水生生物養殖のための神経ペプチド
この発明は、水生生物の成長を刺激し、そして免疫システムを改善するために、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ−活性化ペプチドの変異体の使用に関係する。このペプチドの変異体は、浸漬又は注射によるか又は餌に添加する形で供給される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に水生生物の養殖に脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドを使用する、養殖バイオテクノロジーの分野に関係する。浸漬、注射又は餌添加によりこのペプチドを水生生物に適用することにより、これらの生物の食欲の増進、成長速度及び生存率の増加、優れた免疫活性及びプロラクチン放出の増加を生じる。
【背景技術】
【０００２】
脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、１９８９年に初めてウシの視床下部から単離され、成長ホルモン分泌を刺激するその能力はアデニル酸シクラーゼ酵素の活性化によることが示された（Ｍｉｙａｔａ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９８９）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ３８ ｒｅｓｉｄｕｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｗｈｉｃｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ｉｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４：５６７−５７４）。ＰＡＣＡＰは、セクレチン、グルカゴン及び腸管血管作動性ペプチドを含むペプチドファミリーに属している（Ａｒｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｓｈｉｏｄａ（１９９５）Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓａ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ａｎｄ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６：５３−８８）。哺乳類において、ＰＡＣＡＰ及び成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）の前駆体は二つの異なる遺伝子によりコード化されている（Ｈｏｓｏｙａ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９９２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ｇｅｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１２９：１９９−２０６）。今日までに試験された哺乳類以下の動物種（鳥類、爬虫類及び魚類）において、ＧＨＲＨ及びＰＡＣＡＰペプチドは同じ遺伝子によりコード化されており、同じ前駆体中に含まれている（Ｍｏｎｔｅｒｏ ａｎｄ ｃｏｌ．（２０００） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ／ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１５７−１６８）。ＰＡＣＡＰ遺伝子は基本的に、中枢及び末梢神経系、眼に刺激を与える神経線維、気管、唾液腺、胃腸管、生殖系器官、膵臓及び尿管に発現する。また、それは副腎、生殖腺及び免疫細胞において合成される（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ａｎｄ ｃｏｌ．（２０００）Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ａｄｅｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）／Ｇｌｕｃａｇｏｎ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｅｎｄｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ ２１：６１９−６７０）。ＰＡＣＡＰは、種々の組織における多様な分布及び下垂体刺激性、神経伝達、神経調節及び血管調節作用に一致する種々の生物学的機能を示す（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９９７） Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｕｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ５９−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１２１２２−１２１３１）。
【０００３】
それは細胞分裂、分化及び死の調節に関係している（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ａｎｄ ｃｏｌ．（２０００） Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ａｄｅｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）／Ｇｌｕｃａｇｏｎ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｅｎｄｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ ２１：６１９−６７０）。
【０００４】
ＰＡＣＡＰは成長ホルモン（ＧＨ）の遊離を刺激する。ＧＨ遊離におけるこのペプチドの作用は、インビトロにおいて、哺乳類、鳥類、両生類の数種において実施されている（Ｈｕ ａｎｄ ｃｏｌ（２０００） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｏｇ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ｂｒａｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １４１：６５７−６６５）及び魚類（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｌ．Ｌ．ａｎｄ ｃｏｌ．（２００４） Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｍｅｄ．２２９：２９１−３０２）。ＧＨの分泌及び遊離におけるＰＡＣＡＰの作用に関するインビボの試験はあまりない。今日まで、インビボにおいてこのペプチドはラット血漿中のＧＨのレベルを増加させることが知られている（Ｊａｒｒ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９９２） Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｍａｌｅ ｒａｔｓ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５１：８２３−８３０）及びウシ血漿中（Ｒａｄｃｌｉｆｆ ａｎｄ ｃｏｌ．（２００１） Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ．Ｄｏｍｅｓｔｉｃ．Ａｎｉａｍａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２１：１８７−１９６）。一方、雌ヒツジ（Ｓａｗａｎｇｊａｒｏｅｎ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｗｉｓ（１９９４） Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ａｎｄ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）ｏｎ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ，ｌｕｔｅｉｎａｉｚｉｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｗｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６：５４９−５５５）及びヒト（Ｃｈｉｏｄｅｒａ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９９６） Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｒｖｅｎｏｕｓｌｙ ｉｎｆｕｓｅｄ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎｎｏｍａｌ ｍｅｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６４：２４２−２４６）では、この作用は生じない。
【０００５】
これらの試験結果は、哺乳類において、ＧＨ分泌に対するこのペプチドの作用は動物種によって異なることを示唆している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ ｃｏｌ．（２００４） Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｍｅｄ．２２９：２９１−３０２）。
【０００６】
今まで、魚類において、ＧＨ調節におけるＰＡＣＡＰ機能を示すインビボ試験はなく、さらに、水生生物における食欲刺激にこのペプチドを使用した先行試験は存在しない。甲殻類において、これまで、このペプチドが存在するというエビデンスはなく、これらの生物における成長を調節するシグナルのカスケードは知られていない。
【０００７】
ＰＡＣＡＰは哺乳類において脳下垂体細胞によるプロラクチン遊離を刺激する（Ｏｒｔｍａｎｎ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９９９） Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｓｔｅｒｏｉｄｓ ｗｉｔｈ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ＧｎＲＨ ｉｎ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４０：２０７−２１４）。これは、脳下垂体のメラノトロピン細胞によるメラノトロピン（α−メラニン細胞刺激ホルモン、ＭＳＨ）の遊離を促進する（Ｖａｕｄｒｙ ａｎｄ ｃｏｌ．（２０００） Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．ｓ ５２：２６９−３６４）。
【０００８】
魚類において、プロラクチン遊離におけるこのペプチドの作用を示すインビボ試験はない。また、サカナの色の発生におけるその作用に関する試験結果はない。
【０００９】
哺乳類において、ＰＡＣＡＰ免疫システムの機能は非常に良く特徴分析されており、免疫応答調節物質としてヒトにおける使用を記述したいくつかの特許がある。現在まで、水生生物におけるＰＡＣＡＰ免疫システム機能を説明した先行する文献はない。
【００１０】
ＰＡＣＡＰ遺伝子は、いくつかの脊椎動物種及びｐｒｏｔｏｃｏｒｄａｄｅ（被嚢類）の１種からクローニングされている。魚類では、サーモン及びナマズの一部の種類から単離された（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ａｎｄ ｃｏｌ．（２０００） Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ａｄｅｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）／Ｇｌｕｃａｇｏｎ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２１（６）：６１９−６７０）、金魚（Ｌｅｕｎｇ ｙ ｃｏｌ．（１９９９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ｔｈｅ ｇｏｌｄｆｉｓｈ．Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇｒ．Ｍｏｌ．Ｃｏｍｐ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３３８−３８８）、ゼブラフィッシュ（Ｆｒａｄｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｒｗｏｏｄ（２０００）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂｏｔｈ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｏｍｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＲＦ）ａｎｄ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ．Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６５：２１１−２１９）、ｔｒｕｃｈａ（Ｋｒｕｅｃｋｌ ａｎｄ Ｓｈｅｒｗｏｏｄ．（２００１））及びマス（Ｋｒｕｅｃｋｌ ａｎｄ Ｓｈｅｒｗｏｏｄ．（２００１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＲＦ）ｇｅｎｅ ｉｎ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ．Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８２：９９−１０８）。特許ＵＳ ５６９５９５４は、サカナＧＨＲＨ−ＰＡＣＡＰポリペプチドをコードする遺伝子ヌクレオチド配列の単離及び精製並びにこれらの配列を発現するベクター及びホストを、当該遺伝子構築物を授精魚卵に導入する遺伝子導入によりサカナの成長を増加させるために使用する目的で保護している。また、それはこれらの配列を含んでいる遺伝子導入サカナを検出する方法も保護している。
【００１１】
この特許においては、特に、Ｏｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ Ｎｅｒｋａ， Ｃｌａｒｉａｓ ｍａｃｒｏｃｅｐａｌｕｓ及びＡｃｉｓｐｅｎｓｅｒ ｔｒａｎｓｍｏｎｔａｎｕｓの種のＧＨＲＨ−ＰＡＣＡＰポリペプチドをコードする遺伝子配列が報告されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明において、Ｃｌａｒｉａｓ ｇｅｒｉｅｐｉｎｕｓ及びＯｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓの種からわれわれの実験室において得、そしてＮ−末端修飾を施したＰＡＣＡＰアミノ酸配列の種々の変異体が使用された。これらの変異体は、水生生物において、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清の中に発現される浸漬浴（ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｂａｔｈ）での投与により、遺伝子導入によらない成長刺激物質として、それらを予め精製せずに使用された。予期せずに、われわれは、これらの変異体がこのような条件下にこれらの生物の免疫活性の有意な増加を促進できること及び血清中のプロラクチン濃度を上昇させることができることを発見した。このようなペプチドの性質は、水生生物について記述されたことがない。
【００１３】
一部の著者は、浸漬浴による組換え成長ホルモン投与による魚類における成長刺激作用を報告していた。それにもかかわらず、成長ホルモンの直接使用は多数の規制条件に従うが、同じことは成長ホルモン又は成長ホルモン遊離因子を発現する遺伝子導入魚の使用でも生じる。
【００１４】
本発明において、無脊椎動物を含めた水生生物の成長を増進し、そして免疫系を改善するために、非遺伝子導入の方法が記述される。
【００１５】
今日、水生生物は重要なタンパク質源であるが、自然環境における捕獲は充分に開発されている。このような理由から、生産を増やすために、これらの水生生物種の養殖が必要である（Ｐｕｌｌｉｎ ｙ ｃｏｌ．；Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ７，４３２ｐ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｌｉｖｉｎｇ Ａｑｕａｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｍａｎｉｌａ，Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ，１９８２，ＩＳＳＮ０１１５−４３８９）。
【００１６】
成長を刺激し、生物の生存率を増やし、幼生の品質を改善することにより、水産養殖の効率を増加させることが、水産養殖において解決すべき重要な問題として継続される。
【００１７】
発明の要約
本発明は上記問題に対する解答を与える。即ち本発明は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、１３及び１４として記載されるアミノ酸配列を持つ脳下垂体アデニル酸シクラーゼ−活性化ポリペプチドの変異体を提供する。これらは、浸漬浴により又は餌添加物として適用した場合に、短期間に無脊椎生物を含む水生生物の成長速度を増加させ（これは水産養殖にとって非常に重要である）、さらに、これらのペプチドは魚幼生及び商業的関心のある甲殻類の生存率を増加させる。これらは、これら生物における免疫活性並びに食欲、魚の色の発生及びプロラクチン遊離を刺激する。
【００１８】
本発明の好ましい態様において、０．１ μｇ／ｇ動物体重の濃度で３日間隔の周期的注射により、１００〜２００ μｇ／リットルの水のペプチド濃度で新鮮水又は海水中４日ごとの浸漬浴により、及び製剤化餌に５ ｍｇ／Ｋｇの濃度で加えられる餌添加物として、ＰＡＣＡＰ変異体を魚類又は甲殻類に適用する。有意な成長増加及び優れた免疫活性が得られる。
【００１９】
ＰＡＣＡＰ変異体の適用は、そのサイズが小さいので（５ ＫＤａ）、それが浸漬浴により適用された場合に、その生物の皮膚及び粘膜からの良好な吸収を可能にし、それによる投与は水産養殖に対する費用及び操作が有利であり、汚染の可能性が少なく、さらに、ＰＡＣＡＰ信号伝達機構は、ホルモンの活性化を経由しないアデニル酸シクラーゼ活性化で始まり、その成長ホルモンの遊離作用はヒトを含む哺乳類では弱いので、その使用が公衆により認容され、規制条件が少ない、などの利点が提供される。
【００２０】
他のＰＡＣＡＰの利点は、魚類における先天性及び適応性免疫活性を刺激する能力及び病原体感染に対する抵抗性を増加させる能力である。
【００２１】
本発明の具体的態様において、ＰＡＣＡＰ変異体は、テラピアＯｒｅｃｈｒｏｍｉｓ種、ナマズＣｌａｒｉａ種、サーモンＳａｌｍｏｎ種及びエビＰｅｎａｕｓ種のような水生生物に与えられる。
【００２２】
本発明の他の好ましい態様において、ＰＡＣＡＰ変異体は病原体による感染を予防又は治療するために魚類又は甲殻類に与えられる。
【００２３】
本発明の具体的態様は、養殖の魚類又は甲殻類を処理してその成長を刺激し、疾患に対するその抵抗性を増加すると共に病原体による感染の予防的及び治療的処理のための組成物調製品を記述し、それらは総て生産性を改善する目的を有する。
【実施例】
【００２４】
個別の態様の詳細な説明／実施例
実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉの細胞内発現及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの培養上清中の細胞外生産のためのＰＡＣＡＰのコード配列を含む発現ベクターの構築。
Ｔベクター中に予めクローニングした鋳型としてＧＨＲＨ−ＰＡＣＡＰ ｃＤＮＡを使用しポリメラーゼ連鎖反応により、Ｃｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓＰＡＣＡＰ遺伝子を単離した。われわれは、シグナルペプチド配列を含めたＧＨＲＦ−ＰＡＣＡＰ完全配列を得るために配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に対応する特定のオリゴヌクレオチドを使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターでクローニングするために必要な制限部位を持つＰＡＣＡＰ遺伝子のみを増幅するために特異的オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４を使用した。
【００２５】
特定のオリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４を使用して、上記のようにテラピアＰＡＣＡＰ遺伝子を単離した。本発明は、テラピアのこの遺伝子単離の最初の報告となる。
【００２６】
制限部位ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（図１Ａ）を使用して、ＰＡＣＡＰコード化配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＡＲ ３０４０でクローニングした。われわれは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｄ３細菌を形質転換するために組換えプラスミドに対して一つを選択し、そしてＴ７プロモーターの調節の下にＰＡＣＡＰ発現を誘導するために、誘導物質として０．５ ｍＭ ＩＰＴＧを使用した。
【００２７】
遺伝子発現は、２８℃、５時間で行った。組換えＰＡＣＡＰの発現及びその完全性はマススペクトルにより確認した。
【００２８】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＰＡＣＡＰを発現するために、われわれはイースト発現ベクターｐＰＳ９及びｐＰＳ１０を使用した。われわれは、ｐＰＳ９遺伝子クローニングのために特異的オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６を使用し、ｐＰＳ１０クローニングのためにオリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６を使用した。われわれは、ｐＰＳ７をクローニングするために、制限部位ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩを使用し、このクローニング方法は目的のタンパク質のＮ−末端にｍｅｔｅｏｎｙｎｅ及びグリシンを付加した。ｐＰＳ１０をクローニングするために、われわれは制限部位ＮａｅＩ及びＳｐｅＩを使用したが、このクローニング方法は目的のタンパク質にアミノ酸を付加しない（図１Ｂ）。
【００２９】
形質転換に先だって、プラスミドを酵素ＳｐｈＩにより直線化した。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＭＰ３６株を、組換え発現ベクターを使用して電気ポレーションにより形質転換した。この株は栄養要求性変異株ｈｉｓ３であり、形質転換後Ｈｉｓ＋表現型を獲得した。
【００３０】
ドットブロットにより確認された形質転換体は、サザンブロットによっても分析され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの遺伝子ＡＯＸ１の組換えプラスミドの発現カセットへの置換による統合が生じたことを確認した。この統合事象はＭｕｔＳ（低レベルのメタノール利用）及びＨｉｓ＋表現型を生じた。ＡＯＸ１の遺伝子置換は、ベクターとゲノムのプロモーター領域のＡＯＸ１及び３’ＡＯＸ１の間の組換えにより生じる。Ｍｕｔ３表現型を持つ組換え株はＡＯＸ２遺伝子におけるアルコール酸化酵素生産を支持し、メタノール中における低い成長を示した。
【００３１】
目的のポリペプチド及びテラピア成長ホルモンをコードする遺伝子は、ＡＯＸ１プロモーターの調節下にあり、メタノールにより誘発され、シグナルペプチドを持っている。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは低レベルの自己タンパク質を分泌し、その培地は添加物としてタンパク質を必要としない。したがって、分泌された異種タンパク質は培地中の総タンパク質中の高いパーセンテージを占めることが予測できる（８０％を超える）（Ｔｓｃｈｏｐｐ ｙ ｃｏｌ．；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｔｙ １９８７，５：１３０５−１３０８； Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．； Ｐｈａｒｍ．Ｅｎｇ．１９９２，１２：４８−５１）。本発明において説明された組換えタンパク質の生産は、培地にメタノールを添加した５Ｌのバイオリアクター中で行われた。
【００３２】
実施例２．幼いＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓにおける成長刺激実験、肝臓重量／体重比及び魚筋肉乾燥重量の測定。
ほぼ同年齢で平均体重３０から４０グラムのＣｌａｒｉａｓ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ種のナマズ１８匹を性別に関係なく使用した。二つの実験群を構成し、各群９匹ずつとした。各群を安定した水の循環を行っている、温度２８℃及び１４時間明期及び１０時間暗期の照明サイクルの別のタンクにおいて馴化した。動物には、各タンク中の合計体重の５％に相当する量を１日２回給餌した。動物は実験前に確認された。１群は、半精製ＰＡＣＡＰ（７０％純度）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３で処理され、一方、他の１群はＰＢＳ １Ｘ中に含まれるＥ．ｃｏｌｉタンパク質（目的ペプチドと同じ精製方法により得られたＥ．ｃｏｌｉタンパク質、精製ＰＡＣＡＰ検体中に存在する混入物に相当する量を含む）により処理され、対照群として使用した。ＰＡＣＡＰ処理魚は動物の体重グラム当たり０．１ μｇのペプチドの用量で腹腔内に週２回注射された。対照群は上記と同様に注射された。実験開始２２日後に、腹腔内にＰＡＣＡＰを注射された動物は、陰性対照に比較して体重の有意な増加を示した（ｐ＜０．０５）（図２）。
【００３３】
体重増加が臓器サイズの増加又は筋肉の水含量の増加によるものではなく、体重の増加によるものであることを示すために、肝臓重量／体重比及び筋肉乾燥重量を測定した。
【００３４】
実験群の肝臓重量／体重比及び筋肉乾燥重量の間に有意差は観察されなかった（図３）。
【００３５】
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２の組換えＰＡＣＡＰを適用した場合に類似の結果が得られた。
【００３６】
実施例３．組換えＰＡＣＡＰを含有するＥ．ｃｏｌｉ破裂上清を使用した浸漬浴によるテラピア幼生における成長刺激、病原体に対する抵抗性及びプロラクチン遊離に関する実験。
われわれは、Ｅ．ｃｏｌｉの破裂上清中に存在するＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓの組換えＰＡＣＡＰのテラピア幼生における機能を評価するための実験を行った。
【００３７】
二つの実験群はそれぞれ６０匹で構成された。一つの群はＰＡＣＡＰ神経ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）で処理し、他の群は対照群として使用した。幼生の群は安定した水の循環を行っている、温度２８℃及び１４時間明期及び１０時間暗期の照明サイクルの個別のタンクにおいて馴化し、そして動物は次の式から得られる量で飼育された：餌の量＝動物数×平均体重（ｇ）×４０％／１００。処理は、２Ｌの水の浸漬浴であり、週３回６０分間の２０日間であり、用量はターゲットタンパク質２００ μｇ／リットル水であった。
【００３８】
結果として、実験１０日目に、ＰＡＣＡＰ処理群は、対照群に比較して有意な体重及び体長の増加を示し（ｐ＜０．０１）、実験開始１５日目に、実験群の間の差は高度に有意となった（Ｐ＜０．００１）（表１及び図４Ａ及び４Ｂ）。浸漬浴開始の２０日後には、ＰＡＣＡＰ処理群と対照群の間の差は統計的に有意であった（ｐ＜０．００１）（図５）。
【００３９】
【表１】
体重と体長は平均±ＳＤ．として示す
【００４０】
最後の浸漬浴の３０日後に実験群動物の体重及び体長の差は著しく有意であったので（ｐ＜０．０１）、成長に対するＰＡＣＡＰの作用は持続することが観察された（図６）。さらに、ＰＡＣＡＰ処理した魚は陰性対照に比較して早い発育段階において皮膚の着色を示すことが観察された（図７）。
【００４１】
この実験において、われわれは皮膚原虫、Ｔｒｉｃｈｏｄｉｎａ種の存在を試験した。１０匹の動物を各実験群から無作為に選択し、この病原体の侵入強度を次の式にしたがって測定した：
（Ｉ：魚寄生虫の合計数）Ｉ＝ΣＮ／ｎーＦ０及びＥ＝ｎ−Ｆ０Ｘ１００／ｎ
Ｉ：（平均侵入強度） Ｅ：（全体の中で寄生虫のいる魚の数）
ΣＮ（発見された寄生虫の総数） Ｆ０：（寄生虫のいない魚の数）
ｎ：（分析した魚の数）
【００４２】
ＰＡＣＡＰ処理魚の原虫Ｔｒｉｃｈｏｄｉｎａ種による侵入強度（平均Ｉ＝２．２０）は対照群（平均Ｉ＝５．５６）に比較して有意に少ないこと（Ｐ＜０．０１）を示した。
【００４３】
魚は前記と同じ条件において実験開始から４５日間浸漬浴により処理され、処理２４時間後に群当たり１０匹の動物から血液を採取し、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡにより血清のプロラクチンを測定した。このアッセイにポリクロナール抗テラピアプロラクチン抗体を使用した。われわれは、対照群と比較してＰＡＣＡＰ処理群の間に統計的に有意差を観察した（ｐ＜０．０１）（表２）。これらは、サーモンの場合に新鮮水と海水を回遊し、そこでプロラクチンが浸透圧調節に重要な機能を果たしているので、商業的水生生物において非常に魅力的な結果である。
【００４４】
【表２】
濃度は平均±ＳＤとして示されている。
＊有意差Ｐ＜０．０１を示す。
【００４５】
実施例４．幼いテラピアＯｒｅｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓの食欲に対する組換えＰＡＣＡＰの作用を評価するための実験。
これまで、魚における食欲に対するＰＡＣＡＰの生物作用は試験されていなかった。哺乳類以下の脊椎動物において、食欲に対するこのペプチドの作用は殆ど分析されていない（Ｊｅｎｓｅｎ，２００１，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ ｉｎ ｎｏｎ−ｍａｍｍａｌｉａｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ Ｐｈｉｓｉｏｌ．Ｐａｒｔ Ａ１２８：４７１−４７９）。
【００４６】
魚の食欲に対するＰＡＣＡＰの作用を分析するために、われわれはＯｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ種のテラピアを使用した。３つの実験群を構成し、各群３匹とし、３回反復した。動物群は、安定した水の循環を行っている、温度２８℃及び１４時間明期及び１０時間暗期の照明サイクルの別々のタンクにおいて馴化した。
【００４７】
一群は、０．５ μｇ／ｇ動物体重の腹腔内注射により半精製ＰＡＣＡＰ（８７％純度）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３で処理した。第２群はＧＨＲＰ−６（Ｌｉｐｏｔｅｃ，Ｓ．Ａ．スペイン）で０．１ μｇ／ｇ動物体重の用量のペプチドにより同じ投与経路で処理した。対照群はＰＢＳ １Ｘ中に含有されるＥ．ｃｏｌｉタンパク質で処理した（Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質は関心のペプチドと同じ精製方法により得た、精製ＰＡＣＡＰ検体中に存在する混入物と同量含む）。
【００４８】
処理後、同量の餌を３つの実験群に与え、６時間後に摂食されなかった餌を回収し、再度餌を与えた。実験開始２２時間後に食欲を再度測定した。
【００４９】
それぞれのタンクの摂食されなかった餌を乾燥機で乾燥し（１００℃、２４時間）そして分析用秤で測定した。摂食された餌は、タンクに加えた餌の量（１０グラム、水分２０％）と魚に摂食されなかった餌の量の差から計算した。
【００５０】
ＰＡＣＡＰ及びＧＨＲＰ−６で処理したテラピアは、対照群に比較して有意な食欲増加を示した（ｐ＜０．０５）（図８）。
【００５１】
実施例５．ナマズＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓの免疫系に対する組換えＰＡＣＡＰの評価。
幼いＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓを使用した。各群１０匹ずつの２群に分けた。動物群は、安定した水の循環を行っている、温度２８℃及び１４時間明期及び１０時間暗期の照明サイクルの別々のタンクにおいて馴化した。動物には、各タンク中の合計体重の５％の比率で１日２回給餌した。実験前に動物を確認した。ＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）で処理した魚は、週２回、０．１ μｇ／ｇ動物体重の用量で腹腔内に注射を受けた。
【００５２】
実験開始２０日後に、血清中のリゾチーム及びレシチンを測定するために魚から血液を採取した。血清中のリゾチーム活性は細菌Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓを溶菌するリゾチームの能力にもとづく方法を使用して測定した。９６−ウエルのマイクロトレイ中、リン酸緩衝液（０．０５ Ｍ、ｐＨ６．２）の中で２倍系列希釈した検体１００ μＬを、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓの３ ｍｇ／ｍｌ懸濁（Ｓｉｇｍａ）の１００ μＬと混合した。このマイクロトレイを２２℃でインキュベートし、０、２、３、５、１０、１５、２５、３５及び４５分に４５０ ｎｍのＯＤを記録した。陽性対照として、サカナ血清をニワトリ卵白リゾチームに置換し（系列希釈は８ μｇ／ｍｌから開始）、陰性対照として、サカナ血清を緩衝液に置換した。リゾチーム活性の単位は、０．００１ Ｍｉｎ−１のＯＤ値の減少を生じる幼生ホモジネートの量として定義した。われわれは、対照群とＰＡＣＡＰ群の間に統計的有意差を観察した（ｐ＜０．０１）（表３）。
【００５３】
【表３】
濃度を平均±ＳＤとして示す。
＊有意差Ｐ＜０．０１を示す。
【００５４】
血清中に存在するレシチンを測定するために、われわれは赤血球凝集アッセイを行った。ＰＢＳ ｐＨ７．２による血清の２倍系列希釈をＵ型底のマイクロタイターウエル（９６ウエル、Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｍｉｃｒｏｌｏｎ）中で行い、この中に同じ容量の新しく調製した２％赤血球懸濁（ウサギ、ＰＢＳ）を加えた。このウエルを室温で１時間インキュベートし、力価は、肉眼で観察し、凝集を示す最後の希釈と等しいとした（ウエルの底全体に均一な細胞の分布層が示される）。検体の赤血球凝集活性を検査し、それぞれの力価を得た。活性は力価、すなわち完全凝集を示す最高希釈の逆数として示した。
【００５５】
ＰＡＣＡＰ処理サカナは対照群に比較して、血清中のレシチンレベルの有意な増加を示した（ｐ＜０．０５）（表４）。
【００５６】
【表４】
Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。＊有意差Ｐ＜０．０５を示す
【００５７】
実施例６．組み換えＰＡＣＡＰを含有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に浸漬することによるテラピア幼生における成長刺激の実験。
テラピア幼生の成長におけるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に含まれるＣｌａｒｉａｓ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ ＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）の機能を評価するためにわれわれは実験を行った。
【００５８】
各群５０匹の幼生からなる３つの実験群を構成した。一つの群はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に含まれる組換えＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）で処理した。第２群は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に含まれる組換えテラピア成長ホルモン（ＧＨ）で処理された。対照群は形質転換されていないＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で処理した。幼生は１日２回次の式から得られる量の餌を与えられた：餌の量＝動物数×平均体重（ｇ）×４０％／１００。処理は、週に３回９０分間、３０ Ｌ容積の中に浸漬することにより行った。容量は、標的タンパク質１００ μｇ／Ｌ水）
【００５９】
実験開始の５週間（３５日）後、ＰＡＣＡＰ処理群は、対照群に比較して有意な体重増加（ｐ＜０．０１）を示す結果を、われわれは得た。成長ホルモン処理群は、対照群に比較して有意な体重増加を示した（ｐ＜０．０５）（表５）。
【００６０】
【表５】
体重は平均±ＳＤとして示す。
【００６１】
実施例７．組換えＰＡＣＡＰを含有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で処理したエビＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｓｃｈｍｉｔｔｉにおける成長刺激及び幼生品質の改善の実験。
われわれは、Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｓｃｈｍｉｔｔｉ種のエビ幼生を使用した。二つの実験群は、各群１００匹の幼生で構成した。１群は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に含まれる組換えＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）で処理し、対照群として使用した他の群は、形質転換していないＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で処理した。
【００６２】
幼生は１００ Ｌの容積のファイバーグラス製タンクの中で養殖された。給餌は、ｄｙａｔｏｍｅａｓ（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ），ｔｈｅ ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｄ ａｌｇａｅ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｕｅｃｉｃａ）及びＡｒｔｅｍｉａ ｎａｕｐｌｉｕｓ（Ａｑｕａｔｉｃ Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）に基づいて行った。
【００６３】
非生物成長要因は以下の通り：
・照明（２４：００ Ｌ／Ｄ）
・安定通気
・塩分、３４ ｐｐｍ
・溶存酸素 ５．２±０．５（幼生循環において）
・再循環変動 ＰＺＩＩＩ ８０％
【００６４】
実験群に、３日に１度１時間の浸漬浴を４回適用した。
【００６５】
ＰＡＣＡＰ処理群は対照群に比較して有意な体重増加を示す結果をわれわれは得た（ｐ＜０．０１）（表６）。
【表６】
体重は平均±ＳＤとして示す。
【００６６】
われわれは、ＰＡＣＡＰ処理群においてエビの養殖に重要である高い均一性及び幼生の優れた品質（鰓器官の多い分枝及び口吻の修飾）を観察した。ＰＬ９ステージにおける生存率の相違は、ＰＡＣＡＰ処理群において４０％多かった。
【００６７】
実施例８．組換えＰＡＣＡＰ含有サカナ餌製品による若いＣｌａｒｉａｓ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓにおける成長刺激。
組換えＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）を含有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清を濃縮し、サカナ養殖餌に添加して約５ ｍｇ／Ｋｇ餌の濃度にした。
【００６８】
それぞれ平均体重０．１ｇの幼生１００匹の２実験群を構成した。１群は組換えＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）を含有するＰｉｃｈｉ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で処理し、対照として使用したほかの１群は非形質転換Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で処理した。実験を３０日間行った。
【００６９】
５ ｍｇ／Ｋｇ餌の用量で餌に含まれた組換えＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）は対照に比較して３０％成長を増加し、高度の統計的有意差があった（ｐ＜０．０１）。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】細菌発現ベクター（図１Ａ）及びイースト発現ベクター（図１Ｂ）におけるＰＡＣＡＰクローニング方法。
【図２】アフィニティークロマトグラフィーにより精製した組換えＰＡＣＡＰの腹腔内注射による、０．１ μｇ／ｇ動物体重の用量における幼いＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓにおける成長刺激実験。グラフは、対照群と比較したＰＡＣＡＰ処理群の平均体重を示す。
【図３】アフィニティークロマトグラフィーにより精製した組換えＰＡＣＡＰの腹腔内注射による、０．１ μｇ／ｇ動物体重の用量における幼いＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓにおける成長刺激実験。グラフは、対照群と比較したＰＡＣＡＰ処理群の肝臓重量／体重比の平均を示す。
【図４】１００ μｇ／リットル水の用量における組換えＰＡＣＡＰを含有するＥ．ｃｏｌｉ破裂上清中への浸漬によるテラピア幼生の成長刺激実験。グラフ４Ａ及び４Ｂは、陰性対照と比較した処理群の平均体重及び体長を示す。
【図５】１００ μｇ／リットル水の用量における組換えＰＡＣＡＰを含有するＥ．ｃｏｌｉ破裂上清中への浸漬によるテラピア幼生の成長刺激実験。グラフは、処理開始２２日後における、陰性対照と比較した処理群の平均体重を示す。
【図６】１００ μｇ／リットル水の用量における組換えＰＡＣＡＰを含有するＥ．ｃｏｌｉ破裂上清中への浸漬によるテラピア幼生の成長刺激実験。図は、最終浸漬浴の３０日後におけるＰＡＣＡＰ処理サカナ（Ａ及びＣ）と対照群（Ｂ）の体長の差を示す。
【図７】１００ μｇ／リットル水の用量における組換えＰＡＣＡＰを含有するＥ．ｃｏｌｉ破裂上清中への浸漬によるテラピア幼生の成長刺激実験。図は、対照群（Ｃ）に比較してＰＡＣＡＰ処理サカナ（Ａ及びＢ）の色の早期発生を示す。
【図８】アフィニティークロマトグラフィーで精製した組換えＰＡＣＡＰの、０．５ μｇ／ｇ動物体重の用量におけるテラピアＯｒｅｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓの食欲に対する評価。図は、処理開始６時間と２２時間にサカナによって摂取された平均食物量を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に水生生物の養殖に脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドを使用する、養殖バイオテクノロジーの分野に関係する。浸漬、注射又は餌添加によりこのペプチドを水生生物に適用することにより、これらの生物の食欲の増進、成長速度及び生存率の増加、優れた免疫活性及びプロラクチン放出の増加を生じる。
【背景技術】
【０００２】
脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、１９８９年に初めてウシの視床下部から単離され、成長ホルモン分泌を刺激するその能力はアデニル酸シクラーゼ酵素の活性化によることが示された（Ｍｉｙａｔａ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９８９）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ３８ ｒｅｓｉｄｕｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｗｈｉｃｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ｉｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４：５６７−５７４）。ＰＡＣＡＰは、セクレチン、グルカゴン及び腸管血管作動性ペプチドを含むペプチドファミリーに属している（Ａｒｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｓｈｉｏｄａ（１９９５）Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓａ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ａｎｄ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６：５３−８８）。哺乳類において、ＰＡＣＡＰ及び成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）の前駆体は二つの異なる遺伝子によりコード化されている（Ｈｏｓｏｙａ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９９２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ｇｅｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１２９：１９９−２０６）。今日までに試験された哺乳類以下の動物種（鳥類、爬虫類及び魚類）において、ＧＨＲＨ及びＰＡＣＡＰペプチドは同じ遺伝子によりコード化されており、同じ前駆体中に含まれている（Ｍｏｎｔｅｒｏ ａｎｄ ｃｏｌ．（２０００） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ／ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１５７−１６８）。ＰＡＣＡＰ遺伝子は基本的に、中枢及び末梢神経系、眼に刺激を与える神経線維、気管、唾液腺、胃腸管、生殖系器官、膵臓及び尿管に発現する。また、それは副腎、生殖腺及び免疫細胞において合成される（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ａｎｄ ｃｏｌ．（２０００）Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ａｄｅｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）／Ｇｌｕｃａｇｏｎ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｅｎｄｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ ２１：６１９−６７０）。ＰＡＣＡＰは、種々の組織における多様な分布及び下垂体刺激性、神経伝達、神経調節及び血管調節作用に一致する種々の生物学的機能を示す（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９９７） Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｕｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ５９−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１２１２２−１２１３１）。
【０００３】
それは細胞分裂、分化及び死の調節に関係している（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ａｎｄ ｃｏｌ．（２０００） Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ａｄｅｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）／Ｇｌｕｃａｇｏｎ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｅｎｄｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ ２１：６１９−６７０）。
【０００４】
ＰＡＣＡＰは成長ホルモン（ＧＨ）の遊離を刺激する。ＧＨ遊離におけるこのペプチドの作用は、インビトロにおいて、哺乳類、鳥類、両生類の数種において実施されている（Ｈｕ ａｎｄ ｃｏｌ（２０００） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｏｇ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ｂｒａｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １４１：６５７−６６５）及び魚類（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｌ．Ｌ．ａｎｄ ｃｏｌ．（２００４） Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｍｅｄ．２２９：２９１−３０２）。ＧＨの分泌及び遊離におけるＰＡＣＡＰの作用に関するインビボの試験はあまりない。今日まで、インビボにおいてこのペプチドはラット血漿中のＧＨのレベルを増加させることが知られている（Ｊａｒｒ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９９２） Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｍａｌｅ ｒａｔｓ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５１：８２３−８３０）及びウシ血漿中（Ｒａｄｃｌｉｆｆ ａｎｄ ｃｏｌ．（２００１） Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ．Ｄｏｍｅｓｔｉｃ．Ａｎｉａｍａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２１：１８７−１９６）。一方、雌ヒツジ（Ｓａｗａｎｇｊａｒｏｅｎ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｗｉｓ（１９９４） Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ａｎｄ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）ｏｎ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ，ｌｕｔｅｉｎａｉｚｉｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｗｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６：５４９−５５５）及びヒト（Ｃｈｉｏｄｅｒａ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９９６） Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｒｖｅｎｏｕｓｌｙ ｉｎｆｕｓｅｄ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｎ ａｄｅｎｏｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎｎｏｍａｌ ｍｅｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６４：２４２−２４６）では、この作用は生じない。
【０００５】
これらの試験結果は、哺乳類において、ＧＨ分泌に対するこのペプチドの作用は動物種によって異なることを示唆している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ ｃｏｌ．（２００４） Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｍｅｄ．２２９：２９１−３０２）。
【０００６】
今まで、魚類において、ＧＨ調節におけるＰＡＣＡＰ機能を示すインビボ試験はなく、さらに、水生生物における食欲刺激にこのペプチドを使用した先行試験は存在しない。甲殻類において、これまで、このペプチドが存在するというエビデンスはなく、これらの生物における成長を調節するシグナルのカスケードは知られていない。
【０００７】
ＰＡＣＡＰは哺乳類において脳下垂体細胞によるプロラクチン遊離を刺激する（Ｏｒｔｍａｎｎ ａｎｄ ｃｏｌ．（１９９９） Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｓｔｅｒｏｉｄｓ ｗｉｔｈ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ＧｎＲＨ ｉｎ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４０：２０７−２１４）。これは、脳下垂体のメラノトロピン細胞によるメラノトロピン（α−メラニン細胞刺激ホルモン、ＭＳＨ）の遊離を促進する（Ｖａｕｄｒｙ ａｎｄ ｃｏｌ．（２０００） Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．ｓ ５２：２６９−３６４）。
【０００８】
魚類において、プロラクチン遊離におけるこのペプチドの作用を示すインビボ試験はない。また、サカナの色の発生におけるその作用に関する試験結果はない。
【０００９】
哺乳類において、ＰＡＣＡＰ免疫システムの機能は非常に良く特徴分析されており、免疫応答調節物質としてヒトにおける使用を記述したいくつかの特許がある。現在まで、水生生物におけるＰＡＣＡＰ免疫システム機能を説明した先行する文献はない。
【００１０】
ＰＡＣＡＰ遺伝子は、いくつかの脊椎動物種及びｐｒｏｔｏｃｏｒｄａｄｅ（被嚢類）の１種からクローニングされている。魚類では、サーモン及びナマズの一部の種類から単離された（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ａｎｄ ｃｏｌ．（２０００） Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ａｄｅｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）／Ｇｌｕｃａｇｏｎ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２１（６）：６１９−６７０）、金魚（Ｌｅｕｎｇ ｙ ｃｏｌ．（１９９９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ｔｈｅ ｇｏｌｄｆｉｓｈ．Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇｒ．Ｍｏｌ．Ｃｏｍｐ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３３８−３８８）、ゼブラフィッシュ（Ｆｒａｄｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｒｗｏｏｄ（２０００）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂｏｔｈ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｏｍｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＲＦ）ａｎｄ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ．Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６５：２１１−２１９）、ｔｒｕｃｈａ（Ｋｒｕｅｃｋｌ ａｎｄ Ｓｈｅｒｗｏｏｄ．（２００１））及びマス（Ｋｒｕｅｃｋｌ ａｎｄ Ｓｈｅｒｗｏｏｄ．（２００１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＲＦ）ｇｅｎｅ ｉｎ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ．Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８２：９９−１０８）。特許ＵＳ ５６９５９５４は、サカナＧＨＲＨ−ＰＡＣＡＰポリペプチドをコードする遺伝子ヌクレオチド配列の単離及び精製並びにこれらの配列を発現するベクター及びホストを、当該遺伝子構築物を授精魚卵に導入する遺伝子導入によりサカナの成長を増加させるために使用する目的で保護している。また、それはこれらの配列を含んでいる遺伝子導入サカナを検出する方法も保護している。
【００１１】
この特許においては、特に、Ｏｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ Ｎｅｒｋａ， Ｃｌａｒｉａｓ ｍａｃｒｏｃｅｐａｌｕｓ及びＡｃｉｓｐｅｎｓｅｒ ｔｒａｎｓｍｏｎｔａｎｕｓの種のＧＨＲＨ−ＰＡＣＡＰポリペプチドをコードする遺伝子配列が報告されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明において、Ｃｌａｒｉａｓ ｇｅｒｉｅｐｉｎｕｓ及びＯｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓの種からわれわれの実験室において得、そしてＮ−末端修飾を施したＰＡＣＡＰアミノ酸配列の種々の変異体が使用された。これらの変異体は、水生生物において、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清の中に発現される浸漬浴（ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｂａｔｈ）での投与により、遺伝子導入によらない成長刺激物質として、それらを予め精製せずに使用された。予期せずに、われわれは、これらの変異体がこのような条件下にこれらの生物の免疫活性の有意な増加を促進できること及び血清中のプロラクチン濃度を上昇させることができることを発見した。このようなペプチドの性質は、水生生物について記述されたことがない。
【００１３】
一部の著者は、浸漬浴による組換え成長ホルモン投与による魚類における成長刺激作用を報告していた。それにもかかわらず、成長ホルモンの直接使用は多数の規制条件に従うが、同じことは成長ホルモン又は成長ホルモン遊離因子を発現する遺伝子導入魚の使用でも生じる。
【００１４】
本発明において、無脊椎動物を含めた水生生物の成長を増進し、そして免疫系を改善するために、非遺伝子導入の方法が記述される。
【００１５】
今日、水生生物は重要なタンパク質源であるが、自然環境における捕獲は充分に開発されている。このような理由から、生産を増やすために、これらの水生生物種の養殖が必要である（Ｐｕｌｌｉｎ ｙ ｃｏｌ．；Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ７，４３２ｐ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｌｉｖｉｎｇ Ａｑｕａｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｍａｎｉｌａ，Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ，１９８２，ＩＳＳＮ０１１５−４３８９）。
【００１６】
成長を刺激し、生物の生存率を増やし、幼生の品質を改善することにより、水産養殖の効率を増加させることが、水産養殖において解決すべき重要な問題として継続される。
【００１７】
発明の要約
本発明は上記問題に対する解答を与える。即ち本発明は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、１３及び１４として記載されるアミノ酸配列を持つ脳下垂体アデニル酸シクラーゼ−活性化ポリペプチドの変異体を提供する。これらは、浸漬浴により又は餌添加物として適用した場合に、短期間に無脊椎生物を含む水生生物の成長速度を増加させ（これは水産養殖にとって非常に重要である）、さらに、これらのペプチドは魚幼生及び商業的関心のある甲殻類の生存率を増加させる。これらは、これら生物における免疫活性並びに食欲、魚の色の発生及びプロラクチン遊離を刺激する。
【００１８】
本発明の好ましい態様において、０．１ μｇ／ｇ動物体重の濃度で３日間隔の周期的注射により、１００〜２００ μｇ／リットルの水のペプチド濃度で新鮮水又は海水中４日ごとの浸漬浴により、及び製剤化餌に５ ｍｇ／Ｋｇの濃度で加えられる餌添加物として、ＰＡＣＡＰ変異体を魚類又は甲殻類に適用する。有意な成長増加及び優れた免疫活性が得られる。
【００１９】
ＰＡＣＡＰ変異体の適用は、そのサイズが小さいので（５ ＫＤａ）、それが浸漬浴により適用された場合に、その生物の皮膚及び粘膜からの良好な吸収を可能にし、それによる投与は水産養殖に対する費用及び操作が有利であり、汚染の可能性が少なく、さらに、ＰＡＣＡＰ信号伝達機構は、ホルモンの活性化を経由しないアデニル酸シクラーゼ活性化で始まり、その成長ホルモンの遊離作用はヒトを含む哺乳類では弱いので、その使用が公衆により認容され、規制条件が少ない、などの利点が提供される。
【００２０】
他のＰＡＣＡＰの利点は、魚類における先天性及び適応性免疫活性を刺激する能力及び病原体感染に対する抵抗性を増加させる能力である。
【００２１】
本発明の具体的態様において、ＰＡＣＡＰ変異体は、テラピアＯｒｅｃｈｒｏｍｉｓ種、ナマズＣｌａｒｉａ種、サーモンＳａｌｍｏｎ種及びエビＰｅｎａｕｓ種のような水生生物に与えられる。
【００２２】
本発明の他の好ましい態様において、ＰＡＣＡＰ変異体は病原体による感染を予防又は治療するために魚類又は甲殻類に与えられる。
【００２３】
本発明の具体的態様は、養殖の魚類又は甲殻類を処理してその成長を刺激し、疾患に対するその抵抗性を増加すると共に病原体による感染の予防的及び治療的処理のための組成物調製品を記述し、それらは総て生産性を改善する目的を有する。
【実施例】
【００２４】
個別の態様の詳細な説明／実施例
実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉの細胞内発現及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの培養上清中の細胞外生産のためのＰＡＣＡＰのコード配列を含む発現ベクターの構築。
Ｔベクター中に予めクローニングした鋳型としてＧＨＲＨ−ＰＡＣＡＰ ｃＤＮＡを使用しポリメラーゼ連鎖反応により、Ｃｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓＰＡＣＡＰ遺伝子を単離した。われわれは、シグナルペプチド配列を含めたＧＨＲＦ−ＰＡＣＡＰ完全配列を得るために配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に対応する特定のオリゴヌクレオチドを使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターでクローニングするために必要な制限部位を持つＰＡＣＡＰ遺伝子のみを増幅するために特異的オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４を使用した。
【００２５】
特定のオリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４を使用して、上記のようにテラピアＰＡＣＡＰ遺伝子を単離した。本発明は、テラピアのこの遺伝子単離の最初の報告となる。
【００２６】
制限部位ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（図１Ａ）を使用して、ＰＡＣＡＰコード化配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＡＲ ３０４０でクローニングした。われわれは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｄ３細菌を形質転換するために組換えプラスミドに対して一つを選択し、そしてＴ７プロモーターの調節の下にＰＡＣＡＰ発現を誘導するために、誘導物質として０．５ ｍＭ ＩＰＴＧを使用した。
【００２７】
遺伝子発現は、２８℃、５時間で行った。組換えＰＡＣＡＰの発現及びその完全性はマススペクトルにより確認した。
【００２８】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＰＡＣＡＰを発現するために、われわれはイースト発現ベクターｐＰＳ９及びｐＰＳ１０を使用した。われわれは、ｐＰＳ９遺伝子クローニングのために特異的オリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６を使用し、ｐＰＳ１０クローニングのためにオリゴヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６を使用した。われわれは、ｐＰＳ７をクローニングするために、制限部位ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩを使用し、このクローニング方法は目的のタンパク質のＮ−末端にｍｅｔｅｏｎｙｎｅ及びグリシンを付加した。ｐＰＳ１０をクローニングするために、われわれは制限部位ＮａｅＩ及びＳｐｅＩを使用したが、このクローニング方法は目的のタンパク質にアミノ酸を付加しない（図１Ｂ）。
【００２９】
形質転換に先だって、プラスミドを酵素ＳｐｈＩにより直線化した。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＭＰ３６株を、組換え発現ベクターを使用して電気ポレーションにより形質転換した。この株は栄養要求性変異株ｈｉｓ３であり、形質転換後Ｈｉｓ＋表現型を獲得した。
【００３０】
ドットブロットにより確認された形質転換体は、サザンブロットによっても分析され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの遺伝子ＡＯＸ１の組換えプラスミドの発現カセットへの置換による統合が生じたことを確認した。この統合事象はＭｕｔＳ（低レベルのメタノール利用）及びＨｉｓ＋表現型を生じた。ＡＯＸ１の遺伝子置換は、ベクターとゲノムのプロモーター領域のＡＯＸ１及び３’ＡＯＸ１の間の組換えにより生じる。Ｍｕｔ３表現型を持つ組換え株はＡＯＸ２遺伝子におけるアルコール酸化酵素生産を支持し、メタノール中における低い成長を示した。
【００３１】
目的のポリペプチド及びテラピア成長ホルモンをコードする遺伝子は、ＡＯＸ１プロモーターの調節下にあり、メタノールにより誘発され、シグナルペプチドを持っている。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは低レベルの自己タンパク質を分泌し、その培地は添加物としてタンパク質を必要としない。したがって、分泌された異種タンパク質は培地中の総タンパク質中の高いパーセンテージを占めることが予測できる（８０％を超える）（Ｔｓｃｈｏｐｐ ｙ ｃｏｌ．；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｔｙ １９８７，５：１３０５−１３０８； Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．； Ｐｈａｒｍ．Ｅｎｇ．１９９２，１２：４８−５１）。本発明において説明された組換えタンパク質の生産は、培地にメタノールを添加した５Ｌのバイオリアクター中で行われた。
【００３２】
実施例２．幼いＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓにおける成長刺激実験、肝臓重量／体重比及び魚筋肉乾燥重量の測定。
ほぼ同年齢で平均体重３０から４０グラムのＣｌａｒｉａｓ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ種のナマズ１８匹を性別に関係なく使用した。二つの実験群を構成し、各群９匹ずつとした。各群を安定した水の循環を行っている、温度２８℃及び１４時間明期及び１０時間暗期の照明サイクルの別のタンクにおいて馴化した。動物には、各タンク中の合計体重の５％に相当する量を１日２回給餌した。動物は実験前に確認された。１群は、半精製ＰＡＣＡＰ（７０％純度）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３で処理され、一方、他の１群はＰＢＳ １Ｘ中に含まれるＥ．ｃｏｌｉタンパク質（目的ペプチドと同じ精製方法により得られたＥ．ｃｏｌｉタンパク質、精製ＰＡＣＡＰ検体中に存在する混入物に相当する量を含む）により処理され、対照群として使用した。ＰＡＣＡＰ処理魚は動物の体重グラム当たり０．１ μｇのペプチドの用量で腹腔内に週２回注射された。対照群は上記と同様に注射された。実験開始２２日後に、腹腔内にＰＡＣＡＰを注射された動物は、陰性対照に比較して体重の有意な増加を示した（ｐ＜０．０５）（図２）。
【００３３】
体重増加が臓器サイズの増加又は筋肉の水含量の増加によるものではなく、体重の増加によるものであることを示すために、肝臓重量／体重比及び筋肉乾燥重量を測定した。
【００３４】
実験群の肝臓重量／体重比及び筋肉乾燥重量の間に有意差は観察されなかった（図３）。
【００３５】
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２の組換えＰＡＣＡＰを適用した場合に類似の結果が得られた。
【００３６】
実施例３．組換えＰＡＣＡＰを含有するＥ．ｃｏｌｉ破裂上清を使用した浸漬浴によるテラピア幼生における成長刺激、病原体に対する抵抗性及びプロラクチン遊離に関する実験。
われわれは、Ｅ．ｃｏｌｉの破裂上清中に存在するＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓの組換えＰＡＣＡＰのテラピア幼生における機能を評価するための実験を行った。
【００３７】
二つの実験群はそれぞれ６０匹で構成された。一つの群はＰＡＣＡＰ神経ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）で処理し、他の群は対照群として使用した。幼生の群は安定した水の循環を行っている、温度２８℃及び１４時間明期及び１０時間暗期の照明サイクルの個別のタンクにおいて馴化し、そして動物は次の式から得られる量で飼育された：餌の量＝動物数×平均体重（ｇ）×４０％／１００。処理は、２Ｌの水の浸漬浴であり、週３回６０分間の２０日間であり、用量はターゲットタンパク質２００ μｇ／リットル水であった。
【００３８】
結果として、実験１０日目に、ＰＡＣＡＰ処理群は、対照群に比較して有意な体重及び体長の増加を示し（ｐ＜０．０１）、実験開始１５日目に、実験群の間の差は高度に有意となった（Ｐ＜０．００１）（表１及び図４Ａ及び４Ｂ）。浸漬浴開始の２０日後には、ＰＡＣＡＰ処理群と対照群の間の差は統計的に有意であった（ｐ＜０．００１）（図５）。
【００３９】
【表１】
体重と体長は平均±ＳＤ．として示す
【００４０】
最後の浸漬浴の３０日後に実験群動物の体重及び体長の差は著しく有意であったので（ｐ＜０．０１）、成長に対するＰＡＣＡＰの作用は持続することが観察された（図６）。さらに、ＰＡＣＡＰ処理した魚は陰性対照に比較して早い発育段階において皮膚の着色を示すことが観察された（図７）。
【００４１】
この実験において、われわれは皮膚原虫、Ｔｒｉｃｈｏｄｉｎａ種の存在を試験した。１０匹の動物を各実験群から無作為に選択し、この病原体の侵入強度を次の式にしたがって測定した：
（Ｉ：魚寄生虫の合計数）Ｉ＝ΣＮ／ｎーＦ０及びＥ＝ｎ−Ｆ０Ｘ１００／ｎ
Ｉ：（平均侵入強度） Ｅ：（全体の中で寄生虫のいる魚の数）
ΣＮ（発見された寄生虫の総数） Ｆ０：（寄生虫のいない魚の数）
ｎ：（分析した魚の数）
【００４２】
ＰＡＣＡＰ処理魚の原虫Ｔｒｉｃｈｏｄｉｎａ種による侵入強度（平均Ｉ＝２．２０）は対照群（平均Ｉ＝５．５６）に比較して有意に少ないこと（Ｐ＜０．０１）を示した。
【００４３】
魚は前記と同じ条件において実験開始から４５日間浸漬浴により処理され、処理２４時間後に群当たり１０匹の動物から血液を採取し、ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡにより血清のプロラクチンを測定した。このアッセイにポリクロナール抗テラピアプロラクチン抗体を使用した。われわれは、対照群と比較してＰＡＣＡＰ処理群の間に統計的に有意差を観察した（ｐ＜０．０１）（表２）。これらは、サーモンの場合に新鮮水と海水を回遊し、そこでプロラクチンが浸透圧調節に重要な機能を果たしているので、商業的水生生物において非常に魅力的な結果である。
【００４４】
【表２】
濃度は平均±ＳＤとして示されている。
＊有意差Ｐ＜０．０１を示す。
【００４５】
実施例４．幼いテラピアＯｒｅｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓの食欲に対する組換えＰＡＣＡＰの作用を評価するための実験。
これまで、魚における食欲に対するＰＡＣＡＰの生物作用は試験されていなかった。哺乳類以下の脊椎動物において、食欲に対するこのペプチドの作用は殆ど分析されていない（Ｊｅｎｓｅｎ，２００１，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ ｉｎ ｎｏｎ−ｍａｍｍａｌｉａｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ Ｐｈｉｓｉｏｌ．Ｐａｒｔ Ａ１２８：４７１−４７９）。
【００４６】
魚の食欲に対するＰＡＣＡＰの作用を分析するために、われわれはＯｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ種のテラピアを使用した。３つの実験群を構成し、各群３匹とし、３回反復した。動物群は、安定した水の循環を行っている、温度２８℃及び１４時間明期及び１０時間暗期の照明サイクルの別々のタンクにおいて馴化した。
【００４７】
一群は、０．５ μｇ／ｇ動物体重の腹腔内注射により半精製ＰＡＣＡＰ（８７％純度）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３で処理した。第２群はＧＨＲＰ−６（Ｌｉｐｏｔｅｃ，Ｓ．Ａ．スペイン）で０．１ μｇ／ｇ動物体重の用量のペプチドにより同じ投与経路で処理した。対照群はＰＢＳ １Ｘ中に含有されるＥ．ｃｏｌｉタンパク質で処理した（Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質は関心のペプチドと同じ精製方法により得た、精製ＰＡＣＡＰ検体中に存在する混入物と同量含む）。
【００４８】
処理後、同量の餌を３つの実験群に与え、６時間後に摂食されなかった餌を回収し、再度餌を与えた。実験開始２２時間後に食欲を再度測定した。
【００４９】
それぞれのタンクの摂食されなかった餌を乾燥機で乾燥し（１００℃、２４時間）そして分析用秤で測定した。摂食された餌は、タンクに加えた餌の量（１０グラム、水分２０％）と魚に摂食されなかった餌の量の差から計算した。
【００５０】
ＰＡＣＡＰ及びＧＨＲＰ−６で処理したテラピアは、対照群に比較して有意な食欲増加を示した（ｐ＜０．０５）（図８）。
【００５１】
実施例５．ナマズＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓの免疫系に対する組換えＰＡＣＡＰの評価。
幼いＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓを使用した。各群１０匹ずつの２群に分けた。動物群は、安定した水の循環を行っている、温度２８℃及び１４時間明期及び１０時間暗期の照明サイクルの別々のタンクにおいて馴化した。動物には、各タンク中の合計体重の５％の比率で１日２回給餌した。実験前に動物を確認した。ＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）で処理した魚は、週２回、０．１ μｇ／ｇ動物体重の用量で腹腔内に注射を受けた。
【００５２】
実験開始２０日後に、血清中のリゾチーム及びレシチンを測定するために魚から血液を採取した。血清中のリゾチーム活性は細菌Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓを溶菌するリゾチームの能力にもとづく方法を使用して測定した。９６−ウエルのマイクロトレイ中、リン酸緩衝液（０．０５ Ｍ、ｐＨ６．２）の中で２倍系列希釈した検体１００ μＬを、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓの３ ｍｇ／ｍｌ懸濁（Ｓｉｇｍａ）の１００ μＬと混合した。このマイクロトレイを２２℃でインキュベートし、０、２、３、５、１０、１５、２５、３５及び４５分に４５０ ｎｍのＯＤを記録した。陽性対照として、サカナ血清をニワトリ卵白リゾチームに置換し（系列希釈は８ μｇ／ｍｌから開始）、陰性対照として、サカナ血清を緩衝液に置換した。リゾチーム活性の単位は、０．００１ Ｍｉｎ−１のＯＤ値の減少を生じる幼生ホモジネートの量として定義した。われわれは、対照群とＰＡＣＡＰ群の間に統計的有意差を観察した（ｐ＜０．０１）（表３）。
【００５３】
【表３】
濃度を平均±ＳＤとして示す。
＊有意差Ｐ＜０．０１を示す。
【００５４】
血清中に存在するレシチンを測定するために、われわれは赤血球凝集アッセイを行った。ＰＢＳ ｐＨ７．２による血清の２倍系列希釈をＵ型底のマイクロタイターウエル（９６ウエル、Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｍｉｃｒｏｌｏｎ）中で行い、この中に同じ容量の新しく調製した２％赤血球懸濁（ウサギ、ＰＢＳ）を加えた。このウエルを室温で１時間インキュベートし、力価は、肉眼で観察し、凝集を示す最後の希釈と等しいとした（ウエルの底全体に均一な細胞の分布層が示される）。検体の赤血球凝集活性を検査し、それぞれの力価を得た。活性は力価、すなわち完全凝集を示す最高希釈の逆数として示した。
【００５５】
ＰＡＣＡＰ処理サカナは対照群に比較して、血清中のレシチンレベルの有意な増加を示した（ｐ＜０．０５）（表４）。
【００５６】
【表４】
Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。＊有意差Ｐ＜０．０５を示す
【００５７】
実施例６．組み換えＰＡＣＡＰを含有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に浸漬することによるテラピア幼生における成長刺激の実験。
テラピア幼生の成長におけるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に含まれるＣｌａｒｉａｓ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ ＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）の機能を評価するためにわれわれは実験を行った。
【００５８】
各群５０匹の幼生からなる３つの実験群を構成した。一つの群はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に含まれる組換えＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）で処理した。第２群は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に含まれる組換えテラピア成長ホルモン（ＧＨ）で処理された。対照群は形質転換されていないＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で処理した。幼生は１日２回次の式から得られる量の餌を与えられた：餌の量＝動物数×平均体重（ｇ）×４０％／１００。処理は、週に３回９０分間、３０ Ｌ容積の中に浸漬することにより行った。容量は、標的タンパク質１００ μｇ／Ｌ水）
【００５９】
実験開始の５週間（３５日）後、ＰＡＣＡＰ処理群は、対照群に比較して有意な体重増加（ｐ＜０．０１）を示す結果を、われわれは得た。成長ホルモン処理群は、対照群に比較して有意な体重増加を示した（ｐ＜０．０５）（表５）。
【００６０】
【表５】
体重は平均±ＳＤとして示す。
【００６１】
実施例７．組換えＰＡＣＡＰを含有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で処理したエビＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｓｃｈｍｉｔｔｉにおける成長刺激及び幼生品質の改善の実験。
われわれは、Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｓｃｈｍｉｔｔｉ種のエビ幼生を使用した。二つの実験群は、各群１００匹の幼生で構成した。１群は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に含まれる組換えＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）で処理し、対照群として使用した他の群は、形質転換していないＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で処理した。
【００６２】
幼生は１００ Ｌの容積のファイバーグラス製タンクの中で養殖された。給餌は、ｄｙａｔｏｍｅａｓ（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ），ｔｈｅ ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｄ ａｌｇａｅ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｕｅｃｉｃａ）及びＡｒｔｅｍｉａ ｎａｕｐｌｉｕｓ（Ａｑｕａｔｉｃ Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）に基づいて行った。
【００６３】
非生物成長要因は以下の通り：
・照明（２４：００ Ｌ／Ｄ）
・安定通気
・塩分、３４ ｐｐｍ
・溶存酸素 ５．２±０．５（幼生循環において）
・再循環変動 ＰＺＩＩＩ ８０％
【００６４】
実験群に、３日に１度１時間の浸漬浴を４回適用した。
【００６５】
ＰＡＣＡＰ処理群は対照群に比較して有意な体重増加を示す結果をわれわれは得た（ｐ＜０．０１）（表６）。
【表６】
体重は平均±ＳＤとして示す。
【００６６】
われわれは、ＰＡＣＡＰ処理群においてエビの養殖に重要である高い均一性及び幼生の優れた品質（鰓器官の多い分枝及び口吻の修飾）を観察した。ＰＬ９ステージにおける生存率の相違は、ＰＡＣＡＰ処理群において４０％多かった。
【００６７】
実施例８．組換えＰＡＣＡＰ含有サカナ餌製品による若いＣｌａｒｉａｓ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓにおける成長刺激。
組換えＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）を含有するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清を濃縮し、サカナ養殖餌に添加して約５ ｍｇ／Ｋｇ餌の濃度にした。
【００６８】
それぞれ平均体重０．１ｇの幼生１００匹の２実験群を構成した。１群は組換えＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）を含有するＰｉｃｈｉ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で処理し、対照として使用したほかの１群は非形質転換Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で処理した。実験を３０日間行った。
【００６９】
５ ｍｇ／Ｋｇ餌の用量で餌に含まれた組換えＰＡＣＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）は対照に比較して３０％成長を増加し、高度の統計的有意差があった（ｐ＜０．０１）。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】細菌発現ベクター（図１Ａ）及びイースト発現ベクター（図１Ｂ）におけるＰＡＣＡＰクローニング方法。
【図２】アフィニティークロマトグラフィーにより精製した組換えＰＡＣＡＰの腹腔内注射による、０．１ μｇ／ｇ動物体重の用量における幼いＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓにおける成長刺激実験。グラフは、対照群と比較したＰＡＣＡＰ処理群の平均体重を示す。
【図３】アフィニティークロマトグラフィーにより精製した組換えＰＡＣＡＰの腹腔内注射による、０．１ μｇ／ｇ動物体重の用量における幼いＣｌａｒｉａ ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓにおける成長刺激実験。グラフは、対照群と比較したＰＡＣＡＰ処理群の肝臓重量／体重比の平均を示す。
【図４】１００ μｇ／リットル水の用量における組換えＰＡＣＡＰを含有するＥ．ｃｏｌｉ破裂上清中への浸漬によるテラピア幼生の成長刺激実験。グラフ４Ａ及び４Ｂは、陰性対照と比較した処理群の平均体重及び体長を示す。
【図５】１００ μｇ／リットル水の用量における組換えＰＡＣＡＰを含有するＥ．ｃｏｌｉ破裂上清中への浸漬によるテラピア幼生の成長刺激実験。グラフは、処理開始２２日後における、陰性対照と比較した処理群の平均体重を示す。
【図６】１００ μｇ／リットル水の用量における組換えＰＡＣＡＰを含有するＥ．ｃｏｌｉ破裂上清中への浸漬によるテラピア幼生の成長刺激実験。図は、最終浸漬浴の３０日後におけるＰＡＣＡＰ処理サカナ（Ａ及びＣ）と対照群（Ｂ）の体長の差を示す。
【図７】１００ μｇ／リットル水の用量における組換えＰＡＣＡＰを含有するＥ．ｃｏｌｉ破裂上清中への浸漬によるテラピア幼生の成長刺激実験。図は、対照群（Ｃ）に比較してＰＡＣＡＰ処理サカナ（Ａ及びＢ）の色の早期発生を示す。
【図８】アフィニティークロマトグラフィーで精製した組換えＰＡＣＡＰの、０．５ μｇ／ｇ動物体重の用量におけるテラピアＯｒｅｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓの食欲に対する評価。図は、処理開始６時間と２２時間にサカナによって摂取された平均食物量を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
養殖しているサカナ又は甲殻類に、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４による神経ペプチドＰＡＣＡＰを、成長を刺激するか又は病気に対する抵抗性を増加させる又は両者のために有効な量で与える又は投与することを含む、サカナ又は甲殻類養殖の生産性を増加させる方法。
【請求項２】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、プロラクチン分泌を増加させる、サカナの浸透圧調節を改善するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、水生生物の食欲を調節するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、観賞用動物及び甲殻類における発色を改善するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが化学合成により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが組換え技術により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｅ．ｃｏｌｉ破裂上清中に含まれるＰＡＣＡＰ神経ペプチドを精製せずに使用する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に含まれるＰＡＣＡＰ神経ペプチドを精製せずに使用する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
組換え生産システムから出発した精製ＰＡＣＡＰ神経ペプチドを使用する請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、０．１ μｇ／ｇ動物体重の濃度で３日ごとに周期的注射によりサカナ又は甲殻類に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、新鮮水又は海水中１００〜２００ μｇ／リットル水の濃度で、１〜４日の間隔で行われる浸漬浴によりサカナ又は甲殻類に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、５ ｍｇ／Ｋｇ餌の濃度で混餌（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｆｅｅｄ）としてサカナ又は甲殻類に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドがＯｒｅｃｈｒｏｍｉｓ種のテラピアに供給される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドがＣｌａｒｉｓ種のナマズに供給される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドがＳａｌｍｏｎ種のサーモンに供給される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドがＰｅｎａｕｓ種のエビに供給される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、病原体により生じる感染を予防又は治療するためにサカナ又は甲殻類に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
成長を刺激するために養殖しているサカナ又は甲殻類を処理するための組成物を製造するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に記載するＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項１９】
病気に対する抵抗性を増加させるために養殖しているサカナ又は甲殻類を処理するための組成物を製造するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に記載するＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項２０】
養殖しているサカナ又は甲殻類における病原体により生じる感染の予防的又は治療的処理のための組成物を製造するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に記載するＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項２１】
生産性を改善するためにサカナ及び甲殻類の成長を刺激するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４によるＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項２２】
養殖におけるサカナ及び甲殻類の病気に対する抵抗性を増加させて、生産性を改善するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に記載するＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項２３】
養殖において病原体により生じる感染からサカナ及び甲殻類を予防又は治療して生産性を改善するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に記載するＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項１】
養殖しているサカナ又は甲殻類に、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４による神経ペプチドＰＡＣＡＰを、成長を刺激するか又は病気に対する抵抗性を増加させる又は両者のために有効な量で与える又は投与することを含む、サカナ又は甲殻類養殖の生産性を増加させる方法。
【請求項２】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、プロラクチン分泌を増加させる、サカナの浸透圧調節を改善するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、水生生物の食欲を調節するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、観賞用動物及び甲殻類における発色を改善するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが化学合成により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが組換え技術により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｅ．ｃｏｌｉ破裂上清中に含まれるＰＡＣＡＰ神経ペプチドを精製せずに使用する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清に含まれるＰＡＣＡＰ神経ペプチドを精製せずに使用する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
組換え生産システムから出発した精製ＰＡＣＡＰ神経ペプチドを使用する請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、０．１ μｇ／ｇ動物体重の濃度で３日ごとに周期的注射によりサカナ又は甲殻類に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、新鮮水又は海水中１００〜２００ μｇ／リットル水の濃度で、１〜４日の間隔で行われる浸漬浴によりサカナ又は甲殻類に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、５ ｍｇ／Ｋｇ餌の濃度で混餌（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｆｅｅｄ）としてサカナ又は甲殻類に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドがＯｒｅｃｈｒｏｍｉｓ種のテラピアに供給される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドがＣｌａｒｉｓ種のナマズに供給される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドがＳａｌｍｏｎ種のサーモンに供給される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドがＰｅｎａｕｓ種のエビに供給される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＡＣＡＰ神経ペプチドが、病原体により生じる感染を予防又は治療するためにサカナ又は甲殻類に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
成長を刺激するために養殖しているサカナ又は甲殻類を処理するための組成物を製造するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に記載するＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項１９】
病気に対する抵抗性を増加させるために養殖しているサカナ又は甲殻類を処理するための組成物を製造するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に記載するＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項２０】
養殖しているサカナ又は甲殻類における病原体により生じる感染の予防的又は治療的処理のための組成物を製造するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に記載するＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項２１】
生産性を改善するためにサカナ及び甲殻類の成長を刺激するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４によるＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項２２】
養殖におけるサカナ及び甲殻類の病気に対する抵抗性を増加させて、生産性を改善するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に記載するＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【請求項２３】
養殖において病原体により生じる感染からサカナ及び甲殻類を予防又は治療して生産性を改善するための、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に記載するＰＡＣＡＰ神経ペプチドの使用。
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５１６５２０（Ｐ２００９−５１６５２０Ａ）
【公表日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４１５７３（Ｐ２００８−５４１５７３）
【出願日】平成１８年１１月２０日（２００６．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００６／００００１３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５９７１４
【国際公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【出願人】（５０２２４１１３２）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２０日（２００６．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００６／００００１３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５９７１４
【国際公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【出願人】（５０２２４１１３２）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (2)
【Ｆターム（参考）】
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