機能的ヌクレオチド分子の検索方法
遺伝子の発現を効果的に抑制できる核酸の普遍的検索法、該方法に使用する核酸構築物、ベクター、該方法のためのキットに関する。プロモーター配列、少なくとも２つの遺伝子配列及びポリＡシグナル配列を有する核酸構築物であって、前記少なくとも２つの遺伝子配列は１分子のＲＮＡとして転写され、少なくとも１つの遺伝子配列が翻訳可能な形であり、少なくとも１つの遺伝子配列が実質的に翻訳されない形でコードされる核酸構築物を構築することに特徴を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の発現を効果的に抑制できる核酸の普遍的検索法に関する。さらに、該方法に使用する核酸構築物、ベクター、該方法のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の発現量は多様な方法で制御されている。例えば、転写因子による遺伝子からｍＲＮＡへの転写制御、ｍＲＮＡからアミノ酸配列への翻訳の制御、ヌクレアーゼによるｍＲＮＡ分解に対するｍＲＮＡの安定性の制御などにより、細胞は常に目的の発現量を保つよう制御している。
【０００３】
タンパク質の発現量をｍＲＮＡの段階で人工的に抑制する方法として、ｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡによる抑制、リボザイムによるｍＲＮＡの分解、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）などが挙げられる。これらの方法においては、タンパク質をコードする核酸配列、およびその周辺の核酸配列のどの領域を標的とするかにより、その抑制効果が著しく異なることが知られている（例えば、非特許文献１）。タンパク質の発現量を確認する方法として、通常、標的のタンパク質とレポータータンパク質の融合タンパク質を合成し、そのレポータータンパク質を指標にタンパク質の発現量を推測している。そして、標的のタンパク質とレポータータンパク質の融合タンパク質の全長が翻訳されているかを確認するために、標的のタンパク質の下流にレポータータンパク質を融合させる方法が通常用いられている。従って、レポーター遺伝子が翻訳可能な形で、これに隣接する標的のタンパク質をコードする核酸配列が翻訳されない形で連結されたＤＮＡは知られていない。
【０００４】
例えば、Ｎｉｌｓｅｎ ＴＷらは、標的のタンパク質とその下流にレポータータンパク質を融合させた融合タンパク質を発現するＤＮＡを構築し、レポータータンパク質の発現を調べることにより、標的の核酸配列の発現を効果的に抑制できるリボザイム等の検索を行なっている（例えば、特許文献１）。しかしながら、機能を持つ融合タンパクを発現することは容易ではなく、融合したためにタンパク質としての機能を失うことは少なくない。従って、レポータータンパク質が検出されなかったとしても、ｍＲＮＡの分解によるｍＲＮＡの不安定化によるものか、ｍＲＮＡの立体構造の変化によるものか、翻訳機構の阻害によるものか、レポータータンパク質としての機能を失ったのか、さらなる詳細な検証が必要となる。このような、融合タンパク質、キメラタンパク質を生じることなく、標的遺伝子由来の配列に作用する分子の検索方法は知られていない。
【０００５】
従って、より多くの核酸配列に普遍的に対応でき、ｍＲＮＡの安定性を変化させることにより発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子の検索方法が求められていた。
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０００２２７８号明細書
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ．９ Ｎｏ．３ ３４７頁（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、より多くの核酸配列に普遍的に対応できる、標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子の検索方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の事情を鑑み、鋭意研究及び探索を行った結果、プロモーター配列、少なくとも２つの遺伝子配列及びポリＡシグナル配列を有する核酸構築物であって、前記少なくとも２つの遺伝子配列は１分子のＲＮＡとして転写され、少なくとも１つの遺伝子配列が翻訳可能な形であり、少なくとも１つの遺伝子配列が実質的に翻訳されない形でコードされる核酸構築物を構築することにより、より多くの核酸配列に普遍的に対応でき、ｍＲＮＡの安定性を変化させて翻訳されない形の遺伝子配列がコードするタンパク質の発現を変化させることができる分子を検索できることを見出した。さらに、上記の核酸構築物がより多くの核酸配列に普遍的に対応できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、プロモーター配列、該配列に翻訳可能な形で連結された、少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびポリＡシグナル配列を有する核酸構築物であって、
該核酸構築物はプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間には前記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有し、
プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる翻訳されないヌクレオチド配列は該核酸構築物より１分子のＲＮＡとして転写されるように連結されており、
さらに前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする核酸構築物に関する；
（Ａ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（Ｂ）天然においてタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
【００１０】
本発明の第１の発明において、翻訳されないヌクレオチド配列が、プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に位置している核酸構築物であってもよく、翻訳されないヌクレオチド配列が、プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流に位置している核酸構築物であってもよい。また、プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列がレポータータンパク質をコードするものである核酸構築物であってもよい。
【００１１】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の核酸構築物を含有するベクターに関する。
【００１２】
本発明の第３の発明は、翻訳可能な形の少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有するＲＮＡであって、前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とするＲＮＡに関する；
（Ａ）前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（Ｂ）天然において前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
【００１３】
本発明の第４の発明は、機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であって、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する本発明の第１の発明の核酸構築物もしくは本発明の第２の発明のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法に関する。
【００１４】
本発明の第５の発明は、機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であって、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する本発明の第３の発明のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｃ）工程（Ｂ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法に関する。
【００１５】
本発明の第４、５の発明において、機能的ヌクレオチドによる標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出することを特徴とする、標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子の検索方法であってもよく、細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレオチド分子のＲＮＡへの接触が行われる機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であってもよい。
【００１６】
本発明の第６の発明は、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法であって、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する本発明の第１の発明の核酸構築物もしくは本発明の第２の発明のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいてヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法に関する。
【００１７】
本発明の第７の発明は、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法であって、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する本発明の第３の発明のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｃ）工程（Ｂ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法に関する。
【００１８】
本発明の第６、７の発明において、細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレオチド分子のＲＮＡへの接触が行われるヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法であってもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、より多くの標的遺伝子に普遍的に対応でき、ＲＮＡを不安定化させることにより標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド分子の検索方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図である。
【図２】本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図である。
【図３】本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図である。
【図４】本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明に関して具体的に説明する。
【００２２】
本明細書において、核酸構築物はＤＮＡおよび／またはＲＮＡで構成された構築物である。核酸構築物は、上記ＤＮＡ、ＲＮＡのアナログや修飾化合物から構成されていてもよく、また、その一部に含んでいても良い。
本明細書において、標的遺伝子とは、発現の変化を起こすことが望まれる標的タンパク質をコードする核酸配列、および／または、その前後の核酸配列であり、本発明の核酸構築物又はベクターから転写されうる配列のことを示す。本明細書においては、目的の核酸配列、標的核酸配列と記載することもある。標的遺伝子は標的タンパク質の全長又はその一部をコードするヌクレオチド配列であっても良く、さらにその前後の５’ＵＴＲ（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎ：非翻訳領域）、３’ＵＴＲであっても良い。特に限定はされないが例えば、ＲＮＡｉ作用により発現を抑制することが望まれる対象であるタンパク質をコードする塩基配列及びその前後の配列（ｓｉＲＮＡ）のような機能的ヌクレオチド分子のことであり、ヌクレオチド分子を介した配列特異的ｍＲＮＡの分解の対象となる核酸配列をいう。遺伝子のエキソンに相当する配列、開始コドンとして機能する配列を含有しないように改変された配列も好適に使用できる。標的遺伝子は、真核細胞生物由来の配列、ウイルス由来の配列、原核細胞生物由来の配列のいずれであってもよい。ウイルス由来の標的遺伝子は、該ウイルスゲノムの分解、ウイルスの複製、増殖の抑制にかかわる機能的ヌクレオチド分子の検索に有用である。
【００２３】
本明細書において、コード領域とは、タンパク質のアミノ酸配列を直接規定する遺伝暗号からなる遺伝子内の領域を意味する。
【００２４】
本明細書において、ｍＲＮＡの不安定化とは、ｍＲＮＡの分解反応の増大を意味する。ｍＲＮＡは、合成と分解の２つの反応によりその蓄積量が決定されるが、合成反応と分解反応のバランスが分解反応に傾いた場合にｍＲＮＡが不安定化されるという。ｍＲＮＡの分解は、標的遺伝子由来の核酸配列を含むｍＲＮＡの分解であれば特に限定はなく、エンド的な分解、エキソ的な分解のどちらも含まれる。
【００２５】
本明細書において、ヌクレオチド分子とは、ヌクレオシドのリン酸エステル化合物を示す。ヌクレオチド分子は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらのキメラ分子であってよく、アナログや修飾されたヌクレオチドもヌクレオチド分子に含まれる。また、タンパク質、糖質などと共に複合体を形成していてもよい。
【００２６】
本明細書において、機能的ヌクレオチド分子とは、タンパク質の発現を変化させるヌクレオチド分子のことをいう。機能的ヌクレオチド分子には、標的タンパク質の発現を阻害する分子、本発明のＲＮＡの中の翻訳されないヌクレオチド配列に配列特異的に作用し、最終的にＲＮＡ全体を不安定化させる分子、ＲＮＡの中の翻訳されないヌクレオチド配列を配列特異的に分解し、最終的にＲＮＡ全体を不安定化させる分子も含まれる。機能的なヌクレオチド分子は、タンパク質や糖質などとともに複合体を形成していてもよい。
【００２７】
本発明において、翻訳可能な形のヌクレオチド配列とは、適切な条件、環境下において、タンパク質の合成が行われるように配置されたヌクレオチド配列である。翻訳は多数の因子の協働によりなされるが、翻訳開始シグナル（翻訳アクチベーター）、翻訳開始コドン、翻訳終止コドンなど、翻訳に最低限必要な因子を含む形態であれば本発明では翻訳可能な形であることを意味する。
【００２８】
本発明において、翻訳されない形のヌクレオチド配列とは、理論上翻訳されることの無いように設計された形態であり、翻訳された場合でもその存在が無視できる程度に微量であること、言い換えれば実質的に翻訳されないことを示す。ごく微量の翻訳が確認されたとしても、融合タンパク質による影響を排除できるという本発明の特徴を否定する量でなければ、実質的に翻訳されないのと同等である。つまり、翻訳されない形のヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と、翻訳可能な形のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列とが、融合タンパク質として翻訳されることのない配列のことである。翻訳されない形のヌクレオチド配列は、翻訳に最低限必要な因子を欠くことにより翻訳されない配列である。
【００２９】
本明細書において、上流および下流とは、本発明の核酸構築物のプロモーターからＲＮＡが転写される方向に対する位置関係を示す。本発明の核酸構築物においては、プロモーター配列に近い方が上流であり、ポリＡシグナル配列に近い方が下流となる。
【００３０】
（１）本発明の核酸構築物
本発明の核酸構築物は、プロモーター配列、該配列に翻訳可能な形で連結された、少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびポリＡシグナル配列を有する核酸構築物であって、
該核酸構築物はプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間には前記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有し、
プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる翻訳されないヌクレオチド配列は該核酸構築物より１分子のＲＮＡとして転写されるように連結されており、
さらに前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする核酸構築物である。
（Ａ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（Ｂ）天然においてタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
また、本発明の核酸構築物の１つの態様として、プロモーター配列、ポリＡシグナル配列、およびプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間に挿入された、前記プロモーターの作用により１分子のＲＮＡとして転写されるＤＮＡ配列を有する核酸構築物であって、前記ＤＮＡ配列が下記から選択されることを特徴とする核酸構築物が例示される。
（Ａ）レポーター遺伝子配列に接続された翻訳されないヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列であって、当該ＤＮＡからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、ヌクレオチド配列は翻訳されない形でコードされるＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列、および
（Ｂ）レポーター遺伝子配列とこれに隣接する制限酵素認識切断部位を有するＤＮＡ配列であって、前記制限酵素認識切断部位にヌクレオチド配列が挿入された場合、当該ＤＮＡからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、かつヌクレオチド配列は翻訳されない形でコードされるＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列。
【００３１】
本発明を特に限定するものではないが、通常、前記の翻訳されないヌクレオチド配列は、翻訳可能な形のヌクレオチド配列とは異なる遺伝子に由来する。本発明の核酸構築物としては、特に限定はされないが例えば、プロモーター配列、レポーター遺伝子配列、終止コドンとして機能する配列、翻訳されないヌクレオチド配列、ポリＡシグナル配列の順に並んだ核酸構築物であってもよい。また、プロモーター配列、翻訳されないヌクレオチド配列、開始コドンとして機能する配列、レポーター遺伝子配列、ポリＡシグナル配列の順に並んだ核酸構築物であってもよい。
【００３２】
本発明の核酸構築物において、翻訳されないヌクレオチド配列（例えば標的遺伝子由来の配列）は該核酸構築物から転写されるＲＮＡのＵＴＲとして存在し、翻訳されないため、融合タンパク質が生じることなく、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えばレポータータンパク質をコードする遺伝子配列）からは前記タンパク質が機能を保った形で発現される。前記ＲＮＡ中の翻訳されないヌクレオチド配列をコードする領域を分解するようなヌクレオチド分子、例えばリボザイムやｓｉＲＮＡが存在すると、ＲＮＡ全体が不安定となり、この結果翻訳可能な形で連結されたヌクレオチド配列にコードされたタンパク質の発現が減少する。したがって、本発明の核酸構築物から転写されるＲＮＡまたは該ＲＮＡからの翻訳産物の変化を追跡することにより、翻訳されないヌクレオチド配列の発現を効果的に抑制できる分子を普遍的かつ容易に検索できる。
【００３３】
翻訳されないヌクレオチド配列は実質的に翻訳されない配列であれば、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流にあってもよく、下流にあってもよい。また、翻訳されないヌクレオチド配列は翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と異なる遺伝子由来の配列であっても良い。
【００３４】
翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流にある場合、本発明の核酸構築物は翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳されないよう配置されていれば特に限定はないが、例えば翻訳の開始コドン（例えばＡＴＧ）を含まないように特定の領域を選択して翻訳されない形の配列としても良く、開始コドンとして機能する可能性を有する配列があれば、塩基の置換、付加、欠失、挿入を行うことにより前記コドンを改変し、翻訳されない配列としても良い。
【００３５】
翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流にある場合、本発明の核酸構築物は翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳されないよう配置されていれば特に限定はない。例えば翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と翻訳されないヌクレオチド配列の間に終止コドンとして機能する配列（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）を配置すれば良い。この場合、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンから連続する３塩基ずつの読み枠（コドン）が終止コドンを規定し、この終止コドンによりＲＮＡの翻訳が翻訳可能な形で連結されたタンパク質でストップし、下流の翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳されない。従って、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と翻訳されないヌクレオチド配列がコードするタンパク質の融合タンパク質が生じることなく、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の翻訳産物がｍＲＮＡの安定性を反映しながら発現することが期待できる。
【００３６】
本発明の核酸構築物は、機能的ヌクレオチド分子による遺伝子発現の変化を検出する方法に用いることができる。
【００３７】
本発明の核酸構築物に含まれるプロモーター配列は、真核細胞内またはそれに類似した環境（例えば、無細胞タンパク質発現系）においてＲＮＡの転写開始反応に関与する活性を有する配列であれば何でもよく、真核細胞生物由来のプロモーター配列（例えば、βアクチンプロモーター、Ｕ６プロモーター）、真核細胞内でプロモーター活性を有するウイルス由来のプロモーター配列（例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター）のいずれもが使用できる。また、転写反応が行われる環境（生物個体、培養細胞、無細胞タンパク質合成系、等）に応じて適切なプロモーターを選択することができる。例えば、無細胞タンパク質合成系の場合には、使用されるＲＮＡポリメラーゼに対応するものを選択すればよく、上記真核細胞生物由来、ウイルス由来のプロモーター配列のほか、Ｔ７ファージなどのファージ由来のプロモーター配列を選択しても良い。特に限定はされないが、タンパク質の発現を抑制する機能的ヌクレオチド分子を検索する場合は、明確にその抑制の程度を判断できるように、恒常的に強く発現するプロモーターが好適に使用できる。
【００３８】
本発明の核酸構築物に含まれる翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列として、レポーター遺伝子配列が挙げられる。レポーター遺伝子配列は、直接的及び／又は間接的に検出しうる任意のタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列であれば限定は無い。レポーター遺伝子がコードするタンパク質（レポータータンパク質）としては、特に限定はされないが、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼなどの特異的に検出可能な物質を生産する酵素、ならびに直接的に検出されうるタンパク質が例示される。前記レポーター遺伝子は、その有用な特徴を保持する範囲において、その一部のみを選択して使用してもよく、複数のレポーター遺伝子を組み合わせても良い。直接的にタンパク質を検出する方法としては、レポータータンパク質を認識する特異抗体の使用により検出する方法、蛍光シグナルを生じるレポータータンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蛍光を検出する方法、及び薬剤耐性形質を付与するような選択マーカータンパク質が例示される。これらのレポータータンパク質により細胞をｓｏｒｔｉｎｇすることができる。例えば蛍光シグナルを生じるレポータータンパク質の場合は、そのタンパク質を発現する細胞をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）法により選択することができ有用である。
【００３９】
本発明の核酸構築物に含まれる翻訳されないヌクレオチド配列は、興味の対象である（発現を変化させることが望まれる）標的遺伝子のいずれの領域であってよく、標的タンパク質のコード領域、コード領域の一部、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲのいずれもが翻訳されないヌクレオチド配列として選択できる。また、翻訳されないヌクレオチド配列は複数の遺伝子由来の配列が並んでいてもよい。さらに興味の対象である生物由来のゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、特定の器官、時期で発現しているｃＤＮＡライブラリーなどから作製された核酸（群）を、翻訳されないヌクレオチド配列としてもよい。
【００４０】
本発明の核酸構築物は、導入された宿主細胞中もしくは転写反応液中において、１分子のＲＮＡとして転写される。該ＲＮＡは、機能的ヌクレオチド分子により不安定化されうる。例えば、機能的ヌクレオチド分子として、ＲＮＡの翻訳されないヌクレオチド配列領域に、該領域の塩基配列を認識して作用し、結果的にＲＮＡ全体を不安定化させる分子が挙げられる。例えば、ＲＮＡｉ機構におけるｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）、生物の発生段階に関与しているとされるｓｔＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）、広範な生命現象に関与していると思われるｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡを含むタンパク質複合体ｍｉＲＮＰ、リボザイム、マキシザイム、ハンマーヘッドリボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ＥＧＳ（Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびこれらのヌクレオチド分子を含むタンパク質複合体などについて、本発明の方法によりその作用を調べることができる。
【００４１】
本発明の核酸構築物より転写されたＲＮＡから、レポータータンパク質などの翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、融合タンパク質となることなく、単独のタンパク質として自然に近い状態で安定的に発現する。したがって、本発明の遺伝子発現の検出方法においては、例えば、レポータータンパク質の発現が抑制された場合、この現象が標的遺伝子にコードされるタンパク質とレポータータンパク質が融合タンパク質となったために、レポータータンパク質の本来の機能に変化を生じたことに起因する現象である可能性を排除することができる。また、機能的なヌクレオチド分子が翻訳されないヌクレオチド配列に翻訳機構を阻害するように作用して、レポータータンパク質の本来の機能に変化を生じたことに起因する現象である可能性を排除することができる。
さらに、翻訳されないヌクレオチド配列はタンパク質に翻訳する必要がないため、翻訳されないヌクレオチド配列の読み枠（コドン：それぞれのアミノ酸に対応する３塩基連鎖）を合わせる必要がない。従って、本発明の核酸構築物は、適切な制限酵素認識部位を選択する、塩基を挿入もしくは削除するなどの読み枠を合わせる必要がないため、翻訳されないヌクレオチド配列と翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の連結が容易である。
【００４２】
本発明においては、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列とこれに隣接する制限酵素認識切断部位を有する核酸構築物であって、前記制限酵素認識切断部位に翻訳されないヌクレオチド配列が挿入された場合、当該核酸構築物からは、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列が翻訳可能な形で、かつ翻訳されないヌクレオチド配列は実質的に翻訳されない形でコードされるＲＮＡが転写される核酸構築物も本発明の核酸構築物に含まれる。該核酸構築物は、使用する際に目的に応じて自由に標的遺伝子配列を挿入することができ有用である。制限酵素認識切断部位は、興味の対象である標的遺伝子配列を挿入するのに都合のよい配列であれば何でもよい。特に限定はされないが、例えばクローニングサイト、マルチクローニングサイトと呼ばれる１つもしくは複数の制限酵素サイトが並んだ配列が挙げられ、市販のベクター、リンカーなどで広く一般に使用されている配列が好適に使用できる。
【００４３】
本発明の核酸構築物において、ポリＡシグナル配列はｍＲＮＡの３’末端にポリＡ付加反応を生じさせる配列である。ポリＡシグナル配列は、ポリＡ付加反応を生じさせる配列であれば特に限定はない。例えば、高等真核生物のｍＲＮＡに高度に保存されていて、通常ポリＡ付加部位の１１〜３０塩基上流に存在するＡＡＵＡＡＡ塩基配列が挙げられる。
【００４４】
本発明の核酸構築物において、ポリＡシグナル配列の下流にターミネーター配列を配置してもよい。ターミネーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡの転写を終結させる機能を有する配列であれば何でもよい。特に限定はされないが、高等真核生物においては、ＲＮＡポリメラーゼはターミネーター配列内の複数の部位でＲＮＡの合成を終結する。
【００４５】
本発明の核酸構築物に含まれるポリＡシグナル配列、ターミネーター配列は、ＲＮＡの転写反応を行う環境に合わせて適宜選択することができる。タンパク質の発現ベクターが宿主に合わせて多数市販されており、これらのベクターを基に、又は組み合わせることにより、本発明の核酸構築物を作成してもよい。特に限定はされないが、例えば、ウシ由来のＢＧＨｐｏｌｙＡシグナル配列、ターミネーター配列が使用できる。
【００４６】
（２）本発明のベクター
本発明のベクターは、本発明の核酸構築物を含有するベクターであり、適当な宿主細胞中やその環境に類似した反応溶液中においてレポーター遺伝子配列に代表される翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列、標的遺伝子配列に代表される翻訳されないヌクレオチド配列、ポリＡシグナル配列を同一分子内に含有するＲＮＡが転写されるベクターであれば何でもよい。また、本発明のベクターを作製するために使用するベクターも、本発明の核酸構築物を含有していれば本発明のベクターに含まれる。本発明のベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、自立複製しうるベクター、ウイルスベクター、宿主の染色体に組み込まれるベクター、一時的、一過的に発現するベクターのいずれであってもよい。本発明の核酸構築物に含まれるプロモーター配列、遺伝子配列、機能的ヌクレオチド分子に応じて、適合する種由来のベクター、宿主を選択することが好ましい。現在、多くの宿主−ベクター系が市販されており、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４７】
（３）本発明のＲＮＡ
本発明のＲＮＡは、翻訳可能な形の少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有するＲＮＡであって、前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とするＲＮＡである；
（Ａ）前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（Ｂ）天然において前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
【００４８】
本発明のＲＮＡは、本発明の核酸構築物をインビボ、インビトロにおいて、転写することにより作製することができる。また、本発明のＲＮＡを構成する各構成成分であるＲＮＡを連結して作製することができる。
【００４９】
本発明のＲＮＡは、本発明の標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子を検索する方法、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法に使用することができる。
【００５０】
（４）本発明の機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用の検出方法
本発明の機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法は、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する（１）記載の核酸構築物もしくは（２）記載のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法である。
【００５１】
また、本発明の機能的ヌクレオチド分子を検索する方法の１つの態様として、以下の工程を包含する機能的ヌクレオチド分子の検索方法が挙げられる。
（Ａ）本発明の核酸構築物もしくはベクター、つまりプロモーター配列、ポリＡシグナル配列、およびプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間に挿入された、前記プロモーターの作用により１分子のＲＮＡとして転写されるＤＮＡ配列を有する核酸構築物もしくは該核酸構築物を含有するベクターを用意する。ここで前記ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子配列に接続された翻訳されないヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列であって、当該ＤＮＡからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、ヌクレオチド配列は翻訳されない形でコードされるＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列である。
（Ｂ）（Ａ）の核酸構築物もしくはベクターを用いてＲＮＡを転写させる。
（Ｃ）（Ｂ）のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる。
（Ｄ）ＲＮＡのレポーター遺伝子領域またはレポータータンパク質を検出する。
【００５２】
本発明の核酸構築物又は該核酸構築物を含有するベクターを用いて翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列、翻訳されないヌクレオチド配列、ポリＡシグナル配列の一連の配列を含むＲＮＡを転写し、もしくは本発明のＲＮＡを用意し、このＲＮＡとヌクレオチド分子と接触させて、ＲＮＡの翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相当する部分や翻訳されたタンパク質を検出、比較し、機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出することができる。上記検出の結果、変化を生じるヌクレオチドが機能的なヌクレオチドであると判断することができる。また、本発明においては、上記検出方法を用いて、複数のヌクレオチド分子の中から標的遺伝子の発現を変化させる機能的なヌクレオチド分子を検索（スクリーニング）することが可能である。上記ＲＮＡの転写、ヌクレオチド分子との接触、タンパク質の発現は、細胞内、細胞外のいずれで行われてもよく、並行して、もしくは順に行われてもよい。機能的ヌクレオチド分子を検索する方法に特に限定はないが、例えば、本発明の核酸構築物又は本発明のベクターと、機能的ヌクレオチド分子を宿主細胞に導入し、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を確認すればよい。
【００５３】
機能的ヌクレオチド分子は、標的とする核酸配列もしくはその一部を基に化学的に合成してもよく、生合成してもよく、宿主細胞で生産されるように設計されたベクターを宿主細胞に導入して細胞中で発現した生産物であってもよい。また、機能的ヌクレオチド分子は複数の種類であっても良く、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、器官・時期特異的ｃＤＮＡライブラリー由来の複数のヌクレオチドであってもよい。このようなライブラリーを用いることにより、標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子をスクリーニングすることができる。
【００５４】
本発明の方法においては、本発明の核酸構築物、ベクターから転写されたＲＮＡや本発明のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させ、接触後のＲＮＡを直接検出もしくは該ＲＮＡの翻訳産物を検出することができる。ＲＮＡを直接検出する方法は、多くの方法が報告されているが、ＲＮＡの定性的または定量的な検出が可能な方法であれば何でもよい。特に限定はされないが、例えば濃度の測定、ゲル電気泳動法、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、リアルタイムＰＴ−ＰＣＲ法、ＴＡＳ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、Ｑβレプリカーゼ法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、が挙げられる。
【００５５】
宿主細胞に本発明の核酸構築物、本発明のベクター、機能的ヌクレオチド分子、機能的オリゴヌクレオチド分子を生産しうる核酸構築物を導入する方法は、核酸構築物、ベクターに応じて適切な方法を選択すればよく、特に限定はされないが、物理的、化学的に直接導入してもよく、感染により導入してもよい。
【００５６】
（５）本発明のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法
本発明のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法は、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する本発明の第１の発明の核酸構築物もしくは本発明の第２の発明のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいてヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法である。
【００５７】
本発明のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法においては、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、器官時期特異的ｃＤＮＡライブラリー由来の複数の標的配列を翻訳されないヌクレオチド配列として作製した本発明の核酸構築物又はベクターを用意し、複数種の翻訳されないヌクレオチド配列を含む複数種のＲＮＡを転写しもしくは複数種の本発明のＲＮＡを用意し、該ＲＮＡに機能的ヌクレオチド分子を接触させ、ＲＮＡの翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相当する部分又は翻訳されたタンパク質を検出することにより、該機能的ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子をスクリーニングでき、該機能的ヌクレオチド分子の作用を検索することもできる。この方法には、プロモーター配列、ポリＡシグナル配列、およびプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間に挿入された、前記プロモーターの作用により１分子のＲＮＡとして転写されるＤＮＡ配列を有する核酸構築物が好適に使用できる。ここで前記ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子配列とこれに隣接する制限酵素認識切断部位を有するＤＮＡ配列であって、前記制限酵素認識切断部位に標的遺伝子配列が挿入された場合、当該ＤＮＡからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、かつ標的遺伝子配列由来の産物は翻訳されない形でコードされるＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列である。
【００５８】
（６）本発明のキット
本発明は、前述の（４）、（５）で例示した本発明の機能的ヌクレオチド分子を検索する方法や、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法に使用されるキットを提供する。１つの実施態様において、パッケージされた形態において、前出の（１）で示した本発明の核酸構築物、もしくは、該核酸構築物中の翻訳されない形の遺伝子配列の代わりにクローニングサイトに置き換え、使用者が好みの標的遺伝子由来の配列を挿入できる核酸構築物を含有するキットも本発明のキットに含まれる。また本発明のキットには、指示書が含まれていてもよい。
【００５９】
上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
【００６０】
さらに、前述の（２）で示したベクター、（３）で示したＲＮＡを包含したキットも本発明のキットに含まれる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素消化などの基本的な操作にてついては上記のモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版に記載の方法によった。さらに、以下に示す大腸菌を用いたプラスミドの構築には、特に記載のない限り大腸菌ＪＭ１０９を宿主として使用した。また、形質転換された大腸菌は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）、あるいは上記培地に１．５％の寒天を加え固化させたＬＢ−アンピシリンプレートを用いて３７℃で好気的に培養した。細胞の培養は、培地としてダルベッコ改変イーグル培地（バイオウィタカ社製）に１０％ウシ胎児血清（バイオウィタカ社製）を加えたものを使用し、細胞培養用シャーレ（イワキガラス社製）に接種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で湿潤培養インキュベーター内において行なった。キットの使用および各種機器の取り扱いは添付の操作説明書に従って行なった
【００６２】
実施例１ マウスＦａｓ遺伝子配列を持つ標的プラスミドの構築
プラスミドｐＱＢＩ２５（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ社製）はＣＭＶプロモーター、ｒｓＧＦＰ（ｒｅｄ ｓｈｉｆｔｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、ＢＧＨｐｏｌｙＡを持ち、細胞内で効率よくｒｓＧＦＰを発現する。ｒｓＧＦＰ遺伝子とＢＧＨｐｏｌｙＡの間には制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩが存在する。マウスＦａｓ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｍ８３６４９）の開始コドンの７５塩基下流から終止コドンまでの配列の両端に制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ ｃｏｈｅｓｉｖｅ末端が付加されたｄｓＤＮＡ（配列表の配列番号１）をｐＱＢＩ２５のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入することにより標的プラスミドｐＴａｒｇｅｔＦａｓを構築した。標的プラスミドは細胞内でｒｓＧＦＰ遺伝子配列とＦａｓ遺伝子の部分配列をもつＲＮＡを転写する。
【００６３】
実施例２ 効果的にＦａｓ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡの検索
マウスＦａｓ遺伝子の部分配列を持つ２１ｂｐの５種のｄｓＲＮＡを準備した。ＲＮＡ２−１（配列番号２）とＲＮＡ２−２（配列番号３）をアニールしてＲＮＡ２、ＲＮＡ３−１（配列番号４）とＲＮＡ３−２（配列番号５）をアニールしてＲＮＡ３、ＲＮＡ４−１（配列番号６）とＲＮＡ４−２（配列番号７）をアニールしてＲＮＡ４、ＲＮＡ５−１（配列番号８）とＲＮＡ５−２（配列番号９）をアニールしてＲＮＡ５、ＲＮＡ６−１（配列番号１０）とＲＮＡ６−２（配列番号１１）をアニールしてＲＮＡ６を調製した。これらのｄｓＲＮＡをそれぞれｐＴａｒｇｅｔＦａｓと共に２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１５７３）に導入した。遺伝子導入はリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とＲｉｂｏｊｕｉｃｅ（タカラバイオ社製）を用いて行なった。細胞を２日間培養したのち、トリプシンを用いてシャーレから剥がし、ＭｏＦｌｏ（タカラバイオ社製）により細胞の蛍光強度を測定した。結果を図１に示す。図１は、対照としてＲＮＡを導入しなかった細胞の蛍光強度を１００とした場合の相対値を示す。ＲＮＡ２とｐＴａｒｇｅｔＦａｓとを導入した細胞は最も蛍光強度が弱いことから、ＲＮＡ２を効果的にＦａｓ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡであると判断した。
【００６４】
実施例３ 実施例２の結果の確認
実施例２で得られたｓｉＲＮＡが有効である確認を次のようにして行なった。Ｆａｓを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１６５８）にＲＮＡ２、ＲＮＡ３、ＲＮＡ４、ＲＮＡ５、ＲＮＡ６をそれぞれＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（タカラバイオ社製）で導入した。２日後にこれらの細胞からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、Ｆａｓ ｍＲＮＡを定量した。対照としてＲＮＡを導入していない細胞を使用し、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いてデータの補正を行なった。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲコアキット（タカラバイオ社製）、スマートサイクラーシステム（タカラバイオ社製）を用いて行い、Ｆａｓのプライマーとして配列番号１２、１３のオリゴＤＮＡを、ＧＡＰＤＨのプライマーとしてＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（タカラバイオ社製）のプライマーをそれぞれ使用した。結果を図２に示す。図２は、対照としてＲＮＡを導入しなかった細胞のｍＲＮＡ量を１００とした場合の相対値を示す。Ｆａｓ ｍＲＮＡ量の減少は実施例２で得られたｒｓＧＦＰの蛍光強度の減少と一致することから、本スクリーニング法が有用であることが確認できた。
【００６５】
実施例４ ｒｓＧＦＰ（ｒｅｄ ｓｈｉｆｔｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子配列を持つ標的プラスミドの構築
ｒｓＧＦＰ−１（配列番号１４）とｒｓＧＦＰ−２（配列番号１５）をプライマーとし、ｐＱＢＩ２５を鋳型として、ＰＣＲによりｒｓＧＦＰ遺伝子の開始コドンから終止コドン付近までを含み両端に制限酵素ＸｂａＩおよびＮｈｅＩを有するＤＮＡ断片（配列番号１６）を調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩおよびＮｈｅＩで処理して得られた、約７２０ｂｐのＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＬ３ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のホタルルシフェラーゼ遺伝子とＳＶ４０ｐｏｌｙＡの間に存在する制限酵素部位ＸｂａＩに挿入し、標的プラスミドｐＧＬ３−３’（ＧＦＰ）を構築した。
【００６６】
実施例５ 効果的にｒｓＧＦＰ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡの検索
ｒｓＧＦＰ遺伝子の部分配列を持つ２１ｂｐの５種のｄｓＲＮＡを準備した。ＲＮＡ７−１（配列番号１７）とＲＮＡ７−２（配列番号１８）をアニールしてＲＮＡ７、ＲＮＡ８−１（配列番号１９）とＲＮＡ８−２（配列番号２０）をアニールしてＲＮＡ８、ＲＮＡ９−１（配列番号２１）とＲＮＡ９−２（配列番号２２）をアニールしてＲＮＡ９、ＲＮＡ１０−１（配列番号２３）とＲＮＡ１０−２（配列番号２４）をアニールしてＲＮＡ１０を調製した。これらのｄｓＲＮＡをそれぞれｐＧＬ３−３’（ＧＦＰ）、さらにインターナルコントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼを発現するｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と共に２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１５７３）に導入した。遺伝子導入はＴｒａｎｓＩＴ２９３（タカラバイオ社製）とＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（タカラバイオ社製）を用いて行なった。ｓｉＲＮＡ濃度は終濃度が１．２５〜１６０ｎＭとなるように決定した。細胞を２４時間培養したのち、培養上清を除去した後ＰＢＳで一度洗浄し、脱イオン水で５倍希釈した５×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により細胞を溶解した。この溶解液１０μｌよりＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のプロトコールに従い、発光プレートリーダーであるＭｉｔｈｒａｓ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて、ホタルルシフェラーゼ発光値とウミシイタケルシフェラーゼ発光値を測定した。得られた発光値をもとに（相対発光強度）＝（ホタルルシフェラーゼ発光値）／（ウミシイタケルシフェラーゼ発光値）を算出した。結果を図３に示す。図３において、横軸は導入時のｓｉＲＮＡ濃度、縦軸は対照としてＲＮＡを導入しなかった細胞の（相対発光強度）を１００％とした場合の各サンプルの相対発光強度の相対値を示す。図３からＲＮＡ８、ＲＮＡ１０、ＲＮＡ９、ＲＮＡ７の順に相対発光強度の相対値が低い値を示すことが分かった。このことから、ＲＮＡ８、ＲＮＡ１０、ＲＮＡ９、ＲＮＡ７の順に効果的にｒｓＧＦＰ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡであると判断した。
【００６７】
実施例６ リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡｉ効果の比較
２９３細胞に、各ｓｉＲＮＡ７〜１０およびｒｓＧＦＰ発現プラスミド（ｐＱＢＩ２５）を、ＴｒａｎｓＩＴ２９３およびＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯを用いて導入した。２日後にこれらの細胞からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ｒｓＧＦＰ ｍＲＮＡを定量した。対照としてｐＱＢＩ２５のみを導入した細胞を使用し、ｐＱＢＩ２５に乗っているネオマイシン耐性遺伝子を用いてデータの補正を行なった。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲコアキット（タカラバイオ社製）、スマートサイクラーシステム（タカラバイオ社製）を用いて行い、ｒｓＧＦＰのプライマーとしてＧＦＰ−Ｂ−Ｆ（配列番号２５）、ＧＦＰ−Ｂ−Ｒ（配列番号２６）を、ネオマイシン耐性遺伝子のプライマーとしてＮｅｏ−Ｆ（配列番号２７）、Ｎｅｏ−Ｒ（配列番号２８）のオリゴＤＮＡをそれぞれ使用した。結果を図４に示す。図４において、横軸は使用したｓｉＲＮＡ名、縦軸は対照としてｐＱＢＩ２５のみを導入した細胞のｍＲＮＡ量を１００とした場合の相対値を示す。図４においてｒｓＧＦＰ ｍＲＮＡ量の減少は実施例５で得られたホタルルシフェラーゼの相対発光強度の相対値の減少と一致することから、実施例４〜５記載のｓｉＲＮＡ検索法が有用であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、より多くの標的遺伝子に普遍的に対応でき、ＲＮＡを不安定化させることにより標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド分子の検索方法が提供された。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ２−１．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ２−２．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ３−１．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ３−２．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ４−１．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ４−２．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ５−１．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ５−２．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ６−１．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ６−２．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ Ｆａｓ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ Ｆａｓ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｒｓＧＦＰ−１ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｒｓＧＦＰ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｒｓＧＦＰ−２ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｒｓＧＦＰ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６：ｒｓＧＦＰ ｇｅｎｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ７−１．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ７−２．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ８−１．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ８−２．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ９−１．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ９−２．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ１０−１．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ１０−２．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ＧＦＰ−Ｂ−Ｆ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｒｓＧＦＰ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ＧＦＰ−Ｂ−Ｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｒｓＧＦＰ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｏ−Ｆ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｏ−Ｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ．
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の発現を効果的に抑制できる核酸の普遍的検索法に関する。さらに、該方法に使用する核酸構築物、ベクター、該方法のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の発現量は多様な方法で制御されている。例えば、転写因子による遺伝子からｍＲＮＡへの転写制御、ｍＲＮＡからアミノ酸配列への翻訳の制御、ヌクレアーゼによるｍＲＮＡ分解に対するｍＲＮＡの安定性の制御などにより、細胞は常に目的の発現量を保つよう制御している。
【０００３】
タンパク質の発現量をｍＲＮＡの段階で人工的に抑制する方法として、ｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡによる抑制、リボザイムによるｍＲＮＡの分解、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）などが挙げられる。これらの方法においては、タンパク質をコードする核酸配列、およびその周辺の核酸配列のどの領域を標的とするかにより、その抑制効果が著しく異なることが知られている（例えば、非特許文献１）。タンパク質の発現量を確認する方法として、通常、標的のタンパク質とレポータータンパク質の融合タンパク質を合成し、そのレポータータンパク質を指標にタンパク質の発現量を推測している。そして、標的のタンパク質とレポータータンパク質の融合タンパク質の全長が翻訳されているかを確認するために、標的のタンパク質の下流にレポータータンパク質を融合させる方法が通常用いられている。従って、レポーター遺伝子が翻訳可能な形で、これに隣接する標的のタンパク質をコードする核酸配列が翻訳されない形で連結されたＤＮＡは知られていない。
【０００４】
例えば、Ｎｉｌｓｅｎ ＴＷらは、標的のタンパク質とその下流にレポータータンパク質を融合させた融合タンパク質を発現するＤＮＡを構築し、レポータータンパク質の発現を調べることにより、標的の核酸配列の発現を効果的に抑制できるリボザイム等の検索を行なっている（例えば、特許文献１）。しかしながら、機能を持つ融合タンパクを発現することは容易ではなく、融合したためにタンパク質としての機能を失うことは少なくない。従って、レポータータンパク質が検出されなかったとしても、ｍＲＮＡの分解によるｍＲＮＡの不安定化によるものか、ｍＲＮＡの立体構造の変化によるものか、翻訳機構の阻害によるものか、レポータータンパク質としての機能を失ったのか、さらなる詳細な検証が必要となる。このような、融合タンパク質、キメラタンパク質を生じることなく、標的遺伝子由来の配列に作用する分子の検索方法は知られていない。
【０００５】
従って、より多くの核酸配列に普遍的に対応でき、ｍＲＮＡの安定性を変化させることにより発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子の検索方法が求められていた。
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０００２２７８号明細書
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ．９ Ｎｏ．３ ３４７頁（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、より多くの核酸配列に普遍的に対応できる、標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子の検索方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の事情を鑑み、鋭意研究及び探索を行った結果、プロモーター配列、少なくとも２つの遺伝子配列及びポリＡシグナル配列を有する核酸構築物であって、前記少なくとも２つの遺伝子配列は１分子のＲＮＡとして転写され、少なくとも１つの遺伝子配列が翻訳可能な形であり、少なくとも１つの遺伝子配列が実質的に翻訳されない形でコードされる核酸構築物を構築することにより、より多くの核酸配列に普遍的に対応でき、ｍＲＮＡの安定性を変化させて翻訳されない形の遺伝子配列がコードするタンパク質の発現を変化させることができる分子を検索できることを見出した。さらに、上記の核酸構築物がより多くの核酸配列に普遍的に対応できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、プロモーター配列、該配列に翻訳可能な形で連結された、少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびポリＡシグナル配列を有する核酸構築物であって、
該核酸構築物はプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間には前記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有し、
プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる翻訳されないヌクレオチド配列は該核酸構築物より１分子のＲＮＡとして転写されるように連結されており、
さらに前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする核酸構築物に関する；
（Ａ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（Ｂ）天然においてタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
【００１０】
本発明の第１の発明において、翻訳されないヌクレオチド配列が、プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に位置している核酸構築物であってもよく、翻訳されないヌクレオチド配列が、プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流に位置している核酸構築物であってもよい。また、プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列がレポータータンパク質をコードするものである核酸構築物であってもよい。
【００１１】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の核酸構築物を含有するベクターに関する。
【００１２】
本発明の第３の発明は、翻訳可能な形の少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有するＲＮＡであって、前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とするＲＮＡに関する；
（Ａ）前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（Ｂ）天然において前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
【００１３】
本発明の第４の発明は、機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であって、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する本発明の第１の発明の核酸構築物もしくは本発明の第２の発明のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法に関する。
【００１４】
本発明の第５の発明は、機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であって、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する本発明の第３の発明のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｃ）工程（Ｂ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法に関する。
【００１５】
本発明の第４、５の発明において、機能的ヌクレオチドによる標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出することを特徴とする、標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子の検索方法であってもよく、細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレオチド分子のＲＮＡへの接触が行われる機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であってもよい。
【００１６】
本発明の第６の発明は、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法であって、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する本発明の第１の発明の核酸構築物もしくは本発明の第２の発明のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいてヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法に関する。
【００１７】
本発明の第７の発明は、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法であって、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する本発明の第３の発明のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｃ）工程（Ｂ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法に関する。
【００１８】
本発明の第６、７の発明において、細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレオチド分子のＲＮＡへの接触が行われるヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法であってもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、より多くの標的遺伝子に普遍的に対応でき、ＲＮＡを不安定化させることにより標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド分子の検索方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図である。
【図２】本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図である。
【図３】本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図である。
【図４】本発明の機能的ヌクレオチド分子の検索方法による検索の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明に関して具体的に説明する。
【００２２】
本明細書において、核酸構築物はＤＮＡおよび／またはＲＮＡで構成された構築物である。核酸構築物は、上記ＤＮＡ、ＲＮＡのアナログや修飾化合物から構成されていてもよく、また、その一部に含んでいても良い。
本明細書において、標的遺伝子とは、発現の変化を起こすことが望まれる標的タンパク質をコードする核酸配列、および／または、その前後の核酸配列であり、本発明の核酸構築物又はベクターから転写されうる配列のことを示す。本明細書においては、目的の核酸配列、標的核酸配列と記載することもある。標的遺伝子は標的タンパク質の全長又はその一部をコードするヌクレオチド配列であっても良く、さらにその前後の５’ＵＴＲ（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎ：非翻訳領域）、３’ＵＴＲであっても良い。特に限定はされないが例えば、ＲＮＡｉ作用により発現を抑制することが望まれる対象であるタンパク質をコードする塩基配列及びその前後の配列（ｓｉＲＮＡ）のような機能的ヌクレオチド分子のことであり、ヌクレオチド分子を介した配列特異的ｍＲＮＡの分解の対象となる核酸配列をいう。遺伝子のエキソンに相当する配列、開始コドンとして機能する配列を含有しないように改変された配列も好適に使用できる。標的遺伝子は、真核細胞生物由来の配列、ウイルス由来の配列、原核細胞生物由来の配列のいずれであってもよい。ウイルス由来の標的遺伝子は、該ウイルスゲノムの分解、ウイルスの複製、増殖の抑制にかかわる機能的ヌクレオチド分子の検索に有用である。
【００２３】
本明細書において、コード領域とは、タンパク質のアミノ酸配列を直接規定する遺伝暗号からなる遺伝子内の領域を意味する。
【００２４】
本明細書において、ｍＲＮＡの不安定化とは、ｍＲＮＡの分解反応の増大を意味する。ｍＲＮＡは、合成と分解の２つの反応によりその蓄積量が決定されるが、合成反応と分解反応のバランスが分解反応に傾いた場合にｍＲＮＡが不安定化されるという。ｍＲＮＡの分解は、標的遺伝子由来の核酸配列を含むｍＲＮＡの分解であれば特に限定はなく、エンド的な分解、エキソ的な分解のどちらも含まれる。
【００２５】
本明細書において、ヌクレオチド分子とは、ヌクレオシドのリン酸エステル化合物を示す。ヌクレオチド分子は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらのキメラ分子であってよく、アナログや修飾されたヌクレオチドもヌクレオチド分子に含まれる。また、タンパク質、糖質などと共に複合体を形成していてもよい。
【００２６】
本明細書において、機能的ヌクレオチド分子とは、タンパク質の発現を変化させるヌクレオチド分子のことをいう。機能的ヌクレオチド分子には、標的タンパク質の発現を阻害する分子、本発明のＲＮＡの中の翻訳されないヌクレオチド配列に配列特異的に作用し、最終的にＲＮＡ全体を不安定化させる分子、ＲＮＡの中の翻訳されないヌクレオチド配列を配列特異的に分解し、最終的にＲＮＡ全体を不安定化させる分子も含まれる。機能的なヌクレオチド分子は、タンパク質や糖質などとともに複合体を形成していてもよい。
【００２７】
本発明において、翻訳可能な形のヌクレオチド配列とは、適切な条件、環境下において、タンパク質の合成が行われるように配置されたヌクレオチド配列である。翻訳は多数の因子の協働によりなされるが、翻訳開始シグナル（翻訳アクチベーター）、翻訳開始コドン、翻訳終止コドンなど、翻訳に最低限必要な因子を含む形態であれば本発明では翻訳可能な形であることを意味する。
【００２８】
本発明において、翻訳されない形のヌクレオチド配列とは、理論上翻訳されることの無いように設計された形態であり、翻訳された場合でもその存在が無視できる程度に微量であること、言い換えれば実質的に翻訳されないことを示す。ごく微量の翻訳が確認されたとしても、融合タンパク質による影響を排除できるという本発明の特徴を否定する量でなければ、実質的に翻訳されないのと同等である。つまり、翻訳されない形のヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列と、翻訳可能な形のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列とが、融合タンパク質として翻訳されることのない配列のことである。翻訳されない形のヌクレオチド配列は、翻訳に最低限必要な因子を欠くことにより翻訳されない配列である。
【００２９】
本明細書において、上流および下流とは、本発明の核酸構築物のプロモーターからＲＮＡが転写される方向に対する位置関係を示す。本発明の核酸構築物においては、プロモーター配列に近い方が上流であり、ポリＡシグナル配列に近い方が下流となる。
【００３０】
（１）本発明の核酸構築物
本発明の核酸構築物は、プロモーター配列、該配列に翻訳可能な形で連結された、少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびポリＡシグナル配列を有する核酸構築物であって、
該核酸構築物はプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間には前記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有し、
プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる翻訳されないヌクレオチド配列は該核酸構築物より１分子のＲＮＡとして転写されるように連結されており、
さらに前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする核酸構築物である。
（Ａ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（Ｂ）天然においてタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
また、本発明の核酸構築物の１つの態様として、プロモーター配列、ポリＡシグナル配列、およびプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間に挿入された、前記プロモーターの作用により１分子のＲＮＡとして転写されるＤＮＡ配列を有する核酸構築物であって、前記ＤＮＡ配列が下記から選択されることを特徴とする核酸構築物が例示される。
（Ａ）レポーター遺伝子配列に接続された翻訳されないヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列であって、当該ＤＮＡからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、ヌクレオチド配列は翻訳されない形でコードされるＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列、および
（Ｂ）レポーター遺伝子配列とこれに隣接する制限酵素認識切断部位を有するＤＮＡ配列であって、前記制限酵素認識切断部位にヌクレオチド配列が挿入された場合、当該ＤＮＡからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、かつヌクレオチド配列は翻訳されない形でコードされるＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列。
【００３１】
本発明を特に限定するものではないが、通常、前記の翻訳されないヌクレオチド配列は、翻訳可能な形のヌクレオチド配列とは異なる遺伝子に由来する。本発明の核酸構築物としては、特に限定はされないが例えば、プロモーター配列、レポーター遺伝子配列、終止コドンとして機能する配列、翻訳されないヌクレオチド配列、ポリＡシグナル配列の順に並んだ核酸構築物であってもよい。また、プロモーター配列、翻訳されないヌクレオチド配列、開始コドンとして機能する配列、レポーター遺伝子配列、ポリＡシグナル配列の順に並んだ核酸構築物であってもよい。
【００３２】
本発明の核酸構築物において、翻訳されないヌクレオチド配列（例えば標的遺伝子由来の配列）は該核酸構築物から転写されるＲＮＡのＵＴＲとして存在し、翻訳されないため、融合タンパク質が生じることなく、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えばレポータータンパク質をコードする遺伝子配列）からは前記タンパク質が機能を保った形で発現される。前記ＲＮＡ中の翻訳されないヌクレオチド配列をコードする領域を分解するようなヌクレオチド分子、例えばリボザイムやｓｉＲＮＡが存在すると、ＲＮＡ全体が不安定となり、この結果翻訳可能な形で連結されたヌクレオチド配列にコードされたタンパク質の発現が減少する。したがって、本発明の核酸構築物から転写されるＲＮＡまたは該ＲＮＡからの翻訳産物の変化を追跡することにより、翻訳されないヌクレオチド配列の発現を効果的に抑制できる分子を普遍的かつ容易に検索できる。
【００３３】
翻訳されないヌクレオチド配列は実質的に翻訳されない配列であれば、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流にあってもよく、下流にあってもよい。また、翻訳されないヌクレオチド配列は翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と異なる遺伝子由来の配列であっても良い。
【００３４】
翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流にある場合、本発明の核酸構築物は翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳されないよう配置されていれば特に限定はないが、例えば翻訳の開始コドン（例えばＡＴＧ）を含まないように特定の領域を選択して翻訳されない形の配列としても良く、開始コドンとして機能する可能性を有する配列があれば、塩基の置換、付加、欠失、挿入を行うことにより前記コドンを改変し、翻訳されない配列としても良い。
【００３５】
翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流にある場合、本発明の核酸構築物は翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳されないよう配置されていれば特に限定はない。例えば翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と翻訳されないヌクレオチド配列の間に終止コドンとして機能する配列（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）を配置すれば良い。この場合、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンから連続する３塩基ずつの読み枠（コドン）が終止コドンを規定し、この終止コドンによりＲＮＡの翻訳が翻訳可能な形で連結されたタンパク質でストップし、下流の翻訳されないヌクレオチド配列が翻訳されない。従って、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と翻訳されないヌクレオチド配列がコードするタンパク質の融合タンパク質が生じることなく、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の翻訳産物がｍＲＮＡの安定性を反映しながら発現することが期待できる。
【００３６】
本発明の核酸構築物は、機能的ヌクレオチド分子による遺伝子発現の変化を検出する方法に用いることができる。
【００３７】
本発明の核酸構築物に含まれるプロモーター配列は、真核細胞内またはそれに類似した環境（例えば、無細胞タンパク質発現系）においてＲＮＡの転写開始反応に関与する活性を有する配列であれば何でもよく、真核細胞生物由来のプロモーター配列（例えば、βアクチンプロモーター、Ｕ６プロモーター）、真核細胞内でプロモーター活性を有するウイルス由来のプロモーター配列（例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター）のいずれもが使用できる。また、転写反応が行われる環境（生物個体、培養細胞、無細胞タンパク質合成系、等）に応じて適切なプロモーターを選択することができる。例えば、無細胞タンパク質合成系の場合には、使用されるＲＮＡポリメラーゼに対応するものを選択すればよく、上記真核細胞生物由来、ウイルス由来のプロモーター配列のほか、Ｔ７ファージなどのファージ由来のプロモーター配列を選択しても良い。特に限定はされないが、タンパク質の発現を抑制する機能的ヌクレオチド分子を検索する場合は、明確にその抑制の程度を判断できるように、恒常的に強く発現するプロモーターが好適に使用できる。
【００３８】
本発明の核酸構築物に含まれる翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列として、レポーター遺伝子配列が挙げられる。レポーター遺伝子配列は、直接的及び／又は間接的に検出しうる任意のタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列であれば限定は無い。レポーター遺伝子がコードするタンパク質（レポータータンパク質）としては、特に限定はされないが、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼなどの特異的に検出可能な物質を生産する酵素、ならびに直接的に検出されうるタンパク質が例示される。前記レポーター遺伝子は、その有用な特徴を保持する範囲において、その一部のみを選択して使用してもよく、複数のレポーター遺伝子を組み合わせても良い。直接的にタンパク質を検出する方法としては、レポータータンパク質を認識する特異抗体の使用により検出する方法、蛍光シグナルを生じるレポータータンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蛍光を検出する方法、及び薬剤耐性形質を付与するような選択マーカータンパク質が例示される。これらのレポータータンパク質により細胞をｓｏｒｔｉｎｇすることができる。例えば蛍光シグナルを生じるレポータータンパク質の場合は、そのタンパク質を発現する細胞をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）法により選択することができ有用である。
【００３９】
本発明の核酸構築物に含まれる翻訳されないヌクレオチド配列は、興味の対象である（発現を変化させることが望まれる）標的遺伝子のいずれの領域であってよく、標的タンパク質のコード領域、コード領域の一部、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲのいずれもが翻訳されないヌクレオチド配列として選択できる。また、翻訳されないヌクレオチド配列は複数の遺伝子由来の配列が並んでいてもよい。さらに興味の対象である生物由来のゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、特定の器官、時期で発現しているｃＤＮＡライブラリーなどから作製された核酸（群）を、翻訳されないヌクレオチド配列としてもよい。
【００４０】
本発明の核酸構築物は、導入された宿主細胞中もしくは転写反応液中において、１分子のＲＮＡとして転写される。該ＲＮＡは、機能的ヌクレオチド分子により不安定化されうる。例えば、機能的ヌクレオチド分子として、ＲＮＡの翻訳されないヌクレオチド配列領域に、該領域の塩基配列を認識して作用し、結果的にＲＮＡ全体を不安定化させる分子が挙げられる。例えば、ＲＮＡｉ機構におけるｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）、生物の発生段階に関与しているとされるｓｔＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）、広範な生命現象に関与していると思われるｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡを含むタンパク質複合体ｍｉＲＮＰ、リボザイム、マキシザイム、ハンマーヘッドリボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ＥＧＳ（Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、およびこれらのヌクレオチド分子を含むタンパク質複合体などについて、本発明の方法によりその作用を調べることができる。
【００４１】
本発明の核酸構築物より転写されたＲＮＡから、レポータータンパク質などの翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、融合タンパク質となることなく、単独のタンパク質として自然に近い状態で安定的に発現する。したがって、本発明の遺伝子発現の検出方法においては、例えば、レポータータンパク質の発現が抑制された場合、この現象が標的遺伝子にコードされるタンパク質とレポータータンパク質が融合タンパク質となったために、レポータータンパク質の本来の機能に変化を生じたことに起因する現象である可能性を排除することができる。また、機能的なヌクレオチド分子が翻訳されないヌクレオチド配列に翻訳機構を阻害するように作用して、レポータータンパク質の本来の機能に変化を生じたことに起因する現象である可能性を排除することができる。
さらに、翻訳されないヌクレオチド配列はタンパク質に翻訳する必要がないため、翻訳されないヌクレオチド配列の読み枠（コドン：それぞれのアミノ酸に対応する３塩基連鎖）を合わせる必要がない。従って、本発明の核酸構築物は、適切な制限酵素認識部位を選択する、塩基を挿入もしくは削除するなどの読み枠を合わせる必要がないため、翻訳されないヌクレオチド配列と翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の連結が容易である。
【００４２】
本発明においては、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列とこれに隣接する制限酵素認識切断部位を有する核酸構築物であって、前記制限酵素認識切断部位に翻訳されないヌクレオチド配列が挿入された場合、当該核酸構築物からは、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列が翻訳可能な形で、かつ翻訳されないヌクレオチド配列は実質的に翻訳されない形でコードされるＲＮＡが転写される核酸構築物も本発明の核酸構築物に含まれる。該核酸構築物は、使用する際に目的に応じて自由に標的遺伝子配列を挿入することができ有用である。制限酵素認識切断部位は、興味の対象である標的遺伝子配列を挿入するのに都合のよい配列であれば何でもよい。特に限定はされないが、例えばクローニングサイト、マルチクローニングサイトと呼ばれる１つもしくは複数の制限酵素サイトが並んだ配列が挙げられ、市販のベクター、リンカーなどで広く一般に使用されている配列が好適に使用できる。
【００４３】
本発明の核酸構築物において、ポリＡシグナル配列はｍＲＮＡの３’末端にポリＡ付加反応を生じさせる配列である。ポリＡシグナル配列は、ポリＡ付加反応を生じさせる配列であれば特に限定はない。例えば、高等真核生物のｍＲＮＡに高度に保存されていて、通常ポリＡ付加部位の１１〜３０塩基上流に存在するＡＡＵＡＡＡ塩基配列が挙げられる。
【００４４】
本発明の核酸構築物において、ポリＡシグナル配列の下流にターミネーター配列を配置してもよい。ターミネーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡの転写を終結させる機能を有する配列であれば何でもよい。特に限定はされないが、高等真核生物においては、ＲＮＡポリメラーゼはターミネーター配列内の複数の部位でＲＮＡの合成を終結する。
【００４５】
本発明の核酸構築物に含まれるポリＡシグナル配列、ターミネーター配列は、ＲＮＡの転写反応を行う環境に合わせて適宜選択することができる。タンパク質の発現ベクターが宿主に合わせて多数市販されており、これらのベクターを基に、又は組み合わせることにより、本発明の核酸構築物を作成してもよい。特に限定はされないが、例えば、ウシ由来のＢＧＨｐｏｌｙＡシグナル配列、ターミネーター配列が使用できる。
【００４６】
（２）本発明のベクター
本発明のベクターは、本発明の核酸構築物を含有するベクターであり、適当な宿主細胞中やその環境に類似した反応溶液中においてレポーター遺伝子配列に代表される翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列、標的遺伝子配列に代表される翻訳されないヌクレオチド配列、ポリＡシグナル配列を同一分子内に含有するＲＮＡが転写されるベクターであれば何でもよい。また、本発明のベクターを作製するために使用するベクターも、本発明の核酸構築物を含有していれば本発明のベクターに含まれる。本発明のベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、自立複製しうるベクター、ウイルスベクター、宿主の染色体に組み込まれるベクター、一時的、一過的に発現するベクターのいずれであってもよい。本発明の核酸構築物に含まれるプロモーター配列、遺伝子配列、機能的ヌクレオチド分子に応じて、適合する種由来のベクター、宿主を選択することが好ましい。現在、多くの宿主−ベクター系が市販されており、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４７】
（３）本発明のＲＮＡ
本発明のＲＮＡは、翻訳可能な形の少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有するＲＮＡであって、前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とするＲＮＡである；
（Ａ）前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（Ｂ）天然において前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
【００４８】
本発明のＲＮＡは、本発明の核酸構築物をインビボ、インビトロにおいて、転写することにより作製することができる。また、本発明のＲＮＡを構成する各構成成分であるＲＮＡを連結して作製することができる。
【００４９】
本発明のＲＮＡは、本発明の標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子を検索する方法、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法に使用することができる。
【００５０】
（４）本発明の機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用の検出方法
本発明の機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法は、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する（１）記載の核酸構築物もしくは（２）記載のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法である。
【００５１】
また、本発明の機能的ヌクレオチド分子を検索する方法の１つの態様として、以下の工程を包含する機能的ヌクレオチド分子の検索方法が挙げられる。
（Ａ）本発明の核酸構築物もしくはベクター、つまりプロモーター配列、ポリＡシグナル配列、およびプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間に挿入された、前記プロモーターの作用により１分子のＲＮＡとして転写されるＤＮＡ配列を有する核酸構築物もしくは該核酸構築物を含有するベクターを用意する。ここで前記ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子配列に接続された翻訳されないヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列であって、当該ＤＮＡからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、ヌクレオチド配列は翻訳されない形でコードされるＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列である。
（Ｂ）（Ａ）の核酸構築物もしくはベクターを用いてＲＮＡを転写させる。
（Ｃ）（Ｂ）のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる。
（Ｄ）ＲＮＡのレポーター遺伝子領域またはレポータータンパク質を検出する。
【００５２】
本発明の核酸構築物又は該核酸構築物を含有するベクターを用いて翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列、翻訳されないヌクレオチド配列、ポリＡシグナル配列の一連の配列を含むＲＮＡを転写し、もしくは本発明のＲＮＡを用意し、このＲＮＡとヌクレオチド分子と接触させて、ＲＮＡの翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相当する部分や翻訳されたタンパク質を検出、比較し、機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出することができる。上記検出の結果、変化を生じるヌクレオチドが機能的なヌクレオチドであると判断することができる。また、本発明においては、上記検出方法を用いて、複数のヌクレオチド分子の中から標的遺伝子の発現を変化させる機能的なヌクレオチド分子を検索（スクリーニング）することが可能である。上記ＲＮＡの転写、ヌクレオチド分子との接触、タンパク質の発現は、細胞内、細胞外のいずれで行われてもよく、並行して、もしくは順に行われてもよい。機能的ヌクレオチド分子を検索する方法に特に限定はないが、例えば、本発明の核酸構築物又は本発明のベクターと、機能的ヌクレオチド分子を宿主細胞に導入し、翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を確認すればよい。
【００５３】
機能的ヌクレオチド分子は、標的とする核酸配列もしくはその一部を基に化学的に合成してもよく、生合成してもよく、宿主細胞で生産されるように設計されたベクターを宿主細胞に導入して細胞中で発現した生産物であってもよい。また、機能的ヌクレオチド分子は複数の種類であっても良く、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、器官・時期特異的ｃＤＮＡライブラリー由来の複数のヌクレオチドであってもよい。このようなライブラリーを用いることにより、標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子をスクリーニングすることができる。
【００５４】
本発明の方法においては、本発明の核酸構築物、ベクターから転写されたＲＮＡや本発明のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させ、接触後のＲＮＡを直接検出もしくは該ＲＮＡの翻訳産物を検出することができる。ＲＮＡを直接検出する方法は、多くの方法が報告されているが、ＲＮＡの定性的または定量的な検出が可能な方法であれば何でもよい。特に限定はされないが、例えば濃度の測定、ゲル電気泳動法、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、リアルタイムＰＴ−ＰＣＲ法、ＴＡＳ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、Ｑβレプリカーゼ法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、が挙げられる。
【００５５】
宿主細胞に本発明の核酸構築物、本発明のベクター、機能的ヌクレオチド分子、機能的オリゴヌクレオチド分子を生産しうる核酸構築物を導入する方法は、核酸構築物、ベクターに応じて適切な方法を選択すればよく、特に限定はされないが、物理的、化学的に直接導入してもよく、感染により導入してもよい。
【００５６】
（５）本発明のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法
本発明のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法は、下記工程；
（Ａ）翻訳されないヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する本発明の第１の発明の核酸構築物もしくは本発明の第２の発明のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいてヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法である。
【００５７】
本発明のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法においては、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、器官時期特異的ｃＤＮＡライブラリー由来の複数の標的配列を翻訳されないヌクレオチド配列として作製した本発明の核酸構築物又はベクターを用意し、複数種の翻訳されないヌクレオチド配列を含む複数種のＲＮＡを転写しもしくは複数種の本発明のＲＮＡを用意し、該ＲＮＡに機能的ヌクレオチド分子を接触させ、ＲＮＡの翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相当する部分又は翻訳されたタンパク質を検出することにより、該機能的ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子をスクリーニングでき、該機能的ヌクレオチド分子の作用を検索することもできる。この方法には、プロモーター配列、ポリＡシグナル配列、およびプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間に挿入された、前記プロモーターの作用により１分子のＲＮＡとして転写されるＤＮＡ配列を有する核酸構築物が好適に使用できる。ここで前記ＤＮＡ配列はレポーター遺伝子配列とこれに隣接する制限酵素認識切断部位を有するＤＮＡ配列であって、前記制限酵素認識切断部位に標的遺伝子配列が挿入された場合、当該ＤＮＡからは、レポーター遺伝子産物が翻訳可能な形で、かつ標的遺伝子配列由来の産物は翻訳されない形でコードされるＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列である。
【００５８】
（６）本発明のキット
本発明は、前述の（４）、（５）で例示した本発明の機能的ヌクレオチド分子を検索する方法や、ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法に使用されるキットを提供する。１つの実施態様において、パッケージされた形態において、前出の（１）で示した本発明の核酸構築物、もしくは、該核酸構築物中の翻訳されない形の遺伝子配列の代わりにクローニングサイトに置き換え、使用者が好みの標的遺伝子由来の配列を挿入できる核酸構築物を含有するキットも本発明のキットに含まれる。また本発明のキットには、指示書が含まれていてもよい。
【００５９】
上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
【００６０】
さらに、前述の（２）で示したベクター、（３）で示したＲＮＡを包含したキットも本発明のキットに含まれる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素消化などの基本的な操作にてついては上記のモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版に記載の方法によった。さらに、以下に示す大腸菌を用いたプラスミドの構築には、特に記載のない限り大腸菌ＪＭ１０９を宿主として使用した。また、形質転換された大腸菌は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）、あるいは上記培地に１．５％の寒天を加え固化させたＬＢ−アンピシリンプレートを用いて３７℃で好気的に培養した。細胞の培養は、培地としてダルベッコ改変イーグル培地（バイオウィタカ社製）に１０％ウシ胎児血清（バイオウィタカ社製）を加えたものを使用し、細胞培養用シャーレ（イワキガラス社製）に接種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で湿潤培養インキュベーター内において行なった。キットの使用および各種機器の取り扱いは添付の操作説明書に従って行なった
【００６２】
実施例１ マウスＦａｓ遺伝子配列を持つ標的プラスミドの構築
プラスミドｐＱＢＩ２５（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ社製）はＣＭＶプロモーター、ｒｓＧＦＰ（ｒｅｄ ｓｈｉｆｔｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、ＢＧＨｐｏｌｙＡを持ち、細胞内で効率よくｒｓＧＦＰを発現する。ｒｓＧＦＰ遺伝子とＢＧＨｐｏｌｙＡの間には制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩが存在する。マウスＦａｓ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｍ８３６４９）の開始コドンの７５塩基下流から終止コドンまでの配列の両端に制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ ｃｏｈｅｓｉｖｅ末端が付加されたｄｓＤＮＡ（配列表の配列番号１）をｐＱＢＩ２５のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入することにより標的プラスミドｐＴａｒｇｅｔＦａｓを構築した。標的プラスミドは細胞内でｒｓＧＦＰ遺伝子配列とＦａｓ遺伝子の部分配列をもつＲＮＡを転写する。
【００６３】
実施例２ 効果的にＦａｓ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡの検索
マウスＦａｓ遺伝子の部分配列を持つ２１ｂｐの５種のｄｓＲＮＡを準備した。ＲＮＡ２−１（配列番号２）とＲＮＡ２−２（配列番号３）をアニールしてＲＮＡ２、ＲＮＡ３−１（配列番号４）とＲＮＡ３−２（配列番号５）をアニールしてＲＮＡ３、ＲＮＡ４−１（配列番号６）とＲＮＡ４−２（配列番号７）をアニールしてＲＮＡ４、ＲＮＡ５−１（配列番号８）とＲＮＡ５−２（配列番号９）をアニールしてＲＮＡ５、ＲＮＡ６−１（配列番号１０）とＲＮＡ６−２（配列番号１１）をアニールしてＲＮＡ６を調製した。これらのｄｓＲＮＡをそれぞれｐＴａｒｇｅｔＦａｓと共に２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１５７３）に導入した。遺伝子導入はリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とＲｉｂｏｊｕｉｃｅ（タカラバイオ社製）を用いて行なった。細胞を２日間培養したのち、トリプシンを用いてシャーレから剥がし、ＭｏＦｌｏ（タカラバイオ社製）により細胞の蛍光強度を測定した。結果を図１に示す。図１は、対照としてＲＮＡを導入しなかった細胞の蛍光強度を１００とした場合の相対値を示す。ＲＮＡ２とｐＴａｒｇｅｔＦａｓとを導入した細胞は最も蛍光強度が弱いことから、ＲＮＡ２を効果的にＦａｓ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡであると判断した。
【００６４】
実施例３ 実施例２の結果の確認
実施例２で得られたｓｉＲＮＡが有効である確認を次のようにして行なった。Ｆａｓを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１６５８）にＲＮＡ２、ＲＮＡ３、ＲＮＡ４、ＲＮＡ５、ＲＮＡ６をそれぞれＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（タカラバイオ社製）で導入した。２日後にこれらの細胞からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、Ｆａｓ ｍＲＮＡを定量した。対照としてＲＮＡを導入していない細胞を使用し、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いてデータの補正を行なった。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲコアキット（タカラバイオ社製）、スマートサイクラーシステム（タカラバイオ社製）を用いて行い、Ｆａｓのプライマーとして配列番号１２、１３のオリゴＤＮＡを、ＧＡＰＤＨのプライマーとしてＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（タカラバイオ社製）のプライマーをそれぞれ使用した。結果を図２に示す。図２は、対照としてＲＮＡを導入しなかった細胞のｍＲＮＡ量を１００とした場合の相対値を示す。Ｆａｓ ｍＲＮＡ量の減少は実施例２で得られたｒｓＧＦＰの蛍光強度の減少と一致することから、本スクリーニング法が有用であることが確認できた。
【００６５】
実施例４ ｒｓＧＦＰ（ｒｅｄ ｓｈｉｆｔｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子配列を持つ標的プラスミドの構築
ｒｓＧＦＰ−１（配列番号１４）とｒｓＧＦＰ−２（配列番号１５）をプライマーとし、ｐＱＢＩ２５を鋳型として、ＰＣＲによりｒｓＧＦＰ遺伝子の開始コドンから終止コドン付近までを含み両端に制限酵素ＸｂａＩおよびＮｈｅＩを有するＤＮＡ断片（配列番号１６）を調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩおよびＮｈｅＩで処理して得られた、約７２０ｂｐのＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＬ３ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のホタルルシフェラーゼ遺伝子とＳＶ４０ｐｏｌｙＡの間に存在する制限酵素部位ＸｂａＩに挿入し、標的プラスミドｐＧＬ３−３’（ＧＦＰ）を構築した。
【００６６】
実施例５ 効果的にｒｓＧＦＰ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡの検索
ｒｓＧＦＰ遺伝子の部分配列を持つ２１ｂｐの５種のｄｓＲＮＡを準備した。ＲＮＡ７−１（配列番号１７）とＲＮＡ７−２（配列番号１８）をアニールしてＲＮＡ７、ＲＮＡ８−１（配列番号１９）とＲＮＡ８−２（配列番号２０）をアニールしてＲＮＡ８、ＲＮＡ９−１（配列番号２１）とＲＮＡ９−２（配列番号２２）をアニールしてＲＮＡ９、ＲＮＡ１０−１（配列番号２３）とＲＮＡ１０−２（配列番号２４）をアニールしてＲＮＡ１０を調製した。これらのｄｓＲＮＡをそれぞれｐＧＬ３−３’（ＧＦＰ）、さらにインターナルコントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼを発現するｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と共に２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１５７３）に導入した。遺伝子導入はＴｒａｎｓＩＴ２９３（タカラバイオ社製）とＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（タカラバイオ社製）を用いて行なった。ｓｉＲＮＡ濃度は終濃度が１．２５〜１６０ｎＭとなるように決定した。細胞を２４時間培養したのち、培養上清を除去した後ＰＢＳで一度洗浄し、脱イオン水で５倍希釈した５×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により細胞を溶解した。この溶解液１０μｌよりＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のプロトコールに従い、発光プレートリーダーであるＭｉｔｈｒａｓ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて、ホタルルシフェラーゼ発光値とウミシイタケルシフェラーゼ発光値を測定した。得られた発光値をもとに（相対発光強度）＝（ホタルルシフェラーゼ発光値）／（ウミシイタケルシフェラーゼ発光値）を算出した。結果を図３に示す。図３において、横軸は導入時のｓｉＲＮＡ濃度、縦軸は対照としてＲＮＡを導入しなかった細胞の（相対発光強度）を１００％とした場合の各サンプルの相対発光強度の相対値を示す。図３からＲＮＡ８、ＲＮＡ１０、ＲＮＡ９、ＲＮＡ７の順に相対発光強度の相対値が低い値を示すことが分かった。このことから、ＲＮＡ８、ＲＮＡ１０、ＲＮＡ９、ＲＮＡ７の順に効果的にｒｓＧＦＰ遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡであると判断した。
【００６７】
実施例６ リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡｉ効果の比較
２９３細胞に、各ｓｉＲＮＡ７〜１０およびｒｓＧＦＰ発現プラスミド（ｐＱＢＩ２５）を、ＴｒａｎｓＩＴ２９３およびＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯを用いて導入した。２日後にこれらの細胞からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ｒｓＧＦＰ ｍＲＮＡを定量した。対照としてｐＱＢＩ２５のみを導入した細胞を使用し、ｐＱＢＩ２５に乗っているネオマイシン耐性遺伝子を用いてデータの補正を行なった。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲコアキット（タカラバイオ社製）、スマートサイクラーシステム（タカラバイオ社製）を用いて行い、ｒｓＧＦＰのプライマーとしてＧＦＰ−Ｂ−Ｆ（配列番号２５）、ＧＦＰ−Ｂ−Ｒ（配列番号２６）を、ネオマイシン耐性遺伝子のプライマーとしてＮｅｏ−Ｆ（配列番号２７）、Ｎｅｏ−Ｒ（配列番号２８）のオリゴＤＮＡをそれぞれ使用した。結果を図４に示す。図４において、横軸は使用したｓｉＲＮＡ名、縦軸は対照としてｐＱＢＩ２５のみを導入した細胞のｍＲＮＡ量を１００とした場合の相対値を示す。図４においてｒｓＧＦＰ ｍＲＮＡ量の減少は実施例５で得られたホタルルシフェラーゼの相対発光強度の相対値の減少と一致することから、実施例４〜５記載のｓｉＲＮＡ検索法が有用であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、より多くの標的遺伝子に普遍的に対応でき、ＲＮＡを不安定化させることにより標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド分子の検索方法が提供された。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ２−１．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ２−２．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ３−１．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ３−２．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ４−１．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ４−２．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ５−１．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ５−２．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ６−１．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ６−２．“ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ Ｆａｓ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ Ｆａｓ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｒｓＧＦＰ−１ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｒｓＧＦＰ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｒｓＧＦＰ−２ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｒｓＧＦＰ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６：ｒｓＧＦＰ ｇｅｎｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ７−１．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ７−２．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ８−１．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ８−２．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ９−１．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ９−２．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ１０−１．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｓ ＲＮＡ１０−２．″ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １ ｔｏ １９ ａｒｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ＧＦＰ−Ｂ−Ｆ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｒｓＧＦＰ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ＧＦＰ−Ｂ−Ｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｒｓＧＦＰ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｏ−Ｆ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８：Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｏ−Ｒ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター配列、該配列に翻訳可能な形で連結された、少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびポリＡシグナル配列を有する核酸構築物であって、
該核酸構築物はプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間に前記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列をさらに含有し、
プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる翻訳されないヌクレオチド配列は該核酸構築物より１分子のＲＮＡとして転写されるように連結されており、
さらに前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする核酸構築物；
（１）タンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（２）天然においてタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
【請求項２】
翻訳されないヌクレオチド配列が、プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に位置している請求項１記載の核酸構築物。
【請求項３】
翻訳されないヌクレオチド配列が、プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流に位置している請求項１記載の核酸構築物。
【請求項４】
プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列がレポータータンパク質をコードするものである請求項１記載の核酸構築物。
【請求項５】
請求項１記載の核酸構築物を含有するベクター。
【請求項６】
翻訳可能な形の少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有するＲＮＡであって、前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とするＲＮＡ；
（１）前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（２）天然において前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
【請求項７】
機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であって、下記工程；
（１）翻訳されないヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項１記載の核酸構築物もしくは請求項５記載のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（２）工程（１）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（３）工程（２）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（４）工程（３）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法。
【請求項８】
機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であって、下記工程；
（１）翻訳されないヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項６記載のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（２）工程（１）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（３）工程（２）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法。
【請求項９】
請求項７又は８記載の方法により、機能的ヌクレオチドによる標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出することを特徴とする、標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子の検索方法。
【請求項１０】
細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレオチド分子のＲＮＡへの接触が行われる請求項７または８記載の機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法。
【請求項１１】
ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法であって、下記工程；
（１）翻訳されないヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項１記載の核酸構築物もしくは請求項８記載のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（２）工程（１）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（３）工程（２）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（４）工程（３）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいてヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法。
【請求項１２】
ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法であって、下記工程；
（１）翻訳されないヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項６記載のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（２）工程（１）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（３）工程（２）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法。
【請求項１３】
細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレオチド分子のＲＮＡへの接触が行われる請求項１１または１２記載のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法。
【請求項１】
プロモーター配列、該配列に翻訳可能な形で連結された、少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびポリＡシグナル配列を有する核酸構築物であって、
該核酸構築物はプロモーター配列とポリＡシグナル配列の間に前記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列をさらに含有し、
プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる翻訳されないヌクレオチド配列は該核酸構築物より１分子のＲＮＡとして転写されるように連結されており、
さらに前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とする核酸構築物；
（１）タンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（２）天然においてタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
【請求項２】
翻訳されないヌクレオチド配列が、プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に位置している請求項１記載の核酸構築物。
【請求項３】
翻訳されないヌクレオチド配列が、プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流に位置している請求項１記載の核酸構築物。
【請求項４】
プロモーター配列に翻訳可能な形で連結されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列がレポータータンパク質をコードするものである請求項１記載の核酸構築物。
【請求項５】
請求項１記載の核酸構築物を含有するベクター。
【請求項６】
翻訳可能な形の少なくとも１つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列と該配列とは異なる、翻訳されないヌクレオチド配列を含有するＲＮＡであって、前記の翻訳されないヌクレオチド配列が下記から選択されることを特徴とするＲＮＡ；
（１）前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または前記タンパク質の一部をコードするヌクレオチド配列、および
（２）天然において前記の翻訳可能な形のタンパク質をコードするヌクレオチドとは異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域のヌクレオチド配列。
【請求項７】
機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であって、下記工程；
（１）翻訳されないヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項１記載の核酸構築物もしくは請求項５記載のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（２）工程（１）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（３）工程（２）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（４）工程（３）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法。
【請求項８】
機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法であって、下記工程；
（１）翻訳されないヌクレオチド配列として標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、標的遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項６記載のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（２）工程（１）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（３）工程（２）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する工程、
を包含することを特徴とする標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法。
【請求項９】
請求項７又は８記載の方法により、機能的ヌクレオチドによる標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出することを特徴とする、標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子の検索方法。
【請求項１０】
細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレオチド分子のＲＮＡへの接触が行われる請求項７または８記載の機能的ヌクレオチド分子による標的遺伝子の発現を変化させる作用を検出する方法。
【請求項１１】
ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法であって、下記工程；
（１）翻訳されないヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項１記載の核酸構築物もしくは請求項８記載のベクターよりＲＮＡを転写させる工程、
（２）工程（１）で転写されたＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（３）工程（２）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（４）工程（３）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいてヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法。
【請求項１２】
ヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子を検索する方法であって、下記工程；
（１）翻訳されないヌクレオチド配列として任意の遺伝子中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列の一部、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’側もしくは３’側に位置する非翻訳領域から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項６記載のＲＮＡにヌクレオチド分子を接触させる工程、
（２）工程（１）のＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物を検出する工程、および
（３）工程（２）で検出されたＲＮＡまたは該ＲＮＡより翻訳される翻訳産物の量に基づいて標的遺伝子の発現を変化させる機能的ヌクレオチド分子を同定する工程、
を包含することを特徴とするヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法。
【請求項１３】
細胞内もしくは無細胞タンパク質合成系でヌクレオチド分子のＲＮＡへの接触が行われる請求項１１または１２記載のヌクレオチド分子によって発現が変化する遺伝子の検索方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１７５２
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３４３９（Ｐ２００５−５１３４３９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２１７２
【国際出願日】平成１６年８月２５日（２００４．８．２５）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【発行日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２１７２
【国際出願日】平成１６年８月２５日（２００４．８．２５）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
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