本発明は一般にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びその小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）相同体／誘導体を用いて、新しい抗腫瘍／抗癌薬、ワクチン及び治療を開発させる設計と方法に関する。具体的に、本発明は、核酸組成物を使用し、該核酸組成物がヒト細胞内に送達されると、ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターを発現させることで、ｍｉｒ−３０２の標的となる細胞周期調節因子及び発癌遺伝子をサイレンシングさせることができ、腫瘍／癌細胞の成長と転移を抑制する効果を奏する。Ｍｉｒ−３０２はヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞と誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞で発見された最も主要なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるが、その機能についてはまだ明らかではない。本発明は、ヒト細胞においては、ｍｉｒ−３０２がｃｙｃｌｉｎ−Ｅ−ＣＤＫ２及びｃｙｃｌｉｎ−Ｄ−ＣＤＫ４／６経路の両方を同時に抑制し、最終的にＧ１−Ｓ期の細胞周期の移行を７０％より多く阻止したことを証明した。同時に、ｍｉｒ−３０２は腫瘍幹細胞マーカーであるＢＭＩ−１をサイレンシングし、続いてＣＤＫ４／６により媒介される細胞増殖を抑制する際にｐｌ６Ｉｎｋ４とｐｌ４／ｐｌ９Ａｒｆの腫瘍抑制機能を促進する。従って、本発明はヒト細胞におけるｍｉｒ−３０２の腫瘍抑制機能を初めて公表した。この新しい発見は、新規抗癌薬、ワクチン及び各種のヒト腫瘍と癌症治療の設計及び方法における開発を促進した。ここで言う癌症は、特に悪性皮膚癌、前立腺癌、乳癌、肝癌及び各種の腫瘍を含むが、これらに限らない。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に治療機能を有するＤＮＡ／ＲＮＡ薬剤の癌治療における設計と利用に関する。より詳細には、本発明は核酸組成物を設計及び使用する方法に関しており、該核酸組成物はヒト細胞において小型ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）遺伝子サイレンシングエフェクターを生成／発現させることで、ｍｉｒ−３０２の標的となる細胞周期調節因子及び発癌遺伝子をサイレンシングさせることができ、腫瘍／癌細胞の成長と転移に対する抑制効果を奏する。小型ＲＮＡ遺伝子サイレンシングエフェクターは、ｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、ｍｉｒ−３０２ｄ、ｍｉｒ−３０２ｅ、マイクロＲＮＡ前駆体（プレマイクロＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ）、及び手動で再設計した小ヘアピンＲＮＡ／小干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ）の相同体／誘導体、並びにそれらの組み合わせのようなマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含むことが好ましい。興味を示す該ヒト細胞は、インビトロ、エクスビボ及び／又はインビボの体細胞又は腫瘍／癌細胞を含む。
【背景技術】
【０００２】
Ｍｉｒ−３０２はヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ、ｈＥＳ ｃｅｌｌ）と誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ、ｉＰＳ ｃｅｌｌ）において発見された最も主要なマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）であるが、その機能はまだ明らかではない。従来の研究ではｍｉｒ−３０２の異所性発現が、著しく遅い細胞周期速度と休眠細胞様の細胞形態を有しているｈＥＳ様多能性細胞にヒト癌細胞を再プログラムできることを示した（Ｌｉｎ氏ら，２００８）。相対静止はｍｉｒ−３０２の再プログラム化された多能性幹細胞（ｍｉｒＰＳ）の明確な特徴の一つであるが、一方、ほかの３／４個の因子（即ち、Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２−Ｋｌｆ４−ｃ−Ｍｙｃ又はＯｃｔ４−Ｓｏｘ２−Ｎａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８）により誘発された多能性幹細胞（ｉＰＳ）は目覚ましい増殖能力と容赦のない腫瘍形成傾向を有している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ氏ら，２００６；Ｙｕ氏ら，２００７；Ｗｅｒｎｉｇ氏ら，２００７）。ｍｉｒＰＳ細胞の抗増殖特性を裏付けるメカニズムのほとんどはまだ解明されてないが、ｍｉｒ−３０２の標的となる２つのＧ１チェックポイント調節因子（Ｇ１−ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）が関与している可能性を発見した。これらは、サイクリン依存性キナーゼ２（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ２、ＣＤＫ２）とサイクリンＤ（ｃｙｃｌｉｎ Ｄ）である（Ｌｉｎ氏ら，２００８）。真核細胞の細胞周期の進行はサイクリン依存性キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅｓ、ＣＤＫｓ）の活性により駆動され、サイクリン依存性キナーゼは、正の調節サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔｓ）であるサイクリン及び負の調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）であるサイクリン依存性キナーゼ抑制剤（ＣＤＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、ＣＫＩ、例えば、ｐ１４／ｐ１９Ａｒｆ、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、ｐ２１Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１及びｐ２７Ｋｉｐ１）と機能性複合体を形成する。ほ乳類動物細胞においては、異なるサイクリン−サイクリン依存性キナーゼ複合体（ｃｙｃｌｉｎ−ＣＤＫ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）が異なる細胞周期の移行の調節に関与し、例えば、Ｇ１期進行に関与するＣｙｃｌｉｎ−Ｄ−ＣＤＫ４／６、Ｇ１−Ｓ期の移行に関与するｃｙｃｌｉｎ−Ｅ−ＣＤＫ２、Ｓ期進行に関与するｃｙｃｌｉｎ−Ａ−ＣＤＫ２及びＭ期進入に関与するｃｙｃｌｉｎＡ／Ｂ−ＣＤＣ２（ｃｙｃｌｉｎ−Ａ／Ｂ−ＣＤＫ１）。これにより、ｍｉｒ−３０２の抗増殖機能はＧ１−Ｓ期移行期間においてＣＤＫ２とｃｙｃｌｉｎ Ｄが共抑制された結果であると推測される。
【０００３】
しかし、ヒトｍｉｒ−３０２相同体であるマウスｍｉｒ−２９１／２９４／２９５ファミリーに関する研究では、ヒトのｍｉｒＰＳ細胞におけるｍｉｒ−３０２と機能が全く違う結果が示された。マウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）においては、ｍｉｒ−２９１／２９４／２９５の異所性発現はｐ２１Ｃｉｐ１（又はＣＤＫＮ１Ａと言う）とセリン／スレオニンプロテインキナーゼＬａｔｓ２（Ｗａｎｇ氏ら，２００８）を直接サイレンシングすることによって、細胞の急速な増殖とＧ１−Ｓ期移行を誘発した。該腫瘍傾向（ｔｕｍｏｒ−ｐｒｏｎｅ）の結果はｐ２１Ｃｉｐ１とＬａｔｓ２腫瘍抑制因子の本来の特性によるものだと考えられる。ｐ２１Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１遺伝子が欠損した遺伝子導入マウスはＧ１チェックポイントによる制御が欠けている場合、正常の成長を示した（Ｄｅｎｇ氏ら，１９９５）。しかし、Ｌａｔｓ２は、有糸分裂開始時にλ−チューブリン（ｇａｍｍａ−ｔｕｂｕｌｉｎ）を動員する機能及び紡錘体の形成に関与する機能を有しているため、その役割はまだ解明されていない。また、マウス胚におけるＬａｔｓ２の欠損は、有糸分裂の重度な欠陥を引き起こし、致命的であると発見されたことも、Ｌａｔｓ２のサイレンシングは細胞分裂の促進ではなく、それを阻害することを示している（Ｙａｂｕｔａ氏ら，２００７）。以上により、ｐ２１Ｃｉｐ１のサイレンシングはｍｉｒ−２９１／２９４／２９５により誘発された腫瘍形成の裏にある主要なメカニズムのように思われる。それにもかかわらず、最近我々がヒトｐ２１Ｃｉｐ１遺伝子のｍｉｒ−３０２の標的部位をスクリーニングした結果は陰性であった。同様な陰性の結果はオンライン演算プログラム「ＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）及び「ＰＩＣＴＡＲ−ＶＥＲＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ／）によっても予測できた。従って、ｍｉｒ−３０２及びその相同体であるｍｉｒ−２９１／２９４／２９５はｈＥＳとｍＥＳ細胞においてそれぞれ異なる機能を果たす可能性が大きいことから、ヒトｉＰＳ及びマウスｉＰＳ細胞に違う特性を持たせたと考えられる。上記の発見より、我々は、ｍＥＳ細胞におけるｍｉｒ−２９１／２９４／２９５の役割を、ｈＥＳ及びｉＰＳ細胞におけるｍｉｒ−３０２の機能を評価するための等価モデルとみなすことができないと理解した。
【０００４】
ＭｉＲＮＡは細胞質中の抑制因子（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であり、その通常の機能は高度相補的な標的遺伝子転写物（ｍＲＮＡｓ）の翻訳を抑制することである。ＭｉＲＮＡとその標的遺伝子との結合の厳密度によって該ｍｉＲＮＡ本来の機能が決められる。細胞条件の違いによって、遺伝子標的におけるｍｉＲＮＡの嗜好も異なってくる。しかしながら、今までｍｉｒ−３０２の濃度効果、又はｍｉｒ−３０２の標的遺伝子との相互作用の厳密度に関連する報告はなかった。この疑問を解決するために、本発明はその重要な詳細を開示するとともに、ｍｉｒ−３０２がヒトとマウス細胞における機能が大きく異なることを初めて披露した。ｍｉｒ−３０２は、ヒト細胞において、ＣＤＫ２、ｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２、及びＢＭＩ−１を標的として強く狙うが、興味深いことに、ｐ２１Ｃｉｐ１が含まれていない。マウスのｐ２１Ｃｉｐ１と違って、ヒトのｐ２１Ｃｉｐ１にはｍｉｒ−３０２の標的部位がいずれも含まれていない。この遺伝子標的の相違は両者の細胞周期調節における重要な分岐を招いた。マウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）において、ｍｉｒ−３０２はｐ２１Ｃｉｐ１をサイレンシングするとともに、腫瘍様（ｔｕｍｏｒ−ｌｉｋｅ）細胞の増殖を促進するが（Ｗａｎｇ氏ら，２００８；Ｊｕｄｓｏｎ氏，２００９）、ヒトｍｉｒＰＳ細胞中では、ｐ２１Ｃｉｐ１の発現が維持されるとともに、比較的遅い細胞増殖と比較的低い腫瘍形成能力をもたらす。さらに、マウスのＢＭＩ−１も、適切な標的部位を欠いているためｍｉｒ−３０２の標的遺伝子とならない。我々は、ｍｉｒＰＳ細胞において、ヒトＢＭＩ−１をサイレンシングすることによって、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ／ｐ１４ＡＲＦ発現を刺激し、細胞増殖を減弱させるが、ｍｉｒ−３０２でマウスＢＭＩ−１をサイレンシングすることによって、マウス細胞に同様な効果を引き起こすことができないことを発見した。ヒトｍｉｒＰＳ細胞において、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ／ｐ１４ＡＲＦの発現が増加し、ｐ２１Ｃｉｐ１が影響を受けないため、ヒト細胞中でｍｉｒ−３０２はｃｙｃｌｉｎ−Ｅ−ＣＤＫ２及びｃｙｃｌｉｎ−Ｄ−ＣＤＫ４／６経路を共抑制するほか、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ−Ｒｂ及び／又はｐ１４／１９ＡＲＦ−ｐ５３経路を通じて抗増殖機能を発揮する可能性が最も大きい。Ｍｉｒ−３０２がヒト及びマウス遺伝子を標的とする際の嗜好における顕著な違いは、両者の細胞周期調節機構に根本的な相違があったことを示している。
【０００５】
要するに、先行技術はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とその標的遺伝子の相互作用の厳密度を見過ごしたため、ヒトｍｉｒ−３０２の機能に対して間違った仮説を立てた。この誤解を解くため、本発明は誘導性のｍｉｒ−３０２発現系を採用することで、ヒト腫瘍／癌細胞形成の抑制におけるｍｉｒ−３０２の新しい機能を明らかにした。我々の新しい発見は、癌の治療と予防に対する汎用的な抗腫瘍／抗癌症薬及び／又はワクチンの開発に応用できる。従って、薬／ワクチンの開発及びその癌治療において、ｍｉｒ−３０２を有効且つ安全な設計と方法で使用する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記した懸案を鑑みてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、治療効果を有するＤＮＡ／ＲＮＡ薬剤及び／又はワクチンの癌治療における設計及び使用に関する。詳細には、本発明は、組換え核酸組成物を使用し、該組換え核酸組成物がヒト細胞に送達されると、小型ＲＮＡ遺伝子サイレンシングエフェクター（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）を発現させることで、ｍｉｒ−３０２の標的となる細胞周期調節因子及び発癌遺伝子の活性を抑制することができ、ヒト腫瘍／癌細胞の成長及び転移に対する腫瘍抑制効果をもたらす。小型ＲＮＡ遺伝子サイレンシングエフェクターは、例えば、ｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、ｍｉｒ−３０２ｄ、そのヘアピン様マイクロＲＮＡ前駆体（ｈａｉｒｐｉｎ−ｌｉｋｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ）、手動で再設計した小ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）相同体／誘導体及びこれらの組み合わせのようなマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含むことが好ましい。小ヘアピンＲＮＡ相同体／誘導体の設計は、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び小干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）の構造における単一ユニット又は複合クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）内のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）及び完全にマッチした（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｍａｔｃｈｅｄ）核酸組成物を含む。それらは標的特異性を促進するとともに、送達及び治療に必要なｍｉｒ−３０２の数量（コピー数、ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）を低減することができる。
【０００８】
天然マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長さが約１８〜２７個のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ｎｔ）で、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とその標的との間の相補性によって、その標的となるメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を直接分解し、又はその標的となるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳を抑制することができる。Ｍｉｒ−３０２ファミリー（ｍｉｒ−３０２ｓ）は高度な相同性を有し、数多くのほ乳類動物に保存（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）されているマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）である。Ｍｉｒ−３０２ファミリー（ｍｉｒ−３０２ｓ）は４つのファミリーメンバーを含み、それらは５’から３’への順番で、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、ｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｄ及びｍｉｒ−３６７を含む非コードＲＮＡクラスター（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｃｌｕｓｔｅｒ）に転写される（Ｓｕｈ氏ら、２００４）。最近、科学者は本来のクラスターのほかに、５つ目のｍｉｒ−３０２メンバーであるｍｉｒ−３０２ｅを発見した。Ｍｉｒ−３６７とｍｉｒ−３０２ｓは共発現されるが、これらの機能は実際に互いに異なっており、そのため、我々はｍｉｒ−３０２ｓのみを発現させるようにｍｉｒ−３０２クラスターを再設計する。また、我々は、容易に送達及び発現するために、５’−ＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧ ＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）と５’−ＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡ ＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）のような手動で再設計したヘアピンループを用いて、本来のｍｉｒ−３０２前駆体（ｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２）の環配列を代替することによって、より緊密なクラスターを形成する。通常、ｍｉｒ−３０２はマウス以外のほ乳類動物胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ（ＥＳ） ｃｅｌｌ）のみにおいて大量に発現され、そして、細胞分化及び／又は増殖後速やかに減少する（Ｔａｎｇ氏ら，２００７；Ｓｕｈ氏ら，２００４）。ｍｉＲＮＡの特徴はそれに高度に相補的な標的となる遺伝子の小型抑制性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡｓ）をサイレンシングすることができるので（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．，２００４）、ｍｉｒ−３０２ｓは、ＥＳ細胞が初期胚発生における不規則な成長と早熟な成長を防ぐための重要な抑制因子であり、幹細胞の腫瘍形成も防止する可能性がある。実際に、桑実胚期（ｍｏｒｕｌａ ｓｔａｇｅ、３２〜６４細胞期）前のＥＳ細胞は、通常、非常に遅い細胞周期速度を示す。これらの発見は、ｍｉｒ−３０２が正常幹細胞の維持と再生を制御することにあたって、重要な役割を果たすとともに、腫瘍／癌細胞の形成を抑制するのに有益であることを示唆した。
【０００９】
全てのｍｉｒ−３０２メンバーは、５’末端配列の最初にある１７個のヌクレオチドにおいて完全一致な配列を共有し、そのうち、シードモチーフ（ｓｅｅｄ ｍｏｔｉｆ）である５’−ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ ＣＡＵＧＵＵＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）を含み、また、同様に、２３個のヌクレオチドを有する成熟したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）において、８５％以上の配列相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有する。オンライン演算方程式「ＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）及び「ＰＩＣＴＡＲ−ＶＥＲＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ／）による現在の予測結果に基づき、これらのメンバーは同時にほぼ同じ細胞遺伝子を標的とし、そのうちに、６０７個を超えるヒト遺伝子が含まれている。さらに、ｍｉｒ−３０２は機能上においてある程度似ているかもしれないｍｉｒ−９３、ｍｉｒ−３６７、ｍｉｒ−３７１、ｍｉｒ−３７２、ｍｉｒ−３７３及びｍｉｒ−５２０ファミリーとも、多数の標的遺伝子を共有している。これらの標的遺伝子の多くは、初期胚発生中の系列特異的な細胞分化（ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の開始及び／又は確立に関与する発生シグナル（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｉｇｎａｌｓ）及び転写因子である（Ｌｉｎ氏ら，２００８）。そして、標的遺伝子の多くは既知の発癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ）でもある。従って、ｍｉｒ−３０２の機能は、従来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）方法のように特定の胚シグナル伝達経路に転写作用を刺激するよりも、むしろ発生シグナル及び分化関連転写因子の全体的発生を抑制する可能性が高い。また、標的となる発生シグナルと分化関連転写因子の多くは発癌遺伝子であるため、ｍｉｒ−３０２は腫瘍抑制機能も有しており、正常ｈＥＳ細胞の成長が腫瘍／癌細胞の形成へ進行することを防止することができる。
【００１０】
ある好ましい実施例において、本発明者は既に誘導性ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓ発現ベクター（図１Ａ）を設計、開発しており、ウィルス感染法、電気穿孔法又はリポソーム／ポリソーム（ｐｏｌｙｓｏｍａｌ）形質移入法によって正常及び／又は癌性のヒト細胞中にｍｉｒ−３０２を送達する。再設計されたｍｉｒ−３０２構造は同じクラスター中のｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ及びｍｉｒ−３０２ｄ という４つの小非コードＲＮＡメンバー（ｓｍａｌｌ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｍｅｍｂｅｒｓ）を含む（ｍｉｒ−３０２ｓ、図１Ｂ）。ドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ、Ｄｏｘ）による刺激において、該ｍｉｒ−３０２ｓ構造は、テトラサイクリン応答要素（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、ＴＲＥ）に制御されるサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動され、発現される。感染／形質移入後、ｍｉｒ−３０２の発現は天然マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）生合成経路に沿って行われる。そのうち、ｍｉｒ−３０２ｓ構造は、赤方偏移蛍光タンパク質（ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＧＦＰ）のようなレポーター遺伝子とともに共転写され、そして、更にスプライセオソーム複合体（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）及び／又は細胞質内のＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）ダイサー（Ｄｉｃｅｒｓ）（図２Ａ）（Ｌｉｎ氏ら，２００３）によって、単独のｍｉｒ−３０２メンバーにプロセシングされる。この施策による結果は、ｍｉＲＮＡマイクロアレイＲＮＡ分析（実施例３）において、センス（ｓｅｎｓｅ）ｍｉｒ−３０２メンバーの全てがドキシサイクリンによる刺激後、形質移入された細胞で有効的に発現された（図１Ｃ）。ｍｉｒ−３０２発現ベクターをヒト細胞に形質導入する手順は図２Ｂ−Ｃに説明される。
【００１１】
本発明者は、天然のイントロンマイクロＲＮＡ（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｍｉＲＮＡ）の生合成経路を模倣して（図２Ａ）、組換えＲＧＦＰ遺伝子を転写するように、イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現系、即ち、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰを設計した。ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰは、人造／人工のスプライシング可能なイントロン（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｉｎｔｒｏｎ、ＳｐＲＮＡｉ）を含有し、該イントロンはイントロンマイクロＲＮＡ（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｍｉＲＮＡ）及び／又は小ヘアピンＲＮＡ様（ｓｈＲＮＡ−ｌｉｋｅ）遺伝子サイレンシングエフェクターを生成することができる（Ｌｉｎ氏ら，２００３；Ｌｉｎ氏ら，（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３４２：２９５−３１２）。ＳｐＲＮＡｉとＲＧＦＰはＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によって共転写されてＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）中に包含され、しかも、ＲＧＦＰはＲＮＡスプライシング複合体（ＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）によって切り出される。そして、スプライス済みのＳｐＲＮＡｉは更に天然マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び人工小ペアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）のような成熟した遺伝子サイレンシングエフェクターにプロセシングされることで、標的遺伝子に対する特定的なＲＮＡ干渉効果（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）を誘発する。同時に、イントロンスプライシング（ｉｎｔｒｏ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）後、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）のエクソン（ｅｘｏｎｓ）が連結されることによって、成熟したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成し、その後、ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡの発現を識別するために用いるＲＧＦＰレポータータンパク質に翻訳される。定量上では、１倍のＲＧＦＰ濃度は４倍のｍｉｒ−３０２濃度に相当する。また、ＲＧＦＰの代わりに機能性タンパク質エクソンを選択的に用いて、付加的な遺伝子機能を提供してもよく、例えば、体細胞再プログラム（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ、ＳＣＲ）中のｈＥＳ遺伝子マーカー。現在、脊椎動物において、機能不明の天然マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が１０００種類以上発見され、また、更に新しいマイクロＲＮＡも相次ぎ識別されているため、我々のイントロンマイクロＲＮＡ発現系はインビトロ及びインビボでのマイクロＲＮＡ機能を測定するための有力なツ−ルとなる。
【００１２】
ＳｐＲＮＡｉイントロンは、５’スプライス部位（５’−ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ）、分岐点モチーフ（Ｂｒａｎｃｈ−Ｐｏｉｎｔ、ＢｒＰ）、ポリピリミジントラクト（ｐｏｌｙ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｒａｃｔ）、及び３’スプライス部位（３’−ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ）を有する幾つかの共通ヌクレオチド組成分を含む。また、５’スプライス部位とＢｒＰモチ−フとの間に挿入されるヘアピンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体も含む。イントロンのこの部分は、通常ＲＮＡスプライシングとプロセシング中に投げ縄（ｌａｒｉａｔ）構造を形成する。さらに、ＳｐＲＮＡｉの３’末端は、イントロンＲＮＡスプライシング（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）とプロセシングの正確度を増すために、様々な翻訳終止コードン領域（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ ｒｅｇｉｏｎ、Ｔ ｃｏｄｏｎ）を含む。このＴ ｃｏｄｏｎは細胞質内のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に現れると、ナンセンス仲介減衰（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ、ＮＭＤ）システムの活性化シグナルを生じさせ、細胞毒性の発生を防ぐために細胞内に蓄積したあらゆる非構造化のＲＮＡを分解する。しかし、高度に構造化された小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が保留され、更にダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって切断され、それぞれ成熟した小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を形成する。我々は、イントロンｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを発現させるために、ＳｐＲＮＡｉを手動でＲＧＦＰ遺伝子のＤｒａＩＩ制限部位に組み込んで（Ｌｉｎ氏ら、２００６と２００８）、組換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子を形成した。ＤｒａＩＩ制限酵素によるＲＧＦＰの開裂によって、各末端に３個の陥凹ヌクレオチドをもつＡＧ−ＧＮヌクレオチド切断が生じ、ＳｐＲＮＡｉ挿入後にそれぞれ５’及び３’スプライス部位を形成する。このイントロン挿入は、機能性ＲＧＦＰタンパク質の完全性を破壊するが、これはイントロンのスプライシングによって完全性を回復できるので、我々は形質移入された細胞中に現れる赤色の赤方偏移蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ）によって、成熟のｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡの発現を測定することができる。ＲＧＦＰ遺伝子は、ＲＮＡスプライシングの正確性と効率を向上させるように、複数のエクソンスプライシングエンハンサー（ｅｘｏｎｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ、ＥＳＥ）も備えている。
【００１３】
詳細には、ＳｐＲＮＡｉイントロンは、５’−ＧＴＡＡＧＡＧＫ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４）又はＧＵ（Ａ／Ｇ）ＡＧＵモチーフ（即ち、５’−ＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴ−３’、５’−ＧＴＡＡＧＡＧＴ−３’、５’−ＧＴＡＧＡＧＴ−３’、及び５’−ＧＴＡＡＧＴ−３’）のいずれかと相同である５’スプライス部位（５’−ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｉｔｅ）を含み、ＳｐＲＮＡｉイントロンの３’末端は、ＧＷＫＳＣＹＲＣＡＧ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５）又はＣＴ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）ＮＧモチーフ（即ち、５’−ＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧ−３’、５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’、及び５’−ＣＣＡＣＡＧ−３’）と相同な３’受容スプライス部位である。また、分岐点配列（ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、５’末端と３’末端のスプライス部位の間に位置し、５’−ＴＡＣＴＡＡＣ−３’及び５’−ＴＡＣＴＴＡＴ−３’のような５’−ＴＡＣＴＷＡＹ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６）モチーフと高度相同である。分岐点配列のアデノシンヌクレオチドである「Ａ」ヌクレオチドは、ほぼ全てのスプライセオソームイントロン（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｒｏｎｓ）において細胞の２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素（（２’−５’）−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ）とスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅｓ）によって、（２’−５’）結合型の投げ縄イントロンＲＮＡ（ｉｎｔｒｏｎ ＲＮＡ）の一部を形成する。さらに、ポリピリミジントラクト（ｐｏｌｙ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｒａｃｔ）が分岐点配列と３’スプライス部位との間に近接して位置し、高Ｔ（チミンヌクレオチド）含量又は高Ｃ（シトシンヌクレオチド）含量の配列であって、５’−（ＴＹ）ｍ（Ｃ／−）（Ｔ）ｎＳ（Ｃ／−）−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７）又は５’−（ＴＣ）ｎＮＣＴＡＧ（Ｇ／−）−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８）モチーフのいずれかと相同である。そのうち、符号「ｍ」及び「ｎ」は複数の重複を示し、≧１であり、最も好ましくは、ｍは１〜３、ｎは７〜１２である。符号「−」は、該配列内にスキップしてよい１個のヌクレオチドがあることを示す。また、これらの全ての合成イントロン構成要素を連結するために、配列には幾つかのリンカーヌクレオチド配列も含まれる。米国特許法施行規則（３７ ＣＦＲ）第１．８２２条のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データに使用する符号及び書式に関するガイドラインに基づき、符号Ｗはアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、符号Ｋはグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、符号Ｓはシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）、符号Ｙはシトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）、符号Ｒはアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）、符号Ｎはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を示す。
【００１４】
他の好ましい実施例において、本発明は直接の（エクソン型）ｍｉｒ−３０２ ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ発現系であって、細胞内のＲＮＡスプライシング及び／又はＮＭＤ機構を経ず、ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターを直接に生成することができる。しかし、この方法の欠点はｍｉｒ−３０２遺伝子サイレンシングエフェクターの発現が、ナンセンス仲介減衰（ＮＭＤ）のようないずれかの細胞内監視システム（ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ）にも制御されないため、天然ｍｉＲＮＡ生合成経路の過飽和によって細胞毒性を生成するおそれがある（Ｇｒｉｍｍ氏ら，２００６）。この方法に用いられる発現系は、直鎖状又は環状の核酸組成物であって、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、ウィルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、レンチウィルスベクター（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、トランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）、レトロトランスポゾン（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）、ジャンピング遺伝子（ｊｕｍｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）、タンパク質コード遺伝子（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ）、非コード遺伝子（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ）、人工組換え導入遺伝子（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）及びこれらの組み合わせから選ばれる。マイクロＲＮＡ、小ヘアピンＲＮＡ、小干渉ＲＮＡ、及びこれらの前駆体と相同体／誘導体を含むＭｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターは、組織特異的または非特異的なＲＮＡプロモーターの制御により発現される。ＲＮＡプロモーターはＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）、ウィルスポリメラーゼ（ｖｉｒａｌ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩＩ）、Ｉ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−Ｉ）、及びテトラサイクリン応答要素に制御されるＲＮＡポリメラーゼ（ＴＲＥ）プロモーターから選ばれる。ウィルスプロモーターは、Ｐｏｌ−ＩＩ様ＲＮＡプロモーターであり、サイトメガロウィルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）、レトロウィルス末端反復配列（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ、ＬＴＲ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＡＭＶ）、及びアデノ関連ウィルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）から単離されるが、これらに限らない。例として、レンチウィルスＬＴＲプロモーターは、１つの細胞において、五十万ものｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写物（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）（コピー）を生産することができる。また、薬剤感受性抑制体（ｄｒｕｇ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ、即ち、ｔＴＳ）をＲＮＡポリメラーゼプロモーターの前に挿入することによって、遺伝子サイレンシングエフェクターの転写速度を制御することも可能である。抑制因子は、化学薬剤、又は、Ｇ４１８、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）及びこれらの誘導体などから選ばれる抗生物質により抑制される。
【００１５】
また、幾つかのイントロン遺伝子サイレンシングエフェクターを発現する複数の導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ）及び／又はベクターを用いて、ｍｉｒ−３０２の標的遺伝子に対して遺伝子サイレンシング効果を実現してもよい。また、複数の遺伝子サイレンシングエフェクターは、１つのイントロンインサート（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｉｎｓｅｒｔ）によって生成することができる。例えば、ゼブラフィッシュ中のマイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を含有する抗ＥＧＦＰ（ａｎｔｉ−ＥＧＦＰ）イントロンの異所性発現（ｅｃｔｏｐｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）で、２種類の異なるサイズのｍｉＲＮＡ、即ち、ｍｉｒ−ＥＧＦＰ（２８２／３００）及びｍｉｒＲ−ＥＧＦＰ（２８０／３０２）が生成されるとの報告があった。これは、１つのＳｐＲＮＡｉインサートが複数の遺伝子サイレンシングエフェクターを生成できることを示している（Ｌｉｎ氏ら，（２００５）Ｇｅｎｅ３５６：３２−３８）。ある場合では、イントロン遺伝子サイレンシングエフェクターは標的遺伝子転写物（即ち、メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションすることで、２本鎖小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）を形成してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）二次効果を引き起こすことができる。これらの遺伝子サイレンシングエフェクターは導入遺伝子ベクターによって絶えず生成されるので、ＲＮＡのインビボにおける素早い分解の懸念が軽減される。この方策の利点は、ベクターによる形質移入又はウィルス感染の安定性によって、確実で長期的な遺伝子サイレンシング効果を提供することができることである。
【００１６】
一部の天然マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ）のステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造が過大及び／又は複雑でマイクロＲＮＡ発現系／ベクターに適合しないため、本発明者は、天然マイクロＲＮＡ前駆体のループに代わって、手動で再設計したメチオニルｔＲＮＡループ（ｔＲＮＡ^ｍｅｔループ、即ち５’−（Ａ／Ｕ）ＵＣＣＡＡＧＧＧＧＧ−３’）を用いる場合が多い。ｔＲＮＡ^ｍｅｔループは、天然ｍｉＲＮＡと同様な輸送メカニズムによって、Ｒａｎ−ＧＴＰ及びエクスポーチン−５（Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５）を介して、手動で再設計したｍｉＲＮＡを細胞核から細胞質への輸送を有効的に実行できる（Ｌｉｎ氏ら，２００５）。本発明の利点は、５’−ＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧ ＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）と５’ＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡ ＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）を含む人工改良した１対のマイクロＲＮＡ前駆体ループを使用することにより、手動で再設計したマイクロＲＮＡに天然ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと同じ核外への輸送（ｎｕｃｌｅｕｓ ｅｘｐｏｒｔ）効率をあげるとともに、ｔＲＮＡ輸出には干渉しないことができる。また、この改良は、ｍｉｒ−３０２ａ−ｍｉｒ−３０２ａ＊のデュプレックスとｍｉｒ−３０２ｃ−ｍｉｒ−３０２ｃ＊のデュプレックスの形成を促進し、ｍｉｒ−３０２ｓ全体的機能及び安定性を向上させることができる。これらの新しいマイクロＲＮＡ前駆体ループの設計はｔＲＮＡ^ｍｅｔループとｍｉｒ−３０２ｂ／ｍｉｒ−３０２ａの短鎖ステムループの組み合わせを修飾することによって完成され、そのうち、ｍｉｒ−３０２ｂ／ｍｉｒ−３０２ａの短鎖ステムループはヒトＥＳ細胞では高度に発現しているが、他の分化した組織細胞ではそうでない。従って、ｍｉｒ−３０２構造内のこれらの組換え／人造／人工ヘアピンループの使用は、人体での天然ｍｉＲＮＡ経路に干渉しないため、細胞毒性を低減させ、安全性を向上させる。
【００１７】
ｍｉｒ−３０２マイクロＲＮＡ前駆体ファミリークラスターは、合成されたｍｉｒ−３０２相同体のハイブリダイゼーション及び連鎖／ライゲーションによって形成され、５’末端から３’末端に向けてｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、及びｍｉｒ−３０２ｄ のｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ、図１Ｂ）の４つの部分を含む。これら全ての手動で再設計したｍｉｒ−３０２ ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ分子は、その５’末端配列の最初に、同じ１７ヌクレオチド［例えば、５’−ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣ ＣＡＵＧＵＵＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）］がある。Ｍｉｒ−３０２のマイクロＲＮＡ前駆体クラスターに使用される合成オリゴヌクレオチドとして、ｍｉｒ−３０２ａ−センス：５’−ＧＴＣＡＣＧＣＧＴＴ ＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴ ＡＡＡＣＧＴＧＧＡＴ ＧＴＡＣＴＴＧＣＴＴ ＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡ ＧＡＡＧＴＡＡＧＴＧ ＣＴＴＣＣＡＴＧＴＴ ＴＴＧＧＴＧＡＴＧＧ ＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴ Ｃ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９）、ｍｉｒ−３０２ａ−アンチセンス：５’−ＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡ ＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡ ＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡ ＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴ ＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣ ＡＡＡＧＣＡＡＧＴＡ ＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴ ＴＡＡＧＴＧＧＴＧＧ ＧＡＡＣＧＣＧＴＧＡ Ｃ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０）、ｍｉｒ−３０２ｂ−センス：５’−ＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴ ＣＧＣＴＣＣＣＴＴＣ ＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡ ＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴ ＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴ ＴＴＧＡＡＡＧＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＧ ＧＡＧＴＣＧＣＴＣＡ ＴＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１）、ｍｉｒ−３０２ｂ−アンチセンス：５’−ＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣ ＧＡＣＴＣＣＴＡＣＴ ＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡ ＡＧＣＡＣＴＴＡＣＴ ＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡ ＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣ ＴＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧ ＧＡＧＣＧＡＧＡＧＡ ＴＣＴＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２）、ｍｉｒ−３０２ｃ−センス：５’−ＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴ ＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴ ＴＡＡＣＡＴＧＧＡＧ ＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧ ＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧ ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＣ ＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴ ＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣ ＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３）、ｍｉｒ−３０２ｃ−アンチセンス：５’−ＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣ ＧＣＣＴＣＣＡＣＴＧ ＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡ ＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴ ＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡ ＣＡＧＣＡＧＧＴＡＣ ＣＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＡＡＧＣＡＡＡＧＧＴ ＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４）、ｍｉｒ−３０２ｄ−センス：５’−ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＡ ＴＡＡＣＡＣＴＣＡＡ ＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣ ＡＣＴＴＡＧＣＴＡＡ ＧＣＣＡＧＧＣＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴ ＴＣＧＣＧＡＴＣＧＣ ＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５）、及びｍｉｒ−３０２ｄ−アンチセンス，５’−ＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣ ＧＡＡＣＡＣＴＣＡＡ ＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣ ＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧ ＧＣＴＴＡＧＣＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴ ＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡ ＣＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６）を含む。また、手動で再設計した小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用してもよい。該手動で再設計した小ヘアピンＲＮＡは合成ｍｉｒ−３０２ｓ−センス：５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＧ ＡＧＧＴＡＣＣＧＡＣ ＧＣＧＴＣＣＴＣＴＴ ＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡ ＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＧＡＧＴＧＧ ＴＧＴＧＧＣＧＣＧＡ ＴＣＧＡＴＡＴＣＴＣ ＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣ ＡＣＡＴＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７） 及びｍｉｒ−３０２ｓ−アンチセンス：５’−ＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣ ＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴ ＡＴＣＧＡＴＣＧＣＧ ＣＣＡＣＡＣＣＡＣＴ ＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡ ＡＧＣＡＣＴＴＡＡＴ ＴＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＡＡＧＴＡＡＡＧＡＧ ＧＡＣＧＣＧＴＣＧＧ ＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡ ＴＣＴＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８）のハイブリダイゼーションによって形成され、ｍｉｒ−３０２ マイクロＲＮＡ前駆体クラスター（ｍｉｒ−３０２ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ ｃｌｕｓｔｅｒ）に代わって、簡単なイントロン挿入を行う。Ｍｉｒ−３０２小ヘアピンＲＮＡ（ｍｉｒ−３０２ ｓｈＲＮＡ）は、全ての天然ｍｉｒ−３０２メンバーと８５％よりも高い相同性を有し、同じヒト細胞遺伝子を標的とする。ｍｉｒ−３０２相同体の設計に当たって、ウラシルの代わりにチミンを使ってもよく、逆の場合も同様である。
【００１８】
ｍｉｒ−３０２のｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ前駆体のイントロン挿入（ｉｎｇｒｏｎｉｃ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）については、組換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子の挿入部位の側面において、それぞれ５’ 末端にＰｖｕＩ及び３’末端にＭｌｕＩ制限／クローニング部位があることから、最初のインサートを除去し、ｍｉｒ−３０２ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ前駆体のような様々なｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ前駆体インサートで置き換えることできる。ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ前駆体インサートはＰｖｕＩ及びＭｌｕＩ制限部位とマッチする付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄｓ）を有する。異なる遺伝子転写物を標的とするイントロンインサートを変えることで、本発明のイントロンｍｉｒ−３０２ｓ（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｍｉｒ−３０２ｓ）発現系は、インビトロ、エクスビボ及びインビボで標的遺伝子サイレンシングを誘発する強力なツールとして使用できる。イントロン挿入後、イントロン挿入部位にｍｉｒ−３０２を含有するこのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ導入遺伝子は更にドキシサイクリンにより誘導されるｐＳｉｎｇｌｅ−ｔＴＳ−ｓｈＲＮＡベクターの制限／クローニング部位（即ち、ＸｈｏＩ−ＨｉｎＤＩＩＩ制限／クローニング部位）に挿入され、細胞内で発現できるｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓ発現ベクターを形成する（図１Ａ）。
【００１９】
ｍｉｒ−３０２を発現する核酸組成物をヒト細胞に送達させる方法として、リポソーム／ポリソーム／化学的形質移入（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ／ｐｏｌｙｓｏｍａｌ／ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＮＡ組換え（ＤＮＡ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遺伝子銃による貫入（ｇｅｎｅ ｇｕｎ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）、トランスポゾン／レトロトランスポゾン挿入（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ／ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、ジャンピング遺伝子組み込み（ｊｕｍｐｉｎｇ ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ウィルス感染（ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、レトロウィルス／レンチウィルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ／ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、及びこれらの組み合わせから選ばれる非遺伝子組換え方法又は遺伝子組換え方法が用いられる。ランダムな導入遺伝子挿入及び細胞の突然変異のリスクを防ぐために、本発明は、リポソーム又はポリソーム形質移入法を用いて、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉｒ３０２ｓベクターを標的ヒト細胞（即ち、腫瘍／癌細胞）に送達することが好ましい。Ｍｉｒ−３０２ｓの発現は、各濃度のドキシサイクリンにおいて、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓベクターにおけるＴＲＥに制御されるＣＭＶプロモーターの活性化によって決められる。従って、本発明は、明確な薬剤（即ち、ドキシサイクリン）により行われる誘導性機構を提供することによって、ｍｉｒ−３０２ｓのインビトロ、エクスビボ、インビボでの発現を制御し、これも細胞内ＮＭＤシステム以外の第２の保護手段である。ドキシサイクリンによる制御の結果、我々は被験細胞において、ＲＮＡ蓄積又は過飽和による細胞毒性を検出しなかった。また、本発明は、所定の期間内にｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターを持続的に発現することができる持続的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）ｍｉｒ−３０２発現系を提供する。ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターの発現は、ＣＭＶプロモーターにより駆動されることが好ましい。該ＣＭＶプロモーターは通常、ヒト細胞内で１ヶ月の活性化状態を経てＤＮＡメチル化によってサイレンシングされる。その１ヶ月の活性化機構は、処理された細胞におけるＲＮＡ蓄積又は過飽和による細胞毒性を防止できるため、癌の治療に有益である。
【００２０】
要するに、本発明は新規設計及び施策を採用し、形質移入した細胞に誘導的又は持続的にｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターを発現することができる。ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターは、ｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、ｍｉｒ−３０２ｄとこれらのヘアピン様マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ）、手動で再設計した小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）相同体／誘導体、及びこれらの組み合わせを含む。好ましい実施例では、本発明は標的細胞において、ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターに送達、転写及びプロセシングされることで、ｍｉｒ−３０２の標的となる細胞周期調節因子及び発癌遺伝子の特定遺伝子サイレンシング効果を誘発する組換え核酸組成物の設計及び方法を提供し、ａ）少なくとも１つの遺伝子サイレンシングエフェクターに送達、転写及びプロセシングされることで、ｍｉｒ−３０２の標的となる複数の細胞遺伝子を干渉する組換え核酸組成物を提供する工程、とｂ）該組換え核酸組成物で細胞基質を処理する工程を含む。ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターの転写は持続的プロモーター（即ち、ＣＭＶ）又は薬剤誘導性プロモーター（即ち、ＴＲＥ−ＣＭＶ）によって駆動される。該薬剤誘導性組換え核酸組成物は、Ｔｅｔ−Ｏｎベクターであって、組換えｍｉｒ−３０２フミリークラスター（ｍｉｒ−３０２ｓ、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯｓ．９〜１６の雑種）又は手動で再設計したｍｉｒ−３０２小ヘアピンＲＮＡ相同体（ｓｈＲＮＡ、即ち、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯｓ．１７と１８との雑種）が挿入された組換え遺伝子を含むことが好ましい。該細胞基質はインビトロ、エクスビボ又はインビボでｍｉｒ−３０２の標的遺伝子を発現させることができる。本発明は、ｍｉｒ−３０２の標的となる細胞周期調節因子及び発癌遺伝子をサイレンシングすることによって、細胞腫瘍形成能力を抑制することができ、処理された細胞を非腫瘍／癌細胞に再プログラムすることができる。
【００２１】
本発明は、６つの分野でｍｉｒ−３０２媒介の腫瘍／癌の治療が成功したことを証明した。第１に、ｍｉｒ−３０２を正常ヒト細胞（ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ）に形質移入することにより、細胞周期が減衰するが、アポトーシス又は細胞死を引き起こさない（図１Ｄ−Ｆと図３Ａ−Ｃ）。第２に、ｍｉｒ−３０２を正常ヒト細胞に形質移入することにより、細胞を幹細胞様状態へ再プログラムすることができ、損傷組織の治療に有益である（図４Ａ−Ｂと図５Ａ−Ｄ）。第３に、ｍｉｒ−３０２を腫瘍／癌細胞（ｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７、ｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２及びｍｉｒＰＳ−ＮＴｅｒａ２）に形質移入することにより、腫瘍／癌細胞の腫瘍形成能力を強力に抑制し、＞９８％のアポトーシス又は細胞死を引き起こすことができる（図６Ａ−Ｅ）。第４に、ｍｉｒ−３０２は、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）、サイクリンＤ１／Ｄ２（ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１／Ｄ２）とＢＭＩ−１のような複数の細胞周期調節因子を共抑制するのみならず、腫瘍抑制因子であるｐ１６ＩＮＫ４ａ及びｐ１４／ｐ１９Ａｒｆを活性化することによっても、腫瘍／癌細胞の形成を抑制できる（図７Ａ−Ｄ）。第５に、インビボでｍｉｒ−３０２を腫瘍に送達することによって、＞９０％の腫瘍細胞の成長を抑制することができる（図８Ａ−Ｃ）。最後に、ｍｉｒ−３０２はテロメア短縮（ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）による細胞老化（ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）を引き起こすことはない（図９Ａ−Ｃ）。また、本発明者は、ポリソーム／リポソーム（ｐｏｌｙｓｏｍｅ／ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を用いて、ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターをインビボの標的腫瘍細胞に形質移入するに成功し、レトロウィルス感染及び組換え遺伝子突然変異というリスクを予防することができた（図８Ａ−Ｃ）。これらの知見は、ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターを腫瘍／癌治療の治療薬及び／又はワクチンとして使用できる強力な証拠を提供した。また、ｍｉｒ−３０２はヒト細胞の幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を回復させる機能をも有しているため（Ｌｉｎ氏ら，２００８）、本発明は幹細胞及び癌治療の両方への適用に有益である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｆは誘導性のｍｉｒ−３０２発現及び正常ヒト毛嚢細胞（ｈＨＦＣ）を増殖する効果を示す。（Ａ）ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）により誘導可能なｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴｓ−ｍｉＲ３０２ｓベクターの構造。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｆは誘導性のｍｉｒ−３０２発現及び正常ヒト毛嚢細胞（ｈＨＦＣ）を増殖する効果を示す。（Ｂ）ｍｉｒ−３０２ファミリー（ｍｉｒ−３０２ｓ）の構造。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｆは誘導性のｍｉｒ−３０２発現及び正常ヒト毛嚢細胞（ｈＨＦＣ）を増殖する効果を示す。（Ｃ）１０μＭドキシサイクリン（Ｄｏｘ）により処理され（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）、６時間経過後、誘導発現されたｍｉｒ−３０２をマイクロＲＮＡマイクロアレイ分析した結果。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｆは誘導性のｍｉｒ−３０２発現及び正常ヒト毛嚢細胞（ｈＨＦＣ）を増殖する効果を示す。（Ｄ）コア再プログラム転写因子Ｏｃｔ３／４−Ｓｏｘ２−Ｎａｎｏｇとメラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ）のマーカー遺伝子ＴＲＰ１のタンパク質産物、サイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １６）の発現パターンに対するｍｉｒ−３０２の用量依存的な効果をノーザン及びウェスタンブロット分析法で分析した（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。
【図１Ｅ】図１Ａ〜Ｆは誘導性のｍｉｒ−３０２発現及び正常ヒト毛嚢細胞（ｈＨＦＣ）を増殖する効果を示す。（Ｅ）ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ細胞集団の有糸分裂期（Ｍ期）と休眠期（Ｇ０／Ｇ１期）の変化に対するｍｉｒ−３０２の用量依存的な効果を示すフローサイトメトリー分析結果の棒グラフ。
【図１Ｆ】図１Ａ〜Ｆは誘導性のｍｉｒ−３０２発現及び正常ヒト毛嚢細胞（ｈＨＦＣ）を増殖する効果を示す。（Ｆ）１０μＭドキシサイクリン（Ｄｏｘ）による処理後、各ｍｉｒＰＳ細胞株におけるｍｉｒ−３０２の誘導によるアポトーシスＤＮＡ断裂のＤＮＡラダーリング（ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）の特徴。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｃはｍｉｒ−３０２ｓの生合成及びｍｉｒ−ＰＳ細胞の生成を示す。（Ａ）イントロンｍｉｒ−３０２の生合成機構。ｍｉｒ−３０２ファミリーは、赤色蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ）とともに転写され、更にスプライソーム複合体（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）及び細胞質酵素であるエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）ダイサー（Ｄｉｃｅｒｓ）によって、単独のｍｉｒ−３０２メンバーにスプライスされる。そのうち、赤色蛍光タンパク質をｍｉｒ−３０２生成量の指標とする。１倍の赤色蛍光タンパク質濃度は４倍のｍｉｒ−３０２生産量濃度に相当する。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｃはｍｉｒ−３０２ｓの生合成及びｍｉｒ−ＰＳ細胞の生成を示す。（Ｂ）はリポソーム／ポリソーム／電気穿孔法により、ｍｉｒ−３０２を形質移入する工程を示す。誘導性のｍｉｒ−３０２発現ベクターｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴｓ−ｍｉＲ３０２ｓ（図１Ａ）は低浸透圧ｐＨ緩衝液（２００μｌ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において、３００〜４００Ｖで１５０μｓｅｃの電気穿孔法によって、成熟（ａｄｕｌｔ）ｈＨＦＣ細胞に導入された。試験毎に１０μｇのｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴｓ−ｍｉＲ３０２ｓを用いて、２つのヒト毛嚢（真皮乳頭）由来の培養された２００，０００個のｈＨＦＣ細胞に形質移入した。ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｌｉｎｅ，Ｄｏｘ）により誘導されて、発現された後、ｍｉｒ−３０２の生合成は天然のイントロンマイクロＲＮＡ（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｍｉＲＮＡ）経路に基づいた。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｃはｍｉｒ−３０２ｓの生合成及びｍｉｒ−ＰＳ細胞の生成を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｃは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ＝５又は１０μｇ）により誘導された後に発現されたｍｉｒ−３０２がｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ細胞特性に対して起こした変化を示す。（Ａ）はドキシサイクリンにより細胞の再プログラムを誘導する前後、細胞形態と細胞周期の速度の変化である。各細胞周期段階に対応するＤＮＡ含量のフローサイトメトリー分析結果を細胞形態学の上方にグラフで示す（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）。グラフにおいて、第１（左）と第２（右）のピークは、それぞれ全ての被験細胞集団に対する休止期（Ｇ０／Ｇ１）細胞及び有糸分裂期（Ｍ）細胞の比率を示す。目盛尺＝１００μｍ。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｃは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ＝５又は１０μｇ）により誘導された後に発現されたｍｉｒ−３０２がｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ細胞特性に対して起こした変化を示す。（Ｂ）は限界希釈後、単一のｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ細胞が胚性様体（ＥＢ）を形成する時間経過である。細胞周期は、最初では２０〜２４時間であったが、７２時間後に徐々に加速したと推測される。目盛尺＝１００μｍ。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｃは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ＝５又は１０μｇ）により誘導された後に発現されたｍｉｒ−３０２がｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ細胞特性に対して起こした変化を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、多能性マーカーの発現の分析及びインビボでの多能性分化と同化を示す。（Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）マーカー遺伝子がｍｉｒＰＳ細胞において高濃度のｍｉｒ−３０２により誘導された後の発現パターンと、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）マーカー遺伝子がヒト胚性幹細胞であるＷＡ０１−Ｈ１（Ｈ１）及びＷＡ０９−Ｈ９（Ｈ９）における発現パターンとのノーザンブロット分析による比較の結果（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。７．５μＭドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処理後のｍｉｒＰＳ細胞におけるｍｉｒ−３０２の濃度は、Ｈ１とＨ９細胞における濃度より３０％高くなり（未処理のｈＨＦＣの＞３０倍）、主要な多能性マーカーであるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８及び未分化胚性細胞転写因子１（ＵＴＦ１）の共発現を誘発し始めた。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、多能性マーカーの発現の分析及びインビボでの多能性分化と同化を示す。（Ｂ）ｍｉｒＰＳ細胞を免疫不全ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスに移植してから１週間経過後、ｍｉｒＰＳ細胞により分化された組織が注射部位付近の周辺組織に同化された。白い矢印は注射の方向を示す。境界板（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｄｉｓｋｓ）の位置は黄色い三角形で標記する。ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ由来の組織腫瘍はマウスの子宮及び腹膜腔以外の器官／組織で成長することはない。更に、我々は移植後１週間経過時、解剖を行い、注射部位の周辺の組織形成を検査した。解剖の前日にマウスに尾静脈から１０μｇドキシサイクリンをマウスに与えた。腹腔内注射後に形成された腸上皮組織、心臓注射後の心筋、及び背側脇腹（ｄｏｒｓａｌ ｆｌａｎｋ）に注射後に形成された骨格筋を含み、ＲＧＦＰ陽性を呈するｍｉｒＰＳ細胞が注射部位の周辺組織の細胞と同じ種類の細胞に分化したことが我々に観察された。また、同化されたｍｉｒＰＳ細胞も、例えば、腸上皮のＭＵＣ２、心筋のトロポニンＴ２（ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ ｔｙｐｅ ２、ｃＴｎＴ）、及び骨格筋のミオシン重鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、ＭＨＣ）という周辺組織と同様な組織特異性マーカーを発現した。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｄは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ＝１０μＭ）の誘導によりｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓがヒト胚性様幹細胞（ｈＥＳ−ｌｉｋｅ）の特性を得たことを示す。（Ａ）ヒトゲノム遺伝子チップ（Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｕ１３３ ｐｌｕｓ ２．０ ａｒｒａｙ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、ｍｉｒ−３０２により誘導される体細胞の再プログラム（ＳＣＲ）前後の全遺伝子発現パターンを分析した結果（ｎ＝５、ｐ＜０．０１〜０．０５）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｄは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ＝１０μＭ）の誘導によりｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓがヒト胚性様幹細胞（ｈＥＳ−ｌｉｋｅ）の特性を得たことを示す。（Ｂ）制限酵素ＨｐａＩＩにより切断された後、比較的小さいＤＮＡ断片の存在と増加は、５μＭではなく１０μＭのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）による処理後、ｍｉｒＰＳ細胞におけるゲノム全体範囲の全ＣｐＧメチル化の大幅減少を証明した。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｄは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ＝１０μＭ）の誘導によりｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓがヒト胚性様幹細胞（ｈＥＳ−ｌｉｋｅ）の特性を得たことを示す。（Ｃ）重亜硫酸塩ＤＮＡ配列決定法によりＯｃｔ３／４とＮａｎｏｇのプロモーター領域の配列を決定して得られた詳細なメチル化地図である。黒い円形と白い円形は、それぞれメチル化と非メチル化のシトシン部位を表している。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｄは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ＝１０μＭ）の誘導によりｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓがヒト胚性様幹細胞（ｈＥＳ−ｌｉｋｅ）の特性を得たことを示す。（Ｄ）ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓにより多能性分化された奇形腫様組織嚢腫（ｔｅｒａｔｏｍａ−ｌｉｋｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｙｓｔｓ）は３つの胚性細胞層（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒｓ）に由来する各種の組織を含む。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｅは、１０μＭドキシサイクリン（Ｄｏｘ）がｍｉｒ−３０２を誘導して発現させた後、各種の腫瘍／癌細胞に由来するｍｉｒＰＳ細胞のインビトロ腫瘍形成能力の分析を示す。（Ａ）は、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）により細胞の再プログラムを誘導する前後、細胞形態と細胞周期の速度の変化である。各細胞周期段階に対応するＤＮＡ含量のフローサイトメトリー分析結果を細胞形態学の上方にグラフで示す（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｅは、１０μＭドキシサイクリン（Ｄｏｘ）がｍｉｒ−３０２を誘導して発現させた後、各種の腫瘍／癌細胞に由来するｍｉｒＰＳ細胞のインビトロ腫瘍形成能力の分析を示す。（Ｂ）ｍｉｒＰＳ細胞集団の有糸分裂（Ｍ期）と休眠（Ｇ０／Ｇ１期）の変化に対するｍｉｒ−３０２の用量依存的な効果を示すフローサイトメトリー分析結果の棒グラフ。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｅは、１０μＭドキシサイクリン（Ｄｏｘ）がｍｉｒ−３０２を誘導して発現させた後、各種の腫瘍／癌細胞に由来するｍｉｒＰＳ細胞のインビトロ腫瘍形成能力の分析を示す。（Ｃ）Ｍｉｒ−３０２の腫瘍（及び／又は癌細胞）の抑制はＭａｔｒｉｇｅｌチャンバー中で現れた侵入行為の機能性の分析（ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｅは、１０μＭドキシサイクリン（Ｄｏｘ）がｍｉｒ−３０２を誘導して発現させた後、各種の腫瘍／癌細胞に由来するｍｉｒＰＳ細胞のインビトロ腫瘍形成能力の分析を示す。（Ｄ）ドキシサイクリン誘導のｍｉｒ−３０２の発現前と発現後、細胞がヒト骨髄内皮細胞（ｈＢＭＥＣｓ）単層に接着する比率の比較結果（ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。
【図６Ｅ】図６Ａ〜Ｅは、１０μＭドキシサイクリン（Ｄｏｘ）がｍｉｒ−３０２を誘導して発現させた後、各種の腫瘍／癌細胞に由来するｍｉｒＰＳ細胞のインビトロ腫瘍形成能力の分析を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｄはルシフェラーゼ３’末端非翻訳レポーター遺伝子アッセイ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ３’−ＵＴＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ）により、標的となるＧ１チェックポイント調節因子（Ｇ１−ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）においてｍｉｒ−３０２が誘発した遺伝子サイレンシング効果を示す。（Ａ）ルシフェラーゼ３’末端非翻訳レポーター遺伝子の構造は３’末端非翻訳領域に２つの正常（Ｔ１＋Ｔ２）の、２つの突然変異（Ｍ１＋Ｍ２）の、又は正常と突然変異による混合（Ｔ１＋Ｍ２又はＭ１＋Ｔ２）のｍｉｒ−３０２の標的部位がある。突然変異部位は、正常の標的部位と一致する３’−ＣＴＴ末端の代わりに、ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）するＴＣＣモチーフを含有する。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｄはルシフェラーゼ３’末端非翻訳レポーター遺伝子アッセイ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ３’−ＵＴＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ）により、標的となるＧ１チェックポイント調節因子（Ｇ１−ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）においてｍｉｒ−３０２が誘発した遺伝子サイレンシング効果を示す。（Ｂ）ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）が誘導したｍｉｒ−３０２の発現はルシフェラーゼの発現に対する影響（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。Ｄｏｘ濃度＝５又は１０μＭ。ＣＣＮＤ１とＣＣＮＤ２は、それぞれサイクリンＤ１とサイクリンＤ２を示す。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｄはルシフェラーゼ３’末端非翻訳レポーター遺伝子アッセイ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ３’−ＵＴＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ）により、標的となるＧ１チェックポイント調節因子（Ｇ１−ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）においてｍｉｒ−３０２が誘発した遺伝子サイレンシング効果を示す。（Ｃ）と（Ｄ）はウェスタンブロット分析法で高濃度（１０μＭ Ｄｏｘ）と低濃度（５μＭ Ｄｏｘ）のｍｉｒ−３０２誘導において、ｍｉｒ−３０２の主要な標的となるＧ１チェックポイント調節因子がｍｉｒＰＳ細胞、及びヒト胚性幹細胞であるＷＡ０１−Ｈ１（Ｈ１）とＷＡ０９−Ｈ９（Ｈ９）における変化の比較結果（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）。
【図７Ｄ】図７Ａ〜Ｄはルシフェラーゼ３’末端非翻訳レポーター遺伝子アッセイ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ３’−ＵＴＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ）により、標的となるＧ１チェックポイント調節因子（Ｇ１−ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）においてｍｉｒ−３０２が誘発した遺伝子サイレンシング効果を示す。（Ｃ）と（Ｄ）はウェスタンブロット分析法で高濃度（１０μＭ Ｄｏｘ）と低濃度（５μＭ Ｄｏｘ）のｍｉｒ−３０２誘導において、ｍｉｒ−３０２の主要な標的となるＧ１チェックポイント調節因子がｍｉｒＰＳ細胞、及びヒト胚性幹細胞であるＷＡ０１−Ｈ１（Ｈ１）とＷＡ０９−Ｈ９（Ｈ９）における変化の比較結果（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）。
【図８】図８Ａ〜Ｃはインビボでの腫瘍形成能力の分析は、ｍｉｒＰＳ−ＮＴｅｒａ２細胞が持続的発現のｍｉｒ−３０２ｓ（ＮＴｅｒａ２＋ｍｉｒ−３０２ｓ）又はｍｉｒ−３０２ｄ＊（ＮＴｅｒａ２＋ｍｉｒ−３０２ｄ＊）（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）に対する反応を示す。形質移入された腫瘍細胞ＮＴｅｒａ−２中のｍｉｒ−３０２ｓとｍｉｒ−３０２ｄ＊は、それぞれｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓベクター及びｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｄ＊ベクターから転写された。（Ａ）インサイチュー注射（ｐｏｓｔ−ｉｓ）を実施して３週間経過後、平均の腫瘍サイズに対して形態学評価を行った。全ての腫瘍は本来の移入部位に位置した（黒い矢印が指す所）。いずれの被験マウス（雄性、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ品種）でも、悪液質又は腫瘍転移の徴候は観察されなかった。（Ｂ）ノーザンブロット分析とウェスタンブロット分析及び（Ｃ）免疫組織化学染色分析の図により、インビボでｍｉｒ−３０２がコア再プログラム転写因子Ｏｃｔ３／４−Ｓｏｘ−Ｎａｎｏｇとｍｉｒ−３０２の標的となるＧ１チェックポイント調節因子であるサイクリン依存キナーゼ２（ＣＤＫ２）、サイクリンＤ１／Ｄ２（ｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２）、ＢＭＩ−１、及びｐ１６Ｉｎｋ４ａとｐ１４Ａｒｆの発現パターンに対する効果を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜Ｃはインビボでの腫瘍形成能力の分析は、ｍｉｒＰＳ−ＮＴｅｒａ２細胞が持続的発現のｍｉｒ−３０２ｓ（ＮＴｅｒａ２＋ｍｉｒ−３０２ｓ）又はｍｉｒ−３０２ｄ＊（ＮＴｅｒａ２＋ｍｉｒ−３０２ｄ＊）（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）に対する反応を示す。形質移入された腫瘍細胞ＮＴｅｒａ−２中のｍｉｒ−３０２ｓとｍｉｒ−３０２ｄ＊は、それぞれｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓベクター及びｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｄ＊ベクターから転写された。（Ｂ）ノーザンブロット分析とウェスタンブロット分析及び（Ｃ）免疫組織化学染色分析の図により、インビボでｍｉｒ−３０２がコア再プログラム転写因子Ｏｃｔ３／４−Ｓｏｘ−Ｎａｎｏｇとｍｉｒ−３０２の標的となるＧ１チェックポイント調節因子であるサイクリン依存キナーゼ２（ＣＤＫ２）、サイクリンＤ１／Ｄ２（ｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２）、ＢＭＩ−１、及びｐ１６Ｉｎｋ４ａとｐ１４Ａｒｆの発現パターンに対する効果を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｃは１０μＭドキシサイクリンにより誘導されるｍｉｒ−３０２の発現において、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣと各種腫瘍／癌細胞に由来するｍｉｒＰＳ細胞株のテロメラーゼの活性分析を示す。（Ａ）テロメアリピート増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）法でテロメラーゼの活性を分析した（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。テロメラーゼの活性はＲＮａｓｅ処理に影響される（ｈＨＦＣ＋ＲＮａｓｅ）。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｃは１０μＭドキシサイクリンにより誘導されるｍｉｒ−３０２の発現において、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣと各種腫瘍／癌細胞に由来するｍｉｒＰＳ細胞株のテロメラーゼの活性分析を示す。（Ｂ）ウェスタンブロット法により、各種ｍｉｒＰＳ細胞株におけるヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の発現は一致的に増加するが、ＡＯＦ２とＨＤＡＣ２の発現は減少することを証明した（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｃは１０μＭドキシサイクリンにより誘導されるｍｉｒ−３０２の発現において、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣと各種腫瘍／癌細胞に由来するｍｉｒＰＳ細胞株のテロメラーゼの活性分析を示す。（Ｃ）テロメラーゼＰＣＲ ＥＬＩＳＡ試験でテロメラーゼの活性を測定した（ＯＤ４７０−ＯＤ６８０；ｎ＝３、ｐ＜０．０１）。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｄの分析結果により、標的となる後成的遺伝子（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｇｅｎｅ）に対するｍｉｒ−３０２のサイレンシング効果を示した。（Ａ）ルシフェラーゼ３’末端非翻訳領域レポーター遺伝子の構造は、３’末端非翻訳領域に２つの正常の（Ｔ１＋Ｔ２）、２つの突然変異の（Ｍ１＋Ｍ２）、又は正常と突然変異混合の（Ｔ１＋Ｍ２又はＭ１＋Ｔ２）ｍｉｒ−３０２の標的部位がある。突然変異部位は正常の標的部位と一致する３’−ＣＴＴ末端の代わりに、ミスマッチＴＣＣモチーフを含有する。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｄの分析結果により、標的となる後成的遺伝子（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｇｅｎｅ）に対するｍｉｒ−３０２のサイレンシング効果を示した。（Ｂ）ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）により誘導して発現されたｍｉｒ−３０２はルシフェラーゼの発現に対する影響（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｄの分析結果により、標的となる後成的遺伝子（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｇｅｎｅ）に対するｍｉｒ−３０２のサイレンシング効果を示した。（Ｃ）と（Ｄ）はウェスタンブロット分析法で、高濃度（１０μＭ Ｄｏｘ）と低濃度（５μＭ Ｄｏｘ）のｍｉｒ−３０２の誘導で、ｍｉｒ−３０２の主要な標的外遺伝子はｍｉｒＰＳ細胞、及びヒト胚性幹細胞であるＷＡ０１−Ｈ１（Ｈ１）及びＷＡ０９−Ｈ９（Ｈ９）における変化の比較結果（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜Ｄの分析結果により、標的となる後成的遺伝子（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｇｅｎｅ）に対するｍｉｒ−３０２のサイレンシング効果を示した。（Ｃ）と（Ｄ）はウェスタンブロット分析法で、高濃度（１０μＭ Ｄｏｘ）と低濃度（５μＭ Ｄｏｘ）のｍｉｒ−３０２の誘導で、ｍｉｒ−３０２の主要な標的外遺伝子はｍｉｒＰＳ細胞、及びヒト胚性幹細胞であるＷＡ０１−Ｈ１（Ｈ１）及びＷＡ０９−Ｈ９（Ｈ９）における変化の比較結果（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）。
【図１１】図１１はｍｉｒ−３０２媒介の体細胞再プログラム（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ、ＳＣＲ）と細胞周期調節機能の概略図である。現在までの研究に基づき、我々は平行する２つの事象を発見した。第１に、ｍｉｒ−３０２は、多種の後成的遺伝子調節因子（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）であるＡＯＦ１／２、ＭＥＣＰ１／２及びＨＤＡＣ２に対する強力なサイレンシング作用によって再プログラムを開始するとともに、全ゲノムＤＮＡの脱メチル化を引き起こすことで、さらにＳＣＲを誘発するのに必要とする（灰色標識）ヒト胚性幹細胞の細胞マーカー遺伝子を活性化する。第２に、Ｇ１チェックポイント調節因子サイクリン依存キナーゼ（ＣＤＫ２）、サイクリンＤ１／Ｄ２（ｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２）とＢＭＩ−１の共抑制及びｐ１６Ｉｎｋ４ａとｐ１４／ｐ１８Ａｒｆの活性化によって、細胞周期の減衰を引き起こすることで、ＳＣＲに備える（黒色標識）ように全細胞活動を抑制する。休眠期（Ｇ０／Ｇ１）の静止も可能なランダム成長（ｒａｎｄｏｍ ｇｒｏｗｔｈ）及び／又は再プログラムされた多能性幹細胞の腫瘍様形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を防止することができる。要するに、これら２つの事象の協同効果の結果は、より精確且つ安全な再プログラムプロセスと、早熟（ｐｒｅ−ｍａｔｕｒｅ）及び腫瘍の形成も抑制できるという結果をもたらした。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
下記の図面は挙げた例の説明のみに使用され、本発明を制限するものではない。
図を参考しながら本発明の特定の具体的実施形態を説明するが、これらの具体的実施形態は例示に過ぎず、本発明の原理の応用を代表する例であることを理解すべきである。当技術分野を熟知しているものであれば、簡単に種々の変更や修飾ができるので、これらの変更や修飾は特許請求の範囲に含むと見なすべきである。
【００２４】
本発明は、新しい核酸組成物、及び組換えのｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターを利用してヒト腫瘍細胞／癌細胞の増殖と腫瘍形成を抑制する方法を提供する。従来の小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の設計と異なり、本発明に係る小ヘアピンＲＮＡは、天然ｍｉｒ−３０２ｓの前駆体（ｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ｓ）に類似するミスマッチステムアーム（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｓｔｅｍ−ａｒｍ）を含む。また、本発明に係る小ヘアピンＲＮＡは、改良されたｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ステムループである５’−ＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧ ＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）及び５’−ＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡ ＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）を含み、該ｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ステムループはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の輸送に干渉せずに天然マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）と同様な核外への輸送効率を提供できる。いかなる特定の理論に制限されず、本発明の抗増殖性と抗腫瘍形成の効果は、新たに発見されたｍｉｒ−３０２ファミリークラスター（ｍｉｒ−３０２ｓ）又はｍｉｒ−３０２と相同な小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現できる組換え核酸組成物を形質移入することによって引き起こされるｍｉｒ−３０２媒介の遺伝子サイレンシングメカニズムを示す。全ての手動で再設計したｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ分子は、その５’末端配列の最初の１７個のヌクレオチドに、同様な配列である５’−ＵＡＡＧＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）を有する。ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクター、及びｍｉｒ−３０２を発現する核酸組成物を構築する工程は実施例２及び３において記述する。ｍｉｒ−３０２と相同な配列を設計する際、ウラシル（Ｕ）に代わってチミン（Ｔ）を用いてもよい。
【００２５】
ヒト細胞周期においてｍｉｒ−３０２の役割を位置づけるために、我々は誘導性のｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴｓ−ｍｉＲ３０２ｓ発現ベクターを設計し（図１Ａ、実施例２）、正常のヒト癌細胞中に形質移入した。Ｍｉｒ−３０２ｓはｈＥＳ特有のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ファミリーであり、ファミリークラスターにｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、ｍｉｒ−３０２ａ及びｍｉｒ−３０２ｄ（ｍｉｒ−３０２ｓ、図１Ｂ）という４つの小型非コードＲＮＡメンバーが含まれる（Ｓｕｈ氏ら，２００４）。本発明では、ｍｉｒ−３０２ｓの発現は、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の刺激下で、テトラサイクリン応答要素（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ−ｅｌｅｍｅｎｔ、ＴＲＥ）により制御されるサイトメガロウィルスプロモーター（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒａｌ （ＣＭＶ）ｐｒｏｍｏｔｅｒ）によって駆動される。形質移入後、ｍｉｒ−３０２の生合成は天然のイントロンマイクロＲＮＡ生合成の経路に基づいて行われ、その内、ｍｉｒ−３０２が赤色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子（ＲＧＦＰ）とともに転写され、スプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍａｌ）及び細胞質のエンドヌクレオチドＲＮａｓｅＩＩＩダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって単独のｍｉｒ−３０２メンバーにスプライスされる（図２Ａ）（Ｌｉｎ氏ら，２００８）。定量上では、１倍のＲＧＦＰ濃度が４倍のｍｉｒ−３０２濃度に相当する。マイクロＲＮＡのマイクロアレイ分析によって、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の刺激下、ｍｉｒ−３０２ｂ＊以外の全てのｍｉｒ−３０２メンバーが形質移入された細胞において有効的に発現することを確認した（図１Ｃ、実施例３）。ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓ発現ベクターで細胞を形質移入する工程については図２Ｂ−Ｃにおいて概略に記述する。
【００２６】
例えば、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴｓ−ｍｉＲ３０２ｓのようなｍｉｒ−３０２を発現する核酸組成物は、真核細胞における翻訳効率を向上させるＫｏｚａｋ翻訳開始共通配列（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）、ｍｉｒ−３０２を発現させる構造物（ｍｉｒ−３０２ ｃｏｎｓｔｒｕｔ）の下流側に位置する複数のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ）、原核細胞増殖のためのｐＵＣ複製起点、ｍｉｒ−３０２を発現させる構造物（即ち、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ）を該核酸組成物に組み込むための少なくとも２箇所の制限部位、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現させるほ乳類細胞において複製に必要とする選択的ＳＶ４０複製起点、及び複製可能な原核細胞で抗生物質耐性遺伝子を発現させるための選択的ＳＶ４０初期プロモーターを含む。抗生物質耐性遺伝子の発現は、導入遺伝子発現で陽性クローニングを単離するための選択的マーカーとして用いられる。これらの抗生物質は、Ｇ４１８、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ペニシリンＧ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ）、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、スペクトロマイシン（ｓｐｅｃｔｒｏｍｙｃｉｎ）、フォフォマイシン（ｐｈｏｐｈｏｍｙｃｉｎ）、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、リファピシン（ｒｉｆａｐｉｃｉｎ）、アンホテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、セファロチン（ｃｅｐｈａｌｏｔｈｉｎ）、チロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）、及びこれらの組み合わせから選ばれる。
【００２７】
Ｍｉｒ−３０２はアポトーシスを起こさずに正常細胞の細胞周期を減衰させる
我々の過去の研究では、ヒト黒色腫細胞Ｃｏｌｏ−８２９及び前立腺癌細胞ＰＣ３において、ｍｉｒ−３０２発現の増加はこれらの悪性癌細胞をｈＥＳ様の多能性の（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）状態に再プログラムができることを示した（Ｌｉｎ氏ら， ２００８）。体細胞の再プログラム（ＳＣＲ）の過程において、ｍｉｒ−３０２が９８％より多くの（＞９８％）癌細胞のアポトーシスを引き起こすとともに、さらに、残りの（＜２％）再プログラム細胞の増殖速度を大幅に低減した。確かにこれらの特性は癌治療に有益だが、ｍｉｒ−３０２が正常ヒト細胞における機能はまだ確実ではない。その効果を評価するために、我々は誘導性ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴｓ−ｍｉＲ３０２ｓ発現ベクターを正常ヒト毛嚢細胞（ｈＨＦＣｓ）中に導入させた。ｈＨＦＣｓを選んだ理由は、量が十分で、到達性を有し、且つ成長が速いことにある。我々は、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の濃度が１０μＭまで増加することにつれ、ドキシサイクリン濃度が７．５μＭより濃い（＞７．５μＭ）（図１Ｄ、実施例５）閾値において、コア再プログラム因子（ｃｏｒｅ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２−Ｎａｎｏｇが一斉に促進されるとともに、増殖性の細胞クラスターが７０％減少し、即ち、本来の３７％±２％から１１％±２％まで減少した（図１Ｅ、Ｍ期、実施例７）ことを観察できた。それに応じて、休眠細胞クラスターが４１％増加し、即ち、本来の５６％±３％から７９％±５％までに増加し（図１Ｅ、Ｇ０／Ｇ１期、実施例７）、我々が以前、ｍｉｒ−３０２によって再プログラムされた多能性幹細胞（ｍｉｒ−３０２−ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）において発見された（ｍｉｒＰＳ ｃｅｌｌｓ，Ｌｉｎ氏ら，２００８）強力な抗増殖作用と相似することを示唆した。しかし、ｍｉｒ−３０２により再プログラムされたｈＨＦＣ細胞（ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ）はアポトーシスを測定できるＤＮＡラダーリング（ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）又は細胞死のいずれの徴候も示さない（図１Ｆ、実施例６）ことから、腫瘍／癌細胞と比較して、正常細胞のほうがよりｍｉｒ−３０２による抗増殖作用を耐えられることを示した。腫瘍／癌細胞はその旺盛な新陳代謝及び急速な成長拡張に伴い、このような休眠状態における生存が極めて困難となると考えられる。
【００２８】
注意すべきなのは、７．５μＭより高い濃度のドキシサイクリンで処理した後、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣの形態は、紡錘状から休眠細胞様の球状に変わったことである（図３Ａ−Ｂ、赤色ＲＧＦＰ陽性細胞）。７．５μＭドキシサイクリンの刺激下で生成された細胞のｍｉｒ−３０２濃度はヒト胚性幹細胞Ｈ１及びＨ９細胞中のｍｉｒ−３０２濃度水準の約１．３倍である（図４Ａ、実施例４）。このより高い濃度水準下で、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びその他の標準ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）マーカーを強く発現した（図４Ａ）。全遺伝子発現のマイクロアレイ分析では、約半分のトランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）がｈＨＦＣ体細胞のパターンからｈＥＳ様の発現パターンに変化し、且つ、Ｈ１／Ｈ９細胞と９３％よりも高い相似性を有することが更に示された（図５Ａ、実施例８）。体細胞の再プログラム（ＳＣＲ）開始の最初の徴候である全ゲノムＤＮＡの脱メチル化は、これらのｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓにおいても明確に測定でき、脱メチル化のパターンもＨ１／Ｈ９細胞中のと同じである（図５Ｂ及び５Ｃ、実施例９）。また、個々のｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣ細胞は胚様体と類似する単一のコロニーに成長するとともに、１サイクルあたり２０〜２４時間の細胞分裂速度もｍｉｒ−３０２の抗増殖効果に一致している（図３Ｃ）。我々はこれらのｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓは多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）であるが、腫瘍形成能力（ｔｕｍｏｒｅｇｅｎｅｔｉｃ）を有しないことについて特筆した理由は、これらのｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓは偽妊娠免疫不全のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスの子宮及び腹腔中にのみ、奇形腫様組織嚢腫を形成することである。これらの奇形腫様組織嚢腫は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉という３つの胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）の組織に由来する種々組織を含む（図５Ｄ、実施例１０）。また、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓが正常の雄性マウスの体内に異種移植されると、ｍｉｒＰＳ−ｈＨＦＣｓが周辺組織に同化され、それらと同様な組織マーカーを呈するようになった。このことは、ｍｉｒ−３０２が損傷細胞の治癒に用いられる可能性を示した（図４Ｂ）。以上の発見をまとめると、ｍｉｒ−３０２は体細胞ｈＨＦＣｓをｈＥＳ様のｉＰＳ細胞（誘導多能性幹細胞）に再プログラムできることを示唆する。Ｏｃｔ３／４とＳｏｘ２らの転写因子はｍｉｒ−３０２の発現にとって重要であり（Ｍａｒｓｏｎ氏ら，２００８；Ｃａｒｄ氏ら，２００８）、ｍｉｒ−３０２はＯｃｔ３／４−Ｓｏｘ２に代わって、体細胞再プログラム（ＳＣＲ）の発生を誘導できるかもしれない。
【００２９】
Ｍｉｒ−３０２に誘導されるＳＣＲと細胞周期の減衰と平行に行われることは、ｍｉｒ−３０２の濃度によって決まる。ｍｉｒ−３０２の濃度がヒト胚性幹細胞Ｈ１／Ｈ９における濃度の１．３倍を超えると、それらはほぼ同時に起こることを我々が発見したことから、この特殊な濃度は前記２つの事象を開始させる最小閾値であることが示された。過去の実験では、単一のｍｉｒ−３０２メンバー、又はＨ１／Ｈ９細胞中の比較的低濃度に相当する濃度のｍｉｒ−３０２を使用した場合、前記の事象を誘発することができなかった。また、我々は比較的低濃度の５μＭドキシサイクリンにより誘導されたｍｉｒ−３０２の濃度ではレポーター遺伝子の標的部位又は標的となるＧ１チェックポイント調節因子をサイレンシングできないことを証明した。自然の発育と比較して、桑実胚期（ｍｏｒｕｌａ ｓｔａｇｅ、３２〜６４細胞期）以前の胚性細胞はｍｉｒＰＳ細胞の状態と相似な非常に遅い細胞周期速度を示している場合が多いが、このような細胞周期調節作用は胚盤胞由来の（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ）ｈＥＳ細胞では見つからなかった。これより、ｈＥＳ細胞質において比較的低濃度のｍｉｒ−３０２では、標的となるＧ１チェックポイント調節因子及び発癌遺伝子をサイレンシングするのに足りないことが推測できる。これは、胚盤胞由来のｈＥＳはなぜ劇的な増殖能力及び腫瘍形成傾向を有する理由を解釈できるかもしれない。従って、本発明は幹細胞治療においてｈＥＳ細胞の腫瘍形成能力（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｃｉｔｙ）を低減させるためにも適用できる。
【００３０】
Ｍｉｒ−３０２が腫瘍形成能力を抑制するとともに、様々腫瘍／癌細胞のアポトーシスを誘導する
ｍｉｒ−３０２は癌細胞のアポトーシス及び細胞周期の減衰を引き起こす機能を有することに鑑みて、我々は引き続きｍｉｒ−３０２を汎用性ヒト腫瘍／癌細胞の治療薬として使用する可能性を検討した。我々の過去の研究では、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）と前立腺癌細胞における可能性を既に示したが（Ｌｉｎ氏ら，２００８）、現行の研究で、乳癌細胞ＭＣＦ７、肝癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、及び胚性奇形腫細胞ＮＴｅｒａ−２における可能性を更に試した。図６Ａ−Ｂに示すように、３種類の腫瘍／癌細胞はｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓベクターによって形質移入され、且つ、１０μＭドキシサイクリンの刺激下で、全てが休眠ｍｉｒＰＳ細胞に再プログラムされ、且つ、胚性体様コロニー（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ ｃｏｌｏｎｏｅｓ）を形成した。３種類の腫瘍／癌細胞の全てにおいて、該濃度水準のｍｉｒ−３０２は顕著なアポトーシスも引き起こした（＞９５％）（図１Ｆ、実施例６）。更に、フローサイトメトリーによって、細胞周期の各時期のＤＮＡ含量を分析した結果、全てのｍｉｒＰＳ細胞中の有糸分裂細胞集団が著しく減少したことを示した（図６Ｃ、実施例７）。有糸分裂細胞集団（Ｍ期）は、ｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７細胞中では４９％±３％から１１％±２％まで７８％低減し、ｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２細胞中では４６％±４％から１７％±２％まで６３％低減し、ｍｉｒＰＳ−ＮＴｅｒａ２細胞中では５０％±６％から１９％±４％まで６２％低減した。一方、休止／休眠の細胞集団（Ｇ０／Ｇ１期）は、ｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７細胞、ｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２細胞及びｍｉｒＰＳ−ＮＴｅｒａ２細胞では、それぞれ８０％、６５％及び７２％増加し、ｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７細胞では４１％±４％から７４％±５％まで、ｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２細胞では、４３％±３％から７１％±４％まで、またｍｉｒＰＳ−ＮＴｅｒａ２細胞では、４０％±７％から６９％±８％まで増加した。これらの結果は、ｍｉｒ−３０２がこれらの腫瘍／癌細胞の速い細胞周期速度を有効的に低減し、顕著なアポトーシスを誘発することができたことを示唆している。
【００３１】
細胞侵入試験（マトリゲルチャンバー使用）及び細胞接着試験（細胞がヒト骨髄内皮細胞（ｈＢＭＥＣ）の単細胞層に接着する）などのインビトロでの腫瘍形成能力試験（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｃｉｔｙ ａｓｓａｙ）では、ｍｉｒ−３０２が抗増殖特性を有するほか、更に２種類の抗腫瘍形成の効果も示された。細胞侵入試験（ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）は、全ての３種類の休眠ｍｉｒＰＳ−腫瘍／癌細胞がその移動能力を失ったが（＜１％まで低下）、本来の腫瘍／癌細胞がより高い栄養物で補充された区画エリアに強引的に侵入し、ＭＣＦ７細胞では９％±３％より多くの、Ｈｅｐ Ｇ２細胞では１６％±４％の、またＮＴｅｒａ−２細胞では３％±２％の細胞集団を占めることを示した（図６Ｄ、実施例１１）。細胞接着試験（Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）も一貫して、これらのｍｉｒＰＳ−腫瘍／癌細胞もｈＢＭＥＣ単細胞層に接着できないことを示したが、本来のＭＣＦ７、Ｈｅｐ Ｇ２細胞が５０分間の培養を経た後、そのうちのかなりの細胞集団（ＭＣＦ７ ７％±３％、Ｈｅｐ Ｇ２ ２０％±２％）は速やかにｈＢＭＥＣ単細胞層に転移した（図６Ｅ、実施例１２）。総括すれば、これまで全ての発見は、ｍｉｒ−３０２がヒト腫瘍抑制因子であり、細胞の速い成長を減速させ、腫瘍／癌細胞のアポトーシスを誘発でき、腫瘍／癌細胞の侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）及び転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）を抑制できることを、再々に強く示した。最も重要なのは、このｍｉｒ−３０２の新しい機能は、悪性の皮膚癌（Ｃｏｌｏ−８２９）、前立腺癌（ＰＣ−３）、乳癌（ＭＣＦ７）及び肝癌（ＨｅｐＧ２）に限らない多様なヒト腫瘍／癌に対抗でき、且つ奇形腫（ＮＴｅｒａ−２）に様々な異なる組織が含まれる観点から、各種の腫瘍治療への汎用的な治療を提供できる。
【００３２】
Ｍｉｒ−３０２媒介の抗増殖機能は、ＣＤＫ２、ｃｙｃｌｉｎ−Ｄ１／Ｄ２及びＢＭＩ−１に対する共抑制によって達成される
ｍｉｒ−３０２とその標的となるＧ１チェックポイント調節因子との間の実際の相互作用を確認するために、我々は３’末端非翻訳領域のルシフェラーゼレポーター（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ３’ＵＴＲ ｒｅｇｉｏｎ ｒｅｐｏｒｔｅｒ）アッセイを行った（図７Ａ、実施例１５）。その結果、種々の濃度のｍｉｒ−３０２による処理は、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）、サイクリンＤ１／Ｄ２（ｃｙｃｌｉｎｓ−Ｄ１／Ｄ２）とＢＭＩ−１ ポリコームリングフィンガー発癌遺伝子（ＢＭＩ１ ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｒｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）を含む標的となるＧ１チェックポイント調節因子に対して、大く異なる抑制効果を引き起こすこととなった。１０μＭドキシサイクリンの存在下で、ｍｉｒ−３０２はＣＤＫ２、ｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２、及びＢＭＩ−１転写物の標的部位に効果的に結合し、８０％より多く（＞８０％）のレポータールシフェラーゼの発現をサイレンシングすることに成功した（図７Ｂ、実施例１５）。ｍｉｒＰＳ細胞中で真の標的遺伝子に対するｍｉｒ−３０２の抑制効果をウェスタンブロット分析法によって確認した結果は、３’末端非翻訳領域のルシフェラーゼレポーターアッセイ（図７Ｃ、実施例５）による結果と一致する。これに反して、５μＭのドキシサイクリンにより誘導されるｍｉｒ−３０２の比較的少量の発現では、レポーター遺伝子の標的部位、又はサイクリンＤ２以外の標的となるＧ１チェックポイント調節因子のいずれに対しても顕著なサイレンシング効果を誘発できない（図７Ｂ及び７Ｄ）。これはｍｉｒ−３０２が現れた用量依存性（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ）及びｍｉｒ−３０２が用量依存性に基づいて細胞周期の速度を微調整する能力を示している。ほ乳類動物の細胞周期では、Ｇ１−Ｓ期の移行は通常、代償性の２つのサイクリン−サイクリン依存性キナーゼ複合体（ｃｙｃｌｉｎ−ＣＤＫ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）であるｃｙｃｌｉｎ−Ｄ−ＣＤＫ４／６及びｃｙｃｌｉｎ−Ｅ−ＣＤＫ２によって制御される（Ｂｅｒｔｈｅｔ氏ら，２００６）。そこで、我々は、高濃度のｍｉｒ−３０２がＣＤＫ２及びｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２の共抑制を通じて両複合体を失活させることで、Ｇ１−Ｓ期移行を制御する２つの経路を阻害するとともに、再プログラムされたｍｉｒＰＳの細胞周期速度を低下することを発見した。ｈＨＦＣｓ及びｍｉｒＰＳ細胞において、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ３の有限な発現量は、ｍｉｒＰＳ細胞におけるｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２損失の代償に及ばない。
【００３３】
我々は、ＢＭＩ−１のサイレンシングに伴って、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ及びｐ１４Ａｒｆの発現は微増する（ｈＨＦＣｓにおける上昇比率はそれぞれ６３％±１７％及び５７％±１３％である）ことを検知したが、ｐ２１Ｃｉｐ１の発現の変化は見られなかった（図７Ｃ）。発癌性の癌症幹細胞（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）マーカーであるＢＭＩ−１の欠乏は、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ及びｐ１４Ａｒｆなどの腫瘍抑制因子の活性を増加させることによって、Ｇ１−Ｓ期移行を抑制する（Ｊａｃｏｂｓ氏ら，１９９９）。このような状況では、１６Ｉｎｋ４ａは、ｃｙｃｌｉｎ−Ｄに依存するＣＤＫ４／６（ｃｙｃｌｉｎ−Ｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＤＫ４／６）が網膜芽細胞腫タンパク質（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｒｂ）をリン酸化する活性を直接抑制することで、ＲｂがＳ期に入るために必要とするＥ２Ｆを放出することを防止し、さらにＥ２Ｆ依存性転写（Ｅ２Ｆ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を行う（Ｐａｒｒｙ氏ら，１９９５；Ｑｕｅｌｌｅ氏ら，１９９５）。また、ｐ１４ＡｒｆはＨＤＭ２とｐ５３との結合を防止しながら、Ｇ１期の停止又はアポトーシスの役割を担うｐ５３依存性転写（ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を許容する（Ｋａｍｉｊｉｏ氏ら，１９９７）。しかし、現在知られている限りでは、胚性幹細胞はｃｙｃｌｉｎ−Ｄ依存性のＣＤＫ（ｃｙｃｌｉｎ−Ｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＤＫ）による制御を受けない（Ｂｕｒｄｏｎ氏ら，２００２；Ｊｉｒｍａｎｏｖａ氏ら，２００２；Ｓｔｅａｄ氏ら，２００２）ことから、ｈＥＳ細胞の細胞周期調節については、ＣＤＫ２はＧ１−Ｓ期移行を誘発するために主要な決定因子であると認知されている。そのため、ＣＤＫ２のサイレンシングがｍｉｒＰＳ細胞のＧ１期の停止（Ｇ１−ａｒｒｅｓｔ）に最も影響を与える可能性は最も大きく、ｃｙｃｌｉｎ−ＤとＢＭＩ−１の共抑制及びｐ１６Ｉｎｋ４ａとｐ１４Ａｒｆの共活性化は、腫瘍の生成シグナルにより誘発される細胞増殖（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ）を付加的に抑制する。更に、ｃｙｃｌｉｎ−Ｄの損失及びｐ１６Ｉｎｋ４ａの活性化は、胚性幹細胞においてｃｙｃｌｉｎ−Ｄ依存性（ｃｙｃｌｉｎ−Ｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）のＣＤＫの活性不足についても解釈できる。
【００３４】
従って、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と標的遺伝子との相互作用の厳密度はマイクロＲＮＡ本来の機能を決定できる。異なる細胞条件によって、マイクロＲＮＡは遺伝子標的の異なる嗜好を表す。本発明はその重要な詳細を開示するとともに、ｍｉｒ−３０２がヒトとマウス細胞における機能が大いに異なることを初めて開示した。ｍｉｒ−３０２は、ヒト細胞において、ＣＤＫ２、ｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２、及びＢＭＩ−１を標的として強く狙うが、興味深いことに、ｐ２１Ｃｉｐ１が含まれていない。マウスｐ２１Ｃｉｐ１と違って、ヒトｐ２１Ｃｉｐ１にはｍｉｒ−３０２の標的部位がいずれも含まれていない。この遺伝子標的の相違は両者の細胞周期調節における重要な分岐を招いた。マウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）において、ｍｉｒ−３０２はｐ２１Ｃｉｐ１をサイレンシングするとともに、腫瘍様（ｔｕｍｏｒ−ｌｉｋｅ）の細胞増殖を促進するが（Ｗａｎｇ氏ら，２００８；Ｊｕｄｓｏｎ氏，２００９）、ヒトｍｉｒＰＳ細胞中では、ｐ２１Ｃｉｐ１の発現が維持されるとともに、比較的遅い細胞増殖と比較的低い腫瘍形成能力をもたらす。
【００３５】
また、マウスのＢＭＩ−１も、適切な標的部位を欠けているためｍｉｒ−３０２の標的遺伝子とならない。我々は、ｍｉｒＰＳ細胞において、ヒトＢＭＩ−１のサイレンシングは、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ／ｐ１４ＡＲＦの発現をわずかに刺激し、細胞増殖を減弱させるが、一方、ｍｉｒ−３０２はマウスＢＭＩ−１をサイレンシングすることによって、マウス細胞において同様な効果を引き起こすことができないことを発見した。ｍｉｒＰＳ細胞において、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ／ｐ１４ＡＲＦの発現が増加し、ｐ２１Ｃｉｐ１が影響を受けないことから、ヒトｍｉｒＰＳ細胞における抗増殖の効果及び抗腫瘍生成の効果は、ｃｙｃｌｉｎ−Ｅ−ＣＤＫ２及びｃｙｃｌｉｎ−Ｄ−ＣＤＫ４／６を共抑制する経路以外、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ−Ｒｂ及び／又はｐ１４／１９ＡＲＦ−ｐ５３経路を通じて発揮する可能性が最も大きいと理解されるべきである。Ｍｉｒ−３０２の標的となるヒト及びマウス遺伝子の嗜好における顕著な違いは、両者の細胞周期調節機構に根本的な相違があることを示唆している。
【００３６】
Ｍｉｒ−３０２の処理は、幹細胞の多能性を変えずにインビボでの腫瘍細胞の成長を９０％よりも多く減少させる
我々は、ｍｉｒ−３０２の腫瘍抑制機能及びその正常と腫瘍／癌細胞との間における異なる作用を確認した後、８週齢の雄性胸腺欠損マウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ 種）のインビボＮＴｅｒａ２由来の奇形腫を治療する薬物としてｍｉｒ−３０２が使用可能か否かの試験を行った（実施例１３）。腫瘍Ｔｅｒａ−２細胞株（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｔｅｒａ−２、ＮＴｅｒａ−２）は多能性ヒト胚性奇形腫細胞株（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であって、特に、原始的腺組織及び原始的神経組織のようなインビボで多種の原始的体細胞組織（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ）に分化することができる（Ａｎｄｒｅｗｓ氏ら，１９８４）。その多能性のため、ＮＴｅｒａ−２由来の奇形腫はインビボでの種々の腫瘍を治療するモデルになることができる。薬剤の投与において、インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）注射によってポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）で調製されたｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓ発現ベクターを腫瘍にできるだけ近い部位に注射した。ｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓベクターはテトラサイクリン応答要素により制御される（ＴＲＥ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）ＣＭＶプロモーターを一般のＣＭＶプロモーターに変えることで構成させたが（実施例２）、ＤＮＡメチル化のため、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓのヒト細胞における発現は１ヶ月くらい期間に続く。上限値の１０μｇ／マウス体重（ｇ）（一回の注射の最大量）のｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓベクターを注射した後、マウスに疾患又は悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）の徴候が観察されなかったため、この方法の安全性が証明された。組織学的検査においても、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、及び脾臓に組織損傷（ｌｅｓｉｏｎ）が検出されなかったことが示された。
【００３７】
本発明の実施例では、２μｇ／マウス体重（ｇ）のｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓで５回の処理（３日置きに処理する）を行ったところ、奇形腫の成長に対して顕著な抑制作用があることを見出した。図８Ａ（実施例１３）に示すように、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓベクターで処理した後、ＮＴｅｒａ２由来の奇形腫の平均サイズ（１１±５ｍｍ^３、ｎ＝６）は未処理のグループ（１０４±２３ｍｍ^３、ｎ＝４）と比較して、８９％より多く（＞８９％）減少した。これに反して、ＰＥＩで調製した等量のアンチセンス−ｍｉｒ−３０２ｄ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｍｉｒ−３０２ｄ）発現ベクター（ｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｄ＊）の投与は、奇形腫のサイズ本来の１４０％（２５０±７３ｍｍ^３、ｎ＝３）に増大させた。以上の結果により、本発明はＮＴｅｒａ−２細胞が中程度のｍｉｒ−３０２を発現することが発見された（図８Ｂ）。ノーザンブロック分析の結果も、これらの異なる処理を受けた奇形腫細胞において、ｍｉｒ−３０２の発現は腫瘍の大きさ（図８Ｂ）と負の相関関係であることを示した。つまり、ｍｉｒ−３０２の発現を調節することでインビボの奇形腫の成長を有効に制御することができることを示唆している。過去のインビトロでの発見を証明するために、我々はウエスタンブロック分析を用いて、ｍｉｒ−３０２で処理した奇形腫において、Ｇ１チェックポイント調節因子ＣＤＫ２−ｃｙｃｌｉｎｓ−Ｄ１／Ｄ２−ＢＭＩ−１の共抑制及びコア再プログラム因子Ｏｃｔ３／４−Ｓｏｘ２−Ｎａｎｏｇの共活性化を確認した（図８Ｂ）。免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ、ＩＨＣ）染色法で奇形腫組織におけるこれらのタンパク質を分析したところ、同様な結果が証明された（図８Ｃ、実施例１４）。最も注目すべきなのは、我々は自然分化能力に影響せずにｍｉｒ−３０２が奇形腫細胞の成長を抑制できることを発見した。このことから、高濃度のｍｉｒ−３０２が腫瘍抑制因子と再プログラム因子の両役を担うことをも示唆した。Ｍｉｒ−３０２の二重機能及インビトロとインビボにおいて得られた一致した結果に基づき、我々はインビトロで発見されたｍｉｒ−３０２の抗増殖機能はインビボの奇形腫成長の抑制に適用することができ、そのため、各種腫瘍に対して潜在的な治療法としての可能性があると推測した。
【００３８】
Ｍｉｒ−３０２はテロメアを短縮させるのではなく、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ／ｐ１４ＡＲＦの活性化によって、細胞老化（ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）を誘発する
人工誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）には老化を加速し、拡張を制限する可能性があるという問題が報告された（Ｂａｎｉｔｏ氏ら，２００９；Ｆｅｎｇ氏ら，２０１０）。正常の成熟細胞は、有限回数の分裂を行い、最終的に複製老化（ｒｅｐｌｅｃａｔｉｖｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）と呼ばれる静止状態（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｔｅ）に至る。複製老化を回避した細胞は大抵腫瘍／癌細胞のような不死化細胞（ｉｍｍｏｒｔａｌ ｃｅｌｌｓ）となるため、複製老化は腫瘍／癌細胞の形成に対抗する正常な防御機構である。本発明では、我々は、ｍｉｒ−３０２はＢＭＩ−１を直接サイレンシングすることによって、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ／ｐ１４ＡＲＴ関連の細胞周期調節を引き起こすことができることを発見した。他の研究では、ＢＭＩ−１によってヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ｈＴＥＲＴ）の転写作用が活性化され、テロメラーゼの活性化が高められることによって複製老化が回避されて、細胞寿命が増長されるとのことが更に指摘された（Ｄｉｍｒｉ氏ら，２００２）。このことから、ｍｉｒ−３０２の過剰発現はｍｉｒＰＳ細胞のｈＴＥＲＴ随伴性老化（ｈＴＥＲＴ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）を引き起こすことが分かる。これを解明するために、我々はテロメアリピート増幅プロトコル法（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｒｅｐｅａｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＴＲＡＰ）（実施例１６）を用いて、テロメラーゼの活性を測定した。図９Ａに示すように、１０μＭのドキシサイクリンで処理した全てのｍｉｒＰＳ細胞は、意外にもその本来の腫瘍／癌細胞及びＨ１／Ｈ９細胞に相似し、強烈なテロメラーゼ活性を示した。また、ウエスタンブロック分析は、これらｍｉｒＰＳ細胞において、ｈＴＥＲＴの発現は減少ではなく、増加したことが示された（図９Ｂ）。テロメラーゼＰＣＲ ＥＬＩＳＡ試験によって、テロメラーゼの相対活性が増加したことが証明された（図９Ｃ）。更に、我々はｍｉｒＰＳ細胞中のリジン特異的ヒストンデメチラーゼ（ｌｙｓｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ ＡＯＦ２、又はＫＤＭ１／ＬＳＤ１とも言う）及びヒストンデアセチラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ＨＤＡＣ２）のサイレンシングも検出できた（図９Ｂ）。ｈＴＥＲＴ転写の抑制にＡＯＦ２が必要であり、ＡＯＦ２とＨＤＡＣ２の両者の欠乏がｈＴＥＲＴの過剰発現を引き起こすことは過去の研究で指摘された（Ｗｏｎ氏ら，２００２；Ｚｈｕ氏ら，２００８）。我々はまた、本発明において、ＡＯＦ２とＨＤＡＣ２はｍｉｒ−３０２の強い標的であり、且つｍｉｒＰＳ細胞中ではいずれもサイレンシングされたことを発見した（図１０）。そのため、ｍｉｒＰＳ細胞中では、ｍｉｒ−３０２は実際に、ｈＴＥＲＴ随伴性老化を誘発するのではなく、ｍｉｒＰＳ細胞のテロメラーゼの活性を増強させる。しかしながら、ｈＴＥＲＴ活性増大の効果はｍｉｒ−３０２により引き起こされたＢＭＩ−１の抑制とｐ１６Ｉｎｋ４ａ／ｐ１４ＡＲＦの活性化で中和され、ｍｉｒ−３０２細胞中で腫瘍／癌細胞の形成を防ぐバランスに達している。
【００３９】
要するに、本発明では癌治療薬として新しい腫瘍抑制機能のあるｍｉｒ−３０２を使用する。我々は、ｍｉｒ−３０２媒介性の細胞周期調節は、Ｇ１チェックポイント調節因子の共抑制とＣＤＫ抑制因子の活性化との間にある高度協調的なメカニズムを含むことを発見した。Ｇ１−Ｓ進行中にいかなるミスを防ぐために、これらの事象は同時に起こる必要がある。細胞周期中のＧ０／Ｇ１期の静止ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅが体細胞の再プログラム（ＳＣＲ）の開始にとって極めて重要である。該休眠状態において、体細胞遺伝子が大量にメチル化され、且つ９１％より多くの細胞トランスクリプトームがｈＥＳ様の遺伝子発現パターンに再プログラムされる。我々は、ｍｉｒ−３０２とその標的遺伝子との間の相互作用を解明することによって、ＳＣＲ期間におけるｍｉｒ−３０２が関連する細胞周期調節の複雑なメカニズムを認識することができた（図１１）。我々の過去の研究では、ｍｉｒ−３０２はその標的となる後成的な調節因子（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）をサイレンシングする一方、Ｏｃｔ３／４−Ｓｏｘ２−Ｎａｎｏｇを活性化させて共発現させ、続いてこれらのコア再プログラム転写因子はＳＣＲを引き起こすことを証明した（Ｌｉｎ氏ら，２００８）。本発明はさらに、ｍｉｒ−３０２がＳＣＲ期間中にＣＤＫ２、ｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２、及びＢＭＩ−１を同時にサイレンシングすることで、細胞分裂を減弱させることを率先的に明らかにした。細胞周期の速度を適度に制御することは、ＳＣＲ期でよく活性化される発癌遺伝子の腫瘍形成能力を防止することにおいて、生物学上の重要性を有している。これについて、ｍｉｒ−３０２はＣＤＫ２及びｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２をサイレンシングさせるとともに、Ｇ１−Ｓ期移行を阻害する。同時に、ＢＭＩ−１の抑制はｐ１６Ｉｎｋ４ａとｐ１９Ａｒｆの腫瘍抑制活性を更に増大させる。これらの細胞周期経路の協調的な調節を介して、ｍｉｒ−３０２は細胞を腫瘍形成能力（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｃｉｔｙ）具備へ悪化せずに、体細胞の再プログラム（ＳＣＲ）の進行を開始させることができる。
【００４０】
本発明は、少なくとも５つの重大な革新がある。第１に、ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターは４つのコア再プログラム転写因子Ｏｃｔ−Ｓｏｘ２−Ｋｌｆ−ｃ−Ｍｙｃ及びＯｃｔ４−Ｓｏｘ２−Ｎａｎｏｇ−Ｌｉｎ２８の全てを代替することで、ヒト細胞をｈＥＳ様幹細胞に再プログラムすることができる。これらの再プログラム細胞は幹細胞治療法に有益である。第２に、ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターは小さいサイズ（約２３個のリボヌクレオチドを含む）を有するため、このようなサイズの小さいｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターを発現するベクターは構造上よりコンパクトであることで、インビボでの形質移入効率を向上させることができる。第３に、細胞内のナンセンス仲介減衰（ＮＭＤ）システム及び誘導性の発現系はＲＮＡと関連する細胞毒性を防止することができる。第４に、ｍｉｒ−３０２媒介のアポトーシスは腫瘍／癌細胞のみで起こり、正常ヒト細胞では起こらない。最後に、本発明はレトロウィルス／レンチウィルス感染の代わりに、ポリソーム（ｐｏｌｙｓｏｍａｌ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ）、及び電気穿孔法形質移入法を用いて、ｍｉｒ−３０２を発現する核酸組成物を腫瘍／癌細胞中に送達させることによって、安全性及びインビトロとインビボでの治療におけるｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターの治療的使用を確証させる。総括すると、これらの革新はｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクター及び該ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターを発現する組成物を使用することによって、腫瘍／癌を治療する可能性を示し、汎用性癌治療薬及び／又はワクチンに開発できる新しい設計を提供した。
【００４１】
Ａ．定義
本発明をより理解しやすくするために、下記のように、幾つかの用語を定義する。
ヌクレオチド：糖成分（五炭糖、ｐｅｎｔｏｓｅ）、リン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び窒素複素環塩基（ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ ｈｅｔｅｒｏｙｃｌｉｃ ｂａｓｅ）を含み、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の単量体単位である。該塩基はグリコシド連結した炭素（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｃａｒｂｏｎ、該五炭糖の１’炭素）によって該糖成分と結合し、該塩基と糖の組み合わせがヌクレオシドである。該五炭糖の３’又は５’の位置に少なくとも１つのリン酸基が結合しているヌクレオシドはヌクレオチドである。
【００４２】
オリゴヌクレオチド：２個以上、好ましくは３個以上、通常は１０個以上のデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む分子である。正確なサイズは多くの要因によって決まり、さらに該オリゴヌクレオチドの最良の機能又は用途によって決まる。オリゴヌクレオチドは化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、又はこれらの組み合わせを含む如何なる方法で生成してもよい。
【００４３】
核酸：１本鎖又は２本鎖のヌクレオチドの重合体である。
ヌクレオチド類似体：プリン又はピリミジンヌクレオチドであって、構造において、Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）又はＵ（ウラシル）ヌクレオチドは異なるが、十分に類似しており、核酸分子中で通常のヌクレオチドと置換できる。
【００４４】
核酸組成物：１本鎖又は２本鎖分子構造の形式で存在するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを指す。
遺伝子：核酸であって、そのヌクレオチド配列はＲＮＡ及び／又はポリペプチド（タンパク質）のためにコードする。遺伝子はＲＮＡ又はＤＮＡである。
【００４５】
塩基対（ｂｐ）：２本鎖ＤＮＡ分子中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の連携（ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ）である。ＲＮＡでは、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）となる。一般に、この連携は水素結合を介して連結される。
【００４６】
メッセンジャーＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）：真核細胞において、遺伝子が転写と呼ばれる細胞内メカニズムによって、ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）によって生成されるリボヌクレオチド一次転写物である。メッセンジャーＲＮＡ前駆体配列には、５’末端非翻訳領域（５’−ｅｎｄ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）、３’末端非翻訳領域（３’−ｅｎｄ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）、エクソン、及びイントロンが含まれる。
【００４７】
イントロン：非タンパク質読み枠をコードする遺伝子転写物配列の一部分又は複数の部分である。例えば、インフレームイントロン、５’末端非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）及び３’末端非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）である。
【００４８】
エクソン：タンパク質読み枠（ｃＤＮＡ）をコードする遺伝子転写配列の一部分又は複数の部分である。該ｃＤＮＡは、例えば、細胞遺伝子、ほ乳類動物遺伝子、胚性幹細胞マーカー遺伝子、蛍光タンパク質マーカー遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ｌａｃ−Ｚ乳糖レポーター遺伝子、ウィルス遺伝子、ジャンピング遺伝子、トランスポゾン、及びこれらの組み合わせである。
【００４９】
メッセンジャーリボ核酸（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）：メッセンジャーＲＮＡ前駆体のエクソンによる組み合わせで形成される。メッセンジャーリボ核酸前駆体が核内スプライセオソーム機構（ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅａｒ ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍａｌ ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓ）によるイントロン除去後に形成されるとともに、タンパク質合成においてタンパク質をコードするＲＮＡとして機能する。
【００５０】
相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）：ｍＲＮＡ配列と相補して、イントロン配列が全く含まれない１本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
センス核酸：配列順及び組成が相同なｍＲＮＡと同じ核酸分子である。「＋」、「ｓ」又は「ｓｅｎｓｅ」の符号で該センス核酸構造を示す。
【００５１】
アンチセンス核酸：個々のｍＲＮＡ分子と相補的な核酸分子である。「−」符号でこのアンチセンス構造を示し、又は、「ａ」もしくは「ａｎｔｉｓｅｎｓｅ」をＤＮＡ又はＲＮＡの前に付けて示し、例えば、「ａＤＮＡ」又は「ａＲＮＡ」。
【００５２】
５’末端（５’−ｅｎｄ）：連続したヌクレオチドの５’位置で１つのヌクレオチドを欠く末端である。該連続したヌクレオチドにおいて、１つのヌクレオチドの５’ヒドロキシル基がリン酸ジエステル結合によって次のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基に連結される。該末端に、１つ又は複数のリン酸のような他の基が存在してもよい。
【００５３】
３’末端（３’−ｅｎｄ）：連続したヌクレオチドの３’位置で１つのヌクレオチドを欠く末端である。該連続したヌクレオチドにおいて、１つのヌクレオチドの５’ヒドロキシル基が次のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基とリン酸ジエステル結合によって連結される。該末端に、他の基が存在してもよく、通常はヒドロキシル基である。
【００５４】
鋳型：核酸ポリメラーゼによってコピーできる核酸分子である。異なるポリメラーゼにより、鋳型は１本鎖、２本鎖、又は部分的な２本鎖であってもよい。合成されたコピーはこの鋳型、２本鎖鋳型の少なくとも１本鎖、又は部分的な２本鎖鋳型と相補的である。ＲＮＡ及びＤＮＡの両者は５’から３’方向に合成される。核酸デュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）の２本の鎖は常にアラインメントしているので、２本鎖の５’末端はデュプレックスの反対側の末端に位置する（必要があれば、これらの２本鎖の３’末端も同様）。
【００５５】
核酸鋳型：２本鎖ＤＮＡ分子、２本鎖ＲＮＡ分子、雑種分子（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡもしくはＲＮＡ−ＤＮＡ雑種）、又は１本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である。
保存性（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）：ヌクレオチド配列が予めて選択された配列（参照配列）に精確に相補するものと非無作為的にハイブリダイゼーションする場合、このヌクレオチド配列はこの予めて選択された配列の間に保存性を有する。
【００５６】
相補的、相補又は相補性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ、又はｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ又はｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）：塩基対規則（ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ ｒｕｌｅ）によって関連付けられたポリヌクレオチド（即ち、ヌクレオチド配列）である。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と「Ｔ−Ｃ−Ｕ」とそれぞれ相補している。相補は、２本のＤＮＡ鎖間、１本のＤＮＡ鎖と１本のＲＮＡ鎖間、又は２本のＲＮＡ鎖間で生じてよい。相補は「部分」又は「完全」又は「全体」であってもよい。幾つかの核酸塩基のみが塩基対規則に従って適合する場合は、部分相補（ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ 又は ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）となる。核酸鎖間で塩基が完全に適合する場合は、完全又は全体相補（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｏｒ ｔｏｔａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）となる。核酸鎖間の相補の程度は核酸鎖間のハイブリダイゼーションにおける効率と強度に大きく影響する。これは、増幅反応、さらに核酸間の結合に依存する検出方法にとって非常に重要である。相補率（Ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ 又はｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）とは、核酸の１本鎖におけるミスマッチを示した塩基数と全塩基との比のことである。従って、５０％の相補率とは、塩基の半分がミスマッチで、半分が適合していることを意味する。核酸の２本鎖は、この２本鎖の塩基数が異なっても相補することができる。この場合、短い方の鎖の塩基とペアを成している比較的長い方の鎖に相補が生じる。
【００５７】
相同又は相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ又はｈｏｍｏｌｏｇｙ）：遺伝子又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列と類似するポリヌクレオチド配列である。例えば、核酸配列は特定の遺伝子又はｍＲＮＡ配列と完全又は部分的に相同である可能性がある。また、相同性は、類似したヌクレオチドの数と全ヌクレオチド数の比率（パーセンテージ）で表すことができる。
【００５８】
相補的塩基：ＤＮＡ又はＲＮＡが２本鎖の形状をとる場合に、通常のペアを形成するヌクレオチドである。
相補的ヌクレオチド配列：１本鎖分子のＤＮＡ又はＲＮＡにおけるヌクレオチド配列がもう一方の１本鎖のヌクレオチド配列と十分に相補しており、水素結合によって、２本鎖間で特異的にハイブリダイゼーションする。
【００５９】
ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ及びＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）：塩基対形成によって複合体を形成するのに十分相補的なヌクレオチド配列間のデュプレックスの形成である。プライマー（又はスプライス鋳型）が標的（鋳型）と「ハイブリダイゼーション」する場合、ハイブリダイゼーションで形成された複合体（又は雑種、ｈｙｂｒｉｄｓ）は十分に安定しているので、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ合成を開始するために必要なプライミング機能が提供される。２つの相補的ヌクレオチド間には、競合的に抑制（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）できる特異的な相互作用がある（即ち、非ランダムである）。
【００６０】
転写後遺伝子サイレンシング（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）：ｍＲＮＡ分解又は翻訳抑制における標的遺伝子ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）又はノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）の効果であって、一般的に外来／ウィルスＤＮＡ導入遺伝子又は小型抑制性ＲＮＡのいずれかによって引き起こされる。
【００６１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）：真核細胞における転写後の遺伝子サイレンシングメカニズムであって、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のような小型抑制性ＲＮＡ分子によって誘発することができる。これらの小型ＲＮＡ分子は一般的に遺伝子サイレンサーとして機能し、細胞内のこれらの小型ＲＮＡに完全又は部分的に相補的な遺伝子の発現を干渉する。
【００６２】
非コードＲＮＡ（Ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）：細胞内翻訳機構によってペプチド又はタンパク質の合成に用いることができないＲＮＡ転写物である。
マイクロＲＮＡ（Ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）：該マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に部分的に相補な標的遺伝子転写物に結合できる１本鎖ＲＮＡである。ＭｉＲＮＡは通常長さが約１７〜２７個のオリゴヌクレオチドで、該ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの相補性によって、細胞内のｍＲＮＡ標的を直接分解するか、又はその標的ｍＲＮＡのタンパク質翻訳を抑制する。天然のｍｉＲＮＡはほぼ全ての真核細胞で発見され、その役割はウィルス感染に対抗する防御物のようなものであるとともに、動植物の発育期間における遺伝子発現を制御するものとして機能している。
【００６３】
マイクロＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）：細胞内エンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅＩＩＩと相互作用するステムアーム（ｓｔｅｍ−ａｒｍ）及びステムループ（ｓｔｍｅ−ｌｏｏｐ）領域を含むヘアピン様の１本鎖ＲＮＡであって、１つ又は複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）を産生し、このマイクロＲＮＡの標的遺伝子又はこのマイクロＲＮＡ配列と相補的な遺伝子をサイレンシングできる。マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）のステムアームは完全（１００％）又は部分的（ミスマッチ）にハイブリダイゼーションしたデュプレックス構造を形成し、ステムループ領域はステムアームデュプレックスの１端と連結して、円形又はヘアピンループ状の環状構造を形成する。
【００６４】
小干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）：短鎖の２本鎖ＲＮＡであって、約１８〜２５個の完全な塩基対を有するリボヌクレオチドデュプレックスであって、それにほぼ完全相補的である標的遺伝子転写物を分解できる。
【００６５】
小ヘアピン又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ 又は ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）：部分的又は完全にマッチする１対のステムアームヌクレオチド配列を含む１本鎖ＲＮＡであって、該ステムアーム配列はマッチしないループ状オリゴヌクレオチドによって分けられ、ヘアピン様構造を形成する。多くの天然マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）はヘアピン様ＲＮＡ前駆体、即ち、マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に由来する。
【００６６】
ベクター：異なる遺伝子環境において移動及び定着が可能な組換え核酸組成物であって、例えば、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）である。一般に、他の核酸はこれに操作的に連結される。該ベクターは細胞内で自己複製が可能であり、この場合、ベクターとその連結した部位も複製される。好ましいベクターとして、エピソーム（ｅｐｉｓｏｍｅ）、すなわち、染色体外で複製可能な核酸分子が挙げられる。好ましいベクターは自己複製及び発現可能な核酸である。１つ又は複数のポリペプチド及び／又は非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡをコードする遺伝子の発現を誘導できるベクターを、ここでは「発現ベクター」と呼ぶ。特に重要なベクターは、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡｓからｃＤＮＡをクローニングできる。ベクターの内容物は、ウィルスプロモーター、ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターもしくははこれらの両者、Ｋｏｚａｋ共通翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ）、複数の制限／クローニング部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ／ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、ｐＵＣ複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、複製可能な原核細胞で抗生物質耐性遺伝子を少なくとも１つ発現させるためのＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ほ乳類動物細胞の選択的ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ ｏｒｉｇｉｎ）、及び／又はテトラサイクリン応答要素を含む。
【００６７】
シストロン：ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列であって、アミノ酸残基配列をコードし、上流及び下流にＤＮＡ発現制御要素を含む。
プロモーター：ポリメラーゼ分子により認識され（おそらく結合し）、合成を誘発する核酸である。本発明の目的に対して、プロモーターは、既知のポリメラーゼ結合部位、エンハンサーとその類似物、又は必要なポリメラーゼを用いて合成を誘発する如何なる配列であってもよい。
【００６８】
抗体：予め選択した保存領域構造をもつペプチド又はタンパク質分子であって、該構造は予め選択したリガンドと結合できる受容体をコードする。
ＲＮＡ一次転写物：リボヌクレオチド配列であって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、ウィルスＲＮＡ（ｖｉｒａｌ ＲＮＡ）、及びその前駆体と誘導体から選ばれる。
【００６９】
イントロン切除（Ｉｎｔｒｏｎ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）：ＲＮＡプロセッシング、成熟、及び分解を担当する細胞機構であって、ＲＮＡスプライシング（ＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）、エキソソーム消化（ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｉｆｅｓｔｉｏｎ）、ナンセンス仲介減衰（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ，ＮＭＤ）、及びこれらの組み合わせを含む。
【００７０】
供与スプライス部位（Ｄｏｎｏｒ Ｓｐｌｉｃｅ Ｓｉｔｅ）：ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４配列、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４に相同な配列、又は５’−ＧＴＡＡＧ−３’配列を含む核酸配列である。
【００７１】
受容スプライス部位（Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｓｐｌｉｃｅ Ｓｉｔｅ）：ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５配列、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５に相同な配列、又は５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’配列を含む核酸配列である。
【００７２】
分岐点モチーフ（Ｂｒａｎｃｈ Ｐｏｉｎｔ）：核酸配列におけるアデニンヌクレオチドであって、該核酸配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６配列、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６に相同な核酸配列、又は５’−ＴＡＣＴＡＡＣ−３’配列を含む。
【００７３】
ポリピリミジントラクト（Ｐｏｌｙ−Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ Ｔｒａｃｔ）：高割合のチミンヌクレオチドとシトシンヌクレオチドを含有する核酸配列であって、該核酸配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７配列、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８配列、又はこれらに相同な配列を含む。
【００７４】
標的細胞：１個又は複数個のヒト細胞であって、該ヒト細胞は体細胞、組織、幹細胞、生殖細胞、奇形腫細胞、腫瘍細胞、癌細胞、及びこれらの組み合わせから選ばれる。
癌組織（Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ）：皮膚癌、前立腺癌、乳癌、肝癌、肺癌、脳腫瘍／癌、リンパ癌、白血病及びこれらの組み合わせから選ばれる腫瘍組織である。
【００７５】
発現可能ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ）：直鎖状又は環状の１本鎖又は２本鎖のＤＮＡであって、プラスミド、ウィルスベクター、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ＤＮＡ組換え遺伝子、ジャンピング遺伝子、及びこれらの組み合わせから選ばれる。
【００７６】
抗生物質耐性遺伝子（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅ）：抗生物質を分解する能力を備えるように発現する遺伝子であって、該抗生物質はペニシリンＧ、アンピシリン、ネオマイシン、Ｇ４１８、パロマイシン（ｐａｒｏｍｙｃｉｎ）、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、スペクトロマイシン、フォフォマイシン、テトラサイクリン、リファンピシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、クロランフェニコ−ル、セファロチン、タイロシン、及びこれらの組み合わせから選ばれる。
【００７７】
ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ等価物（Ｔｙｐｅ−ＩＩＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）：転写機構であり、ＩＩ型（Ｐｏｌ−ＩＩ）、ＩＩＩ型（Ｐｏｌ−ＩＩＩ）、Ｉ型（Ｐｏｌ−Ｉ）及びウィルス型ＲＮＡポリメラーゼから選ばれる。
【００７８】
制限／クローニング部位：制限酵素の開裂部位であるＤＮＡモチーフ（ＤＮＡ ｍｏｔｉｆ）であって、該制限／クローニング部位はＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩ／ＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ／ＬＩ、ＡｓｅＩ、Ａｓｐ７１８Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｌＩ／ＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、ＢｓｐＨＩ／ＬＵ１１Ｉ／１２０Ｉ、ＢｓｒＩ／ＢＩ／ＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ／ＳＩ、ＢｓｔＢＩ／Ｕ１／ＸＩ、ＣｌａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ／ＩＩ、ＥａｇＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＲＩＩ／４７ＩＩＩ／ＲＶ、ＥｈｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ／ＩＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭａｅＩＩ／ＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＰｍｌＩ、Ｐｐｕ１０Ｉ、ＰＳｔＩ、ＰｖｕＩ／ＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ／ＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＴａｉＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩの開裂部位を含むが、これらに限らない。
【００７９】
遺伝子送達：遺伝子工学手法であって、ポリソーム形質移入、リポソーム形質移入、化学的形質移入、電気穿孔法、ウィルス感染、ＤＮＡ組換え、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入、マイクロインジェクション、遺伝子銃による貫入、及びこれらの組み合わせから選ばれる。
【００８０】
遺伝子工学：ＤＮＡ組換え方法であって、ＤＮＡ制限酵素反応とライゲーション、相同組換え、導入遺伝子の組み込み、トランスポゾンの挿入、ジャンピング遺伝子の挿入、レトロウィルスの感染、及びこれらの組み合わせから選ばれる。
【００８１】
細胞周期調節因子（Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）：細胞分裂及び細胞増殖の速度を制御することに関与する細胞遺伝子であって、サイクリン依存キナーゼ２（ＣＤＫ２）、サイクリン依存キナーゼ４（ＣＤＫ４）、サイクリン依存キナーゼ６（ＣＤＫ６）、サイクリン（ｃｙｃｌｉｎｓ）、ＢＭＩ−１、ｐ１４／ｐ１９Ａｒｆ、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、ｐ２１Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１、ｐ２７Ｋｉｐ１及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限らない。
【００８２】
腫瘍抑制（Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）：細胞の抗腫瘍及び抗癌メカニズムであって、細胞周期の減衰、Ｇ０／Ｇ１チェックポイントの停止、腫瘍の抑制、抗腫瘍形成、癌細胞のアポトーシス及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限らない。
【００８３】
遺伝子サイレンシング効果：遺伝子機能が抑制された後の細胞反応であって、細胞周期の減衰、Ｇ０／Ｇ１チェックポイントの停止、腫瘍の抑制、抗腫瘍形成、癌細胞のアポトーシス及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限らない。
【００８４】
Ｂ．組成物
本発明は組換え核酸組成物を使用する設計と方法に関する。該組換え核酸組成物は標的ヒト細胞に送達され、ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターに転写及びプロセシングされ、細胞におけるｍｉｒ−３０２の標的細胞周期調節因子及び発癌遺伝子の特定遺伝子のサイレンシング効果を誘発する。下記の手順を含む。
【００８５】
ａ）ｍｉｒ−３０２の標的となる複数の細胞遺伝子を干渉する少なくとも１つの遺伝子サイレンシングエフェクターになるように、組換え核酸組成物を提供して、送達、転写及びプロセシングされる工程、及び
ｂ）該組換え核酸組成物で細胞基質を処理する工程。
【００８６】
上記組換え核酸組成物は：
ａ）必要な機能をもつ遺伝子転写物を形成するように連結可能な複数のエクソンと；
ｂ）組換えｍｉｒ−３０２相同体を含み、細胞内ＲＮＡスプライシング及びプロセシング機構によって切断されることでエクソンから切り離し可能な少なくとも１つイントロンと；
を更に含む。
【００８７】
上記組換え遺伝子組成物のイントロンは：
ａ）スプライセオソーム結合のための５’末端供与スプライス部位と；
ｂ）該ｍｉｒ−３０２ファミリーメンバーと相同な遺伝子サイレンシングエフェクターインサートと；
ｃ）スプライセオソーム認識のための分岐点モチーフと；
ｄ）スプライセオソーム相互作用のためのポリピリミジントラクトと；
ｅ）スプライセオソーム結合のための３’受容スプライス部位と；
ｆ）５’から３’の方向に上記各成分のそれぞれを連結する複数のリンカーと；
を更に含む。
【００８８】
本発明は、新しい設計と方法を採用して、形質移入された細胞においてｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターを誘導的又は持続的に発現させることが好ましい。Ｍｉｒ−３０２様遺伝子サイレンシングエフェクターはｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、ｍｉｒ−３０２ｄ及びこれらのヘアピン様（ｈａｒｉｐｉｎ−ｌｉｋｅ）マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ）と手動で再設計した小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）相同体／誘導体、及びこれらの組み合わせを含む。Ｍｉｒ−３０２遺伝子サイレンシングエフェクターの転写は持続的発現の（即ち、ＣＭＶ）又は薬剤誘導性の（即ち、ＴＲＥ−ＣＭＶ）プロモーターにより駆動される。該薬剤誘導式の組換え核酸組成物は、組換えｍｉｒ−３０２フミリークラスター（ｍｉｒ−３０２ｓ、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯｓ．９−１６の雑種）又は手動で再設計したｍｉｒ−３０２ ｓｈＲＮＡ相同体（即ち、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯｓ．１７と１８の雑種）が挿入された組換え導入遺伝子を含むＴｅｔ−Ｏｎベクターであることが好ましい。該細胞基質はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）、又はインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でｍｉｒ−３０２の標的となる遺伝子を発現する。該ｍｉｒ−３０２の標的となる細胞周期調節因子及び発癌遺伝子をサイレンシングすることによって、本発明は細胞の腫瘍形成能力を抑制でき、且つ処理された細胞を非腫瘍／非癌細胞に再プログラムすることができる。
【００８９】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい具体的実施例と形態を示すものであるが、本発明の範囲を制限するものではない。
【００９０】
以下の実験に関する開示において、次の略語を適用する。Ｍ（モーラー、ｍｏｌａｒ）、ｍＭ（ミリモーラー、ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）、μＭ（マイクロモーラー、ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）、ｍｏｌ（モル、ｍｏｌｅｓ）、ｐｍｏｌ（ピコモル、ｐｉｃｏｍｏｌｅ）、ｇｍ（グラム、ｇｒａｍｓ）、ｍｇ（ミリグラム、ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ）、μｇ（マイクログラム、ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ）、ｎｇ（ナノグラム、ｎａｎｏｇｒａｍｓ）、Ｌ（リットル、ｌｉｔｅｒｓ）、ｍｌ（ミリリットル、ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓ）、μｌ（マイクロリットル、ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓ）、℃（摂氏温度、ｄｅｇｒｅｅｓ Ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ）、ｃＤＮＡ（コピー又は相補的ＤＮＡ、ｃｏｐｙ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸、ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ、ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ、ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド−３リン酸、ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＲＮＡ（リボ核酸、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム、ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸、Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、ｔｒｉｓ−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ｈＥＳ（ヒト胚性幹細胞、ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、ｉＰＳ（誘導多能性幹細胞、ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、及びＳＣＲ（体細胞再プログラム、ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）。
【実施例１】
【００９１】
細胞培養及び形質移入
ヒト癌細胞株ＮＴｅｒａ−２、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＰＣ３及びＣｏｌｏ８２９はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、ヒト毛嚢細胞（ｈＨＦＣｓ）は、少なくとも２つの毛嚢真皮乳頭（ｈａｉｒ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａｅ）を４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼで分解することによって得られ、そのうち、コラゲナーゼの消化は、２０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）が補充されている新鮮なＲＰＭＩ １６４０培養液中で４５分作用させた。メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）は、３７℃、５％ＣＯ_２で、ヒトメラニン細胞成長補充剤−２（ＨＭＧＳ−２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が添加されており、抗生物質が含まれていない２５４培養液（Ｍｅｄｉｕｍ ２５４）中で培養された。細胞が７０％〜８０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）までに成長した時に、細胞をｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液中で１分間暴露することで単離させ、フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培養液（ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ−ｆｒｅｅ ＤＭＥＭ ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回すすいだ後、これらの単離された細胞を１：１０に希釈し、ＨＭＧＳ−２補助剤を含有する新鮮な２５４培養液中で培養し続けた。電気穿孔法で遺伝子形質移入を行う工程については、ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓベクター（１０μｇ）とｐＴｅｔ−Ｏｎ−Ａｄｖ−Ｎｅｏ（−）ベクター（５０μｇ）の混合物を、低浸透圧緩衝溶液（２００μｌ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）における単離された細胞（２０，０００〜５０，０００個）中に投入し、また、電気穿孔は電気穿孔機を用いて、３００〜４００Ｖで１５０μｓｅｃ実施し、これらのベクターを相応な細胞内に送達した。電気穿孔を経た細胞はまずフェノールレッドフリーで、２０％ノックアウト血清（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２４時間培養した。続いて、８５０μｇ／ｍｌのＧ４１８及び３．７５μｇ／ｍｌより高い濃度のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を追加し、毎日入れ替えるように、細胞が強烈の赤色蛍光（ＲＧＦＰ）を発現するまで３から５日間継続した。次に、ＴＥ２００倒立顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）で個々の赤色蛍光細胞（ｍｉｒＰＳ）を監視し、ＭＯ−１８８ＮＥ ３Ｄ顕微操作装置（Ｎｉｋｏｎ）で９６穴プレートに個別的に収集した。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）欠乏条件下で、２０％ノックアウト血清（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００μＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、１００ ＩＵ／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのステレプトマイシン／２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８、０．１μＭのＡ８３−０１及び０．１μＭのバルプロ酸（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地でｍｉｒＰＳ細胞を３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。一方、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ、３．７５〜５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）存在下で、ｍｉｒＰＳ細胞を同様なフィーダーフリー（ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ）の培養条件下で培養し、更に０．０５μＭのＧＳＫ抑制剤ＳＢ２１６７６３（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を添加した。ＧＳＫ抑制剤の添加はｍｉｒＰＳの増殖を促進したが、神経分化を引き起こす傾向がわずかに見られた。神経細胞誘導の面では、ｍｉｒＰＳ細胞を０．０５μＭ ＳＢ２１６７６３を含有し、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を含有しない上記フィードフリー層の培養条件で培養する。
【実施例２】
【００９２】
ｍｉｒ−３０２ｓを発現する組換えベクターの構築
Ｍｉｒ−３０２ファミリークラスター（ｍｉｒ−３０２ｓ）の生成は前記の通りである（Ｌｉｎ氏ら、２００８）。Ｍｉｒ−３０２ｓクラスターは、ｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、及びｍｉｒ−３０２ｄのマイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ）という４つの部分を含有する。ｍｉｒ−３０２ｓクラスターを構築するために使用される合成オリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は下記のように挙げられる。発現ベクターの構成において、我々は等量（１：１）のｍｉｒ−３０２ｓと予め作られたＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ組換え遺伝子を混合させ（Ｌｉｎ氏ら，２００６と２００８）、そしてＭｌｕＩ／ＰｖｕＩ制限酵素によって３７℃でこの混合物を４時間消化させた。次に、ゲル抽出フィルター（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）で該消化された混合物を純化させるとともに、３０μｌの再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）に収集し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ）を用いて８℃で１６時間作用し、該混合物をライゲーションさせた。該工程では、ｍｉｒ−３０２を発現する組換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子が形成され、更にＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素によって切断された後、ドキシサイクリンにより誘導できるｐＳｉｎｇｌｅ−ｔＴＳ−ｓｈＲＮＡベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）中に挿入されたことで、誘導性のｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓ発現ベクターが形成された。その後、我々はｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓベクターを更に修正し、即ち、ｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離されたＴＲＥ−ＣＭＶプロモーターを用いて、ｐＴＥｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓベクター本来のＵ６プロモーターを置換した。非誘導性のｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓの持続的発現ベクターを生成するために、我々はＥｃｏＲＩ制限酵素で該修飾したｐＴＥｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓベクターを切断し、ゲル電気泳動によりｔＴＳ−ＴＲＥの上流配列（１．５ｋｂ）を除去するとともに、切断されたベクターを改めて該ゲルから得ることによって、ＤＮＡライゲーション工程を行い、非誘導性のｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓベクターの構築を完成させた。
【００９３】
ｍｉｒ−３０２ファミリーマイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）クラスターのＤＮＡ組換えに使用される合成オリゴヌクレオチドとして、次のように、ｍｉｒ−３０２ａ−センス：５’−ＧＴＣＡＣＧＣＧＴＴ ＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴ ＡＡＡＣＧＴＧＧＡＴ ＧＴＡＣＴＴＧＣＴＴ ＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡ ＧＡＡＧＴＡＡＧＴＧ ＣＴＴＣＣＡＴＧＴＴ ＴＴＧＧＴＧＡＴＧＧ ＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴ Ｃ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９）、ｍｉｒ−３０２ａ−アンチセンス：５’−ＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡ ＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡ ＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡ ＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴ ＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣ ＡＡＡＧＣＡＡＧＴＡ ＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴ ＴＡＡＧＴＧＧＴＧＧ ＧＡＡＣＧＣＧＴＧＡ Ｃ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０）、ｍｉｒ−３０２ｂ−センス：５’−ＡＴＡＧＡＴＣＴＣＴ ＣＧＣＴＣＣＣＴＴＣ ＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡ ＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴ ＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴ ＴＴＧＡＡＡＧＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＴＡＧＴＡＧ ＧＡＧＴＣＧＣＴＣＡ ＴＡＴＧＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１）、ｍｉｒ−３０２ｂ−アンチセンス：５’−ＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣ ＧＡＣＴＣＣＴＡＣＴ ＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡ ＡＧＣＡＣＴＴＡＣＴ ＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡ ＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣ ＴＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧ ＧＡＧＣＧＡＧＡＧＡ ＴＣＴＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２）、ｍｉｒ−３０２ｃ−センス：５’−ＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴ ＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴ ＴＡＡＣＡＴＧＧＡＧ ＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧ ＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧ ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＣ ＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴ ＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣ ＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３）、ｍｉｒ−３０２ｃ−アンチセンス：５’−ＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣ ＧＣＣＴＣＣＡＣＴＧ ＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡ ＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴ ＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡ ＣＡＧＣＡＧＧＴＡＣ ＣＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＡＡＧＣＡＡＡＧＧＴ ＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４）、ｍｉｒ−３０２ｄ−センス：５’−ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＡ ＴＡＡＣＡＣＴＣＡＡ ＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣ ＡＣＴＴＡＧＣＴＡＡ ＧＣＣＡＧＧＣＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴ ＴＣＧＣＧＡＴＣＧＣ ＡＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５）、及びｍｉｒ−３０２ｄ−アンチセンス：５’−ＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣ ＧＡＡＣＡＣＴＣＡＡ ＡＣＡＴＧＧＡＡＧＣ ＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧ ＧＣＴＴＡＧＣＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＧＡＧＴＧＴ ＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡ ＣＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６）が挙げられる。また，我々はｍｉｒ−３０２マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）クラスターの代わりに、合成されたｍｉＲ−３０２ｓ−センス：５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＣＧ ＡＧＧＴＡＣＣＧＡＣ ＧＣＧＴＣＣＴＣＴＴ ＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡ ＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡ ＧＴＧＣＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴＴＧＡＧＴＧＧ ＴＧＴＧＧＣＧＣＧＡ ＴＣＧＡＴＡＴＣＴＣ ＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣ ＡＣＡＴＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７） 及びｍｉｒ−３０２ｓ−アンチセンス：５’−ＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣ ＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴ ＡＴＣＧＡＴＣＧＣＧ ＣＣＡＣＡＣＣＡＣＴ ＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡ ＡＧＣＡＣＴＴＡＡＴ ＴＴＣＣＡＴＧＴＴＡ ＡＡＧＴＡＡＡＧＡＧ ＧＡＣＧＣＧＴＣＧＧ ＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡ ＴＣＴＧＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８）のハイブリダイゼーションによって形成された手動で再設計のｓｈＲＮＡを用いることで、簡易なイントロ挿入を行った。ｍｉｒ−３０２相同体を設計する際、ウラシル（Ｕ）の代わりにチミン（Ｔ）を用いてもよく、逆も同様である。これらの合成配列の全ては、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行う前にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲル抽出法によって精製されている。
【００９４】
組換えられたｍｉｒ−３０２ファミリーマイクロＲＮＡ（ｍｉｒ−３０２ｓ）前駆体クラスターは、ｍｉｒ−３０２ａ−センスとｍｉｒ−３０２ａ−アンチセンス、ｍｉｒ−３０２ｂ−センスとｍｉｒ−３０２ｂ−アンチセンス、ｍｉｒ−３０２ｃ−センスとｍｉｒ−３０２ｃ−アンチセンス、及びｍｉｒ−３０２ｄ−センスとｍｉｒ−３０２ｄ−アンチセンスを含む４つのｍｉｒ−３０２ａ〜ｄ雑種を連結することによって形成された。これらのｍｉｒ−３０２ａ、ｍｉｒ−３０２ｂ、ｍｉｒ−３０２ｃ、及びｍｉｒ−３０２ｄ雑種は、それぞれＰｖｕＩ／ＸｈｏＩ、ＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ、ＮｈｅＩ／ＸｂａＩ及びＸｂａＩ／ＭｌｕＩ制限酵素によって消化された後、ゲルで抽出され、その後、濾過カラム（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）で３５μｌ滅菌された再蒸留水中に共に収集された。そして、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）（Ｒｏｃｈｅ、２０Ｕ）で混合雑種をライゲーションさせ、クラスターを形成した。最後にｍｉｒ−３０２ファミリーのマイクロＲＮＡクラスターをＰｖｕＩ／ＭｌｕＩ制限酵素直線化のＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ組換え遺伝子に挿入した。また、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７とＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８をハイブリダイゼーションさせてから、ＰｖｕＩ／ＭｌｕＩ制限酵素を用いて該雑種を切断し、切断された雑種をＰｖｕＩ／ＭｌｕＩ直線化のＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ中に挿入することによって、ｍｉｒ−３０２ ｓｈＲＮＡを形成した。
【００９５】
ｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓ及びＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓベクターを増殖させるために、濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＬＢ培地で大腸菌ＤＨ５αの菌株を培養した。そして、エンドトキシンフリーのマキシプレッププラスミド抽出キット（Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅ Ｍａｘｉ−Ｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を用いて、増殖後のｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ３０２ｓ及びＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓベクターを単離、精製した。
【実施例３】
【００９６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のマイクロアレイ分析
細胞密集度７０％で、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭマイクロＲＮＡ単離キット（ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭ ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、各細胞培養物から小型ＲＮＡｓを単離した。単離した小型ＲＮＡｓの純度と含量を１％ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動及び分光光度計の測定（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって評価した後、直ちにドライアイスで凍結させ、ＲＮＡマイクロアレイ分析を行うためにＬＣＳｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に送付した。各マイクロアレイチップは、それぞれＣｙ３もしくはＣｙ５で標識した単一のサンプルとハイブリダイゼーションされ、又はＣｙ３及びＣｙ５で標識した１対のサンプルとハイブリダイゼーションされた。次に、バックグラウンドの差し引き（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）及び正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行った。二重分析において、ｐ値を算出し、３倍より大きな差で発現した転写物を一覧表に示した。その結果は図１Ｃに示す。
【実施例４】
【００９７】
ノーザンブロット分析法
ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭマイクロＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で全ＲＮＡｓ（１０μｇ）を単離した後、１５％のＴＢＥ−ウレアポリアクリルアミドゲル又は３．５％の低融点アガロース電気泳動によって該全ＲＮＡｓを分画し、該分画された全ＲＮＡｓを電気ブロッティングによってナイロンメンブラン（ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）上に移した。続いて、［ＬＮＡ］−ＤＮＡプローブ（５’−［ＴＣＡＣＴＧＡＡＡＣ］ＡＴＧＧＡＡＧＣＡＣ ＴＴＡ−３’）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９）でｍｉｒ−３０２を検出した。その他の遺伝子を検出するプローブは更に合成され、その配列は表１に示す。全てのプローブは高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）によって精製し、且つ［^３２Ｐ］−ｄＡＴＰ（＞３０００ Ｃｉ／ｍＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）存在下で、末端転移酵素（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、２０ ｕｎｉｔｓ）で末端標識を行った。ハイブリダイゼーションは、５０％の新鮮な脱イオンホルムアミド（ｆｒｅｓｈｌｙ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ｐＨ７．０）、５倍デンハート液、０．５％ＳＤＳ、４倍ＳＳＰＥ、及び２５０ｍｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ断片の混合液中にて実施した（１８時間、４２℃）。次に、メンブランを２倍ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで連続２回洗浄し（１５分間、２５℃）、０．２倍ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで１回洗浄し（４５分間、３７℃）、そして、オートラジオグラフィーを実施した。その結果を、図１Ｄ、図４Ａ及び８Ｂに示す。
【実施例５】
【００９８】
ウェスタンブロット分析法
製造元の提案に基づき、プロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ及びＰＭＳＦを補充したＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ溶解／抽出試薬（ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ ｌｙｓｉｓ／ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ、Ｓｉｇｍａ）で細胞（１，０００，０００個）を溶解した。該溶解液を１２，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液を取った。そして、Ｅ−ｍａｘマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ）において、改良されたＳＯＦＴｍａｘプロテインアッセイパッケージでタンパク質濃度を測定した。還元（ｒｅｄｕｃｉｎｇ、＋５０ｍＭ ＤＴＴ）及び非還元（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ、ＤＴＴ無し）下において、各々３０μｇの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル用緩衝液に添加し、さらに３分間沸騰してから、６％〜８％ポリアクリルアミドゲルにロードした。次に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でタンパク質を解析した後、タンパク質をニトロセルロースメンブラン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に電気ブロットし、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング試薬（Ｏｄｙｓｓｅｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ；Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、 ＮＢ）でメンブランを室温で２時間培養した。その後、該試薬に一次抗体を加えて４℃で該混合物を培養した。使用した一次抗体は、Ｏｃｔ３／４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｓｏｘ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｎａｎｏｇ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｌｉｎ２８（Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＵＴＦ１（Ａｂｃａｍ）、Ｋｌｆ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＴＲＰ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｋｅｒａｔｉｎ １６（Ａｂｃａｍ）、ＣＤＫ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ２（Ａｂｃａｍ）、ＢＭＩ−１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＡＯＦ２（Ｓｉｇｍａ）、ＨＤＡＣ２（Ａｂｃａｍ）、ｈＴＥＲＴ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、β−ａｃｔｉｎ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、及びＲＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。一晩経過後、ＴＢＳ−Ｔで該膜を３回すすぎ、そして、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）中に室温で１時間暴露した。該ヤギ抗マウスＩｇＧとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０反応性染料（１：２，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が結合して二次抗体を形成した。更にＴＢＳ−Ｔで３回すすいだ後、Ｌｉ−ＣｏｒＯｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ及びＯｄｙｓｓｅｙ ＳｏｆｔｗａｒｅＶ．１０（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を用いて免疫ブロットの蛍光スキャニング及び画像解析を行った。その結果を、図１Ｄ、図４Ｂ、図７Ｃ〜７Ｄ、図８Ｂ及び９Ｂに示す。
【実施例６】
【００９９】
アポトーシスした細胞のＤＮＡのラダーアッセイ
製造元の提案に基づき、アポトーシスのＤＮＡラダーキット（Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＡ）を用いて、約２，０００，０００個の細胞からゲノムＤＮＡを単離し、そして単離されたＤＮＡを２μｇ取り、２％アガロースゲル電気泳動法によって評価した。その結果を図１Ｆに示す。
【実施例７】
【０１００】
ＤＮＡ含量のフローサイトメトリー分析
必要な実験を終えた後、細胞をトリプシンで加水分解させ、塊状に遠心分離し、さらに予め冷却した１ｍｌ ７０％メタノールを含有するＰＢＳ溶液中に浮遊させ、これらの細胞を−２０℃で１時間固定した。そして、これらの細胞をペレット状に遠心分離し、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した。再びこれらの細胞をペレット状に遠心分離し、３７℃で、１ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、０．５μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を含む１ ｍｌのＰＢＳ溶液において３０分間再浮遊させた。続いて、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で約１５，０００個の細胞を分析した。パルス幅対パルス面積の図を描き、単一細胞をゲーティングすることによって細胞ダブレットを除外した。収集したデータを「ＷａｔｓｏｎＰｒａｇｍａｔｉｃ」アルゴリズムでソフトウェアＦｌｏｗｊｏを使用して解析した。その結果を図３Ａ〜Ｂ、図６Ａ−ｂ及び６Ｃに示す。
【実施例８】
【０１０１】
ゲノム全体のマイクロアレイ分析
ヒトゲノムＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｕ１３３ ｐｌｕｓ ２．０ アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて、４７，０００個を超えたヒト遺伝子の発現パターンの変化を検出した。製造元の提案に基づき、ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭマイクロＲＮＡ単離キット（ｍｉｒＶａｎａ^ＴＭ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、各試験サンプルから全ＲＮＡを単離した。単離したＲＮＡの純度と含量を１％ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動及び分光光度計の測定（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって評価した。完全マッチしたプローブ及びミスマッチプローブの全体的平均差を用いて、サンプルシグナルを正規化した。そして、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０版、ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｏｎｓｏｌｅ^ＴＭ １．１．１版（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、及びＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇｓ（ＳｉｌｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ）ソフトウェアを用いて、ゲノム全体の遺伝子発現パターンの変化を分析した。遺伝子発現の変化が１倍より大きい場合は、陽性差異遺伝子と見なされた。遺伝子クラスター測定において、プラグインプログラムＧｅｎｅｔｒｉｘ（ＥｐｉｃｅｎｔｅｒＳｏｆｔｗａｒｅ）とＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウェアを組み合わせて使用した。各マイクロアレイ内の対照群ハウスキーピング遺伝子の平均値で、該サンプルシグナルを正規化した。その結果を図５Ａに示す。
【実施例９】
【０１０２】
ＤＮＡ脱メチル化の測定
ＤＮＡ単離キット（ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ）によって、約２，０００，０００個の細胞中のゲノムＤＮＡを単離した。１μｇの単離されたＤＮＡを取り、製造元の提案に基づき、重亜硫酸塩処理（ＣｐＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を行った。一方、２μｇの単離されたＤＮＡｓを取り、ＣＣＧＧ切断制限酵素ＨｐａＩＩで消化し、さらに１％アガロースゲル電気泳動によって、全ゲノムの脱メチル化を判別した（図５Ｂ）。重亜硫酸塩でＤＮＡを処理することによって、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換させる一方、メチル化シトシンをシトシンのままに維持させた。重亜硫酸塩ＤＮＡ配列決定分析においては、我々はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＯｃｔ３／４とＮａｎｏｇプロモーター領域を更に増幅した。Ｏｃｔ３／４プロモーター領域を増幅するために使用されるプライマーは、５’−ＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧ ＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴ ＧＣＴＴＴＧＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０）及び ５’−ＣＣＣＴＣＣＴＧＡＣ ＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣ ＣＡＣＣＡＣＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１）を含み、また、Ｎａｎｏｇプロモーター領域を増幅するために使用されるプライマーは、５’−ＴＧＧＴＴＡＧＧＴＴ ＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴ ＴＴＴＴＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２２） 及び ５’−ＡＡＣＣＣＡＣＣＣＴ ＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴ ＣＡＡＴＴＡ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２３）を含む。まず、重亜硫酸塩修飾後のＤＮＡｓ（５０ｎｇ）とこれらのプライマー（合計１００ ｐｍｏｌｅ）を１倍ＰＣＲ緩衝液中にて混合し、９４℃に加熱しながら２分間保ち、そして直ちに氷で冷却した。その後、高感度のＰＣＲ延長キット（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ）を用いて９４℃で１分間、７０℃で３分間のようなＰＣＲを２５サイクル行った。増幅反応終了後、３％アガロースゲル電気泳動法によって正確な大きさを有するＤＮＡ産物を更に分画し、続いて該ＤＮＡ産物をゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ＤＮＡ配列決定を行った。ＤＮＡメチル化部位の詳細なプロフィルは、重亜硫酸塩で修飾されたＤＮＡ配列内に変わっていないシトシンと重亜硫酸塩で修飾されていないＤＮＡ配列内の変わっていないシトシンとを比較することによって得られた。その結果を図５Ｃに示す。
【実施例１０】
【０１０３】
移植及び奇形腫の形成
約５〜１０個のｍｉｒＰＳ細胞由来の胚様体（４〜８細胞段階）を５０μｌのＤＭＥＭ培養液とマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の２：１混合液中に浮遊させた後、これらのｍｉｒＰＳ細胞由来の胚様体を６週齢の雌性偽妊娠の免疫不全ＳＣＩＤベージュ（ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅ）マウスの子宮に移植した。偽妊娠マウスを作る方法は、１ＩＵのヒト閉経期ゴナドトロピン（ｈｕｍａｎ ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ、ＨＭＧ）を２日間腹膜内注射し、そしてヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈｕｍａｎｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ、ｈＣＧ）をもう１日間注射した。該細胞及び該マウスは、移植前又は移植後において、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処理を行わない。移植期間では、２．５％トリブロモエタノール（Ａｖｅｒｔｉｎ）溶液で、１匹のマウスに０．４ｍｌの量でマウスを麻酔した。移植後又は移植細胞集団が１００ｍｍ^３より大きいサイズに成長した後、移植細胞集団（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ ｍａｓｓｅｓ）を３から４週間監視した。該腫瘍／奇形腫を切り離した後、数式（長さ×幅２）／２を用いて、その体積を計算し、且つ計数、秤量、及び、更なる組織学的解析を行った。奇形腫様組織嚢腫の形成（ｔｅｒａｔｏｍａ−ｌｉｋｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｙｓｔｓ）は、通常移植して約２．５週間後に観察できる。その結果を図５Ｄに示す。
【実施例１１】
【０１０４】
細胞侵入試験
まず、２００μｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌを単独使用し、又は２０％ＦＢＳ及び１％Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）のフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培養液を追加したＭａｔｒｉｇｅｌを用いて、チャンバーインサート（ｃｈａｍｂｅｒ ｉｎｓｅｒｔｓ、穴径１２μｍ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を塗布し、無菌環境下において翌日まで乾燥させた。フェノールレッドフリーＤＭＥＭ培養液を使用して、最終的に１００，０００個細胞／ｍｌの細胞密度になるように細胞を収集、すすぎ、及び浮遊させた。該細胞懸濁液を５００μｌ取ってトップチャンバー（ｔｏｐ ｃｈａｍｂｅｒ）内に分配させ、１．５ｍｌのＤＭＥＭならし培養液をボトムチャンバーに追加することで、走化性勾配（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を作り出した。３７℃で一晩置き、１６時間培養した後、侵入状況について測定を行った。まず、脱脂綿でトップチャンバーを拭き、そして１００％メタノールを用いてメンブランの下側に位置する侵入細胞を１０分間固定し、風乾させ、クレシルバイオレット（ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ）で２０分間染色した後、水で緩やかに洗浄した。乾燥後、１：１の１００％エタノールと０．２Ｍクエン酸ナトリウム（ＮａＣｉｔｒａｔｅ）の洗浄液でメンブラン上のクレシルバイオレット染色を２０分間洗い出し、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で波長５７０ｎｍの吸光度を読み取った。細胞の侵入率の表示法は、試験サンプルの吸光度対メンブランインサート層未乾燥の場合（総細胞数）に得られた吸光度の百分比とした。その結果を図６Ｄに示す。
【実施例１２】
【０１０５】
細胞接着試験
細胞接着試験は過去の報告に述べられた通りに行われた（Ｌｉｎ氏ら，２００７）。ヒト骨髄内皮細胞（ｈＢＭＥＣｓ）を１００，０００個細胞／ｍｌの密度で９６穴プレートに植え、試験前に接着培養液（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）［ＲＰＭＩ １６４０／０．１％ＢＳＡ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）］ですすいだ。トリプシン（腫瘍／癌細胞に使用する）又はコラゲナーゼ（ｍｉｒＰＳ細胞に使用する）を用いて、被験細胞を単離させ、無菌生理塩水で細胞をすすいだ後、１０μＭ ｆｕｒａ−４アセトキシメチルエステル蛍光プローブ（ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ，Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中で、再び細胞を１，０００，０００個細胞／ｍｌの密度で浮遊させたまま、３７℃の暗黒環境下で１時間経過した。続いて、該細胞を遠心分離させ、１％（ｖ／ｖ）プロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、１００ｍＭ）を含む無血清の培養液で細胞をすすいだ後、該細胞を接着培養液に３７℃の暗黒環境下で２０分間培養することで、細胞内の蛍光プローブを活性化した。その後、該１００，０００個の細胞（３００μｌの細胞懸濁液／ｗｅｌｌ）をコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）なｈＢＭＥＣ内皮細胞単層に投入し、３７℃で５０分間培養した。２５０μｌの接着培地を用いて２回すすいで、未接着の細胞を洗い流した。蛍光プレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、３７℃で励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３０ｎｍで蛍光を読み取った。その結果を図６Ｅに示す。
【実施例１３】
【０１０６】
インビボでの腫瘍形成試験
我々はＮＴｅｒａ−２細胞（総体積が１００μｌであるＭａｔｒｉｇｅｌ−ＰＢＳ中の２，０００，０００個細胞）を８週齢の雄性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ種）の脇腹部（即ち、後右肢）に異種移植した。該腫瘍に対して毎週監視し、ＮＴｅｒａ−２異種移植してから１週間後、ｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓベクター又はｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｄ＊ベクターをインサイチュー注射で導入した。マウス体重の１ｇあたり２μｇのポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）により調製されたｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓ又はｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｄ＊ベクターで、３日置きに５回の処理を行った。（合計１０μｇ）。製造元の提案に基づき、インビボ−ｊｅｔＰＥＩ送達試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を使用した。注射してから３週間後又はベクター非処理の腫瘍が平均サイズで約１００ｍｍ^３に成長した時点、サンプリングし始めた。腫瘍の組織学的評価及び免疫反応細胞毒性試験を行うために、血液、脳、心臓、肺臓、肝臓、腎臓又は脾臓のような主要な器官及び異種移植腫瘍は全て摘出された。そのうち、触診で腫瘍形成を監視し、数式（長さ×幅^２）／２で腫瘍体積を計算した。また、腫瘍に対して計数、解剖及び秤量を行い、ヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）及び免疫染色試験で組織学的な検査を行った。組織学的な検査では、脳、心臓、肺臓、肝臓、腎臓及び脾臓における検査可能な組織的病変が検出されなかった。その結果を図８Ａに示す。
【実施例１４】
【０１０７】
免疫染色試験
組織サンプルを４℃で４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に一晩固定させた。該サンプルをパラフィンワックスに包埋する前に、１倍のＰＢＳ、メタノール、イソプロパノール、及びテトラヒドロナフタレン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の順で洗浄した。次に、包埋したサンプルをミクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）で７〜１０μｍの厚さに切断し、ＴＥＳＰＡでコートした清潔なスライドガラス上に固定した。次に、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）を用いてスライドガラスを脱ろうし、取付け媒体（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ、Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）を用いてカバーガラスの下に取り付け、そして、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシン（ｅｏｓｉｎ）（Ｈ＆Ｅ、Ｓｉｇｍａ）で染色して形態を観察した。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色キットは、Ｉｍｇｅｎｅｘ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。製造元の提案に基づき、抗体の希釈及び免疫染色工程を行った。用いられた一次抗体は、Ｏｃｔ３／４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｓｏｘ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｎａｎｏｇ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＣＤＫ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ２（Ａｂｃａｍ）、ＢＭＩ−１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びＲＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。二次抗体としては、ビオチン標識のヤギ抗ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ）又はビオチン標識のウマ抗マウス（ｈｏｒｓｅ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を用いた。三次抗体としてのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ）を追加した。スライドガラスをＰＢＴで３回洗浄した後、ＤＡＢ基質（ＤＡＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で、結合された抗体の検出を行った。全視野スキャニングを備える１００倍の顕微鏡で、陽性結果が観察され、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈイメージングプログラム（Ｎｉｋｏｎ ８０ｉ顕微鏡定量分析システム）によって、２００倍の拡大倍率で計測して、定量分析を行った。その結果を図８Ｃに示す。
【実施例１５】
【０１０８】
ルシフェラーゼ ３’末端非翻訳領域レポーターアッセイ
ルシフェラーゼアッセイは、修飾されたｐＭｉｒ−Ｒｅｐｏｒｔ ｍｉＲＮＡ発現レポーターベクターシステム（ｐＭｉｒ−Ｒｅｐｏｒｔ ｍｉＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。Ｍｉｒ−３０２の標的部位（正常及び／又は変異）がｐＭｉｒ−Ｒｅｐｏｒｔ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒレポーターベクターの３’末端非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）のクローニングサイトに挿入された。合成された２つの標的部位を１２個の−ＣＡＧＴ−重複配列で区切った。もう１つのｐＭｉｒ−Ｒｅｐｏｒｔβ−ｇａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌベクターはレポーターなし（ｎｏ ｒｅｐｏｒｔｅｒ）の制御ベクターとして使用された。ドキシサイクリンによって処理し、または処理せずに、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造元の提案に基づき、２００ ｎｇのレポーターベクターで、５０，０００個のｍｉｒＰＳ細胞を形質移入した。形質移入して４８時間経過後に、細胞溶解液を収集した。ルシフェラーゼのノックダウンレベルは正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）され、相対的なルシフェラーゼ活性（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＲＬＡ）で表示され、その計算方法は、ドキシサイクリンによって処理された（Ｄｏｘ−ｏｎ）ｍｉｒＰＳ細胞のルシフェラーゼ活性レベルをドキシサイクリンによって処理されなかった（Ｄｏｘ−ｏｆｆ）ｍｉｒＰＳ細胞のルシフェラーゼ活性レベルで割ることによって計算される。また、ｍｉｒ−４３４を発現する細胞は電気穿孔法によってｐＴｅｔ−Ｏｎ−ｔＴＳ−ｍｉＲ４３４−５ｐをｈＨＦＣｓに導入することで生成され、ネガティブコントロールとした。その結果を図７Ｂ及び図１０Ｂに示す。
【実施例１６】
【０１０９】
ＴＲＡＰ（テロメアリピート増幅プロトコル）法
製造元の提案に基づき、プロテアーゼ抑制剤、ロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ及びＰＭＳＦを追加した細胞分解／抽出試薬（ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ ｌｙｓｉｓ／ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ、Ｓｉｇｍａ）で約１，０００，０００個の細胞を溶解した。１２，０００ｒｐｍの回転速度で、４℃において該分解液を２０分間遠心分離させ、分解液（上澄み液）を収集した。続いて、Ｅ−ｍａｘマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ）上で、改良されたＳＯＦＴｍａｘタンパク質アッセイソフトでタンパク質濃度を測定した。赤外アレクサフルオロ６８０（ｉｎｆｒａｒｅｄ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ ｄｙｅ、ＴＳ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）標識のオリゴヌクレオチド５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２４）及び ５’−ＧＴＧＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣ−３’（ＣＸ ｐｒｉｍｅｒ，３０μＭ）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２５）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物を測定した。テロメラーゼ抑制剤は主要な混合液に直接に追加された。全ての被験細胞株に対して、反応ごとに５０ｎｇのタンパク質を使用することで、最良な結果に達した。３０℃で３０分間培養後、サンプルをポリメラーゼ連鎖反応器に入れ、９４℃まで加熱し、２分間保持した後、９４℃で変性反応（ｄｅｎｕｔｕｒａｔｉｏｎ）を３０秒間、５７℃で合成反応（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を３０秒間のＰＣＲを３５サイクル、最後に５７℃で単一合成後を３０秒間行った。次に、６％の非変性ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｎｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）電気泳動法でＰＣＲ産物を分画させ、Ｌｉ−Ｃｏｒオディセ赤外イメージャー（Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ）及びＯｄｙｓｓｅｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ．１０（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を用いて画像のスキャニング及び分析を行った。その結果を図９Ａに示す。
【実施例１７】
【０１１０】
統計解析
免疫染色、ウェスタンブロット及びノーザンブロット法による分析において、７５％より大きいシグナル強度の変化のいずれも陽性の結果とみなされ、これらの結果が解析された後、平均値±標準誤差（ｍｅａｎｓ±ＳＥ）で表示された。資料の統計解析は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって計算された。主効果が有意な場合、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓポストホックテスト（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔ）で対照群と有意に異なる群を判定した。２処理群間の対での比較には、両側スチューデントｔ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔ）を用いた。２群より多い処理群を含む実験では、ＡＮＯＶＡを行った後に、ポストホック多重範囲検定（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ）を行った。確率ｐ＜０．０５を統計上において有意とみなした。両側検定から全ｐ値を決定した。
【０１１１】
参考文献
以下の参考文献は、参照として本明細書に完全に記載されたものとして援用される。
【０１１２】
【表１】




本明細書に記載されている実施例及び実施形態は例示のみの目的であり、種々の修正又は変更が当業者に提案されること、そして添付された特許請求の範囲に記載された本発明の精神及び範囲内に含まれるべきであることは理解される。本明細書にて引用された全ての刊行物及び特許は、その全体が本明細書において援用される。
【０１１３】
表１．実施例４に係る配列
【０１１４】
【表２】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え核酸組成物を用いて標的細胞において特定の遺伝子サイレンシング効果を誘発する方法であって、
（ａ）ｍｉｒ−３０２の標的となる複数の細胞遺伝子を干渉するための少なくとも１つの遺伝子サイレンシングエフェクターになるように、該組換え核酸組成物を提供して、送達、転写及びプロセシングされる工程と、
（ｂ）該標的細胞を含み、且つｍｉｒ−３０２の標的となる細胞周期調節因子遺伝子及び発癌遺伝子を発現する細胞基質を、該組換え核酸組成物で処理する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
該標的細胞は、奇形腫において見つかった腫瘍細胞類に属するヒト細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該標的細胞は、癌組織に由来するヒト細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該組換え核酸組成物は、発現可能ベクターを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該組換え核酸組成物は、薬剤誘導性遺伝子発現プロモーターを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該薬剤誘導性遺伝子発現プロモーターがテトラサイクリン誘導体、またはその等価物によって制御される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該組換え核酸組成物は、持続的遺伝子発現プロモーターを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該持続的遺伝子発現プロモーターは、ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ、またはその等価物によって駆動される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該持続的遺伝子発現プロモーターは、ウィルスプロモーターである請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
該細胞基質は、ｍｉｒ−３０２の標的となる複数の細胞遺伝子を発現する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該細胞基質を処理する工程は、ｍｉｒ−３０２がｍｉｒ−３０２の標的となる細胞遺伝子を抑制する条件下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該組換え核酸組成物は、５’末端供与スプライス供与部位、イントロン挿入部位、分岐点モチーフ、ポリピリミジントラクト、及び３’末端受容スプライス部位を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該イントロン挿入部位は、ｍｉｒ−３０２と相同性を有する該遺伝子サイレンシングエフェクターを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該組換え核酸組成物は、さらに複数のエクソンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１配列またはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２配列に対して相同性を有する配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３配列に対して相同、または／及び相補的である請求項１の記載の方法。
【請求項１７】
該遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９配列、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０配列、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１配列、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１２配列、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１３配列、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４配列、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５配列、及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６配列の雑種をライゲーションにより連結されて形成される請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該遺伝子サイレンシングエフェクターは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７配列及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８配列の雑種から形成される組換え核酸配列である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該組換え核酸組成物は、遺伝子送達法によって該細胞基質中に送達される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
該ｍｉｒ−３０２の標的となる細胞周期調節子遺伝子及び発癌遺伝子は、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃｙｌｃｉｎ Ｄ、ＢＭＩ−１、及びこれらの組み合わせから選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
該特定の遺伝子サイレンシング効果は、細胞周期の減衰、Ｇ０／Ｇ１チェックポイントの停止、抗腫瘍形成、及び癌細胞のアポトーシスの中の少なくとも１つを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
該特定の遺伝子サイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉に起因にする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該組換え核酸組成物は、遺伝子工学手法により生成される請求項１に記載の方法。

【図１Ｃ】

【図６Ｂ】

【図８Ｃ】

【図１０Ｂ】

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図６Ａ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図６Ｅ】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図７Ｄ】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１１】

【公表番号】特表２０１３−５０３１６４（Ｐ２０１３−５０３１６４Ａ）
【公表日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２６７４５（Ｐ２０１２−５２６７４５）
【出願日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３７２５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２５５６６
【国際公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【出願人】（５１００８７８０７）
【氏名又は名称原語表記】ＬＩＮ，Ｓｈｉ−Ｌｕｎｇ
【出願人】（５１００８７９９９）
【氏名又は名称原語表記】ＷＵ，Ｄａｖｉｄ　ＴＳ
【Ｆターム（参考）】