水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析方法
【課題】 水溶性高分子と低分子化合物の分離が良く、たんぱく質などの影響を受けずに、イソクラティック条件下で水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析を迅速に行うことのできる分析法を提供する。
【解決手段】 原料モノマーとして２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物（グリセリンジメタクリレート等）を９０質量％以上使用して得られた架橋有機高分子からなり、プルランによる排除限界分子量が３００００以下３０００以上であり、質量平均粒子径が０.１〜１００μｍである充填剤を用いたカラムを用い、高速液体クロマトグラフィーによる分析を行うことを特徴とする水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析方法、その分析方法に用いる充填剤を使用した水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物分析用液体クロマトグラフィー用カラム。
【解決手段】 原料モノマーとして２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物（グリセリンジメタクリレート等）を９０質量％以上使用して得られた架橋有機高分子からなり、プルランによる排除限界分子量が３００００以下３０００以上であり、質量平均粒子径が０.１〜１００μｍである充填剤を用いたカラムを用い、高速液体クロマトグラフィーによる分析を行うことを特徴とする水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析方法、その分析方法に用いる充填剤を使用した水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物分析用液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物を高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣということがある。）分析する方法に関する。詳しくは、生体試料などに含まれる生体高分子化合物（たんぱく質など）を含む試料中の微量の低分子化合物（特に極性低分子化合物）を分離、分析する方法に関する。さらに詳しくは、生体成分に多く含まれる血清アルブミンのようなたんぱく質が含まれた試料において、質量分析装置（以下「ＭＳ（マススペクトログラフ）」と表記することもある。）を検出器に用いた場合でも、イオンサプレッション等の影響を受けずに、そこに含まれる薬物代謝物のような低分子化合物の分析を行うことのできる分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水溶性高分子、特に、血清アルブミン等のたんぱく質と、低分子化合物、例えば、薬物の生体内代謝物を含有する試料中の低分子化合物を分析する場合には、予め有機溶媒の添加、固相抽出等によって、妨害成分となるたんぱく質の大部分を除去した後に分析することが行われている。しかし、この際にすべてのたんぱく質の除去は難しく、微量のたんぱく質は除去できずに残ってしまうことがあった。
【０００３】
こうした試料を従来のＯＤＳ（オクタデシル基を結合させたシリカゲル充填剤）で分析すると、微量に存在するたんぱく質が不可逆的にカラムに吸着し、このため、カラムの劣化を早めたり分離パターンに変化を生じたりするといった問題があった。これらを回避する方法として、カラムスイッチング法や浸透制限充填剤と呼ばれる充填剤を用いたカラムを用いる方法が開発されている。
【０００４】
これらシリカゲル系の充填剤の欠点を補うために、充填剤の基材に多孔性有機高分子を用いたものが開発されている。例えば、ポリビニルアルコール基材の充填剤を用いたカラムは親水性であるために、たんぱく質等の吸着が少なく、たんぱく質は吸着されずに先にカラムから溶出する。ところが、当該基材自身はわずかに疎水性の部分を有しているために、低分子化合物を疎水性相互作用により保持することができる。このため、低分子化合物をたんぱく質等と分離して、分析することができる。
【０００５】
特開２００３−９３８０１号公報（特許文献１）には、細孔容積や表面積に特徴を有する、表面に親水層を持つ多孔性重合体粒子が記載されている。特開２００１−６６２９５号公報（特許文献２）、特開２００３−１９４７９３号公報（特許文献３）には、架橋性モノマーとしてポリエチレングリコール骨格を含む化合物を用い合成した充填剤について述べられている。この充填剤は、カラムスイッチング法の濃縮用カラムとしての性能が紹介されている。
【０００６】
これらの有機高分子を充填剤として用いたカラムは親水性高分子（特にこの場合生体試料に多く含まれる血清アルブミン）の吸着が起きないような性質を有している。しかし、これらのカラムを用いて、水溶性高分子と低分子化合物を含む試料を分析する場合、問題となるのが、高い極性を有する低分子化合物を分析する場合であった。こうした化合物は疎水性が小さいので、通常の疎水性を有する充填剤では水溶性高分子との分離が十分でなかった。また、逆に、極性の高い低分子物質を良く保持するような充填剤では、疎水性が強すぎ、全体に低分子化合物の保持が大きすぎ、イソクラティック条件（溶離液組成が一定の条件）では分析に時間がかかりすぎ、分析用カラムとしては不都合であるという問題があった。
【０００７】
これらの問題は溶離液にグラジエント条件を用いることにより回避することができる場合もあるが、グラジエント条件には別の問題点があった。すなわち、グラジエントに伴う溶離液組成の変化、ポンプ切り替わりによる圧力変動の影響により、配管やカラムハウジングなどに吸着していたアルブミンなどの水溶性高分子が少しずつ溶出すると、ＭＳなどで低分子を分析する場合に低分子薬物のイオン化を妨げ、検出感度を低下させるイオンサプレッションが起き、定量の妨げになるということである。
【０００８】
こうした背景の下、高い極性を有した低分子化合物に対する保持が強く、水溶性高分子と低分子化合物の良い分離を与える一方で、迅速分析が可能であり、しかもイソクラティック条件下で用いることができる充填剤とそれを用いた分析法が望まれていた。
【０００９】
なお、本発明で好適に使用されるグリセリンジメタクリレートを９０％以上使用して得られる有機高分子を用いた多孔性分離剤は特開昭５８−３２１６４号公報（特許文献４）に記載されているが、この充填剤を用いて、水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物を分析する方法についての記載はない。
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−９３８０１号公報
【特許文献２】特開２００１−６６２９５号公報
【特許文献３】特開２００３−１９４７９３号公報
【特許文献４】特開昭５８−３２１６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記従来技術の問題点を解決することを課題とする。すなわち、水溶性高分子と低分子化合物の分離が良く、たんぱく質などの影響を受けずに、溶離液組成が一定であるイソクラティック条件下で水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析を迅速に行うことのできる分析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決できる充填剤としての必須条件は、水溶性高分子として生体内試料に多く含まれ吸着しやすいため分析の妨げとなりやすい血清アルブミンが吸着等の問題を起こさないよう、疎水性の大きな基（例えばオクタデシル基）を有さないこと、及び同じ試料に含まれている極性の低分子化合物を水溶性高分子と分離するためには水素結合性を有することが同時に必要であると考えて鋭意検討を行い、上記課題を解決することに成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の１〜１０の水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析方法、１１の分析用液体クロマトグラフィー用充填剤、及び１２の水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物分析用液体クロマトグラフィー用カラムに関する。
【００１３】
１．原料モノマーとして２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物を９０質量％以上使用して得られた架橋有機高分子からなる充填剤を用いたカラムを用い、高速液体クロマトグラフィーによる分析を行うことを特徴とする水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析方法。
２．２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物がグリセリンジメタクリレートである前記１に記載の分析方法。
３．前記充填剤が、プルランによる排除限界分子量が３００００以下である前記１または２に記載の分析方法。
４．水と相溶する有機溶媒１５〜４０質量％および水性緩衝液８５〜６０質量％を含有する溶離液を使用し、イソクラティック条件下で高速液体クロマトグラフィー分析を行う前記１〜３のいずれかに記載の分析方法。
５．水と相溶する有機溶媒がメタノールおよび／またはアセトニトリルである前記４に記載の分析方法。
６．水と相溶する有機溶媒がアセトニトリルである前記５に記載の分析方法。
７．水溶性高分子が生体成分に含まれる生体由来の水溶性高分子である前記１〜６のいずれかに記載の分析方法。
８．水溶性高分子が、血清アルブミンである前記１〜６のいずれかに記載の分析方法。
９．前記分析法において使用する充填剤の質量平均粒子径が０.１〜１００μｍである多孔性の球状粒子である前記１〜８のいずれかに記載の分析方法。
１０．高速液体クロマトグラフィーにより分離された低分子化合物を質量分析装置で分析する前記１〜９のいずれかに記載の分析方法。
１１．原料モノマーとしてグリセリンジメタクリレートを９０質量％以上使用して得られた架橋有機高分子からなり、プルランによる排除限界分子量が３００００以下３０００以上であり、質量平均粒子径が０.１〜１００μｍである、水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析用液体クロマトグラフィー用充填剤。
１２．前記１１に記載の充填剤を使用した水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物分析用液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の効果】
【００１４】
本発明による方法を用いれば、水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物を、イソクラティック条件下で迅速に測定できる。特に、検出器に質量分析装置（ＭＳ）を用いた場合にも、微量溶出するたんぱく質成分によるイオンサプレッション等の妨害にあうことなく、測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
充填剤：
本発明の充填剤は２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物を９０質量％以上有する原料モノマー混合液を重合して得られた架橋有機高分子である。モノマー混合液を懸濁重合すれば微粒子状の充填剤を得ることができる。
【００１６】
本発明の分析対象となる試料は水溶性高分子と低分子化合物を含むものであるが、水溶性高分子自体は解析の対象とはしないので、低分子化合物と分離され、早く溶出しさえすればよい。本発明の試料は生体由来のものを主体としているため、分析対象の低分子化合物は極性の高いものが多い。極性の高い低分子化合物の充填剤での保持の程度は、充填剤との静電的相互作用（水素結合性や双極子相互作用）と疎水性相互作用の両方の合計によって決まる。疎水性相互作用で保持を大きくする場合は、試料中に共存する疎水性の強い他の低分子化合物の溶出がさらに遅くなるために迅速な分析の妨げになる。このため、迅速分析に適し、極性の高い低分子化合物を水溶性高分子から分離できる充填剤としては、主に水素結合性によって極性の高い低分子化合物を良く保持するものが好ましい。これらの低分子物質を分離するには適度の水素結合性を有することが好ましく、そのために本発明では水酸基を導入した。水酸基が多くなりすぎると、結果として充填剤の極性が高くなりすぎて、疎水性相互作用が弱くなりすぎる。本発明の充填剤には疎水性と水素結合性とが極めて微妙にバランスしていることが求められる。
【００１７】
原料モノマー：
このような条件を満たす充填剤としては、原料モノマーとして２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物を９０質量％以上使用して得られる架橋有機高分子が挙げられる。２個のエチレン性炭素−炭素二重結合は重合時に架橋構造を導入するのに必要である。２個のエチレン性炭素−炭素二重結合の間は適切な間隔が必要であるが、あまり長すぎると充填剤の架橋が疎になり、膨潤収縮が大きくなり、充填剤の強度が低下する問題が生じるため好ましくない。炭素−炭素二重結合間の共有結合数は６〜１０が好ましい。水酸基は充填剤に水素結合性を付与するが、多すぎると充填剤の疎水性が小さくなり分析に使用できなくなる。従って、原料モノマーに１個の水酸基が適当である。
【００１８】
２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物としては、３個以上の水酸基を有する多価アルコールのジ（エチレン性不飽和カルボン酸）エステル、またはこうしたジエステルのエステル結合をエーテル結合もしくは単結合に置き換えた化合物が挙げられ、例えばグリセリンジ−１，３−（メタ）アクリレート、グリセリンジ−１，２−（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシ−１，３−ジアリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１，３−ジビニロキシ プロパンなどが挙げられる。なお、ここで「（メタ）アクリレート」は「メタクリレート」または「アクリレート」を意味する。これらの中で特に好ましいのは、グリセリンジメタクリレート（２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン）である。以下、グリセリンジメタクリレートを例として説明する。
グリセリンジメタクリレートよりも疎水性の低いモノマー、例えば、アクリルアミドと架橋剤（多官能モノマー）等を使用すると、充填剤の疎水性が低くなりすぎるので、好ましくない。また、疎水性の高いモノマー、例えばジビニルベンゼン等を使用すると疎水性が大きくなってしまい、疎水性の低分子化合物の溶出が大きく遅れ分析時間が長くなってしまうので好ましくない。
【００１９】
グリセリンジメタクリレートは架橋性のモノマーなので、得られた充填剤は、架橋度が高く、強度の高いものとなる。このため充填剤粒子の径を小さくできるので、高性能な液体クロマトグラフィー用充填剤を得ることができる。逆に、グリセリンジメタクリレート以外の架橋性でないモノマーを使用するとそれだけ充填剤の強度が失われてしまうため、好ましくない。架橋剤であり、疎水性の程度が似ているモノマーに、ポリエチレングリコールジメタクリレートのような架橋部の分子の鎖が長いものがあるが、これを使用すると、膨潤収縮が大きくなり、充填剤の強度が低下するので好ましくない。
【００２０】
原料モノマー混合液中のグリセリンジメタクリレートの濃度は９０質量％以上が必要である。より好ましくは、９５質量％、さらに好ましくは９９質量％以上含有していることが好ましい。９０質量％未満では水素結合性が小さくなり、極性の高い低分子化合物の分離が悪くなったりするので好ましくない。９０質量％以上使用した場合に、十分な強度を持ち、水素結合性が高く、疎水性の小さい充填剤を得ることができる。
【００２１】
本発明の充填剤の分離性能、特性はグリセリンジメタクリレートが９０質量％未満にならない範囲で、他のモノマーを混合することによって微調節することができる。グリセリンジメタクリレート以外に加えることのできるモノマーとしては、通常の充填剤を製造するときに使用されるラジカル重合性モノマーが殆ど使用できる。例えば、スチレン、ジビニルベンゼン、メチルアクリレート、ビス（メタ）アクリルアミド、エチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、グリセリンモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００２２】
重合：
重合は、溶液重合、塊状重合、懸濁重合、乳化重合などの通常のラジカル重合により実施することができる。以下に代表例として水性懸濁重合で球状粒子を作る場合について説明するが、この方法に限定されるものではない。
水性懸濁重合に用いる油相の調製は、原料モノマー混合液と希釈剤（溶媒または分散媒、モノマーの希釈剤として使用）との混合物に、重合開始剤を添加して行う。
【００２３】
希釈剤は、生成する球状架橋有機高分子粒子（充填剤）を多孔性にする目的でモノマー混合物に添加される。その種類は、塊状重合などのように水を媒体に用いない場合には特に限定されないが、水性懸濁重合などのように水を媒体に用いる場合には、水に難溶性の有機化合物が好ましい。具体例としては、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ヘプタン、オクタン、ドデカン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、イソアミルアルコール、１−ヘキサノール、シクロヘキサノール、２−エチルヘキサノール、１−ドデカノール、非架橋ポリスチレンなどが挙げられる。これらの溶媒または分散媒は、単独でまたは２種以上組み合わせたそれらの混合物として使用することができる。
【００２４】
また、これらの希釈剤の添加量は、原料モノマーと希釈剤の総量を基準として１０〜９０質量％、好ましくは２０〜８０質量％、より好ましくは２５〜６０質量％である。添加量が１０質量％未満だと、充填剤の多孔性が不十分になるため好ましくない。希釈剤を多く使用すると充填剤の細孔容積が大きくなり好ましいが、９０質量％を超えた場合は充填剤の物理的強度が不足し、カラムとしての耐圧性が低下する。
【００２５】
重合開始剤の例としては、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）のようなアゾ系化合物；過酸化ベンゾイル、過酸化ジクミル、過酸化ジ−ｔ−ブチル、過安息香酸−ｔ−ブチル、メチルエチルケトンペルオキシドのような有機過酸化物など一般に使用される重合開始剤が挙げられる。これらは単独でまたは２種以上を組み合わせて使用する。用いる重合開始剤の濃度は、単量体の種類などにより適宜決められるものであり一概に規定できないが、モノマーの総量１００質量部に対して０.１〜５質量部が好ましく用いられる。
【００２６】
水相には油相の分散安定剤を添加する。用いる分散安定剤として、ポリビニルアルコール、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、ゼラチンなどの水溶性高分子化合物が挙げられる。分散安定剤の濃度は、特に限定はないが、水１００質量部に対して０.１〜５質量部が好ましい。またモノマーの一部が水相へ溶解するのを防ぐため、水相に塩類を添加するのが好ましい。添加する塩類の例としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウムなどが挙げられ、これら塩類は単独でまたは２種以上組み合わせて使用する。用いる塩類の濃度に特に限定はないが、溶解度の許す範囲で、可能な限り高い濃度が好ましい。例えば、水に対して、塩化ナトリウムであれば１〜１５質量部、塩化カルシウムであれば１〜４０質量部である。
【００２７】
油相に対する水相の比率が大きすぎると、単量体の一部が水相へ溶解する量が増えてしまい、小さすぎると油滴の合一が起こりやすくなる。そのため、使用する水の質量は、モノマーおよび希釈剤の総量１００質量部に対して２００〜１０００質量部が好ましい。
【００２８】
水性懸濁重合を始める前に油相と水相を混合し、油滴が目的とする粒子径（粒子の直径）になるように分散させる。分散には、微粒子化用の撹拌翼を付けた撹拌装置、または高速分散機（ホモジナイザー）などを用いることができる。粒子径が比較的大きい吸着剤（例えば固相抽出用）を作るには微粒子化用の撹拌翼を付けた撹拌装置を用い、粒子径の小さい吸着剤（例えば、液体クロマトグラフィー用の吸着剤）を作るには高速分散機（ホモジナイザー）を用いるのがよい。
【００２９】
重合反応は、通常の撹拌下において４０〜１００℃の温度範囲で５〜１６時間行なわれる。
このようにして得られた充填剤微粒子は熱水、有機溶媒などで十分洗浄し、粒子に含有されている、あるいは付着している分散安定剤、溶媒、残存モノマー、希釈剤などを除去する。さらに、必要に応じて粒子を分級して、クロマトグラフィー用充填剤が得られる。
【００３０】
充填剤の粒子径：
ＨＰＬＣにおいて、十分な理論段数を有するように、粒子が細かいものを使用する必要がある。充填剤の質量平均粒子径は０.１〜１００μｍが好ましく、１〜１０μｍがより好ましく、３〜５μｍがさらに好ましい。粒子径が０.１μｍ未満であるとカラムの圧力が高くなりすぎ、機器に負担を与えるという問題が生ずる。１００μｍを超えると分析カラムとしての性能が低くなり都合が悪い。所望の粒子径を得るのには重合における分散剤の量や撹拌速度を調節する。最終的に得られた充填剤の大きさとこれらの条件の相関を求めることで、最適な条件を決めることができる。また、重合の粒子を分級してもよい。分級操作としては篩による分級、風力分級等が挙げられる。
【００３１】
質量平均粒子径はコールターカウンター（登録商標）、光学顕微鏡などで測定できる。
以上は充填剤が多孔性の粒子である場合について説明したが、多孔性であれば、モノリスのような一体型の充填剤であっても良い。
【００３２】
充填剤の排除限界分子量：
本発明の充填剤の排除限界分子量は３００００以下であることが好ましい。排除限界分子量が３００００を超えると、血清アルブミンのような水溶性高分子の溶出が遅れるため、低分子化合物との分離が悪くなる。また、排除限界分子量が、３０００未満であると、分析対象の低分子化合物自体の保持が低下したり、分離が悪化したりするため好ましくない。
【００３３】
排除限界分子量は充填剤を内径４.６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレスカラムに充填し、純水を溶離液にして、分子量既知のプルラン（昭和電工（株）製）を標準サンプルとして、較正曲線を作成して求める。排除限界分子量が、３００００以下である場合、生体内等に多く含まれる水溶性たんぱく質の多くは、排除限界（Ｖｏ）に近いところに溶出する。一方、低分子化合物は、浸透限界以降（Ｖｔ）にその疎水性の強さに従って順次溶出するため、水溶性高分子と低分子化合物との分離が改善する。このことから、排除限界分子量の値は水溶性高分子と低分子化合物の分離を良くするために重要である。
【００３４】
本発明の充填剤を通常の懸濁重合等によって製造する場合、充填剤の排除限界分子量は、モノマーと共に加えられる希釈剤の量と種類によってコントロールできる。一般に希釈剤の量を増やすことにより、充填剤粒子の細孔が大きくなる為排除限界分子量は大きくなる。希釈剤に、モノマーの重合により生成する高分子に対する貧溶媒のものを用いれば排除限界分子量は大きくなり、良溶媒のものを用いれば排除限界分子量は小さくなる。
【００３５】
分析対象物質：
水溶性高分子とは、分子量が１００００程度以上のたんぱく質や有機高分子、天然高分子を呼ぶ。特に、生体由来の水溶性高分子が挙げられ、さらに、生体由来の試料に、一般に多く含まれ、分析において妨害になりやすい化合物である血清アルブミン、アルブミン２量体等が挙げられる。
【００３６】
本明細書において低分子化合物とは、分子量４０００以下の有機化合物を表す。特に、生体試料が分析目的試料などのときは、その中に含有される薬物や薬物の代謝物などが挙げられる。具体的にはカフェイン、テオブロミン、テオフィリン、バルビタール類などが挙げられる。
本発明の充填剤は、疎水性が低いにもかかわらず、水素結合性がこれまでに使われてきた逆相系の分析カラムに比べて際立って高い。このため、カフェインなどの極性の強い低分子化合物の保持が大きい特性を有する。この性質が、本発明における分析方法を可能にするひとつの要因になっている。この水素結合性の高さの理由は、粒子表面のみならず細孔内面にも点在する水酸基の影響であると推測されるが、詳しくはわからない。
本発明のカラムは次式で示されるα：
【数１】
ｋcaffeine：カフェインの保持係数，ｋtoluene：トルエンの保持係数，ｋr：（ｔr−ｔ0）／ｔ0，ｔr：サンプルの保持時間（ピーク位置の時間，ｒはカフェインまたはトルエンを示す。），ｔ0：非保持時間。
が、０．０５〜１．０が好ましく、０．０８〜０．５がより好ましい。αが下限値未満では水溶性高分子と低分子化合物の分離が悪くなり、上限値を超えると低分子化合物同士の分離が悪くなる。
【００３７】
高速液体クロマトグラフィーによる分析条件：
＜溶離液＞
本発明の分析方法ではＨＰＬＣの溶離液として水と相溶する有機溶媒１５〜４０質量％と水性緩衝液８５〜６０質量％を含有するものを使用することが好ましい。
【００３８】
水と相溶する有機溶媒とは常温〜ＨＰＬＣの分析温度の範囲で水（水性緩衝液を含む）に２５質量％以上溶解する有機溶媒である。このような有機溶媒としては通常の液体クロマトグラフィーで用いることのできる溶媒であれば、特に限定されないが、例を挙げれば、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどが挙げられ、特にアセトニトリルが好ましい。これらの有機溶媒は数種類を混合して使用することもできる。
【００３９】
水性緩衝液としては分析時のｐＨを安定化するために使用する様々な緩衝液が使用できる。また、緩衝液を使用しないで、純水を用いることもできる。ＭＳを検出器として使用する場合には、揮発性の緩衝液が望まれる。これには、ギ酸アンモニウムや酢酸アンモニウムが好ましい。一般的に用いられるのは、５〜１０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液である。
【００４０】
水と相溶する有機溶媒と水性緩衝液との混合比率は１５〜４０質量％：８５〜６０質量％が好ましく、２０〜３５質量％：８０〜６５質量％がより好ましく、２０〜３０質量％：８０〜７０質量％が最も好ましい。
本発明の充填剤は、血清アルブミン等のたんぱく質の吸着が、まったくないわけではない。しかし、本充填剤が好適に使用できるところの、有機溶剤が１５〜４０質量％の溶離液条件下では、血清アルブミン等のたんぱく質との疎水性相互作用が最小になり、ほとんど吸着を起こさない。このため、この溶離液範囲で分析を行うと、アルブミンの回収率は９０％以上であり、さらにこのとき、親水性の低分子化合物の保持も十分に大きく、疎水性の強い化合物も遅れることなく溶出する。このため、イソクラティック条件で好適にＨＰＬＣ分析できる。有機溶媒濃度が１５質量％未満の条件では、血清アルブミン等のたんぱく質の吸着が若干見られるばかりでなく、疎水性の強い化合物の溶出が遅くなりすぎてしまう。さらに、有機溶媒濃度が４０質量％を超える条件下では、極性の高い低分子化合物の保持が小さくなり、浸透限界に近づくために、分離が悪くなる。さらに、この条件では、血清アルブミン等のたんぱく質も溶解性が悪く析出の危険もあることから好ましくない。
【００４１】
本発明のＨＰＬＣ分析では溶離液をイソクラティック条件で行うことが好ましい。これはカラムハウジングや配管などに吸着した親水性高分子の溶出を最低限に抑え、ＭＳでの検出や、低分子化合物の定量を安定に行うためである。ＭＳで観測していないときや、カラムや分析装置の洗浄等の場合には、グラジエント条件を適応しても問題はない。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１：
１．グリセリンジメタクリレート充填剤の合成
グリセリンジメタクリレート（ＮＫエステル７０１、新中村化学工業（株））２０００ｇとシクロヘキサノール（純正化学（株））１３４０ｇの混合液に、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）（和光純薬工業（株））３０ｇを溶解させ、油相を調製した。一方、ポリビニルアルコール（クラレ（株）製クラレポバールＰＶＡ−２２４）１２０ｇを水３リットルに溶解させ、そこへ水７リットル、次いで塩化ナトリウム２４０ｇの水（２リットル）溶液を加えて混合し、水相を調製した。２０Ｌのステンレス製容器内で上記油相と上記水相を混合し、高速分散機（ホモジナイザー）にかけ、回転数と分散時間を調節することにより、油滴の最大粒子径が５μｍになるように調整した。
【００４４】
次いで、通常の撹拌翼を使用し、１５０ｒｐｍで撹拌しながら、６０℃で７時間反応を行った。生成した架橋重合体粒子を遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）して上澄みを捨て、沈澱を７０℃の温水１２リットルに分散（超音波洗浄器使用）後、７０℃で３時間撹拌した。これを吸引ろ過し、漏斗上のケーキを７０℃の温水６０リットル、次いでアセトン１８リットルで洗浄した後、ステンレス製バットに広げて風乾し、さらに６０℃で２４時間減圧乾燥した。これを風力分級装置で分級した。コールターカウンター（ベックマン・コールター Multisizer 3）で測定したところ、質量平均粒子径５.１μｍの架橋重合体粒子１３００ｇを得た。
上記で得られた架橋重合体粒子５０ｇに純水５００ｍｌを加え、６０℃で５時間加熱撹拌した後、粒子をろ取し、７０℃の温水２０００ｍｌ、メタノール３００ｍｌで順次洗浄した。これをステンレス製バットに広げて風乾後、さらに７０℃で２４時間減圧乾燥し、充填剤４８ｇを得た。
【００４５】
２．カラムの性能評価
この充填剤約３ｇを、内径４.６ｍｍで長さ１５０ｍｍのステンレス製カラムに湿式充填法によって充填した。
溶離液：純水、
流量：０.３３ｍｌ／分、
標準試料：プルラン０.１質量％、
プルランの分子量：７５８０００、３３８０００、１９４０００、９５４００、４６７００、２０８００、１２０００、５３００（全て、Shodex STANDARD P-82，昭和電工（株）製）、
分子量：２９３０（昭和電工（株）製）、
分子量：１３３０（昭和電工（株）製）、
検出器：ＲＩ、
注入量：１００μｌ。
各分子量のプルランの溶出位置を測定、そのリテンションタイムから、溶出容量を計算し較正曲線を作成した。すなわち、分子量の対数値を縦軸に、溶出容量を横軸にとったグラフに各点をプロットし曲線でつないだ（図１）。図１において傾斜した直線の延長と縦軸に平行な線の延長が交わる点の縦軸の値を排除限界分子量として求めたところ、この充填剤の排除限界分子量は、２００００であった。
【００４６】
３．ＢＳＡ（牛血清アルブミン）の回収率評価
この充填剤を、直径４.６ｍｍで長さ５０ｍｍのカラムに充填した。
このカラムに牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製、以下ＢＳＡと表記することがある。）を注入したときのＢＳＡの回収率を、カラムを付けない時（カラムの代わりにポリテトラフルオロエチレン製のチューブ（内径０．５ｍｍ、長さ１０ｍ）を取り付けて測定した。）のＢＳＡのピーク面積を１００％として求めた。
溶離液：１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝８５０ｇ／１５０ｇ、
流量：１ｍｌ／分、
カラム温度：３０℃、
試料：ＢＳＡ７ｍｇ／ｍｌ、
注入量：１０μｌ、
検出器：ＵＶ（２２０ｎｍ）。
ＢＳＡは排除限界に１本のピークとして観測され、ピーク面積から、９８％のＢＳＡが溶出していることが観測された。
【００４７】
４．カラムの分離性能の評価
それぞれの充填剤の持つ静電的相互作用の大きさを疎水性も考慮したうえで比較するために、相対的な静電的相互作用の強さを次式で求めた。
【数１】
ｋcaffeine：カフェインの保持係数，ｋtoluene：トルエンの保持係数，ｋr：（ｔr−ｔ0）／ｔ0，ｔr：サンプルの保持時間（ピーク位置の時間），ｔ0：非保持時間。
この値は、疎水性相互作用と静電的相互作用の比を表しており、この値が大きいほど、極性の高い低分子化合物の保持が大きく、かつ、疎水性の低分子化合物の溶出も遅くなりすぎないということを示す。つまり、この値が（ある程度までは）大きいほど、始めに溶出する親水性高分子と極性の高い低分子化合物の分離が好調であり、かつ疎水性の強い低分子化合物の溶出に長い時間待つ必要がないカラムを与えることを示す。
【００４８】
分析条件：
溶離液１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝７５０ｇ／２５０ｇ、
流量：１ｍｌ／分、
カラム温度：４０℃、
検出器：ＵＶ（２５４ｎｍ）、
注入量：１０μｌ、
サンプル：ＢＳＡ７００ｍｇ／Ｌ、カフェイン１０ｍｇ／Ｌ、トルエン１５０ｍｇ／Ｌ、
結果：α＝０.０８６。
【００４９】
図２にクロマトグラムを示した。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエンのピークを示す。ＢＳＡが排除限界（０.３９分）に溶出した後、カフェイン０.９７分、トルエン４.４５分に溶出した。ＢＳＡとカフェインの分離は良好で、トルエンの溶出も遅くないので、イソクラティック条件下での迅速分析が可能であった。
【００５０】
実施例２（共重合タイプの充填剤）
グリセリンジメタクリレート２０００ｇのかわりにグリセリンジメタクリレート１８８０ｇ、グリシジルメタクリレート１２０ｇを使用した以外は実施例１と同様にして重合、風力分級し、架橋重合体粒子１２００ｇを得た。当該架橋重合体粒子の質量平均粒子径は５．１μｍであった。
上記で得られた架橋重合体粒子３０ｇに０．３Ｍギ酸水溶液（１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ３．０に調整したもの。）５００ｍｌを加え、６０℃で５時間過熱攪拌した後、粒子をろ取し、７０℃の温水２０００ｍｌ、メタノール３００ｍｌで順次洗浄した。これをステンレス製バットに広げて風乾後、さらに７０℃で２４時間減圧乾燥し、充填剤３０ｇを得た。
２．排除限界分子量（分析条件は実施例１と同じ）は２００００であった。
３．ＢＳＡの回収率評価（分析条件は実施例１と同じ）：
９３％のＢＳＡを回収した。
４．カラムの分離性能（分析条件は実施例１と同じ）：
α＝０．０８７
実施例１と同様な充填剤が得られた。
【００５１】
比較例１：
１．充填剤の製造
グリセリンジメタクリレート２０００ｇの代わりに、エチレンジメタクリレート２０００ｇを用いたほかは、実施例１と同じようにして、質量平均粒子径４.９μｍの充填剤を得た。
２．排除限界分子量（分析条件は実施例１の２に同じ）は３００００であった。
３．ＢＳＡの回収率評価（分析条件は実施例１の３に同じ）：
９０％のＢＳＡを回収した。
４．カラムの分離性能の評価（分析条件は実施例１の４に同じ）：
α＝０.０２８。
αの値は実施例１の充填剤より小さかった。図３にクロマトグラムを示した。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエンのピークを示す。クロマトグラムは、図２と比べるためにＢＳＡのピークとトルエンのピークの間の距離がほぼ同じになるように、時間軸を縮小して示している。トルエンの溶出時間が約１２分と実施例１の約５分と比較してかなり遅く、イソクラティック条件での迅速分析に向いていないことがわかる。
【００５２】
比較例２：
１．充填剤の製造
グリセリンジメタクリレート２０００ｇの代わりに、エチレンジメタクリレート１０００ｇとグリセリンジメタクリレート１０００ｇを用いたほかは、実施例１と同じようにして、質量平均粒子径５.１μｍの充填剤を得た。
２．排除限界分子量（分析条件は実施例１と同じ）は５００００であった。
３．ＢＳＡの回収率評価（分析条件は実施例１と同じ）：
９３％のＢＳＡを回収した。
４．カラムの分離性能の評価（分析条件は実施例１と同じ）：
α＝０.０４４。
αの値は実施例１の充填剤より小さかった。図４にクロマトグラムを示した。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエンのピークを示す。クロマトグラムは、図２と比べるためにＢＳＡのピークとトルエンのピークの間の距離がほぼ同じになるように、時間軸を拡大して示している。
トルエンの溶出時間は遅すぎず、適切な位置であったが、カフェインの分離は実施例１に劣った。
【００５３】
比較例３：
１．充填剤は市販のカラム：ＧＦ−３１０ ４Ｂ（昭和電工（株）製、ポリビニルアルコール系充填剤，質量平均粒子径５μｍ）を使用した。
２．排除限界分子量：
カタログ値 ４００００。
３．ＢＳＡの回収率評価（分析条件は実施例１と同じ）：
ＢＳＡが９８％回収された。
４．カラムの分離性能の評価（分析条件は実施例１と同じ）：
α＝０.０１９。
αの値は実施例１の充填剤より小さかった。図５にクロマトグラムを示した。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエンのピークを示す。クロマトグラムは、図２と比べるためにＢＳＡのピークとトルエンのピークの間の距離がほぼ同じになるように、時間軸を縮小して示している。ＢＳＡとカフェインの分離が劣っている。
【００５４】
実施例３：ＭＳを検出器に用いた分析
カラムとして実施例１の充填剤を直径２.０ｍｍ，長さ５０ｍｍのステンレスカラムに湿式充填により、充填したものを用いた。低分子化合物の試料として３種の薬物、すなわち、下記式で示されるバルビタール（barbital）、フェノバルビタール（phenobarbital）、ヘキソバルビタール（hexobarbital）、
【化１】
水溶性高分子マトリックスとして牛血清アルブミン（ＢＳＡ、分子量：約６７，０００）を選んだ。ＬＣ−ＭＳシステムとしては、Agilent 1100シリーズＨＰＬＣシステム（アジレントテクノロジー製）にLCQ Advantage （サーモエレクトロン社製）を連結し、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法で使用した。カラム温度３０℃、（１０ｍＭ酢酸アンモニウム）／アセトニトリル＝７０ｍｌ／３０ｍｌを移動相とする５分間のイソクラティック溶出（０.２０ｍｌ／ｍｉｎ、スプリットなし）で分析を行った。
まず、薬物（各５μｇ／ｍｌ）のみをイオン交換水に溶かした試料１０μｌを注入し、ＵＶ検出（２２０ｎｍ）およびＥＳＩ−負イオンモードによる選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）にて測定した（イオン化電圧：５ｋＶ）。次に、３種の薬物（各５μｇ／ｍｌ）とＢＳＡ（０.７ｍｇ／ｍｌ）をイオン交換水に溶かした試料１０μｌを注入し、同様に測定した。ただし、後者ではＢＳＡが高濃度で溶出している部分（１.２ｍｉｎまで）の溶出液はＭＳへ導入しなかった。
結果：
薬物試料の分析結果を図６に、ＢＳＡ含有薬物試料の分析結果を図７に示す。ＵＶ検出クロマトグラムの縦軸最大値は、ＢＳＡのピークトップに合わせてある。また、ＳＩＭクロマトグラムの縦軸最大値は、同じｍ／ｚにおける測定では合わせてある。
初めに行った薬物試料の分析結果から、各薬物は脱プロトン化した負の分子イオン［Ｍ−Ｈ］-として感度よく検出され、バルビタール（ｍ／ｚ １８３.２）、フェノバルビタール（ｍ／ｚ ２３１.１）、ヘキソバルビタール（ｍ／ｚ ２３５.２）が保持時間１.３〜４.５ｍｉｎの間によく分離して溶出することがわかった。
次に行ったＢＳＡ含有薬物試料の分析では、ＢＳＡが保持時間０.４〜０.９ｍｉｎに集中して溶出したので、バルビタール溶出の直前で流路を切り替える瞬間（１.２ｍｉｎ）まで充分な余裕があった。得られた各薬物のＳＩＭクロマトグラムは、ピークの形状・高さともに、ＢＳＡを含まない場合の結果と非常によく一致した。フェノバルビタールの感度は他の２種に比べて低かったが、ＢＳＡの有無による差は認められなかった。
充填剤の排除限界より大きいＢＳＡの場合は、サイズ排除モードが働くため逆相的な相互作用は無視できるほど小さくなり、その結果、先端にまとまって溶出されたと考えられる。それに対し、低分子のバルビタール類は細孔内に入って逆相モードで分離されるが、細孔内面に点在する水酸基との水素結合により保持が若干増加するので、ＢＳＡとの分離がさらに促進されたと推定される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】サイズ排除クロマトグラフィーにおける被分析物質の分子量と溶離液の溶出容量との関係を表す較正曲線、および排除限界分子量を示す。
【図２】実施例１のクロマトグラム。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエン。
【図３】比較例１のクロマトグラム。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエン。
【図４】比較例２のクロマトグラム。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエン。
【図５】比較例３のクロマトグラム。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエン。
【図６】実施例３のクロマトグラム。ＵＶ検出器（ＢＳＡなし）、ＭＳ（ＢＳＡなし）。
【図７】実施例３のクロマトグラム。ＵＶ検出器（ＢＳＡあり）、ＭＳ（ＢＳＡあり）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物を高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣということがある。）分析する方法に関する。詳しくは、生体試料などに含まれる生体高分子化合物（たんぱく質など）を含む試料中の微量の低分子化合物（特に極性低分子化合物）を分離、分析する方法に関する。さらに詳しくは、生体成分に多く含まれる血清アルブミンのようなたんぱく質が含まれた試料において、質量分析装置（以下「ＭＳ（マススペクトログラフ）」と表記することもある。）を検出器に用いた場合でも、イオンサプレッション等の影響を受けずに、そこに含まれる薬物代謝物のような低分子化合物の分析を行うことのできる分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水溶性高分子、特に、血清アルブミン等のたんぱく質と、低分子化合物、例えば、薬物の生体内代謝物を含有する試料中の低分子化合物を分析する場合には、予め有機溶媒の添加、固相抽出等によって、妨害成分となるたんぱく質の大部分を除去した後に分析することが行われている。しかし、この際にすべてのたんぱく質の除去は難しく、微量のたんぱく質は除去できずに残ってしまうことがあった。
【０００３】
こうした試料を従来のＯＤＳ（オクタデシル基を結合させたシリカゲル充填剤）で分析すると、微量に存在するたんぱく質が不可逆的にカラムに吸着し、このため、カラムの劣化を早めたり分離パターンに変化を生じたりするといった問題があった。これらを回避する方法として、カラムスイッチング法や浸透制限充填剤と呼ばれる充填剤を用いたカラムを用いる方法が開発されている。
【０００４】
これらシリカゲル系の充填剤の欠点を補うために、充填剤の基材に多孔性有機高分子を用いたものが開発されている。例えば、ポリビニルアルコール基材の充填剤を用いたカラムは親水性であるために、たんぱく質等の吸着が少なく、たんぱく質は吸着されずに先にカラムから溶出する。ところが、当該基材自身はわずかに疎水性の部分を有しているために、低分子化合物を疎水性相互作用により保持することができる。このため、低分子化合物をたんぱく質等と分離して、分析することができる。
【０００５】
特開２００３−９３８０１号公報（特許文献１）には、細孔容積や表面積に特徴を有する、表面に親水層を持つ多孔性重合体粒子が記載されている。特開２００１−６６２９５号公報（特許文献２）、特開２００３−１９４７９３号公報（特許文献３）には、架橋性モノマーとしてポリエチレングリコール骨格を含む化合物を用い合成した充填剤について述べられている。この充填剤は、カラムスイッチング法の濃縮用カラムとしての性能が紹介されている。
【０００６】
これらの有機高分子を充填剤として用いたカラムは親水性高分子（特にこの場合生体試料に多く含まれる血清アルブミン）の吸着が起きないような性質を有している。しかし、これらのカラムを用いて、水溶性高分子と低分子化合物を含む試料を分析する場合、問題となるのが、高い極性を有する低分子化合物を分析する場合であった。こうした化合物は疎水性が小さいので、通常の疎水性を有する充填剤では水溶性高分子との分離が十分でなかった。また、逆に、極性の高い低分子物質を良く保持するような充填剤では、疎水性が強すぎ、全体に低分子化合物の保持が大きすぎ、イソクラティック条件（溶離液組成が一定の条件）では分析に時間がかかりすぎ、分析用カラムとしては不都合であるという問題があった。
【０００７】
これらの問題は溶離液にグラジエント条件を用いることにより回避することができる場合もあるが、グラジエント条件には別の問題点があった。すなわち、グラジエントに伴う溶離液組成の変化、ポンプ切り替わりによる圧力変動の影響により、配管やカラムハウジングなどに吸着していたアルブミンなどの水溶性高分子が少しずつ溶出すると、ＭＳなどで低分子を分析する場合に低分子薬物のイオン化を妨げ、検出感度を低下させるイオンサプレッションが起き、定量の妨げになるということである。
【０００８】
こうした背景の下、高い極性を有した低分子化合物に対する保持が強く、水溶性高分子と低分子化合物の良い分離を与える一方で、迅速分析が可能であり、しかもイソクラティック条件下で用いることができる充填剤とそれを用いた分析法が望まれていた。
【０００９】
なお、本発明で好適に使用されるグリセリンジメタクリレートを９０％以上使用して得られる有機高分子を用いた多孔性分離剤は特開昭５８−３２１６４号公報（特許文献４）に記載されているが、この充填剤を用いて、水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物を分析する方法についての記載はない。
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−９３８０１号公報
【特許文献２】特開２００１−６６２９５号公報
【特許文献３】特開２００３−１９４７９３号公報
【特許文献４】特開昭５８−３２１６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記従来技術の問題点を解決することを課題とする。すなわち、水溶性高分子と低分子化合物の分離が良く、たんぱく質などの影響を受けずに、溶離液組成が一定であるイソクラティック条件下で水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析を迅速に行うことのできる分析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決できる充填剤としての必須条件は、水溶性高分子として生体内試料に多く含まれ吸着しやすいため分析の妨げとなりやすい血清アルブミンが吸着等の問題を起こさないよう、疎水性の大きな基（例えばオクタデシル基）を有さないこと、及び同じ試料に含まれている極性の低分子化合物を水溶性高分子と分離するためには水素結合性を有することが同時に必要であると考えて鋭意検討を行い、上記課題を解決することに成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の１〜１０の水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析方法、１１の分析用液体クロマトグラフィー用充填剤、及び１２の水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物分析用液体クロマトグラフィー用カラムに関する。
【００１３】
１．原料モノマーとして２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物を９０質量％以上使用して得られた架橋有機高分子からなる充填剤を用いたカラムを用い、高速液体クロマトグラフィーによる分析を行うことを特徴とする水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析方法。
２．２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物がグリセリンジメタクリレートである前記１に記載の分析方法。
３．前記充填剤が、プルランによる排除限界分子量が３００００以下である前記１または２に記載の分析方法。
４．水と相溶する有機溶媒１５〜４０質量％および水性緩衝液８５〜６０質量％を含有する溶離液を使用し、イソクラティック条件下で高速液体クロマトグラフィー分析を行う前記１〜３のいずれかに記載の分析方法。
５．水と相溶する有機溶媒がメタノールおよび／またはアセトニトリルである前記４に記載の分析方法。
６．水と相溶する有機溶媒がアセトニトリルである前記５に記載の分析方法。
７．水溶性高分子が生体成分に含まれる生体由来の水溶性高分子である前記１〜６のいずれかに記載の分析方法。
８．水溶性高分子が、血清アルブミンである前記１〜６のいずれかに記載の分析方法。
９．前記分析法において使用する充填剤の質量平均粒子径が０.１〜１００μｍである多孔性の球状粒子である前記１〜８のいずれかに記載の分析方法。
１０．高速液体クロマトグラフィーにより分離された低分子化合物を質量分析装置で分析する前記１〜９のいずれかに記載の分析方法。
１１．原料モノマーとしてグリセリンジメタクリレートを９０質量％以上使用して得られた架橋有機高分子からなり、プルランによる排除限界分子量が３００００以下３０００以上であり、質量平均粒子径が０.１〜１００μｍである、水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析用液体クロマトグラフィー用充填剤。
１２．前記１１に記載の充填剤を使用した水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物分析用液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の効果】
【００１４】
本発明による方法を用いれば、水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物を、イソクラティック条件下で迅速に測定できる。特に、検出器に質量分析装置（ＭＳ）を用いた場合にも、微量溶出するたんぱく質成分によるイオンサプレッション等の妨害にあうことなく、測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
充填剤：
本発明の充填剤は２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物を９０質量％以上有する原料モノマー混合液を重合して得られた架橋有機高分子である。モノマー混合液を懸濁重合すれば微粒子状の充填剤を得ることができる。
【００１６】
本発明の分析対象となる試料は水溶性高分子と低分子化合物を含むものであるが、水溶性高分子自体は解析の対象とはしないので、低分子化合物と分離され、早く溶出しさえすればよい。本発明の試料は生体由来のものを主体としているため、分析対象の低分子化合物は極性の高いものが多い。極性の高い低分子化合物の充填剤での保持の程度は、充填剤との静電的相互作用（水素結合性や双極子相互作用）と疎水性相互作用の両方の合計によって決まる。疎水性相互作用で保持を大きくする場合は、試料中に共存する疎水性の強い他の低分子化合物の溶出がさらに遅くなるために迅速な分析の妨げになる。このため、迅速分析に適し、極性の高い低分子化合物を水溶性高分子から分離できる充填剤としては、主に水素結合性によって極性の高い低分子化合物を良く保持するものが好ましい。これらの低分子物質を分離するには適度の水素結合性を有することが好ましく、そのために本発明では水酸基を導入した。水酸基が多くなりすぎると、結果として充填剤の極性が高くなりすぎて、疎水性相互作用が弱くなりすぎる。本発明の充填剤には疎水性と水素結合性とが極めて微妙にバランスしていることが求められる。
【００１７】
原料モノマー：
このような条件を満たす充填剤としては、原料モノマーとして２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物を９０質量％以上使用して得られる架橋有機高分子が挙げられる。２個のエチレン性炭素−炭素二重結合は重合時に架橋構造を導入するのに必要である。２個のエチレン性炭素−炭素二重結合の間は適切な間隔が必要であるが、あまり長すぎると充填剤の架橋が疎になり、膨潤収縮が大きくなり、充填剤の強度が低下する問題が生じるため好ましくない。炭素−炭素二重結合間の共有結合数は６〜１０が好ましい。水酸基は充填剤に水素結合性を付与するが、多すぎると充填剤の疎水性が小さくなり分析に使用できなくなる。従って、原料モノマーに１個の水酸基が適当である。
【００１８】
２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物としては、３個以上の水酸基を有する多価アルコールのジ（エチレン性不飽和カルボン酸）エステル、またはこうしたジエステルのエステル結合をエーテル結合もしくは単結合に置き換えた化合物が挙げられ、例えばグリセリンジ−１，３−（メタ）アクリレート、グリセリンジ−１，２−（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシ−１，３−ジアリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１，３−ジビニロキシ プロパンなどが挙げられる。なお、ここで「（メタ）アクリレート」は「メタクリレート」または「アクリレート」を意味する。これらの中で特に好ましいのは、グリセリンジメタクリレート（２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン）である。以下、グリセリンジメタクリレートを例として説明する。
グリセリンジメタクリレートよりも疎水性の低いモノマー、例えば、アクリルアミドと架橋剤（多官能モノマー）等を使用すると、充填剤の疎水性が低くなりすぎるので、好ましくない。また、疎水性の高いモノマー、例えばジビニルベンゼン等を使用すると疎水性が大きくなってしまい、疎水性の低分子化合物の溶出が大きく遅れ分析時間が長くなってしまうので好ましくない。
【００１９】
グリセリンジメタクリレートは架橋性のモノマーなので、得られた充填剤は、架橋度が高く、強度の高いものとなる。このため充填剤粒子の径を小さくできるので、高性能な液体クロマトグラフィー用充填剤を得ることができる。逆に、グリセリンジメタクリレート以外の架橋性でないモノマーを使用するとそれだけ充填剤の強度が失われてしまうため、好ましくない。架橋剤であり、疎水性の程度が似ているモノマーに、ポリエチレングリコールジメタクリレートのような架橋部の分子の鎖が長いものがあるが、これを使用すると、膨潤収縮が大きくなり、充填剤の強度が低下するので好ましくない。
【００２０】
原料モノマー混合液中のグリセリンジメタクリレートの濃度は９０質量％以上が必要である。より好ましくは、９５質量％、さらに好ましくは９９質量％以上含有していることが好ましい。９０質量％未満では水素結合性が小さくなり、極性の高い低分子化合物の分離が悪くなったりするので好ましくない。９０質量％以上使用した場合に、十分な強度を持ち、水素結合性が高く、疎水性の小さい充填剤を得ることができる。
【００２１】
本発明の充填剤の分離性能、特性はグリセリンジメタクリレートが９０質量％未満にならない範囲で、他のモノマーを混合することによって微調節することができる。グリセリンジメタクリレート以外に加えることのできるモノマーとしては、通常の充填剤を製造するときに使用されるラジカル重合性モノマーが殆ど使用できる。例えば、スチレン、ジビニルベンゼン、メチルアクリレート、ビス（メタ）アクリルアミド、エチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、グリセリンモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００２２】
重合：
重合は、溶液重合、塊状重合、懸濁重合、乳化重合などの通常のラジカル重合により実施することができる。以下に代表例として水性懸濁重合で球状粒子を作る場合について説明するが、この方法に限定されるものではない。
水性懸濁重合に用いる油相の調製は、原料モノマー混合液と希釈剤（溶媒または分散媒、モノマーの希釈剤として使用）との混合物に、重合開始剤を添加して行う。
【００２３】
希釈剤は、生成する球状架橋有機高分子粒子（充填剤）を多孔性にする目的でモノマー混合物に添加される。その種類は、塊状重合などのように水を媒体に用いない場合には特に限定されないが、水性懸濁重合などのように水を媒体に用いる場合には、水に難溶性の有機化合物が好ましい。具体例としては、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ヘプタン、オクタン、ドデカン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、イソアミルアルコール、１−ヘキサノール、シクロヘキサノール、２−エチルヘキサノール、１−ドデカノール、非架橋ポリスチレンなどが挙げられる。これらの溶媒または分散媒は、単独でまたは２種以上組み合わせたそれらの混合物として使用することができる。
【００２４】
また、これらの希釈剤の添加量は、原料モノマーと希釈剤の総量を基準として１０〜９０質量％、好ましくは２０〜８０質量％、より好ましくは２５〜６０質量％である。添加量が１０質量％未満だと、充填剤の多孔性が不十分になるため好ましくない。希釈剤を多く使用すると充填剤の細孔容積が大きくなり好ましいが、９０質量％を超えた場合は充填剤の物理的強度が不足し、カラムとしての耐圧性が低下する。
【００２５】
重合開始剤の例としては、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）のようなアゾ系化合物；過酸化ベンゾイル、過酸化ジクミル、過酸化ジ−ｔ−ブチル、過安息香酸−ｔ−ブチル、メチルエチルケトンペルオキシドのような有機過酸化物など一般に使用される重合開始剤が挙げられる。これらは単独でまたは２種以上を組み合わせて使用する。用いる重合開始剤の濃度は、単量体の種類などにより適宜決められるものであり一概に規定できないが、モノマーの総量１００質量部に対して０.１〜５質量部が好ましく用いられる。
【００２６】
水相には油相の分散安定剤を添加する。用いる分散安定剤として、ポリビニルアルコール、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、ゼラチンなどの水溶性高分子化合物が挙げられる。分散安定剤の濃度は、特に限定はないが、水１００質量部に対して０.１〜５質量部が好ましい。またモノマーの一部が水相へ溶解するのを防ぐため、水相に塩類を添加するのが好ましい。添加する塩類の例としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウムなどが挙げられ、これら塩類は単独でまたは２種以上組み合わせて使用する。用いる塩類の濃度に特に限定はないが、溶解度の許す範囲で、可能な限り高い濃度が好ましい。例えば、水に対して、塩化ナトリウムであれば１〜１５質量部、塩化カルシウムであれば１〜４０質量部である。
【００２７】
油相に対する水相の比率が大きすぎると、単量体の一部が水相へ溶解する量が増えてしまい、小さすぎると油滴の合一が起こりやすくなる。そのため、使用する水の質量は、モノマーおよび希釈剤の総量１００質量部に対して２００〜１０００質量部が好ましい。
【００２８】
水性懸濁重合を始める前に油相と水相を混合し、油滴が目的とする粒子径（粒子の直径）になるように分散させる。分散には、微粒子化用の撹拌翼を付けた撹拌装置、または高速分散機（ホモジナイザー）などを用いることができる。粒子径が比較的大きい吸着剤（例えば固相抽出用）を作るには微粒子化用の撹拌翼を付けた撹拌装置を用い、粒子径の小さい吸着剤（例えば、液体クロマトグラフィー用の吸着剤）を作るには高速分散機（ホモジナイザー）を用いるのがよい。
【００２９】
重合反応は、通常の撹拌下において４０〜１００℃の温度範囲で５〜１６時間行なわれる。
このようにして得られた充填剤微粒子は熱水、有機溶媒などで十分洗浄し、粒子に含有されている、あるいは付着している分散安定剤、溶媒、残存モノマー、希釈剤などを除去する。さらに、必要に応じて粒子を分級して、クロマトグラフィー用充填剤が得られる。
【００３０】
充填剤の粒子径：
ＨＰＬＣにおいて、十分な理論段数を有するように、粒子が細かいものを使用する必要がある。充填剤の質量平均粒子径は０.１〜１００μｍが好ましく、１〜１０μｍがより好ましく、３〜５μｍがさらに好ましい。粒子径が０.１μｍ未満であるとカラムの圧力が高くなりすぎ、機器に負担を与えるという問題が生ずる。１００μｍを超えると分析カラムとしての性能が低くなり都合が悪い。所望の粒子径を得るのには重合における分散剤の量や撹拌速度を調節する。最終的に得られた充填剤の大きさとこれらの条件の相関を求めることで、最適な条件を決めることができる。また、重合の粒子を分級してもよい。分級操作としては篩による分級、風力分級等が挙げられる。
【００３１】
質量平均粒子径はコールターカウンター（登録商標）、光学顕微鏡などで測定できる。
以上は充填剤が多孔性の粒子である場合について説明したが、多孔性であれば、モノリスのような一体型の充填剤であっても良い。
【００３２】
充填剤の排除限界分子量：
本発明の充填剤の排除限界分子量は３００００以下であることが好ましい。排除限界分子量が３００００を超えると、血清アルブミンのような水溶性高分子の溶出が遅れるため、低分子化合物との分離が悪くなる。また、排除限界分子量が、３０００未満であると、分析対象の低分子化合物自体の保持が低下したり、分離が悪化したりするため好ましくない。
【００３３】
排除限界分子量は充填剤を内径４.６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレスカラムに充填し、純水を溶離液にして、分子量既知のプルラン（昭和電工（株）製）を標準サンプルとして、較正曲線を作成して求める。排除限界分子量が、３００００以下である場合、生体内等に多く含まれる水溶性たんぱく質の多くは、排除限界（Ｖｏ）に近いところに溶出する。一方、低分子化合物は、浸透限界以降（Ｖｔ）にその疎水性の強さに従って順次溶出するため、水溶性高分子と低分子化合物との分離が改善する。このことから、排除限界分子量の値は水溶性高分子と低分子化合物の分離を良くするために重要である。
【００３４】
本発明の充填剤を通常の懸濁重合等によって製造する場合、充填剤の排除限界分子量は、モノマーと共に加えられる希釈剤の量と種類によってコントロールできる。一般に希釈剤の量を増やすことにより、充填剤粒子の細孔が大きくなる為排除限界分子量は大きくなる。希釈剤に、モノマーの重合により生成する高分子に対する貧溶媒のものを用いれば排除限界分子量は大きくなり、良溶媒のものを用いれば排除限界分子量は小さくなる。
【００３５】
分析対象物質：
水溶性高分子とは、分子量が１００００程度以上のたんぱく質や有機高分子、天然高分子を呼ぶ。特に、生体由来の水溶性高分子が挙げられ、さらに、生体由来の試料に、一般に多く含まれ、分析において妨害になりやすい化合物である血清アルブミン、アルブミン２量体等が挙げられる。
【００３６】
本明細書において低分子化合物とは、分子量４０００以下の有機化合物を表す。特に、生体試料が分析目的試料などのときは、その中に含有される薬物や薬物の代謝物などが挙げられる。具体的にはカフェイン、テオブロミン、テオフィリン、バルビタール類などが挙げられる。
本発明の充填剤は、疎水性が低いにもかかわらず、水素結合性がこれまでに使われてきた逆相系の分析カラムに比べて際立って高い。このため、カフェインなどの極性の強い低分子化合物の保持が大きい特性を有する。この性質が、本発明における分析方法を可能にするひとつの要因になっている。この水素結合性の高さの理由は、粒子表面のみならず細孔内面にも点在する水酸基の影響であると推測されるが、詳しくはわからない。
本発明のカラムは次式で示されるα：
【数１】
ｋcaffeine：カフェインの保持係数，ｋtoluene：トルエンの保持係数，ｋr：（ｔr−ｔ0）／ｔ0，ｔr：サンプルの保持時間（ピーク位置の時間，ｒはカフェインまたはトルエンを示す。），ｔ0：非保持時間。
が、０．０５〜１．０が好ましく、０．０８〜０．５がより好ましい。αが下限値未満では水溶性高分子と低分子化合物の分離が悪くなり、上限値を超えると低分子化合物同士の分離が悪くなる。
【００３７】
高速液体クロマトグラフィーによる分析条件：
＜溶離液＞
本発明の分析方法ではＨＰＬＣの溶離液として水と相溶する有機溶媒１５〜４０質量％と水性緩衝液８５〜６０質量％を含有するものを使用することが好ましい。
【００３８】
水と相溶する有機溶媒とは常温〜ＨＰＬＣの分析温度の範囲で水（水性緩衝液を含む）に２５質量％以上溶解する有機溶媒である。このような有機溶媒としては通常の液体クロマトグラフィーで用いることのできる溶媒であれば、特に限定されないが、例を挙げれば、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどが挙げられ、特にアセトニトリルが好ましい。これらの有機溶媒は数種類を混合して使用することもできる。
【００３９】
水性緩衝液としては分析時のｐＨを安定化するために使用する様々な緩衝液が使用できる。また、緩衝液を使用しないで、純水を用いることもできる。ＭＳを検出器として使用する場合には、揮発性の緩衝液が望まれる。これには、ギ酸アンモニウムや酢酸アンモニウムが好ましい。一般的に用いられるのは、５〜１０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液である。
【００４０】
水と相溶する有機溶媒と水性緩衝液との混合比率は１５〜４０質量％：８５〜６０質量％が好ましく、２０〜３５質量％：８０〜６５質量％がより好ましく、２０〜３０質量％：８０〜７０質量％が最も好ましい。
本発明の充填剤は、血清アルブミン等のたんぱく質の吸着が、まったくないわけではない。しかし、本充填剤が好適に使用できるところの、有機溶剤が１５〜４０質量％の溶離液条件下では、血清アルブミン等のたんぱく質との疎水性相互作用が最小になり、ほとんど吸着を起こさない。このため、この溶離液範囲で分析を行うと、アルブミンの回収率は９０％以上であり、さらにこのとき、親水性の低分子化合物の保持も十分に大きく、疎水性の強い化合物も遅れることなく溶出する。このため、イソクラティック条件で好適にＨＰＬＣ分析できる。有機溶媒濃度が１５質量％未満の条件では、血清アルブミン等のたんぱく質の吸着が若干見られるばかりでなく、疎水性の強い化合物の溶出が遅くなりすぎてしまう。さらに、有機溶媒濃度が４０質量％を超える条件下では、極性の高い低分子化合物の保持が小さくなり、浸透限界に近づくために、分離が悪くなる。さらに、この条件では、血清アルブミン等のたんぱく質も溶解性が悪く析出の危険もあることから好ましくない。
【００４１】
本発明のＨＰＬＣ分析では溶離液をイソクラティック条件で行うことが好ましい。これはカラムハウジングや配管などに吸着した親水性高分子の溶出を最低限に抑え、ＭＳでの検出や、低分子化合物の定量を安定に行うためである。ＭＳで観測していないときや、カラムや分析装置の洗浄等の場合には、グラジエント条件を適応しても問題はない。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１：
１．グリセリンジメタクリレート充填剤の合成
グリセリンジメタクリレート（ＮＫエステル７０１、新中村化学工業（株））２０００ｇとシクロヘキサノール（純正化学（株））１３４０ｇの混合液に、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）（和光純薬工業（株））３０ｇを溶解させ、油相を調製した。一方、ポリビニルアルコール（クラレ（株）製クラレポバールＰＶＡ−２２４）１２０ｇを水３リットルに溶解させ、そこへ水７リットル、次いで塩化ナトリウム２４０ｇの水（２リットル）溶液を加えて混合し、水相を調製した。２０Ｌのステンレス製容器内で上記油相と上記水相を混合し、高速分散機（ホモジナイザー）にかけ、回転数と分散時間を調節することにより、油滴の最大粒子径が５μｍになるように調整した。
【００４４】
次いで、通常の撹拌翼を使用し、１５０ｒｐｍで撹拌しながら、６０℃で７時間反応を行った。生成した架橋重合体粒子を遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）して上澄みを捨て、沈澱を７０℃の温水１２リットルに分散（超音波洗浄器使用）後、７０℃で３時間撹拌した。これを吸引ろ過し、漏斗上のケーキを７０℃の温水６０リットル、次いでアセトン１８リットルで洗浄した後、ステンレス製バットに広げて風乾し、さらに６０℃で２４時間減圧乾燥した。これを風力分級装置で分級した。コールターカウンター（ベックマン・コールター Multisizer 3）で測定したところ、質量平均粒子径５.１μｍの架橋重合体粒子１３００ｇを得た。
上記で得られた架橋重合体粒子５０ｇに純水５００ｍｌを加え、６０℃で５時間加熱撹拌した後、粒子をろ取し、７０℃の温水２０００ｍｌ、メタノール３００ｍｌで順次洗浄した。これをステンレス製バットに広げて風乾後、さらに７０℃で２４時間減圧乾燥し、充填剤４８ｇを得た。
【００４５】
２．カラムの性能評価
この充填剤約３ｇを、内径４.６ｍｍで長さ１５０ｍｍのステンレス製カラムに湿式充填法によって充填した。
溶離液：純水、
流量：０.３３ｍｌ／分、
標準試料：プルラン０.１質量％、
プルランの分子量：７５８０００、３３８０００、１９４０００、９５４００、４６７００、２０８００、１２０００、５３００（全て、Shodex STANDARD P-82，昭和電工（株）製）、
分子量：２９３０（昭和電工（株）製）、
分子量：１３３０（昭和電工（株）製）、
検出器：ＲＩ、
注入量：１００μｌ。
各分子量のプルランの溶出位置を測定、そのリテンションタイムから、溶出容量を計算し較正曲線を作成した。すなわち、分子量の対数値を縦軸に、溶出容量を横軸にとったグラフに各点をプロットし曲線でつないだ（図１）。図１において傾斜した直線の延長と縦軸に平行な線の延長が交わる点の縦軸の値を排除限界分子量として求めたところ、この充填剤の排除限界分子量は、２００００であった。
【００４６】
３．ＢＳＡ（牛血清アルブミン）の回収率評価
この充填剤を、直径４.６ｍｍで長さ５０ｍｍのカラムに充填した。
このカラムに牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製、以下ＢＳＡと表記することがある。）を注入したときのＢＳＡの回収率を、カラムを付けない時（カラムの代わりにポリテトラフルオロエチレン製のチューブ（内径０．５ｍｍ、長さ１０ｍ）を取り付けて測定した。）のＢＳＡのピーク面積を１００％として求めた。
溶離液：１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝８５０ｇ／１５０ｇ、
流量：１ｍｌ／分、
カラム温度：３０℃、
試料：ＢＳＡ７ｍｇ／ｍｌ、
注入量：１０μｌ、
検出器：ＵＶ（２２０ｎｍ）。
ＢＳＡは排除限界に１本のピークとして観測され、ピーク面積から、９８％のＢＳＡが溶出していることが観測された。
【００４７】
４．カラムの分離性能の評価
それぞれの充填剤の持つ静電的相互作用の大きさを疎水性も考慮したうえで比較するために、相対的な静電的相互作用の強さを次式で求めた。
【数１】
ｋcaffeine：カフェインの保持係数，ｋtoluene：トルエンの保持係数，ｋr：（ｔr−ｔ0）／ｔ0，ｔr：サンプルの保持時間（ピーク位置の時間），ｔ0：非保持時間。
この値は、疎水性相互作用と静電的相互作用の比を表しており、この値が大きいほど、極性の高い低分子化合物の保持が大きく、かつ、疎水性の低分子化合物の溶出も遅くなりすぎないということを示す。つまり、この値が（ある程度までは）大きいほど、始めに溶出する親水性高分子と極性の高い低分子化合物の分離が好調であり、かつ疎水性の強い低分子化合物の溶出に長い時間待つ必要がないカラムを与えることを示す。
【００４８】
分析条件：
溶離液１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アセトニトリル＝７５０ｇ／２５０ｇ、
流量：１ｍｌ／分、
カラム温度：４０℃、
検出器：ＵＶ（２５４ｎｍ）、
注入量：１０μｌ、
サンプル：ＢＳＡ７００ｍｇ／Ｌ、カフェイン１０ｍｇ／Ｌ、トルエン１５０ｍｇ／Ｌ、
結果：α＝０.０８６。
【００４９】
図２にクロマトグラムを示した。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエンのピークを示す。ＢＳＡが排除限界（０.３９分）に溶出した後、カフェイン０.９７分、トルエン４.４５分に溶出した。ＢＳＡとカフェインの分離は良好で、トルエンの溶出も遅くないので、イソクラティック条件下での迅速分析が可能であった。
【００５０】
実施例２（共重合タイプの充填剤）
グリセリンジメタクリレート２０００ｇのかわりにグリセリンジメタクリレート１８８０ｇ、グリシジルメタクリレート１２０ｇを使用した以外は実施例１と同様にして重合、風力分級し、架橋重合体粒子１２００ｇを得た。当該架橋重合体粒子の質量平均粒子径は５．１μｍであった。
上記で得られた架橋重合体粒子３０ｇに０．３Ｍギ酸水溶液（１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ３．０に調整したもの。）５００ｍｌを加え、６０℃で５時間過熱攪拌した後、粒子をろ取し、７０℃の温水２０００ｍｌ、メタノール３００ｍｌで順次洗浄した。これをステンレス製バットに広げて風乾後、さらに７０℃で２４時間減圧乾燥し、充填剤３０ｇを得た。
２．排除限界分子量（分析条件は実施例１と同じ）は２００００であった。
３．ＢＳＡの回収率評価（分析条件は実施例１と同じ）：
９３％のＢＳＡを回収した。
４．カラムの分離性能（分析条件は実施例１と同じ）：
α＝０．０８７
実施例１と同様な充填剤が得られた。
【００５１】
比較例１：
１．充填剤の製造
グリセリンジメタクリレート２０００ｇの代わりに、エチレンジメタクリレート２０００ｇを用いたほかは、実施例１と同じようにして、質量平均粒子径４.９μｍの充填剤を得た。
２．排除限界分子量（分析条件は実施例１の２に同じ）は３００００であった。
３．ＢＳＡの回収率評価（分析条件は実施例１の３に同じ）：
９０％のＢＳＡを回収した。
４．カラムの分離性能の評価（分析条件は実施例１の４に同じ）：
α＝０.０２８。
αの値は実施例１の充填剤より小さかった。図３にクロマトグラムを示した。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエンのピークを示す。クロマトグラムは、図２と比べるためにＢＳＡのピークとトルエンのピークの間の距離がほぼ同じになるように、時間軸を縮小して示している。トルエンの溶出時間が約１２分と実施例１の約５分と比較してかなり遅く、イソクラティック条件での迅速分析に向いていないことがわかる。
【００５２】
比較例２：
１．充填剤の製造
グリセリンジメタクリレート２０００ｇの代わりに、エチレンジメタクリレート１０００ｇとグリセリンジメタクリレート１０００ｇを用いたほかは、実施例１と同じようにして、質量平均粒子径５.１μｍの充填剤を得た。
２．排除限界分子量（分析条件は実施例１と同じ）は５００００であった。
３．ＢＳＡの回収率評価（分析条件は実施例１と同じ）：
９３％のＢＳＡを回収した。
４．カラムの分離性能の評価（分析条件は実施例１と同じ）：
α＝０.０４４。
αの値は実施例１の充填剤より小さかった。図４にクロマトグラムを示した。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエンのピークを示す。クロマトグラムは、図２と比べるためにＢＳＡのピークとトルエンのピークの間の距離がほぼ同じになるように、時間軸を拡大して示している。
トルエンの溶出時間は遅すぎず、適切な位置であったが、カフェインの分離は実施例１に劣った。
【００５３】
比較例３：
１．充填剤は市販のカラム：ＧＦ−３１０ ４Ｂ（昭和電工（株）製、ポリビニルアルコール系充填剤，質量平均粒子径５μｍ）を使用した。
２．排除限界分子量：
カタログ値 ４００００。
３．ＢＳＡの回収率評価（分析条件は実施例１と同じ）：
ＢＳＡが９８％回収された。
４．カラムの分離性能の評価（分析条件は実施例１と同じ）：
α＝０.０１９。
αの値は実施例１の充填剤より小さかった。図５にクロマトグラムを示した。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエンのピークを示す。クロマトグラムは、図２と比べるためにＢＳＡのピークとトルエンのピークの間の距離がほぼ同じになるように、時間軸を縮小して示している。ＢＳＡとカフェインの分離が劣っている。
【００５４】
実施例３：ＭＳを検出器に用いた分析
カラムとして実施例１の充填剤を直径２.０ｍｍ，長さ５０ｍｍのステンレスカラムに湿式充填により、充填したものを用いた。低分子化合物の試料として３種の薬物、すなわち、下記式で示されるバルビタール（barbital）、フェノバルビタール（phenobarbital）、ヘキソバルビタール（hexobarbital）、
【化１】
水溶性高分子マトリックスとして牛血清アルブミン（ＢＳＡ、分子量：約６７，０００）を選んだ。ＬＣ−ＭＳシステムとしては、Agilent 1100シリーズＨＰＬＣシステム（アジレントテクノロジー製）にLCQ Advantage （サーモエレクトロン社製）を連結し、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法で使用した。カラム温度３０℃、（１０ｍＭ酢酸アンモニウム）／アセトニトリル＝７０ｍｌ／３０ｍｌを移動相とする５分間のイソクラティック溶出（０.２０ｍｌ／ｍｉｎ、スプリットなし）で分析を行った。
まず、薬物（各５μｇ／ｍｌ）のみをイオン交換水に溶かした試料１０μｌを注入し、ＵＶ検出（２２０ｎｍ）およびＥＳＩ−負イオンモードによる選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）にて測定した（イオン化電圧：５ｋＶ）。次に、３種の薬物（各５μｇ／ｍｌ）とＢＳＡ（０.７ｍｇ／ｍｌ）をイオン交換水に溶かした試料１０μｌを注入し、同様に測定した。ただし、後者ではＢＳＡが高濃度で溶出している部分（１.２ｍｉｎまで）の溶出液はＭＳへ導入しなかった。
結果：
薬物試料の分析結果を図６に、ＢＳＡ含有薬物試料の分析結果を図７に示す。ＵＶ検出クロマトグラムの縦軸最大値は、ＢＳＡのピークトップに合わせてある。また、ＳＩＭクロマトグラムの縦軸最大値は、同じｍ／ｚにおける測定では合わせてある。
初めに行った薬物試料の分析結果から、各薬物は脱プロトン化した負の分子イオン［Ｍ−Ｈ］-として感度よく検出され、バルビタール（ｍ／ｚ １８３.２）、フェノバルビタール（ｍ／ｚ ２３１.１）、ヘキソバルビタール（ｍ／ｚ ２３５.２）が保持時間１.３〜４.５ｍｉｎの間によく分離して溶出することがわかった。
次に行ったＢＳＡ含有薬物試料の分析では、ＢＳＡが保持時間０.４〜０.９ｍｉｎに集中して溶出したので、バルビタール溶出の直前で流路を切り替える瞬間（１.２ｍｉｎ）まで充分な余裕があった。得られた各薬物のＳＩＭクロマトグラムは、ピークの形状・高さともに、ＢＳＡを含まない場合の結果と非常によく一致した。フェノバルビタールの感度は他の２種に比べて低かったが、ＢＳＡの有無による差は認められなかった。
充填剤の排除限界より大きいＢＳＡの場合は、サイズ排除モードが働くため逆相的な相互作用は無視できるほど小さくなり、その結果、先端にまとまって溶出されたと考えられる。それに対し、低分子のバルビタール類は細孔内に入って逆相モードで分離されるが、細孔内面に点在する水酸基との水素結合により保持が若干増加するので、ＢＳＡとの分離がさらに促進されたと推定される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】サイズ排除クロマトグラフィーにおける被分析物質の分子量と溶離液の溶出容量との関係を表す較正曲線、および排除限界分子量を示す。
【図２】実施例１のクロマトグラム。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエン。
【図３】比較例１のクロマトグラム。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエン。
【図４】比較例２のクロマトグラム。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエン。
【図５】比較例３のクロマトグラム。ピーク１：ＢＳＡ、ピーク２：カフェイン、ピーク３：トルエン。
【図６】実施例３のクロマトグラム。ＵＶ検出器（ＢＳＡなし）、ＭＳ（ＢＳＡなし）。
【図７】実施例３のクロマトグラム。ＵＶ検出器（ＢＳＡあり）、ＭＳ（ＢＳＡあり）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料モノマーとして２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物を９０質量％以上使用して得られた架橋有機高分子からなる充填剤を用いたカラムを用い、高速液体クロマトグラフィーによる分析を行うことを特徴とする水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析方法。
【請求項２】
２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物がグリセリンジメタクリレートである請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記充填剤が、プルランによる排除限界分子量が３００００以下である請求項１または２に記載の分析方法。
【請求項４】
水と相溶する有機溶媒１５〜４０質量％および水性緩衝液８５〜６０質量％を含有する溶離液を使用し、イソクラティック条件下で高速液体クロマトグラフィー分析を行う請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項５】
水と相溶する有機溶媒がメタノールおよび／またはアセトニトリルである請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
水と相溶する有機溶媒がアセトニトリルである請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
水溶性高分子が生体成分に含まれる生体由来の水溶性高分子である請求項１〜６のいずれかに記載の分析方法。
【請求項８】
水溶性高分子が、血清アルブミンである請求項１〜６のいずれかに記載の分析方法。
【請求項９】
前記分析法において使用する充填剤の質量平均粒子径が０.１〜１００μｍである多孔性の球状粒子である請求項１〜８のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１０】
高速液体クロマトグラフィーにより分離された低分子化合物を質量分析装置で分析する請求項１〜９のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１１】
原料モノマーとしてグリセリンジメタクリレートを９０質量％以上使用して得られた架橋有機高分子からなり、プルランによる排除限界分子量が３００００以下３０００以上であり、質量平均粒子径が０.１〜１００μｍである、水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析用液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１２】
請求項１１に記載の充填剤を使用した水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物分析用液体クロマトグラフィー用カラム。
【請求項１】
原料モノマーとして２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物を９０質量％以上使用して得られた架橋有機高分子からなる充填剤を用いたカラムを用い、高速液体クロマトグラフィーによる分析を行うことを特徴とする水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析方法。
【請求項２】
２個のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個の水酸基を有する化合物がグリセリンジメタクリレートである請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記充填剤が、プルランによる排除限界分子量が３００００以下である請求項１または２に記載の分析方法。
【請求項４】
水と相溶する有機溶媒１５〜４０質量％および水性緩衝液８５〜６０質量％を含有する溶離液を使用し、イソクラティック条件下で高速液体クロマトグラフィー分析を行う請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項５】
水と相溶する有機溶媒がメタノールおよび／またはアセトニトリルである請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
水と相溶する有機溶媒がアセトニトリルである請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
水溶性高分子が生体成分に含まれる生体由来の水溶性高分子である請求項１〜６のいずれかに記載の分析方法。
【請求項８】
水溶性高分子が、血清アルブミンである請求項１〜６のいずれかに記載の分析方法。
【請求項９】
前記分析法において使用する充填剤の質量平均粒子径が０.１〜１００μｍである多孔性の球状粒子である請求項１〜８のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１０】
高速液体クロマトグラフィーにより分離された低分子化合物を質量分析装置で分析する請求項１〜９のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１１】
原料モノマーとしてグリセリンジメタクリレートを９０質量％以上使用して得られた架橋有機高分子からなり、プルランによる排除限界分子量が３００００以下３０００以上であり、質量平均粒子径が０.１〜１００μｍである、水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析用液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１２】
請求項１１に記載の充填剤を使用した水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物分析用液体クロマトグラフィー用カラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−５７５２６（Ｐ２００７−５７５２６Ａ）
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２０１６９６（Ｐ２００６−２０１６９６）
【出願日】平成１８年７月２５日（２００６．７．２５）
【出願人】（０００００２００４）昭和電工株式会社 (3,251)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２５日（２００６．７．２５）
【出願人】（０００００２００４）昭和電工株式会社 (3,251)
【Ｆターム（参考）】
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