海水性二枚貝検出用プライマーセットとこれを利用した海水性二枚貝幼生の検出・定量方法
【課題】海水性二枚貝であるムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイの幼生を簡易に検出すると共にその個体数を定量する方法の提供。
【解決手段】被験試料に対し、特定な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む（１）ムラサキイガイ検出用プライマー対、（２）ミドリイガイ検出用プライマー対（３）キタノムラサキイガイ検出用プライマー対のうち一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより海水性二枚貝幼生の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の被験試料中の個体数を定量する方法。
【解決手段】被験試料に対し、特定な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む（１）ムラサキイガイ検出用プライマー対、（２）ミドリイガイ検出用プライマー対（３）キタノムラサキイガイ検出用プライマー対のうち一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより海水性二枚貝幼生の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の被験試料中の個体数を定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海水性二枚貝検出用プライマーセットとこれを利用した海水性二枚貝幼生の検出・定量方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、複数種のプランクトンが多数存在する海水域から採集した被験試料のムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の有無を検出し、その個体数の定量を行うのに好適な海水性二枚貝検出用プライマーセットとこれを利用した海水性二枚貝幼生の検出・定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
海水性二枚貝であるムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイは、火力・原子力発電所等の冷却水路系に付着する付着生物として知られている（非特許文献１）。火力・原子力発電所等の冷却水路系に付着生物が付着すると、冷却水の流量が流動抵抗の増大により低下し、復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内に付着生物が付着したり、剥がれた付着生物が詰まったりすることによって、管壁の腐食や細管の閉塞が生じる。そこで、各発電所では、付着生物を機械的に除去したり、付着生物の付着そのものを抑制したりするための様々な防除対策が実施されている。また、ムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイの付着による被害は火力・原子力発電所等の冷却水路系のみに留まらず、常時海水と接触している船舶の船底や各種設備等にも及んでいる。
【０００３】
ここで、ムラサキイガイやミドリイガイ、キタノムラサキイガイは、水路等の基体に付着してしまうと、完全に除去することが困難である。また、除去する際に発生する死骸等によって水質の悪化が生じ、周囲の環境に対する悪影響が懸念される。したがって、ムラサキイガイやミドリイガイ、キタノムラサキイガイの駆除は、水路等の基体に付着する前の浮遊幼生の段階で、大量に発生する時期を見計らって行うことが望ましいと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】発電所を困らせる水の生き物たち（２００８年３月、財団法人電力中央研究所）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
海水域には、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生以外にも多種多様なプランクトンが存在している。したがって、海水域で採集した被験試料からムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の発生量を調査する際には、多種多様なプランクトンの中からムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生のみを選択的に検出・定量する必要がある。しかしながら、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生と海水中の多種多様なプランクトンとの形態分類学上の差異のみを頼りにムラサキイガイ幼生やミドリイガイ幼生、ムラサキイガイ幼生の検出・定量を行うことは、熟練した研究者でも極めて困難なものである。そこで、誰もがムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生を簡易に検出・定量することのできる方法の確立が望まれている。
【０００６】
本発明は、かかる要望に鑑みてなされたものであって、海水性二枚貝であるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生を簡易に検出する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、海水性二枚貝であるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生を簡易に検出すると共にその個体数を定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は、遺伝子解析技術からのアプローチによりムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイを分子レベルで種々検討した。その結果、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の塩基配列情報に基づき、ムラサキイガイのみを分子レベルで特異的に認識するオリゴヌクレオチドプライマー対を開発することに成功した。また、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の塩基配列情報に基づき、ミドリイガイのみを分子レベルで特異的に認識するオリゴヌクレオチドプライマー対を開発することに成功した。さらに、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の塩基配列情報に基づき、キタノムラサキイガイのみを分子レベルで特異的に認識するオリゴヌクレオチドプライマー対を開発することに成功した。本願発明者等は、さらに検討を進め、これらのプライマー対を用いることで、海水性二枚貝の中でも代表的な付着生物であるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の検出・定量を行えることを知見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明の海水性二枚貝検出用のプライマーセットは、下記（１）〜（３）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むものである。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【００１０】
（１）のプライマー対は、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、近縁種の二枚貝であるキタノムラサキイガイ、カワヒバリガイ、コウロエンカワヒバリガイ、ミドリイガイ、ホトトギスガイ、クジャクガイ、クログチ、ヒバリガイモドキ、ムラサキインコガイ、アサリ、タイワンシジミ、ヤマトシジミ、カキ、さらには海水域に一般的に存在しているプランクトンを認識することがない。したがって、（１）のプライマー対によれば、ムラサキイガイの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１１】
（２）のプライマー対は、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、近縁種の二枚貝であるムラサキイガイ、キタノムラサキイガイ、カワヒバリガイ、コウロエンカワヒバリガイ、ホトトギスガイ、クジャクガイ、クログチ、ヒバリガイモドキ、ムラサキインコガイ、アサリ、タイワンシジミ、ヤマトシジミ、カキ、さらには海水域に一般的に存在しているプランクトンを認識することがない。したがって、（２）のプライマー対によれば、ミドリイガイの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１２】
（３）のプライマー対は、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、近縁種の二枚貝であるムラサキイガイ、カワヒバリガイ、コウロエンカワヒバリガイ、ミドリイガイ、ホトトギスガイ、クジャクガイ、クログチ、ヒバリガイモドキ、ムラサキインコガイ、アサリ、タイワンシジミ、ヤマトシジミ、カキ、さらには海水域に一般的に存在しているプランクトンを認識することがない。したがって、（３）のプライマー対によれば、キタノムラサキイガイの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１３】
また、本発明の海水性二枚貝幼生の検出方法は、下記（１）〜（３）のうち一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅の有無によりプライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生が被験試料に存在しているか否かを検出するようにしている。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【００１４】
被験試料にムラサキイガイ幼生が存在している場合には、上記（１）のプライマー対がムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識し、ＰＣＲによりムラサキイガイ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にムラサキイガイ幼生が含まれていない場合には、上記（１）のプライマー対によって認識される遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、上記（１）のプライマー対を用いて遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料にムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。
【００１５】
被験試料にミドリイガイ幼生が存在している場合には、上記（２）のプライマー対がミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識し、ＰＣＲによりミドリイガイ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にミドリイガイ幼生が含まれていない場合には、上記（２）のプライマー対によって認識される遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、上記（２）のプライマー対を用いて遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料にミドリイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。
【００１６】
被験試料にキタノムラサキイガイ幼生が存在している場合には、上記（３）のプライマー対がキタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識し、ＰＣＲによりキタノムラサキイガイ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にキタノムラサキイガイ幼生が含まれていない場合には、上記（３）のプライマー対によって認識される遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、上記（３）のプライマー対を用いて遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料にキタノムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。
【００１７】
さらに、本発明の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、下記（１）〜（３）のうち一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより海水性二枚貝幼生の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の被験試料中の個体数を定量するようにしている。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【００１８】
ここで、本発明の海水性二枚貝個体数の定量方法においては、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲとすることが好ましく、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値を利用することが好ましい。
【００１９】
また、本発明の海水性二枚貝個体数の定量方法においては、被験試料は分画処理してからＰＣＲに供することが好ましい。
【００２０】
本発明の海水性二枚貝検出キットは、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むものとしている。したがって、このプローブがムラサキイガイ、ミドリイガイまたはキタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生またはキタノムラサキイガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。
【発明の効果】
【００２１】
請求項１に記載の海水性二枚貝検出用プライマーセットによれば、配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ検出用プライマー対によって、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができるので、このプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。また、配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ検出用プライマー対によって、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができるので、このプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。さらに、配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ検出用プライマー対によって、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができるので、このプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。
【００２２】
請求項２に記載の海水性二枚貝幼生の検出方法によれば、被験試料にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生以外のプランクトンが複数種混在している場合であっても、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生をそれぞれ特異的に検出することができる。
【００２３】
請求項３に記載の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法によれば、被験試料にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生以外のプランクトンが複数種混在している場合であっても、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生をそれぞれ特異的に検出し、その個体数を定量することができる。
【００２４】
請求項４に記載の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法によれば、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲにより得られるＣｔ値を利用しており、しかも、配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ検出用プライマー対により増幅されるＤＮＡ断片長と配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ検出用プライマー対より増幅されるＤＮＡ断片長と配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ検出用プライマー対により増幅されるＤＮＡ断片長は、リアルタイムＰＣＲを行うのに好適な長さとなることから、幼生個体数の定量分析をより精度良く行うことができる。
【００２５】
請求項５に記載の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法によれば、被験試料が予め分画処理されてからＰＣＲに供されるので、幼生の成長段階（幼生の体積）に応じて被験試料を分画して定量することが可能となる。したがって幼生個体数の定量精度をさらに高めることができる。
【００２６】
請求項６記載の海水性二枚貝検出用キットによれば、配列番号１〜６記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一つのプライマーをプローブとして含んでいるので、プローブとして含まれるプライマーによって認識される遺伝子を有する海水性二枚貝について、そのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができ、被験試料にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図１Ｂ】配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図であり、図１Ａとは対象とする生物を異にしたものである。
【図２Ａ】配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図２Ｂ】配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図であり、図２Ａとは対象とする生物を異にしたものである。
【図３】反応液中のムラサキイガイの鋳型ＤＮＡ濃度を０．０２〜２ｎｇ／μＬとしたときの配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図４】反応液中のミドリイガイの鋳型ＤＮＡ濃度を０．０２〜２ｎｇ／μＬとしたときの配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図５】リアルタイムＰＣＲにより作成されたムラサキイガイ幼生用の検量線である。
【図６】リアルタイムＰＣＲにより作成されたミドリイガイ幼生用の検量線である。
【図７】ＤＮＡチップの実施の一例を示す図である。
【図８Ａ】配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図８Ｂ】配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図であり、図８Ａとは対象とする生物を異にしたものである。
【図９】反応液中のキタノムラサキイガイの鋳型ＤＮＡ濃度を０．２〜２０ｎｇ／μＬとしたときの配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図１０】リアルタイムＰＣＲにより作成されたキタノムラサキイガイ幼生用の検量線である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２９】
本発明の海水性二枚貝検出用プライマーセットは、配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ検出用プライマー対、配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ検出用プライマー対及び配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ検出用プライマー対の少なくともいずれかを含むものである。
【００３０】
本発明のプライマーセットのムラサキイガイ検出用プライマー対により、配列番号７に示すムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子解析領域（ＬＣＯ１４９０〜ＨＣＯ２１９８）のうち、３５８番目〜４５５番目に含まれる９８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。また、本発明のプライマーセットのミドリイガイ検出用プライマー対により、配列番号８に示すミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子解析領域（ＬＣＯ１４９０〜ＨＣＯ２１９８）のうち、３０７番目〜４５５番目に含まれる１４９ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。さらに、本発明のプライマーセットのキタノムラサキイガイ検出用プライマー対により、配列番号１３に示すキタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子解析領域（ＬＣＯ１４９０〜ＨＣＯ２１９８）のうち、２８６番目〜４４０番目に含まれる１５５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３１】
ここで、プライマーの塩基配列は、配列番号１〜６で示される塩基配列のものに限定されない。例えば、プライマーの一端または両端が延長あるいは短縮されたプライマーであって、ムラサキイガイのＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列、ミドリイガイのＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列と相補的な配列またはキタノムラサキイガイのＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列と相補的な配列を有して特異的に認識するプライマーも包含される。但し、プライマー長は、１８〜４０塩基とすることが好適である。プライマー長を４０塩基超とすると、非特異的なアニーリングが起こりやすくなって、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。また、短すぎても、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。
【００３２】
本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成することができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いて合成してもよい。
【００３３】
次に、本発明の海水性二枚貝幼生の検出方法について説明する。本発明の海水性二枚貝幼生の検出方法は、被験試料に対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより被験試料に海水性二枚貝幼生であるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生、キタノムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定するようにしている。
【００３４】
被験試料としては、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生またはキタノムラサキイガイ幼生を１個体以上含有する可能性のあるあらゆる種類の試料が包含される。例えば、複数種のプランクトンを多数含む海水域から採集された環境サンプルは勿論のこと、人工飼育水槽の飼育水等も被験試料とすることができるが、被験試料はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
被験試料からは塩分が含まれる海水や飼育水等をできるだけ除き、被験試料中のプランクトンをエタノールに浸漬して固定することが好ましい。この処理により、被験試料中のプランクトンに含まれる酵素等が失活してＤＮＡが分解等を起こすことがなくなり、被検試料の長期保存が可能になると共に、ＰＣＲに悪影響を及ぼす虞のある塩分の析出を防ぐことができる。エタノール固定後は、室温（２０℃程度）で保存してもよいが、１５℃程度で保存することが好適であり、１０℃程度で保存することがより好適であり、５℃程度で保存することがさらに好適である。低温保存することで、プランクトンに含まれる酵素の活性を確実に抑えることができ、ＤＮＡの分解を防止することができる。エタノールに固定した被験試料は、例えばエッペンドルフチューブなどのチューブに入れて乾燥させる。エタノールは揮発しやすいので、乾燥を素早く行うことができる。尚、エタノール以外の揮発性有機物、例えば、メタノール、プロパノール、ブタノール、ベンゼン、トルエン等を用いても同様の効果を発揮する。
【００３６】
但し、被験試料中のプランクトンをエタノール等に浸漬して固定する処理は本発明においては必須処理ではない。即ち、滅菌水等で被験試料中のプランクトンを十分に洗浄して塩分を除いた後、風乾等を行うようにしても良いし、ＤＮＡが分解しない程度に熱をかけて乾燥を行うようにしても良い。
【００３７】
ここで、被験試料に対しＤＮＡ抽出処理を施すようにしてもよい。この場合、プランクトン等に含まれる有機物等によるＰＣＲへの悪影響を防いで、より確実にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生またはキタノムラサキイガイ幼生の検出を行うことが可能になる。ＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知あるいは新規の方法を適宜用いることができる。
【００３８】
ＰＣＲは、被験試料中のＤＮＡを鋳型として、上記のプライマーセットを用いて行われる。ＰＣＲ条件としては、当該技術分野において公知あるいは新規の条件を適宜用いることができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼアドバンテージ２（クローンテック社）を用いたＰＣＲが挙げられるが、これに限られるものではない。
【００３９】
ＰＣＲによって得られた増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動で展開し、非検出対象成分（鋳型ＤＮＡ、プライマー等）と検出対象成分である増幅産物とを分離した状態で蛍光染色によって増幅産物のバンドをその分子量から判断して特定し、そのバンドの蛍光強度を測定することにより行うことができる。しかしながら、この方法に限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いることもできる。
【００４０】
ここで、本発明の海水性二枚貝幼生の検出方法においては、本発明のプライマーセットのうち、ムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、被験試料にムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。また、本発明のプライマーセットのうち、ミドリイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、被験試料にミドリイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。さらに、本発明のプライマーセットのうち、キタノムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、被験試料にキタノムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。また、本発明のプライマーセットのうち、二種のプライマー対を用いることで、これら二種の幼生が存在しているか否かを判定することができる。例えば、本発明のプライマーセットのムラサキイガイ検出用のプライマー対とミドリイガイ検出用のプライマー対の両方を用いてＰＣＲを行うことで、被験試料にムラサキイガイ幼生またはミドリイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。この場合、ムラサキイガイ検出用のプライマー対によって増幅されるＤＮＡ断片の分子量とミドリイガイ検出用のプライマー対によって増幅されるＤＮＡ断片の分子量には差があるので、増幅ＤＮＡ断片の分子量によって、被験試料にムラサキイガイ幼生とミドリイガイ幼生のいずれが含まれているかを判定することもできる。換言すれば、幼生の種がムラサキイガイとミドリイガイのいずれであるかを判定することができる。また、本発明のプライマーセットの全プライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、被験試料にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。
【００４１】
次に、本発明の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法について説明する。本発明の海水性二枚貝個体数の定量方法は、本発明のプライマーセットの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより海水性二枚貝幼生の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の被験試料中の個体数を定量するようにしている。具体的には、ムラサキイガイ幼生個体数が既知の試料それぞれに対し本発明のプライマーセットのムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりムラサキイガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から、被験試料中のムラサキイガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。または、ミドリイガイ幼生個体数が既知の試料それぞれに対し本発明のプライマーセットのミドリイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりミドリイガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しミドリイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から、被験試料中のミドリイガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。または、キタノムラサキイガイ幼生個体数が既知の試料それぞれに対し本発明のプライマーセットのキタノムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりキタノムラサキイガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しキタノムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から、被験試料中のキタノムラサキイガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。以下に、リアルタイムＰＣＲを利用した場合の実施形態について、詳細に説明する。
【００４２】
リアルタイムＰＣＲを利用した本発明の幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、本発明のプライマーセットの一組のプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値に基づき、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより海水性二枚貝幼生の個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在する海水性二枚貝幼生の個体数の定量を行うようにしている。
【００４３】
ここで、リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。この手法を用いることで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。即ち、段階希釈した濃度既知の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡを標準試料としてＰＣＲを行い、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定する。この結果に基づいて、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡ濃度を横軸にプロットし、検量線を作成する。つまり、この検量線が、試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度とＣｔ値との関係を表す。したがって、濃度未知の被験試料のＣｔ値をリアルタイムＰＣＲにより測定することで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度を決定することができる。
【００４４】
リアルタイムＰＣＲは、例えば、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置により行うことができる。また、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、蛍光試薬を用いた蛍光モニター法により行われる。例えば、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光発光する試薬（インターカレータ）をＰＣＲ反応系に添加し、ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）にインターカレータを結合させ、励起光を照射することにより蛍光発光を生じさせて、蛍光強度を検出することによりＤＮＡ増幅量のモニタリングを行う、所謂インターカレータ法を用いることができる。尚、インターカレータ法に限定されるものではなく、ＴａｑＭａｎプローブ法などといった公知または新規の方法を適宜採用することができる。
【００４５】
リアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値とは、蛍光標識されたＰＣＲ産物量が指数関数的なＤＮＡ増幅期の中で一定量となるときの値、即ち、一定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲサイクル数を表している。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、初期には指数関数的に起こり、１次関数的な増幅を経て、最終的にはプラトーに達する。指数関数的なＤＮＡ増幅期における一定ＰＣＲ産物量に達するＰＣＲサイクル数と初期鋳型ＤＮＡ量には高い相関がある。したがって、初期鋳型ＤＮＡ量、つまり、試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度とＣｔ値との相関を調べることで、Ｃｔ値から試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度を推定する為の検量線を作成することができる。また、ＤＮＡの増幅曲線を二回微分して最大値を算出し、この最大値に達するまでのサイクル数、つまり、ＰＣＲ産物量の増幅がバックグラウンド値から指数関数的に変化する時点のサイクル数を検出し、これをＣｔ値とするようにしてもよい。
【００４６】
本発明の定量方法に用いる検量線は、ムラサキイガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、本発明のプライマーセットのうちのムラサキイガイ検出用プライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりムラサキイガイ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成される。また、本発明の定量方法に用いる検量線は、ミドリイガイ幼生個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し、本発明のプライマーセットのうちのミドリイガイ検出用プライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりミドリイガイ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成される。また、本発明の定量方法に用いる検量線は、キタノムラサキイガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、本発明のプライマーセットのうちのキタノムラサキイガイ検出用プライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりキタノムラサキイガイ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成される。
【００４７】
試料の処理方法に関しては、上述の通り、例えば試料中の幼生をエタノールに浸漬して固定し、乾燥させることが好適であるが、この方法に限定されるものではない。
【００４８】
試料のＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知の方法あるいは新規の方法を適宜用いることができる。例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）によるシリカゲル膜やＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ（フジフィルム社）による多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出方法、Soil DNA Isolation Kit （NORGEN社）等を用いることが好適であるが、特に、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ（フジフィルム社）による多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出方法を用いることが好適である。この場合には、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、幼生の定量をより正確に実施し易くなる。また、Soil DNA Isolation Kit （NORGEN社）を用いた場合には、サンプル中の泥や砂の影響を抑えてリアルタイムＰＣＲに適したＤＮＡ抽出サンプルを得ることができ、好適である。
【００４９】
ここで、幼生の甲皮が原因で試料のＤＮＡ抽出効率が低下する場合がある。そこで、試料からＤＮＡを抽出する前に、甲皮の破砕処理を行うことが好適である。例えば、乾燥させた試料を入れたエッペンドルフチューブにジルコニアボール（例えば、直径２〜３ｍｍ）を数個（例えば、３〜５個程度）を入れて、強く震盪することで組織を破砕した後、上記のＤＮＡ抽出処理に供することが好適である。この処理を行うことにより、幼生の甲皮（殻）によるＤＮＡ抽出効率の低下等を防いで、幼生個体数の分析精度を確実に高精度なものとすることができる。
【００５０】
尚、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の成長過程は、成体から放出された卵（５０〜６０μｍ）が孵化後にトロコフォア幼生となり、約１日後、ベリジャー幼生となる。そして、数週間でＤ型幼生（１００〜１５０μｍ）となり、さらに１週間ほどで付着期のペディベリジャー幼生（３００μｍ程度）となる。そして、付着変態後に稚貝となる。但し、ベリジャー幼生とＤ型幼生とを一括してベリジャー幼生と呼ぶ場合もある。
【００５１】
このように、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生は、その成長段階により、個体サイズが増加し、その細胞数も増加する。したがって、成長段階に応じて標的となるＣＯＩ遺伝子の１個体当たりのコピー数も増加することとなり、幼生の個体数が同じであっても、リアルタイムＰＣＲの結果示されるＣｔ値が幼生の成長段階で異なってくる。そこで、検量線を作成する際に使用する試料としては、幼生の各個体のＣＯＩ遺伝子コピー数がほぼ一定である試料を用いることが好ましい。この場合には、ＣＯＩ遺伝子コピー数が試料中の幼生個体数を正確に反映するので、幼生個体数に対する正確なＣｔ値を得ることができる。例えば、ペディベリジャー幼生のみが含まれている試料を用いれば、ペディベリジャー幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができるし、Ｄ型幼生のみが含まれている試料を用いれば、Ｄ型幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができる。
【００５２】
尚、幼生個体数が既知の複数の試料は、上記とは別の方法でも得ることができる。即ち、成体試料等から鋳型ＤＮＡを抽出し、これを幼生個体数と同等の遺伝子コピー数となるように段階希釈することによって、幼生個体数が既知の複数の試料を得るようにしてもよい。
【００５３】
ここで、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することが好ましい。この場合には、精度の高い定量分析を実施することが可能となる。上記の通り、ムラサキイガイ幼生及びミドリイガイ幼生は成長段階に応じてその体積が異なるため、例えば、被験試料を篩にかけて、定量分析の対象としている成長段階の幼生のみを通過させて取り出し、これを被験試料とすることで、その成長段階の幼生の個体数を定量分析することができる。このように、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することで、特定の成長段階にあるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生が被験試料中にどの程度存在するのかをより具体的に明らかにすることが可能となる。
【００５４】
以上、本発明の海水性二枚貝幼生の検出方法により、海水域で採集した被験試料に存在しているムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の有無を顕微鏡などで観察することなく分析することが可能となる。したがって、本発明の検出・定量分析方法を実施することで、対象海水域におけるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の存在や繁殖の有無を知ることが可能となり、対象海水域におけるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の有無を明らかにすることで、被害可能性を予知できると共に、基体等に付着する前の幼生の大量発生段階を予測して、ピンポイントで駆除することが可能になる。また、本発明の幼生個体数の定量方法により、海水域で採集した被験試料に存在しているムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の個体数を定量分析することが可能となる。したがって、本発明の定量方法によりこれらの幼生個体数の定量分析を定期的（例えば、３日〜１週間毎）に行うことで、対象海水域でのムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイの付着時期を確実に予測することが可能となり、基体等に付着する前の幼生の大量発生段階を予測して、ピンポイントで駆除することが可能になる。したがって、駆除剤の使用量を抑えてムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイの駆除にかかるコストを抑えることができ、駆除剤による海水の汚染も最小限に抑えることが可能となる。
【００５５】
次に、本発明の海水性二枚貝検出用キットについて説明する。
【００５６】
本発明の海水性二枚貝検出用キットは、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むものである。
【００５７】
したがって、配列番号１または２からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとした場合には、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にムラサキイガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。また、配列番号３または４からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとした場合には、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にミドリイガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。さらに配列番号５または６からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとした場合には、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にキタノムラサキイガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。
【００５８】
本発明のキットの一例として、図７に示すＤＮＡチップが挙げられる。このＤＮＡチップ１は、基板２と、基板２の表面に形成されたスポット３と、スポット３内に固定されたＤＮＡプローブ４により構成される。
【００５９】
基板２としては、ガラス基板、シリコンウエハー、ナイロン膜、セルロース膜等を適宜用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
スポット３には、ＤＮＡプローブ４が等量ずつ固定される。ＤＮＡプローブ４は、配列番号１〜４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つである。
【００６１】
ＤＮＡチップ１を用いて、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生またはキタノムラサキイガイ幼生の検出を行う。被検試料はＤＮＡ抽出処理後、ＤＮＡを一本鎖に調製し、蛍光剤や発色剤を添加して１本鎖ＤＮＡを蛍光標識する。そして、これをＤＮＡチップ１のスポット３に滴下し、ＤＮＡプローブ４と結合（ハイブリダイズ）させる。未結合の一本鎖ＤＮＡは洗い流し、スポット３の蛍光強度を検出することにより、蛍光発光が生じたスポットを特定することで、被験試料中のムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生またはキタノムラサキイガイ幼生の検出を行うことができる。
【００６２】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００６３】
例えば、上述の実施形態では、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置を用いて幼生個体数の定量分析を行う場合について詳細に説明したが、ＰＣＲ装置やヒートブロックを利用して遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅量をモニタリングすることによって、幼生個体数の定量を行うことも可能である。具体的には、幼生個体数が既知の試料を複数用意し、この試料に一定サイクルでＰＣＲ装置またはヒートブロックを用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅量をモニタリングし、幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、実海域から採集した試料を同条件でＰＣＲして遺伝子増幅量をモニタリングし、検量線を利用して試料中の幼生個体数の定量を行うようにしてもよい。
【００６４】
遺伝子増幅量のモニタリング方法としては、公知あるいは新規の方法を各種用いることができる。例えば、分光光度計によりＰＣＲ後の溶液のＤＮＡ濃度を測定することで遺伝子増幅量をモニタリングするようにしてもよいし、電気泳動や色素によるＤＮＡ染色を利用した定量方法を用いることもできる。ＤＮＡを染色する色素としては、核酸のＡＴに特異性があり、ＤＮＡ量の測定に一般的に使用されている色素であるＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、サイクリングプローブ法を用いてもよく、サイクリングプローブの蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｘはサイクリングプローブの核酸）を用い、消光物質としてEclipseを用いることで、紫外光を照射することにより赤色の強い蛍光強度を得ることができ好ましいが、これに限定されるものではない。また、蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンを用い、消光物質としてEclipseを用いたサイクリングプローブ法のように、可視光領域において強い蛍光発光を生じる場合には、目的とする幼生の増幅ＤＮＡのみを、蛍光物質を励起するための励起光を照射するだけで目視で検出することが可能となるので、幼生の有無およびおおよその量を目視で容易に検出することができる。
【００６５】
また、本発明の定量方法は、上記（１）〜（３）のプライマー対のうち２種のプライマー対を同時に使用してＰＣＲを行うことにより実施するようにしてもよい。例えば、上記（１）と（２）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、電気泳動法を利用して遺伝子増幅の有無をバンドの発現の有無により確認すると共に、バンドの位置から海水性二枚貝幼生の種を検出し、さらに遺伝子増幅量をバンドの濃淡から判断し、予め作成されたバンドの濃淡と幼生個体数との関係を示す検量線から、海水性二枚貝幼生の個体数の定量を行うようにしてもよい。また、本発明の定量方法は、上記（１）〜（３）のプライマー対の全てを同時に使用してＰＣＲを行うことにより実施するようにしてもよい。
【実施例】
【００６６】
以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６７】
（実施例１）
ムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）及びミドリイガイ（Perna viridis）と、これらと比較的近縁であると考えられる二枚貝であるカワヒバリガイ（Limnoperna fortunei)、コウロエンカワヒバリガイ（Xenostrobus securis)及びホトトギスガイ（Musculista senhousia）についてのＣＯＩ遺伝子の塩基配列のデータベース化を行い、このデータベースに基づいてムラサキイガイに特異的な塩基配列並びにミドリイガイに特異的な塩基配列を特定し、プライマーを設計した。データベース化に供した二枚貝は採集直後に９９．５％エタノールに浸漬し４℃で保存した。
【００６８】
データベース化に供した二枚貝は、解剖後、軟体部、可能であれば筋肉組織の小片（２〜３ｍｍ角）を清浄なメスを用いて切り出し、キアゲン社のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出を行った。基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＡＴＬ ｂｕｆｆｅｒ）と２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに２００μＬのバッファー（ＡＬ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２００μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、２ｍＬのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＴｕｂｅにセットしたＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに処理サンプルを供した。このチューブを１分間遠心分離処理して素通り画分を除いた後、Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎのシリカゲル膜フィルターに吸着したＤＮＡをＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１およびＡＷ２で洗浄し、最終的には１００μＬの溶出バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥ）によりＤＮＡを溶出し、回収した。
【００６９】
ＡＥバッファーに溶解したＤＮＡの濃度を分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ Ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社）により測定した結果、５μｇ以上のＤＮＡが得られていることが確認された。ＤＮＡ濃度の測定結果に基づいて、２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度としたＡＥバッファー溶液を調整し、これをＰＣＲの際に鋳型ＤＮＡとして供した。
【００７０】
次に、上記操作により得られた総ＤＮＡを鋳型として、ＣＯＩ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。プライマーには、後生無脊椎生物のＣＯＩ遺伝子に対するプライマーとして文献１で報告されているユニバーサルプライマーを用いた（文献１：Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., Vrijenhoek, R., 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 3, 294-299.）。
【００７１】
配列番号１４及び１５に使用したユニバーサルプライマーの配列を示す。尚、これらのプライマーは合成（インビトロジェン）により得られたものであり、ＰＣＲに供するまで５０ｐｍｏｌ／μＬのストック溶液（シグマジェノシス製）中に−２０℃で保存した。使用前にストック溶液を純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）で５倍希釈し１０ｐｍｏｌ／μＬとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは、上記の操作により抽出した総ＤＮＡを鋳型とし、アドバンテージ２（クローンテック）を用いて行った。なお、鋳型ＤＮＡは２０ｎｇ／μＬに調製した溶液を２μＬ（４０ｎｇ）、反応にはタカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）を用い、反応液の調製はそれぞれのアドバンテージ２に添付された方法に従った。具体的には、滅菌水１４．２０μＬ、１０ｘＰＣＲ ＳＡバッファー（１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、５０×ｄＮＴＰ混合物０．４０μＬ、５０×ポリメラーゼ ｍｉｘ０．４０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。なお、アドバンテージ２においては、添付された２種類の反応バッファーのうち良好な結果が得られたＳＡバッファーを使用した。
【００７２】
まず、グラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の推定を行った。グラジエントＰＣＲでのアニーリング温度は、４５．０℃〜６５．０℃の１２段階に設定した。９５℃（アドバンテージ２）で１分間保ったあと、熱変性９５℃（アドバンテージ２）３０秒間、各温度でのアニーリング３０秒間、伸長反応６８℃（アドバンテージ２）３０秒間という反応を３０サイクル繰り返す条件で行った。反応産物はサイズマーカーとともに２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により特定領域の増幅の有無を確認した。
【００７３】
その結果、ＣＯＩ遺伝子のＰＣＲにおいては、クローンテックのアドバンテージ２を用いた場合は５４℃が最適であったが、４５．０℃〜６５．０℃のアニーリング温度範囲であれば、安定してＰＣＲすることが可能であった。なお、増幅されたＤＮＡ断片は本来は７０９ｂｐ程度の長さであるが、配列を正確に確認できたのは、いずれの二枚貝においても約５０５〜５８５ｂｐの長さであった。
【００７４】
アガロース電気泳動にて増幅を確認したＰＣＲ産物からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、その一部を塩基配列決定に供した。ＰＣＲ産物に９９．５％エタノール５０μＬ、３Ｍの酢酸ナトリウム（和光純薬製）２μＬ、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（和光純薬製）２μＬを加え、撹拌混合して１５分間室温で静置した後、１３８００ｇで２０分間遠心分離処理した。沈澱はさらに７０μＬの７０％エタノールで洗浄し、得られた沈澱を乾燥後、６μＬの純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）に溶解した。回収されたＰＣＲ産物（鋳型ＤＮＡ）１μＬと配列番号３と４に記載された塩基配列からなるプライマーを用い、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）により、サイクルシーケンス反応を行った。反応は、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を２５サイクル行い、終了後、再度エタノール沈澱を行った。得られた乾燥標品にＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）２０μＬを加え、９５℃で２分間の反応後、サンプルをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０に供してシーケンシングを行った。また、塩基配列のデータはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて解析した。
【００７５】
各種二枚貝を鋳型とし、配列番号１４及び１５に記載された塩基配列からなるユニバーサルプライマーを用いて得られたＣＯＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングの結果について、塩基配列を配列表の配列番号７〜１１に示す。配列番号７がムラサキイガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号８がミドリイガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号９がカワヒバリガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号１０がコウロエンカワヒバリガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号１１がホトトギスガイのＣＯＩ領域の塩基配列である。尚、解析領域は、得られたＤＮＡ断片のうち、全てのサンプルで塩基配列が決定できた領域である５０５〜５８５ｂｐの範囲とした。また、配列表の配列番号７〜１１に示す塩基配列は、それぞれの種において最も出現頻度の高かった塩基配列である。但し、コウロエンカワヒバリガイについては、配列番号１０に記載された塩基配列と１９塩基だけ異なる塩基配列が同等に検出された。この塩基配列を配列表の配列番号１２に示す。具体的には、２４番目、５４番目、８１番目、１０３番目、１７７番目、２１０番目、２４９番目、２５０番目、２５２番目、３３３番目、３５１番目、３８１番目、４０５番目、４５６番目、５１６番目、５４１番目、５５９番目、５８１番目及び５８４番目の１９箇所の塩基が配列番号１０に記載の塩基配列とは異なっていた。
【００７６】
また、上記と同様の方法で、キタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）についてもＣＯＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングを行い、配列番号１３に示す塩基配列を得た。
【００７７】
次に、配列表の配列番号７〜１１の塩基配列に基づいて、種間で変位の大きい領域に基づき、ムラサキイガイについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる９８ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。ムラサキイガイ検出用プライマーの塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示す。
【００７８】
また、配列表の配列番号７〜１１の塩基配列に基づいて、種間で変位の大きい領域に基づき、ミドリイガイについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる９８ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。ミドリイガイ検出用プライマーの塩基配列を配列表の配列番号３及び４に示す。
【００７９】
さらに、配列表の配列番号７〜１１、１３の塩基配列に基づいて、種間で変位の大きい領域に基づき、キタノムラサキイガイについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる１５５ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。キタノムラサキイガイ検出用プライマーの塩基配列を配列表の配列番号５及び６に示す。
【００８０】
配列番号１〜６のプライマーは合成（インビトロジェン）し、以下の実験に供した。
【００８１】
配列番号１及び２のムラサキイガイ検出用プライマー対について、上記方法により得られたミドリイガイ成体、カワヒバリガイ成体、コウロエンカワヒバリガイ成体及びホトトギスガイ成体、さらにはキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）成体、クジャクガイ（Septifer bilocularis）成体、クログチ（Xenostrobus atratus）成体、ヒバリガイモドキ（Hormomya mutabilis）成体、ムラサキインコガイ（Septifer virgatus）成体、アサリ成体、混合プランクトン、タイワンシジミ（Corbicula fluminea）成体、ヤマトシジミ（Corbicula japonica）成体及びカキ成体の鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、配列番号１及び２のムラサキイガイ検出用プライマー対の有効性とＰＣＲの最適条件について検討した。
【００８２】
ＰＣＲは基本的には上述の方法に従い、タカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）のグラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の検討を行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動（３％アガロース）後にＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により検出した。ＰＣＲにおけるサイクル数は３０サイクルとした。電気泳動写真を図１Ａ及び図１Ｂに示す。尚、図１Ａにおいて、ａがムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｂがキタノムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｃがカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｄがコウロエンカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｅがミドリイガイの電気泳動結果であり、ｆがホトトギスガイの電気泳動結果であり、ｇがクジャクガイの電気泳動結果であり、ｈがクログチの電気泳動結果であり、ｉがヒバリガイモドキの電気泳動結果であり、ｊがムラサキインコガイの電気泳動結果であり、ｋがアサリの電気泳動結果であり、ｌが混合プランクトンの電気泳動結果である。また、図１Ｂにおいて、ａがムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｍがタイワンシジミの電気泳動結果であり、ｎがヤマトシジミの電気泳動結果であり、ｏがカキの電気泳動結果である。
【００８３】
アニーリング温度の検討を行った結果、６０℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行うこととした。ＰＣＲの結果、ムラサキイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した場合、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号１及び２のムラサキイガイ検出用プライマーにより増幅した９８ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、ムラサキイガイ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【００８４】
以上の結果から、配列番号１及び２のムラサキイガイ検出用プライマー対は、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅することが判明した。
【００８５】
また、上記と同様の実験を配列番号３及び４のミドリイガイ検出用プライマー対を用いて実施した。電気泳動写真を図２Ａ及び図２Ｂに示す。尚、図２Ａにおいて、ａがミドリイガイの電気泳動結果であり、ｂがムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｃがキタノムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｄがカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｅがコウロエンカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｆがホトトギスガイの電気泳動結果であり、ｇがクジャクガイの電気泳動結果であり、ｈがクログチの電気泳動結果であり、ｉがヒバリガイモドキの電気泳動結果であり、ｊがムラサキインコガイの電気泳動結果であり、ｋがアサリの電気泳動結果であり、ｌが混合プランクトンの電気泳動結果である。また、図２Ｂにおいて、ａがミドリイガイの電気泳動結果であり、ｍがタイワンシジミの電気泳動結果であり、ｎがヤマトシジミの電気泳動結果であり、ｏがカキの電気泳動結果である。
【００８６】
アニーリング温度の検討を行った結果、６０℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行うこととした。ＰＣＲの結果、ミドリイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した場合、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号３及び４のミドリイガイ検出用プライマーにより増幅した１４９ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、ミドリイガイ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【００８７】
以上の結果から、配列番号３及び４のミドリイガイ検出用プライマー対は、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅することが判明した。
【００８８】
さらに、上記と同様の実験を配列番号５及び６のキタノムラサキイガイ検出用プライマー対を用いて実施した。電気泳動写真を図８Ａ及び図８Ｂに示す。尚、図８Ａにおいて、ａがキタノムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｂがムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｃがカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｄがコウロエンカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｅがミドリイガイの電気泳動結果であり、ｆがホトトギスガイの電気泳動結果であり、ｇがクジャクガイの電気泳動結果であり、ｈがクログチの電気泳動結果であり、ｉがヒバリガイモドキの電気泳動結果であり、ｊがムラサキインコガイの電気泳動結果であり、ｋがアサリの電気泳動結果である。また、図８Ｂにおいて、ａがキタノムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｌがタイワンシジミの電気泳動結果であり、ｍがヤマトシジミの電気泳動結果であり、ｎがカキの電気泳動結果であり、ｏが東京湾プランクトンの電気泳動結果であり、ｐが志津川湾プランクトンの電気泳動結果である。
【００８９】
アニーリング温度の検討を行った結果、６０℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行うこととした。ＰＣＲの結果、キタノムラサキイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した場合、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号５及び６のキタノムラサキイガイ検出用プライマーにより増幅した１５５ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、キタノムラサキイガイ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【００９０】
以上の結果から、配列番号５及び６のキタノムラサキイガイ検出用プライマー対は、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅することが判明した。
【００９１】
（実施例２）
本発明のプライマーを用いた定量分析について検討した。
【００９２】
ムラサキイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．０２〜２ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号１及び２のムラサキイガイ検出用プライマーを用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。電気泳動写真を図３に示す。図３に示されるように、０．０２〜２ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるムラサキイガイ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、ムラサキイガイ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【００９３】
次に、ミドリイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．０２〜２ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号３及び４のミドリイガイ検出用プライマーを用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。電気泳動写真を図４に示す。図４に示されるように、０．０２〜２ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるミドリイガイ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、ミドリイガイ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【００９４】
次に、キタノムラサキイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号５及び６のキタノムラサキイガイ検出用プライマーを用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。電気泳動写真を図９に示す。図９に示されるように、０．２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるキタノムラサキイガイ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、キタノムラサキイガイ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【００９５】
（実施例３）
ムラサキイガイ幼生から総ＤＮＡを抽出するための条件と定量分析について検討を行った。
【００９６】
２００９年７月２４日に宮城県志津川湾で採集したムラサキイガイ成体から幼生を取り出し、幼生を得たのちに珪藻を与えながら飼育しＤ型幼生（殻長約１０６μｍ）から塩分を十分に洗い流した後、９９．５％エタノールを十分に加えてエタノールに固定し、４℃で保存した。
【００９７】
ＤＮＡ抽出処理は、Ｄ型幼生を０、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００個体含むエッペンドルフチューブ（すべてエタノールを乾燥させたもの）をそれぞれ３個ずつ用意して行った。
【００９８】
フジフィルム社のＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔＳによる多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出を行った。基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＭＤＴ）と２０μＬのＥＤＴとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに１８０μＬのバッファー（ＬＤＴ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２４０μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＭｉｎｉ８０のカートリッジに全量処理サンプルを供した。このカートリッジに添加後に、加圧処理と７５０μＬのＷＤＴを加える操作を３回繰り返した（洗浄処理）。洗浄後、フィルターに吸着したＤＮＡを１００μＬの溶出バッファー（ＣＤＴ）によりＤＮＡを溶出し、回収した。
【００９９】
ＤＮＡ抽出処理後の試料をリアルタイムＰＣＲによる定量的解析に供して、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定することにより、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを評価した。リアルタイムＰＣＲによる定量的解析は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたインターカレータ法により行った。
【０１００】
反応液は、純水９．５μＬ、配列番号１に記載のプライマー（１０μＭ）、配列番号２に記載のプライマー（１０μＭ）それぞれ０．５μＬ（最終濃度０．２μＭ）、鋳型ＤＮＡを２μＬ、そしてＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ｘ２）を１２．５μＬを混合して調製した。
【０１０１】
装置はＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｉｅｄ社）を使用して、９５℃で初期変性した後、９５℃を５秒、６０℃を３０秒のＰＣＲを４０サイクル繰り返し、最後に融解曲線確認のための反応（６０℃−９５℃）を実施した。そして反応後、各試料のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定した。
【０１０２】
その結果、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合の試料間のＣｔ値ばらつきがＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出処理を行った場合のＣｔ値ばらつきよりも少ないことが明らかとなった。
【０１０３】
したがって、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出処理でも同様の定量化が可能であるが、フジフィルム社のQuickGene DNA tissue Ｋｉｔ Sを採用することがＣｔ値ばらつきを抑える上で好適であることがわかった。また、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加した後のインキュベート時間を１時間として処理時間の低減を図れることがわかった。
【０１０４】
また、Ｄ型幼生をエッペンドルフチューブに収容し、乾燥後、ジルコニアボール（直径２ｍｍまたは３ｍｍ）を数個（３〜５個）加えて、強く震盪することで幼生を破砕し、その後、上記のＤＮＡ抽出をしたところ、試料間のＣｔ値ばらつきをさらに抑えて、定量の再現性及び精度を向上できることが明らかとなった。この破砕処理を行うことで、Ｄ型幼生の甲皮の堅さに起因するＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、定量の再現性及び精度を向上できることが明らかとなった。また、この破砕処理は多量の他種動物プランクトンを含む採集サンプルの場合にはさらに効率よくＤ型幼生のＤＮＡを抽出できることもわかった。
【０１０５】
また、融解曲線を確認した結果、温度ピークがすべて単一であった。したがって、目的の増幅産物（９８ｂｐのＤＮＡ断片）のみが得られ、その定量が行われたことが明らかとなった。
【０１０６】
尚、他のインビトロジェン社のＥａｓｙ−ＤＮＡキットやインビトロジェン社のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔのＤＮＡ抽出処理を行った場合には、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合と比較して試料間のＣｔ値ばらつきが若干大きくなったものの、これらのＤＮＡ抽出方法を否定するものではなく、試料のすり潰し操作や、ＤＮＡ沈殿の回収操作の試料間ばらつきを抑えることで、また、上記の破砕処理をＤＮＡ抽出処理前に実施することで、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合と同程度のＣｔ値ばらつきを達成することができると考えられる。
【０１０７】
次に、リアルタイムＰＣＲによる定量性について評価した。前述の操作で最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、実施例２に示したリアルタイムＰＣＲに供した。即ち、１、２、５、１０、２０、５０、１００及び２００個体の幼生から抽出されたＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＰＣＲのそれぞれの反応液には最終的には、０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４、１．０、２．０及び４．０個体相当の幼生が含まれることになる。
【０１０８】
ムラサキイガイ幼生を試料とした場合のリアルタイムＰＣＲの結果を図５に示す。Ｃｔ値は異なる３バッチのサンプルから得られた鋳型ＤＮＡを用いた３回の実験の平均値を示している。リアルタイムＰＣＲに供した反応液の幼生個体数は最終的には０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４、１．０、２．０及び４．０個体相当と非常に少なかったにも関わらず、幼生個体数の対数とＣｔ値との間に高い相関性が認められることが確認された。即ち、Ｄ型幼生がＤＮＡ抽出液１００μＬ中に１個体以上存在すれば、本発明のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、高い定量性をもって幼生の個体数の分析が可能であることがわかった。つまり、Ｄ型幼生の個体数が未知のサンプルにおいても、リアルタイムＰＣＲを実施し、そのＣｔ値を測定することで、正確な幼生個体数の推定ができると考えられた。
【０１０９】
次に、ミドリイガイの場合について検討した。２００８年１２月１６日に東京湾で採集したミドリイガイの成体を十分に洗い流した後、９９．５％エタノールを十分に加えてエタノールに固定し、４℃で保存した。この試料にＤＮＡ抽出処理を施し、配列番号３及び４のプライマー対を用いた以外は上記と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行い、ＤＮＡ量とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との相関について検討した。結果を図６に示す。図６に示されるように、ＤＮＡ量とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との間には相関が見られ、試料のＣｔ値からＤＮＡ量を推定できることが明らかとなった。ここで、各成長段階における幼生の遺伝子コピー数は既知であることから、試料のＣｔ値から推定されるＤＮＡ量から、幼生個体数の定量を行うことが可能である。
【０１１０】
次に、キタノムラサキイガイの場合について検討した。２００９年５月１０日に宮城県志津川湾で採集したキタノムラサキイガイの成体を十分に洗い流した後、９９．５％エタノールを十分に加えてエタノールに固定し、４℃で保存した。この試料にＤＮＡ抽出処理を施し、配列番号５及び６のプライマー対を用いた以外は上記と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行い、ＤＮＡ量とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との相関について検討した。結果を図１０に示す。図１０に示されるように、ＤＮＡ量とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との間には相関が見られ、試料のＣｔ値からＤＮＡ量を推定できることが明らかとなった。ここで、各成長段階における幼生の遺伝子コピー数は既知であることから、試料のＣｔ値から推定されるＤＮＡ量から、幼生個体数の定量を行うことが可能である。
【符号の説明】
【０１１１】
１ ＤＮＡチップ
４ ＤＮＡプローブ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海水性二枚貝検出用プライマーセットとこれを利用した海水性二枚貝幼生の検出・定量方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、複数種のプランクトンが多数存在する海水域から採集した被験試料のムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の有無を検出し、その個体数の定量を行うのに好適な海水性二枚貝検出用プライマーセットとこれを利用した海水性二枚貝幼生の検出・定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
海水性二枚貝であるムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイは、火力・原子力発電所等の冷却水路系に付着する付着生物として知られている（非特許文献１）。火力・原子力発電所等の冷却水路系に付着生物が付着すると、冷却水の流量が流動抵抗の増大により低下し、復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内に付着生物が付着したり、剥がれた付着生物が詰まったりすることによって、管壁の腐食や細管の閉塞が生じる。そこで、各発電所では、付着生物を機械的に除去したり、付着生物の付着そのものを抑制したりするための様々な防除対策が実施されている。また、ムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイの付着による被害は火力・原子力発電所等の冷却水路系のみに留まらず、常時海水と接触している船舶の船底や各種設備等にも及んでいる。
【０００３】
ここで、ムラサキイガイやミドリイガイ、キタノムラサキイガイは、水路等の基体に付着してしまうと、完全に除去することが困難である。また、除去する際に発生する死骸等によって水質の悪化が生じ、周囲の環境に対する悪影響が懸念される。したがって、ムラサキイガイやミドリイガイ、キタノムラサキイガイの駆除は、水路等の基体に付着する前の浮遊幼生の段階で、大量に発生する時期を見計らって行うことが望ましいと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】発電所を困らせる水の生き物たち（２００８年３月、財団法人電力中央研究所）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
海水域には、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生以外にも多種多様なプランクトンが存在している。したがって、海水域で採集した被験試料からムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の発生量を調査する際には、多種多様なプランクトンの中からムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生のみを選択的に検出・定量する必要がある。しかしながら、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生と海水中の多種多様なプランクトンとの形態分類学上の差異のみを頼りにムラサキイガイ幼生やミドリイガイ幼生、ムラサキイガイ幼生の検出・定量を行うことは、熟練した研究者でも極めて困難なものである。そこで、誰もがムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生を簡易に検出・定量することのできる方法の確立が望まれている。
【０００６】
本発明は、かかる要望に鑑みてなされたものであって、海水性二枚貝であるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生を簡易に検出する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、海水性二枚貝であるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生を簡易に検出すると共にその個体数を定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は、遺伝子解析技術からのアプローチによりムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイを分子レベルで種々検討した。その結果、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の塩基配列情報に基づき、ムラサキイガイのみを分子レベルで特異的に認識するオリゴヌクレオチドプライマー対を開発することに成功した。また、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の塩基配列情報に基づき、ミドリイガイのみを分子レベルで特異的に認識するオリゴヌクレオチドプライマー対を開発することに成功した。さらに、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の塩基配列情報に基づき、キタノムラサキイガイのみを分子レベルで特異的に認識するオリゴヌクレオチドプライマー対を開発することに成功した。本願発明者等は、さらに検討を進め、これらのプライマー対を用いることで、海水性二枚貝の中でも代表的な付着生物であるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の検出・定量を行えることを知見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明の海水性二枚貝検出用のプライマーセットは、下記（１）〜（３）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むものである。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【００１０】
（１）のプライマー対は、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、近縁種の二枚貝であるキタノムラサキイガイ、カワヒバリガイ、コウロエンカワヒバリガイ、ミドリイガイ、ホトトギスガイ、クジャクガイ、クログチ、ヒバリガイモドキ、ムラサキインコガイ、アサリ、タイワンシジミ、ヤマトシジミ、カキ、さらには海水域に一般的に存在しているプランクトンを認識することがない。したがって、（１）のプライマー対によれば、ムラサキイガイの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１１】
（２）のプライマー対は、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、近縁種の二枚貝であるムラサキイガイ、キタノムラサキイガイ、カワヒバリガイ、コウロエンカワヒバリガイ、ホトトギスガイ、クジャクガイ、クログチ、ヒバリガイモドキ、ムラサキインコガイ、アサリ、タイワンシジミ、ヤマトシジミ、カキ、さらには海水域に一般的に存在しているプランクトンを認識することがない。したがって、（２）のプライマー対によれば、ミドリイガイの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１２】
（３）のプライマー対は、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、近縁種の二枚貝であるムラサキイガイ、カワヒバリガイ、コウロエンカワヒバリガイ、ミドリイガイ、ホトトギスガイ、クジャクガイ、クログチ、ヒバリガイモドキ、ムラサキインコガイ、アサリ、タイワンシジミ、ヤマトシジミ、カキ、さらには海水域に一般的に存在しているプランクトンを認識することがない。したがって、（３）のプライマー対によれば、キタノムラサキイガイの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１３】
また、本発明の海水性二枚貝幼生の検出方法は、下記（１）〜（３）のうち一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅の有無によりプライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生が被験試料に存在しているか否かを検出するようにしている。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【００１４】
被験試料にムラサキイガイ幼生が存在している場合には、上記（１）のプライマー対がムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識し、ＰＣＲによりムラサキイガイ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にムラサキイガイ幼生が含まれていない場合には、上記（１）のプライマー対によって認識される遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、上記（１）のプライマー対を用いて遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料にムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。
【００１５】
被験試料にミドリイガイ幼生が存在している場合には、上記（２）のプライマー対がミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識し、ＰＣＲによりミドリイガイ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にミドリイガイ幼生が含まれていない場合には、上記（２）のプライマー対によって認識される遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、上記（２）のプライマー対を用いて遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料にミドリイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。
【００１６】
被験試料にキタノムラサキイガイ幼生が存在している場合には、上記（３）のプライマー対がキタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識し、ＰＣＲによりキタノムラサキイガイ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にキタノムラサキイガイ幼生が含まれていない場合には、上記（３）のプライマー対によって認識される遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、上記（３）のプライマー対を用いて遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料にキタノムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。
【００１７】
さらに、本発明の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、下記（１）〜（３）のうち一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより海水性二枚貝幼生の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の被験試料中の個体数を定量するようにしている。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【００１８】
ここで、本発明の海水性二枚貝個体数の定量方法においては、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲとすることが好ましく、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値を利用することが好ましい。
【００１９】
また、本発明の海水性二枚貝個体数の定量方法においては、被験試料は分画処理してからＰＣＲに供することが好ましい。
【００２０】
本発明の海水性二枚貝検出キットは、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むものとしている。したがって、このプローブがムラサキイガイ、ミドリイガイまたはキタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生またはキタノムラサキイガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。
【発明の効果】
【００２１】
請求項１に記載の海水性二枚貝検出用プライマーセットによれば、配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ検出用プライマー対によって、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができるので、このプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。また、配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ検出用プライマー対によって、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができるので、このプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。さらに、配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ検出用プライマー対によって、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができるので、このプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。
【００２２】
請求項２に記載の海水性二枚貝幼生の検出方法によれば、被験試料にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生以外のプランクトンが複数種混在している場合であっても、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生をそれぞれ特異的に検出することができる。
【００２３】
請求項３に記載の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法によれば、被験試料にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生以外のプランクトンが複数種混在している場合であっても、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生をそれぞれ特異的に検出し、その個体数を定量することができる。
【００２４】
請求項４に記載の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法によれば、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲにより得られるＣｔ値を利用しており、しかも、配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ検出用プライマー対により増幅されるＤＮＡ断片長と配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ検出用プライマー対より増幅されるＤＮＡ断片長と配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ検出用プライマー対により増幅されるＤＮＡ断片長は、リアルタイムＰＣＲを行うのに好適な長さとなることから、幼生個体数の定量分析をより精度良く行うことができる。
【００２５】
請求項５に記載の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法によれば、被験試料が予め分画処理されてからＰＣＲに供されるので、幼生の成長段階（幼生の体積）に応じて被験試料を分画して定量することが可能となる。したがって幼生個体数の定量精度をさらに高めることができる。
【００２６】
請求項６記載の海水性二枚貝検出用キットによれば、配列番号１〜６記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一つのプライマーをプローブとして含んでいるので、プローブとして含まれるプライマーによって認識される遺伝子を有する海水性二枚貝について、そのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができ、被験試料にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図１Ｂ】配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図であり、図１Ａとは対象とする生物を異にしたものである。
【図２Ａ】配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図２Ｂ】配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図であり、図２Ａとは対象とする生物を異にしたものである。
【図３】反応液中のムラサキイガイの鋳型ＤＮＡ濃度を０．０２〜２ｎｇ／μＬとしたときの配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図４】反応液中のミドリイガイの鋳型ＤＮＡ濃度を０．０２〜２ｎｇ／μＬとしたときの配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図５】リアルタイムＰＣＲにより作成されたムラサキイガイ幼生用の検量線である。
【図６】リアルタイムＰＣＲにより作成されたミドリイガイ幼生用の検量線である。
【図７】ＤＮＡチップの実施の一例を示す図である。
【図８Ａ】配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図８Ｂ】配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られた増幅産物のアガロース電気泳動像を示す図であり、図８Ａとは対象とする生物を異にしたものである。
【図９】反応液中のキタノムラサキイガイの鋳型ＤＮＡ濃度を０．２〜２０ｎｇ／μＬとしたときの配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ後のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図１０】リアルタイムＰＣＲにより作成されたキタノムラサキイガイ幼生用の検量線である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２９】
本発明の海水性二枚貝検出用プライマーセットは、配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ検出用プライマー対、配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ検出用プライマー対及び配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ検出用プライマー対の少なくともいずれかを含むものである。
【００３０】
本発明のプライマーセットのムラサキイガイ検出用プライマー対により、配列番号７に示すムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子解析領域（ＬＣＯ１４９０〜ＨＣＯ２１９８）のうち、３５８番目〜４５５番目に含まれる９８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。また、本発明のプライマーセットのミドリイガイ検出用プライマー対により、配列番号８に示すミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子解析領域（ＬＣＯ１４９０〜ＨＣＯ２１９８）のうち、３０７番目〜４５５番目に含まれる１４９ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。さらに、本発明のプライマーセットのキタノムラサキイガイ検出用プライマー対により、配列番号１３に示すキタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子解析領域（ＬＣＯ１４９０〜ＨＣＯ２１９８）のうち、２８６番目〜４４０番目に含まれる１５５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００３１】
ここで、プライマーの塩基配列は、配列番号１〜６で示される塩基配列のものに限定されない。例えば、プライマーの一端または両端が延長あるいは短縮されたプライマーであって、ムラサキイガイのＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列、ミドリイガイのＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列と相補的な配列またはキタノムラサキイガイのＣＯＩ遺伝子の特定領域の塩基配列と相補的な配列を有して特異的に認識するプライマーも包含される。但し、プライマー長は、１８〜４０塩基とすることが好適である。プライマー長を４０塩基超とすると、非特異的なアニーリングが起こりやすくなって、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。また、短すぎても、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。
【００３２】
本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成することができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いて合成してもよい。
【００３３】
次に、本発明の海水性二枚貝幼生の検出方法について説明する。本発明の海水性二枚貝幼生の検出方法は、被験試料に対し上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより被験試料に海水性二枚貝幼生であるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生、キタノムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定するようにしている。
【００３４】
被験試料としては、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生またはキタノムラサキイガイ幼生を１個体以上含有する可能性のあるあらゆる種類の試料が包含される。例えば、複数種のプランクトンを多数含む海水域から採集された環境サンプルは勿論のこと、人工飼育水槽の飼育水等も被験試料とすることができるが、被験試料はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
被験試料からは塩分が含まれる海水や飼育水等をできるだけ除き、被験試料中のプランクトンをエタノールに浸漬して固定することが好ましい。この処理により、被験試料中のプランクトンに含まれる酵素等が失活してＤＮＡが分解等を起こすことがなくなり、被検試料の長期保存が可能になると共に、ＰＣＲに悪影響を及ぼす虞のある塩分の析出を防ぐことができる。エタノール固定後は、室温（２０℃程度）で保存してもよいが、１５℃程度で保存することが好適であり、１０℃程度で保存することがより好適であり、５℃程度で保存することがさらに好適である。低温保存することで、プランクトンに含まれる酵素の活性を確実に抑えることができ、ＤＮＡの分解を防止することができる。エタノールに固定した被験試料は、例えばエッペンドルフチューブなどのチューブに入れて乾燥させる。エタノールは揮発しやすいので、乾燥を素早く行うことができる。尚、エタノール以外の揮発性有機物、例えば、メタノール、プロパノール、ブタノール、ベンゼン、トルエン等を用いても同様の効果を発揮する。
【００３６】
但し、被験試料中のプランクトンをエタノール等に浸漬して固定する処理は本発明においては必須処理ではない。即ち、滅菌水等で被験試料中のプランクトンを十分に洗浄して塩分を除いた後、風乾等を行うようにしても良いし、ＤＮＡが分解しない程度に熱をかけて乾燥を行うようにしても良い。
【００３７】
ここで、被験試料に対しＤＮＡ抽出処理を施すようにしてもよい。この場合、プランクトン等に含まれる有機物等によるＰＣＲへの悪影響を防いで、より確実にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生またはキタノムラサキイガイ幼生の検出を行うことが可能になる。ＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知あるいは新規の方法を適宜用いることができる。
【００３８】
ＰＣＲは、被験試料中のＤＮＡを鋳型として、上記のプライマーセットを用いて行われる。ＰＣＲ条件としては、当該技術分野において公知あるいは新規の条件を適宜用いることができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼアドバンテージ２（クローンテック社）を用いたＰＣＲが挙げられるが、これに限られるものではない。
【００３９】
ＰＣＲによって得られた増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動で展開し、非検出対象成分（鋳型ＤＮＡ、プライマー等）と検出対象成分である増幅産物とを分離した状態で蛍光染色によって増幅産物のバンドをその分子量から判断して特定し、そのバンドの蛍光強度を測定することにより行うことができる。しかしながら、この方法に限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いることもできる。
【００４０】
ここで、本発明の海水性二枚貝幼生の検出方法においては、本発明のプライマーセットのうち、ムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、被験試料にムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。また、本発明のプライマーセットのうち、ミドリイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、被験試料にミドリイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。さらに、本発明のプライマーセットのうち、キタノムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、被験試料にキタノムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。また、本発明のプライマーセットのうち、二種のプライマー対を用いることで、これら二種の幼生が存在しているか否かを判定することができる。例えば、本発明のプライマーセットのムラサキイガイ検出用のプライマー対とミドリイガイ検出用のプライマー対の両方を用いてＰＣＲを行うことで、被験試料にムラサキイガイ幼生またはミドリイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。この場合、ムラサキイガイ検出用のプライマー対によって増幅されるＤＮＡ断片の分子量とミドリイガイ検出用のプライマー対によって増幅されるＤＮＡ断片の分子量には差があるので、増幅ＤＮＡ断片の分子量によって、被験試料にムラサキイガイ幼生とミドリイガイ幼生のいずれが含まれているかを判定することもできる。換言すれば、幼生の種がムラサキイガイとミドリイガイのいずれであるかを判定することができる。また、本発明のプライマーセットの全プライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、被験試料にムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生が存在しているか否かを判定することができる。
【００４１】
次に、本発明の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法について説明する。本発明の海水性二枚貝個体数の定量方法は、本発明のプライマーセットの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより海水性二枚貝幼生の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の被験試料中の個体数を定量するようにしている。具体的には、ムラサキイガイ幼生個体数が既知の試料それぞれに対し本発明のプライマーセットのムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりムラサキイガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から、被験試料中のムラサキイガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。または、ミドリイガイ幼生個体数が既知の試料それぞれに対し本発明のプライマーセットのミドリイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりミドリイガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しミドリイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から、被験試料中のミドリイガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。または、キタノムラサキイガイ幼生個体数が既知の試料それぞれに対し本発明のプライマーセットのキタノムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりキタノムラサキイガイ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対しキタノムラサキイガイ検出用のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより得られる被験試料の遺伝子増幅量から、被験試料中のキタノムラサキイガイ幼生個体数の定量を行うようにしている。以下に、リアルタイムＰＣＲを利用した場合の実施形態について、詳細に説明する。
【００４２】
リアルタイムＰＣＲを利用した本発明の幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、本発明のプライマーセットの一組のプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値に基づき、プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより海水性二枚貝幼生の個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在する海水性二枚貝幼生の個体数の定量を行うようにしている。
【００４３】
ここで、リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。この手法を用いることで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。即ち、段階希釈した濃度既知の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡを標準試料としてＰＣＲを行い、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定する。この結果に基づいて、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡ濃度を横軸にプロットし、検量線を作成する。つまり、この検量線が、試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度とＣｔ値との関係を表す。したがって、濃度未知の被験試料のＣｔ値をリアルタイムＰＣＲにより測定することで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度を決定することができる。
【００４４】
リアルタイムＰＣＲは、例えば、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置により行うことができる。また、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、蛍光試薬を用いた蛍光モニター法により行われる。例えば、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光発光する試薬（インターカレータ）をＰＣＲ反応系に添加し、ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）にインターカレータを結合させ、励起光を照射することにより蛍光発光を生じさせて、蛍光強度を検出することによりＤＮＡ増幅量のモニタリングを行う、所謂インターカレータ法を用いることができる。尚、インターカレータ法に限定されるものではなく、ＴａｑＭａｎプローブ法などといった公知または新規の方法を適宜採用することができる。
【００４５】
リアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値とは、蛍光標識されたＰＣＲ産物量が指数関数的なＤＮＡ増幅期の中で一定量となるときの値、即ち、一定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲサイクル数を表している。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、初期には指数関数的に起こり、１次関数的な増幅を経て、最終的にはプラトーに達する。指数関数的なＤＮＡ増幅期における一定ＰＣＲ産物量に達するＰＣＲサイクル数と初期鋳型ＤＮＡ量には高い相関がある。したがって、初期鋳型ＤＮＡ量、つまり、試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度とＣｔ値との相関を調べることで、Ｃｔ値から試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度を推定する為の検量線を作成することができる。また、ＤＮＡの増幅曲線を二回微分して最大値を算出し、この最大値に達するまでのサイクル数、つまり、ＰＣＲ産物量の増幅がバックグラウンド値から指数関数的に変化する時点のサイクル数を検出し、これをＣｔ値とするようにしてもよい。
【００４６】
本発明の定量方法に用いる検量線は、ムラサキイガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、本発明のプライマーセットのうちのムラサキイガイ検出用プライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりムラサキイガイ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成される。また、本発明の定量方法に用いる検量線は、ミドリイガイ幼生個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し、本発明のプライマーセットのうちのミドリイガイ検出用プライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりミドリイガイ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成される。また、本発明の定量方法に用いる検量線は、キタノムラサキイガイ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、本発明のプライマーセットのうちのキタノムラサキイガイ検出用プライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりキタノムラサキイガイ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成される。
【００４７】
試料の処理方法に関しては、上述の通り、例えば試料中の幼生をエタノールに浸漬して固定し、乾燥させることが好適であるが、この方法に限定されるものではない。
【００４８】
試料のＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知の方法あるいは新規の方法を適宜用いることができる。例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）によるシリカゲル膜やＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ（フジフィルム社）による多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出方法、Soil DNA Isolation Kit （NORGEN社）等を用いることが好適であるが、特に、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ（フジフィルム社）による多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出方法を用いることが好適である。この場合には、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、幼生の定量をより正確に実施し易くなる。また、Soil DNA Isolation Kit （NORGEN社）を用いた場合には、サンプル中の泥や砂の影響を抑えてリアルタイムＰＣＲに適したＤＮＡ抽出サンプルを得ることができ、好適である。
【００４９】
ここで、幼生の甲皮が原因で試料のＤＮＡ抽出効率が低下する場合がある。そこで、試料からＤＮＡを抽出する前に、甲皮の破砕処理を行うことが好適である。例えば、乾燥させた試料を入れたエッペンドルフチューブにジルコニアボール（例えば、直径２〜３ｍｍ）を数個（例えば、３〜５個程度）を入れて、強く震盪することで組織を破砕した後、上記のＤＮＡ抽出処理に供することが好適である。この処理を行うことにより、幼生の甲皮（殻）によるＤＮＡ抽出効率の低下等を防いで、幼生個体数の分析精度を確実に高精度なものとすることができる。
【００５０】
尚、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の成長過程は、成体から放出された卵（５０〜６０μｍ）が孵化後にトロコフォア幼生となり、約１日後、ベリジャー幼生となる。そして、数週間でＤ型幼生（１００〜１５０μｍ）となり、さらに１週間ほどで付着期のペディベリジャー幼生（３００μｍ程度）となる。そして、付着変態後に稚貝となる。但し、ベリジャー幼生とＤ型幼生とを一括してベリジャー幼生と呼ぶ場合もある。
【００５１】
このように、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生は、その成長段階により、個体サイズが増加し、その細胞数も増加する。したがって、成長段階に応じて標的となるＣＯＩ遺伝子の１個体当たりのコピー数も増加することとなり、幼生の個体数が同じであっても、リアルタイムＰＣＲの結果示されるＣｔ値が幼生の成長段階で異なってくる。そこで、検量線を作成する際に使用する試料としては、幼生の各個体のＣＯＩ遺伝子コピー数がほぼ一定である試料を用いることが好ましい。この場合には、ＣＯＩ遺伝子コピー数が試料中の幼生個体数を正確に反映するので、幼生個体数に対する正確なＣｔ値を得ることができる。例えば、ペディベリジャー幼生のみが含まれている試料を用いれば、ペディベリジャー幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができるし、Ｄ型幼生のみが含まれている試料を用いれば、Ｄ型幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができる。
【００５２】
尚、幼生個体数が既知の複数の試料は、上記とは別の方法でも得ることができる。即ち、成体試料等から鋳型ＤＮＡを抽出し、これを幼生個体数と同等の遺伝子コピー数となるように段階希釈することによって、幼生個体数が既知の複数の試料を得るようにしてもよい。
【００５３】
ここで、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することが好ましい。この場合には、精度の高い定量分析を実施することが可能となる。上記の通り、ムラサキイガイ幼生及びミドリイガイ幼生は成長段階に応じてその体積が異なるため、例えば、被験試料を篩にかけて、定量分析の対象としている成長段階の幼生のみを通過させて取り出し、これを被験試料とすることで、その成長段階の幼生の個体数を定量分析することができる。このように、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することで、特定の成長段階にあるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生が被験試料中にどの程度存在するのかをより具体的に明らかにすることが可能となる。
【００５４】
以上、本発明の海水性二枚貝幼生の検出方法により、海水域で採集した被験試料に存在しているムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の有無を顕微鏡などで観察することなく分析することが可能となる。したがって、本発明の検出・定量分析方法を実施することで、対象海水域におけるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の存在や繁殖の有無を知ることが可能となり、対象海水域におけるムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の有無を明らかにすることで、被害可能性を予知できると共に、基体等に付着する前の幼生の大量発生段階を予測して、ピンポイントで駆除することが可能になる。また、本発明の幼生個体数の定量方法により、海水域で採集した被験試料に存在しているムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生及びキタノムラサキイガイ幼生の個体数を定量分析することが可能となる。したがって、本発明の定量方法によりこれらの幼生個体数の定量分析を定期的（例えば、３日〜１週間毎）に行うことで、対象海水域でのムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイの付着時期を確実に予測することが可能となり、基体等に付着する前の幼生の大量発生段階を予測して、ピンポイントで駆除することが可能になる。したがって、駆除剤の使用量を抑えてムラサキイガイ、ミドリイガイ及びキタノムラサキイガイの駆除にかかるコストを抑えることができ、駆除剤による海水の汚染も最小限に抑えることが可能となる。
【００５５】
次に、本発明の海水性二枚貝検出用キットについて説明する。
【００５６】
本発明の海水性二枚貝検出用キットは、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むものである。
【００５７】
したがって、配列番号１または２からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとした場合には、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にムラサキイガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。また、配列番号３または４からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとした場合には、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にミドリイガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。さらに配列番号５または６からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方のプライマーをプローブとした場合には、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされたＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にキタノムラサキイガイ幼生が存在するか否かを判定することができる。
【００５８】
本発明のキットの一例として、図７に示すＤＮＡチップが挙げられる。このＤＮＡチップ１は、基板２と、基板２の表面に形成されたスポット３と、スポット３内に固定されたＤＮＡプローブ４により構成される。
【００５９】
基板２としては、ガラス基板、シリコンウエハー、ナイロン膜、セルロース膜等を適宜用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
スポット３には、ＤＮＡプローブ４が等量ずつ固定される。ＤＮＡプローブ４は、配列番号１〜４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つである。
【００６１】
ＤＮＡチップ１を用いて、ムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生またはキタノムラサキイガイ幼生の検出を行う。被検試料はＤＮＡ抽出処理後、ＤＮＡを一本鎖に調製し、蛍光剤や発色剤を添加して１本鎖ＤＮＡを蛍光標識する。そして、これをＤＮＡチップ１のスポット３に滴下し、ＤＮＡプローブ４と結合（ハイブリダイズ）させる。未結合の一本鎖ＤＮＡは洗い流し、スポット３の蛍光強度を検出することにより、蛍光発光が生じたスポットを特定することで、被験試料中のムラサキイガイ幼生、ミドリイガイ幼生またはキタノムラサキイガイ幼生の検出を行うことができる。
【００６２】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００６３】
例えば、上述の実施形態では、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置を用いて幼生個体数の定量分析を行う場合について詳細に説明したが、ＰＣＲ装置やヒートブロックを利用して遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅量をモニタリングすることによって、幼生個体数の定量を行うことも可能である。具体的には、幼生個体数が既知の試料を複数用意し、この試料に一定サイクルでＰＣＲ装置またはヒートブロックを用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅量をモニタリングし、幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、実海域から採集した試料を同条件でＰＣＲして遺伝子増幅量をモニタリングし、検量線を利用して試料中の幼生個体数の定量を行うようにしてもよい。
【００６４】
遺伝子増幅量のモニタリング方法としては、公知あるいは新規の方法を各種用いることができる。例えば、分光光度計によりＰＣＲ後の溶液のＤＮＡ濃度を測定することで遺伝子増幅量をモニタリングするようにしてもよいし、電気泳動や色素によるＤＮＡ染色を利用した定量方法を用いることもできる。ＤＮＡを染色する色素としては、核酸のＡＴに特異性があり、ＤＮＡ量の測定に一般的に使用されている色素であるＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、サイクリングプローブ法を用いてもよく、サイクリングプローブの蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｘはサイクリングプローブの核酸）を用い、消光物質としてEclipseを用いることで、紫外光を照射することにより赤色の強い蛍光強度を得ることができ好ましいが、これに限定されるものではない。また、蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンを用い、消光物質としてEclipseを用いたサイクリングプローブ法のように、可視光領域において強い蛍光発光を生じる場合には、目的とする幼生の増幅ＤＮＡのみを、蛍光物質を励起するための励起光を照射するだけで目視で検出することが可能となるので、幼生の有無およびおおよその量を目視で容易に検出することができる。
【００６５】
また、本発明の定量方法は、上記（１）〜（３）のプライマー対のうち２種のプライマー対を同時に使用してＰＣＲを行うことにより実施するようにしてもよい。例えば、上記（１）と（２）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、電気泳動法を利用して遺伝子増幅の有無をバンドの発現の有無により確認すると共に、バンドの位置から海水性二枚貝幼生の種を検出し、さらに遺伝子増幅量をバンドの濃淡から判断し、予め作成されたバンドの濃淡と幼生個体数との関係を示す検量線から、海水性二枚貝幼生の個体数の定量を行うようにしてもよい。また、本発明の定量方法は、上記（１）〜（３）のプライマー対の全てを同時に使用してＰＣＲを行うことにより実施するようにしてもよい。
【実施例】
【００６６】
以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６７】
（実施例１）
ムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）及びミドリイガイ（Perna viridis）と、これらと比較的近縁であると考えられる二枚貝であるカワヒバリガイ（Limnoperna fortunei)、コウロエンカワヒバリガイ（Xenostrobus securis)及びホトトギスガイ（Musculista senhousia）についてのＣＯＩ遺伝子の塩基配列のデータベース化を行い、このデータベースに基づいてムラサキイガイに特異的な塩基配列並びにミドリイガイに特異的な塩基配列を特定し、プライマーを設計した。データベース化に供した二枚貝は採集直後に９９．５％エタノールに浸漬し４℃で保存した。
【００６８】
データベース化に供した二枚貝は、解剖後、軟体部、可能であれば筋肉組織の小片（２〜３ｍｍ角）を清浄なメスを用いて切り出し、キアゲン社のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出を行った。基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＡＴＬ ｂｕｆｆｅｒ）と２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに２００μＬのバッファー（ＡＬ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２００μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、２ｍＬのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＴｕｂｅにセットしたＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに処理サンプルを供した。このチューブを１分間遠心分離処理して素通り画分を除いた後、Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎのシリカゲル膜フィルターに吸着したＤＮＡをＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１およびＡＷ２で洗浄し、最終的には１００μＬの溶出バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥ）によりＤＮＡを溶出し、回収した。
【００６９】
ＡＥバッファーに溶解したＤＮＡの濃度を分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ Ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社）により測定した結果、５μｇ以上のＤＮＡが得られていることが確認された。ＤＮＡ濃度の測定結果に基づいて、２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度としたＡＥバッファー溶液を調整し、これをＰＣＲの際に鋳型ＤＮＡとして供した。
【００７０】
次に、上記操作により得られた総ＤＮＡを鋳型として、ＣＯＩ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。プライマーには、後生無脊椎生物のＣＯＩ遺伝子に対するプライマーとして文献１で報告されているユニバーサルプライマーを用いた（文献１：Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., Vrijenhoek, R., 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 3, 294-299.）。
【００７１】
配列番号１４及び１５に使用したユニバーサルプライマーの配列を示す。尚、これらのプライマーは合成（インビトロジェン）により得られたものであり、ＰＣＲに供するまで５０ｐｍｏｌ／μＬのストック溶液（シグマジェノシス製）中に−２０℃で保存した。使用前にストック溶液を純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）で５倍希釈し１０ｐｍｏｌ／μＬとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは、上記の操作により抽出した総ＤＮＡを鋳型とし、アドバンテージ２（クローンテック）を用いて行った。なお、鋳型ＤＮＡは２０ｎｇ／μＬに調製した溶液を２μＬ（４０ｎｇ）、反応にはタカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）を用い、反応液の調製はそれぞれのアドバンテージ２に添付された方法に従った。具体的には、滅菌水１４．２０μＬ、１０ｘＰＣＲ ＳＡバッファー（１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、５０×ｄＮＴＰ混合物０．４０μＬ、５０×ポリメラーゼ ｍｉｘ０．４０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。なお、アドバンテージ２においては、添付された２種類の反応バッファーのうち良好な結果が得られたＳＡバッファーを使用した。
【００７２】
まず、グラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の推定を行った。グラジエントＰＣＲでのアニーリング温度は、４５．０℃〜６５．０℃の１２段階に設定した。９５℃（アドバンテージ２）で１分間保ったあと、熱変性９５℃（アドバンテージ２）３０秒間、各温度でのアニーリング３０秒間、伸長反応６８℃（アドバンテージ２）３０秒間という反応を３０サイクル繰り返す条件で行った。反応産物はサイズマーカーとともに２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により特定領域の増幅の有無を確認した。
【００７３】
その結果、ＣＯＩ遺伝子のＰＣＲにおいては、クローンテックのアドバンテージ２を用いた場合は５４℃が最適であったが、４５．０℃〜６５．０℃のアニーリング温度範囲であれば、安定してＰＣＲすることが可能であった。なお、増幅されたＤＮＡ断片は本来は７０９ｂｐ程度の長さであるが、配列を正確に確認できたのは、いずれの二枚貝においても約５０５〜５８５ｂｐの長さであった。
【００７４】
アガロース電気泳動にて増幅を確認したＰＣＲ産物からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、その一部を塩基配列決定に供した。ＰＣＲ産物に９９．５％エタノール５０μＬ、３Ｍの酢酸ナトリウム（和光純薬製）２μＬ、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（和光純薬製）２μＬを加え、撹拌混合して１５分間室温で静置した後、１３８００ｇで２０分間遠心分離処理した。沈澱はさらに７０μＬの７０％エタノールで洗浄し、得られた沈澱を乾燥後、６μＬの純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）に溶解した。回収されたＰＣＲ産物（鋳型ＤＮＡ）１μＬと配列番号３と４に記載された塩基配列からなるプライマーを用い、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）により、サイクルシーケンス反応を行った。反応は、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を２５サイクル行い、終了後、再度エタノール沈澱を行った。得られた乾燥標品にＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）２０μＬを加え、９５℃で２分間の反応後、サンプルをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０に供してシーケンシングを行った。また、塩基配列のデータはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて解析した。
【００７５】
各種二枚貝を鋳型とし、配列番号１４及び１５に記載された塩基配列からなるユニバーサルプライマーを用いて得られたＣＯＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングの結果について、塩基配列を配列表の配列番号７〜１１に示す。配列番号７がムラサキイガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号８がミドリイガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号９がカワヒバリガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号１０がコウロエンカワヒバリガイのＣＯＩ領域の塩基配列であり、配列番号１１がホトトギスガイのＣＯＩ領域の塩基配列である。尚、解析領域は、得られたＤＮＡ断片のうち、全てのサンプルで塩基配列が決定できた領域である５０５〜５８５ｂｐの範囲とした。また、配列表の配列番号７〜１１に示す塩基配列は、それぞれの種において最も出現頻度の高かった塩基配列である。但し、コウロエンカワヒバリガイについては、配列番号１０に記載された塩基配列と１９塩基だけ異なる塩基配列が同等に検出された。この塩基配列を配列表の配列番号１２に示す。具体的には、２４番目、５４番目、８１番目、１０３番目、１７７番目、２１０番目、２４９番目、２５０番目、２５２番目、３３３番目、３５１番目、３８１番目、４０５番目、４５６番目、５１６番目、５４１番目、５５９番目、５８１番目及び５８４番目の１９箇所の塩基が配列番号１０に記載の塩基配列とは異なっていた。
【００７６】
また、上記と同様の方法で、キタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）についてもＣＯＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングを行い、配列番号１３に示す塩基配列を得た。
【００７７】
次に、配列表の配列番号７〜１１の塩基配列に基づいて、種間で変位の大きい領域に基づき、ムラサキイガイについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる９８ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。ムラサキイガイ検出用プライマーの塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示す。
【００７８】
また、配列表の配列番号７〜１１の塩基配列に基づいて、種間で変位の大きい領域に基づき、ミドリイガイについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる９８ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。ミドリイガイ検出用プライマーの塩基配列を配列表の配列番号３及び４に示す。
【００７９】
さらに、配列表の配列番号７〜１１、１３の塩基配列に基づいて、種間で変位の大きい領域に基づき、キタノムラサキイガイについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できる１５５ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。キタノムラサキイガイ検出用プライマーの塩基配列を配列表の配列番号５及び６に示す。
【００８０】
配列番号１〜６のプライマーは合成（インビトロジェン）し、以下の実験に供した。
【００８１】
配列番号１及び２のムラサキイガイ検出用プライマー対について、上記方法により得られたミドリイガイ成体、カワヒバリガイ成体、コウロエンカワヒバリガイ成体及びホトトギスガイ成体、さらにはキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）成体、クジャクガイ（Septifer bilocularis）成体、クログチ（Xenostrobus atratus）成体、ヒバリガイモドキ（Hormomya mutabilis）成体、ムラサキインコガイ（Septifer virgatus）成体、アサリ成体、混合プランクトン、タイワンシジミ（Corbicula fluminea）成体、ヤマトシジミ（Corbicula japonica）成体及びカキ成体の鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、配列番号１及び２のムラサキイガイ検出用プライマー対の有効性とＰＣＲの最適条件について検討した。
【００８２】
ＰＣＲは基本的には上述の方法に従い、タカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）のグラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の検討を行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動（３％アガロース）後にＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により検出した。ＰＣＲにおけるサイクル数は３０サイクルとした。電気泳動写真を図１Ａ及び図１Ｂに示す。尚、図１Ａにおいて、ａがムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｂがキタノムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｃがカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｄがコウロエンカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｅがミドリイガイの電気泳動結果であり、ｆがホトトギスガイの電気泳動結果であり、ｇがクジャクガイの電気泳動結果であり、ｈがクログチの電気泳動結果であり、ｉがヒバリガイモドキの電気泳動結果であり、ｊがムラサキインコガイの電気泳動結果であり、ｋがアサリの電気泳動結果であり、ｌが混合プランクトンの電気泳動結果である。また、図１Ｂにおいて、ａがムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｍがタイワンシジミの電気泳動結果であり、ｎがヤマトシジミの電気泳動結果であり、ｏがカキの電気泳動結果である。
【００８３】
アニーリング温度の検討を行った結果、６０℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行うこととした。ＰＣＲの結果、ムラサキイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した場合、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号１及び２のムラサキイガイ検出用プライマーにより増幅した９８ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、ムラサキイガイ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【００８４】
以上の結果から、配列番号１及び２のムラサキイガイ検出用プライマー対は、ムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅することが判明した。
【００８５】
また、上記と同様の実験を配列番号３及び４のミドリイガイ検出用プライマー対を用いて実施した。電気泳動写真を図２Ａ及び図２Ｂに示す。尚、図２Ａにおいて、ａがミドリイガイの電気泳動結果であり、ｂがムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｃがキタノムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｄがカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｅがコウロエンカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｆがホトトギスガイの電気泳動結果であり、ｇがクジャクガイの電気泳動結果であり、ｈがクログチの電気泳動結果であり、ｉがヒバリガイモドキの電気泳動結果であり、ｊがムラサキインコガイの電気泳動結果であり、ｋがアサリの電気泳動結果であり、ｌが混合プランクトンの電気泳動結果である。また、図２Ｂにおいて、ａがミドリイガイの電気泳動結果であり、ｍがタイワンシジミの電気泳動結果であり、ｎがヤマトシジミの電気泳動結果であり、ｏがカキの電気泳動結果である。
【００８６】
アニーリング温度の検討を行った結果、６０℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行うこととした。ＰＣＲの結果、ミドリイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した場合、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号３及び４のミドリイガイ検出用プライマーにより増幅した１４９ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、ミドリイガイ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【００８７】
以上の結果から、配列番号３及び４のミドリイガイ検出用プライマー対は、ミドリイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅することが判明した。
【００８８】
さらに、上記と同様の実験を配列番号５及び６のキタノムラサキイガイ検出用プライマー対を用いて実施した。電気泳動写真を図８Ａ及び図８Ｂに示す。尚、図８Ａにおいて、ａがキタノムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｂがムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｃがカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｄがコウロエンカワヒバリガイの電気泳動結果であり、ｅがミドリイガイの電気泳動結果であり、ｆがホトトギスガイの電気泳動結果であり、ｇがクジャクガイの電気泳動結果であり、ｈがクログチの電気泳動結果であり、ｉがヒバリガイモドキの電気泳動結果であり、ｊがムラサキインコガイの電気泳動結果であり、ｋがアサリの電気泳動結果である。また、図８Ｂにおいて、ａがキタノムラサキイガイの電気泳動結果であり、ｌがタイワンシジミの電気泳動結果であり、ｍがヤマトシジミの電気泳動結果であり、ｎがカキの電気泳動結果であり、ｏが東京湾プランクトンの電気泳動結果であり、ｐが志津川湾プランクトンの電気泳動結果である。
【００８９】
アニーリング温度の検討を行った結果、６０℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行うこととした。ＰＣＲの結果、キタノムラサキイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した場合、シングルバンドが確認できた。これは、配列番号５及び６のキタノムラサキイガイ検出用プライマーにより増幅した１５５ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。これに対し、キタノムラサキイガイ成体以外から調製したＤＮＡを鋳型とした場合には、バンドは一切確認できなかった。
【００９０】
以上の結果から、配列番号５及び６のキタノムラサキイガイ検出用プライマー対は、キタノムラサキイガイのミトコンドリアＤＮＡ上のＣＯＩ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅することが判明した。
【００９１】
（実施例２）
本発明のプライマーを用いた定量分析について検討した。
【００９２】
ムラサキイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．０２〜２ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号１及び２のムラサキイガイ検出用プライマーを用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。電気泳動写真を図３に示す。図３に示されるように、０．０２〜２ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるムラサキイガイ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、ムラサキイガイ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【００９３】
次に、ミドリイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．０２〜２ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号３及び４のミドリイガイ検出用プライマーを用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。電気泳動写真を図４に示す。図４に示されるように、０．０２〜２ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるミドリイガイ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、ミドリイガイ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【００９４】
次に、キタノムラサキイガイ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号５及び６のキタノムラサキイガイ検出用プライマーを用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲのサイクル数は２５サイクルとした。電気泳動写真を図９に示す。図９に示されるように、０．２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるキタノムラサキイガイ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、キタノムラサキイガイ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【００９５】
（実施例３）
ムラサキイガイ幼生から総ＤＮＡを抽出するための条件と定量分析について検討を行った。
【００９６】
２００９年７月２４日に宮城県志津川湾で採集したムラサキイガイ成体から幼生を取り出し、幼生を得たのちに珪藻を与えながら飼育しＤ型幼生（殻長約１０６μｍ）から塩分を十分に洗い流した後、９９．５％エタノールを十分に加えてエタノールに固定し、４℃で保存した。
【００９７】
ＤＮＡ抽出処理は、Ｄ型幼生を０、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００個体含むエッペンドルフチューブ（すべてエタノールを乾燥させたもの）をそれぞれ３個ずつ用意して行った。
【００９８】
フジフィルム社のＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔＳによる多孔質メンブレンを利用したＤＮＡ抽出を行った。基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＭＤＴ）と２０μＬのＥＤＴとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに１８０μＬのバッファー（ＬＤＴ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２４０μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅＭｉｎｉ８０のカートリッジに全量処理サンプルを供した。このカートリッジに添加後に、加圧処理と７５０μＬのＷＤＴを加える操作を３回繰り返した（洗浄処理）。洗浄後、フィルターに吸着したＤＮＡを１００μＬの溶出バッファー（ＣＤＴ）によりＤＮＡを溶出し、回収した。
【００９９】
ＤＮＡ抽出処理後の試料をリアルタイムＰＣＲによる定量的解析に供して、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定することにより、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを評価した。リアルタイムＰＣＲによる定量的解析は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたインターカレータ法により行った。
【０１００】
反応液は、純水９．５μＬ、配列番号１に記載のプライマー（１０μＭ）、配列番号２に記載のプライマー（１０μＭ）それぞれ０．５μＬ（最終濃度０．２μＭ）、鋳型ＤＮＡを２μＬ、そしてＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ｘ２）を１２．５μＬを混合して調製した。
【０１０１】
装置はＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｉｅｄ社）を使用して、９５℃で初期変性した後、９５℃を５秒、６０℃を３０秒のＰＣＲを４０サイクル繰り返し、最後に融解曲線確認のための反応（６０℃−９５℃）を実施した。そして反応後、各試料のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定した。
【０１０２】
その結果、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合の試料間のＣｔ値ばらつきがＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出処理を行った場合のＣｔ値ばらつきよりも少ないことが明らかとなった。
【０１０３】
したがって、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出処理でも同様の定量化が可能であるが、フジフィルム社のQuickGene DNA tissue Ｋｉｔ Sを採用することがＣｔ値ばらつきを抑える上で好適であることがわかった。また、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加した後のインキュベート時間を１時間として処理時間の低減を図れることがわかった。
【０１０４】
また、Ｄ型幼生をエッペンドルフチューブに収容し、乾燥後、ジルコニアボール（直径２ｍｍまたは３ｍｍ）を数個（３〜５個）加えて、強く震盪することで幼生を破砕し、その後、上記のＤＮＡ抽出をしたところ、試料間のＣｔ値ばらつきをさらに抑えて、定量の再現性及び精度を向上できることが明らかとなった。この破砕処理を行うことで、Ｄ型幼生の甲皮の堅さに起因するＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、定量の再現性及び精度を向上できることが明らかとなった。また、この破砕処理は多量の他種動物プランクトンを含む採集サンプルの場合にはさらに効率よくＤ型幼生のＤＮＡを抽出できることもわかった。
【０１０５】
また、融解曲線を確認した結果、温度ピークがすべて単一であった。したがって、目的の増幅産物（９８ｂｐのＤＮＡ断片）のみが得られ、その定量が行われたことが明らかとなった。
【０１０６】
尚、他のインビトロジェン社のＥａｓｙ−ＤＮＡキットやインビトロジェン社のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔのＤＮＡ抽出処理を行った場合には、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合と比較して試料間のＣｔ値ばらつきが若干大きくなったものの、これらのＤＮＡ抽出方法を否定するものではなく、試料のすり潰し操作や、ＤＮＡ沈殿の回収操作の試料間ばらつきを抑えることで、また、上記の破砕処理をＤＮＡ抽出処理前に実施することで、上記のＤＮＡ抽出処理を行った場合と同程度のＣｔ値ばらつきを達成することができると考えられる。
【０１０７】
次に、リアルタイムＰＣＲによる定量性について評価した。前述の操作で最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、実施例２に示したリアルタイムＰＣＲに供した。即ち、１、２、５、１０、２０、５０、１００及び２００個体の幼生から抽出されたＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＰＣＲのそれぞれの反応液には最終的には、０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４、１．０、２．０及び４．０個体相当の幼生が含まれることになる。
【０１０８】
ムラサキイガイ幼生を試料とした場合のリアルタイムＰＣＲの結果を図５に示す。Ｃｔ値は異なる３バッチのサンプルから得られた鋳型ＤＮＡを用いた３回の実験の平均値を示している。リアルタイムＰＣＲに供した反応液の幼生個体数は最終的には０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４、１．０、２．０及び４．０個体相当と非常に少なかったにも関わらず、幼生個体数の対数とＣｔ値との間に高い相関性が認められることが確認された。即ち、Ｄ型幼生がＤＮＡ抽出液１００μＬ中に１個体以上存在すれば、本発明のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、高い定量性をもって幼生の個体数の分析が可能であることがわかった。つまり、Ｄ型幼生の個体数が未知のサンプルにおいても、リアルタイムＰＣＲを実施し、そのＣｔ値を測定することで、正確な幼生個体数の推定ができると考えられた。
【０１０９】
次に、ミドリイガイの場合について検討した。２００８年１２月１６日に東京湾で採集したミドリイガイの成体を十分に洗い流した後、９９．５％エタノールを十分に加えてエタノールに固定し、４℃で保存した。この試料にＤＮＡ抽出処理を施し、配列番号３及び４のプライマー対を用いた以外は上記と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行い、ＤＮＡ量とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との相関について検討した。結果を図６に示す。図６に示されるように、ＤＮＡ量とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との間には相関が見られ、試料のＣｔ値からＤＮＡ量を推定できることが明らかとなった。ここで、各成長段階における幼生の遺伝子コピー数は既知であることから、試料のＣｔ値から推定されるＤＮＡ量から、幼生個体数の定量を行うことが可能である。
【０１１０】
次に、キタノムラサキイガイの場合について検討した。２００９年５月１０日に宮城県志津川湾で採集したキタノムラサキイガイの成体を十分に洗い流した後、９９．５％エタノールを十分に加えてエタノールに固定し、４℃で保存した。この試料にＤＮＡ抽出処理を施し、配列番号５及び６のプライマー対を用いた以外は上記と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行い、ＤＮＡ量とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との相関について検討した。結果を図１０に示す。図１０に示されるように、ＤＮＡ量とリアルタイムＰＣＲのＣｔ値との間には相関が見られ、試料のＣｔ値からＤＮＡ量を推定できることが明らかとなった。ここで、各成長段階における幼生の遺伝子コピー数は既知であることから、試料のＣｔ値から推定されるＤＮＡ量から、幼生個体数の定量を行うことが可能である。
【符号の説明】
【０１１１】
１ ＤＮＡチップ
４ ＤＮＡプローブ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むことを特徴とする海水性二枚貝検出用プライマーセット。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【請求項２】
被験試料に対し、下記（１）〜（３）のうち一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅の有無により前記プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生が前記被験試料に存在しているか否かを検出することを特徴とする海水性二枚貝幼生の検出方法。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【請求項３】
被験試料に対し、下記（１）〜（３）のうち一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、前記プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し前記プライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより前記海水性二枚貝幼生の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、前記プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の前記被験試料中の個体数を定量することを特徴とする海水性二枚貝幼生個体数の定量方法。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【請求項４】
前記ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲであり、前記遺伝子増幅量として前記リアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値を利用することを特徴とする請求項３記載の海水性二枚貝個体数の定量方法。
【請求項５】
前記被験試料を分画処理してから前記ＰＣＲに供する請求項３または４に記載の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法。
【請求項６】
配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含む海水性二枚貝検出用キット。
【請求項１】
下記（１）〜（３）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むことを特徴とする海水性二枚貝検出用プライマーセット。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【請求項２】
被験試料に対し、下記（１）〜（３）のうち一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅の有無により前記プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生が前記被験試料に存在しているか否かを検出することを特徴とする海水性二枚貝幼生の検出方法。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【請求項３】
被験試料に対し、下記（１）〜（３）のうち一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、前記プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し前記プライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより前記海水性二枚貝幼生の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、前記プライマー対に対応する種の海水性二枚貝幼生の前記被験試料中の個体数を定量することを特徴とする海水性二枚貝幼生個体数の定量方法。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むミドリイガイ（Perna viridis）検出用プライマー対
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むキタノムラサキイガイ（Mytilus trossulus）検出用プライマー対
【請求項４】
前記ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲであり、前記遺伝子増幅量として前記リアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値を利用することを特徴とする請求項３記載の海水性二枚貝個体数の定量方法。
【請求項５】
前記被験試料を分画処理してから前記ＰＣＲに供する請求項３または４に記載の海水性二枚貝幼生個体数の定量方法。
【請求項６】
配列番号１〜６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含む海水性二枚貝検出用キット。
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−９７９２２（Ｐ２０１１−９７９２２Ａ）
【公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０８７８０（Ｐ２０１０−２０８７８０）
【出願日】平成２２年９月１７日（２０１０．９．１７）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１７日（２０１０．９．１７）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
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