樹状細胞を活性化する方法
【課題】 抗原を発現し、活性化された樹状細胞が開示される
【解決手段】 そのような樹状細胞は、腫瘍、ウイルス、もしくは細菌性抗原をＴ細胞に提示するのに使われ、予防接種プロトコールに有用となりうる。他のサイトカインを、該活性化され抗原パルスされた樹状細胞と別々に、逐次的にもしくは同時に組み合わせて使用することが可能である。抗原を発現し活性化された樹状細胞を用いて免疫応答を刺激する方法も開示される。
【解決手段】 そのような樹状細胞は、腫瘍、ウイルス、もしくは細菌性抗原をＴ細胞に提示するのに使われ、予防接種プロトコールに有用となりうる。他のサイトカインを、該活性化され抗原パルスされた樹状細胞と別々に、逐次的にもしくは同時に組み合わせて使用することが可能である。抗原を発現し活性化された樹状細胞を用いて免疫応答を刺激する方法も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）活性化因子、リンパ球を介した免疫応答をｉｎ ｖｉｖｏで昂進する方法、並びに、細胞性および体液性免疫応答の操作に有用な樹状細胞集団に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の技術
予防接種は、感染症による死もしくは障害を防ぐ有効な手段である。感染症における本法の成功は、新生物疾患の治療もしくは予防における予防接種の利用に対する興味も刺激してきた。しかしながら、ワクチン利用により達成された数々の成功にもかかわらず、ワクチン開発の分野には未だに多くの挑戦がある。非経口の投与経路、多くの異なる予防接種が要求されること、並びにブースター免疫の必要性、およびその頻度など、すべてが疾患を管理もしくは排除しようとする努力の妨げとなっている。
【０００３】
そのような困難の一つが、抗原の免疫原性の欠如、即ち、抗原が病原体に対する効果的な免疫応答を促進することができないことである。加えて、ある抗原は、ある型の免疫応答、たとえば、細胞を介した、もしくは体液性応答のみしか誘導しないこともある。アジュバントは、免疫応答を昂進、増大もしくは強化する物質であり、いくつかの例では、あるタイプの免疫応答を他のタイプより率先して促進するのに用いることができる。多くのワクチンアジュバントが知られているが、明礬（ａｌｕｍ）がヒトに広く使われている唯一のアジュバントである。
【０００４】
樹状細胞は、顕著な形態と広範な組織分布を持った不均一な細胞集団である（Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｒ．Ｍ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９： ２７１−２９６， １９９１）。樹状細胞は、「専門的な（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）」抗原提示細胞と言及され、ＭＨＣ制限Ｔ細胞の感化に関し、高い能力を有する。以上のことから、腫瘍もしくは感染症ワクチンアジュバントとして樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで利用しようという興味が持ち上がっている（例えば、Ｒｏｍａｎｉら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８０： ８３， １９９４）。それ故、樹状細胞の免疫応答刺激能を昂進する試薬は、広く重要であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、抗原を発現する活性化された樹状細胞の集団およびその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、樹状細胞を活性化して抗原提示能を昂進させる方法に関する。活性化され、抗原提示する本発明の樹状細胞は、ワクチンアジュバントとして有用である。
【０００７】
本発明はまた、ｅｘ ｖｉｖｏで多量の抗原提示樹状細胞を製造する方法を提供する。ある個体のＣＤ３４+造血始原細胞および幹細胞の回収後、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびｆｌｔ−３リガンド（ｆｌｔ３−Ｌ）などのサイトカインを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖させ、それらを樹状細胞系列の細胞に分化させることができる。サイトカインは、細胞回収に先立って血流中のＣＤ３４+細胞の数を増加させることにも使用することができる。得られた樹状細胞を、免疫応答を誘導したい抗原に暴露させ、抗原を加工させる（本手順を当該分野では「抗原パルス（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｕｌｓｉｎｇ）」ということもある）。抗原パルスされた（もしくは抗原発現している）樹状細胞を、それから、ＣＤ４０結合蛋白質で活性化し、次いで上記個体に投与する。
【０００８】
抗原提示する樹状細胞を調製する別の方法は、抗原もしくはそれに由来する特異的なポリペプチドをコードする遺伝子で樹状細胞をトランスフェクトすることである。樹状細胞がＭＨＣとの関連で抗原を発現した後、該樹状細胞をＣＤ４０結合蛋白質で活性化し、次いで上記個体に投与し、該抗原に対しより強力かつ改善された免疫応答を提供する。
【０００９】
活性化された抗原提示樹状細胞は、ワクチンアジュバントとしても使用でき、抗原投与前、中もしくは後に投与してもよい。さらに、上記樹状細胞は、免疫応答を調節するサイトカイン、例えばＣＤ４０結合蛋白質（即ち、可溶性ＣＤ４０Ｌ）もしくは可溶性ＣＤ８３分子の投与前、中もしくは後に該個体に投与してもよい。別の有用なサイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）１，２，４，５，６，７，１０，１２および１５、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、もしくはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、またはＴＮＦ−αもしくはｃ−ｋｉｔリガンドなどの他のサイトカインが含まれるが、これらだけに制限されない。さらに、これらのサイトカインの生物学的に活性のある誘導体、ならびにその組み合わせも有用であろう。
【００１０】
本発明はまた、抗原特異的Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの調製品も提供する。上記の操作により多数の抗原提示樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで調製した後、回収された抗原提示樹状細胞を用いて、該個体より回収されたナイーブＴ細胞から抗原特異的なＴ細胞を製造する。該抗原が製造されたＴ細胞に適切に提示された後、該抗原特異的Ｔ細胞を該個体に投与できる。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、抗原パルスされた樹状細胞を活性化するためのＣＤ４０Ｌの利用に向けられている。活性化は、樹状細胞がリンパ球細胞に抗原を提示する能力を昂進し、それによって抗原に対する免疫応答を増大させる。本発明の別の態様は、活性化され、抗原パルスされた樹状細胞の単離およびそのワクチンアジュバントとしての利用である。活性化され、抗原パルスされた樹状細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで使用し、抗原特異的なＴ細胞を作製することもできる。
【００１２】
樹状細胞
樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）は、顕著な形態と広範な組織分布を持つ不均一な細胞集団を含む。樹状細胞系およびその免疫における役割は、Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：２７１−２９６（１９９１）（本明細書中に参考文献として援用される）にまとめられている。樹状細胞の細胞表面は変わっており、ベールのような特徴的な突起物があり、細胞表面マーカーＣＤ１ａ+，ＣＤ４+，ＣＤ８６+もしくはＨＬＡ−ＤＲ+を有すことから特徴付けられる。樹状細胞は、ＭＨＣ制限Ｔ細胞の感化に関し高い能力を持ち、Ｔ細胞発生および寛容期間における自己抗原および免疫中の外来抗原の両方に関し、非常に効果的にｉｎ ｓｉｔｕでＴ細胞へ抗原提示する。
【００１３】
その抗原提示の有効性から、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍もしくは感染症ワクチンアジュバントとして使用することへの興味が持ち上がってきている（例、Ｒｏｍａｎｉら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８０： ８３， １９９４参照）。免疫刺激剤としての樹状細胞の利用は、末梢血における樹状細胞の割合の低さ、リンパ器官への操作が制限されること、および樹状細胞が分化の最終段階にあることに制約があった。樹状細胞は、ＣＤ３４+骨髄もしくは末梢血始原細胞および末梢血単核球に起源を持ち、樹状細胞の増殖および成熟は、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ），Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標），Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ， ワシントン州シアトル），ＴＮＦ−α，ｃ−ｋｉｔリガンド（幹細胞因子（ＳＣＦ），スチール因子（ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ；ＳＦ）もしくはマスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）としても知られている）およびインターロイキン−４により昂進できる。最近、ｆｌｔ３−Ｌが、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、多数の機能的に成熟した樹状細胞の生成を刺激することが見いだされている（ＵＳＳＮ ０８／５３９，１４２、１９９５年１０月４日出願）。
【００１４】
樹状細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養
造血幹細胞および始原細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖手法が米国特許第５，１９９，９４２号（本明細書中に参考文献として援用されている）に記載されている。他の適当な方法については、当該分野では既知である。簡単に述べると、ｅｘ ｖｉｖｏ培養および増殖は以下のものを含む：（１）患者、末梢血採取物、もしくは骨髄外植体からＣＤ３４+造血幹細胞および始原細胞を回収すること；および（２）当該細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させること。特許第５，１９９，９４２号に記載されている細胞性増殖因子に加え、ｆｌｔ３−Ｌ，ＩＬ−１，ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子を使用することができる。
【００１５】
ＣＤ３４マーカーを有す幹細胞もしくは始原細胞は、骨髄中の単核球の約１％から３％しか含まれない。末梢血のＣＤ３４+幹細胞もしくは始原細胞の量は、骨髄のおよそ１０から１００倍少ない。ｆｌｔ３−Ｌなどのサイトカインを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでの樹状細胞の数を増加もしくは変動させることができる。ある個体の樹状細胞の量を増加させることで、腫瘍抗原または細菌性もしくはウイルス性抗原などの、すでに患者に存在している抗原に関し、Ｔ細胞への抗原提示を容易にすることができる。また、免疫目的で個体に抗原を投与する前、投与している間、または投与した後に、サイトカインを投与してもよい。
【００１６】
末梢血細胞を、当該分野では既知のアフェレシス（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）操作を用いて回収する。例えば、Ｂｉｓｈｏｐら、Ｂｌｏｏｄ， ８３巻、２号、６１０−６１６頁（１９９４）を参照していただきたい。簡単に述べると、末梢血始原細胞（ＰＢＰＣ）および末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）を、慣用された器具、例えばＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｍｏｄｅｌ Ｖ５０ ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｄｅｖｉｃｅ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ、 ブレーンツリー、マサチューセッツ州）を使って回収する。週に５回以下で、およそ６．５×１０8単核球（ＭＮＣ）／ｋｇが回収されるまで、４時間回収を行うのが典型である。細胞を標準培地に懸濁し、それから遠心して赤血球および好中球を除去する。２層の界面（バッフィーコート）にある細胞を抜き出し、ＨＢＳＳに再懸濁する。懸濁した細胞は、単核球が大勢を占めており、細胞混合物のある程度が初期の幹細胞である。
【００１７】
ある細胞集団からＣＤ３４+造血幹細胞もしくは始原細胞を同定し分離することに関して、種々の細胞選択技術が知られている。例えば、モノクローナル抗体（もしくは他の特異的な細胞結合性蛋白質）を用いて、幹細胞もしくは始原細胞上に見いだされるマーカー蛋白質もしくは表面抗原蛋白質に結合させることが可能である。造血幹細胞に関して、特異的結合蛋白質となるような、いくつかのマーカーもしくは細胞表面抗原（即ち、ｆｌｔ３，ＣＤ３４，Ｍｙ−１０およびＴｈｙ−１）が当該分野で知られている（例、ＵＳＳＮ ０８／５３９，１４２、１９９５年１０月４日出願を参照）。
【００１８】
ある方法では、抗体もしくは結合蛋白質を、例えばガラスビーズもしくはフラスコ、磁気ビーズまたは適当なクロマトグラフ用樹脂の表面に固定し、細胞集団に接触させる。それから幹細胞をビーズマトリクスに結合させる。または、結合蛋白質を細胞混合物とインキュベートし、得られる混合体を抗体−細胞複合体に親和性のある表面に接触させてもよい。不要な細胞および細胞物質は除去され、比較的純粋な幹細胞集団が提供される。特異的な細胞結合性蛋白質を蛍光ラベル（例、クロモフォアもしくはフルオロフォア）で標識し、標識された細胞をソーティングによって分離することも可能である。分離は、免疫アフィニティーカラムによりなされるのが望ましい。
【００１９】
免疫アフィニティーカラムは、いかなる形体もとりうるが、通常、充填ベッド反応系から成る。こうしたバイオリアクターにおける充填ベッドは、基質によって実質的に均一にコートされた多孔性物質から作られるのが望ましい。多孔性物質は、高い表面積−体積比を提供し、細胞混合物がベッドから流れ出るのを妨げることなく、細胞の流れに沿って多くの接触機会を与える。基質は、それ自身の性質、もしくは化学的分子の添加により、細胞結合性蛋白質上に見いだされる部分に対し高い親和性を示す。典型的な基質としては、アビジンおよびストレプトアビジンが含まれるが、他の慣用されている基質も利用可能である。
【００２０】
ある有用な方法では、分離すべき細胞上にある細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体をさらに修飾してビオチン部分を提示させるのが典型である。ビオチンのアビジンに対する親和性は、それによって可逆的に充填ベッドの表面にモノクローナル抗体を確保する（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，９１：１１，１９８６を参照）。充填ベッドを洗浄して未結合の物質を除去し、従来の方法を用いて標的細胞を放出させる。ビオチン化した抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を用いてアビジンコートした充填ベッドに確保した、上記のタイプの免疫アフィニティーカラムについては、例えばＷＯ ９３／０８２６８に記載されている。
【００２１】
静止期にある幹細胞を選択する別の手段は、分裂中の、より分化系列にコミットされたタイプの細胞を、５−フルオロウラシル （５−ＦＵ）などの抗代謝物、もしくは４−ヒドロキシシクロホスホアミド （４−ＨＣ）などのアルキル化剤を用いて細胞死を誘導することである。幹細胞にほとんどもしくは全く影響しない増殖因子の添加により、静止期にない細胞の増殖分化を刺激すると、非幹細胞は増殖分化を引き起こされ、５−ＦＵもしくは４−ＨＣの細胞傷害効果により攻撃されやすくなる。Ｂｅｒａｒｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６７：１０４（１９９５）（本明細書中に参考文献として援用されている）を参照していただきたい。
【００２２】
単離された幹細胞をレート制御フリーザー（例、Ｃｒｙｏ−Ｍｅｄ， マウントクレメンス、ミズーリ州）で凍らせ、それからジメチルスルホキシドを凍結防止剤として液体窒素の蒸気相中で保存することができる。無血清培地もしくは血清ベースの培地を含め、種々の増殖および培養培地が、樹状細胞（新鮮なものもしくは凍結したもの）の増殖および培養に利用可能である。有用な増殖培地には、ＲＰＭＩ、ＴＣ １９９、Ｉｓｃｏｖｅ修飾ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅら、Ｆ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４７：９２３（１９７８））、ＤＭＥＭ、フィッシャー、アルファ培地、ＮＣＴＣ、Ｆ−１０、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５、ＭＥＭおよびマッコイが含まれる。
【００２３】
培地に存在する特定の栄養素には、血清アルブミン、トランスフェリン、脂質、コレステロール、２−メルカプトエタノールもしくはモノチオグリセロールなどの還元剤、ピルビン酸塩、ブチル酸塩、並びに、ヒドロコルチゾン−２−ヘミコハク酸塩などのグルココルチコイドが含まれる。特に、標準培地には、エネルギー源、ビタミンもしくは他の細胞を助ける有機化合物、培地のｐＨを安定化させる作用のあるＨＥＰＥＳもしくはＴｒｉｓなどのバッファー、および種々の無機塩が含まれる。様々な無血清細胞増殖培地がＷＯ ９５／００６３２（本明細書中に参考文献として援用されている）に記載されている。
【００２４】
回収されたＣＤ３４+細胞を、例えば本明細書およびＵＳＳＮ ０８／５３９，１４２中で記載されている適当なサイトカインとともに培養する。ＣＤ３４+細胞をそれから、分化させ樹状細胞系列へとコミットさせる。これらの細胞を、次に、ＣＤ１ａ，ＨＬＡ ＤＲ，ＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６などの樹状細胞に特徴的なマーカーを用いて、フローサイトメトリーもしくは同様の手段でさらに精製する。培養された樹状細胞を、例えば腫瘍抗原または病原性微生物もしくは日和見性微生物由来の抗原に暴露し、抗原を加工させ、次いである量のＣＤ４０結合蛋白質とともに培養し、樹状細胞を活性化する。または、樹状細胞を、抗原をコードする遺伝子でトランスフェクトし、次いである量のＣＤ４０結合蛋白質とともに培養し、抗原提示している樹状細胞を活性化する。
【００２５】
活性化され、抗原を有している樹状細胞を、それから、抗原特異的な免疫応答を刺激するために個体に投与する。樹状細胞は、抗原投与前、中もしくは後に投与することができる。または、Ｔ細胞を個体から回収して、活性化され、抗原を有している樹状細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで暴露させ、抗原特異的なＴ細胞を刺激し、これを該個体に投与することもできる。
【００２６】
有用なサイトカイン
様々なサイトカインが、樹状細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養に有用であろう。ｆｌｔ３−Ｌは、ＥＰ ０６２７４８７ Ａ２およびＷＯ ９４／２８３９１（共に本明細書中に参考文献として援用されている）に記載されている一群のポリペプチドをいう。ヒトｆｌｔ３−Ｌ ｃＤＮＡは、１９９３年８月６日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，アメリカ、メリーランド州、ロックビル）に寄託され、登録番号ＡＴＣＣ ６９３８２を受けている。ＩＬ−３は、米国特許第５，１０８，９１０号（本明細書中で参考文献に取り入れられている）に記載されているインターロイキン−３ポリペプチドをいう。本発明での使用に適したヒトＩＬ−３蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より登録番号 ＡＴＣＣ ６７７４７で公に入手可能である。ｃ−ｋｉｔリガンドは、マスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）、スチール因子もしくは幹細胞因子（ＳＣＦ）とも呼ばれ、ＥＰ ４２３，９８０（本明細書中に参考文献として援用されている）に記載されている。
【００２７】
他の有用なサイトカインには、インターロイキン−４（ＩＬ−４；Ｍｏｓｌｅｙら、Ｃｅｌｌ ５９：３３５（１９８９）、Ｉｄｚｅｒｄａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１ （１９９０）およびＧａｌｉｚｚｉら、Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６６９（１９９０）（各々、本明細書中も参考文献として援用されている））、並びに顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；米国特許第５，１０８，９１０号および５，２２９，４９６号（各、本明細書中で参考文献に取り入れられている））が含まれる。市販のＧＭ−ＣＳＦ（サルグラモスチン、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））はＩｍｍｕｎｅｘ社（ワシントン州シアトル）より入手可能である。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質（即ち、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の、Ｎ末端へのＣ末端融合）も、樹状細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養に有用であろう。そのような融合蛋白質は既知であり、米国特許第５，１９９，９４２号、５，１０８，９１０号および５，０７３，６２７号（各々、本明細書中に参考文献として援用されている）に記載されている。好適な融合蛋白質は、米国特許第５，１９９，９４２号に記載されているようなＰＩＸＹ３２１である。
【００２８】
樹状細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養への利用に加え、活性化され、抗原パルスされた樹状細胞に、１種もしくは複数のサイトカインを別々に、逐次的にもしくは同時に投与することによっても、サイトカインは本発明に有用であろう。好適なサイトカインは、免疫応答を調節するもの、特に、インターロイキン１，２，３，４，５，６，７，１０，１２および１５；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子；インターロイキン−３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む融合蛋白質；インターフェロン−γ；ＴＮＦ；ＴＧＦ−β；ｆｌｔ−３リガンド；可溶性ＣＤ４０リガンド；これらのサイトカインの生物学的に活性のある誘導体；並びにこれらの組み合わせから成るグループから選択されるサイトカインである。ＵＳＳＮ ０８／６０１，９５４（１９９６年２月１５日出願）に記載の可溶性ＣＤ８３、並びに、ＵＳＳＮ ０８／４７７，７３３およびＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４（共に１９９５年６月７日出願）に記載の可溶性ＣＤ４０Ｌは、特に望ましいサイトカインである。
【００２９】
有用なサイトカインは、樹状細胞表面に存在する受容体に結合し、シグナルを伝えることによって作用する。さらに、ＣＤ４０結合蛋白質に関し、適当なサイトカイン受容体に結合し樹状細胞にシグナルを伝える別の結合蛋白質が、本明細書に記載されるようにして調製可能である。例えば、ＷＯ ９５／２７０６２は、Ｆｌｔ−３Ｌの受容体であるＦｌｔ−３に対するアゴニスト抗体について記載しており、これより種々のＦｌｔ−３結合蛋白質が調製可能である。さらに有用なサイトカインとして、樹状細胞の培養に有用なサイトカインの生物学的に活性な類似体が含まれる。有用なサイトカイン類似体は、天然のサイトカインと実質的に同様のアミノ酸配列を有し、その特異的受容体に結合して生物学的シグナルを伝えることのできる生物学的活性を有している。そのような類似体は、当該分野では既知の、そして本明細書中でも記載される方法によって調製され試験することができる。
【００３０】
ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ
ＣＤ４０は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子（ＮＧＦ）受容体ファミリーの一員であり、細胞外領域におけるシステインに富んだモチーフの存在により定義される（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１９，１９９０；ＭａｌｌｅｔｔおよびＢａｒｃｌａｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １２：２２０；１９９１）。このファミリーには、リンパ球抗原ＣＤ２７，ＣＤ３０（ホジキンリンパ腫およびＲｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ細胞に見出される抗原）、ＴＮＦに対する２種の受容体、４−１ＢＢと呼ばれるマウス蛋白質、ラットＯＸ４０抗原、ＮＧＦ受容体、並びにＦａｓ抗原が含まれる。ヒトＣＤ４０抗原（ＣＤ４０）は、分子量３０，６００を持つ、２７７アミノ酸から成るペプチドである（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、ＥＭＢＯ Ｊ． ８：１４０３，１９８９）。
【００３１】
活性化されたＣＤ４+ Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）を発現する。ヒトＣＤ４０Ｌは、Ｓｐｒｉｇｇｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５４３（１９９２）に記載されたように、末梢血Ｔ細胞からクローン化された。マウスＣＤ４０Ｌのクローン化はＡｒｍｉｔａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０（１９９２）に記載されている。ＣＤ４０Ｌは、細胞外領域をＣ末端に、膜貫通領域および細胞内領域をＮ末端に持つタイプＩＩポリペプチドである。ＣＤ４０Ｌの生物学的活性は、ＣＤ４０Ｌの細胞外領域がＣＤ４０と結合することによって媒介され、Ｂ細胞増殖および（ＩｇＥ分泌を含む）抗体分泌の誘導を含む。
【００３２】
ＣＤ４０Ｌは、免疫応答のフィードバック制御に重要と考えられている。例えば、ＣＤ４０+の抗原提示細胞は、Ｔ細胞に抗原提示するが、それから活性化されＣＤ４０Ｌを発現するようになる。ＣＤ４０Ｌは、今度は、抗原提示細胞をさらに活性化し、抗原提示の効率を増加させ、種々のサイトカインの他にクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、ＣＤ８０およびＣＤ８６共刺激分子の発現を上昇させる（Ｃａｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１２６３，１９９４）。
【００３３】
本発明の方法に有用なＣＤ４０Ｌの形体は、ＵＳＳＮ ０８／４７７，７３３およびＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４（共に１９９５年６月７日出願、共に本明細書中で参考文献に取り入れられている）に開示されている。そのような有用な形体には、ＣＤ４０結合性ペプチドおよびオリゴマー形成ペプチドを含む、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドが含まれる。ＣＤ４０結合性ペプチドは、
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；ならびに
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド、
から成るグループから選択される。
【００３４】
有用なオリゴマー形成ペプチドもＵＳＳＮ ０８／４７７，７３３およびＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４に開示されており、本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および４に示されている。
【００３５】
ＴＮＦＲファミリー中の分子に関して、対応するリガンドのファミリーが存在しており、これらのいくつかはまた、活性化されたＴ細胞もしくは免疫系の他の細胞に発現している。このファミリーには、ＣＤ２７Ｌ（ＵＳＳＮ ０８／１０６，５０７、１９９３年８月１３日出願）、ＣＤ３０Ｌ（米国特許第５，４８０，９８１号、１９９６年１月２日公表）、４−１ＢＢＬ（ＵＳＳＮ ０８／２３６，９１８、１９９４年５月６日出願）、ＯＸ４０Ｌ（米国特許第５，４５７，０３５号、１９９５年１０月１０日公表）、およびＦａｓ Ｌ（ＵＳＳＮ ０８／５７１，５７９、１９９５年１２月１３日出願）以外に、腫瘍壊死因子およびリンホトキシン（それぞれ、ＴＮＦおよびＬＴ；Ｗａｒｅら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８：１７５，１９９５にまとめられている）が含まれる。これらのリガンドは、免疫応答の調節にも関与していることが知られており、抗原パルスされた樹状細胞もしくは対応する受容体を持った他の抗原提示細胞の活性化に有用となるであろう。
【００３６】
ＣＤ４０モノクローナル抗体およびさらなるＣＤ４０結合蛋白質
有用なＣＤ４０結合蛋白質は、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌとの結合を阻害する（可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌとの結合を少なくとも約９０％阻害することが観察されることによって決定される）能力を持つものであり、モノクローナル抗体、ＣＤ４０リガンドおよびその誘導分子が含まれる。ＣＤ４０表面抗原に対するモノクローナル抗体（ＣＤ４０ ｍＡｂ）は、ヒトＢ細胞に対し様々な生物学的活性を媒介することが示されている（例えば、ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ ＴＹＰＩＮＧ ＩＶ； Ａ．Ｊ． ＭｃＭｉｃｈａｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｖｉｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、４２６頁）。ＵＳＳＮ ０８／１３０，５４１（１９９３年１０月１日出願）（その関連した開示は本明細書中に参考文献として援用されている）は、ＣＤ４０に特異的に結合する２種のモノクローナル抗体、ｈＣＤ４０ｍ２およびｈＣＤ４０ｍ３を開示している。他のＣＤ４０ ｍＡｂとは異なり、ｈＣＤ４０ｍ２（ＡＴＣＣ ＨＢ１１４５９；ブダペスト条約下、アメリカンタイプカルチャーコレクション、米国メリーランド州ロックビルに１９９３年１０月６日寄託された）およびｈＣＤ４０ｍ３は、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０Ｌを構成的に発現する細胞にＣＤ４０が結合するのを阻害することで、ｈＣＤ４０ｍ２およびｈＣＤ４０ｍ３は、リガンド結合ドメインもしくはその近くでＣＤ４０に結合することが示されている。
【００３７】
さらなるＣＤ４０モノクローナル抗体を従来の技術によって作製してもよい（米国特許第ＲＥ３２，０１１号、４，９０２，６１４号、４，５４３，４３９号および４，４１１，９９３号（本明細書中に参考文献として援用されている）を参照；また、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｋｅｎｎｅｔｔ， ＭｃＫｅａｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ編、１９８０，並びに、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８（これらも本明細書中に参考文献として援用されている）も参照していただきたい）。リガンド結合ドメインもしくはその近くでＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体も、本発明に有用であろう。
【００３８】
さらに別のＣＤ４０結合蛋白質は、組換ＤＮＡ技術を利用して構築することもできる。例えば、リガンド結合ドメインもしくはその近くで結合する、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体をコードする遺伝子の可変領域を、有用なＣＤ４０結合蛋白質に取り込ませることが可能である（Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４，１９８９；Ｒｅｉｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３，１９８８；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１，１９８７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４，１９８８；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４，１９８９を参照）。
【００３９】
簡単に述べると、ＣＤ４０ ｍＡｂの抗原結合部位（即ちＣＤ４０結合ドメイン；可変領域）をコードするＤＮＡを単離、増幅し、別の蛋白質、例えばヒトＩｇＧをコードするＤＮＡに連結する（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、上記；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、上記を参照）。また、抗原結合部位（可変領域）を、別の完全に異なる蛋白質に連結もしくは挿入し（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、上記）、完全に異なる蛋白質の機能活性とともに、抗体の抗原結合部位を持つ新たな蛋白質を得ることもできる。
【００４０】
同様に、ＣＤ４０リガンドのＣＤ４０結合領域（細胞外ドメイン）を用いて他のＣＤ４０結合蛋白質を調製してもよい。ＣＤ４０リガンドの有用な形体は、ＵＳＳＮ ０８／４７７，７３３およびＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４（共に１９９５年６月７日出願）に開示されている。ＣＤ４０リガンドの別の形体は、当該分野において既知の方法により調製可能である。他の有用なＣＤ４０結合蛋白質と同様、ＣＤ４０リガンドはリガンド結合ドメインもしくはその近くでＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０発現細胞にシグナルを伝えることができる（即ち生物学的活性のある）であろう。
【００４１】
オリゴマーを形成する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＣＤ４０抗体の抗原結合ドメインもしくはＣＤ４０リガンドの細胞外ドメインを含むＣＤ４０結合蛋白質の調製において特に有用であろう。ある、そのようなオリゴマー形成蛋白質は、ＵＳＳＮ ０８／４７７，７３３およびＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４（共に１９９５年６月７日出願）に開示されている；別の有用なオリゴマー形成蛋白質は、ＵＳＳＮ ０８／４４６，９２２（１９９５年５月１８日出願）にも開示されている。Ｆｃ融合蛋白質（Ｆｃムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）で形成され、Ｆｃ受容体に対する親和性が低下したものを含む）も調製できる。
【００４２】
前記のＣＤ４０結合蛋白質と実質的に同様の（即ち、天然アミノ酸配列と少なくとも８０％、最も好適には最低９０％同一のアミノ酸配列を有す）ＣＤ４０結合蛋白質の変異型も本発明に有用であろう。配列の一致率は、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４に記載、ウィスコンシン大学ジェネティックスコンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能）を用いて配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ． ２：４８２，１９８１）により修正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアライメント法を利用している。ＧＡＰプログラムの望ましいデフォルトのパラメーターは：（１）ＳｃｈｗａｒｔｚとＤａｙｈｏｆｆ編、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，３５３−３５８頁、１９７９年に記載された、ヌクレオチドに対する単一の比較行列（一致に対し１を不一致に対し０の値を含む）、およびＧｒｉｂｓｋｏｖとＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の荷重比較行列；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップの各文字に対するさらに０．１０のペナルティ；並びに（３）終末ギャップに対するペナルティなしを含む。
【００４３】
一般に、有用なＣＤ４０結合蛋白質の天然型におけるものから異なるアミノ酸型への置換は、保存的になされるべきである；即ち、最も好適な置換アミノ酸とは、本発明の蛋白質が天然のＣＤ４０リガンドと実質的に等価にＣＤ４０と結合する能力に影響しない。保存的置換の例としては、結合ドメイン外のアミノ酸の置換、並びにＣＤ４０結合蛋白質の２次および／もしくは３次構造を変更しないアミノ酸置換が含まれる。更なる例としては、Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，もしくはＡｌａを互いに置換するように、ある脂肪族残基からの別の脂肪族残基への置換、または、ＬｙｓとＡｒｇ間；ＧｌｕとＡｓｐ間；およびＧｌｎとＡｓｎ間のように、ある極性残基から別の極性残基への置換が含まれる。他のそのような保存的置換、例えば、類似した疎水性特性を持つ領域全体の置換がよく知られている。
【００４４】
同様に、欠失もしくは挿入法が採用された場合、生物学的活性に対する欠失もしくは挿入の潜在的効果を考慮すべきである。ＣＤ４０結合蛋白質のサブユニットを、末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させて構築することもできる。なされうる変異のタイプに関する別の指針は、ＣＤ４０結合蛋白質の配列を同様の構造を持つ蛋白質と比較することにより提供される。
【００４５】
変異は、勿論、コード配列の読み枠を保存していなければならず、ＣＤ４０結合蛋白質ｍＲＮＡの翻訳に不都合に働くループもしくはヘアピンなどのｍＲＮＡ２次構造を作り出すようなハイブリダイゼーションをしうる相補的な領域を作り出さないことが望ましい。変異部位は予め決定できるが、変異の性質それ自体は予め決定される必要はない。例えば、ある特定部位における変異の最適な性質を選択するために、無作為変異導入を標的コドンに導入し、発現した変異蛋白質を求める活性に対してスクリーニングすることもできる。
【００４６】
変異は、変異配列を含むオリゴヌクレオチド（天然の配列の断片に連結可能となるよう制限部位を隣に配置しておく）を合成することにより特定の座に導入することができる。連結後、得られる再構築された配列は、求めるアミノ酸付加、置換もしくは欠失を有す類似体をコードする。または、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異導入を使って、求める置換、欠失もしくは付加によって変更された特定のコドンを有す変更された遺伝子を提供することもできる。上記の変更を行う実際の方法の例については、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２−１９、１９８５年１月）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；並びに米国特許第４，５１８，５８４号および４，７３７，４６２号に開示されており、これらには適当な技術が開示され、本明細書中に参考文献として援用されている。
【００４７】
当該分野でよく知られているように、すべての変異がアミノ酸配列の変化を生じさせるわけではない。組換蛋白質の生産に有利な特性を与える変異も、有用なＣＤ４０結合蛋白質の調製に有用であろう。天然に存在する変異型も本発明に包含される。そのような変異型の例は、ｍＲＮＡの選択的スプライシングもしくは蛋白質の蛋白分解的切断から生じる蛋白質であり、そこにおいても天然の生物学的特性は保持されている。
【００４８】
適当な抗体もしくは結合蛋白質が得られたなら、当該分野に熟達したものにはよく知られた多くの技術によってそれらを単離もしくは精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照）。適当な技術には、ペプチドもしくは蛋白質アフィニティカラム、ＨＰＬＣもしくはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡもしくはプロテインＧカラムによる精製、または、これらの技術のいかなる組み合わせも含まれる。組換ＣＤ４０結合蛋白質は、標準的方法に従って調製し、例えばＥＬＩＳＡ、ＡＢＣもしくはドットブロットアッセイを含めた当該分野において既知のアッセイを利用してＣＤ４０に対する結合特異性を試験することができる。後者は、ＣＤ４０結合蛋白質の生物学的活性の評価にも有用である。
【００４９】
抗原の調製
免疫は、疾患を予防もしくは改善するための病原体に対する防御的免疫応答も含め、１世紀の歴史を持つ非常に効果的な手段である。そのような誘導のために使われてきたワクチンは、生きた弱毒化された微生物、または殺された微生物標品もしくはその分画であることが一般的である。弱毒化生ワクチンは一般的に、殺された微生物もしくは病原体由来の非感染性標品から調製されるもの（即ち、トキソイド、組換蛋白質ワクチン）に比べ、自然の感染時に起こる免疫応答により近く模倣するものと考えられている。しかし、弱毒化ワクチンもまた、病原性の復活という危険性を持っており、特に免疫不調の患者には病気を起こしうる。
【００５０】
衛生状況の改善にともない、免疫は、ヒトおよび動物における多くの感染症による死もしくは障害を防ぐ最も有効な手段となってきた。疑いのある集団に対する予防接種は、世界レベルでの小ポックスの根絶、そして先進国におけるジフテリア、百日咳および麻痺性ポリオなどの疾患の罹患率の劇的な現象をもたらしてきた。アデノウイルス、はしか、おたふく風邪および風疹ウイルス、並びにポリオウイルスといった生ウイルスワクチン、そしてジフテリアおよび破傷風トキソイドワクチン、並びにＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｂおよび髄膜炎菌多糖ワクチンを含め、多数のワクチンのヒトへの投与が許可されている（Ｈｉｎｍａｎら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，第３版；Ｇ．Ｌ． Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｒ．Ｇ．Ｄｏｕｇｌａｓ およびＪ．Ｅ． Ｂｅｎｎｅｔｔ編、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ニューヨーク；２３２０−２３３３；表２）。
【００５１】
感染症の分野での利用に加え、予防接種はガンの有望な治療法としても考えられている。そのような利用法のために、例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０５５ （１９９４） およびＣｏｈｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：３１５（１９９４）に記載されたようにして腫瘍細胞の粗抽出液を調製する、または抗原を部分的に精製する（例えば、Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１２０２；１９９４に記載）ことによって、腫瘍細胞から腫瘍に関連した抗原を調製することができる。さらに、有用な腫瘍抗原をさらに精製、または組み換えて発現させることで、適当な抗原標品を提供することもできる。ガンにおいてそれに対する免疫応答が有益であると考えられる抗原を同定し単離する他のいかなる方法も、本発明の方法に有用性を見出すであろう。
【００５２】
精製した樹状細胞を、それから、抗原にパルス（暴露）させ、他の免疫系の細胞に提示するのに適した様式で抗原を取り込まさせる。抗原は、古典的には２種の経路で加工され提示される。細胞質画分の蛋白質に由来するペプチドはクラスＩ ＭＨＣ分子の流れで提示され、エンドサイトーシス経路に見出される蛋白質に由来するペプチドはクラスＩＩ ＭＨＣ分子の流れで提示される。しかし、当該分野に熟達したものは、例外が存在することに気づく；例えば、ＣＤ８+腫瘍特異的Ｔ細胞（ＭＨＣクラスＩ上に発現された外来性腫瘍抗原を認識する）の反応。ＭＨＣ依存性の抗原加工およびペプチド提示に関するレビューはＧｅｒｍａｉｎ， Ｒ．Ｎ．， Ｃｅｌｌ ７６：２８７（１９９４）に見出される。
【００５３】
樹状細胞を抗原でパルスする多数の方法が知られている；当該分野の熟達者は選択された抗原を適当な方法で開発することを、日常の実験と見做している。一般に、細胞の生存能力が促進される条件下で培養された樹状細胞に抗原を添加し、それから細胞が抗原を取り込み加工するのに十分な時間を与え、そして約２４時間（約１８から約３０時間、２４時間が望ましい）の間に、クラスＩもしくはクラスＩＩ ＭＨＣに関連して細胞表面に抗原ペプチドが発現される。樹状細胞は、抗原をコードするＤＮＡでトランスフェクトすることによって抗原に暴露してもよい。ＤＮＡが発現し、抗原は細胞質／クラスＩの経路でおそらく加工されるであろう。
【００５４】
活性化され抗原パルスされた樹状細胞の投与
本発明は、活性化され抗原パルスされた樹状細胞を含む治療組成物の使用法を提供する。そのような細胞を可溶性サイトカイン受容体もしくはサイトカインまたは他の免疫制御分子と組み合わせて使用することも企図されている。本発明の組成物は、免疫応答を刺激するために投与され、巨丸注入、連続点滴、インプラントからの持続的放出、もしくは他の適当な技術によって与えられうる。典型的には、生理学的に受容可能な担体、賦形剤もしくは希釈剤とともに、抗原パルスされ活性化された樹状細胞を含む組成物の形で、本発明の方法の細胞を投与するであろう。そのような担体は、使われる薬量および濃度において受容者にとって毒性が無いであろう。中性緩衝化生理食塩水もしくは同種の血清アルブミンと混合した生理食塩水が、実際に適した希釈液である。
【００５５】
あるタイプの免疫応答を刺激するのに使うにあたり、活性化され抗原パルスされた樹状細胞とともに他のサイトカインの投与も企図されている。いくつかの有用なサイトカイン（もしくはペプチド制御因子）については、Ｓｃｈｒａｄｅｒ， Ｊ．Ｗ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：２９５；１９９１）に考察されている。そのような因子としては、インターロイキン１，２，４，５，６，７，１０，１２および１５；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子；インターロイキン−３と顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む融合蛋白質；インターフェロン−γ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−β、ｆｌｔ−３リガンド、並びにその生物学的活性のある誘導体（これら単独もしくはその組み合わせ）が含まれる。特に望ましいサイトカインはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。可溶化型ＣＤ４０Ｌは、ＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４（１９９５年６月７日出願）に記載されている。他のサイトカインも、本明細書中で記載されているように、有用であろう。そのようなサイトカインをコードするＤＮＡもまた、例えば、樹状細胞にトランスフェクトしてサイトカインを発現させることによって、本発明の方法に有用であろう。これらの免疫制御分子の投与は、本発明の細胞と同時に、別々に、もしくは逐次的に投与することが含まれる。
【００５６】
好ましい態様
本発明は好ましくは以下の態様を含む。
１．（ａ） 樹状細胞を回収し；
（ｂ） （ｉ）抗原の取り込みおよび加工を促進する条件下で培養中に該樹状細胞を抗原に暴露させる、もしくは（ｉｉ）該抗原をコードする遺伝子で該樹状細胞をトランスフェクトすることによって、該樹状細胞に該抗原を発現させ；そして
（ｃ） 該抗原を発現する樹状細胞を、可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を最低約９０％阻害することが観察されることによって決定されるように、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害することができるＣＤ４０結合蛋白質に暴露することによって、該抗原を発現する樹状細胞を活性化する
工程により産生される、抗原を発現する活性化された樹状細胞の集団。
【００５７】
２．造血幹細胞もしくは始原細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ， ｆｌｔ３−Ｌ， ＩＬ−４， ＴＮＦ−α， ＩＬ−３， ｃ−ｋｉｔリガンド， ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３の融合体、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と接触させることによって、樹状細胞が得られる、態様１に記載の集団。
【００５８】
３．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；並びに
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド、
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１に記載の集団。
【００５９】
４．可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドが：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にあげられたアミノ酸配列を持ち、アミノ酸１９４のシステインが別のアミノ酸に置換されているポリペプチド；および
（ｂ） ムテイン（ａ）の断片でＣＤ４０に結合するポリペプチド；
ここにおいて、アミノ酸１９４のシステインのかわりに置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される
からなるグループから選択される、態様３に記載の集団。
【００６０】
５．（ａ） 個体から樹状細胞を回収し；
（ｂ） （ｉ）抗原の取り込みおよび加工を促進する条件下で培養中に該樹状細胞を抗原に暴露させる、もしくは（ｉｉ）該抗原をコードする遺伝子で該樹状細胞をトランスフェクトすることによって、該樹状細胞に該抗原を発現させ；
（ｃ） 該抗原を発現する樹状細胞を、可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を最低約９０％阻害することが観察されることによって決定されるように、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害することができるＣＤ４０結合蛋白質に暴露することによって、該抗原を発現する樹状細胞を活性化し；そして
（ｄ） 該活性化され抗原を発現する樹状細胞を該個体に投与する
工程を含む、個体における抗原に対する特異的な免疫反応を刺激する方法。
【００６１】
６．造血幹細胞もしくは始原細胞を該個体から回収し、該造血幹細胞もしくは始原細胞をｆｌｔ−３リガンド， ＧＭ−ＣＳＦ， ＩＬ−４， ＴＮＦ−α， ＩＬ−３， ｃ−ｋｉｔリガンド， ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３の融合体、および、これらの組み合わせからなるグループから選択される分子と接触させることによって、樹状細胞が得られる、態様５に記載の方法。
【００６２】
７．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；並びに
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド、
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様６に記載の方法。
【００６３】
８．可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドが：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にあげられたアミノ酸配列を持ち、アミノ酸１９４のシステインが別のアミノ酸に置換されているポリペプチド；および
（ｂ） ポリペプチド（ａ）の断片でＣＤ４０に結合するポリペプチド；
ここにおいて、アミノ酸１９４のシステインのかわりに置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される
からなるグループから選択される、態様７に記載の集団。
【００６４】
９．該個体の血中の始原細胞数を増大させるため、ｆｌｔ−３リガンドが樹状細胞回収前に該個体に投与される、態様５に記載の方法。
１０．造血幹細胞もしくは始原細胞を該個体から回収し、該造血幹細胞もしくは始原細胞をｆｌｔ−３リガンド，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−４，ＴＮＦ−α，ＩＬ−３，ｃ−ｋｉｔリガンド， ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３の融合体、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と接触させることによって、樹状細胞が得られる、態様９に記載の方法。
【００６５】
１１．抗原を発現し、活性化された樹状細胞が、インターロイキン１，２，３，４，５，６，７，１０，１２および１５；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子；インターロイキン−３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む融合蛋白質；インターフェロン−γ；ＴＮＦ；ＴＧＦ−β；ｆｌｔ−３リガンド；可溶性ＣＤ４０リガンド；可溶性ＣＤ８３；これらサイトカインの生物学的活性のある誘導体；並びにこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と、同時に、逐次的に、または別々に投与される、態様５に記載の方法。
【００６６】
１２．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様９に記載の方法。
【００６７】
１３．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１０に記載の方法。
【００６８】
１４．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１１に記載の方法。
【００６９】
１５．（ａ） 個体から樹状細胞を回収し；
（ｂ） （ｉ）抗原の取り込みおよび加工を促進する条件下で培養中に該樹状細胞を抗原に暴露させる、もしくは（ｉｉ）該抗原をコードする遺伝子で該樹状細胞をトランスフェクトすることによって、該樹状細胞に該抗原を発現させ；
（ｃ） 該抗原を発現する樹状細胞を、可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を最低約９０％阻害することが観察されることによって決定されるように、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害することができるＣＤ４０結合蛋白質に暴露することによって、該抗原を発現する樹状細胞を活性化し；そして
（ｄ） Ｔ細胞に対して該樹状細胞に該抗原を提示させる
工程を含む、個体から抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法。
【００７０】
１６．抗原特異的Ｔ細胞が、該個体から回収され、抗原提示樹状細胞にｅｘ ｖｉｖｏで暴露され、そして該個体に再投与される、態様１５に記載の方法。
１７．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１５に記載の方法。
【００７１】
１８．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１６に記載の方法。
【００７２】
１９．（ａ） 個体から樹状細胞を回収し；
（ｂ） （ｉ）抗原の取り込みおよび加工を促進する条件下で培養中に該樹状細胞を抗原に暴露させる、もしくは（ｉｉ）該抗原をコードする遺伝子で該樹状細胞をトランスフェクトすることによって、該樹状細胞に該抗原を発現させ；
（ｃ） 該抗原を発現する樹状細胞を、可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を最低約９０％阻害することが観察されることによって決定されるように、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害することができるＣＤ４０結合蛋白質に暴露することによって、該抗原を発現する樹状細胞を活性化し；そして
（ｄ） Ｔ細胞に対して該樹状細胞に該抗原を提示させる
工程によって産生される抗原特異的Ｔ細胞の集団。
【００７３】
２０．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１９に記載の集団。
【実施例】
【００７４】
本明細書中にあげた全ての出版物の関連開示は、参考文献として取り入れられている。以下の実施例は本発明の特定の態様の例示を提供するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００７５】
実施例１
本実施例は、精製された樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで作製する方法を記載する。ヒト骨髄を入手し、ＣＤ３４+表現型を有す細胞をＣＤ３４抗体カラム（ＣｅｌｌＰｒｏ， Ｂｏｔｈｅｌｌ， ワシントン州）を用いて分離する。ＣＤ３４+細胞を、適当な培地、例えば、マッコイのエンハンス培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍｅｄｉａ）（樹状細胞の増殖を促進するサイトカイン（即ち、ＧＭ−ＣＳＦ， ＩＬ−４， ＴＮＦ−αをそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌ、または、１００ｎｇ／ｍｌのｆｌｔ３−Ｌもしくはｃ−ｋｉｔリガンド、またはそれらの組み合わせ）を含む）で培養する。３７℃、１０％ ＣＯ2、湿気でおよそ２週間培養し続ける。それから細胞を、ＣＤ１ａ+， ＨＬＡ−ＤＲ+ およびＣＤ８６+に対する抗体を使ってフローサイトメトリーによりソートする。ＧＭ−ＣＳＦ， ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの組み合わせは、２週間の培養後、細胞数を６から７倍に増加させることができ、その内５０−８０％がＣＤ１ａ+ ＨＬＡ−ＤＲ+ ＣＤ８６+である。ｆｌｔ３−Ｌおよび／もしくはｃ−ｋｉｔリガンドの添加は、総細胞の増加、従って、樹状細胞の増加をさらに昂進する。こうした条件下で分離し培養した細胞の表現型分析は、細胞の６０−７０％がＨＬＡ−ＤＲ+ ＣＤ８６+（試験した全ての因子の組み合わせにおいてＣＤ１ａを発現する細胞の４０−５０％）である。
【００７６】
実施例２
本発明は、樹状細胞を回収し増幅させるための方法を記載する。細胞回収前に、ｆｌｔ３−Ｌもしくはサルグラモスチン（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標），Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ワシントン州シアトル）を個体に投与し血中のＰＢＰＣおよびＰＢＳＣの数を変動もしくは増加させることができる。ＣＳＦ−１，ＧＭ−ＣＳＦ，ｃ−ｋｉｔリガンド，Ｇ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＩＬ−１３，ＩＬ−１４，ＩＬ−１５，ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質，ＬＩＦ，ＦＧＦおよびその組み合わせなどの他の増殖因子を、ｆｌｔ３−Ｌと連続的にもしくは同時に組み合わせて、同様に投与することができる。
【００７７】
動化もしくは非動化したＰＢＰＣおよびＰＢＳＣを、当該分野で既知のａｐｈｅｒｅｓｉｓ操作を用いて回収する。例えば、Ｂｉｓｈｏｐら、Ｂｌｏｏｄ， ８３巻、２号、６１０−６１６頁（１９９４年）を参照していただきたい。簡単に述べると、ＰＢＰＣおよびＰＢＳＣを従来の器具、例えばＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ モデルＶ５０ ａｐｈｒｅｓｉｓ ｄｅｖｉｃｅ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ， マサチューセッツ州ブレインツリー）を用いて回収する。典型的には、およそ６．５×１０8単核球（ＭＮＣ）／ｋｇ個体が回収されるまで、週５回以下で４時間回収を行う。
【００７８】
回収されたＰＢＰＣおよびＰＢＳＣのアリコットを顆粒球−マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）量についてアッセイする。簡単に述べると、ＭＮＣ（およそ３００，０００）を分離し、十分な湿度のもと、３７℃、５％ＣＯ2で、改変されたマッコイの５Ａ培地（０．３％寒天、２００Ｕ／ｍｌ組換ヒトＧＭ−ＣＳＦ、２００Ｕ／ｍｌ組換ヒトＩＬ−３および２００Ｕ／ｍｌ組換ヒトＧ−ＣＳＦを含む）中で約２週間培養する。ｆｌｔ３−ＬもしくはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合分子（ＰＩＸＹ ３２１）を含め、他のサイトカインを培養液に添加してもよい。これらの培養液をＷｒｉｇｈｔ染色液で染め、ＣＦＵ−ＧＭコロニーを解剖顕微鏡を用いて計測する（Ｗａｒｄら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１６：３５８（１９８８））。また、ＣＦＵーＧＭコロニーは、Ｓｉｅｎａら、Ｂｌｏｏｄ，７７巻、２号、４００−４０９頁、１９９１年のＣＤ３４／ＣＤ３３フローサイトメトリー法、または当該分野で既知のいかなる他の方法を用いてアッセイしてもよい。
【００７９】
ＣＦＵ−ＧＭを含む培養液を、レート制御フリーザー（例、Ｃｒｙｏ−Ｍｅｄ，ミズーリ州マウントクレメンス）で凍らせ、それから液体窒素の蒸気相中で保存する。１０％ジメチルスルホキシドを凍結防止剤として使用してもよい。個体から全ての回収作業がなされた後、ＣＦＵ−ＧＭを含む培養液を融解し、プールし、それからｆｌｔ３−Ｌと、上記にあげた他のサイトカインとを別々に、逐次的にもしくは同時に組み合わせて接触させ、ＣＦＵ−ＧＭを樹状細胞系列へと誘導する。樹状細胞は、培養され、上記の選択マーカーを発現する細胞の割合について分析される。
【００８０】
実施例３
本実施例は、ＣＤ４０Ｌ刺激された樹状細胞が同種抗原を提示し、従ってＴ細胞の増殖をもたらす能力を例示する。ＣＤ３４+細胞をヒトドナーの骨髄から得て、選択されたサイトカインの存在下で２週間培養し、実質的に実施例１に記載したようにしてフローサイトメトリーにより分離した。混合リンパ球反応液（ＭＬＲ）中でそれらを使う前に、樹状細胞の増殖を助けるサイトカインを含むマッコイのエンハンス培地中で、ＣＤ４０Ｌの可溶性３量体の存在下（１μｇ／ｍｌ）もしくは非存在下で樹状細胞をさらに２４時間培養した。
【００８１】
ＨＬＡ不一致のドナーの血液から、２−アミノメチルイソチオイロニウム ブロマイド ヒドロブロマイド処理した羊赤血球でロゼット化させることによって、Ｔ細胞を精製した。ＣＤ４+およびＣＤ８+集団を、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， カリフォルニア州サニーベール）を用いて業者の指示にしたがって免疫磁気選択によりさらに精製した。滴定された数の樹状細胞の存在下で、ＲＰＭＩ（１０％加熱不活化されたウシ胎児血清を含む）中で、３７℃、１０％ＣＯ2下で、精製したＴ細胞に対して細胞増殖アッセイを行った。ウェルあたりおよそ１×１０5のＴ細胞を、丸底９６穴ミクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で３重にして、様々な数の不一致樹状細胞の存在下で、７日間培養した。トリチウムラベルしたチミジン（２５Ｃｉ／ｎｍｏｌｅ，アマシャム、イリノイ州アーリントンハイツ）１μＣｉ／ウェルで培養の最後の８時間、細胞をパルスした。
【００８２】
細胞を自動細胞回収器でグラスファーバーディスク上に回収し、取り込まれたｃｐｍを液体シンチレーションスペクトロメトリーで計測した。結果は、図１に示してあるが、ＭＬＲに使用する前にＣＤ４０Ｌ暴露しなかったものに比べ、ＣＤ４０Ｌ活性化した樹状細胞は、Ｔ細胞を同等に増殖刺激するのに要する量が３倍少なかったことが示された。この増加は、同種反応性Ｔ細胞を刺激する細胞表面分子の発現の増加によるものと思われた。
【００８３】
実施例４
本実施例は、樹状細胞が抗原特異的にＴ細胞の増殖を刺激する能力を例示する。ＣＤ３４+細胞を、破傷風トキソイドに対して反応すると考えられるヒトドナーの骨髄から採取し、選択されたサイトカインの存在下で２週間培養し、実質的に実施例１に記載したようにしてフローサイトメトリーによって分離した。これらを破傷風トキソイド（ＴＴＸ）抗原提示アッセイに使用する前に、樹状細胞の増殖を助けるサイトカインを含むマッコイのエンハンス培地中で、ＣＤ４０Ｌの可溶性３量体の存在下（１μｇ／ｍｌ）もしくは非存在下で樹状細胞をさらに２４時間培養し、それから精製したＴＴＸ（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．， ペンシルバニア州スイフトウォーター）で、３７℃、１０％ＣＯ2下で２４時間パルスした。
【００８４】
自己由来の破傷風トキソイド反応性Ｔ細胞は、精製したＴＴＸおよび低濃度のＩＬ−２およびＩＬ−７（それぞれ、２ｎｇ／ｍｌおよび５ｎｇ／ｍｌ）存在下で、ＣＤ３４抗体カラムから溶出したＣＤ３４−細胞を２週間培養することによって誘導した。ＣＤ３４−集団は、抗原提示細胞として作用する他のタイプの細胞以外に、Ｔ細胞（その一部は破傷風トキソイドに反応する）をある割合（約５％）だけ含んでいる。２週目までには、これらの細胞の分析から、約９０％がＴ細胞で、その大勢が破傷風トキソイド特異的で、Ｔ細胞活性化マーカーは低レベルになっていることが示された。
【００８５】
抗原特異的Ｔ細胞増殖アッセイは、１０％加熱不活化されたウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ中で、３７℃、１０％ＣＯ2下で、破傷風トキソイドパルスされた樹状細胞の存在下で、上記ＣＤ３４−骨髄細胞からのＴＴＸ特異的Ｔ細胞について行われた。ウェルあたりおよそ１×１０5のＴ細胞を、丸底９６穴ミクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で３重にして、滴定された数の樹状細胞の存在下で、５日間培養した。トリチウムラベルしたチミジン（２５Ｃｉ／ｎｍｏｌｅ，アマシャム、イリノイ州アーリントンハイツ）１μＣｉ／ウェルで培養の最後の４から８時間、細胞をパルスした。細胞を自動細胞回収器でグラスファーバーディスク上に回収し、取り込まれたｃｐｍを液体シンチレーションスペクトロメトリーで計測した。結果は、図２に示してあるが、ＣＤ４０Ｌとともに培養した樹状細胞は、ＣＤ４０Ｌ暴露しなかった樹状細胞に比べ、ＴＴＸ特異的Ｔ細胞に対する抗原提示効率が約１０倍低いことが示された。
【００８６】
実施例５
本実施例は、ＣＤ４０Ｌが、抗原パルスされた樹状細胞の抗原特異的Ｔ細胞の刺激を活性化する能力について例示する。ＣＤ３４+細胞を実施例４に記載したようにして回収し、処理をした。但し、ＣＤ４０Ｌとともに培養する前に破傷風トキソイドで２４時間パルスした。自己由来の破傷風トキソイド反応性Ｔ細胞の誘導、および抗原特異的Ｔ細胞増殖アッセイは、実施例４に記載されたようにして行った。結果は、図３に示してあるが、最初に抗原でパルスし、それからＣＤ４０Ｌで培養した樹状細胞は、抗原でパルスしたがＣＤ４０Ｌ暴露しなかった樹状細胞に比べ、ＴＴＸ特異的Ｔ細胞にＴＴＸを提示した際に同等の増殖刺激を与えるのに要する量が、３倍少なかったことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、同種（ａｌｌｏ）抗原Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表し、ＭＬＲ（混合リンパ球反応液）中でその使用前に樹状細胞をＣＤ４０Ｌとともにインキュベートすると、樹状細胞のＴ細胞増殖刺激能を約３倍増加させることを示している（実施例３に記載）。
【図２】図２は、ＣＤ４０Ｌとともに培養した樹状細胞が、ＣＤ４０Ｌに暴露されていない樹状細胞に比べ、抗原特異的Ｔ細胞に対する抗原提示に関して効果的でないことを例示する（実施例４に記載）。
【図３】図３は、最初に抗原でパルスされ、次にＣＤ４０Ｌとともに培養された樹状細胞が、抗原でパルスされたがＣＤ４０Ｌに暴露されていない樹状細胞に比べ、抗原特異的Ｔ細胞に対する抗原提示に関して効果的であることを例示する（実施例５に記載）。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）活性化因子、リンパ球を介した免疫応答をｉｎ ｖｉｖｏで昂進する方法、並びに、細胞性および体液性免疫応答の操作に有用な樹状細胞集団に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の技術
予防接種は、感染症による死もしくは障害を防ぐ有効な手段である。感染症における本法の成功は、新生物疾患の治療もしくは予防における予防接種の利用に対する興味も刺激してきた。しかしながら、ワクチン利用により達成された数々の成功にもかかわらず、ワクチン開発の分野には未だに多くの挑戦がある。非経口の投与経路、多くの異なる予防接種が要求されること、並びにブースター免疫の必要性、およびその頻度など、すべてが疾患を管理もしくは排除しようとする努力の妨げとなっている。
【０００３】
そのような困難の一つが、抗原の免疫原性の欠如、即ち、抗原が病原体に対する効果的な免疫応答を促進することができないことである。加えて、ある抗原は、ある型の免疫応答、たとえば、細胞を介した、もしくは体液性応答のみしか誘導しないこともある。アジュバントは、免疫応答を昂進、増大もしくは強化する物質であり、いくつかの例では、あるタイプの免疫応答を他のタイプより率先して促進するのに用いることができる。多くのワクチンアジュバントが知られているが、明礬（ａｌｕｍ）がヒトに広く使われている唯一のアジュバントである。
【０００４】
樹状細胞は、顕著な形態と広範な組織分布を持った不均一な細胞集団である（Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｒ．Ｍ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９： ２７１−２９６， １９９１）。樹状細胞は、「専門的な（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）」抗原提示細胞と言及され、ＭＨＣ制限Ｔ細胞の感化に関し、高い能力を有する。以上のことから、腫瘍もしくは感染症ワクチンアジュバントとして樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで利用しようという興味が持ち上がっている（例えば、Ｒｏｍａｎｉら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８０： ８３， １９９４）。それ故、樹状細胞の免疫応答刺激能を昂進する試薬は、広く重要であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、抗原を発現する活性化された樹状細胞の集団およびその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、樹状細胞を活性化して抗原提示能を昂進させる方法に関する。活性化され、抗原提示する本発明の樹状細胞は、ワクチンアジュバントとして有用である。
【０００７】
本発明はまた、ｅｘ ｖｉｖｏで多量の抗原提示樹状細胞を製造する方法を提供する。ある個体のＣＤ３４+造血始原細胞および幹細胞の回収後、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびｆｌｔ−３リガンド（ｆｌｔ３−Ｌ）などのサイトカインを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖させ、それらを樹状細胞系列の細胞に分化させることができる。サイトカインは、細胞回収に先立って血流中のＣＤ３４+細胞の数を増加させることにも使用することができる。得られた樹状細胞を、免疫応答を誘導したい抗原に暴露させ、抗原を加工させる（本手順を当該分野では「抗原パルス（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｕｌｓｉｎｇ）」ということもある）。抗原パルスされた（もしくは抗原発現している）樹状細胞を、それから、ＣＤ４０結合蛋白質で活性化し、次いで上記個体に投与する。
【０００８】
抗原提示する樹状細胞を調製する別の方法は、抗原もしくはそれに由来する特異的なポリペプチドをコードする遺伝子で樹状細胞をトランスフェクトすることである。樹状細胞がＭＨＣとの関連で抗原を発現した後、該樹状細胞をＣＤ４０結合蛋白質で活性化し、次いで上記個体に投与し、該抗原に対しより強力かつ改善された免疫応答を提供する。
【０００９】
活性化された抗原提示樹状細胞は、ワクチンアジュバントとしても使用でき、抗原投与前、中もしくは後に投与してもよい。さらに、上記樹状細胞は、免疫応答を調節するサイトカイン、例えばＣＤ４０結合蛋白質（即ち、可溶性ＣＤ４０Ｌ）もしくは可溶性ＣＤ８３分子の投与前、中もしくは後に該個体に投与してもよい。別の有用なサイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）１，２，４，５，６，７，１０，１２および１５、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、もしくはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、またはＴＮＦ−αもしくはｃ−ｋｉｔリガンドなどの他のサイトカインが含まれるが、これらだけに制限されない。さらに、これらのサイトカインの生物学的に活性のある誘導体、ならびにその組み合わせも有用であろう。
【００１０】
本発明はまた、抗原特異的Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの調製品も提供する。上記の操作により多数の抗原提示樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで調製した後、回収された抗原提示樹状細胞を用いて、該個体より回収されたナイーブＴ細胞から抗原特異的なＴ細胞を製造する。該抗原が製造されたＴ細胞に適切に提示された後、該抗原特異的Ｔ細胞を該個体に投与できる。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、抗原パルスされた樹状細胞を活性化するためのＣＤ４０Ｌの利用に向けられている。活性化は、樹状細胞がリンパ球細胞に抗原を提示する能力を昂進し、それによって抗原に対する免疫応答を増大させる。本発明の別の態様は、活性化され、抗原パルスされた樹状細胞の単離およびそのワクチンアジュバントとしての利用である。活性化され、抗原パルスされた樹状細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで使用し、抗原特異的なＴ細胞を作製することもできる。
【００１２】
樹状細胞
樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）は、顕著な形態と広範な組織分布を持つ不均一な細胞集団を含む。樹状細胞系およびその免疫における役割は、Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：２７１−２９６（１９９１）（本明細書中に参考文献として援用される）にまとめられている。樹状細胞の細胞表面は変わっており、ベールのような特徴的な突起物があり、細胞表面マーカーＣＤ１ａ+，ＣＤ４+，ＣＤ８６+もしくはＨＬＡ−ＤＲ+を有すことから特徴付けられる。樹状細胞は、ＭＨＣ制限Ｔ細胞の感化に関し高い能力を持ち、Ｔ細胞発生および寛容期間における自己抗原および免疫中の外来抗原の両方に関し、非常に効果的にｉｎ ｓｉｔｕでＴ細胞へ抗原提示する。
【００１３】
その抗原提示の有効性から、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍もしくは感染症ワクチンアジュバントとして使用することへの興味が持ち上がってきている（例、Ｒｏｍａｎｉら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８０： ８３， １９９４参照）。免疫刺激剤としての樹状細胞の利用は、末梢血における樹状細胞の割合の低さ、リンパ器官への操作が制限されること、および樹状細胞が分化の最終段階にあることに制約があった。樹状細胞は、ＣＤ３４+骨髄もしくは末梢血始原細胞および末梢血単核球に起源を持ち、樹状細胞の増殖および成熟は、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ），Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標），Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ， ワシントン州シアトル），ＴＮＦ−α，ｃ−ｋｉｔリガンド（幹細胞因子（ＳＣＦ），スチール因子（ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ；ＳＦ）もしくはマスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）としても知られている）およびインターロイキン−４により昂進できる。最近、ｆｌｔ３−Ｌが、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、多数の機能的に成熟した樹状細胞の生成を刺激することが見いだされている（ＵＳＳＮ ０８／５３９，１４２、１９９５年１０月４日出願）。
【００１４】
樹状細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養
造血幹細胞および始原細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖手法が米国特許第５，１９９，９４２号（本明細書中に参考文献として援用されている）に記載されている。他の適当な方法については、当該分野では既知である。簡単に述べると、ｅｘ ｖｉｖｏ培養および増殖は以下のものを含む：（１）患者、末梢血採取物、もしくは骨髄外植体からＣＤ３４+造血幹細胞および始原細胞を回収すること；および（２）当該細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させること。特許第５，１９９，９４２号に記載されている細胞性増殖因子に加え、ｆｌｔ３−Ｌ，ＩＬ−１，ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子を使用することができる。
【００１５】
ＣＤ３４マーカーを有す幹細胞もしくは始原細胞は、骨髄中の単核球の約１％から３％しか含まれない。末梢血のＣＤ３４+幹細胞もしくは始原細胞の量は、骨髄のおよそ１０から１００倍少ない。ｆｌｔ３−Ｌなどのサイトカインを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでの樹状細胞の数を増加もしくは変動させることができる。ある個体の樹状細胞の量を増加させることで、腫瘍抗原または細菌性もしくはウイルス性抗原などの、すでに患者に存在している抗原に関し、Ｔ細胞への抗原提示を容易にすることができる。また、免疫目的で個体に抗原を投与する前、投与している間、または投与した後に、サイトカインを投与してもよい。
【００１６】
末梢血細胞を、当該分野では既知のアフェレシス（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）操作を用いて回収する。例えば、Ｂｉｓｈｏｐら、Ｂｌｏｏｄ， ８３巻、２号、６１０−６１６頁（１９９４）を参照していただきたい。簡単に述べると、末梢血始原細胞（ＰＢＰＣ）および末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）を、慣用された器具、例えばＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｍｏｄｅｌ Ｖ５０ ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｄｅｖｉｃｅ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ、 ブレーンツリー、マサチューセッツ州）を使って回収する。週に５回以下で、およそ６．５×１０8単核球（ＭＮＣ）／ｋｇが回収されるまで、４時間回収を行うのが典型である。細胞を標準培地に懸濁し、それから遠心して赤血球および好中球を除去する。２層の界面（バッフィーコート）にある細胞を抜き出し、ＨＢＳＳに再懸濁する。懸濁した細胞は、単核球が大勢を占めており、細胞混合物のある程度が初期の幹細胞である。
【００１７】
ある細胞集団からＣＤ３４+造血幹細胞もしくは始原細胞を同定し分離することに関して、種々の細胞選択技術が知られている。例えば、モノクローナル抗体（もしくは他の特異的な細胞結合性蛋白質）を用いて、幹細胞もしくは始原細胞上に見いだされるマーカー蛋白質もしくは表面抗原蛋白質に結合させることが可能である。造血幹細胞に関して、特異的結合蛋白質となるような、いくつかのマーカーもしくは細胞表面抗原（即ち、ｆｌｔ３，ＣＤ３４，Ｍｙ−１０およびＴｈｙ−１）が当該分野で知られている（例、ＵＳＳＮ ０８／５３９，１４２、１９９５年１０月４日出願を参照）。
【００１８】
ある方法では、抗体もしくは結合蛋白質を、例えばガラスビーズもしくはフラスコ、磁気ビーズまたは適当なクロマトグラフ用樹脂の表面に固定し、細胞集団に接触させる。それから幹細胞をビーズマトリクスに結合させる。または、結合蛋白質を細胞混合物とインキュベートし、得られる混合体を抗体−細胞複合体に親和性のある表面に接触させてもよい。不要な細胞および細胞物質は除去され、比較的純粋な幹細胞集団が提供される。特異的な細胞結合性蛋白質を蛍光ラベル（例、クロモフォアもしくはフルオロフォア）で標識し、標識された細胞をソーティングによって分離することも可能である。分離は、免疫アフィニティーカラムによりなされるのが望ましい。
【００１９】
免疫アフィニティーカラムは、いかなる形体もとりうるが、通常、充填ベッド反応系から成る。こうしたバイオリアクターにおける充填ベッドは、基質によって実質的に均一にコートされた多孔性物質から作られるのが望ましい。多孔性物質は、高い表面積−体積比を提供し、細胞混合物がベッドから流れ出るのを妨げることなく、細胞の流れに沿って多くの接触機会を与える。基質は、それ自身の性質、もしくは化学的分子の添加により、細胞結合性蛋白質上に見いだされる部分に対し高い親和性を示す。典型的な基質としては、アビジンおよびストレプトアビジンが含まれるが、他の慣用されている基質も利用可能である。
【００２０】
ある有用な方法では、分離すべき細胞上にある細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体をさらに修飾してビオチン部分を提示させるのが典型である。ビオチンのアビジンに対する親和性は、それによって可逆的に充填ベッドの表面にモノクローナル抗体を確保する（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，９１：１１，１９８６を参照）。充填ベッドを洗浄して未結合の物質を除去し、従来の方法を用いて標的細胞を放出させる。ビオチン化した抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を用いてアビジンコートした充填ベッドに確保した、上記のタイプの免疫アフィニティーカラムについては、例えばＷＯ ９３／０８２６８に記載されている。
【００２１】
静止期にある幹細胞を選択する別の手段は、分裂中の、より分化系列にコミットされたタイプの細胞を、５−フルオロウラシル （５−ＦＵ）などの抗代謝物、もしくは４−ヒドロキシシクロホスホアミド （４−ＨＣ）などのアルキル化剤を用いて細胞死を誘導することである。幹細胞にほとんどもしくは全く影響しない増殖因子の添加により、静止期にない細胞の増殖分化を刺激すると、非幹細胞は増殖分化を引き起こされ、５−ＦＵもしくは４−ＨＣの細胞傷害効果により攻撃されやすくなる。Ｂｅｒａｒｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６７：１０４（１９９５）（本明細書中に参考文献として援用されている）を参照していただきたい。
【００２２】
単離された幹細胞をレート制御フリーザー（例、Ｃｒｙｏ−Ｍｅｄ， マウントクレメンス、ミズーリ州）で凍らせ、それからジメチルスルホキシドを凍結防止剤として液体窒素の蒸気相中で保存することができる。無血清培地もしくは血清ベースの培地を含め、種々の増殖および培養培地が、樹状細胞（新鮮なものもしくは凍結したもの）の増殖および培養に利用可能である。有用な増殖培地には、ＲＰＭＩ、ＴＣ １９９、Ｉｓｃｏｖｅ修飾ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅら、Ｆ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４７：９２３（１９７８））、ＤＭＥＭ、フィッシャー、アルファ培地、ＮＣＴＣ、Ｆ−１０、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５、ＭＥＭおよびマッコイが含まれる。
【００２３】
培地に存在する特定の栄養素には、血清アルブミン、トランスフェリン、脂質、コレステロール、２−メルカプトエタノールもしくはモノチオグリセロールなどの還元剤、ピルビン酸塩、ブチル酸塩、並びに、ヒドロコルチゾン−２−ヘミコハク酸塩などのグルココルチコイドが含まれる。特に、標準培地には、エネルギー源、ビタミンもしくは他の細胞を助ける有機化合物、培地のｐＨを安定化させる作用のあるＨＥＰＥＳもしくはＴｒｉｓなどのバッファー、および種々の無機塩が含まれる。様々な無血清細胞増殖培地がＷＯ ９５／００６３２（本明細書中に参考文献として援用されている）に記載されている。
【００２４】
回収されたＣＤ３４+細胞を、例えば本明細書およびＵＳＳＮ ０８／５３９，１４２中で記載されている適当なサイトカインとともに培養する。ＣＤ３４+細胞をそれから、分化させ樹状細胞系列へとコミットさせる。これらの細胞を、次に、ＣＤ１ａ，ＨＬＡ ＤＲ，ＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６などの樹状細胞に特徴的なマーカーを用いて、フローサイトメトリーもしくは同様の手段でさらに精製する。培養された樹状細胞を、例えば腫瘍抗原または病原性微生物もしくは日和見性微生物由来の抗原に暴露し、抗原を加工させ、次いである量のＣＤ４０結合蛋白質とともに培養し、樹状細胞を活性化する。または、樹状細胞を、抗原をコードする遺伝子でトランスフェクトし、次いである量のＣＤ４０結合蛋白質とともに培養し、抗原提示している樹状細胞を活性化する。
【００２５】
活性化され、抗原を有している樹状細胞を、それから、抗原特異的な免疫応答を刺激するために個体に投与する。樹状細胞は、抗原投与前、中もしくは後に投与することができる。または、Ｔ細胞を個体から回収して、活性化され、抗原を有している樹状細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで暴露させ、抗原特異的なＴ細胞を刺激し、これを該個体に投与することもできる。
【００２６】
有用なサイトカイン
様々なサイトカインが、樹状細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養に有用であろう。ｆｌｔ３−Ｌは、ＥＰ ０６２７４８７ Ａ２およびＷＯ ９４／２８３９１（共に本明細書中に参考文献として援用されている）に記載されている一群のポリペプチドをいう。ヒトｆｌｔ３−Ｌ ｃＤＮＡは、１９９３年８月６日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，アメリカ、メリーランド州、ロックビル）に寄託され、登録番号ＡＴＣＣ ６９３８２を受けている。ＩＬ−３は、米国特許第５，１０８，９１０号（本明細書中で参考文献に取り入れられている）に記載されているインターロイキン−３ポリペプチドをいう。本発明での使用に適したヒトＩＬ−３蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より登録番号 ＡＴＣＣ ６７７４７で公に入手可能である。ｃ−ｋｉｔリガンドは、マスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）、スチール因子もしくは幹細胞因子（ＳＣＦ）とも呼ばれ、ＥＰ ４２３，９８０（本明細書中に参考文献として援用されている）に記載されている。
【００２７】
他の有用なサイトカインには、インターロイキン−４（ＩＬ−４；Ｍｏｓｌｅｙら、Ｃｅｌｌ ５９：３３５（１９８９）、Ｉｄｚｅｒｄａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１ （１９９０）およびＧａｌｉｚｚｉら、Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６６９（１９９０）（各々、本明細書中も参考文献として援用されている））、並びに顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；米国特許第５，１０８，９１０号および５，２２９，４９６号（各、本明細書中で参考文献に取り入れられている））が含まれる。市販のＧＭ−ＣＳＦ（サルグラモスチン、Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））はＩｍｍｕｎｅｘ社（ワシントン州シアトル）より入手可能である。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質（即ち、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の、Ｎ末端へのＣ末端融合）も、樹状細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養に有用であろう。そのような融合蛋白質は既知であり、米国特許第５，１９９，９４２号、５，１０８，９１０号および５，０７３，６２７号（各々、本明細書中に参考文献として援用されている）に記載されている。好適な融合蛋白質は、米国特許第５，１９９，９４２号に記載されているようなＰＩＸＹ３２１である。
【００２８】
樹状細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養への利用に加え、活性化され、抗原パルスされた樹状細胞に、１種もしくは複数のサイトカインを別々に、逐次的にもしくは同時に投与することによっても、サイトカインは本発明に有用であろう。好適なサイトカインは、免疫応答を調節するもの、特に、インターロイキン１，２，３，４，５，６，７，１０，１２および１５；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子；インターロイキン−３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む融合蛋白質；インターフェロン−γ；ＴＮＦ；ＴＧＦ−β；ｆｌｔ−３リガンド；可溶性ＣＤ４０リガンド；これらのサイトカインの生物学的に活性のある誘導体；並びにこれらの組み合わせから成るグループから選択されるサイトカインである。ＵＳＳＮ ０８／６０１，９５４（１９９６年２月１５日出願）に記載の可溶性ＣＤ８３、並びに、ＵＳＳＮ ０８／４７７，７３３およびＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４（共に１９９５年６月７日出願）に記載の可溶性ＣＤ４０Ｌは、特に望ましいサイトカインである。
【００２９】
有用なサイトカインは、樹状細胞表面に存在する受容体に結合し、シグナルを伝えることによって作用する。さらに、ＣＤ４０結合蛋白質に関し、適当なサイトカイン受容体に結合し樹状細胞にシグナルを伝える別の結合蛋白質が、本明細書に記載されるようにして調製可能である。例えば、ＷＯ ９５／２７０６２は、Ｆｌｔ−３Ｌの受容体であるＦｌｔ−３に対するアゴニスト抗体について記載しており、これより種々のＦｌｔ−３結合蛋白質が調製可能である。さらに有用なサイトカインとして、樹状細胞の培養に有用なサイトカインの生物学的に活性な類似体が含まれる。有用なサイトカイン類似体は、天然のサイトカインと実質的に同様のアミノ酸配列を有し、その特異的受容体に結合して生物学的シグナルを伝えることのできる生物学的活性を有している。そのような類似体は、当該分野では既知の、そして本明細書中でも記載される方法によって調製され試験することができる。
【００３０】
ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ
ＣＤ４０は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子（ＮＧＦ）受容体ファミリーの一員であり、細胞外領域におけるシステインに富んだモチーフの存在により定義される（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１９，１９９０；ＭａｌｌｅｔｔおよびＢａｒｃｌａｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １２：２２０；１９９１）。このファミリーには、リンパ球抗原ＣＤ２７，ＣＤ３０（ホジキンリンパ腫およびＲｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ細胞に見出される抗原）、ＴＮＦに対する２種の受容体、４−１ＢＢと呼ばれるマウス蛋白質、ラットＯＸ４０抗原、ＮＧＦ受容体、並びにＦａｓ抗原が含まれる。ヒトＣＤ４０抗原（ＣＤ４０）は、分子量３０，６００を持つ、２７７アミノ酸から成るペプチドである（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、ＥＭＢＯ Ｊ． ８：１４０３，１９８９）。
【００３１】
活性化されたＣＤ４+ Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）を発現する。ヒトＣＤ４０Ｌは、Ｓｐｒｉｇｇｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５４３（１９９２）に記載されたように、末梢血Ｔ細胞からクローン化された。マウスＣＤ４０Ｌのクローン化はＡｒｍｉｔａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０（１９９２）に記載されている。ＣＤ４０Ｌは、細胞外領域をＣ末端に、膜貫通領域および細胞内領域をＮ末端に持つタイプＩＩポリペプチドである。ＣＤ４０Ｌの生物学的活性は、ＣＤ４０Ｌの細胞外領域がＣＤ４０と結合することによって媒介され、Ｂ細胞増殖および（ＩｇＥ分泌を含む）抗体分泌の誘導を含む。
【００３２】
ＣＤ４０Ｌは、免疫応答のフィードバック制御に重要と考えられている。例えば、ＣＤ４０+の抗原提示細胞は、Ｔ細胞に抗原提示するが、それから活性化されＣＤ４０Ｌを発現するようになる。ＣＤ４０Ｌは、今度は、抗原提示細胞をさらに活性化し、抗原提示の効率を増加させ、種々のサイトカインの他にクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、ＣＤ８０およびＣＤ８６共刺激分子の発現を上昇させる（Ｃａｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１２６３，１９９４）。
【００３３】
本発明の方法に有用なＣＤ４０Ｌの形体は、ＵＳＳＮ ０８／４７７，７３３およびＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４（共に１９９５年６月７日出願、共に本明細書中で参考文献に取り入れられている）に開示されている。そのような有用な形体には、ＣＤ４０結合性ペプチドおよびオリゴマー形成ペプチドを含む、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドが含まれる。ＣＤ４０結合性ペプチドは、
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；ならびに
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド、
から成るグループから選択される。
【００３４】
有用なオリゴマー形成ペプチドもＵＳＳＮ ０８／４７７，７３３およびＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４に開示されており、本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および４に示されている。
【００３５】
ＴＮＦＲファミリー中の分子に関して、対応するリガンドのファミリーが存在しており、これらのいくつかはまた、活性化されたＴ細胞もしくは免疫系の他の細胞に発現している。このファミリーには、ＣＤ２７Ｌ（ＵＳＳＮ ０８／１０６，５０７、１９９３年８月１３日出願）、ＣＤ３０Ｌ（米国特許第５，４８０，９８１号、１９９６年１月２日公表）、４−１ＢＢＬ（ＵＳＳＮ ０８／２３６，９１８、１９９４年５月６日出願）、ＯＸ４０Ｌ（米国特許第５，４５７，０３５号、１９９５年１０月１０日公表）、およびＦａｓ Ｌ（ＵＳＳＮ ０８／５７１，５７９、１９９５年１２月１３日出願）以外に、腫瘍壊死因子およびリンホトキシン（それぞれ、ＴＮＦおよびＬＴ；Ｗａｒｅら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８：１７５，１９９５にまとめられている）が含まれる。これらのリガンドは、免疫応答の調節にも関与していることが知られており、抗原パルスされた樹状細胞もしくは対応する受容体を持った他の抗原提示細胞の活性化に有用となるであろう。
【００３６】
ＣＤ４０モノクローナル抗体およびさらなるＣＤ４０結合蛋白質
有用なＣＤ４０結合蛋白質は、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌとの結合を阻害する（可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌとの結合を少なくとも約９０％阻害することが観察されることによって決定される）能力を持つものであり、モノクローナル抗体、ＣＤ４０リガンドおよびその誘導分子が含まれる。ＣＤ４０表面抗原に対するモノクローナル抗体（ＣＤ４０ ｍＡｂ）は、ヒトＢ細胞に対し様々な生物学的活性を媒介することが示されている（例えば、ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ ＴＹＰＩＮＧ ＩＶ； Ａ．Ｊ． ＭｃＭｉｃｈａｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｖｉｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、４２６頁）。ＵＳＳＮ ０８／１３０，５４１（１９９３年１０月１日出願）（その関連した開示は本明細書中に参考文献として援用されている）は、ＣＤ４０に特異的に結合する２種のモノクローナル抗体、ｈＣＤ４０ｍ２およびｈＣＤ４０ｍ３を開示している。他のＣＤ４０ ｍＡｂとは異なり、ｈＣＤ４０ｍ２（ＡＴＣＣ ＨＢ１１４５９；ブダペスト条約下、アメリカンタイプカルチャーコレクション、米国メリーランド州ロックビルに１９９３年１０月６日寄託された）およびｈＣＤ４０ｍ３は、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０Ｌを構成的に発現する細胞にＣＤ４０が結合するのを阻害することで、ｈＣＤ４０ｍ２およびｈＣＤ４０ｍ３は、リガンド結合ドメインもしくはその近くでＣＤ４０に結合することが示されている。
【００３７】
さらなるＣＤ４０モノクローナル抗体を従来の技術によって作製してもよい（米国特許第ＲＥ３２，０１１号、４，９０２，６１４号、４，５４３，４３９号および４，４１１，９９３号（本明細書中に参考文献として援用されている）を参照；また、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｋｅｎｎｅｔｔ， ＭｃＫｅａｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ編、１９８０，並びに、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８８（これらも本明細書中に参考文献として援用されている）も参照していただきたい）。リガンド結合ドメインもしくはその近くでＣＤ４０に結合するモノクローナル抗体も、本発明に有用であろう。
【００３８】
さらに別のＣＤ４０結合蛋白質は、組換ＤＮＡ技術を利用して構築することもできる。例えば、リガンド結合ドメインもしくはその近くで結合する、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体をコードする遺伝子の可変領域を、有用なＣＤ４０結合蛋白質に取り込ませることが可能である（Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４，１９８９；Ｒｅｉｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３，１９８８；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１，１９８７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４，１９８８；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４，１９８９を参照）。
【００３９】
簡単に述べると、ＣＤ４０ ｍＡｂの抗原結合部位（即ちＣＤ４０結合ドメイン；可変領域）をコードするＤＮＡを単離、増幅し、別の蛋白質、例えばヒトＩｇＧをコードするＤＮＡに連結する（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、上記；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、上記を参照）。また、抗原結合部位（可変領域）を、別の完全に異なる蛋白質に連結もしくは挿入し（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、上記）、完全に異なる蛋白質の機能活性とともに、抗体の抗原結合部位を持つ新たな蛋白質を得ることもできる。
【００４０】
同様に、ＣＤ４０リガンドのＣＤ４０結合領域（細胞外ドメイン）を用いて他のＣＤ４０結合蛋白質を調製してもよい。ＣＤ４０リガンドの有用な形体は、ＵＳＳＮ ０８／４７７，７３３およびＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４（共に１９９５年６月７日出願）に開示されている。ＣＤ４０リガンドの別の形体は、当該分野において既知の方法により調製可能である。他の有用なＣＤ４０結合蛋白質と同様、ＣＤ４０リガンドはリガンド結合ドメインもしくはその近くでＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０発現細胞にシグナルを伝えることができる（即ち生物学的活性のある）であろう。
【００４１】
オリゴマーを形成する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＣＤ４０抗体の抗原結合ドメインもしくはＣＤ４０リガンドの細胞外ドメインを含むＣＤ４０結合蛋白質の調製において特に有用であろう。ある、そのようなオリゴマー形成蛋白質は、ＵＳＳＮ ０８／４７７，７３３およびＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４（共に１９９５年６月７日出願）に開示されている；別の有用なオリゴマー形成蛋白質は、ＵＳＳＮ ０８／４４６，９２２（１９９５年５月１８日出願）にも開示されている。Ｆｃ融合蛋白質（Ｆｃムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）で形成され、Ｆｃ受容体に対する親和性が低下したものを含む）も調製できる。
【００４２】
前記のＣＤ４０結合蛋白質と実質的に同様の（即ち、天然アミノ酸配列と少なくとも８０％、最も好適には最低９０％同一のアミノ酸配列を有す）ＣＤ４０結合蛋白質の変異型も本発明に有用であろう。配列の一致率は、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４に記載、ウィスコンシン大学ジェネティックスコンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能）を用いて配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ． ２：４８２，１９８１）により修正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアライメント法を利用している。ＧＡＰプログラムの望ましいデフォルトのパラメーターは：（１）ＳｃｈｗａｒｔｚとＤａｙｈｏｆｆ編、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，３５３−３５８頁、１９７９年に記載された、ヌクレオチドに対する単一の比較行列（一致に対し１を不一致に対し０の値を含む）、およびＧｒｉｂｓｋｏｖとＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の荷重比較行列；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップの各文字に対するさらに０．１０のペナルティ；並びに（３）終末ギャップに対するペナルティなしを含む。
【００４３】
一般に、有用なＣＤ４０結合蛋白質の天然型におけるものから異なるアミノ酸型への置換は、保存的になされるべきである；即ち、最も好適な置換アミノ酸とは、本発明の蛋白質が天然のＣＤ４０リガンドと実質的に等価にＣＤ４０と結合する能力に影響しない。保存的置換の例としては、結合ドメイン外のアミノ酸の置換、並びにＣＤ４０結合蛋白質の２次および／もしくは３次構造を変更しないアミノ酸置換が含まれる。更なる例としては、Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，もしくはＡｌａを互いに置換するように、ある脂肪族残基からの別の脂肪族残基への置換、または、ＬｙｓとＡｒｇ間；ＧｌｕとＡｓｐ間；およびＧｌｎとＡｓｎ間のように、ある極性残基から別の極性残基への置換が含まれる。他のそのような保存的置換、例えば、類似した疎水性特性を持つ領域全体の置換がよく知られている。
【００４４】
同様に、欠失もしくは挿入法が採用された場合、生物学的活性に対する欠失もしくは挿入の潜在的効果を考慮すべきである。ＣＤ４０結合蛋白質のサブユニットを、末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させて構築することもできる。なされうる変異のタイプに関する別の指針は、ＣＤ４０結合蛋白質の配列を同様の構造を持つ蛋白質と比較することにより提供される。
【００４５】
変異は、勿論、コード配列の読み枠を保存していなければならず、ＣＤ４０結合蛋白質ｍＲＮＡの翻訳に不都合に働くループもしくはヘアピンなどのｍＲＮＡ２次構造を作り出すようなハイブリダイゼーションをしうる相補的な領域を作り出さないことが望ましい。変異部位は予め決定できるが、変異の性質それ自体は予め決定される必要はない。例えば、ある特定部位における変異の最適な性質を選択するために、無作為変異導入を標的コドンに導入し、発現した変異蛋白質を求める活性に対してスクリーニングすることもできる。
【００４６】
変異は、変異配列を含むオリゴヌクレオチド（天然の配列の断片に連結可能となるよう制限部位を隣に配置しておく）を合成することにより特定の座に導入することができる。連結後、得られる再構築された配列は、求めるアミノ酸付加、置換もしくは欠失を有す類似体をコードする。または、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異導入を使って、求める置換、欠失もしくは付加によって変更された特定のコドンを有す変更された遺伝子を提供することもできる。上記の変更を行う実際の方法の例については、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２−１９、１９８５年１月）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；並びに米国特許第４，５１８，５８４号および４，７３７，４６２号に開示されており、これらには適当な技術が開示され、本明細書中に参考文献として援用されている。
【００４７】
当該分野でよく知られているように、すべての変異がアミノ酸配列の変化を生じさせるわけではない。組換蛋白質の生産に有利な特性を与える変異も、有用なＣＤ４０結合蛋白質の調製に有用であろう。天然に存在する変異型も本発明に包含される。そのような変異型の例は、ｍＲＮＡの選択的スプライシングもしくは蛋白質の蛋白分解的切断から生じる蛋白質であり、そこにおいても天然の生物学的特性は保持されている。
【００４８】
適当な抗体もしくは結合蛋白質が得られたなら、当該分野に熟達したものにはよく知られた多くの技術によってそれらを単離もしくは精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照）。適当な技術には、ペプチドもしくは蛋白質アフィニティカラム、ＨＰＬＣもしくはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡもしくはプロテインＧカラムによる精製、または、これらの技術のいかなる組み合わせも含まれる。組換ＣＤ４０結合蛋白質は、標準的方法に従って調製し、例えばＥＬＩＳＡ、ＡＢＣもしくはドットブロットアッセイを含めた当該分野において既知のアッセイを利用してＣＤ４０に対する結合特異性を試験することができる。後者は、ＣＤ４０結合蛋白質の生物学的活性の評価にも有用である。
【００４９】
抗原の調製
免疫は、疾患を予防もしくは改善するための病原体に対する防御的免疫応答も含め、１世紀の歴史を持つ非常に効果的な手段である。そのような誘導のために使われてきたワクチンは、生きた弱毒化された微生物、または殺された微生物標品もしくはその分画であることが一般的である。弱毒化生ワクチンは一般的に、殺された微生物もしくは病原体由来の非感染性標品から調製されるもの（即ち、トキソイド、組換蛋白質ワクチン）に比べ、自然の感染時に起こる免疫応答により近く模倣するものと考えられている。しかし、弱毒化ワクチンもまた、病原性の復活という危険性を持っており、特に免疫不調の患者には病気を起こしうる。
【００５０】
衛生状況の改善にともない、免疫は、ヒトおよび動物における多くの感染症による死もしくは障害を防ぐ最も有効な手段となってきた。疑いのある集団に対する予防接種は、世界レベルでの小ポックスの根絶、そして先進国におけるジフテリア、百日咳および麻痺性ポリオなどの疾患の罹患率の劇的な現象をもたらしてきた。アデノウイルス、はしか、おたふく風邪および風疹ウイルス、並びにポリオウイルスといった生ウイルスワクチン、そしてジフテリアおよび破傷風トキソイドワクチン、並びにＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｂおよび髄膜炎菌多糖ワクチンを含め、多数のワクチンのヒトへの投与が許可されている（Ｈｉｎｍａｎら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，第３版；Ｇ．Ｌ． Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｒ．Ｇ．Ｄｏｕｇｌａｓ およびＪ．Ｅ． Ｂｅｎｎｅｔｔ編、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ニューヨーク；２３２０−２３３３；表２）。
【００５１】
感染症の分野での利用に加え、予防接種はガンの有望な治療法としても考えられている。そのような利用法のために、例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０５５ （１９９４） およびＣｏｈｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：３１５（１９９４）に記載されたようにして腫瘍細胞の粗抽出液を調製する、または抗原を部分的に精製する（例えば、Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１２０２；１９９４に記載）ことによって、腫瘍細胞から腫瘍に関連した抗原を調製することができる。さらに、有用な腫瘍抗原をさらに精製、または組み換えて発現させることで、適当な抗原標品を提供することもできる。ガンにおいてそれに対する免疫応答が有益であると考えられる抗原を同定し単離する他のいかなる方法も、本発明の方法に有用性を見出すであろう。
【００５２】
精製した樹状細胞を、それから、抗原にパルス（暴露）させ、他の免疫系の細胞に提示するのに適した様式で抗原を取り込まさせる。抗原は、古典的には２種の経路で加工され提示される。細胞質画分の蛋白質に由来するペプチドはクラスＩ ＭＨＣ分子の流れで提示され、エンドサイトーシス経路に見出される蛋白質に由来するペプチドはクラスＩＩ ＭＨＣ分子の流れで提示される。しかし、当該分野に熟達したものは、例外が存在することに気づく；例えば、ＣＤ８+腫瘍特異的Ｔ細胞（ＭＨＣクラスＩ上に発現された外来性腫瘍抗原を認識する）の反応。ＭＨＣ依存性の抗原加工およびペプチド提示に関するレビューはＧｅｒｍａｉｎ， Ｒ．Ｎ．， Ｃｅｌｌ ７６：２８７（１９９４）に見出される。
【００５３】
樹状細胞を抗原でパルスする多数の方法が知られている；当該分野の熟達者は選択された抗原を適当な方法で開発することを、日常の実験と見做している。一般に、細胞の生存能力が促進される条件下で培養された樹状細胞に抗原を添加し、それから細胞が抗原を取り込み加工するのに十分な時間を与え、そして約２４時間（約１８から約３０時間、２４時間が望ましい）の間に、クラスＩもしくはクラスＩＩ ＭＨＣに関連して細胞表面に抗原ペプチドが発現される。樹状細胞は、抗原をコードするＤＮＡでトランスフェクトすることによって抗原に暴露してもよい。ＤＮＡが発現し、抗原は細胞質／クラスＩの経路でおそらく加工されるであろう。
【００５４】
活性化され抗原パルスされた樹状細胞の投与
本発明は、活性化され抗原パルスされた樹状細胞を含む治療組成物の使用法を提供する。そのような細胞を可溶性サイトカイン受容体もしくはサイトカインまたは他の免疫制御分子と組み合わせて使用することも企図されている。本発明の組成物は、免疫応答を刺激するために投与され、巨丸注入、連続点滴、インプラントからの持続的放出、もしくは他の適当な技術によって与えられうる。典型的には、生理学的に受容可能な担体、賦形剤もしくは希釈剤とともに、抗原パルスされ活性化された樹状細胞を含む組成物の形で、本発明の方法の細胞を投与するであろう。そのような担体は、使われる薬量および濃度において受容者にとって毒性が無いであろう。中性緩衝化生理食塩水もしくは同種の血清アルブミンと混合した生理食塩水が、実際に適した希釈液である。
【００５５】
あるタイプの免疫応答を刺激するのに使うにあたり、活性化され抗原パルスされた樹状細胞とともに他のサイトカインの投与も企図されている。いくつかの有用なサイトカイン（もしくはペプチド制御因子）については、Ｓｃｈｒａｄｅｒ， Ｊ．Ｗ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：２９５；１９９１）に考察されている。そのような因子としては、インターロイキン１，２，４，５，６，７，１０，１２および１５；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子；インターロイキン−３と顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む融合蛋白質；インターフェロン−γ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−β、ｆｌｔ−３リガンド、並びにその生物学的活性のある誘導体（これら単独もしくはその組み合わせ）が含まれる。特に望ましいサイトカインはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。可溶化型ＣＤ４０Ｌは、ＵＳＳＮ ０８／４８４，６２４（１９９５年６月７日出願）に記載されている。他のサイトカインも、本明細書中で記載されているように、有用であろう。そのようなサイトカインをコードするＤＮＡもまた、例えば、樹状細胞にトランスフェクトしてサイトカインを発現させることによって、本発明の方法に有用であろう。これらの免疫制御分子の投与は、本発明の細胞と同時に、別々に、もしくは逐次的に投与することが含まれる。
【００５６】
好ましい態様
本発明は好ましくは以下の態様を含む。
１．（ａ） 樹状細胞を回収し；
（ｂ） （ｉ）抗原の取り込みおよび加工を促進する条件下で培養中に該樹状細胞を抗原に暴露させる、もしくは（ｉｉ）該抗原をコードする遺伝子で該樹状細胞をトランスフェクトすることによって、該樹状細胞に該抗原を発現させ；そして
（ｃ） 該抗原を発現する樹状細胞を、可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を最低約９０％阻害することが観察されることによって決定されるように、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害することができるＣＤ４０結合蛋白質に暴露することによって、該抗原を発現する樹状細胞を活性化する
工程により産生される、抗原を発現する活性化された樹状細胞の集団。
【００５７】
２．造血幹細胞もしくは始原細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ， ｆｌｔ３−Ｌ， ＩＬ−４， ＴＮＦ−α， ＩＬ−３， ｃ−ｋｉｔリガンド， ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３の融合体、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と接触させることによって、樹状細胞が得られる、態様１に記載の集団。
【００５８】
３．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；並びに
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド、
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１に記載の集団。
【００５９】
４．可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドが：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にあげられたアミノ酸配列を持ち、アミノ酸１９４のシステインが別のアミノ酸に置換されているポリペプチド；および
（ｂ） ムテイン（ａ）の断片でＣＤ４０に結合するポリペプチド；
ここにおいて、アミノ酸１９４のシステインのかわりに置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される
からなるグループから選択される、態様３に記載の集団。
【００６０】
５．（ａ） 個体から樹状細胞を回収し；
（ｂ） （ｉ）抗原の取り込みおよび加工を促進する条件下で培養中に該樹状細胞を抗原に暴露させる、もしくは（ｉｉ）該抗原をコードする遺伝子で該樹状細胞をトランスフェクトすることによって、該樹状細胞に該抗原を発現させ；
（ｃ） 該抗原を発現する樹状細胞を、可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を最低約９０％阻害することが観察されることによって決定されるように、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害することができるＣＤ４０結合蛋白質に暴露することによって、該抗原を発現する樹状細胞を活性化し；そして
（ｄ） 該活性化され抗原を発現する樹状細胞を該個体に投与する
工程を含む、個体における抗原に対する特異的な免疫反応を刺激する方法。
【００６１】
６．造血幹細胞もしくは始原細胞を該個体から回収し、該造血幹細胞もしくは始原細胞をｆｌｔ−３リガンド， ＧＭ−ＣＳＦ， ＩＬ−４， ＴＮＦ−α， ＩＬ−３， ｃ−ｋｉｔリガンド， ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３の融合体、および、これらの組み合わせからなるグループから選択される分子と接触させることによって、樹状細胞が得られる、態様５に記載の方法。
【００６２】
７．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；並びに
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド、
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様６に記載の方法。
【００６３】
８．可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドが：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にあげられたアミノ酸配列を持ち、アミノ酸１９４のシステインが別のアミノ酸に置換されているポリペプチド；および
（ｂ） ポリペプチド（ａ）の断片でＣＤ４０に結合するポリペプチド；
ここにおいて、アミノ酸１９４のシステインのかわりに置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される
からなるグループから選択される、態様７に記載の集団。
【００６４】
９．該個体の血中の始原細胞数を増大させるため、ｆｌｔ−３リガンドが樹状細胞回収前に該個体に投与される、態様５に記載の方法。
１０．造血幹細胞もしくは始原細胞を該個体から回収し、該造血幹細胞もしくは始原細胞をｆｌｔ−３リガンド，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−４，ＴＮＦ−α，ＩＬ−３，ｃ−ｋｉｔリガンド， ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３の融合体、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と接触させることによって、樹状細胞が得られる、態様９に記載の方法。
【００６５】
１１．抗原を発現し、活性化された樹状細胞が、インターロイキン１，２，３，４，５，６，７，１０，１２および１５；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子；インターロイキン−３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む融合蛋白質；インターフェロン−γ；ＴＮＦ；ＴＧＦ−β；ｆｌｔ−３リガンド；可溶性ＣＤ４０リガンド；可溶性ＣＤ８３；これらサイトカインの生物学的活性のある誘導体；並びにこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と、同時に、逐次的に、または別々に投与される、態様５に記載の方法。
【００６６】
１２．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様９に記載の方法。
【００６７】
１３．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１０に記載の方法。
【００６８】
１４．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１１に記載の方法。
【００６９】
１５．（ａ） 個体から樹状細胞を回収し；
（ｂ） （ｉ）抗原の取り込みおよび加工を促進する条件下で培養中に該樹状細胞を抗原に暴露させる、もしくは（ｉｉ）該抗原をコードする遺伝子で該樹状細胞をトランスフェクトすることによって、該樹状細胞に該抗原を発現させ；
（ｃ） 該抗原を発現する樹状細胞を、可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を最低約９０％阻害することが観察されることによって決定されるように、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害することができるＣＤ４０結合蛋白質に暴露することによって、該抗原を発現する樹状細胞を活性化し；そして
（ｄ） Ｔ細胞に対して該樹状細胞に該抗原を提示させる
工程を含む、個体から抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法。
【００７０】
１６．抗原特異的Ｔ細胞が、該個体から回収され、抗原提示樹状細胞にｅｘ ｖｉｖｏで暴露され、そして該個体に再投与される、態様１５に記載の方法。
１７．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１５に記載の方法。
【００７１】
１８．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１６に記載の方法。
【００７２】
１９．（ａ） 個体から樹状細胞を回収し；
（ｂ） （ｉ）抗原の取り込みおよび加工を促進する条件下で培養中に該樹状細胞を抗原に暴露させる、もしくは（ｉｉ）該抗原をコードする遺伝子で該樹状細胞をトランスフェクトすることによって、該樹状細胞に該抗原を発現させ；
（ｃ） 該抗原を発現する樹状細胞を、可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を最低約９０％阻害することが観察されることによって決定されるように、ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害することができるＣＤ４０結合蛋白質に暴露することによって、該抗原を発現する樹状細胞を活性化し；そして
（ｄ） Ｔ細胞に対して該樹状細胞に該抗原を提示させる
工程によって産生される抗原特異的Ｔ細胞の集団。
【００７３】
２０．ＣＤ４０結合蛋白質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｂ） ＣＤ４０に結合する（ａ）によるペプチドの断片；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド；
（ｄ） （ａ）によるポリペプチドで、アミノ酸１９４のシステインが、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される別のアミノ酸に置換されている当該ポリペプチド；並びに
（ｅ） ポリペプチド（ｄ）の断片でＣＤ４０に結合する当該断片；
並びにオリゴマー形成ペプチドから成るグループから選択される、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドである、態様１９に記載の集団。
【実施例】
【００７４】
本明細書中にあげた全ての出版物の関連開示は、参考文献として取り入れられている。以下の実施例は本発明の特定の態様の例示を提供するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００７５】
実施例１
本実施例は、精製された樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで作製する方法を記載する。ヒト骨髄を入手し、ＣＤ３４+表現型を有す細胞をＣＤ３４抗体カラム（ＣｅｌｌＰｒｏ， Ｂｏｔｈｅｌｌ， ワシントン州）を用いて分離する。ＣＤ３４+細胞を、適当な培地、例えば、マッコイのエンハンス培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍｅｄｉａ）（樹状細胞の増殖を促進するサイトカイン（即ち、ＧＭ−ＣＳＦ， ＩＬ−４， ＴＮＦ−αをそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌ、または、１００ｎｇ／ｍｌのｆｌｔ３−Ｌもしくはｃ−ｋｉｔリガンド、またはそれらの組み合わせ）を含む）で培養する。３７℃、１０％ ＣＯ2、湿気でおよそ２週間培養し続ける。それから細胞を、ＣＤ１ａ+， ＨＬＡ−ＤＲ+ およびＣＤ８６+に対する抗体を使ってフローサイトメトリーによりソートする。ＧＭ−ＣＳＦ， ＩＬ−４およびＴＮＦ−αの組み合わせは、２週間の培養後、細胞数を６から７倍に増加させることができ、その内５０−８０％がＣＤ１ａ+ ＨＬＡ−ＤＲ+ ＣＤ８６+である。ｆｌｔ３−Ｌおよび／もしくはｃ−ｋｉｔリガンドの添加は、総細胞の増加、従って、樹状細胞の増加をさらに昂進する。こうした条件下で分離し培養した細胞の表現型分析は、細胞の６０−７０％がＨＬＡ−ＤＲ+ ＣＤ８６+（試験した全ての因子の組み合わせにおいてＣＤ１ａを発現する細胞の４０−５０％）である。
【００７６】
実施例２
本発明は、樹状細胞を回収し増幅させるための方法を記載する。細胞回収前に、ｆｌｔ３−Ｌもしくはサルグラモスチン（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標），Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ワシントン州シアトル）を個体に投与し血中のＰＢＰＣおよびＰＢＳＣの数を変動もしくは増加させることができる。ＣＳＦ−１，ＧＭ−ＣＳＦ，ｃ−ｋｉｔリガンド，Ｇ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＩＬ−１３，ＩＬ−１４，ＩＬ−１５，ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合蛋白質，ＬＩＦ，ＦＧＦおよびその組み合わせなどの他の増殖因子を、ｆｌｔ３−Ｌと連続的にもしくは同時に組み合わせて、同様に投与することができる。
【００７７】
動化もしくは非動化したＰＢＰＣおよびＰＢＳＣを、当該分野で既知のａｐｈｅｒｅｓｉｓ操作を用いて回収する。例えば、Ｂｉｓｈｏｐら、Ｂｌｏｏｄ， ８３巻、２号、６１０−６１６頁（１９９４年）を参照していただきたい。簡単に述べると、ＰＢＰＣおよびＰＢＳＣを従来の器具、例えばＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ モデルＶ５０ ａｐｈｒｅｓｉｓ ｄｅｖｉｃｅ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ， マサチューセッツ州ブレインツリー）を用いて回収する。典型的には、およそ６．５×１０8単核球（ＭＮＣ）／ｋｇ個体が回収されるまで、週５回以下で４時間回収を行う。
【００７８】
回収されたＰＢＰＣおよびＰＢＳＣのアリコットを顆粒球−マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）量についてアッセイする。簡単に述べると、ＭＮＣ（およそ３００，０００）を分離し、十分な湿度のもと、３７℃、５％ＣＯ2で、改変されたマッコイの５Ａ培地（０．３％寒天、２００Ｕ／ｍｌ組換ヒトＧＭ−ＣＳＦ、２００Ｕ／ｍｌ組換ヒトＩＬ−３および２００Ｕ／ｍｌ組換ヒトＧ−ＣＳＦを含む）中で約２週間培養する。ｆｌｔ３−ＬもしくはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合分子（ＰＩＸＹ ３２１）を含め、他のサイトカインを培養液に添加してもよい。これらの培養液をＷｒｉｇｈｔ染色液で染め、ＣＦＵ−ＧＭコロニーを解剖顕微鏡を用いて計測する（Ｗａｒｄら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１６：３５８（１９８８））。また、ＣＦＵーＧＭコロニーは、Ｓｉｅｎａら、Ｂｌｏｏｄ，７７巻、２号、４００−４０９頁、１９９１年のＣＤ３４／ＣＤ３３フローサイトメトリー法、または当該分野で既知のいかなる他の方法を用いてアッセイしてもよい。
【００７９】
ＣＦＵ−ＧＭを含む培養液を、レート制御フリーザー（例、Ｃｒｙｏ−Ｍｅｄ，ミズーリ州マウントクレメンス）で凍らせ、それから液体窒素の蒸気相中で保存する。１０％ジメチルスルホキシドを凍結防止剤として使用してもよい。個体から全ての回収作業がなされた後、ＣＦＵ−ＧＭを含む培養液を融解し、プールし、それからｆｌｔ３−Ｌと、上記にあげた他のサイトカインとを別々に、逐次的にもしくは同時に組み合わせて接触させ、ＣＦＵ−ＧＭを樹状細胞系列へと誘導する。樹状細胞は、培養され、上記の選択マーカーを発現する細胞の割合について分析される。
【００８０】
実施例３
本実施例は、ＣＤ４０Ｌ刺激された樹状細胞が同種抗原を提示し、従ってＴ細胞の増殖をもたらす能力を例示する。ＣＤ３４+細胞をヒトドナーの骨髄から得て、選択されたサイトカインの存在下で２週間培養し、実質的に実施例１に記載したようにしてフローサイトメトリーにより分離した。混合リンパ球反応液（ＭＬＲ）中でそれらを使う前に、樹状細胞の増殖を助けるサイトカインを含むマッコイのエンハンス培地中で、ＣＤ４０Ｌの可溶性３量体の存在下（１μｇ／ｍｌ）もしくは非存在下で樹状細胞をさらに２４時間培養した。
【００８１】
ＨＬＡ不一致のドナーの血液から、２−アミノメチルイソチオイロニウム ブロマイド ヒドロブロマイド処理した羊赤血球でロゼット化させることによって、Ｔ細胞を精製した。ＣＤ４+およびＣＤ８+集団を、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， カリフォルニア州サニーベール）を用いて業者の指示にしたがって免疫磁気選択によりさらに精製した。滴定された数の樹状細胞の存在下で、ＲＰＭＩ（１０％加熱不活化されたウシ胎児血清を含む）中で、３７℃、１０％ＣＯ2下で、精製したＴ細胞に対して細胞増殖アッセイを行った。ウェルあたりおよそ１×１０5のＴ細胞を、丸底９６穴ミクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で３重にして、様々な数の不一致樹状細胞の存在下で、７日間培養した。トリチウムラベルしたチミジン（２５Ｃｉ／ｎｍｏｌｅ，アマシャム、イリノイ州アーリントンハイツ）１μＣｉ／ウェルで培養の最後の８時間、細胞をパルスした。
【００８２】
細胞を自動細胞回収器でグラスファーバーディスク上に回収し、取り込まれたｃｐｍを液体シンチレーションスペクトロメトリーで計測した。結果は、図１に示してあるが、ＭＬＲに使用する前にＣＤ４０Ｌ暴露しなかったものに比べ、ＣＤ４０Ｌ活性化した樹状細胞は、Ｔ細胞を同等に増殖刺激するのに要する量が３倍少なかったことが示された。この増加は、同種反応性Ｔ細胞を刺激する細胞表面分子の発現の増加によるものと思われた。
【００８３】
実施例４
本実施例は、樹状細胞が抗原特異的にＴ細胞の増殖を刺激する能力を例示する。ＣＤ３４+細胞を、破傷風トキソイドに対して反応すると考えられるヒトドナーの骨髄から採取し、選択されたサイトカインの存在下で２週間培養し、実質的に実施例１に記載したようにしてフローサイトメトリーによって分離した。これらを破傷風トキソイド（ＴＴＸ）抗原提示アッセイに使用する前に、樹状細胞の増殖を助けるサイトカインを含むマッコイのエンハンス培地中で、ＣＤ４０Ｌの可溶性３量体の存在下（１μｇ／ｍｌ）もしくは非存在下で樹状細胞をさらに２４時間培養し、それから精製したＴＴＸ（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．， ペンシルバニア州スイフトウォーター）で、３７℃、１０％ＣＯ2下で２４時間パルスした。
【００８４】
自己由来の破傷風トキソイド反応性Ｔ細胞は、精製したＴＴＸおよび低濃度のＩＬ−２およびＩＬ−７（それぞれ、２ｎｇ／ｍｌおよび５ｎｇ／ｍｌ）存在下で、ＣＤ３４抗体カラムから溶出したＣＤ３４−細胞を２週間培養することによって誘導した。ＣＤ３４−集団は、抗原提示細胞として作用する他のタイプの細胞以外に、Ｔ細胞（その一部は破傷風トキソイドに反応する）をある割合（約５％）だけ含んでいる。２週目までには、これらの細胞の分析から、約９０％がＴ細胞で、その大勢が破傷風トキソイド特異的で、Ｔ細胞活性化マーカーは低レベルになっていることが示された。
【００８５】
抗原特異的Ｔ細胞増殖アッセイは、１０％加熱不活化されたウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ中で、３７℃、１０％ＣＯ2下で、破傷風トキソイドパルスされた樹状細胞の存在下で、上記ＣＤ３４−骨髄細胞からのＴＴＸ特異的Ｔ細胞について行われた。ウェルあたりおよそ１×１０5のＴ細胞を、丸底９６穴ミクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で３重にして、滴定された数の樹状細胞の存在下で、５日間培養した。トリチウムラベルしたチミジン（２５Ｃｉ／ｎｍｏｌｅ，アマシャム、イリノイ州アーリントンハイツ）１μＣｉ／ウェルで培養の最後の４から８時間、細胞をパルスした。細胞を自動細胞回収器でグラスファーバーディスク上に回収し、取り込まれたｃｐｍを液体シンチレーションスペクトロメトリーで計測した。結果は、図２に示してあるが、ＣＤ４０Ｌとともに培養した樹状細胞は、ＣＤ４０Ｌ暴露しなかった樹状細胞に比べ、ＴＴＸ特異的Ｔ細胞に対する抗原提示効率が約１０倍低いことが示された。
【００８６】
実施例５
本実施例は、ＣＤ４０Ｌが、抗原パルスされた樹状細胞の抗原特異的Ｔ細胞の刺激を活性化する能力について例示する。ＣＤ３４+細胞を実施例４に記載したようにして回収し、処理をした。但し、ＣＤ４０Ｌとともに培養する前に破傷風トキソイドで２４時間パルスした。自己由来の破傷風トキソイド反応性Ｔ細胞の誘導、および抗原特異的Ｔ細胞増殖アッセイは、実施例４に記載されたようにして行った。結果は、図３に示してあるが、最初に抗原でパルスし、それからＣＤ４０Ｌで培養した樹状細胞は、抗原でパルスしたがＣＤ４０Ｌ暴露しなかった樹状細胞に比べ、ＴＴＸ特異的Ｔ細胞にＴＴＸを提示した際に同等の増殖刺激を与えるのに要する量が、３倍少なかったことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、同種（ａｌｌｏ）抗原Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表し、ＭＬＲ（混合リンパ球反応液）中でその使用前に樹状細胞をＣＤ４０Ｌとともにインキュベートすると、樹状細胞のＴ細胞増殖刺激能を約３倍増加させることを示している（実施例３に記載）。
【図２】図２は、ＣＤ４０Ｌとともに培養した樹状細胞が、ＣＤ４０Ｌに暴露されていない樹状細胞に比べ、抗原特異的Ｔ細胞に対する抗原提示に関して効果的でないことを例示する（実施例４に記載）。
【図３】図３は、最初に抗原でパルスされ、次にＣＤ４０Ｌとともに培養された樹状細胞が、抗原でパルスされたがＣＤ４０Ｌに暴露されていない樹状細胞に比べ、抗原特異的Ｔ細胞に対する抗原提示に関して効果的であることを例示する（実施例５に記載）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ） （ｉ）抗原の取り込みおよび加工を促進する条件下で培養中に該樹状細胞を抗原に暴露させる、もしくは（ｉｉ）該抗原をコードする遺伝子で該樹状細胞をトランスフェクトすることによって、該樹状細胞に該抗原を発現させ；そして
（ｂ） 該抗原を発現する樹状細胞を、ＣＤ４０に結合できるＣＤ４０結合タンパク質に暴露することによって、該抗原を発現する樹状細胞を活性化する
工程により産生される、抗原を発現する活性化された樹状細胞の集団であって、
ここにおいて、前記ＣＤ４０結合タンパク質は、ＣＤ４０抗体、あるいは、ＣＤ４０結合ペプチド及びオリゴマ形成ペプチドを含む、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドであって、そして、ＣＤ４０結合ペプチ緒は、以下の：
（ｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｉｉ） ＣＤ４０に結合する、（ｉ）のペプチドの断片；並びに
（ｉｉｉ） （ｉ）もしくは（ｉｉ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド
から成るグループから選択される、
前記集団。
【請求項２】
ＣＤ４０結合蛋白質が、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を少なくとも９０％阻害することができる、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
造血幹細胞もしくは始原細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ，ｆｌｔ３−Ｌ，ＩＬ−４，ＴＮＦ−α，ＩＬ−３，ｃ−ｋｉｔリガンド，ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３の融合体、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と接触させることによって、樹状細胞が得られる、請求項１又は２に記載の集団。
【請求項４】
ＣＤ４０結合タンパク質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されたアミノ酸配列を持ち、アミノ酸１９４のシステインが別のアミノ酸に置換されているポリペプチド；および
（ｂ） ポリペプチド（ａ）の断片でＣＤ４０に結合するポリペプチド；
ここにおいて、アミノ酸１９４のシステインのかわりに置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される
からなるグループから選択される、請求項３に記載の集団。
【請求項５】
前記（ａ）の樹状細胞が、工程（ａ）および（ｂ）の前にｆｌｔ−３リガンドで処理されている、請求項１−４のいずれか１項の集団。
【請求項６】
免疫応答を刺激するための治療組成物の調製ための、請求項１−５のいずれか１項の活性化された樹状細胞の集団の使用。
【請求項７】
インターロイキン１，２，３，４，５，６，７，１０，１２および１５；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子；インターロイキン−３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む融合蛋白質；インターフェロン−γ；ＴＮＦ；ＴＧＦ−β；ｆｌｔ−３リガンド；可溶性ＣＤ４０リガンド；可溶性ＣＤ８３；これらサイトカインの生物学的活性のある誘導体；並びにこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と組み合わせである、請求項６の使用。
【請求項８】
請求項１−５のいずれか１項の活性化された樹状細胞の集団を含む、免疫応答を刺激するための治療組成物
【請求項９】
インターロイキン１，２，３，４，５，６，７，１０，１２および１５；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子；インターロイキン−３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む融合蛋白質；インターフェロン−γ；ＴＮＦ；ＴＧＦ−β；ｆｌｔ−３リガンド；可溶性ＣＤ４０リガンド；可溶性ＣＤ８３；これらサイトカインの生物学的活性のある誘導体；並びにこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と投与される、請求項８の治療組成物。
【請求項１０】
抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、
（ａ）請求項１−５のいずれか１項の活性化された樹状細胞の集団を提供し；そして
（ｂ）活性化された樹状細胞がＴ細胞へｅｘ ｖｉｖｏで抗原を提示することを可能にする
工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法により得られるＴ細胞の集団。
【請求項１２】
請求項１０のＴ細胞の集団の、免疫応答を刺激するための治療組成物の調製のための使用。
【請求項１３】
請求項１１のＴ細胞の集団を含む、免疫応答を刺激するための治療組成物。
【請求項１】
（ａ） （ｉ）抗原の取り込みおよび加工を促進する条件下で培養中に該樹状細胞を抗原に暴露させる、もしくは（ｉｉ）該抗原をコードする遺伝子で該樹状細胞をトランスフェクトすることによって、該樹状細胞に該抗原を発現させ；そして
（ｂ） 該抗原を発現する樹状細胞を、ＣＤ４０に結合できるＣＤ４０結合タンパク質に暴露することによって、該抗原を発現する樹状細胞を活性化する
工程により産生される、抗原を発現する活性化された樹状細胞の集団であって、
ここにおいて、前記ＣＤ４０結合タンパク質は、ＣＤ４０抗体、あるいは、ＣＤ４０結合ペプチド及びオリゴマ形成ペプチドを含む、可溶性オリゴマーＣＤ４０リガンドであって、そして、ＣＤ４０結合ペプチ緒は、以下の：
（ｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１から２６１，３５から２６１，３４から２２５，１１３から２６１，１１３から２２５，１２０から２６１もしくは１２０から２２５を含むペプチド；
（ｉｉ） ＣＤ４０に結合する、（ｉ）のペプチドの断片；並びに
（ｉｉｉ） （ｉ）もしくは（ｉｉ）のペプチドをコードするＤＮＡに、ストリンジェントな条件下（６×ＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイズ；３×ＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズするＤＮＡにコードされ、ＣＤ４０に結合するペプチド
から成るグループから選択される、
前記集団。
【請求項２】
ＣＤ４０結合蛋白質が、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を少なくとも９０％阻害することができる、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
造血幹細胞もしくは始原細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ，ｆｌｔ３−Ｌ，ＩＬ−４，ＴＮＦ−α，ＩＬ−３，ｃ−ｋｉｔリガンド，ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３の融合体、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と接触させることによって、樹状細胞が得られる、請求項１又は２に記載の集団。
【請求項４】
ＣＤ４０結合タンパク質が：
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されたアミノ酸配列を持ち、アミノ酸１９４のシステインが別のアミノ酸に置換されているポリペプチド；および
（ｂ） ポリペプチド（ａ）の断片でＣＤ４０に結合するポリペプチド；
ここにおいて、アミノ酸１９４のシステインのかわりに置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなるグループから選択される
からなるグループから選択される、請求項３に記載の集団。
【請求項５】
前記（ａ）の樹状細胞が、工程（ａ）および（ｂ）の前にｆｌｔ−３リガンドで処理されている、請求項１−４のいずれか１項の集団。
【請求項６】
免疫応答を刺激するための治療組成物の調製ための、請求項１−５のいずれか１項の活性化された樹状細胞の集団の使用。
【請求項７】
インターロイキン１，２，３，４，５，６，７，１０，１２および１５；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子；インターロイキン−３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む融合蛋白質；インターフェロン−γ；ＴＮＦ；ＴＧＦ−β；ｆｌｔ−３リガンド；可溶性ＣＤ４０リガンド；可溶性ＣＤ８３；これらサイトカインの生物学的活性のある誘導体；並びにこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と組み合わせである、請求項６の使用。
【請求項８】
請求項１−５のいずれか１項の活性化された樹状細胞の集団を含む、免疫応答を刺激するための治療組成物
【請求項９】
インターロイキン１，２，３，４，５，６，７，１０，１２および１５；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子；インターロイキン−３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む融合蛋白質；インターフェロン−γ；ＴＮＦ；ＴＧＦ−β；ｆｌｔ−３リガンド；可溶性ＣＤ４０リガンド；可溶性ＣＤ８３；これらサイトカインの生物学的活性のある誘導体；並びにこれらの組み合わせからなるグループから選択される分子と投与される、請求項８の治療組成物。
【請求項１０】
抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、
（ａ）請求項１−５のいずれか１項の活性化された樹状細胞の集団を提供し；そして
（ｂ）活性化された樹状細胞がＴ細胞へｅｘ ｖｉｖｏで抗原を提示することを可能にする
工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法により得られるＴ細胞の集団。
【請求項１２】
請求項１０のＴ細胞の集団の、免疫応答を刺激するための治療組成物の調製のための使用。
【請求項１３】
請求項１１のＴ細胞の集団を含む、免疫応答を刺激するための治療組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−１１９００４（Ｐ２００８−１１９００４Ａ）
【公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２７４８０（Ｐ２００７−３２７４８０）
【出願日】平成１９年１２月１９日（２００７．１２．１９）
【分割の表示】特願平１０−５０５３４９の分割
【原出願日】平成９年７月９日（１９９７．７．９）
【出願人】（５９１１２３６０９）イミュネックス・コーポレーション (24)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＥＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１９日（２００７．１２．１９）
【分割の表示】特願平１０−５０５３４９の分割
【原出願日】平成９年７月９日（１９９７．７．９）
【出願人】（５９１１２３６０９）イミュネックス・コーポレーション (24)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＥＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]