不均質な核酸混合物中の特定の標的核酸の選択的なハイブリダイゼーションおよび捕捉のための組成物、キットおよび方法を開示する。次いで、標的核酸は後続の分析で使用される。該方法は、後続の分析で酵素および他の試薬を使用するのに適当な環境を確保するために慣用的に必要とされるものよりも、低いストリンジェントの精製および／または無菌性についての少ない労力しか必要としないという利点を提供する。本発明によって提供される不活化可能型標的捕捉オリゴマーは、少なくとも３つの核酸配列領域：すなわち、標的ハイブリダイゼーション領域；タグ閉鎖領域；および結合ペアメンバー領域を含む。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ． 核酸試料中の標的核酸配列を、不活化可能型標的捕捉オリゴマーで処理する工程であって、前記不活化可能型標的捕捉オリゴマーは、約１５連続核酸塩基長〜約３０連続核酸塩基長である標的ハイブリダイズ領域、結合ペアメンバーおよびタグ閉鎖領域を含み、前記タグ閉鎖領域は約３連続核酸塩基長〜約２０連続核酸塩基長であり、前記標的ハイブリダイゼーション領域の一部分に実質的に相補的であり、前記標的核酸に安定的にハイブリダイズせず、前記標的ハイブリダイズ領域、前記結合ペアメンバーおよび前記タグ閉鎖領域が単一の分子として連接されている、工程；
ｂ． １組の条件を準備する工程であって、前記条件のストリンジェンシーにより、前記標的ハイブリダイズ領域が前記標的核酸と安定的にハイブリダイズする方向に偏向され、前記タグ閉鎖領域と安定的にハイブリダイズする方向には偏向されない、工程；
ｃ． 前記１組の条件に変更をもたらす工程であって、前記ストリンジェンシーが低下し、前記タグ閉鎖領域が前記標的ハイブリダイズ領域とハイブリダイズすることにより、標的核酸と安定的にハイブリダイズされない不活化可能型標的捕捉オリゴマーが、不活性な立体配置を形成することが可能になる、工程；ならびに
ｄ． 捕捉工程を行なう工程であって、工程ｂで前記標的核酸と安定的にハイブリダイズされた前記不活化可能型捕捉オリゴマーを含む複合体が捕捉される、工程、
を含む、標的核酸の特異的ハイブリダイゼーションおよび捕捉のための方法。
【請求項２】
工程ｄ．が、相補結合ペアメンバーから本質的になる固相支持体物質を準備すること；および前記不活化可能型捕捉プローブの前記結合ペアメンバーと、前記相補結合メンバーとの結合を可能にする条件を準備することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固相支持体物質が常磁性ビーズであり、前記相補結合ペアメンバーが前記常磁性ビーズに共有結合されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記相補結合ペアメンバーが固定化プローブであり、前記不活化可能型捕捉プローブの前記結合ペアメンバーが、前記固定化プローブに実質的に相補的なヌクレオチド配列から本質的になるポリヌクレオチド領域である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
洗浄工程をさらに含み、工程ｄ．の前記捕捉された標的核酸は保持されるが、非捕捉核酸、非標的核酸、夾雑核酸、不活化された不活化可能型標的捕捉オリゴマー、試薬および試料残屑の１種類以上は、前記捕捉された標的核酸から分離される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記固相支持体物質が、アミン、イミンまたはグアニジンコート常磁性ビーズである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記不活化可能型標的捕捉オリゴマーの前記結合ペアメンバーが、ヌクレオチド配列から本質的になるポリヌクレオチド領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記タグ閉鎖領域が、脱塩基ヌクレオチド残基、ゆらぎヌクレオチド残基、前記標的ハイブリダイズ領域内に含まれた前記配列内の前記残基の対応する位置に対するミスマッチヌクレオチド残基、およびその組合せからなる群より選択される１つ以上のヌクレオチド残基を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タグ閉鎖領域が少なくとも６〜１４核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記タグ閉鎖領域が少なくとも６〜９核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記タグ閉鎖領域が７核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記タグ閉鎖領域が少なくとも６〜９核酸塩基長のヌクレオチド配列を含み、前記標的ハイブリダイズ領域が１７核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タグ閉鎖領域が、前記結合ペアメンバーが連接されている前記標的ハイブリダイズ領域の末端と反対側である前記標的ハイブリダイズ領域の末端に連接されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記タグ閉鎖領域が、前記標的ハイブリダイズ領域の前記末端に非ヌクレオチドリンカーを用いて連接されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的ハイブリダイズ領域が、前記結合ペアメンバーが連接されている前記タグ閉鎖領域の末端と反対側である前記タグ閉鎖領域の末端に連接されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的ハイブリダイズ領域が前記タグ閉鎖領域の前記末端に、非ヌクレオチドリンカーを用いて連接されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的ハイブリダイズ領域が前記タグ閉鎖領域の前記末端にヌクレオチドリンカーを用いて連接されており、それにより、前記標的ハイブリダイズ領域と前記タグ閉鎖領域とから本質的になる連続ヌクレオチド配列が形成されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合ペアメンバーが実質的にホモポリマーであるヌクレオチド配列であり、前記タグ閉鎖領域の前記末端にヌクレオチドリンカーを用いて連接されており、それにより、前記結合ペアメンバー、前記タグ閉鎖領域および前記標的ハイブリダイズ領域から本質的になる連続ヌクレオチド配列が形成されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記不活化可能型標的捕捉オリゴマーが、前記結合ペアメンバーの５’末端が前記タグ閉鎖領域の３’末端に連接されており、前記タグ閉鎖領域の５’末端が前記標的ハイブリダイズ領域の３’末端に連接されているような３’→５’の向きを有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記捕捉された標的核酸の分析を行なう工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記分析が増幅および検出反応である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅反応が、タグ配列を含む第１の増幅産物が生成されるように構成された異種増幅オリゴマーを含み、前記第１の増幅産物内の前記タグ配列またはその相補体にハイブリダイズして後続の増幅産物が生成されるように構成された第２の増幅オリゴマーを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出がヌクレオチドプローブによる検出である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも、結合ペアメンバー、少なくとも１５〜３０核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む標的ハイブリダイズ領域、および少なくとも３〜２０核酸塩基長のヌクレオチド配列を含むタグ閉鎖領域を含む不活化可能型標的捕捉オリゴマーから本質的になり、前記結合ペアメンバー、前記標的ハイブリダイズ領域および前記タグ閉鎖領域が単一の分子として連接されており、前記タグ閉鎖領域のヌクレオチド配列が、前記標的ハイブリダイズ領域内に含まれた配列に実質的に相補的である、プレアニーリング反応混合物。
【請求項２５】
前記タグ閉鎖領域が、脱塩基ヌクレオチド残基、ゆらぎヌクレオチド残基、前記標的ハイブリダイズ領域内に含まれた前記配列内の前記残基の対応する位置に対するミスマッチヌクレオチド残基、およびその組合せからなる群より選択される１つ以上のヌクレオチド残基を含むヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の反応混合物。
【請求項２６】
前記タグ閉鎖領域が少なくとも６〜１４核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の反応混合物。
【請求項２７】
前記タグ閉鎖領域が少なくとも６〜９核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の反応混合物。
【請求項２８】
前記タグ閉鎖領域が７核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の反応混合物。
【請求項２９】
前記タグ閉鎖領域が少なくとも６〜９核酸塩基長のヌクレオチド配列を含み、前記標的ハイブリダイズ領域が１７核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の反応混合物。
【請求項３０】
前記タグ閉鎖領域が、前記結合ペアメンバーが連接されている前記標的ハイブリダイズ領域の末端と反対側である前記標的ハイブリダイズ領域の末端に連接されている、請求項２４に記載の反応混合物。
【請求項３１】
前記タグ閉鎖領域が、前記標的ハイブリダイズ領域の前記末端に非ヌクレオチドリンカーを用いて連接されている、請求項３０に記載の反応混合物。
【請求項３２】
前記標的ハイブリダイズ領域が、前記結合ペアメンバーが連接されている前記タグ閉鎖領域の末端と反対側である前記タグ閉鎖領域の末端に連接されている、請求項２４に記載の反応混合物。
【請求項３３】
前記標的ハイブリダイズ領域が前記タグ閉鎖領域の前記末端に、非ヌクレオチドリンカーを用いて連接されている、請求項３２に記載の反応混合物。
【請求項３４】
前記標的ハイブリダイズ領域が前記タグ閉鎖領域の前記末端にヌクレオチドリンカーを用いて連接されており、それにより、前記標的ハイブリダイズ領域と前記タグ閉鎖領域から本質的になる連続ヌクレオチド配列が形成されている、請求項３２に記載の反応混合物。
【請求項３５】
前記結合ペアメンバーが実質的にホモポリマーであるヌクレオチド配列であり、前記タグ閉鎖領域の前記末端にヌクレオチドリンカーを用いて連接されており、それにより、前記結合ペアメンバー、前記タグ閉鎖領域および前記標的ハイブリダイズ領域から本質的になる連続ヌクレオチド配列が形成されている、請求項３４に記載の反応混合物。
【請求項３６】
前記不活化可能型標的捕捉オリゴマーが、前記結合ペアメンバーの５’末端が前記タグ閉鎖領域の３’末端に連接されており、前記タグ閉鎖領域の５’末端が前記標的ハイブリダイズ領域の３’末端に連接されているような３’→５’の向きを有する、請求項３５に記載の反応混合物。
【請求項３７】
少なくとも１種類の増幅オリゴマーをさらに含む、請求項２４に記載の反応混合物。
【請求項３８】
前記少なくとも１種類の増幅オリゴマーが異種増幅オリゴマーである、請求項３７に記載の反応混合物。
【請求項３９】
前記標的ハイブリダイズ領域が標的核酸とハイブリダイズする方向に偏向され、前記タグ閉鎖領域とハイブリダイズする方向には偏向されない１組の条件をさらに含む、請求項２４に記載の反応混合物。
【請求項４０】
前記標的ハイブリダイズ領域が前記タグ閉鎖領域とハイブリダイズする方向に偏向され、非標的核酸とハイブリダイズする方向には偏向されない１組の条件をさらに含む、請求項２４に記載の反応混合物。
【請求項４１】
標的核酸と、非標的核酸と夾雑核酸の一方または両方とを含む核酸混合物中の標的核酸の選択的増幅のための方法であって、
ａ． 核酸試料の標的核酸を、請求項１に記載の方法を用いて選択的にハイブリダイズさせ、捕捉する工程；
ｂ． 増幅反応を行ない、タグ配列を含む第１の増幅産物を生成させる工程；
ｃ． 後続の増幅反応を行なう工程であって、前記後続の増幅反応の混合物は、前記第１の増幅産物内に含まれた前記タグ配列またはその相補体にハイブリダイズし、それにより後続の増幅産物が生成されるように構成された増幅オリゴマーを含む、工程；ならびに
ｄ． 前記標的核酸の存在または非存在を判定するために前記後続の増幅産物を検出する工程
を含む方法。
【請求項４２】
前記タグ配列が前記第１の増幅産物内に異種増幅オリゴマーによって導入されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記タグ配列が前記第１の増幅産物内に、前記不活化可能型標的捕捉オリゴマーをプライマーとして使用することにより導入されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記不活化可能型標的捕捉オリゴマーがタグ領域をさらに含み、前記タグ領域のヌクレオチド配列が、前記タグ閉鎖領域のヌクレオチド配列とは別個のヌクレオチド配列である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記不活化可能型標的捕捉オリゴマーがタグ領域をさらに含み、前記タグ領域のヌクレオチド配列が、一部、前記タグ閉鎖領域のヌクレオチド配列と重複している、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記不活化可能型標的捕捉オリゴマーがタグ領域をさらに含み、前記タグ領域のヌクレオチド配列が前記タグ閉鎖領域のヌクレオチド配列と同じである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
工程ｃの増幅反応が非標的核酸と夾雑核酸の一方または両方の存在下で行なわれ、工程ｂの組込みタグ配列が非標的核酸に実質的に含まれず、夾雑核酸に実質的に含まれない、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的核酸がプローブによる検出工程において検出される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記標的核酸がプローブによる検出工程において検出される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記タグ閉鎖領域が、脱塩基ヌクレオチド残基、ゆらぎヌクレオチド残基、前記標的ハイブリダイズ領域内に含まれた前記配列内の前記残基の対応する位置に対するミスマッチヌクレオチド残基、およびその組合せからなる群より選択される１つ以上のヌクレオチド残基を含むヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記タグ閉鎖領域が少なくとも６〜１４核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記タグ閉鎖領域が少なくとも６〜９核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記タグ閉鎖領域が７核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記タグ閉鎖領域が少なくとも６〜９核酸塩基長のヌクレオチド配列を含み、前記標的ハイブリダイズ領域が１７核酸塩基長のヌクレオチド配列を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記タグ閉鎖領域が、前記結合ペアメンバーが連接されている前記標的ハイブリダイズ領域の末端と反対側である前記標的ハイブリダイズ領域の末端に連接されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
前記タグ閉鎖領域が、前記標的ハイブリダイズ領域の前記末端に非ヌクレオチドリンカーを用いて連接されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的ハイブリダイズ領域が、前記結合ペアメンバーが連接されている前記タグ閉鎖領域の末端と反対側である前記タグ閉鎖領域の末端に連接されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項５８】
前記標的ハイブリダイズ領域が前記タグ閉鎖領域の前記末端に、非ヌクレオチドリンカーを用いて連接されている、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記標的ハイブリダイズ領域が前記タグ閉鎖領域の前記末端にヌクレオチドリンカーを用いて連接されており、それにより、前記標的ハイブリダイズ領域と前記タグ閉鎖領域とから本質的になる連続ヌクレオチド配列が形成される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記結合ペアメンバーが実質的にホモポリマーであるヌクレオチド配列であり、前記タグ閉鎖領域の前記末端にヌクレオチドリンカーを用いて連接されており、それにより、前記結合ペアメンバー、前記タグ閉鎖領域および前記標的ハイブリダイズ領域から本質的になる連続ヌクレオチド配列が形成される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記不活化可能型標的捕捉オリゴマーが、前記結合ペアメンバーの５’末端が前記タグ閉鎖領域の３’末端に連接されており、前記タグ閉鎖領域の５’末端が前記標的ハイブリダイズ領域の３’末端に連接されているような３’→５’の向きを有する、請求項６０に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【公表番号】特表２０１１−５２０４５０（Ｐ２０１１−５２０４５０Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０９６５０（Ｐ２０１１−５０９６５０）
【出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４３７７５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４０３７４
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５００５０６５３０）ジェン−プロウブ　インコーポレイテッド (58)
【Ｆターム（参考）】