液体クロマトグラフィー装置
【課題】目的成分の濃縮率をさらに高めた液体クロマトグラフィー装置を提供すること。
【解決手段】第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、前記成分を検出する第一の検出手段と、前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、第二の分析カラムがミクロカラムもしくはナノカラムであり、第二の検出手段の検出器セルがミクロセルもしくはナノセルであることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置。
【解決手段】第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、前記成分を検出する第一の検出手段と、前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、第二の分析カラムがミクロカラムもしくはナノカラムであり、第二の検出手段の検出器セルがミクロセルもしくはナノセルであることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数の成分を含む試料中の成分を第一の分析カラムにより分離し、前記成分を第一の紫外光検出器により検出し、前記成分をトラップカラムに捕捉して濃縮し、これを第二の分析カラムに送り出して分離し、第二の紫外光検出器により検出する液体クロマトグラフィー装置が知られており（例えば特許文献１および２参照。）、このような液体クロマトグラフィー装置を用いることにより、試料中の成分を容易に濃縮することができる。
【０００３】
一方で、医薬、農薬等の開発においては、極めて微量の成分の構造を同定することが必要とされる場合も多く、試料中の成分の濃縮率をさらに高め、構造の同定をより容易にすることが望まれていた。
【０００４】
【特許文献１】特許第２８９２７９５号公報
【特許文献２】国際公開第９９／６１９０５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況のもと、本発明者らは、成分の濃縮率をさらに高めた液体クロマトグラフィー装置を開発すべく検討したところ、第二の分析カラムとして、ミクロカラムもしくはナノカラムを用いるとともに、第二の検出手段の検出器セルとして、ミクロセルもしくはナノセルを用いることにより、目的成分の濃縮率をさらに高めることができることを見出し、本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、
前記成分を検出する第一の検出手段と、
前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、
前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、
第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、
前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、
第二の分析カラムがミクロカラムもしくはナノカラムであり、第二の検出手段の検出器セルがミクロセルもしくはナノセルであることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の液体クロマトグラフィー装置によれば、試料中の目的成分の濃縮率をさらに高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、図面を参照しながら、本発明を詳細に説明する。図１に、本発明の液体クロマトグラフィー装置の一つの実施態様を示した。図１に示した液体クロマトグラフィー装置は、一つのトラップカラムを備え、第二の分析カラムがミクロカラムで、かつ、第二の検出手段の検出器セルがミクロセルである液体クロマトグラフィー装置である。
【０００９】
送液ポンプ２ａおよび２ｂは、有機溶媒、水等の移動相として使用され得る溶媒を送液可能なものであればよい。かかる送液ポンプは、流量を任意に設定することができるものが好ましい。
【００１０】
送液ポンプ２ａの上流側に、流路Ｌ１により切替えバルブ１０が接続されており、切替えバルブ１０と第一の移動相を構成する有機溶媒４ａとは、流路Ｌ２で接続されている。流路Ｌ２の途中にはオンラインデガッサ８が設けられている。オンラインデガッサ８は、流路内を流れる有機溶媒４ａおよび希釈液６ａ中への気泡の噛み込みを防止する機能を有するものであり、安定した送液状態を保つ点で設けておくことが好ましい。また、切替えバルブ１０には、希釈液６ａとの流路Ｌ３が接続されている。切替えバルブ１０を切替えることにより、流路Ｌ１と流路Ｌ２とを接続したり、流路Ｌ１と流路Ｌ３とを接続したりするようになっている。
【００１１】
同様に、送液ポンプ２ｂの上流側には、流路Ｌ４により切替えバルブ１０が接続され、切替えバルブ１０と第一の移動相を構成する水４ｂとが流路Ｌ５で、切替えバルブ１０と搬送液６ｂとが流路Ｌ６でそれぞれ接続されている。さらに、流路Ｌ５およびＬ６の途中に、オンラインデガッサ８が設けられている。切替えバルブ１０を切替えることにより、流路Ｌ４とＬ５とを接続したり、流路Ｌ４とＬ６とを接続したりするようになっている。なお、図１に示す実施態様では、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａと希釈液６ａとを、切替えバルブ１０を介して、送液ポンプ２ａにより送液するようになっているが、切替えバルブ１０を介することなく、それぞれを送液する送液ポンプを設けてもよい。また、第一の移動相を構成する水４ｂと搬送液６ｂについても、同様に、切替えバルブ１０を介することなく、それぞれを送液する送液ポンプを設けてもよい。
【００１２】
希釈液６ａは、後述する分取部２５ａ〜２５ｅから押し出された成分を希釈しながらトラップカラム３０へ送り出す液であり、搬送液６ｂは、後述する分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分をトラップカラム３０に押し出す液であり、それぞれ同じ溶媒であってもよいし、異なる溶媒であってもよく、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂ、成分等に応じて、トラップカラム３０への成分の吸着効率を高めるような溶媒を選択することが好ましい。また、かかる希釈液６ａおよび搬送液６ｂとしては、不揮発性塩等の緩衝剤を含まない水もしくは水溶液も使用することができる。緩衝剤を含む第一の移動相を用いた場合に、かかる緩衝剤を含まない搬送液を用いることにより、成分をトラップカラムへ捕捉・濃縮させる際に、脱塩処理を行うことができる。
【００１３】
送液ポンプ２ａおよび２ｂの下流側の流路Ｌ７およびＬ８は、切替えバルブ１２を介して両流路を流れる液を混合するミキサ１４に接続されており、ミキサ１４で混合された溶液の流路が、試料注入部であるオートサンプラ１６を介して第一の分析カラム１８に接続されている。
【００１４】
送液ポンプ２ａおよび２ｂの流量は、試料、第一の分析カラム等に応じて適宜選択すればよく、それぞれの送液ポンプの流量は一定であってもよいし、それぞれ独立に、経時的に変化させてもよい。なお、図１に示した実施態様では、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａと水４ｂとを２つの送液ポンプで送液し、ミキサ１４で混合し、所定の組成の第一の移動相を調製し、第一の分析カラム１８に送液するようにしているが、あらかじめ有機溶媒４ａと水４ｂを所定の割合で混合しておき、一つの送液ポンプにより送液するようにしてもよい。また、第一の移動相の組成も、有機溶媒と水との混合溶液に限らず、単独の有機溶媒としてもよいし、異なる二種の有機溶媒の混合溶液としてもよく、試料やその成分、分析カラム等に応じて適宜選択すればよい。また、試料中の成分の分離をよくするため、不揮発性塩等の緩衝剤が溶解した緩衝溶液等を第一の移動相を構成する溶媒として用いてもよい。
【００１５】
本発明において、試料とは、濃縮したい成分を含むものであればよく、あらゆる形態の試料を意味し、試料成分自体、試料成分含有製剤等を溶液にしたものの他、例えば、血液、血漿、尿等を媒体とした試料成分等も挙げることができる。
【００１６】
第一の分析カラム１８としては、順相カラム、逆相カラム、イオン交換カラム、アフィニティカラム、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム等種々のカラムが使用でき、分離しようとする試料中の成分に応じて、適宜選択すればよい。かかる分析カラムの内径や長さも特に制限されない。
【００１７】
第一の分析カラム１８の下流側には、第一の検出手段である紫外光検出器２０が接続され、第一の分析カラム１８で分離された試料中の成分が紫外光検出器２０で検出されるようになっている。第一の分析カラム１８で分離された成分の、紫外領域の特定の波長における吸光スペクトルが取得できる。検出された吸光スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
【００１８】
図１に示した液体クロマトグラフィー装置では、第一の検出手段として、紫外光検出器が用いられているが、例えばＰＤＡ検出器、赤外検出器、放射性同位体検出器、蛍光検出器等を用いてもよい。
【００１９】
紫外光検出器２０には、切替えバルブ２２を介して、分画用流路２４が接続されている。分画用流路２４は、２つの分配バルブ２６ａおよび２６ｂとの間に分取部を有した流路を複数、並列に備え、切替えバルブ２２と、流路Ｌ９およびＬ１０により接続されており、第一の分析カラム１８で分離された成分が、分配バルブの分配操作により分画され、分画された成分が移動相とともに、分取部２５ａ〜２５ｅに保持されるようになっている。切替えバルブ２２には、ドレインへつながる流路Ｌ２２も接続されている。図１では、分取部は５つ設けられているが、その数は制限されない。
【００２０】
切替えバルブ１２と切替えバルブ２２との間には２つの流路Ｌ１１およびＬ１２が接続されており、一方の流路Ｌ１１は、途中で分岐してトラップ用流路に接続されている。トラップ用流路は、前記分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめる流路であり、一つのトラップカラム３０が設けられている。トラップカラム３０は、切替えバルブ２８と、流路Ｌ１６およびＬ１７でそれぞれ接続されている。前記流路Ｌ１１から分岐した流路Ｌ１３は切替えバルブ２８に接続されており、該切替えバルブ２８には、トラップカラム３０に捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラム３２と第二の分析カラム３２で分離された成分を検出する第二の検出手段である紫外光検出器３３が設けられている。
【００２１】
トラップカラム３０としては、通常その内径が、前記第一の分析カラム１８の内径よりも小さいカラムが用いられ、第一の分析カラム１８の内径にもよるが、通常０．０３〜６ｍｍの内径のカラムが使用される。また、トラップカラム３０としては、例えば筒状部材内に充填剤を充填した充填型カラム、モノリス型カラム等を用いることができる。充填型カラムをトラップカラムとして用いる場合には、トラップカラム内の圧力を小さくするという点で、その粒径が１０〜６０μｍである充填剤が充填された充填型カラムを用いることが好ましい。また、トラップカラム３０の長さは特に制限されないが、通常は１０〜１００ｍｍ程度である。
【００２２】
図１に示した実施態様では、第二の分析カラム３２として、内径０．１〜０．３ｍｍ程度のミクロカラムが用いられているが、かかる第二の分析カラムとしては、内径０．０３〜０．１ｍｍ程度のナノカラムを用いてもよい。第二の分析カラム３２の長さは、通常１０〜３０ｃｍである。
【００２３】
トラップカラム３０から溶出した成分が、第二の検出手段である紫外光検出器（ミクロセル）３３で検出され、該成分の、紫外領域の特定波長における吸光スペクトルが取得できる。検出された吸光スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
【００２４】
図１に示した実施態様では、かかる紫外光検出器３３を構成する検出器セルは、内容量が２０ｎＬ〜２μＬのミクロセルであるが、検出器セルとして、内容量が、１ｎＬ〜２０ｎＬのナノセルを用いてもよい。先に述べた第二の分析カラムとしてミクロカラムもしくはナノカラムを用い、かつ、第二の検出手段の検出器セルとしてミクロセルもしくはナノセルを用いることにより、目的成分の濃縮率をさらに高めることができる。
【００２５】
切替えバルブ２８には、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂを供給するための送液ポンプ３６ａおよび３６ｂが、ミキサ４０を介して接続されている。有機溶媒３８ａおよび水３８ｂと送液ポンプ３６ａおよび３６ｂとを接続する流路には、オンラインデガッサ３９が設けられている。また、切替えバルブ２８には、ドレインへの排出流路が接続されている。
【００２６】
第二の移動相は、トラップカラム３０からの成分の溶出をより容易にするため、成分やトラップカラム３０に応じて適宜決めればよい。また、第二の移動相は、トラップカラム３０に捕捉・濃縮された成分を溶出させるものであるため、成分の分離をよくするための不揮発性塩等の緩衝剤等を用いなくてもよい。
【００２７】
第一の分析カラム１８およびトラップカラム３０は、カラムオーブン４１中に設けられており、略一定の温度に保持されている。図１に示した実施態様では、第一の分析カラム１８およびトラップカラム３０が一つのカラムオーブンに設けられているが、それぞれのカラムごとにカラムオーブンを設けてもよい。また、第二の分析カラム３２も、前記カラムオーブン４１もしくは図示しない別のカラムオーブン中に設けられ、略一定の温度に保持されている。
【００２８】
続いて、本発明の一実施態様である液体クロマトグラフィー装置の動作について説明する。図１は、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図２は、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程が行われている状態を示しており、図１と同様に、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図３は、トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の第二の分析カラムによる分離工程が行われている状態を示しており、図１および２と同様に、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。
【００２９】
まず、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態について、図１に基づいて説明する。
【００３０】
＜試料中の成分の分離工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ２とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ５とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂが起動されると、有機溶媒４ａおよび水４ｂがそれぞれ送液ポンプ２ａおよび２ｂにより送液され、それぞれ流路Ｌ７およびＬ８を通り、切替えバルブ１２を経てミキサ１４で混合され、第一の移動相となり、オートサンプラ１６を経て第一の分析カラム１８に送液される。試料をオートサンプラ１６により注入すると、注入された試料は第一の移動相により第一の分析カラム１８に導かれ、試料中の成分が、第一の分析カラム１８で分離される。
【００３１】
＜分離された成分の分画工程＞
分離された成分は第一の分析カラム１８から溶出していき、紫外光検出器２０で検出され、切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ９を通り、分画用流路２４へ流れる。紫外光検出器２０で成分が検出されると、その検出信号に応じて分配バルブ２６ａおよび２６ｂとが働き、分画用流路２４内の分取部２５ａ〜２５ｅのうちのいずれかが選択され、分離された成分を分画し、選択された分取部に分画された成分が第一の移動相とともに保持される。紫外光検出器２０で検出されたスペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。図１では、分取部２５ｅが選択され、成分が分取部２５ｅに分画されている。紫外光検出器２０で成分が検出される毎に分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、分画用流路２４内のいずれかの分取部が選択され、分離された成分毎に分画動作が行われ、分画された成分が第一の移動相とともに選択された分取部に保持される。第一の分析カラム１８から流出する第一の移動相により分画用流路２４の分取部に保持されなかったものは、分配バルブ２６ｂ、流路Ｌ１０、切替えバルブ２２、流路Ｌ２２を経て、ドレインから排出される。
【００３２】
一方で、送液ポンプ３６ａおよび３６ｂも起動され、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂがそれぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となり、切替えバルブ２８を経て、トラップカラム３０に送液され、コンディショニングが行われるようになっている。
【００３３】
次に、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程が行われている状態について、図２に基づいて説明する。
【００３４】
＜成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ３とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ６とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂにより希釈液６ａおよび搬送液６ｂが送液され、搬送液６ｂは、流路Ｌ６、Ｌ４およびＬ８を通り、切替えバルブ１２、流路Ｌ１２、さらに切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ１０へ導かれる。分配バルブ２６ａおよび２６ｂが操作され、分画された成分が保持された分取部のうちの一つが選択され、搬送液６ｂが、分配バルブ２６ｂから選択された分取部を通り、前記分取部に保持されていた成分と第一の移動相とともに、分配バルブ２６ａ、流路Ｌ９、切替えバルブ２２、流路Ｌ１１、流路Ｌ１３、切替えバルブ２８、流路Ｌ１６を通り、トラップカラム３０へ導かれる。一方、希釈液６ａは、流路Ｌ３、Ｌ１およびＬ７を通り、切替えバルブ１２を経て、流路Ｌ１１を通り、前記選択された分取部に保持されていた成分、第一の移動相および搬送液６ｂの流れと合流し、トラップカラム３０へ導かれる。トラップカラム３０に導かれた成分は、トラップカラム３０に捕捉され、濃縮される。トラップカラム３０を経た第一の移動相と希釈液６ａと搬送液６ｂは、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８を経てドレインから排出される。
【００３５】
続いて、トラップカラムに捕捉・濃縮された成分の第二の分析カラムによる分離工程が行われている状態について図３に基づいて説明する。
【００３６】
＜トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の第二の分析カラムによる分離工程＞
第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂが、オンラインデガッサ３９を経て、気泡が除去された状態で、それぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となって、切替えバルブ２８を経て、流路Ｌ１６を通り、トラップカラム３０に導かれる。トラップカラム３０にすでに捕捉され濃縮された成分は、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８を経て、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２へ導かれ、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器である紫外光検出器（ミクロセル）３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
【００３７】
なお、図１〜図３では、分画用流路２４内の分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分を、希釈液６ａおよび搬送液６ｂで希釈し、押し出しながらトラップカラム３０へ導くようにしているが、分画された成分を、搬送液６ｂとともに分取部２５ａ〜２５ｅに保持するようにしてもよい。
【００３８】
続いて、本発明の別の実施態様である液体クロマトグラフィー装置の動作について、図４〜図６に基づいて説明する。図４〜図６に示す液体クロマトグラフィー装置は、トラップカラムが２つ並列に設けられるとともに、流路切替え機構が設けられた液体クロマトグラフィー装置である。図１に示した液体クロマトグラフィー装置では、一つのトラップカラムで、成分の捕捉・濃縮動作と成分の溶出動作が交互に行われるため、溶出しきれず、トラップカラム内に成分が残存した場合には、次に捕捉・濃縮しようとする成分と混ざり合う可能性があるため、例えば成分の溶出動作に要する時間を延ばす等の必要が生じる場合があるが、図４に示す液体クロマトグラフィー装置では、トラップカラムが２つ並列に設けられているため、成分を捕捉・濃縮させるトラップカラムを代えることができるため、より高い濃縮率で目的成分を得ることができるとともに、かかる濃縮操作をより効率的に行うことができる。
【００３９】
図４は、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図５および図６は、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。
【００４０】
図４に示した試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態については、前記図１に示した状態について説明したと同様の動作が行われている。
【００４１】
次に、成分の別のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・取り出し工程が同時に行われている状態について、図５に基づいて説明する。
【００４２】
＜成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ３とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ６とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂにより希釈液６ａおよび搬送液６ｂが送液され、搬送液６ｂは、流路Ｌ６、Ｌ４およびＬ８を通り、切替えバルブ１２、流路Ｌ１２、さらに切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ１０へ導かれる。分配バルブ２６ａおよび２６ｂが操作され、分画された成分が保持された分取部のうちの一つが選択され、搬送液６ｂが、分配バルブ２６ｂから選択された分取部を通り、前記分取部に保持されていた成分と第一の移動相とともに、分配バルブ２６ａ、流路Ｌ９、切替えバルブ２２、流路Ｌ１１、流路Ｌ１３、切替えバルブ２８ｂ、流路Ｌ１７を通り、トラップカラム３０ｂへ導かれる。一方、希釈液６ａは、流路Ｌ３、Ｌ１およびＬ７を通り、切替えバルブ１２を経て、流路Ｌ１１を通り、前記選択された分取部に保持されていた成分、第一の移動相および搬送液６ｂの流れと合流し、トラップカラム３０ｂへ導かれる。トラップカラム３０ｂに導かれた成分は、トラップカラム３０ｂに捕捉され、濃縮される。トラップカラム３０ｂを経た第一の移動相と希釈液６ａと搬送液６ｂは、流路Ｌ１６を通り、切替えバルブ２８ａ、流路Ｌ２３を経てドレインから排出される。
【００４３】
＜トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・取り出し工程＞
一方で、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂが、オンラインデガッサ３９を経て、気泡が除去された状態で、それぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となって、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１４を通り、トラップカラム３０ａに導かれる。トラップカラム３０ａにすでに捕捉され濃縮された成分は、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１５を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２へ導かれ、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器である紫外光検出器（ミクロセル）３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
【００４４】
次に、成分の別のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われている状態について、図６に基づいて説明する。
【００４５】
図５に示す上記したトラップカラム３０ａからの成分の溶出工程とトラップカラム３０ｂへの成分の捕捉・濃縮工程とが終了すると、図６に示すように、分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、別の分画された成分が保持されている分取部２５ｄが選択される。さらに、切替えバルブ２８ａおよび２８ｂが切替えられ、分取部２５ｄに保持された成分が、第一の移動相、希釈液６ａおよび搬送液６ｂとともに切替えバルブ２８ｂを経て、流路Ｌ１５を通り、トラップカラム３０ａに導かれ、トラップカラム３０ａに成分が捕捉され、濃縮される。一方で、トラップカラム３０ｂに捕捉され、濃縮されていた成分は、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１６を通った第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２へ導かれ、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器である紫外光検出器（ミクロセル）３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
【００４６】
このように、図４〜図６に示した液体クロマトグラフィー装置では、トラップカラムを複数有し、トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構を備えていることから、トラップカラムにおける成分の捕捉・濃縮動作と別のトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出動作を同時に、また連続的に行うことができるため、目的成分の濃縮率をさらに高めることができるだけでなく、濃縮操作をより効率的に行うことができる。
【００４７】
また、不揮発性塩等の緩衝剤を含む第一の移動相を用いた場合には、不揮発性塩等の緩衝剤を含まない希釈液や搬送液を用いることにより、脱塩処理も同時に行うことができるため、不揮発性塩等の緩衝剤の影響を受けやすい質量分析等に適した前記緩衝剤を実質的に含まない分析サンプルを調製することもできる。そのため、質量分析装置や核磁気共鳴装置を紫外光検出器３３の後方に接続し、オンライン分析を行うこともでき、目的成分の濃縮率が向上していることから、より高感度の分析も可能となる。
【００４８】
なお、図４〜図６に示した実施態様では、トラップカラムが２つ並列に設けられているが、複数のトラップカラムを２組並列に設けることもできる。これにより、トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うことができる。
【００４９】
また、図１〜図６に示した実施態様では、切替えバルブ１０を設けて、送液ポンプ２ａおよび２ｂにより、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂと、希釈液６ａおよび搬送液６ｂとを、切替えて送液し、同じ流路を通り、分画用流路２４へ送液されるようになっているが、希釈液６ａおよび搬送液６ｂを送液する送液ポンプを別途設けるとともに、希釈液６ａおよび搬送液６ｂが、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂが流れる流路とは異なる流路を通るようにして、分画用流路２４へ送液するようにすることにより、試料中の成分の分離および分離された成分の分画工程と成分の溶出・取り出し工程もしくは成分の第二の分析カラムでの分析工程と、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮および濃縮された成分の溶出・取り出しもしくは第二の分析カラムでの分析工程とを同時に行うようにすることもできる。
【実施例】
【００５０】
実施例１
目的成分Ａを１ｍｇ秤量し、アセトニトリル１ｍＬに溶解させ、得られた目的成分Ａのアセトニトリル溶液を、さらに、１００倍に希釈し、モデル液を調製した。図４に示す液体クロマトグラフィー装置を用い、モデル液中の目的成分Ａの濃縮処理を行った。注入量は、１μＬとし、第二の分析カラム３２として、内径０．３ｍｍのミクロカラムを用い、紫外光検出器３３の検出器セルとして、内容量３５ｎＬのミクロセルを用いた。また、紫外光検出器２０および紫外光検出器（ミクロセル）３３の検出波長をそれぞれ２５４ｎｍとした。紫外光検出器２０で得られたクロマトグラムを図７に、紫外光検出器（ミクロセル）３３で得られたクロマトグラムを図８に示した。目的成分Ａのピーク面積を比較し、濃縮率（紫外光検出器（ミクロセル）３３で得られたクロマトグラム中の目的成分Ａのピーク面積／紫外光検出器２０で得られたクロマトグラム中の目的成分Ａのピーク面積）を計算したところ、７４３７６／２８８１＝２５．８倍であった。
【００５１】
比較例１
前記実施例１で用いた液体クロマトグラフィー装置において、紫外光検出器（ミクロセル）３３に代えて、内容量２．５μＬのセミミクロセルを用いた以外は、前記実施例１と同様に、モデル液中の目的成分Ａの濃縮処理を行った。紫外光検出器２０で得られたクロマトグラムを図９に、紫外光検出器（セミミクロセル）で得られたクロマトグラムを図１０に示した。目的成分Ａのピーク面積を比較し、濃縮率（紫外光検出器（セミミクロセル）で得られたクロマトグラム中の目的成分Ａのピーク面積／紫外光検出器２０で得られたクロマトグラム中の目的成分Ａのピーク面積）を計算したところ、８２５１２／４３９５＝１８．８倍であった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の一つの実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示す。
【図２】本発明の一つの実施態様である液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程が行われている状態を示す。
【図３】本発明の一つの実施態様である液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の第二の分析カラムでの分析工程が行われている状態を示す。
【図４】本発明の別の実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、試料中の成分の分離および分離された成分の分画工程が行われている状態を示す。
【図５】本発明の別の実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮および濃縮された成分の溶出工程と成分の第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われる状態を示す。
【図６】本発明の別の実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、成分の別のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われている状態を示す。
【図７】実施例１において、紫外光検出器２０で得られたクロマトグラムである。
【図８】実施例１において、紫外光検出器（ミクロセル）３３で得られたクロマトグラムである。
【図９】比較例１において、紫外光検出器２０で得られたクロマトグラムである。
【図１０】比較例１において、紫外光検出器（セミミクロセル）で得られたクロマトグラムである。
【符号の説明】
【００５３】
２ａ，２ｂ，３６ａ，３６ｂ 送液ポンプ
４ａ 第一の移動相を構成する有機溶媒
４ｂ 第一の移動相を構成する水
６ａ 希釈液
６ｂ 搬送液
８，３９ オンラインデガッサ
１０，１２，２２，２８，２８ａ，２８ｂ 切替えバルブ
１４，４０ ミキサ
１６ オートサンプラ
１８ 第一の分析カラム
２０ 紫外光検出器
２４ 分画用流路
２５ａ〜２５ｅ 分取部
２６ａ，２６ｂ 分配バルブ
３０，３０ａ，３０ｂ トラップカラム
３２ 第二の分析カラム（ミクロカラム）
３３ 紫外光検出器（ミクロセル）
３８ａ 第二の移動相を構成する有機溶媒
３８ｂ 第二の移動相を構成する水
４１ カラムオーブン
Ｌ１〜Ｌ１７，Ｌ２２〜Ｌ２３ 流路
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数の成分を含む試料中の成分を第一の分析カラムにより分離し、前記成分を第一の紫外光検出器により検出し、前記成分をトラップカラムに捕捉して濃縮し、これを第二の分析カラムに送り出して分離し、第二の紫外光検出器により検出する液体クロマトグラフィー装置が知られており（例えば特許文献１および２参照。）、このような液体クロマトグラフィー装置を用いることにより、試料中の成分を容易に濃縮することができる。
【０００３】
一方で、医薬、農薬等の開発においては、極めて微量の成分の構造を同定することが必要とされる場合も多く、試料中の成分の濃縮率をさらに高め、構造の同定をより容易にすることが望まれていた。
【０００４】
【特許文献１】特許第２８９２７９５号公報
【特許文献２】国際公開第９９／６１９０５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況のもと、本発明者らは、成分の濃縮率をさらに高めた液体クロマトグラフィー装置を開発すべく検討したところ、第二の分析カラムとして、ミクロカラムもしくはナノカラムを用いるとともに、第二の検出手段の検出器セルとして、ミクロセルもしくはナノセルを用いることにより、目的成分の濃縮率をさらに高めることができることを見出し、本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、
前記成分を検出する第一の検出手段と、
前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、
前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、
第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、
前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、
第二の分析カラムがミクロカラムもしくはナノカラムであり、第二の検出手段の検出器セルがミクロセルもしくはナノセルであることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の液体クロマトグラフィー装置によれば、試料中の目的成分の濃縮率をさらに高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、図面を参照しながら、本発明を詳細に説明する。図１に、本発明の液体クロマトグラフィー装置の一つの実施態様を示した。図１に示した液体クロマトグラフィー装置は、一つのトラップカラムを備え、第二の分析カラムがミクロカラムで、かつ、第二の検出手段の検出器セルがミクロセルである液体クロマトグラフィー装置である。
【０００９】
送液ポンプ２ａおよび２ｂは、有機溶媒、水等の移動相として使用され得る溶媒を送液可能なものであればよい。かかる送液ポンプは、流量を任意に設定することができるものが好ましい。
【００１０】
送液ポンプ２ａの上流側に、流路Ｌ１により切替えバルブ１０が接続されており、切替えバルブ１０と第一の移動相を構成する有機溶媒４ａとは、流路Ｌ２で接続されている。流路Ｌ２の途中にはオンラインデガッサ８が設けられている。オンラインデガッサ８は、流路内を流れる有機溶媒４ａおよび希釈液６ａ中への気泡の噛み込みを防止する機能を有するものであり、安定した送液状態を保つ点で設けておくことが好ましい。また、切替えバルブ１０には、希釈液６ａとの流路Ｌ３が接続されている。切替えバルブ１０を切替えることにより、流路Ｌ１と流路Ｌ２とを接続したり、流路Ｌ１と流路Ｌ３とを接続したりするようになっている。
【００１１】
同様に、送液ポンプ２ｂの上流側には、流路Ｌ４により切替えバルブ１０が接続され、切替えバルブ１０と第一の移動相を構成する水４ｂとが流路Ｌ５で、切替えバルブ１０と搬送液６ｂとが流路Ｌ６でそれぞれ接続されている。さらに、流路Ｌ５およびＬ６の途中に、オンラインデガッサ８が設けられている。切替えバルブ１０を切替えることにより、流路Ｌ４とＬ５とを接続したり、流路Ｌ４とＬ６とを接続したりするようになっている。なお、図１に示す実施態様では、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａと希釈液６ａとを、切替えバルブ１０を介して、送液ポンプ２ａにより送液するようになっているが、切替えバルブ１０を介することなく、それぞれを送液する送液ポンプを設けてもよい。また、第一の移動相を構成する水４ｂと搬送液６ｂについても、同様に、切替えバルブ１０を介することなく、それぞれを送液する送液ポンプを設けてもよい。
【００１２】
希釈液６ａは、後述する分取部２５ａ〜２５ｅから押し出された成分を希釈しながらトラップカラム３０へ送り出す液であり、搬送液６ｂは、後述する分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分をトラップカラム３０に押し出す液であり、それぞれ同じ溶媒であってもよいし、異なる溶媒であってもよく、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂ、成分等に応じて、トラップカラム３０への成分の吸着効率を高めるような溶媒を選択することが好ましい。また、かかる希釈液６ａおよび搬送液６ｂとしては、不揮発性塩等の緩衝剤を含まない水もしくは水溶液も使用することができる。緩衝剤を含む第一の移動相を用いた場合に、かかる緩衝剤を含まない搬送液を用いることにより、成分をトラップカラムへ捕捉・濃縮させる際に、脱塩処理を行うことができる。
【００１３】
送液ポンプ２ａおよび２ｂの下流側の流路Ｌ７およびＬ８は、切替えバルブ１２を介して両流路を流れる液を混合するミキサ１４に接続されており、ミキサ１４で混合された溶液の流路が、試料注入部であるオートサンプラ１６を介して第一の分析カラム１８に接続されている。
【００１４】
送液ポンプ２ａおよび２ｂの流量は、試料、第一の分析カラム等に応じて適宜選択すればよく、それぞれの送液ポンプの流量は一定であってもよいし、それぞれ独立に、経時的に変化させてもよい。なお、図１に示した実施態様では、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａと水４ｂとを２つの送液ポンプで送液し、ミキサ１４で混合し、所定の組成の第一の移動相を調製し、第一の分析カラム１８に送液するようにしているが、あらかじめ有機溶媒４ａと水４ｂを所定の割合で混合しておき、一つの送液ポンプにより送液するようにしてもよい。また、第一の移動相の組成も、有機溶媒と水との混合溶液に限らず、単独の有機溶媒としてもよいし、異なる二種の有機溶媒の混合溶液としてもよく、試料やその成分、分析カラム等に応じて適宜選択すればよい。また、試料中の成分の分離をよくするため、不揮発性塩等の緩衝剤が溶解した緩衝溶液等を第一の移動相を構成する溶媒として用いてもよい。
【００１５】
本発明において、試料とは、濃縮したい成分を含むものであればよく、あらゆる形態の試料を意味し、試料成分自体、試料成分含有製剤等を溶液にしたものの他、例えば、血液、血漿、尿等を媒体とした試料成分等も挙げることができる。
【００１６】
第一の分析カラム１８としては、順相カラム、逆相カラム、イオン交換カラム、アフィニティカラム、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラム等種々のカラムが使用でき、分離しようとする試料中の成分に応じて、適宜選択すればよい。かかる分析カラムの内径や長さも特に制限されない。
【００１７】
第一の分析カラム１８の下流側には、第一の検出手段である紫外光検出器２０が接続され、第一の分析カラム１８で分離された試料中の成分が紫外光検出器２０で検出されるようになっている。第一の分析カラム１８で分離された成分の、紫外領域の特定の波長における吸光スペクトルが取得できる。検出された吸光スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
【００１８】
図１に示した液体クロマトグラフィー装置では、第一の検出手段として、紫外光検出器が用いられているが、例えばＰＤＡ検出器、赤外検出器、放射性同位体検出器、蛍光検出器等を用いてもよい。
【００１９】
紫外光検出器２０には、切替えバルブ２２を介して、分画用流路２４が接続されている。分画用流路２４は、２つの分配バルブ２６ａおよび２６ｂとの間に分取部を有した流路を複数、並列に備え、切替えバルブ２２と、流路Ｌ９およびＬ１０により接続されており、第一の分析カラム１８で分離された成分が、分配バルブの分配操作により分画され、分画された成分が移動相とともに、分取部２５ａ〜２５ｅに保持されるようになっている。切替えバルブ２２には、ドレインへつながる流路Ｌ２２も接続されている。図１では、分取部は５つ設けられているが、その数は制限されない。
【００２０】
切替えバルブ１２と切替えバルブ２２との間には２つの流路Ｌ１１およびＬ１２が接続されており、一方の流路Ｌ１１は、途中で分岐してトラップ用流路に接続されている。トラップ用流路は、前記分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめる流路であり、一つのトラップカラム３０が設けられている。トラップカラム３０は、切替えバルブ２８と、流路Ｌ１６およびＬ１７でそれぞれ接続されている。前記流路Ｌ１１から分岐した流路Ｌ１３は切替えバルブ２８に接続されており、該切替えバルブ２８には、トラップカラム３０に捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラム３２と第二の分析カラム３２で分離された成分を検出する第二の検出手段である紫外光検出器３３が設けられている。
【００２１】
トラップカラム３０としては、通常その内径が、前記第一の分析カラム１８の内径よりも小さいカラムが用いられ、第一の分析カラム１８の内径にもよるが、通常０．０３〜６ｍｍの内径のカラムが使用される。また、トラップカラム３０としては、例えば筒状部材内に充填剤を充填した充填型カラム、モノリス型カラム等を用いることができる。充填型カラムをトラップカラムとして用いる場合には、トラップカラム内の圧力を小さくするという点で、その粒径が１０〜６０μｍである充填剤が充填された充填型カラムを用いることが好ましい。また、トラップカラム３０の長さは特に制限されないが、通常は１０〜１００ｍｍ程度である。
【００２２】
図１に示した実施態様では、第二の分析カラム３２として、内径０．１〜０．３ｍｍ程度のミクロカラムが用いられているが、かかる第二の分析カラムとしては、内径０．０３〜０．１ｍｍ程度のナノカラムを用いてもよい。第二の分析カラム３２の長さは、通常１０〜３０ｃｍである。
【００２３】
トラップカラム３０から溶出した成分が、第二の検出手段である紫外光検出器（ミクロセル）３３で検出され、該成分の、紫外領域の特定波長における吸光スペクトルが取得できる。検出された吸光スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
【００２４】
図１に示した実施態様では、かかる紫外光検出器３３を構成する検出器セルは、内容量が２０ｎＬ〜２μＬのミクロセルであるが、検出器セルとして、内容量が、１ｎＬ〜２０ｎＬのナノセルを用いてもよい。先に述べた第二の分析カラムとしてミクロカラムもしくはナノカラムを用い、かつ、第二の検出手段の検出器セルとしてミクロセルもしくはナノセルを用いることにより、目的成分の濃縮率をさらに高めることができる。
【００２５】
切替えバルブ２８には、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂを供給するための送液ポンプ３６ａおよび３６ｂが、ミキサ４０を介して接続されている。有機溶媒３８ａおよび水３８ｂと送液ポンプ３６ａおよび３６ｂとを接続する流路には、オンラインデガッサ３９が設けられている。また、切替えバルブ２８には、ドレインへの排出流路が接続されている。
【００２６】
第二の移動相は、トラップカラム３０からの成分の溶出をより容易にするため、成分やトラップカラム３０に応じて適宜決めればよい。また、第二の移動相は、トラップカラム３０に捕捉・濃縮された成分を溶出させるものであるため、成分の分離をよくするための不揮発性塩等の緩衝剤等を用いなくてもよい。
【００２７】
第一の分析カラム１８およびトラップカラム３０は、カラムオーブン４１中に設けられており、略一定の温度に保持されている。図１に示した実施態様では、第一の分析カラム１８およびトラップカラム３０が一つのカラムオーブンに設けられているが、それぞれのカラムごとにカラムオーブンを設けてもよい。また、第二の分析カラム３２も、前記カラムオーブン４１もしくは図示しない別のカラムオーブン中に設けられ、略一定の温度に保持されている。
【００２８】
続いて、本発明の一実施態様である液体クロマトグラフィー装置の動作について説明する。図１は、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図２は、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程が行われている状態を示しており、図１と同様に、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図３は、トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の第二の分析カラムによる分離工程が行われている状態を示しており、図１および２と同様に、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。
【００２９】
まず、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態について、図１に基づいて説明する。
【００３０】
＜試料中の成分の分離工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ２とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ５とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂが起動されると、有機溶媒４ａおよび水４ｂがそれぞれ送液ポンプ２ａおよび２ｂにより送液され、それぞれ流路Ｌ７およびＬ８を通り、切替えバルブ１２を経てミキサ１４で混合され、第一の移動相となり、オートサンプラ１６を経て第一の分析カラム１８に送液される。試料をオートサンプラ１６により注入すると、注入された試料は第一の移動相により第一の分析カラム１８に導かれ、試料中の成分が、第一の分析カラム１８で分離される。
【００３１】
＜分離された成分の分画工程＞
分離された成分は第一の分析カラム１８から溶出していき、紫外光検出器２０で検出され、切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ９を通り、分画用流路２４へ流れる。紫外光検出器２０で成分が検出されると、その検出信号に応じて分配バルブ２６ａおよび２６ｂとが働き、分画用流路２４内の分取部２５ａ〜２５ｅのうちのいずれかが選択され、分離された成分を分画し、選択された分取部に分画された成分が第一の移動相とともに保持される。紫外光検出器２０で検出されたスペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。図１では、分取部２５ｅが選択され、成分が分取部２５ｅに分画されている。紫外光検出器２０で成分が検出される毎に分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、分画用流路２４内のいずれかの分取部が選択され、分離された成分毎に分画動作が行われ、分画された成分が第一の移動相とともに選択された分取部に保持される。第一の分析カラム１８から流出する第一の移動相により分画用流路２４の分取部に保持されなかったものは、分配バルブ２６ｂ、流路Ｌ１０、切替えバルブ２２、流路Ｌ２２を経て、ドレインから排出される。
【００３２】
一方で、送液ポンプ３６ａおよび３６ｂも起動され、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂがそれぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となり、切替えバルブ２８を経て、トラップカラム３０に送液され、コンディショニングが行われるようになっている。
【００３３】
次に、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程が行われている状態について、図２に基づいて説明する。
【００３４】
＜成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ３とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ６とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂにより希釈液６ａおよび搬送液６ｂが送液され、搬送液６ｂは、流路Ｌ６、Ｌ４およびＬ８を通り、切替えバルブ１２、流路Ｌ１２、さらに切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ１０へ導かれる。分配バルブ２６ａおよび２６ｂが操作され、分画された成分が保持された分取部のうちの一つが選択され、搬送液６ｂが、分配バルブ２６ｂから選択された分取部を通り、前記分取部に保持されていた成分と第一の移動相とともに、分配バルブ２６ａ、流路Ｌ９、切替えバルブ２２、流路Ｌ１１、流路Ｌ１３、切替えバルブ２８、流路Ｌ１６を通り、トラップカラム３０へ導かれる。一方、希釈液６ａは、流路Ｌ３、Ｌ１およびＬ７を通り、切替えバルブ１２を経て、流路Ｌ１１を通り、前記選択された分取部に保持されていた成分、第一の移動相および搬送液６ｂの流れと合流し、トラップカラム３０へ導かれる。トラップカラム３０に導かれた成分は、トラップカラム３０に捕捉され、濃縮される。トラップカラム３０を経た第一の移動相と希釈液６ａと搬送液６ｂは、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８を経てドレインから排出される。
【００３５】
続いて、トラップカラムに捕捉・濃縮された成分の第二の分析カラムによる分離工程が行われている状態について図３に基づいて説明する。
【００３６】
＜トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の第二の分析カラムによる分離工程＞
第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂが、オンラインデガッサ３９を経て、気泡が除去された状態で、それぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となって、切替えバルブ２８を経て、流路Ｌ１６を通り、トラップカラム３０に導かれる。トラップカラム３０にすでに捕捉され濃縮された成分は、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８を経て、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２へ導かれ、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器である紫外光検出器（ミクロセル）３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
【００３７】
なお、図１〜図３では、分画用流路２４内の分取部２５ａ〜２５ｅに保持された成分を、希釈液６ａおよび搬送液６ｂで希釈し、押し出しながらトラップカラム３０へ導くようにしているが、分画された成分を、搬送液６ｂとともに分取部２５ａ〜２５ｅに保持するようにしてもよい。
【００３８】
続いて、本発明の別の実施態様である液体クロマトグラフィー装置の動作について、図４〜図６に基づいて説明する。図４〜図６に示す液体クロマトグラフィー装置は、トラップカラムが２つ並列に設けられるとともに、流路切替え機構が設けられた液体クロマトグラフィー装置である。図１に示した液体クロマトグラフィー装置では、一つのトラップカラムで、成分の捕捉・濃縮動作と成分の溶出動作が交互に行われるため、溶出しきれず、トラップカラム内に成分が残存した場合には、次に捕捉・濃縮しようとする成分と混ざり合う可能性があるため、例えば成分の溶出動作に要する時間を延ばす等の必要が生じる場合があるが、図４に示す液体クロマトグラフィー装置では、トラップカラムが２つ並列に設けられているため、成分を捕捉・濃縮させるトラップカラムを代えることができるため、より高い濃縮率で目的成分を得ることができるとともに、かかる濃縮操作をより効率的に行うことができる。
【００３９】
図４は、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。図５および図６は、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われている状態を示しており、かかる工程で使用される流路が太線で、液の流れが矢印で表わされている。
【００４０】
図４に示した試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態については、前記図１に示した状態について説明したと同様の動作が行われている。
【００４１】
次に、成分の別のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・取り出し工程が同時に行われている状態について、図５に基づいて説明する。
【００４２】
＜成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程＞
切替えバルブ１０が操作され、流路Ｌ１と流路Ｌ３とが接続されるとともに、流路Ｌ４と流路Ｌ６とが接続される。送液ポンプ２ａおよび２ｂにより希釈液６ａおよび搬送液６ｂが送液され、搬送液６ｂは、流路Ｌ６、Ｌ４およびＬ８を通り、切替えバルブ１２、流路Ｌ１２、さらに切替えバルブ２２を経て、流路Ｌ１０へ導かれる。分配バルブ２６ａおよび２６ｂが操作され、分画された成分が保持された分取部のうちの一つが選択され、搬送液６ｂが、分配バルブ２６ｂから選択された分取部を通り、前記分取部に保持されていた成分と第一の移動相とともに、分配バルブ２６ａ、流路Ｌ９、切替えバルブ２２、流路Ｌ１１、流路Ｌ１３、切替えバルブ２８ｂ、流路Ｌ１７を通り、トラップカラム３０ｂへ導かれる。一方、希釈液６ａは、流路Ｌ３、Ｌ１およびＬ７を通り、切替えバルブ１２を経て、流路Ｌ１１を通り、前記選択された分取部に保持されていた成分、第一の移動相および搬送液６ｂの流れと合流し、トラップカラム３０ｂへ導かれる。トラップカラム３０ｂに導かれた成分は、トラップカラム３０ｂに捕捉され、濃縮される。トラップカラム３０ｂを経た第一の移動相と希釈液６ａと搬送液６ｂは、流路Ｌ１６を通り、切替えバルブ２８ａ、流路Ｌ２３を経てドレインから排出される。
【００４３】
＜トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・取り出し工程＞
一方で、第二の移動相を構成する有機溶媒３８ａおよび水３８ｂが、オンラインデガッサ３９を経て、気泡が除去された状態で、それぞれ送液ポンプ３６ａおよび３６ｂにより送液され、ミキサ４０で混合され、第二の移動相となって、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１４を通り、トラップカラム３０ａに導かれる。トラップカラム３０ａにすでに捕捉され濃縮された成分は、第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１５を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２へ導かれ、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器である紫外光検出器（ミクロセル）３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
【００４４】
次に、成分の別のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われている状態について、図６に基づいて説明する。
【００４５】
図５に示す上記したトラップカラム３０ａからの成分の溶出工程とトラップカラム３０ｂへの成分の捕捉・濃縮工程とが終了すると、図６に示すように、分配バルブ２６ａおよび２６ｂが切替えられ、別の分画された成分が保持されている分取部２５ｄが選択される。さらに、切替えバルブ２８ａおよび２８ｂが切替えられ、分取部２５ｄに保持された成分が、第一の移動相、希釈液６ａおよび搬送液６ｂとともに切替えバルブ２８ｂを経て、流路Ｌ１５を通り、トラップカラム３０ａに導かれ、トラップカラム３０ａに成分が捕捉され、濃縮される。一方で、トラップカラム３０ｂに捕捉され、濃縮されていた成分は、切替えバルブ２８ａを経て、流路Ｌ１６を通った第二の移動相により溶出し、溶出した成分は第二の移動相とともに、流路Ｌ１７を通り、切替えバルブ２８ｂを経て、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２へ導かれ、第二の分析カラム（ミクロカラム）３２で分離される。分離された成分は、第二の検出器である紫外光検出器（ミクロセル）３３で検出され、吸収スペクトルが取得される。取得された吸収スペクトルは、記憶手段（図示しない）に記憶される。
【００４６】
このように、図４〜図６に示した液体クロマトグラフィー装置では、トラップカラムを複数有し、トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構を備えていることから、トラップカラムにおける成分の捕捉・濃縮動作と別のトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出動作を同時に、また連続的に行うことができるため、目的成分の濃縮率をさらに高めることができるだけでなく、濃縮操作をより効率的に行うことができる。
【００４７】
また、不揮発性塩等の緩衝剤を含む第一の移動相を用いた場合には、不揮発性塩等の緩衝剤を含まない希釈液や搬送液を用いることにより、脱塩処理も同時に行うことができるため、不揮発性塩等の緩衝剤の影響を受けやすい質量分析等に適した前記緩衝剤を実質的に含まない分析サンプルを調製することもできる。そのため、質量分析装置や核磁気共鳴装置を紫外光検出器３３の後方に接続し、オンライン分析を行うこともでき、目的成分の濃縮率が向上していることから、より高感度の分析も可能となる。
【００４８】
なお、図４〜図６に示した実施態様では、トラップカラムが２つ並列に設けられているが、複数のトラップカラムを２組並列に設けることもできる。これにより、トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うことができる。
【００４９】
また、図１〜図６に示した実施態様では、切替えバルブ１０を設けて、送液ポンプ２ａおよび２ｂにより、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂと、希釈液６ａおよび搬送液６ｂとを、切替えて送液し、同じ流路を通り、分画用流路２４へ送液されるようになっているが、希釈液６ａおよび搬送液６ｂを送液する送液ポンプを別途設けるとともに、希釈液６ａおよび搬送液６ｂが、第一の移動相を構成する有機溶媒４ａおよび水４ｂが流れる流路とは異なる流路を通るようにして、分画用流路２４へ送液するようにすることにより、試料中の成分の分離および分離された成分の分画工程と成分の溶出・取り出し工程もしくは成分の第二の分析カラムでの分析工程と、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮および濃縮された成分の溶出・取り出しもしくは第二の分析カラムでの分析工程とを同時に行うようにすることもできる。
【実施例】
【００５０】
実施例１
目的成分Ａを１ｍｇ秤量し、アセトニトリル１ｍＬに溶解させ、得られた目的成分Ａのアセトニトリル溶液を、さらに、１００倍に希釈し、モデル液を調製した。図４に示す液体クロマトグラフィー装置を用い、モデル液中の目的成分Ａの濃縮処理を行った。注入量は、１μＬとし、第二の分析カラム３２として、内径０．３ｍｍのミクロカラムを用い、紫外光検出器３３の検出器セルとして、内容量３５ｎＬのミクロセルを用いた。また、紫外光検出器２０および紫外光検出器（ミクロセル）３３の検出波長をそれぞれ２５４ｎｍとした。紫外光検出器２０で得られたクロマトグラムを図７に、紫外光検出器（ミクロセル）３３で得られたクロマトグラムを図８に示した。目的成分Ａのピーク面積を比較し、濃縮率（紫外光検出器（ミクロセル）３３で得られたクロマトグラム中の目的成分Ａのピーク面積／紫外光検出器２０で得られたクロマトグラム中の目的成分Ａのピーク面積）を計算したところ、７４３７６／２８８１＝２５．８倍であった。
【００５１】
比較例１
前記実施例１で用いた液体クロマトグラフィー装置において、紫外光検出器（ミクロセル）３３に代えて、内容量２．５μＬのセミミクロセルを用いた以外は、前記実施例１と同様に、モデル液中の目的成分Ａの濃縮処理を行った。紫外光検出器２０で得られたクロマトグラムを図９に、紫外光検出器（セミミクロセル）で得られたクロマトグラムを図１０に示した。目的成分Ａのピーク面積を比較し、濃縮率（紫外光検出器（セミミクロセル）で得られたクロマトグラム中の目的成分Ａのピーク面積／紫外光検出器２０で得られたクロマトグラム中の目的成分Ａのピーク面積）を計算したところ、８２５１２／４３９５＝１８．８倍であった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の一つの実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、試料中の成分の分離工程および分離された成分の分画工程が行われている状態を示す。
【図２】本発明の一つの実施態様である液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程が行われている状態を示す。
【図３】本発明の一つの実施態様である液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、トラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の第二の分析カラムでの分析工程が行われている状態を示す。
【図４】本発明の別の実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、試料中の成分の分離および分離された成分の分画工程が行われている状態を示す。
【図５】本発明の別の実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、成分のトラップカラムへの捕捉・濃縮および濃縮された成分の溶出工程と成分の第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われる状態を示す。
【図６】本発明の別の実施態様の液体クロマトグラフィー装置およびその動作を示す図であって、成分の別のトラップカラムへの捕捉・濃縮工程とトラップカラムに捕捉・濃縮されていた成分の溶出・第二の分析カラムでの分析工程が同時に行われている状態を示す。
【図７】実施例１において、紫外光検出器２０で得られたクロマトグラムである。
【図８】実施例１において、紫外光検出器（ミクロセル）３３で得られたクロマトグラムである。
【図９】比較例１において、紫外光検出器２０で得られたクロマトグラムである。
【図１０】比較例１において、紫外光検出器（セミミクロセル）で得られたクロマトグラムである。
【符号の説明】
【００５３】
２ａ，２ｂ，３６ａ，３６ｂ 送液ポンプ
４ａ 第一の移動相を構成する有機溶媒
４ｂ 第一の移動相を構成する水
６ａ 希釈液
６ｂ 搬送液
８，３９ オンラインデガッサ
１０，１２，２２，２８，２８ａ，２８ｂ 切替えバルブ
１４，４０ ミキサ
１６ オートサンプラ
１８ 第一の分析カラム
２０ 紫外光検出器
２４ 分画用流路
２５ａ〜２５ｅ 分取部
２６ａ，２６ｂ 分配バルブ
３０，３０ａ，３０ｂ トラップカラム
３２ 第二の分析カラム（ミクロカラム）
３３ 紫外光検出器（ミクロセル）
３８ａ 第二の移動相を構成する有機溶媒
３８ｂ 第二の移動相を構成する水
４１ カラムオーブン
Ｌ１〜Ｌ１７，Ｌ２２〜Ｌ２３ 流路
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、
前記成分を検出する第一の検出手段と、
前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、
前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、
第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、
前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、
第二の分析カラムがミクロカラムもしくはナノカラムであり、第二の検出手段の検出器セルがミクロセルもしくはナノセルであることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置。
【請求項２】
トラップカラムが複数設けられ、前記トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構とを備えてなる請求項１に記載の液体クロマトグラフィー装置。
【請求項３】
ミクロセルもしくはナノセルの内容量が、１ｎＬ〜２μＬである請求項１に記載の液体クロマトグラフィー装置。
【請求項１】
第一の移動相により導かれた試料中の成分を分離する第一の分析カラムと、
前記成分を検出する第一の検出手段と、
前記第一の検出手段で検出された成分を分画して分取部に保持する分画用流路と、
前記分取部に保持された成分をトラップカラムに送り出して前記成分をトラップカラムに捕捉させて濃縮せしめるトラップ用流路と、
第二の移動相により前記トラップカラムから溶出させられた前記トラップカラムに捕捉・濃縮された成分を分離する第二の分析カラムと、
前記第二の分析カラムで分離された成分を検出する第二の検出手段とを備えた液体クロマトグラフィー装置において、
第二の分析カラムがミクロカラムもしくはナノカラムであり、第二の検出手段の検出器セルがミクロセルもしくはナノセルであることを特徴とする液体クロマトグラフィー装置。
【請求項２】
トラップカラムが複数設けられ、前記トラップ用流路の一つのトラップカラムに成分を捕捉させて濃縮せしめる捕捉・濃縮動作と、他のトラップカラムから捕捉された成分を溶出させる溶出動作を同時に行うための流路切替え機構とを備えてなる請求項１に記載の液体クロマトグラフィー装置。
【請求項３】
ミクロセルもしくはナノセルの内容量が、１ｎＬ〜２μＬである請求項１に記載の液体クロマトグラフィー装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−２７５８７３（Ｐ２００６−２７５８７３Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−９７４８３（Ｐ２００５−９７４８３）
【出願日】平成１７年３月３０日（２００５．３．３０）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３０日（２００５．３．３０）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
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