樹脂粒子およびその製造方法
【課題】蛍光強度の劣化を防止し、かつ多色化に有利な樹脂粒子および該樹脂粒子の製造方法を提供すること。
【解決手段】励起エネルギーにより発光するナノ結晶が、含有された構造を有する略球状の樹脂粒子。励起エネルギーにより発光するナノ結晶、および磁性体が、含有された構造を有する略球状の樹脂粒子。前記樹脂粒子は生体関連物質の検出に好適に使用することができる。また、前記樹脂粒子は溶融分散法を用いて製造されることが好ましい。
【解決手段】励起エネルギーにより発光するナノ結晶が、含有された構造を有する略球状の樹脂粒子。励起エネルギーにより発光するナノ結晶、および磁性体が、含有された構造を有する略球状の樹脂粒子。前記樹脂粒子は生体関連物質の検出に好適に使用することができる。また、前記樹脂粒子は溶融分散法を用いて製造されることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は樹脂粒子に関し、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体関連物質の検出に好適に使用できる、識別可能な樹脂粒子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、このような目的に使用される粒子（もしくはビーズ）は例えば特許文献１に見られるように、ナノ粒子を予め濃度を変えた蛍光染料で染色し、これを表面に結合したポリマー微小粒子が開示されている。このポリマー微小粒子は、フローサイトメトリー等でその微小粒子の識別を行うことができる。また、特許文献２では、蛍光ポリマー性コア粒子を金属酸化物を含むポリマー層で被覆した粒子が開示されている。
しかしながら、これらの粒子に用いられている蛍光染料は、励起に使われるＵＶ光はもちろん太陽光にも弱く、光に暴露することで物質が崩壊し、蛍光強度が弱くなるといった欠点を持ち合わせている。そのため、測定中だけでなく保存中の退色にも気をつけなければならない。
【０００３】
これに対して、特許文献３、特許文献４、および特許文献５において、蛍光物質として、１乃至１０ｎｍの半導体ナノ結晶を用いる技術が開示されている。半導体ナノ結晶は、その組成およびサイズ、またはサイズ分布を変化させることにより特徴的なスペクトルを放出するように調整することができる。また、半導体ナノ結晶はシャープな蛍光スペクトルを有しており、同定のための識別が容易であり、ナノサイズによる量子効果で蛍光強度が強い。さらに長時間の測定や保存でも安定している。
なお、生物学的物質を粒子に結合させ免疫検査、核酸検出等を行う場合には、結合せずに遊離している物質から、結合した物質を分離する必要がある。しかし、これらの発明では具体的な分離を行うための組成物について示されていない。
これについて、非特許文献１にはマグネットビーズ（サイズ：約１０μｍ）の表面にＱｄｏｔ（カンタムドット社）と呼ばれる半導体ナノ結晶をコーティングした粒子が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特許第３４６８７５０号明細書
【特許文献２】特許第２５８９６１８号明細書
【特許文献３】特表２００３−５２３７１８号公報
【特許文献４】特表２００３−５３１７３４号公報
【特許文献５】特開２００２−３１１０２７号公報
【非特許文献１】住商バイオサイエンス株式会社資料：遺伝子発現解析用「Ｍｏｓａｉｃシステム」（２００４年１２月）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１に開示されている粒子は、コーティングにより半導体ナノ結晶が粒子表面に配置されたものであるため、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の検出のための反応工程で、半導体ナノ結晶が脱落もしくは溶解するなどのため、所定の蛍光強度、蛍光スペクトルが得られない等の不具合が生じることがあった。脱落もしくは溶解を防ぐため表面をさらにコーティングする方法もあるが、製造工程が増えコストが上昇する。
また、サイズの異なる２種以上の半導体ナノ結晶を用いる多色化技術においても粒子表面だけでは十分な濃度を付与することが困難であるため、多色化には自ずと制限があった。
本発明は上記の問題点に鑑み、蛍光強度の劣化を防止し、かつ多色化に有利な樹脂粒子および該樹脂粒子の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、上記課題は以下の手段［１］および［２１］に記載の手段により解決された。好ましい実施態様である［２］乃至［２０］、［２２］および［２３］と共に以下に記載する。
［１］ 励起エネルギーにより発光するナノ結晶が包含された構造を有する略球状の樹脂粒子、
［２］ 励起エネルギーにより発光するナノ結晶および磁性体が包含された構造を有する略球状の樹脂粒子、
［３］ 樹脂粒子の平均粒子径が１乃至１００μｍである［１］または［２］に記載の樹脂粒子、
［４］ 樹脂粒子の密度が１乃至１．５ｇ／ｍｌである［１］乃至［３］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［５］ ナノ結晶が１乃至１０ｎｍからなる化合物半導体である［１］乃至［４］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［６］ ナノ結晶の発光波長が３５０ｎｍ乃至９００ｎｍである［１］乃至［５］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［７］ ナノ結晶がコア／シェルタイプでありシェルの表面が有機基で保護されてなる［１］乃至［６］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［８］ 発光波長の異なる２種以上のナノ結晶を含む［１］乃至［７］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［９］ 少なくとも一部分が励起エネルギーを透過する［１］乃至［８］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１０］ 少なくとも一部分が発光波長を透過する［１］乃至［９］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１１］ 励起エネルギーにより、樹脂が放射する発光スペクトルのピークが、ナノ結晶の発光スペクトルのピークと異なる［１］乃至［１０］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１２］ 励起エネルギーが紫外線である［１］乃至［１１］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１３］ 樹脂が熱可塑性樹脂である［１］乃至［１２］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１４］ 表面にカルボキシル基、スルホ基、グリシジル基、水酸基、アミノ基およびチオール基よりなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の官能基を有する［１］乃至［１３］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１５］ 熱可塑性樹脂がカルボキシル基を側鎖に有するポリオレフィンの共重合体である［１３］に記載の樹脂粒子、
［１６］ 磁性体が強磁性体である［２］乃至［１５］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１７］ 磁性体が金属である［２］乃至［１６］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１８］ 磁性体が鉄、ニッケルおよびコバルトよりなる群から選ばれる少なくとも１つを含む［２］乃至［１７］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１９］ 磁性体の大きさが０．１乃至１０μｍである［２］乃至［１８］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［２０］ 溶融分散法を用いて製造された［１］乃至［１９］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［２１］ 溶融分散法を用いた［１］乃至［１９］いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法、
［２２］ 熱可塑性樹脂１、前記熱可塑性樹脂１と相溶性のない熱可塑性樹脂２、ナノ結晶または磁性体、またはナノ結晶および磁性粒子をナノ結晶および磁性粒子の融点以下の温度で溶融混練する工程、および熱可塑性樹脂１の溶融温度以下で熱可塑性樹脂２の展開溶媒に溶解して略球状の樹脂粒子を熱可塑性樹脂２の溶液から分離する工程を含むことを特徴とする［１］乃至［１９］いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法、
［２３］ 熱可塑性樹脂１とナノ結晶をナノ結晶の融点以下で溶融混練してナノ結晶分散熱可塑性樹脂（Ａ）を製造する工程、（Ａ）と磁性粒子をナノ結晶および磁性粒子の融点以下の温度で溶融混練してナノ結晶および磁性粒子を包含した熱可塑性樹脂（Ｂ）を製造する工程、樹脂（Ｂ）とこれと相溶性のない熱可塑性樹脂２をナノ結晶および磁性体の融点以下の温度で溶融混練する工程、および熱可塑性樹脂１の溶融温度以下で樹脂２の展開溶媒に溶解して略球状の樹脂粒子を熱可塑性樹脂２の溶液から分離する工程を含むことを特徴とする［２］乃至［１９］いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の樹脂粒子およびその製造方法により、蛍光強度の劣化が防止され、多色化が容易で識別可能な樹脂粒子が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下詳細に説明する。
（樹脂粒子の構造）
本発明の樹脂粒子は該樹脂粒子中にナノ結晶が包含された構造を有する略球状の樹脂粒子であり、紫外線、電子線、Ｘ線、ガンマ線等の各種エネルギー線による励起エネルギーにより、強く発光するものである。ここで、略球状とは樹脂粒子の投影断面形状の最短径に対する最長径の比で定義される形状因子が０．８以上であるものを９５％以上含むものをいう。
本発明の樹脂粒子は、ナノ結晶が包含されて構造を有し、分散された構造を有することが好ましく、ナノ結晶が樹脂粒子全体に分散されていることがより好ましく、樹脂粒子全体に均一に分散されていることがさらに好ましい。なお、「ナノ結晶」とは、結晶サイズがナノオーダーの結晶をいう。
また、２種以上の樹脂粒子を識別する目的から２種以上の濃度の異なるナノ結晶や発光波長の異なる２種以上のナノ結晶を含むことができる。
【０００９】
本発明の樹脂粒子はＤＮＡ、タンパク質等の検出処理工程でのハンドリングの容易さなどから上記ナノ結晶に加えて磁性体を含有することが好ましい。
磁性体は粒子として樹脂粒子中に分散した形態をとることが好ましい。磁性体粒子のサイズ（磁性体の大きさ）は０．１乃至５０μｍが好ましく、０．１乃至２０μｍであることがより好ましく、０．１乃至１０μｍであることがさらに好ましい。磁性体粒子の大きさが上記範囲内であると製造が容易であるので好ましい。また、樹脂粒子に比べてその２分の１乃至２０分の１のサイズが好ましい。また、樹脂粒子中に含まれる磁性粒子は１乃至１０個程度が好ましく、１乃至３個程度がより好ましい。
ここで、磁性体としては、いずれの形状でも使用することができ、球状、棒状或いは平板状の粒子が例示できる。また、前記磁性体粒子のサイズとは、平均粒子サイズを意味するものであり、粒子サイズは、磁性体粒子の体積と同等な球を考えたときの直径をいう。
【００１０】
本発明の樹脂粒子のサイズは１乃至１００μｍであることが好ましい。樹脂粒子のサイズが１μｍ以上であると、ハンドリングが容易であり、特に磁性体を含有した場合、外部磁場による動作が良好であるので好ましい。また、樹脂粒子のサイズが１００μｍ以下であると、ＤＮＡ、タンパク質等の生体関連物質に対して、良好な捕獲比表面積を得ることができるので好ましい。
ここで、樹脂粒子のサイズとは、平均体積粒子径を意味し、平均体積粒子径はレーザー回折式粒度分布計等により測定できる。
【００１１】
本発明の樹脂粒子の密度は、１乃至１．５ｇ／ｍｌであることが好ましい。樹脂粒子の密度が上記範囲内であると、水系の溶液中で良好な浮遊性が得られるので好ましい。
特に、樹脂粒子が磁性体を含有する場合、磁性体の含有量が多いほど外部磁場に対する動作が敏感となるが、同時に密度が高くなり、水系の溶液中で種々の処理を行う場合、樹脂粒子の浮遊性が損なわれる傾向がある。
樹脂粒子の浮遊性の観点からは密度が１乃至１．２ｇ／ｍｌであることが好ましく、１乃至１．０５ｇ／ｍｌであることがより好ましい。
【００１２】
本発明の樹脂粒子の少なくとも一部分が励起エネルギーを透過することが好ましい。特に磁性体を含有する場合は、励起エネルギーを遮蔽する傾向があるため、磁性体の含有量を低減し、励起エネルギーの透過性を向上させることが好ましい。
本発明の樹脂粒子の少なくとも一部分が発光波長を透過することが好ましい。特に磁性体を含有する場合は、発光波長を遮蔽する傾向があるため、磁性体の含有量を低減し、発光波長の透過性を向上させることが好ましい。
【００１３】
本発明において、ＤＮＡ等の生体関連物質の捕獲の観点から樹脂粒子の表面に官能基が付与されていることが好ましい。官能基としては、カルボキシル基、スルホ基（−ＳＯ3Ｈ）、グリシジル基、水酸基、アミノ基、チオール基等があげられる。特にカルボキシル基が好ましく用いられる。
【００１４】
（ナノ結晶）
ナノ結晶としては半導体ナノ結晶であることが好ましく、化合物半導体のナノ結晶であることがより好ましい。ここで、化合物半導体とは、複数の元素を材料にしている半導体を意味する。本発明において、ナノ結晶は、その結晶サイズが量子効果の発現する１乃至１０ｎｍであることが発光波長が可視領域となる点で好ましい。本発明においてナノ結晶は、結晶サイズが１乃至１０ｎｍである化合物半導体であることが特に好ましい。
【００１５】
本発明においてナノ結晶は、３５０ｎｍ乃至９００ｎｍの範囲で発光するナノ結晶であることが好ましい。発光波長が上記範囲内であると一般に普及している測定装置で検出が可能であるので好ましい。
【００１６】
また、１種類の結晶サイズのばらつきが小さいほどそのサイズに対応する発光波長でのピークの半値幅が小さくなり、多種類の樹脂粒子の識別に有利となり好ましい。すなわち多色化した場合に検出効率が向上するので、１種類の結晶サイズのばらつきが小さいことが好ましい。
【００１７】
可視領域において発光する半導体ナノ結晶としては、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＧａＰおよびＧａＡｓが挙げられるが、これに限定されない。
また、近赤外で発光する半導体結晶として、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＰｂＳおよびＰｂＳｅが挙げられるが、これに限定されない。
青から近紫外において発光する半導体ナノ結晶として、ＺｎＳおよびＧａＮが挙げられるが、これに限定されない。
【００１８】
ナノ結晶は耐励起エネルギー性を向上させる目的からコア／シェルタイプのものが好ましく、また、発光光の取り出し効率向上の目的からシェルの材質はコアの材質より光学的バンドギャップが大きいことが好ましい。
具体的には、コアの材質として可視（例えばＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＧａＰ、ＧａＡｓ）または近赤外（例えばＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ）においてエネルギーを放射するナノ結晶を使用し、シェルの材質として紫外光域にてエネルギーを放出するＺｎＳ、ＧａＮ、および、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅなどのマグネシウムカルコゲニドを使用することが例示できる。
本発明において、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ等が好ましく用いられる。
さらに、樹脂中に均一分散状態とする目的からシェルの表面は有機基で保護されているものが好ましく、特に疎水基、例えばトリオクチルホスフェイト（ＴＯＰＯ）やトリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）等で保護されているものが好ましく用いられる。
【００１９】
樹脂粒子中のナノ結晶の含有量は、その用途に応じて適宜選択することができ、特に限定されない。樹脂粒子を生体関連物質の検出に使用する場合、ナノ結晶の含有量は本発明の樹脂粒子全体に対して重量基準で１乃至２，０００ｐｐｍであることが好ましく、１０乃至１，０００ｐｐｍであることがより好ましく、５０乃至７００ｐｐｍであることがさらに好ましい。ナノ結晶の含有量が上記範囲内であると使用する検出器にもよるが半導体検出器などを使用した場合検出感度以上で、且つ出力が含有量にほぼ比例する場合が多いので好ましい。
【００２０】
（樹脂材料）
本発明によれば、略球状の樹脂粒子に用いられる樹脂材料として特に制限なく、いかなるものも使用できるが、励起エネルギーにより、樹脂が放射する発光スペクトルのピークが、ナノ結晶の発光スペクトルのピークと異なる樹脂を用いることが好ましい。さらに、励起エネルギーにより、樹脂自体が可視領域（波長３５０ｎｍ乃至９００ｎｍ）で発光しない樹脂がより好ましい。
【００２１】
励起エネルギーとしては使用上の利便性から紫外線が好ましく用いられる。紫外線としては低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、紫外線レーザー等から放射される紫外線が好ましく使用されるが、とくに取り扱い容易な低圧水銀ランプが好ましく使用される。
【００２２】
また、後述する製造方法（溶融分散法）の観点から熱可塑性樹脂であることが好ましい。熱可塑性樹脂としては、各種ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリオレフィン共重合体、エチレンメタクリル酸共重合体、ポリカーボネート、ポリスチレン、ＰＤＭＳ等があげられる。特に、表面官能基付与の観点から側鎖にカルボキシル基を有するポリオレフィンの共重合体が好ましく、例えばエチレンメタクリル酸共重合体が好ましく用いられる。
【００２３】
（磁性体）
本発明の磁性体としては磁石による操作が容易となる強磁性体好ましい。ここで強磁性体とは自発磁化を有する磁性材料を意味する。強磁性体の中でも自発磁化の大きな材料が好ましく、金属（金属間化合物を含む）好ましく、鉄、および鉄を含む合金、ニッケル、コバルト等が例示できる。さらに、フェライト等の磁性酸化物、特に残留磁化の少ないソフトフェライトが好ましい。ソフトフェライトとしてはＮｉＭｎフェライト、ＭｎＺｎフェライトが例示される。
【００２４】
磁性体は、本発明の樹脂粒子に対して１乃至５０重量％で添加することが好ましく、５乃至２０重量％で添加することがさらに好ましい。
磁性体の添加量が上記範囲内であると、良好な樹脂粒子の密度および透過性が得られるので好ましい。
【００２５】
（溶融分散法）
本発明の樹脂粒子は本発明者の一人が開発した複合微小球体の製造方法（特開昭６１−１７４２２９号公報）により製造することができる。この方法は目的の略球状粒子を構成する熱可塑性樹脂１とこれと相溶性のない熱可塑性樹脂２を溶融混練し、球状化した熱可塑性樹脂１を溶融温度以下に冷却し、熱可塑性樹脂２の展開溶媒中に分散し、球状化した熱可塑性樹脂１のみを熱可塑性樹脂２の溶液から分離回収するものである。
本発明の熱可塑性樹脂２は、熱可塑性樹脂組成物１を微粒子に分散させるための連続相を形成し、熱可塑性樹脂１と相溶性がない。相溶性がないとは、加熱温度において、１重量％以上の溶解度を有しないことをいう。熱可塑性樹脂２は、好ましくは熱可塑性樹脂１に対して、相溶性を有さず、好ましくは貧溶剤であることが望ましい。ここで、貧溶媒とは、所定温度における熱可塑性樹脂１を含む溶液に添加するとその熱可塑性樹脂１の溶解度が減少するような溶媒をいう。本発明において熱可塑性樹脂２は、２以上の熱可塑性樹脂の混合物であっても良く、熱可塑性樹脂１に対して、室温から加熱温度の範囲にわたり、貧溶媒であることが望ましい。本発明において、熱可塑性樹脂２は、熱可塑性樹脂１に対して、容量で、０．５倍以上５以下使用されることが好ましい。
【００２６】
熱可塑性樹脂２としては、ポリアルキレンオキサイド類、例えばポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールおよびその誘導体（アセタール化体等）、ポリブテン、ワックス、天然ゴム、合成ゴム、例えばポリブタジエン、スチレン・ブタジエン共重合ゴム、石油樹脂等が例示でき、これらを単独で、あるいは組み合わせて使用することができる。ポリアルキレンオキサイド類は、異なった重合度のものが市販されており、これらの成分を適宜組み合わせることも好ましい。
【００２７】
溶融分散法を本発明の樹脂粒子の製造に適応する場合は、ナノ結晶を熱可塑性樹脂１に対して所望の組成となるよう仕込み、ナノ結晶の融点以下で同様に溶融分散することでナノ結晶を含有する樹脂粒子が容易に得られる。さらに、ナノ結晶に加えて磁性体を含有させる場合は、熱可塑性樹脂１に対して所望の組成となるように仕込み、ナノ結晶および磁性体の溶融温度以下で溶融混練することで同様にナノ結晶および磁性体含有樹脂粒子が得られる。さらに、必要に応じて分級することで、粒子径の揃った樹脂粒子にすることができる。
【００２８】
本発明の樹脂粒子を溶融分散法にて製造する場合、以下の改善された方法により品質のそろった樹脂粒子の製造が可能となる。
すなわち、まず、熱可塑性樹脂１とナノ結晶をナノ結晶の融点以下で溶融混練してナノ結晶を含有した熱可塑性樹脂（Ａ）を製造し、つぎに（Ａ）と磁性粒子をナノ結晶および磁性粒子の融点以下の温度で溶融混練してナノ結晶および磁性粒子を含有した熱可塑性樹脂（Ｂ）を製造する。最後に樹脂（Ｂ）とこれと相溶性のない熱可塑性樹脂２をナノ結晶および磁性体の融点以下の温度で溶融混練し、熱可塑性樹脂１の溶融温度以下で熱可塑性樹脂２の展開溶媒に溶解して略球状の樹脂粒子を熱可塑性樹脂２の溶液から分離回収することができる。
【００２９】
本発明の樹脂粒子は様々な用途に使用することができ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体関連物質の検出に使用することが好ましい。具体的には、樹脂粒子表面をＤＮＡ、ＲＮＡ、たんぱく質等の生体関連物質で修飾し、その修飾物質と反応する生体関連物質の検出を行うことが例示できる。
【実施例】
【００３０】
［実施例１］
（ナノ結晶）
ナノ結晶としては、ＣｄＳｅ／ＺｎＳのコア／シェルタイプのエヴィドット（エヴィデントテクノロジーズ製）粒径２．４ｎｍを準備した。このナノ結晶は表面がＴＯＰＯ（Ｔｒｉ−ｎ−ｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）で保護され、トルエン溶媒に分散されている。このナノ結晶の紫外線励起（励起波長：４００ｎｍ以下）による発光色は緑（発光波長：５２０ｎｍ）であった。
（磁性体）
磁性体としてはカルボニル鉄から製造される粒子径２μｍの市販の鉄粒子（融点１，５００℃）を準備した。
【００３１】
（ナノ結晶の分散）
上記トルエン溶媒に分散した発光色が緑のナノ結晶を２００ｐｐｍの濃度になるようにエチレンメタクリル酸共重合体（三井・デュポン ポリケミカル(株)製Ｎ１８６０；エチレン：メタクリル酸＝８２：１８、融点９０℃）と混合し、１７０℃で溶融混練し、ナノ結晶含有熱可塑性樹脂（Ａ）を作製した。
【００３２】
（磁性体の分散）
上記熱可塑性樹脂（Ａ）に１０重量％となるように上記鉄粒子を混合し、１７０℃で溶融混練し、ナノ結晶および磁性体を含有する熱可塑性樹脂（Ｂ）を作製した。
【００３３】
（略球状樹脂粒子の作製）
上記熱可塑性樹脂（Ｂ）にこれと相溶性のない熱可塑性樹脂２としてポリエチレングリコールを２倍量加えて１７０℃の２軸の押し出し機中で溶融混練したのち、水中に押し出し、ポリエチレングリコールを溶解し、溶液からナノ結晶および鉄粒子を含有した略球状の樹脂粒子を遠心分離した。ここで、ポリエチレングリコールに対するエチレンメタクリル酸共重合体の溶解度は１重量％以下であり、相溶性がなかった。
得られた樹脂粒子をＪＩＳ規格のステンレス製篩を用いて分級した結果、平均粒子径２０μｍ乃至２５μｍの略球状樹脂粒子が得られた。
また、得られた樹脂粒子について、投影断面積形状の最短径に対する最長径の比で表される形状因子０．８以上の粒子は９７％であった。なお、形状因子は１００個の樹脂粒子について顕微鏡写真により測定した。
【００３４】
［実施例２］
実施例１において粒子径が５．０ｎｍで発光色が赤のナノ結晶（ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、励起波長：４００ｎｍ以下、発光波長：６２０ｎｍ）を準備した。これを２００ｐｐｍ添加した以外は同様な方法で赤色発光の平均粒子径が２０μｍ乃至２５μｍの略球状樹脂粒子を作製した。
また、得られた樹脂粒子について、投影断面積形状の最短径に対する最長径の比で表される形状因子０．８以上の粒子は９８％であった。
【００３５】
［実施例３］
実施例２において、１００ｐｐｍの赤色発光のナノ粒子を添加した以外は同様に平均粒子径が２０μ乃至２５μｍの略球状樹脂粒子を作製した。
また、得られた樹脂粒子について、投影断面積形状の最短径に対する最長径の比で表される形状因子０．８以上の粒子は９８％であった。
【００３６】
［実施例４］
実施例１において、緑色発光のナノ結晶２００ｐｐｍの代わりに、実施例１で使用した緑色発光ナノ結晶１００ｐｐｍおよび実施例２で使用した赤色発光ナノ結晶１００ｐｐｍを添加した以外は同様な方法で平均粒子径が２０μ乃至２５μｍの略球状樹脂粒子を作製した。
また、得られた樹脂粒子について、投影断面積形状の最短径に対する最長径の比で表される形状因子０．８以上の粒子は９７％であった。
【００３７】
（樹脂粒子の評価）
（１）樹脂粒子の密度：
ガラス製のピクノメータを用い、置換液体としてイソプロピルアルコールを用いて測定した。
【００３８】
（２）着磁性：
約１０重量％の粒子濃度になるように樹脂粒子の水分散液を作製し、これを直径１５ｍｍの蓋付きポリスチレン容器中で振とう分散したのち、永久磁石を管壁に近づけ、樹脂粒子の磁石に吸引される様子を観察し、数秒以内に管壁に吸引された場合を良好とした。
【００３９】
（３）浮遊性の評価：
約１０重量％の粒子濃度になるように得られた樹脂粒子の水分散液を作製し、これを直径１５ｍｍの蓋付きポリスチレン容器中で振とう分散したのち、１分間以上沈降が見られなかった場合を良好とした。
【００４０】
（４）蛍光顕微鏡観察：
（３）にて作製した分散液を約５μｌ、スライドガラスに滴下し、カバーガラスで表面を覆った。低圧水銀ランプを光源に可視光をカットする光学フィルターを配置し樹脂粒子に紫外線照射した発光の様子を観察した。発光色と粒子内の発光均一性を評価し、全体的に斑のない発光が観察された場合を均一発光とした。
これにより、ナノ結晶の包含性を評価することができる。また、樹脂粒子の一部が励起エネルギーおよび発光波長を透過することが評価できる。
【００４１】
（５）樹脂粒子の発光強度：
（４）の蛍光顕微鏡にオリンパス製顕微鏡デジタルカメラＤＰ１０を設置し、撮影条件を一定として、実施例２ならびに実施例３の樹脂粒子を撮影した。その撮影画像を日本ローパー製画像解析ソフト「Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ ＰＬＵＳ」を用いて、樹脂粒子内の平均輝度を計測し、実施例３に対する実施例２の相対値を求めた。
【００４２】
（６）発光ピーク波長の測定：
樹脂粒子の発光ピーク波長の測定には日立ハイテクノロジー社製蛍光分光光度計Ｆ７０００を使用した。励起波長を３６５ｎｍに固定し、分光波長を４００から９００ｎｍまでスキャンした。
（７）標識化の評価：
以下の手順で樹脂粒子の標識化を行った。（４）の顕微鏡に日本ローパー製デジタル冷却ＣＣＤカメラ「Ｃｏｏｌ ＳＮＡＰ」と、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰＲＯＢＥＳ製）の励起波長６５０ｎｍ、発光波長６６５ｎｍに適合する光学フィルターを設置し、標識化を行っていない元の樹脂粒子の発光輝度と比較して顕微鏡下で識別が可能な場合を良好とした。標識化は以下の方法で行った。
１）樹脂粒子の分散水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）から５０μｌを分取し、溶媒を１００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０ １２５μｌで置換した。
２）１）にＢｉｏｔｉｎ付ＢＳＡ（Ａｒｉｓｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．製）の１．２５×１０-2ｍｇ／ｍｌ溶液を１００μｌ加えた。
３）ＥＤＡＣ（N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）の２６ｍＭ ＭＥＳ溶液を調整し、２）に２５μｌを加えた。その後、マイクロチューブローテーター（アズワン製）で１時間の攪拌を行った。これにより、樹脂粒子表面のカルボンキシル基にＢｉｏｔｉｎ付ＢＳＡを結合させた。
４）攪拌後、溶媒をＰＢＳ（−）２５０μｌで置き換えた。
５）４）の溶液を５０μｌ分取して、ストレプトアビジン付Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰＲＯＢＥＳ製）の５０μｇ／μｌ溶液を１μｌ加えて攪拌した。５分間経過後、溶媒をＰＢＳ（−）２５０μｌで置き換えた。
【００４３】
評価の結果を表１に示す。なお、使用したエチレンメタクリル酸共重合体からの発光は４００ｎｍから９００ｎｍの測定範囲では認められなかった。
【００４４】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は樹脂粒子に関し、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体関連物質の検出に好適に使用できる、識別可能な樹脂粒子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、このような目的に使用される粒子（もしくはビーズ）は例えば特許文献１に見られるように、ナノ粒子を予め濃度を変えた蛍光染料で染色し、これを表面に結合したポリマー微小粒子が開示されている。このポリマー微小粒子は、フローサイトメトリー等でその微小粒子の識別を行うことができる。また、特許文献２では、蛍光ポリマー性コア粒子を金属酸化物を含むポリマー層で被覆した粒子が開示されている。
しかしながら、これらの粒子に用いられている蛍光染料は、励起に使われるＵＶ光はもちろん太陽光にも弱く、光に暴露することで物質が崩壊し、蛍光強度が弱くなるといった欠点を持ち合わせている。そのため、測定中だけでなく保存中の退色にも気をつけなければならない。
【０００３】
これに対して、特許文献３、特許文献４、および特許文献５において、蛍光物質として、１乃至１０ｎｍの半導体ナノ結晶を用いる技術が開示されている。半導体ナノ結晶は、その組成およびサイズ、またはサイズ分布を変化させることにより特徴的なスペクトルを放出するように調整することができる。また、半導体ナノ結晶はシャープな蛍光スペクトルを有しており、同定のための識別が容易であり、ナノサイズによる量子効果で蛍光強度が強い。さらに長時間の測定や保存でも安定している。
なお、生物学的物質を粒子に結合させ免疫検査、核酸検出等を行う場合には、結合せずに遊離している物質から、結合した物質を分離する必要がある。しかし、これらの発明では具体的な分離を行うための組成物について示されていない。
これについて、非特許文献１にはマグネットビーズ（サイズ：約１０μｍ）の表面にＱｄｏｔ（カンタムドット社）と呼ばれる半導体ナノ結晶をコーティングした粒子が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特許第３４６８７５０号明細書
【特許文献２】特許第２５８９６１８号明細書
【特許文献３】特表２００３−５２３７１８号公報
【特許文献４】特表２００３−５３１７３４号公報
【特許文献５】特開２００２−３１１０２７号公報
【非特許文献１】住商バイオサイエンス株式会社資料：遺伝子発現解析用「Ｍｏｓａｉｃシステム」（２００４年１２月）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１に開示されている粒子は、コーティングにより半導体ナノ結晶が粒子表面に配置されたものであるため、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の検出のための反応工程で、半導体ナノ結晶が脱落もしくは溶解するなどのため、所定の蛍光強度、蛍光スペクトルが得られない等の不具合が生じることがあった。脱落もしくは溶解を防ぐため表面をさらにコーティングする方法もあるが、製造工程が増えコストが上昇する。
また、サイズの異なる２種以上の半導体ナノ結晶を用いる多色化技術においても粒子表面だけでは十分な濃度を付与することが困難であるため、多色化には自ずと制限があった。
本発明は上記の問題点に鑑み、蛍光強度の劣化を防止し、かつ多色化に有利な樹脂粒子および該樹脂粒子の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、上記課題は以下の手段［１］および［２１］に記載の手段により解決された。好ましい実施態様である［２］乃至［２０］、［２２］および［２３］と共に以下に記載する。
［１］ 励起エネルギーにより発光するナノ結晶が包含された構造を有する略球状の樹脂粒子、
［２］ 励起エネルギーにより発光するナノ結晶および磁性体が包含された構造を有する略球状の樹脂粒子、
［３］ 樹脂粒子の平均粒子径が１乃至１００μｍである［１］または［２］に記載の樹脂粒子、
［４］ 樹脂粒子の密度が１乃至１．５ｇ／ｍｌである［１］乃至［３］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［５］ ナノ結晶が１乃至１０ｎｍからなる化合物半導体である［１］乃至［４］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［６］ ナノ結晶の発光波長が３５０ｎｍ乃至９００ｎｍである［１］乃至［５］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［７］ ナノ結晶がコア／シェルタイプでありシェルの表面が有機基で保護されてなる［１］乃至［６］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［８］ 発光波長の異なる２種以上のナノ結晶を含む［１］乃至［７］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［９］ 少なくとも一部分が励起エネルギーを透過する［１］乃至［８］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１０］ 少なくとも一部分が発光波長を透過する［１］乃至［９］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１１］ 励起エネルギーにより、樹脂が放射する発光スペクトルのピークが、ナノ結晶の発光スペクトルのピークと異なる［１］乃至［１０］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１２］ 励起エネルギーが紫外線である［１］乃至［１１］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１３］ 樹脂が熱可塑性樹脂である［１］乃至［１２］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１４］ 表面にカルボキシル基、スルホ基、グリシジル基、水酸基、アミノ基およびチオール基よりなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の官能基を有する［１］乃至［１３］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１５］ 熱可塑性樹脂がカルボキシル基を側鎖に有するポリオレフィンの共重合体である［１３］に記載の樹脂粒子、
［１６］ 磁性体が強磁性体である［２］乃至［１５］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１７］ 磁性体が金属である［２］乃至［１６］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１８］ 磁性体が鉄、ニッケルおよびコバルトよりなる群から選ばれる少なくとも１つを含む［２］乃至［１７］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［１９］ 磁性体の大きさが０．１乃至１０μｍである［２］乃至［１８］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［２０］ 溶融分散法を用いて製造された［１］乃至［１９］いずれか１つに記載の樹脂粒子、
［２１］ 溶融分散法を用いた［１］乃至［１９］いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法、
［２２］ 熱可塑性樹脂１、前記熱可塑性樹脂１と相溶性のない熱可塑性樹脂２、ナノ結晶または磁性体、またはナノ結晶および磁性粒子をナノ結晶および磁性粒子の融点以下の温度で溶融混練する工程、および熱可塑性樹脂１の溶融温度以下で熱可塑性樹脂２の展開溶媒に溶解して略球状の樹脂粒子を熱可塑性樹脂２の溶液から分離する工程を含むことを特徴とする［１］乃至［１９］いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法、
［２３］ 熱可塑性樹脂１とナノ結晶をナノ結晶の融点以下で溶融混練してナノ結晶分散熱可塑性樹脂（Ａ）を製造する工程、（Ａ）と磁性粒子をナノ結晶および磁性粒子の融点以下の温度で溶融混練してナノ結晶および磁性粒子を包含した熱可塑性樹脂（Ｂ）を製造する工程、樹脂（Ｂ）とこれと相溶性のない熱可塑性樹脂２をナノ結晶および磁性体の融点以下の温度で溶融混練する工程、および熱可塑性樹脂１の溶融温度以下で樹脂２の展開溶媒に溶解して略球状の樹脂粒子を熱可塑性樹脂２の溶液から分離する工程を含むことを特徴とする［２］乃至［１９］いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の樹脂粒子およびその製造方法により、蛍光強度の劣化が防止され、多色化が容易で識別可能な樹脂粒子が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下詳細に説明する。
（樹脂粒子の構造）
本発明の樹脂粒子は該樹脂粒子中にナノ結晶が包含された構造を有する略球状の樹脂粒子であり、紫外線、電子線、Ｘ線、ガンマ線等の各種エネルギー線による励起エネルギーにより、強く発光するものである。ここで、略球状とは樹脂粒子の投影断面形状の最短径に対する最長径の比で定義される形状因子が０．８以上であるものを９５％以上含むものをいう。
本発明の樹脂粒子は、ナノ結晶が包含されて構造を有し、分散された構造を有することが好ましく、ナノ結晶が樹脂粒子全体に分散されていることがより好ましく、樹脂粒子全体に均一に分散されていることがさらに好ましい。なお、「ナノ結晶」とは、結晶サイズがナノオーダーの結晶をいう。
また、２種以上の樹脂粒子を識別する目的から２種以上の濃度の異なるナノ結晶や発光波長の異なる２種以上のナノ結晶を含むことができる。
【０００９】
本発明の樹脂粒子はＤＮＡ、タンパク質等の検出処理工程でのハンドリングの容易さなどから上記ナノ結晶に加えて磁性体を含有することが好ましい。
磁性体は粒子として樹脂粒子中に分散した形態をとることが好ましい。磁性体粒子のサイズ（磁性体の大きさ）は０．１乃至５０μｍが好ましく、０．１乃至２０μｍであることがより好ましく、０．１乃至１０μｍであることがさらに好ましい。磁性体粒子の大きさが上記範囲内であると製造が容易であるので好ましい。また、樹脂粒子に比べてその２分の１乃至２０分の１のサイズが好ましい。また、樹脂粒子中に含まれる磁性粒子は１乃至１０個程度が好ましく、１乃至３個程度がより好ましい。
ここで、磁性体としては、いずれの形状でも使用することができ、球状、棒状或いは平板状の粒子が例示できる。また、前記磁性体粒子のサイズとは、平均粒子サイズを意味するものであり、粒子サイズは、磁性体粒子の体積と同等な球を考えたときの直径をいう。
【００１０】
本発明の樹脂粒子のサイズは１乃至１００μｍであることが好ましい。樹脂粒子のサイズが１μｍ以上であると、ハンドリングが容易であり、特に磁性体を含有した場合、外部磁場による動作が良好であるので好ましい。また、樹脂粒子のサイズが１００μｍ以下であると、ＤＮＡ、タンパク質等の生体関連物質に対して、良好な捕獲比表面積を得ることができるので好ましい。
ここで、樹脂粒子のサイズとは、平均体積粒子径を意味し、平均体積粒子径はレーザー回折式粒度分布計等により測定できる。
【００１１】
本発明の樹脂粒子の密度は、１乃至１．５ｇ／ｍｌであることが好ましい。樹脂粒子の密度が上記範囲内であると、水系の溶液中で良好な浮遊性が得られるので好ましい。
特に、樹脂粒子が磁性体を含有する場合、磁性体の含有量が多いほど外部磁場に対する動作が敏感となるが、同時に密度が高くなり、水系の溶液中で種々の処理を行う場合、樹脂粒子の浮遊性が損なわれる傾向がある。
樹脂粒子の浮遊性の観点からは密度が１乃至１．２ｇ／ｍｌであることが好ましく、１乃至１．０５ｇ／ｍｌであることがより好ましい。
【００１２】
本発明の樹脂粒子の少なくとも一部分が励起エネルギーを透過することが好ましい。特に磁性体を含有する場合は、励起エネルギーを遮蔽する傾向があるため、磁性体の含有量を低減し、励起エネルギーの透過性を向上させることが好ましい。
本発明の樹脂粒子の少なくとも一部分が発光波長を透過することが好ましい。特に磁性体を含有する場合は、発光波長を遮蔽する傾向があるため、磁性体の含有量を低減し、発光波長の透過性を向上させることが好ましい。
【００１３】
本発明において、ＤＮＡ等の生体関連物質の捕獲の観点から樹脂粒子の表面に官能基が付与されていることが好ましい。官能基としては、カルボキシル基、スルホ基（−ＳＯ3Ｈ）、グリシジル基、水酸基、アミノ基、チオール基等があげられる。特にカルボキシル基が好ましく用いられる。
【００１４】
（ナノ結晶）
ナノ結晶としては半導体ナノ結晶であることが好ましく、化合物半導体のナノ結晶であることがより好ましい。ここで、化合物半導体とは、複数の元素を材料にしている半導体を意味する。本発明において、ナノ結晶は、その結晶サイズが量子効果の発現する１乃至１０ｎｍであることが発光波長が可視領域となる点で好ましい。本発明においてナノ結晶は、結晶サイズが１乃至１０ｎｍである化合物半導体であることが特に好ましい。
【００１５】
本発明においてナノ結晶は、３５０ｎｍ乃至９００ｎｍの範囲で発光するナノ結晶であることが好ましい。発光波長が上記範囲内であると一般に普及している測定装置で検出が可能であるので好ましい。
【００１６】
また、１種類の結晶サイズのばらつきが小さいほどそのサイズに対応する発光波長でのピークの半値幅が小さくなり、多種類の樹脂粒子の識別に有利となり好ましい。すなわち多色化した場合に検出効率が向上するので、１種類の結晶サイズのばらつきが小さいことが好ましい。
【００１７】
可視領域において発光する半導体ナノ結晶としては、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＧａＰおよびＧａＡｓが挙げられるが、これに限定されない。
また、近赤外で発光する半導体結晶として、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＰｂＳおよびＰｂＳｅが挙げられるが、これに限定されない。
青から近紫外において発光する半導体ナノ結晶として、ＺｎＳおよびＧａＮが挙げられるが、これに限定されない。
【００１８】
ナノ結晶は耐励起エネルギー性を向上させる目的からコア／シェルタイプのものが好ましく、また、発光光の取り出し効率向上の目的からシェルの材質はコアの材質より光学的バンドギャップが大きいことが好ましい。
具体的には、コアの材質として可視（例えばＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＧａＰ、ＧａＡｓ）または近赤外（例えばＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ）においてエネルギーを放射するナノ結晶を使用し、シェルの材質として紫外光域にてエネルギーを放出するＺｎＳ、ＧａＮ、および、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅなどのマグネシウムカルコゲニドを使用することが例示できる。
本発明において、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ等が好ましく用いられる。
さらに、樹脂中に均一分散状態とする目的からシェルの表面は有機基で保護されているものが好ましく、特に疎水基、例えばトリオクチルホスフェイト（ＴＯＰＯ）やトリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）等で保護されているものが好ましく用いられる。
【００１９】
樹脂粒子中のナノ結晶の含有量は、その用途に応じて適宜選択することができ、特に限定されない。樹脂粒子を生体関連物質の検出に使用する場合、ナノ結晶の含有量は本発明の樹脂粒子全体に対して重量基準で１乃至２，０００ｐｐｍであることが好ましく、１０乃至１，０００ｐｐｍであることがより好ましく、５０乃至７００ｐｐｍであることがさらに好ましい。ナノ結晶の含有量が上記範囲内であると使用する検出器にもよるが半導体検出器などを使用した場合検出感度以上で、且つ出力が含有量にほぼ比例する場合が多いので好ましい。
【００２０】
（樹脂材料）
本発明によれば、略球状の樹脂粒子に用いられる樹脂材料として特に制限なく、いかなるものも使用できるが、励起エネルギーにより、樹脂が放射する発光スペクトルのピークが、ナノ結晶の発光スペクトルのピークと異なる樹脂を用いることが好ましい。さらに、励起エネルギーにより、樹脂自体が可視領域（波長３５０ｎｍ乃至９００ｎｍ）で発光しない樹脂がより好ましい。
【００２１】
励起エネルギーとしては使用上の利便性から紫外線が好ましく用いられる。紫外線としては低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、紫外線レーザー等から放射される紫外線が好ましく使用されるが、とくに取り扱い容易な低圧水銀ランプが好ましく使用される。
【００２２】
また、後述する製造方法（溶融分散法）の観点から熱可塑性樹脂であることが好ましい。熱可塑性樹脂としては、各種ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリオレフィン共重合体、エチレンメタクリル酸共重合体、ポリカーボネート、ポリスチレン、ＰＤＭＳ等があげられる。特に、表面官能基付与の観点から側鎖にカルボキシル基を有するポリオレフィンの共重合体が好ましく、例えばエチレンメタクリル酸共重合体が好ましく用いられる。
【００２３】
（磁性体）
本発明の磁性体としては磁石による操作が容易となる強磁性体好ましい。ここで強磁性体とは自発磁化を有する磁性材料を意味する。強磁性体の中でも自発磁化の大きな材料が好ましく、金属（金属間化合物を含む）好ましく、鉄、および鉄を含む合金、ニッケル、コバルト等が例示できる。さらに、フェライト等の磁性酸化物、特に残留磁化の少ないソフトフェライトが好ましい。ソフトフェライトとしてはＮｉＭｎフェライト、ＭｎＺｎフェライトが例示される。
【００２４】
磁性体は、本発明の樹脂粒子に対して１乃至５０重量％で添加することが好ましく、５乃至２０重量％で添加することがさらに好ましい。
磁性体の添加量が上記範囲内であると、良好な樹脂粒子の密度および透過性が得られるので好ましい。
【００２５】
（溶融分散法）
本発明の樹脂粒子は本発明者の一人が開発した複合微小球体の製造方法（特開昭６１−１７４２２９号公報）により製造することができる。この方法は目的の略球状粒子を構成する熱可塑性樹脂１とこれと相溶性のない熱可塑性樹脂２を溶融混練し、球状化した熱可塑性樹脂１を溶融温度以下に冷却し、熱可塑性樹脂２の展開溶媒中に分散し、球状化した熱可塑性樹脂１のみを熱可塑性樹脂２の溶液から分離回収するものである。
本発明の熱可塑性樹脂２は、熱可塑性樹脂組成物１を微粒子に分散させるための連続相を形成し、熱可塑性樹脂１と相溶性がない。相溶性がないとは、加熱温度において、１重量％以上の溶解度を有しないことをいう。熱可塑性樹脂２は、好ましくは熱可塑性樹脂１に対して、相溶性を有さず、好ましくは貧溶剤であることが望ましい。ここで、貧溶媒とは、所定温度における熱可塑性樹脂１を含む溶液に添加するとその熱可塑性樹脂１の溶解度が減少するような溶媒をいう。本発明において熱可塑性樹脂２は、２以上の熱可塑性樹脂の混合物であっても良く、熱可塑性樹脂１に対して、室温から加熱温度の範囲にわたり、貧溶媒であることが望ましい。本発明において、熱可塑性樹脂２は、熱可塑性樹脂１に対して、容量で、０．５倍以上５以下使用されることが好ましい。
【００２６】
熱可塑性樹脂２としては、ポリアルキレンオキサイド類、例えばポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールおよびその誘導体（アセタール化体等）、ポリブテン、ワックス、天然ゴム、合成ゴム、例えばポリブタジエン、スチレン・ブタジエン共重合ゴム、石油樹脂等が例示でき、これらを単独で、あるいは組み合わせて使用することができる。ポリアルキレンオキサイド類は、異なった重合度のものが市販されており、これらの成分を適宜組み合わせることも好ましい。
【００２７】
溶融分散法を本発明の樹脂粒子の製造に適応する場合は、ナノ結晶を熱可塑性樹脂１に対して所望の組成となるよう仕込み、ナノ結晶の融点以下で同様に溶融分散することでナノ結晶を含有する樹脂粒子が容易に得られる。さらに、ナノ結晶に加えて磁性体を含有させる場合は、熱可塑性樹脂１に対して所望の組成となるように仕込み、ナノ結晶および磁性体の溶融温度以下で溶融混練することで同様にナノ結晶および磁性体含有樹脂粒子が得られる。さらに、必要に応じて分級することで、粒子径の揃った樹脂粒子にすることができる。
【００２８】
本発明の樹脂粒子を溶融分散法にて製造する場合、以下の改善された方法により品質のそろった樹脂粒子の製造が可能となる。
すなわち、まず、熱可塑性樹脂１とナノ結晶をナノ結晶の融点以下で溶融混練してナノ結晶を含有した熱可塑性樹脂（Ａ）を製造し、つぎに（Ａ）と磁性粒子をナノ結晶および磁性粒子の融点以下の温度で溶融混練してナノ結晶および磁性粒子を含有した熱可塑性樹脂（Ｂ）を製造する。最後に樹脂（Ｂ）とこれと相溶性のない熱可塑性樹脂２をナノ結晶および磁性体の融点以下の温度で溶融混練し、熱可塑性樹脂１の溶融温度以下で熱可塑性樹脂２の展開溶媒に溶解して略球状の樹脂粒子を熱可塑性樹脂２の溶液から分離回収することができる。
【００２９】
本発明の樹脂粒子は様々な用途に使用することができ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体関連物質の検出に使用することが好ましい。具体的には、樹脂粒子表面をＤＮＡ、ＲＮＡ、たんぱく質等の生体関連物質で修飾し、その修飾物質と反応する生体関連物質の検出を行うことが例示できる。
【実施例】
【００３０】
［実施例１］
（ナノ結晶）
ナノ結晶としては、ＣｄＳｅ／ＺｎＳのコア／シェルタイプのエヴィドット（エヴィデントテクノロジーズ製）粒径２．４ｎｍを準備した。このナノ結晶は表面がＴＯＰＯ（Ｔｒｉ−ｎ−ｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）で保護され、トルエン溶媒に分散されている。このナノ結晶の紫外線励起（励起波長：４００ｎｍ以下）による発光色は緑（発光波長：５２０ｎｍ）であった。
（磁性体）
磁性体としてはカルボニル鉄から製造される粒子径２μｍの市販の鉄粒子（融点１，５００℃）を準備した。
【００３１】
（ナノ結晶の分散）
上記トルエン溶媒に分散した発光色が緑のナノ結晶を２００ｐｐｍの濃度になるようにエチレンメタクリル酸共重合体（三井・デュポン ポリケミカル(株)製Ｎ１８６０；エチレン：メタクリル酸＝８２：１８、融点９０℃）と混合し、１７０℃で溶融混練し、ナノ結晶含有熱可塑性樹脂（Ａ）を作製した。
【００３２】
（磁性体の分散）
上記熱可塑性樹脂（Ａ）に１０重量％となるように上記鉄粒子を混合し、１７０℃で溶融混練し、ナノ結晶および磁性体を含有する熱可塑性樹脂（Ｂ）を作製した。
【００３３】
（略球状樹脂粒子の作製）
上記熱可塑性樹脂（Ｂ）にこれと相溶性のない熱可塑性樹脂２としてポリエチレングリコールを２倍量加えて１７０℃の２軸の押し出し機中で溶融混練したのち、水中に押し出し、ポリエチレングリコールを溶解し、溶液からナノ結晶および鉄粒子を含有した略球状の樹脂粒子を遠心分離した。ここで、ポリエチレングリコールに対するエチレンメタクリル酸共重合体の溶解度は１重量％以下であり、相溶性がなかった。
得られた樹脂粒子をＪＩＳ規格のステンレス製篩を用いて分級した結果、平均粒子径２０μｍ乃至２５μｍの略球状樹脂粒子が得られた。
また、得られた樹脂粒子について、投影断面積形状の最短径に対する最長径の比で表される形状因子０．８以上の粒子は９７％であった。なお、形状因子は１００個の樹脂粒子について顕微鏡写真により測定した。
【００３４】
［実施例２］
実施例１において粒子径が５．０ｎｍで発光色が赤のナノ結晶（ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、励起波長：４００ｎｍ以下、発光波長：６２０ｎｍ）を準備した。これを２００ｐｐｍ添加した以外は同様な方法で赤色発光の平均粒子径が２０μｍ乃至２５μｍの略球状樹脂粒子を作製した。
また、得られた樹脂粒子について、投影断面積形状の最短径に対する最長径の比で表される形状因子０．８以上の粒子は９８％であった。
【００３５】
［実施例３］
実施例２において、１００ｐｐｍの赤色発光のナノ粒子を添加した以外は同様に平均粒子径が２０μ乃至２５μｍの略球状樹脂粒子を作製した。
また、得られた樹脂粒子について、投影断面積形状の最短径に対する最長径の比で表される形状因子０．８以上の粒子は９８％であった。
【００３６】
［実施例４］
実施例１において、緑色発光のナノ結晶２００ｐｐｍの代わりに、実施例１で使用した緑色発光ナノ結晶１００ｐｐｍおよび実施例２で使用した赤色発光ナノ結晶１００ｐｐｍを添加した以外は同様な方法で平均粒子径が２０μ乃至２５μｍの略球状樹脂粒子を作製した。
また、得られた樹脂粒子について、投影断面積形状の最短径に対する最長径の比で表される形状因子０．８以上の粒子は９７％であった。
【００３７】
（樹脂粒子の評価）
（１）樹脂粒子の密度：
ガラス製のピクノメータを用い、置換液体としてイソプロピルアルコールを用いて測定した。
【００３８】
（２）着磁性：
約１０重量％の粒子濃度になるように樹脂粒子の水分散液を作製し、これを直径１５ｍｍの蓋付きポリスチレン容器中で振とう分散したのち、永久磁石を管壁に近づけ、樹脂粒子の磁石に吸引される様子を観察し、数秒以内に管壁に吸引された場合を良好とした。
【００３９】
（３）浮遊性の評価：
約１０重量％の粒子濃度になるように得られた樹脂粒子の水分散液を作製し、これを直径１５ｍｍの蓋付きポリスチレン容器中で振とう分散したのち、１分間以上沈降が見られなかった場合を良好とした。
【００４０】
（４）蛍光顕微鏡観察：
（３）にて作製した分散液を約５μｌ、スライドガラスに滴下し、カバーガラスで表面を覆った。低圧水銀ランプを光源に可視光をカットする光学フィルターを配置し樹脂粒子に紫外線照射した発光の様子を観察した。発光色と粒子内の発光均一性を評価し、全体的に斑のない発光が観察された場合を均一発光とした。
これにより、ナノ結晶の包含性を評価することができる。また、樹脂粒子の一部が励起エネルギーおよび発光波長を透過することが評価できる。
【００４１】
（５）樹脂粒子の発光強度：
（４）の蛍光顕微鏡にオリンパス製顕微鏡デジタルカメラＤＰ１０を設置し、撮影条件を一定として、実施例２ならびに実施例３の樹脂粒子を撮影した。その撮影画像を日本ローパー製画像解析ソフト「Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ ＰＬＵＳ」を用いて、樹脂粒子内の平均輝度を計測し、実施例３に対する実施例２の相対値を求めた。
【００４２】
（６）発光ピーク波長の測定：
樹脂粒子の発光ピーク波長の測定には日立ハイテクノロジー社製蛍光分光光度計Ｆ７０００を使用した。励起波長を３６５ｎｍに固定し、分光波長を４００から９００ｎｍまでスキャンした。
（７）標識化の評価：
以下の手順で樹脂粒子の標識化を行った。（４）の顕微鏡に日本ローパー製デジタル冷却ＣＣＤカメラ「Ｃｏｏｌ ＳＮＡＰ」と、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰＲＯＢＥＳ製）の励起波長６５０ｎｍ、発光波長６６５ｎｍに適合する光学フィルターを設置し、標識化を行っていない元の樹脂粒子の発光輝度と比較して顕微鏡下で識別が可能な場合を良好とした。標識化は以下の方法で行った。
１）樹脂粒子の分散水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）から５０μｌを分取し、溶媒を１００ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０ １２５μｌで置換した。
２）１）にＢｉｏｔｉｎ付ＢＳＡ（Ａｒｉｓｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．製）の１．２５×１０-2ｍｇ／ｍｌ溶液を１００μｌ加えた。
３）ＥＤＡＣ（N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）の２６ｍＭ ＭＥＳ溶液を調整し、２）に２５μｌを加えた。その後、マイクロチューブローテーター（アズワン製）で１時間の攪拌を行った。これにより、樹脂粒子表面のカルボンキシル基にＢｉｏｔｉｎ付ＢＳＡを結合させた。
４）攪拌後、溶媒をＰＢＳ（−）２５０μｌで置き換えた。
５）４）の溶液を５０μｌ分取して、ストレプトアビジン付Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰＲＯＢＥＳ製）の５０μｇ／μｌ溶液を１μｌ加えて攪拌した。５分間経過後、溶媒をＰＢＳ（−）２５０μｌで置き換えた。
【００４３】
評価の結果を表１に示す。なお、使用したエチレンメタクリル酸共重合体からの発光は４００ｎｍから９００ｎｍの測定範囲では認められなかった。
【００４４】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起エネルギーにより発光するナノ結晶が包含された構造を有する略球状の樹脂粒子。
【請求項２】
励起エネルギーにより発光するナノ結晶および磁性体が包含された構造を有する略球状の樹脂粒子。
【請求項３】
樹脂粒子の平均粒子径が１乃至１００μｍである請求項１または２に記載の樹脂粒子。
【請求項４】
樹脂粒子の密度が１乃至１．５ｇ／ｍｌである請求項１乃至３いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項５】
ナノ結晶が１乃至１０ｎｍからなる化合物半導体である請求項１乃至４いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項６】
ナノ結晶の発光波長が３５０ｎｍ乃至９００ｎｍである請求項１乃至５いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項７】
ナノ結晶がコア／シェルタイプでありシェルの表面が有機基で保護されてなる請求項１乃至６いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項８】
発光波長の異なる２種以上のナノ結晶を含む請求項１乃至７いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項９】
少なくとも一部分が励起エネルギーを透過する請求項１乃至８いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１０】
少なくとも一部分が発光波長を透過する請求項１乃至９いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１１】
励起エネルギーにより、樹脂が放射する発光スペクトルのピークが、ナノ結晶の発光スペクトルのピークと異なる請求項１乃至１０いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１２】
励起エネルギーが紫外線である請求項１乃至１１いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１３】
樹脂が熱可塑性樹脂である請求項１乃至１２いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１４】
表面にカルボキシル基、スルホ基、グリシジル基、水酸基、アミノ基およびチオール基よりなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の官能基を有する請求項１乃至１３いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１５】
熱可塑性樹脂がカルボキシル基を側鎖に有するポリオレフィンの共重合体である請求項１３に記載の樹脂粒子。
【請求項１６】
磁性体が強磁性体である請求項２乃至１５いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１７】
磁性体が金属である請求項２乃至１６いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１８】
磁性体が鉄、ニッケルおよびコバルトよりなる群から選ばれる少なくとも１つを含む請求項２乃至１７いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１９】
磁性体の大きさが０．１乃至１０μｍである請求項２乃至１８いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項２０】
溶融分散法を用いて製造された請求項１乃至１９いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項２１】
溶融分散法を用いた請求項１乃至１９いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法。
【請求項２２】
熱可塑性樹脂１、前記熱可塑性樹脂１と相溶性のない熱可塑性樹脂２、ナノ結晶または磁性体、またはナノ結晶および磁性粒子をナノ結晶および磁性粒子の融点以下の温度で溶融混練する工程、および
熱可塑性樹脂１の溶融温度以下で熱可塑性樹脂２の展開溶媒に溶解して略球状の樹脂粒子を熱可塑性樹脂２の溶液から分離する工程を含むことを特徴とする
請求項１乃至１９いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法。
【請求項２３】
熱可塑性樹脂１とナノ結晶をナノ結晶の融点以下で溶融混練してナノ結晶分散熱可塑性樹脂（Ａ）を製造する工程、
（Ａ）と磁性粒子をナノ結晶および磁性粒子の融点以下の温度で溶融混練してナノ結晶および磁性粒子を包含した熱可塑性樹脂（Ｂ）を製造する工程、
樹脂（Ｂ）とこれと相溶性のない熱可塑性樹脂２をナノ結晶および磁性体の融点以下の温度で溶融混練する工程、および
熱可塑性樹脂１の溶融温度以下で樹脂２の展開溶媒に溶解して略球状の樹脂粒子を熱可塑性樹脂２の溶液から分離する工程を含むことを特徴とする請求項２乃至１９いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法。
【請求項１】
励起エネルギーにより発光するナノ結晶が包含された構造を有する略球状の樹脂粒子。
【請求項２】
励起エネルギーにより発光するナノ結晶および磁性体が包含された構造を有する略球状の樹脂粒子。
【請求項３】
樹脂粒子の平均粒子径が１乃至１００μｍである請求項１または２に記載の樹脂粒子。
【請求項４】
樹脂粒子の密度が１乃至１．５ｇ／ｍｌである請求項１乃至３いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項５】
ナノ結晶が１乃至１０ｎｍからなる化合物半導体である請求項１乃至４いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項６】
ナノ結晶の発光波長が３５０ｎｍ乃至９００ｎｍである請求項１乃至５いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項７】
ナノ結晶がコア／シェルタイプでありシェルの表面が有機基で保護されてなる請求項１乃至６いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項８】
発光波長の異なる２種以上のナノ結晶を含む請求項１乃至７いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項９】
少なくとも一部分が励起エネルギーを透過する請求項１乃至８いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１０】
少なくとも一部分が発光波長を透過する請求項１乃至９いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１１】
励起エネルギーにより、樹脂が放射する発光スペクトルのピークが、ナノ結晶の発光スペクトルのピークと異なる請求項１乃至１０いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１２】
励起エネルギーが紫外線である請求項１乃至１１いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１３】
樹脂が熱可塑性樹脂である請求項１乃至１２いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１４】
表面にカルボキシル基、スルホ基、グリシジル基、水酸基、アミノ基およびチオール基よりなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の官能基を有する請求項１乃至１３いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１５】
熱可塑性樹脂がカルボキシル基を側鎖に有するポリオレフィンの共重合体である請求項１３に記載の樹脂粒子。
【請求項１６】
磁性体が強磁性体である請求項２乃至１５いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１７】
磁性体が金属である請求項２乃至１６いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１８】
磁性体が鉄、ニッケルおよびコバルトよりなる群から選ばれる少なくとも１つを含む請求項２乃至１７いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項１９】
磁性体の大きさが０．１乃至１０μｍである請求項２乃至１８いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項２０】
溶融分散法を用いて製造された請求項１乃至１９いずれか１つに記載の樹脂粒子。
【請求項２１】
溶融分散法を用いた請求項１乃至１９いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法。
【請求項２２】
熱可塑性樹脂１、前記熱可塑性樹脂１と相溶性のない熱可塑性樹脂２、ナノ結晶または磁性体、またはナノ結晶および磁性粒子をナノ結晶および磁性粒子の融点以下の温度で溶融混練する工程、および
熱可塑性樹脂１の溶融温度以下で熱可塑性樹脂２の展開溶媒に溶解して略球状の樹脂粒子を熱可塑性樹脂２の溶液から分離する工程を含むことを特徴とする
請求項１乃至１９いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法。
【請求項２３】
熱可塑性樹脂１とナノ結晶をナノ結晶の融点以下で溶融混練してナノ結晶分散熱可塑性樹脂（Ａ）を製造する工程、
（Ａ）と磁性粒子をナノ結晶および磁性粒子の融点以下の温度で溶融混練してナノ結晶および磁性粒子を包含した熱可塑性樹脂（Ｂ）を製造する工程、
樹脂（Ｂ）とこれと相溶性のない熱可塑性樹脂２をナノ結晶および磁性体の融点以下の温度で溶融混練する工程、および
熱可塑性樹脂１の溶融温度以下で樹脂２の展開溶媒に溶解して略球状の樹脂粒子を熱可塑性樹脂２の溶液から分離する工程を含むことを特徴とする請求項２乃至１９いずれか１つに記載の樹脂粒子の製造方法。
【公開番号】特開２００７−３０８５４８（Ｐ２００７−３０８５４８Ａ）
【公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１３７３９０（Ｐ２００６−１３７３９０）
【出願日】平成１８年５月１７日（２００６．５．１７）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【出願人】（３０２０５０１２３）トライアル株式会社 (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１７日（２００６．５．１７）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【出願人】（３０２０５０１２３）トライアル株式会社 (19)
【Ｆターム（参考）】
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