活性酸素の測定方法および活性酸素測定用素子
【課題】本発明の目的は、活性酸素種を、簡便に、高感度で検出できる活性酸素測定方法を提供することにあり、特に生体由来の被検体中の活性酸素種を、簡便に、高感度で定量分析できる活性酸素の測定方法およびそれに用いられ活性酸素検出用素子提供することにある。
【解決手段】蛍光プローブを用いて活性酸素を測定する活性酸素の測定方法であって、該蛍光プローブが半導体ナノ粒子であることを特徴とする活性酸素の測定方法。
【解決手段】蛍光プローブを用いて活性酸素を測定する活性酸素の測定方法であって、該蛍光プローブが半導体ナノ粒子であることを特徴とする活性酸素の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素種を検出するための活性酸素測定方法に関し、さらに詳しくは、ヒトなどの好気性生物の血液、尿、汗、唾液、涙液、分泌液などの体液、飲料水などの食品、および医療用の薬品などに含まれる活性酸素種を、簡便に、高感度で検出するための活性酸素測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療の分野においては、各種生体物質中の活性酸素種の存在の情報が、生体物質の状態を把握する上での重要な情報の一つとして認識されている。
【０００３】
活性酸素種は、その反応性が比較的高いために、直接検出することは難しく、下記のように活性酸素種と反応する化合物などと反応させ反応生成物を測定する方法が一般的に用いられている。
【０００４】
例えば、活性酸素の検出方法としては、活性酸素と発光試薬と反応させ発光を測定する方法（特許文献１参照）、活性酸素と発色試薬とを反応させ発色を測定するなどが知られている（特許文献２参照）。
【０００５】
また、気体中の微量の活性酸素を感度よく検出する方法として、色素からなる蛍光プローブを用いる方法が知られている（特許文献３参照）。
【０００６】
しかしながら、これら従来の方法においては、感度を高めようとすると装置などが大がかりになりコストが上昇する、簡便な方法をとろうとすると、感度よく検出することが難しい、定量的に測定することが難しい、といった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２５４３５２号公報
【特許文献２】特開２００１−５０９４６号公報
【特許文献３】特開２００８−１２８９０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、活性酸素種を、簡便に、高感度で検出できる活性酸素測定方法を提供することにあり、特に生体由来の被検体中の活性酸素種を、簡便に、高感度で定量分析できる活性酸素の測定方法、それに用いられ活性酸素検出用素子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の上記課題は、下記の手段により達成できる。
【００１０】
１．蛍光プローブを用いて活性酸素を測定する活性酸素の測定方法であって、該蛍光プローブが半導体ナノ粒子であることを特徴とする活性酸素の測定方法。
【００１１】
２．検体と前記半導体ナノ粒子とを接触させ、接触させた後、該半導体ナノ粒子に励起光の照射を行い、該照射により発生した蛍光の測定を行い、活性酸素を測定することを特徴とする前記１に記載の活性酸素の測定方法。
【００１２】
３．前記照射により発生した蛍光の測定を行い、検体と半導体ナノ粒子とを接触させる前の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルの極大値を示す波長と、検体と前記半導体ナノ粒子とを接触させた後の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルの極大値を示す波長との差を求めることを特徴とする前記２に記載の活性酸素の測定方法。
【００１３】
４．前記活性酸素を測定する活性酸素の測定方法、が活性酸素の濃度を測定する活性酸素の測定方法であることを特徴とする前記１から３のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【００１４】
５．前記半導体ナノ粒子を含有する活性酸素測定用素子を用いることを特徴とする前記１から４のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【００１５】
６．前記半導体ナノ粒子が、Ｓｉを含有する粒子であることを特徴とする前記１から５のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【００１６】
７．前記５または６に記載の活性酸素の測定方法に用いられる活性酸素測定用素子であって、半導体ナノ粒子を含有することを特徴とする活性酸素測定用素子。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の上記手段により、活性酸素種を、簡便に、高感度で検出できる活性酸素測定方法ならびにそれに用いられる活性酸素測定用素子および活性酸素測定用粒子が提供でき、特に生体由来の被検体中の活性酸素種を、簡便に、高感度で定量分析できる活性酸素測定方法ならびにそれに用いられる活性酸素検出用素子が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】活性酸素の測定に用いられる半導体ナノ粒子の発光スペクトルの変化を示す概略図である。
【図２】活性酸素濃度と、活性酸素と反応した蛍光プローブの発光スペクトルのピーク波長の変化量との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、蛍光プローブを用いて活性酸素を測定する活性酸素の測定方法であって、該蛍光プローブが半導体ナノ粒子であることを特徴とする。
【００２０】
蛍光プローブに半導体ナノ粒子を用いることで、簡便で、感度の高い活性酸素の測定方法が得られる。
【００２１】
（測定方法）
蛍光プローブを用いる活性酸素の測定方法は、活性酸素と反応した反応生成物（蛍光プローブ）の蛍光を測定することで活性酸素を検出方法であるが、本発明の測定方法は、蛍光プローブとして下述する半導体ナノ粒子を用いる。
【００２２】
本発明では、蛍光プローブである半導体ナノ粒子と検体中の活性酸素との反応生成物（半導体ナノ粒子）の蛍光を測定することで活性酸素を検出、定量する。
【００２３】
即ち、本発明の活性酸素を測定する活性酸素の測定方法は、活性酸素を検出する方法であり、活性酸素の濃度を測定する方法である。
【００２４】
本発明の測定方法においては、活性酸素を測定するための検体と半導体ナノ粒子とを接触させ、接触させた後、半導体ナノ粒子に励起光の照射を行い、照射により発生した蛍光の測定を行い、活性酸素を検出し定量することができる。
【００２５】
蛍光の測定は、半導体ナノ粒子の励起光による蛍光の発光スペクトルを測定することにより行われ、検体と接触する前と後との発光スペクトルを比較することで活性酸素を検出することができる。
【００２６】
即ち、励起光の照射により発生した蛍光の測定を行い、検体と半導体ナノ粒子とを接触させる前の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルＡの極大値を示す波長と、検体と前記半導体ナノ粒子とを接触させた後の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルＢの極大値を示す波長との差（波長差）を求めることで、活性酸素を検出、定量することができる。
【００２７】
図１は、本発明の活性酸素の測定に用いられる半導体ナノ粒子の発光スペクトルの、検体と接触する前と後との変化を示す概略図である。
【００２８】
半導体ナノ粒子の、検体と接触させる前の発光スペクトルＡの極大値を示す波長ａと、検体と接触させた後の発光スペクトルＢの極大値を示す波長ｂとを比較することで活性酸素の検出することができる。
【００２９】
半導体ナノ粒子の発光スペクトルの極大値を示す波長（蛍光ピーク波長）は、活性酸素と接触することで短波長側に変化する。（波長ａ−波長ｂ）で表される極大値を示す波長差ｃは、活性酸素の量に応じ変化する。
【００３０】
従って、波長ａに対する波長差ｃの割合を求め、この割合と活性酸素濃度との関係を予め測定して、検量線を作成しておくことで、活性酸素濃度の測定が可能となる。
【００３１】
検量線は、好ましくは、検体ごとに求めておくことが好ましい。例えば、血液中の血清の場合には、血清に予め既知の活性酸素種を加えて検量線を作成することで得られる。
【００３２】
本発明においては、検体にもよるが、活性酸素の量、例えば過酸化水素の量が０〜１００μモル／Ｌ範囲において、過酸化水素の量に応じて極大値を示す波長は変化し、特に１０〜１００μモル／Ｌの範囲においてほぼ直線的に比例する。
【００３３】
極大値を示す波長は、概ね約２５ｎｍ変化する。即ち波長差ｃとしては、０から約２５ｎｍまでの範囲で測定が可能である。
【００３４】
本発明の活性酸素の測定方法としては、下述する活性酸素測定用素子に含有される半導体ナノ粒子と、検体とを活性酸素測定用素子中で接触させ、この活性酸素測定用素子を用い蛍光を測定する方法が好ましい態様である。
【００３５】
本発明の活性酸素の測定方法は、半導体ナノ粒子をプローブとして用いるため、タンパク質などの生体物質を用いる測定方法に比べ熱的に安定であり、取り扱いが容易である。
【００３６】
半導体ナノ粒子の発光スペクトルの変化が、活性酸素の量に対応する理由は明確ではないが、以下のように推測される。
【００３７】
半導体ナノ粒子が活性酸素と反応することにより、発光波長に影響する半導体ナノ粒子の有効直径が変化し、この有効直径の変化が定量的に生じているためと推測される。
【００３８】
本発明の活性酸素の測定が対象とする検体としては、血液、尿、汗、唾液、涙液、分泌液などの体液、食品、医療用の薬品などが挙げられるが、検体としては、液体状態のものに特に好適に用いることができる。
【００３９】
（活性酸素）
本発明における活性酸素とは、活性酸素を放出する物質も含む。本発明では、例えば、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルラジカル、ハイドロペルオキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素、一酸化窒素、二酸化窒素、オゾン、過酸化脂質等の活性酸素種に適用できる。
【００４０】
（半導体ナノ粒子）
半導体ナノ粒子とは、平均粒径が１００ｎｍ以下である半導体粒子をいう。
【００４１】
平均粒径は、ＴＥＭを用いて電子顕微鏡写真を撮影し、１００個の粒子について投影面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めて、その算術平均を平均粒径とする。
【００４２】
半導体粒子は、周期表のIV族、II−VI族、およびIII−Ｖ族の元素を含有する半導体化合物である。
【００４３】
II−VI族の半導体の中では、特に、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅおよびＨｇＴｅを挙げることができる。
【００４４】
III−Ｖ族の半導体の中では、ＧａＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂおよびＡｌＳが好ましい。
【００４５】
IV族の半導体の中では、Ｇｅ、ＰｂおよびＳｉは特に適しており、本発明において、特に好ましいのは、Ｓｉである。
【００４６】
本発明においては、半導体ナノ粒子として、コア／シェル構造を有する粒子を用いることが好ましい。この場合、半導体ナノ粒子は半導体粒子からなるコア粒子と当該コア粒子を被覆するシェル層とで構成されるコア／シェル構造を有する半導体ナノ粒子であって、当該コア粒子とシェル層の化学組成が相異するものであることが好ましい。
【００４７】
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＡｌＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、Ｇｅ、Ｓｉ、またはこれらの混合物等が挙げられる。
【００４８】
本発明において、コア／シェル構造を有する粒子として好ましい半導体は、ＳｉまたはＧｅである。なお、Ｇａなどのドープ材料を極微量含んでもよい。
【００４９】
シェルに用いられる材料としては、種々の材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＧａＳ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＡｓ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＡｓ、ＡｌＮ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、またはこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい材料は、ＳｉＯ２、ＺｎＳである。
【００５０】
なお、シェル層は、コア粒子が部分的に露出して部分がなく、コア粒子の全表面を完全に被覆するものが好ましい。
【００５１】
本発明に係る半導体ナノ粒子の平均粒径は１００ｎｍ以下であるが、１ｎｍ以上２０ｎｍ以下が好ましい。より好ましくは２ｎｍ以上１０ｎｍ以下、特に好ましくは２ｎｍ以上８ｎｍ以下である。
【００５２】
〈半導体ナノ粒子の製造方法〉
半導体ナノ粒子の製造については、従来公知の種々の方法を用いることができる。
【００５３】
液相法の製造方法としては、沈殿法、共沈法、ゾル−ゲル法、均一沈殿法、還元法などがある。そのほかに、逆ミセル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子を作製する上で優れた方法である（例えば、特開２００２−３２２４６８号、特開２００５−２３９７７５号、特開平１０−３１０７７０号、特開２０００−１０４０５８号公報等を参照。）。
【００５４】
なお、液相法により、半導体ナノ粒子の集合体を製造する場合においては、半導体前駆体を還元反応により還元する工程を有する製造方法であることが好ましい。
【００５５】
また、当該半導体前駆体の反応を界面活性剤の存在下で行う工程を有する態様が好ましい。なお、半導体前駆体は、上記の半導体材料として用いられる元素を含む化合物であり、たとえば半導体がＳｉの場合、半導体前駆体としてはＳｉＣｌ４などが挙げられる。その他半導体前駆体としては、ＩｎＣｌ３、Ｐ（ＳｉＭｅ３）３、ＺｎＭｅ２、ＣｄＭｅ２、ＧｅＣｌ４、トリブチルホスフィンセレンなどが挙げられる。
【００５６】
気相法の製造方法としては、（１）対向する原料半導体を電極間で発生させた第一の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた第二の高温プラズマ中に通過させる方法（例えば特開平６−２７９０１５号公報参照。）、（２）電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離・除去する方法（例えば特表２００３−５１５４５９号公報参照。）、（３）レーザーアブレーション法（例えば特開２００４−３５６１６３号参照。）、（４）高速スパッタリング法（例えば特開２００４−２９６７８１号参照）などが用いられる。また、原料ガスを低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。
【００５７】
（活性酸素測定用素子）
本発明の活性酸素測定用素子は、半導体ナノ粒子を含有する。
【００５８】
活性酸素測定用素子は半導体ナノ粒子を保持する保持部材を有する。
【００５９】
保持部材としては、半導体ナノ粒子と検体とを接触させた後、半導体ナノ粒子からの蛍光をそのまま測定できるようにするために、励起光、蛍光の吸収の少ない部材が好ましく、例えば石英、ガラス、ポリスチレンなどが好ましく用いられる。
【００６０】
保持部材の形状としては、角柱形状の光学キュベット、チューブ状（Ｕ字形状）、多孔質薄膜シートなどが挙げられる。
【００６１】
例えば、角柱形状の光学キュベットの場合５ｍｍ角〜５０ｍｍ角のものが、チューブ状の場合チューブ径が５ｍｍ〜１０ｍｍ、長さが１０ｍｍ〜５０ｍｍのものが好ましく用いられる。
【００６２】
活性酸素測定用素子の形態としては、これらの保持部材中に半導体ナノ粒子が充填された形態であり、半導体ナノ粒子が薄膜状で充填された形態が好ましい。
【００６３】
充填される形態としては、粒子のみが充填されてもよいが、例えばｍｍオーダーの直径を有するビーズと共に充填される形態が、検体との混合がスムーズであり効率よく検体と半導体ナノ粒子を接触させることから、好ましい形態として用いられる。
【００６４】
ビーズは、検体の成分、半導体ナノ粒子などの吸着防止の面から、ポリエチレングリコール等の高分子で被覆されている状態が好ましい。
【００６５】
半導体ナノ粒子と検体との接触は、上記のような半導体ナノ粒子を保持した保持部材に検体を注入することで行われる。
【００６６】
例えば、例えばマイクロシリンジで注入のスピードを５０μｌ／ｓ程度とすることで、泡立ちを防止して注入することができる。
【００６７】
また、半導体ナノ粒子と検体とを接触させる際には、活性酸素測定用素子を振動することが好ましい。
【００６８】
検体と接触した半導体ナノ粒子は、半導体ナノ粒子の蛍光を測定するために、励起光照射手段を有する装置にセットされ、蛍光スペクトルが測定される。
【００６９】
蛍光スペクトルの測定は、活性酸素測定素子をそのままセットし測定してもよいし、素子から半導体ナノ粒子を分離する処理などの処理がほどこされた後測定してもよいが、そのままセットし測定する方法が好ましい。
【００７０】
（測定装置）
本発明の活性酸素測定用素子を用いて、測定を行うには、半導体ナノ粒子に励起光の照射を行う照射手段、および照射により発生した蛍光の測定を行う蛍光測定手段を具備する活性酸素測定装置により行うことができる。
【００７１】
励起光としては、ハロゲンランプ、キセノンランプ、水銀ランプまたはＬＥＤなど光源からの発光光が好ましく用いられ、活性酸素測定装置は、これらの光源を具備する。
【００７２】
励起光の波長としては、概ね波長域２８０ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲の波長が利用でき、半導体ナノ粒子により選択される。例えば６５０ｎｍの発光光を有する半導体ナノ粒子を用いる場合は、光源として、波長域２８０ｎｍ〜５５０ｎｍの励起光成分を照射可能なものが使用される。このような光源としては、可視光から赤外光までの発光波長特性を有するキセノンランプやハロゲンランプ等の白色光源が好適に用いられる。
【００７３】
蛍光測定部には、例えば、分光器と光電子増倍管等から構成される蛍光分光光度計等が使用できる。測定する蛍光特性としては、蛍光強度が極大を示す波長（蛍光ピーク波長）のシフトを測定する。なお、上記光電子増倍管としては、例えば浜松ホトニクス社製Ｒ９２８Ｆ等が使用できる。また、蛍光分光光度計としては、例えば分光器内蔵の日立ハイテク社製蛍光分光光度計Ｆ−７０００等が使用できる。
【００７４】
本発明においては、上記のような簡単な励起光光源と、蛍光の測定を行う市販の蛍光分光光度計を利用することができ、簡単に活性酸素を測定することができる。
【００７５】
活性酸素測定素子が、光学キュベット状である場合、その側面が励起光に対して正対する向きに配置する。光源と測定キュベットの間には光学レンズが配置してあり測定キュベット部で焦点を結ぶように配置することができる。集光された励起光が半導体ナノ粒子に照射され、半導体ナノ粒子が発光するが、励起光が照射される面と直交する面より発せられる光を検出器にて測定する。
【００７６】
また、励起光由来の高次光が混入する場合があるので、適宜光学フィルターで励起光以外の光が検出器に入らないようにすることが可能である。例えば、３５０ｎｍの励起光を照射し７００ｎｍの蛍光を検出する場合、検出器では蛍光由来の７００ｎｍ以外に励起光由来の７００ｎｍの光も測定される。励起光と検出器の間に４００ｎｍ以下の波長以上の光をカットする光学フィルターを設置すると、これを防ぐことが可能である。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７８】
（半導体ナノ粒子の作製）
シリコン基板およびシリカターゲットを用いて高速スパッタリング法（特開２００４−２９６７８１号公報に記載の方法）にて、シリコン半導体ナノ粒子を作製した。
【００７９】
この粒子は、粒子径８ｎｍ、波長４０５ｎｍの励起光の照射により、赤色の蛍光を示すシリコン半導体ナノ粒子であった。
【００８０】
この半導体ナノ粒子の２μｇをディスポーザブル光学キュベットの底部に充填した。
【００８１】
次に検体として、１００μモル／１Ｌ過酸化水素水を準備し、そのキュベットに検体５００μＬを添加し、キュベットに蓋をした。
【００８２】
シリコン半導体ナノ粒子と過酸化水素水を十分反応させるため、検体およびシリコン半導体ナノ粒子の入ったキュベットを１回転／秒の速度で１分間攪拌機（Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅなど）にて攪拌を行った。
【００８３】
その後キュベットを蛍光分光計（日立ハイテク社、蛍光分光光度計Ｆ−７０００）にセットし、励起光４０５ｎｍを照射し、蛍光スペクトルを測定し、蛍光強度の極大値を示す波長（蛍光ピーク波長）を測定した。
【００８４】
過酸化水素水と接触させる前の蛍光ピーク波長と接触後の蛍光ピーク波長を比較し、その差（波長の変化量）を求めた。
【００８５】
その結果、波長の変化量は、２２．２ｎｍであった。尚、過酸化水素水と接触させる前の蛍光ピーク波長は、７５０ｎｍであった。
【００８６】
また、過酸化水素の濃度Ｄが各々、７５、５０、２５、１０、５μモル／１ｌの検体を準備し、同様の操作により蛍光ピーク波長の変化（波長の変化量）を測定したところ、各々１３．８ｎｍ、８．５ｎｍ、３．２ｎｍ、０．７ｎｍ、０．２ｎｍあった。
【００８７】
図２に、過酸化水素の濃度と、蛍光ピーク波長の差（波長の変化量）との関係を示す。図２は、縦軸に過酸化水素の濃度、横軸に活性酸素と反応した蛍光プローブの発光スペクトルのピーク波長の変化量即ち、ピーク波長の、測定試料と接触させる前と後との差を示す。
【００８８】
図２から、過酸化水素の濃度と、波長の変化量とは、１次相関関係を示すことが分かり、定量分析が可能であることが分かる。
【００８９】
また、上記特許文献１の特開２００７−２５４３５２号公報で示されているような化学発光物質を用いる方法では、検体と接触させ発光すると同時にこの発光を検出する必要があり、複雑な装置構成となるが、本発明では測定する時期の制限はなく、上記のように簡便に測定を行うことができる。
【００９０】
また、上記特許文献３の特開２００８−１２８９０５号公報に記載の方法の測定装置は全反射光などの極めて特殊な測定装置を必要とするのに対して、本発明では上記のように汎用的に用いられる蛍光分光光度計で測定可能であり、簡便に活性酸素を測定することができた。
【符号の説明】
【００９１】
Ａ 検体と接触させる前の発光スペクトル
Ｂ 検体と接触させた後の発光スペクトル
ａ 発光スペクトルＡの極大値を示す波長
ｂ 発光スペクトルＢの極大値を示す波長
ｃ 波長差
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素種を検出するための活性酸素測定方法に関し、さらに詳しくは、ヒトなどの好気性生物の血液、尿、汗、唾液、涙液、分泌液などの体液、飲料水などの食品、および医療用の薬品などに含まれる活性酸素種を、簡便に、高感度で検出するための活性酸素測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療の分野においては、各種生体物質中の活性酸素種の存在の情報が、生体物質の状態を把握する上での重要な情報の一つとして認識されている。
【０００３】
活性酸素種は、その反応性が比較的高いために、直接検出することは難しく、下記のように活性酸素種と反応する化合物などと反応させ反応生成物を測定する方法が一般的に用いられている。
【０００４】
例えば、活性酸素の検出方法としては、活性酸素と発光試薬と反応させ発光を測定する方法（特許文献１参照）、活性酸素と発色試薬とを反応させ発色を測定するなどが知られている（特許文献２参照）。
【０００５】
また、気体中の微量の活性酸素を感度よく検出する方法として、色素からなる蛍光プローブを用いる方法が知られている（特許文献３参照）。
【０００６】
しかしながら、これら従来の方法においては、感度を高めようとすると装置などが大がかりになりコストが上昇する、簡便な方法をとろうとすると、感度よく検出することが難しい、定量的に測定することが難しい、といった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２５４３５２号公報
【特許文献２】特開２００１−５０９４６号公報
【特許文献３】特開２００８−１２８９０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、活性酸素種を、簡便に、高感度で検出できる活性酸素測定方法を提供することにあり、特に生体由来の被検体中の活性酸素種を、簡便に、高感度で定量分析できる活性酸素の測定方法、それに用いられ活性酸素検出用素子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の上記課題は、下記の手段により達成できる。
【００１０】
１．蛍光プローブを用いて活性酸素を測定する活性酸素の測定方法であって、該蛍光プローブが半導体ナノ粒子であることを特徴とする活性酸素の測定方法。
【００１１】
２．検体と前記半導体ナノ粒子とを接触させ、接触させた後、該半導体ナノ粒子に励起光の照射を行い、該照射により発生した蛍光の測定を行い、活性酸素を測定することを特徴とする前記１に記載の活性酸素の測定方法。
【００１２】
３．前記照射により発生した蛍光の測定を行い、検体と半導体ナノ粒子とを接触させる前の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルの極大値を示す波長と、検体と前記半導体ナノ粒子とを接触させた後の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルの極大値を示す波長との差を求めることを特徴とする前記２に記載の活性酸素の測定方法。
【００１３】
４．前記活性酸素を測定する活性酸素の測定方法、が活性酸素の濃度を測定する活性酸素の測定方法であることを特徴とする前記１から３のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【００１４】
５．前記半導体ナノ粒子を含有する活性酸素測定用素子を用いることを特徴とする前記１から４のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【００１５】
６．前記半導体ナノ粒子が、Ｓｉを含有する粒子であることを特徴とする前記１から５のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【００１６】
７．前記５または６に記載の活性酸素の測定方法に用いられる活性酸素測定用素子であって、半導体ナノ粒子を含有することを特徴とする活性酸素測定用素子。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の上記手段により、活性酸素種を、簡便に、高感度で検出できる活性酸素測定方法ならびにそれに用いられる活性酸素測定用素子および活性酸素測定用粒子が提供でき、特に生体由来の被検体中の活性酸素種を、簡便に、高感度で定量分析できる活性酸素測定方法ならびにそれに用いられる活性酸素検出用素子が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】活性酸素の測定に用いられる半導体ナノ粒子の発光スペクトルの変化を示す概略図である。
【図２】活性酸素濃度と、活性酸素と反応した蛍光プローブの発光スペクトルのピーク波長の変化量との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、蛍光プローブを用いて活性酸素を測定する活性酸素の測定方法であって、該蛍光プローブが半導体ナノ粒子であることを特徴とする。
【００２０】
蛍光プローブに半導体ナノ粒子を用いることで、簡便で、感度の高い活性酸素の測定方法が得られる。
【００２１】
（測定方法）
蛍光プローブを用いる活性酸素の測定方法は、活性酸素と反応した反応生成物（蛍光プローブ）の蛍光を測定することで活性酸素を検出方法であるが、本発明の測定方法は、蛍光プローブとして下述する半導体ナノ粒子を用いる。
【００２２】
本発明では、蛍光プローブである半導体ナノ粒子と検体中の活性酸素との反応生成物（半導体ナノ粒子）の蛍光を測定することで活性酸素を検出、定量する。
【００２３】
即ち、本発明の活性酸素を測定する活性酸素の測定方法は、活性酸素を検出する方法であり、活性酸素の濃度を測定する方法である。
【００２４】
本発明の測定方法においては、活性酸素を測定するための検体と半導体ナノ粒子とを接触させ、接触させた後、半導体ナノ粒子に励起光の照射を行い、照射により発生した蛍光の測定を行い、活性酸素を検出し定量することができる。
【００２５】
蛍光の測定は、半導体ナノ粒子の励起光による蛍光の発光スペクトルを測定することにより行われ、検体と接触する前と後との発光スペクトルを比較することで活性酸素を検出することができる。
【００２６】
即ち、励起光の照射により発生した蛍光の測定を行い、検体と半導体ナノ粒子とを接触させる前の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルＡの極大値を示す波長と、検体と前記半導体ナノ粒子とを接触させた後の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルＢの極大値を示す波長との差（波長差）を求めることで、活性酸素を検出、定量することができる。
【００２７】
図１は、本発明の活性酸素の測定に用いられる半導体ナノ粒子の発光スペクトルの、検体と接触する前と後との変化を示す概略図である。
【００２８】
半導体ナノ粒子の、検体と接触させる前の発光スペクトルＡの極大値を示す波長ａと、検体と接触させた後の発光スペクトルＢの極大値を示す波長ｂとを比較することで活性酸素の検出することができる。
【００２９】
半導体ナノ粒子の発光スペクトルの極大値を示す波長（蛍光ピーク波長）は、活性酸素と接触することで短波長側に変化する。（波長ａ−波長ｂ）で表される極大値を示す波長差ｃは、活性酸素の量に応じ変化する。
【００３０】
従って、波長ａに対する波長差ｃの割合を求め、この割合と活性酸素濃度との関係を予め測定して、検量線を作成しておくことで、活性酸素濃度の測定が可能となる。
【００３１】
検量線は、好ましくは、検体ごとに求めておくことが好ましい。例えば、血液中の血清の場合には、血清に予め既知の活性酸素種を加えて検量線を作成することで得られる。
【００３２】
本発明においては、検体にもよるが、活性酸素の量、例えば過酸化水素の量が０〜１００μモル／Ｌ範囲において、過酸化水素の量に応じて極大値を示す波長は変化し、特に１０〜１００μモル／Ｌの範囲においてほぼ直線的に比例する。
【００３３】
極大値を示す波長は、概ね約２５ｎｍ変化する。即ち波長差ｃとしては、０から約２５ｎｍまでの範囲で測定が可能である。
【００３４】
本発明の活性酸素の測定方法としては、下述する活性酸素測定用素子に含有される半導体ナノ粒子と、検体とを活性酸素測定用素子中で接触させ、この活性酸素測定用素子を用い蛍光を測定する方法が好ましい態様である。
【００３５】
本発明の活性酸素の測定方法は、半導体ナノ粒子をプローブとして用いるため、タンパク質などの生体物質を用いる測定方法に比べ熱的に安定であり、取り扱いが容易である。
【００３６】
半導体ナノ粒子の発光スペクトルの変化が、活性酸素の量に対応する理由は明確ではないが、以下のように推測される。
【００３７】
半導体ナノ粒子が活性酸素と反応することにより、発光波長に影響する半導体ナノ粒子の有効直径が変化し、この有効直径の変化が定量的に生じているためと推測される。
【００３８】
本発明の活性酸素の測定が対象とする検体としては、血液、尿、汗、唾液、涙液、分泌液などの体液、食品、医療用の薬品などが挙げられるが、検体としては、液体状態のものに特に好適に用いることができる。
【００３９】
（活性酸素）
本発明における活性酸素とは、活性酸素を放出する物質も含む。本発明では、例えば、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルラジカル、ハイドロペルオキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素、一酸化窒素、二酸化窒素、オゾン、過酸化脂質等の活性酸素種に適用できる。
【００４０】
（半導体ナノ粒子）
半導体ナノ粒子とは、平均粒径が１００ｎｍ以下である半導体粒子をいう。
【００４１】
平均粒径は、ＴＥＭを用いて電子顕微鏡写真を撮影し、１００個の粒子について投影面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めて、その算術平均を平均粒径とする。
【００４２】
半導体粒子は、周期表のIV族、II−VI族、およびIII−Ｖ族の元素を含有する半導体化合物である。
【００４３】
II−VI族の半導体の中では、特に、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅおよびＨｇＴｅを挙げることができる。
【００４４】
III−Ｖ族の半導体の中では、ＧａＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂおよびＡｌＳが好ましい。
【００４５】
IV族の半導体の中では、Ｇｅ、ＰｂおよびＳｉは特に適しており、本発明において、特に好ましいのは、Ｓｉである。
【００４６】
本発明においては、半導体ナノ粒子として、コア／シェル構造を有する粒子を用いることが好ましい。この場合、半導体ナノ粒子は半導体粒子からなるコア粒子と当該コア粒子を被覆するシェル層とで構成されるコア／シェル構造を有する半導体ナノ粒子であって、当該コア粒子とシェル層の化学組成が相異するものであることが好ましい。
【００４７】
コア粒子に用いられる半導体材料としては、種々の半導体材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＡｓ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＡｌＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、Ｇｅ、Ｓｉ、またはこれらの混合物等が挙げられる。
【００４８】
本発明において、コア／シェル構造を有する粒子として好ましい半導体は、ＳｉまたはＧｅである。なお、Ｇａなどのドープ材料を極微量含んでもよい。
【００４９】
シェルに用いられる材料としては、種々の材料を用いることができる。具体例としては、例えば、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＧａＳ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＡｓ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＡｓ、ＡｌＮ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、またはこれらの混合物等が挙げられる。本発明において、特に好ましい材料は、ＳｉＯ２、ＺｎＳである。
【００５０】
なお、シェル層は、コア粒子が部分的に露出して部分がなく、コア粒子の全表面を完全に被覆するものが好ましい。
【００５１】
本発明に係る半導体ナノ粒子の平均粒径は１００ｎｍ以下であるが、１ｎｍ以上２０ｎｍ以下が好ましい。より好ましくは２ｎｍ以上１０ｎｍ以下、特に好ましくは２ｎｍ以上８ｎｍ以下である。
【００５２】
〈半導体ナノ粒子の製造方法〉
半導体ナノ粒子の製造については、従来公知の種々の方法を用いることができる。
【００５３】
液相法の製造方法としては、沈殿法、共沈法、ゾル−ゲル法、均一沈殿法、還元法などがある。そのほかに、逆ミセル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子を作製する上で優れた方法である（例えば、特開２００２−３２２４６８号、特開２００５−２３９７７５号、特開平１０−３１０７７０号、特開２０００−１０４０５８号公報等を参照。）。
【００５４】
なお、液相法により、半導体ナノ粒子の集合体を製造する場合においては、半導体前駆体を還元反応により還元する工程を有する製造方法であることが好ましい。
【００５５】
また、当該半導体前駆体の反応を界面活性剤の存在下で行う工程を有する態様が好ましい。なお、半導体前駆体は、上記の半導体材料として用いられる元素を含む化合物であり、たとえば半導体がＳｉの場合、半導体前駆体としてはＳｉＣｌ４などが挙げられる。その他半導体前駆体としては、ＩｎＣｌ３、Ｐ（ＳｉＭｅ３）３、ＺｎＭｅ２、ＣｄＭｅ２、ＧｅＣｌ４、トリブチルホスフィンセレンなどが挙げられる。
【００５６】
気相法の製造方法としては、（１）対向する原料半導体を電極間で発生させた第一の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた第二の高温プラズマ中に通過させる方法（例えば特開平６−２７９０１５号公報参照。）、（２）電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離・除去する方法（例えば特表２００３−５１５４５９号公報参照。）、（３）レーザーアブレーション法（例えば特開２００４−３５６１６３号参照。）、（４）高速スパッタリング法（例えば特開２００４−２９６７８１号参照）などが用いられる。また、原料ガスを低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。
【００５７】
（活性酸素測定用素子）
本発明の活性酸素測定用素子は、半導体ナノ粒子を含有する。
【００５８】
活性酸素測定用素子は半導体ナノ粒子を保持する保持部材を有する。
【００５９】
保持部材としては、半導体ナノ粒子と検体とを接触させた後、半導体ナノ粒子からの蛍光をそのまま測定できるようにするために、励起光、蛍光の吸収の少ない部材が好ましく、例えば石英、ガラス、ポリスチレンなどが好ましく用いられる。
【００６０】
保持部材の形状としては、角柱形状の光学キュベット、チューブ状（Ｕ字形状）、多孔質薄膜シートなどが挙げられる。
【００６１】
例えば、角柱形状の光学キュベットの場合５ｍｍ角〜５０ｍｍ角のものが、チューブ状の場合チューブ径が５ｍｍ〜１０ｍｍ、長さが１０ｍｍ〜５０ｍｍのものが好ましく用いられる。
【００６２】
活性酸素測定用素子の形態としては、これらの保持部材中に半導体ナノ粒子が充填された形態であり、半導体ナノ粒子が薄膜状で充填された形態が好ましい。
【００６３】
充填される形態としては、粒子のみが充填されてもよいが、例えばｍｍオーダーの直径を有するビーズと共に充填される形態が、検体との混合がスムーズであり効率よく検体と半導体ナノ粒子を接触させることから、好ましい形態として用いられる。
【００６４】
ビーズは、検体の成分、半導体ナノ粒子などの吸着防止の面から、ポリエチレングリコール等の高分子で被覆されている状態が好ましい。
【００６５】
半導体ナノ粒子と検体との接触は、上記のような半導体ナノ粒子を保持した保持部材に検体を注入することで行われる。
【００６６】
例えば、例えばマイクロシリンジで注入のスピードを５０μｌ／ｓ程度とすることで、泡立ちを防止して注入することができる。
【００６７】
また、半導体ナノ粒子と検体とを接触させる際には、活性酸素測定用素子を振動することが好ましい。
【００６８】
検体と接触した半導体ナノ粒子は、半導体ナノ粒子の蛍光を測定するために、励起光照射手段を有する装置にセットされ、蛍光スペクトルが測定される。
【００６９】
蛍光スペクトルの測定は、活性酸素測定素子をそのままセットし測定してもよいし、素子から半導体ナノ粒子を分離する処理などの処理がほどこされた後測定してもよいが、そのままセットし測定する方法が好ましい。
【００７０】
（測定装置）
本発明の活性酸素測定用素子を用いて、測定を行うには、半導体ナノ粒子に励起光の照射を行う照射手段、および照射により発生した蛍光の測定を行う蛍光測定手段を具備する活性酸素測定装置により行うことができる。
【００７１】
励起光としては、ハロゲンランプ、キセノンランプ、水銀ランプまたはＬＥＤなど光源からの発光光が好ましく用いられ、活性酸素測定装置は、これらの光源を具備する。
【００７２】
励起光の波長としては、概ね波長域２８０ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲の波長が利用でき、半導体ナノ粒子により選択される。例えば６５０ｎｍの発光光を有する半導体ナノ粒子を用いる場合は、光源として、波長域２８０ｎｍ〜５５０ｎｍの励起光成分を照射可能なものが使用される。このような光源としては、可視光から赤外光までの発光波長特性を有するキセノンランプやハロゲンランプ等の白色光源が好適に用いられる。
【００７３】
蛍光測定部には、例えば、分光器と光電子増倍管等から構成される蛍光分光光度計等が使用できる。測定する蛍光特性としては、蛍光強度が極大を示す波長（蛍光ピーク波長）のシフトを測定する。なお、上記光電子増倍管としては、例えば浜松ホトニクス社製Ｒ９２８Ｆ等が使用できる。また、蛍光分光光度計としては、例えば分光器内蔵の日立ハイテク社製蛍光分光光度計Ｆ−７０００等が使用できる。
【００７４】
本発明においては、上記のような簡単な励起光光源と、蛍光の測定を行う市販の蛍光分光光度計を利用することができ、簡単に活性酸素を測定することができる。
【００７５】
活性酸素測定素子が、光学キュベット状である場合、その側面が励起光に対して正対する向きに配置する。光源と測定キュベットの間には光学レンズが配置してあり測定キュベット部で焦点を結ぶように配置することができる。集光された励起光が半導体ナノ粒子に照射され、半導体ナノ粒子が発光するが、励起光が照射される面と直交する面より発せられる光を検出器にて測定する。
【００７６】
また、励起光由来の高次光が混入する場合があるので、適宜光学フィルターで励起光以外の光が検出器に入らないようにすることが可能である。例えば、３５０ｎｍの励起光を照射し７００ｎｍの蛍光を検出する場合、検出器では蛍光由来の７００ｎｍ以外に励起光由来の７００ｎｍの光も測定される。励起光と検出器の間に４００ｎｍ以下の波長以上の光をカットする光学フィルターを設置すると、これを防ぐことが可能である。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７８】
（半導体ナノ粒子の作製）
シリコン基板およびシリカターゲットを用いて高速スパッタリング法（特開２００４−２９６７８１号公報に記載の方法）にて、シリコン半導体ナノ粒子を作製した。
【００７９】
この粒子は、粒子径８ｎｍ、波長４０５ｎｍの励起光の照射により、赤色の蛍光を示すシリコン半導体ナノ粒子であった。
【００８０】
この半導体ナノ粒子の２μｇをディスポーザブル光学キュベットの底部に充填した。
【００８１】
次に検体として、１００μモル／１Ｌ過酸化水素水を準備し、そのキュベットに検体５００μＬを添加し、キュベットに蓋をした。
【００８２】
シリコン半導体ナノ粒子と過酸化水素水を十分反応させるため、検体およびシリコン半導体ナノ粒子の入ったキュベットを１回転／秒の速度で１分間攪拌機（Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅなど）にて攪拌を行った。
【００８３】
その後キュベットを蛍光分光計（日立ハイテク社、蛍光分光光度計Ｆ−７０００）にセットし、励起光４０５ｎｍを照射し、蛍光スペクトルを測定し、蛍光強度の極大値を示す波長（蛍光ピーク波長）を測定した。
【００８４】
過酸化水素水と接触させる前の蛍光ピーク波長と接触後の蛍光ピーク波長を比較し、その差（波長の変化量）を求めた。
【００８５】
その結果、波長の変化量は、２２．２ｎｍであった。尚、過酸化水素水と接触させる前の蛍光ピーク波長は、７５０ｎｍであった。
【００８６】
また、過酸化水素の濃度Ｄが各々、７５、５０、２５、１０、５μモル／１ｌの検体を準備し、同様の操作により蛍光ピーク波長の変化（波長の変化量）を測定したところ、各々１３．８ｎｍ、８．５ｎｍ、３．２ｎｍ、０．７ｎｍ、０．２ｎｍあった。
【００８７】
図２に、過酸化水素の濃度と、蛍光ピーク波長の差（波長の変化量）との関係を示す。図２は、縦軸に過酸化水素の濃度、横軸に活性酸素と反応した蛍光プローブの発光スペクトルのピーク波長の変化量即ち、ピーク波長の、測定試料と接触させる前と後との差を示す。
【００８８】
図２から、過酸化水素の濃度と、波長の変化量とは、１次相関関係を示すことが分かり、定量分析が可能であることが分かる。
【００８９】
また、上記特許文献１の特開２００７−２５４３５２号公報で示されているような化学発光物質を用いる方法では、検体と接触させ発光すると同時にこの発光を検出する必要があり、複雑な装置構成となるが、本発明では測定する時期の制限はなく、上記のように簡便に測定を行うことができる。
【００９０】
また、上記特許文献３の特開２００８−１２８９０５号公報に記載の方法の測定装置は全反射光などの極めて特殊な測定装置を必要とするのに対して、本発明では上記のように汎用的に用いられる蛍光分光光度計で測定可能であり、簡便に活性酸素を測定することができた。
【符号の説明】
【００９１】
Ａ 検体と接触させる前の発光スペクトル
Ｂ 検体と接触させた後の発光スペクトル
ａ 発光スペクトルＡの極大値を示す波長
ｂ 発光スペクトルＢの極大値を示す波長
ｃ 波長差
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光プローブを用いて活性酸素を測定する活性酸素の測定方法であって、該蛍光プローブが半導体ナノ粒子であることを特徴とする活性酸素の測定方法。
【請求項２】
検体と前記半導体ナノ粒子とを接触させ、接触させた後、該半導体ナノ粒子に励起光の照射を行い、該照射により発生した蛍光の測定を行い、活性酸素を測定することを特徴とする請求項１に記載の活性酸素の測定方法。
【請求項３】
前記照射により発生した蛍光の測定を行い、検体と半導体ナノ粒子とを接触させる前の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルの極大値を示す波長と、検体と前記半導体ナノ粒子とを接触させた後の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルの極大値を示す波長との差を求めることを特徴とする請求項２に記載の活性酸素の測定方法。
【請求項４】
前記活性酸素を測定する活性酸素の測定方法、が活性酸素の濃度を測定する活性酸素の測定方法であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【請求項５】
前記半導体ナノ粒子を含有する活性酸素測定用素子を用いることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【請求項６】
前記半導体ナノ粒子が、Ｓｉを含有する粒子であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載の活性酸素の測定方法に用いられる活性酸素測定用素子であって、半導体ナノ粒子を含有することを特徴とする活性酸素測定用素子。
【請求項１】
蛍光プローブを用いて活性酸素を測定する活性酸素の測定方法であって、該蛍光プローブが半導体ナノ粒子であることを特徴とする活性酸素の測定方法。
【請求項２】
検体と前記半導体ナノ粒子とを接触させ、接触させた後、該半導体ナノ粒子に励起光の照射を行い、該照射により発生した蛍光の測定を行い、活性酸素を測定することを特徴とする請求項１に記載の活性酸素の測定方法。
【請求項３】
前記照射により発生した蛍光の測定を行い、検体と半導体ナノ粒子とを接触させる前の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルの極大値を示す波長と、検体と前記半導体ナノ粒子とを接触させた後の半導体ナノ粒子の蛍光の発光スペクトルの極大値を示す波長との差を求めることを特徴とする請求項２に記載の活性酸素の測定方法。
【請求項４】
前記活性酸素を測定する活性酸素の測定方法、が活性酸素の濃度を測定する活性酸素の測定方法であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【請求項５】
前記半導体ナノ粒子を含有する活性酸素測定用素子を用いることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【請求項６】
前記半導体ナノ粒子が、Ｓｉを含有する粒子であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の活性酸素の測定方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載の活性酸素の測定方法に用いられる活性酸素測定用素子であって、半導体ナノ粒子を含有することを特徴とする活性酸素測定用素子。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−７５４７９（Ｐ２０１１−７５４７９Ａ）
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２９３２９（Ｐ２００９−２２９３２９）
【出願日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（３０３０００４２０）コニカミノルタエムジー株式会社 (2,950)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（３０３０００４２０）コニカミノルタエムジー株式会社 (2,950)
【Ｆターム（参考）】
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