油糧粕からのアルコール製造方法
【課題】トウモロコシ胚芽粕などの食用油圧搾残物を、酵素加水分解反応によって糖化およびアルコール発酵を行ない、低環境負荷で低エネルギーのバイオエタノール生産技術を開発する。
【解決手段】食用油製造工程で発生する油糧粕であるトウモロコシ胚芽粕を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ菌体による糖化分解を酸性領域において行なう糖化分解工程と、この糖化分解工程で得られた糖をキシロースおよびセロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母でエタノール発酵する工程とを備える。
【解決手段】食用油製造工程で発生する油糧粕であるトウモロコシ胚芽粕を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ菌体による糖化分解を酸性領域において行なう糖化分解工程と、この糖化分解工程で得られた糖をキシロースおよびセロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母でエタノール発酵する工程とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は油糧粕からのアルコール製造方法に関し、特にトウモロコシ胚芽粕からのエタノール製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖・デンプン等を原料とするエタノール製造では、将来的に食料問題と競合するため、糖・デンプンに依存しない新しいバイオエタノール製造法の開発が求められている。バイオエタノール原料となるトウモロコシの生産は年々増加しており、デンプン以外のセルロース系廃棄物からのバイオエタノール生産は、ますます重要視されている。例えば、トウモロコシｓｔｏｖｅｒと呼ばれる皮や芯、茎などの廃棄物を希硫酸法で加水分解処理を行ない、ヘミセルロースを分解した後、セルラーゼによって糖にする方法が知られている（非特許文献１）
また、セルロースをセルラーゼにより加水分解してグルコースを経て酵母により発酵することでエタノールへの変換が可能である。セルラーゼ高生産菌としては、糸状真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉが知られており、セルロースをグルコースに完全分解可能な複数のセルラーゼを持つことが知られている（非特許文献２）。
【０００３】
また、バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースを酵素分解し、次いで、セルロースおよびヘミセルロースの酵素分解により生成した糖類を発酵させることによりエタノールを生成するバイオエタノールの製造方法が開示されている。このバイオエタノールの製造方法は、バイオマスに含まれるリグニンを破壊処理するとともに、当該バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの構造分解処理する前処理工程と、この前処理工程にて構造分解処理を施したセルロースおよびヘミセルロースを酵素分解させる酵素分解工程と、この酵素分解工程にて生成した糖類を発酵させる発酵工程と、この酵素分解工程にて生成した糖類を含む溶液と、上記発酵工程にて生成したエタノールを含む溶液との熱交換を行う熱交換工程と、上記発酵工程にて生成したエタノールを含む溶液から発酵菌を分離する発酵菌分離工程を有することを特徴としている（特許文献１）。
【０００４】
また、キシロースを代謝可能なアーミング酵母として、ともにピチア・スチピチス由来のキシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子であるＸＹＬ１（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５９４６５）およびＸＹＬ２（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５５３９２）、ならびにサッカロマイセス・セレビシエ由来キシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子であるＸＫＳ１（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ８２４０８）遺伝子の細胞内発現のためのプラスミドｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫの構築についても知られている（特許文献２）。
【０００５】
一方、コーン胚芽を搾油した後のトウモロコシ胚芽粕は、飼料原料として用いられているが、飼料原料としての粗たんぱく質含有量を上げるためにたんぱく質溶液の吸着などを行なうなどさらなる加工処理が行なわれている。
このため、トウモロコシ胚芽粕などの油糧粕は、付加価値の高い資材ではなく、この有効利用が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１００７１３
【特許文献２】特開２００８-１９３９３５
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】http://sugar.lin.go.jp/japan/view/jv_0610b.html
【非特許文献２】http://pelican.nagaokaut.ac.jp/GER/study/e15.html
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、トウモロコシ胚芽粕などの油糧粕を、酵素加水分解反応によって糖化およびアルコール発酵、特にエタノール発酵を行ない、低環境負荷で低エネルギーのバイオエタノール生産技術の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の油糧粕からのアルコール製造方法は、油糧粕を菌体による糖化分解を行なう糖化分解工程と、この糖化分解工程で得られた糖をアルコール発酵する工程とを備え、上記油糧粕が食用油製造工程で発生する油糧粕であり、上記菌体が糸状菌であることを特徴とする。特に上記アルコールがエタノールであることを特徴とする。
また、上記油糧粕がトウモロコシ胚芽粕であることを特徴とする。特に、搾油後の酸性胚芽粕であることを特徴とする。
また、上記糸状菌がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉであり、酸性領域において糖化分解を行なうことを特徴とする。
また、上記アルコール発酵がアーミング酵母を用いるアルコール発酵であり、上記アーミング酵母がキシロースおよびセロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアルコール製造方法は、油糧粕としてのトウモロコシ胚芽粕をそのまま使用して糖化分解、発酵させるので、過激な酸処理や熱エネルギーを必要とすることなく、短時間で糖化分解および発酵により、付加価値が低い油糧粕をバイオマス資源として有効利用が図れる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】トウモロコシ粒の分別工程を示す図である。
【図２】糖化分解後の溶液中に含まれるブドウ糖・セロオリゴ糖などを示すＴＬＣである。
【図３】糖化分解後の溶液中に含まれる還元糖の測定結果である。
【図４】糖化分解におけるヘミセルラーゼの濃度と反応時間との関係を示す図である。
【図５】還元糖の生成割合をトウモロコシ胚芽粕（固形分換算）中の割合で示す図である。
【図６】キシロースを代謝可能なアーミング酵母のプラスミドマップである。
【図７】セロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母のプラスミドマップである。
【図８】アルコール発酵前後の組成変化を示す液体クロマトグラフィー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
トウモロコシ胚芽粕は、植物油脂の製造から得られる副産物資源の一つである。トウモロコシ食用油を製造する際にトウモロコシの胚芽に含まれる油分を搾油・抽出を行なった後に産出される油糧粕である。同じく油糧穀物として知られている大豆やなたねとは異なり、トウモロコシは胚芽中に油分が局在するため、トウモロコシ粒を原材料とするのではなく胚芽だけ分別されコーン油製造に用いられる。トウモロコシ粒の分別工程について、図１に示す。
【００１３】
トウモロコシ粒は澱粉原料としてスターチメーカーに利用される。トウモロコシ粒は果皮（約５質量％（以下、質量％を％と略記する））、胚乳（７５〜８０％）、胚芽（１０〜１５％）、油分（約５％）に大別されるが、澱粉質は胚乳の部分に含まれるため、現在スターチメーカーは主にウェットミリングと呼ばれる工程によって、胚乳と胚芽との分別を行なう。この工程では希薄な亜硫酸溶液にトウモロコシ粒を約４８時間浸積させ、トウモロコシ粒を膨潤させ分別を行なう。浸積により、別れた胚乳は水分を含み下部に沈降し、油分を多く含む胚芽は上部に集まる。これを比重差により集め乾燥させた後、胚乳の部分はコーンスターチの製造原料として利用され、胚芽の部分は副産物として、植物油脂原料となる。胚芽はもともと約３５％程度の油分を含むが、ウェットミリングによって、胚芽に含まれる可溶性たんぱく質などが抽出され、油分の濃縮が起こり、結果的に約５０％の油分を含む油糧原料となる。大豆やなたねと比べ、胚芽の発生数量は少なくなるが、単位当たり油分を多く含む原料であるため、植物油脂の製造効率はよい原料である。この胚芽に含まれる油分は圧搾と呼ばれる工程により約半分の油が搾油され、残りは有機溶剤のｎ−ヘキサンにより抽出をされ、トウモロコシ粗油が得られ、以降の精製工程を経て、食用のコーン油となる。
【００１４】
油分を除かれたトウモロコシ胚芽は大豆やなたねと同様にトウモロコシ胚芽粕となる。トウモロコシ胚芽粕の成分を分析した結果を表１に示す。表１は製造ロットの異なるトウモロコシ胚芽粕Ａ、ＢおよびＣの分析値と、それらの平均値を表している。
表１に示すように、トウモロコシ胚芽粕中に含まれる窒素（Ｎ）含量またはこれに基づく粗たんぱく質値（Ｎ％×６．２５）は約２０％と低い。また、胚乳と胚芽の分別におけるウェットミリングで酸が使用されるため、胚芽は酸性を示し、搾油後も胚芽粕はｐＨ３．５〜４．０の酸性が確認される。さらにトウモロコシ胚芽中には澱粉質を殆ど含まない。このため、トウモロコシ胚芽粕は、大豆粕やなたね粕よりも飼料原料や肥料原料としての利用価値が低い。
また、トウモロコシ胚芽粕中に含まれる、セルロース質の含有量は平均値として、セルロース１０．９％、ヘミセルロース２３．３％、リグニン０．６％であり、粗繊維と可溶性無窒素物を合わせた含有量約６３．５％中の５０〜５５％程度がセルロース質に該当する。
【００１５】
【表１】
【００１６】
次に、トウモロコシ胚芽粕は、後述する微生物による糖化分解工程において、胚芽粕に含まれる他の微生物が影響を与えることも考えられる。そこでトウモロコシ胚芽粕に含まれる微生物が如何なるものか以下に示す微生物試験方法で確認を行なった。結果を表２に示す。
（１）一般生菌数は、トウモロコシ胚芽粕１ｇを１０ｍｌと１００ｍｌの滅菌水にけん濁を行ない、軽く遠心分離を行なった後、上澄み液を標準寒天培地に加え、３７℃で４８時間培養後に寒天上に形成されるコロニー数の計測を行なった。
（２）大腸菌群数は、トウモロコシ胚芽粕１ｇを１０ｍｌと１００ｍｌの滅菌水にけん濁を行ない、軽く遠心分離を行なった後、上澄み液をＸ−ｇａｌ寒天培地に加え、３７℃で２４時間培養後に寒天上に青いコロニー（陽性）が形成されるか確認を行なった。
（３）カビ・酵母は、トウモロコシ胚芽粕１ｇを１０ｍｌと１００ｍｌの滅菌水にけん濁を行ない、軽く遠心分離を行なった後、上澄み液をポテトデキストロース寒天培地に加え、３０℃、５日間後形成された寒天上のコロニー数の計測を行なった。
（４）サルモネラ菌は、食品衛生検査指針（微生物編）に掲載されている試験法を一部改良して行なった。即ち、サンプル量として、トウモロコシ胚芽粕を１０ｇ取り、ＢＰＷ培地で前培養を行ない、次ぎにＨＴＴ培地で選択増菌培養、次いでＤＨＬ寒天培地とＢＧ寒天培地で分離培養を行ない、寒天上に形成されるコロニーの観察を行なった。
【００１７】
【表２】
【００１８】
表２に示すように、１０倍希釈での測定で一般生菌数が４０個、カビ・酵母数が１０個検出された。大腸菌群とサルモネラ菌は検出されなかった。トウモロコシ胚芽粕が酸性であるため、計測される菌数の数も大豆粕やなたね粕に比べ、少ないと考えられる。また、トウモロコシ胚芽粕を１２１℃、２０分の条件でオートクレイブした後、同様に微生物試験を行なった結果、上記菌数は全く検出されなかった。
【００１９】
上述したように、トウモロコシ胚芽粕は、セルロース質が多く、酸性状態で得られ、飼料原料や肥料原料としての利用価値が低く、付加価値の高い資材ではなく、その有効利用が望まれている。
なお、図１は、油糧粕の原料として、本発明の好ましい例としてのトウモロコシ胚芽粕の分別について説明したが、同様にたんぱく質含量が低く飼料原料や肥料原料としての利用価値が低い油糧粕もその有効利用が望まれている。
【００２０】
本発明のアルコール、特にエタノール製造方法は、油糧粕、特にトウモロコシ胚芽粕中に含まれる上記セルロース質を微生物の培養を通じて、ブドウ糖・セロオリゴ糖などに分解する糖化分解工程を経る。
糖化分解に用いる微生物としては、糸状菌、細菌、放射菌であることが好ましく、これらの中で糸状菌が好ましい。また、糸状菌の中でもＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉが好ましい。
その理由は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉが（１）セルラーゼ酵素の高生産菌である、（２）複数種のセルラーゼ酵素を発現・生産する、（３）成長が早く、増殖力が強い、（４）成育阻害に強く、成育域が広い、（５）遺伝子組み換えなどの研究が盛んである等である。例えば発現するセルラーゼファミリーの生産量比率を遺伝子操作することにより、最もセルロース質の分解効率のよい酵素発現・生産を調節できる。
【００２１】
糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より入手し、トウモロコシ胚芽粕中のセルロース質の糖化分解を検討した。
トウモロコシ胚芽粕は前述したとおり、ｐＨが３．５〜４．０の範囲にあるため、これをＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉにより培養を行なうにおいて、このｐＨ領域においてこの糸状菌の成育が可能かどうかについて検討した。
Ｐｏｔａｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ４ｇ、Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ、Ａｇａｒ １５ｇを滅菌水１Ｌに溶解後、オートクレイブ滅菌を行なったＰＤＡ培地に硫酸を用いて、ｐＨ３．９、ｐＨ４．２、ｐＨ４．５、ｐＨ４．７、ｐＨ４．９になるようにｐＨ調整を行ない、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを温度３０℃にて５日間振盪培養した結果、ｐＨ３．９では若干の成育の遅れは見られたが、全ての培地液体中に分生子の形成が確認され、５日目には十分な成育が確認できた。この結果から、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉはトウモロコシ胚芽粕（ｐＨ３．８５）と同様なｐＨ領域においても、成育が可能であることが分かった。
【００２２】
培養おいて基質であるトウモロコシ胚芽粕の濃度を５％とし、以下の６条件で３０℃、５日間振盪培養を行ない、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの培養状況およびトウモロコシ胚芽粕の分解度合いを調査した。
（１）培地＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理有り、ｐＨ ６．０
（２）培地＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理無し、ｐＨ ６．０
（３）水＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理有り、ｐＨ ６．５
（４）水＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理無し、ｐＨ ６．５
（５）水＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理有り、ｐＨ ３．５
（６）水＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理無し、ｐＨ ３．５
なお、（１）および（２）の条件で使用した培地は、グルタミン酸ナトリウム５．２６ｇ、りん酸水素二カリウム５．２６ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．０５ｇ、塩化ナトリウム２．１１ｇに水を加えて１Ｌとし、１２１℃、２０分オートクレイブ滅菌を行なった組成を用いた。（３）〜（６）は、培地を使用せずに水だけで培養した。
３０℃、５日間振盪培養後、培養状態を目視で観察すると共に、遠心分離により上澄み溶液の回収を行ない、この溶液中に含まれるブドウ糖・セロオリゴ糖などを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、定性分析を行なった。結果を図２に示す。
【００２３】
培養後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行なうことで上澄みと沈澱部に分離が見られた。培養条件（１）、（２）、（３）および（６）で明確にトウモロコシ胚芽粕の組織崩壊が沈澱部に確認された。つまり、糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ によりトウモロコシ胚芽粕のセルロース質が分解されたことが考えられる。さらに上澄み液の外観も清澄なもの、濁りを生じているものに分かれ、培養条件（６）は、清澄な上澄み液が得られた。
また、図２に示す上澄み溶液のＴＬＣ分析結果から、上澄み溶液中にセルロース質の分解産物であるブドウ糖、セロオリゴ糖の定性スポットが確認された。
組織崩壊の目視結果と同様に培養条件（１）、（２）、（３）および（６）で確認されるスポットの濃度が高く、ブドウ糖・セロオリゴ糖への糖化分解が適切な条件であったと考えられる。
【００２４】
また、目視で確認された上澄み液の濁度は培養における他の菌類のコンタミ汚染度合いを示していると考えられる。即ち、糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉは他の細菌とくらべ個体が大きいため、遠心分離により簡単に沈澱するため、上澄み液には殆ど観察されなくなるが、他の細菌が混在しているとこれらは上澄み液に濁りを生じる。上記実験において、培養条件（６）は最も清澄な上澄み液が得られた。
以上の結果、本発明の糖化分解工程では、上澄み液が清澄でＴＬＣ分析による糖類への分解が優れている酸性領域における培養条件（６）が好ましい培養条件である。
さらに、酸性領域における培養条件（６）は、トウモロコシ胚芽粕の滅菌を行なう必要もなく、水を加えて培養を行なうことのみでセルロース質の分解産物であるブドウ糖・セロオリゴ糖が得られるため、実用化にむけて十分なコストダウンが図れる優れた糖化分解工程である。
【００２５】
上記糖化分解は、トウモロコシ胚芽粕に含まれるセルロースについて検討した。しかし、トウモロコシ胚芽粕には１０．９％のセルロースだけでなく、２３．３％のヘミセルロースも含まれている。このため、このヘミセルロースを糖化分解する菌について検討したところ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のヘミセルラーゼが好適であることが実験の結果分かった。
トウモロコシ胚芽粕の糖化分解工程において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のヘミセルラーゼとその両者が共存したときの還元糖やグルコースの生成量を確認するために、（１）トウモロコシ胚芽粕のみの場合、（２）トウモロコシ胚芽粕にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉだけを加えた場合、（３）上記ヘミセルラーゼだけを加えた場合、（４）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとヘミセルラーゼ両方を加えた場合の４種類の条件を用いて、以下に示す糖化分解実験を行なった。
【００２６】
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに蒸留水に対してトウモロコシ胚芽粕が１０％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水１００ｍｌにトウモロコシ胚芽粕１０ｇを加える。
そこに、（１）トウモロコシ胚芽粕のみの場合、（２）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを培養したトウモロコシ胚芽粕を０．０５ｇ、（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のヘミセルラーゼを０．０１％、（４）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを培養したトウモロコシ胚芽粕を０．０５ｇおよび上記ヘミセルラーゼを０．０１％の４条件で、３７℃、１６０ｒｐｍで撹拌器を回転させながら２日間反応を行なった。
反応終了後、遠心分離によって上清を回収した。上清にどのようなオリゴ糖が含まれるかを確認するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ)によって確認したところ、上記（３）および（４）の条件の場合、顕著にグルコースが確認できた。また、反応後の上清に含まれる還元糖濃度をＤＮＳ法によって、また、グルコース濃度をグルコ−オキシダーゼ法によってそれぞれ測定した。測定結果をトウモロコシ胚芽粕中の割合に換算した結果を図３（ａ）および（ｂ）に示す。図３（ａ）は還元糖の割合を示す図であり、図３（ｂ）は還元糖に含まれるグルコースの割合を示す図である。
【００２７】
図３（ａ）および（ｂ）の結果から、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉやヘミセルラーゼだけを単独で添加した場合に比べて、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとヘミセルラーゼ共存下の方が、反応２日目の段階ではより多くの還元糖およびグルコースを得ることができた。トウモロコシ胚芽粕から２３．８％の還元糖、また１８．４％のグルコースが得られた。さらに生成した還元糖に占めるグルコースの割合は７７．３％と高く、得られた還元糖の大部分がグルコースであると分かった。トウモロコシ胚芽粕から２３．８％の還元糖が得られたということは、トウモロコシ胚芽粕に含まれる総セルロースの６９．６％を還元糖に分解できたことになる。この結果より、トウモロコシ胚芽粕からより多くの糖を得るためには、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉやヘミセルラーゼを単独で加えるのではなく、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとヘミセルラーゼ両方を加えた方が効果的である。
【００２８】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとヘミセルラーゼとが共存した場合、最も多くの還元糖やグルコースが得られる反応時間を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの共在下でヘミセルラーゼ濃度を変え、還元糖濃度およびグルコース濃度の経時変化を以下の実験で調べた。
蒸留水に対してトウモロコシ胚芽粕が１０％(ｗ／ｖ)となるように５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに取り、そこへＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを培養したトウモロコシ胚芽粕を０．０５ｇ加えた。さらに、ヘミセルラーゼ濃度が０．１％、０．０１％、０．００５％、０．００１％となるようにヘミセルラーゼを加え、３７℃、１６０ｒｐｍで反応させ、２４時間毎に３日間上清を１ｍｌ程度回収した。また、トウモロコシ胚芽粕のみの場合とヘミセルラーゼを加えずにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉだけを加えた場合も同様に行なった。上清にどのようなオリゴ糖が含まれるかを確認するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ)によって確認した（展開溶媒：酢酸エチル：メタノール：水＝１２：７：３、発色方法：硫酸噴霧）。次に上清の還元糖濃度をＤＮＳ法によって測定した。また、グルコース濃度をグルコーオキシダーゼ法によって測定した。測定結果を図４（ａ）および（ｂ）に示す。図４（ａ）は還元糖の生成割合を示す図であり、図４（ｂ）はグルコースの生成割合を示す図である。
【００２９】
図４（ａ）および（ｂ）に示すように、還元糖およびグルコースの生成割合は、共にヘミセルラーゼ濃度が高くなるとともに増加した。また、還元糖、グルコース共に全ての場合において、反応４８時間後で最も多く生成することが分かった。それ以降はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉによって生成された糖が代謝され、減少したと考えられる。
本発明における糖化分解工程において、ヘミセルラーゼの濃度は、トウモロコシ胚芽粕に対して、０．１％以上であることが好ましい。
また、糖化分解時間は、還元糖またはグルコースの生成割合が最大となる時間であることが好ましく、この時間は、予備的な糖化分解実験により求めることができる。
【００３０】
糖化分解工程におけるトウモロコシ胚芽粕の最適な水分含量を調べるため、トウモロコシ胚芽粕に含まれる水分含量を変えて生成する還元糖量の違いを測定した。
原料となるトウモロコシ胚芽粕には１０％の水分が含まれていることを考慮して、原料に対する水分含量が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１．８％となるようにトウモロコシ胚芽粕を調製した。また、水分含量が１０％を対照とした。トウモロコシ胚芽粕に対して０．１％となるようにヘミセルラーゼを添加し、３７℃で静置して反応させた。反応開始後２４時間毎にサンプリングし、遠心分離によって上清を１ｍｌ回収した。得られたサンプルに含まれる還元糖濃度をＤＮＳ法によって測定した。結果を図５に示す。図５は還元糖の生成割合をトウモロコシ胚芽粕（固形分換算）中の割合で示す図である。
【００３１】
図５より、水分含量を多くする程、トウモロコシ胚芽粕の多くを還元糖に分解することができた。これは、水分含量が少ない程、還元糖の濃度が高く、そのため生成物による酵素反応の阻害が起こりやすくなるためであると考えられる。トウモロコシ胚芽粕をより多く分解し効率良く還元糖およびグルコースを得るには、加えるトウモロコシ胚芽粕量を増やすだけでなく水分含量を高くすることで、トウモロコシ胚芽粕をより多く分解させることが重要である。一方で、反応装置の容量を考慮すると、体積当たりにより多くのトウモロコシ胚芽粕を投入するには、水分含量を少なくすることが必要であるといえる。さらに、効率良く分解するためにはある程度の水分含量が必要となる。
水分含量としては、図５より、６０％〜９０％が好ましい。６０％未満になると糖化分解反応が十分でなく、９０％をこえると反応装置の容量が大きくなりすぎる。
【００３２】
アルコール発酵、特にエタノール発酵工程について説明する。
エタノール発酵工程に用いられるエタノール生産に優れた酵母として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがある。しかしこの酵母はグルコースを効率よくエタノールへと発酵できるが、キシロースなどに代表されるＣ５糖、およびセロオリゴ糖は資化することができない。これらの糖分からエタノール発酵が行なえる酵母を構築することで、トウモロコシ胚芽粕の糖化分解物から効率よくエタノール発酵が行なえる。そこで以下のアーミング酵母の構築を行なった。
【００３３】
＜キシロースを代謝可能なアーミング酵母の構築＞
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにキシロース代謝系を組み込むことで、Ｃ５及びＣ６糖を同時に発酵できる酵母を構築できる。そこで、酵母ＭＴ８−１を用いて、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ由来キシロースレダクターゼとキシリトールデヒドロゲナーゼを菌体内発現させ、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来キシルロキナーゼを過剰発現させる酵母の構築を行なった。上記３種類の酵素を組み込んだベクターｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫを酵母ＭＴ８−１に組み込んだ酵母を構築した。図６にプラスミドマップを示す。それぞれの酵素活性があることを確認し、３種類の酵素が組み込まれた酵母株を得た。
上記アーミング酵母は、特開２００８−１９３９３５の明細書の実施例１に記載されている方法により構築することができる。
【００３４】
＜セロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母の構築＞
酵母の表層にセロオリゴ糖分解酵素を提示させることで、セロオリゴ糖を直接発酵できる酵母を構築できる。そこで、上記キシロース代謝能を付与した酵母に更にβ.グルコシダーゼを表層提示させる酵母の構築を行なった。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のβ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ−１(ＢＧＬ１)をα−ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎで表層提示するプラスミドｐＩＢＧ１３を酵母に組み込み、キシロースおよびセロオリゴ糖の両方を資化する酵母を構築した。図７にプラスミドマップを示す。ＢＧＬ活性があることも同様に確認した。
上記アーミング酵母は、特開２００８−１９３９３５の明細書の実施例１に記載されている方法により構築することができる。
【００３５】
トウモロコシ胚芽粕から得られた糖類溶液を滅菌水で２倍に希釈し、上記セロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母を酵母菌体量が４０ｇ／Ｌになるよう加えて３０℃で４時間発酵を行なった。結果を図８に示す。図８はアルコール発酵前後の組成変化を示す液体クロマトグラフィー図である。
トウモロコシ胚芽粕の糖化分解工程後の分解産物にはおよそ５ｇ／Ｌのグルコースが含まれている。４時間の発酵でグルコースが消滅してエタノールが生成することが分かる。エタノール収率は理論収率のおよそ８割であった。また、培養中に他の微生物による汚染もなく、エタノール発酵への阻害も確認されなかった。
【実施例】
【００３６】
搾油後のトウモロコシ胚芽粕（ｐＨ３．８、水分９．２％）を３０００ｇ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを培養したトウモロコシ胚芽粕を１ｇ、ヘミセルラーゼ（天野エンザイム社製ヘミセルラーゼ「アマノ」９０）を３ｇ、蒸留水６０００ｍｌを加えて、３７℃で４８時間内容物を撹拌しながら糖化分解反応させた。なお、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを培養したトウモロコシ胚芽粕は３７℃、２日間の条件で培養したものを用いた。
糖化分解反応の結果、トウモロコシ胚芽粕は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとヘミセルラーゼの共存下で、トウモロコシ胚芽粕（固形分換算）全体に対して、１３．８％の還元糖が得られ、４．６９％のグルコースが得られた。
【００３７】
糖化分解反応で得られた糖類溶液を蒸留水で２倍に希釈し、上記セロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母を酵母菌体量が４０ｇ／Ｌになるよう加えて３０℃で４時間発酵を行なった。
その結果、２．１５％のエタノールが回収された。これは理論収率で糖類の９０％がエタノールに変換されたことを表している。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のアルコール製造方法は、付加価値の低い油糧粕の有効利用が図れるので、環境負荷の少ないエタノール製造方法として利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は油糧粕からのアルコール製造方法に関し、特にトウモロコシ胚芽粕からのエタノール製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖・デンプン等を原料とするエタノール製造では、将来的に食料問題と競合するため、糖・デンプンに依存しない新しいバイオエタノール製造法の開発が求められている。バイオエタノール原料となるトウモロコシの生産は年々増加しており、デンプン以外のセルロース系廃棄物からのバイオエタノール生産は、ますます重要視されている。例えば、トウモロコシｓｔｏｖｅｒと呼ばれる皮や芯、茎などの廃棄物を希硫酸法で加水分解処理を行ない、ヘミセルロースを分解した後、セルラーゼによって糖にする方法が知られている（非特許文献１）
また、セルロースをセルラーゼにより加水分解してグルコースを経て酵母により発酵することでエタノールへの変換が可能である。セルラーゼ高生産菌としては、糸状真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉが知られており、セルロースをグルコースに完全分解可能な複数のセルラーゼを持つことが知られている（非特許文献２）。
【０００３】
また、バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースを酵素分解し、次いで、セルロースおよびヘミセルロースの酵素分解により生成した糖類を発酵させることによりエタノールを生成するバイオエタノールの製造方法が開示されている。このバイオエタノールの製造方法は、バイオマスに含まれるリグニンを破壊処理するとともに、当該バイオマスに含まれるセルロースおよびヘミセルロースの構造分解処理する前処理工程と、この前処理工程にて構造分解処理を施したセルロースおよびヘミセルロースを酵素分解させる酵素分解工程と、この酵素分解工程にて生成した糖類を発酵させる発酵工程と、この酵素分解工程にて生成した糖類を含む溶液と、上記発酵工程にて生成したエタノールを含む溶液との熱交換を行う熱交換工程と、上記発酵工程にて生成したエタノールを含む溶液から発酵菌を分離する発酵菌分離工程を有することを特徴としている（特許文献１）。
【０００４】
また、キシロースを代謝可能なアーミング酵母として、ともにピチア・スチピチス由来のキシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子であるＸＹＬ１（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５９４６５）およびＸＹＬ２（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５５３９２）、ならびにサッカロマイセス・セレビシエ由来キシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子であるＸＫＳ１（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ８２４０８）遺伝子の細胞内発現のためのプラスミドｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫの構築についても知られている（特許文献２）。
【０００５】
一方、コーン胚芽を搾油した後のトウモロコシ胚芽粕は、飼料原料として用いられているが、飼料原料としての粗たんぱく質含有量を上げるためにたんぱく質溶液の吸着などを行なうなどさらなる加工処理が行なわれている。
このため、トウモロコシ胚芽粕などの油糧粕は、付加価値の高い資材ではなく、この有効利用が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１００７１３
【特許文献２】特開２００８-１９３９３５
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】http://sugar.lin.go.jp/japan/view/jv_0610b.html
【非特許文献２】http://pelican.nagaokaut.ac.jp/GER/study/e15.html
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、トウモロコシ胚芽粕などの油糧粕を、酵素加水分解反応によって糖化およびアルコール発酵、特にエタノール発酵を行ない、低環境負荷で低エネルギーのバイオエタノール生産技術の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の油糧粕からのアルコール製造方法は、油糧粕を菌体による糖化分解を行なう糖化分解工程と、この糖化分解工程で得られた糖をアルコール発酵する工程とを備え、上記油糧粕が食用油製造工程で発生する油糧粕であり、上記菌体が糸状菌であることを特徴とする。特に上記アルコールがエタノールであることを特徴とする。
また、上記油糧粕がトウモロコシ胚芽粕であることを特徴とする。特に、搾油後の酸性胚芽粕であることを特徴とする。
また、上記糸状菌がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉであり、酸性領域において糖化分解を行なうことを特徴とする。
また、上記アルコール発酵がアーミング酵母を用いるアルコール発酵であり、上記アーミング酵母がキシロースおよびセロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアルコール製造方法は、油糧粕としてのトウモロコシ胚芽粕をそのまま使用して糖化分解、発酵させるので、過激な酸処理や熱エネルギーを必要とすることなく、短時間で糖化分解および発酵により、付加価値が低い油糧粕をバイオマス資源として有効利用が図れる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】トウモロコシ粒の分別工程を示す図である。
【図２】糖化分解後の溶液中に含まれるブドウ糖・セロオリゴ糖などを示すＴＬＣである。
【図３】糖化分解後の溶液中に含まれる還元糖の測定結果である。
【図４】糖化分解におけるヘミセルラーゼの濃度と反応時間との関係を示す図である。
【図５】還元糖の生成割合をトウモロコシ胚芽粕（固形分換算）中の割合で示す図である。
【図６】キシロースを代謝可能なアーミング酵母のプラスミドマップである。
【図７】セロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母のプラスミドマップである。
【図８】アルコール発酵前後の組成変化を示す液体クロマトグラフィー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
トウモロコシ胚芽粕は、植物油脂の製造から得られる副産物資源の一つである。トウモロコシ食用油を製造する際にトウモロコシの胚芽に含まれる油分を搾油・抽出を行なった後に産出される油糧粕である。同じく油糧穀物として知られている大豆やなたねとは異なり、トウモロコシは胚芽中に油分が局在するため、トウモロコシ粒を原材料とするのではなく胚芽だけ分別されコーン油製造に用いられる。トウモロコシ粒の分別工程について、図１に示す。
【００１３】
トウモロコシ粒は澱粉原料としてスターチメーカーに利用される。トウモロコシ粒は果皮（約５質量％（以下、質量％を％と略記する））、胚乳（７５〜８０％）、胚芽（１０〜１５％）、油分（約５％）に大別されるが、澱粉質は胚乳の部分に含まれるため、現在スターチメーカーは主にウェットミリングと呼ばれる工程によって、胚乳と胚芽との分別を行なう。この工程では希薄な亜硫酸溶液にトウモロコシ粒を約４８時間浸積させ、トウモロコシ粒を膨潤させ分別を行なう。浸積により、別れた胚乳は水分を含み下部に沈降し、油分を多く含む胚芽は上部に集まる。これを比重差により集め乾燥させた後、胚乳の部分はコーンスターチの製造原料として利用され、胚芽の部分は副産物として、植物油脂原料となる。胚芽はもともと約３５％程度の油分を含むが、ウェットミリングによって、胚芽に含まれる可溶性たんぱく質などが抽出され、油分の濃縮が起こり、結果的に約５０％の油分を含む油糧原料となる。大豆やなたねと比べ、胚芽の発生数量は少なくなるが、単位当たり油分を多く含む原料であるため、植物油脂の製造効率はよい原料である。この胚芽に含まれる油分は圧搾と呼ばれる工程により約半分の油が搾油され、残りは有機溶剤のｎ−ヘキサンにより抽出をされ、トウモロコシ粗油が得られ、以降の精製工程を経て、食用のコーン油となる。
【００１４】
油分を除かれたトウモロコシ胚芽は大豆やなたねと同様にトウモロコシ胚芽粕となる。トウモロコシ胚芽粕の成分を分析した結果を表１に示す。表１は製造ロットの異なるトウモロコシ胚芽粕Ａ、ＢおよびＣの分析値と、それらの平均値を表している。
表１に示すように、トウモロコシ胚芽粕中に含まれる窒素（Ｎ）含量またはこれに基づく粗たんぱく質値（Ｎ％×６．２５）は約２０％と低い。また、胚乳と胚芽の分別におけるウェットミリングで酸が使用されるため、胚芽は酸性を示し、搾油後も胚芽粕はｐＨ３．５〜４．０の酸性が確認される。さらにトウモロコシ胚芽中には澱粉質を殆ど含まない。このため、トウモロコシ胚芽粕は、大豆粕やなたね粕よりも飼料原料や肥料原料としての利用価値が低い。
また、トウモロコシ胚芽粕中に含まれる、セルロース質の含有量は平均値として、セルロース１０．９％、ヘミセルロース２３．３％、リグニン０．６％であり、粗繊維と可溶性無窒素物を合わせた含有量約６３．５％中の５０〜５５％程度がセルロース質に該当する。
【００１５】
【表１】
【００１６】
次に、トウモロコシ胚芽粕は、後述する微生物による糖化分解工程において、胚芽粕に含まれる他の微生物が影響を与えることも考えられる。そこでトウモロコシ胚芽粕に含まれる微生物が如何なるものか以下に示す微生物試験方法で確認を行なった。結果を表２に示す。
（１）一般生菌数は、トウモロコシ胚芽粕１ｇを１０ｍｌと１００ｍｌの滅菌水にけん濁を行ない、軽く遠心分離を行なった後、上澄み液を標準寒天培地に加え、３７℃で４８時間培養後に寒天上に形成されるコロニー数の計測を行なった。
（２）大腸菌群数は、トウモロコシ胚芽粕１ｇを１０ｍｌと１００ｍｌの滅菌水にけん濁を行ない、軽く遠心分離を行なった後、上澄み液をＸ−ｇａｌ寒天培地に加え、３７℃で２４時間培養後に寒天上に青いコロニー（陽性）が形成されるか確認を行なった。
（３）カビ・酵母は、トウモロコシ胚芽粕１ｇを１０ｍｌと１００ｍｌの滅菌水にけん濁を行ない、軽く遠心分離を行なった後、上澄み液をポテトデキストロース寒天培地に加え、３０℃、５日間後形成された寒天上のコロニー数の計測を行なった。
（４）サルモネラ菌は、食品衛生検査指針（微生物編）に掲載されている試験法を一部改良して行なった。即ち、サンプル量として、トウモロコシ胚芽粕を１０ｇ取り、ＢＰＷ培地で前培養を行ない、次ぎにＨＴＴ培地で選択増菌培養、次いでＤＨＬ寒天培地とＢＧ寒天培地で分離培養を行ない、寒天上に形成されるコロニーの観察を行なった。
【００１７】
【表２】
【００１８】
表２に示すように、１０倍希釈での測定で一般生菌数が４０個、カビ・酵母数が１０個検出された。大腸菌群とサルモネラ菌は検出されなかった。トウモロコシ胚芽粕が酸性であるため、計測される菌数の数も大豆粕やなたね粕に比べ、少ないと考えられる。また、トウモロコシ胚芽粕を１２１℃、２０分の条件でオートクレイブした後、同様に微生物試験を行なった結果、上記菌数は全く検出されなかった。
【００１９】
上述したように、トウモロコシ胚芽粕は、セルロース質が多く、酸性状態で得られ、飼料原料や肥料原料としての利用価値が低く、付加価値の高い資材ではなく、その有効利用が望まれている。
なお、図１は、油糧粕の原料として、本発明の好ましい例としてのトウモロコシ胚芽粕の分別について説明したが、同様にたんぱく質含量が低く飼料原料や肥料原料としての利用価値が低い油糧粕もその有効利用が望まれている。
【００２０】
本発明のアルコール、特にエタノール製造方法は、油糧粕、特にトウモロコシ胚芽粕中に含まれる上記セルロース質を微生物の培養を通じて、ブドウ糖・セロオリゴ糖などに分解する糖化分解工程を経る。
糖化分解に用いる微生物としては、糸状菌、細菌、放射菌であることが好ましく、これらの中で糸状菌が好ましい。また、糸状菌の中でもＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉが好ましい。
その理由は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉが（１）セルラーゼ酵素の高生産菌である、（２）複数種のセルラーゼ酵素を発現・生産する、（３）成長が早く、増殖力が強い、（４）成育阻害に強く、成育域が広い、（５）遺伝子組み換えなどの研究が盛んである等である。例えば発現するセルラーゼファミリーの生産量比率を遺伝子操作することにより、最もセルロース質の分解効率のよい酵素発現・生産を調節できる。
【００２１】
糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より入手し、トウモロコシ胚芽粕中のセルロース質の糖化分解を検討した。
トウモロコシ胚芽粕は前述したとおり、ｐＨが３．５〜４．０の範囲にあるため、これをＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉにより培養を行なうにおいて、このｐＨ領域においてこの糸状菌の成育が可能かどうかについて検討した。
Ｐｏｔａｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ４ｇ、Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ、Ａｇａｒ １５ｇを滅菌水１Ｌに溶解後、オートクレイブ滅菌を行なったＰＤＡ培地に硫酸を用いて、ｐＨ３．９、ｐＨ４．２、ｐＨ４．５、ｐＨ４．７、ｐＨ４．９になるようにｐＨ調整を行ない、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを温度３０℃にて５日間振盪培養した結果、ｐＨ３．９では若干の成育の遅れは見られたが、全ての培地液体中に分生子の形成が確認され、５日目には十分な成育が確認できた。この結果から、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉはトウモロコシ胚芽粕（ｐＨ３．８５）と同様なｐＨ領域においても、成育が可能であることが分かった。
【００２２】
培養おいて基質であるトウモロコシ胚芽粕の濃度を５％とし、以下の６条件で３０℃、５日間振盪培養を行ない、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの培養状況およびトウモロコシ胚芽粕の分解度合いを調査した。
（１）培地＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理有り、ｐＨ ６．０
（２）培地＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理無し、ｐＨ ６．０
（３）水＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理有り、ｐＨ ６．５
（４）水＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理無し、ｐＨ ６．５
（５）水＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理有り、ｐＨ ３．５
（６）水＋トウモロコシ胚芽粕滅菌処理無し、ｐＨ ３．５
なお、（１）および（２）の条件で使用した培地は、グルタミン酸ナトリウム５．２６ｇ、りん酸水素二カリウム５．２６ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．０５ｇ、塩化ナトリウム２．１１ｇに水を加えて１Ｌとし、１２１℃、２０分オートクレイブ滅菌を行なった組成を用いた。（３）〜（６）は、培地を使用せずに水だけで培養した。
３０℃、５日間振盪培養後、培養状態を目視で観察すると共に、遠心分離により上澄み溶液の回収を行ない、この溶液中に含まれるブドウ糖・セロオリゴ糖などを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、定性分析を行なった。結果を図２に示す。
【００２３】
培養後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）を行なうことで上澄みと沈澱部に分離が見られた。培養条件（１）、（２）、（３）および（６）で明確にトウモロコシ胚芽粕の組織崩壊が沈澱部に確認された。つまり、糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ によりトウモロコシ胚芽粕のセルロース質が分解されたことが考えられる。さらに上澄み液の外観も清澄なもの、濁りを生じているものに分かれ、培養条件（６）は、清澄な上澄み液が得られた。
また、図２に示す上澄み溶液のＴＬＣ分析結果から、上澄み溶液中にセルロース質の分解産物であるブドウ糖、セロオリゴ糖の定性スポットが確認された。
組織崩壊の目視結果と同様に培養条件（１）、（２）、（３）および（６）で確認されるスポットの濃度が高く、ブドウ糖・セロオリゴ糖への糖化分解が適切な条件であったと考えられる。
【００２４】
また、目視で確認された上澄み液の濁度は培養における他の菌類のコンタミ汚染度合いを示していると考えられる。即ち、糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉは他の細菌とくらべ個体が大きいため、遠心分離により簡単に沈澱するため、上澄み液には殆ど観察されなくなるが、他の細菌が混在しているとこれらは上澄み液に濁りを生じる。上記実験において、培養条件（６）は最も清澄な上澄み液が得られた。
以上の結果、本発明の糖化分解工程では、上澄み液が清澄でＴＬＣ分析による糖類への分解が優れている酸性領域における培養条件（６）が好ましい培養条件である。
さらに、酸性領域における培養条件（６）は、トウモロコシ胚芽粕の滅菌を行なう必要もなく、水を加えて培養を行なうことのみでセルロース質の分解産物であるブドウ糖・セロオリゴ糖が得られるため、実用化にむけて十分なコストダウンが図れる優れた糖化分解工程である。
【００２５】
上記糖化分解は、トウモロコシ胚芽粕に含まれるセルロースについて検討した。しかし、トウモロコシ胚芽粕には１０．９％のセルロースだけでなく、２３．３％のヘミセルロースも含まれている。このため、このヘミセルロースを糖化分解する菌について検討したところ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のヘミセルラーゼが好適であることが実験の結果分かった。
トウモロコシ胚芽粕の糖化分解工程において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のヘミセルラーゼとその両者が共存したときの還元糖やグルコースの生成量を確認するために、（１）トウモロコシ胚芽粕のみの場合、（２）トウモロコシ胚芽粕にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉだけを加えた場合、（３）上記ヘミセルラーゼだけを加えた場合、（４）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとヘミセルラーゼ両方を加えた場合の４種類の条件を用いて、以下に示す糖化分解実験を行なった。
【００２６】
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに蒸留水に対してトウモロコシ胚芽粕が１０％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水１００ｍｌにトウモロコシ胚芽粕１０ｇを加える。
そこに、（１）トウモロコシ胚芽粕のみの場合、（２）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを培養したトウモロコシ胚芽粕を０．０５ｇ、（３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のヘミセルラーゼを０．０１％、（４）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを培養したトウモロコシ胚芽粕を０．０５ｇおよび上記ヘミセルラーゼを０．０１％の４条件で、３７℃、１６０ｒｐｍで撹拌器を回転させながら２日間反応を行なった。
反応終了後、遠心分離によって上清を回収した。上清にどのようなオリゴ糖が含まれるかを確認するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ)によって確認したところ、上記（３）および（４）の条件の場合、顕著にグルコースが確認できた。また、反応後の上清に含まれる還元糖濃度をＤＮＳ法によって、また、グルコース濃度をグルコ−オキシダーゼ法によってそれぞれ測定した。測定結果をトウモロコシ胚芽粕中の割合に換算した結果を図３（ａ）および（ｂ）に示す。図３（ａ）は還元糖の割合を示す図であり、図３（ｂ）は還元糖に含まれるグルコースの割合を示す図である。
【００２７】
図３（ａ）および（ｂ）の結果から、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉやヘミセルラーゼだけを単独で添加した場合に比べて、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとヘミセルラーゼ共存下の方が、反応２日目の段階ではより多くの還元糖およびグルコースを得ることができた。トウモロコシ胚芽粕から２３．８％の還元糖、また１８．４％のグルコースが得られた。さらに生成した還元糖に占めるグルコースの割合は７７．３％と高く、得られた還元糖の大部分がグルコースであると分かった。トウモロコシ胚芽粕から２３．８％の還元糖が得られたということは、トウモロコシ胚芽粕に含まれる総セルロースの６９．６％を還元糖に分解できたことになる。この結果より、トウモロコシ胚芽粕からより多くの糖を得るためには、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉやヘミセルラーゼを単独で加えるのではなく、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとヘミセルラーゼ両方を加えた方が効果的である。
【００２８】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとヘミセルラーゼとが共存した場合、最も多くの還元糖やグルコースが得られる反応時間を、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの共在下でヘミセルラーゼ濃度を変え、還元糖濃度およびグルコース濃度の経時変化を以下の実験で調べた。
蒸留水に対してトウモロコシ胚芽粕が１０％(ｗ／ｖ)となるように５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに取り、そこへＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを培養したトウモロコシ胚芽粕を０．０５ｇ加えた。さらに、ヘミセルラーゼ濃度が０．１％、０．０１％、０．００５％、０．００１％となるようにヘミセルラーゼを加え、３７℃、１６０ｒｐｍで反応させ、２４時間毎に３日間上清を１ｍｌ程度回収した。また、トウモロコシ胚芽粕のみの場合とヘミセルラーゼを加えずにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉだけを加えた場合も同様に行なった。上清にどのようなオリゴ糖が含まれるかを確認するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ)によって確認した（展開溶媒：酢酸エチル：メタノール：水＝１２：７：３、発色方法：硫酸噴霧）。次に上清の還元糖濃度をＤＮＳ法によって測定した。また、グルコース濃度をグルコーオキシダーゼ法によって測定した。測定結果を図４（ａ）および（ｂ）に示す。図４（ａ）は還元糖の生成割合を示す図であり、図４（ｂ）はグルコースの生成割合を示す図である。
【００２９】
図４（ａ）および（ｂ）に示すように、還元糖およびグルコースの生成割合は、共にヘミセルラーゼ濃度が高くなるとともに増加した。また、還元糖、グルコース共に全ての場合において、反応４８時間後で最も多く生成することが分かった。それ以降はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉによって生成された糖が代謝され、減少したと考えられる。
本発明における糖化分解工程において、ヘミセルラーゼの濃度は、トウモロコシ胚芽粕に対して、０．１％以上であることが好ましい。
また、糖化分解時間は、還元糖またはグルコースの生成割合が最大となる時間であることが好ましく、この時間は、予備的な糖化分解実験により求めることができる。
【００３０】
糖化分解工程におけるトウモロコシ胚芽粕の最適な水分含量を調べるため、トウモロコシ胚芽粕に含まれる水分含量を変えて生成する還元糖量の違いを測定した。
原料となるトウモロコシ胚芽粕には１０％の水分が含まれていることを考慮して、原料に対する水分含量が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１．８％となるようにトウモロコシ胚芽粕を調製した。また、水分含量が１０％を対照とした。トウモロコシ胚芽粕に対して０．１％となるようにヘミセルラーゼを添加し、３７℃で静置して反応させた。反応開始後２４時間毎にサンプリングし、遠心分離によって上清を１ｍｌ回収した。得られたサンプルに含まれる還元糖濃度をＤＮＳ法によって測定した。結果を図５に示す。図５は還元糖の生成割合をトウモロコシ胚芽粕（固形分換算）中の割合で示す図である。
【００３１】
図５より、水分含量を多くする程、トウモロコシ胚芽粕の多くを還元糖に分解することができた。これは、水分含量が少ない程、還元糖の濃度が高く、そのため生成物による酵素反応の阻害が起こりやすくなるためであると考えられる。トウモロコシ胚芽粕をより多く分解し効率良く還元糖およびグルコースを得るには、加えるトウモロコシ胚芽粕量を増やすだけでなく水分含量を高くすることで、トウモロコシ胚芽粕をより多く分解させることが重要である。一方で、反応装置の容量を考慮すると、体積当たりにより多くのトウモロコシ胚芽粕を投入するには、水分含量を少なくすることが必要であるといえる。さらに、効率良く分解するためにはある程度の水分含量が必要となる。
水分含量としては、図５より、６０％〜９０％が好ましい。６０％未満になると糖化分解反応が十分でなく、９０％をこえると反応装置の容量が大きくなりすぎる。
【００３２】
アルコール発酵、特にエタノール発酵工程について説明する。
エタノール発酵工程に用いられるエタノール生産に優れた酵母として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがある。しかしこの酵母はグルコースを効率よくエタノールへと発酵できるが、キシロースなどに代表されるＣ５糖、およびセロオリゴ糖は資化することができない。これらの糖分からエタノール発酵が行なえる酵母を構築することで、トウモロコシ胚芽粕の糖化分解物から効率よくエタノール発酵が行なえる。そこで以下のアーミング酵母の構築を行なった。
【００３３】
＜キシロースを代謝可能なアーミング酵母の構築＞
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにキシロース代謝系を組み込むことで、Ｃ５及びＣ６糖を同時に発酵できる酵母を構築できる。そこで、酵母ＭＴ８−１を用いて、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ由来キシロースレダクターゼとキシリトールデヒドロゲナーゼを菌体内発現させ、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来キシルロキナーゼを過剰発現させる酵母の構築を行なった。上記３種類の酵素を組み込んだベクターｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫを酵母ＭＴ８−１に組み込んだ酵母を構築した。図６にプラスミドマップを示す。それぞれの酵素活性があることを確認し、３種類の酵素が組み込まれた酵母株を得た。
上記アーミング酵母は、特開２００８−１９３９３５の明細書の実施例１に記載されている方法により構築することができる。
【００３４】
＜セロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母の構築＞
酵母の表層にセロオリゴ糖分解酵素を提示させることで、セロオリゴ糖を直接発酵できる酵母を構築できる。そこで、上記キシロース代謝能を付与した酵母に更にβ.グルコシダーゼを表層提示させる酵母の構築を行なった。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のβ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ−１(ＢＧＬ１)をα−ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎで表層提示するプラスミドｐＩＢＧ１３を酵母に組み込み、キシロースおよびセロオリゴ糖の両方を資化する酵母を構築した。図７にプラスミドマップを示す。ＢＧＬ活性があることも同様に確認した。
上記アーミング酵母は、特開２００８−１９３９３５の明細書の実施例１に記載されている方法により構築することができる。
【００３５】
トウモロコシ胚芽粕から得られた糖類溶液を滅菌水で２倍に希釈し、上記セロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母を酵母菌体量が４０ｇ／Ｌになるよう加えて３０℃で４時間発酵を行なった。結果を図８に示す。図８はアルコール発酵前後の組成変化を示す液体クロマトグラフィー図である。
トウモロコシ胚芽粕の糖化分解工程後の分解産物にはおよそ５ｇ／Ｌのグルコースが含まれている。４時間の発酵でグルコースが消滅してエタノールが生成することが分かる。エタノール収率は理論収率のおよそ８割であった。また、培養中に他の微生物による汚染もなく、エタノール発酵への阻害も確認されなかった。
【実施例】
【００３６】
搾油後のトウモロコシ胚芽粕（ｐＨ３．８、水分９．２％）を３０００ｇ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを培養したトウモロコシ胚芽粕を１ｇ、ヘミセルラーゼ（天野エンザイム社製ヘミセルラーゼ「アマノ」９０）を３ｇ、蒸留水６０００ｍｌを加えて、３７℃で４８時間内容物を撹拌しながら糖化分解反応させた。なお、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉを培養したトウモロコシ胚芽粕は３７℃、２日間の条件で培養したものを用いた。
糖化分解反応の結果、トウモロコシ胚芽粕は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉとヘミセルラーゼの共存下で、トウモロコシ胚芽粕（固形分換算）全体に対して、１３．８％の還元糖が得られ、４．６９％のグルコースが得られた。
【００３７】
糖化分解反応で得られた糖類溶液を蒸留水で２倍に希釈し、上記セロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母を酵母菌体量が４０ｇ／Ｌになるよう加えて３０℃で４時間発酵を行なった。
その結果、２．１５％のエタノールが回収された。これは理論収率で糖類の９０％がエタノールに変換されたことを表している。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のアルコール製造方法は、付加価値の低い油糧粕の有効利用が図れるので、環境負荷の少ないエタノール製造方法として利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
油糧粕を菌体による糖化分解を行なう糖化分解工程と、この糖化分解工程で得られた糖をアルコール発酵する工程とを備えたアルコール製造方法であって、
前記油糧粕は食用油製造工程で発生する油糧粕であり、
前記菌体は糸状菌であることを特徴とする油糧粕からのアルコール製造方法。
【請求項２】
前記アルコールがエタノールであることを特徴とする請求項１記載のアルコール製造方法。
【請求項３】
前記油糧粕がトウモロコシ胚芽粕であることを特徴とする請求項１または請求項２記載のアルコール製造方法。
【請求項４】
前記トウモロコシ胚芽粕は、搾油後の酸性胚芽粕であることを特徴とする請求項３記載のアルコール製造方法。
【請求項５】
前記糸状菌がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉであり、酸性領域において糖化分解を行なうことを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項記載のアルコール製造方法。
【請求項６】
前記アルコール発酵がアーミング酵母を用いるアルコール発酵であり、前記アーミング酵母がキシロースおよびセロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母であることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項記載のアルコール製造方法。
【請求項１】
油糧粕を菌体による糖化分解を行なう糖化分解工程と、この糖化分解工程で得られた糖をアルコール発酵する工程とを備えたアルコール製造方法であって、
前記油糧粕は食用油製造工程で発生する油糧粕であり、
前記菌体は糸状菌であることを特徴とする油糧粕からのアルコール製造方法。
【請求項２】
前記アルコールがエタノールであることを特徴とする請求項１記載のアルコール製造方法。
【請求項３】
前記油糧粕がトウモロコシ胚芽粕であることを特徴とする請求項１または請求項２記載のアルコール製造方法。
【請求項４】
前記トウモロコシ胚芽粕は、搾油後の酸性胚芽粕であることを特徴とする請求項３記載のアルコール製造方法。
【請求項５】
前記糸状菌がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉであり、酸性領域において糖化分解を行なうことを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項記載のアルコール製造方法。
【請求項６】
前記アルコール発酵がアーミング酵母を用いるアルコール発酵であり、前記アーミング酵母がキシロースおよびセロオリゴ糖を資化できるアーミング酵母であることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項記載のアルコール製造方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図８】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１８２７６２（Ｐ２０１１−１８２７６２Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４６３７（Ｐ２０１０−５４６３７）
【出願日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、平成２０年度、経済産業省、地域資源活用型研究開発事業「トウモロコシ胚芽粕からのバイオエタノール生産技術の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１１９３０３７）辻製油株式会社 (12)
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、平成２０年度、経済産業省、地域資源活用型研究開発事業「トウモロコシ胚芽粕からのバイオエタノール生産技術の開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９１１９３０３７）辻製油株式会社 (12)
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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