樹状高分子量ポリマー薬物担体および特に固形腫瘍の処置のための薬物とのそれらの結合体
本発明は、アミドアミン及び２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸タイプのデンドリマーから誘導され、そのアミノ末端基及びヒドロキシ末端基がＮ−（２ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）のセミテレケリックコポリマーに生分解性スペーサーを介して連結している、水溶性高分子量ポリマー薬物担体、及び薬物とのその結合体に関する。ポリマー担体及び結合体は、固形腫瘍中への特に抗癌剤の標的輸送を可能にし、生分解、付随する制御薬物放出、及びそれに続く生物体からのポリマー担体の排出が提供される。ヒト腫瘍の標的療法に使用するための抗癌剤と複合化されたポリマー担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固形腫瘍中への抗腫瘍薬物の標的化輸送、生分解、付随する制御薬物放出及びそれに続く生物体からのポリマー担体の排出を可能にする、水溶性高分子量（ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ：ＨＭＷ）樹状ポリマー薬物担体、及び薬物とのその結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する。抗癌剤（ｃａｎｃｅｒｏｓｔａｔｉｃ）と結結合体化されたポリマー担体の作用は、ヒト腫瘍の標的療法を目標とする。
【背景技術】
【０００２】
最近、薬剤開発は、主に必要な治療効果の部位における活性物質の標的化作用を可能にする剤形の探索をますます目標とするようになった。標的化された活性型の薬物は、その副作用が生物体の健常な部分の損傷を招くおそれがある物質と一緒に適用される。この話題の最大の懸念は、健常な組織及び器官を損傷し、細胞増殖抑制剤による処置を受けている患者を危険にさらすことである。薬物の標的化輸送用担体としてのポリマー材料、特に水溶性ポリマーの利用は、上記問題の重要な解決候補の一つである。共有結合による水溶性ポリマーへの細胞増殖抑制剤の連結（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）は、水溶性の乏しい薬物の溶解性をかなり高めることができ、その毒性を顕著に低下させることができる。ポリマー−薬物結合体の分子量は、糸球体ろ過による生物体からの薬物の急速な排出を防止し、したがってその血中循環時間及び生物体におけるその全滞留時間をかなり延長し、したがって薬物の生物学的利用能を高める。さらに、ポリマー結合体の高分子量は、高められた透過性及び保持（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ：ＥＰＲ）の効果に起因して、固形腫瘍におけるその蓄積を増加させる［非特許文献１（Ｍａｅｄａ ２０００）］。
【０００３】
抗癌剤がポリマー担体に連結すると、この効果を腫瘍におけるその標的蓄積に利用することができる。過去２０年間に、ＥＰＲ効果をポリマーミセル、リポソームまたは水溶性ポリマー結合体などの薬物のターゲティングに利用することに基づく幾つかの系が開発された。ポリマーミセルは、可溶性ポリマー系とは対照的に、通常、コロイド溶液を形成するＨＭＷ構造中に両親媒性ジブロックコポリマーを構築することによって調製される。薬物は、大部分はその疎水性コアにおいて物理的（疎水性）相互作用又は共有結合によってミセルに連結する［非特許文献２（Ｋａｔａｏｋａ ２００１）、非特許文献３（Ｂａｅ ２００３）、非特許文献４（Ｂｒｏｎｉｃｈ １９９９）］。固形腫瘍に蓄積する可溶系ミセルとは対照的に、ポリマーは、水性媒体中に分子的に分散し、通常はランダムコイル形状をとり、薬物は親水性ポリマーに接する。酵素加水分解又は一般的な化学加水分解しやすい加水分解的に不安定なイオン結合又は共有結合によって薬物が連結された、抗癌剤と可溶性ポリマーの多数のタイプの結合体が研究された。上記系は、抗癌剤をその活性な形で腫瘍組織において、又は特異的な方法で直接腫瘍細胞においても、放出することができる。水溶性の系のうち、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマーに基づいて調製されたポリマー結合体は、最も重要なものに属する。その幾つかは、連結されたターゲティング構造（抗体、ホルモン及びオリゴペプチド）によって腫瘍中に能動的に向けられる。［非特許文献５（Ｄｕｎｃａｎ １９８５）、非特許文献６（Ｒｉｈｏｖａ ２０００）、非特許文献７（Ｋｏｐｅｃｅｋ ２００１）、非特許文献８（Ｍｒｋｖａｎ ２００５）］。
【０００４】
ヒト用の医薬品における薬物担体としてのＨＰＭＡコポリマーの使用を妨げる主な欠点の一つは、その切断できない炭素鎖であり、分子量のポリマー担体の調製に利用可能な関連する分子量制限が４００００〜５００００よりも低い（生物体の腎閾値未満の）分子量であることである。高分子量ポリマーは、生物体から効果的かつ十分に排出されず、したがって薬物としてのその使用は生物体内でのその蓄積を招く。明白なＥＰＲ効果、すなわち固形腫瘍における蓄積が多い場合、排除限界をはるかに超えた分子量を有する（ＨＰＭＡコポリマーを含めた）ポリマーを処理する必要がある［非特許文献９（Ｓｅｙｍｏｕｒ １９９５）、非特許文献１０（Ｎｏｇｕｃｈｉ １９９８）］。したがって、ポリマー担体の分子量は十分に高いが、そのポリマーは有効成分の放出後に、例えば糸球体ろ過によって生物体から排出することができる断片へと分解できることが重要である。最近、本発明者らは、ＨＰＭＡポリマーを使用した薬物の構造及び生物活性、並びに腎臓ろ過限界よりも高い分子量とのその関連を特許化した。これらは、抗癌剤が共有結合によってポリマーに連結した、ＨＰＭＡコポリマーに基づくグラフトポリマー担体［Ｅｔｒｙｃｈ特許ＣＺ２９８９４５Ｂ６、非特許文献１１（Ｅｔｒｙｃｈ ２００８）］及びポリマーミセル［Ｃｈｙｔｉｌ特許ＣＺ ＰＶ２００６−２０７］であった。この共有結合は酵素的に又は単に加水分解的に不安定であり、恐らくは、ポリマー鎖は、生分解性の酵素的に及び／又は還元的に切断可能なスペーサー、すなわちオリゴペプチドＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ又はジスルフィド架橋を介してグラフト構造に結合した。抗癌剤ドキソルビシン（Ｄｏｘ）を有効成分として含む系の利点は、マウスモデルにおいて確認された、同じ薬物を含む元のポリマー系と比較して高められた抗腫瘍活性であった。上記系の欠点は、比較的広い分子量分布（３から４の多分散性指数Ｉｎ）であり、したがって２０００００ｇ／ｍｏｌを超える高分子量を得る可能性が限られた十分に規定されていない系である。本発明の主題は、分子量分布が狭く（Ｉｎ約１．５〜２．５）、腫瘍における細胞増殖抑制剤の高い蓄積と細胞内分解後に生物体からポリマー担体が排出されることを特徴とする規定された生分解性骨格を有する、新しいＨＭＷポリマー薬物の構造及び合成である。その構造は、樹状中心部から発し、共有結合的に連結した薬物を含むポリマーグラフトを樹状分枝上に有する。グラフト数及びそのサイズを選択することによって、高分子量のポリマー（最高１４０００００ｇ／ｍｏｌ）を得ることができる。類似の系は以前に記述されており［Ｗａｎｇ ２０００］、記述された系、本発明の主題の系、及び以前に発表された系の主要な相違は、以前に記述された系が、簡単に分解可能なポリマー骨格を持たず、薬物が酵素分解性のＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙオリゴペプチド配列のみを介して連結している点にある。デンドリマー分枝端部の修飾のために、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）［非特許文献１２（Ｇａｊｂｈｉｙｅ ２００９）、非特許文献１３（Ｂａｉ ２００９）］がしばしば使用された。これらの系におけるＰＥＧの主要な役割は、デンドリマーの潜在的に有毒なアミノ基を妨害することであり、ここではＰＥＧは生物活性分子の担体としては働かない。前述の場合と同様に、この系は生分解性ではない。それらが生物体に蓄積するべきでない場合、その利用は、５００００ｇ／ｍｏｌまでの低分子量に限られる。
【０００５】
デンドリマーと他の、しばしば生分解性のポリマーの併用は、特許文献に記載されている。ポリ（アミノ酸）は、デンドリマー−ポリ（アミノ酸）結合体の調製に使用され［Ｌｉ特許ＷＯ０３０５５９３５］、ここで、この結合体は、デンドリマー開始剤を用いてαアミノ酸のＮ−カルボキシ無水物の重合によって調製された。この場合、ポリ（アミノ酸）グラフトは、かなりの負電荷（ポリ（グルタミン酸）及びポリ（アスパラギン酸））、正電荷（ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリリジン）を帯びるか、又は疎水性であり、したがって体液に不溶である。薬物、例えばパクリタキセルは、共有結合性エステル結合を介してこのポリマーに結合する。系表面の高電荷密度又はそのかなりの疎水性及び不溶性のために、種々の組織との望ましくない相互作用及び生物体（例えば、腎臓）内の蓄積が起こり得る。これは、例えば、負に帯電したポリ（アミノ酸）で典型的である［非特許文献１４（Ｒｙｐａｃｅｋ １９８２）］。生分解性スペーサーのない共有結合性エステル結合による薬物とポリマーの連結は、本来の活性型の薬物の放出を保証しない。ポリ（アミノ酸）グラフトを利用した系においては、ポリ（グルタミン酸）の部分的分解のみが確認され、ここでは必ずしも生物活性ではない、薬物の広範な低分子量断片及びアミノ酸誘導体の切断が起こる。かかる系の分解は、カテプシンＢを含むモデル系においてのみ文献に記述され、ｉｎ ｖｉｖｏでのその分解に関するデータは不十分である。
【０００６】
本発明による系の利点は、ＨＰＭＡコポリマーに基づく、生物体と相互作用しない不活性無電荷水溶性ポリマーによって形成されるポリマーグラフトであり、薬物はこのポリマーグラフトに対して細胞内分解性スペーサーを介して連結し、標的細胞及び組織における活性薬物の制御放出が可能である。本発明による系の別の利点は、糸球体ろ過によって生物体から排出することができる不活性水溶性ＨＰＭＡコポリマーのポリマー生成物への担体骨格の明確に証明された細胞内還元又は酵素分解である。したがって、抗癌剤を腫瘍部位に輸送した後に生物体からＨＭＷポリマー担体が排出されることが保証される。
【０００７】
文献では、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコールメタクリレート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリアクリル酸、ポリ（メタクリル酸、ポリ（２−アミノエチルメタクリレート］、ポリ［Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド］及びポリ［２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］の親水性鎖が線状又は星形のポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ−ラクチド）、ポリ（ＤＬ−ラクチド）及びポリ（グリコール酸）に連結した他の系が記載されている［Ｌｅｌｅ特許ＵＳ７０１８６５５］。著者らは、こうして調製された系がＨＭＷ系を形成し、薬物輸送に利用可能であることを示す。この系は、例えば疎水性ポリ（ε−カプロラクトン）及びＨＰＭＡベースのポリマーを含む、その構造の両親媒性のために、溶液中でミセル又はナノ粒子を形成する。次いで、これらの系中の薬物は、この系の疎水性コア上で、疎水性相互作用によって吸収され、外的条件に依存して薬物を制御放出を可能にできず、輸送の過程で薬物放出を防止することができない。さらに、この系は、ほとんどの場合、特許［Ｌｉ特許ＷＯ０３０５５９３５］に記載の系の問題に類似した問題、すなわち表面電荷及び生物体における望ましくない相互作用を抱える。
【０００８】
上記系とは対照的に、すなわち、本発明によれば、凝集の可能性なしに、水及び体液に可溶であり、生分解性スペーサーを介して連結した薬物を有し、標的細胞又は腫瘍組織における薬物の制御放出を可能にする。
【０００９】
文献では、例えば消炎薬用の、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを担体として利用する系も記述されており［Ｋｕｒｔｏｇｌｕ ２００９］、ここでは、薬物（Ｎ−アセチルシステイン）は、還元的に切断可能なジスルフィド架橋を介してデンドリマーに結合する。この系においては、ＰＡＭＡＭデンドリマーが担体として働く。したがって、ＰＡＭＡＭに起因して、腫瘍組織中への受動的ターゲティングに重要である高分子量を得ることが困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍａｅｄａ， Ｈ．， Ｊ． Ｗｕ， Ｔ． Ｓａｗａ， Ｙ． Ｍａｔｓｕｍｕｒａ， ａｎｄ Ｋ． Ｈｏｒｉ， Ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ＥＰＲ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６５：２７１−２８４ （２０００）
【非特許文献２】Ｋａｔａｏｋａ， Ｋ．； Ｈａｒａｄａ， Ａ．； Ｎａｇａｓａｋｉ， Ｙ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ４７， １１３−１３１ （２００１）
【非特許文献３】Ｂａｅ， Ｙ． Ｓ．； Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ， Ｓ．； Ｈａｒａｄａ， Ａ．； Ｋａｔａｏｋａ， Ｋ． ｐＨ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｅｌｌｅｓ： Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ＳＢＣ−３． Ｗｉｎｔｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ａｎｄ １１ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ， Ｕｔａｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ． ２００３． Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ， Ｕｔａｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【非特許文献４】Ｂｒｏｎｉｃｈ， Ｔ． Ｋ．； Ｎｅｈｌｓ， Ａ．； Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ａ．； Ｋａｂａｎｏｖ， Ｖ． Ａ．； Ｋａｂａｎｏｖ， Ａ． Ｖ． Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ． Ｂ １６， ２４３−２５１ （１９９９）
【非特許文献５】Ｄｕｎｃａｎ， Ｒ．， Ｌｌｏｙｄ， Ｊ．Ｂ．， Ｊ． Ｋｏｐｅｃｅｋ， Ｐ． Ｒｅｊｍａｎｏｖａ， Ｊ． Ｓｔｒｏｈａｌｍ， Ｋ． Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｂ． Ｒｉｈｏｖａ， Ｖ． Ｃｈｙｔｒｙ： Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ （１９８５）． Ｐａｔｅｎｔ ＣＺ ００９５／８５， Ａｕｓｔｒａｌｉａ ５８９５８７， Ｃａｎａｄａ １３００５３， Ｄｅｎｍａｒｋ １６４４８５， Ｅｕｒｏｐｅ ０１８７５４７， ＵＳ ５，０３７，８８３， Ｊａｐａｎ ０００１３７／８６
【非特許文献６】Ｂ． Ｒｉｈｏｖａ， Ｍ． Ｊｅｌｉｎｋｏｖａ， Ｊ． Ｓｔｒｏｈａｌｍ， Ｖ． Ｓｕｂｒ， Ｄ． Ｐｌｏｃｏｖａ， Ｏ． Ｈｏｖｏｒｋａ， Ｍ． Ｎｏｖａｋ， Ｄ． Ｐｌｕｎｄｒｏｖａ， Ｙ． Ｇｅｒｍａｎｏ， Ｋ． Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＩＩ． Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｒ （Ｆａｂ’）２−ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ． Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ． ６４， ２４１−２６１ （２０００）
【非特許文献７】Ｋｏｐｅｃｅｋ， Ｊ．， Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ， Ｐ．， Ｍｉｎｋｏ， Ｔ．， Ｌｕ， Ｚ．Ｒ．， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｃ．Ｍ．； ”Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”． Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ７４， １６５−１７３ （２００１）．
【非特許文献８】Ｔ． Ｍｒｋｖａｎ， Ｍ． Ｓｉｒｏｖａ， Ｔ． Ｅｔｒｙｃｈ， Ｐ． Ｃｈｙｔｉｌ， Ｊ． Ｓｔｒｏｈａｌｍ， Ｄ． Ｐｌｏｃｏｖａ， Ｋ． Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｂ． Ｒｉｈｏｖａ， Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＨＰＭＡ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｐＨ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｉｍｕｎｉｔｙ， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１０， １１９−１２９ （２００５）
【非特許文献９】Ｌ．Ｗ． Ｓｅｙｍｏｕｒ， Ｙ． Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｈ． Ｍａｅｄａ， Ｍ． Ｂｒｅｒｅｔｏｎ， Ｊ． Ｓｔｒｏｈａｌｍ， Ｋ． Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｒ． Ｄｕｎｃａｎ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ａ ３１， ７６６ − ７７０ （１９９５）
【非特許文献１０】Ｙ． Ｎｏｇｕｃｈｉ， Ｊ． Ｗｕ， Ｒ． Ｄｕｎｃａｎ， Ｊ． Ｓｔｒｏｈａｌｍ， Ｋ． Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｔ． Ａｋａｉｋｅ， Ｈ． Ｍａｅｄａ， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８９， ３０７−３１４ （１９９８）
【非特許文献１１】Ｅｔｒｙｃｈ Ｔ．， Ｃｈｙｔｉｌ Ｐ．， Ｍｒｋｖａｎ Ｔ．， Ｓｉｒｏｖａ Ｍ．， Ｒｉｈｏｖａ Ｂ．， Ｕｌｂｒｉｃｈ Ｋ．， Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｗｉｔｈ ｇｒａｆｔ ＨＰＭＡ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ｐａｓｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３２， １８４−１９２ （２００８）
【非特許文献１２】Ｇａｊｂｈｉｙｅ Ｖ．， Ｋｕｍａｒ Ｐ．， Ｔｅｋａｄｅ Ｒ．， Ｊａｉｎ Ｎ．， ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ＰＰＩ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｈ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４４， １１５５−１１６６ （２００９）
【非特許文献１３】Ｂａｉ Ｓ．， Ａｈｓａｎ Ｆ．， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｈｅｐａｒｉｎ， ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２６， ５３９−５４８ （２００９）
【非特許文献１４】Ｆ． Ｒｙｐａｃｅｋ， Ｊ． Ｄｒｏｂｎｉｋ， Ｖ． Ｃｈｍｅｌａｒ， Ｊ． Ｋａｌａｌ， Ｔｈｅ ｒｅｎａｌ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ？？ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ − ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｆｆｅｃｔ， Ｐｆｌｕｇ． Ａｒｃｈ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｇｙ． ３９２， ２１１−２１７ （１９８２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の開示
本発明の目的は、狭い分子量分布、系の明確に定義された構造、生分解性骨格、及び単純化された合成によって、既報の系とは異なる、樹状構造を有する新しいＨＭＷポリマー薬物担体及びその薬物結合体の構造及び合成である。上記ポリマー薬物は、腫瘍中の細胞増殖抑制剤の蓄積の増加、並びに細胞内分解、並びに薬物放出及び担体のその役割の遂行後に生物体から排出されるポリマー担体の付随する能力を特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によるＨＭＷ生分解性ポリマー担体の目的は、それが、中心Ｇ０世代からＧ６世代までの樹状ポリ（アミドアミン）及び２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン構造からなっており、そのアミノ基又はヒドロキシ基にセミテレケリックＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）が生分解性スペーサーを用いてポリマー鎖末端を介して連結していることにある。
【００１３】
生きている生物体の主に組織又は標的細胞において分解することができる生分解性スペーサーとしては、還元的に切断可能なジスルフィド結合又は酵素的に切断可能なオリゴペプチド配列が使用される。中心樹状構造及びセミテレケリックグラフトの分子量は、分解後、担体成分すべてが糸球体ろ過によって生物体から排出できるように、生物体の排出限界（ＨＭＰＡコポリマーの場合約５００００ｇ／ｍｏｌ）未満で選択される。デンドリマーとＨＰＭＡコポリマーを連結する酵素分解性オリゴペプチド配列は、好ましくはＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ及びＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ配列を含む。
【００１４】
生分解性スペーサーは、３つの方法によって、すなわち、分解性スペーサーを含むセミテレケリックポリマーを使用したデンドリマー分枝末端のアミノ基若しくはヒドロキシ基の反応によって、生分解性スペーサーを含む構造で末端基が修飾されたデンドリマーとセミテレケリックポリマーの反応によって、又は活性化デンドリマーチオール基とセミテレケリックポリマーのチオール末端基の反応によって還元的に切断可能なジスルフィド結合を結合体構造中に導入することによって、担体構造に導入することができる。
【００１５】
本発明の一態様は、さらに、セミテレケリックＨＰＭＡコポリマーがアミノ基上にグラフトされたポリ（アミドアミン）樹状構造をその中心部に有するポリマー担体であって、このポリマーグラフトは、アミド結合及び生分解性スペーサーを介してポリマー鎖末端経由でデンドリマーに連結している、ポリマー担体である。このポリマー担体は、模式的構造Ｉ及びＩＩを有する。
【００１６】
【化１】
本発明の一目的は、さらに、４〜２５６個のアミノ基、ピリジルジスルファニル基又はカルボキシル基を含むポリ（アミドアミン）に基づくＧ０世代からＧ６世代までの樹状構造によってその中心部が形成されたポリマー担体であって、コアユニットは、好ましくは、システアミン、エチレンジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、ヘキサン−１，６−ジアミン又はドデカン−１，１２−ジアミンによって形成される、ポリマー担体である。
【００１７】
本発明の目的は、さらに、ポリマー担体であって、その中心部が、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸に基づく樹状構造によって形成され、それにヒドロキシ基を介してセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーが結合しており、このポリマーグラフトはエステル結合及び生分解性スペーサーを介してこのデンドリマーに連結している、ポリマー担体である。このポリマー担体は、模式的構造ＩＩＩ及びＩＶを有する。
【００１８】
【化２】
【００１９】
【化３】
本発明の更なる一態様は、樹状ポリマー担体であって、その中心部が、８〜２５６個のヒドロキシ末端基、ピリジルジスルファニル末端基又はカルボキシル末端基を含む第１世代から第６世代までの２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸に基づく樹状構造によって形成された、樹状ポリマー担体である。
【００２０】
本発明による樹状ポリマー担体の一態様は、それが、ＳＰ１のメタクリロイル化アミノ酸ヒドラジドのモノマー単位０．５〜８ｍｏｌ％を含むＨＰＭＡコポリマーによって形成された２〜２８個のグラフトを含み、ここでこのアミノアシルが、好ましくは、β−アラニル、６−アミノヘキサノイル（ＡＨ）、４−アミノベンゾイル、及び／又はオリゴペプチドヒドラジド（ｏｌｉｇｏｐｅ ｈｙｄｒａｚｉｄｅｓ）ＧｌｙＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ及びＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙから誘導される複合アシルＳＰ２の群から選択されることである。
【００２１】
本発明は、さらに、ポリマーグラフトが、ジスルフィド又は生分解性オリゴペプチドを含む生分解性結合を介して中心ポリ（アミドアミン）樹状部分に連結している、ＨＭＷポリマー担体を含む。本発明によるオリゴペプチドは、好ましくは、酵素分解性オリゴペプチドＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ及びＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙの群から選択される。
【００２２】
本発明の更なる一目的は、本発明による樹状ポリマー担体と、加水分解的に切断可能な結合を介して担体に連結している薬物とからなる、薬物とのＨＭＷポリマー結合体である。
【００２３】
本発明の一態様は、薬物が好ましくは抗癌剤であるＨＭＷポリマー結合体でもある。本発明の更なる一態様は、抗癌剤が、好ましくは、加水分解的に切断可能なヒドラゾン結合を介して担体に連結しているドキソルビシンである、樹状ポリマー結合体である。
【００２４】
本発明の更なる一態様は、本発明によるポリマー担体と、アミドで結合された薬物とからなる、本発明によるＨＭＷポリマー結合体であって、ここで、２〜２８個のＨＰＭＡコポリマーグラフトが、結合薬物、好ましくはドキソルビシンがオリゴペプチド配列の末端にアミド結合を介して連結したメタクリロイル化オリゴペプチドヒドラジドＳＰ２のモノマー単位０．５〜８ｍｏｌ％を含み、このオリゴペプチドは、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ及びＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙからなる群から選択される、ＨＭＷポリマー結合体である。
【００２５】
本発明の更なる一目的は、樹状構造から誘導されるＨＭＷ担体とドキソルビシンとの結合体であり、ここでドキソルビシン含有量は１〜２５ｗｔ．％である。本発明は、本発明による樹状構造から誘導されるＨＭＷポリマー結合体を有効成分として含む医薬組成物も含む。この組成物は、腫瘍、詳細には固形腫瘍、一部のリンパ腫タイプ及び白血病の処置における使用が意図される。
【００２６】
ポリマー結合体においては、担体は、生分解性結合、好ましくは、ｐＨに依存して加水分解的に切断可能なヒドラゾン結合又はリソソーム酵素によって切断可能なオリゴペプチドスペーサーを介して連結した薬物を有する。ポリマー結合体は、生物体の排除限界をかなり超えて、長期の血液循環時間、十分に高いＥＰＲ効果、及び固形腫瘍組織における捕捉をもたらすために十分な高分子量を得るように構築される。結合体の分子量は、合成に使用されるセミテレケリックポリマーの分子量、使用するデンドリマーの世代数、及び樹状末端基の置換によって制御することができる。かかる樹状系の分子量は、好ましくは、４００００から１４０００００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、Ｄｏｘ含有量は、ポリマー鎖と得られる樹状結合体のどちらも、１から２５ｗｔ％（ポリマー中０．３〜８ｍｏｌ％）の範囲である。
【００２７】
本発明による樹状ポリマー結合体は、主に静脈内適用（注射又は注入）が意図されるが、腫瘍又は腹腔内に適用することもできる。化学的に結合した細胞増殖抑制剤を有するポリマーは血液循環中で安定であり、オリゴペプチドスペーサー又はヒドラゾン結合は血流の生理的条件下（ｐＨ７．４）で比較的安定である。血管外遊出及び固形腫瘍における捕捉後、溶解した結合体は、ＥＰＲ効果による飲作用によって腫瘍細胞中に侵入する。外部のｐＨ７．４から細胞内の５〜６へとｐＨが低下することにより、ヒドラゾン結合が加水分解され、細胞増殖抑制剤が標的細胞中に放出され、活性化される。同様に、腫瘍細胞に侵入後、ジスルフィド結合又はオリゴペプチドスペーサーは、細胞質及び細胞リソソーム中で切断する。オリゴペプチドスペーサーを介して結合した薬物及び同時にポリマー骨格は、分解して断片になり、この断片は生物体から排出することができる。さらに、システアミンコアを有するＰＡＭＡＭ樹状構造が結合体に組み込まれると、コアは既に生分解性ジスルフィド結合を含み、腫瘍細胞中でこの系をより低分子量の分解生成物へと分解するのを可能にする。
【００２８】
文献に記載された系とは対照的に、本発明による担体は、ＨＭＷで受動的に標的化された担体のその機能を果たした後、十分可溶な生体適合性の短鎖ポリマー断片へと生物体中で分解することができる。細胞の少し酸性の還元性媒体中で、ジスルフィド結合は還元され（文献によれば、動物細胞の細胞質中のグルタチオン濃度は、１ｍｍｏｌ／ｌと５ｍｍｏｌ／ｌとの間の範囲である）、ＨＭＷ系は最初のポリマーの断片へと分解し、生物体から排出することができる。酵素的に切断可能なオリゴペプチド配列を介して樹状構造に連結したポリマー鎖を含む担体では、類似の担体分解が起こるはずである。この場合、ポリマー骨格は、リソソーム酵素の作用によって分解されるはずである。本発明によるポリマー結合体の提案された作用機序の現実性は、ポリマー担体からのドキソルビシンのモデル放出、及び動物細胞における関係を模した媒体中で試験された樹状ポリマーの分解によって、実証される。抗腫瘍活性試験を含めたこれらの試験の結果は、本特許出願の実施例に記載されている。
【００２９】
したがって、本発明の目的は、抗癌剤の生分解性ＨＭＷ担体、並びに固形腫瘍に対する明白な細胞傷害効果及び細胞分裂阻害効果を有する選択された抗癌剤、好ましくはドキソルビシンとこの担体との結合体である。
【００３０】
ポリマー担体及び薬物とのその結合体は以下のグループに分けることができる：
１型のポリマー担体は、系のコアがポリ（アミドアミン）系デンドリマーコアによって形成されており、中心部がシステアミン、エチレンジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、ヘキサン−１，６−ジアミン又はドデカン−１，１２−ジアミンによって形成されており、分子量１００００〜５００００ｇ／ｍｏｌの２〜２８個のＨＰＭＡコポリマーグラフトが還元的に切断可能なジスルフィド結合を含むスペーサーを介して連結している４〜２５６個の末端アミノ基（スキーム１１、１３及び１４の構造参照）を有することを特徴とし、コポリマーグラフトが、スキーム７〜１０に示す構造及び組成を有するセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーの群から選択されることを特徴とする。
【００３１】
２型のポリマー担体は、系のコアが２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸に基づく樹状構造によって形成されており、分子量１００００〜５００００ｇ／ｍｏｌの２〜２８個のＨＰＭＡコポリマーグラフトが還元的に切断可能なジスルフィド結合を含むスペーサーを介して連結している８〜２５６個のヒドロキシ末端基（スキーム１２〜１４の構造参照）を有することを特徴とし、ポリマーグラフトが、スキーム７〜１０に示す構造及び組成を有するセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーの群から選択されることを特徴とする。
【００３２】
３型ポリマー担体は、系のコアが１型ポリマー担体の場合と同じ樹状構造によって形成されており、セミテレケリックポリマーが生分解性オリゴペプチド配列ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙを介して連結していることを特徴とし、ポリマーグラフトがスキーム１〜６に示す構造及び組成を有するセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーの群から選択されることを特徴とする。
【００３３】
４型のポリマー担体は、系のコアが２型ポリマー担体の場合と同じデンドリマーによって形成され、セミテレケリックポリマーが生分解性オリゴペプチド配列、好ましくはＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙを介して結合していることを特徴とし、ポリマーグラフトがスキーム１〜６に示す構造及び組成を有するセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーの群から選択されることを特徴とする。
【００３４】
ポリマー結合体１〜４型の構造は、ポリマー担体の構造と同一であるが、抗癌剤は、オリゴペプチド配列（スペーサー）の末端で、純粋に加水分解的に切断可能なヒドラゾン結合又は酵素的に切断可能なアミド結合によってポリマーグラフトに結合している。ポリマー結合体の分子量は、樹状部分のサイズ、セミテレケリックポリマーの長さ、及び置換度に応じて４００００ｇ／ｍｏｌと１４０００００ｇ／ｍｏｌとの間の範囲である。
【００３５】
樹状ポリマー担体及びドキソルビシンとのその結合体の構造
本発明によるポリマー担体及びＤｏｘが連結したポリマー結合体の合成は、幾つかのステップで実施される。それは、モノマー（ＨＰＭＡ、Ｄｏｘがアミドとして結合したメタクリロイル化オリゴペプチド、アミノ酸のメタクリロイル化誘導体、及びヒドラジド又はＢｏｃで保護されたヒドラジド基で終結したオリゴペプチド）の合成、それに続くラジカル重合によって調製されるポリマー前駆体（中心樹状構造に結合するための反応性末端基を有し、オリゴペプチドスペーサーを介して連結した保護された若しくは無保護のヒドラジド基又は薬物成分を鎖に沿って有するための反応性末端基、セミテレケリックポリマー）の合成からなる。モノマー及びセミテレケリックポリマー前駆体の合成は、以前に詳述された［Ｅｔｒｙｃｈ特許ＣＺ２９８９４５Ｂ６、Ｅｔｒｙｃｈ ２００８］。セミテレケリックポリマーの合成は、連鎖移動剤（３−スルファニルプロパン酸）（ＳＰＡ）の存在下でラジカル重合によって、又は二官能アゾ開始剤（３，３’−アゾビス（シアノイソ吉草酸）（ＡＢＩＡ）若しくは３，３’−［４，４’−アゾビス（４−シアノ−４−メチル−１−オキソブタン−４，１−ジイル）］ビス（チアゾリジン−２−チオン）、ＡＢＩＡ−ＴＴ）を用いて開始される共重合によって、又はアゾビスイソブチロニトリル及び４−シアノ−４−チオベンゾイルスルファニルペンタン酸を用いて開始される制御されたラジカル重合（ＲＡＦＴ、可逆的連結−開裂連鎖移動）とそれに続く水素化ホウ素ナトリウム還元によって、実施された。
【００３６】
セミテレケリックコポリマーは、ＨＰＭＡ単位８５〜９９ｍｏｌ％、メタクリロイル化Ｂｏｃ保護アミノ酸ヒドラジド若しくはオリゴペプチド又はメタクリロイル化オリゴペプチドの単位１〜１５ｍｏｌ％を含み、反応鎖末端に連結薬物及び反応基を有することを特徴とする。担体及び結合体の合成においては、以下の反応基を有するセミテレケリックコポリマーを使用した：カルボキシル、カルボキシチアゾリジンチオン（ＴＴ）、第一級アミノ基、チオール及びピリジルジスルファニル（ＰＤＳ）。ポリマーの構造は、ポリマー、担体及び結合体の構造を示したスキームにおいて後述する。以下の記号を使用する：
（ｉ）メタクリロイル化アミノ酸ヒドラジドにおけるアミノ酸アシル、例えば、グリシル、βアラニル、６−アミノヘキサノイル（ＡＨ）、４−アミノベンゾイル、及び／又はオリゴペプチドＧｌｙＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ及びＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙから誘導される複合アシルに対してはＳＰ１、
（ｉｉ）好ましくは生分解性オリゴペプチド配列ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ及びＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ）を含む、酵素分解性オリゴペプチド配列から誘導されるメタクリロイル化アミノ酸アミド中の複合アシルに対してはＳＰ２、
（ｉｉｉ）メタクリロイルに対してはＭＡ、
（ｉｖ）２−アミノエチルに対してはＡＥ、
（ｖ）スルファニルプロパノイルに対してはＳＰ。
【００３７】
コポリマーのリスト
ポリマー１
ヒドラジド基がＢｏｃで保護されている（−ＣＯＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）、メタクリロイル化アミノ酸ヒドラジド又はオリゴペプチドヒドラジドとＨＭＰＡとのコポリマーであって、このコポリマーは、反応性Ｎ−スクシンイミジルエステル又はカルボキシル末端鎖基を含む（ポリマー１ａ）。このコポリマーは、連鎖移動剤（スルファニルプロパン酸、ＳＰＡ）の存在下で共重合によって調製された。第２ステップにおいては、ＳＰＡ（−ＣＯＯＨ）鎖末端基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣ反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換された。
【００３８】
【化４】
Ｂｏｃで保護されたヒドラジド基で終結された、メタクリロイル化アミノ酸又はオリゴペプチドとのＨＰＭＡコポリマーであって、このコポリマーは、反応性カルボニルチアゾリジン−２−チオン鎖末端基（ポリマー１ｂ）又はＮ−スクシンイミジルエステル鎖末端基（ポリマー１ｃ）を含む。
【００３９】
【化５】
Ｂｏｃ保護ヒドラジド基及び生分解性オリゴペプチド（例えば、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ、一般にＳＰ２）の鎖末端Ｎ−スクシンイミジルエステル基で終結された、メタクリロイル化アミノ酸又はオリゴペプチドとのＨＰＭＡコポリマー（ポリマー１ｄ）は、２ステップ合成によって調製された。第１ステップにおいては、ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕコポリマーのＮ−スクシンイミジルエステルは、オリゴペプチドＧＦＬＧのアミノ基と反応した。第２ステップにおいては、調製されたコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＣＯＯＨのカルボキシル鎖末端基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣ反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換された。
【００４０】
【化６】
アミド基に薬物が結合されたメタクリロイル化オリゴペプチドとＨＰＭＡとのコポリマーは、連鎖移動剤としてＳＰＡの存在下で実施されたＨＰＭＡのラジカル重合によって調製された。このコポリマーは、カルボキシル基又はＮ−スクシンイミジルエステルで終結する（ポリマー１ｅ）。このコポリマーは、連鎖移動剤ＳＰＡの存在下で共重合によって調製された。第２ステップにおいては、カルボキシル末端基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣ反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換された。
【００４１】
【化７】
カルボニルチアゾリジン−２−チオン末端基で終結された、アミド結合で結合された薬物を有するメタクリロイル化オリゴペプチドとＨＰＭＡのコポリマー（ポリマー１ｆ）は、ＡＢＩＡ−ＴＴを用いて開始される対応するモノマーのラジカル重合によって調製された。Ｎ−スクシンイミジルエステル基で終結されたコポリマーは、ＡＢＩＡ−ＴＴを用いて開始され、続いてカルボキシル鎖末端基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性化する類似の方法で調製された（ポリマー１ｇ）。
【００４２】
【化８】
生分解性オリゴペプチド（例えば、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ）（一般にＳＰ２）の鎖末端Ｎ−スクシンイミジルエステルを有する、アミドで結合された薬物を有するメタクリロイル化オリゴペプチドとＨＰＭＡとのコポリマー（ポリマー１ｈ）は、２ステップ合成によって調製された。第１ステップにおいては、コポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＳＰ２−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＯＳｕのスクシンイミジルエステルは、このオリゴペプチドのアミノ基と反応した。第２ステップにおいては、調製されたコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＳＰ２−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＣＯＯＨのカルボキシル鎖末端基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣ反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換された。
【００４３】
【化９】
ポリマー２
チオールで終結された主鎖を有する、ＨＰＭＡとメタクリロイル化アミノ酸又はヒドラジド基がＢｏｃで保護されたオリゴペプチドヒドラジドとの基本コポリマーは、ＨＰＭＡと関連コモノマーのＲＡＦＴ共重合とそれに続く水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元によって調製された（ポリマー２ｚ）。
【００４４】
【化１０】
チオール基で終結された主鎖を有する、ＨＰＭＡとメタクリロイル化アミノ酸又はヒドラジドがＮ−Ｂｏｃで保護されたオリゴペプチドヒドラジドとのＨＰＭＡコポリマーは、ポリマー１ａのスクシンイミジルエステルと２−（２−ピリジルジスルファニル）エチルアミン（ＰＤＥＡ）の反応とそれに続くジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いた還元によって調製された（ポリマー２ａ）。
【００４５】
【化１１】
チオール基で終結された主鎖を有する、ＨＰＭＡとメタクリロイル化アミノ酸又はヒドラジド基がＢｏｃで保護されたオリゴペプチドヒドラジドとのコポリマーは、ポリマー１ｂ及び１ｃの活性化鎖末端カルボキシル基とＰＤＥＡの反応とそれに続くＤＴＴを用いた還元によって調製された（ポリマー２ｂ）。
【００４６】
【化１２】
チオール基で終結された主鎖を有し、アミドで結合された薬物を有する、ＨＰＭＡとメタクリロイル化オリゴペプチドとのコポリマーは、ポリマー１ｅのスクシンイミジルエステル鎖末端基とＰＤＥＡとの反応とそれに続くＤＴＴを用いた還元によって調製された（ポリマー２ｃ）。
【００４７】
【化１３】
チオール基で終結された主鎖を有する、アミドで結合された薬物を有するＨＰＭＡとメタクリロイル化オリゴペプチドのコポリマーは、ポリマー１ｆ及びポリマー１ｇの活性化カルボキシル鎖末端基とＰＤＥＡの反応とそれに続くＤＴＴを用いた還元によって調製された（ポリマー２ｄ）。
【００４８】
【化１４】
デンドリマー
ゼロから第６世代の樹状構造をポリマー結合体における中心部として使用した。好ましくは、システアミン、エチレンジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、ヘキサン−１，６−ジアミン又はドデカン−１，１２−ジアミンコアユニットを有し、第一級アミノ基を末端基として有する、ＰＡＭＡＭデンドリマー（スキーム１１）
【００４９】
【化１５】
又は
ヒドロキシ末端基を有する２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸（ＢＰＡ）に基づくデンドリマーを使用した（スキーム１２）。
【００５０】
【化１６】
一部の生分解性ポリマー担体及び結合体の合成においては、ＰＡＭＡＭ又はＢＰＡデンドリマーのアミノ基又はヒドロキシ基は、セミテレケリックポリマーとの反応前に末端ピリジルジスルファニル（ＰＤＳ）基に転換された（スキーム１３）。アミノ基含有デンドリマーにおいては、アミノ基は、リソソーム酵素を用いて切断可能なオリゴペプチドＳＰ２で修飾された（スキーム１４）。ピリジルジスルファニル基は、アミノ基とＮ−スクシンイミジル［３−（２−ピリジルジスルファニル）］プロパノエート（ＳＰＤＰ）のスクシンイミジル基との反応によって、又はＤＣＣ法を使用してヒドロキシ基と３−（２−ピリジルジスルファニル）］プロピオン酸との反応によって、導入された。このオリゴペプチドは、ＤＣＣ法を使用して、デンドリマーのアミノ基又はヒドロキシ基とＦｍｏｃで保護されたオリゴペプチドとの反応によって導入された。
【００５１】
【化１７】
【００５２】
【化１８】
【００５３】
以下、ポリマー担体は、薬物が連結していない、樹状構造を含むＨＭＷポリマーである。したがって、ポリマー結合体は、薬物が連結したポリマー担体である。薬物、好ましくはドキソルビシンは、Ｂｏｃ保護基を除去後、ヒドラゾン結合を介して担体に連結する。担体へのＤｏｘの連結は、メタノール中で酢酸の存在下で実施される。アミドで結合されたドキソルビシンの場合、ポリマー結合体は、Ｄｏｘを有するセミテレケリックコポリマーと対応するデンドリマーとの反応によって調製される。
【００５４】
結合体構造、及びポリマー構造の分解機序に起因して、本発明によるポリマー結合体は、４つの基本グループに分けられる。
【００５５】
結合体１
結合体１は、薬物を有するポリマー鎖が還元分解性ジスルフィド結合を介して連結した中心ＰＡＭＡＭ樹状構造からなる。この薬物は、ポリマー鎖にヒドラゾン又はアミド結合によって連結する（スキーム１５参照）。
【００５６】
【化１９】
【００５７】
結合体２
結合体２は、薬物を有するポリマー鎖が還元分解性ジスルフィド結合を介して結合した中心ＢＰＡ樹状構造からなる。この薬物は、ポリマー鎖にヒドラゾン又はアミド結合によって連結する（スキーム１６参照）。
【００５８】
【化２０】
【００５９】
結合体３
結合体３は、薬物を有するポリマー鎖が酵素分解性オリゴペプチドを介して結合した中心ＰＡＭＡＭ樹状構造からなる。この薬物は、ポリマー鎖にヒドラゾン又はアミド結合によって連結する（スキーム１７参照）
【００６０】
【化２１】
【００６１】
結合体４
結合体４は、薬物を有するポリマー鎖が酵素分解性オリゴペプチドを介して結合した中心ＢＰＡ樹状構造からなる。この薬物は、ポリマー鎖にヒドラゾン又はアミド結合によって連結する（スキーム１８参照）。
【００６２】
【化２２】
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、（細胞内媒体を模した）ｐＨ５の緩衝液中でインキュベートされたｐＨ５における樹状ポリマー結合体１及び２並びに線状ポリマー結合体３（Ｄｏｘはヒドラゾン結合を介して結合している）から放出されたＤｏｘの時間依存を示す。
【図２】図２は、（血流を模した）ｐＨ７．４の緩衝液中でインキュベートされたｐＨ７．４における樹状ポリマー結合体１及び２並びに線状ポリマー結合体３（Ｄｏｘはヒドラゾン結合を介して結合している）から放出されたＤｏｘの時間依存を示す。
【図３】図３は、グルタチオン（ｃ＝３．１０−３ｍｏｌ／ｌ）を含むリン酸緩衝液中でインキュベートされたポリマー結合体１の分子量の時間依存を示す。
【図４】図４は、カテプシンＢ（ｃ＝５．１０−７ｍｏｌ／ｌ）を含むリン酸緩衝液中でインキュベーション中のポリマー結合体３の分子量の時間依存を示す。
【図５】図５は、ヒドラゾンで結合されたドキソルビシンを有するＫ−１ ＨＹＤ、アミド結合で結合されたドキソルビシンを有するＫ−１ ＡＭ、並びに線状ポリマー結合体ＬＩＮ ＨＹＤ及びＬＩＮ ＡＭの投与後の腫瘍増殖を示す。
【図６】図６は、ヒドラゾン結合で結合されたドキソルビシンを有するＫ−１ ＨＹＤ、アミド結合で結合されたドキソルビシンを有するＫ−１ ＡＭ、並びに線状ポリマー結合体ＬＩＮ ＨＹＤ及びＬＩＮ ＡＭの投与後のＥＬ４腫瘍を有するマウスの生存を示す。
【図７】図７は、ポリマー結合体を用いて治癒され（図５及び６参照）、致死量の最初の腫瘍細胞（マウスＴ細胞リンパ腫ＥＬ４、１×１０５細胞）が再移植されたマウスの生存を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
発明を実施する例
結合体の合成及び諸性質の例
中間体及びドキソルビシン−ポリマー結合体の合成例
【実施例１】
【００６５】
（連鎖移動剤ＳＰＡを使用した）セミテレケリックポリマー前駆体の合成
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕ（ポリマー１ａ）
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕを、アセトン中で５０℃で開始剤２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）及び連鎖移動剤ＳＰＡの存在下でＨＰＭＡとＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃとの沈殿ラジカル共重合によって調製した。ある場合には、第２ステップにおいて、既報（Ｅｔｒｙｃｈ、ＣＺ特許２９８９４５Ｂ６）のように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣとの反応によってカルボキシ末端基をＮ−スクシンイミジルエステルに転換した。
【実施例２】
【００６６】
セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＴＴ（ポリマー１ｂ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＴＴを、ＤＭＳＯ中で６０℃でＡＢＩＡ−ＴＴを用いて開始された（Ｅｔｒｙｃｈ、ＣＺ特許２９８９４５Ｂ６）ＨＰＭＡとＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃとの溶液ラジカル共重合によって調製した。
【実施例３】
【００６７】
セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＯＳｕ（ポリマー１ｃ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕを、エタノール中５０℃における開始剤ＡＢＩＡの存在下でのＨＰＭＡとＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃとの溶液ラジカル共重合とそれに続くＮ−スクシンイミジルエステルへの転換によるカルボキシ鎖末端基の活性化（Ｅｔｒｙｃｈ、ＣＺ特許２９８９４５Ｂ６）によって調製した。
【実施例４】
【００６８】
セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕ（ポリマー１ｄ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕを２ステップ合成によって調製した。第１ステップにおいては、コポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＯＳｕのＮ−スクシンイミジルエステルは、オリゴペプチドＧＦＬＧのアミノ基と反応した。ある場合には、調製されたコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＣＯＯＨのカルボキシ末端基を、第２ステップにおいて、既報（Ｅｔｒｙｃｈ、ＣＺ特許２９８９４５Ｂ６）のように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣとの反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換した。
【実施例５】
【００６９】
（ＳＰＡによる連鎖移動を含む）セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＯＳｕ（ポリマー１ｅ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＯＳｕを、アセトン中で５０℃で開始剤ＡＩＢＮ及び連鎖移動剤ＳＰＡの存在下でＨＰＭＡとＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘとの沈殿ラジカル共重合によって調製した。カルボキシ鎖末端基を、第２ステップにおいて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣとの反応によってＮ−スクシンイミジルエステル基に転換した。［Ｕｌｂｒｉｃｈ ２０００］。
【実施例６】
【００７０】
セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＴＴ（ポリマー１ｆ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＴＴを、ＤＭＳＯ中で６０℃でＡＢＩＡ−ＴＴを用いて開始されたＨＰＭＡとＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘの溶液ラジカル共重合によって調製した。
【００７１】
２２０ｍｇ（１．５４ｍｍｏｌ）ＨＰＭＡ、２５ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＤｏｘをＤＭＳＯ１．７ｍｌに溶解させ、その溶液を重合アンプルに移した。重合アンプル中、ＡＢＩＡ−ＴＴ８４ｍｇ（０．１７０ｍｍｏｌ）（４ｗｔ％）であった。窒素をアンプル中の溶液を通して１５分間バブリングさせ、アンプルを密封し、サーモスタット中に６０℃で置いた。開始剤は６０℃で３分後に溶解した。６時間後、反応混合物が５０ｍｌのアセトン−ジエチルエーテル２：１中に沈殿した。コポリマーをメタノール３ｍｌに溶解させ、同じ混合溶媒５０ｍｌ中に再度沈殿させた。沈殿したコポリマーをろ別し、恒量まで乾燥させた。
【実施例７】
【００７２】
セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕ（ポリマー１ｈ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕを、ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕの調製（実施例４）において記述した２ステップ合成によって調製した。第１ステップにおいては、コポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＯＳｕのＮ−スクシンイミジルエステルは、オリゴペプチドＧＦＬＧのアミノ基と反応した。コポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＯＳｕのカルボキシ末端とオリゴペプチドＧＦＬＧのアミノ基。第２ステップにおいては、調製したコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＣＯＯＨのカルボキシル鎖末端基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣとの反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換した。
【実施例８】
【００７３】
セミテレケリックポリマー前駆体−ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＡＥ−ＳＨ（ポリマー２ａ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＡＥ−ＳＨを、ＤＭＳＯ中でのコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕと二官能性試薬２−（２−ピリジルジスルファニル）エチルアミン（ＰＤＥＡ）のポリマー類似反応とそれに続く０．５Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いた還元によって調製した。
【００７４】
ＰＤＥＡ．ＨＣｌ ８ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ ０．５ｍｌに溶解させ、激しく撹拌しながらエチル（ジイソプロピル）アミン６μｌ（０．０３６ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、ＤＭＳＯ ４ｍｌ中のポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕ ３００ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌ ＴＴ基）の溶液を室温で激しく撹拌しながら添加した。２時間後、反応混合物をメタノールで１５ｍｌに希釈し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０充填カラムでのゲルクロマトグラフィー（メタノール、ＲＩ検出）によって低分子量不純物を除去することによってコポリマーを精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって６ｍｌに濃縮し、このコポリマーを８０ｍｌのアセトン−ジエチルエーテル３：１中に沈殿させて単離した。次のステップにおいては、ＰＤＳ基を有するポリマー３００ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝液５ｍｌに溶解させ、蒸留水０．４ｍｌ中のＤＴＴ １８．５ｍｇの溶液を添加した。１時間後、水溶液中でのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５充填カラムでのゲルろ過によって低分子量不純物を除去することによってこのポリマーを精製した。このポリマーを凍結乾燥によって単離し、アルゴン下で−１８℃で貯蔵した。
【実施例９】
【００７５】
セミテレケリックポリマー前駆体−ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＡＥ−ＳＨ（ポリマー２ｂ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＡＥ−ＳＨを、実施例８に記載の手順によって、ＤＭＳＯ中でのコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＯＳｕ又はポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＴＴと二官能性試薬ＰＤＥＡとのポリマー類似反応とそれに続く０．５Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のＤＴＴを用いた還元によって調製した。
【実施例１０】
【００７６】
セミテレケリックポリマー前駆体−ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＡＥ−ＳＨ（ポリマー２ｃ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＡＥ−ＳＰＫ−ＳＨを、実施例８に記載の手順によって、ＤＭＳＯ中でのコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＯＳｕと二官能性試薬ＰＤＥＡのポリマー類似反応とそれに続く０．５Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のＤＴＴを用いた還元によって調製した。
【実施例１１】
【００７７】
セミテレケリックポリマー前駆体−ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＡＥ−ＳＨ（ポリマー２ｄ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＡＥ−ＳＨを、実施例８に記載の手順によって、ＤＭＳＯ中でのコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＯＳｕ又はポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＴＴと二官能性試薬ＰＤＥＡのポリマー類似反応とそれに続く０．５Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のＤＴＴを用いた還元によって調製した。
【実施例１２】
【００７８】
ＰＤＳ基を有するデンドリマーの合成
ピリジルジスルファニル基を含むＰＡＭＡＭ又はＢＰＡデンドリマー（デンドリマー−ＰＤＳ）を、デンドリマーのアミノ基又はヒドロキシ基と、Ｎ−スクシンイミジル［３−（２−ピリジルジスルファニル）］プロパノエート（ＳＰＤＰ）のスクシンイミジル基、又はＤＣＣ法を使用して３−（２−ピリジルジスルファニル）プロパン酸のカルボキシル基との反応によって調製した。第二世代ＰＡＭＡＭデンドリマー５ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌアミノ基）をメタノール０．５ｍｌに溶解させ、メタノール０．５ｍｌ中のＳＰＤＰ ２３ｍｇ（０．０７１ｍｍｏｌ）の溶液を一定撹拌下で添加した。２時間後、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０充填カラムでのゲルクロマトグラフィー（ＲＩ検出）によって低分子量不純物を除去することによって修飾デンドリマーを精製した。デンドリマーを含む画分を回転式減圧エバポレータで１ｍｌに濃縮し、このデンドリマーを凍結乾燥によってメタノール−水 １：３混合物から単離した。
【実施例１３】
【００７９】
オリゴペプチドが連結したデンドリマーの合成
アミノ末端基を含むオリゴペプチドが連結したＰＡＭＡＭ又はＢＰＡデンドリマー（デンドリマー−ＳＰ２）を、縮合試薬ＤＣＣの存在下でデンドリマーのアミノ基又はヒドロキシ基とＮ−Ｆｍｏｃで保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基との反応によって調製した。
【００８０】
Ｎ−Ｆｍｏｃで保護されたオリゴペプチドＧＦＬＧ ４０ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ０．９ｍｌに溶解させ、−１８℃に冷却後、ＤＭＦ ０．１ｍｌ中のＤＣＣ １３．５ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。３０分後、ＤＭＦ０．５ｍｌ中の第２世代デンドリマーＢＰＡ １０ｍｇ（０．０５２ｍｍｏｌヒドロキシ基）の溶液を冷却した反応混合物に添加した。混合物を４℃で９０分間及び室温で更に２時間撹拌した。次いで、反応混合物をメタノールで５ｍｌに希釈し、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０充填カラムでのゲルクロマトグラフィー（ＲＩ検出）によって低分子量不純物を除去することによって修飾デンドリマーを精製した。デンドリマーを含む画分を回転式減圧エバポレータによって１ｍｌに濃縮し、デンドリマーをジエチルエーテル中に沈殿させて単離した。Ｆｍｏｃで保護されたアミノ基をＤＭＦ中の２５％ピペリジン溶液で脱保護して、修飾デンドリマー上の遊離アミノ基を得た。
【実施例１４】
【００８１】
ポリマー結合体１及び２の合成
薬物がオリゴペプチド配列末端にアミド結合によって結合したポリマー結合体１又は２を、修飾ＰＡＭＡＭ又はＢＰＡデンドリマーのＰＤＳ基とポリマー２ｃ又は２ｄのチオール基との反応によって調製した。
【００８２】
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＡＥ−ＳＨ １５０ｍｇ（０．０１０ｍｍｏｌ ＳＨ基）を０．１Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む０．５Ｍリン酸緩衝液３ｍｌ（ｐＨ７．４）に溶解させ、その溶液をメタノール１ｍｌ中のデンドリマー−ＰＤＳ（０．０１３ｍｍｏｌ ＰＤＳ基）の撹拌溶液に実験室温度で添加されたメタノール１ｍｌ中のデンドリマー−ＰＤＳ ６．５ｍｇ（０．０１３ｍｍｏｌ ＰＤＳ基）の撹拌溶液に添加した。室温で４時間反応後、その溶液をメタノール１０ｍｌに希釈し、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０でのゲルクロマトグラフィーによって低分子量不純物を除去することによってポリマー結合体を精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって２ｍｌに濃縮し、コポリマーを酢酸エチル３０ｍｌ中に沈殿させて単離した。生成物を恒量まで乾燥させた。
【００８３】
ヒドラゾンで結合された薬物を有するポリマー結合体１又は２を、デンドリマー−ＰＤＳのＰＤＳ基とポリマー２ａ又は２ｂのＳＨ基との反応とそれに続くトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用したヒドラジド基の脱保護及びメタノール中で酢酸触媒下でのＤｏｘ結合によって調製した。
【００８４】
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＡＥ−ＳＨ ２００ｍｇ（０．０１４ｍｍｏｌ ＳＨ基）を０．５Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４）４ｍｌに溶解させ、その溶液を室温でメタノール１．５ｍｌ中のデンドリマー−ＰＤＳ ８．５ｍｇ（ＰＤＳ基０．０１７ｍｍｏｌ）撹拌溶液に添加した。室温で４時間反応後、溶液をメタノールで１３ｍｌに希釈し、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムでのゲルクロマトグラフィーによって低分子量不純物を除去することによってポリマー担体を精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって２ｍｌに濃縮し、コポリマーを酢酸エチル３０ｍｌ中に沈殿させて単離した。生成物を恒量まで乾燥させた。Ｂｏｃで保護されたポリマー担体の脱保護においては、この担体１９０ｍｇをＴＦＡ−トリイソプロピルシラン−水９５：２．５：２５混合物５ｍｌに溶解させた。１５分後、この混合物を小さい結晶が沈殿するまで水ポンプ減圧下でメタノール（５倍過剰）と一緒にエバポレータによって繰り返し蒸発させた。生成物を水に溶解させ、その溶液のｐＨをｐＨ７〜８に調節した。蒸留水中でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムでのゲルクロマトグラフィー（ＲＩ検出）によって低分子量不純物を除去することによってポリマー担体を精製した。このポリマーをＬｙｏｖａｃ ＧＴ−２装置中で凍結乾燥によってポリマー画分から単離した。Ｄｏｘを結合させるために、ポリマー担体１８０ｍｇをメタノール２ｍｌに溶解させ、溶液をサーモスタットセルに移した。サーモスタットセル中、Ｄｏｘ．ＨＣｌ２０ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）であった。得られた不均一懸濁液を暗所で２５℃で撹拌し、１分後、酢酸１００μｌを添加した。反応中、懸濁液は順次溶解し、２３時間の反応後、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムでのゲルクロマトグラフィーによって低分子量不純物及び遊離薬物を除去することによってポリマー生成物を精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって３ｍｌに濃縮した。ポリマー結合体を酢酸エチル３０ｍｌに沈殿させて単離した。生成物を恒量まで乾燥させた。
【実施例１５】
【００８５】
ポリマー結合体３及び４の合成
オリゴペプチドによってアミド基を介して結合した薬物を含むポリマー結合体３又は４を、アミノ修飾ＰＡＭＡＭ若しくはＢＰＡデンドリマー−ＧＦＬＧ−ＮＨ２とポリマー１ｅ、１ｆ若しくは１ｇのＴＴ基若しくはＯＳｕ基との反応によって、又はポリマー１ｈ（ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕ）のスクシンイミジル基若しくはカルボキシル基とこのデンドリマーのアミノ基若しくはヒドロキシ基との反応によって調製した。
【００８６】
ポリマー１ｆ １００ｍｇ（０．００６ｍｍｏｌ ＯＳｕ基）をＤＭＳＯ ２ｍｌに溶解させ、その溶液をメタノール１ｍｌ中のデンドリマー１．９ｍｇ（０．００９ｍｍｏｌ ＧＦＬＧ−ＮＨ２基）撹拌溶液に実験室温度で添加した。実験室温度で２時間反応後、その溶液をメタノールで８ｍｌに希釈し、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムでのゲルクロマトグラフィーによって低分子量不純物を除去することによってポリマー結合体を精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって２ｍｌに濃縮し、コポリマー結合体を酢酸エチル３０ｍｌ中に沈殿させて単離した。生成物を恒量まで乾燥させた。
【００８７】
ヒドラゾンで結合された薬物を有するポリマー結合体３又は４を、修飾ＰＡＭＡＭ若しくはＢＰＡデンドリマー−ＧＦＬＧ−ＮＨ２のアミノ基とポリマー１ａ、１ｂ若しくは１ｃのＴＴ基若しくはＯＳｕ基との反応によって、又はポリマー１ｄポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕのスクシンイミジル基若しくはある場合にはカルボキシル基とデンドリマーのアミノ基若しくはヒドロキシ基との反応とそれに続くトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用したヒドラジド基の脱保護及びメタノール中で酢酸触媒下でのＤｏｘの連結によって調製した。
【００８８】
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＧＦＬＧ−ＯＳｕ １２０ｍｇ（０．００８ｍｍｏｌ ＯＳｕ基）をＤＭＳＯ ２ｍｌに溶解させ、その溶液をメタノール１ｍｌ中のデンドリマー２．２ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ ＮＨ２基）撹拌溶液に実験室温度で添加した。実験室温度で２時間反応後、この溶液をメタノールで９ｍｌに希釈し、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムでのゲルクロマトグラフィーによって低分子量不純物を除去することによってポリマー担体を精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって２ｍｌに濃縮し、コポリマー担体を酢酸エチル３０ｍｌ中に沈殿させて単離した。生成物を恒量まで乾燥させた。
【００８９】
Ｂｏｃ保護基の除去及びヒドラゾン結合による薬物の連結を実施例１４に記載の手順によって実施した。
【実施例１６】
【００９０】
ポリマー結合体からのドキソルビシンの放出
ポリマー結合体から放出されたドキソルビシンの量を、細胞内媒体を模したｐＨ５．０の０．１Ｍリン酸緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＣｌ）中及び血流媒体を模したｐＨ７．４のリン酸緩衝液中でのそれらのインキュベーション後に測定した。インキュベーション溶液中の放出されたＤｏｘをＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）によって決定した。所定時間間隔で溶液試料５０μｌを抜き取り、ＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ｘｌカラムによってｐＨ６．５のメタノール−アセテート（８０：２０ｖｏｌ％）緩衝液からなる移動相のイソクラチック流量０．５ｍｌ／ｍｉｎで分析した。Ｄｏｘ量を遊離及び結合のＤｏｘのピーク面積から計算した（４８８ｎｍにおけるＵＶ−ＶＩＳ検出）。３７℃の生理的媒体（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中の（濃度５ｍｇ／ｍｌの）結合体溶液のインキュベーション後は、わずかに少量の薬物しか放出されない（最高７％／２４時間、図２）。それに対して、ｐＨ５．０における弱酸性の媒体中のポリマー結合体からのＤｏｘ放出速度、したがって細胞毒の活性化速度はかなり大きい（図１）。ｐＨ７．４及びｐＨ５におけるグラフトポリマー結合体からの放出速度は、線状コポリマー又はグラフトコポリマーから調製されたヒドラゾン結合体で見られる放出速度［Ｅｔｒｙｃｈ ２００８］に十分匹敵する。
【実施例１７】
【００９１】
グルタチオンを使用した、生物体から排出することができる分解生成物への、アミド結合で結合された薬物を有するポリマー結合体１の分解
０．１Ｍリン酸緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６）中で還元剤としてグルタチオンの存在下で、すなわち細胞（細胞質、エンドソーム及び二次リソソーム）を模した媒体中で、ポリマー結合体の分解を試験した。ポリマー結合体をリン酸緩衝液に濃度２０ｍｇ／ｍｌで溶解させた。溶液をサーモスタット（３７℃）中に置く直前に、インキュベーション媒体中の得られるグルタチオン濃度が３．１０−３ｍｏｌ／ｌであるようにグルタチオンストック液を添加した。インキュベーション溶液のアリコート試料（２００μｌ）を所定時間間隔で抜き取り、ＰＤ−１０カラムによって脱塩し、凍結乾燥させた。分解生成物の分子量を屈折計（Ｏｐｔｉｌａｂ Ｒｅｘ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）及び多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ ＥＯＳ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を備えた液体クロマトグラフＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＤによって測定した。分析をＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６カラム（３００×１０ｍｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって実施した。移動相として、流量０．５ｍｌ／ｍｉｎの０．３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．５ｇ／ｌＮａＮ３）を使用した。コポリマーの分子量及び多分散性をＡｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）によって計算した。
【００９２】
細胞質濃度のグルタチオン（３．１０−３ｍｏｌ／ｌ）を含む溶液中のジスルフィド架橋を有する結合体（結合体１）は急速に分解する。グルタチオンと一緒に２４時間インキュベーション後、分子量が腎臓ろ過限界（約２５０００ｇ／ｍｏｌ）未満のポリマー分解生成物が見られた（図３）。
【実施例１８】
【００９３】
生物体から排出することができる分解生成物への、ヒドラゾン結合で結合された薬物を有するポリマー結合体３のカテプシンＢによる分解
リソソーム酵素カテプシンＢを含む、したがって腫瘍細胞中の二次リソソームの媒体を模した、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ、ｐＨ６．０、５ｍＭグルタチオン、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中でポリマー結合体の分解を基質濃度５０ｍｇ／ｍｌで試験した。ポリマー結合体をリン酸緩衝液に濃度１０ｍｇ／ｍｌで溶解させ、（３７℃で）サーモスタット中に配置する直前に、その得られる濃度が５．１０−７ＭであるようにカテプシンＢのストック液を添加した。インキュベーション溶液の試料（２００μｌ）を所定時間間隔で抜き取り、ＰＤ−１０カラムによって脱塩し、凍結乾燥させた。分解生成物の分子量を上記と同様に測定した。ＧＦＬＧオリゴペプチドスペーサーを含む結合体（結合体３）は、カテプシンＢの溶液（５．１０−７ｍｏｌ／ｌ）中で徐々に分解した。カテプシンＢと一緒に４８時間インキュベーション後、分子量が腎臓ろ過限界（約４００００ｇ／ｍｏｌ）未満のポリマー分解生成物が見られた（図４）。
【００９４】
生物活性の例では、ポリマー結合体に対して以下のコードを定義する。
【００９５】
Ｋ−１ ＡＭ−アミド結合で結合された薬物を有する樹状ポリマー結合体１
Ｍｗ＝２４８０００、Ｉｎ＝１．９、Ｒｈ＝１５．６ｎｍ
Ｋ−１ ＨＹＤ−ヒドラゾン結合で結合された薬物を有する樹状ポリマー結合体１
Ｍｗ＝１９９０００、Ｉｎ＝２．１、Ｒｈ＝１４．２ｎｍ
ＬＩＮ ＡＭ−アミド結合で結合された薬物を有する線状ポリマー結合体
Ｍｗ＝４５０００、Ｉｎ＝１．８５、Ｒｈ＝５．２ｎｍ
ＬＩＮ ＨＹＤ−ヒドラゾン結合で結合された薬物を有する線状ポリマー結合体
Ｍｗ＝３６０００、Ｉｎ＝１．８７、Ｒｈ＝４．５ｎｍ。
【実施例１９】
【００９６】
種々の腫瘍株の細胞と一緒にインキュベートされたドキソルビシンの樹状結合体及びグラフト結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性（細胞傷害性、ＩＣ５０）の例（［３Ｈ］チミジン取り込み方法を使用した）
【００９７】
【表１】
試験ポリマーの阻害活性を決定するために、マウス起源及びヒト起源の以下の永久腫瘍株を選択した：マウスＴ細胞リンパ腫ＥＬ４、マウスＢ細胞リンパ腫３８Ｃ１３、マウス黒色腫Ｂ１６、マウスＢ細胞白血病ＢＣＬ１、ヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｊｉ、ヒトＴ細胞白血病Ｊｕｒｋａｔ、マウス線維芽細胞腫３Ｔ３、ヒト有棘細胞癌腫ＦａＤｕ及びマウス乳癌腫４Ｔ１。抗増殖活性を［３Ｈ］チミジンの取り込みによって測定した。
【００９８】
表１から、全試験株において最も明白な阻害活性は、両方のヒドラゾン結合で結合されたドキソルビシンポリマー結合体（Ｋ−１ ＨＹＤ及びＬＩＮ ＨＹＤ）で示されることになる。アミド結合で結合されたドキソルビシンとの結合体は、かなり低い活性を示す。高分子量ポリマー結合体Ｋ−１ ＨＹＤ及びＫ−１ ＡＭは、薬物が同様に結合した線状結合体よりもわずかに高い抗増殖活性を示す。その差は大きくなく、高分子量ポリマー結合体は、その低分子量線状類似体とほぼ同じ抗増殖活性を示すと言うことができる。
【実施例２０】
【００９９】
Ｔ細胞リンパ腫ＥＬ４を皮下移植した近交系マウスＣ５７ＢＬ／６における樹状ポリマー−ドキソルビシン結合体のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性の例
Ｔ細胞リンパ腫ＥＬ４を皮下移植した近交系マウスＣ５７ＢＬ／６をｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用した。静脈内（ｉ．ｖ．）投与された用量は、１×１５ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇ及び１０ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇであった。有効な対照として、ＥＬ４腫瘍を有するマウス群を使用し、ドキソルビシンのみ（８日目及び１５日目に２×５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処置した。基本対照は、ＥＬ４腫瘍を有する無処置マウスであった。ドキソルビシンがヒドラゾンで結合されたＫ−１ ＨＹＤ、ドキソルビシンがアミドで結合されたＫ−１ ＡＭ、並びに線状ポリマー結合体ＬＩＮ ＨＹＤ及びＬＩＮ ＡＭを投与した後の腫瘍増殖を図５に示す。
【０１００】
図５及び６から、用量１５ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇの両方の樹状ＨＭＷポリマー結合体（Ｋ−１ ＨＹＤ及びＫ−１ ＡＭ）の試料は非常に効率が高いことが明らかである。活動的な腫瘍増殖期間に投与された単一用量の薬物は、実験腫瘍ＥＬ４を有するマウスの１００％を治癒させることができる。ＨＭＷポリマー結合体の効率は、薬物が同様に結合した線状結合体の効率よりもかなり高い。これらの線状結合体では、実験腫瘍を有するマウスの３７％（ＬＩＮ ＨＹＤ）又は２５％（ＬＩＮ ＡＭ）が治癒した。１０ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇの用量では、ドキソルビシンがヒドラゾン結合で結合されたＫ−１ ＨＹＤは、活動的な腫瘍増殖期間に投与された単一用量によってやはり１００％のマウスが治癒したので、常に活性が高いことがわかった。ドキソルビシンがアミド結合で結合されたポリマー結合体Ｋ−１ ＡＭは、それよりも低活性であるが、それでも単一の低用量によって実験腫瘍を有するマウスの６０％超が治癒する。
【０１０１】
図７は、ポリマー結合体（図５及び６参照）を用いて治癒したマウス、及び致死量の最初の腫瘍（１×１０５マウスＴ細胞リンパ腫ＥＬ４）を再移植したマウスの生存を示す。マウスは処置されなかった。図７の結果から、ポリマー結合体で処置したマウスにおいては、抗腫瘍抵抗性が治療中に発現したことが明らかである。これは、ヒドラゾンで結合されたドキソルビシン（用量１０ｍｇ及び１５ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇ）を含むＫ−１ ＨＹＤ及びアミド結合で結合されたドキソルビシン（１０ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇ）を含むＫ−１ ＡＭで治癒したマウスの３０〜４０％で生じた。この結果は、本発明による新規に調製されたポリマー薬物が２つの効果、すなわち、大多数の腫瘍細胞を直接殺傷する細胞分裂阻害効果、及び処置中に免疫系を刺激して抗腫瘍抵抗性を誘発する免疫調節効果を示すことを意味する。以前に処置した動物に致死量の腫瘍細胞を再移植した後に得られた結果は、本発明によるポリマー結合体を使用した療法が、腫瘍の除去だけでなく、癌の二次的な／転移性の発生又はその再発に対して治癒動物を防御するということの実験的証拠である。
【０１０２】
【表２−１】
【０１０３】
【表２−２】
【０１０４】
【表２−３】
【０１０５】
【表２−４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固形腫瘍中への抗腫瘍薬物の標的化輸送、生分解、付随する制御薬物放出及びそれに続く生物体からのポリマー担体の排出を可能にする、水溶性高分子量（ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ：ＨＭＷ）樹状ポリマー薬物担体、及び薬物とのその結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する。抗癌剤（ｃａｎｃｅｒｏｓｔａｔｉｃ）と結結合体化されたポリマー担体の作用は、ヒト腫瘍の標的療法を目標とする。
【背景技術】
【０００２】
最近、薬剤開発は、主に必要な治療効果の部位における活性物質の標的化作用を可能にする剤形の探索をますます目標とするようになった。標的化された活性型の薬物は、その副作用が生物体の健常な部分の損傷を招くおそれがある物質と一緒に適用される。この話題の最大の懸念は、健常な組織及び器官を損傷し、細胞増殖抑制剤による処置を受けている患者を危険にさらすことである。薬物の標的化輸送用担体としてのポリマー材料、特に水溶性ポリマーの利用は、上記問題の重要な解決候補の一つである。共有結合による水溶性ポリマーへの細胞増殖抑制剤の連結（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）は、水溶性の乏しい薬物の溶解性をかなり高めることができ、その毒性を顕著に低下させることができる。ポリマー−薬物結合体の分子量は、糸球体ろ過による生物体からの薬物の急速な排出を防止し、したがってその血中循環時間及び生物体におけるその全滞留時間をかなり延長し、したがって薬物の生物学的利用能を高める。さらに、ポリマー結合体の高分子量は、高められた透過性及び保持（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ：ＥＰＲ）の効果に起因して、固形腫瘍におけるその蓄積を増加させる［非特許文献１（Ｍａｅｄａ ２０００）］。
【０００３】
抗癌剤がポリマー担体に連結すると、この効果を腫瘍におけるその標的蓄積に利用することができる。過去２０年間に、ＥＰＲ効果をポリマーミセル、リポソームまたは水溶性ポリマー結合体などの薬物のターゲティングに利用することに基づく幾つかの系が開発された。ポリマーミセルは、可溶性ポリマー系とは対照的に、通常、コロイド溶液を形成するＨＭＷ構造中に両親媒性ジブロックコポリマーを構築することによって調製される。薬物は、大部分はその疎水性コアにおいて物理的（疎水性）相互作用又は共有結合によってミセルに連結する［非特許文献２（Ｋａｔａｏｋａ ２００１）、非特許文献３（Ｂａｅ ２００３）、非特許文献４（Ｂｒｏｎｉｃｈ １９９９）］。固形腫瘍に蓄積する可溶系ミセルとは対照的に、ポリマーは、水性媒体中に分子的に分散し、通常はランダムコイル形状をとり、薬物は親水性ポリマーに接する。酵素加水分解又は一般的な化学加水分解しやすい加水分解的に不安定なイオン結合又は共有結合によって薬物が連結された、抗癌剤と可溶性ポリマーの多数のタイプの結合体が研究された。上記系は、抗癌剤をその活性な形で腫瘍組織において、又は特異的な方法で直接腫瘍細胞においても、放出することができる。水溶性の系のうち、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマーに基づいて調製されたポリマー結合体は、最も重要なものに属する。その幾つかは、連結されたターゲティング構造（抗体、ホルモン及びオリゴペプチド）によって腫瘍中に能動的に向けられる。［非特許文献５（Ｄｕｎｃａｎ １９８５）、非特許文献６（Ｒｉｈｏｖａ ２０００）、非特許文献７（Ｋｏｐｅｃｅｋ ２００１）、非特許文献８（Ｍｒｋｖａｎ ２００５）］。
【０００４】
ヒト用の医薬品における薬物担体としてのＨＰＭＡコポリマーの使用を妨げる主な欠点の一つは、その切断できない炭素鎖であり、分子量のポリマー担体の調製に利用可能な関連する分子量制限が４００００〜５００００よりも低い（生物体の腎閾値未満の）分子量であることである。高分子量ポリマーは、生物体から効果的かつ十分に排出されず、したがって薬物としてのその使用は生物体内でのその蓄積を招く。明白なＥＰＲ効果、すなわち固形腫瘍における蓄積が多い場合、排除限界をはるかに超えた分子量を有する（ＨＰＭＡコポリマーを含めた）ポリマーを処理する必要がある［非特許文献９（Ｓｅｙｍｏｕｒ １９９５）、非特許文献１０（Ｎｏｇｕｃｈｉ １９９８）］。したがって、ポリマー担体の分子量は十分に高いが、そのポリマーは有効成分の放出後に、例えば糸球体ろ過によって生物体から排出することができる断片へと分解できることが重要である。最近、本発明者らは、ＨＰＭＡポリマーを使用した薬物の構造及び生物活性、並びに腎臓ろ過限界よりも高い分子量とのその関連を特許化した。これらは、抗癌剤が共有結合によってポリマーに連結した、ＨＰＭＡコポリマーに基づくグラフトポリマー担体［Ｅｔｒｙｃｈ特許ＣＺ２９８９４５Ｂ６、非特許文献１１（Ｅｔｒｙｃｈ ２００８）］及びポリマーミセル［Ｃｈｙｔｉｌ特許ＣＺ ＰＶ２００６−２０７］であった。この共有結合は酵素的に又は単に加水分解的に不安定であり、恐らくは、ポリマー鎖は、生分解性の酵素的に及び／又は還元的に切断可能なスペーサー、すなわちオリゴペプチドＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ又はジスルフィド架橋を介してグラフト構造に結合した。抗癌剤ドキソルビシン（Ｄｏｘ）を有効成分として含む系の利点は、マウスモデルにおいて確認された、同じ薬物を含む元のポリマー系と比較して高められた抗腫瘍活性であった。上記系の欠点は、比較的広い分子量分布（３から４の多分散性指数Ｉｎ）であり、したがって２０００００ｇ／ｍｏｌを超える高分子量を得る可能性が限られた十分に規定されていない系である。本発明の主題は、分子量分布が狭く（Ｉｎ約１．５〜２．５）、腫瘍における細胞増殖抑制剤の高い蓄積と細胞内分解後に生物体からポリマー担体が排出されることを特徴とする規定された生分解性骨格を有する、新しいＨＭＷポリマー薬物の構造及び合成である。その構造は、樹状中心部から発し、共有結合的に連結した薬物を含むポリマーグラフトを樹状分枝上に有する。グラフト数及びそのサイズを選択することによって、高分子量のポリマー（最高１４０００００ｇ／ｍｏｌ）を得ることができる。類似の系は以前に記述されており［Ｗａｎｇ ２０００］、記述された系、本発明の主題の系、及び以前に発表された系の主要な相違は、以前に記述された系が、簡単に分解可能なポリマー骨格を持たず、薬物が酵素分解性のＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙオリゴペプチド配列のみを介して連結している点にある。デンドリマー分枝端部の修飾のために、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）［非特許文献１２（Ｇａｊｂｈｉｙｅ ２００９）、非特許文献１３（Ｂａｉ ２００９）］がしばしば使用された。これらの系におけるＰＥＧの主要な役割は、デンドリマーの潜在的に有毒なアミノ基を妨害することであり、ここではＰＥＧは生物活性分子の担体としては働かない。前述の場合と同様に、この系は生分解性ではない。それらが生物体に蓄積するべきでない場合、その利用は、５００００ｇ／ｍｏｌまでの低分子量に限られる。
【０００５】
デンドリマーと他の、しばしば生分解性のポリマーの併用は、特許文献に記載されている。ポリ（アミノ酸）は、デンドリマー−ポリ（アミノ酸）結合体の調製に使用され［Ｌｉ特許ＷＯ０３０５５９３５］、ここで、この結合体は、デンドリマー開始剤を用いてαアミノ酸のＮ−カルボキシ無水物の重合によって調製された。この場合、ポリ（アミノ酸）グラフトは、かなりの負電荷（ポリ（グルタミン酸）及びポリ（アスパラギン酸））、正電荷（ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリリジン）を帯びるか、又は疎水性であり、したがって体液に不溶である。薬物、例えばパクリタキセルは、共有結合性エステル結合を介してこのポリマーに結合する。系表面の高電荷密度又はそのかなりの疎水性及び不溶性のために、種々の組織との望ましくない相互作用及び生物体（例えば、腎臓）内の蓄積が起こり得る。これは、例えば、負に帯電したポリ（アミノ酸）で典型的である［非特許文献１４（Ｒｙｐａｃｅｋ １９８２）］。生分解性スペーサーのない共有結合性エステル結合による薬物とポリマーの連結は、本来の活性型の薬物の放出を保証しない。ポリ（アミノ酸）グラフトを利用した系においては、ポリ（グルタミン酸）の部分的分解のみが確認され、ここでは必ずしも生物活性ではない、薬物の広範な低分子量断片及びアミノ酸誘導体の切断が起こる。かかる系の分解は、カテプシンＢを含むモデル系においてのみ文献に記述され、ｉｎ ｖｉｖｏでのその分解に関するデータは不十分である。
【０００６】
本発明による系の利点は、ＨＰＭＡコポリマーに基づく、生物体と相互作用しない不活性無電荷水溶性ポリマーによって形成されるポリマーグラフトであり、薬物はこのポリマーグラフトに対して細胞内分解性スペーサーを介して連結し、標的細胞及び組織における活性薬物の制御放出が可能である。本発明による系の別の利点は、糸球体ろ過によって生物体から排出することができる不活性水溶性ＨＰＭＡコポリマーのポリマー生成物への担体骨格の明確に証明された細胞内還元又は酵素分解である。したがって、抗癌剤を腫瘍部位に輸送した後に生物体からＨＭＷポリマー担体が排出されることが保証される。
【０００７】
文献では、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコールメタクリレート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリアクリル酸、ポリ（メタクリル酸、ポリ（２−アミノエチルメタクリレート］、ポリ［Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド］及びポリ［２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］の親水性鎖が線状又は星形のポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ−ラクチド）、ポリ（ＤＬ−ラクチド）及びポリ（グリコール酸）に連結した他の系が記載されている［Ｌｅｌｅ特許ＵＳ７０１８６５５］。著者らは、こうして調製された系がＨＭＷ系を形成し、薬物輸送に利用可能であることを示す。この系は、例えば疎水性ポリ（ε−カプロラクトン）及びＨＰＭＡベースのポリマーを含む、その構造の両親媒性のために、溶液中でミセル又はナノ粒子を形成する。次いで、これらの系中の薬物は、この系の疎水性コア上で、疎水性相互作用によって吸収され、外的条件に依存して薬物を制御放出を可能にできず、輸送の過程で薬物放出を防止することができない。さらに、この系は、ほとんどの場合、特許［Ｌｉ特許ＷＯ０３０５５９３５］に記載の系の問題に類似した問題、すなわち表面電荷及び生物体における望ましくない相互作用を抱える。
【０００８】
上記系とは対照的に、すなわち、本発明によれば、凝集の可能性なしに、水及び体液に可溶であり、生分解性スペーサーを介して連結した薬物を有し、標的細胞又は腫瘍組織における薬物の制御放出を可能にする。
【０００９】
文献では、例えば消炎薬用の、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを担体として利用する系も記述されており［Ｋｕｒｔｏｇｌｕ ２００９］、ここでは、薬物（Ｎ−アセチルシステイン）は、還元的に切断可能なジスルフィド架橋を介してデンドリマーに結合する。この系においては、ＰＡＭＡＭデンドリマーが担体として働く。したがって、ＰＡＭＡＭに起因して、腫瘍組織中への受動的ターゲティングに重要である高分子量を得ることが困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍａｅｄａ， Ｈ．， Ｊ． Ｗｕ， Ｔ． Ｓａｗａ， Ｙ． Ｍａｔｓｕｍｕｒａ， ａｎｄ Ｋ． Ｈｏｒｉ， Ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ＥＰＲ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６５：２７１−２８４ （２０００）
【非特許文献２】Ｋａｔａｏｋａ， Ｋ．； Ｈａｒａｄａ， Ａ．； Ｎａｇａｓａｋｉ， Ｙ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． ４７， １１３−１３１ （２００１）
【非特許文献３】Ｂａｅ， Ｙ． Ｓ．； Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ， Ｓ．； Ｈａｒａｄａ， Ａ．； Ｋａｔａｏｋａ， Ｋ． ｐＨ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｅｌｌｅｓ： Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ＳＢＣ−３． Ｗｉｎｔｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ａｎｄ １１ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ， Ｕｔａｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ． ２００３． Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ， Ｕｔａｈ， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【非特許文献４】Ｂｒｏｎｉｃｈ， Ｔ． Ｋ．； Ｎｅｈｌｓ， Ａ．； Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ａ．； Ｋａｂａｎｏｖ， Ｖ． Ａ．； Ｋａｂａｎｏｖ， Ａ． Ｖ． Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ． Ｂ １６， ２４３−２５１ （１９９９）
【非特許文献５】Ｄｕｎｃａｎ， Ｒ．， Ｌｌｏｙｄ， Ｊ．Ｂ．， Ｊ． Ｋｏｐｅｃｅｋ， Ｐ． Ｒｅｊｍａｎｏｖａ， Ｊ． Ｓｔｒｏｈａｌｍ， Ｋ． Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｂ． Ｒｉｈｏｖａ， Ｖ． Ｃｈｙｔｒｙ： Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ （１９８５）． Ｐａｔｅｎｔ ＣＺ ００９５／８５， Ａｕｓｔｒａｌｉａ ５８９５８７， Ｃａｎａｄａ １３００５３， Ｄｅｎｍａｒｋ １６４４８５， Ｅｕｒｏｐｅ ０１８７５４７， ＵＳ ５，０３７，８８３， Ｊａｐａｎ ０００１３７／８６
【非特許文献６】Ｂ． Ｒｉｈｏｖａ， Ｍ． Ｊｅｌｉｎｋｏｖａ， Ｊ． Ｓｔｒｏｈａｌｍ， Ｖ． Ｓｕｂｒ， Ｄ． Ｐｌｏｃｏｖａ， Ｏ． Ｈｏｖｏｒｋａ， Ｍ． Ｎｏｖａｋ， Ｄ． Ｐｌｕｎｄｒｏｖａ， Ｙ． Ｇｅｒｍａｎｏ， Ｋ． Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＩＩ． Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｒ （Ｆａｂ’）２−ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ． Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ． ６４， ２４１−２６１ （２０００）
【非特許文献７】Ｋｏｐｅｃｅｋ， Ｊ．， Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ， Ｐ．， Ｍｉｎｋｏ， Ｔ．， Ｌｕ， Ｚ．Ｒ．， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｃ．Ｍ．； ”Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”． Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ７４， １６５−１７３ （２００１）．
【非特許文献８】Ｔ． Ｍｒｋｖａｎ， Ｍ． Ｓｉｒｏｖａ， Ｔ． Ｅｔｒｙｃｈ， Ｐ． Ｃｈｙｔｉｌ， Ｊ． Ｓｔｒｏｈａｌｍ， Ｄ． Ｐｌｏｃｏｖａ， Ｋ． Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｂ． Ｒｉｈｏｖａ， Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＨＰＭＡ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｐＨ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｉｍｕｎｉｔｙ， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１０， １１９−１２９ （２００５）
【非特許文献９】Ｌ．Ｗ． Ｓｅｙｍｏｕｒ， Ｙ． Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｈ． Ｍａｅｄａ， Ｍ． Ｂｒｅｒｅｔｏｎ， Ｊ． Ｓｔｒｏｈａｌｍ， Ｋ． Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｒ． Ｄｕｎｃａｎ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ａ ３１， ７６６ − ７７０ （１９９５）
【非特許文献１０】Ｙ． Ｎｏｇｕｃｈｉ， Ｊ． Ｗｕ， Ｒ． Ｄｕｎｃａｎ， Ｊ． Ｓｔｒｏｈａｌｍ， Ｋ． Ｕｌｂｒｉｃｈ， Ｔ． Ａｋａｉｋｅ， Ｈ． Ｍａｅｄａ， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８９， ３０７−３１４ （１９９８）
【非特許文献１１】Ｅｔｒｙｃｈ Ｔ．， Ｃｈｙｔｉｌ Ｐ．， Ｍｒｋｖａｎ Ｔ．， Ｓｉｒｏｖａ Ｍ．， Ｒｉｈｏｖａ Ｂ．， Ｕｌｂｒｉｃｈ Ｋ．， Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｗｉｔｈ ｇｒａｆｔ ＨＰＭＡ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ｐａｓｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １３２， １８４−１９２ （２００８）
【非特許文献１２】Ｇａｊｂｈｉｙｅ Ｖ．， Ｋｕｍａｒ Ｐ．， Ｔｅｋａｄｅ Ｒ．， Ｊａｉｎ Ｎ．， ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ＰＰＩ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｈ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４４， １１５５−１１６６ （２００９）
【非特許文献１３】Ｂａｉ Ｓ．， Ａｈｓａｎ Ｆ．， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｈｅｐａｒｉｎ， ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２６， ５３９−５４８ （２００９）
【非特許文献１４】Ｆ． Ｒｙｐａｃｅｋ， Ｊ． Ｄｒｏｂｎｉｋ， Ｖ． Ｃｈｍｅｌａｒ， Ｊ． Ｋａｌａｌ， Ｔｈｅ ｒｅｎａｌ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ？？ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ − ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｆｆｅｃｔ， Ｐｆｌｕｇ． Ａｒｃｈ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｇｙ． ３９２， ２１１−２１７ （１９８２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の開示
本発明の目的は、狭い分子量分布、系の明確に定義された構造、生分解性骨格、及び単純化された合成によって、既報の系とは異なる、樹状構造を有する新しいＨＭＷポリマー薬物担体及びその薬物結合体の構造及び合成である。上記ポリマー薬物は、腫瘍中の細胞増殖抑制剤の蓄積の増加、並びに細胞内分解、並びに薬物放出及び担体のその役割の遂行後に生物体から排出されるポリマー担体の付随する能力を特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によるＨＭＷ生分解性ポリマー担体の目的は、それが、中心Ｇ０世代からＧ６世代までの樹状ポリ（アミドアミン）及び２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン構造からなっており、そのアミノ基又はヒドロキシ基にセミテレケリックＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）が生分解性スペーサーを用いてポリマー鎖末端を介して連結していることにある。
【００１３】
生きている生物体の主に組織又は標的細胞において分解することができる生分解性スペーサーとしては、還元的に切断可能なジスルフィド結合又は酵素的に切断可能なオリゴペプチド配列が使用される。中心樹状構造及びセミテレケリックグラフトの分子量は、分解後、担体成分すべてが糸球体ろ過によって生物体から排出できるように、生物体の排出限界（ＨＭＰＡコポリマーの場合約５００００ｇ／ｍｏｌ）未満で選択される。デンドリマーとＨＰＭＡコポリマーを連結する酵素分解性オリゴペプチド配列は、好ましくはＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ及びＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ配列を含む。
【００１４】
生分解性スペーサーは、３つの方法によって、すなわち、分解性スペーサーを含むセミテレケリックポリマーを使用したデンドリマー分枝末端のアミノ基若しくはヒドロキシ基の反応によって、生分解性スペーサーを含む構造で末端基が修飾されたデンドリマーとセミテレケリックポリマーの反応によって、又は活性化デンドリマーチオール基とセミテレケリックポリマーのチオール末端基の反応によって還元的に切断可能なジスルフィド結合を結合体構造中に導入することによって、担体構造に導入することができる。
【００１５】
本発明の一態様は、さらに、セミテレケリックＨＰＭＡコポリマーがアミノ基上にグラフトされたポリ（アミドアミン）樹状構造をその中心部に有するポリマー担体であって、このポリマーグラフトは、アミド結合及び生分解性スペーサーを介してポリマー鎖末端経由でデンドリマーに連結している、ポリマー担体である。このポリマー担体は、模式的構造Ｉ及びＩＩを有する。
【００１６】
【化１】
本発明の一目的は、さらに、４〜２５６個のアミノ基、ピリジルジスルファニル基又はカルボキシル基を含むポリ（アミドアミン）に基づくＧ０世代からＧ６世代までの樹状構造によってその中心部が形成されたポリマー担体であって、コアユニットは、好ましくは、システアミン、エチレンジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、ヘキサン−１，６−ジアミン又はドデカン−１，１２−ジアミンによって形成される、ポリマー担体である。
【００１７】
本発明の目的は、さらに、ポリマー担体であって、その中心部が、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸に基づく樹状構造によって形成され、それにヒドロキシ基を介してセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーが結合しており、このポリマーグラフトはエステル結合及び生分解性スペーサーを介してこのデンドリマーに連結している、ポリマー担体である。このポリマー担体は、模式的構造ＩＩＩ及びＩＶを有する。
【００１８】
【化２】
【００１９】
【化３】
本発明の更なる一態様は、樹状ポリマー担体であって、その中心部が、８〜２５６個のヒドロキシ末端基、ピリジルジスルファニル末端基又はカルボキシル末端基を含む第１世代から第６世代までの２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸に基づく樹状構造によって形成された、樹状ポリマー担体である。
【００２０】
本発明による樹状ポリマー担体の一態様は、それが、ＳＰ１のメタクリロイル化アミノ酸ヒドラジドのモノマー単位０．５〜８ｍｏｌ％を含むＨＰＭＡコポリマーによって形成された２〜２８個のグラフトを含み、ここでこのアミノアシルが、好ましくは、β−アラニル、６−アミノヘキサノイル（ＡＨ）、４−アミノベンゾイル、及び／又はオリゴペプチドヒドラジド（ｏｌｉｇｏｐｅ ｈｙｄｒａｚｉｄｅｓ）ＧｌｙＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ及びＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙから誘導される複合アシルＳＰ２の群から選択されることである。
【００２１】
本発明は、さらに、ポリマーグラフトが、ジスルフィド又は生分解性オリゴペプチドを含む生分解性結合を介して中心ポリ（アミドアミン）樹状部分に連結している、ＨＭＷポリマー担体を含む。本発明によるオリゴペプチドは、好ましくは、酵素分解性オリゴペプチドＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ及びＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙの群から選択される。
【００２２】
本発明の更なる一目的は、本発明による樹状ポリマー担体と、加水分解的に切断可能な結合を介して担体に連結している薬物とからなる、薬物とのＨＭＷポリマー結合体である。
【００２３】
本発明の一態様は、薬物が好ましくは抗癌剤であるＨＭＷポリマー結合体でもある。本発明の更なる一態様は、抗癌剤が、好ましくは、加水分解的に切断可能なヒドラゾン結合を介して担体に連結しているドキソルビシンである、樹状ポリマー結合体である。
【００２４】
本発明の更なる一態様は、本発明によるポリマー担体と、アミドで結合された薬物とからなる、本発明によるＨＭＷポリマー結合体であって、ここで、２〜２８個のＨＰＭＡコポリマーグラフトが、結合薬物、好ましくはドキソルビシンがオリゴペプチド配列の末端にアミド結合を介して連結したメタクリロイル化オリゴペプチドヒドラジドＳＰ２のモノマー単位０．５〜８ｍｏｌ％を含み、このオリゴペプチドは、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ及びＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙからなる群から選択される、ＨＭＷポリマー結合体である。
【００２５】
本発明の更なる一目的は、樹状構造から誘導されるＨＭＷ担体とドキソルビシンとの結合体であり、ここでドキソルビシン含有量は１〜２５ｗｔ．％である。本発明は、本発明による樹状構造から誘導されるＨＭＷポリマー結合体を有効成分として含む医薬組成物も含む。この組成物は、腫瘍、詳細には固形腫瘍、一部のリンパ腫タイプ及び白血病の処置における使用が意図される。
【００２６】
ポリマー結合体においては、担体は、生分解性結合、好ましくは、ｐＨに依存して加水分解的に切断可能なヒドラゾン結合又はリソソーム酵素によって切断可能なオリゴペプチドスペーサーを介して連結した薬物を有する。ポリマー結合体は、生物体の排除限界をかなり超えて、長期の血液循環時間、十分に高いＥＰＲ効果、及び固形腫瘍組織における捕捉をもたらすために十分な高分子量を得るように構築される。結合体の分子量は、合成に使用されるセミテレケリックポリマーの分子量、使用するデンドリマーの世代数、及び樹状末端基の置換によって制御することができる。かかる樹状系の分子量は、好ましくは、４００００から１４０００００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、Ｄｏｘ含有量は、ポリマー鎖と得られる樹状結合体のどちらも、１から２５ｗｔ％（ポリマー中０．３〜８ｍｏｌ％）の範囲である。
【００２７】
本発明による樹状ポリマー結合体は、主に静脈内適用（注射又は注入）が意図されるが、腫瘍又は腹腔内に適用することもできる。化学的に結合した細胞増殖抑制剤を有するポリマーは血液循環中で安定であり、オリゴペプチドスペーサー又はヒドラゾン結合は血流の生理的条件下（ｐＨ７．４）で比較的安定である。血管外遊出及び固形腫瘍における捕捉後、溶解した結合体は、ＥＰＲ効果による飲作用によって腫瘍細胞中に侵入する。外部のｐＨ７．４から細胞内の５〜６へとｐＨが低下することにより、ヒドラゾン結合が加水分解され、細胞増殖抑制剤が標的細胞中に放出され、活性化される。同様に、腫瘍細胞に侵入後、ジスルフィド結合又はオリゴペプチドスペーサーは、細胞質及び細胞リソソーム中で切断する。オリゴペプチドスペーサーを介して結合した薬物及び同時にポリマー骨格は、分解して断片になり、この断片は生物体から排出することができる。さらに、システアミンコアを有するＰＡＭＡＭ樹状構造が結合体に組み込まれると、コアは既に生分解性ジスルフィド結合を含み、腫瘍細胞中でこの系をより低分子量の分解生成物へと分解するのを可能にする。
【００２８】
文献に記載された系とは対照的に、本発明による担体は、ＨＭＷで受動的に標的化された担体のその機能を果たした後、十分可溶な生体適合性の短鎖ポリマー断片へと生物体中で分解することができる。細胞の少し酸性の還元性媒体中で、ジスルフィド結合は還元され（文献によれば、動物細胞の細胞質中のグルタチオン濃度は、１ｍｍｏｌ／ｌと５ｍｍｏｌ／ｌとの間の範囲である）、ＨＭＷ系は最初のポリマーの断片へと分解し、生物体から排出することができる。酵素的に切断可能なオリゴペプチド配列を介して樹状構造に連結したポリマー鎖を含む担体では、類似の担体分解が起こるはずである。この場合、ポリマー骨格は、リソソーム酵素の作用によって分解されるはずである。本発明によるポリマー結合体の提案された作用機序の現実性は、ポリマー担体からのドキソルビシンのモデル放出、及び動物細胞における関係を模した媒体中で試験された樹状ポリマーの分解によって、実証される。抗腫瘍活性試験を含めたこれらの試験の結果は、本特許出願の実施例に記載されている。
【００２９】
したがって、本発明の目的は、抗癌剤の生分解性ＨＭＷ担体、並びに固形腫瘍に対する明白な細胞傷害効果及び細胞分裂阻害効果を有する選択された抗癌剤、好ましくはドキソルビシンとこの担体との結合体である。
【００３０】
ポリマー担体及び薬物とのその結合体は以下のグループに分けることができる：
１型のポリマー担体は、系のコアがポリ（アミドアミン）系デンドリマーコアによって形成されており、中心部がシステアミン、エチレンジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、ヘキサン−１，６−ジアミン又はドデカン−１，１２−ジアミンによって形成されており、分子量１００００〜５００００ｇ／ｍｏｌの２〜２８個のＨＰＭＡコポリマーグラフトが還元的に切断可能なジスルフィド結合を含むスペーサーを介して連結している４〜２５６個の末端アミノ基（スキーム１１、１３及び１４の構造参照）を有することを特徴とし、コポリマーグラフトが、スキーム７〜１０に示す構造及び組成を有するセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーの群から選択されることを特徴とする。
【００３１】
２型のポリマー担体は、系のコアが２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸に基づく樹状構造によって形成されており、分子量１００００〜５００００ｇ／ｍｏｌの２〜２８個のＨＰＭＡコポリマーグラフトが還元的に切断可能なジスルフィド結合を含むスペーサーを介して連結している８〜２５６個のヒドロキシ末端基（スキーム１２〜１４の構造参照）を有することを特徴とし、ポリマーグラフトが、スキーム７〜１０に示す構造及び組成を有するセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーの群から選択されることを特徴とする。
【００３２】
３型ポリマー担体は、系のコアが１型ポリマー担体の場合と同じ樹状構造によって形成されており、セミテレケリックポリマーが生分解性オリゴペプチド配列ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙを介して連結していることを特徴とし、ポリマーグラフトがスキーム１〜６に示す構造及び組成を有するセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーの群から選択されることを特徴とする。
【００３３】
４型のポリマー担体は、系のコアが２型ポリマー担体の場合と同じデンドリマーによって形成され、セミテレケリックポリマーが生分解性オリゴペプチド配列、好ましくはＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙを介して結合していることを特徴とし、ポリマーグラフトがスキーム１〜６に示す構造及び組成を有するセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーの群から選択されることを特徴とする。
【００３４】
ポリマー結合体１〜４型の構造は、ポリマー担体の構造と同一であるが、抗癌剤は、オリゴペプチド配列（スペーサー）の末端で、純粋に加水分解的に切断可能なヒドラゾン結合又は酵素的に切断可能なアミド結合によってポリマーグラフトに結合している。ポリマー結合体の分子量は、樹状部分のサイズ、セミテレケリックポリマーの長さ、及び置換度に応じて４００００ｇ／ｍｏｌと１４０００００ｇ／ｍｏｌとの間の範囲である。
【００３５】
樹状ポリマー担体及びドキソルビシンとのその結合体の構造
本発明によるポリマー担体及びＤｏｘが連結したポリマー結合体の合成は、幾つかのステップで実施される。それは、モノマー（ＨＰＭＡ、Ｄｏｘがアミドとして結合したメタクリロイル化オリゴペプチド、アミノ酸のメタクリロイル化誘導体、及びヒドラジド又はＢｏｃで保護されたヒドラジド基で終結したオリゴペプチド）の合成、それに続くラジカル重合によって調製されるポリマー前駆体（中心樹状構造に結合するための反応性末端基を有し、オリゴペプチドスペーサーを介して連結した保護された若しくは無保護のヒドラジド基又は薬物成分を鎖に沿って有するための反応性末端基、セミテレケリックポリマー）の合成からなる。モノマー及びセミテレケリックポリマー前駆体の合成は、以前に詳述された［Ｅｔｒｙｃｈ特許ＣＺ２９８９４５Ｂ６、Ｅｔｒｙｃｈ ２００８］。セミテレケリックポリマーの合成は、連鎖移動剤（３−スルファニルプロパン酸）（ＳＰＡ）の存在下でラジカル重合によって、又は二官能アゾ開始剤（３，３’−アゾビス（シアノイソ吉草酸）（ＡＢＩＡ）若しくは３，３’−［４，４’−アゾビス（４−シアノ−４−メチル−１−オキソブタン−４，１−ジイル）］ビス（チアゾリジン−２−チオン）、ＡＢＩＡ−ＴＴ）を用いて開始される共重合によって、又はアゾビスイソブチロニトリル及び４−シアノ−４−チオベンゾイルスルファニルペンタン酸を用いて開始される制御されたラジカル重合（ＲＡＦＴ、可逆的連結−開裂連鎖移動）とそれに続く水素化ホウ素ナトリウム還元によって、実施された。
【００３６】
セミテレケリックコポリマーは、ＨＰＭＡ単位８５〜９９ｍｏｌ％、メタクリロイル化Ｂｏｃ保護アミノ酸ヒドラジド若しくはオリゴペプチド又はメタクリロイル化オリゴペプチドの単位１〜１５ｍｏｌ％を含み、反応鎖末端に連結薬物及び反応基を有することを特徴とする。担体及び結合体の合成においては、以下の反応基を有するセミテレケリックコポリマーを使用した：カルボキシル、カルボキシチアゾリジンチオン（ＴＴ）、第一級アミノ基、チオール及びピリジルジスルファニル（ＰＤＳ）。ポリマーの構造は、ポリマー、担体及び結合体の構造を示したスキームにおいて後述する。以下の記号を使用する：
（ｉ）メタクリロイル化アミノ酸ヒドラジドにおけるアミノ酸アシル、例えば、グリシル、βアラニル、６−アミノヘキサノイル（ＡＨ）、４−アミノベンゾイル、及び／又はオリゴペプチドＧｌｙＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ及びＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙから誘導される複合アシルに対してはＳＰ１、
（ｉｉ）好ましくは生分解性オリゴペプチド配列ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ及びＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ）を含む、酵素分解性オリゴペプチド配列から誘導されるメタクリロイル化アミノ酸アミド中の複合アシルに対してはＳＰ２、
（ｉｉｉ）メタクリロイルに対してはＭＡ、
（ｉｖ）２−アミノエチルに対してはＡＥ、
（ｖ）スルファニルプロパノイルに対してはＳＰ。
【００３７】
コポリマーのリスト
ポリマー１
ヒドラジド基がＢｏｃで保護されている（−ＣＯＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）、メタクリロイル化アミノ酸ヒドラジド又はオリゴペプチドヒドラジドとＨＭＰＡとのコポリマーであって、このコポリマーは、反応性Ｎ−スクシンイミジルエステル又はカルボキシル末端鎖基を含む（ポリマー１ａ）。このコポリマーは、連鎖移動剤（スルファニルプロパン酸、ＳＰＡ）の存在下で共重合によって調製された。第２ステップにおいては、ＳＰＡ（−ＣＯＯＨ）鎖末端基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣ反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換された。
【００３８】
【化４】
Ｂｏｃで保護されたヒドラジド基で終結された、メタクリロイル化アミノ酸又はオリゴペプチドとのＨＰＭＡコポリマーであって、このコポリマーは、反応性カルボニルチアゾリジン−２−チオン鎖末端基（ポリマー１ｂ）又はＮ−スクシンイミジルエステル鎖末端基（ポリマー１ｃ）を含む。
【００３９】
【化５】
Ｂｏｃ保護ヒドラジド基及び生分解性オリゴペプチド（例えば、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ、一般にＳＰ２）の鎖末端Ｎ−スクシンイミジルエステル基で終結された、メタクリロイル化アミノ酸又はオリゴペプチドとのＨＰＭＡコポリマー（ポリマー１ｄ）は、２ステップ合成によって調製された。第１ステップにおいては、ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕコポリマーのＮ−スクシンイミジルエステルは、オリゴペプチドＧＦＬＧのアミノ基と反応した。第２ステップにおいては、調製されたコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＣＯＯＨのカルボキシル鎖末端基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣ反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換された。
【００４０】
【化６】
アミド基に薬物が結合されたメタクリロイル化オリゴペプチドとＨＰＭＡとのコポリマーは、連鎖移動剤としてＳＰＡの存在下で実施されたＨＰＭＡのラジカル重合によって調製された。このコポリマーは、カルボキシル基又はＮ−スクシンイミジルエステルで終結する（ポリマー１ｅ）。このコポリマーは、連鎖移動剤ＳＰＡの存在下で共重合によって調製された。第２ステップにおいては、カルボキシル末端基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣ反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換された。
【００４１】
【化７】
カルボニルチアゾリジン−２−チオン末端基で終結された、アミド結合で結合された薬物を有するメタクリロイル化オリゴペプチドとＨＰＭＡのコポリマー（ポリマー１ｆ）は、ＡＢＩＡ−ＴＴを用いて開始される対応するモノマーのラジカル重合によって調製された。Ｎ−スクシンイミジルエステル基で終結されたコポリマーは、ＡＢＩＡ−ＴＴを用いて開始され、続いてカルボキシル鎖末端基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性化する類似の方法で調製された（ポリマー１ｇ）。
【００４２】
【化８】
生分解性オリゴペプチド（例えば、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ）（一般にＳＰ２）の鎖末端Ｎ−スクシンイミジルエステルを有する、アミドで結合された薬物を有するメタクリロイル化オリゴペプチドとＨＰＭＡとのコポリマー（ポリマー１ｈ）は、２ステップ合成によって調製された。第１ステップにおいては、コポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＳＰ２−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＯＳｕのスクシンイミジルエステルは、このオリゴペプチドのアミノ基と反応した。第２ステップにおいては、調製されたコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＳＰ２−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＣＯＯＨのカルボキシル鎖末端基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣ反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換された。
【００４３】
【化９】
ポリマー２
チオールで終結された主鎖を有する、ＨＰＭＡとメタクリロイル化アミノ酸又はヒドラジド基がＢｏｃで保護されたオリゴペプチドヒドラジドとの基本コポリマーは、ＨＰＭＡと関連コモノマーのＲＡＦＴ共重合とそれに続く水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元によって調製された（ポリマー２ｚ）。
【００４４】
【化１０】
チオール基で終結された主鎖を有する、ＨＰＭＡとメタクリロイル化アミノ酸又はヒドラジドがＮ−Ｂｏｃで保護されたオリゴペプチドヒドラジドとのＨＰＭＡコポリマーは、ポリマー１ａのスクシンイミジルエステルと２−（２−ピリジルジスルファニル）エチルアミン（ＰＤＥＡ）の反応とそれに続くジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いた還元によって調製された（ポリマー２ａ）。
【００４５】
【化１１】
チオール基で終結された主鎖を有する、ＨＰＭＡとメタクリロイル化アミノ酸又はヒドラジド基がＢｏｃで保護されたオリゴペプチドヒドラジドとのコポリマーは、ポリマー１ｂ及び１ｃの活性化鎖末端カルボキシル基とＰＤＥＡの反応とそれに続くＤＴＴを用いた還元によって調製された（ポリマー２ｂ）。
【００４６】
【化１２】
チオール基で終結された主鎖を有し、アミドで結合された薬物を有する、ＨＰＭＡとメタクリロイル化オリゴペプチドとのコポリマーは、ポリマー１ｅのスクシンイミジルエステル鎖末端基とＰＤＥＡとの反応とそれに続くＤＴＴを用いた還元によって調製された（ポリマー２ｃ）。
【００４７】
【化１３】
チオール基で終結された主鎖を有する、アミドで結合された薬物を有するＨＰＭＡとメタクリロイル化オリゴペプチドのコポリマーは、ポリマー１ｆ及びポリマー１ｇの活性化カルボキシル鎖末端基とＰＤＥＡの反応とそれに続くＤＴＴを用いた還元によって調製された（ポリマー２ｄ）。
【００４８】
【化１４】
デンドリマー
ゼロから第６世代の樹状構造をポリマー結合体における中心部として使用した。好ましくは、システアミン、エチレンジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、ヘキサン−１，６−ジアミン又はドデカン−１，１２−ジアミンコアユニットを有し、第一級アミノ基を末端基として有する、ＰＡＭＡＭデンドリマー（スキーム１１）
【００４９】
【化１５】
又は
ヒドロキシ末端基を有する２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸（ＢＰＡ）に基づくデンドリマーを使用した（スキーム１２）。
【００５０】
【化１６】
一部の生分解性ポリマー担体及び結合体の合成においては、ＰＡＭＡＭ又はＢＰＡデンドリマーのアミノ基又はヒドロキシ基は、セミテレケリックポリマーとの反応前に末端ピリジルジスルファニル（ＰＤＳ）基に転換された（スキーム１３）。アミノ基含有デンドリマーにおいては、アミノ基は、リソソーム酵素を用いて切断可能なオリゴペプチドＳＰ２で修飾された（スキーム１４）。ピリジルジスルファニル基は、アミノ基とＮ−スクシンイミジル［３−（２−ピリジルジスルファニル）］プロパノエート（ＳＰＤＰ）のスクシンイミジル基との反応によって、又はＤＣＣ法を使用してヒドロキシ基と３−（２−ピリジルジスルファニル）］プロピオン酸との反応によって、導入された。このオリゴペプチドは、ＤＣＣ法を使用して、デンドリマーのアミノ基又はヒドロキシ基とＦｍｏｃで保護されたオリゴペプチドとの反応によって導入された。
【００５１】
【化１７】
【００５２】
【化１８】
【００５３】
以下、ポリマー担体は、薬物が連結していない、樹状構造を含むＨＭＷポリマーである。したがって、ポリマー結合体は、薬物が連結したポリマー担体である。薬物、好ましくはドキソルビシンは、Ｂｏｃ保護基を除去後、ヒドラゾン結合を介して担体に連結する。担体へのＤｏｘの連結は、メタノール中で酢酸の存在下で実施される。アミドで結合されたドキソルビシンの場合、ポリマー結合体は、Ｄｏｘを有するセミテレケリックコポリマーと対応するデンドリマーとの反応によって調製される。
【００５４】
結合体構造、及びポリマー構造の分解機序に起因して、本発明によるポリマー結合体は、４つの基本グループに分けられる。
【００５５】
結合体１
結合体１は、薬物を有するポリマー鎖が還元分解性ジスルフィド結合を介して連結した中心ＰＡＭＡＭ樹状構造からなる。この薬物は、ポリマー鎖にヒドラゾン又はアミド結合によって連結する（スキーム１５参照）。
【００５６】
【化１９】
【００５７】
結合体２
結合体２は、薬物を有するポリマー鎖が還元分解性ジスルフィド結合を介して結合した中心ＢＰＡ樹状構造からなる。この薬物は、ポリマー鎖にヒドラゾン又はアミド結合によって連結する（スキーム１６参照）。
【００５８】
【化２０】
【００５９】
結合体３
結合体３は、薬物を有するポリマー鎖が酵素分解性オリゴペプチドを介して結合した中心ＰＡＭＡＭ樹状構造からなる。この薬物は、ポリマー鎖にヒドラゾン又はアミド結合によって連結する（スキーム１７参照）
【００６０】
【化２１】
【００６１】
結合体４
結合体４は、薬物を有するポリマー鎖が酵素分解性オリゴペプチドを介して結合した中心ＢＰＡ樹状構造からなる。この薬物は、ポリマー鎖にヒドラゾン又はアミド結合によって連結する（スキーム１８参照）。
【００６２】
【化２２】
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、（細胞内媒体を模した）ｐＨ５の緩衝液中でインキュベートされたｐＨ５における樹状ポリマー結合体１及び２並びに線状ポリマー結合体３（Ｄｏｘはヒドラゾン結合を介して結合している）から放出されたＤｏｘの時間依存を示す。
【図２】図２は、（血流を模した）ｐＨ７．４の緩衝液中でインキュベートされたｐＨ７．４における樹状ポリマー結合体１及び２並びに線状ポリマー結合体３（Ｄｏｘはヒドラゾン結合を介して結合している）から放出されたＤｏｘの時間依存を示す。
【図３】図３は、グルタチオン（ｃ＝３．１０−３ｍｏｌ／ｌ）を含むリン酸緩衝液中でインキュベートされたポリマー結合体１の分子量の時間依存を示す。
【図４】図４は、カテプシンＢ（ｃ＝５．１０−７ｍｏｌ／ｌ）を含むリン酸緩衝液中でインキュベーション中のポリマー結合体３の分子量の時間依存を示す。
【図５】図５は、ヒドラゾンで結合されたドキソルビシンを有するＫ−１ ＨＹＤ、アミド結合で結合されたドキソルビシンを有するＫ−１ ＡＭ、並びに線状ポリマー結合体ＬＩＮ ＨＹＤ及びＬＩＮ ＡＭの投与後の腫瘍増殖を示す。
【図６】図６は、ヒドラゾン結合で結合されたドキソルビシンを有するＫ−１ ＨＹＤ、アミド結合で結合されたドキソルビシンを有するＫ−１ ＡＭ、並びに線状ポリマー結合体ＬＩＮ ＨＹＤ及びＬＩＮ ＡＭの投与後のＥＬ４腫瘍を有するマウスの生存を示す。
【図７】図７は、ポリマー結合体を用いて治癒され（図５及び６参照）、致死量の最初の腫瘍細胞（マウスＴ細胞リンパ腫ＥＬ４、１×１０５細胞）が再移植されたマウスの生存を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
発明を実施する例
結合体の合成及び諸性質の例
中間体及びドキソルビシン−ポリマー結合体の合成例
【実施例１】
【００６５】
（連鎖移動剤ＳＰＡを使用した）セミテレケリックポリマー前駆体の合成
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕ（ポリマー１ａ）
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕを、アセトン中で５０℃で開始剤２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ）及び連鎖移動剤ＳＰＡの存在下でＨＰＭＡとＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃとの沈殿ラジカル共重合によって調製した。ある場合には、第２ステップにおいて、既報（Ｅｔｒｙｃｈ、ＣＺ特許２９８９４５Ｂ６）のように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣとの反応によってカルボキシ末端基をＮ−スクシンイミジルエステルに転換した。
【実施例２】
【００６６】
セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＴＴ（ポリマー１ｂ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＴＴを、ＤＭＳＯ中で６０℃でＡＢＩＡ−ＴＴを用いて開始された（Ｅｔｒｙｃｈ、ＣＺ特許２９８９４５Ｂ６）ＨＰＭＡとＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃとの溶液ラジカル共重合によって調製した。
【実施例３】
【００６７】
セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＯＳｕ（ポリマー１ｃ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕを、エタノール中５０℃における開始剤ＡＢＩＡの存在下でのＨＰＭＡとＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃとの溶液ラジカル共重合とそれに続くＮ−スクシンイミジルエステルへの転換によるカルボキシ鎖末端基の活性化（Ｅｔｒｙｃｈ、ＣＺ特許２９８９４５Ｂ６）によって調製した。
【実施例４】
【００６８】
セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕ（ポリマー１ｄ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕを２ステップ合成によって調製した。第１ステップにおいては、コポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＯＳｕのＮ−スクシンイミジルエステルは、オリゴペプチドＧＦＬＧのアミノ基と反応した。ある場合には、調製されたコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＣＯＯＨのカルボキシ末端基を、第２ステップにおいて、既報（Ｅｔｒｙｃｈ、ＣＺ特許２９８９４５Ｂ６）のように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣとの反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換した。
【実施例５】
【００６９】
（ＳＰＡによる連鎖移動を含む）セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＯＳｕ（ポリマー１ｅ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＯＳｕを、アセトン中で５０℃で開始剤ＡＩＢＮ及び連鎖移動剤ＳＰＡの存在下でＨＰＭＡとＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘとの沈殿ラジカル共重合によって調製した。カルボキシ鎖末端基を、第２ステップにおいて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣとの反応によってＮ−スクシンイミジルエステル基に転換した。［Ｕｌｂｒｉｃｈ ２０００］。
【実施例６】
【００７０】
セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＴＴ（ポリマー１ｆ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＴＴを、ＤＭＳＯ中で６０℃でＡＢＩＡ−ＴＴを用いて開始されたＨＰＭＡとＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘの溶液ラジカル共重合によって調製した。
【００７１】
２２０ｍｇ（１．５４ｍｍｏｌ）ＨＰＭＡ、２５ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＤｏｘをＤＭＳＯ１．７ｍｌに溶解させ、その溶液を重合アンプルに移した。重合アンプル中、ＡＢＩＡ−ＴＴ８４ｍｇ（０．１７０ｍｍｏｌ）（４ｗｔ％）であった。窒素をアンプル中の溶液を通して１５分間バブリングさせ、アンプルを密封し、サーモスタット中に６０℃で置いた。開始剤は６０℃で３分後に溶解した。６時間後、反応混合物が５０ｍｌのアセトン−ジエチルエーテル２：１中に沈殿した。コポリマーをメタノール３ｍｌに溶解させ、同じ混合溶媒５０ｍｌ中に再度沈殿させた。沈殿したコポリマーをろ別し、恒量まで乾燥させた。
【実施例７】
【００７２】
セミテレケリックポリマー前駆体ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕ（ポリマー１ｈ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕを、ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕの調製（実施例４）において記述した２ステップ合成によって調製した。第１ステップにおいては、コポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＯＳｕのＮ−スクシンイミジルエステルは、オリゴペプチドＧＦＬＧのアミノ基と反応した。コポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＯＳｕのカルボキシ末端とオリゴペプチドＧＦＬＧのアミノ基。第２ステップにおいては、調製したコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＣＯＯＨのカルボキシル鎖末端基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／ＤＣＣとの反応によってＮ−スクシンイミジルエステルに転換した。
【実施例８】
【００７３】
セミテレケリックポリマー前駆体−ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＡＥ−ＳＨ（ポリマー２ａ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＡＥ−ＳＨを、ＤＭＳＯ中でのコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕと二官能性試薬２−（２−ピリジルジスルファニル）エチルアミン（ＰＤＥＡ）のポリマー類似反応とそれに続く０．５Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いた還元によって調製した。
【００７４】
ＰＤＥＡ．ＨＣｌ ８ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ ０．５ｍｌに溶解させ、激しく撹拌しながらエチル（ジイソプロピル）アミン６μｌ（０．０３６ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、ＤＭＳＯ ４ｍｌ中のポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＯＳｕ ３００ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌ ＴＴ基）の溶液を室温で激しく撹拌しながら添加した。２時間後、反応混合物をメタノールで１５ｍｌに希釈し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０充填カラムでのゲルクロマトグラフィー（メタノール、ＲＩ検出）によって低分子量不純物を除去することによってコポリマーを精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって６ｍｌに濃縮し、このコポリマーを８０ｍｌのアセトン−ジエチルエーテル３：１中に沈殿させて単離した。次のステップにおいては、ＰＤＳ基を有するポリマー３００ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝液５ｍｌに溶解させ、蒸留水０．４ｍｌ中のＤＴＴ １８．５ｍｇの溶液を添加した。１時間後、水溶液中でのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５充填カラムでのゲルろ過によって低分子量不純物を除去することによってこのポリマーを精製した。このポリマーを凍結乾燥によって単離し、アルゴン下で−１８℃で貯蔵した。
【実施例９】
【００７５】
セミテレケリックポリマー前駆体−ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＡＥ−ＳＨ（ポリマー２ｂ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＡＥ−ＳＨを、実施例８に記載の手順によって、ＤＭＳＯ中でのコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＯＳｕ又はポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＴＴと二官能性試薬ＰＤＥＡとのポリマー類似反応とそれに続く０．５Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のＤＴＴを用いた還元によって調製した。
【実施例１０】
【００７６】
セミテレケリックポリマー前駆体−ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＡＥ−ＳＨ（ポリマー２ｃ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＡＥ−ＳＰＫ−ＳＨを、実施例８に記載の手順によって、ＤＭＳＯ中でのコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＯＳｕと二官能性試薬ＰＤＥＡのポリマー類似反応とそれに続く０．５Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のＤＴＴを用いた還元によって調製した。
【実施例１１】
【００７７】
セミテレケリックポリマー前駆体−ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＡＥ−ＳＨ（ポリマー２ｄ）の合成
セミテレケリックコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＡＥ−ＳＨを、実施例８に記載の手順によって、ＤＭＳＯ中でのコポリマーポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＯＳｕ又はポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＴＴと二官能性試薬ＰＤＥＡのポリマー類似反応とそれに続く０．５Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中のＤＴＴを用いた還元によって調製した。
【実施例１２】
【００７８】
ＰＤＳ基を有するデンドリマーの合成
ピリジルジスルファニル基を含むＰＡＭＡＭ又はＢＰＡデンドリマー（デンドリマー−ＰＤＳ）を、デンドリマーのアミノ基又はヒドロキシ基と、Ｎ−スクシンイミジル［３−（２−ピリジルジスルファニル）］プロパノエート（ＳＰＤＰ）のスクシンイミジル基、又はＤＣＣ法を使用して３−（２−ピリジルジスルファニル）プロパン酸のカルボキシル基との反応によって調製した。第二世代ＰＡＭＡＭデンドリマー５ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌアミノ基）をメタノール０．５ｍｌに溶解させ、メタノール０．５ｍｌ中のＳＰＤＰ ２３ｍｇ（０．０７１ｍｍｏｌ）の溶液を一定撹拌下で添加した。２時間後、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０充填カラムでのゲルクロマトグラフィー（ＲＩ検出）によって低分子量不純物を除去することによって修飾デンドリマーを精製した。デンドリマーを含む画分を回転式減圧エバポレータで１ｍｌに濃縮し、このデンドリマーを凍結乾燥によってメタノール−水 １：３混合物から単離した。
【実施例１３】
【００７９】
オリゴペプチドが連結したデンドリマーの合成
アミノ末端基を含むオリゴペプチドが連結したＰＡＭＡＭ又はＢＰＡデンドリマー（デンドリマー−ＳＰ２）を、縮合試薬ＤＣＣの存在下でデンドリマーのアミノ基又はヒドロキシ基とＮ−Ｆｍｏｃで保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基との反応によって調製した。
【００８０】
Ｎ−Ｆｍｏｃで保護されたオリゴペプチドＧＦＬＧ ４０ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ０．９ｍｌに溶解させ、−１８℃に冷却後、ＤＭＦ ０．１ｍｌ中のＤＣＣ １３．５ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。３０分後、ＤＭＦ０．５ｍｌ中の第２世代デンドリマーＢＰＡ １０ｍｇ（０．０５２ｍｍｏｌヒドロキシ基）の溶液を冷却した反応混合物に添加した。混合物を４℃で９０分間及び室温で更に２時間撹拌した。次いで、反応混合物をメタノールで５ｍｌに希釈し、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０充填カラムでのゲルクロマトグラフィー（ＲＩ検出）によって低分子量不純物を除去することによって修飾デンドリマーを精製した。デンドリマーを含む画分を回転式減圧エバポレータによって１ｍｌに濃縮し、デンドリマーをジエチルエーテル中に沈殿させて単離した。Ｆｍｏｃで保護されたアミノ基をＤＭＦ中の２５％ピペリジン溶液で脱保護して、修飾デンドリマー上の遊離アミノ基を得た。
【実施例１４】
【００８１】
ポリマー結合体１及び２の合成
薬物がオリゴペプチド配列末端にアミド結合によって結合したポリマー結合体１又は２を、修飾ＰＡＭＡＭ又はＢＰＡデンドリマーのＰＤＳ基とポリマー２ｃ又は２ｄのチオール基との反応によって調製した。
【００８２】
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＡＥ−ＳＨ １５０ｍｇ（０．０１０ｍｍｏｌ ＳＨ基）を０．１Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む０．５Ｍリン酸緩衝液３ｍｌ（ｐＨ７．４）に溶解させ、その溶液をメタノール１ｍｌ中のデンドリマー−ＰＤＳ（０．０１３ｍｍｏｌ ＰＤＳ基）の撹拌溶液に実験室温度で添加されたメタノール１ｍｌ中のデンドリマー−ＰＤＳ ６．５ｍｇ（０．０１３ｍｍｏｌ ＰＤＳ基）の撹拌溶液に添加した。室温で４時間反応後、その溶液をメタノール１０ｍｌに希釈し、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０でのゲルクロマトグラフィーによって低分子量不純物を除去することによってポリマー結合体を精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって２ｍｌに濃縮し、コポリマーを酢酸エチル３０ｍｌ中に沈殿させて単離した。生成物を恒量まで乾燥させた。
【００８３】
ヒドラゾンで結合された薬物を有するポリマー結合体１又は２を、デンドリマー−ＰＤＳのＰＤＳ基とポリマー２ａ又は２ｂのＳＨ基との反応とそれに続くトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用したヒドラジド基の脱保護及びメタノール中で酢酸触媒下でのＤｏｘ結合によって調製した。
【００８４】
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＡＥ−ＳＨ ２００ｍｇ（０．０１４ｍｍｏｌ ＳＨ基）を０．５Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４）４ｍｌに溶解させ、その溶液を室温でメタノール１．５ｍｌ中のデンドリマー−ＰＤＳ ８．５ｍｇ（ＰＤＳ基０．０１７ｍｍｏｌ）撹拌溶液に添加した。室温で４時間反応後、溶液をメタノールで１３ｍｌに希釈し、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムでのゲルクロマトグラフィーによって低分子量不純物を除去することによってポリマー担体を精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって２ｍｌに濃縮し、コポリマーを酢酸エチル３０ｍｌ中に沈殿させて単離した。生成物を恒量まで乾燥させた。Ｂｏｃで保護されたポリマー担体の脱保護においては、この担体１９０ｍｇをＴＦＡ−トリイソプロピルシラン−水９５：２．５：２５混合物５ｍｌに溶解させた。１５分後、この混合物を小さい結晶が沈殿するまで水ポンプ減圧下でメタノール（５倍過剰）と一緒にエバポレータによって繰り返し蒸発させた。生成物を水に溶解させ、その溶液のｐＨをｐＨ７〜８に調節した。蒸留水中でＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムでのゲルクロマトグラフィー（ＲＩ検出）によって低分子量不純物を除去することによってポリマー担体を精製した。このポリマーをＬｙｏｖａｃ ＧＴ−２装置中で凍結乾燥によってポリマー画分から単離した。Ｄｏｘを結合させるために、ポリマー担体１８０ｍｇをメタノール２ｍｌに溶解させ、溶液をサーモスタットセルに移した。サーモスタットセル中、Ｄｏｘ．ＨＣｌ２０ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）であった。得られた不均一懸濁液を暗所で２５℃で撹拌し、１分後、酢酸１００μｌを添加した。反応中、懸濁液は順次溶解し、２３時間の反応後、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムでのゲルクロマトグラフィーによって低分子量不純物及び遊離薬物を除去することによってポリマー生成物を精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって３ｍｌに濃縮した。ポリマー結合体を酢酸エチル３０ｍｌに沈殿させて単離した。生成物を恒量まで乾燥させた。
【実施例１５】
【００８５】
ポリマー結合体３及び４の合成
オリゴペプチドによってアミド基を介して結合した薬物を含むポリマー結合体３又は４を、アミノ修飾ＰＡＭＡＭ若しくはＢＰＡデンドリマー−ＧＦＬＧ−ＮＨ２とポリマー１ｅ、１ｆ若しくは１ｇのＴＴ基若しくはＯＳｕ基との反応によって、又はポリマー１ｈ（ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕ）のスクシンイミジル基若しくはカルボキシル基とこのデンドリマーのアミノ基若しくはヒドロキシ基との反応によって調製した。
【００８６】
ポリマー１ｆ １００ｍｇ（０．００６ｍｍｏｌ ＯＳｕ基）をＤＭＳＯ ２ｍｌに溶解させ、その溶液をメタノール１ｍｌ中のデンドリマー１．９ｍｇ（０．００９ｍｍｏｌ ＧＦＬＧ−ＮＨ２基）撹拌溶液に実験室温度で添加した。実験室温度で２時間反応後、その溶液をメタノールで８ｍｌに希釈し、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムでのゲルクロマトグラフィーによって低分子量不純物を除去することによってポリマー結合体を精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって２ｍｌに濃縮し、コポリマー結合体を酢酸エチル３０ｍｌ中に沈殿させて単離した。生成物を恒量まで乾燥させた。
【００８７】
ヒドラゾンで結合された薬物を有するポリマー結合体３又は４を、修飾ＰＡＭＡＭ若しくはＢＰＡデンドリマー−ＧＦＬＧ−ＮＨ２のアミノ基とポリマー１ａ、１ｂ若しくは１ｃのＴＴ基若しくはＯＳｕ基との反応によって、又はポリマー１ｄポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＳＰＡ−ＧＦＬＧ−ＯＳｕのスクシンイミジル基若しくはある場合にはカルボキシル基とデンドリマーのアミノ基若しくはヒドロキシ基との反応とそれに続くトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用したヒドラジド基の脱保護及びメタノール中で酢酸触媒下でのＤｏｘの連結によって調製した。
【００８８】
ポリ（ＨＰＭＡ−ｃｏ−ＭＡ−ＡＨ−ＮＨＮＨ−Ｂｏｃ）−ＧＦＬＧ−ＯＳｕ １２０ｍｇ（０．００８ｍｍｏｌ ＯＳｕ基）をＤＭＳＯ ２ｍｌに溶解させ、その溶液をメタノール１ｍｌ中のデンドリマー２．２ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ ＮＨ２基）撹拌溶液に実験室温度で添加した。実験室温度で２時間反応後、この溶液をメタノールで９ｍｌに希釈し、メタノール中でＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムでのゲルクロマトグラフィーによって低分子量不純物を除去することによってポリマー担体を精製した。ポリマー画分を回転式減圧エバポレータによって２ｍｌに濃縮し、コポリマー担体を酢酸エチル３０ｍｌ中に沈殿させて単離した。生成物を恒量まで乾燥させた。
【００８９】
Ｂｏｃ保護基の除去及びヒドラゾン結合による薬物の連結を実施例１４に記載の手順によって実施した。
【実施例１６】
【００９０】
ポリマー結合体からのドキソルビシンの放出
ポリマー結合体から放出されたドキソルビシンの量を、細胞内媒体を模したｐＨ５．０の０．１Ｍリン酸緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＣｌ）中及び血流媒体を模したｐＨ７．４のリン酸緩衝液中でのそれらのインキュベーション後に測定した。インキュベーション溶液中の放出されたＤｏｘをＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）によって決定した。所定時間間隔で溶液試料５０μｌを抜き取り、ＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ｘｌカラムによってｐＨ６．５のメタノール−アセテート（８０：２０ｖｏｌ％）緩衝液からなる移動相のイソクラチック流量０．５ｍｌ／ｍｉｎで分析した。Ｄｏｘ量を遊離及び結合のＤｏｘのピーク面積から計算した（４８８ｎｍにおけるＵＶ−ＶＩＳ検出）。３７℃の生理的媒体（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中の（濃度５ｍｇ／ｍｌの）結合体溶液のインキュベーション後は、わずかに少量の薬物しか放出されない（最高７％／２４時間、図２）。それに対して、ｐＨ５．０における弱酸性の媒体中のポリマー結合体からのＤｏｘ放出速度、したがって細胞毒の活性化速度はかなり大きい（図１）。ｐＨ７．４及びｐＨ５におけるグラフトポリマー結合体からの放出速度は、線状コポリマー又はグラフトコポリマーから調製されたヒドラゾン結合体で見られる放出速度［Ｅｔｒｙｃｈ ２００８］に十分匹敵する。
【実施例１７】
【００９１】
グルタチオンを使用した、生物体から排出することができる分解生成物への、アミド結合で結合された薬物を有するポリマー結合体１の分解
０．１Ｍリン酸緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６）中で還元剤としてグルタチオンの存在下で、すなわち細胞（細胞質、エンドソーム及び二次リソソーム）を模した媒体中で、ポリマー結合体の分解を試験した。ポリマー結合体をリン酸緩衝液に濃度２０ｍｇ／ｍｌで溶解させた。溶液をサーモスタット（３７℃）中に置く直前に、インキュベーション媒体中の得られるグルタチオン濃度が３．１０−３ｍｏｌ／ｌであるようにグルタチオンストック液を添加した。インキュベーション溶液のアリコート試料（２００μｌ）を所定時間間隔で抜き取り、ＰＤ−１０カラムによって脱塩し、凍結乾燥させた。分解生成物の分子量を屈折計（Ｏｐｔｉｌａｂ Ｒｅｘ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）及び多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ ＥＯＳ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を備えた液体クロマトグラフＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＤによって測定した。分析をＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６カラム（３００×１０ｍｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって実施した。移動相として、流量０．５ｍｌ／ｍｉｎの０．３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．５ｇ／ｌＮａＮ３）を使用した。コポリマーの分子量及び多分散性をＡｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）によって計算した。
【００９２】
細胞質濃度のグルタチオン（３．１０−３ｍｏｌ／ｌ）を含む溶液中のジスルフィド架橋を有する結合体（結合体１）は急速に分解する。グルタチオンと一緒に２４時間インキュベーション後、分子量が腎臓ろ過限界（約２５０００ｇ／ｍｏｌ）未満のポリマー分解生成物が見られた（図３）。
【実施例１８】
【００９３】
生物体から排出することができる分解生成物への、ヒドラゾン結合で結合された薬物を有するポリマー結合体３のカテプシンＢによる分解
リソソーム酵素カテプシンＢを含む、したがって腫瘍細胞中の二次リソソームの媒体を模した、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ、ｐＨ６．０、５ｍＭグルタチオン、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中でポリマー結合体の分解を基質濃度５０ｍｇ／ｍｌで試験した。ポリマー結合体をリン酸緩衝液に濃度１０ｍｇ／ｍｌで溶解させ、（３７℃で）サーモスタット中に配置する直前に、その得られる濃度が５．１０−７ＭであるようにカテプシンＢのストック液を添加した。インキュベーション溶液の試料（２００μｌ）を所定時間間隔で抜き取り、ＰＤ−１０カラムによって脱塩し、凍結乾燥させた。分解生成物の分子量を上記と同様に測定した。ＧＦＬＧオリゴペプチドスペーサーを含む結合体（結合体３）は、カテプシンＢの溶液（５．１０−７ｍｏｌ／ｌ）中で徐々に分解した。カテプシンＢと一緒に４８時間インキュベーション後、分子量が腎臓ろ過限界（約４００００ｇ／ｍｏｌ）未満のポリマー分解生成物が見られた（図４）。
【００９４】
生物活性の例では、ポリマー結合体に対して以下のコードを定義する。
【００９５】
Ｋ−１ ＡＭ−アミド結合で結合された薬物を有する樹状ポリマー結合体１
Ｍｗ＝２４８０００、Ｉｎ＝１．９、Ｒｈ＝１５．６ｎｍ
Ｋ−１ ＨＹＤ−ヒドラゾン結合で結合された薬物を有する樹状ポリマー結合体１
Ｍｗ＝１９９０００、Ｉｎ＝２．１、Ｒｈ＝１４．２ｎｍ
ＬＩＮ ＡＭ−アミド結合で結合された薬物を有する線状ポリマー結合体
Ｍｗ＝４５０００、Ｉｎ＝１．８５、Ｒｈ＝５．２ｎｍ
ＬＩＮ ＨＹＤ−ヒドラゾン結合で結合された薬物を有する線状ポリマー結合体
Ｍｗ＝３６０００、Ｉｎ＝１．８７、Ｒｈ＝４．５ｎｍ。
【実施例１９】
【００９６】
種々の腫瘍株の細胞と一緒にインキュベートされたドキソルビシンの樹状結合体及びグラフト結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性（細胞傷害性、ＩＣ５０）の例（［３Ｈ］チミジン取り込み方法を使用した）
【００９７】
【表１】
試験ポリマーの阻害活性を決定するために、マウス起源及びヒト起源の以下の永久腫瘍株を選択した：マウスＴ細胞リンパ腫ＥＬ４、マウスＢ細胞リンパ腫３８Ｃ１３、マウス黒色腫Ｂ１６、マウスＢ細胞白血病ＢＣＬ１、ヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｊｉ、ヒトＴ細胞白血病Ｊｕｒｋａｔ、マウス線維芽細胞腫３Ｔ３、ヒト有棘細胞癌腫ＦａＤｕ及びマウス乳癌腫４Ｔ１。抗増殖活性を［３Ｈ］チミジンの取り込みによって測定した。
【００９８】
表１から、全試験株において最も明白な阻害活性は、両方のヒドラゾン結合で結合されたドキソルビシンポリマー結合体（Ｋ−１ ＨＹＤ及びＬＩＮ ＨＹＤ）で示されることになる。アミド結合で結合されたドキソルビシンとの結合体は、かなり低い活性を示す。高分子量ポリマー結合体Ｋ−１ ＨＹＤ及びＫ−１ ＡＭは、薬物が同様に結合した線状結合体よりもわずかに高い抗増殖活性を示す。その差は大きくなく、高分子量ポリマー結合体は、その低分子量線状類似体とほぼ同じ抗増殖活性を示すと言うことができる。
【実施例２０】
【００９９】
Ｔ細胞リンパ腫ＥＬ４を皮下移植した近交系マウスＣ５７ＢＬ／６における樹状ポリマー−ドキソルビシン結合体のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性の例
Ｔ細胞リンパ腫ＥＬ４を皮下移植した近交系マウスＣ５７ＢＬ／６をｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用した。静脈内（ｉ．ｖ．）投与された用量は、１×１５ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇ及び１０ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇであった。有効な対照として、ＥＬ４腫瘍を有するマウス群を使用し、ドキソルビシンのみ（８日目及び１５日目に２×５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処置した。基本対照は、ＥＬ４腫瘍を有する無処置マウスであった。ドキソルビシンがヒドラゾンで結合されたＫ−１ ＨＹＤ、ドキソルビシンがアミドで結合されたＫ−１ ＡＭ、並びに線状ポリマー結合体ＬＩＮ ＨＹＤ及びＬＩＮ ＡＭを投与した後の腫瘍増殖を図５に示す。
【０１００】
図５及び６から、用量１５ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇの両方の樹状ＨＭＷポリマー結合体（Ｋ−１ ＨＹＤ及びＫ−１ ＡＭ）の試料は非常に効率が高いことが明らかである。活動的な腫瘍増殖期間に投与された単一用量の薬物は、実験腫瘍ＥＬ４を有するマウスの１００％を治癒させることができる。ＨＭＷポリマー結合体の効率は、薬物が同様に結合した線状結合体の効率よりもかなり高い。これらの線状結合体では、実験腫瘍を有するマウスの３７％（ＬＩＮ ＨＹＤ）又は２５％（ＬＩＮ ＡＭ）が治癒した。１０ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇの用量では、ドキソルビシンがヒドラゾン結合で結合されたＫ−１ ＨＹＤは、活動的な腫瘍増殖期間に投与された単一用量によってやはり１００％のマウスが治癒したので、常に活性が高いことがわかった。ドキソルビシンがアミド結合で結合されたポリマー結合体Ｋ−１ ＡＭは、それよりも低活性であるが、それでも単一の低用量によって実験腫瘍を有するマウスの６０％超が治癒する。
【０１０１】
図７は、ポリマー結合体（図５及び６参照）を用いて治癒したマウス、及び致死量の最初の腫瘍（１×１０５マウスＴ細胞リンパ腫ＥＬ４）を再移植したマウスの生存を示す。マウスは処置されなかった。図７の結果から、ポリマー結合体で処置したマウスにおいては、抗腫瘍抵抗性が治療中に発現したことが明らかである。これは、ヒドラゾンで結合されたドキソルビシン（用量１０ｍｇ及び１５ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇ）を含むＫ−１ ＨＹＤ及びアミド結合で結合されたドキソルビシン（１０ｍｇ Ｄｏｘ当量／ｋｇ）を含むＫ−１ ＡＭで治癒したマウスの３０〜４０％で生じた。この結果は、本発明による新規に調製されたポリマー薬物が２つの効果、すなわち、大多数の腫瘍細胞を直接殺傷する細胞分裂阻害効果、及び処置中に免疫系を刺激して抗腫瘍抵抗性を誘発する免疫調節効果を示すことを意味する。以前に処置した動物に致死量の腫瘍細胞を再移植した後に得られた結果は、本発明によるポリマー結合体を使用した療法が、腫瘍の除去だけでなく、癌の二次的な／転移性の発生又はその再発に対して治癒動物を防御するということの実験的証拠である。
【０１０２】
【表２−１】
【０１０３】
【表２−２】
【０１０４】
【表２−３】
【０１０５】
【表２−４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミドアミン−及び２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸単位からなる群から選択されるゼロから第６世代のデンドリマーの中心樹状部分からなることを特徴とする、樹状高分子量ポリマー薬物担体であって、そのアミノ末端基又はヒドロキシ末端基にＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）のセミテレケリックコポリマーがアミド結合又はエステル結合及び生分解性スペーサーを介してグラフトされた、ポリマー薬物担体。
【請求項２】
中心アミドアミンデンドリマーからなることを特徴とする、請求項１に記載のポリマー薬物担体であって、そのアミノ基にセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーがグラフトされており、該セミテレケリックＨＰＭＡコポリマーは、アミド結合と、構造Ｉに示されるジスルフィド結合によって形成された生分解性スペーサー又は構造ＩＩに示されるオリゴペプチド配列ＳＰ２によって形成された生分解性スペーサーとを介してポリマー鎖末端で該デンドリマーに連結している、ポリマー薬物担体。
【化２３】
【化２４】
【請求項３】
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸に基づく中心デンドリマーからなることを特徴とする、請求項１に記載のポリマー担体であって、そのヒドロキシ基にセミテレケリックＨＰＭＡコポリマー鎖がグラフトされており、該セミテレケリックＨＰＭＡコポリマー鎖は、鎖末端エステル結合と、構造ＩＩＩに示されるジスルフィド結合を含む生分解性スペーサー又は構造ＩＶに示されるオリゴペプチド配列ＳＰ２とによって、該デンドリマーに連結している、ポリマー担体。
【化２５】
【化２６】
【請求項４】
その中心部がアミノ基、ピリジルジスルファニル基及びカルボキシル基からなる群から選択される４〜２５６個の末端基を含むゼロから第６世代のアミドアミンデンドリマーによって形成されたことを特徴とする、請求項１及び２に記載のポリマー担体であって、そのコアユニットが好ましくはシステアミン、エチレンジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、ヘキサン−１，６−ジアミン又はドデカン−１，１２−ジアミンによって形成された、ポリマー担体。
【請求項５】
その中心部がヒドロキシ基、ピリジルジスルファニル基及びカルボキシル基を含む群から選択される８〜２５６個の末端基を含むゼロから第６世代の２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸デンドリマーによって形成されることを特徴とする、請求項１及び３に記載のポリマー担体。
【請求項６】
２〜２８個のグラフトが、アミノアシルＳＰ１のメタクリロイル化ヒドラジドのモノマー単位０．５〜８ｍｏｌ％を含むＨＰＭＡコポリマーによって形成されることを特徴とする、請求項１から５に記載のポリマー担体であって、前記アミノアシルが、好ましくは、グリシル、βアラニル、６−アミノヘキサノイル（ＡＨ）、４−アミノベンゾイル、及び／又はオリゴペプチドＧｌｙＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ及びＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙから誘導される混合アシルの群から選択される、ポリマー担体。
【請求項７】
前記ポリマーグラフトが前記中心樹状ポリ（アミドアミン）又は２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸にジスルフィド基又は生分解性オリゴペプチドＳＰ２を含む生分解性スペーサーによって連結することを特徴とする、請求項１から５に記載のポリマー担体。
【請求項８】
前記オリゴペプチドＳＰ２が、好ましくは、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ及びＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙを含めたオリゴペプチドの群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載のポリマー担体。
【請求項９】
請求項１から８に記載のポリマー担体と、共有結合した薬物、好ましくは抗癌剤とからなることを特徴とする、ポリマー結合体。
【請求項１０】
請求項１から８に記載のポリマー担体と、抗癌剤、好ましくはドキソルビシンとからなることを特徴とする、請求項９に記載のポリマー結合体。
【請求項１１】
ドキソルビシンが、加水分解的に切断可能なヒドラゾン結合によって前記担体に連結していることを特徴とする、請求項１０に記載のポリマー結合体。
【請求項１２】
請求項１、２、３、４、５、７及び８に記載のポリマー担体と、アミド結合で結合された薬物とからなることを特徴とする、請求項１０に記載のポリマー結合体であって、２〜２８個のポリマーグラフトが、メタクリロイル化オリゴペプチドＳＰ２のモノマー単位０．５〜８ｍｏｌ％を含むＨＰＭＡコポリマーによって形成され、ドキソルビシンが該オリゴペプチドの末端にアミド結合を介して連結しており、前記オリゴペプチドが、好ましくは、オリゴペプチドＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ及びＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙからなる群から選択される、ポリマー結合体。
【請求項１３】
かかる樹状系の分子量が好ましくは４００００から１４０００００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、ｖポリマー鎖と生成樹状結合体の両方におけるドキソルビシン含有量が１ｗｔ％と２５ｗｔ％との間（ポリマーに対して０．３〜８ｍｏｌ％）の範囲であることを特徴とする、請求項９から１２に記載のポリマー結合体。
【請求項１４】
腫瘍処置に使用するための、請求項９から１２のいずれかに記載の物質を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項１５】
固形腫瘍処置に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
幾つかのタイプのリンパ腫及び白血病の処置に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１】
アミドアミン−及び２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸単位からなる群から選択されるゼロから第６世代のデンドリマーの中心樹状部分からなることを特徴とする、樹状高分子量ポリマー薬物担体であって、そのアミノ末端基又はヒドロキシ末端基にＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）のセミテレケリックコポリマーがアミド結合又はエステル結合及び生分解性スペーサーを介してグラフトされた、ポリマー薬物担体。
【請求項２】
中心アミドアミンデンドリマーからなることを特徴とする、請求項１に記載のポリマー薬物担体であって、そのアミノ基にセミテレケリックＨＰＭＡコポリマーがグラフトされており、該セミテレケリックＨＰＭＡコポリマーは、アミド結合と、構造Ｉに示されるジスルフィド結合によって形成された生分解性スペーサー又は構造ＩＩに示されるオリゴペプチド配列ＳＰ２によって形成された生分解性スペーサーとを介してポリマー鎖末端で該デンドリマーに連結している、ポリマー薬物担体。
【化２３】
【化２４】
【請求項３】
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸に基づく中心デンドリマーからなることを特徴とする、請求項１に記載のポリマー担体であって、そのヒドロキシ基にセミテレケリックＨＰＭＡコポリマー鎖がグラフトされており、該セミテレケリックＨＰＭＡコポリマー鎖は、鎖末端エステル結合と、構造ＩＩＩに示されるジスルフィド結合を含む生分解性スペーサー又は構造ＩＶに示されるオリゴペプチド配列ＳＰ２とによって、該デンドリマーに連結している、ポリマー担体。
【化２５】
【化２６】
【請求項４】
その中心部がアミノ基、ピリジルジスルファニル基及びカルボキシル基からなる群から選択される４〜２５６個の末端基を含むゼロから第６世代のアミドアミンデンドリマーによって形成されたことを特徴とする、請求項１及び２に記載のポリマー担体であって、そのコアユニットが好ましくはシステアミン、エチレンジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、ヘキサン−１，６−ジアミン又はドデカン−１，１２−ジアミンによって形成された、ポリマー担体。
【請求項５】
その中心部がヒドロキシ基、ピリジルジスルファニル基及びカルボキシル基を含む群から選択される８〜２５６個の末端基を含むゼロから第６世代の２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸デンドリマーによって形成されることを特徴とする、請求項１及び３に記載のポリマー担体。
【請求項６】
２〜２８個のグラフトが、アミノアシルＳＰ１のメタクリロイル化ヒドラジドのモノマー単位０．５〜８ｍｏｌ％を含むＨＰＭＡコポリマーによって形成されることを特徴とする、請求項１から５に記載のポリマー担体であって、前記アミノアシルが、好ましくは、グリシル、βアラニル、６−アミノヘキサノイル（ＡＨ）、４−アミノベンゾイル、及び／又はオリゴペプチドＧｌｙＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ及びＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙから誘導される混合アシルの群から選択される、ポリマー担体。
【請求項７】
前記ポリマーグラフトが前記中心樹状ポリ（アミドアミン）又は２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロパン酸にジスルフィド基又は生分解性オリゴペプチドＳＰ２を含む生分解性スペーサーによって連結することを特徴とする、請求項１から５に記載のポリマー担体。
【請求項８】
前記オリゴペプチドＳＰ２が、好ましくは、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ及びＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙを含めたオリゴペプチドの群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載のポリマー担体。
【請求項９】
請求項１から８に記載のポリマー担体と、共有結合した薬物、好ましくは抗癌剤とからなることを特徴とする、ポリマー結合体。
【請求項１０】
請求項１から８に記載のポリマー担体と、抗癌剤、好ましくはドキソルビシンとからなることを特徴とする、請求項９に記載のポリマー結合体。
【請求項１１】
ドキソルビシンが、加水分解的に切断可能なヒドラゾン結合によって前記担体に連結していることを特徴とする、請求項１０に記載のポリマー結合体。
【請求項１２】
請求項１、２、３、４、５、７及び８に記載のポリマー担体と、アミド結合で結合された薬物とからなることを特徴とする、請求項１０に記載のポリマー結合体であって、２〜２８個のポリマーグラフトが、メタクリロイル化オリゴペプチドＳＰ２のモノマー単位０．５〜８ｍｏｌ％を含むＨＰＭＡコポリマーによって形成され、ドキソルビシンが該オリゴペプチドの末端にアミド結合を介して連結しており、前記オリゴペプチドが、好ましくは、オリゴペプチドＧｌｙＰｈｅＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＧｌｙ、ＧｌｙＬｅｕＰｈｅＧｌｙ及びＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙからなる群から選択される、ポリマー結合体。
【請求項１３】
かかる樹状系の分子量が好ましくは４００００から１４０００００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、ｖポリマー鎖と生成樹状結合体の両方におけるドキソルビシン含有量が１ｗｔ％と２５ｗｔ％との間（ポリマーに対して０．３〜８ｍｏｌ％）の範囲であることを特徴とする、請求項９から１２に記載のポリマー結合体。
【請求項１４】
腫瘍処置に使用するための、請求項９から１２のいずれかに記載の物質を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項１５】
固形腫瘍処置に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
幾つかのタイプのリンパ腫及び白血病の処置に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５１３６２６（Ｐ２０１３−５１３６２６Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４３４６５（Ｐ２０１２−５４３４６５）
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＺ２０１０／０００１３１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７２６２７
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５１２１５３９５７）
【出願人】（５１２１５３９６８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＺ２０１０／０００１３１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７２６２７
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５１２１５３９５７）
【出願人】（５１２１５３９６８）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]