標的配列およびそれらの中のヌクレオチド変異の量を測定するための方法および試験キット
本発明は1より多い標的ポリヌクレオチド配列およびその中のヌクレオチド変異の相対量の同時測定法に関する。その方法は標的にハイブリダイズした一本鎖プローブを分離し記録することにより行い、プローブはサイズおよび所望により検出可能な標識を含む既定の特性により測定、識別される。プローブは標的中の測定すべきヌクレオチド変異に隣接する配列を有する領域に相補的である。アフィニティータグを付けた標的にハイブリダイズ後、プローブは固体支持体に連結し精製される。標的-プローブハイブリッドは酵素の補助により伸長させる。伸長したプローブは固体担体から遊離させた後に記録し、各標的およびヌクレオチド変異の量ならびに改変および非改変標的ポリヌクレオチド配列の比率を記録結果から計算する。パッケージ形態にて装置機器および試薬およびその方法を行うための説明書を含む試験キットも開示する。この方法はいくつかの診断目的に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞または組織ライセートであり得るサンプル溶液から直接、複数の標的ポリヌクレオチド配列およびその中のヌクレオチド変異の量を、複数の検出プローブとの親和性を補助する溶液ハイブリダイゼーションおよび酵素が補助するその検出プローブの伸長を用いて、同時に測定することができる方法に関する。本発明はまた、パッケージ形態にて、既定の特性を有する検出プローブの混合物および試薬を含むプールを有する装置、ならびにその方法を行うための説明書を含む試験キットを開示する。この方法および試験キットの様々な診断目的のための使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
利用可能な遺伝子情報、および、その情報の、分子生物学、ヘルスケア、処置様式、医薬的研究、疫学的研究などに対する影響の急速な増大に対する反応として、今日の科学的な関心は、遺伝子の主要な要素ならびにそれらの生物学的な役割および機能の細胞効果に焦点が置かれている。遺伝学における基本的な主要な要素に関連する新しい情報の蓄積は減速しているが、遺伝子、それらの発現産物および発現に有効な因子の生物学的な役割、ならびに病気および健康に対する発現遺伝子の影響を研究する欲求は、確実に増大している。
【０００３】
生命過程に関連する情報を取り扱い、バイオサイエンスに蓄積するバイオインフォマティクスは、数値的に正確な方法にてコンピュータ処理し、取り扱うことができる形態であるべきである。様々な標的ポリヌクレオチド配列およびそれらのヌクレオチド変異の発現に対する様々な外部刺激の効果および潜在的重要性の素早い評価がバイオインフォマティクスに望まれる。これにより、標的ポリヌクレオチド配列のみならずその中のヌクレオチド変異（点突然変異、ヌクレオチド変異、一塩基多型などを含む）の、効果および生物学的な役割の、素早く正確な、好ましくは定量的な評価を可能にする新たなツールに対するおびただしい需要が生まれた。様々な疾患および障害に関する素質（disposition）およびそれらの疾患および障害の原因または処置様式を診断する際に、これらのヌクレオチド変異および様々な細胞および組織におけるそれらの発現の影響は、望ましい対象である。この技術の周辺においてかなりの市場が成長したが、多用途で、かつ定量的な特性を提供する新たな方法を開発することが依然として望まれる。転写特性は、生命科学の基礎研究の多くの領域における科学者に用いられるだけでなく、産業的な研究および開発においてもしばしば利用される。ヒトおよび実験動物の遺伝子発現に対する既知の薬物および新規な薬物の効果は、病院およびヘルスセンターを含む、医薬品産業および診断に関する産業ならびにヘルスケアにおいて今や不可欠な知識であるが、バイオ産業の、食品産業、農業および林業を含むいくつかの他の部門も受益者となるであろう。
【０００４】
転写特性における強力なツールはオリゴマーチップ技術であり、これは多数の標的ポリヌクレオチド配列の同時検出を可能にする。主にバックグラウンドのノイズにより、マイクロアレイの識別力が不十分であるために、定量的な結果を得るのに十分な精度をもって結果を比較するのはしばしば不可能である。
【０００５】
一方、マイクロアレイ系に代表されるハイブリダイゼーション技術は非常に大きく発展したが、その技術の新たな用途も創出されてきた。ゲノミクスまたは発現されたゲノミクスの治療への転換を含む、これらの新たな用途により、再現性のある定量的な結果を提供するより正確な方法の必要性が生まれた。現在、遺伝的因子が血管系の疾患、癌、肥満などを含む多数の疾患の要因であることが知られている。これらの疾患の発症は、遺伝性のゲノム因子のみならず、遺伝子の発現、ならびに遺伝子およびそれら遺伝子の発現の程度を調節する多くの因子にも依拠している。それ故に、ゲノミクスを治療に転換する際に必要な方法は、定量的であり、発現レベルの変化の測定が可能でなければならないが、同時に、堅固で（robust）再現性があり多数のサンプルを取り扱うのに適用できることに加え、実施が容易であるべきである。これらの問題のいくつかは、より効率的なマイクロアレイ系を開発することにより挑戦されてきたが、固相ハイブリダイゼーションに基づくマイクロアレイを、液相において行い溶液ハイブリダイゼーションと固相吸着-脱離反応とを組み合わせる、溶液ハイブリダイゼーション法に置き換えることによっても対応されてきた。
【０００６】
標的ポリヌクレオチド配列の量を測定するための、かかる定量的かつ高感度な方法は、米国特許出願公開第20040053300号および20060035228号明細書に記載されている。転写分析のための多重の（multiplexed）方法は、Kataja et al., 2006, J. Microbiol. Methods, 67: 102-113に記載されている。その方法の多重性は、キャピラリー電気泳動により分離された、明確に異なるサイズを有する検出プローブを用いることにより得られる。しかしながら、これらの方法において、ゲノミクスまたは発現されたゲノミクスを治療に転換する際に重要な、ヌクレオチド変異を定量する方法は記載されていない。
【０００７】
標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド変異を測定するために開発された第１の方法のひとつは、ゲノムDNA中のヌクレオチド変異のみがアッセイされるものであった。これらの方法の1つ、いわゆるミニシーケンシング法は、米国特許出願公開第20030082530号および20030082531号明細書に開示されている。米国特許出願公開第200300129589号明細書は、質量スペクトル分析法を用いて突然変異および他の診断マーカーを検出するDNAシーケンシング法を提供している。プローブライゲーションを用いることによるポリヌクレオチドサンプルにおける複数の核酸配列の存在の有無は、米国特許第5,514,543号明細書において開示されている。米国特許出願公開第200500214825号および200400121342号明細書ならびに国際公開第02/33126号および2004/063700号パンフレットにおいて開示されている方法は、サンプル中の複数のポリヌクレオチド配列を検出する方法を記載している。Pirrung et al., 2001, Bioorg. Med. Chem. Lett., 11: 2437-2440に開示されている整列化プライマー伸長（Arrayed Primer Extension）（APEX）法は、RNA分析のために発展させたもので、固相における、逆転写酵素によるDNA/RNAハイブリッドの単一ヌクレオチドプライマー伸長を含んでいる。
【０００８】
上述の方法はいずれも、複数の標的ポリヌクレオチド配列およびそのそれぞれの標的配列中のヌクレオチド変異の量を同時に分析し、測定することはできない。よって、それらの方法は、標的ポリヌクレオチド配列およびそれらの中のヌクレオチド変異の相対量の定量的な測定が可能ではなく、改変遺伝子の量と非改変遺伝子の量の割合の測定が可能ではなく、特に、それらの方法はいずれも、発現遺伝子およびそれらの中の変異のレベルの測定が可能ではない。しかしながら、上記の記載から明らかなように、診断を行う、処置応答を予測する、およびどの処置様式が最も効果的であるか、患者に最も適しているかを決定する際に、正確な結果を得ることは、現代医療において、とりわけ最も重要である。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明の目的は、特に、診断を行う、処置応答を予測する、または最も効果的な処置様式を選択する際に、正確な結果を得るための、方法およびそれらの方法に用いるための試験キットを提供することである。本発明は、多数のポリヌクレオチド配列を含むサンプルから、複数の標的ポリヌクレオチド配列およびそれらの標的配列に存在するヌクレオチド変異の量を同時に測定する方法を開示する。それ故に、本発明は、既定の遺伝子におけるヌクレオチド変異の測定のみならず、ヌクレオチド変異を有するそれら標的またはヌクレオチド変異を有さない標的の比率を同時に測定することも目的とする。標的は必ずしも遺伝子を表すとは言えないが、１以上の標的は一緒になって多くのヌクレオチド変異を有する遺伝子を表し得る。さらに、発現遺伝子産物を表すRNA配列に存在するヌクレオチド変異の比率は、発現されたペプチドまたはタンパク質（酵素を含む）の存在の有無を検出することにより得られるよりも初期の段階において測定することができる。本発明は、標的ポリヌクレオチド配列（標的）およびその中のヌクレオチド変異の、より多用途の発現パターンまたは転写特性を、同じサンプル溶液からそれらを同時に測定することによって決定する方法を提供する。同時に、非常に感受性が高く、堅固で、再現性ある試験であり、複数の標的の量の測定に加え、それらの標的のそれぞれにおける少なくとも１のヌクレオチド変異の量を同時に測定することが可能な試験を提供する。これらはすべて、ポリヌクレオチド配列の混合物中に複数の標的を含む可能性のある、水ベースのサンプル溶液、例えば細胞または組織ライセートから、ポリヌクレオチド配列を単離することなく、測定することができる。
【００１０】
本発明の方法は、遺伝性疾患または特定疾患に関する遺伝的素質の特異的かつ感度の高い診断が可能であり、特に発現事象および発現産物におけるヌクレオチド変異の存在についての情報を提供する。この方法は、遺伝性疾患の進行および発症の予測および処置の効力におけるまったく新しい局面を提供する。
【００１１】
従って、本発明に用いられる方法および試験キットの利点は、ゲノムDNAにおけるヌクレオチド変異の評価だけでなく、転写特性または発現パターンおよび発現過程において生じたヌクレオチド変異の同時評価が可能なことである。これらの結果は、特に疾患の発症の予後を判定する、および医学的処置の効力を評価する際に、医学およびヘルスケアの実践者によりなされる診断の結果に対して大きな影響を与える。
【００１２】
本発明の特に有利な点は、分析すべき調製物における標的の質が決定的に重要ではないことである。その不安定性のために、RNAse阻害剤を使用するなどの特別な処置を必要とすることが知られるRNAを、試験においてRNAをcDNAに変換することなく直接用いることができる。本発明の方法において、そのハイブリダイゼーション工程の後にその手続を中断してもよく、アフィニティータグを付けた標的を介して固体担体上に捕捉されるまたは結合する、アフィニティータグを付けた標的、例えばmRNA標的およびDNA（標的-検出プローブハイブリッドまたは複合体を含む）を含むサンプルを、比較試験のためのすべてのサンプルが収集され、自動的な分離と記録を同時に行う工程のための準備が整うまで貯蔵してもよい。その方法は、非常に順応性があり、堅固で、再現性がある。その方法は、完全に自動の、または半自動のアセンブリーにおいて用いられ得る。その手続はいくつかの段階において中断されてもよい。試薬または反応産物は、十分なデータが収集されるまで、またはその工程を続行するのがより便利になるまで保存してもよい。その方法は種々の規模または型式にて用い得る、すなわち試験管における試験としてだけでなく、マイクロリットル規模からナノリットル規模において行うようにさらに小型化してもよい。その方法は、様々な時間間隔にて種々の部位からサンプルを収集することができ、自動装置によって最終的に相対的な記録を行うために収集されたサンプルを貯蔵することができる。よって、記録された結果によって、収集され、貯蔵されたサンプルを同時に簡便に比較することができる。
【００１３】
本発明により、細胞または組織ライセートであり得る、測定すべき標的配列を含む未知のポリヌクレオチド配列の混合物を含む同じサンプル溶液から、複数の標的およびそれらの中のヌクレオチド変異の相対的な量を同時に測定することが可能となる。必然的に、ポリヌクレオチド配列は試験を行う前に単離してもよいが、そのことは必要ではない。本発明において、ヌクレオチド変異は好ましくは、１つまたはさらに数個のヌクレオチドを含む、少数のヌクレオチド変異、例えば、点突然変異、逆位（inversion）、欠失、置換である。しばしば、一塩基多型を生じるトリプレットが、測定すべきヌクレオチド変異の適切なサイズである。ヌクレオチド変異は、１以上の標的配列に存在し得、１以上の標的配列は、細胞または組織ライセートサンプルにおいて遺伝子を表し得る。従って、標的配列なる用語は、遺伝子の同義語として用いるためのものではない。本発明によると、遺伝子およびそのヌクレオチド変異は、いくつかの標的配列により表し得る。本発明において、１標的につきただ１つの所望の目的ヌクレオチド変異を測定することも典型的である。標的における所望のヌクレオチド変異の存在の有無の測定は定量化してもよく、標的が二倍体生物に由来する場合、ヌクレオチド変異のホモ接合またはヘテロ接合状態ならびにその発現レベルを測定することができる。
【００１４】
複数の標的およびヌクレオチド変異の量の測定は、標的にハイブリダイズした検出プローブを記録することによって実際に行う。それらの検出プローブは、ヌクレオチド変異のフランキング領域に相補的であるように設計する。本発明において、フランキングとは、ヌクレオチド変異を担持することが予期される部位に接触して隣接する（contiguously adjacent）またはそのごく近傍に位置する配列に、検出プローブが相補的であることを意味する。言い換えると、検出プローブが標的にハイブリダイズした場合、そのヌクレオチド変異は標的上の次のヌクレオチドに存在する。このことは、検出プローブが、１以上の隣接（contiguous）または連続（continuous）するヌクレオチド配列分伸長する（extendまたはelongate）と、伸長した検出プローブは、鋳型として用いられる標的に沿って所望のヌクレオチド変異を含有する部位上に形成されることを意味する。
【００１５】
本発明の方法により、異なる時点に、例えば特定の処置の前または後に、異なる部位または異なる標的生物から得られたサンプルにおいて起こった変化の簡単な比較評価ができる。ゲノム標的配列および発現配列から得られた結果を比較することにより、潜在的な修復機構の存在を検出することが可能である。これは、特に、生命過程および同じ細胞または組織に適用した物理的および化学的刺激の影響を研究する際に有用であり、いくつかの生物学的現象を同時に比較評価することができるが、何よりも、かかるヌクレオチド変異に関連する特定疾患に関する素因（predisposition）を診断するのに有用である。
【００１６】
本発明は、複数の標的とそれらそれぞれの標的の既定の部位または領域に存在するヌクレオチド変異との間の、相対的な量または比率を同時に定量的に測定することができる。特に、ゲノム配列がいくつかのヌクレオチド変異を有することが予期される場合、ハイブリダイゼーション反応が起こる状態に供する前に、それらの配列を断片化することが推奨される。また、二本鎖ゲノムDNAであり得る標的は、一本鎖にする。一本鎖mRNAは消化する必要はないが、特にゲノムDNA配列は、ハイブリダイゼーション反応の前に、例えばホモジナイズにより、または超音波処理により、または制限酵素またはヌクレアーゼによる処置により、機械的に断片化する。
【００１７】
その後それらの標的に、標的を捕捉する手段を与える。これは、ハイブリダイゼーションを行う前に、それらの標的に、好ましくはそれらの3'末端において、アフィニティータグ、例えばビオチンを与えることを意味し得るが、そのアフィニティータグ付けはハイブリダイゼーション反応の前または最中に、アフィニティータグを付けたプローブ、いわゆる捕捉プローブにより行ってもよい。その捕捉プローブは特異的または非特異的であり得る。特異的捕捉プローブを用いる場合、測定すべきそれぞれの標的には、独自の捕捉プローブが必要である。あらゆるポリアデニル化標的のために用いることができる非特異的捕捉プローブは、例えばポリ（dT）を含むプローブである。当分野において知られる非特異的化学アフィニティータグ付けを同様に用いてもよい。
【００１８】
本方法はいくつかの段階を含み、水ベースのサンプル溶液、例えば前処理した標的を含有する細胞または組織ライセートを加えることにより開始し、そのサンプル溶液は好ましくはハイブリダイゼーション溶液とともに、モル過剰の１より多い水溶性のまたは可溶化できる検出プローブ、および少なくとも１のアフィニティータグを付けたプローブを含む検出プローブのプール、ならびにアフィニティータグのカウンターパートにより被覆した固体担体に加える。
【００１９】
検出プローブはいくつかの既定の特性を有する。これらの特性は、それぞれの検出プローブが以下であることを含む：
（i）水ベースのサンプル溶液に可溶性である；
（ii）標的に対して過剰に存在する；
（iii）測定すべき標的における既定の配列に相補的である、ここでその配列は測定すべきヌクレオチド変位のヌクレオチドが直接後続する部位に位置する；
（iv）標的における既定の配列にハイブリダイズした検出プローブおよび伸長した検出プローブのそれぞれの区別可能な分離および記録が可能となる、既定の明確に異なるサイズを有する；
（v）測定すべきヌクレオチド変位における測定すべきヌクレオチド数よりも少なくとも１ヌクレオチド多い分サイズが異なる；
（vi）検出可能な標識によりトレーサータグ付けされている；および
（vii）プールの中の別の検出プローブとハイブリダイゼーション可能な相補的領域を持たない。
【００２０】
検出プローブおよび伸長した検出プローブのサイズが異なることにより、各検出プローブ上のトレーサータグまたは検出可能な標識の強度の区別可能な分離および記録が可能になる。種々の各検出プローブは、それらの標的におけるヌクレオチド変位の部位に隣接する隣接物（contiguous adjacency）に位置する既定の部位、領域または配列に相補的である。測定すべきヌクレオチド変位は通常、代謝物の在または不在を引き起こすことにより疾患または障害の原因となることが知られる変異である。しばしば、ヌクレオチド変異のホモまたはヘテロ接合状態を知ることが重要である。ヌクレオチド変異は、ホモまたはヘテロ接合状態および発現の程度に応じて異なる効果を有することが知られるので、適時に測定を行ってその有害作用を避けるために初期の段階でその存在を実証することが望ましい。プール中の検出プローブには、検出可能な標識またはマーカー、例えば、フルオロフォアまたは発色団であり、すべてのプローブについて同じであってもよい、トレーサータグを与えるのが好ましい。あるいは、種々の検出プローブのそれぞれは独自のトレーサータグを有してもよく、これにより区別可能な記録が可能となる。好ましくは、検出プローブの3'末端において鋳型として働く標的の5'末端に向かって酵素が補助する伸長が妨げられずに起こるように、検出プローブの5'末端にトレーサータグを付ける。標的にハイブリダイズする、標的に相補的な検出プローブの3'末端は、ヌクレオチド変異の部位のはじめのヌクレオチドに先行するヌクレオチドにおいて終わる。従って、その部位は、検出プローブと測定すべきヌクレオチド変異に相補的な領域の間の接合部を形成する。
【００２１】
ハイブリダイゼーション反応は、標的の選択された既定の領域上に安定なハイブリッドを形成させることができる条件において起こる。標的がポリアデニル化する場合、（例えば真核mRNAなど）、アフィニティータグは、好ましくは、ポリ（dT）プローブがハイブリダイゼーションすることにより3'末端に結合し、さらなるアフィニティータグ、例えばビオチンを担持してもよい。その標的はアフィニティータグを介して固体支持体上に固定されたアフィニティータグのカウンターパートに捕捉される。これにより、いずれかの標的上の相補的領域とハイブリダイズしたそれらの検出プローブは、結果として、アフィニティータグのカウンターパート、例えばアビジンにより被覆された固体担体、好ましくは磁性マイクロビーズに捕捉される。
【００２２】
ハイブリダイゼーション反応およびその後または同時に起こる固体支持体への結合の後には、非結合物質の１以上の洗浄および除去を含む精製が続く。洗浄された微小粒子を緩衝溶液に移し、そこで酵素が補助する伸長が起こる。標的がDNAである場合、酵素はDNAポリメラーゼであり、標的がRNAである場合、酵素は逆転写酵素である。緩衝溶液は、酵素の他に、酵素が補助する伸長反応に適用可能な形態の少なくとも１のデオキシヌクレオチド（dNTP）またはジデオキシヌクレオチド（ddNTP）、すなわちdATP、dTTP、dCTP、およびdGTPまたはddATP、ddTTP、ddCTP、およびddGTPを含む。ddNTPが別個の容器に存在する場合、ただ１つのヌクレオチドが各プローブに加えられ、容器および標的につきだた１つのヌクレオチド変異が測定できるが、プローブに後続するはじめのヌクレオチドは、それが何であれ、異なる容器から測定することができる。dNTPが異なる容器に存在する場合、はじめのヌクレオチドを伸長させることができるヌクレオチド変異のみが伸長する。他の容器において、プローブは伸長しない。はじめのヌクレオチドを伸長させ、同じタイプのヌクレオチドが続く場合、異なるヌクレオチドに遭遇するまで伸長させることができる。この場合、異なる標的上の異なるプローブは異なる容器において異なって伸長され得、比較可能な結果が得られうる。
【００２３】
異なるdNTPが全て同じ容器に存在する場合、溶液にdNTPが存在する限り伸長は起こるであろう。終止コドンとして働く１以上のddNTPを加える場合、伸長を無作為に停止させることができる。異なるサイズを有する検出プローブの分解能（resolution）および長さが、どの程度の量のヌクレオチドが結果の記録を妨げずに検出できるかを決定する。それ故に、終止コドンとして働く少なくとも１のddNTPと組み合わせて１より多いが４未満のdNTPを用いるのが便利である。dNTPまたはddNTPはトレーサータグを付けてもよい。特に、４つのddNTP全てが同じ容器に存在する場合、全ての検出プローブが１ヌクレオチド伸長し、それらは異なる検出可能な標識を有するトレーサータグを付けていなければヌクレオチド変異は区別できない。図2に示すように、ddNTPに異なる波長にて発光する異なるトレーサータグを与えた場合、それらは識別可能なように記録することができる。容器は、試験管、マイクロウェル、管状マイクロチャネルまたはマイクロ流体マイクロチップデバイスのリザーバーであり得る。
【００２４】
酵素が補助する伸長により、サンプル中の標的およびそれぞれの標的に存在するヌクレオチド変異の量の同時測定が可能となる。ハイブリッドの検出プローブの3'末端の直後に続くまたはフランキングするはじめのフリーのヌクレオチドである、標的の5'末端のはじめのヌクレオチドに応じて、酵素は、少なくとも１のヌクレオチドを含む溶液中において、検出プローブの3'末端に、１以上のヌクレオチドを、鋳型としての標的の5'末端に向かって組み込むことにより、検出プローブを伸長する。
【００２５】
好ましくは、試薬を含む非結合物質の除去によるさらなる精製が可能な固体支持体上において伸長を行う。しかしながら、検出プローブは同じ緩衝液内に遊離させることができるので、その後の洗浄による精製は必要でない。検出プローブは、適切な水溶液、例えばアルカリ性水酸化ナトリウムまたはカリウム溶液またはホルムアミドを含む変性させるための水または緩衝溶液中においてハイブリッドが一本鎖になることにより固体支持体から遊離し、その溶液から、遊離した検出プローブは直接分離され、記録され得る。標的に結合したアフィニティータグを付けた捕捉プローブまたはアフィニティータグを付けた標的は、固体支持体に結合した、または固定されたままであり、回収された溶液中に存在する検出プローブを含有する溶液から分離され得る。アフィニティータグを付けた捕捉プローブが結合した固体担体は不要物として除去しても、またはアフィニティータグを付けた標的を除去した後に再利用するために回収してもよい。標的とハイブリッドを形成し、それにより固体支持体上に捕捉された、それらの一本鎖の検出プローブのみが、一本鎖にされることにより可溶化し、分離および記録のために溶液から回収され得る。好ましくは検出可能な標識によりトレーサータグを付けた、各種一本鎖検出プローブは、直接、識別可能なように分離および記録し得る。たとえ、標的またはそれらのフラグメントが変性段階において遊離し、それにより溶液（この溶液の結果が記録される）中に存在するとしても、それらはトレーサータグが付いていないので、標的は記録を妨げないであろう。さらにそれらは不規則なサイズを持ち、検出プローブとして既定のサイズを持たないであろう。アフィニティータグを付けたプローブが検出プローブと同時に遊離した場合、それらは区別可能なサイズが与えられ、検出可能なトレーサータグを持たないので、検出を妨げないであろう。
【００２６】
標的およびヌクレオチド変異の測定された量の最終的な結果は、安定なDNAまたは修飾DNAから調製した、安定な、よく特徴決定された検出プローブにより記録された結果から、さらに、対照としてハウスキーピング遺伝子、および較正された記録装置および標準曲線を用いて、計算し得る。データは、市販のプログラムおよびコンピュータソフトウェアを用いて解析し、計算することができる。検出プローブは、標的上の、既定の選択された部位または領域に相補的である。同じプール内の検出プローブは一本鎖であり、互いに相補的でなく、互いにハイブリダイズしないように選択され、設計されるまたは調製される。ハイブリダイゼーション反応に用いられる過剰の検出プローブにより、ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーションに有利に働くほとんどの条件において完了するまで推進され、結果として検出プローブの量はサンプル中に元来存在する標的の量に化学量論的に対応する。検出プローブの量は、スペクトログラム、電位図などとしてグラフを使って記録され、その量は、グラフのピーク面積を市販購入し得るプログラムを用いて測定することによりグラフから算出され得る。その方法は非常に堅固で再現性がある。その結果は適切な対照を用いて較正し得る。
【００２７】
本発明の方法において用いられる試験キットは、検出プローブの混合物を有するプールを調製したことを特徴とし、ここでそれぞれの検出プローブは上記に規定の通りである。試験キットは、組み合わせのパッケージとして提供し、その組み合わせは、検出プローブの上記に規定のプール、パッケージに組み込まれたさらなる試薬、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応のための適用可能な条件および標的濃度とサンプル溶液を希釈するための適切なモデルを含む使用説明書を含む。例えば、サンプル溶液が細胞または組織ライセートである場合、どの程度の数の細胞を溶液中に含めるべきか、または含めることができるか、および試験において最適な結果を得るための希釈の仕方は、一般に知られている。試験キットは、テーラーメイド試験の容易な適応を可能とする他の市販購入し得る試薬を含み得る。試験キットは好ましくは組み合わせのパッケージとして提供し、その組み合わせは、所望の検出プローブの混合物を有するプールを含有する装置および使用説明書を含む。本発明の方法のための検出プローブのプールを設計する際に、プローブの選択がとりわけ最も重要であることに注意されたい。
【００２８】
試験キットのプールには、アフィニティータグを付けた捕捉プローブを含めてもよく、アフィニティータグのカウンターパートにより被覆された固体担体を含み得る。標的がmRNAである場合、アフィニティータグを付けた、例えばビオチンタグを付けたポリ（dT）含有捕捉プローブ（さらなるアフィニティータグを含有してもよい）は、検出プローブのプールに便利に供されるが、サンプル溶液とは別個にプールに加えてもよい。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、未精製の水ベースのサンプル、例えば細胞または組織ライセートから直接、標的ポリヌクレオチド配列（標的）およびそれぞれの標的中のヌクレオチド変異の量を同時に測定する方法に関するが、当然ながらポリヌクレオチド配列は単離し精製することができる。ヌクレオチド変異は、多数の異なる遺伝的変異、例えば、１以上のヌクレオチドの置換、逆位または欠失を含み得る。本発明の方法は、ゲノムDNAに存在する一塩基多型（SNP）または点突然変異を形成するヌクレオチドのトリプレットの相対的な量を同時に測定することが可能であるが、mRNAを含む発現産物の量の測定およびスプライシング変異体の検出に特に有用である。本発明の方法により、遺伝子における特定のヌクレオチド変異を担持する個体がそのヌクレオチド変異についてホモ接合またはヘテロ接合であるかどうかを決定するが可能である。この試験はこれらの遺伝子がいかに発現されるかを決定することによりさらに追跡することができ、さらにいくつかの修復機構を評価し得る。
【００３０】
本発明は、特に標的ポリヌクレオチド配列の発現パターンまたは転写特性およびその中のヌクレオチド変異を決定するための方法およびその方法に適用可能な試験キットを提供する。これにより、本発明の方法により、ゲノムDNAを含有するサンプルのみならず、発現事象および発現産物中のヌクレオチド変異の存在についての情報を提供するサンプルにも基づいた、疾患および特定疾患に関する遺伝的素質の、特異的な、感度の高い同時の診断が可能となる。この方法は、診断上の予後の判定にまったく新しい局面を提供する。従って、本発明の方法および試験キットの利点は、ゲノムDNAのヌクレオチド変異の評価のみならず、転写特性または発現パターンの評価および発現過程において生じるヌクレオチド変異の検出も可能であることである。これらの結果は、特に疾患発症の予後を判定する、および医学的処置の効力を評価する際に、医学およびヘルスケアの実践者によりなされる診断の結果に対して大きな影響を与える。
【００３１】
本発明は、再現性ある定量的な結果を提供することにより、ゲノミクスの治療への転換に特に有用である。本方法はゲノミクスにおいて便利であるだけでなく、発現されたゲノミクスにも適用することができ、これにより例えば遺伝子治療の効力を評価する際に有用な組み合わされた結果を提供し得る。信頼のおける有用な結果は病態生理学において得られうる。その方法は、ある個体が特定疾患の素因を有するかどうかの判定、適切な処置様式の選択、または特定の処置様式の除外、処置反応の予測などに有用である。今日、遺伝的原因が血管疾患、癌、肥満などを含む多数の疾患の背後に存在すること、これらの疾患の発生は遺伝学的因子のみならず、遺伝子の発現、および多くの調節因子にも依拠することが知られている。それ故に、本発明の方法は、多数のサンプルからの定量的な結果を提供することにより、ゲノミクスを治療に転換する効率的な堅固な方法を提供する。
【００３２】
本発明の方法によって、多重の遺伝子型の同定（ここで標的はゲノムDNA配列である）、および、複数の標的およびそれぞれの標的中のヌクレオチド変異の量の同時測定が可能となり、また、標的とヌクレオチド変異を有する標的との間の比率を測定することが可能であり、その比率は、測定すべき標的配列に存在する各ヌクレオチド変異のホモ接合またはヘテロ接合状態を示す。
【００３３】
本発明の方法はまた、アレル特異的発現の多重分析が可能であり、ここで標的は発現されたRNA配列であり、複数の標的およびその中のヌクレオチド変異の量により、標的の発現レベルに加えて、標的とヌクレオチド変異を有する標的との間の比率の測定が可能となる。
【００３４】
本発明の本質的部分である、サンプル中の標的の前処理、複数の既定の特性を有する検出プローブのプールまたは混合物を有するテーラーメイドの試験キットの調製を段階的に記載することにより、本発明を説明する。検出プローブは様々な目的のためのテーラーメイドの試験キットとして提供し得る。これらの準備段階は、サンプルおよびその中の標的の調製、検出プローブの選択および構築、および種々の分析目的に適する試験キットの最適な調製を含む。分析段階はすべてはじめ別個に記載するが、本発明のより実践的な実施形態において、いくつかの段階を組み合わせて同時に実行してもよく、これにより、自動システムに適用しやすい、単純化された非常に便利な分析を提供する。これらの方法は実施例において詳しく説明する。
【００３５】
準備段階
1. サンプルおよび標的ポリヌクレオチド配列の調製
1.1 サンプル調製
本発明において、標的ポリヌクレオチド配列およびそれらの標的中のヌクレオチド変異の量を、細胞または組織ライセートから直接、または単離されたゲノムDNAまたはRNA（これら自体は既知の方法によって単離される）から測定する。細胞から単離されたRNA、特にメッセンジャーRNAは、適切な実験条件（これ自体は既知の方法を用いる）において用いる（Sambrookら、1989、「Molecular cloning, a laboratory manual.（分子クローニング、実験室マニュアル）」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989）。あるいは、粗製のサンプルライセートを直接用いてもよい。標的ポリヌクレオチド配列が二本鎖、例えばゲノムDNAである場合、標的は既知の方法により一本鎖とする（Sambrookら、1989：「Molecular cloning, a laboratory manual（分子クローニング、実験室マニュアル）」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989）。ゲノムDNAを含むサンプルは、有利なように、サンプルのホモジナイズまたは超音波処理を含む機械的手段により、いくらか断片化してもよく（Sambrookら、1989、「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、実験室マニュアル）」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989）、それらの標的もハイブリダイゼーション反応を行う前に一本鎖にする。
【００３６】
本発明の方法は、測定すべき標的を含むポリヌクレオチド配列の混合物中の標的およびヌクレオチド変異の相対的な量を同時に測定するのに特に便利である。本方法はDNAおよびRNAの両方の量を測定するために独特であるが、RNA、特にメッセンジャーRNA（mRNA）におけるヌクレオチド変異の量を測定するのに特に有用である。例えばmRNAの不安定性のために、RNAを分析する方法は典型的には、RNAを対応するcDNAに転換するまたは変換する段階が必要である。この段階は本発明において完全に回避され、mRNAは、DNAまたは他の修飾ポリヌクレオチド配列からできている安定な検出プローブへのハイブリダイゼーションにより安定化される。というのは、標的ではなくそれらのプローブが測定されるためである。この安定化はハイブリダイゼーション段階においてなされ、ここでRNAを安定化する検出プローブとハイブリダイズさせる。RNAseおよびアルカリに感受性のmRNA標的が検出プローブにより安定化し得るという事実により、RNAse阻害剤または例えば熱によるRNAseの不活性化は必要ない。
【００３７】
1.2 標的のアフィニティータグ付け
標的
本発明の方法における標的は、サンプルに存在する分析物であるポリヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド変異を含んでいてもよいが、含んでいる必要はない。本方法は、メッセンジャーRNA（mRNA）標的の量（転写特性およびスプライシング現象を含む）の測定に特に有用である。特定の瞬間に、またはその後の時間間隔に、研究対象の細胞または組織に存在する発現産物を、便利に研究することができる。サンプルを既定の検出プローブを含むプールと接触させる前に、適切なアフィニティータグを担持するように標的を修飾しなければならないが、本発明のより便利な実施態様において、ハイブリダイゼーション反応過程においてそれらの標的にアフィニティータグを付ける。その場合、ハイブリダイゼーション溶液は、好ましくは標的の3'末端に相補的である、アフィニティータグを担持する捕捉プローブを含む。
【００３８】
mRNA標的は、当分野において知られる化学的な非酵素学的な工程を用いて、便利よくアフィニティータグを付ける、またはビオチン化する。光活性化した試薬であるフォトビオチンはこの目的に便利であり、市販購入し得る。RNAはcDNAに転写する、または標識化のために酵素学的に修飾する必要はないので、RNAは強い界面活性剤、例えばSDSにおいて調製し、維持してもよい。RNAseはSDSにより阻害されるので、インタクトなRNAを単離するのが容易である。サンプル中のmRNAの断片化は通常、重すぎなければ困難ではない。RNAフラグメントのサイズは捕捉能に影響しないであろうが、測定すべき所望のヌクレオチド変異の位置は、プローブを設計する際に考慮に入れるべきである。標的がゲノムDNAを含むサンプルである場合、DNAは好ましくは上記のようにホモジナイズするまたは超音波処理する。
【００３９】
アフィニティー対
アフィニティータグは、標識またはマーカーとして用いることができ、別の物質に高い親和性を有する物質である。互いに高親和性を有するかかる物質は、アフィニティータグとそれらのアフィニティータグのカウンターパートであり、互いにいわゆるアフィニティー対を形成する。アフィニティー対は互いに強い結合を形成する傾向にある物質である。アフィニティー対形成は、所望の物質を捕捉する手段として働く。好ましいアフィニティー対は、例えばビオチン-アビジンまたはビオチン-ストレプトアビジンであるが、他の合成または非合成アフィニティー対または結合物質も同様に適用してもよい。適切なアフィニティー対は、レセプターとリガンド、抗原と抗体間に、ならびにそれらのフラグメント間に見られ得る。
【００４０】
本発明において、少なくとも１のアフィニティータグを標的に与えなければならない。アフィニティータグ付けは、ハイブリダイゼーション反応の前または最中に行い得る。ハイブリダイゼーション中の立体障害を避けるために、アフィニティータグは、好ましくはアフィニティー対の、より小さいカウンターパート、すなわちビオチン、フォトビオチン、ヒスチジンオリゴマー、ハプテン、グリカン、オリゴヌクレオチド配列、例えば、オリゴ（dA）、オリゴ（dT）であり、一方、アフィニティー対の好ましいより大きなカウンターパート、アビジン、ストレプトアビジン、金属キレート、抗体、レクチンまたはヌクレオチドオリゴマーは、好ましくは本方法において用いられる固体担体を被覆するために用いる。
【００４１】
本発明の方法において、ハイブリダイゼーションが溶液中において起こることはとりわけ最も重要である。それ故に、ハイブリダイゼーション反応が起こる前に、化学反応（例えばビオチン残基が研究すべきポリヌクレオチド配列または核酸配列に共有結合し、修飾されたポリヌクレオチド標的、すなわちビオチン化標的が生じる）によって標的にアフィニティータグを付けてもよい。アフィニティータグは捕捉プローブ上に与えてもよく、標的のいずれかの末端にハイブリダイズすることができる捕捉プローブが好ましい。この捕捉プローブはさらなるアフィニティータグ、例えばビオチンを担持してもよい。標的がmRNAである場合、本発明の方法の固液相アッセイの本質的部分である固体支持体が、mRNAのポリ（dA）テールを捕捉し得るポリ（dT）配列により被覆されているならば、さらなるアフィニティータグを有する必要はない。
【００４２】
アフィニティータグを担持する捕捉プローブを用いて標的を末端標識化する場合、標的のアフィニティータグ付けをハイブリダイゼーション反応の前にする必要はなく、ハイブリダイゼーション反応と同時に行ってもよい。試験キットの同じプールにおいて所望のアフィニティータグを付けた捕捉プローブが他の検出プローブと一緒に提供され得る場合、これにより本方法のパフォーマンスはさらに単純化される。捕捉プローブは固体支持体上に集まり、その固体支持体上に残るが、可溶性検出プローブを含有する溶液は分離および記録のために回収されるので、捕捉プローブが測定を妨げる可能性はないことに留意されたい。
【００４３】
2. 検出プローブの調製
本発明の方法において、複数の標的は、標的にハイブリダイズした安定な検出プローブを記録することにより実際に測定されるが、標的-検出プローブハイブリッドが化学量論的に形成されるために、記録された検出プローブの量はサンプルに本来存在する標的の量に実際に対応する。検出プローブの混合物を有するプールを作製する場合、適切かつ有用なプローブの選択はとりわけ最も重要である。従って、分析段階に先行する本発明の最も重要な段階は試験キットのための検出プローブの調製である。これらの準備段階において、適切な検出プローブを選択し、設計する。
【００４４】
本発明において、検出プローブは、プローブが固定化された形態にて、例えば、いわゆるマイクロアレイ系にて提供される系とは対照的に、可溶性である。本発明は定量的な方法であり、化学量論的なハイブリダイゼーション反応を妨げる立体障害を回避することが重要である。それ故に、検出プローブは、特異的な固定化されたプローブを適用するマイクロアレイ系とは対照的に、可溶性の形態または可溶化できる形態にて提供する。このことは、プールの中のプローブ混合物が、例えば凍結乾燥された形態にて提供され得る、またはマイクロタイタープレートのウェルの底にゆるく結合していてもよいことを意味する。検出プローブは、水ベースの溶液に可溶性である。このことは、サンプル溶液を水溶性の検出プローブに加えると、検出プローブが溶解し、ハイブリダイゼーション反応が起こる時に検出プローブが溶液であることを意味する。
【００４５】
プローブ
いくつかの異なる検出プローブの混合物を調製し、検出プローブのプールを提供する。１以上のプールを試験キットとして用いてもよい。検出プローブの特徴は、特許請求の範囲および明細書の他の場所に規定されている。
【００４６】
異なるサイズ
本発明の方法を実行可能にするための必須条件の１つは、同じプール中に混合物として存在する異なる検出プローブが区別可能に分離され、記録され得ることである。可溶性の検出プローブまたは可溶化できる検出プローブは、明確に異なるサイズを有することを特徴とし、これにより質量スペクトル分析法またはキャピラリー電気泳動により記録するための、正確かつ区別可能な分離および／または同定が可能となる。検出プローブの特異的配列がおおよそ同じサイズである場合、それらに分離を可能にするポリヌクレオチド配列を含む非特異的領域を与えてもよい。本発明の検出プローブは好ましくはオリゴヌクレオチド配列である。本発明において、オリゴヌクレオチド配列は、本発明において用いられ、典型的には20〜200のヌクレオチドを含むあらゆるプローブを意味する。それらはオリゴヌクレオチド配列が通常有すると考えられているよりも多いヌクレオチドを有する。検出プローブは、少なくとも15ヌクレオチド以上、好ましくは20ヌクレオチド以上、最も好ましくは少なくとも25ヌクレオチド以上の様々なサイズを有する。上限は、必要な分解能、プールに存在する異なるプローブの数、伸長されるプローブに組み込まれることが予期されるヌクレオチド数を含む、いくつかの因子により決まる。非常に長いプローブを用いるにあたっての制限要因は、より長いプローブを合成する費用、および、それらが断片化された標的と混合される要因となりうる望まれない相互作用およびミスマッチの増大した危険性である。上記の要因は、同じプールに存在すべき検出プローブの混合物を設計する際に考慮に入れるべきである。プローブサイズの簡便な上限は約200ヌクレオチド、好ましくは100ヌクレオチド、最も好ましくは50ヌクレオチドである。例えばヌクレオチド変異が１または２のヌクレオチドを有することが予期される場合、分解能が１ヌクレオチドである場合のプローブ間のサイズの差異は、それぞれ１または２ヌクレオチドよりも多くなければならない。
【００４７】
より短い検出プローブ配列は、例えば以下の判断基準を有するコンピュータプログラムにより設計され得る：プローブ長の範囲30−50 nt；融解温度範囲60−75℃；GC％範囲40−60％；設計されるプローブ配列と同一のヒトゲノムのいずれかの部分の配列の最大長の基準は約17 ntであるべきである；ヒトゲノムのいずれかの部分の配列のプローブ配列に対する最大類似性の基準は80％であるべきである；プール中のプローブ間のサイズの最小の差異は2ntであるべきである。より長いプローブが用いられる場合は、別の基準に従わなければならない。短い検出プローブおよび長い検出プローブの両方が用いられる場合、判断基準は標準化しなければならない。テキストブックおよび研究室ハンドブックに情報が提供されている。
【００４８】
検出プローブの十分な分解能は、本方法において必要条件である。本発明の方法における分解能は、わずか２ヌクレオチド分異なる検出プローブ間にて区別し得る程度に高くあるべきである。ヌクレオチド変異を同時に分析する場合、検出プローブは、伸長に組み込まれることが予期されるヌクレオチド数よりも多いヌクレオチド分サイズが異なるのが好ましい。図3に示す結果は1-3ヌクレオチドの組み込みを示している。その場合、プール中の検出プローブのサイズは少なくとも４ヌクレオチド分異なるべきであるが、わずか１ヌクレオチドの伸長を検出すべき場合、プローブ間のサイズの差異は、より小さくてもよい。２ヌクレオチド程度の小ささでも可能である。一般に、プローブのヌクレオチドのサイズまたは数の差異は、ヌクレオチド変異において測定されるであろうヌクレオチド数より少なくとも１ヌクレオチド多くあるべきであると言ってもよい。
【００４９】
検出プローブが必要とする相補性配列
本発明の方法のための検出プローブを選択するための別の必要条件は、それぞれの検出プローブが標的上の既定のよく特徴決定された領域に相補的であることである。プールのための可溶性検出プローブは、好ましくは標的において既定の領域に基づいて合成的に調製する。これらの部位、領域または配列は、可能性ある既知のヌクレオチド変異に隣接する隣接物内にあるように選択する。このことは、検出プローブが、予期されるヌクレオチド変異のごく近傍に位置し、標的-検出プローブハイブリッドが１以上のヌクレオチドの組み込みにより伸長される際に隣接するまたは連続する配列を形成する、標的上の領域に相補的であることを意味する。言い換えると、相補的な標的上のプローブの位置が、標的中のヌクレオチド変異上に、隣接するまたは連続する伸長された配列または伸長された検出プローブが形成されることを可能にする。検出プローブの伸長により、フランキング標的配列中の１以上のヌクレオチド変異の存在の有無の検出が可能となる。
【００５０】
安定なDNAプローブ
国際公開第02/055734号パンフレットは、多くは既に特徴決定されているか、将来特徴決定されるであろう所望の種々の生物から適切な検出プローブを調製する方法を開示している。本発明の方法のための検出プローブは、オリゴヌクレオチド合成、PCR増幅を用いることにより、または所望のヌクレオチド数を有する所望の配列を適切な制限部位を有するプラスミドに挿入し、適切な微生物をそのプラスミドにより形質転換し、組み込まれたプラスミドが増殖した際に所望のプローブを放出することによる組換えDNA技術により、合成的に調製する。特定の目的において、全体的にランダム化された配列を有する検出プローブを合成することが可能である。現在の当業者であれば、適切なオリゴヌクレオチドプローブを作製する多数の方法を知っている。
【００５１】
特徴決定されていないゲノムからのプローブ
好ましくは、検出プローブは既知の特徴決定された配列に基づいて設計するが、本発明の検出プローブは、国際公開第2002/055734号パンフレットに記載の、部分的に特徴決定された、または特徴決定されていない配列に基づいて設計してもよい。
【００５２】
修飾プローブ
検出プローブのセットを合成的に調製する場合、修飾されたポリヌクレオチドプローブを調製するのも便利であり、その場合、ヌクレオチド配列の糖リン酸骨格をペプチド結合により置換してもよく、またはいわゆるロックドヌクレオシド類似体から作製してもよい。修飾ポリヌクレオチドは、例えば、例えば国際公開第96/20212号パンフレットに記載のペプチド核酸（PNA）または例えば国際公開第99/14226号パンフレットに記載のロックド核酸（LNA）である。それらの修飾ポリヌクレオチドプローブを本発明の方法および本発明の方法に用いられる試験キットに適用してもよい。それらはゲノムDNAまたはcDNAを鋳型として用いて複製してもよい。しばしば、これらの修飾プローブは、改善された安定性を含む改善された特性を有し、それらは正常なDNAプローブよりも容易にトレーサータグが付られるという利点も有し得る。
【００５３】
適用可能なプローブ
本方法は、基礎研究に有用なツールであるが、その主要な有用性は、特定の標的およびその中のヌクレオチド変異の存在の有無を同時に判定するための便利な試験を提供することであり、これにより対象が疾患に関して遺伝的素因を有するかどうかが結論づけられる。本方法はまた、特定の治療が所望の効果を奏したかどうかを結論づけるのにも有用である。本発明を、ヒトゲノムに基づいて選択され設計された２つのプローブを用いて例証した。これらの２つの検出プローブは、GAPDH（配列番号1）およびPRSS1（配列番号2）である。
【００５４】
診断に有用な検出プローブ
本発明の目的は、遺伝性疾患を引き起こすヌクレオチド変異の存在の有無を検出するアッセイを提供することである。点突然変異により引き起こされるよく知られた遺伝性疾患は、鎌状赤血球貧血、β地中海貧血症、フェニルケトン尿症、血友病α1抗トリプシン欠乏症であり（Antonarkis, 1989, New England J Med, 320, 153-163）、嚢胞性線維症を挙げてもよい。特定の疾患に関する素因に相関する多形性の例は、アポリポタンパク質E遺伝子の３つの対立遺伝子多型である（Mahley, 1988, Science, 240, 622-630）。微生物の点突然変異は、改変された病原性または抗生物質または治療に対する耐性を導き得る。これらの遺伝子の変異を開示する従来技術に精通する当業者であれば、これらのゲノムの変異を検出するのに適切なプローブを容易に選択できるであろう。
【００５５】
トレーサータグ
プールに存在する検出プローブは異なるサイズを有し、これにより質量スペクトル分析法による記録が可能となるが、本発明の好ましい実施形態において、検出プローブに、プローブの直接のまたは別の試薬と接触した後の検出または記録を可能にするトレーサータグ、すなわち標識またはマーカーを与える。検出プローブすべてを同じトレーサータグによりタグ付けしてもよいが、検出プローブのプールを調製する場合、それぞれのプローブが独自のトレーサータグを有するプールおよび試験キットを提供することも可能であり、これによりプールの中の各検出プローブの識別可能な記録が可能となる。本発明において、トレーサータグまたはタグは検出プローブの5'末端に位置する。標的およびヌクレオチド変異の定量的な記録に不可欠であり検出プローブの3'末端において起こる伸長反応をトレーサーが妨害するのを防ぐためには、かかる5'末端にタグを付けた検出プローブが好ましい。
【００５６】
検出プローブはトレーサータグを用いて記録し、それらの電気化学的または磁気的特性、蛍光、発光、放射活性、赤外吸収に基づいて、または酵素反応によって記録してもよい。主に、自動の手段または装置により容易に記録可能であり、ハイブリダイゼーション反応を妨げない、いずれかのトレーサータグを用い得る。それらには、伸長反応の最中に、検出可能な標識によりトレーサータグを付けてもよいが、その場合、本来の標的にもトレーサータグを与えなければ、検出できないことに注意されたい。
【００５７】
蛍光に基づく技術において、特に有用なトレーサータグまたは標識は、蛍光色素およびフルオロフォア、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、フィコビリタンパク質（phycobiliprotein）、シアニン色素、またはこれらの色素の代わりになるよう設計されたいずれかの色素によるものである。
【００５８】
フルオレセイン塩には、例えばフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、3-o-メチルフルオレセインホスフェート、フルオレセインアミン、フルオレセインジアセテート、フルオレセインカプロエート、フルオレセインジラウレート、フルオレセインジプロピオネート、フルオレセインジ-β-D-グルクロニド、フルオレセインジ-β-D-ガラクトシド、フルオレセインマーキュリックアセテート、5-カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ-6-カルボキシ-フルオレセイン（TET）、ヘキサクロロ-6-カルボキシ-フルオレセイン（HEX）、5-カルボキシフルオレセイン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、5-カルボキシフルオレセイン-X-N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル、5-カルボキシフルオレセインジアセテートまたは5-ヨードアセトアミドフルオレセインなどがある。
【００５９】
ローダミン塩は、ローダミン-B-イソチオシアネート、スルホローダミン、5(6)-テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、6-カルボキシ-ローダミン、5(6)-アミノテトラメチルローダミン（5(6)-アミノTMR）、5(6)-カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、5(6)-カルボキシテトラメチルローダミン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、5(6)-カルボキシテトラメチル-ローダミン-X-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、5(6)-ヨードアセトアミド-テトラメチルローダミン（IATR）、x-ローダミンイソチオシアネート（XTRITC）、またはローダミンのスルホニルクロリド誘導体（Texas Red）を含む。
【００６０】
ピレン塩には、例えばピレンスルホニルクロリドまたはカスケードブルー（Cascade Blue）色素などがある。シアニン色素はCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5またはCy7色素を含む。フィコビリタンパク質には、例えばフィコエリスリン（PE）、例えばR-PE、フィコシアニン、例えばC-PC、およびR-PC-IIまたはアロフィコシアニン（APC）などがある。
【００６１】
他の潜在的に有用な蛍光性標識には、1,5-IAEDANS（N-(ヨードアセトアミノエチル)-1-ナフチルアミン-5-スルホン酸）；メチルインドキシルまたはその塩、例えば、N-メチルインドキシルアセテートまたはN-メチルインドキシルミリステート；ウンベリフェリルまたはその塩または誘導体、例えば、4-メチルウンベリフェリルカプリレート、4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼ、MUG（4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニド）、4-メチルウンベリフェリルホスフェートまたは4-メチルウンベリフェリルスルフェート；NDA（ナフタレンジアルデヒド）；OPD（o-フタルジアルデヒド）；Quantum色素；ヨウ化プロピジウム；キナクリンマスタードジヒドロクロリド；SITS（4-アセトアミド-4'-イソチオシアノスチルベン-2,2'-ジスルホン酸）；DIDS（4,4'-ジイソチオシアナトスチルベン-2,2'-ジスルホン酸、二ナトリウム塩）；5(6)-カルボキシエオシンまたはその塩、例えば、5(6)-カルボキシエオシンジアセテートまたは5(6)-カルボキシエオシンジアセテート-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル；アクリジンオレンジヘミ亜鉛（hemizinc）塩（塩化亜鉛を有する5(6)-アクリジンジアミン）；NBDクロリド（7-クロロ-4-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾール）；ピリジルオキサゾール；ベンゾキサジアゾール；CTC（5-シアノ-2,3-ジトリルテトラゾリウムクロリド）；ABTS（2,2'-アジノ-ジ-3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸、二アンモニウム塩）；アミノナフタレン；ダンシルクロリド（5-ジメチルアミノ-1-ナフタレンスルホニルクロリド）；DAPI（4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド）；エリスロシンまたはその塩、例えば、エリスロシンアミンまたはEITC（エリスロシンイソチオシアネート）；臭化エチジウム；クマリン類、例えば、AMCA（7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸）またはマリーナブルー（Marina Blue）（6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリンフルオロフォアに基づく）；BODIPY；オレゴングリーン（Oregon Green）；マレイミド、ルシファーイエロー（Lucifer Yellow）、ポルフィリン、PerCP（ペリジニンクロロフィルタンパク質）またはベルジアンレッド（Beljian Red）などがある。
【００６２】
有用な蛍光性の標識には、２以上の発色団または合成発色団の組み合わせもある。タンデム型のコンジュゲートには、例えばPE-APC、PE-テキサスレッド（Texas Red）、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、APC-Cy5.5、APC-Cy7またはPerCP-Cy5.5などがある。合成発色団には、例えば人工光合成分子などがあり得る。
【００６３】
蛍光性標識は様々な商業的供給源から得ることができる。Molecular Probesから得られる様々なAlexa Fluor（登録商標）色素（スルホン酸化クマリンおよびローダミンに基づく標識）が上記の色素のいくつかの代わりになるように設計されている。
【００６４】
発色団および色素原は可視光と強く相互作用する物質であり、酵素反応において種々の比色分析の最終産物を産生する。色素原基質には、分子、例えば、o-ニトロフェノール-β-D-ガラクトピラノシド、クロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド、ニトロブルーテトラゾリウムと5-ブロモ-4-クロロインドリルホスフェートまたは3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンなどがある。化学発光基質には、アクリジニウム（acridium）エステル、アダマンチル1,2-ジオキセタンアリールホスフェートまたは5-置換類似体、ルミノールまたは他の環状ジアシルヒドラジド類などがある。
【００６５】
他の潜在的に有用なトレーサータグには、希土類金属標識（ランタニド、イットリウムまたはクリプチウム（cryptium）を含む）または放射性標識、例えば、32P、14C、35S、125Jなどがあり得、これらは十分なシグナルを提供し、十分な半減期を有する。
【００６６】
検出プローブのプールを作製する際に、化学的手段、例えば、増幅すべき核酸配列に特異的な、標識化したまたはタグを付けたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術によって、プローブをトレーサーまたは標識により直接標識することができる。複数の分子の標識、例えば3×FITCまたは5×FITCタグのプライマー配列への組み込みにより、検出段階においてより高い強度が得られる。標的配列のPCR増幅のためのプライマーおよび条件を設計する方法は当業者によく知られている。標識化したプライマーは商業的供給源から得ることができる。PCR過程における直接的な標識化のための適切なヌクレオチドは市販購入し得る。それらには、デオキシヌクレオチド、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン-イソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、ローダミングリーン（Rhodamine Green）、シアニン-3、シアニン-5、BODIPY、クマリン、テキサスレッド、オレゴングリーンまたはカスケードブルーにより標識化したdUTPなどがある。色素の直接的な組み込みにより、増幅されたDNA産物の低レベルの標識化が生じ得る。標識化効率は、アミノアリルdUTPをPCR産物に導入し、次に色素を修飾PCR産物に化学的にカップリングすることにより改善され得る。直接的な標識化は、DNAコンストラクトを単離または合成した後に、当分野において知られる方法によって、例えばニックトランスレーションによって行ってもよい。
【００６７】
3. 試験キットの調製
プール
本発明の試験キットは、測定すべき標的の量に対して過剰に存在する可溶性または可溶化できる検出プローブの混合物を含む１つのプールまたは複数のプールを含む。プールはいずれかの種類の容器に組み込むことができ、完全に分離していてもよく、または固定されていない様式、または強固に固定された様式のいずれかにて連結されていてもよい。その最も単純な形態において、プールは１以上の容器、例えば試験管または瓶を含み、固定されていない様式にて例えば試験管立てにおいて一緒に連結されていてもよい。強固に固定された様式にてともに連結された容器内に入れられたプールの実践的な例には、マイクロタイタープレート上のコンパートメントまたはウェルがある。可溶性のプールは、各プールが明確に同定可能であり、検出プローブのその含有量が分かっている様式にて体系化する。コンパートメントまたはウェルを有するマイクロタイタープレートが典型的であり、市販購入し得る実施形態において、多数のプールを簡便に同時に取り扱うことが可能である。複数のコンパートメントを有するテーラーメイドの便利なプールを開発し、作製し、適切なマークおよび使用説明書を提供してもよい。
【００６８】
プールは、既定の可溶性のまたは可溶化できる検出プローブのサブセットまたはライブラリーである。試験キットのそれぞれのプールは、随意的に定義された数の検出プローブを含む。プールにおける検出プローブの数は常に１より多い。便利な随意的な数は、おおよそ5または10の異なる検出プローブである。しかしながら、本方法はわずか２または３の検出プローブを用いて行うこともできる。上限は分解能によって決まる。短い検出プローブを用いる場合、プール中の検出プローブの量の都合よい上限は約50〜60のようであるが、より良い分解能を得るためには、その数はプールあたり50〜60検出プローブより少なくするべきである。オリゴヌクレオチドプローブのみならず、より長いポリヌクレオチドも試験において検出プローブとして用いてもよいが、数個のプローブを含むプールにおいては、長いポリヌクレオチドプローブは、調製のために時間を消費し、費用が高くつくだけでなく、長いプローブは、ミスマッチ、環形成および上述のような他の問題を引き起こす可能性がある。それ故に、特に、ヌクレオチド変異が示されるべきである本発明において、より短いプローブを用いるのが好ましい。
【００６９】
有利には、検出プローブは、同じプール中の検出プローブが互いにハイブリダイズすることによってハイブリダイゼーション反応を妨げるようなことがなく、かつ区別可能に記録されるように異なるサイズを有するように設計すべきである。１より多い検出プローブからなる混合物を含むプールを、本発明の方法に容易に適用可能な試験キットを調製するのに用いる。
【００７０】
上述のように、試験キットに用いられる検出プローブのプールは、好ましくはDNAフラグメントであり、好ましくは鋳型としてゲノムDNAまたはRNA配列を用いて調製される。検出プローブは、特徴決定された、部分的に特徴決定された、または特徴決定されていないmRNAから複製されたcDNAであり得る。検出プローブは化学的に合成してもよく、それらはPCR反応および適切なプライマーを用いて増幅することにより作製してもよく、また上述のように合成的に都合よく産生してもよく、また所望の制限酵素によって切断することにより異なるサイズにしてもよい。
【００７１】
試験キットは検出プローブの混合物を含むプールを有することを特徴とし、検出プローブは、標的内の既定の配列と相補的である検出プローブの配列、それらの区別可能なサイズ、トレーサータグなどにより識別され得る。試験キットのプールは、検出プローブに加え、アフィニティータグを付けた捕捉プローブおよび／またはアフィニティータグのカウンターパートにより被覆された固体担体を含んでも含まなくてもよい。試験キットは、プールに存在しないが、別個の試薬として提供される他の成分を含んでもよく、それらも他の供給源から市販購入し得る。しかし、これらの補助試薬の存在により、試験キットを異なるテーラーメイドの用途に容易に適応させることができる。
【００７２】
上記のように、試験キット中のプールは、アフィニティータグを付けた捕捉プローブを含んでもよく、それらは通常検出プローブが遊離した後に固体担体上に残り、再利用され得るので、検出プローブの記録を妨げない。さらに、それらにトレーサータグは付与されず、蛍光、発光などに基づく記録を妨げない。アフィニティータグを付けた捕捉プローブのサイズは検出プローブのサイズと異なるので、たとえ質量スペクトル分析法を用いて記録されても区別され得る。
【００７３】
本発明の方法において、標的-検出プローブハイブリッドは固体支持体上に捕捉される、または結合する。本発明の液体固体相ハイブリダイゼーション溶離方法において、固体担体は、たとえそれらが別個に供給され得るとしても、試験キットにおいて不可欠な構成要素であり、他の供給源から市販購入できる。固体担体は好ましくは磁性マイクロビーズであり、用いられるアフィニティータグのカウンターパートにより被覆される。言い換えると、アフィニティータグがビオチンである場合、カウンターパートはアビジンである。ビオチンおよびアビジンは適切な好ましいアフィニティー対を形成する。固体支持体の被覆は化学的手段により達成され、場合により単純に、固体支持体の表面とアフィニティータグのカウンターパートの間の静電気的な親和性が、安定な結合に十分である。
【００７４】
固体担体は通常、マイクロビーズ、ラテックス粒子、微小粒子、糸状のもの、釘状のもの、スティック、マイクロウェルまたはアフィニティーカラム、凹部またはリザーバーの壁であり、これらにアフィニティータグのカウンターパートを提供する、またはカウンターパートにより被覆する。必要に応じて、固体支持体は磁性体であり、または粒子を移動させる手段、例えば相分離、電気泳動または他の手段を含んでもよく、アフィニティータグのカウンターパートの存在に依拠し得る。
【００７５】
分析段階
本発明は、粗製の細胞または組織細胞ライセート中の１以上の標的およびそれらの標的に存在するヌクレオチド変異の量を同時に測定する方法に関する。本方法は、区別可能であり、そのごく近傍にヌクレオチド変異を有することが予期されるゲノムまたは遺伝子内の領域に相補的である検出プローブを記録することにより行う。検出プローブはアフィニティータグを付けた標的へのハイブリダイゼーションにより固体担体上に捕捉される。捕捉されたハイブリッドを洗浄した後、捕捉されたハイブリッドをデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下において伸長を行うことができる逆転写酵素またはDNAポリメラーゼと接触させ、酵素が補助する伸長を行う。検出プローブを再度洗浄した後、検出プローブは溶離し、区別可能に分離され、記録され得る。すべてのヌクレオチドに、明確に異なるトレーサータグを与えてもよく、これらも別個に記録され得る。
【００７６】
段階1−溶液ハイブリダイゼーション
一本鎖にされ、ビオチン、ヒスチジンオリゴマー、ハプテンまたはグリカン、オリゴヌクレオチド配列、オリゴ（dA）またはオリゴ（dT）のようなタグによりアフィニティータグ付けした標的の混合物を含むサンプルを、適切なハイブリダイゼーション溶液とともに検出プローブのプールに加える。あるいは、一本鎖にされた標的の混合物を含むサンプルを、アフィニティータグを付けたプローブをさらに含む検出プローブのプールに加える。ハイブリダイゼーション反応を起こさせる。サイズおよび標的上の選択された領域に相補的なそれらの既定の配列により区別可能な検出プローブ、を、テーラーメイドの試験キットとして便利に提供する。これにより、可溶性の、必要に応じてトレーサータグを付けた安定な検出プローブプールのそれぞれを、アフィニティータグを付けた一本鎖標的調製物のアリコートおよび適切なハイブリダイゼーション溶液と接触させる。それぞれのプールの区画、例えばマイクロタイタープレート上のウェルまたはマイクロ流体マイクロチップデバイス上の凹部もしくはリザーバーにより確保された少量の自由溶液中においてハイブリダイゼーションを起こさせる。
【００７７】
適用可能なハイブリダイゼーション条件は従来技術において知られている。一般に、溶液ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーションをハイブリッド形成に向けて推進する条件下において起こる。過剰のプローブを使用するとハイブリダイゼーションが完了するまで推進される。その方法は非常に堅固で再現性がある。それ故に、研究室ハンドブックおよびテキストブックから知られるいずれかのハイブリダイゼーション、洗浄および遊離条件が適用できる。最も好ましい条件は、試薬、標的によって変動し、容易に最適化し得る。再現性ある結果を得るために、相対評価のための条件は標準化すべきであり、反応物に最もよく合うように適応させるべきではないことに注意されたい。
【００７８】
ハイブリダイゼーション条件には、例えばSambrookら、2001（「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「Preparation and Analysis of Eukaryotic Genomic DNA（真核生物ゲノムDNAの調製および分析）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、第3版、pp 6.50-6.64、2001；「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「Extraction, Purification, and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells（真核生物細胞からのmRNAの抽出、精製および分析）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、第3版、pp 7.42-7.50、2001；「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「Working with synthetic oligonucleotide probes（合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる実験」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、第3版、pp 10.35-10.37、2001）または他の研究室マニュアルに記載されているものがある。標的の100-200以上のヌクレオチドからなるDNAプローブとのハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシー条件、すなわち完全なハイブリッドの算定融解温度Tmより低い20-25℃の温度におけるハイブリダイゼーションにて通常行われる。
【００７９】
工程2−分離段階
上記のように、標的-プローブ複合体またはハイブリッドは、ハイブリダイゼーション反応過程において形成される。トレーサータグを付けた検出プローブとアフィニティータグを付けた標的間に形成された標的-プローブハイブリッドを収集する本発明の方法に、上記の固体担体が必要である。アフィニティー対のより大きなカウンターパート、例えば、アビジンにより被覆された固体担体、例えば、マイクロビーズ、特に磁性微小粒子を、ハイブリダイゼーション溶液に加える、またはプールに供する。いずれの標的にもハイブリダイズしなかった検出プローブを含む捕捉されなかった物質をすべて除去するために、捕捉されたハイブリッドを洗浄してもよい。固体担体は、捕捉を助け、固体担体が一方の溶液から他方の溶液に移動するのを助ける、磁性微小粒子、例えばラテックスビーズであり得る。
【００８０】
アフィニティータグを付けた標的により、ハイブリッドは固体支持体に結合する。プローブと標的のハイブリッドに存在するそれらの検出プローブのみが、固体担体上に集められる。非結合物質、細胞片、アフィニティータグを付けた標的配列上のいずれのマッチする配列にもハイブリダイズすることができなかった、またはマッチ配列を発見できなかった検出プローブを含む過多のプローブを含まないように、集まった標的-検出プローブハイブリッドを洗浄してもよい。
【００８１】
洗浄は、低い塩濃度（例えば0.1×SSC）、Tmより低い12-20℃の温度にて行う。標的、特に100-200ヌクレオチド以上のRNA標的のための典型的な条件は、Sambrookら、1989（「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「Extraction, Purification, and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells（真核生物細胞からのmRNAの抽出、精製および分析）」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、2001）の7.42-7.50頁に掲載されている。それ故に、ハイブリダイゼーション後のハイブリッドの洗浄は、プローブがその標的配列から解離しないように素早く行うべきである。オリゴヌクレオチドプローブのための有用なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、Sambrookら、2001（「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「Working with synthetic oligonucleotide probes（合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる実験）」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、2001）の10.35-10.41頁に掲載されている。
【００８２】
段階3−酵素が補助するプローブの伸長
ハイブリダイゼーション反応および洗浄段階の後、固体担体上に捕捉された標的-プローブハイブリッドを伸長のための緩衝溶液に移す。伸長緩衝溶液は、１以上のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下、標的の5'末端に向けて二本鎖ハイブリッドを伸長し得る酵素を含む。これにより、検出プローブは、標的を鋳型として用いて１以上のデオキシヌクレオチドまたは１つのジデオキシヌクレオチドにより伸長する。伸長緩衝液は、全部で４つのデオキシヌクレオチド、すなわちdATP、dTTP、dCTPおよびdGTPまたは全部で４つのジデオキシヌクレオチド、すなわちddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPまたはそれらの組合せを含んでもよい。試薬は使用説明書とともに市販購入し得る。
【００８３】
酵素が補助する伸長において、酵素はDNAの複製を補助するDNAポリメラーゼであり得る。それらの酵素は、鋳型として用いられるDNA鎖の標的鎖と並ぶデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。重合した分子は鋳型鎖に相補的である。標的がRNAである場合に用いられる酵素はRNA依存性DNAポリメラーゼとしても知られる逆転写酵素であり、これは一本鎖RNAを二本鎖DNAに転写するDNAポリメラーゼ酵素である。これらの酵素およびともに用いられる緩衝液は、例えばSambrookら、2001（「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「In Vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction（ポリメラーゼ連鎖反応によるイン・ビトロにおけるDNAの増幅）」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、2001、pp. 8.18-8.24およびpp. 8.46-8.53）に掲載されている。あるいは、酵素の製造者により推奨される条件において伸長反応を起こさせる。ハイブリッドのそれぞれの検出プローブの3'末端に直接後続する、標的上の最後のフリーのヌクレオチドに依拠して、逆転写酵素は、前記４つの溶液の少なくとも１つにおいて１以上のヌクレオチドを加えることによりプローブを伸長させる。
【００８４】
段階4−洗浄
検出プローブ（伸長されている、または伸長されていない、すなわち、検出プローブはそれらの元来のサイズを有する、または１以上のヌクレオチドにより伸長されている）を有する、固体支持体上に捕捉された標的-プローブハイブリッドは、非結合ヌクレオチド、酵素および他の非結合物質を除去するために洗浄してもよいが、精製は必要なく、それ故に、遊離段階に直接移行することを薦める。
【００８５】
段階5−ハイブリッドからの検出プローブの遊離
洗浄後、ハイブリッドを切断する、すなわち標的とプローブを一本鎖にする溶液により固体支持体上のハイブリッドを溶離させることによって、伸長されている、または伸長されていない検出プローブを遊離させる。かかるアニーリング条件は、ホルムアミドまたはアルカリ性溶液、例えば水酸化ナトリウムまたはカリウムにより提供される。アフィニティータグを付けたプローブが結合した固体支持体は溶液から機械的に分離してもよく、その後、溶液は検出プローブのみを含むことになる。必要であれば一本鎖DNAを、沈殿させ、洗浄してもよい。標的配列からの検出プローブの溶離は、ハイブリッドの分離を補助し一本鎖核酸を生じる条件において行われる。かかる条件は、例えば、ホルムアミド、非常に低い塩濃度の緩衝液、アルカリ性の水または緩衝液を用いて達成し得る。標的からの検出プローブの分離は、上昇した温度（30℃以上）を用いることにより促進され得る。好ましくは緩衝液は後のキャピラリー電気泳動および検出において用いることができるようなものであるべきである。
【００８６】
段階6−結果の記録
一本鎖にされた検出プローブを電気泳動緩衝液に加える。好ましくは、電気泳動が先に用いた緩衝液により直接行われ、種々の検出プローブが同時に記録され得るような条件を用いるべきである。伸長されたまたは伸長されていないDNAの検出プローブをハイブリッドから溶離させ、次にそれらのサイズに基づいてキャピラリーまたはゲル電気泳動により分離させ、その後記録する。
【００８７】
段階7−記録結果および検出プローブの量の計算
次に、検出プローブの量は、グラフ上のピークの領域を外挿し、結果を適切な対照によって較正することにより、グラフから計算することができる。検出プローブにトレーサータグを付けた場合、同じであっても異なっていてもよい適切なトレーサータグ、例えば蛍光性の標識のシグナルを記録する種々の装置を用いて記録し得る。市販のシステムを結果の記録および計算に利用できる。
【００８８】
段階8−記録結果の解釈および標的の量の計算
記録された検出プローブは過剰に存在していたので、ハイブリダイゼーション反応は完了するまで進められていた。結果として、固体担体に捕捉されたそれらの検出プローブは、サンプル中に存在するすべての相補的標的領域にハイブリダイズしたと想定され得る。それ故に、標的およびヌクレオチド変異の量は、測定された検出プローブおよびそれらの伸長の量に対応する。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図1は、本発明による方法の原理を模式的に説明する。標的（1）（この場合RNAであるが一本鎖となったDNAもあり得る）は、ハイブリダイゼーション反応過程において、トレーサータグ（2.1）を担持するトレーサータグを付けた検出プローブ（2）およびアフィニティータグ（3.1）を担持するアフィニティータグを付けた捕捉プローブ（3）に結合する。ハイブリダイゼーションにおいて形成される多くの可能性あるハイブリッドのうちのただ１つを示す。ボックス（4）の標的プローブ複合体またはハイブリッドは、アフィニティータグを付けた捕捉プローブ（3）を介して、磁性球体またはビーズ（5）の表面に結合する。同一サンプルが、逆転写酵素（E）を有する緩衝溶液をそれぞれ含有し、ヌクレオチドdATP、dTTP、dCTPまたはdGTPのいずれかをさらに含む４つの容器に移される。プローブの3'末端のAGGTG末端に隣接する隣接物における標的（1）の5'末端のはじめのフリーのヌクレオチド（この場合ヌクレオチドG）に応じて、逆転写酵素（E）がそのプローブを１以上のヌクレオチド（この場合dCTPを含有する緩衝溶液中において下線を引いたヌクレオチドC）伸長する。dATP、dTTPまたはdGTPを含有する他の溶液において、伸長は起こらない。
【図２】図2は、本発明による方法の別の実施態様の原理を模式的に説明する。ハイブリダイゼーション反応において形成される多くの可能性あるハイブリッドのうちのただ１つを示す。標的（1）（この場合はRNAであるが、一本鎖DNAもあり得る）は、溶液中におけるハイブリダイゼーション反応過程において、検出プローブ（2）、およびアフィニティータグ（3.1）を担持するアフィニティータグを付けた捕捉プローブ（3）に結合する。ボックス（4）の標的-プローブ複合体またはハイブリッドはその後、アフィニティータグを付けた捕捉プローブ（3）を介して磁性球体（5）の表面に結合する。サンプルを逆転写酵素（E）を含有する緩衝溶液に移す。溶液は、それぞれが（6.1）、（6.2）、（6.3）または（6.4）として示された異なるトレーサータグを有し終止コドンとして働く４つのジデオキシヌクレオチド、ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPのすべてを含む。標的（1）の5'末端においてハイブリッドにフランキングするはじめのフリーのヌクレオチド（この場合ヌクレオチドG）に応じて、検出プローブの3'末端のAGGTG末端が逆転写酵素（E）により伸長され得るように、１ジデオキシヌクレオチド、ddCTPがハイブリッドに付加される。検出プローブ（2）において伸長されたCに下線を引いている。
【図３】図3は、（トレーサータグの強度を記録する）本発明の方法を用いてキャピラリー電気泳動のピークとして得られた結果を示す。この実験において、大腸菌（E. coli.）からの既知の配列と混合された結腸癌細胞株（COLO205）からのライセートを含有するサンプルにおいて、３つの異なるプローブ配列（1、2および3）を用いて、ヌクレオチド変異を同定した。図3は、ヌクレオチドdGTPおよび逆転写酵素の存在下において行われた伸長反応の結果を示す。さらなる詳細については図1の説明文を参照のこと。 （1）とマークしたはじめのプローブ（配列番号3）は、イン・ビトロにて転写され陽性ハウスキーピング対照としてハイブリダイゼーション反応に加えられた既知の大腸菌配列（1-traT）に相補的である。他の２つのプローブは、ヒトゲノムにおいて既知の配列に相補的である。これらのプローブはGAPDH（配列番号1）およびPRSS1（配列番号2）であり、それぞれ（2）および（3）とマークしている。 図3において、ピーク（1）は上記に規定の対照プローブ配列番号3からのものであり、ピーク（1B）は２つのdGTPヌクレオチドにより伸長されたプローブ配列番号3からのものである。ピーク（2）はプローブ配列番号1からものもであり、ピーク（2B）は１つのdGTPにより伸長されたプローブ配列番号1からのものである。ピーク（3）はプローブ配列番号2からのものであり、ピーク（3B）は３つのdGTPヌクレオチドにより伸長されたプローブ配列番号2からのものである。dGTPとの反応後、ピーク（1）およびピーク（2）は、逆転写酵素により伸長されていない対照プローブ配列番号3およびプローブ配列番号1の残分である。プローブ配列番号2の残分のピーク（3）は、伸長段階後のdGTP溶液中において検出されなかった。３つのRNAレベルの量はピーク（1−3）および（1B−3B）の面積に基づいて算出することができ、プローブの3'末端に隣接する隣接物におけるはじめのフリーのヌクレオチドがいずれであるかは、プローブが伸長した反応により明らかになった。はじめのヌクレオチドが伸長されない場合、伸長されたプローブは形成されない。80-100％のプローブが正しい反応溶液中において伸長されたので、２つの別のNTPによりプローブを伸長することができる場合において、ポリヌクレオチドのレベルを高精度にて定量化するすることが可能である（ヘテロ接合体、実施例4を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本発明を以下の実施例により例証する。
【実施例１】
【００９１】
発現されたRNA中の１ヌクレオチドの同定
本実施例は、それぞれの標的-検出プローブハイブリッドに後続する１以上のヌクレオチドを同時に同定することにより、結腸癌細胞株COLO205の粗製ライセートから３つのmRNA標的分子を定量的に測定することを実証する。２つのmRNA標的分子は、セリンプロテアーゼをコードするヒト遺伝子PRSS1およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードするGAPDHであった。第３のmRNA標的はイン・ビトロにおいて転写された大腸菌traT遺伝子であり、陽性対照として用いた。
【００９２】
1．準備段階
プローブプールの調製
用いた結腸癌細胞株に存在する２つの既知のヒト遺伝子、
PRSS1、プロテアーゼ、セリン、1（トリプシン1）、NM_002769.2および
GAPDH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、NM_002046.3
のためにプローブ配列を設計した。
大腸菌traT RNA配列を同定する対照プローブを設計した。
【００９３】
プローブ配列はコンピュータプログラムにより以下の判断基準を用いて設計した：プローブ長範囲30-50 nt；融解温度範囲60-75℃；GC％範囲40-60％；設計されるプローブ配列と同一のヒトゲノムのいずれかの部分の配列の最大長の基準は17 ntであった；プローブ配列に対するヒトゲノムのいずれかの部分の配列の最大の類似性の基準は80％であった；プール中のプローブ間のサイズの最小の差異は2ntであった。これらの判断基準を用いて以下のプローブを設計した。
【００９４】
プローブ配列（配列番号1）
5' AGCACAGGGTACTTTATTGATGGTACATGACAAGGT 3'
は36ヌクレオチドを有し、GAPDHグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、NM_002046.3およびそのヌクレオチド変異を検出するために用いた。
【００９５】
プローブ配列（配列番号2）
5' CCTCAAGGAAGCCCACACAGAACATGTTGYTGGTAATCTTTCCA 3'
は44ヌクレオチドを有し、PRSS1プロテアーゼ、セリン、1（トリプシン1）、NM_002769.2およびその中のヌクレオチド変異を検出するために用いた。
【００９６】
プローブ配列（配列番号3）
5'ACCACACGGGTCTGGTATTTATGCT 3'
は25ヌクレオチドを有し、イン・ビトロにて転写された大腸菌traT mRNA、EMBL:ECPTRAT、アクセッションX14566およびその中のヌクレオチド変異を検出するために用いる。
【００９７】
GAPDHおよびPRSS1プローブはMetabionによって合成されたものであり、traTプローブはApplied Biosystemsによるものであった。これらのプローブを１つのプール中に混合した。
【００９８】
陽性対照として用いる大腸菌mRNAの調製
大腸菌traT（EMBL:ECPTRAT、アクセッションX14566）RNAを、ハイブリダイゼーションにおいて陽性対照として用いた。
PCRプライマー（配列番号4）および（配列番号5）
5' CTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGAAAAAATTGATGATGGTおよび
5' TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-CAGAGTGCGATTGATTTGGC
（Metabion、Martinsried、Germany）を用いて、大腸菌DNAからT7プロモーター配列および25 nt長Tテールを含有する鋳型を合成した。この鋳型から、MEGAscript転写キット（Ambion、Austin、TX）を製造者が推奨するように用い、T7-RNAポリメラーゼによりイン・ビトロにてtraT RNAを転写した。合成されたtraT RNAを、Agilent BioanalyserおよびRiboGreen RNA定量化キット（Molecular Probess、Leiden、The Netherlands）により製造者が推奨するように定量した。
【００９９】
細胞ライセートの調製
ヒト結腸癌細胞株COLO205を96ウェルプレートにおいて培養した。おおよそ10×104の細胞を96ウェルプレートの12ウェルに加え、10％FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび1％グルタミンを含有するRPMI 1640成長培地100μl中、37℃、8％CO2にて24時間培養した。24時間後、溶解緩衝液100μl：1×TE（10 mMトリス-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5）中0.5％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）により細胞を溶解させた。溶解緩衝液により処理した細胞をシリンジの針に通した。
【０１００】
ハイブリダイゼーション
4 pmolのアフィニティータグを付けたビオチン化オリゴ（dT）アフィニティープローブ（Promega）、1 pmolの6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）により標識化したプローブGAPDHおよびPRSS1、および１つの2,7',8'-ベンゾ-5'-フルオロ-2',4,7-トリクロロ-5-カルボキシ-フルオレセイン（NED）により標識化したtraT プローブ、5×SSC（750 mM塩化ナトリウム、75 mMクエン酸ナトリウム）、0.2％SDS、1×デンハート（Denhardt）溶液（0.02％フィコール（Ficoll）、0.02％ポリビニルピロリドン、0.02％BSA）、および1.5 fmolのイン・ビトロにて転写した大腸菌traT mRNAを含有するハイブリダイゼーション緩衝液に細胞ライセート100μlを移した。96ウェルPCRプレート（ABgene、Epsom、UK）において60℃にて、650 rpmで振盪しながら30分間ハイブリダイゼーションを行った（サーモミキサーコンフォート（Thermomixer Comfort）、Eppendorf、Hamburg、Germany）。
【０１０１】
親和性による捕捉、プローブ伸長、洗浄および溶離
親和性による捕捉、プローブ伸長、洗浄および溶離を含む、ハイブリダイゼーション後の段階は、96ウェルプレートにおいて室温にて磁性ビーズ粒子プロセッサKingFisher 96（Thermo Electron、Vantaa、Finland）により以下のように自動化して行った：
1）50μgのストレプトアビジンにより被覆したMyOne DynaBeads（Dynal、Oslo、Norway）にハイブリダイズしたRNA標的の、親和性による捕捉（30分間）；
2）0.1×SSC、0.1％SDS 150μlにおいて1.5分間２回ビーズを洗浄する；
3）2 mM Mg2Cl、2.4 U/μl M-MuLV RNaseH−転写酵素（F-572L、Finnzymes）およびM-MuLV反応緩衝液（F-577B、Finnzymes）中の0.4 mMのいずれかのdNTP：dATP、dTTP、dCTPまたはdGTPを含有する４つのいずれかの溶液（総体積50μl）中において、37℃にて30分間ビーズをインキュベーションする；
4）0.1×SSC、0.1％SDS 150μl中においてビーズを1.5分間２回洗浄する；および
5）ハイブリッドを一本鎖にするホルムアミド（Applied Biosystems）10μlにより37℃にて20分間プローブを溶離させる。
【０１０２】
溶離液はABI PRISM 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems、Foster City、CA）を用いてキャピラリー電気泳動によって分析した。検出プローブのサイズによる分離を較正するために、GeneScan-120LIZ size standard（Applied Biosystems）を各サンプルに加えた。プローブの同一性は泳動速度およびピーク領域による量によって決定した。
【０１０３】
結果は図3に示すとおりであった。
【実施例２】
【０１０４】
単一の反応容器におけるヌクレオチド変異の同定
標的およびプローブの調製は、実施例1に記載の通りであるが、アフィニティータグが付けられ、固体支持体上にハイブリダイズし、捕捉され、洗浄された１以上の標的ポリヌクレオチド配列を含有するサンプルを、逆転写酵素を含有し、それぞれ明確に異なるトレーサータグにより標識化した成分、ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPの全てをさらに含む緩衝溶液に移す（図2）。標的の5'末端上のプローブの3'末端に直接後続するフリーのヌクレオチドに応じて、逆転写酵素は溶液中において１以上のプローブを１ヌクレオチド分伸長させる。ddNTPが組み込まれると、ddNTPは3位の炭素原子上にH原子を含有する（dNTPはその位置にOH原子を含有する）ので、伸長反応は止まる。この場合、ハイブリダイゼーションに用いられるポリヌクレオチド配列に相補的なプローブにトレーサータグを付ける必要はないが、トレーサーを逆転写酵素によるプローブ伸長の最中に組み込む。溶離の後、伸長されたプローブを好ましくはキャピラリー電気泳動により定量化し、プローブの3'末端に後続するヌクレオチドがいずれであるかはトレーサータグの種類から明らかである。結果を実施例1に記載のように表し、計算する。
【実施例３】
【０１０５】
嚢胞性線維症膜貫通制御因子遺伝子（CFTR）の発現を定量化する方法の使用、および嚢胞性線維症（CF）を引き起こすCFTR中の一塩基多型（SNP）の同定
嚢胞性線維症（CF）は、常染色体劣性の様式にて遺伝する一般的な致死性の遺伝的障害である。病原性のCFTRの突然変異のホモ接合体または複合ヘテロ接合体を有する個体はCFに罹患しており、CFの疾患表現型は、異なる程度の膵臓不全を伴う重度から軽度の肺疾患と様々である（Lee et al., Mutation research (2005), 573, 195-204）。現在のところ、CFTRの1000以上の突然変異が記録されている。CFTR遺伝子のいくつかの突然変異、例えば、F508del（最も一般的）、394delTT、G542X、N1303は、重症のCF表現型を伴い、高い疾患浸透率を示す。
【０１０６】
本発明に記載の方法を用いて、その中に種々のCF関連ヌクレオチド変異を有すると同定された、例えば各種ヒト組織から収集されたサンプル中のCFTR遺伝子のアレル特異的発現を測定する。
【０１０７】
準備段階
細胞ライセートの調製
はじめに、組織サンプルを、例えばホモジナイズにより小さな粒子サイズに破壊する。得られた小さな粒子を含むサンプル物質を実施例1の結腸癌細胞株サンプルと同様に溶解させる。
【０１０８】
プローブプールの調製
5以上の異なるCF疾患関連ヌクレオチド変異または突然変異（例えばF508del、1540A/G、394delTT、G542X、N1303K）の同定に用い得るCFTR mRNAの位置に結合するように、5以上のオリゴヌクレオチドプローブを設計する。対応するCFTR遺伝子配列変異／突然変異の同定に用い、１つのプールにまとめるべきプローブ配列には以下のものがあり得る。
【０１０９】
F508del
プローブ
5'-GTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAA（配列番号6）
は29ヌクレオチドを有し、突然変異F508del、すなわち1652と1655の間の3bpの欠失の検出に用いる。
【０１１０】
標的配列：
野生型配列は
TCATCTTTGGTGTT（配列番号7）
であり、CFを引き起こすF508del突然変異は
TCA...TTGGTGTT（配列番号8）
であり、ここで...は3つの欠失ヌクレオチドの部位を示す。
【０１１１】
1540A/G
プローブ配列番号9は、1540A/G ヌクレオチド変異の検出のためのプローブであり、コドン470（M470/V470）におけるメチオニン／バリン多型を同定し、配列
5'-TACCCTCTGAAGGCTCCAGTTCTCCCATAATCA
を有する。
【０１１２】
標的配列：
1540A（コドン470にメチオニン）は
TAATGATGATTA（配列番号10）であり、
TAATGGTGATTA（配列番号11）
は1540G（コドン470にバリン）である。
【０１１３】
394delTT
プローブは
5'-GAGAGGCTGTACTGCTTTGGTGACTTCCCCTAAATAT（配列番号12）
である。このプローブは、394delTT、配列の394位の２つのT塩基の欠失の検出のために用いる。
【０１１４】
標的配列：
野生型は、
TCTTTTTATATTTAGGGGAAGTCACC（配列番号13）であり、
TCTTT..ATATTTAGGGGAAGTCACC（配列番号14）
は、CFを引き起こす２つのT塩基の欠失、394delTT突然変異を有する配列であり、ここで2つのドット..は２つの欠失したT塩基を示す。
【０１１５】
G542X
プローブは、
5' ATTCTTGCTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTCTC（配列番号15）
であり、G542Xヌクレオチド変異の検出のために用いる。
【０１１６】
標的配列：
野生型は、
TTCTTGGAGAAGGTGGA（配列番号16）であり、
TTCTTTGAGAAGGTGGA（配列番号17）
は、CFを引き起こすG542X突然変異を含有する。
【０１１７】
N1303K
プローブは
5' GCAACTTTCCATATTTCTTGATCACTCCACTGTTCATAGGGATCCAA（配列番号18）
であり、N1303Kの検出のために用いる。
【０１１８】
標的配列：
野生型は、
GAAAAAACTTGGATC（配列番号19）であり、
GAAAAAAGTTGGATC（配列番号20）
は、CFを引き起こすN1303K突然変異を含有する。
【０１１９】
プローブの長さの差異により、１つのプールにおいて質量スペクトル分析法のキャピラリー電気泳動を用いてそれらを同定することができる。
【０１２０】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応は、CFを引き起こすヌクレオチド変異を検出するために標的化した、蛍光標識を有するまたは有さない上記のプローブを用いて、実施例1に記載のように行う。
【０１２１】
親和性による捕捉、プローブ伸長、洗浄および溶離
親和性による捕捉、プローブ伸長、洗浄、溶離は、実施例1に記載のものと同様に行う。１つのプールにまとめられたプローブの検出は、キャピラリー電気泳動または質量スペクトル分析法を用いて行う。
【０１２２】
結果：
各プローブにおいて、３つの可能性ある結果が存在する。
1．野生型ホモ接合体、すなわちサンプルは研究された変異の野生型配列を有するCFTR mRNAのみを含有し、測定した伸長されたプローブの量により定量化し得る。
2．変異型ホモ接合体、すなわちサンプルは研究された変異の変異型配列を有するCFTR mRNAのみを含有し、測定した伸長されたプローブの量により定量化し得る。
3．ヘテロ接合体、すなわちサンプルは野生型および変異型CFTR mRNA配列の両方を含有し、その比率は伸長されたプローブの量によって定量化し得る。これはCF疾患の診断において用い得る。発現比は疾患の重症度の予測にも用いられ得る。さらに、異なるアレルの組織特異的発現が種々の組織から収集されたサンプル間にて比較し得る。各標的ヌクレオチド変異についての具体的な結果を以下に詳しく記載する。
【０１２３】
F508del
野生型ホモ接合体：プローブは１つのdATPにより伸長する。
F508delの変異型ホモ接合体：プローブは１つのdTTPにより伸長する。
ヘテロ接合体：プローブは１つのdATPまたは１つのdTTPのいずれかにより伸長する。これらの２つの異なって伸長したプローブの比率により２つのアレル（野生型および変異型配列）の相対的発現が明らかになる。
【０１２４】
1540A/G
VV470（1540A）のホモ接合体：プローブ配列は２つのdCTPにより伸長する。
MM470（1540G）のホモ接合体：プローブ配列は１つのdTTPにより伸長する。
VM470（1540A/G）のヘテロ接合体：プローブ配列は２つのdCTPまたは１つのdTTPのいずれかにより伸長する。これらの２つの異なって伸長したプローブの比率により、２つのアレル（野生型および変異型配列）の相対的発現が明らかになる。
V470多型は疾患を引き起こす変異ではないが、他の軽度のCFTR変異を伴うV470 は疾患の原因となり得る。
【０１２５】
394delTT
野生型ホモ接合体：プローブは５つのdTTPにより伸長される。
394TTのホモ接合体：プローブは３つのdTTPにより伸長する。
ヘテロ接合体：プローブは３つのdTTPまたは５つのdTTPのいずれかにより伸長する。これらの２つの異なって伸長したプローブの比率により、2つのアレル（野生型および変異型配列）の相対的発現が明らかになる。
【０１２６】
G542X
野生型ホモ接合体：プローブは１つのdCTPにより伸長する。
G542Xのホモ接合体：プローブは３つのdATPにより伸長する。
ヘテロ接合体：プローブは３つのdATPまたは１つのdCTPのいずれかにより伸長する。
これらの２つの異なって伸長したプローブの比率により、2つのアレル（野生型および変異型配列）の相対的発現が明らかになる。
【０１２７】
N1303K
野生型ホモ接合体：プローブは１つのdGTPにより伸長する。
N1303Kのホモ接合体：プローブは１つのdCTPにより伸長する。
ヘテロ接合体：プローブは１つのdCTPまたは１つのdGTPのいずれかにより伸長する。これらの２つの異なって伸長したプローブの比率により、2つのアレル（野生型および変異型配列）の相対的発現が明らかになる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞または組織ライセートであり得るサンプル溶液から直接、複数の標的ポリヌクレオチド配列およびその中のヌクレオチド変異の量を、複数の検出プローブとの親和性を補助する溶液ハイブリダイゼーションおよび酵素が補助するその検出プローブの伸長を用いて、同時に測定することができる方法に関する。本発明はまた、パッケージ形態にて、既定の特性を有する検出プローブの混合物および試薬を含むプールを有する装置、ならびにその方法を行うための説明書を含む試験キットを開示する。この方法および試験キットの様々な診断目的のための使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
利用可能な遺伝子情報、および、その情報の、分子生物学、ヘルスケア、処置様式、医薬的研究、疫学的研究などに対する影響の急速な増大に対する反応として、今日の科学的な関心は、遺伝子の主要な要素ならびにそれらの生物学的な役割および機能の細胞効果に焦点が置かれている。遺伝学における基本的な主要な要素に関連する新しい情報の蓄積は減速しているが、遺伝子、それらの発現産物および発現に有効な因子の生物学的な役割、ならびに病気および健康に対する発現遺伝子の影響を研究する欲求は、確実に増大している。
【０００３】
生命過程に関連する情報を取り扱い、バイオサイエンスに蓄積するバイオインフォマティクスは、数値的に正確な方法にてコンピュータ処理し、取り扱うことができる形態であるべきである。様々な標的ポリヌクレオチド配列およびそれらのヌクレオチド変異の発現に対する様々な外部刺激の効果および潜在的重要性の素早い評価がバイオインフォマティクスに望まれる。これにより、標的ポリヌクレオチド配列のみならずその中のヌクレオチド変異（点突然変異、ヌクレオチド変異、一塩基多型などを含む）の、効果および生物学的な役割の、素早く正確な、好ましくは定量的な評価を可能にする新たなツールに対するおびただしい需要が生まれた。様々な疾患および障害に関する素質（disposition）およびそれらの疾患および障害の原因または処置様式を診断する際に、これらのヌクレオチド変異および様々な細胞および組織におけるそれらの発現の影響は、望ましい対象である。この技術の周辺においてかなりの市場が成長したが、多用途で、かつ定量的な特性を提供する新たな方法を開発することが依然として望まれる。転写特性は、生命科学の基礎研究の多くの領域における科学者に用いられるだけでなく、産業的な研究および開発においてもしばしば利用される。ヒトおよび実験動物の遺伝子発現に対する既知の薬物および新規な薬物の効果は、病院およびヘルスセンターを含む、医薬品産業および診断に関する産業ならびにヘルスケアにおいて今や不可欠な知識であるが、バイオ産業の、食品産業、農業および林業を含むいくつかの他の部門も受益者となるであろう。
【０００４】
転写特性における強力なツールはオリゴマーチップ技術であり、これは多数の標的ポリヌクレオチド配列の同時検出を可能にする。主にバックグラウンドのノイズにより、マイクロアレイの識別力が不十分であるために、定量的な結果を得るのに十分な精度をもって結果を比較するのはしばしば不可能である。
【０００５】
一方、マイクロアレイ系に代表されるハイブリダイゼーション技術は非常に大きく発展したが、その技術の新たな用途も創出されてきた。ゲノミクスまたは発現されたゲノミクスの治療への転換を含む、これらの新たな用途により、再現性のある定量的な結果を提供するより正確な方法の必要性が生まれた。現在、遺伝的因子が血管系の疾患、癌、肥満などを含む多数の疾患の要因であることが知られている。これらの疾患の発症は、遺伝性のゲノム因子のみならず、遺伝子の発現、ならびに遺伝子およびそれら遺伝子の発現の程度を調節する多くの因子にも依拠している。それ故に、ゲノミクスを治療に転換する際に必要な方法は、定量的であり、発現レベルの変化の測定が可能でなければならないが、同時に、堅固で（robust）再現性があり多数のサンプルを取り扱うのに適用できることに加え、実施が容易であるべきである。これらの問題のいくつかは、より効率的なマイクロアレイ系を開発することにより挑戦されてきたが、固相ハイブリダイゼーションに基づくマイクロアレイを、液相において行い溶液ハイブリダイゼーションと固相吸着-脱離反応とを組み合わせる、溶液ハイブリダイゼーション法に置き換えることによっても対応されてきた。
【０００６】
標的ポリヌクレオチド配列の量を測定するための、かかる定量的かつ高感度な方法は、米国特許出願公開第20040053300号および20060035228号明細書に記載されている。転写分析のための多重の（multiplexed）方法は、Kataja et al., 2006, J. Microbiol. Methods, 67: 102-113に記載されている。その方法の多重性は、キャピラリー電気泳動により分離された、明確に異なるサイズを有する検出プローブを用いることにより得られる。しかしながら、これらの方法において、ゲノミクスまたは発現されたゲノミクスを治療に転換する際に重要な、ヌクレオチド変異を定量する方法は記載されていない。
【０００７】
標的ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド変異を測定するために開発された第１の方法のひとつは、ゲノムDNA中のヌクレオチド変異のみがアッセイされるものであった。これらの方法の1つ、いわゆるミニシーケンシング法は、米国特許出願公開第20030082530号および20030082531号明細書に開示されている。米国特許出願公開第200300129589号明細書は、質量スペクトル分析法を用いて突然変異および他の診断マーカーを検出するDNAシーケンシング法を提供している。プローブライゲーションを用いることによるポリヌクレオチドサンプルにおける複数の核酸配列の存在の有無は、米国特許第5,514,543号明細書において開示されている。米国特許出願公開第200500214825号および200400121342号明細書ならびに国際公開第02/33126号および2004/063700号パンフレットにおいて開示されている方法は、サンプル中の複数のポリヌクレオチド配列を検出する方法を記載している。Pirrung et al., 2001, Bioorg. Med. Chem. Lett., 11: 2437-2440に開示されている整列化プライマー伸長（Arrayed Primer Extension）（APEX）法は、RNA分析のために発展させたもので、固相における、逆転写酵素によるDNA/RNAハイブリッドの単一ヌクレオチドプライマー伸長を含んでいる。
【０００８】
上述の方法はいずれも、複数の標的ポリヌクレオチド配列およびそのそれぞれの標的配列中のヌクレオチド変異の量を同時に分析し、測定することはできない。よって、それらの方法は、標的ポリヌクレオチド配列およびそれらの中のヌクレオチド変異の相対量の定量的な測定が可能ではなく、改変遺伝子の量と非改変遺伝子の量の割合の測定が可能ではなく、特に、それらの方法はいずれも、発現遺伝子およびそれらの中の変異のレベルの測定が可能ではない。しかしながら、上記の記載から明らかなように、診断を行う、処置応答を予測する、およびどの処置様式が最も効果的であるか、患者に最も適しているかを決定する際に、正確な結果を得ることは、現代医療において、とりわけ最も重要である。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明の目的は、特に、診断を行う、処置応答を予測する、または最も効果的な処置様式を選択する際に、正確な結果を得るための、方法およびそれらの方法に用いるための試験キットを提供することである。本発明は、多数のポリヌクレオチド配列を含むサンプルから、複数の標的ポリヌクレオチド配列およびそれらの標的配列に存在するヌクレオチド変異の量を同時に測定する方法を開示する。それ故に、本発明は、既定の遺伝子におけるヌクレオチド変異の測定のみならず、ヌクレオチド変異を有するそれら標的またはヌクレオチド変異を有さない標的の比率を同時に測定することも目的とする。標的は必ずしも遺伝子を表すとは言えないが、１以上の標的は一緒になって多くのヌクレオチド変異を有する遺伝子を表し得る。さらに、発現遺伝子産物を表すRNA配列に存在するヌクレオチド変異の比率は、発現されたペプチドまたはタンパク質（酵素を含む）の存在の有無を検出することにより得られるよりも初期の段階において測定することができる。本発明は、標的ポリヌクレオチド配列（標的）およびその中のヌクレオチド変異の、より多用途の発現パターンまたは転写特性を、同じサンプル溶液からそれらを同時に測定することによって決定する方法を提供する。同時に、非常に感受性が高く、堅固で、再現性ある試験であり、複数の標的の量の測定に加え、それらの標的のそれぞれにおける少なくとも１のヌクレオチド変異の量を同時に測定することが可能な試験を提供する。これらはすべて、ポリヌクレオチド配列の混合物中に複数の標的を含む可能性のある、水ベースのサンプル溶液、例えば細胞または組織ライセートから、ポリヌクレオチド配列を単離することなく、測定することができる。
【００１０】
本発明の方法は、遺伝性疾患または特定疾患に関する遺伝的素質の特異的かつ感度の高い診断が可能であり、特に発現事象および発現産物におけるヌクレオチド変異の存在についての情報を提供する。この方法は、遺伝性疾患の進行および発症の予測および処置の効力におけるまったく新しい局面を提供する。
【００１１】
従って、本発明に用いられる方法および試験キットの利点は、ゲノムDNAにおけるヌクレオチド変異の評価だけでなく、転写特性または発現パターンおよび発現過程において生じたヌクレオチド変異の同時評価が可能なことである。これらの結果は、特に疾患の発症の予後を判定する、および医学的処置の効力を評価する際に、医学およびヘルスケアの実践者によりなされる診断の結果に対して大きな影響を与える。
【００１２】
本発明の特に有利な点は、分析すべき調製物における標的の質が決定的に重要ではないことである。その不安定性のために、RNAse阻害剤を使用するなどの特別な処置を必要とすることが知られるRNAを、試験においてRNAをcDNAに変換することなく直接用いることができる。本発明の方法において、そのハイブリダイゼーション工程の後にその手続を中断してもよく、アフィニティータグを付けた標的を介して固体担体上に捕捉されるまたは結合する、アフィニティータグを付けた標的、例えばmRNA標的およびDNA（標的-検出プローブハイブリッドまたは複合体を含む）を含むサンプルを、比較試験のためのすべてのサンプルが収集され、自動的な分離と記録を同時に行う工程のための準備が整うまで貯蔵してもよい。その方法は、非常に順応性があり、堅固で、再現性がある。その方法は、完全に自動の、または半自動のアセンブリーにおいて用いられ得る。その手続はいくつかの段階において中断されてもよい。試薬または反応産物は、十分なデータが収集されるまで、またはその工程を続行するのがより便利になるまで保存してもよい。その方法は種々の規模または型式にて用い得る、すなわち試験管における試験としてだけでなく、マイクロリットル規模からナノリットル規模において行うようにさらに小型化してもよい。その方法は、様々な時間間隔にて種々の部位からサンプルを収集することができ、自動装置によって最終的に相対的な記録を行うために収集されたサンプルを貯蔵することができる。よって、記録された結果によって、収集され、貯蔵されたサンプルを同時に簡便に比較することができる。
【００１３】
本発明により、細胞または組織ライセートであり得る、測定すべき標的配列を含む未知のポリヌクレオチド配列の混合物を含む同じサンプル溶液から、複数の標的およびそれらの中のヌクレオチド変異の相対的な量を同時に測定することが可能となる。必然的に、ポリヌクレオチド配列は試験を行う前に単離してもよいが、そのことは必要ではない。本発明において、ヌクレオチド変異は好ましくは、１つまたはさらに数個のヌクレオチドを含む、少数のヌクレオチド変異、例えば、点突然変異、逆位（inversion）、欠失、置換である。しばしば、一塩基多型を生じるトリプレットが、測定すべきヌクレオチド変異の適切なサイズである。ヌクレオチド変異は、１以上の標的配列に存在し得、１以上の標的配列は、細胞または組織ライセートサンプルにおいて遺伝子を表し得る。従って、標的配列なる用語は、遺伝子の同義語として用いるためのものではない。本発明によると、遺伝子およびそのヌクレオチド変異は、いくつかの標的配列により表し得る。本発明において、１標的につきただ１つの所望の目的ヌクレオチド変異を測定することも典型的である。標的における所望のヌクレオチド変異の存在の有無の測定は定量化してもよく、標的が二倍体生物に由来する場合、ヌクレオチド変異のホモ接合またはヘテロ接合状態ならびにその発現レベルを測定することができる。
【００１４】
複数の標的およびヌクレオチド変異の量の測定は、標的にハイブリダイズした検出プローブを記録することによって実際に行う。それらの検出プローブは、ヌクレオチド変異のフランキング領域に相補的であるように設計する。本発明において、フランキングとは、ヌクレオチド変異を担持することが予期される部位に接触して隣接する（contiguously adjacent）またはそのごく近傍に位置する配列に、検出プローブが相補的であることを意味する。言い換えると、検出プローブが標的にハイブリダイズした場合、そのヌクレオチド変異は標的上の次のヌクレオチドに存在する。このことは、検出プローブが、１以上の隣接（contiguous）または連続（continuous）するヌクレオチド配列分伸長する（extendまたはelongate）と、伸長した検出プローブは、鋳型として用いられる標的に沿って所望のヌクレオチド変異を含有する部位上に形成されることを意味する。
【００１５】
本発明の方法により、異なる時点に、例えば特定の処置の前または後に、異なる部位または異なる標的生物から得られたサンプルにおいて起こった変化の簡単な比較評価ができる。ゲノム標的配列および発現配列から得られた結果を比較することにより、潜在的な修復機構の存在を検出することが可能である。これは、特に、生命過程および同じ細胞または組織に適用した物理的および化学的刺激の影響を研究する際に有用であり、いくつかの生物学的現象を同時に比較評価することができるが、何よりも、かかるヌクレオチド変異に関連する特定疾患に関する素因（predisposition）を診断するのに有用である。
【００１６】
本発明は、複数の標的とそれらそれぞれの標的の既定の部位または領域に存在するヌクレオチド変異との間の、相対的な量または比率を同時に定量的に測定することができる。特に、ゲノム配列がいくつかのヌクレオチド変異を有することが予期される場合、ハイブリダイゼーション反応が起こる状態に供する前に、それらの配列を断片化することが推奨される。また、二本鎖ゲノムDNAであり得る標的は、一本鎖にする。一本鎖mRNAは消化する必要はないが、特にゲノムDNA配列は、ハイブリダイゼーション反応の前に、例えばホモジナイズにより、または超音波処理により、または制限酵素またはヌクレアーゼによる処置により、機械的に断片化する。
【００１７】
その後それらの標的に、標的を捕捉する手段を与える。これは、ハイブリダイゼーションを行う前に、それらの標的に、好ましくはそれらの3'末端において、アフィニティータグ、例えばビオチンを与えることを意味し得るが、そのアフィニティータグ付けはハイブリダイゼーション反応の前または最中に、アフィニティータグを付けたプローブ、いわゆる捕捉プローブにより行ってもよい。その捕捉プローブは特異的または非特異的であり得る。特異的捕捉プローブを用いる場合、測定すべきそれぞれの標的には、独自の捕捉プローブが必要である。あらゆるポリアデニル化標的のために用いることができる非特異的捕捉プローブは、例えばポリ（dT）を含むプローブである。当分野において知られる非特異的化学アフィニティータグ付けを同様に用いてもよい。
【００１８】
本方法はいくつかの段階を含み、水ベースのサンプル溶液、例えば前処理した標的を含有する細胞または組織ライセートを加えることにより開始し、そのサンプル溶液は好ましくはハイブリダイゼーション溶液とともに、モル過剰の１より多い水溶性のまたは可溶化できる検出プローブ、および少なくとも１のアフィニティータグを付けたプローブを含む検出プローブのプール、ならびにアフィニティータグのカウンターパートにより被覆した固体担体に加える。
【００１９】
検出プローブはいくつかの既定の特性を有する。これらの特性は、それぞれの検出プローブが以下であることを含む：
（i）水ベースのサンプル溶液に可溶性である；
（ii）標的に対して過剰に存在する；
（iii）測定すべき標的における既定の配列に相補的である、ここでその配列は測定すべきヌクレオチド変位のヌクレオチドが直接後続する部位に位置する；
（iv）標的における既定の配列にハイブリダイズした検出プローブおよび伸長した検出プローブのそれぞれの区別可能な分離および記録が可能となる、既定の明確に異なるサイズを有する；
（v）測定すべきヌクレオチド変位における測定すべきヌクレオチド数よりも少なくとも１ヌクレオチド多い分サイズが異なる；
（vi）検出可能な標識によりトレーサータグ付けされている；および
（vii）プールの中の別の検出プローブとハイブリダイゼーション可能な相補的領域を持たない。
【００２０】
検出プローブおよび伸長した検出プローブのサイズが異なることにより、各検出プローブ上のトレーサータグまたは検出可能な標識の強度の区別可能な分離および記録が可能になる。種々の各検出プローブは、それらの標的におけるヌクレオチド変位の部位に隣接する隣接物（contiguous adjacency）に位置する既定の部位、領域または配列に相補的である。測定すべきヌクレオチド変位は通常、代謝物の在または不在を引き起こすことにより疾患または障害の原因となることが知られる変異である。しばしば、ヌクレオチド変異のホモまたはヘテロ接合状態を知ることが重要である。ヌクレオチド変異は、ホモまたはヘテロ接合状態および発現の程度に応じて異なる効果を有することが知られるので、適時に測定を行ってその有害作用を避けるために初期の段階でその存在を実証することが望ましい。プール中の検出プローブには、検出可能な標識またはマーカー、例えば、フルオロフォアまたは発色団であり、すべてのプローブについて同じであってもよい、トレーサータグを与えるのが好ましい。あるいは、種々の検出プローブのそれぞれは独自のトレーサータグを有してもよく、これにより区別可能な記録が可能となる。好ましくは、検出プローブの3'末端において鋳型として働く標的の5'末端に向かって酵素が補助する伸長が妨げられずに起こるように、検出プローブの5'末端にトレーサータグを付ける。標的にハイブリダイズする、標的に相補的な検出プローブの3'末端は、ヌクレオチド変異の部位のはじめのヌクレオチドに先行するヌクレオチドにおいて終わる。従って、その部位は、検出プローブと測定すべきヌクレオチド変異に相補的な領域の間の接合部を形成する。
【００２１】
ハイブリダイゼーション反応は、標的の選択された既定の領域上に安定なハイブリッドを形成させることができる条件において起こる。標的がポリアデニル化する場合、（例えば真核mRNAなど）、アフィニティータグは、好ましくは、ポリ（dT）プローブがハイブリダイゼーションすることにより3'末端に結合し、さらなるアフィニティータグ、例えばビオチンを担持してもよい。その標的はアフィニティータグを介して固体支持体上に固定されたアフィニティータグのカウンターパートに捕捉される。これにより、いずれかの標的上の相補的領域とハイブリダイズしたそれらの検出プローブは、結果として、アフィニティータグのカウンターパート、例えばアビジンにより被覆された固体担体、好ましくは磁性マイクロビーズに捕捉される。
【００２２】
ハイブリダイゼーション反応およびその後または同時に起こる固体支持体への結合の後には、非結合物質の１以上の洗浄および除去を含む精製が続く。洗浄された微小粒子を緩衝溶液に移し、そこで酵素が補助する伸長が起こる。標的がDNAである場合、酵素はDNAポリメラーゼであり、標的がRNAである場合、酵素は逆転写酵素である。緩衝溶液は、酵素の他に、酵素が補助する伸長反応に適用可能な形態の少なくとも１のデオキシヌクレオチド（dNTP）またはジデオキシヌクレオチド（ddNTP）、すなわちdATP、dTTP、dCTP、およびdGTPまたはddATP、ddTTP、ddCTP、およびddGTPを含む。ddNTPが別個の容器に存在する場合、ただ１つのヌクレオチドが各プローブに加えられ、容器および標的につきだた１つのヌクレオチド変異が測定できるが、プローブに後続するはじめのヌクレオチドは、それが何であれ、異なる容器から測定することができる。dNTPが異なる容器に存在する場合、はじめのヌクレオチドを伸長させることができるヌクレオチド変異のみが伸長する。他の容器において、プローブは伸長しない。はじめのヌクレオチドを伸長させ、同じタイプのヌクレオチドが続く場合、異なるヌクレオチドに遭遇するまで伸長させることができる。この場合、異なる標的上の異なるプローブは異なる容器において異なって伸長され得、比較可能な結果が得られうる。
【００２３】
異なるdNTPが全て同じ容器に存在する場合、溶液にdNTPが存在する限り伸長は起こるであろう。終止コドンとして働く１以上のddNTPを加える場合、伸長を無作為に停止させることができる。異なるサイズを有する検出プローブの分解能（resolution）および長さが、どの程度の量のヌクレオチドが結果の記録を妨げずに検出できるかを決定する。それ故に、終止コドンとして働く少なくとも１のddNTPと組み合わせて１より多いが４未満のdNTPを用いるのが便利である。dNTPまたはddNTPはトレーサータグを付けてもよい。特に、４つのddNTP全てが同じ容器に存在する場合、全ての検出プローブが１ヌクレオチド伸長し、それらは異なる検出可能な標識を有するトレーサータグを付けていなければヌクレオチド変異は区別できない。図2に示すように、ddNTPに異なる波長にて発光する異なるトレーサータグを与えた場合、それらは識別可能なように記録することができる。容器は、試験管、マイクロウェル、管状マイクロチャネルまたはマイクロ流体マイクロチップデバイスのリザーバーであり得る。
【００２４】
酵素が補助する伸長により、サンプル中の標的およびそれぞれの標的に存在するヌクレオチド変異の量の同時測定が可能となる。ハイブリッドの検出プローブの3'末端の直後に続くまたはフランキングするはじめのフリーのヌクレオチドである、標的の5'末端のはじめのヌクレオチドに応じて、酵素は、少なくとも１のヌクレオチドを含む溶液中において、検出プローブの3'末端に、１以上のヌクレオチドを、鋳型としての標的の5'末端に向かって組み込むことにより、検出プローブを伸長する。
【００２５】
好ましくは、試薬を含む非結合物質の除去によるさらなる精製が可能な固体支持体上において伸長を行う。しかしながら、検出プローブは同じ緩衝液内に遊離させることができるので、その後の洗浄による精製は必要でない。検出プローブは、適切な水溶液、例えばアルカリ性水酸化ナトリウムまたはカリウム溶液またはホルムアミドを含む変性させるための水または緩衝溶液中においてハイブリッドが一本鎖になることにより固体支持体から遊離し、その溶液から、遊離した検出プローブは直接分離され、記録され得る。標的に結合したアフィニティータグを付けた捕捉プローブまたはアフィニティータグを付けた標的は、固体支持体に結合した、または固定されたままであり、回収された溶液中に存在する検出プローブを含有する溶液から分離され得る。アフィニティータグを付けた捕捉プローブが結合した固体担体は不要物として除去しても、またはアフィニティータグを付けた標的を除去した後に再利用するために回収してもよい。標的とハイブリッドを形成し、それにより固体支持体上に捕捉された、それらの一本鎖の検出プローブのみが、一本鎖にされることにより可溶化し、分離および記録のために溶液から回収され得る。好ましくは検出可能な標識によりトレーサータグを付けた、各種一本鎖検出プローブは、直接、識別可能なように分離および記録し得る。たとえ、標的またはそれらのフラグメントが変性段階において遊離し、それにより溶液（この溶液の結果が記録される）中に存在するとしても、それらはトレーサータグが付いていないので、標的は記録を妨げないであろう。さらにそれらは不規則なサイズを持ち、検出プローブとして既定のサイズを持たないであろう。アフィニティータグを付けたプローブが検出プローブと同時に遊離した場合、それらは区別可能なサイズが与えられ、検出可能なトレーサータグを持たないので、検出を妨げないであろう。
【００２６】
標的およびヌクレオチド変異の測定された量の最終的な結果は、安定なDNAまたは修飾DNAから調製した、安定な、よく特徴決定された検出プローブにより記録された結果から、さらに、対照としてハウスキーピング遺伝子、および較正された記録装置および標準曲線を用いて、計算し得る。データは、市販のプログラムおよびコンピュータソフトウェアを用いて解析し、計算することができる。検出プローブは、標的上の、既定の選択された部位または領域に相補的である。同じプール内の検出プローブは一本鎖であり、互いに相補的でなく、互いにハイブリダイズしないように選択され、設計されるまたは調製される。ハイブリダイゼーション反応に用いられる過剰の検出プローブにより、ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーションに有利に働くほとんどの条件において完了するまで推進され、結果として検出プローブの量はサンプル中に元来存在する標的の量に化学量論的に対応する。検出プローブの量は、スペクトログラム、電位図などとしてグラフを使って記録され、その量は、グラフのピーク面積を市販購入し得るプログラムを用いて測定することによりグラフから算出され得る。その方法は非常に堅固で再現性がある。その結果は適切な対照を用いて較正し得る。
【００２７】
本発明の方法において用いられる試験キットは、検出プローブの混合物を有するプールを調製したことを特徴とし、ここでそれぞれの検出プローブは上記に規定の通りである。試験キットは、組み合わせのパッケージとして提供し、その組み合わせは、検出プローブの上記に規定のプール、パッケージに組み込まれたさらなる試薬、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応のための適用可能な条件および標的濃度とサンプル溶液を希釈するための適切なモデルを含む使用説明書を含む。例えば、サンプル溶液が細胞または組織ライセートである場合、どの程度の数の細胞を溶液中に含めるべきか、または含めることができるか、および試験において最適な結果を得るための希釈の仕方は、一般に知られている。試験キットは、テーラーメイド試験の容易な適応を可能とする他の市販購入し得る試薬を含み得る。試験キットは好ましくは組み合わせのパッケージとして提供し、その組み合わせは、所望の検出プローブの混合物を有するプールを含有する装置および使用説明書を含む。本発明の方法のための検出プローブのプールを設計する際に、プローブの選択がとりわけ最も重要であることに注意されたい。
【００２８】
試験キットのプールには、アフィニティータグを付けた捕捉プローブを含めてもよく、アフィニティータグのカウンターパートにより被覆された固体担体を含み得る。標的がmRNAである場合、アフィニティータグを付けた、例えばビオチンタグを付けたポリ（dT）含有捕捉プローブ（さらなるアフィニティータグを含有してもよい）は、検出プローブのプールに便利に供されるが、サンプル溶液とは別個にプールに加えてもよい。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、未精製の水ベースのサンプル、例えば細胞または組織ライセートから直接、標的ポリヌクレオチド配列（標的）およびそれぞれの標的中のヌクレオチド変異の量を同時に測定する方法に関するが、当然ながらポリヌクレオチド配列は単離し精製することができる。ヌクレオチド変異は、多数の異なる遺伝的変異、例えば、１以上のヌクレオチドの置換、逆位または欠失を含み得る。本発明の方法は、ゲノムDNAに存在する一塩基多型（SNP）または点突然変異を形成するヌクレオチドのトリプレットの相対的な量を同時に測定することが可能であるが、mRNAを含む発現産物の量の測定およびスプライシング変異体の検出に特に有用である。本発明の方法により、遺伝子における特定のヌクレオチド変異を担持する個体がそのヌクレオチド変異についてホモ接合またはヘテロ接合であるかどうかを決定するが可能である。この試験はこれらの遺伝子がいかに発現されるかを決定することによりさらに追跡することができ、さらにいくつかの修復機構を評価し得る。
【００３０】
本発明は、特に標的ポリヌクレオチド配列の発現パターンまたは転写特性およびその中のヌクレオチド変異を決定するための方法およびその方法に適用可能な試験キットを提供する。これにより、本発明の方法により、ゲノムDNAを含有するサンプルのみならず、発現事象および発現産物中のヌクレオチド変異の存在についての情報を提供するサンプルにも基づいた、疾患および特定疾患に関する遺伝的素質の、特異的な、感度の高い同時の診断が可能となる。この方法は、診断上の予後の判定にまったく新しい局面を提供する。従って、本発明の方法および試験キットの利点は、ゲノムDNAのヌクレオチド変異の評価のみならず、転写特性または発現パターンの評価および発現過程において生じるヌクレオチド変異の検出も可能であることである。これらの結果は、特に疾患発症の予後を判定する、および医学的処置の効力を評価する際に、医学およびヘルスケアの実践者によりなされる診断の結果に対して大きな影響を与える。
【００３１】
本発明は、再現性ある定量的な結果を提供することにより、ゲノミクスの治療への転換に特に有用である。本方法はゲノミクスにおいて便利であるだけでなく、発現されたゲノミクスにも適用することができ、これにより例えば遺伝子治療の効力を評価する際に有用な組み合わされた結果を提供し得る。信頼のおける有用な結果は病態生理学において得られうる。その方法は、ある個体が特定疾患の素因を有するかどうかの判定、適切な処置様式の選択、または特定の処置様式の除外、処置反応の予測などに有用である。今日、遺伝的原因が血管疾患、癌、肥満などを含む多数の疾患の背後に存在すること、これらの疾患の発生は遺伝学的因子のみならず、遺伝子の発現、および多くの調節因子にも依拠することが知られている。それ故に、本発明の方法は、多数のサンプルからの定量的な結果を提供することにより、ゲノミクスを治療に転換する効率的な堅固な方法を提供する。
【００３２】
本発明の方法によって、多重の遺伝子型の同定（ここで標的はゲノムDNA配列である）、および、複数の標的およびそれぞれの標的中のヌクレオチド変異の量の同時測定が可能となり、また、標的とヌクレオチド変異を有する標的との間の比率を測定することが可能であり、その比率は、測定すべき標的配列に存在する各ヌクレオチド変異のホモ接合またはヘテロ接合状態を示す。
【００３３】
本発明の方法はまた、アレル特異的発現の多重分析が可能であり、ここで標的は発現されたRNA配列であり、複数の標的およびその中のヌクレオチド変異の量により、標的の発現レベルに加えて、標的とヌクレオチド変異を有する標的との間の比率の測定が可能となる。
【００３４】
本発明の本質的部分である、サンプル中の標的の前処理、複数の既定の特性を有する検出プローブのプールまたは混合物を有するテーラーメイドの試験キットの調製を段階的に記載することにより、本発明を説明する。検出プローブは様々な目的のためのテーラーメイドの試験キットとして提供し得る。これらの準備段階は、サンプルおよびその中の標的の調製、検出プローブの選択および構築、および種々の分析目的に適する試験キットの最適な調製を含む。分析段階はすべてはじめ別個に記載するが、本発明のより実践的な実施形態において、いくつかの段階を組み合わせて同時に実行してもよく、これにより、自動システムに適用しやすい、単純化された非常に便利な分析を提供する。これらの方法は実施例において詳しく説明する。
【００３５】
準備段階
1. サンプルおよび標的ポリヌクレオチド配列の調製
1.1 サンプル調製
本発明において、標的ポリヌクレオチド配列およびそれらの標的中のヌクレオチド変異の量を、細胞または組織ライセートから直接、または単離されたゲノムDNAまたはRNA（これら自体は既知の方法によって単離される）から測定する。細胞から単離されたRNA、特にメッセンジャーRNAは、適切な実験条件（これ自体は既知の方法を用いる）において用いる（Sambrookら、1989、「Molecular cloning, a laboratory manual.（分子クローニング、実験室マニュアル）」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989）。あるいは、粗製のサンプルライセートを直接用いてもよい。標的ポリヌクレオチド配列が二本鎖、例えばゲノムDNAである場合、標的は既知の方法により一本鎖とする（Sambrookら、1989：「Molecular cloning, a laboratory manual（分子クローニング、実験室マニュアル）」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989）。ゲノムDNAを含むサンプルは、有利なように、サンプルのホモジナイズまたは超音波処理を含む機械的手段により、いくらか断片化してもよく（Sambrookら、1989、「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、実験室マニュアル）」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989）、それらの標的もハイブリダイゼーション反応を行う前に一本鎖にする。
【００３６】
本発明の方法は、測定すべき標的を含むポリヌクレオチド配列の混合物中の標的およびヌクレオチド変異の相対的な量を同時に測定するのに特に便利である。本方法はDNAおよびRNAの両方の量を測定するために独特であるが、RNA、特にメッセンジャーRNA（mRNA）におけるヌクレオチド変異の量を測定するのに特に有用である。例えばmRNAの不安定性のために、RNAを分析する方法は典型的には、RNAを対応するcDNAに転換するまたは変換する段階が必要である。この段階は本発明において完全に回避され、mRNAは、DNAまたは他の修飾ポリヌクレオチド配列からできている安定な検出プローブへのハイブリダイゼーションにより安定化される。というのは、標的ではなくそれらのプローブが測定されるためである。この安定化はハイブリダイゼーション段階においてなされ、ここでRNAを安定化する検出プローブとハイブリダイズさせる。RNAseおよびアルカリに感受性のmRNA標的が検出プローブにより安定化し得るという事実により、RNAse阻害剤または例えば熱によるRNAseの不活性化は必要ない。
【００３７】
1.2 標的のアフィニティータグ付け
標的
本発明の方法における標的は、サンプルに存在する分析物であるポリヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド変異を含んでいてもよいが、含んでいる必要はない。本方法は、メッセンジャーRNA（mRNA）標的の量（転写特性およびスプライシング現象を含む）の測定に特に有用である。特定の瞬間に、またはその後の時間間隔に、研究対象の細胞または組織に存在する発現産物を、便利に研究することができる。サンプルを既定の検出プローブを含むプールと接触させる前に、適切なアフィニティータグを担持するように標的を修飾しなければならないが、本発明のより便利な実施態様において、ハイブリダイゼーション反応過程においてそれらの標的にアフィニティータグを付ける。その場合、ハイブリダイゼーション溶液は、好ましくは標的の3'末端に相補的である、アフィニティータグを担持する捕捉プローブを含む。
【００３８】
mRNA標的は、当分野において知られる化学的な非酵素学的な工程を用いて、便利よくアフィニティータグを付ける、またはビオチン化する。光活性化した試薬であるフォトビオチンはこの目的に便利であり、市販購入し得る。RNAはcDNAに転写する、または標識化のために酵素学的に修飾する必要はないので、RNAは強い界面活性剤、例えばSDSにおいて調製し、維持してもよい。RNAseはSDSにより阻害されるので、インタクトなRNAを単離するのが容易である。サンプル中のmRNAの断片化は通常、重すぎなければ困難ではない。RNAフラグメントのサイズは捕捉能に影響しないであろうが、測定すべき所望のヌクレオチド変異の位置は、プローブを設計する際に考慮に入れるべきである。標的がゲノムDNAを含むサンプルである場合、DNAは好ましくは上記のようにホモジナイズするまたは超音波処理する。
【００３９】
アフィニティー対
アフィニティータグは、標識またはマーカーとして用いることができ、別の物質に高い親和性を有する物質である。互いに高親和性を有するかかる物質は、アフィニティータグとそれらのアフィニティータグのカウンターパートであり、互いにいわゆるアフィニティー対を形成する。アフィニティー対は互いに強い結合を形成する傾向にある物質である。アフィニティー対形成は、所望の物質を捕捉する手段として働く。好ましいアフィニティー対は、例えばビオチン-アビジンまたはビオチン-ストレプトアビジンであるが、他の合成または非合成アフィニティー対または結合物質も同様に適用してもよい。適切なアフィニティー対は、レセプターとリガンド、抗原と抗体間に、ならびにそれらのフラグメント間に見られ得る。
【００４０】
本発明において、少なくとも１のアフィニティータグを標的に与えなければならない。アフィニティータグ付けは、ハイブリダイゼーション反応の前または最中に行い得る。ハイブリダイゼーション中の立体障害を避けるために、アフィニティータグは、好ましくはアフィニティー対の、より小さいカウンターパート、すなわちビオチン、フォトビオチン、ヒスチジンオリゴマー、ハプテン、グリカン、オリゴヌクレオチド配列、例えば、オリゴ（dA）、オリゴ（dT）であり、一方、アフィニティー対の好ましいより大きなカウンターパート、アビジン、ストレプトアビジン、金属キレート、抗体、レクチンまたはヌクレオチドオリゴマーは、好ましくは本方法において用いられる固体担体を被覆するために用いる。
【００４１】
本発明の方法において、ハイブリダイゼーションが溶液中において起こることはとりわけ最も重要である。それ故に、ハイブリダイゼーション反応が起こる前に、化学反応（例えばビオチン残基が研究すべきポリヌクレオチド配列または核酸配列に共有結合し、修飾されたポリヌクレオチド標的、すなわちビオチン化標的が生じる）によって標的にアフィニティータグを付けてもよい。アフィニティータグは捕捉プローブ上に与えてもよく、標的のいずれかの末端にハイブリダイズすることができる捕捉プローブが好ましい。この捕捉プローブはさらなるアフィニティータグ、例えばビオチンを担持してもよい。標的がmRNAである場合、本発明の方法の固液相アッセイの本質的部分である固体支持体が、mRNAのポリ（dA）テールを捕捉し得るポリ（dT）配列により被覆されているならば、さらなるアフィニティータグを有する必要はない。
【００４２】
アフィニティータグを担持する捕捉プローブを用いて標的を末端標識化する場合、標的のアフィニティータグ付けをハイブリダイゼーション反応の前にする必要はなく、ハイブリダイゼーション反応と同時に行ってもよい。試験キットの同じプールにおいて所望のアフィニティータグを付けた捕捉プローブが他の検出プローブと一緒に提供され得る場合、これにより本方法のパフォーマンスはさらに単純化される。捕捉プローブは固体支持体上に集まり、その固体支持体上に残るが、可溶性検出プローブを含有する溶液は分離および記録のために回収されるので、捕捉プローブが測定を妨げる可能性はないことに留意されたい。
【００４３】
2. 検出プローブの調製
本発明の方法において、複数の標的は、標的にハイブリダイズした安定な検出プローブを記録することにより実際に測定されるが、標的-検出プローブハイブリッドが化学量論的に形成されるために、記録された検出プローブの量はサンプルに本来存在する標的の量に実際に対応する。検出プローブの混合物を有するプールを作製する場合、適切かつ有用なプローブの選択はとりわけ最も重要である。従って、分析段階に先行する本発明の最も重要な段階は試験キットのための検出プローブの調製である。これらの準備段階において、適切な検出プローブを選択し、設計する。
【００４４】
本発明において、検出プローブは、プローブが固定化された形態にて、例えば、いわゆるマイクロアレイ系にて提供される系とは対照的に、可溶性である。本発明は定量的な方法であり、化学量論的なハイブリダイゼーション反応を妨げる立体障害を回避することが重要である。それ故に、検出プローブは、特異的な固定化されたプローブを適用するマイクロアレイ系とは対照的に、可溶性の形態または可溶化できる形態にて提供する。このことは、プールの中のプローブ混合物が、例えば凍結乾燥された形態にて提供され得る、またはマイクロタイタープレートのウェルの底にゆるく結合していてもよいことを意味する。検出プローブは、水ベースの溶液に可溶性である。このことは、サンプル溶液を水溶性の検出プローブに加えると、検出プローブが溶解し、ハイブリダイゼーション反応が起こる時に検出プローブが溶液であることを意味する。
【００４５】
プローブ
いくつかの異なる検出プローブの混合物を調製し、検出プローブのプールを提供する。１以上のプールを試験キットとして用いてもよい。検出プローブの特徴は、特許請求の範囲および明細書の他の場所に規定されている。
【００４６】
異なるサイズ
本発明の方法を実行可能にするための必須条件の１つは、同じプール中に混合物として存在する異なる検出プローブが区別可能に分離され、記録され得ることである。可溶性の検出プローブまたは可溶化できる検出プローブは、明確に異なるサイズを有することを特徴とし、これにより質量スペクトル分析法またはキャピラリー電気泳動により記録するための、正確かつ区別可能な分離および／または同定が可能となる。検出プローブの特異的配列がおおよそ同じサイズである場合、それらに分離を可能にするポリヌクレオチド配列を含む非特異的領域を与えてもよい。本発明の検出プローブは好ましくはオリゴヌクレオチド配列である。本発明において、オリゴヌクレオチド配列は、本発明において用いられ、典型的には20〜200のヌクレオチドを含むあらゆるプローブを意味する。それらはオリゴヌクレオチド配列が通常有すると考えられているよりも多いヌクレオチドを有する。検出プローブは、少なくとも15ヌクレオチド以上、好ましくは20ヌクレオチド以上、最も好ましくは少なくとも25ヌクレオチド以上の様々なサイズを有する。上限は、必要な分解能、プールに存在する異なるプローブの数、伸長されるプローブに組み込まれることが予期されるヌクレオチド数を含む、いくつかの因子により決まる。非常に長いプローブを用いるにあたっての制限要因は、より長いプローブを合成する費用、および、それらが断片化された標的と混合される要因となりうる望まれない相互作用およびミスマッチの増大した危険性である。上記の要因は、同じプールに存在すべき検出プローブの混合物を設計する際に考慮に入れるべきである。プローブサイズの簡便な上限は約200ヌクレオチド、好ましくは100ヌクレオチド、最も好ましくは50ヌクレオチドである。例えばヌクレオチド変異が１または２のヌクレオチドを有することが予期される場合、分解能が１ヌクレオチドである場合のプローブ間のサイズの差異は、それぞれ１または２ヌクレオチドよりも多くなければならない。
【００４７】
より短い検出プローブ配列は、例えば以下の判断基準を有するコンピュータプログラムにより設計され得る：プローブ長の範囲30−50 nt；融解温度範囲60−75℃；GC％範囲40−60％；設計されるプローブ配列と同一のヒトゲノムのいずれかの部分の配列の最大長の基準は約17 ntであるべきである；ヒトゲノムのいずれかの部分の配列のプローブ配列に対する最大類似性の基準は80％であるべきである；プール中のプローブ間のサイズの最小の差異は2ntであるべきである。より長いプローブが用いられる場合は、別の基準に従わなければならない。短い検出プローブおよび長い検出プローブの両方が用いられる場合、判断基準は標準化しなければならない。テキストブックおよび研究室ハンドブックに情報が提供されている。
【００４８】
検出プローブの十分な分解能は、本方法において必要条件である。本発明の方法における分解能は、わずか２ヌクレオチド分異なる検出プローブ間にて区別し得る程度に高くあるべきである。ヌクレオチド変異を同時に分析する場合、検出プローブは、伸長に組み込まれることが予期されるヌクレオチド数よりも多いヌクレオチド分サイズが異なるのが好ましい。図3に示す結果は1-3ヌクレオチドの組み込みを示している。その場合、プール中の検出プローブのサイズは少なくとも４ヌクレオチド分異なるべきであるが、わずか１ヌクレオチドの伸長を検出すべき場合、プローブ間のサイズの差異は、より小さくてもよい。２ヌクレオチド程度の小ささでも可能である。一般に、プローブのヌクレオチドのサイズまたは数の差異は、ヌクレオチド変異において測定されるであろうヌクレオチド数より少なくとも１ヌクレオチド多くあるべきであると言ってもよい。
【００４９】
検出プローブが必要とする相補性配列
本発明の方法のための検出プローブを選択するための別の必要条件は、それぞれの検出プローブが標的上の既定のよく特徴決定された領域に相補的であることである。プールのための可溶性検出プローブは、好ましくは標的において既定の領域に基づいて合成的に調製する。これらの部位、領域または配列は、可能性ある既知のヌクレオチド変異に隣接する隣接物内にあるように選択する。このことは、検出プローブが、予期されるヌクレオチド変異のごく近傍に位置し、標的-検出プローブハイブリッドが１以上のヌクレオチドの組み込みにより伸長される際に隣接するまたは連続する配列を形成する、標的上の領域に相補的であることを意味する。言い換えると、相補的な標的上のプローブの位置が、標的中のヌクレオチド変異上に、隣接するまたは連続する伸長された配列または伸長された検出プローブが形成されることを可能にする。検出プローブの伸長により、フランキング標的配列中の１以上のヌクレオチド変異の存在の有無の検出が可能となる。
【００５０】
安定なDNAプローブ
国際公開第02/055734号パンフレットは、多くは既に特徴決定されているか、将来特徴決定されるであろう所望の種々の生物から適切な検出プローブを調製する方法を開示している。本発明の方法のための検出プローブは、オリゴヌクレオチド合成、PCR増幅を用いることにより、または所望のヌクレオチド数を有する所望の配列を適切な制限部位を有するプラスミドに挿入し、適切な微生物をそのプラスミドにより形質転換し、組み込まれたプラスミドが増殖した際に所望のプローブを放出することによる組換えDNA技術により、合成的に調製する。特定の目的において、全体的にランダム化された配列を有する検出プローブを合成することが可能である。現在の当業者であれば、適切なオリゴヌクレオチドプローブを作製する多数の方法を知っている。
【００５１】
特徴決定されていないゲノムからのプローブ
好ましくは、検出プローブは既知の特徴決定された配列に基づいて設計するが、本発明の検出プローブは、国際公開第2002/055734号パンフレットに記載の、部分的に特徴決定された、または特徴決定されていない配列に基づいて設計してもよい。
【００５２】
修飾プローブ
検出プローブのセットを合成的に調製する場合、修飾されたポリヌクレオチドプローブを調製するのも便利であり、その場合、ヌクレオチド配列の糖リン酸骨格をペプチド結合により置換してもよく、またはいわゆるロックドヌクレオシド類似体から作製してもよい。修飾ポリヌクレオチドは、例えば、例えば国際公開第96/20212号パンフレットに記載のペプチド核酸（PNA）または例えば国際公開第99/14226号パンフレットに記載のロックド核酸（LNA）である。それらの修飾ポリヌクレオチドプローブを本発明の方法および本発明の方法に用いられる試験キットに適用してもよい。それらはゲノムDNAまたはcDNAを鋳型として用いて複製してもよい。しばしば、これらの修飾プローブは、改善された安定性を含む改善された特性を有し、それらは正常なDNAプローブよりも容易にトレーサータグが付られるという利点も有し得る。
【００５３】
適用可能なプローブ
本方法は、基礎研究に有用なツールであるが、その主要な有用性は、特定の標的およびその中のヌクレオチド変異の存在の有無を同時に判定するための便利な試験を提供することであり、これにより対象が疾患に関して遺伝的素因を有するかどうかが結論づけられる。本方法はまた、特定の治療が所望の効果を奏したかどうかを結論づけるのにも有用である。本発明を、ヒトゲノムに基づいて選択され設計された２つのプローブを用いて例証した。これらの２つの検出プローブは、GAPDH（配列番号1）およびPRSS1（配列番号2）である。
【００５４】
診断に有用な検出プローブ
本発明の目的は、遺伝性疾患を引き起こすヌクレオチド変異の存在の有無を検出するアッセイを提供することである。点突然変異により引き起こされるよく知られた遺伝性疾患は、鎌状赤血球貧血、β地中海貧血症、フェニルケトン尿症、血友病α1抗トリプシン欠乏症であり（Antonarkis, 1989, New England J Med, 320, 153-163）、嚢胞性線維症を挙げてもよい。特定の疾患に関する素因に相関する多形性の例は、アポリポタンパク質E遺伝子の３つの対立遺伝子多型である（Mahley, 1988, Science, 240, 622-630）。微生物の点突然変異は、改変された病原性または抗生物質または治療に対する耐性を導き得る。これらの遺伝子の変異を開示する従来技術に精通する当業者であれば、これらのゲノムの変異を検出するのに適切なプローブを容易に選択できるであろう。
【００５５】
トレーサータグ
プールに存在する検出プローブは異なるサイズを有し、これにより質量スペクトル分析法による記録が可能となるが、本発明の好ましい実施形態において、検出プローブに、プローブの直接のまたは別の試薬と接触した後の検出または記録を可能にするトレーサータグ、すなわち標識またはマーカーを与える。検出プローブすべてを同じトレーサータグによりタグ付けしてもよいが、検出プローブのプールを調製する場合、それぞれのプローブが独自のトレーサータグを有するプールおよび試験キットを提供することも可能であり、これによりプールの中の各検出プローブの識別可能な記録が可能となる。本発明において、トレーサータグまたはタグは検出プローブの5'末端に位置する。標的およびヌクレオチド変異の定量的な記録に不可欠であり検出プローブの3'末端において起こる伸長反応をトレーサーが妨害するのを防ぐためには、かかる5'末端にタグを付けた検出プローブが好ましい。
【００５６】
検出プローブはトレーサータグを用いて記録し、それらの電気化学的または磁気的特性、蛍光、発光、放射活性、赤外吸収に基づいて、または酵素反応によって記録してもよい。主に、自動の手段または装置により容易に記録可能であり、ハイブリダイゼーション反応を妨げない、いずれかのトレーサータグを用い得る。それらには、伸長反応の最中に、検出可能な標識によりトレーサータグを付けてもよいが、その場合、本来の標的にもトレーサータグを与えなければ、検出できないことに注意されたい。
【００５７】
蛍光に基づく技術において、特に有用なトレーサータグまたは標識は、蛍光色素およびフルオロフォア、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、フィコビリタンパク質（phycobiliprotein）、シアニン色素、またはこれらの色素の代わりになるよう設計されたいずれかの色素によるものである。
【００５８】
フルオレセイン塩には、例えばフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、3-o-メチルフルオレセインホスフェート、フルオレセインアミン、フルオレセインジアセテート、フルオレセインカプロエート、フルオレセインジラウレート、フルオレセインジプロピオネート、フルオレセインジ-β-D-グルクロニド、フルオレセインジ-β-D-ガラクトシド、フルオレセインマーキュリックアセテート、5-カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ-6-カルボキシ-フルオレセイン（TET）、ヘキサクロロ-6-カルボキシ-フルオレセイン（HEX）、5-カルボキシフルオレセイン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、5-カルボキシフルオレセイン-X-N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル、5-カルボキシフルオレセインジアセテートまたは5-ヨードアセトアミドフルオレセインなどがある。
【００５９】
ローダミン塩は、ローダミン-B-イソチオシアネート、スルホローダミン、5(6)-テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、6-カルボキシ-ローダミン、5(6)-アミノテトラメチルローダミン（5(6)-アミノTMR）、5(6)-カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、5(6)-カルボキシテトラメチルローダミン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、5(6)-カルボキシテトラメチル-ローダミン-X-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、5(6)-ヨードアセトアミド-テトラメチルローダミン（IATR）、x-ローダミンイソチオシアネート（XTRITC）、またはローダミンのスルホニルクロリド誘導体（Texas Red）を含む。
【００６０】
ピレン塩には、例えばピレンスルホニルクロリドまたはカスケードブルー（Cascade Blue）色素などがある。シアニン色素はCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5またはCy7色素を含む。フィコビリタンパク質には、例えばフィコエリスリン（PE）、例えばR-PE、フィコシアニン、例えばC-PC、およびR-PC-IIまたはアロフィコシアニン（APC）などがある。
【００６１】
他の潜在的に有用な蛍光性標識には、1,5-IAEDANS（N-(ヨードアセトアミノエチル)-1-ナフチルアミン-5-スルホン酸）；メチルインドキシルまたはその塩、例えば、N-メチルインドキシルアセテートまたはN-メチルインドキシルミリステート；ウンベリフェリルまたはその塩または誘導体、例えば、4-メチルウンベリフェリルカプリレート、4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼ、MUG（4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニド）、4-メチルウンベリフェリルホスフェートまたは4-メチルウンベリフェリルスルフェート；NDA（ナフタレンジアルデヒド）；OPD（o-フタルジアルデヒド）；Quantum色素；ヨウ化プロピジウム；キナクリンマスタードジヒドロクロリド；SITS（4-アセトアミド-4'-イソチオシアノスチルベン-2,2'-ジスルホン酸）；DIDS（4,4'-ジイソチオシアナトスチルベン-2,2'-ジスルホン酸、二ナトリウム塩）；5(6)-カルボキシエオシンまたはその塩、例えば、5(6)-カルボキシエオシンジアセテートまたは5(6)-カルボキシエオシンジアセテート-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル；アクリジンオレンジヘミ亜鉛（hemizinc）塩（塩化亜鉛を有する5(6)-アクリジンジアミン）；NBDクロリド（7-クロロ-4-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾール）；ピリジルオキサゾール；ベンゾキサジアゾール；CTC（5-シアノ-2,3-ジトリルテトラゾリウムクロリド）；ABTS（2,2'-アジノ-ジ-3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸、二アンモニウム塩）；アミノナフタレン；ダンシルクロリド（5-ジメチルアミノ-1-ナフタレンスルホニルクロリド）；DAPI（4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド）；エリスロシンまたはその塩、例えば、エリスロシンアミンまたはEITC（エリスロシンイソチオシアネート）；臭化エチジウム；クマリン類、例えば、AMCA（7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸）またはマリーナブルー（Marina Blue）（6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリンフルオロフォアに基づく）；BODIPY；オレゴングリーン（Oregon Green）；マレイミド、ルシファーイエロー（Lucifer Yellow）、ポルフィリン、PerCP（ペリジニンクロロフィルタンパク質）またはベルジアンレッド（Beljian Red）などがある。
【００６２】
有用な蛍光性の標識には、２以上の発色団または合成発色団の組み合わせもある。タンデム型のコンジュゲートには、例えばPE-APC、PE-テキサスレッド（Texas Red）、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、APC-Cy5.5、APC-Cy7またはPerCP-Cy5.5などがある。合成発色団には、例えば人工光合成分子などがあり得る。
【００６３】
蛍光性標識は様々な商業的供給源から得ることができる。Molecular Probesから得られる様々なAlexa Fluor（登録商標）色素（スルホン酸化クマリンおよびローダミンに基づく標識）が上記の色素のいくつかの代わりになるように設計されている。
【００６４】
発色団および色素原は可視光と強く相互作用する物質であり、酵素反応において種々の比色分析の最終産物を産生する。色素原基質には、分子、例えば、o-ニトロフェノール-β-D-ガラクトピラノシド、クロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド、ニトロブルーテトラゾリウムと5-ブロモ-4-クロロインドリルホスフェートまたは3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンなどがある。化学発光基質には、アクリジニウム（acridium）エステル、アダマンチル1,2-ジオキセタンアリールホスフェートまたは5-置換類似体、ルミノールまたは他の環状ジアシルヒドラジド類などがある。
【００６５】
他の潜在的に有用なトレーサータグには、希土類金属標識（ランタニド、イットリウムまたはクリプチウム（cryptium）を含む）または放射性標識、例えば、32P、14C、35S、125Jなどがあり得、これらは十分なシグナルを提供し、十分な半減期を有する。
【００６６】
検出プローブのプールを作製する際に、化学的手段、例えば、増幅すべき核酸配列に特異的な、標識化したまたはタグを付けたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術によって、プローブをトレーサーまたは標識により直接標識することができる。複数の分子の標識、例えば3×FITCまたは5×FITCタグのプライマー配列への組み込みにより、検出段階においてより高い強度が得られる。標的配列のPCR増幅のためのプライマーおよび条件を設計する方法は当業者によく知られている。標識化したプライマーは商業的供給源から得ることができる。PCR過程における直接的な標識化のための適切なヌクレオチドは市販購入し得る。それらには、デオキシヌクレオチド、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン-イソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、ローダミングリーン（Rhodamine Green）、シアニン-3、シアニン-5、BODIPY、クマリン、テキサスレッド、オレゴングリーンまたはカスケードブルーにより標識化したdUTPなどがある。色素の直接的な組み込みにより、増幅されたDNA産物の低レベルの標識化が生じ得る。標識化効率は、アミノアリルdUTPをPCR産物に導入し、次に色素を修飾PCR産物に化学的にカップリングすることにより改善され得る。直接的な標識化は、DNAコンストラクトを単離または合成した後に、当分野において知られる方法によって、例えばニックトランスレーションによって行ってもよい。
【００６７】
3. 試験キットの調製
プール
本発明の試験キットは、測定すべき標的の量に対して過剰に存在する可溶性または可溶化できる検出プローブの混合物を含む１つのプールまたは複数のプールを含む。プールはいずれかの種類の容器に組み込むことができ、完全に分離していてもよく、または固定されていない様式、または強固に固定された様式のいずれかにて連結されていてもよい。その最も単純な形態において、プールは１以上の容器、例えば試験管または瓶を含み、固定されていない様式にて例えば試験管立てにおいて一緒に連結されていてもよい。強固に固定された様式にてともに連結された容器内に入れられたプールの実践的な例には、マイクロタイタープレート上のコンパートメントまたはウェルがある。可溶性のプールは、各プールが明確に同定可能であり、検出プローブのその含有量が分かっている様式にて体系化する。コンパートメントまたはウェルを有するマイクロタイタープレートが典型的であり、市販購入し得る実施形態において、多数のプールを簡便に同時に取り扱うことが可能である。複数のコンパートメントを有するテーラーメイドの便利なプールを開発し、作製し、適切なマークおよび使用説明書を提供してもよい。
【００６８】
プールは、既定の可溶性のまたは可溶化できる検出プローブのサブセットまたはライブラリーである。試験キットのそれぞれのプールは、随意的に定義された数の検出プローブを含む。プールにおける検出プローブの数は常に１より多い。便利な随意的な数は、おおよそ5または10の異なる検出プローブである。しかしながら、本方法はわずか２または３の検出プローブを用いて行うこともできる。上限は分解能によって決まる。短い検出プローブを用いる場合、プール中の検出プローブの量の都合よい上限は約50〜60のようであるが、より良い分解能を得るためには、その数はプールあたり50〜60検出プローブより少なくするべきである。オリゴヌクレオチドプローブのみならず、より長いポリヌクレオチドも試験において検出プローブとして用いてもよいが、数個のプローブを含むプールにおいては、長いポリヌクレオチドプローブは、調製のために時間を消費し、費用が高くつくだけでなく、長いプローブは、ミスマッチ、環形成および上述のような他の問題を引き起こす可能性がある。それ故に、特に、ヌクレオチド変異が示されるべきである本発明において、より短いプローブを用いるのが好ましい。
【００６９】
有利には、検出プローブは、同じプール中の検出プローブが互いにハイブリダイズすることによってハイブリダイゼーション反応を妨げるようなことがなく、かつ区別可能に記録されるように異なるサイズを有するように設計すべきである。１より多い検出プローブからなる混合物を含むプールを、本発明の方法に容易に適用可能な試験キットを調製するのに用いる。
【００７０】
上述のように、試験キットに用いられる検出プローブのプールは、好ましくはDNAフラグメントであり、好ましくは鋳型としてゲノムDNAまたはRNA配列を用いて調製される。検出プローブは、特徴決定された、部分的に特徴決定された、または特徴決定されていないmRNAから複製されたcDNAであり得る。検出プローブは化学的に合成してもよく、それらはPCR反応および適切なプライマーを用いて増幅することにより作製してもよく、また上述のように合成的に都合よく産生してもよく、また所望の制限酵素によって切断することにより異なるサイズにしてもよい。
【００７１】
試験キットは検出プローブの混合物を含むプールを有することを特徴とし、検出プローブは、標的内の既定の配列と相補的である検出プローブの配列、それらの区別可能なサイズ、トレーサータグなどにより識別され得る。試験キットのプールは、検出プローブに加え、アフィニティータグを付けた捕捉プローブおよび／またはアフィニティータグのカウンターパートにより被覆された固体担体を含んでも含まなくてもよい。試験キットは、プールに存在しないが、別個の試薬として提供される他の成分を含んでもよく、それらも他の供給源から市販購入し得る。しかし、これらの補助試薬の存在により、試験キットを異なるテーラーメイドの用途に容易に適応させることができる。
【００７２】
上記のように、試験キット中のプールは、アフィニティータグを付けた捕捉プローブを含んでもよく、それらは通常検出プローブが遊離した後に固体担体上に残り、再利用され得るので、検出プローブの記録を妨げない。さらに、それらにトレーサータグは付与されず、蛍光、発光などに基づく記録を妨げない。アフィニティータグを付けた捕捉プローブのサイズは検出プローブのサイズと異なるので、たとえ質量スペクトル分析法を用いて記録されても区別され得る。
【００７３】
本発明の方法において、標的-検出プローブハイブリッドは固体支持体上に捕捉される、または結合する。本発明の液体固体相ハイブリダイゼーション溶離方法において、固体担体は、たとえそれらが別個に供給され得るとしても、試験キットにおいて不可欠な構成要素であり、他の供給源から市販購入できる。固体担体は好ましくは磁性マイクロビーズであり、用いられるアフィニティータグのカウンターパートにより被覆される。言い換えると、アフィニティータグがビオチンである場合、カウンターパートはアビジンである。ビオチンおよびアビジンは適切な好ましいアフィニティー対を形成する。固体支持体の被覆は化学的手段により達成され、場合により単純に、固体支持体の表面とアフィニティータグのカウンターパートの間の静電気的な親和性が、安定な結合に十分である。
【００７４】
固体担体は通常、マイクロビーズ、ラテックス粒子、微小粒子、糸状のもの、釘状のもの、スティック、マイクロウェルまたはアフィニティーカラム、凹部またはリザーバーの壁であり、これらにアフィニティータグのカウンターパートを提供する、またはカウンターパートにより被覆する。必要に応じて、固体支持体は磁性体であり、または粒子を移動させる手段、例えば相分離、電気泳動または他の手段を含んでもよく、アフィニティータグのカウンターパートの存在に依拠し得る。
【００７５】
分析段階
本発明は、粗製の細胞または組織細胞ライセート中の１以上の標的およびそれらの標的に存在するヌクレオチド変異の量を同時に測定する方法に関する。本方法は、区別可能であり、そのごく近傍にヌクレオチド変異を有することが予期されるゲノムまたは遺伝子内の領域に相補的である検出プローブを記録することにより行う。検出プローブはアフィニティータグを付けた標的へのハイブリダイゼーションにより固体担体上に捕捉される。捕捉されたハイブリッドを洗浄した後、捕捉されたハイブリッドをデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下において伸長を行うことができる逆転写酵素またはDNAポリメラーゼと接触させ、酵素が補助する伸長を行う。検出プローブを再度洗浄した後、検出プローブは溶離し、区別可能に分離され、記録され得る。すべてのヌクレオチドに、明確に異なるトレーサータグを与えてもよく、これらも別個に記録され得る。
【００７６】
段階1−溶液ハイブリダイゼーション
一本鎖にされ、ビオチン、ヒスチジンオリゴマー、ハプテンまたはグリカン、オリゴヌクレオチド配列、オリゴ（dA）またはオリゴ（dT）のようなタグによりアフィニティータグ付けした標的の混合物を含むサンプルを、適切なハイブリダイゼーション溶液とともに検出プローブのプールに加える。あるいは、一本鎖にされた標的の混合物を含むサンプルを、アフィニティータグを付けたプローブをさらに含む検出プローブのプールに加える。ハイブリダイゼーション反応を起こさせる。サイズおよび標的上の選択された領域に相補的なそれらの既定の配列により区別可能な検出プローブ、を、テーラーメイドの試験キットとして便利に提供する。これにより、可溶性の、必要に応じてトレーサータグを付けた安定な検出プローブプールのそれぞれを、アフィニティータグを付けた一本鎖標的調製物のアリコートおよび適切なハイブリダイゼーション溶液と接触させる。それぞれのプールの区画、例えばマイクロタイタープレート上のウェルまたはマイクロ流体マイクロチップデバイス上の凹部もしくはリザーバーにより確保された少量の自由溶液中においてハイブリダイゼーションを起こさせる。
【００７７】
適用可能なハイブリダイゼーション条件は従来技術において知られている。一般に、溶液ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーションをハイブリッド形成に向けて推進する条件下において起こる。過剰のプローブを使用するとハイブリダイゼーションが完了するまで推進される。その方法は非常に堅固で再現性がある。それ故に、研究室ハンドブックおよびテキストブックから知られるいずれかのハイブリダイゼーション、洗浄および遊離条件が適用できる。最も好ましい条件は、試薬、標的によって変動し、容易に最適化し得る。再現性ある結果を得るために、相対評価のための条件は標準化すべきであり、反応物に最もよく合うように適応させるべきではないことに注意されたい。
【００７８】
ハイブリダイゼーション条件には、例えばSambrookら、2001（「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「Preparation and Analysis of Eukaryotic Genomic DNA（真核生物ゲノムDNAの調製および分析）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、第3版、pp 6.50-6.64、2001；「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「Extraction, Purification, and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells（真核生物細胞からのmRNAの抽出、精製および分析）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、第3版、pp 7.42-7.50、2001；「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「Working with synthetic oligonucleotide probes（合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる実験」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、第3版、pp 10.35-10.37、2001）または他の研究室マニュアルに記載されているものがある。標的の100-200以上のヌクレオチドからなるDNAプローブとのハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシー条件、すなわち完全なハイブリッドの算定融解温度Tmより低い20-25℃の温度におけるハイブリダイゼーションにて通常行われる。
【００７９】
工程2−分離段階
上記のように、標的-プローブ複合体またはハイブリッドは、ハイブリダイゼーション反応過程において形成される。トレーサータグを付けた検出プローブとアフィニティータグを付けた標的間に形成された標的-プローブハイブリッドを収集する本発明の方法に、上記の固体担体が必要である。アフィニティー対のより大きなカウンターパート、例えば、アビジンにより被覆された固体担体、例えば、マイクロビーズ、特に磁性微小粒子を、ハイブリダイゼーション溶液に加える、またはプールに供する。いずれの標的にもハイブリダイズしなかった検出プローブを含む捕捉されなかった物質をすべて除去するために、捕捉されたハイブリッドを洗浄してもよい。固体担体は、捕捉を助け、固体担体が一方の溶液から他方の溶液に移動するのを助ける、磁性微小粒子、例えばラテックスビーズであり得る。
【００８０】
アフィニティータグを付けた標的により、ハイブリッドは固体支持体に結合する。プローブと標的のハイブリッドに存在するそれらの検出プローブのみが、固体担体上に集められる。非結合物質、細胞片、アフィニティータグを付けた標的配列上のいずれのマッチする配列にもハイブリダイズすることができなかった、またはマッチ配列を発見できなかった検出プローブを含む過多のプローブを含まないように、集まった標的-検出プローブハイブリッドを洗浄してもよい。
【００８１】
洗浄は、低い塩濃度（例えば0.1×SSC）、Tmより低い12-20℃の温度にて行う。標的、特に100-200ヌクレオチド以上のRNA標的のための典型的な条件は、Sambrookら、1989（「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「Extraction, Purification, and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells（真核生物細胞からのmRNAの抽出、精製および分析）」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、2001）の7.42-7.50頁に掲載されている。それ故に、ハイブリダイゼーション後のハイブリッドの洗浄は、プローブがその標的配列から解離しないように素早く行うべきである。オリゴヌクレオチドプローブのための有用なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、Sambrookら、2001（「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「Working with synthetic oligonucleotide probes（合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる実験）」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、2001）の10.35-10.41頁に掲載されている。
【００８２】
段階3−酵素が補助するプローブの伸長
ハイブリダイゼーション反応および洗浄段階の後、固体担体上に捕捉された標的-プローブハイブリッドを伸長のための緩衝溶液に移す。伸長緩衝溶液は、１以上のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下、標的の5'末端に向けて二本鎖ハイブリッドを伸長し得る酵素を含む。これにより、検出プローブは、標的を鋳型として用いて１以上のデオキシヌクレオチドまたは１つのジデオキシヌクレオチドにより伸長する。伸長緩衝液は、全部で４つのデオキシヌクレオチド、すなわちdATP、dTTP、dCTPおよびdGTPまたは全部で４つのジデオキシヌクレオチド、すなわちddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPまたはそれらの組合せを含んでもよい。試薬は使用説明書とともに市販購入し得る。
【００８３】
酵素が補助する伸長において、酵素はDNAの複製を補助するDNAポリメラーゼであり得る。それらの酵素は、鋳型として用いられるDNA鎖の標的鎖と並ぶデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。重合した分子は鋳型鎖に相補的である。標的がRNAである場合に用いられる酵素はRNA依存性DNAポリメラーゼとしても知られる逆転写酵素であり、これは一本鎖RNAを二本鎖DNAに転写するDNAポリメラーゼ酵素である。これらの酵素およびともに用いられる緩衝液は、例えばSambrookら、2001（「Molecular cloning、a laboratory manual（分子クローニング、研究室マニュアル）」の「In Vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction（ポリメラーゼ連鎖反応によるイン・ビトロにおけるDNAの増幅）」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、2001、pp. 8.18-8.24およびpp. 8.46-8.53）に掲載されている。あるいは、酵素の製造者により推奨される条件において伸長反応を起こさせる。ハイブリッドのそれぞれの検出プローブの3'末端に直接後続する、標的上の最後のフリーのヌクレオチドに依拠して、逆転写酵素は、前記４つの溶液の少なくとも１つにおいて１以上のヌクレオチドを加えることによりプローブを伸長させる。
【００８４】
段階4−洗浄
検出プローブ（伸長されている、または伸長されていない、すなわち、検出プローブはそれらの元来のサイズを有する、または１以上のヌクレオチドにより伸長されている）を有する、固体支持体上に捕捉された標的-プローブハイブリッドは、非結合ヌクレオチド、酵素および他の非結合物質を除去するために洗浄してもよいが、精製は必要なく、それ故に、遊離段階に直接移行することを薦める。
【００８５】
段階5−ハイブリッドからの検出プローブの遊離
洗浄後、ハイブリッドを切断する、すなわち標的とプローブを一本鎖にする溶液により固体支持体上のハイブリッドを溶離させることによって、伸長されている、または伸長されていない検出プローブを遊離させる。かかるアニーリング条件は、ホルムアミドまたはアルカリ性溶液、例えば水酸化ナトリウムまたはカリウムにより提供される。アフィニティータグを付けたプローブが結合した固体支持体は溶液から機械的に分離してもよく、その後、溶液は検出プローブのみを含むことになる。必要であれば一本鎖DNAを、沈殿させ、洗浄してもよい。標的配列からの検出プローブの溶離は、ハイブリッドの分離を補助し一本鎖核酸を生じる条件において行われる。かかる条件は、例えば、ホルムアミド、非常に低い塩濃度の緩衝液、アルカリ性の水または緩衝液を用いて達成し得る。標的からの検出プローブの分離は、上昇した温度（30℃以上）を用いることにより促進され得る。好ましくは緩衝液は後のキャピラリー電気泳動および検出において用いることができるようなものであるべきである。
【００８６】
段階6−結果の記録
一本鎖にされた検出プローブを電気泳動緩衝液に加える。好ましくは、電気泳動が先に用いた緩衝液により直接行われ、種々の検出プローブが同時に記録され得るような条件を用いるべきである。伸長されたまたは伸長されていないDNAの検出プローブをハイブリッドから溶離させ、次にそれらのサイズに基づいてキャピラリーまたはゲル電気泳動により分離させ、その後記録する。
【００８７】
段階7−記録結果および検出プローブの量の計算
次に、検出プローブの量は、グラフ上のピークの領域を外挿し、結果を適切な対照によって較正することにより、グラフから計算することができる。検出プローブにトレーサータグを付けた場合、同じであっても異なっていてもよい適切なトレーサータグ、例えば蛍光性の標識のシグナルを記録する種々の装置を用いて記録し得る。市販のシステムを結果の記録および計算に利用できる。
【００８８】
段階8−記録結果の解釈および標的の量の計算
記録された検出プローブは過剰に存在していたので、ハイブリダイゼーション反応は完了するまで進められていた。結果として、固体担体に捕捉されたそれらの検出プローブは、サンプル中に存在するすべての相補的標的領域にハイブリダイズしたと想定され得る。それ故に、標的およびヌクレオチド変異の量は、測定された検出プローブおよびそれらの伸長の量に対応する。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図1は、本発明による方法の原理を模式的に説明する。標的（1）（この場合RNAであるが一本鎖となったDNAもあり得る）は、ハイブリダイゼーション反応過程において、トレーサータグ（2.1）を担持するトレーサータグを付けた検出プローブ（2）およびアフィニティータグ（3.1）を担持するアフィニティータグを付けた捕捉プローブ（3）に結合する。ハイブリダイゼーションにおいて形成される多くの可能性あるハイブリッドのうちのただ１つを示す。ボックス（4）の標的プローブ複合体またはハイブリッドは、アフィニティータグを付けた捕捉プローブ（3）を介して、磁性球体またはビーズ（5）の表面に結合する。同一サンプルが、逆転写酵素（E）を有する緩衝溶液をそれぞれ含有し、ヌクレオチドdATP、dTTP、dCTPまたはdGTPのいずれかをさらに含む４つの容器に移される。プローブの3'末端のAGGTG末端に隣接する隣接物における標的（1）の5'末端のはじめのフリーのヌクレオチド（この場合ヌクレオチドG）に応じて、逆転写酵素（E）がそのプローブを１以上のヌクレオチド（この場合dCTPを含有する緩衝溶液中において下線を引いたヌクレオチドC）伸長する。dATP、dTTPまたはdGTPを含有する他の溶液において、伸長は起こらない。
【図２】図2は、本発明による方法の別の実施態様の原理を模式的に説明する。ハイブリダイゼーション反応において形成される多くの可能性あるハイブリッドのうちのただ１つを示す。標的（1）（この場合はRNAであるが、一本鎖DNAもあり得る）は、溶液中におけるハイブリダイゼーション反応過程において、検出プローブ（2）、およびアフィニティータグ（3.1）を担持するアフィニティータグを付けた捕捉プローブ（3）に結合する。ボックス（4）の標的-プローブ複合体またはハイブリッドはその後、アフィニティータグを付けた捕捉プローブ（3）を介して磁性球体（5）の表面に結合する。サンプルを逆転写酵素（E）を含有する緩衝溶液に移す。溶液は、それぞれが（6.1）、（6.2）、（6.3）または（6.4）として示された異なるトレーサータグを有し終止コドンとして働く４つのジデオキシヌクレオチド、ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPのすべてを含む。標的（1）の5'末端においてハイブリッドにフランキングするはじめのフリーのヌクレオチド（この場合ヌクレオチドG）に応じて、検出プローブの3'末端のAGGTG末端が逆転写酵素（E）により伸長され得るように、１ジデオキシヌクレオチド、ddCTPがハイブリッドに付加される。検出プローブ（2）において伸長されたCに下線を引いている。
【図３】図3は、（トレーサータグの強度を記録する）本発明の方法を用いてキャピラリー電気泳動のピークとして得られた結果を示す。この実験において、大腸菌（E. coli.）からの既知の配列と混合された結腸癌細胞株（COLO205）からのライセートを含有するサンプルにおいて、３つの異なるプローブ配列（1、2および3）を用いて、ヌクレオチド変異を同定した。図3は、ヌクレオチドdGTPおよび逆転写酵素の存在下において行われた伸長反応の結果を示す。さらなる詳細については図1の説明文を参照のこと。 （1）とマークしたはじめのプローブ（配列番号3）は、イン・ビトロにて転写され陽性ハウスキーピング対照としてハイブリダイゼーション反応に加えられた既知の大腸菌配列（1-traT）に相補的である。他の２つのプローブは、ヒトゲノムにおいて既知の配列に相補的である。これらのプローブはGAPDH（配列番号1）およびPRSS1（配列番号2）であり、それぞれ（2）および（3）とマークしている。 図3において、ピーク（1）は上記に規定の対照プローブ配列番号3からのものであり、ピーク（1B）は２つのdGTPヌクレオチドにより伸長されたプローブ配列番号3からのものである。ピーク（2）はプローブ配列番号1からものもであり、ピーク（2B）は１つのdGTPにより伸長されたプローブ配列番号1からのものである。ピーク（3）はプローブ配列番号2からのものであり、ピーク（3B）は３つのdGTPヌクレオチドにより伸長されたプローブ配列番号2からのものである。dGTPとの反応後、ピーク（1）およびピーク（2）は、逆転写酵素により伸長されていない対照プローブ配列番号3およびプローブ配列番号1の残分である。プローブ配列番号2の残分のピーク（3）は、伸長段階後のdGTP溶液中において検出されなかった。３つのRNAレベルの量はピーク（1−3）および（1B−3B）の面積に基づいて算出することができ、プローブの3'末端に隣接する隣接物におけるはじめのフリーのヌクレオチドがいずれであるかは、プローブが伸長した反応により明らかになった。はじめのヌクレオチドが伸長されない場合、伸長されたプローブは形成されない。80-100％のプローブが正しい反応溶液中において伸長されたので、２つの別のNTPによりプローブを伸長することができる場合において、ポリヌクレオチドのレベルを高精度にて定量化するすることが可能である（ヘテロ接合体、実施例4を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本発明を以下の実施例により例証する。
【実施例１】
【００９１】
発現されたRNA中の１ヌクレオチドの同定
本実施例は、それぞれの標的-検出プローブハイブリッドに後続する１以上のヌクレオチドを同時に同定することにより、結腸癌細胞株COLO205の粗製ライセートから３つのmRNA標的分子を定量的に測定することを実証する。２つのmRNA標的分子は、セリンプロテアーゼをコードするヒト遺伝子PRSS1およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードするGAPDHであった。第３のmRNA標的はイン・ビトロにおいて転写された大腸菌traT遺伝子であり、陽性対照として用いた。
【００９２】
1．準備段階
プローブプールの調製
用いた結腸癌細胞株に存在する２つの既知のヒト遺伝子、
PRSS1、プロテアーゼ、セリン、1（トリプシン1）、NM_002769.2および
GAPDH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、NM_002046.3
のためにプローブ配列を設計した。
大腸菌traT RNA配列を同定する対照プローブを設計した。
【００９３】
プローブ配列はコンピュータプログラムにより以下の判断基準を用いて設計した：プローブ長範囲30-50 nt；融解温度範囲60-75℃；GC％範囲40-60％；設計されるプローブ配列と同一のヒトゲノムのいずれかの部分の配列の最大長の基準は17 ntであった；プローブ配列に対するヒトゲノムのいずれかの部分の配列の最大の類似性の基準は80％であった；プール中のプローブ間のサイズの最小の差異は2ntであった。これらの判断基準を用いて以下のプローブを設計した。
【００９４】
プローブ配列（配列番号1）
5' AGCACAGGGTACTTTATTGATGGTACATGACAAGGT 3'
は36ヌクレオチドを有し、GAPDHグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、NM_002046.3およびそのヌクレオチド変異を検出するために用いた。
【００９５】
プローブ配列（配列番号2）
5' CCTCAAGGAAGCCCACACAGAACATGTTGYTGGTAATCTTTCCA 3'
は44ヌクレオチドを有し、PRSS1プロテアーゼ、セリン、1（トリプシン1）、NM_002769.2およびその中のヌクレオチド変異を検出するために用いた。
【００９６】
プローブ配列（配列番号3）
5'ACCACACGGGTCTGGTATTTATGCT 3'
は25ヌクレオチドを有し、イン・ビトロにて転写された大腸菌traT mRNA、EMBL:ECPTRAT、アクセッションX14566およびその中のヌクレオチド変異を検出するために用いる。
【００９７】
GAPDHおよびPRSS1プローブはMetabionによって合成されたものであり、traTプローブはApplied Biosystemsによるものであった。これらのプローブを１つのプール中に混合した。
【００９８】
陽性対照として用いる大腸菌mRNAの調製
大腸菌traT（EMBL:ECPTRAT、アクセッションX14566）RNAを、ハイブリダイゼーションにおいて陽性対照として用いた。
PCRプライマー（配列番号4）および（配列番号5）
5' CTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGAAAAAATTGATGATGGTおよび
5' TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-CAGAGTGCGATTGATTTGGC
（Metabion、Martinsried、Germany）を用いて、大腸菌DNAからT7プロモーター配列および25 nt長Tテールを含有する鋳型を合成した。この鋳型から、MEGAscript転写キット（Ambion、Austin、TX）を製造者が推奨するように用い、T7-RNAポリメラーゼによりイン・ビトロにてtraT RNAを転写した。合成されたtraT RNAを、Agilent BioanalyserおよびRiboGreen RNA定量化キット（Molecular Probess、Leiden、The Netherlands）により製造者が推奨するように定量した。
【００９９】
細胞ライセートの調製
ヒト結腸癌細胞株COLO205を96ウェルプレートにおいて培養した。おおよそ10×104の細胞を96ウェルプレートの12ウェルに加え、10％FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび1％グルタミンを含有するRPMI 1640成長培地100μl中、37℃、8％CO2にて24時間培養した。24時間後、溶解緩衝液100μl：1×TE（10 mMトリス-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5）中0.5％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）により細胞を溶解させた。溶解緩衝液により処理した細胞をシリンジの針に通した。
【０１００】
ハイブリダイゼーション
4 pmolのアフィニティータグを付けたビオチン化オリゴ（dT）アフィニティープローブ（Promega）、1 pmolの6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）により標識化したプローブGAPDHおよびPRSS1、および１つの2,7',8'-ベンゾ-5'-フルオロ-2',4,7-トリクロロ-5-カルボキシ-フルオレセイン（NED）により標識化したtraT プローブ、5×SSC（750 mM塩化ナトリウム、75 mMクエン酸ナトリウム）、0.2％SDS、1×デンハート（Denhardt）溶液（0.02％フィコール（Ficoll）、0.02％ポリビニルピロリドン、0.02％BSA）、および1.5 fmolのイン・ビトロにて転写した大腸菌traT mRNAを含有するハイブリダイゼーション緩衝液に細胞ライセート100μlを移した。96ウェルPCRプレート（ABgene、Epsom、UK）において60℃にて、650 rpmで振盪しながら30分間ハイブリダイゼーションを行った（サーモミキサーコンフォート（Thermomixer Comfort）、Eppendorf、Hamburg、Germany）。
【０１０１】
親和性による捕捉、プローブ伸長、洗浄および溶離
親和性による捕捉、プローブ伸長、洗浄および溶離を含む、ハイブリダイゼーション後の段階は、96ウェルプレートにおいて室温にて磁性ビーズ粒子プロセッサKingFisher 96（Thermo Electron、Vantaa、Finland）により以下のように自動化して行った：
1）50μgのストレプトアビジンにより被覆したMyOne DynaBeads（Dynal、Oslo、Norway）にハイブリダイズしたRNA標的の、親和性による捕捉（30分間）；
2）0.1×SSC、0.1％SDS 150μlにおいて1.5分間２回ビーズを洗浄する；
3）2 mM Mg2Cl、2.4 U/μl M-MuLV RNaseH−転写酵素（F-572L、Finnzymes）およびM-MuLV反応緩衝液（F-577B、Finnzymes）中の0.4 mMのいずれかのdNTP：dATP、dTTP、dCTPまたはdGTPを含有する４つのいずれかの溶液（総体積50μl）中において、37℃にて30分間ビーズをインキュベーションする；
4）0.1×SSC、0.1％SDS 150μl中においてビーズを1.5分間２回洗浄する；および
5）ハイブリッドを一本鎖にするホルムアミド（Applied Biosystems）10μlにより37℃にて20分間プローブを溶離させる。
【０１０２】
溶離液はABI PRISM 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems、Foster City、CA）を用いてキャピラリー電気泳動によって分析した。検出プローブのサイズによる分離を較正するために、GeneScan-120LIZ size standard（Applied Biosystems）を各サンプルに加えた。プローブの同一性は泳動速度およびピーク領域による量によって決定した。
【０１０３】
結果は図3に示すとおりであった。
【実施例２】
【０１０４】
単一の反応容器におけるヌクレオチド変異の同定
標的およびプローブの調製は、実施例1に記載の通りであるが、アフィニティータグが付けられ、固体支持体上にハイブリダイズし、捕捉され、洗浄された１以上の標的ポリヌクレオチド配列を含有するサンプルを、逆転写酵素を含有し、それぞれ明確に異なるトレーサータグにより標識化した成分、ddATP、ddTTP、ddCTPおよびddGTPの全てをさらに含む緩衝溶液に移す（図2）。標的の5'末端上のプローブの3'末端に直接後続するフリーのヌクレオチドに応じて、逆転写酵素は溶液中において１以上のプローブを１ヌクレオチド分伸長させる。ddNTPが組み込まれると、ddNTPは3位の炭素原子上にH原子を含有する（dNTPはその位置にOH原子を含有する）ので、伸長反応は止まる。この場合、ハイブリダイゼーションに用いられるポリヌクレオチド配列に相補的なプローブにトレーサータグを付ける必要はないが、トレーサーを逆転写酵素によるプローブ伸長の最中に組み込む。溶離の後、伸長されたプローブを好ましくはキャピラリー電気泳動により定量化し、プローブの3'末端に後続するヌクレオチドがいずれであるかはトレーサータグの種類から明らかである。結果を実施例1に記載のように表し、計算する。
【実施例３】
【０１０５】
嚢胞性線維症膜貫通制御因子遺伝子（CFTR）の発現を定量化する方法の使用、および嚢胞性線維症（CF）を引き起こすCFTR中の一塩基多型（SNP）の同定
嚢胞性線維症（CF）は、常染色体劣性の様式にて遺伝する一般的な致死性の遺伝的障害である。病原性のCFTRの突然変異のホモ接合体または複合ヘテロ接合体を有する個体はCFに罹患しており、CFの疾患表現型は、異なる程度の膵臓不全を伴う重度から軽度の肺疾患と様々である（Lee et al., Mutation research (2005), 573, 195-204）。現在のところ、CFTRの1000以上の突然変異が記録されている。CFTR遺伝子のいくつかの突然変異、例えば、F508del（最も一般的）、394delTT、G542X、N1303は、重症のCF表現型を伴い、高い疾患浸透率を示す。
【０１０６】
本発明に記載の方法を用いて、その中に種々のCF関連ヌクレオチド変異を有すると同定された、例えば各種ヒト組織から収集されたサンプル中のCFTR遺伝子のアレル特異的発現を測定する。
【０１０７】
準備段階
細胞ライセートの調製
はじめに、組織サンプルを、例えばホモジナイズにより小さな粒子サイズに破壊する。得られた小さな粒子を含むサンプル物質を実施例1の結腸癌細胞株サンプルと同様に溶解させる。
【０１０８】
プローブプールの調製
5以上の異なるCF疾患関連ヌクレオチド変異または突然変異（例えばF508del、1540A/G、394delTT、G542X、N1303K）の同定に用い得るCFTR mRNAの位置に結合するように、5以上のオリゴヌクレオチドプローブを設計する。対応するCFTR遺伝子配列変異／突然変異の同定に用い、１つのプールにまとめるべきプローブ配列には以下のものがあり得る。
【０１０９】
F508del
プローブ
5'-GTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAA（配列番号6）
は29ヌクレオチドを有し、突然変異F508del、すなわち1652と1655の間の3bpの欠失の検出に用いる。
【０１１０】
標的配列：
野生型配列は
TCATCTTTGGTGTT（配列番号7）
であり、CFを引き起こすF508del突然変異は
TCA...TTGGTGTT（配列番号8）
であり、ここで...は3つの欠失ヌクレオチドの部位を示す。
【０１１１】
1540A/G
プローブ配列番号9は、1540A/G ヌクレオチド変異の検出のためのプローブであり、コドン470（M470/V470）におけるメチオニン／バリン多型を同定し、配列
5'-TACCCTCTGAAGGCTCCAGTTCTCCCATAATCA
を有する。
【０１１２】
標的配列：
1540A（コドン470にメチオニン）は
TAATGATGATTA（配列番号10）であり、
TAATGGTGATTA（配列番号11）
は1540G（コドン470にバリン）である。
【０１１３】
394delTT
プローブは
5'-GAGAGGCTGTACTGCTTTGGTGACTTCCCCTAAATAT（配列番号12）
である。このプローブは、394delTT、配列の394位の２つのT塩基の欠失の検出のために用いる。
【０１１４】
標的配列：
野生型は、
TCTTTTTATATTTAGGGGAAGTCACC（配列番号13）であり、
TCTTT..ATATTTAGGGGAAGTCACC（配列番号14）
は、CFを引き起こす２つのT塩基の欠失、394delTT突然変異を有する配列であり、ここで2つのドット..は２つの欠失したT塩基を示す。
【０１１５】
G542X
プローブは、
5' ATTCTTGCTCGTTGACCTCCACTCAGTGTGATTCCACCTTCTC（配列番号15）
であり、G542Xヌクレオチド変異の検出のために用いる。
【０１１６】
標的配列：
野生型は、
TTCTTGGAGAAGGTGGA（配列番号16）であり、
TTCTTTGAGAAGGTGGA（配列番号17）
は、CFを引き起こすG542X突然変異を含有する。
【０１１７】
N1303K
プローブは
5' GCAACTTTCCATATTTCTTGATCACTCCACTGTTCATAGGGATCCAA（配列番号18）
であり、N1303Kの検出のために用いる。
【０１１８】
標的配列：
野生型は、
GAAAAAACTTGGATC（配列番号19）であり、
GAAAAAAGTTGGATC（配列番号20）
は、CFを引き起こすN1303K突然変異を含有する。
【０１１９】
プローブの長さの差異により、１つのプールにおいて質量スペクトル分析法のキャピラリー電気泳動を用いてそれらを同定することができる。
【０１２０】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応は、CFを引き起こすヌクレオチド変異を検出するために標的化した、蛍光標識を有するまたは有さない上記のプローブを用いて、実施例1に記載のように行う。
【０１２１】
親和性による捕捉、プローブ伸長、洗浄および溶離
親和性による捕捉、プローブ伸長、洗浄、溶離は、実施例1に記載のものと同様に行う。１つのプールにまとめられたプローブの検出は、キャピラリー電気泳動または質量スペクトル分析法を用いて行う。
【０１２２】
結果：
各プローブにおいて、３つの可能性ある結果が存在する。
1．野生型ホモ接合体、すなわちサンプルは研究された変異の野生型配列を有するCFTR mRNAのみを含有し、測定した伸長されたプローブの量により定量化し得る。
2．変異型ホモ接合体、すなわちサンプルは研究された変異の変異型配列を有するCFTR mRNAのみを含有し、測定した伸長されたプローブの量により定量化し得る。
3．ヘテロ接合体、すなわちサンプルは野生型および変異型CFTR mRNA配列の両方を含有し、その比率は伸長されたプローブの量によって定量化し得る。これはCF疾患の診断において用い得る。発現比は疾患の重症度の予測にも用いられ得る。さらに、異なるアレルの組織特異的発現が種々の組織から収集されたサンプル間にて比較し得る。各標的ヌクレオチド変異についての具体的な結果を以下に詳しく記載する。
【０１２３】
F508del
野生型ホモ接合体：プローブは１つのdATPにより伸長する。
F508delの変異型ホモ接合体：プローブは１つのdTTPにより伸長する。
ヘテロ接合体：プローブは１つのdATPまたは１つのdTTPのいずれかにより伸長する。これらの２つの異なって伸長したプローブの比率により２つのアレル（野生型および変異型配列）の相対的発現が明らかになる。
【０１２４】
1540A/G
VV470（1540A）のホモ接合体：プローブ配列は２つのdCTPにより伸長する。
MM470（1540G）のホモ接合体：プローブ配列は１つのdTTPにより伸長する。
VM470（1540A/G）のヘテロ接合体：プローブ配列は２つのdCTPまたは１つのdTTPのいずれかにより伸長する。これらの２つの異なって伸長したプローブの比率により、２つのアレル（野生型および変異型配列）の相対的発現が明らかになる。
V470多型は疾患を引き起こす変異ではないが、他の軽度のCFTR変異を伴うV470 は疾患の原因となり得る。
【０１２５】
394delTT
野生型ホモ接合体：プローブは５つのdTTPにより伸長される。
394TTのホモ接合体：プローブは３つのdTTPにより伸長する。
ヘテロ接合体：プローブは３つのdTTPまたは５つのdTTPのいずれかにより伸長する。これらの２つの異なって伸長したプローブの比率により、2つのアレル（野生型および変異型配列）の相対的発現が明らかになる。
【０１２６】
G542X
野生型ホモ接合体：プローブは１つのdCTPにより伸長する。
G542Xのホモ接合体：プローブは３つのdATPにより伸長する。
ヘテロ接合体：プローブは３つのdATPまたは１つのdCTPのいずれかにより伸長する。
これらの２つの異なって伸長したプローブの比率により、2つのアレル（野生型および変異型配列）の相対的発現が明らかになる。
【０１２７】
N1303K
野生型ホモ接合体：プローブは１つのdGTPにより伸長する。
N1303Kのホモ接合体：プローブは１つのdCTPにより伸長する。
ヘテロ接合体：プローブは１つのdCTPまたは１つのdGTPのいずれかにより伸長する。これらの２つの異なって伸長したプローブの比率により、2つのアレル（野生型および変異型配列）の相対的発現が明らかになる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のポリヌクレオチド配列を含むサンプル溶液から、複数の標的ポリヌクレオチド配列（標的）および該標的の各々に存在するヌクレオチド変異の量を、該標的にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド配列（検出プローブ）の量および伸長した検出プローブの量を測定することにより同時に測定する方法であって、該ヌクレオチド変異は測定すべき少なくとも１のヌクレオチドを含み、該測定方法は以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（a）１以上の検出プローブプールを調製する工程、ここで各プールは少なくとも２の異なる一本鎖検出プローブの混合物を含み、該混合物中の各検出プローブは
（i）水ベースのサンプル溶液に可溶性であり；
（ii）標的に対して過剰に存在し；
（iii）測定すべき標的中の既定の配列に相補的であり、該配列は測定すべきヌクレオチド変異のヌクレオチドが直接後続する部位に位置し；
（iv）標的中の該既定の配列にハイブリダイズした各検出プローブおよび伸長された場合の伸長された検出プローブの区別可能な分離および記録を可能とする、既定の明確に異なるサイズを有し；
（v）測定すべきヌクレオチド変異中の測定すべきヌクレオチド数より少なくとも１ヌクレオチド多い数だけサイズが異なり、
（vi）検出可能な標識によりトレーサータグ付けされている；および
（b）検出プローブの混合物を含むプールを、一本鎖にされた標的を含む複数のポリヌクレオチド配列を含むサンプル溶液と接触させる工程；
（c）検出プローブと標的との間にハイブリダイゼーション反応を起こさせる工程、ここで該標的はハイブリダイゼーション反応の前または最中にアフィニティータグ付けされ、アフィニティータグ付き標的-検出プローブハイブリッドの形成を補助するハイブリダイゼーション条件を提供することによりハイブリダイゼーション反応を起こさせる；
（d）標的上のアフィニティータグのカウンターパートにより被覆された固体支持体上に、アフィニティータグを付けたポリヌクレオチド配列を含む標的-検出プローブハイブリッドを捕捉する工程；
（e）非結合物質を除去し、固体支持体を洗浄することにより、固体支持体を精製する工程；
（f）標的-検出プローブハイブリッドを含む固体支持体を、少なくとも１のデオキシヌクレオチドまたは少なくとも１のジデオキシヌクレオチドの存在下において標的を鋳型として用いて検出プローブの3'末端を少なくとも１のデオキシヌクレオチドまたは１つのジデオキシヌクレオチドにより伸長することができる酵素を含む緩衝溶液と接触させることにより、酵素が補助する伸長反応を行う工程；
（g）標的-検出プローブハイブリッドを一本鎖にすることにより、伸長した検出プローブを含む検出プローブを遊離させる工程；
（h）該検出プローブをキャピラリーまたはゲル電気泳動を用いて互いにサイズにより分離し、較正された自動または半自動の記録装置および標準化するための対照を用いて、検出可能な標識によりトレーサータグを付けた検出プローブの強度をグラフとして記録し、遊離した伸長した検出プローブを含む検出プローブの量を計算することによって、複数の標的ポリヌクレオチド配列およびその中のヌクレオチド変異の量を測定する工程、ここでグラフの各ピークは検出プローブまたは該検出プローブに由来する伸長された検出プローブの量に対応し、各検出プローブおよび各伸長した検出プローブの量は一緒になって該検出プローブにハイブリダイズした相補的標的の総量に対応し、各伸長した検出プローブの量は該標的に存在するそれぞれのヌクレオチド変異の量に対応する。
【請求項２】
酵素が補助する伸長が別個の緩衝溶液中にて行われ、各溶液が４つのジデオキシヌクレオチドのいずれかのみ、または４つのデオキシヌクレオチドのいずれかのみを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
標的がRNAである場合に、酵素が逆転写酵素であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
標的がDNAである場合に、酵素がDNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
ハイブリダイゼーション反応の前または最中に、アフィニティータグを付けた捕捉プローブを介して、標的がアフィニティータグ付けされることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
標的がポリアデニル化される場合、アフィニティータグとして働くポリ（dT）配列、またはさらなるアフィニティータグを有するポリ（dT）配列である捕捉プローブを介して、該標的がアフィニティータグ付けされることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
検出プローブが、DNAフラグメント、合成または修飾オリゴヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
ハイブリダイゼーション反応の前、最中または後に、固体担体がプールに加えられることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
検出可能な標識が、蛍光、発光、赤外吸収、放射活性または酵素反応に基づいて検出可能であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
検出可能な標識がフルオロフォアまたは発色団であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
アフィニティータグとそのカウンターパートが、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、ヒスチジンオリゴマーと金属キレート、ハプテンと抗体、受容体とリガンド、およびグリカンとレクチンからなる群から選択されるアフィニティー対を形成することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
標的がゲノムDNA配列であり、同時に測定された複数の標的および該標的中のヌクレオチド変異の量により、標的とヌクレオチド変異を有する標的との間の比率、および、これにより測定すべき標的に存在するそれぞれのヌクレオチド変異のホモ接合またはヘテロ接合状態を測定することが可能となることを特徴とする、多重の遺伝子型同定を行うための、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
標的が、発現されたRNA配列であり、複数の標的およびその中のヌクレオチド変異の量により、標的とヌクレオチド変異を有する標的との比率、および該標的の発現レベルを測定することが可能となることを特徴とする、アレル特異的発現の多重分析を行うための、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定が試験キット上にて行われ、該試験キットが別個のまたは連結した容器に入った１以上の検出プローブプールを含み、各検出プローブプールが少なくとも２の異なる一本鎖検出プローブの混合物を含み、該混合物中の各検出プローブが、
（i）水ベースのサンプル溶液に可溶性であり；
（ii）標的に対して過剰に存在し；
（iii）測定すべき標的中の既定の配列に相補的であり、該配列は測定すべきヌクレオチド変異のヌクレオチドが直接後続する部位に位置し；
（iv）標的中の該既定の配列にハイブリダイズした伸長されている可能性のある各検出プローブの区別可能な分離および記録を可能とする、既定の明確に異なるサイズを有し；
（v）測定すべきヌクレオチド変異中の測定すべきヌクレオチド数より少なくとも１ヌクレオチド多い数だけサイズが異なり；および
（vi）検出可能な標識によりトレーサータグ付けされており、
該試験キットがパッケージの形態であり、パッケージに組み込まれたさらなる試薬、ならびにハイブリダイゼーションおよび伸長反応のための適用可能な条件および標的濃度とサンプル溶液を希釈するための適切なモデルを含む使用説明書と組み合わせてパッケージされていることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
試験キットが、プール中に入れられた、またはパッケージされた組合せ中に別個に入れられたアフィニティータグを付けた捕捉プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
試験キットが、プール中に入れられた、またはパッケージされた組合せ中に別個に入れられたアフィニティータグのカウンターパートにより被覆された固体支持体をさらに含むことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
試験キットが、パッケージされた組み合わせ中に、酵素、ジデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチドおよび補助的な緩衝液および溶液をさらに含むことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１】
複数のポリヌクレオチド配列を含むサンプル溶液から、複数の標的ポリヌクレオチド配列（標的）および該標的の各々に存在するヌクレオチド変異の量を、該標的にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド配列（検出プローブ）の量および伸長した検出プローブの量を測定することにより同時に測定する方法であって、該ヌクレオチド変異は測定すべき少なくとも１のヌクレオチドを含み、該測定方法は以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（a）１以上の検出プローブプールを調製する工程、ここで各プールは少なくとも２の異なる一本鎖検出プローブの混合物を含み、該混合物中の各検出プローブは
（i）水ベースのサンプル溶液に可溶性であり；
（ii）標的に対して過剰に存在し；
（iii）測定すべき標的中の既定の配列に相補的であり、該配列は測定すべきヌクレオチド変異のヌクレオチドが直接後続する部位に位置し；
（iv）標的中の該既定の配列にハイブリダイズした各検出プローブおよび伸長された場合の伸長された検出プローブの区別可能な分離および記録を可能とする、既定の明確に異なるサイズを有し；
（v）測定すべきヌクレオチド変異中の測定すべきヌクレオチド数より少なくとも１ヌクレオチド多い数だけサイズが異なり、
（vi）検出可能な標識によりトレーサータグ付けされている；および
（b）検出プローブの混合物を含むプールを、一本鎖にされた標的を含む複数のポリヌクレオチド配列を含むサンプル溶液と接触させる工程；
（c）検出プローブと標的との間にハイブリダイゼーション反応を起こさせる工程、ここで該標的はハイブリダイゼーション反応の前または最中にアフィニティータグ付けされ、アフィニティータグ付き標的-検出プローブハイブリッドの形成を補助するハイブリダイゼーション条件を提供することによりハイブリダイゼーション反応を起こさせる；
（d）標的上のアフィニティータグのカウンターパートにより被覆された固体支持体上に、アフィニティータグを付けたポリヌクレオチド配列を含む標的-検出プローブハイブリッドを捕捉する工程；
（e）非結合物質を除去し、固体支持体を洗浄することにより、固体支持体を精製する工程；
（f）標的-検出プローブハイブリッドを含む固体支持体を、少なくとも１のデオキシヌクレオチドまたは少なくとも１のジデオキシヌクレオチドの存在下において標的を鋳型として用いて検出プローブの3'末端を少なくとも１のデオキシヌクレオチドまたは１つのジデオキシヌクレオチドにより伸長することができる酵素を含む緩衝溶液と接触させることにより、酵素が補助する伸長反応を行う工程；
（g）標的-検出プローブハイブリッドを一本鎖にすることにより、伸長した検出プローブを含む検出プローブを遊離させる工程；
（h）該検出プローブをキャピラリーまたはゲル電気泳動を用いて互いにサイズにより分離し、較正された自動または半自動の記録装置および標準化するための対照を用いて、検出可能な標識によりトレーサータグを付けた検出プローブの強度をグラフとして記録し、遊離した伸長した検出プローブを含む検出プローブの量を計算することによって、複数の標的ポリヌクレオチド配列およびその中のヌクレオチド変異の量を測定する工程、ここでグラフの各ピークは検出プローブまたは該検出プローブに由来する伸長された検出プローブの量に対応し、各検出プローブおよび各伸長した検出プローブの量は一緒になって該検出プローブにハイブリダイズした相補的標的の総量に対応し、各伸長した検出プローブの量は該標的に存在するそれぞれのヌクレオチド変異の量に対応する。
【請求項２】
酵素が補助する伸長が別個の緩衝溶液中にて行われ、各溶液が４つのジデオキシヌクレオチドのいずれかのみ、または４つのデオキシヌクレオチドのいずれかのみを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
標的がRNAである場合に、酵素が逆転写酵素であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
標的がDNAである場合に、酵素がDNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
ハイブリダイゼーション反応の前または最中に、アフィニティータグを付けた捕捉プローブを介して、標的がアフィニティータグ付けされることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
標的がポリアデニル化される場合、アフィニティータグとして働くポリ（dT）配列、またはさらなるアフィニティータグを有するポリ（dT）配列である捕捉プローブを介して、該標的がアフィニティータグ付けされることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
検出プローブが、DNAフラグメント、合成または修飾オリゴヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
ハイブリダイゼーション反応の前、最中または後に、固体担体がプールに加えられることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
検出可能な標識が、蛍光、発光、赤外吸収、放射活性または酵素反応に基づいて検出可能であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
検出可能な標識がフルオロフォアまたは発色団であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
アフィニティータグとそのカウンターパートが、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、ヒスチジンオリゴマーと金属キレート、ハプテンと抗体、受容体とリガンド、およびグリカンとレクチンからなる群から選択されるアフィニティー対を形成することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
標的がゲノムDNA配列であり、同時に測定された複数の標的および該標的中のヌクレオチド変異の量により、標的とヌクレオチド変異を有する標的との間の比率、および、これにより測定すべき標的に存在するそれぞれのヌクレオチド変異のホモ接合またはヘテロ接合状態を測定することが可能となることを特徴とする、多重の遺伝子型同定を行うための、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
標的が、発現されたRNA配列であり、複数の標的およびその中のヌクレオチド変異の量により、標的とヌクレオチド変異を有する標的との比率、および該標的の発現レベルを測定することが可能となることを特徴とする、アレル特異的発現の多重分析を行うための、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定が試験キット上にて行われ、該試験キットが別個のまたは連結した容器に入った１以上の検出プローブプールを含み、各検出プローブプールが少なくとも２の異なる一本鎖検出プローブの混合物を含み、該混合物中の各検出プローブが、
（i）水ベースのサンプル溶液に可溶性であり；
（ii）標的に対して過剰に存在し；
（iii）測定すべき標的中の既定の配列に相補的であり、該配列は測定すべきヌクレオチド変異のヌクレオチドが直接後続する部位に位置し；
（iv）標的中の該既定の配列にハイブリダイズした伸長されている可能性のある各検出プローブの区別可能な分離および記録を可能とする、既定の明確に異なるサイズを有し；
（v）測定すべきヌクレオチド変異中の測定すべきヌクレオチド数より少なくとも１ヌクレオチド多い数だけサイズが異なり；および
（vi）検出可能な標識によりトレーサータグ付けされており、
該試験キットがパッケージの形態であり、パッケージに組み込まれたさらなる試薬、ならびにハイブリダイゼーションおよび伸長反応のための適用可能な条件および標的濃度とサンプル溶液を希釈するための適切なモデルを含む使用説明書と組み合わせてパッケージされていることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
試験キットが、プール中に入れられた、またはパッケージされた組合せ中に別個に入れられたアフィニティータグを付けた捕捉プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
試験キットが、プール中に入れられた、またはパッケージされた組合せ中に別個に入れられたアフィニティータグのカウンターパートにより被覆された固体支持体をさらに含むことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
試験キットが、パッケージされた組み合わせ中に、酵素、ジデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチドおよび補助的な緩衝液および溶液をさらに含むことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５１８８４６（Ｐ２０１０−５１８８４６Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５０７３６（Ｐ２００９−５５０７３６）
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５００７４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０２０５７
【国際公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０００２０７７１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００８／０５００７４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０２０５７
【国際公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０００２０７７１）
【Ｆターム（参考）】
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