活性エステル化多糖およびその製造方法
【課題】水溶解時に不溶物を生じることがない安定した品質の活性エステル化多糖の乾燥品、およびそのような品質の活性エステル化多糖の商業スケールでの製造を可能にする製造方法の提供。
【解決手段】カルボキシ基を有する多糖と求電子性化合物とをエステル化反応させ、生成した活性エステル化多糖を多価カルボン酸と接触させた後析出回収する活性エステル化多糖の製造方法。
【解決手段】カルボキシ基を有する多糖と求電子性化合物とをエステル化反応させ、生成した活性エステル化多糖を多価カルボン酸と接触させた後析出回収する活性エステル化多糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性エステル化多糖およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体適合性の高い多糖の側鎖に架橋性基を導入した多糖誘導体は、生体適合材料として有用であることがいくつかの文献で提案されている。なかでも、多糖の側鎖に導入したカルボキシ基を求電子性基とエステル化し、活性水素含有基との接触により該エステル結合が解離することでカルボキシ基が架橋に関与する機構の活性エステル化多糖は、自己架橋性であり、癒着防止材、止血材、医療用接着材などの各種生体適合材料として特に有用である（特許文献１など参照）。
【０００３】
上記活性エステル基は、通常、イミドエステルであり、特にスクシンイミドエステルが代表的である。多糖の活性エステル化としては、分子内にカルボキシ基を有するヒアルロン酸について、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩とＮ−ヒドロキシスクシンイミドジフェニルリン酸塩との反応によるヒアルロン酸のスクシンイミド活性エステルの合成方法なども報告される（非特許文献１参照）が、従来一般には、まず、分子内にカルボキシ基を有さない多糖の側鎖にカルボキシ基を導入して酸型多糖とし、該カルボキシ基とＮ−ヒドロキシイミドとを脱水縮合させてエステル形成する。生成した活性エステル化多糖は、貧溶媒で晶析した後減圧乾燥して粉末とし、使用に際して水に溶解する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２００４／８１０５５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Y. Luoら, Bioconjugate Chem. 2001, 12, 1085-1088
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生体適合材料として有用性の高い活性エステル化多糖の製品化に際して、乾燥製品の活性エステル化多糖を水に溶解するとダマなどの不溶物を生じることがあるという問題を生じた。不溶分を含む製品は、これまで検討されてきた実験レベルでは報告のない問題であるが、商業的スケールアップを図る上で初めて生じた品質上の問題であり、また生産効率の問題でもある。このため、水溶解時に不溶物を生じることがない安定した品質の活性エステル化多糖、および製造スケールをアップしてもそのような品質の活性エステル化多糖を安定して製造しうる方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題について種々検討したところ、エステル反応終了後の反応液を多価カルボン酸と接触させることにより、乾燥製品の水溶解時の不溶物を生じる課題を解決しうることを見出した。また、最終乾燥工程および貯蔵時における目的物質の経時的な平均分子量（Ｍｗ）上昇も抑制しうることも確認できた。これによりスケールアップの実現を担保でき、本発明を完成した。
なお、この検討過程では、従来の製造方法で得られる活性エステル化多糖は、その乾燥製品が水不溶分を生じる場合、該活性エステル化多糖のＧＰＣ測定では、高分子側にショルダーが出現するかまたはショルダーのブロード化が認められ、高分子量成分の生成が示された。この高分子側ショルダー分画はＩＲスペクトルにより活性エステル化多糖の水素結合物と推測された。このような高分子量成分の生成による平均分子量（Ｍｗ）の変化に対する寄与率は必ずしも大きいとはいえず、したがって不溶分が生成してもＭｗの値が顕著に大きくなるともいえない。また逆に、Ｍｗがある程度増加すると必ず不溶分を生成するともいえないが、事実として、従来の製造方法で得られる活性エステル化多糖は、減圧乾燥時および貯蔵時に経時的にＭｗが増加する傾向が認められ、またＭｗの経時的変化率がばらつくという知見も得ている。さらに、減圧乾燥時のＭｗの増加は貯蔵時よりも顕著であること、および減圧乾燥時のＭｗの増加を抑制すれば貯蔵時のＭｗの増加を抑制できるという知見を得ている。したがって減圧乾燥におけるＭｗ評価は貯蔵安定性も含めた製品安定性の評価となる。
【０００８】
一方、上記製造過程において多価カルボン酸と接触させた活性エステル化多糖は、最終乾燥製品における水溶解時の不溶物生成を安定して抑制でき、ＧＰＣ測定におけるピークに顕著な高分子側のショルダー出現またはブロード化は認められない。また、減圧乾燥時の経時的なＭｗ増大が抑制される効果を奏することも確かめている。本発明の製造過程で使用される多価カルボン酸は、ほとんど最終乾燥製品中には残留しておらず、該乾燥製品を水に溶解した際に不溶物を生じない理由および減圧乾燥時の経時的な高分子量成分の生成もしくはＭｗ増大の抑制効果の理由には明らかではないが、製造過程での多価カルボン酸との接触により安定した乾燥製品を再現性よく得ることができ、乾燥製品の確実な水溶解性を保証することは事実である。したがって以下の本発明を提供する。
【０００９】
本発明は、酸型多糖のカルボキシ基と求電子性基導入剤とをエステル化反応させ、生成した活性エステル化多糖を多価カルボン酸と接触させた後析出させ回収する活性エステル化多糖の製造方法である。
上記沈殿回収後の活性エステル化多糖は、通常、減圧乾燥する。
また本発明では、上記のような方法で得られる活性エステル化多糖を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、最終乾燥工程における目的化合物の経時的な分子量上昇の抑制効果を奏する。不溶物を生じない活性エステル化多糖（乾燥品）を商業スケールでも安定して製造することができ、安定した品質の活性エステル化多糖を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明を製造方法にしたがって具体的に説明する。
本明細書において、カルボキシ基を有する多糖を「酸型多糖」と称する。
本発明では、酸型多糖のカルボキシ基と、求電子性基導入剤とをエステル化反応させ、生成した活性エステル化多糖を多価カルボン酸と接触させた後、活性エステル化多糖を析出させ回収する。
＜酸型多糖＞
酸型多糖の主鎖となる多糖は、主骨格に単糖構造を２単位以上有するものであればよく、特に制限されない。たとえば、アラビノース、リボース、キシロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラムノース、フコース、リボデソース等の単糖類；トレハロース、スクロース、マルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクトース、メリビオース等の二糖類；ラフィノース、ゲンチアノース、メレチトース、スタキオース等の三糖以上の多糖類が、共有結合することにより形成されたもの、およびこれに対して、さらに官能基を導入したものが挙げられる。このような多糖は、天然に存在するものでも、人工的に合成されたものでもよい。
【００１２】
多糖の分子量に特に制限はない。好ましくは、上記の単糖類、二糖類または三糖以上の多糖類が、数十〜数千個結合したものに相当する平均分子量（Ｍｗ）が５〜２５００ｋＤａの多糖である。このような多糖であれば、活性エステル化多糖が架橋した後のゲルの硬度を調整しやすく、架橋に関与する活性エステル基および活性水素含有基を１分子鎖に複数導入しやすいからである。好ましくは、Ｍｗが１０〜１０００ｋＤａの多糖である。
【００１３】
酸型多糖における「カルボキシ基」は、通常、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）およびカルボキシアルキル基（−ＲＣＯＯＨ）基である。−ＲＣＯＯＨとしては、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシイソプロピル基、カルボキシブチル基などが挙げられる。
【００１４】
酸型多糖は、活性エステル化多糖の前駆段階で酸型であればよく、カルボキシ基を自己保有する天然酸型多糖であってもよく、導入したカルボキシ基を有する酸型多糖であってもよい。カルボキシ基を導入する多糖は、天然酸型多糖であってもそれ自体はカルボキシ基を有さない多糖であってもよい。
上記カルボキシ基を自己保有する天然酸型多糖としては、特に限定されないが、ガラクツロン酸を含むペクチンやヒアルロン酸等が挙げられる。
カルボキシ基を有さない多糖としては、特に限定されないが、デキストラン、プルラン、デキストリンなどが挙げられる。
【００１５】
デキストランは、代用血漿剤として使用されており、「Dextran Ｔ fractions」（アマシャムバイオサイエンス社）の商品名で入手可能である。
プルランは、経口薬を含む医薬添加剤として使用されており、エンドトキシン等の生物学的コンタミネーションが少ないものが好適である。プルランは、「Pullulan ＰＩ−２０」（林原社）の商品名で入手可能である。
【００１６】
デキストリンは、でんぷんの加水分解物であり、分子鎖長の異なるグルコース重合体の混合物である。デキストリンにおけるグルコース単位は、主としてα−１，４結合であり、通常、ある程度の割合でα−１，６結合を含む。本発明では、デキストリン原料のでんぷん種は特に限定されず、したがってα−１，６結合の存在割合も特に限定されない。
本発明で用いられるデキストリンは、入手しやすさ、用時の物性、扱い易さ、被膜形成性などを考慮して、典型的にＭｗ１０〜２００ｋＤａ程度のものである。
いずれの多糖も、本発明においては、一般的に商業流通しているものを利用できる。上記医療用途で実績のある多糖は、本発明においては安全性面で好適に利用できる多糖である。
【００１７】
上記のうちでも、デキストリンは、アナフィラキシーショックが報告されておらず、腹膜透析での使用実績もあり、生体適応における不具合が未だ報告されていない点で特に好ましい多糖である。
また、酸型多糖は、好ましくは、カルボキシメチル基を有するカルボキシメチル化多糖である。
なお、本発明では、酸型多糖におけるカルボキシ基は、塩が配位していない「非塩型」であることが望ましく、最終的に得られる活性エステル化多糖が塩形態ではないことが望ましい。ここで「塩」とは、アルカリ金属、アルカリ土類金属などの無機塩、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）などの四級アミン、ヨウ化クロロメチルピリジリウムなどのハロゲン塩などを包含する。「非塩型」とは、これらの「塩」が配位していないことであり、「塩形態ではない」とは、これらの塩を含まないことを意味する。
【００１８】
多糖のカルボキシ化反応は、公知の酸化反応を利用して、特に制限なく行うことができる。多糖の水酸基を酸化してカルボン酸とする場合、反応の種類は特に限定されないが、例えば、四酸化二窒素酸化、発煙硫酸酸化、リン酸酸化、硝酸酸化、過酸化水素酸化が挙げられ、各々、試薬を用いて通常知られた反応を選択して酸化することができる。各反応条件はカルボキシ基の導入量により適宜設定することができる。例えば、原料となる多糖をクロロホルムあるいは四塩化炭素中に懸濁させ、四酸化二窒素を加えることにより、多糖の水酸基を酸化してカルボン酸を有する酸型多糖を調製することができる。
【００１９】
多糖のカルボキシアルキル化反応は、公知の方法を利用することができ、特に限定されないが、具体的にカルボキシメチル化反応の場合には、多糖をアルカリ化した後にモノクロル酢酸を使用した反応を選択することが可能である。その反応条件はカルボキシメチル基の導入量により適宜設定することができる。ここでの多糖は、通常、水溶液で反応に供される。
カルボキシ基を導入した酸型多糖は、通常、貧溶媒（通常アルコール）を用いて析出させ、減圧乾燥する。
【００２０】
本発明では、多糖にカルボキシ基を導入する方法として、上記カルボン酸化またはカルボキシアルキル化のいずれの方法も利用でき、特に限定されないが、カルボキシ基導入反応による多糖の分子量の低下が小さく、カルボキシ基の導入量を比較的コントロールしやすい点で、カルボキシアルキル化、特にカルボキシメチル化が好適である。このカルボキシメチル基を、以下「ＣＭ−」とも記す。
【００２１】
活性エステル化に使用される酸型多糖は、その乾燥質量１ｇあたりのカルボキシ基（該基を１分子とみなして）量が、通常、０．１〜５ｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは０．４〜３ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．５〜２ｍｍｏｌ／ｇである。このカルボキシ基量の割合が、０．１ｍｍｏｌ／ｇより少ないと、該基から誘導され架橋点となる活性エステル基数が不充分になる場合が多い。一方、カルボキシ基量の割合が、５ｍｍｏｌ／ｇより多くなると、活性エステル化多糖（未架橋）が水を含む溶媒に溶解しにくくなる。なお、酸型多糖のカルボキシ基量はフェノールフタレインを指示薬として酸塩基逆滴定により定量することができる。
【００２２】
本発明では、最終的な活性エステル化多糖において、活性エステル化されていないカルボキシ基が残存していてもよい。したがって上記カルボキシ基量は、最終的な活性エステル化多糖における活性エステル基と活性エステル化されていないカルボキシ基の合計量となる。
【００２３】
＜活性エステル化＞
上記のような酸型多糖と求電子性基導入剤とを反応させ、活性エステル基を形成する。この際に使用される酸型多糖は、単種であっても２種以上併用されても良い。
活性エステル基は、カルボキシ基のカルボニル炭素に、通常のアルコールよりも強い求電子性基が結合した基であり、アルカリ共存下の水存在下でエステル結合が解離する。このような活性エステル基を形成する求電子性基導入剤としては、典型的に、比較的安価に入手可能なＮ−ヒドロキシアミン系化合物が用いられる。具体的には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステル、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸アミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシマレイミド等が代表的なものとして挙げられる。これら化合物を２種以上用いてもよい。
このなかでも、Ｎ−ヒドロキシイミド、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳとも記す）が、ペプチド合成分野での実績があり、商業上入手し易いことより好適である。
【００２４】
酸型多糖は、通常、非プロトン性極性溶媒の溶液として上記エステル化反応に供する。非プロトン性極性溶媒とは、電気的に陽性な官能基を有する求核剤と水素結合を形成できるプロトンを持たない極性溶媒であり、特に限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンなどが例示される。多糖の溶媒への溶解性が良好であることから、ＤＭＳＯが好適に利用できる。
上記好ましい「非塩型」の酸型多糖であれば、通常、上記溶媒中で２０℃〜１２０℃程度に加熱することにより溶解することができる。
【００２５】
酸型多糖と求電子性基導入剤とのエステル化反応は、通常、脱水縮合剤の存在下で行われる。
脱水縮合剤は、カルボキシ基と求電子性基導入剤との縮合で生成する水分子を１つ引き抜き、すなわち脱水して、両者をエステル結合させるものである。脱水縮合剤としては、特に限定されないが、例えば、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−シクロヘキシル−（２−モルホニル−４−エチル）−カルボジイミド・メソｐ−トルエンスルホネート等が挙げられる。このなかでは、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が、ペプチド合成分野での実績があり、商業上入手し易いことより好適である。
【００２６】
上記求電子性基導入剤と脱水縮合剤の仕込み量を調整することにより、最終活性エステル化多糖における活性エステル基量を制御することができる。
具体的には、酸型多糖の全カルボキシ基のモル数（Ｘｍｍｏｌ）に対する脱水縮合剤のモル数（Ｚｍｍｏｌ）の比（Ｚ／Ｘ）が、前述の反応温度において、０．１＜Ｚ／Ｘ＜５０を満たす添加条件であることが好ましい。Ｚ／Ｘが０．１より小さい場合、脱水縮合剤の添加量が少ないため反応効率が低く、所望の活性エステル基導入率を達成し難くなり、Ｚ／Ｘが５０より大きい場合、脱水縮合剤の添加量が多いため、活性エステル基の導入率は高くなるものの、得られた活性エステル化多糖が水に溶解しにくくなるからである。
また、酸型多糖の全カルボキシ基のモル数（Ｘｍｍｏｌ）に対する求電子性基導入剤のモル数（Ｙｍｍｏｌ）は、活性エステル基の導入率に応じた反応量以上を添加すれば良く、特に限定されないが、０．１＜Ｙ／Ｘ＜１００を満たす添加条件であることが好ましい。通常、求電子性基導入剤は、酸型多糖の全カルボキシ基１モルに対し、２〜３０モルの過剰量で用いられる。
【００２７】
エステル化反応工程の反応温度は、特に限定されないが、好ましくは０℃〜７０℃、より好ましくは、２０℃〜４０℃である。反応時間は反応温度により様々であるが、通常は１〜４８時間、好ましくは１２時間〜２４時間である。
【００２８】
＜酸処理＞
従来、上記エステル化反応により生成した活性エステル化多糖は、晶析させて回収するが、本発明では、この析出前に、活性エステル化多糖を多価カルボン酸と接触させる。
多価カルボン酸は、ジカルボン酸以上であればよいが、通常、入手容易なジカルボン酸およびトリカルボン酸から選ばれる。特に、従来医薬品添加物として実績のあるジカルボン酸としてコハク酸およびリンゴ酸、トリカルボン酸としてクエン酸が好ましい。これらを２種以上併用してもよい。
多価カルボン酸の使用量は、通常、求電子性基導入剤の仕込み１モルに対する酸当量で、通常、１当量以上、通常、１〜１０当量である。この範囲であれば、最終的に水不溶物を生じない活性エステル化多糖乾燥品を得ることができる。好ましくは１．５当量以上である。あまり多すぎると乾燥時の経時的な平均分子量Ｍｗ変化率が高くなる傾向があり、好ましくは９当量以下、より好ましくは７．５当量以下である。典型的には、３当量である。
活性エステル化多糖と多価カルボン酸との接触は、具体的には、エステル化反応後の反応液に多価カルボン酸を加え、混合すればよい。混合時間は、特に制限されず、通常１〜６０分である。
【００２９】
＜後処理＞
上記接触の後、従来と同様に活性エステル化多糖を析出させ、回収する。通常、反応液を、過剰量のアルコール、アセトンなどの貧溶媒中に注入して析出させ、デカンテーション、遠心、ろ過などの適宜の方法で回収する。析出物の貧溶媒による洗浄を少なくとも１回繰り返して精製することが好ましい。この析出・精製工程におけるろ過および／または洗浄等の手段により、未反応の求電子性基導入剤、脱水縮合剤、反応副生成物とともに反応系に供した多価カルボン酸も除去され、最終活性エステル化多糖中には実質的に多価カルボン酸は残留しない。
本発明では、この工程後の活性エステル化多糖（イニシャル）の平均分子量Ｍｗは、エステル化前の酸型多糖とほぼ同等である。
【００３０】
＜乾燥＞
活性エステル化多糖は、水に不安定であり、析出・精製工程後の活性エステル化多糖は通常減圧乾燥する。減圧乾燥は、４５℃以下の温度で、通常、少なくとも１時間好ましくは４時間行うことが望ましい。
本発明の製造工程で得られる活性エステル化多糖は、この減圧乾燥時における経時的な分子量増大が抑制されている。減圧乾燥における経時的平均分子量（Ｍｗ）の変化率を求めた場合、一態様例として、本発明で製造されるＮＨＳデキストリンの減圧乾燥時における経時的平均分子量（Ｍｗ）変化率は１．８未満であることが好ましく、１．４以下であることがより好ましい。なお、従来の方法で得られる活性エステル化多糖は、減圧乾燥時に通常変化率１．８％以上の経時的な平均分子量Ｍｗ増大が観察される。
【００３１】
乾燥した活性エステル化多糖は、必要に応じて、解砕あるいは粉砕し粉末化される。必要であれば篩い分けなどにより、粒径調整を行い任意の粒度分布に調整することもできる。特に限定されないが、通常、平均粒子径数十ｎｍ〜数百μｍの粉末が好ましい。
【００３２】
＜活性エステル化多糖＞
上記のような本発明の方法で得られる活性エステル化多糖（乾燥品）は、架橋性材料として、通常、水に溶解して使用されるが、その際、ダマなどの不溶分を生じない。
【００３３】
本発明に係る活性エステル化多糖は、分子内に上記活性エステル基を少なくとも１つ有するが、架橋マトリックスを形成するためには、通常、１分子中に２以上有する。天然原料由来の多糖は、分子量の異なる分子の混合物であることが多いため、活性エステル基含有率は、その乾燥質量１ｇあたりの活性エステル基量で表すことが適切であろう。その使用目的によっても異なるが、活性エステル化多糖の乾燥質量１ｇあたりの活性エステル基量は、通常、０．１〜５ｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは０．１〜２ｍｍｏｌ／ｇである。
【００３４】
活性エステル基の導入率（％）は、酸型多糖が有する全カルボキシ基（ＴＣ）に対して、得られた活性エステル化多糖中の活性エステル基含有量モル量（ＡＥ）の比（ＡＥ／ＴＣ）に１００を乗することで表すことができ、例えば、Biochemistry Vol. １４, No.７（1975）, p1535−1541に記載の方法により決定することができる。活性エステル基の導入率が１００％未満の場合、活性エステル化多糖は活性エステル基とともにエステル化されていないカルボキシ基を有することを意味する。
【００３５】
本発明の活性エステル化多糖の好ましい態様例として、ＮＨＳデキストリンが挙げられる。特に、デキストリンのＭｗが１０〜２００ｋＤａであり、ＣＭ基の導入量が０．５〜０．９ｍｍｏｌ／ｇのＣＭデキストリンを活性エステル化したＮＨＳ基導入量０．５〜０．７ｍｍｏｌ／ｇのものが好ましく挙げられる。
【００３６】
なお、活性エステル化多糖は、活性エステル基が導入された後も、通常、多糖骨格分子内水酸基を有し、したがって分子内に活性水素含有基を有するが、分子内の活性水素含有基は、これに限定されず、必要に応じて分子内に導入した活性水素含有基をさらに有していてもよい。この場合、活性エステル化多糖の有する活性水素含有基は、１種であっても２種以上であってもよい。活性水素含有基は、たとえば水酸基、１級または２級アミノ基、チオール基などである。
また、活性エステル化多糖は、上記活性エステル基および活性水素含有基に加え、本発明の特性を損なわない範囲であれば、公知の元素、原子団等の官能基を広く含むことができる。このような官能基として具体的には、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン元素；カルボキシ基；カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシイソプロピル基等のカルボキシアルキル基；シリル基、アルキレンシリル基、アルコキシシリル基、リン酸基等が挙げられる。このような官能基は、１種単独でも２種以上が導入されていてもよい。
【００３７】
本発明の活性エステル化多糖は、本質的に水酸基すなわち活性水素含有基を多糖分子内に有するため、架橋剤を加えない場合でも、アルカリ下で、分子鎖内または分子鎖間で架橋構造を形成することができる自己架橋性である。アルカリ下とは、ｐＨ７超の水分が存在する条件をいう。
また活性エステル化多糖を生体表面に適用すれば、生体表面の活性水素含有基との反応により生体表面への接着性を示す。医療用処置材としての用途では、架橋反応時の温度は通常生体温度であり、熱の架橋反応への寄与は実質的に大きくないが、本発明の活性エステル化多糖は、この温度でのアルカリ下で、架橋マトリックスを形成しうる。
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）ＮＨＳデキストリンの調製
１．酸型多糖ＣＭデキストリンの調製
５００ｍＬフラスコ中、デキストリン（名糖産業株式会社製サンデックＳＤ＃１００，Ｍｗ１５ｋＤａ）１０ｇを、純水６２．５ｇにダマや濁りがなくなるまで溶解した後、３６wt％ＮａＯＨ水溶液６２．５ｇを添加して、室温で９０分間撹拌した。そこに、クロル酢酸１０．３１ｇ（１０９．１ｍｍｏｌ）に蒸留水を加え７５ｇとしたクロル酢酸水溶液を添加し、６０℃で６時間反応させた。室温まで冷却した後、２０％ＨＣｌ水溶液を８０ｍＬ添加し、ＣＭデキストリンを含む反応液を得た。
次に、エタノール４４５０ｍＬおよび水１８０ｍＬを含む５Ｌビーカー中に、撹拌下、上記で得た反応液全量を注ぎ込んだ。析出物を濾集し、最初に９０％エタノール水溶液２Ｌで、次にエタノール２Ｌで洗浄した後、室温で２４時間減圧乾燥し、ＣＭデキストリンを得た。
【００３９】
以下のようにして求めたＣＭデキストリンのＣＭ基量は０．８ｍｍｏｌ／ｇであった。
酸型多糖のカルボキシ基量の定量：酸型多糖（ＣＭデキストリン）０．２ｇ（Ａｇ）を秤取り、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬと８０ｖｏｌ％メタノール水溶液１０ｍＬとの混合溶液に添加し、２５℃で３時間撹拌した溶液に、１．０％フェノールフタレイン／９０ｖｏｌ％エタノール水溶液を滴下し、０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を使用して酸塩基逆滴定を行い、０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸の使用量（Ｖ1 ｍＬ）を測定する。酸型多糖を添加しないブランクでの０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸の使用量（Ｖ0 ｍＬ）を測定し、下記式（１）に従い、酸型多糖のカルボキシ基量（Ｂｍｍｏｌ／ｇ）を算出する。なお、使用した０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液、０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸の力価は、ともに１．００である。
Ｂ＝（Ｖ0−Ｖ1）×０．１÷Ａ ・・・（１）
Ａ：酸型多糖の質量（ｇ）
Ｂ：カルボキシ基量（ｍｍｏｌ／ｇ）
【００４０】
２．ＣＭデキストリンの活性エステル化（ＮＨＳ導入率７５％）
１Ｌフラスコ内に、上記で得られたＣＭデキストリン１０ｇ（酸基量で８ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ３００ｇを装入し、室温で撹拌して完全に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（和光純薬工業社製）１２ｇ（１０４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で撹拌して完全に溶解した。次に、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（和光純薬工業社製）２０．１ｇ（１０４ｍｍｏｌ）を添加して、室温で撹拌して完全に溶解した後、２３℃で１６時間撹拌して反応液１を得た。
【００４１】
３．酸処理
上記反応液１を、表１に示す量のクエン酸と２０分間混合して反応液２を得た。
【００４２】
４．回収
メタノール／アセトン＝１：４（ｖ／ｖ）２Ｌを含む３Ｌビーカー中、撹拌下、反応液２の全量を添加した。静置後、デカンテーションして上澄みを除去し、メタノール／アセトン＝１：４（ｖ／ｖ）８００ｍＬを添加した。φ９５ｍｍ桐山ロート，Ｎｏ.５Ａ濾紙を用いて吸引ろ過し、析出物を濾集した。ロート上の濾物を、メタノール／アセトン＝１：４（ｖ／ｖ）１６００ｍＬで洗浄した。
【００４３】
５．乾燥
濾物を４０℃で２４時間減圧乾燥した。４時間、８時間、２４時間の乾燥品ＮＨＳデキストリンのＧＰＣによる平均分子量Ｍｗを測定し、時間に対する変化率を求めた。変化率（％）は、時間−Ｍｗのプロットを直線とみなした時の傾きとして算出する。また、各乾燥時間の乾燥品の溶解性試験を行った。これら結果を表１に示す。
得られた乾燥品ＮＨＳデキストリンは、ゲル化試験でのゲル化が確認された。
【００４４】
＜平均分子量Ｍｗの測定条件＞
試薬：ＲＯ水，硝酸ナトリウム
溶離液の調製：硝酸ナトリウム８．４９ｇを秤量し、ＲＯ水で２Ｌに希釈して、５０ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液とする。
試料溶液の調製：試料１０ｍｇを秤量し、溶離液１０ｍＬで希釈する。溶液を１０回転倒混和し、２時間静置する。得られた溶液はメンブランフィルターに通し、測定バイアルに供する。
ＨＰＬＣ測定条件：
測定装置：東ソー製 ＥＣＯＳＥＣ ＨＰＬＣ−８３２０ＧＰＣ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ φ８．０×３００ｍｍ ２本
溶離液：５０ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ
注入量：１００μＬ
【００４５】
＜溶解性試験＞
試料０．２７ｇをガラス試験管（１５ｍＬ）に量り取り、ＲＯ水０．５４ｍＬを加えて３分間激しく撹拌する。その後、外観を観察し、不溶物の有無を確認した。
【００４６】
＜ゲル化試験＞
試料０．２７ｇをガラス試験管（１５ｍＬ）に量り取り、ＲＯ水０．５４ｍＬを加えて３分間激しく撹拌する。その後、０．５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム水溶液０．１８ｍＬを加え、１０秒間激しく撹拌した後、試験管を反転させる。混合物の流動が認められなければ、ゲルが形成されたと判断した。
【００４７】
【表１】
上記から、特に１．５〜７．５当量でのＭｗ変化率が低く、ばらつきが少ない。
【００４８】
（実施例２）
実施例１の３．酸処理におけるクエン酸に代えてコハク酸を３当量用いた以外は実施例１と同様にしてＮＨＳデキストリンを調製した。実施例１と同様に試験した結果を表２に示す。ゲル化試験でのゲル化が確認された。
【００４９】
（実施例３）
実施例１の３．酸処理におけるクエン酸に代えてリンゴ酸を３当量用いた以外は実施例１と同様にしてＮＨＳデキストリンを調製した。実施例１と同様に試験した結果を表２に示す。ゲル化試験でのゲル化が確認された。
【００５０】
（参考例１）
実施例１の３．酸処理におけるクエン酸に代えて表２に示す３種のモノカルボン酸を３当量用いた以外は実施例１と同様にしてＮＨＳデキストリンを調製した。実施例１と同様に試験した結果を表２に示す。
【００５１】
（参考例２）
実施例１の３．酸処理におけるクエン酸を用いず塩酸を３当量用いた以外は実施例１と同様にしてＮＨＳデキストリンを調製した。実施例１と同様に試験した結果を表２に示す。
【００５２】
（比較例１）
実施例１の３．酸処理を省略した以外は実施例１と同様にしてＮＨＳデキストリンを調製したコントロール例を４例示す。実施例１と同様に試験した結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
表２中には、実施例１におけるクエン酸３当量の例も併記する。
比較例１（コントロール）は、溶解性に再現性がなく、必ずＭｗが増加する傾向にあるが、Ｍｗ変化率がばらつき、均質なものが安定して得られない。また、モノカルボン酸または塩酸の使用では、Ｍｗ変化率が大きかったり、不溶物を生じたりして安定しない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性エステル化多糖およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体適合性の高い多糖の側鎖に架橋性基を導入した多糖誘導体は、生体適合材料として有用であることがいくつかの文献で提案されている。なかでも、多糖の側鎖に導入したカルボキシ基を求電子性基とエステル化し、活性水素含有基との接触により該エステル結合が解離することでカルボキシ基が架橋に関与する機構の活性エステル化多糖は、自己架橋性であり、癒着防止材、止血材、医療用接着材などの各種生体適合材料として特に有用である（特許文献１など参照）。
【０００３】
上記活性エステル基は、通常、イミドエステルであり、特にスクシンイミドエステルが代表的である。多糖の活性エステル化としては、分子内にカルボキシ基を有するヒアルロン酸について、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩とＮ−ヒドロキシスクシンイミドジフェニルリン酸塩との反応によるヒアルロン酸のスクシンイミド活性エステルの合成方法なども報告される（非特許文献１参照）が、従来一般には、まず、分子内にカルボキシ基を有さない多糖の側鎖にカルボキシ基を導入して酸型多糖とし、該カルボキシ基とＮ−ヒドロキシイミドとを脱水縮合させてエステル形成する。生成した活性エステル化多糖は、貧溶媒で晶析した後減圧乾燥して粉末とし、使用に際して水に溶解する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２００４／８１０５５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Y. Luoら, Bioconjugate Chem. 2001, 12, 1085-1088
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生体適合材料として有用性の高い活性エステル化多糖の製品化に際して、乾燥製品の活性エステル化多糖を水に溶解するとダマなどの不溶物を生じることがあるという問題を生じた。不溶分を含む製品は、これまで検討されてきた実験レベルでは報告のない問題であるが、商業的スケールアップを図る上で初めて生じた品質上の問題であり、また生産効率の問題でもある。このため、水溶解時に不溶物を生じることがない安定した品質の活性エステル化多糖、および製造スケールをアップしてもそのような品質の活性エステル化多糖を安定して製造しうる方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題について種々検討したところ、エステル反応終了後の反応液を多価カルボン酸と接触させることにより、乾燥製品の水溶解時の不溶物を生じる課題を解決しうることを見出した。また、最終乾燥工程および貯蔵時における目的物質の経時的な平均分子量（Ｍｗ）上昇も抑制しうることも確認できた。これによりスケールアップの実現を担保でき、本発明を完成した。
なお、この検討過程では、従来の製造方法で得られる活性エステル化多糖は、その乾燥製品が水不溶分を生じる場合、該活性エステル化多糖のＧＰＣ測定では、高分子側にショルダーが出現するかまたはショルダーのブロード化が認められ、高分子量成分の生成が示された。この高分子側ショルダー分画はＩＲスペクトルにより活性エステル化多糖の水素結合物と推測された。このような高分子量成分の生成による平均分子量（Ｍｗ）の変化に対する寄与率は必ずしも大きいとはいえず、したがって不溶分が生成してもＭｗの値が顕著に大きくなるともいえない。また逆に、Ｍｗがある程度増加すると必ず不溶分を生成するともいえないが、事実として、従来の製造方法で得られる活性エステル化多糖は、減圧乾燥時および貯蔵時に経時的にＭｗが増加する傾向が認められ、またＭｗの経時的変化率がばらつくという知見も得ている。さらに、減圧乾燥時のＭｗの増加は貯蔵時よりも顕著であること、および減圧乾燥時のＭｗの増加を抑制すれば貯蔵時のＭｗの増加を抑制できるという知見を得ている。したがって減圧乾燥におけるＭｗ評価は貯蔵安定性も含めた製品安定性の評価となる。
【０００８】
一方、上記製造過程において多価カルボン酸と接触させた活性エステル化多糖は、最終乾燥製品における水溶解時の不溶物生成を安定して抑制でき、ＧＰＣ測定におけるピークに顕著な高分子側のショルダー出現またはブロード化は認められない。また、減圧乾燥時の経時的なＭｗ増大が抑制される効果を奏することも確かめている。本発明の製造過程で使用される多価カルボン酸は、ほとんど最終乾燥製品中には残留しておらず、該乾燥製品を水に溶解した際に不溶物を生じない理由および減圧乾燥時の経時的な高分子量成分の生成もしくはＭｗ増大の抑制効果の理由には明らかではないが、製造過程での多価カルボン酸との接触により安定した乾燥製品を再現性よく得ることができ、乾燥製品の確実な水溶解性を保証することは事実である。したがって以下の本発明を提供する。
【０００９】
本発明は、酸型多糖のカルボキシ基と求電子性基導入剤とをエステル化反応させ、生成した活性エステル化多糖を多価カルボン酸と接触させた後析出させ回収する活性エステル化多糖の製造方法である。
上記沈殿回収後の活性エステル化多糖は、通常、減圧乾燥する。
また本発明では、上記のような方法で得られる活性エステル化多糖を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、最終乾燥工程における目的化合物の経時的な分子量上昇の抑制効果を奏する。不溶物を生じない活性エステル化多糖（乾燥品）を商業スケールでも安定して製造することができ、安定した品質の活性エステル化多糖を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明を製造方法にしたがって具体的に説明する。
本明細書において、カルボキシ基を有する多糖を「酸型多糖」と称する。
本発明では、酸型多糖のカルボキシ基と、求電子性基導入剤とをエステル化反応させ、生成した活性エステル化多糖を多価カルボン酸と接触させた後、活性エステル化多糖を析出させ回収する。
＜酸型多糖＞
酸型多糖の主鎖となる多糖は、主骨格に単糖構造を２単位以上有するものであればよく、特に制限されない。たとえば、アラビノース、リボース、キシロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラムノース、フコース、リボデソース等の単糖類；トレハロース、スクロース、マルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクトース、メリビオース等の二糖類；ラフィノース、ゲンチアノース、メレチトース、スタキオース等の三糖以上の多糖類が、共有結合することにより形成されたもの、およびこれに対して、さらに官能基を導入したものが挙げられる。このような多糖は、天然に存在するものでも、人工的に合成されたものでもよい。
【００１２】
多糖の分子量に特に制限はない。好ましくは、上記の単糖類、二糖類または三糖以上の多糖類が、数十〜数千個結合したものに相当する平均分子量（Ｍｗ）が５〜２５００ｋＤａの多糖である。このような多糖であれば、活性エステル化多糖が架橋した後のゲルの硬度を調整しやすく、架橋に関与する活性エステル基および活性水素含有基を１分子鎖に複数導入しやすいからである。好ましくは、Ｍｗが１０〜１０００ｋＤａの多糖である。
【００１３】
酸型多糖における「カルボキシ基」は、通常、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）およびカルボキシアルキル基（−ＲＣＯＯＨ）基である。−ＲＣＯＯＨとしては、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシイソプロピル基、カルボキシブチル基などが挙げられる。
【００１４】
酸型多糖は、活性エステル化多糖の前駆段階で酸型であればよく、カルボキシ基を自己保有する天然酸型多糖であってもよく、導入したカルボキシ基を有する酸型多糖であってもよい。カルボキシ基を導入する多糖は、天然酸型多糖であってもそれ自体はカルボキシ基を有さない多糖であってもよい。
上記カルボキシ基を自己保有する天然酸型多糖としては、特に限定されないが、ガラクツロン酸を含むペクチンやヒアルロン酸等が挙げられる。
カルボキシ基を有さない多糖としては、特に限定されないが、デキストラン、プルラン、デキストリンなどが挙げられる。
【００１５】
デキストランは、代用血漿剤として使用されており、「Dextran Ｔ fractions」（アマシャムバイオサイエンス社）の商品名で入手可能である。
プルランは、経口薬を含む医薬添加剤として使用されており、エンドトキシン等の生物学的コンタミネーションが少ないものが好適である。プルランは、「Pullulan ＰＩ−２０」（林原社）の商品名で入手可能である。
【００１６】
デキストリンは、でんぷんの加水分解物であり、分子鎖長の異なるグルコース重合体の混合物である。デキストリンにおけるグルコース単位は、主としてα−１，４結合であり、通常、ある程度の割合でα−１，６結合を含む。本発明では、デキストリン原料のでんぷん種は特に限定されず、したがってα−１，６結合の存在割合も特に限定されない。
本発明で用いられるデキストリンは、入手しやすさ、用時の物性、扱い易さ、被膜形成性などを考慮して、典型的にＭｗ１０〜２００ｋＤａ程度のものである。
いずれの多糖も、本発明においては、一般的に商業流通しているものを利用できる。上記医療用途で実績のある多糖は、本発明においては安全性面で好適に利用できる多糖である。
【００１７】
上記のうちでも、デキストリンは、アナフィラキシーショックが報告されておらず、腹膜透析での使用実績もあり、生体適応における不具合が未だ報告されていない点で特に好ましい多糖である。
また、酸型多糖は、好ましくは、カルボキシメチル基を有するカルボキシメチル化多糖である。
なお、本発明では、酸型多糖におけるカルボキシ基は、塩が配位していない「非塩型」であることが望ましく、最終的に得られる活性エステル化多糖が塩形態ではないことが望ましい。ここで「塩」とは、アルカリ金属、アルカリ土類金属などの無機塩、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）などの四級アミン、ヨウ化クロロメチルピリジリウムなどのハロゲン塩などを包含する。「非塩型」とは、これらの「塩」が配位していないことであり、「塩形態ではない」とは、これらの塩を含まないことを意味する。
【００１８】
多糖のカルボキシ化反応は、公知の酸化反応を利用して、特に制限なく行うことができる。多糖の水酸基を酸化してカルボン酸とする場合、反応の種類は特に限定されないが、例えば、四酸化二窒素酸化、発煙硫酸酸化、リン酸酸化、硝酸酸化、過酸化水素酸化が挙げられ、各々、試薬を用いて通常知られた反応を選択して酸化することができる。各反応条件はカルボキシ基の導入量により適宜設定することができる。例えば、原料となる多糖をクロロホルムあるいは四塩化炭素中に懸濁させ、四酸化二窒素を加えることにより、多糖の水酸基を酸化してカルボン酸を有する酸型多糖を調製することができる。
【００１９】
多糖のカルボキシアルキル化反応は、公知の方法を利用することができ、特に限定されないが、具体的にカルボキシメチル化反応の場合には、多糖をアルカリ化した後にモノクロル酢酸を使用した反応を選択することが可能である。その反応条件はカルボキシメチル基の導入量により適宜設定することができる。ここでの多糖は、通常、水溶液で反応に供される。
カルボキシ基を導入した酸型多糖は、通常、貧溶媒（通常アルコール）を用いて析出させ、減圧乾燥する。
【００２０】
本発明では、多糖にカルボキシ基を導入する方法として、上記カルボン酸化またはカルボキシアルキル化のいずれの方法も利用でき、特に限定されないが、カルボキシ基導入反応による多糖の分子量の低下が小さく、カルボキシ基の導入量を比較的コントロールしやすい点で、カルボキシアルキル化、特にカルボキシメチル化が好適である。このカルボキシメチル基を、以下「ＣＭ−」とも記す。
【００２１】
活性エステル化に使用される酸型多糖は、その乾燥質量１ｇあたりのカルボキシ基（該基を１分子とみなして）量が、通常、０．１〜５ｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは０．４〜３ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．５〜２ｍｍｏｌ／ｇである。このカルボキシ基量の割合が、０．１ｍｍｏｌ／ｇより少ないと、該基から誘導され架橋点となる活性エステル基数が不充分になる場合が多い。一方、カルボキシ基量の割合が、５ｍｍｏｌ／ｇより多くなると、活性エステル化多糖（未架橋）が水を含む溶媒に溶解しにくくなる。なお、酸型多糖のカルボキシ基量はフェノールフタレインを指示薬として酸塩基逆滴定により定量することができる。
【００２２】
本発明では、最終的な活性エステル化多糖において、活性エステル化されていないカルボキシ基が残存していてもよい。したがって上記カルボキシ基量は、最終的な活性エステル化多糖における活性エステル基と活性エステル化されていないカルボキシ基の合計量となる。
【００２３】
＜活性エステル化＞
上記のような酸型多糖と求電子性基導入剤とを反応させ、活性エステル基を形成する。この際に使用される酸型多糖は、単種であっても２種以上併用されても良い。
活性エステル基は、カルボキシ基のカルボニル炭素に、通常のアルコールよりも強い求電子性基が結合した基であり、アルカリ共存下の水存在下でエステル結合が解離する。このような活性エステル基を形成する求電子性基導入剤としては、典型的に、比較的安価に入手可能なＮ−ヒドロキシアミン系化合物が用いられる。具体的には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステル、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸アミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシマレイミド等が代表的なものとして挙げられる。これら化合物を２種以上用いてもよい。
このなかでも、Ｎ−ヒドロキシイミド、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳとも記す）が、ペプチド合成分野での実績があり、商業上入手し易いことより好適である。
【００２４】
酸型多糖は、通常、非プロトン性極性溶媒の溶液として上記エステル化反応に供する。非プロトン性極性溶媒とは、電気的に陽性な官能基を有する求核剤と水素結合を形成できるプロトンを持たない極性溶媒であり、特に限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンなどが例示される。多糖の溶媒への溶解性が良好であることから、ＤＭＳＯが好適に利用できる。
上記好ましい「非塩型」の酸型多糖であれば、通常、上記溶媒中で２０℃〜１２０℃程度に加熱することにより溶解することができる。
【００２５】
酸型多糖と求電子性基導入剤とのエステル化反応は、通常、脱水縮合剤の存在下で行われる。
脱水縮合剤は、カルボキシ基と求電子性基導入剤との縮合で生成する水分子を１つ引き抜き、すなわち脱水して、両者をエステル結合させるものである。脱水縮合剤としては、特に限定されないが、例えば、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−シクロヘキシル−（２−モルホニル−４−エチル）−カルボジイミド・メソｐ−トルエンスルホネート等が挙げられる。このなかでは、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が、ペプチド合成分野での実績があり、商業上入手し易いことより好適である。
【００２６】
上記求電子性基導入剤と脱水縮合剤の仕込み量を調整することにより、最終活性エステル化多糖における活性エステル基量を制御することができる。
具体的には、酸型多糖の全カルボキシ基のモル数（Ｘｍｍｏｌ）に対する脱水縮合剤のモル数（Ｚｍｍｏｌ）の比（Ｚ／Ｘ）が、前述の反応温度において、０．１＜Ｚ／Ｘ＜５０を満たす添加条件であることが好ましい。Ｚ／Ｘが０．１より小さい場合、脱水縮合剤の添加量が少ないため反応効率が低く、所望の活性エステル基導入率を達成し難くなり、Ｚ／Ｘが５０より大きい場合、脱水縮合剤の添加量が多いため、活性エステル基の導入率は高くなるものの、得られた活性エステル化多糖が水に溶解しにくくなるからである。
また、酸型多糖の全カルボキシ基のモル数（Ｘｍｍｏｌ）に対する求電子性基導入剤のモル数（Ｙｍｍｏｌ）は、活性エステル基の導入率に応じた反応量以上を添加すれば良く、特に限定されないが、０．１＜Ｙ／Ｘ＜１００を満たす添加条件であることが好ましい。通常、求電子性基導入剤は、酸型多糖の全カルボキシ基１モルに対し、２〜３０モルの過剰量で用いられる。
【００２７】
エステル化反応工程の反応温度は、特に限定されないが、好ましくは０℃〜７０℃、より好ましくは、２０℃〜４０℃である。反応時間は反応温度により様々であるが、通常は１〜４８時間、好ましくは１２時間〜２４時間である。
【００２８】
＜酸処理＞
従来、上記エステル化反応により生成した活性エステル化多糖は、晶析させて回収するが、本発明では、この析出前に、活性エステル化多糖を多価カルボン酸と接触させる。
多価カルボン酸は、ジカルボン酸以上であればよいが、通常、入手容易なジカルボン酸およびトリカルボン酸から選ばれる。特に、従来医薬品添加物として実績のあるジカルボン酸としてコハク酸およびリンゴ酸、トリカルボン酸としてクエン酸が好ましい。これらを２種以上併用してもよい。
多価カルボン酸の使用量は、通常、求電子性基導入剤の仕込み１モルに対する酸当量で、通常、１当量以上、通常、１〜１０当量である。この範囲であれば、最終的に水不溶物を生じない活性エステル化多糖乾燥品を得ることができる。好ましくは１．５当量以上である。あまり多すぎると乾燥時の経時的な平均分子量Ｍｗ変化率が高くなる傾向があり、好ましくは９当量以下、より好ましくは７．５当量以下である。典型的には、３当量である。
活性エステル化多糖と多価カルボン酸との接触は、具体的には、エステル化反応後の反応液に多価カルボン酸を加え、混合すればよい。混合時間は、特に制限されず、通常１〜６０分である。
【００２９】
＜後処理＞
上記接触の後、従来と同様に活性エステル化多糖を析出させ、回収する。通常、反応液を、過剰量のアルコール、アセトンなどの貧溶媒中に注入して析出させ、デカンテーション、遠心、ろ過などの適宜の方法で回収する。析出物の貧溶媒による洗浄を少なくとも１回繰り返して精製することが好ましい。この析出・精製工程におけるろ過および／または洗浄等の手段により、未反応の求電子性基導入剤、脱水縮合剤、反応副生成物とともに反応系に供した多価カルボン酸も除去され、最終活性エステル化多糖中には実質的に多価カルボン酸は残留しない。
本発明では、この工程後の活性エステル化多糖（イニシャル）の平均分子量Ｍｗは、エステル化前の酸型多糖とほぼ同等である。
【００３０】
＜乾燥＞
活性エステル化多糖は、水に不安定であり、析出・精製工程後の活性エステル化多糖は通常減圧乾燥する。減圧乾燥は、４５℃以下の温度で、通常、少なくとも１時間好ましくは４時間行うことが望ましい。
本発明の製造工程で得られる活性エステル化多糖は、この減圧乾燥時における経時的な分子量増大が抑制されている。減圧乾燥における経時的平均分子量（Ｍｗ）の変化率を求めた場合、一態様例として、本発明で製造されるＮＨＳデキストリンの減圧乾燥時における経時的平均分子量（Ｍｗ）変化率は１．８未満であることが好ましく、１．４以下であることがより好ましい。なお、従来の方法で得られる活性エステル化多糖は、減圧乾燥時に通常変化率１．８％以上の経時的な平均分子量Ｍｗ増大が観察される。
【００３１】
乾燥した活性エステル化多糖は、必要に応じて、解砕あるいは粉砕し粉末化される。必要であれば篩い分けなどにより、粒径調整を行い任意の粒度分布に調整することもできる。特に限定されないが、通常、平均粒子径数十ｎｍ〜数百μｍの粉末が好ましい。
【００３２】
＜活性エステル化多糖＞
上記のような本発明の方法で得られる活性エステル化多糖（乾燥品）は、架橋性材料として、通常、水に溶解して使用されるが、その際、ダマなどの不溶分を生じない。
【００３３】
本発明に係る活性エステル化多糖は、分子内に上記活性エステル基を少なくとも１つ有するが、架橋マトリックスを形成するためには、通常、１分子中に２以上有する。天然原料由来の多糖は、分子量の異なる分子の混合物であることが多いため、活性エステル基含有率は、その乾燥質量１ｇあたりの活性エステル基量で表すことが適切であろう。その使用目的によっても異なるが、活性エステル化多糖の乾燥質量１ｇあたりの活性エステル基量は、通常、０．１〜５ｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは０．１〜２ｍｍｏｌ／ｇである。
【００３４】
活性エステル基の導入率（％）は、酸型多糖が有する全カルボキシ基（ＴＣ）に対して、得られた活性エステル化多糖中の活性エステル基含有量モル量（ＡＥ）の比（ＡＥ／ＴＣ）に１００を乗することで表すことができ、例えば、Biochemistry Vol. １４, No.７（1975）, p1535−1541に記載の方法により決定することができる。活性エステル基の導入率が１００％未満の場合、活性エステル化多糖は活性エステル基とともにエステル化されていないカルボキシ基を有することを意味する。
【００３５】
本発明の活性エステル化多糖の好ましい態様例として、ＮＨＳデキストリンが挙げられる。特に、デキストリンのＭｗが１０〜２００ｋＤａであり、ＣＭ基の導入量が０．５〜０．９ｍｍｏｌ／ｇのＣＭデキストリンを活性エステル化したＮＨＳ基導入量０．５〜０．７ｍｍｏｌ／ｇのものが好ましく挙げられる。
【００３６】
なお、活性エステル化多糖は、活性エステル基が導入された後も、通常、多糖骨格分子内水酸基を有し、したがって分子内に活性水素含有基を有するが、分子内の活性水素含有基は、これに限定されず、必要に応じて分子内に導入した活性水素含有基をさらに有していてもよい。この場合、活性エステル化多糖の有する活性水素含有基は、１種であっても２種以上であってもよい。活性水素含有基は、たとえば水酸基、１級または２級アミノ基、チオール基などである。
また、活性エステル化多糖は、上記活性エステル基および活性水素含有基に加え、本発明の特性を損なわない範囲であれば、公知の元素、原子団等の官能基を広く含むことができる。このような官能基として具体的には、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン元素；カルボキシ基；カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシイソプロピル基等のカルボキシアルキル基；シリル基、アルキレンシリル基、アルコキシシリル基、リン酸基等が挙げられる。このような官能基は、１種単独でも２種以上が導入されていてもよい。
【００３７】
本発明の活性エステル化多糖は、本質的に水酸基すなわち活性水素含有基を多糖分子内に有するため、架橋剤を加えない場合でも、アルカリ下で、分子鎖内または分子鎖間で架橋構造を形成することができる自己架橋性である。アルカリ下とは、ｐＨ７超の水分が存在する条件をいう。
また活性エステル化多糖を生体表面に適用すれば、生体表面の活性水素含有基との反応により生体表面への接着性を示す。医療用処置材としての用途では、架橋反応時の温度は通常生体温度であり、熱の架橋反応への寄与は実質的に大きくないが、本発明の活性エステル化多糖は、この温度でのアルカリ下で、架橋マトリックスを形成しうる。
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）ＮＨＳデキストリンの調製
１．酸型多糖ＣＭデキストリンの調製
５００ｍＬフラスコ中、デキストリン（名糖産業株式会社製サンデックＳＤ＃１００，Ｍｗ１５ｋＤａ）１０ｇを、純水６２．５ｇにダマや濁りがなくなるまで溶解した後、３６wt％ＮａＯＨ水溶液６２．５ｇを添加して、室温で９０分間撹拌した。そこに、クロル酢酸１０．３１ｇ（１０９．１ｍｍｏｌ）に蒸留水を加え７５ｇとしたクロル酢酸水溶液を添加し、６０℃で６時間反応させた。室温まで冷却した後、２０％ＨＣｌ水溶液を８０ｍＬ添加し、ＣＭデキストリンを含む反応液を得た。
次に、エタノール４４５０ｍＬおよび水１８０ｍＬを含む５Ｌビーカー中に、撹拌下、上記で得た反応液全量を注ぎ込んだ。析出物を濾集し、最初に９０％エタノール水溶液２Ｌで、次にエタノール２Ｌで洗浄した後、室温で２４時間減圧乾燥し、ＣＭデキストリンを得た。
【００３９】
以下のようにして求めたＣＭデキストリンのＣＭ基量は０．８ｍｍｏｌ／ｇであった。
酸型多糖のカルボキシ基量の定量：酸型多糖（ＣＭデキストリン）０．２ｇ（Ａｇ）を秤取り、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬと８０ｖｏｌ％メタノール水溶液１０ｍＬとの混合溶液に添加し、２５℃で３時間撹拌した溶液に、１．０％フェノールフタレイン／９０ｖｏｌ％エタノール水溶液を滴下し、０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を使用して酸塩基逆滴定を行い、０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸の使用量（Ｖ1 ｍＬ）を測定する。酸型多糖を添加しないブランクでの０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸の使用量（Ｖ0 ｍＬ）を測定し、下記式（１）に従い、酸型多糖のカルボキシ基量（Ｂｍｍｏｌ／ｇ）を算出する。なお、使用した０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液、０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸の力価は、ともに１．００である。
Ｂ＝（Ｖ0−Ｖ1）×０．１÷Ａ ・・・（１）
Ａ：酸型多糖の質量（ｇ）
Ｂ：カルボキシ基量（ｍｍｏｌ／ｇ）
【００４０】
２．ＣＭデキストリンの活性エステル化（ＮＨＳ導入率７５％）
１Ｌフラスコ内に、上記で得られたＣＭデキストリン１０ｇ（酸基量で８ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ３００ｇを装入し、室温で撹拌して完全に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（和光純薬工業社製）１２ｇ（１０４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で撹拌して完全に溶解した。次に、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（和光純薬工業社製）２０．１ｇ（１０４ｍｍｏｌ）を添加して、室温で撹拌して完全に溶解した後、２３℃で１６時間撹拌して反応液１を得た。
【００４１】
３．酸処理
上記反応液１を、表１に示す量のクエン酸と２０分間混合して反応液２を得た。
【００４２】
４．回収
メタノール／アセトン＝１：４（ｖ／ｖ）２Ｌを含む３Ｌビーカー中、撹拌下、反応液２の全量を添加した。静置後、デカンテーションして上澄みを除去し、メタノール／アセトン＝１：４（ｖ／ｖ）８００ｍＬを添加した。φ９５ｍｍ桐山ロート，Ｎｏ.５Ａ濾紙を用いて吸引ろ過し、析出物を濾集した。ロート上の濾物を、メタノール／アセトン＝１：４（ｖ／ｖ）１６００ｍＬで洗浄した。
【００４３】
５．乾燥
濾物を４０℃で２４時間減圧乾燥した。４時間、８時間、２４時間の乾燥品ＮＨＳデキストリンのＧＰＣによる平均分子量Ｍｗを測定し、時間に対する変化率を求めた。変化率（％）は、時間−Ｍｗのプロットを直線とみなした時の傾きとして算出する。また、各乾燥時間の乾燥品の溶解性試験を行った。これら結果を表１に示す。
得られた乾燥品ＮＨＳデキストリンは、ゲル化試験でのゲル化が確認された。
【００４４】
＜平均分子量Ｍｗの測定条件＞
試薬：ＲＯ水，硝酸ナトリウム
溶離液の調製：硝酸ナトリウム８．４９ｇを秤量し、ＲＯ水で２Ｌに希釈して、５０ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液とする。
試料溶液の調製：試料１０ｍｇを秤量し、溶離液１０ｍＬで希釈する。溶液を１０回転倒混和し、２時間静置する。得られた溶液はメンブランフィルターに通し、測定バイアルに供する。
ＨＰＬＣ測定条件：
測定装置：東ソー製 ＥＣＯＳＥＣ ＨＰＬＣ−８３２０ＧＰＣ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ φ８．０×３００ｍｍ ２本
溶離液：５０ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ
注入量：１００μＬ
【００４５】
＜溶解性試験＞
試料０．２７ｇをガラス試験管（１５ｍＬ）に量り取り、ＲＯ水０．５４ｍＬを加えて３分間激しく撹拌する。その後、外観を観察し、不溶物の有無を確認した。
【００４６】
＜ゲル化試験＞
試料０．２７ｇをガラス試験管（１５ｍＬ）に量り取り、ＲＯ水０．５４ｍＬを加えて３分間激しく撹拌する。その後、０．５Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム水溶液０．１８ｍＬを加え、１０秒間激しく撹拌した後、試験管を反転させる。混合物の流動が認められなければ、ゲルが形成されたと判断した。
【００４７】
【表１】
上記から、特に１．５〜７．５当量でのＭｗ変化率が低く、ばらつきが少ない。
【００４８】
（実施例２）
実施例１の３．酸処理におけるクエン酸に代えてコハク酸を３当量用いた以外は実施例１と同様にしてＮＨＳデキストリンを調製した。実施例１と同様に試験した結果を表２に示す。ゲル化試験でのゲル化が確認された。
【００４９】
（実施例３）
実施例１の３．酸処理におけるクエン酸に代えてリンゴ酸を３当量用いた以外は実施例１と同様にしてＮＨＳデキストリンを調製した。実施例１と同様に試験した結果を表２に示す。ゲル化試験でのゲル化が確認された。
【００５０】
（参考例１）
実施例１の３．酸処理におけるクエン酸に代えて表２に示す３種のモノカルボン酸を３当量用いた以外は実施例１と同様にしてＮＨＳデキストリンを調製した。実施例１と同様に試験した結果を表２に示す。
【００５１】
（参考例２）
実施例１の３．酸処理におけるクエン酸を用いず塩酸を３当量用いた以外は実施例１と同様にしてＮＨＳデキストリンを調製した。実施例１と同様に試験した結果を表２に示す。
【００５２】
（比較例１）
実施例１の３．酸処理を省略した以外は実施例１と同様にしてＮＨＳデキストリンを調製したコントロール例を４例示す。実施例１と同様に試験した結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
表２中には、実施例１におけるクエン酸３当量の例も併記する。
比較例１（コントロール）は、溶解性に再現性がなく、必ずＭｗが増加する傾向にあるが、Ｍｗ変化率がばらつき、均質なものが安定して得られない。また、モノカルボン酸または塩酸の使用では、Ｍｗ変化率が大きかったり、不溶物を生じたりして安定しない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸型多糖のカルボキシ基と求電子性基導入剤とをエステル化反応させ、生成した活性エステル化多糖を多価カルボン酸と接触させた後に析出させ回収する活性エステル化多糖の製造方法。
【請求項２】
前記沈殿回収後の活性エステル化多糖を減圧乾燥する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多価カルボン酸が、ジカルボン酸およびトリカルボン酸から選ばれる少なくとも１種である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記多価カルボン酸が、コハク酸、リンゴ酸およびクエン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記求電子性化合物が、Ｎ−ヒドロキシイミドである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記多価カルボン酸の量が、前記求電子性化合物に対し１．５〜７．５当量である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記多糖がデキストリンである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記酸型多糖が、カルボキシ基を導入したデキストリンであり、前記求電子性化合物が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法で得られる活性エステル化多糖。
【請求項１】
酸型多糖のカルボキシ基と求電子性基導入剤とをエステル化反応させ、生成した活性エステル化多糖を多価カルボン酸と接触させた後に析出させ回収する活性エステル化多糖の製造方法。
【請求項２】
前記沈殿回収後の活性エステル化多糖を減圧乾燥する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多価カルボン酸が、ジカルボン酸およびトリカルボン酸から選ばれる少なくとも１種である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記多価カルボン酸が、コハク酸、リンゴ酸およびクエン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記求電子性化合物が、Ｎ−ヒドロキシイミドである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記多価カルボン酸の量が、前記求電子性化合物に対し１．５〜７．５当量である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記多糖がデキストリンである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記酸型多糖が、カルボキシ基を導入したデキストリンであり、前記求電子性化合物が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法で得られる活性エステル化多糖。
【公開番号】特開２０１１−６８８２７（Ｐ２０１１−６８８２７Ａ）
【公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２２９７５（Ｐ２００９−２２２９７５）
【出願日】平成２１年９月２８日（２００９．９．２８）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２８日（２００９．９．２８）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
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