１−２）及び第２プライマー（１−７／１−３）が含まれている。
【０００７】
次に、このＰＣＲ反応溶液を、テストストリップにアプライする。図１（Ｃ）は、当該従来法において用いられる典型的なイムノクロマトグラフ用のテストストリップを模式的に示した図である。主にニトロセルロースからなるメンブレンのテストストリップ（１−１５）には、アプライ領域（１−１６）を兼ねているコンジュゲート領域（１−１７）、第１標識物質（１−４）と特異的に結合する第１パートナー（１−１１）が固定されてなるテスト領域（１−１８）が設けられている。ここで、当該コンジュゲート領域（１−１７）は、第２標識物質（１−５）と特異的に結合する第２パートナー（１−１２）と着色粒子（１−１０）とを結合してなるコンジュゲート（１−９）が分散可能な状態で保持されている領域である。
【０００８】
係るテストストリップに、図１（Ｂ）に示す増幅産物等を含むＰＣＲ反応溶液を試料溶液としてアプライし、イムノクロマトグラフィー法で分析する状態を図１（Ｄ）に示す。アプライ領域（１−１６）にＰＣＲ反応溶液をアプライすると、まず、標的核酸の増幅産物（１−８）の第２標識物質（１−５）が、コンジュゲート（１−９）の第２パートナー（１−１２）と試料溶液中で特異的に結合する（１−３１）。このとき、試料溶液中の未反応の第２プライマー（１−７）も、第２標識物質（１−５）を介してコンジュゲート（１−９）と結合する（１−３２）。これらを含有した試料溶液は、テストストリップ（１−１５）中を毛管作用により流れてテスト領域（１−１８）に至る。テスト領域（１−１８）では、コンジュゲートと結合した標的核酸の増幅産物（１−３１）が、当該領域に固定された第１パートナー（１−１１）と特異的に結合して固定され（１−３３）、着色粒子（１−１０）の色にテスト領域（１−１８）が呈色し、該呈色の有無により、標的核酸の有無が分析される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１５４０７５号公報
【特許文献２】特開２００３−１９４８１７号公報
【特許文献３】特許第３００１９０６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】サイキ（Saiki）、外７名、サイエンス（Science）、米国、１９８８年、第２３９巻、第４８７〜４９１ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一般的に、ＰＣＲを効率よく行うために、ＰＣＲ反応溶液中には過剰量のプライマーを添加する。このため、ＰＣＲ増幅後のＰＣＲ反応溶液を、未反応のプライマーを除去することなくそのままイムノクロマトグラフ用のテストストリップにアプライした場合には、大量の未反応のプライマーも当該テストストリップに持ち込まれることになる。このため、試料溶液中の未反応の第１プライマー（１−６）も、テスト領域（１−１８）に固定された第１パートナー（１−１１）と結合するため（１−３４）、本来の目的である標的核酸の増幅産物（１−３１）と固定された第１パートナー（１−１１）との結合が阻害され、増幅産物がテスト領域を通過してしまう結果、標的核酸の検出感度が低下してしまうという問題がある。
【００１２】
これらの原因により、ＰＣＲ法等による核酸増幅産物から直接イムノクロマトグラフィー法を用いて拡散を分析することは極めて困難であった。前記の文献では、これらの問題に関してなんら言及しておらず、また、解決方法も示していない。
【００１３】
本発明は、前述した従来技術の問題点を鑑みてなされたものであり、ＰＣＲ法等による核酸増幅産物から直接イムノクロマトグラフィー法を用いて分析した場合であっても、標的核酸の有無を容易に検出可能な簡便な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、イムノクロマトグラフ用のテストストリップにおいて、アプライ領域とテスト領域の間に、標的核酸の増幅産物とは結合せず、未反応のプライマーと結合する物質を固定した領域を設けることにより、未反応のプライマーを多く含むＰＣＲ増幅後の核酸増幅産物をそのままテストストリップにアプライした場合であっても感度よく標的核酸を検出し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）イムノクロマトグラフィー法により標的核酸を検出する方法であって、核酸含有試料中の標的核酸を、第１標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第１プライマーと、第１標識物質とは異なる第２標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーとを用いてＰＣＲ増幅する核酸増幅工程と、前記核酸増幅工程により得られた核酸増幅産物を、アプライ領域、前記第１標識物質と特異的に結合するパートナーが固定されているテスト領域、及び前記第２標識物質と特異的に結合するパートナーが結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域を有するテストストリップのアプライ領域に滴下し、当該テストストリップ中を展開させ、前記テスト領域における前記着色粒子の集積を指標として標的核酸を検出する検出工程と、を有し、前記コンジュゲート領域は、前記アプライ領域とテスト領域の間にある領域又は前記アプライ領域と重複する領域であり、前記テストストリップが、アプライ領域とテスト領域の間に、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域を有することを特徴とする標的核酸の検出方法、
（２） 前記キャプチャー領域に固定されている、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が、当該プライマーと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする前記（１）記載の標的核酸の検出方法、
（３） 前記テストストリップにおいて、前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とする前記（１）又は（２）記載の標的核酸の検出方法、
（４） 前記キャプチャー領域に、前記第２プライマーと特異的に結合するが前記第２標識物質とは結合しない物質がさらに固定されていることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
（５） ２種類以上標的核酸を検出するものであり、前記第１標識物質は、標的核酸の種類ごとに異なる物質であり、かつ、前記第２標識物質は、全ての種類の標的核酸に共通の物質であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
（６） ２種類以上標的核酸を検出するものであり、前記第１プライマーは、標的核酸の種類ごとに異なるプライマーであり、かつ、前記第２プライマーは、全ての種類の標的核酸に共通するプライマーであることを特徴とする前記（５）記載の標的核酸の検出方法、
（７） 前記標識物質が、Ｄｉｇ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＤＮＰ（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）、及びＢｉｏｔｉｎからなる群より選択される物質であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
（８） 前記標識物質がハプテンであり、前記パートナーが当該ハプテンと特異的に結合する抗体であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
（９） 前記着色粒子が、金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子であることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
【００１６】
（１０） 第１標識物質により一方の端が標識されており、第１標識物質とは異なる第２標識物質により他方の端が標識されている標的核酸を検出するために用いられるテストストリップであって、アプライ領域と、前記第１標識物質と特異的に結合するパートナーが固定されているテスト領域と、前記第２標識物質と特異的に結合するパートナーが結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域と、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域とを有し、前記コンジュゲート領域及び前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とするテストストリップ、
（１１） 前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とする前記（１０）記載のテストストリップ、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の標的核酸の検出方法により、ＰＣＲ法等による核酸増幅産物から、未反応のプライマーを除去することなく、直接テストストリップにアプライした場合であっても、標識された標的核酸の増幅産物を簡便に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＰＣＲ増幅した標的核酸をイムノクロマトグラフィー法を用いて検出する従来法を、模式的に示した図である。
【図２】本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップ（Ａ）、及び当該テストストリップを用いて標識済み標的核酸を検出した状態（Ｂ）の一態様を模式的に示した図である。
【図３】本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップの別の一態様を模式的に示した図である。
【図４】本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップの別の一態様を模式的に示した図である。
【図５】２種類の標的核酸を検出する場合に用いられるテストストリップを模式的に示した図である。
【図６】図５に記載の構成を有するテストストリップを用いて、１のＳＮＰの野生型と変異型を検出する場合の一態様を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において、標的核酸とは、検出の対象である特定の塩基配列を有する核酸を意味する。該標的核酸は、天然由来のものであってもよく、合成されたものであってもよい。また、ＤＮＡからなるポリヌクレオチドであってもよく、ＲＮＡからなるポリヌクレオチドであってもよく、ＤＮＡ及びＲＮＡからなるキメラポリヌクレオチドであってもよい。その他、人工核酸や、アミノ基等で修飾された修飾核酸を含むポリヌクレオチドであってもよい。該標的核酸として、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等がある。本発明においては、標的核酸をＰＣＲ増幅するため、標的核酸がｍＲＮＡ等の一本鎖核酸である場合には、逆転写反応により予めｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをＰＣＲ増幅の鋳型とする。
【００２０】
本発明において、核酸含有試料とは、標的核酸を含有することが期待される試料であれば、特に限定されるものではない。該核酸含有試料は、動物等から採取した生体試料であってもよく、培養細胞溶液等から調製した試料であってもよく、生体試料等から抽出・精製したゲノム溶液でもよい。特に臨床検査等に用いられるヒト由来の生体試料や、ヒト由来の生体試料から抽出・精製したゲノム溶液であることが好ましい。ヒト由来の生体試料として、例えば、血液、骨髄液、リンパ液、尿、喀痰、腹水、滲出液、羊膜液、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、膀胱洗浄液、膵液、唾液、精液、胆汁、胸水、爪、毛髪、又は大便等がある。また、該生体試料は、生物から採取された状態の試料であってもよく、調製した試料であってもよい。該調製の方法は、該生体試料中に含有されているゲノムを損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、通常、生体試料に対してなされている調製方法を行うことができる。
【００２１】
本発明において用いられる標識物質としては、ＰＣＲを阻害することなく核酸の標識に用いることができるものであれば、特に限定されるものではない。このような標識物質として、例えば、Ｄｉｇ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、Ｄｉｇｏｘｉｎ、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＤＮＰ（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）、Ｂｉｏｔｉｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５等のＣｙ ｄｙｅシリーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＮＢＤ（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ）、ＴＭＲ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、２以上の糖からなる糖鎖、６以上のアミノ酸からなるポリペプチド、及びそれらの誘導体等が挙げられる。本発明においては、入手が容易であり、かつ比較的安価であること、及び、当該技術分野で汎用されているため、標的核酸の検出をより確実に確実で容易なものにすることができることから、Ｄｉｇ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＤＮＰ（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）、及びＢｉｏｔｉｎからなる群より選択される物質であることが好ましい。
【００２２】
本発明において、パートナーとは、ある特定の物質と特異的に結合するものを意味し、当該物質と特異的に結合するものであれば、特に限定されるものではない。但し、本発明において、特異的に結合するとは、特定の物質と、当該物質の検出や精製等に通常用いることができる程度に特異的に結合し得ることを意味し、他の物質等と交差するものであってもよい。
【００２３】
このようなパートナーとしては、例えば、標識物質として用いる物質又はそのフラグメントを抗原として作製された抗体が挙げられる。本発明において用いられるパートナーは、血清等の未精製の抗体や、ポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体であってもよい。また、本発明において用いられるパートナーとしては、標識物質として用いる物質と親和性の高い化合物等であってもよい。親和性の高い化合物とは、例えば、プライマーの標識に用いた標識物質がビオチンの場合にはアビジンやストレプトアビジン、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅの場合にはＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ)、マルトース等のアミロースの場合にはＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、６以上のヒスチジンからなるポリペプチドである場合にはニッケル等が挙げられる。
【００２４】
本発明においては、標識物質としてハプテンを用い、パートナーとして当該ハプテンに対する抗体を用いることが好ましい。なお、ハプテンとは、抗体と結合できるが、低分子であるため単独では抗原性を示さない低分子物質である。このため、ハプテンを標識物質としたプライマーを用いることにより、標識物質によるＰＣＲへの影響を低減することができる。また、ハプテンは種類も豊富であることから、標識物質の選択や組み合わせの幅が広がるという効果を持つ。
【００２５】
本発明において用いられるテストストリップは、多孔質部材のメンブレンから成る。このような多孔質部材としては、核酸を含む試料溶液が毛管作用により展開することが可能なものであれば、特に限定されるものではなく、イムノクロマトグラフ用として用いられているテストストリップのいずれを用いてもよい。具体的には、例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ガラス繊維等からなるメンブレンを用いることができる。
【００２６】
本発明において用いられる着色粒子としては、テストストリップ中の細孔を流出可能な着色された粒子であって、粒子表面にパートナーを結合することが可能であればいずれの粒子を用いてもよい。このような着色粒子として、例えば、金コロイド粒子等の金属コロイド粒子や、色素等で着色された着色ラテックス粒子等が挙げられる。中でも、金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子を用いることが好ましい。イムノクロマトグラフィーの反応に影響を与えないためには、テストストリップ中を自由に移動できるように粒子径を小さくすることが重要であるが、これらの着色粒子は、呈色性に優れるため、粒子径を十分に小さくした場合でも、検出結果の視認性に優れるという効果を持つ。
【００２７】
着色粒子にパートナーを結合させる方法は、特に限定されるものではなく、物理的に吸着させてもよく、粒子表面の官能基に化学的に結合させてもよい。例えば、金コロイド粒子等の金属コロイド粒子は、粒子表面が負に帯電しているため、金属粒子と抗原等のパートナーをインキュベートすることにより、パートナーが結合した着色粒子を得ることができる。また、粒子表面を官能基等で修飾したラテックス粒子の場合には、各官能基に適した方法により受容体を結合させることができる。例えば、水溶性カルボジイミドでカルボン酸とアミノ基を結合させるＥＤＡＣ（１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル) −カルボジイミド塩酸塩）法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを予め混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる方法等がある。
【００２８】
本発明の標的核酸の検出方法は、イムノクロマトグラフィー法により標的核酸を検出する方法であって、標的核酸をＰＣＲ増幅し、標的核酸の両端がそれぞれ異なる標識物質により標識された核酸増幅産物を得る核酸増幅工程と、得られた核酸増幅産物を、テストストリップにアプライし、イムノクロマトグラフィー法により検出する検出工程と、を有する。本発明においては、後述するキャプチャー領域を有するテストストリップを用いることにより、核酸増幅産物中に含まれているＰＣＲ未反応のプライマーによる影響を低減し、標的核酸を簡便かつ感度よく検出することができる。
【００２９】
まず、核酸増幅工程として、核酸含有試料中の標的核酸を、第１標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第１プライマーと、第１標識物質とは異なる第２標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーとを用いてＰＣＲ増幅する。
【００３０】
ＰＣＲ増幅には、増幅対象である核酸領域の両端とハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマー（フォワードプライマーと、それに対応するリバースプライマー）を用いる。本発明における第１プライマーと第２プライマーは、このＰＣＲに用いられる２種類のプライマーであり、第１プライマーと第２プライマーのどちらか一方がフォワードプライマーとして用いられ、他方がリバースプライマーとして用いられる。
【００３１】
第１プライマー及び第２プライマーを構成するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲのプライマーとして機能し得る核酸からなるものであれば特に限定されるものではなく、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＤＮＡ及びＲＮＡからなるキメラオリゴヌクレオチドであってもよく、修飾核酸を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００３２】
このようなプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても設計することができる。例えば、公知のゲノム配列データと汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便にプライマーを設計することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ, Ｓ., Ｈ.Ｊ.Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、１９９６年、ｈｔｔｐ: //ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ.ｗｉ.ｍｉｔ.ｅｄｕ/ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｏｔｈｅｒ/ｐｒｉｍｅｒ３. h t m l）や、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等がある。また、公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースである、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）や、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。
【００３３】
このようにして設計したプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。また、各プライマーは、標的核酸とハイブリダイズする領域以外にも、標的核酸のＰＣＲ増幅を阻害しない程度において、付加的な配列を有することができる。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。
【００３４】
第１プライマー及び第２プライマーは、標的核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの５’末端が、標識物質により標識されているプライマーである。ここで、第１プライマーの標識に用いられる標識物質（第１標識物質）は、第２プライマーの標識に用いられる標識物質（第２標識物質）とは異なる種類の標識物質を用いる。このため、第１プライマーと第２プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、両端が互いに異なる種類の標識物質により標識された標的核酸（標識済み標的核酸）を得ることができる。なお、オリゴヌクレオチドの５’末端への標識物質の結合は、当該技術分野において公知のいずれの方法で行ってもよい。
【００３５】
核酸増幅工程におけるＰＣＲ増幅は、使用するポリメラーゼの種類、プライマーのＴｍ値、増幅される標的核酸の長さ等に基づいて決定される反応条件で、通常行われる方法により行うことができる。ＰＣＲの反応条件の決定方法は、当該技術分野においてよく知られている。また、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応バッファー等の、ＰＣＲに用いられる試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。鋳型となる核酸含有試料の添加量、並びに第１プライマー及び第２プライマーの添加量も、通常用いられる量であれば、特に限定されるものではない。
【００３６】
次に、検出工程として、核酸増幅工程により得られた核酸増幅産物を、テストストリップのアプライ領域に滴下（アプライ）し、当該テストストリップ中を展開させた後、予め設けられているテスト領域の着色を指標として標的核酸を検出する。
【００３７】
本発明において用いられるテストストリップは、試料溶液（核酸増幅工程により得られた核酸増幅産物）をアプライするアプライ領域、第２標識物質と特異的に結合するパートナーが結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域、第１標識物質と特異的に結合するパートナーが固定されているテスト領域、及び、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域を有する。
【００３８】
コンジュゲート領域には、第２標識物質と特異的に結合するパートナー（以下、「第２パートナー」ということがある。）が結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されている。本発明において、「着色粒子が流出可能な状態で保持されている」とは、テストストリップに試料溶液がアプライされる前の乾燥状態では、着色粒子はコンジュゲート領域に留まっているが、試料溶液がアプライされると、試料溶液とともにテストストリップ中を拡散できる状態を意味する。例えば、第２パートナーが結合している着色粒子（以下、「コンジュゲート」ということがある。）を、テストストリップに局所的に滴下し、速やかに乾燥させることにより、コンジュゲート領域を設けることができる。その他、コンジュゲートを染み込ませて乾燥させたメンブレン等の支持体を、テストストリップに接着させ、当該メンブレンを接着させた領域をコンジュゲート領域としてもよい。
【００３９】
テスト領域には、第１標識物質と特異的に結合するパートナー（以下、「第１パートナー」ということがある。）が固定されている。テストストリップへの第１パートナーの固定方法は、特に限定されるものではなく、パートナー分子の種類に応じて、公知の固定方法の中から適宜選択して行うことができる。具体的には、前述の着色粒子へのパートナーの結合方法と同様の方法が挙げられる。
【００４０】
キャプチャー領域には、第１プライマーと特異的に結合するが、第１標識物質とは結合しない物質（以下、「第１プローブ」ということがある。）が固定されている。このような物質として、例えば、第１プライマーと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は当該オリゴヌクレオチドを含む物質等が挙げられる。なお、このようなオリゴヌクレオチドは、第１プライマーとハイブリダイズし得るものであればよく、修飾核酸等からなるものであってもよく、第１プライマーと相補的な配列以外に付加的な配列を有していてもよい。また、当該オリゴヌクレオチドは、ポリペプチドや低分子化合物等により修飾されていてもよい。
【００４１】
テストストリップへの第１プローブの固定方法は、特に限定されるものではなく、プローブの種類に応じて、公知の固定方法の中から適宜選択して行うことができる。具体的には、前述の着色粒子へのパートナーの結合方法と同様の方法が挙げられる。例えば、アミノ修飾した第１プライマーと相補的な塩基配列を持つプローブオリゴヌクレオチドを第１プローブとし、カルボジイミド修飾したニトロセルロースメンブレンからなるテストストリップとすることにより、当該第１プローブのアミノ基と、当該テストストリップのカルボジイミド基とを縮合させることによって、テストストリップにキャプチャー領域を設けることができる。なお、キャプチャー領域には、核酸増幅産物中に多量に含まれている第１プライマーと十分に結合可能な量の第１プローブを固定することが好ましい。
【００４２】
アプライ領域にアプライされた試料溶液（核酸増幅産物）は、テストストリップ中を毛管作用により流れて展開し、コンジュゲート領域とキャプチャー領域を通過した後にテスト領域に到達する。この試料溶液中に標識済み標的核酸が存在していた場合には、この標識済み標的核酸は、コンジュゲート領域を通過する際に、当該領域中に保持されているコンジュゲートと第２パートナーを介して結合し、この状態でテストストリップ中を展開し、テスト領域に到達する。テスト領域において、標識済み標的核酸は、当該領域に固定されている第１パートナーと第１標識物質を介して結合することにより、捕捉される。従って、アプライされた試料溶液中に標識済み標的核酸が含まれていた場合には、コンジュゲートと結合した標識済み標的核酸がテスト領域に集積することにより、当該テスト領域は着色粒子が発する色に呈色される。一方、試料溶液中に標識済み標的核酸が含まれていなかった場合には、着色粒子がテスト領域に集積せず、当該テスト領域は呈色しない。このように、テスト領域における着色粒子の集積を指標として、すなわち、テスト領域の呈色の有無により、標的核酸を簡便に検出することができる。
【００４３】
アプライされた試料溶液中に含まれている未反応の第１プライマーは、キャプチャー領域を通過する際に、当該領域に固定されている第１プローブと結合し、捕捉される。この結果、テスト領域に到達する未反応の第１プライマー量が顕著に低減され、当該領域において、未反応の第１プライマーによって阻害されることなく、標識済み標的核酸が第１パートナーと結合できることから、標的核酸の検出感度が高められる。
【００４４】
コンジュゲート領域は、テストストリップ中の、アプライ領域にアプライされた試料溶液中の核酸増幅産物が、テスト領域に到達するまでに通過するいずれかの領域にあればよい。このため、コンジュゲート領域は、例えば、アプライ領域とテスト領域との間にあってもよく、アプライ領域と重複する領域であってもよい。
【００４５】
同様に、キャプチャー領域は、テストストリップ中の、アプライ領域にアプライされた試料溶液中の核酸増幅産物が、テスト領域に到達するまでに通過するいずれかの領域にあればよく、例えば、アプライ領域とテスト領域との間にあってもよく、アプライ領域と重複する領域であってもよい。
【００４６】
コンジュゲート領域とキャプチャー領域は、テストストリップの試料溶液が流れる方向に対して、どちらがアプライ領域により近い部位にあってもよい。例えば、アプライ領域にアプライされた試料溶液が、キャプチャー領域を通過後にコンジュゲート領域を通過し、その後テスト領域に到達するように、各領域をテストストリップに設けてもよく、コンジュゲート領域を通過後にキャプチャー領域を通過し、その後テスト領域に到達するようにしてもよい。本発明においては、予め余剰のプライマーを除去した後にコンジュゲートと結合させることができるため、アプライ領域にアプライされた試料溶液が、キャプチャー領域を通過後にコンジュゲート領域を通過するように両領域を設けることが好ましい。
【００４７】
本発明においては、キャプチャー領域に、さらに、第２プライマーと特異的に結合するが第２標識物質とは結合しない物質（以下、「第２プローブ」ということがある。）を固定することが好ましい。第１プローブと同様に、このような物質としては、例えば、第２プライマーと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は当該オリゴヌクレオチドを含む物質等が挙げられる。
【００４８】
従来法においては、図１（Ｄ）に示すように、コンジュゲート領域（１−１７）において、試料溶液中の未反応の第２プライマー（１−７）もコンジュゲート（１−９）と結合する（１−３２）ため、未反応の第２プライマー（１−７）が多量に持ち込まれると、コンジュゲート（１−９）が第２プライマー（１−７）により消費される結果、本来の目的である標的核酸の増幅産物（１−８）との結合に係わるコンジュゲート量の低下をまねいてしまう、という問題も生じる。標的核酸の増幅産物（１−８）との結合に係わるコンジュゲート量が低下すると、アプライされた標的核酸の増幅産物（１−８）は、コンジュゲート（１−９）と結合しない状態でテスト領域（１−１８）に到達し、固定された第１パートナー（１−１１）と結合する（１−３５）ことにより、呈色に寄与しない結合が生じ、標的核酸の検出精度が低下してしまう。
【００４９】
そこで、キャプチャー領域に、さらに、第２プローブを固定することにより、当該領域にて未反応の第２プライマーを捕捉し、これらのプライマーによる影響を低減することができる。
【００５０】
未反応の第２プライマーによるコンジュゲートの消費をより効果的に抑制することができるため、アプライ領域にアプライされた試料溶液が、第２プローブが固定されたキャプチャー領域を通過した後にコンジュゲート領域を通過するように設けることが好ましい。また、第２プローブは、第１プローブを固定するキャプチャー領域と同じ領域に固定してもよく、別の領域に固定してもよい。
【００５１】
本発明の標的核酸の検出方法は、１の標的核酸を検出するものであってもよいが、２以上の標的核酸を検出することもできる。例えば、それぞれの標的核酸について、第１プライマーと第２プライマーを設計し、ＰＣＲ増幅し、核酸増幅産物を得る。ＰＣＲ増幅は、標的核酸の種類ごとに別個に行ってもよく、マルチプレックスＰＣＲを行ってもよい。なお、標的核酸の種類ごとに別個にＰＣＲ増幅を行った場合には、得られた核酸増幅産物を混合して１の試料溶液としたものを、テストストリップにアプライする。
【００５２】
第２標識物質は、標的核酸の種類ごとに異なるものを用いてもよく、同種の標識物質を用いてもよいが、第１標識物質は、標的核酸の種類ごとに別の種類の標識物質を用いなければならない。テストストリップの別個の領域に、標的核酸の種類ごとにテスト領域を設け、各テスト領域に、当該領域の検出対象である標的核酸の第１標識物質に応じた第１パートナーを固定することにより、複数の標的核酸を簡便に検出することができる。
【００５３】
２以上の標的核酸を検出する場合には、標的核酸の種類ごとに、キャプチャー領域を設けてもよく、各標的核酸に対する第１プライマー特異的結合物質を一のキャプチャー領域に固定してもよい。また、標的核酸の種類ごとに異なるコンジュゲートを用いる場合には、用いるコンジュゲートの種類ごとにコンジュゲート領域を設けてもよく、一のコンジュゲート領域に全種類のコンジュゲートを保持させてもよい。なお、各標的核酸の第２標識物質を同種の標識物質とすることにより、１種類のコンジュゲートのみで複数の標的核酸を検出することができる。
【００５４】
例えば、ＳＮＰを検出する場合には、一般的に、各アレルに特異的なプライマーと、全てのアレルに共通するプライマーとを用いてＰＣＲ増幅を行う。そこで、アレル特異的なプライマーを第１プライマーとし、全てのアレルに共通するプライマーを第２プライマーとすることにより、本発明の標的核酸の検出方法を用いて、ＳＮＰのタイプを簡便に分析することができる。この場合には、第１プライマーは、標的核酸の種類ごと（ＳＮＰのタイプごと）に異なるプライマーであり、かつ、前記第２プライマーは、全ての種類の標的核酸に共通するプライマーとなる。
【００５５】
図２は、本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップ（Ａ）、及び当該テストストリップを用いて標識済み標的核酸を検出した状態（Ｂ）の一態様を模式的に示した図である。なお、本発明の標的核酸の検出方法の核酸増幅工程、及び得られる核酸増幅産物については、図１（Ａ）及び（Ｂ）に示す従来法と同様である。なお、以下の図２〜６のテストストリップの断面図は、本発明の構成を説明のために模式的に示したものであり、キャプチャー領域のプローブやテスト領域のパートナーを設ける部位は、テストストリップの表面に限られるものではなく、テストストリップの細孔内にわたって設けられることができる。但し、テストストリップの表面に設ける場合には、キャプチャー領域のプローブやテスト領域のパートナーは、試料溶液をアプライする側の表面に設けることが好ましい。
【００５６】
図２（Ａ）に示すテストストリップは、１種類の標的核酸を検出する場合に用いられるものであり、アプライ領域（１−１６）とコンジュゲート領域（１−１７）が重複するものである。テストストリップ（１−１５）に、アプライ領域（１−１６）と兼ねており、かつ第２標識物質と特異的に結合する第２パートナー（１−１２）と着色粒子（１−１０）が結合したコンジュゲート（１−９）を流出可能な状態で保持するコンジュゲート領域（１−１７）、余剰な第１プライマーの量と十分に結合可能な量の第１プローブ（１−１３）を固定したキャプチャー領域（１−１９）、第１標識物質と特異的に結合する第１パートナー（１−１１）を固定して成るテスト領域（１−１８）を、試料を流す順に設けて構成される。
【００５７】
次に、本発明の基本構成の作用を図２（Ｂ）に基づいて説明する。前記の基本構成によるテストストリップに、図１（Ｂ）に示された核酸増幅産物（試料溶液）を、アプライ領域（１−１６）を兼ねるコンジュゲート領域（１−１７）に滴下する。試料溶液は、多孔質のテストストリップに展開されて、下流方向、すなわちテスト領域方向に流れる。まず、核酸増幅産物中に標識された標的核酸の増幅産物（１−８、以下、「標識済み標的核酸」）が含まれていた場合には、コンジュゲート領域（１−１７）において、コンジュゲート（１−９）と標識済み標的核酸（１−８）が結合する（１−３１）。その際、未反応の第２プライマー（１−７）とコンジュゲート（１−９）も結合し（１−３２）、第１プライマー（１−６）は結合せずに下流に展開される。試料溶液がキャプチャー領域（１−１９）に至ると、未反応の第１プライマー（１−６）は、それと相補的な配列を持つ第１プローブ（１−１３）とハイブリダイズして結合し（１−３６）、キャプチャー領域にトラップされ、試料溶液中から除去される。次に、試料溶液が下流に位置するテスト領域に至ると、コンジュゲートと結合した標識済み標的核酸（１−３１）は、その第１標識物質を介して、テスト領域に固定された第１パートナーと結合して固定される（１−３３）。結合反応に寄与しない余剰なコンジュゲート（１−９）及びコンジュゲートと結合した未反応の第２プライマー（１−３２）は、テスト領域の下流に流される。従って、標的核酸が試料中に存在した場合には、テスト領域（１−１８）が、コンジュゲートと結合した標識済み標的核酸による着色粒子により呈色し、結果として、標的核酸が試料中に存在したと分析される。また、標的核酸が試料中に存在しない場合、前述の標識済み標的核酸（１−８）が存在せず、テスト領域が呈色することはない。これにより、試料中に標的核酸がないと分析される。
【００５８】
このように、本発明によれば、未反応の第１プライマーがテスト領域に至る前に試料中から除去されて、テスト領域における標的核酸の第１標識物質と第１パートナーとの結合が効率的に行われる。したがって、本発明のテストストリップを用いるイムノクロマトグラフィー法によって、核酸増幅産物から直接、試料中の標的核酸の有無を分析することが可能となる。
【００５９】
図３は、本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップの別の一態様を模式的に示した図である。アプライ領域（１−１６）とコンジュゲート領域（１−１７）を分けて設け、キャプチャー領域（１−１９）を前記アプライ領域とコンジュゲート領域の間に設ける。係る構成のテストストリップを用いた場合でも、前述の構成のテストストリップを用いた場合と同様の作用と効果を持つことは明らかである。
【００６０】
図４は、本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップの別の一態様を模式的に示した図である。テスト領域の前に、さらに未反応の第２プライマーを捕捉する第２プローブを固定した領域を設けたものである。アプライ領域（１−１６）とコンジュゲート領域（１−１７）の間に、第１プライマーと結合する第１プローブ（１−１３）及び第２プライマーと結合する第２プローブ（１−１４）を固定したキャプチャー領域（１−１９）を設けたことが異なる他は、図３に示すテストストリップの構成と同様である。係る構成のテストストリップを用いた場合でも、前述の構成のテストストリップを用いた場合と同様の作用と効果を持つことは明らかである。特に、この構成では、コンジュゲート領域（１−１７）の上流側に、第２プローブ（１−１４）を固定したキャプチャー領域（１−１９）を設けているため、余剰な第２プライマーがコンジュゲート領域に至る前にキャプチャー領域で除去される。この結果、不要な第２プライマーとコンジュゲートの結合をなくすことができ、従って、コンジュゲートと標識済み標的核酸の結合が効率よく行われる。
【００６１】
図５は、２種類の標的核酸を検出する場合に用いられるテストストリップを模式的に示した図である。具体的には、２種類の標的核酸（標的核酸Ａ及びＢ）を、標的核酸ごとに、標識物質も、標識されるオリゴヌクレオチドの塩基配列も異なる第１プライマーと、両方の標的核酸に共通して用いられる第２プライマーとを用いてＰＣＲ増幅し、得られた核酸増幅産物をアプライして両方の標的核酸を検出するために用いられるテストストリップである。テストストリップ（１−１５）の構成を、上流側から順に説明する。まず、アプライ領域（１−１６）を設け、その次に、標的核酸Ａの第１プライマーと特異的に結合する第１プローブ（１−１３−１）、標的核酸Ｂの第１プライマーと特異的に結合する第１プローブ（１−１３−２）、及び両方の標的核酸に共通して用いられる第２プライマーと特異的に結合する第２プローブ（１−１４−１）を固定したキャプチャー領域（１−１９）を設ける。次いで、第２プライマーと特異的に結合する第２パートナーを結合した着色粒子であるコンジュゲート（１−９）を流出可能な状態で保持するコンジュゲート領域（１−１７）を設ける。コンジュゲート領域の下流には、標的核酸Ａの第１プライマーを標識する第１標識物質と特異的に結合する第１パートナー（１−１１−１）が固定されたテスト領域（１−１８−１）が設けられ、その下流に、このテスト領域（１−１８−１）とは別個に、標的核酸Ｂの第１プライマーを標識する第１標識物質と特異的に結合する第１パートナー（１−１１−２）が固定されたテスト領域（１−１８−２）が設けられている。さらにその下流に、第２プライマーを標識する第２標識物質が固定されたコントロール領域（１−２０）を設けている。
【００６２】
図６は、図５に記載の構成を有するテストストリップを用いて、１のＳＮＰの野生型と変異型を検出する場合の一態様を模式的に示した図である。図６（Ａ）は、ＰＣＲ前の試料の主要構成を示す。検出対象であるＳＮＰを含む可能性のある核酸（１−１）、標的核酸Ｗ（野生型）を増幅するための第１プライマー（１−２−１）、標的核酸Ｍ（変異型）を増幅するための第１プライマー（１−２−２）、標的核酸Ｗと標的核酸Ｍに共通して用いられる第２プライマー（１−３−１）が含まれている。標的核酸Ｗの第１プライマー（１−２−１）は、ハプテンである標識物質Ｄｉｇ（１−４−１）により標識されており、標的核酸Ｍの第１プライマー（１−２−２）は、ハプテンである標識物質ＦＩＴＣ（１−４−２）により標識されており、第２プライマー（１−３−１）は、ハプテンである標識物質Ｂｉｏｔｉｎ（１−５−１）により標識されている。核酸含有試料に、変異型アレルと変異型アレルの両方が含まれるヘテロ型の場合の、当該核酸含有試料を鋳型としてＰＣＲ増幅した後の試料構成要素を、図６（Ｂ）に示す。ＰＣＲ増幅して得られた核酸増幅産物中には、Ｄｉｇ及びＢｉｏｔｉｎにより標識された標的核酸Ｗの増幅産物（１−８−１）と、ＦＩＴＣ及びＢｉｏｔｉｎにより標識された標的核酸Ｍの増幅産物（１−８−２）とに加えて、未反応の過剰なプライマー（１−２−１、１−２−２、及び１−３−１）及び元々核酸含有試料に含まれていた増幅前の標的核酸（１−１）が含まれている。
【００６３】
次に、本発明の基本構成の作用を図６（Ｃ）に基づいて説明する。 図５記載の基本構成によるテストストリップに、図６（Ｂ）に示された核酸増幅産物（試料溶液）をアプライして、分析した状態を図６（Ｃ）に示す。アプライ領域（１−１６）に滴下された試料溶液は、展開して、キャプチャー領域（１−１９）に到達する。キャプチャー領域（１−１９）において、試料溶液中に存在していた標的核酸Ｗの第１プライマーは、当該プライマーと特異的に結合する第１プローブとハイブリダイズし（１−３７−１）、標的核酸Ｍの第１プライマーは、当該プライマーと特異的に結合する第１プローブとハイブリダイズし（１−３７−２）、両方に共通の第２プライマーは、当該プライマーと特異的に結合する第２プローブとハイブリダイズする（１−３７−３）。これにより、試料溶液中に余剰に存在していた未反応のプライマーは、キャプチャー領域（１−１９）に固定されているプローブと結合して捕捉され、これより下流に流れることはない。二本鎖核酸である標的核酸Ｗの増幅産物（１−８−１）及び標的核酸Ｍの増幅産物（１−８−２）は、キャプチャー領域に捕捉されずにさらに下流に展開し、コンジュゲート領域（１−１７）で、それぞれ、ＢｉｏｔｉｎのパートナーであるＡｖｉｄｉｎが金コロイド粒子に結合したコンジュゲート（１−９）と結合し、さらに下流へと流れる。Ｄｉｇのパートナーである抗Ｄｉｇ抗体が固定されたテスト領域（１−１８−１）に到達すると、試料溶液中に存在するコンジュゲートと結合した標的核酸Ｗの増幅産物（１−８−１）は、抗Ｄｉｇ抗体と特異的に結合して捕捉され（１−３８−１）、このテスト領域（１−１８−１）は、金コロイドから成る着色粒子により着色される。さらに、下流へと流れ、ＦＩＴＣのパートナーである抗ＦＩＴＣ抗体が固定されたテスト領域（１−１８−２）に到達すると、試料溶液中に存在するコンジュゲートと結合した標的核酸Ｍの増幅産物（１−８−２）が抗ＦＩＴＣ抗体結合して捕捉され（１−３８−２）、このテスト領域（１−１８−２）の呈色が起きる。試料溶液に流出した余剰のコンジュゲートは、さらに下流へと展開し、コントロール領域（１−２０）に固定されたＢｉｏｔｉｎと特異的に結合する（１−３９）。これにより、試料がテストストリップ中を流れて分析が行われたことがわかる。
【００６４】
図６（Ｄ）は、ヘテロ型、ホモ型の試料を図５記載のテストストリップで分析した場合の、テストストリップ（１−１５）の状態を、マクロ的・模式的に示したものである。遺伝子のタイプがヘテロ型である場合（野生型アレルと変異型アレルの両方を有している場合）には、図６（Ｄ）の上段に示すように、両方のテスト領域（１−２１、１−２２）及びコントロール領域（１−２３）が呈色する。一方、遺伝子のタイプがホモ型である場合（野生型アレルと変異型アレルのいずれか一方のみを有している場合）は、図６（Ｄ）の中段及び下段に示すように、テスト領域（１−２１）とテスト領域（１−２２）のいずれか一方と、コントロール領域（１−２３）とが呈色する。当然、試料溶液に標的核酸が含まれない場合には、６図（Ｂ）の増幅産物（１−８−１、１−８−２）が生じることは無く、結果として、テストストリップの両方のテスト領域は呈色せず、コントロール領域（１−２３）のみが呈色することは、明らかである。
【００６５】
本実施の形態により、ＰＣＲ増幅により得られる核酸増幅産物に含まれる未反応の第1プライマーと第２プライマーとがキャプチャー領域でそれぞれに相補的な配列を持つプローブとハイブリダイズして固定され、試料中から除去されて、これより下流に流れない。このため、ＰＣＲ未反応の第１プライマーは、テスト領域に固定した第１パートナーと結合することがなく、標識済み標的核酸と第１パートナーとの結合が十分に行われる結果、テスト領域が十分に呈色する。さらには、未反応の第２プライマー（標的核酸Ｗと標的核酸Ｍの共通プライマー）も、キャプチャー領域に固定された第２プローブとハイブリダイズすることにより試料中から除去されるため、キャプチャー領域に固定され、試料溶液中から除去されるため、当該第２プローブの標識物質Ｂｉｏｔｉｎが、コンジュゲートのＡｖｉｄｉｎと結合することが無く、従って、無駄にコンジュゲートが消費されることがない。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の標的核酸の検出方法により、ＰＣＲ等の核酸増幅産物から直接イムノクロマトグラフィー法で標的核酸の有無を簡便に検出することができるため、試料中の標的核酸を検出し解析するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。
【符号の説明】
【００６７】
１−１…標的核酸、１−２…第１プライマー、１−３…第２プライマー、１−４…第１標識物質、１−５…第２標識物質、１−６…第１プライマー、１−７…第２プライマー、１−８…標識化された標的核酸の増幅産物、１−９…コンジュゲート、１−１０…着色粒子、１−１１…第１パートナー、１−１２…第２パートナー、１−１３…第１プローブ、１−１４…第２プローブ、１−１５…テストストリップ、１−１６…アプライ領域、１−１７…コンジュゲート領域、１−１８…テスト領域、１−１９…キャプチャー領域、１−２０…コントロール領域、１−２１…テスト領域、１−２２…テスト領域、１−２３…コントロール領域。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ増幅により両端を異なる標識物質により標識した標的核酸を、イムノクロマトグラフィー法により検出する方法、及び、当該方法に用いられるテストストリップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子解析技術の進歩に伴い、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等の遺伝子診断が広がりつつある。特に臨床検査においては、血液等の臨床検体から遺伝子である核酸を、簡便に、かつ良好な感度及び精度で検査できることが重要であり、このため、簡便さ、感度、及び精度の全てが良好な核酸分析方法が求められている。
【０００３】
元来、臨床検体中の核酸は微量であり、増幅して分析することが一般的である。核酸の増幅方法としては、非特許文献１に示されるＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）法が汎用されている。分析対象である核酸（標的核酸）をＰＣＲ増幅した後、この増幅された標的核酸を検出する方法としては、イムノクロマトグラフィー法、ラテックス凝集法、サンドイッチ法等が挙げられる。中でも、イムノクロマトグラフィー法は操作が簡便であり、臨床検査にも好適である。
【０００４】
ＰＣＲ増幅した標的核酸をイムノクロマトグラフィー法を用いて検出する方法としては、例えば、まず、ＰＣＲ増幅により、標識化したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて標的核酸を増幅すると共に標識を導入し、この増幅産物からなる試料をイムノクロマトグラフ用のテストストリップにアプライし、毛細管現象を利用してテストストリップ中を展開させ、当該テストストリップのテスト領域の呈色により標的核酸の有無を目視で分析する方法がある（例えば、特許文献１〜３参照。）。より詳細には、標的核酸を含む可能性のある試料と、標識物質（第１の標識物質）で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーと、前記オリゴヌクレオチドプライマーと異種の標識物質（第２の標識物質）で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、標的核酸を増幅する核酸増幅工程、及び、前記核酸増幅工程で得られた増幅産物を、前記の各標識物質とそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いてテストストリップ上で核酸を分析する方法であり、テストストリップに試料がアプライされる側に、前記標識物質の何れか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子（コンジュゲート）を保持したコンジュゲート領域を設け、試料の流れの下流側にもう一方の標識物質と特異的に結合可能なパートナーが固定されたテスト領域を設けたテストストリップを用いて分析する。
【０００５】
図１は、このイムノクロマトグラフィー法を用いて検出する従来法を、模式的に示した図である。図１（Ａ）は、ＰＣＲ前のＰＣＲ反応溶液中の標的核酸及びＰＣＲ増幅に用いるオリゴヌクレオチドプライマーを示した模式図であり、図１（Ｂ）はＰＣＲ後のＰＣＲ反応溶液中の標的核酸等を示した模式図である。なお、本来、ＰＣＲ反応溶液には、ＰＣＲに必要な耐熱ポリメラーゼ等の酵素類や適当なバッファー類が含まれるが、これらは、本発明の本質には影響しないため、同図および以降の図においても、それらは省略して示す。
【０００６】
ＰＣＲ増幅前のＰＣＲ反応溶液には、標的核酸（１−１）、第１標識物質（１−４）で５’末端が標識化されたオリゴヌクレオチドからなる第１プライマー（１−２）、第１標識物質（１−４）とは異なる第２標識物質（１−５）で５’末端が標識化されたオリゴヌクレオチドからなる第２プライマー（１−３）が含まれる。これに対し、ＰＣＲ増幅後のＰＣＲ反応溶液には、図１（Ｂ）に示すように、第１標識物質（１−４）及び第２標識物質（１−５）により標識化された標的核酸の増幅産物（１−８）と鋳型である標的核酸（１−１）とに加えて、ＰＣＲに用いられなかった未反応の第１プライマー（１−６／１−２）及び第２プライマー（１−７／１−３）が含まれている。
【０００７】
次に、このＰＣＲ反応溶液を、テストストリップにアプライする。図１（Ｃ）は、当該従来法において用いられる典型的なイムノクロマトグラフ用のテストストリップを模式的に示した図である。主にニトロセルロースからなるメンブレンのテストストリップ（１−１５）には、アプライ領域（１−１６）を兼ねているコンジュゲート領域（１−１７）、第１標識物質（１−４）と特異的に結合する第１パートナー（１−１１）が固定されてなるテスト領域（１−１８）が設けられている。ここで、当該コンジュゲート領域（１−１７）は、第２標識物質（１−５）と特異的に結合する第２パートナー（１−１２）と着色粒子（１−１０）とを結合してなるコンジュゲート（１−９）が分散可能な状態で保持されている領域である。
【０００８】
係るテストストリップに、図１（Ｂ）に示す増幅産物等を含むＰＣＲ反応溶液を試料溶液としてアプライし、イムノクロマトグラフィー法で分析する状態を図１（Ｄ）に示す。アプライ領域（１−１６）にＰＣＲ反応溶液をアプライすると、まず、標的核酸の増幅産物（１−８）の第２標識物質（１−５）が、コンジュゲート（１−９）の第２パートナー（１−１２）と試料溶液中で特異的に結合する（１−３１）。このとき、試料溶液中の未反応の第２プライマー（１−７）も、第２標識物質（１−５）を介してコンジュゲート（１−９）と結合する（１−３２）。これらを含有した試料溶液は、テストストリップ（１−１５）中を毛管作用により流れてテスト領域（１−１８）に至る。テスト領域（１−１８）では、コンジュゲートと結合した標的核酸の増幅産物（１−３１）が、当該領域に固定された第１パートナー（１−１１）と特異的に結合して固定され（１−３３）、着色粒子（１−１０）の色にテスト領域（１−１８）が呈色し、該呈色の有無により、標的核酸の有無が分析される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１５４０７５号公報
【特許文献２】特開２００３−１９４８１７号公報
【特許文献３】特許第３００１９０６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】サイキ（Saiki）、外７名、サイエンス（Science）、米国、１９８８年、第２３９巻、第４８７〜４９１ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一般的に、ＰＣＲを効率よく行うために、ＰＣＲ反応溶液中には過剰量のプライマーを添加する。このため、ＰＣＲ増幅後のＰＣＲ反応溶液を、未反応のプライマーを除去することなくそのままイムノクロマトグラフ用のテストストリップにアプライした場合には、大量の未反応のプライマーも当該テストストリップに持ち込まれることになる。このため、試料溶液中の未反応の第１プライマー（１−６）も、テスト領域（１−１８）に固定された第１パートナー（１−１１）と結合するため（１−３４）、本来の目的である標的核酸の増幅産物（１−３１）と固定された第１パートナー（１−１１）との結合が阻害され、増幅産物がテスト領域を通過してしまう結果、標的核酸の検出感度が低下してしまうという問題がある。
【００１２】
これらの原因により、ＰＣＲ法等による核酸増幅産物から直接イムノクロマトグラフィー法を用いて拡散を分析することは極めて困難であった。前記の文献では、これらの問題に関してなんら言及しておらず、また、解決方法も示していない。
【００１３】
本発明は、前述した従来技術の問題点を鑑みてなされたものであり、ＰＣＲ法等による核酸増幅産物から直接イムノクロマトグラフィー法を用いて分析した場合であっても、標的核酸の有無を容易に検出可能な簡便な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、イムノクロマトグラフ用のテストストリップにおいて、アプライ領域とテスト領域の間に、標的核酸の増幅産物とは結合せず、未反応のプライマーと結合する物質を固定した領域を設けることにより、未反応のプライマーを多く含むＰＣＲ増幅後の核酸増幅産物をそのままテストストリップにアプライした場合であっても感度よく標的核酸を検出し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）イムノクロマトグラフィー法により標的核酸を検出する方法であって、核酸含有試料中の標的核酸を、第１標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第１プライマーと、第１標識物質とは異なる第２標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーとを用いてＰＣＲ増幅する核酸増幅工程と、前記核酸増幅工程により得られた核酸増幅産物を、アプライ領域、前記第１標識物質と特異的に結合するパートナーが固定されているテスト領域、及び前記第２標識物質と特異的に結合するパートナーが結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域を有するテストストリップのアプライ領域に滴下し、当該テストストリップ中を展開させ、前記テスト領域における前記着色粒子の集積を指標として標的核酸を検出する検出工程と、を有し、前記コンジュゲート領域は、前記アプライ領域とテスト領域の間にある領域又は前記アプライ領域と重複する領域であり、前記テストストリップが、アプライ領域とテスト領域の間に、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域を有することを特徴とする標的核酸の検出方法、
（２） 前記キャプチャー領域に固定されている、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が、当該プライマーと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする前記（１）記載の標的核酸の検出方法、
（３） 前記テストストリップにおいて、前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とする前記（１）又は（２）記載の標的核酸の検出方法、
（４） 前記キャプチャー領域に、前記第２プライマーと特異的に結合するが前記第２標識物質とは結合しない物質がさらに固定されていることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
（５） ２種類以上標的核酸を検出するものであり、前記第１標識物質は、標的核酸の種類ごとに異なる物質であり、かつ、前記第２標識物質は、全ての種類の標的核酸に共通の物質であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
（６） ２種類以上標的核酸を検出するものであり、前記第１プライマーは、標的核酸の種類ごとに異なるプライマーであり、かつ、前記第２プライマーは、全ての種類の標的核酸に共通するプライマーであることを特徴とする前記（５）記載の標的核酸の検出方法、
（７） 前記標識物質が、Ｄｉｇ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＤＮＰ（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）、及びＢｉｏｔｉｎからなる群より選択される物質であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
（８） 前記標識物質がハプテンであり、前記パートナーが当該ハプテンと特異的に結合する抗体であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
（９） 前記着色粒子が、金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子であることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の標的核酸の検出方法、
【００１６】
（１０） 第１標識物質により一方の端が標識されており、第１標識物質とは異なる第２標識物質により他方の端が標識されている標的核酸を検出するために用いられるテストストリップであって、アプライ領域と、前記第１標識物質と特異的に結合するパートナーが固定されているテスト領域と、前記第２標識物質と特異的に結合するパートナーが結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域と、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域とを有し、前記コンジュゲート領域及び前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とするテストストリップ、
（１１） 前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とする前記（１０）記載のテストストリップ、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の標的核酸の検出方法により、ＰＣＲ法等による核酸増幅産物から、未反応のプライマーを除去することなく、直接テストストリップにアプライした場合であっても、標識された標的核酸の増幅産物を簡便に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＰＣＲ増幅した標的核酸をイムノクロマトグラフィー法を用いて検出する従来法を、模式的に示した図である。
【図２】本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップ（Ａ）、及び当該テストストリップを用いて標識済み標的核酸を検出した状態（Ｂ）の一態様を模式的に示した図である。
【図３】本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップの別の一態様を模式的に示した図である。
【図４】本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップの別の一態様を模式的に示した図である。
【図５】２種類の標的核酸を検出する場合に用いられるテストストリップを模式的に示した図である。
【図６】図５に記載の構成を有するテストストリップを用いて、１のＳＮＰの野生型と変異型を検出する場合の一態様を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において、標的核酸とは、検出の対象である特定の塩基配列を有する核酸を意味する。該標的核酸は、天然由来のものであってもよく、合成されたものであってもよい。また、ＤＮＡからなるポリヌクレオチドであってもよく、ＲＮＡからなるポリヌクレオチドであってもよく、ＤＮＡ及びＲＮＡからなるキメラポリヌクレオチドであってもよい。その他、人工核酸や、アミノ基等で修飾された修飾核酸を含むポリヌクレオチドであってもよい。該標的核酸として、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡ等がある。本発明においては、標的核酸をＰＣＲ増幅するため、標的核酸がｍＲＮＡ等の一本鎖核酸である場合には、逆転写反応により予めｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをＰＣＲ増幅の鋳型とする。
【００２０】
本発明において、核酸含有試料とは、標的核酸を含有することが期待される試料であれば、特に限定されるものではない。該核酸含有試料は、動物等から採取した生体試料であってもよく、培養細胞溶液等から調製した試料であってもよく、生体試料等から抽出・精製したゲノム溶液でもよい。特に臨床検査等に用いられるヒト由来の生体試料や、ヒト由来の生体試料から抽出・精製したゲノム溶液であることが好ましい。ヒト由来の生体試料として、例えば、血液、骨髄液、リンパ液、尿、喀痰、腹水、滲出液、羊膜液、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、膀胱洗浄液、膵液、唾液、精液、胆汁、胸水、爪、毛髪、又は大便等がある。また、該生体試料は、生物から採取された状態の試料であってもよく、調製した試料であってもよい。該調製の方法は、該生体試料中に含有されているゲノムを損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、通常、生体試料に対してなされている調製方法を行うことができる。
【００２１】
本発明において用いられる標識物質としては、ＰＣＲを阻害することなく核酸の標識に用いることができるものであれば、特に限定されるものではない。このような標識物質として、例えば、Ｄｉｇ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、Ｄｉｇｏｘｉｎ、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＤＮＰ（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）、Ｂｉｏｔｉｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５等のＣｙ ｄｙｅシリーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＮＢＤ（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ）、ＴＭＲ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、２以上の糖からなる糖鎖、６以上のアミノ酸からなるポリペプチド、及びそれらの誘導体等が挙げられる。本発明においては、入手が容易であり、かつ比較的安価であること、及び、当該技術分野で汎用されているため、標的核酸の検出をより確実に確実で容易なものにすることができることから、Ｄｉｇ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＤＮＰ（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）、及びＢｉｏｔｉｎからなる群より選択される物質であることが好ましい。
【００２２】
本発明において、パートナーとは、ある特定の物質と特異的に結合するものを意味し、当該物質と特異的に結合するものであれば、特に限定されるものではない。但し、本発明において、特異的に結合するとは、特定の物質と、当該物質の検出や精製等に通常用いることができる程度に特異的に結合し得ることを意味し、他の物質等と交差するものであってもよい。
【００２３】
このようなパートナーとしては、例えば、標識物質として用いる物質又はそのフラグメントを抗原として作製された抗体が挙げられる。本発明において用いられるパートナーは、血清等の未精製の抗体や、ポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体であってもよい。また、本発明において用いられるパートナーとしては、標識物質として用いる物質と親和性の高い化合物等であってもよい。親和性の高い化合物とは、例えば、プライマーの標識に用いた標識物質がビオチンの場合にはアビジンやストレプトアビジン、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅの場合にはＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ)、マルトース等のアミロースの場合にはＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、６以上のヒスチジンからなるポリペプチドである場合にはニッケル等が挙げられる。
【００２４】
本発明においては、標識物質としてハプテンを用い、パートナーとして当該ハプテンに対する抗体を用いることが好ましい。なお、ハプテンとは、抗体と結合できるが、低分子であるため単独では抗原性を示さない低分子物質である。このため、ハプテンを標識物質としたプライマーを用いることにより、標識物質によるＰＣＲへの影響を低減することができる。また、ハプテンは種類も豊富であることから、標識物質の選択や組み合わせの幅が広がるという効果を持つ。
【００２５】
本発明において用いられるテストストリップは、多孔質部材のメンブレンから成る。このような多孔質部材としては、核酸を含む試料溶液が毛管作用により展開することが可能なものであれば、特に限定されるものではなく、イムノクロマトグラフ用として用いられているテストストリップのいずれを用いてもよい。具体的には、例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ガラス繊維等からなるメンブレンを用いることができる。
【００２６】
本発明において用いられる着色粒子としては、テストストリップ中の細孔を流出可能な着色された粒子であって、粒子表面にパートナーを結合することが可能であればいずれの粒子を用いてもよい。このような着色粒子として、例えば、金コロイド粒子等の金属コロイド粒子や、色素等で着色された着色ラテックス粒子等が挙げられる。中でも、金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子を用いることが好ましい。イムノクロマトグラフィーの反応に影響を与えないためには、テストストリップ中を自由に移動できるように粒子径を小さくすることが重要であるが、これらの着色粒子は、呈色性に優れるため、粒子径を十分に小さくした場合でも、検出結果の視認性に優れるという効果を持つ。
【００２７】
着色粒子にパートナーを結合させる方法は、特に限定されるものではなく、物理的に吸着させてもよく、粒子表面の官能基に化学的に結合させてもよい。例えば、金コロイド粒子等の金属コロイド粒子は、粒子表面が負に帯電しているため、金属粒子と抗原等のパートナーをインキュベートすることにより、パートナーが結合した着色粒子を得ることができる。また、粒子表面を官能基等で修飾したラテックス粒子の場合には、各官能基に適した方法により受容体を結合させることができる。例えば、水溶性カルボジイミドでカルボン酸とアミノ基を結合させるＥＤＡＣ（１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル) −カルボジイミド塩酸塩）法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを予め混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる方法等がある。
【００２８】
本発明の標的核酸の検出方法は、イムノクロマトグラフィー法により標的核酸を検出する方法であって、標的核酸をＰＣＲ増幅し、標的核酸の両端がそれぞれ異なる標識物質により標識された核酸増幅産物を得る核酸増幅工程と、得られた核酸増幅産物を、テストストリップにアプライし、イムノクロマトグラフィー法により検出する検出工程と、を有する。本発明においては、後述するキャプチャー領域を有するテストストリップを用いることにより、核酸増幅産物中に含まれているＰＣＲ未反応のプライマーによる影響を低減し、標的核酸を簡便かつ感度よく検出することができる。
【００２９】
まず、核酸増幅工程として、核酸含有試料中の標的核酸を、第１標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第１プライマーと、第１標識物質とは異なる第２標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーとを用いてＰＣＲ増幅する。
【００３０】
ＰＣＲ増幅には、増幅対象である核酸領域の両端とハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマー（フォワードプライマーと、それに対応するリバースプライマー）を用いる。本発明における第１プライマーと第２プライマーは、このＰＣＲに用いられる２種類のプライマーであり、第１プライマーと第２プライマーのどちらか一方がフォワードプライマーとして用いられ、他方がリバースプライマーとして用いられる。
【００３１】
第１プライマー及び第２プライマーを構成するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲのプライマーとして機能し得る核酸からなるものであれば特に限定されるものではなく、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＤＮＡ及びＲＮＡからなるキメラオリゴヌクレオチドであってもよく、修飾核酸を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００３２】
このようなプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても設計することができる。例えば、公知のゲノム配列データと汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便にプライマーを設計することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ, Ｓ., Ｈ.Ｊ.Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ、１９９６年、ｈｔｔｐ: //ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ.ｗｉ.ｍｉｔ.ｅｄｕ/ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｏｔｈｅｒ/ｐｒｉｍｅｒ３. h t m l）や、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）等がある。また、公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースである、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）や、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。
【００３３】
このようにして設計したプライマーは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、オリゴ合成メーカーに合成をされ依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。また、各プライマーは、標的核酸とハイブリダイズする領域以外にも、標的核酸のＰＣＲ増幅を阻害しない程度において、付加的な配列を有することができる。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。
【００３４】
第１プライマー及び第２プライマーは、標的核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの５’末端が、標識物質により標識されているプライマーである。ここで、第１プライマーの標識に用いられる標識物質（第１標識物質）は、第２プライマーの標識に用いられる標識物質（第２標識物質）とは異なる種類の標識物質を用いる。このため、第１プライマーと第２プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、両端が互いに異なる種類の標識物質により標識された標的核酸（標識済み標的核酸）を得ることができる。なお、オリゴヌクレオチドの５’末端への標識物質の結合は、当該技術分野において公知のいずれの方法で行ってもよい。
【００３５】
核酸増幅工程におけるＰＣＲ増幅は、使用するポリメラーゼの種類、プライマーのＴｍ値、増幅される標的核酸の長さ等に基づいて決定される反応条件で、通常行われる方法により行うことができる。ＰＣＲの反応条件の決定方法は、当該技術分野においてよく知られている。また、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応バッファー等の、ＰＣＲに用いられる試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。鋳型となる核酸含有試料の添加量、並びに第１プライマー及び第２プライマーの添加量も、通常用いられる量であれば、特に限定されるものではない。
【００３６】
次に、検出工程として、核酸増幅工程により得られた核酸増幅産物を、テストストリップのアプライ領域に滴下（アプライ）し、当該テストストリップ中を展開させた後、予め設けられているテスト領域の着色を指標として標的核酸を検出する。
【００３７】
本発明において用いられるテストストリップは、試料溶液（核酸増幅工程により得られた核酸増幅産物）をアプライするアプライ領域、第２標識物質と特異的に結合するパートナーが結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域、第１標識物質と特異的に結合するパートナーが固定されているテスト領域、及び、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域を有する。
【００３８】
コンジュゲート領域には、第２標識物質と特異的に結合するパートナー（以下、「第２パートナー」ということがある。）が結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されている。本発明において、「着色粒子が流出可能な状態で保持されている」とは、テストストリップに試料溶液がアプライされる前の乾燥状態では、着色粒子はコンジュゲート領域に留まっているが、試料溶液がアプライされると、試料溶液とともにテストストリップ中を拡散できる状態を意味する。例えば、第２パートナーが結合している着色粒子（以下、「コンジュゲート」ということがある。）を、テストストリップに局所的に滴下し、速やかに乾燥させることにより、コンジュゲート領域を設けることができる。その他、コンジュゲートを染み込ませて乾燥させたメンブレン等の支持体を、テストストリップに接着させ、当該メンブレンを接着させた領域をコンジュゲート領域としてもよい。
【００３９】
テスト領域には、第１標識物質と特異的に結合するパートナー（以下、「第１パートナー」ということがある。）が固定されている。テストストリップへの第１パートナーの固定方法は、特に限定されるものではなく、パートナー分子の種類に応じて、公知の固定方法の中から適宜選択して行うことができる。具体的には、前述の着色粒子へのパートナーの結合方法と同様の方法が挙げられる。
【００４０】
キャプチャー領域には、第１プライマーと特異的に結合するが、第１標識物質とは結合しない物質（以下、「第１プローブ」ということがある。）が固定されている。このような物質として、例えば、第１プライマーと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は当該オリゴヌクレオチドを含む物質等が挙げられる。なお、このようなオリゴヌクレオチドは、第１プライマーとハイブリダイズし得るものであればよく、修飾核酸等からなるものであってもよく、第１プライマーと相補的な配列以外に付加的な配列を有していてもよい。また、当該オリゴヌクレオチドは、ポリペプチドや低分子化合物等により修飾されていてもよい。
【００４１】
テストストリップへの第１プローブの固定方法は、特に限定されるものではなく、プローブの種類に応じて、公知の固定方法の中から適宜選択して行うことができる。具体的には、前述の着色粒子へのパートナーの結合方法と同様の方法が挙げられる。例えば、アミノ修飾した第１プライマーと相補的な塩基配列を持つプローブオリゴヌクレオチドを第１プローブとし、カルボジイミド修飾したニトロセルロースメンブレンからなるテストストリップとすることにより、当該第１プローブのアミノ基と、当該テストストリップのカルボジイミド基とを縮合させることによって、テストストリップにキャプチャー領域を設けることができる。なお、キャプチャー領域には、核酸増幅産物中に多量に含まれている第１プライマーと十分に結合可能な量の第１プローブを固定することが好ましい。
【００４２】
アプライ領域にアプライされた試料溶液（核酸増幅産物）は、テストストリップ中を毛管作用により流れて展開し、コンジュゲート領域とキャプチャー領域を通過した後にテスト領域に到達する。この試料溶液中に標識済み標的核酸が存在していた場合には、この標識済み標的核酸は、コンジュゲート領域を通過する際に、当該領域中に保持されているコンジュゲートと第２パートナーを介して結合し、この状態でテストストリップ中を展開し、テスト領域に到達する。テスト領域において、標識済み標的核酸は、当該領域に固定されている第１パートナーと第１標識物質を介して結合することにより、捕捉される。従って、アプライされた試料溶液中に標識済み標的核酸が含まれていた場合には、コンジュゲートと結合した標識済み標的核酸がテスト領域に集積することにより、当該テスト領域は着色粒子が発する色に呈色される。一方、試料溶液中に標識済み標的核酸が含まれていなかった場合には、着色粒子がテスト領域に集積せず、当該テスト領域は呈色しない。このように、テスト領域における着色粒子の集積を指標として、すなわち、テスト領域の呈色の有無により、標的核酸を簡便に検出することができる。
【００４３】
アプライされた試料溶液中に含まれている未反応の第１プライマーは、キャプチャー領域を通過する際に、当該領域に固定されている第１プローブと結合し、捕捉される。この結果、テスト領域に到達する未反応の第１プライマー量が顕著に低減され、当該領域において、未反応の第１プライマーによって阻害されることなく、標識済み標的核酸が第１パートナーと結合できることから、標的核酸の検出感度が高められる。
【００４４】
コンジュゲート領域は、テストストリップ中の、アプライ領域にアプライされた試料溶液中の核酸増幅産物が、テスト領域に到達するまでに通過するいずれかの領域にあればよい。このため、コンジュゲート領域は、例えば、アプライ領域とテスト領域との間にあってもよく、アプライ領域と重複する領域であってもよい。
【００４５】
同様に、キャプチャー領域は、テストストリップ中の、アプライ領域にアプライされた試料溶液中の核酸増幅産物が、テスト領域に到達するまでに通過するいずれかの領域にあればよく、例えば、アプライ領域とテスト領域との間にあってもよく、アプライ領域と重複する領域であってもよい。
【００４６】
コンジュゲート領域とキャプチャー領域は、テストストリップの試料溶液が流れる方向に対して、どちらがアプライ領域により近い部位にあってもよい。例えば、アプライ領域にアプライされた試料溶液が、キャプチャー領域を通過後にコンジュゲート領域を通過し、その後テスト領域に到達するように、各領域をテストストリップに設けてもよく、コンジュゲート領域を通過後にキャプチャー領域を通過し、その後テスト領域に到達するようにしてもよい。本発明においては、予め余剰のプライマーを除去した後にコンジュゲートと結合させることができるため、アプライ領域にアプライされた試料溶液が、キャプチャー領域を通過後にコンジュゲート領域を通過するように両領域を設けることが好ましい。
【００４７】
本発明においては、キャプチャー領域に、さらに、第２プライマーと特異的に結合するが第２標識物質とは結合しない物質（以下、「第２プローブ」ということがある。）を固定することが好ましい。第１プローブと同様に、このような物質としては、例えば、第２プライマーと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は当該オリゴヌクレオチドを含む物質等が挙げられる。
【００４８】
従来法においては、図１（Ｄ）に示すように、コンジュゲート領域（１−１７）において、試料溶液中の未反応の第２プライマー（１−７）もコンジュゲート（１−９）と結合する（１−３２）ため、未反応の第２プライマー（１−７）が多量に持ち込まれると、コンジュゲート（１−９）が第２プライマー（１−７）により消費される結果、本来の目的である標的核酸の増幅産物（１−８）との結合に係わるコンジュゲート量の低下をまねいてしまう、という問題も生じる。標的核酸の増幅産物（１−８）との結合に係わるコンジュゲート量が低下すると、アプライされた標的核酸の増幅産物（１−８）は、コンジュゲート（１−９）と結合しない状態でテスト領域（１−１８）に到達し、固定された第１パートナー（１−１１）と結合する（１−３５）ことにより、呈色に寄与しない結合が生じ、標的核酸の検出精度が低下してしまう。
【００４９】
そこで、キャプチャー領域に、さらに、第２プローブを固定することにより、当該領域にて未反応の第２プライマーを捕捉し、これらのプライマーによる影響を低減することができる。
【００５０】
未反応の第２プライマーによるコンジュゲートの消費をより効果的に抑制することができるため、アプライ領域にアプライされた試料溶液が、第２プローブが固定されたキャプチャー領域を通過した後にコンジュゲート領域を通過するように設けることが好ましい。また、第２プローブは、第１プローブを固定するキャプチャー領域と同じ領域に固定してもよく、別の領域に固定してもよい。
【００５１】
本発明の標的核酸の検出方法は、１の標的核酸を検出するものであってもよいが、２以上の標的核酸を検出することもできる。例えば、それぞれの標的核酸について、第１プライマーと第２プライマーを設計し、ＰＣＲ増幅し、核酸増幅産物を得る。ＰＣＲ増幅は、標的核酸の種類ごとに別個に行ってもよく、マルチプレックスＰＣＲを行ってもよい。なお、標的核酸の種類ごとに別個にＰＣＲ増幅を行った場合には、得られた核酸増幅産物を混合して１の試料溶液としたものを、テストストリップにアプライする。
【００５２】
第２標識物質は、標的核酸の種類ごとに異なるものを用いてもよく、同種の標識物質を用いてもよいが、第１標識物質は、標的核酸の種類ごとに別の種類の標識物質を用いなければならない。テストストリップの別個の領域に、標的核酸の種類ごとにテスト領域を設け、各テスト領域に、当該領域の検出対象である標的核酸の第１標識物質に応じた第１パートナーを固定することにより、複数の標的核酸を簡便に検出することができる。
【００５３】
２以上の標的核酸を検出する場合には、標的核酸の種類ごとに、キャプチャー領域を設けてもよく、各標的核酸に対する第１プライマー特異的結合物質を一のキャプチャー領域に固定してもよい。また、標的核酸の種類ごとに異なるコンジュゲートを用いる場合には、用いるコンジュゲートの種類ごとにコンジュゲート領域を設けてもよく、一のコンジュゲート領域に全種類のコンジュゲートを保持させてもよい。なお、各標的核酸の第２標識物質を同種の標識物質とすることにより、１種類のコンジュゲートのみで複数の標的核酸を検出することができる。
【００５４】
例えば、ＳＮＰを検出する場合には、一般的に、各アレルに特異的なプライマーと、全てのアレルに共通するプライマーとを用いてＰＣＲ増幅を行う。そこで、アレル特異的なプライマーを第１プライマーとし、全てのアレルに共通するプライマーを第２プライマーとすることにより、本発明の標的核酸の検出方法を用いて、ＳＮＰのタイプを簡便に分析することができる。この場合には、第１プライマーは、標的核酸の種類ごと（ＳＮＰのタイプごと）に異なるプライマーであり、かつ、前記第２プライマーは、全ての種類の標的核酸に共通するプライマーとなる。
【００５５】
図２は、本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップ（Ａ）、及び当該テストストリップを用いて標識済み標的核酸を検出した状態（Ｂ）の一態様を模式的に示した図である。なお、本発明の標的核酸の検出方法の核酸増幅工程、及び得られる核酸増幅産物については、図１（Ａ）及び（Ｂ）に示す従来法と同様である。なお、以下の図２〜６のテストストリップの断面図は、本発明の構成を説明のために模式的に示したものであり、キャプチャー領域のプローブやテスト領域のパートナーを設ける部位は、テストストリップの表面に限られるものではなく、テストストリップの細孔内にわたって設けられることができる。但し、テストストリップの表面に設ける場合には、キャプチャー領域のプローブやテスト領域のパートナーは、試料溶液をアプライする側の表面に設けることが好ましい。
【００５６】
図２（Ａ）に示すテストストリップは、１種類の標的核酸を検出する場合に用いられるものであり、アプライ領域（１−１６）とコンジュゲート領域（１−１７）が重複するものである。テストストリップ（１−１５）に、アプライ領域（１−１６）と兼ねており、かつ第２標識物質と特異的に結合する第２パートナー（１−１２）と着色粒子（１−１０）が結合したコンジュゲート（１−９）を流出可能な状態で保持するコンジュゲート領域（１−１７）、余剰な第１プライマーの量と十分に結合可能な量の第１プローブ（１−１３）を固定したキャプチャー領域（１−１９）、第１標識物質と特異的に結合する第１パートナー（１−１１）を固定して成るテスト領域（１−１８）を、試料を流す順に設けて構成される。
【００５７】
次に、本発明の基本構成の作用を図２（Ｂ）に基づいて説明する。前記の基本構成によるテストストリップに、図１（Ｂ）に示された核酸増幅産物（試料溶液）を、アプライ領域（１−１６）を兼ねるコンジュゲート領域（１−１７）に滴下する。試料溶液は、多孔質のテストストリップに展開されて、下流方向、すなわちテスト領域方向に流れる。まず、核酸増幅産物中に標識された標的核酸の増幅産物（１−８、以下、「標識済み標的核酸」）が含まれていた場合には、コンジュゲート領域（１−１７）において、コンジュゲート（１−９）と標識済み標的核酸（１−８）が結合する（１−３１）。その際、未反応の第２プライマー（１−７）とコンジュゲート（１−９）も結合し（１−３２）、第１プライマー（１−６）は結合せずに下流に展開される。試料溶液がキャプチャー領域（１−１９）に至ると、未反応の第１プライマー（１−６）は、それと相補的な配列を持つ第１プローブ（１−１３）とハイブリダイズして結合し（１−３６）、キャプチャー領域にトラップされ、試料溶液中から除去される。次に、試料溶液が下流に位置するテスト領域に至ると、コンジュゲートと結合した標識済み標的核酸（１−３１）は、その第１標識物質を介して、テスト領域に固定された第１パートナーと結合して固定される（１−３３）。結合反応に寄与しない余剰なコンジュゲート（１−９）及びコンジュゲートと結合した未反応の第２プライマー（１−３２）は、テスト領域の下流に流される。従って、標的核酸が試料中に存在した場合には、テスト領域（１−１８）が、コンジュゲートと結合した標識済み標的核酸による着色粒子により呈色し、結果として、標的核酸が試料中に存在したと分析される。また、標的核酸が試料中に存在しない場合、前述の標識済み標的核酸（１−８）が存在せず、テスト領域が呈色することはない。これにより、試料中に標的核酸がないと分析される。
【００５８】
このように、本発明によれば、未反応の第１プライマーがテスト領域に至る前に試料中から除去されて、テスト領域における標的核酸の第１標識物質と第１パートナーとの結合が効率的に行われる。したがって、本発明のテストストリップを用いるイムノクロマトグラフィー法によって、核酸増幅産物から直接、試料中の標的核酸の有無を分析することが可能となる。
【００５９】
図３は、本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップの別の一態様を模式的に示した図である。アプライ領域（１−１６）とコンジュゲート領域（１−１７）を分けて設け、キャプチャー領域（１−１９）を前記アプライ領域とコンジュゲート領域の間に設ける。係る構成のテストストリップを用いた場合でも、前述の構成のテストストリップを用いた場合と同様の作用と効果を持つことは明らかである。
【００６０】
図４は、本発明の標的核酸の検出方法の検出工程において用いられるテストストリップの別の一態様を模式的に示した図である。テスト領域の前に、さらに未反応の第２プライマーを捕捉する第２プローブを固定した領域を設けたものである。アプライ領域（１−１６）とコンジュゲート領域（１−１７）の間に、第１プライマーと結合する第１プローブ（１−１３）及び第２プライマーと結合する第２プローブ（１−１４）を固定したキャプチャー領域（１−１９）を設けたことが異なる他は、図３に示すテストストリップの構成と同様である。係る構成のテストストリップを用いた場合でも、前述の構成のテストストリップを用いた場合と同様の作用と効果を持つことは明らかである。特に、この構成では、コンジュゲート領域（１−１７）の上流側に、第２プローブ（１−１４）を固定したキャプチャー領域（１−１９）を設けているため、余剰な第２プライマーがコンジュゲート領域に至る前にキャプチャー領域で除去される。この結果、不要な第２プライマーとコンジュゲートの結合をなくすことができ、従って、コンジュゲートと標識済み標的核酸の結合が効率よく行われる。
【００６１】
図５は、２種類の標的核酸を検出する場合に用いられるテストストリップを模式的に示した図である。具体的には、２種類の標的核酸（標的核酸Ａ及びＢ）を、標的核酸ごとに、標識物質も、標識されるオリゴヌクレオチドの塩基配列も異なる第１プライマーと、両方の標的核酸に共通して用いられる第２プライマーとを用いてＰＣＲ増幅し、得られた核酸増幅産物をアプライして両方の標的核酸を検出するために用いられるテストストリップである。テストストリップ（１−１５）の構成を、上流側から順に説明する。まず、アプライ領域（１−１６）を設け、その次に、標的核酸Ａの第１プライマーと特異的に結合する第１プローブ（１−１３−１）、標的核酸Ｂの第１プライマーと特異的に結合する第１プローブ（１−１３−２）、及び両方の標的核酸に共通して用いられる第２プライマーと特異的に結合する第２プローブ（１−１４−１）を固定したキャプチャー領域（１−１９）を設ける。次いで、第２プライマーと特異的に結合する第２パートナーを結合した着色粒子であるコンジュゲート（１−９）を流出可能な状態で保持するコンジュゲート領域（１−１７）を設ける。コンジュゲート領域の下流には、標的核酸Ａの第１プライマーを標識する第１標識物質と特異的に結合する第１パートナー（１−１１−１）が固定されたテスト領域（１−１８−１）が設けられ、その下流に、このテスト領域（１−１８−１）とは別個に、標的核酸Ｂの第１プライマーを標識する第１標識物質と特異的に結合する第１パートナー（１−１１−２）が固定されたテスト領域（１−１８−２）が設けられている。さらにその下流に、第２プライマーを標識する第２標識物質が固定されたコントロール領域（１−２０）を設けている。
【００６２】
図６は、図５に記載の構成を有するテストストリップを用いて、１のＳＮＰの野生型と変異型を検出する場合の一態様を模式的に示した図である。図６（Ａ）は、ＰＣＲ前の試料の主要構成を示す。検出対象であるＳＮＰを含む可能性のある核酸（１−１）、標的核酸Ｗ（野生型）を増幅するための第１プライマー（１−２−１）、標的核酸Ｍ（変異型）を増幅するための第１プライマー（１−２−２）、標的核酸Ｗと標的核酸Ｍに共通して用いられる第２プライマー（１−３−１）が含まれている。標的核酸Ｗの第１プライマー（１−２−１）は、ハプテンである標識物質Ｄｉｇ（１−４−１）により標識されており、標的核酸Ｍの第１プライマー（１−２−２）は、ハプテンである標識物質ＦＩＴＣ（１−４−２）により標識されており、第２プライマー（１−３−１）は、ハプテンである標識物質Ｂｉｏｔｉｎ（１−５−１）により標識されている。核酸含有試料に、変異型アレルと変異型アレルの両方が含まれるヘテロ型の場合の、当該核酸含有試料を鋳型としてＰＣＲ増幅した後の試料構成要素を、図６（Ｂ）に示す。ＰＣＲ増幅して得られた核酸増幅産物中には、Ｄｉｇ及びＢｉｏｔｉｎにより標識された標的核酸Ｗの増幅産物（１−８−１）と、ＦＩＴＣ及びＢｉｏｔｉｎにより標識された標的核酸Ｍの増幅産物（１−８−２）とに加えて、未反応の過剰なプライマー（１−２−１、１−２−２、及び１−３−１）及び元々核酸含有試料に含まれていた増幅前の標的核酸（１−１）が含まれている。
【００６３】
次に、本発明の基本構成の作用を図６（Ｃ）に基づいて説明する。 図５記載の基本構成によるテストストリップに、図６（Ｂ）に示された核酸増幅産物（試料溶液）をアプライして、分析した状態を図６（Ｃ）に示す。アプライ領域（１−１６）に滴下された試料溶液は、展開して、キャプチャー領域（１−１９）に到達する。キャプチャー領域（１−１９）において、試料溶液中に存在していた標的核酸Ｗの第１プライマーは、当該プライマーと特異的に結合する第１プローブとハイブリダイズし（１−３７−１）、標的核酸Ｍの第１プライマーは、当該プライマーと特異的に結合する第１プローブとハイブリダイズし（１−３７−２）、両方に共通の第２プライマーは、当該プライマーと特異的に結合する第２プローブとハイブリダイズする（１−３７−３）。これにより、試料溶液中に余剰に存在していた未反応のプライマーは、キャプチャー領域（１−１９）に固定されているプローブと結合して捕捉され、これより下流に流れることはない。二本鎖核酸である標的核酸Ｗの増幅産物（１−８−１）及び標的核酸Ｍの増幅産物（１−８−２）は、キャプチャー領域に捕捉されずにさらに下流に展開し、コンジュゲート領域（１−１７）で、それぞれ、ＢｉｏｔｉｎのパートナーであるＡｖｉｄｉｎが金コロイド粒子に結合したコンジュゲート（１−９）と結合し、さらに下流へと流れる。Ｄｉｇのパートナーである抗Ｄｉｇ抗体が固定されたテスト領域（１−１８−１）に到達すると、試料溶液中に存在するコンジュゲートと結合した標的核酸Ｗの増幅産物（１−８−１）は、抗Ｄｉｇ抗体と特異的に結合して捕捉され（１−３８−１）、このテスト領域（１−１８−１）は、金コロイドから成る着色粒子により着色される。さらに、下流へと流れ、ＦＩＴＣのパートナーである抗ＦＩＴＣ抗体が固定されたテスト領域（１−１８−２）に到達すると、試料溶液中に存在するコンジュゲートと結合した標的核酸Ｍの増幅産物（１−８−２）が抗ＦＩＴＣ抗体結合して捕捉され（１−３８−２）、このテスト領域（１−１８−２）の呈色が起きる。試料溶液に流出した余剰のコンジュゲートは、さらに下流へと展開し、コントロール領域（１−２０）に固定されたＢｉｏｔｉｎと特異的に結合する（１−３９）。これにより、試料がテストストリップ中を流れて分析が行われたことがわかる。
【００６４】
図６（Ｄ）は、ヘテロ型、ホモ型の試料を図５記載のテストストリップで分析した場合の、テストストリップ（１−１５）の状態を、マクロ的・模式的に示したものである。遺伝子のタイプがヘテロ型である場合（野生型アレルと変異型アレルの両方を有している場合）には、図６（Ｄ）の上段に示すように、両方のテスト領域（１−２１、１−２２）及びコントロール領域（１−２３）が呈色する。一方、遺伝子のタイプがホモ型である場合（野生型アレルと変異型アレルのいずれか一方のみを有している場合）は、図６（Ｄ）の中段及び下段に示すように、テスト領域（１−２１）とテスト領域（１−２２）のいずれか一方と、コントロール領域（１−２３）とが呈色する。当然、試料溶液に標的核酸が含まれない場合には、６図（Ｂ）の増幅産物（１−８−１、１−８−２）が生じることは無く、結果として、テストストリップの両方のテスト領域は呈色せず、コントロール領域（１−２３）のみが呈色することは、明らかである。
【００６５】
本実施の形態により、ＰＣＲ増幅により得られる核酸増幅産物に含まれる未反応の第1プライマーと第２プライマーとがキャプチャー領域でそれぞれに相補的な配列を持つプローブとハイブリダイズして固定され、試料中から除去されて、これより下流に流れない。このため、ＰＣＲ未反応の第１プライマーは、テスト領域に固定した第１パートナーと結合することがなく、標識済み標的核酸と第１パートナーとの結合が十分に行われる結果、テスト領域が十分に呈色する。さらには、未反応の第２プライマー（標的核酸Ｗと標的核酸Ｍの共通プライマー）も、キャプチャー領域に固定された第２プローブとハイブリダイズすることにより試料中から除去されるため、キャプチャー領域に固定され、試料溶液中から除去されるため、当該第２プローブの標識物質Ｂｉｏｔｉｎが、コンジュゲートのＡｖｉｄｉｎと結合することが無く、従って、無駄にコンジュゲートが消費されることがない。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の標的核酸の検出方法により、ＰＣＲ等の核酸増幅産物から直接イムノクロマトグラフィー法で標的核酸の有無を簡便に検出することができるため、試料中の標的核酸を検出し解析するような生化学、分子生物学、臨床検査等の分野で利用が可能である。
【符号の説明】
【００６７】
１−１…標的核酸、１−２…第１プライマー、１−３…第２プライマー、１−４…第１標識物質、１−５…第２標識物質、１−６…第１プライマー、１−７…第２プライマー、１−８…標識化された標的核酸の増幅産物、１−９…コンジュゲート、１−１０…着色粒子、１−１１…第１パートナー、１−１２…第２パートナー、１−１３…第１プローブ、１−１４…第２プローブ、１−１５…テストストリップ、１−１６…アプライ領域、１−１７…コンジュゲート領域、１−１８…テスト領域、１−１９…キャプチャー領域、１−２０…コントロール領域、１−２１…テスト領域、１−２２…テスト領域、１−２３…コントロール領域。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノクロマトグラフィー法により標的核酸を検出する方法であって、
核酸含有試料中の標的核酸を、第１標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第１プライマーと、第１標識物質とは異なる第２標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーとを用いてＰＣＲ増幅する核酸増幅工程と、
前記核酸増幅工程により得られた核酸増幅産物を、アプライ領域、前記第１標識物質と特異的に結合するパートナーが固定されているテスト領域、及び前記第２標識物質と特異的に結合するパートナーが結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域を有するテストストリップのアプライ領域に滴下し、当該テストストリップ中を展開させ、前記テスト領域における前記着色粒子の集積を指標として標的核酸を検出する検出工程と、
を有し、
前記コンジュゲート領域は、前記アプライ領域とテスト領域の間にある領域又は前記アプライ領域と重複する領域であり、
前記テストストリップが、アプライ領域とテスト領域の間に、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項２】
前記キャプチャー領域に固定されている、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が、当該プライマーと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載の標的核酸の検出方法。
【請求項３】
前記テストストリップにおいて、前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とする請求項１又は２記載の標的核酸の検出方法。
【請求項４】
前記キャプチャー領域に、前記第２プライマーと特異的に結合するが前記第２標識物質とは結合しない物質がさらに固定されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
【請求項５】
２種類以上標的核酸を検出するものであり、前記第１標識物質は、標的核酸の種類ごとに異なる物質であり、かつ、前記第２標識物質は、全ての種類の標的核酸に共通の物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
【請求項６】
２種類以上標的核酸を検出するものであり、前記第１プライマーは、標的核酸の種類ごとに異なるプライマーであり、かつ、前記第２プライマーは、全ての種類の標的核酸に共通するプライマーであることを特徴とする請求項５記載の標的核酸の検出方法。
【請求項７】
前記標識物質が、Ｄｉｇ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＤＮＰ（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）、及びＢｉｏｔｉｎからなる群より選択される物質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
【請求項８】
前記標識物質がハプテンであり、前記パートナーが当該ハプテンと特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
【請求項９】
前記着色粒子が、金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１０】
第１標識物質により一方の端が標識されており、第１標識物質とは異なる第２標識物質により他方の端が標識されている標的核酸を検出するために用いられるテストストリップであって、
アプライ領域と、前記第１標識物質と特異的に結合するパートナーが固定されているテスト領域と、前記第２標識物質と特異的に結合するパートナーが結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域と、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域とを有し、
前記コンジュゲート領域及び前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とするテストストリップ。
【請求項１１】
前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とする請求項１０記載のテストストリップ。
【請求項１】
イムノクロマトグラフィー法により標的核酸を検出する方法であって、
核酸含有試料中の標的核酸を、第１標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第１プライマーと、第１標識物質とは異なる第２標識物質により５’末端が標識されているオリゴヌクレオチドからなる第２プライマーとを用いてＰＣＲ増幅する核酸増幅工程と、
前記核酸増幅工程により得られた核酸増幅産物を、アプライ領域、前記第１標識物質と特異的に結合するパートナーが固定されているテスト領域、及び前記第２標識物質と特異的に結合するパートナーが結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域を有するテストストリップのアプライ領域に滴下し、当該テストストリップ中を展開させ、前記テスト領域における前記着色粒子の集積を指標として標的核酸を検出する検出工程と、
を有し、
前記コンジュゲート領域は、前記アプライ領域とテスト領域の間にある領域又は前記アプライ領域と重複する領域であり、
前記テストストリップが、アプライ領域とテスト領域の間に、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項２】
前記キャプチャー領域に固定されている、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が、当該プライマーと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載の標的核酸の検出方法。
【請求項３】
前記テストストリップにおいて、前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とする請求項１又は２記載の標的核酸の検出方法。
【請求項４】
前記キャプチャー領域に、前記第２プライマーと特異的に結合するが前記第２標識物質とは結合しない物質がさらに固定されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
【請求項５】
２種類以上標的核酸を検出するものであり、前記第１標識物質は、標的核酸の種類ごとに異なる物質であり、かつ、前記第２標識物質は、全ての種類の標的核酸に共通の物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
【請求項６】
２種類以上標的核酸を検出するものであり、前記第１プライマーは、標的核酸の種類ごとに異なるプライマーであり、かつ、前記第２プライマーは、全ての種類の標的核酸に共通するプライマーであることを特徴とする請求項５記載の標的核酸の検出方法。
【請求項７】
前記標識物質が、Ｄｉｇ（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＤＮＰ（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）、及びＢｉｏｔｉｎからなる群より選択される物質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
【請求項８】
前記標識物質がハプテンであり、前記パートナーが当該ハプテンと特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
【請求項９】
前記着色粒子が、金コロイド粒子又は着色ラテックス粒子であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の標的核酸の検出方法。
【請求項１０】
第１標識物質により一方の端が標識されており、第１標識物質とは異なる第２標識物質により他方の端が標識されている標的核酸を検出するために用いられるテストストリップであって、
アプライ領域と、前記第１標識物質と特異的に結合するパートナーが固定されているテスト領域と、前記第２標識物質と特異的に結合するパートナーが結合している着色粒子が流出可能な状態で保持されているコンジュゲート領域と、前記第１プライマーと特異的に結合するが前記第１標識物質とは結合しない物質が固定されているキャプチャー領域とを有し、
前記コンジュゲート領域及び前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とするテストストリップ。
【請求項１１】
前記キャプチャー領域が、前記アプライ領域と前記コンジュゲート領域の間に存在することを特徴とする請求項１０記載のテストストリップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２０７１２３（Ｐ２０１０−２０７１２３Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１１５（Ｐ２００９−５５１１５）
【出願日】平成２１年３月９日（２００９．３．９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月９日（２００９．３．９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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