液体細菌接種材料の改善された保存寿命及び種子上での安定性
本発明は、乾燥剤を含む液体接種材料を製造するための方法を包含する。この方法は、包装された液体接種材料及び種子上の細菌の生存率及び安定性を改善することができる。この方法は、実質的に定常期まで生育させた細菌の液体接種材料を用意することを含む。乾燥剤を含む乾燥処理剤を、この液体接種材料に加えて、部分的に乾燥した接種材料製品を形成する。この部分的に乾燥した接種材料製品は、包装することができ、保存することができる。この部分的に乾燥した接種材料製品は又は、種子に適用することもできる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
これは、特許出願第１１／０２０，７１４号(２００４年１２月２３日出願)(その全開示を参考として本明細書中に援用する)の部分継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、液体接種材料に関するものである。特に、本発明は包装された液体接種材料中の細菌の生存率と安定性を改善するための方法及び種子に与える時期に関する。
【０００３】
様々な微生物には植物に対する有益な効果があることが知られている。これらの微生物にはRhizobium（Bradyrhizobiumを含む）、Pseudomonas、Serratia、Bacillus（Paenibacillusを含む）、Pasteuria、Azotobacter、Enterobacter、Azospirillum、Methylobacterium、Cyanobacteria（らん藻類）属の菌類、および菌根菌を含む。これらの微生物は接種組成物を用いて植物に導入できる。接種組成物を作製する過程は、通常、栄養培地で微生物を発酵させるステップを含む。
【０００４】
接種組成物は、植物の種子に直接与えること、又は種子を植えつける前に直接畝間に散布することができる。作物を改良するために、種子又は土への有益な微生物の接種は長年にわたり実施されている。しかし、バラつきのある、一貫性のない結果がしばしば認められている。それは、おそらく接種材料の生存力の喪失、又は接種材料の生存力の変化による供与量のバラつきのためである。
【０００５】
畝間に散布しようと種子に与えようと、接種材料を播種時に加えるのでは、接種材料中の微生物が新しい環境に適応する時間がない。その結果、接種材料中の微生物の生存率は低くなる。
【０００６】
現在は、接種材料中の微生物の生存率を改善するために、接種材料を種子に加えるとき、又は播種時に、糖、又はポリマーベースの増量剤が加えられる。それらの増量剤は接種材料の包装の後に加えられるので、包装内の接種材料の生存能力及び安定性には増量剤は影響を与えない。
【０００７】
また種子に接種材料を与えるとき又は播種の際に、増量剤を添加することは煩雑であり、さらに、それは通常、接種材料の末端利用者（例えば、農業者）によって非制御環境下（例えば、納屋や圃場）で実施されるはずである。したがって増量剤が不適切に使用される確率が高くなることが予想される。
【０００８】
また接種材料の作製後に増量剤を加えることによる問題を克服するために、液体接種材料を作製する発酵ステップの前にも、栄養培地に増量剤が加えられる。しかし、種子上で生存させるための最適量の増量剤を発酵前に添加すると、微生物の成長が抑制される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、保存中の液体接種材料の微生物（例えば、細菌）の生存率と安定性を高める方法、及び、いったん種子上に施された液体接種材料中の微生物の種子上での生存率と安定性を改善する方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１つの実施例は、乾燥剤を含む液体接種材料製品を製造するための方法である。その方法は、実質的に定常期まで増殖させた細菌の液体接種材料を供給することを含む。乾燥剤を含む乾燥処理剤は、部分的に乾燥した接種材料製品を形成するために液体接種材料に加えられる。
【００１１】
本発明の別の具体例では、部分的に乾燥した接種材料製品は、包装され、保存される。
【００１２】
本発明の更なる具体例では、部分的に乾燥した接種材料は種子に施される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は本発明のいくつかの具体例による、時間と温度の関数として示したBradyrhizobium japonicum（「B japonicum」）の液体培地中での生存グラフである。
【図２】図２は本発明のいくつかの具体例による、時間と温度の関数として示したB japonicumの液体培地中での生存グラフである。
【図３】図３は本発明のいくつかの具体例による、時間と温度の関数として示したB japonicumの種子上での生存グラフである。
【図４】図４は本発明のいくつかの具体例による、乾燥剤の種類及び量の関数として示したB japonicumの液体培地中での生存グラフである。
【図５】図５は本発明のいくつかの具体例による、乾燥剤の種類及び量の関数として示したB japonicumの液体培地中での生存グラフである。
【図６】図６は本発明のいくつかの具体例による、乾燥剤の種類及び量の関数として示したB japonicumの種子上での生存グラフである。
【図７】図７は本発明のいくつかの具体例による、乾燥剤の種類及び量の関数として示したPseudomonas fluorescens（「P fluorescens」）の液体培地中での生存グラフである。
【図８】図８は本発明のいくつかの具体例による、乾燥剤の種類及び量の関数として示したS proteomaculans（「S proteomaculans」）の液体培地中での生存グラフである。
【図９】図９は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Bradyrhizobium 菌数のグラフである。
【図１０】図１０は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Bradyrhizobium 菌数のグラフである。
【図１１】図１１は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Rhizobium 菌数のグラフである。
【図１２】図１２は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Rhizobium 菌数のグラフである。
【図１３】図１３は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Bradyrhizobium 菌数のグラフである。
【図１４】図１４は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Bradyrhizobium 菌数のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
細菌の液体接種材料を作製するための方法を提供する。該方法は、細菌を実質的に定常期まで増殖させた後、液体接種材料に乾燥剤を添加することを含む。接種材料に乾燥剤を添加することで、部分的に乾燥した接種材料製品が形成される。
【００１５】
部分的に乾燥した接種材料製品を「包装」する（すなわち、包装内に含ませる）とき、及び部分的に乾燥した接種材料製品を種子に施すときに、該方法は細菌の安定性の向上を提供することができる。安定性の向上により包装内と種子上の両方での細菌の生存率を高めることができる。
【００１６】
細菌培養物を作製するために、細菌を液体栄養培地に導入する。これらには限定されないが、Rhizobium（Bradyrhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobiumを含む）、Pseudomonas、Serratia、Bacillus（Paenibacillusを含む）、Pasteuria、Azotobacter、Enterobacter、Azospirillum、Methylobacterium、Cyanobacteria（らん藻類）属の細菌類を含むさまざまな細菌を液体栄養培地に導入することができる。細菌培養液を作製するために、液体栄養培地に他の微生物（例えば、菌根菌であり、これは、ここで用いる場合、用語「細菌」の定義に包含される）を導入することもできる。Rhizobium及びBradyrhizobiumに関しては、Bradyrhizobium japonicum、Rhizobium meliloti、Rhizobium leguminosarum biovar trifolii、Rhizobium leguminosarum biovar viceae及びRhizobium leguminosarum biovar phaseoliを含む株が好ましい。これらの細菌は豆科植物種の根に小節を形成できる。以下の説明は、主にRhizobium属の接種材料組成物を示すが、同様の原理が他の微生物の使用にも適用されると理解される。
【００１７】
選択された細菌に適合することが当業者に公知の、あらゆる液体栄養培地が細菌を導入する液体栄養培地になり得る。例えば、ＹＭＢはRhizobium属に使用される一般的な培地である。ＹＭＢの組成を表１に示す。
【表１】
【００１８】
細菌を液体栄養培地に添加した後、細菌を「実質的な定常期」にまで増殖させるために細菌培養液を培養（又は、発酵）することができる。「実質的な定常期」は、「対数期」の後期から「定常期」までの培養期間を含むと定義される。「対数期」は発酵初期の誘導期後に起こる段階で、通常、栄養物が無制限にあり、通常、細菌が指数関数的に増殖する段階と定義される。「定常期」は対数期後に起こる段階で、菌増殖が基本的に停止した段階と定義される。液体栄養培地が実質的に枯渇したとき、通常、定常期に達している。本明細書中で使用されるように、実質的に定常期まで培養された細菌を含む物質を「液体接種材料」と呼ぶ。
【００１９】
通常、細菌の培養期間は１〜１５日間である。より限定的にいうと、培養期間は２〜７日間である。培養期間中、液体栄養培地及び細菌を通気し、増殖に適した温度で維持できる。通気は、振盪培養器、発酵装置又は他の同様の手段を用いて実施できる。培養の厳密な条件は細菌の種類及び使用される液体栄養培地の種類に依存する。例えば、B japonicumは、振盪培養器内の栄養培地で約１〜１０日間、約２０℃〜３５℃で培養することができる。好ましくは、B japonicumを増殖するためには、約２〜７日間、約２８℃で培養する。
【００２０】
細菌によって、実質的な定常期における細菌数は異なる。例えばRhizobium属の細菌では、液体接種材料の細菌数は、約１×１０9／ｍｌ〜約５×１０11／ｍｌと想定される。その例では、液体接種材料は１ｍｌあたり約１×１０10の細菌数を含むことができる。これらは一例としての量であり、他の量も本発明の範囲内にあると意図される。
【００２１】
実質的に定常期に達した（すなわち、細菌が指数関数的に増殖した）後に、部分的に乾燥した接種材料製品を作製するために乾燥剤を含む乾燥処理剤を液体接種材料に導入する。用語「乾燥処理剤」は、乾燥剤と通常は水である希釈物質との混合物を意味する。用語「乾燥剤」は、水に加えられると水分活性（飽和圧力で割った物質表面の水蒸気の部分分圧と定義される）を低下させる物質を意味する。０．９９５未満に水分活性を低下することは、部分的に乾燥した接種材料製品中に包装された細菌の生存率の促進に有効であると想定される。０．９９０未満（好ましくは約０．９８０未満）に水分活性を低下することは、部分的に乾燥した接種材料製品中の細菌の種子上での生存率の促進に有効であると想定される。
【００２２】
本明細書に使用される「乾燥剤」は、化合物又は化合物の混合物が、実際に液体接種材料の乾燥に影響を与える濃度で使用されるか否かにかかわらず、乾燥剤として分類できるどんな化合物又は化合物の混合物をも含むことができる。適切な乾燥剤の例は、トレハロース、スクロース、グリセロール及びトリエチレングリコールの１以上を含む。他の適切な乾燥剤は、これには限定されないが、非還元糖及び糖アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）を含む。
【００２３】
通常、液体接種材料に導入する乾燥剤の量は、部分的に乾燥した接種材料製品の約５％〜約５０％（重量／体積）の濃度である。乾燥剤がトレハロースの場合には、部分的に乾燥した接種材料製品の約１０％〜約４０％（重量／体積）の濃度が好ましい。より好ましくは、トレハロースの濃度は、部分的に乾燥した接種材料製品の約２０％〜約３０％（重量／体積）である。乾燥剤がソルビトールである場合には、部分的に乾燥した接種材料製品の約１０％〜約３５％（重量／体積）の濃度が好ましい。より好ましくは、ソルビトールの濃度は、部分的に乾燥した接種材料製品の約１５％〜約２０％（重量／体積）である。
【００２４】
乾燥処理剤は１以上の乾燥剤の混合物を含むことができる。実際、乾燥剤が本明細書で定義される場合、その混合物は２以上の乾燥剤の組み合わせであってもよい。例えば、乾燥処理剤にはトレハロースとグリセロールの混合物、トレハロースとスクロースの混合物、又はスクロースとトリエチレングリコールの混合物を含むことができる。トレハロースとグリセロールの混合物は、部分的に乾燥した接種材料製品の約５％〜約４０％（重量／体積）の濃度のトレハロース、及び部分的に乾燥した接種材料製品の約１％〜約１０％（重量／体積）の濃度のグリセロールを含むことができる。特に、混合物中のトレハロースとグリセロールの濃度は、それぞれ、部分的に乾燥した接種材料製品の約２０％（重量／体積）と約５％（重量／体積）とすることができる。トレハロースを乾燥剤として含む乾燥処理剤は、細菌(例えば、B japonicum)の種子(典型的には大豆が用いられる)上での生存を利用する本発明において特に有益であることが見出されている。
【００２５】
他の混合物も又、企図される。例えば、ソルビトールを他の乾燥剤例えばトレハロース及びスクロースと組み合わせることができる。ソルビトールは又、ポリビニルピロリドン(「ＰＶＰ」)などのポリマーと組み合わせることもできる。ソルビトールを乾燥剤として含む乾燥処理剤は、細菌(例えば、Rhizobium leguminosarum biovar viceae)の種子(典型的にはエンドウマメ及びレンズマメが用いられる)上での生存を利用する本発明において特に有益であることが見出されている。このソルビトールの有益な効果は、この組合せをエンドウマメ及びレンズマメに適用するかトウモロコシなどの他の穀物に適用するかにかかわらずに生じることが企図される。
【００２６】
液体接種材料が培養中の使用容器（例えば、発酵装置または振盪培養器）内にまだある時に、液体接種材料に乾燥剤を加えることができる。あるいは、包装する間に、液体接種材料に乾燥処理剤を加えることができる。
【００２７】
この乾燥処理剤を液体接種材料に包装工程前に(例えば、液体接種材料が未だ培養容器内にあるうちに)加える場合には、この部分的に乾燥した接種材料は、好ましくは、一度乾燥処理剤を液体接種材料に加えたならば、馴化段階(conditioning phase)に入れる。この馴化段階は、部分的に乾燥した接種材料製品を呼吸させる即ち周囲の空気にさらすことを含む。馴化段階中に、細菌は、好ましくは、全速で又はほぼ全速で代謝している。馴化段階の有意の利益は、細菌が乾燥剤に適応することである。馴化段階なしでは、乾燥剤は細菌にショックを与えるかも知れず、それは、減少した細菌生存率を生じる。
【００２８】
好ましくは、この馴化段階は、約１〜１０日間である。一層好ましくは、この馴化段階は、約２〜３日間である。この馴化段階の時間の長さは、加えた乾燥剤の種類、接種材料中の細菌の種類などによって変化しうる。
【００２９】
ある具体例では、接種材料製品中の細菌を少なくとも部分的に乾燥させるために、部分的に乾燥した接種材料製品には十分な乾燥剤が存在する。その結果（１）包装や保存等のその後のステップにおける細菌の安定性と生存率を改善し、（２）部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与える等のその後のステップにおける細菌の安定性と生存率を改善する。
【００３０】
そして、部分的に乾燥した接種材料製品は包装し、保存できる。包装は、当該業界で公知のどんな標準的な包装でもよい。例えば、ポリエチレン性の袋で部分的に乾燥した接種材料製品を包装できる。
【００３１】
部分的に乾燥した接種材料製品は、包装後に保存できる。保存状態としては、冷蔵温度から周囲温度まで、低い相対湿度から適度な相対湿度までを含むことができる。好ましくは、保存状態は約３５℃未満の温度及び約８０％未満の相対湿度を含む。一層好ましくは、保存状態は、約４〜５℃の温度を含み、約１５℃が最も好ましい。
【００３２】
部分的に乾燥した接種材料製品をさまざまな種子に与えることができる。例えば、豆科植物及び非豆科植物の種子に部分的に乾燥した接種材料製品を与えることができる。豆科作物は、大豆、ルーサン（アルファルファ）、ピーナッツ、エンドウマメ、レンズマメ、インゲンマメ等、経済的に重要な野菜を含む植物の大きい群を形成する。非豆科植物は、トウモロコシなどを含む。部分的に乾燥した接種材料製品の細菌は、根毛に浸透し、根にコロニーを形成し、小節を形成するために、根圏にコロニーを形成、及び／又は植物の根に感染することができる。この共生関係の結果、植物は窒素固定を介して窒素ガスを窒素の有機物に変えることができる。そして、植物は、成長のためにこれらの有機物を使用できる。
【００３３】
部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与えた時には、種子上の細菌数は様々である。部分的に乾燥した接種材料製品を与えて１０週間後の種子上の細菌数もまた様々であるが、その数は元の量から著しく逸脱すべきではないと考えられる。言い換えれば、時間が経過するにつれて、細菌数／種子が急激に減少すべきではない。例えば、部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与えた時の種子上の細菌数が少なくとも６×１０5であるなら、好ましくは、約１０週間後の種子上の細菌数は少なくとも１×１０5である。
【００３４】
本発明により調製した接種材料の利点は、これらの接種材料が以前に行なわれていたもの(即ち、約４．２液量オンス／ｃｗｔ未満)より少ない割合で適用することができて、しかも、同時に、以前に達成されていた生存率(即ち、１２週間後に、種子当たり１０5ｃｆｕを超える生存率)に匹敵し又は超える細菌の種子上での生存を達成することである。かかる高い種子上生存率を有する少ない容積率の適用は、幾つかの理由により有理である。
【００３５】
第一に、少容積適用率は、少ない加工及び輸送コストに訳せる(即ち、効果上同じ収率に対する加工及び輸送のための一層少ない容積)。
【００３６】
第二に、低容積の適用率は、種子の架橋(即ち、過剰の液体容積のための２以上の種子の凝集)を防止する。種子架橋の閾値は、一般に、１００ポンドの種子当たり約５液量オンス(「ｃｗｔ」)であり、高レベルの種子架橋は、約６液量オンス／ｃｗｔを超えると起きる。種子架橋は、接種材料による種子の完全な被覆を阻害し、又、それらの種子の植付けにおける均一な分布をも阻害する。
【００３７】
第三に、接種材料の低容積適用は、様々な機能的材料の、種子架橋閾値を超えることなく、細菌の高い種子上生存率を維持しながらの、同時の適用を可能にする(典型的には、１００ポンド当たり約６流体オンスより大)。この機能的材料は、殺生物性化合物を含むことができる。これらの殺生物性化合物には、殺虫剤、殺真菌剤、除草剤、殺菌剤、農薬、殺ウイルス剤、ダニ駆除剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺鼠剤又はこれらの組合せが含まれうる。好適な殺生物性化合物には、殺真菌剤及び殺虫剤が含まれる。例えば、APRONMAXX RFC (Mefenoxam, Fludioxonil)、APRONMAXX RTA (Mefenoxam, Fludioxonil)、WARDEN RTA (Mefenoxam, Fludioxonil)、CRUISERMAXX (PAK)(Thiamethoxam, Mefenoxam, Fludioxonil)、CRUISER (Thiamethoxam)、及びBEAN PAK (Mefenoxam, Fludioxonil)は、特に好適である。
【００３８】
これらの殺生物性化合物は、本発明の接種材料と任意の方法で組み合わせて、接種材料混合物を形成することができる。例えば、１００ポンドの種子に対して、２液量オンスの本発明の接種材料、１液量オンスの第一の殺生物性化合物、１液量オンスの第二の殺生物性化合物、及び１液量オンスの水を、混合物として種子に加えることができる。かかる接種材料混合物は、高い種子上生存率の利益、第一の殺生物性化合物の利益、及び第二の殺生物性化合物の利益を、種子架橋の害を生じることなく、これらの利益を達成して害を回避するための新たな配合物を必要とすることなく、有する。所望であれば、この接種材料混合物は、水を、１液量オンスより大容量で含むことができる。増大された水容積は、増大された種子被覆面積を可能にし、接種材料混合物の種子上保存寿命をも延長する。
【００３９】
殺生物性化合物と本発明の接種材料を組み合わせるタイミングも又、変化しうる。この殺生物性化合物と接種材料は、一緒に混合して混合物を形成してから、その混合物を種子に適用する。この殺生物性化合物と接種材料は、同時に種子に適用することができる。この殺生物性化合物と接種材料は、順次的に種子に適用することができ、その適用の順序及びタイミングは変化しうる。
【００４０】
１ポンド当たり２，０００〜５，０００種子の大きさを有する種子については、それらの種子に適用される接種材料混合物(例えば、接種材料のみ、接種材料と水、接種材料と殺生物性化合物、接種材料と殺生物性化合物と水)中の液体の全容積は、好ましくは、約４．０液量オンス／ｃｗｔより大きい。一層小さい大きさの(即ち、１ポンド当たり約５，０００種子を超える)種子は、増大した表面積を有する。従って、所望の細菌の種子上での安定性(例えば、種子上で、約１０週間後に、１０5ｃｆｕ／種子より大)を達成するためには、接種材料混合物中の液体の一層大きい全容積が必要でありうる。逆に、一層大きい大きさの種子については、所望の細菌の種子上安定性を達成するために、接種材料混合物中の一層少ない液体の全容積が必要でありうる。
【００４１】
実施例４及び５は、本発明の部分的に乾燥した接種材料を低容積適用率で適用した場合の、細菌の種子上生存数を示している。
【００４２】
好ましくは、この接種材料は、個々に袋中に包装される。これらの袋は、ポリプロピレン、ポリエチレン及び他の類似の材料から作成することができる。或は、この接種材料は、一種以上の殺生物性化合物及び／又は一種以上の他の成分例えば着色料及び Bacillus subtilisと包装することができる。この組合せ物の接種材料／殺生物性化合物、接種材料／他の成分、接種材料／殺生物性化合物／他の成分を、一緒に、マルチパック(例えば、ツインパック)として包装することができる。
【００４３】
更に別の方法においては、この接種材料を、２つの別々のコンポーネントとして包装することができる。第一のコンポーネントは、「超濃縮物」である。超濃縮物は、細菌、水、少なくとも一種の乾燥剤、及び少なくとも一種のポリマーを含む。この超濃縮物は又、ゲル化剤をも含みうる。この細菌は、ここで論じている細菌の何れであってもよいが、好ましくは、B. japonicumである。この乾燥剤は、ここで論じている乾燥剤の何れであってもよいが、好ましくは、トレハロースである。このポリマーは、ここで論じているポリマーの何れであってもよいが、好ましくは、ビニルピロリドンとビニルアセテートのコポリマーである。ゲル化剤は、ここで論じたゲル化剤の何れであってもよいが、好ましくは、ジェランガムである。
【００４４】
第二のコンポーネントは、「調節剤」である。この調節剤には、水、少なくとも一種の乾燥剤及び少なくとも一種のポリマーが含まれる。この調節剤は又、水を含むこともできる。この乾燥剤は、ここで論じた乾燥剤の何れであってもよいが、好ましくは、トレハロースである。このポリマーは、ここで論じたポリマーの何れであってもよいが、好ましくは、ビニルピロリドンとビニルアセテートのコポリマーである。
【００４５】
超濃縮物を造るためには、細菌を、栄養培地で、約２〜１０日間、約２０〜３５℃の温度で培養することができる。この栄養培地は、ミクロフィルターにより一層少容積とすることができる(例えば、１００リットルから５リットルに)。この栄養培地をミクロフィルター処理するためには、この培地を、好ましくは、無菌のミクロフィルトレーションユニットを、所望の細菌濃度のレベル(例えば、約１×１０11ｃｆｕ／ｍｌ〜１×１０12ｃｆｕ／ｍｌ)に達するまで通過させる。このミクロフィルター処理した容積を、次いで、元の栄養培地の容積より小さい一層大容積のユニット(例えば、５リットルから１０リットル)に、水、乾燥剤、ポリマー及びゲル化剤(できるかぎり)(例えば、水＋３０％ｗ／ｖ(最終容積に対して)、１％ｗ／ｖビニルピロリドン及びビニルアセテートコポリマー、及び０．０５％ｗ／ｖジェランガム)を加えることによって近づくことができる。その結果生成したユニットは、種子上適用まで、約２〜２０℃で保存することができる。
【００４６】
調節剤を造るためには、乾燥剤、ポリマー及び水(できるかぎり)の混合物を、超濃縮物(例えば、９０リットルのトレハロース(３０％ｗ／ｖ)、ビニルピロリドン及びビニルアセテートコポリマー(１％)、及びジェランガム(０．０５％ｗ／ｖ))から別々に調製することができる。この混合物を殺菌して(但し、不可欠ではない)、無菌的に包装してから、種子上適用まで、約１５〜２５℃で貯蔵することができる。
【００４７】
この超濃縮物及び調節剤を、一緒に、種子上に適用することができる。この組合せは、水及び／又は機能的化合物(例えば、殺生物性化合物)と供に適用することができる。１００ポンドの種子への適用のために、超濃縮物の量は、好ましくは、約０．１〜０．５ ｆｌ ｏｚ．であり、一層好ましくは、０．２ｆｌ ｏｚ．である。調節剤の量は、好ましくは、約１．２〜２．５ｆｌ ｏｚ．であり、一層好ましくは約１．８ｆｌ ｏｚ．である。水及び／又は機能性化合物の量は、好ましくは、約１．５〜５．５ｆｌ ｏｚ．であり、一層好ましくは、約３．０ｆｌ ｏｚ．である。この組み合わせた超濃縮物及び調節剤中の細菌の濃度は、好ましくは、約１×１０9〜５×１０11ｃｆｕ／ｍｌであり、一層好ましくは、約１×１０10ｃｆｕ／ｍｌである。
【００４８】
包装内及び種子上での部分的に乾燥した接種材料製品中の細菌の安定性と生存率を改善するために、部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与える前に、部分的に乾燥した接種材料製品にポリマーを任意に加えることができると想定される。ポリマーは、包装ステップの前または保存ステップの後に加えることができる。ポリマーはポリビニルピロリドン、アルキル化ビニルピロリドンポリマー類、ビニルピロリドン、酢酸ビニル共重合体(例えば、International Specialty Products から市販されている「Ｓ−６３０」など)、ビニルピロリドン、スチレン共重合体、ポリビニールアルコール重合体、その他類似のポリマーを含むことができる。ポリマーは、部分的に乾燥した接種材料製品の約１％〜２５％（重量／体積）の濃度にすることができる。
【００４９】
細菌が実質的に定常期に達した後、部分的に乾燥した接種材料製品を作製するために液体接種材料へ乾燥剤を添加することは、播種時に増量剤を加える必要なく細菌の安定性を改善するが、そのことは増量剤の使用を妨げるものではない。実際、本発明の範囲内では、部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与えた後に増量剤を種子に与えることができる。播種時、又は部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与える時に、増量剤を加えることができる。増量剤は糖、増粘剤、カルボキシメチルセルロース、及びポリマーをベースにするもの等、一般的に使用されるどんな増量剤も含むことができる。
【００５０】
乾いた、流動性のある接種材料の剤形を形成するために泥炭、粘土、及び／又は他の同様の乾いた担体に、部分的に乾燥した接種材料製品を添加することができる。噴霧または他の公知手段で、部分的に乾燥した接種材料製品を添加することができる。
【００５１】
ここで、以下の非限定的な実施例を用いて本発明を具体的に説明する。
【実施例】
【００５２】
実施例１ トレハロース及びグリセロール／トレハロース混合物の存在下におけるBradyrhizobium japonicumの安定性の評価
７日間熟成発酵培地を作製するためにB japonicumを振盪フラスコの栄養培地中で振盪培養器によって２８℃で培養した。４種の処理剤（表２参照）を２５０ｍｌの振盪フラスコに準備した。１種の処理剤を２つずつ準備したので、２５０ｍｌの振盪フラスコが合計８個となった。５０ｍｌの７日間熟成発酵培地をそれぞれの振盪フラスコに加えた。すべてのフラスコの成分は、さらに、振盪培養器によって２８℃で７日間平均化した。平均化させた後に、それぞれの処理液のひとつのフラスコを２８℃の静止培養に移した。それぞれの処理液のもうひとつのフラスコを３５℃の静止培養に移した。
【表２】
【００５３】
フラスコから定期的にサンプルを採取し、生存している細菌数を算定するために一般プレート生菌数測定を行った。菌数測定は、まず、サンプルを混ぜ、目盛り付きピペットと無菌チップを使用して１ｍｌのサンプルを取り、９ｍｌの逆浸透（ＲＯ）水の入った試験管に入れ、１０倍希釈液を作製することによって実施した。そして、１０００μＬのRainin社製ピペット（較正し、１０００μＬにセットする）と無菌チップを用いて、１０００μＬの１０倍希釈液を１０倍希釈試験管から取り、別の９ｍｌ逆浸透水の入った試験管に移し、１００倍希釈液を作製した。希釈液を移すときには、ボルテックス及び無菌操作に注意し、これらのステップを１０7倍希釈まで繰り返した。
【００５４】
１００μＬのRainin社製ピペット（較正し、３０μＬにセットする）と無菌チップを用いて１０倍希釈液試験管から３０μＬを取り、雑菌混入検出プレートとして用意した栄養寒天プレート上に１０μＬずつ３滴加えた。栄養寒天培地はOxoid社製であった。これらのステップは１０-5、１０-6、および１０-7希釈を除く希釈液で繰り返し、そのサンプルは標準のコンゴレッド酵母マンニトール寒天（ＣＲＹＭＡ−表３参照）のプレートに加えた。
【表３】
【００５５】
プレートを裏返しにする前に乾燥し、２８℃のインキュベーターにそれらを５日間置いた。５日後に、コロニーの数を低倍率顕微鏡下で数えた。総コロニー数は、平均×希釈倍率×１００によって算出した。
【００５６】
２８℃の液体培地中で培養したB japonicumの生存について４つの処理の結果を図１に示す。３５℃の液体培地中で培養したB japonicumの生存についての処理の結果を図２に示す。５％のグリセロール処理は試験中に汚染されたので、図２に含めていない。
【００５７】
図１に示した結果は、２８℃での２０％トレハロース処理、及び２０％トレハロース／５％グリセロール処理が液体培地中の細菌の生存に適していることを示す。未処理の細菌数は実験開始から約１２週目〜１６週目のいずれかの時点で減少し始めた。反対に、２０％トレハロース処理、及び２０％トレハロース／５％グリセロール処理の細菌数はその同じ期間、及びそれ以後の期間でさえ比較的一定のレベルで残った。
【００５８】
図２に示した結果は、３５℃での２０％トレハロース処理が培地中の細菌の生存に適していることを示す。未処理を含む他の処理の細菌数は実験の初期で著しく減少したが、２０％トレハロース処理の細菌数は実験中、比較的一定レベルで残った。
【００５９】
１０週間後に、未処理及び２０％トレハロース処理からサンプルを採取し、大豆種子に施した。種子は２２℃で培養した。定期的にサンプルを取り、B japonicumの生存数を評価した。種子の生存を評価する方法は以下の通りであった。
【００６０】
５００ｇの大豆種子を測定し、ラベルしたジッパー付きの汚れのないポリ袋の中に入れた。２ｍｌのシリンジまたは２ｍｌの無菌ピペットを使用して、１．３８ｍｌの処理剤を均等に種子の表面に施した。そして、種子に接種したポリ袋の中に外気を取り込んだ。次に、すぐにポリ袋の封をし、種子が処理物質で均等に被覆されるまで（約３０秒間）振盪した。ポリ袋は、乾燥するまで（約１０分間）実験室条件下（２１℃）で直射日光から避けて封をせずに放置した。乾燥アルコールで拭いた完全な長さのスクープへらを使用して、傷のない種子１００個を正確にポリ袋から無作為に選択した。その種子をあらかじめ準備した１００ｍｌの希釈ボトルの中に入れた。ボトルを閉じて、すぐに、約１分間強く振盪した。準備した１００ｍｌのボトルから、無菌方法を用いて、懸濁液の連続希釈液を以下のように作製した：（１）１００ｍｌのボトルを振盪した後、すぐに、１ｍｌの懸濁した細菌と希釈剤とを９ｍｌのＲＯ水の入った希釈チューブの中に無菌的に移し、１０倍希釈液を作製した。（２）１０倍希釈液を１５秒間ボルテックスした。（３）ボルテックス後、すぐに１ｍｌの１０倍希釈液を９ｍｌのＲＯ水の入った別の希釈チューブの中に移し、１００倍希釈液を作製した。（４）１００倍希釈液をボルテックスした。：（５）ステップ（３）と（４）とを繰り返し、１０3及び１０4倍希釈液を作製した。
【００６１】
使用した希釈チューブの詳細、処理の詳細、及びプレートした日付を、コロニー評価用寒天プレートに表記した。プレートは各希釈液のために２枚ずつ作製した。希釈液チューブからサンプリングし、それらを寒天プレートに入れる前に、希釈液をボルテックスした。次に、標準の無菌ピペット操作のテクニックを用いて、それぞれの希釈液の１００μＬサンプルを各寒天プレートの中心に分注した。無菌延展器具を使用して、サンプルを均等にプレートの表面に広げた。そして、プレートを７日間２８℃で培養した。培養後、それぞれのプレートのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を数えて、記録した。１プレートあたりのＣＦＵの数を算出するために、以下の計算式を用いた：［平均コロニー数×｛表示された希釈×１０(a)×１００(b)｝／１００(c)］、式中、（ａ）は希釈液からプレート１枚あたり０．１ｍｌ取ったことによる補正値、（ｂ）はオリジナルの希釈ボトル中に１００ｍｌあることによる補正値、（ｃ）はオリジナルサンプル中の種子の数による補正値である。
【００６２】
１０週間後の種子上のB japonicumの生存結果を図３に示す。その結果、未処理では、細菌数が１×１０5／種子を超えていた期間の長さが１週間未満であったが、２０％トレハロース処理では１０週間を超えた。これらの結果は、細菌が種子に置かれる場合、２０％のトレハロース濃度による処理が細菌の良好な生存性を提供することを示す。
【００６３】
実施例２ B japonicum安定化に必要なトレハロース／スクロースのレベルの最適化
フラスコを準備するための手順は、実施例１と同じであった。この実施例のための処理を表４に示す。
【表４】
【００６４】
２８℃の液体培地で培養したB japonicumの生存についての処理の結果を図４に示す。３５℃の液体培地で培養したB japonicumの生存についての処理の結果を図５に示す。
【００６５】
図４に示される結果は、２８℃では、１０％〜３０％（重量／体積）のトレハロース濃度処理が液体培地での細菌の生存に最適であることを示す。また、図４は、５％〜１０％（重量／体積）のスクロース濃度処理が液体培地での細菌の生存に好ましいことを示すが、トレハロース処理と同程度ではない。また図４は、４０％トレハロース濃度の処理で細菌が生存できることを示し、このことは、微生物の増殖を抑制する処方においても細菌が生存する能力を持っていることを示す。
【００６６】
図５に示される結果は、３５℃では、１０％〜３０％（重量／体積）のトレハロース濃度処理が液体培地での細菌の生存に最適であることを示す。また、図５は、５％（重量／体積）のスクロース濃度処理が液体培地での細菌の生存に好ましいことを示すが、トレハロース処理と同程度ではない。
【００６７】
１０週間後、表４に記載された処理からサンプルを採取し、大豆種子に施した。その種子を２２℃で培養した。最初に６日後、２週間後、４週間後にサンプルを採取した。これらのサンプルから、生存しているB japonicumの数を算定した。種子上での生存を評価する方法は上の実施例１で記載されたとおりであった。種子上での生存の結果を図６に示す。
【００６８】
図６に示される結果は、２２℃では細菌が種子に置かれるとき、２０％〜３０％（重量／体積）のトレハロース濃度処理が液体培地での細菌の生存に最適であることを示す。
【００６９】
実施例３ 液体培地処方におけるSerratia Proteomaculans及びPseudomonas Fluorescensの安定性の評価
細菌培地を作製するためにSerratia proteomaculans（「S proteomaculans」）を標準の微生物培地（半分に薄められたトリプシンの大豆培地−「ＴＳＢ」）中で２２℃、２４時間培養した。表５に記載された処理の１つに対応する各フラスコを１セット準備した。５０ｍｌの細菌培養液をそれぞれのフラスコに加えた。すべてのフラスコをさらに振盪培養器によって３日間、２２℃で平衡化した。そして、フラスコを２８℃での静止培養に移した。定期的に、サンプルを採取し、連続的に希釈し、半分に薄められたトリプシンの大豆寒天培地−「ＴＳＡ」にプレーティングすることによって、細菌の数を算定した。
【００７０】
Pseudomonas fluorescens（「P fluorescens」）のために同じステップを繰り返した。
【表５】
【００７１】
２８℃の液体培地でのP fluorescensの生存についての処理の結果を図７に示す。その結果は、２８℃では、グリセロール、トレハロース及びスクロースでの処理のすべてがP fluorescensの生存性を改善する能力を有することを示す。
【００７２】
２８℃の液体培地でのS proteomaculansの生存についての処理の結果を図８に示す。その結果は、３０％トレハロース処理、１０％スクロース処理及び３０％スクロース処理の生存数が４週間以上、未処理よりも多いことを示す。このデータは、その処理がS proteomaculansの生存性を改善する能力を有することを示す。
【００７３】
実施例４ 低容量適用率の、「種子上での」生存率に対する効果及び市販製品との比較
部分的に乾燥した接種材料製品を実施例１により製造した。その製品は、B japonicum、２０％トレハロース、及び２％Ｓ−６３０を含んだ。その製品を、種子に適用する前に、５００ｍｌの袋中に、空気を伴わずに、５℃で、４ヶ月保存した。
【００７４】
この部分的に乾燥した製品を、大豆種子(１２％の水分)に適用した。これらの種子を、種子１００ポンド当たり４液量オンスの全体積(部分的に乾燥した接種材料製品及び水)で処理した。この処理物を、様々な体積の濃縮物(種子１００ポンド当たり１〜４液量オンス)を、総体積を種子１００ポンド当たり４液量オンスにするための適当量の水と共に用いて調製した。一度処理したならば、それらの種子を、この袋を開けたままにして、種子を周囲温度(１８〜２０℃)で保存した。
【００７５】
種子を、２種類の市販の液体でも処理した。市販の液体Ａ(未開示の添加物を有する大豆接種材料)を、５．０ｆｌｏｚ／ｃｗｔの比率で適用した。市販の液体Ａは、ＡｐｅｘＰｒｏ4(Agribiotics, Inc.製の液体大豆接種材料)であった。市販の液体Ｂ(未開示の添加物を有する大豆接種材料)を、４．２５ｆｌｏｚ／ｃｗｔの比率で適用した。市販の液体Ｂは、Ｃｅｌｌ−Ｔｅｃｈ(登録商標)ＳＣＩ(商標)(Nitragin, Inc.製の液体大豆接種材料)であった。
【００７６】
これらの種子を採取するために、５０種子を、無菌のスパーテルを用いて無作為に選択して、ＲＯ水を含む１００ｍｌの無菌の医用フラットに移した。これらの種子を、１分間激しく震盪した。１０００μｌの試料を無菌的に採取して９ｍｌのＭｃＣａｒｔｎｅｙ瓶に移した。
【００７７】
無菌技術を利用して、この懸濁液の連続希釈物を、次のように調製した：(１)この１００ｍｌの瓶の震盪後すぐに、１ｍｌの懸濁させた細菌及び希釈剤を無菌的に９ｍｌの希釈用のＲＯ水のチューブに移し、それにより１０-1希釈物を造り、(２)この１０-1希釈物を１５秒間ボルテックスし、(３)ボルテックス後すぐに、この１０-1希釈物１ｍｌを他の９ｍｌの希釈用のＲＯ水のチューブに移して１０-2希釈物を造り、(４)次いで、この１０-2希釈物をボルテックスし；(５)工程(３)及び(４)を反復して、１０-3及び１０-4希釈を達成する。
【００７８】
次いで、コロニー評価用の寒天プレート(Yeast Mannitol Agar)に、用いた希釈用チューブの詳細、処理の詳細、及びプレートした日付のラベルを付した。各希釈物について、複製プレートを造った。これらの希釈用チューブから試料を採取して寒天プレート上にプレートする前に、これらの希釈物をボルテックスした。次いで、標準的な無菌のピペッティング技術を利用して、これらの希釈物の各々１００μｌの試料を各寒天プレートの中央に分配した。無菌のスプレッダーを用いて、これらの試料をプレートの表面に均一に広げた。次いで、これらのプレートを、５〜６日間、２８℃でインキュベートした。インキュベーション後、コロニー形成単位(ＣＦＵ)の各プレート上での数を計数して記録した。次いで、次の計算を利用して、ＣＦＵ／プレートの数を決定した：[平均コロニー×{ラベル付けした希釈物×１０(a)×１００(b)}／１００(c)]、(式中、(ａ)は、希釈物からの０．１ｍｌ／プレートについての補正値であり、(ｂ)は、元の希釈用瓶中の１００ｍｌについての補正値であり、(ｃ)は、元の試料中の種子の数についての補正値である)。
【００７９】
この種子上生存の結果を図９に示した。これらの結果は、本発明の部分的に乾燥した接種材料の最少の２液量オンスの濃縮物(全部で種子１００ポンド当たり４液量オンスを適用)が、処理後６週間より長期間、１０5ＣＦＵ／種子を超える種子上安定性を達成したことを示している。これらの結果は又、本発明の部分的に乾燥した接種材料製品を用いた場合の種子上生存率が、試験した２種類の市販の液体のそれよりも優れていることをも示している。
【００８０】
実施例５ − 少容積適用比率の、「種子上」生存率への効果及び市販製品との比較
実施例４と同じ手順にしたがったが、但し、接種材料製品は、１％ Ｓ−６３０を含み(２％ Ｓ−６３０ではない)、その製品は、３．１Ｌの袋に保存され(５００ｍｌの袋ではない)、そしてこれらの種子は、一定の２０℃で保存された(１８〜２０℃ではない)。
【００８１】
この種子上生存の結果を、図１０に示した。これらの結果は、最少の２液量オンス濃度の本発明の接種材料(全部で、種子１００ポンド当たり４液量オンスを適用)が、１０5ＣＦＵ／種子を超える種子上安定性を、処理後６週間を超えて達成することを示している。これらの結果は又、本発明の部分的に乾燥した接種材料製品による種子上生存が試験した２種類の市販の液体より優れていることをも示している。
【００８２】
実施例６ − 農薬の相溶性の研究
フラスコの準備のために従った手順は、実施例１におけるものと同じであった。この実施例のための処理は、３０％ トレハロース及び１％ Ｓ−６３０を含む。
【００８３】
この処理を、種子に、異なる３つの仕方で施与した。第一の試験は、この部分的に乾燥した接種材料製品のみを種子に加えた。この試験の結果を、表６に示した。第二及び第三の試験は、部分的に乾燥した接種材料製品と農薬を種子に施与した。第二の試験における農薬は、APRONMAXX RTA であり、５ｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ.の適用比率で施与した。第三の試験における農薬は、CRUISERMAXX であり、３ｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ.の適用比率で施与した。
【００８４】
第二及び第三の両試験においては、これらの農薬を、次の３つの方法で加えた：タンク混合、順次的施与、及び同時施与。第二の試験の結果を、表７に示し、第三の試験の結果を表８に示した。
【００８５】
タンク混合のためには、示されたｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔの適用比率の部分的に乾燥した接種材料製品を、４時間にわたって２０℃で、表示した農薬比率でタンク混合した。混合時間後に、この組合せ接種材料製品／農薬を、累積ｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ比率で種子に施与した。
【００８６】
順次的施与のためには、農薬を種子に指示した比率で施与し、その後、乾燥させた。次いで、部分的に乾燥した接種材料製品を、示したｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ適用比率で、全比率を４ｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ(例えば、２ｆｌ ｏｚ.／接種材料製品＋２ｆｌ ｏｚ.水)にする容積の水と共に施与した。
【００８７】
同時施与のためには、部分的に乾燥した接種材料製品と農薬を、同時に、種子に施与した。この農薬は、表示した比率で種子に施与された。部分的に乾燥した接種材料製品を、示したｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ適用比率(例えば、２ｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ)で施与した。
【００８８】
表６〜８に記した「種子上保存寿命」は、部分的に乾燥した接種材料製品を種子に施与した後の、日数である。rhizobium計数／種子は、１×１０5rhizobium／種子の閾値レベル(現行のカナダ国の規制閾値)を超えた。
【００８９】
【表６】
【００９０】
【表７】
【００９１】
【表８】
【００９２】
実施例７ − 糖／糖アルコール研究
部分的に乾燥した接種材料製品を、先ず、Rhizobium leguminosarum bv. viceae 培養培地中でRhizobium leguminosarum を生育させることによって製造した。２つの異なる培養培地１ＸＲ１及び１．５ＸＲ１(これらは、エンドウマメ及びレンズマメの発酵培地である)を用いた。この１．５ＸＲ１は、１ＸＲ１より５０％多い媒質成分を有する。３日間の培養成長の後に、糖又は糖アルコールを無菌的にこの培養物に加えた。この培養物に加えた糖又は糖アルコールの量は、下記の表９に終濃度(重量／体積)にて示してある。この培地を、次いで、２日間、馴化段階に置いた(この段階で、この培養物は、成長を続け、それにより、部分的に乾燥した接種材料製品を造る)。この部分的に乾燥した接種材料製品を、次いで、エンドウの種子に３．１Ｌ接種材料製品／１１３６ｋｇ種子の比率で施与した。これらの種子を、次いで、袋の中で、接種物製品が種子上に一様に分配されるように振り動かすことにより混合した。これらの種子を、次いで、１５℃に保存した。
【００９３】
表９に示したように、種子上の細菌の計数は、接種材料を種子に施与した後、６日目、１２日目、１８日目、及び２９日目に行われた。これらの細菌の計数は、前記の実施例と同様の仕方で行われた。即ち、５０種子を、希釈瓶中の１００ｍｌのリン酸緩衝液に入れた。１０倍連続希釈を行なって、０．１ｍｌの適当な希釈物を、栄養培地プレート上に広げた。種子上の生存細菌細胞を、これらのプレート上のコロニー数に基づいて計算した。
【表９】
【００９４】
これらの結果は、ソルビトールが、Rhizobium leguminosarum の種子上保存寿命の延長に関して、試験したものの内で最高の実行性のある糖又は糖アルコールであることを示唆している。
【００９５】
実施例８ − ２０％ソルビトールを用いたソルビトールの研究
実施例７に続いて、２０％ソルビトールを、ジェランガム(「ＧＧ」)(Kelcogel F Low Acyl)を伴う又は伴わない更なる評価のために選択した。下記の工程を行なった：
１．Rhizobium leguminosarum を１．５ＸＲ１培地中で、２日間、３０℃で、１６０ｒｐｍにて生育させた。
２．１％のこの母培養物を、１．５ｘＲ１培地(３．４１Ｌ)、３０℃、０．１ｖｖｍ、１５０ｒｐｍ、ｐＨ６．６〜７．４に接種した。
３．３日間の生育の後に、２０％のソルビトール(終濃度ｗ／ｖ)を発酵装置に加え、発酵／馴化工程を２日間継続した後、収穫した。(８３％ソルビトール＝８３ｇ＋４６ｍｌ Ｈ2Ｏ)
４．ジェランガム(０．１％)を３袋に収穫時に加えた。
５．培養物を４〜５℃で保存した。
６．１％Ｓ−６３０を肉汁に加えた後、種子に施与した。２．７ｍｌ／ｋｇ。
７．部分的に乾燥した接種材料製品をエンドウの種子に、１１３６ｋｇの種子当たり３．１Ｌの接種材料製品の比率で施与した。
８．種子を袋内で、種子上に接種材料製品を均一に分配するために振盪することによって混合した。
９．それらの種子を、１５℃及び２０℃で保存した。
【００９６】
これらの試験の結果は、図１１に示してある。図１１に記した標準的配合物は、上記のように調製された培養物であった。図１１に記した濃縮物を遠心分離してペレット化し、等容の上記の細胞培養肉汁で上清を置き換えた。そうして、この細胞濃度は、倍化された(もっとも、他のすべての配合物パラメーターは、一定に維持された)。両配合物の施与比率は、４．２ｆｌ ｏｚ／ｃｗｔ(水なし)であった。
【００９７】
ある種の処理(即ち、ジェランガムを含まない標準的配合物)を二連で進めた。それらの試験からの結果は、図１２に示してある。これらの結果に基づいて、種子上安定性温度は、決定的に重要であり、１５℃の温度は、種子上保存寿命を２０℃に拡大する。
【００９８】
実施例９ − 大豆でのソルビトール対トレハロース
実験を行なって、B japonicumを有する大豆への施与に一層適しているのはソルビトールかトレハロースかを決定した。下記の工程を実施した：
１．B japonicum株５３２Ｃを、５日間、１．５ＸＢｊ２(大豆発酵培地)中で、３０℃で、１６５ｒｐｍにて生育させた。
２．ソルビトール(２０％ｗ／ｖ)又はトレハロース(３０％ｗ／ｖ)をこの培養物に加えて、これらの培養物を、５日間、３０℃で、１６５ｒｐｍにて維持した。
３．２．７ｍｌ／ｋｇのソルビトール又はトレハロースで修正した培地を、ダイズ種子に施与した。種子を均一に被覆した。
４．種子を、１８〜２０℃で保存した。
５．種子上での根粒菌の生存力を、時間ゼロと７日後にモニターした。
【００９９】
これらの試験の結果を図１３に示した。これらの結果に基づいて、トレハロースは、B japonicumへの適用について、ソルビトールより一層適している。
【０１００】
実施例１０ − 多成分接種材料組成物の大豆種子への施与
実験を行なって、細胞濃度及び超低濃度トレハロース修正された根粒菌接種材料の、大豆種子上生存率への影響を測定した。下記の工程を行った：
１．B.japonicum 株５３２ｃを、１００Ｌの栄養媒質中で、７日間、２８℃で培養した。この１００Ｌを、次いで、ミクロフィルター処理して５リットルとし、水＋３０％ｗ／ｖ*トレハロース、１％ Ｓ６３０ｗ／ｖ*及び０．０５％ｗ／ｖジェランガム(最終的な１０Ｌにおける*ｗ／ｖ)の添加により１０Ｌとして、「超濃縮」肉汁を形成した。この超濃縮肉汁を、無菌的に包装する前に更に７日間発酵させた。この超濃縮肉汁中のB.japonicum の濃度は、２．７×１０11ｃｆｕ／ｍｌであった。この肉汁を、適用前、５℃で保存した。
２．トレハロース(３０％ｗ／ｖ)、Ｓ６３０(１％ｗ／ｖ)及びジェランガム(０．０５％ｗ／ｖ)を殺菌して、無菌的に「調節剤」として包装した。収穫した調節剤ユニットを適用まで２０℃で保存した。
３．この超濃縮物０．２ｆｌ ｏｚ.、調節剤１．８ｆｌ ｏｚ.及び水３ｆｌ ｏｚ.を混合した。B.japonicum の混合物中の濃度は、７．４×１０9ｃｆｕ／ｍｌであった。この混合物を、１００ｌｂの大豆種子に比例配分ベースで適用した。
４．接種された種子を、１５℃及び２０℃で保存し、数週間間隔で、上記の方法論を利用して評価した。
【０１０１】
これらの試験の結果を表１０及び図１４に示した。
【表１０】
【０１０２】
形態と構成をさまざまに変えて本発明を実施できることは、当業者に良く理解されるであろう。開示された実施例以前の詳細な説明は、唯一、理解を明らかにする目的のために提示され、不必要な制限がそこに暗示されているわけではない。
【技術分野】
【０００１】
これは、特許出願第１１／０２０，７１４号(２００４年１２月２３日出願)(その全開示を参考として本明細書中に援用する)の部分継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、液体接種材料に関するものである。特に、本発明は包装された液体接種材料中の細菌の生存率と安定性を改善するための方法及び種子に与える時期に関する。
【０００３】
様々な微生物には植物に対する有益な効果があることが知られている。これらの微生物にはRhizobium（Bradyrhizobiumを含む）、Pseudomonas、Serratia、Bacillus（Paenibacillusを含む）、Pasteuria、Azotobacter、Enterobacter、Azospirillum、Methylobacterium、Cyanobacteria（らん藻類）属の菌類、および菌根菌を含む。これらの微生物は接種組成物を用いて植物に導入できる。接種組成物を作製する過程は、通常、栄養培地で微生物を発酵させるステップを含む。
【０００４】
接種組成物は、植物の種子に直接与えること、又は種子を植えつける前に直接畝間に散布することができる。作物を改良するために、種子又は土への有益な微生物の接種は長年にわたり実施されている。しかし、バラつきのある、一貫性のない結果がしばしば認められている。それは、おそらく接種材料の生存力の喪失、又は接種材料の生存力の変化による供与量のバラつきのためである。
【０００５】
畝間に散布しようと種子に与えようと、接種材料を播種時に加えるのでは、接種材料中の微生物が新しい環境に適応する時間がない。その結果、接種材料中の微生物の生存率は低くなる。
【０００６】
現在は、接種材料中の微生物の生存率を改善するために、接種材料を種子に加えるとき、又は播種時に、糖、又はポリマーベースの増量剤が加えられる。それらの増量剤は接種材料の包装の後に加えられるので、包装内の接種材料の生存能力及び安定性には増量剤は影響を与えない。
【０００７】
また種子に接種材料を与えるとき又は播種の際に、増量剤を添加することは煩雑であり、さらに、それは通常、接種材料の末端利用者（例えば、農業者）によって非制御環境下（例えば、納屋や圃場）で実施されるはずである。したがって増量剤が不適切に使用される確率が高くなることが予想される。
【０００８】
また接種材料の作製後に増量剤を加えることによる問題を克服するために、液体接種材料を作製する発酵ステップの前にも、栄養培地に増量剤が加えられる。しかし、種子上で生存させるための最適量の増量剤を発酵前に添加すると、微生物の成長が抑制される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、保存中の液体接種材料の微生物（例えば、細菌）の生存率と安定性を高める方法、及び、いったん種子上に施された液体接種材料中の微生物の種子上での生存率と安定性を改善する方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１つの実施例は、乾燥剤を含む液体接種材料製品を製造するための方法である。その方法は、実質的に定常期まで増殖させた細菌の液体接種材料を供給することを含む。乾燥剤を含む乾燥処理剤は、部分的に乾燥した接種材料製品を形成するために液体接種材料に加えられる。
【００１１】
本発明の別の具体例では、部分的に乾燥した接種材料製品は、包装され、保存される。
【００１２】
本発明の更なる具体例では、部分的に乾燥した接種材料は種子に施される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は本発明のいくつかの具体例による、時間と温度の関数として示したBradyrhizobium japonicum（「B japonicum」）の液体培地中での生存グラフである。
【図２】図２は本発明のいくつかの具体例による、時間と温度の関数として示したB japonicumの液体培地中での生存グラフである。
【図３】図３は本発明のいくつかの具体例による、時間と温度の関数として示したB japonicumの種子上での生存グラフである。
【図４】図４は本発明のいくつかの具体例による、乾燥剤の種類及び量の関数として示したB japonicumの液体培地中での生存グラフである。
【図５】図５は本発明のいくつかの具体例による、乾燥剤の種類及び量の関数として示したB japonicumの液体培地中での生存グラフである。
【図６】図６は本発明のいくつかの具体例による、乾燥剤の種類及び量の関数として示したB japonicumの種子上での生存グラフである。
【図７】図７は本発明のいくつかの具体例による、乾燥剤の種類及び量の関数として示したPseudomonas fluorescens（「P fluorescens」）の液体培地中での生存グラフである。
【図８】図８は本発明のいくつかの具体例による、乾燥剤の種類及び量の関数として示したS proteomaculans（「S proteomaculans」）の液体培地中での生存グラフである。
【図９】図９は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Bradyrhizobium 菌数のグラフである。
【図１０】図１０は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Bradyrhizobium 菌数のグラフである。
【図１１】図１１は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Rhizobium 菌数のグラフである。
【図１２】図１２は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Rhizobium 菌数のグラフである。
【図１３】図１３は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Bradyrhizobium 菌数のグラフである。
【図１４】図１４は本発明のいくつかの具体例による、時間の関数としての Bradyrhizobium 菌数のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
細菌の液体接種材料を作製するための方法を提供する。該方法は、細菌を実質的に定常期まで増殖させた後、液体接種材料に乾燥剤を添加することを含む。接種材料に乾燥剤を添加することで、部分的に乾燥した接種材料製品が形成される。
【００１５】
部分的に乾燥した接種材料製品を「包装」する（すなわち、包装内に含ませる）とき、及び部分的に乾燥した接種材料製品を種子に施すときに、該方法は細菌の安定性の向上を提供することができる。安定性の向上により包装内と種子上の両方での細菌の生存率を高めることができる。
【００１６】
細菌培養物を作製するために、細菌を液体栄養培地に導入する。これらには限定されないが、Rhizobium（Bradyrhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobiumを含む）、Pseudomonas、Serratia、Bacillus（Paenibacillusを含む）、Pasteuria、Azotobacter、Enterobacter、Azospirillum、Methylobacterium、Cyanobacteria（らん藻類）属の細菌類を含むさまざまな細菌を液体栄養培地に導入することができる。細菌培養液を作製するために、液体栄養培地に他の微生物（例えば、菌根菌であり、これは、ここで用いる場合、用語「細菌」の定義に包含される）を導入することもできる。Rhizobium及びBradyrhizobiumに関しては、Bradyrhizobium japonicum、Rhizobium meliloti、Rhizobium leguminosarum biovar trifolii、Rhizobium leguminosarum biovar viceae及びRhizobium leguminosarum biovar phaseoliを含む株が好ましい。これらの細菌は豆科植物種の根に小節を形成できる。以下の説明は、主にRhizobium属の接種材料組成物を示すが、同様の原理が他の微生物の使用にも適用されると理解される。
【００１７】
選択された細菌に適合することが当業者に公知の、あらゆる液体栄養培地が細菌を導入する液体栄養培地になり得る。例えば、ＹＭＢはRhizobium属に使用される一般的な培地である。ＹＭＢの組成を表１に示す。
【表１】
【００１８】
細菌を液体栄養培地に添加した後、細菌を「実質的な定常期」にまで増殖させるために細菌培養液を培養（又は、発酵）することができる。「実質的な定常期」は、「対数期」の後期から「定常期」までの培養期間を含むと定義される。「対数期」は発酵初期の誘導期後に起こる段階で、通常、栄養物が無制限にあり、通常、細菌が指数関数的に増殖する段階と定義される。「定常期」は対数期後に起こる段階で、菌増殖が基本的に停止した段階と定義される。液体栄養培地が実質的に枯渇したとき、通常、定常期に達している。本明細書中で使用されるように、実質的に定常期まで培養された細菌を含む物質を「液体接種材料」と呼ぶ。
【００１９】
通常、細菌の培養期間は１〜１５日間である。より限定的にいうと、培養期間は２〜７日間である。培養期間中、液体栄養培地及び細菌を通気し、増殖に適した温度で維持できる。通気は、振盪培養器、発酵装置又は他の同様の手段を用いて実施できる。培養の厳密な条件は細菌の種類及び使用される液体栄養培地の種類に依存する。例えば、B japonicumは、振盪培養器内の栄養培地で約１〜１０日間、約２０℃〜３５℃で培養することができる。好ましくは、B japonicumを増殖するためには、約２〜７日間、約２８℃で培養する。
【００２０】
細菌によって、実質的な定常期における細菌数は異なる。例えばRhizobium属の細菌では、液体接種材料の細菌数は、約１×１０9／ｍｌ〜約５×１０11／ｍｌと想定される。その例では、液体接種材料は１ｍｌあたり約１×１０10の細菌数を含むことができる。これらは一例としての量であり、他の量も本発明の範囲内にあると意図される。
【００２１】
実質的に定常期に達した（すなわち、細菌が指数関数的に増殖した）後に、部分的に乾燥した接種材料製品を作製するために乾燥剤を含む乾燥処理剤を液体接種材料に導入する。用語「乾燥処理剤」は、乾燥剤と通常は水である希釈物質との混合物を意味する。用語「乾燥剤」は、水に加えられると水分活性（飽和圧力で割った物質表面の水蒸気の部分分圧と定義される）を低下させる物質を意味する。０．９９５未満に水分活性を低下することは、部分的に乾燥した接種材料製品中に包装された細菌の生存率の促進に有効であると想定される。０．９９０未満（好ましくは約０．９８０未満）に水分活性を低下することは、部分的に乾燥した接種材料製品中の細菌の種子上での生存率の促進に有効であると想定される。
【００２２】
本明細書に使用される「乾燥剤」は、化合物又は化合物の混合物が、実際に液体接種材料の乾燥に影響を与える濃度で使用されるか否かにかかわらず、乾燥剤として分類できるどんな化合物又は化合物の混合物をも含むことができる。適切な乾燥剤の例は、トレハロース、スクロース、グリセロール及びトリエチレングリコールの１以上を含む。他の適切な乾燥剤は、これには限定されないが、非還元糖及び糖アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）を含む。
【００２３】
通常、液体接種材料に導入する乾燥剤の量は、部分的に乾燥した接種材料製品の約５％〜約５０％（重量／体積）の濃度である。乾燥剤がトレハロースの場合には、部分的に乾燥した接種材料製品の約１０％〜約４０％（重量／体積）の濃度が好ましい。より好ましくは、トレハロースの濃度は、部分的に乾燥した接種材料製品の約２０％〜約３０％（重量／体積）である。乾燥剤がソルビトールである場合には、部分的に乾燥した接種材料製品の約１０％〜約３５％（重量／体積）の濃度が好ましい。より好ましくは、ソルビトールの濃度は、部分的に乾燥した接種材料製品の約１５％〜約２０％（重量／体積）である。
【００２４】
乾燥処理剤は１以上の乾燥剤の混合物を含むことができる。実際、乾燥剤が本明細書で定義される場合、その混合物は２以上の乾燥剤の組み合わせであってもよい。例えば、乾燥処理剤にはトレハロースとグリセロールの混合物、トレハロースとスクロースの混合物、又はスクロースとトリエチレングリコールの混合物を含むことができる。トレハロースとグリセロールの混合物は、部分的に乾燥した接種材料製品の約５％〜約４０％（重量／体積）の濃度のトレハロース、及び部分的に乾燥した接種材料製品の約１％〜約１０％（重量／体積）の濃度のグリセロールを含むことができる。特に、混合物中のトレハロースとグリセロールの濃度は、それぞれ、部分的に乾燥した接種材料製品の約２０％（重量／体積）と約５％（重量／体積）とすることができる。トレハロースを乾燥剤として含む乾燥処理剤は、細菌(例えば、B japonicum)の種子(典型的には大豆が用いられる)上での生存を利用する本発明において特に有益であることが見出されている。
【００２５】
他の混合物も又、企図される。例えば、ソルビトールを他の乾燥剤例えばトレハロース及びスクロースと組み合わせることができる。ソルビトールは又、ポリビニルピロリドン(「ＰＶＰ」)などのポリマーと組み合わせることもできる。ソルビトールを乾燥剤として含む乾燥処理剤は、細菌(例えば、Rhizobium leguminosarum biovar viceae)の種子(典型的にはエンドウマメ及びレンズマメが用いられる)上での生存を利用する本発明において特に有益であることが見出されている。このソルビトールの有益な効果は、この組合せをエンドウマメ及びレンズマメに適用するかトウモロコシなどの他の穀物に適用するかにかかわらずに生じることが企図される。
【００２６】
液体接種材料が培養中の使用容器（例えば、発酵装置または振盪培養器）内にまだある時に、液体接種材料に乾燥剤を加えることができる。あるいは、包装する間に、液体接種材料に乾燥処理剤を加えることができる。
【００２７】
この乾燥処理剤を液体接種材料に包装工程前に(例えば、液体接種材料が未だ培養容器内にあるうちに)加える場合には、この部分的に乾燥した接種材料は、好ましくは、一度乾燥処理剤を液体接種材料に加えたならば、馴化段階(conditioning phase)に入れる。この馴化段階は、部分的に乾燥した接種材料製品を呼吸させる即ち周囲の空気にさらすことを含む。馴化段階中に、細菌は、好ましくは、全速で又はほぼ全速で代謝している。馴化段階の有意の利益は、細菌が乾燥剤に適応することである。馴化段階なしでは、乾燥剤は細菌にショックを与えるかも知れず、それは、減少した細菌生存率を生じる。
【００２８】
好ましくは、この馴化段階は、約１〜１０日間である。一層好ましくは、この馴化段階は、約２〜３日間である。この馴化段階の時間の長さは、加えた乾燥剤の種類、接種材料中の細菌の種類などによって変化しうる。
【００２９】
ある具体例では、接種材料製品中の細菌を少なくとも部分的に乾燥させるために、部分的に乾燥した接種材料製品には十分な乾燥剤が存在する。その結果（１）包装や保存等のその後のステップにおける細菌の安定性と生存率を改善し、（２）部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与える等のその後のステップにおける細菌の安定性と生存率を改善する。
【００３０】
そして、部分的に乾燥した接種材料製品は包装し、保存できる。包装は、当該業界で公知のどんな標準的な包装でもよい。例えば、ポリエチレン性の袋で部分的に乾燥した接種材料製品を包装できる。
【００３１】
部分的に乾燥した接種材料製品は、包装後に保存できる。保存状態としては、冷蔵温度から周囲温度まで、低い相対湿度から適度な相対湿度までを含むことができる。好ましくは、保存状態は約３５℃未満の温度及び約８０％未満の相対湿度を含む。一層好ましくは、保存状態は、約４〜５℃の温度を含み、約１５℃が最も好ましい。
【００３２】
部分的に乾燥した接種材料製品をさまざまな種子に与えることができる。例えば、豆科植物及び非豆科植物の種子に部分的に乾燥した接種材料製品を与えることができる。豆科作物は、大豆、ルーサン（アルファルファ）、ピーナッツ、エンドウマメ、レンズマメ、インゲンマメ等、経済的に重要な野菜を含む植物の大きい群を形成する。非豆科植物は、トウモロコシなどを含む。部分的に乾燥した接種材料製品の細菌は、根毛に浸透し、根にコロニーを形成し、小節を形成するために、根圏にコロニーを形成、及び／又は植物の根に感染することができる。この共生関係の結果、植物は窒素固定を介して窒素ガスを窒素の有機物に変えることができる。そして、植物は、成長のためにこれらの有機物を使用できる。
【００３３】
部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与えた時には、種子上の細菌数は様々である。部分的に乾燥した接種材料製品を与えて１０週間後の種子上の細菌数もまた様々であるが、その数は元の量から著しく逸脱すべきではないと考えられる。言い換えれば、時間が経過するにつれて、細菌数／種子が急激に減少すべきではない。例えば、部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与えた時の種子上の細菌数が少なくとも６×１０5であるなら、好ましくは、約１０週間後の種子上の細菌数は少なくとも１×１０5である。
【００３４】
本発明により調製した接種材料の利点は、これらの接種材料が以前に行なわれていたもの(即ち、約４．２液量オンス／ｃｗｔ未満)より少ない割合で適用することができて、しかも、同時に、以前に達成されていた生存率(即ち、１２週間後に、種子当たり１０5ｃｆｕを超える生存率)に匹敵し又は超える細菌の種子上での生存を達成することである。かかる高い種子上生存率を有する少ない容積率の適用は、幾つかの理由により有理である。
【００３５】
第一に、少容積適用率は、少ない加工及び輸送コストに訳せる(即ち、効果上同じ収率に対する加工及び輸送のための一層少ない容積)。
【００３６】
第二に、低容積の適用率は、種子の架橋(即ち、過剰の液体容積のための２以上の種子の凝集)を防止する。種子架橋の閾値は、一般に、１００ポンドの種子当たり約５液量オンス(「ｃｗｔ」)であり、高レベルの種子架橋は、約６液量オンス／ｃｗｔを超えると起きる。種子架橋は、接種材料による種子の完全な被覆を阻害し、又、それらの種子の植付けにおける均一な分布をも阻害する。
【００３７】
第三に、接種材料の低容積適用は、様々な機能的材料の、種子架橋閾値を超えることなく、細菌の高い種子上生存率を維持しながらの、同時の適用を可能にする(典型的には、１００ポンド当たり約６流体オンスより大)。この機能的材料は、殺生物性化合物を含むことができる。これらの殺生物性化合物には、殺虫剤、殺真菌剤、除草剤、殺菌剤、農薬、殺ウイルス剤、ダニ駆除剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺鼠剤又はこれらの組合せが含まれうる。好適な殺生物性化合物には、殺真菌剤及び殺虫剤が含まれる。例えば、APRONMAXX RFC (Mefenoxam, Fludioxonil)、APRONMAXX RTA (Mefenoxam, Fludioxonil)、WARDEN RTA (Mefenoxam, Fludioxonil)、CRUISERMAXX (PAK)(Thiamethoxam, Mefenoxam, Fludioxonil)、CRUISER (Thiamethoxam)、及びBEAN PAK (Mefenoxam, Fludioxonil)は、特に好適である。
【００３８】
これらの殺生物性化合物は、本発明の接種材料と任意の方法で組み合わせて、接種材料混合物を形成することができる。例えば、１００ポンドの種子に対して、２液量オンスの本発明の接種材料、１液量オンスの第一の殺生物性化合物、１液量オンスの第二の殺生物性化合物、及び１液量オンスの水を、混合物として種子に加えることができる。かかる接種材料混合物は、高い種子上生存率の利益、第一の殺生物性化合物の利益、及び第二の殺生物性化合物の利益を、種子架橋の害を生じることなく、これらの利益を達成して害を回避するための新たな配合物を必要とすることなく、有する。所望であれば、この接種材料混合物は、水を、１液量オンスより大容量で含むことができる。増大された水容積は、増大された種子被覆面積を可能にし、接種材料混合物の種子上保存寿命をも延長する。
【００３９】
殺生物性化合物と本発明の接種材料を組み合わせるタイミングも又、変化しうる。この殺生物性化合物と接種材料は、一緒に混合して混合物を形成してから、その混合物を種子に適用する。この殺生物性化合物と接種材料は、同時に種子に適用することができる。この殺生物性化合物と接種材料は、順次的に種子に適用することができ、その適用の順序及びタイミングは変化しうる。
【００４０】
１ポンド当たり２，０００〜５，０００種子の大きさを有する種子については、それらの種子に適用される接種材料混合物(例えば、接種材料のみ、接種材料と水、接種材料と殺生物性化合物、接種材料と殺生物性化合物と水)中の液体の全容積は、好ましくは、約４．０液量オンス／ｃｗｔより大きい。一層小さい大きさの(即ち、１ポンド当たり約５，０００種子を超える)種子は、増大した表面積を有する。従って、所望の細菌の種子上での安定性(例えば、種子上で、約１０週間後に、１０5ｃｆｕ／種子より大)を達成するためには、接種材料混合物中の液体の一層大きい全容積が必要でありうる。逆に、一層大きい大きさの種子については、所望の細菌の種子上安定性を達成するために、接種材料混合物中の一層少ない液体の全容積が必要でありうる。
【００４１】
実施例４及び５は、本発明の部分的に乾燥した接種材料を低容積適用率で適用した場合の、細菌の種子上生存数を示している。
【００４２】
好ましくは、この接種材料は、個々に袋中に包装される。これらの袋は、ポリプロピレン、ポリエチレン及び他の類似の材料から作成することができる。或は、この接種材料は、一種以上の殺生物性化合物及び／又は一種以上の他の成分例えば着色料及び Bacillus subtilisと包装することができる。この組合せ物の接種材料／殺生物性化合物、接種材料／他の成分、接種材料／殺生物性化合物／他の成分を、一緒に、マルチパック(例えば、ツインパック)として包装することができる。
【００４３】
更に別の方法においては、この接種材料を、２つの別々のコンポーネントとして包装することができる。第一のコンポーネントは、「超濃縮物」である。超濃縮物は、細菌、水、少なくとも一種の乾燥剤、及び少なくとも一種のポリマーを含む。この超濃縮物は又、ゲル化剤をも含みうる。この細菌は、ここで論じている細菌の何れであってもよいが、好ましくは、B. japonicumである。この乾燥剤は、ここで論じている乾燥剤の何れであってもよいが、好ましくは、トレハロースである。このポリマーは、ここで論じているポリマーの何れであってもよいが、好ましくは、ビニルピロリドンとビニルアセテートのコポリマーである。ゲル化剤は、ここで論じたゲル化剤の何れであってもよいが、好ましくは、ジェランガムである。
【００４４】
第二のコンポーネントは、「調節剤」である。この調節剤には、水、少なくとも一種の乾燥剤及び少なくとも一種のポリマーが含まれる。この調節剤は又、水を含むこともできる。この乾燥剤は、ここで論じた乾燥剤の何れであってもよいが、好ましくは、トレハロースである。このポリマーは、ここで論じたポリマーの何れであってもよいが、好ましくは、ビニルピロリドンとビニルアセテートのコポリマーである。
【００４５】
超濃縮物を造るためには、細菌を、栄養培地で、約２〜１０日間、約２０〜３５℃の温度で培養することができる。この栄養培地は、ミクロフィルターにより一層少容積とすることができる(例えば、１００リットルから５リットルに)。この栄養培地をミクロフィルター処理するためには、この培地を、好ましくは、無菌のミクロフィルトレーションユニットを、所望の細菌濃度のレベル(例えば、約１×１０11ｃｆｕ／ｍｌ〜１×１０12ｃｆｕ／ｍｌ)に達するまで通過させる。このミクロフィルター処理した容積を、次いで、元の栄養培地の容積より小さい一層大容積のユニット(例えば、５リットルから１０リットル)に、水、乾燥剤、ポリマー及びゲル化剤(できるかぎり)(例えば、水＋３０％ｗ／ｖ(最終容積に対して)、１％ｗ／ｖビニルピロリドン及びビニルアセテートコポリマー、及び０．０５％ｗ／ｖジェランガム)を加えることによって近づくことができる。その結果生成したユニットは、種子上適用まで、約２〜２０℃で保存することができる。
【００４６】
調節剤を造るためには、乾燥剤、ポリマー及び水(できるかぎり)の混合物を、超濃縮物(例えば、９０リットルのトレハロース(３０％ｗ／ｖ)、ビニルピロリドン及びビニルアセテートコポリマー(１％)、及びジェランガム(０．０５％ｗ／ｖ))から別々に調製することができる。この混合物を殺菌して(但し、不可欠ではない)、無菌的に包装してから、種子上適用まで、約１５〜２５℃で貯蔵することができる。
【００４７】
この超濃縮物及び調節剤を、一緒に、種子上に適用することができる。この組合せは、水及び／又は機能的化合物(例えば、殺生物性化合物)と供に適用することができる。１００ポンドの種子への適用のために、超濃縮物の量は、好ましくは、約０．１〜０．５ ｆｌ ｏｚ．であり、一層好ましくは、０．２ｆｌ ｏｚ．である。調節剤の量は、好ましくは、約１．２〜２．５ｆｌ ｏｚ．であり、一層好ましくは約１．８ｆｌ ｏｚ．である。水及び／又は機能性化合物の量は、好ましくは、約１．５〜５．５ｆｌ ｏｚ．であり、一層好ましくは、約３．０ｆｌ ｏｚ．である。この組み合わせた超濃縮物及び調節剤中の細菌の濃度は、好ましくは、約１×１０9〜５×１０11ｃｆｕ／ｍｌであり、一層好ましくは、約１×１０10ｃｆｕ／ｍｌである。
【００４８】
包装内及び種子上での部分的に乾燥した接種材料製品中の細菌の安定性と生存率を改善するために、部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与える前に、部分的に乾燥した接種材料製品にポリマーを任意に加えることができると想定される。ポリマーは、包装ステップの前または保存ステップの後に加えることができる。ポリマーはポリビニルピロリドン、アルキル化ビニルピロリドンポリマー類、ビニルピロリドン、酢酸ビニル共重合体(例えば、International Specialty Products から市販されている「Ｓ−６３０」など)、ビニルピロリドン、スチレン共重合体、ポリビニールアルコール重合体、その他類似のポリマーを含むことができる。ポリマーは、部分的に乾燥した接種材料製品の約１％〜２５％（重量／体積）の濃度にすることができる。
【００４９】
細菌が実質的に定常期に達した後、部分的に乾燥した接種材料製品を作製するために液体接種材料へ乾燥剤を添加することは、播種時に増量剤を加える必要なく細菌の安定性を改善するが、そのことは増量剤の使用を妨げるものではない。実際、本発明の範囲内では、部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与えた後に増量剤を種子に与えることができる。播種時、又は部分的に乾燥した接種材料製品を種子に与える時に、増量剤を加えることができる。増量剤は糖、増粘剤、カルボキシメチルセルロース、及びポリマーをベースにするもの等、一般的に使用されるどんな増量剤も含むことができる。
【００５０】
乾いた、流動性のある接種材料の剤形を形成するために泥炭、粘土、及び／又は他の同様の乾いた担体に、部分的に乾燥した接種材料製品を添加することができる。噴霧または他の公知手段で、部分的に乾燥した接種材料製品を添加することができる。
【００５１】
ここで、以下の非限定的な実施例を用いて本発明を具体的に説明する。
【実施例】
【００５２】
実施例１ トレハロース及びグリセロール／トレハロース混合物の存在下におけるBradyrhizobium japonicumの安定性の評価
７日間熟成発酵培地を作製するためにB japonicumを振盪フラスコの栄養培地中で振盪培養器によって２８℃で培養した。４種の処理剤（表２参照）を２５０ｍｌの振盪フラスコに準備した。１種の処理剤を２つずつ準備したので、２５０ｍｌの振盪フラスコが合計８個となった。５０ｍｌの７日間熟成発酵培地をそれぞれの振盪フラスコに加えた。すべてのフラスコの成分は、さらに、振盪培養器によって２８℃で７日間平均化した。平均化させた後に、それぞれの処理液のひとつのフラスコを２８℃の静止培養に移した。それぞれの処理液のもうひとつのフラスコを３５℃の静止培養に移した。
【表２】
【００５３】
フラスコから定期的にサンプルを採取し、生存している細菌数を算定するために一般プレート生菌数測定を行った。菌数測定は、まず、サンプルを混ぜ、目盛り付きピペットと無菌チップを使用して１ｍｌのサンプルを取り、９ｍｌの逆浸透（ＲＯ）水の入った試験管に入れ、１０倍希釈液を作製することによって実施した。そして、１０００μＬのRainin社製ピペット（較正し、１０００μＬにセットする）と無菌チップを用いて、１０００μＬの１０倍希釈液を１０倍希釈試験管から取り、別の９ｍｌ逆浸透水の入った試験管に移し、１００倍希釈液を作製した。希釈液を移すときには、ボルテックス及び無菌操作に注意し、これらのステップを１０7倍希釈まで繰り返した。
【００５４】
１００μＬのRainin社製ピペット（較正し、３０μＬにセットする）と無菌チップを用いて１０倍希釈液試験管から３０μＬを取り、雑菌混入検出プレートとして用意した栄養寒天プレート上に１０μＬずつ３滴加えた。栄養寒天培地はOxoid社製であった。これらのステップは１０-5、１０-6、および１０-7希釈を除く希釈液で繰り返し、そのサンプルは標準のコンゴレッド酵母マンニトール寒天（ＣＲＹＭＡ−表３参照）のプレートに加えた。
【表３】
【００５５】
プレートを裏返しにする前に乾燥し、２８℃のインキュベーターにそれらを５日間置いた。５日後に、コロニーの数を低倍率顕微鏡下で数えた。総コロニー数は、平均×希釈倍率×１００によって算出した。
【００５６】
２８℃の液体培地中で培養したB japonicumの生存について４つの処理の結果を図１に示す。３５℃の液体培地中で培養したB japonicumの生存についての処理の結果を図２に示す。５％のグリセロール処理は試験中に汚染されたので、図２に含めていない。
【００５７】
図１に示した結果は、２８℃での２０％トレハロース処理、及び２０％トレハロース／５％グリセロール処理が液体培地中の細菌の生存に適していることを示す。未処理の細菌数は実験開始から約１２週目〜１６週目のいずれかの時点で減少し始めた。反対に、２０％トレハロース処理、及び２０％トレハロース／５％グリセロール処理の細菌数はその同じ期間、及びそれ以後の期間でさえ比較的一定のレベルで残った。
【００５８】
図２に示した結果は、３５℃での２０％トレハロース処理が培地中の細菌の生存に適していることを示す。未処理を含む他の処理の細菌数は実験の初期で著しく減少したが、２０％トレハロース処理の細菌数は実験中、比較的一定レベルで残った。
【００５９】
１０週間後に、未処理及び２０％トレハロース処理からサンプルを採取し、大豆種子に施した。種子は２２℃で培養した。定期的にサンプルを取り、B japonicumの生存数を評価した。種子の生存を評価する方法は以下の通りであった。
【００６０】
５００ｇの大豆種子を測定し、ラベルしたジッパー付きの汚れのないポリ袋の中に入れた。２ｍｌのシリンジまたは２ｍｌの無菌ピペットを使用して、１．３８ｍｌの処理剤を均等に種子の表面に施した。そして、種子に接種したポリ袋の中に外気を取り込んだ。次に、すぐにポリ袋の封をし、種子が処理物質で均等に被覆されるまで（約３０秒間）振盪した。ポリ袋は、乾燥するまで（約１０分間）実験室条件下（２１℃）で直射日光から避けて封をせずに放置した。乾燥アルコールで拭いた完全な長さのスクープへらを使用して、傷のない種子１００個を正確にポリ袋から無作為に選択した。その種子をあらかじめ準備した１００ｍｌの希釈ボトルの中に入れた。ボトルを閉じて、すぐに、約１分間強く振盪した。準備した１００ｍｌのボトルから、無菌方法を用いて、懸濁液の連続希釈液を以下のように作製した：（１）１００ｍｌのボトルを振盪した後、すぐに、１ｍｌの懸濁した細菌と希釈剤とを９ｍｌのＲＯ水の入った希釈チューブの中に無菌的に移し、１０倍希釈液を作製した。（２）１０倍希釈液を１５秒間ボルテックスした。（３）ボルテックス後、すぐに１ｍｌの１０倍希釈液を９ｍｌのＲＯ水の入った別の希釈チューブの中に移し、１００倍希釈液を作製した。（４）１００倍希釈液をボルテックスした。：（５）ステップ（３）と（４）とを繰り返し、１０3及び１０4倍希釈液を作製した。
【００６１】
使用した希釈チューブの詳細、処理の詳細、及びプレートした日付を、コロニー評価用寒天プレートに表記した。プレートは各希釈液のために２枚ずつ作製した。希釈液チューブからサンプリングし、それらを寒天プレートに入れる前に、希釈液をボルテックスした。次に、標準の無菌ピペット操作のテクニックを用いて、それぞれの希釈液の１００μＬサンプルを各寒天プレートの中心に分注した。無菌延展器具を使用して、サンプルを均等にプレートの表面に広げた。そして、プレートを７日間２８℃で培養した。培養後、それぞれのプレートのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を数えて、記録した。１プレートあたりのＣＦＵの数を算出するために、以下の計算式を用いた：［平均コロニー数×｛表示された希釈×１０(a)×１００(b)｝／１００(c)］、式中、（ａ）は希釈液からプレート１枚あたり０．１ｍｌ取ったことによる補正値、（ｂ）はオリジナルの希釈ボトル中に１００ｍｌあることによる補正値、（ｃ）はオリジナルサンプル中の種子の数による補正値である。
【００６２】
１０週間後の種子上のB japonicumの生存結果を図３に示す。その結果、未処理では、細菌数が１×１０5／種子を超えていた期間の長さが１週間未満であったが、２０％トレハロース処理では１０週間を超えた。これらの結果は、細菌が種子に置かれる場合、２０％のトレハロース濃度による処理が細菌の良好な生存性を提供することを示す。
【００６３】
実施例２ B japonicum安定化に必要なトレハロース／スクロースのレベルの最適化
フラスコを準備するための手順は、実施例１と同じであった。この実施例のための処理を表４に示す。
【表４】
【００６４】
２８℃の液体培地で培養したB japonicumの生存についての処理の結果を図４に示す。３５℃の液体培地で培養したB japonicumの生存についての処理の結果を図５に示す。
【００６５】
図４に示される結果は、２８℃では、１０％〜３０％（重量／体積）のトレハロース濃度処理が液体培地での細菌の生存に最適であることを示す。また、図４は、５％〜１０％（重量／体積）のスクロース濃度処理が液体培地での細菌の生存に好ましいことを示すが、トレハロース処理と同程度ではない。また図４は、４０％トレハロース濃度の処理で細菌が生存できることを示し、このことは、微生物の増殖を抑制する処方においても細菌が生存する能力を持っていることを示す。
【００６６】
図５に示される結果は、３５℃では、１０％〜３０％（重量／体積）のトレハロース濃度処理が液体培地での細菌の生存に最適であることを示す。また、図５は、５％（重量／体積）のスクロース濃度処理が液体培地での細菌の生存に好ましいことを示すが、トレハロース処理と同程度ではない。
【００６７】
１０週間後、表４に記載された処理からサンプルを採取し、大豆種子に施した。その種子を２２℃で培養した。最初に６日後、２週間後、４週間後にサンプルを採取した。これらのサンプルから、生存しているB japonicumの数を算定した。種子上での生存を評価する方法は上の実施例１で記載されたとおりであった。種子上での生存の結果を図６に示す。
【００６８】
図６に示される結果は、２２℃では細菌が種子に置かれるとき、２０％〜３０％（重量／体積）のトレハロース濃度処理が液体培地での細菌の生存に最適であることを示す。
【００６９】
実施例３ 液体培地処方におけるSerratia Proteomaculans及びPseudomonas Fluorescensの安定性の評価
細菌培地を作製するためにSerratia proteomaculans（「S proteomaculans」）を標準の微生物培地（半分に薄められたトリプシンの大豆培地−「ＴＳＢ」）中で２２℃、２４時間培養した。表５に記載された処理の１つに対応する各フラスコを１セット準備した。５０ｍｌの細菌培養液をそれぞれのフラスコに加えた。すべてのフラスコをさらに振盪培養器によって３日間、２２℃で平衡化した。そして、フラスコを２８℃での静止培養に移した。定期的に、サンプルを採取し、連続的に希釈し、半分に薄められたトリプシンの大豆寒天培地−「ＴＳＡ」にプレーティングすることによって、細菌の数を算定した。
【００７０】
Pseudomonas fluorescens（「P fluorescens」）のために同じステップを繰り返した。
【表５】
【００７１】
２８℃の液体培地でのP fluorescensの生存についての処理の結果を図７に示す。その結果は、２８℃では、グリセロール、トレハロース及びスクロースでの処理のすべてがP fluorescensの生存性を改善する能力を有することを示す。
【００７２】
２８℃の液体培地でのS proteomaculansの生存についての処理の結果を図８に示す。その結果は、３０％トレハロース処理、１０％スクロース処理及び３０％スクロース処理の生存数が４週間以上、未処理よりも多いことを示す。このデータは、その処理がS proteomaculansの生存性を改善する能力を有することを示す。
【００７３】
実施例４ 低容量適用率の、「種子上での」生存率に対する効果及び市販製品との比較
部分的に乾燥した接種材料製品を実施例１により製造した。その製品は、B japonicum、２０％トレハロース、及び２％Ｓ−６３０を含んだ。その製品を、種子に適用する前に、５００ｍｌの袋中に、空気を伴わずに、５℃で、４ヶ月保存した。
【００７４】
この部分的に乾燥した製品を、大豆種子(１２％の水分)に適用した。これらの種子を、種子１００ポンド当たり４液量オンスの全体積(部分的に乾燥した接種材料製品及び水)で処理した。この処理物を、様々な体積の濃縮物(種子１００ポンド当たり１〜４液量オンス)を、総体積を種子１００ポンド当たり４液量オンスにするための適当量の水と共に用いて調製した。一度処理したならば、それらの種子を、この袋を開けたままにして、種子を周囲温度(１８〜２０℃)で保存した。
【００７５】
種子を、２種類の市販の液体でも処理した。市販の液体Ａ(未開示の添加物を有する大豆接種材料)を、５．０ｆｌｏｚ／ｃｗｔの比率で適用した。市販の液体Ａは、ＡｐｅｘＰｒｏ4(Agribiotics, Inc.製の液体大豆接種材料)であった。市販の液体Ｂ(未開示の添加物を有する大豆接種材料)を、４．２５ｆｌｏｚ／ｃｗｔの比率で適用した。市販の液体Ｂは、Ｃｅｌｌ−Ｔｅｃｈ(登録商標)ＳＣＩ(商標)(Nitragin, Inc.製の液体大豆接種材料)であった。
【００７６】
これらの種子を採取するために、５０種子を、無菌のスパーテルを用いて無作為に選択して、ＲＯ水を含む１００ｍｌの無菌の医用フラットに移した。これらの種子を、１分間激しく震盪した。１０００μｌの試料を無菌的に採取して９ｍｌのＭｃＣａｒｔｎｅｙ瓶に移した。
【００７７】
無菌技術を利用して、この懸濁液の連続希釈物を、次のように調製した：(１)この１００ｍｌの瓶の震盪後すぐに、１ｍｌの懸濁させた細菌及び希釈剤を無菌的に９ｍｌの希釈用のＲＯ水のチューブに移し、それにより１０-1希釈物を造り、(２)この１０-1希釈物を１５秒間ボルテックスし、(３)ボルテックス後すぐに、この１０-1希釈物１ｍｌを他の９ｍｌの希釈用のＲＯ水のチューブに移して１０-2希釈物を造り、(４)次いで、この１０-2希釈物をボルテックスし；(５)工程(３)及び(４)を反復して、１０-3及び１０-4希釈を達成する。
【００７８】
次いで、コロニー評価用の寒天プレート(Yeast Mannitol Agar)に、用いた希釈用チューブの詳細、処理の詳細、及びプレートした日付のラベルを付した。各希釈物について、複製プレートを造った。これらの希釈用チューブから試料を採取して寒天プレート上にプレートする前に、これらの希釈物をボルテックスした。次いで、標準的な無菌のピペッティング技術を利用して、これらの希釈物の各々１００μｌの試料を各寒天プレートの中央に分配した。無菌のスプレッダーを用いて、これらの試料をプレートの表面に均一に広げた。次いで、これらのプレートを、５〜６日間、２８℃でインキュベートした。インキュベーション後、コロニー形成単位(ＣＦＵ)の各プレート上での数を計数して記録した。次いで、次の計算を利用して、ＣＦＵ／プレートの数を決定した：[平均コロニー×{ラベル付けした希釈物×１０(a)×１００(b)}／１００(c)]、(式中、(ａ)は、希釈物からの０．１ｍｌ／プレートについての補正値であり、(ｂ)は、元の希釈用瓶中の１００ｍｌについての補正値であり、(ｃ)は、元の試料中の種子の数についての補正値である)。
【００７９】
この種子上生存の結果を図９に示した。これらの結果は、本発明の部分的に乾燥した接種材料の最少の２液量オンスの濃縮物(全部で種子１００ポンド当たり４液量オンスを適用)が、処理後６週間より長期間、１０5ＣＦＵ／種子を超える種子上安定性を達成したことを示している。これらの結果は又、本発明の部分的に乾燥した接種材料製品を用いた場合の種子上生存率が、試験した２種類の市販の液体のそれよりも優れていることをも示している。
【００８０】
実施例５ − 少容積適用比率の、「種子上」生存率への効果及び市販製品との比較
実施例４と同じ手順にしたがったが、但し、接種材料製品は、１％ Ｓ−６３０を含み(２％ Ｓ−６３０ではない)、その製品は、３．１Ｌの袋に保存され(５００ｍｌの袋ではない)、そしてこれらの種子は、一定の２０℃で保存された(１８〜２０℃ではない)。
【００８１】
この種子上生存の結果を、図１０に示した。これらの結果は、最少の２液量オンス濃度の本発明の接種材料(全部で、種子１００ポンド当たり４液量オンスを適用)が、１０5ＣＦＵ／種子を超える種子上安定性を、処理後６週間を超えて達成することを示している。これらの結果は又、本発明の部分的に乾燥した接種材料製品による種子上生存が試験した２種類の市販の液体より優れていることをも示している。
【００８２】
実施例６ − 農薬の相溶性の研究
フラスコの準備のために従った手順は、実施例１におけるものと同じであった。この実施例のための処理は、３０％ トレハロース及び１％ Ｓ−６３０を含む。
【００８３】
この処理を、種子に、異なる３つの仕方で施与した。第一の試験は、この部分的に乾燥した接種材料製品のみを種子に加えた。この試験の結果を、表６に示した。第二及び第三の試験は、部分的に乾燥した接種材料製品と農薬を種子に施与した。第二の試験における農薬は、APRONMAXX RTA であり、５ｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ.の適用比率で施与した。第三の試験における農薬は、CRUISERMAXX であり、３ｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ.の適用比率で施与した。
【００８４】
第二及び第三の両試験においては、これらの農薬を、次の３つの方法で加えた：タンク混合、順次的施与、及び同時施与。第二の試験の結果を、表７に示し、第三の試験の結果を表８に示した。
【００８５】
タンク混合のためには、示されたｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔの適用比率の部分的に乾燥した接種材料製品を、４時間にわたって２０℃で、表示した農薬比率でタンク混合した。混合時間後に、この組合せ接種材料製品／農薬を、累積ｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ比率で種子に施与した。
【００８６】
順次的施与のためには、農薬を種子に指示した比率で施与し、その後、乾燥させた。次いで、部分的に乾燥した接種材料製品を、示したｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ適用比率で、全比率を４ｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ(例えば、２ｆｌ ｏｚ.／接種材料製品＋２ｆｌ ｏｚ.水)にする容積の水と共に施与した。
【００８７】
同時施与のためには、部分的に乾燥した接種材料製品と農薬を、同時に、種子に施与した。この農薬は、表示した比率で種子に施与された。部分的に乾燥した接種材料製品を、示したｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ適用比率(例えば、２ｆｌ ｏｚ.／ｃｗｔ)で施与した。
【００８８】
表６〜８に記した「種子上保存寿命」は、部分的に乾燥した接種材料製品を種子に施与した後の、日数である。rhizobium計数／種子は、１×１０5rhizobium／種子の閾値レベル(現行のカナダ国の規制閾値)を超えた。
【００８９】
【表６】
【００９０】
【表７】
【００９１】
【表８】
【００９２】
実施例７ − 糖／糖アルコール研究
部分的に乾燥した接種材料製品を、先ず、Rhizobium leguminosarum bv. viceae 培養培地中でRhizobium leguminosarum を生育させることによって製造した。２つの異なる培養培地１ＸＲ１及び１．５ＸＲ１(これらは、エンドウマメ及びレンズマメの発酵培地である)を用いた。この１．５ＸＲ１は、１ＸＲ１より５０％多い媒質成分を有する。３日間の培養成長の後に、糖又は糖アルコールを無菌的にこの培養物に加えた。この培養物に加えた糖又は糖アルコールの量は、下記の表９に終濃度(重量／体積)にて示してある。この培地を、次いで、２日間、馴化段階に置いた(この段階で、この培養物は、成長を続け、それにより、部分的に乾燥した接種材料製品を造る)。この部分的に乾燥した接種材料製品を、次いで、エンドウの種子に３．１Ｌ接種材料製品／１１３６ｋｇ種子の比率で施与した。これらの種子を、次いで、袋の中で、接種物製品が種子上に一様に分配されるように振り動かすことにより混合した。これらの種子を、次いで、１５℃に保存した。
【００９３】
表９に示したように、種子上の細菌の計数は、接種材料を種子に施与した後、６日目、１２日目、１８日目、及び２９日目に行われた。これらの細菌の計数は、前記の実施例と同様の仕方で行われた。即ち、５０種子を、希釈瓶中の１００ｍｌのリン酸緩衝液に入れた。１０倍連続希釈を行なって、０．１ｍｌの適当な希釈物を、栄養培地プレート上に広げた。種子上の生存細菌細胞を、これらのプレート上のコロニー数に基づいて計算した。
【表９】
【００９４】
これらの結果は、ソルビトールが、Rhizobium leguminosarum の種子上保存寿命の延長に関して、試験したものの内で最高の実行性のある糖又は糖アルコールであることを示唆している。
【００９５】
実施例８ − ２０％ソルビトールを用いたソルビトールの研究
実施例７に続いて、２０％ソルビトールを、ジェランガム(「ＧＧ」)(Kelcogel F Low Acyl)を伴う又は伴わない更なる評価のために選択した。下記の工程を行なった：
１．Rhizobium leguminosarum を１．５ＸＲ１培地中で、２日間、３０℃で、１６０ｒｐｍにて生育させた。
２．１％のこの母培養物を、１．５ｘＲ１培地(３．４１Ｌ)、３０℃、０．１ｖｖｍ、１５０ｒｐｍ、ｐＨ６．６〜７．４に接種した。
３．３日間の生育の後に、２０％のソルビトール(終濃度ｗ／ｖ)を発酵装置に加え、発酵／馴化工程を２日間継続した後、収穫した。(８３％ソルビトール＝８３ｇ＋４６ｍｌ Ｈ2Ｏ)
４．ジェランガム(０．１％)を３袋に収穫時に加えた。
５．培養物を４〜５℃で保存した。
６．１％Ｓ−６３０を肉汁に加えた後、種子に施与した。２．７ｍｌ／ｋｇ。
７．部分的に乾燥した接種材料製品をエンドウの種子に、１１３６ｋｇの種子当たり３．１Ｌの接種材料製品の比率で施与した。
８．種子を袋内で、種子上に接種材料製品を均一に分配するために振盪することによって混合した。
９．それらの種子を、１５℃及び２０℃で保存した。
【００９６】
これらの試験の結果は、図１１に示してある。図１１に記した標準的配合物は、上記のように調製された培養物であった。図１１に記した濃縮物を遠心分離してペレット化し、等容の上記の細胞培養肉汁で上清を置き換えた。そうして、この細胞濃度は、倍化された(もっとも、他のすべての配合物パラメーターは、一定に維持された)。両配合物の施与比率は、４．２ｆｌ ｏｚ／ｃｗｔ(水なし)であった。
【００９７】
ある種の処理(即ち、ジェランガムを含まない標準的配合物)を二連で進めた。それらの試験からの結果は、図１２に示してある。これらの結果に基づいて、種子上安定性温度は、決定的に重要であり、１５℃の温度は、種子上保存寿命を２０℃に拡大する。
【００９８】
実施例９ − 大豆でのソルビトール対トレハロース
実験を行なって、B japonicumを有する大豆への施与に一層適しているのはソルビトールかトレハロースかを決定した。下記の工程を実施した：
１．B japonicum株５３２Ｃを、５日間、１．５ＸＢｊ２(大豆発酵培地)中で、３０℃で、１６５ｒｐｍにて生育させた。
２．ソルビトール(２０％ｗ／ｖ)又はトレハロース(３０％ｗ／ｖ)をこの培養物に加えて、これらの培養物を、５日間、３０℃で、１６５ｒｐｍにて維持した。
３．２．７ｍｌ／ｋｇのソルビトール又はトレハロースで修正した培地を、ダイズ種子に施与した。種子を均一に被覆した。
４．種子を、１８〜２０℃で保存した。
５．種子上での根粒菌の生存力を、時間ゼロと７日後にモニターした。
【００９９】
これらの試験の結果を図１３に示した。これらの結果に基づいて、トレハロースは、B japonicumへの適用について、ソルビトールより一層適している。
【０１００】
実施例１０ − 多成分接種材料組成物の大豆種子への施与
実験を行なって、細胞濃度及び超低濃度トレハロース修正された根粒菌接種材料の、大豆種子上生存率への影響を測定した。下記の工程を行った：
１．B.japonicum 株５３２ｃを、１００Ｌの栄養媒質中で、７日間、２８℃で培養した。この１００Ｌを、次いで、ミクロフィルター処理して５リットルとし、水＋３０％ｗ／ｖ*トレハロース、１％ Ｓ６３０ｗ／ｖ*及び０．０５％ｗ／ｖジェランガム(最終的な１０Ｌにおける*ｗ／ｖ)の添加により１０Ｌとして、「超濃縮」肉汁を形成した。この超濃縮肉汁を、無菌的に包装する前に更に７日間発酵させた。この超濃縮肉汁中のB.japonicum の濃度は、２．７×１０11ｃｆｕ／ｍｌであった。この肉汁を、適用前、５℃で保存した。
２．トレハロース(３０％ｗ／ｖ)、Ｓ６３０(１％ｗ／ｖ)及びジェランガム(０．０５％ｗ／ｖ)を殺菌して、無菌的に「調節剤」として包装した。収穫した調節剤ユニットを適用まで２０℃で保存した。
３．この超濃縮物０．２ｆｌ ｏｚ.、調節剤１．８ｆｌ ｏｚ.及び水３ｆｌ ｏｚ.を混合した。B.japonicum の混合物中の濃度は、７．４×１０9ｃｆｕ／ｍｌであった。この混合物を、１００ｌｂの大豆種子に比例配分ベースで適用した。
４．接種された種子を、１５℃及び２０℃で保存し、数週間間隔で、上記の方法論を利用して評価した。
【０１０１】
これらの試験の結果を表１０及び図１４に示した。
【表１０】
【０１０２】
形態と構成をさまざまに変えて本発明を実施できることは、当業者に良く理解されるであろう。開示された実施例以前の詳細な説明は、唯一、理解を明らかにする目的のために提示され、不必要な制限がそこに暗示されているわけではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子を処理する方法であって、該方法は、部分的に乾燥した接種材料製品を、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり１．５〜４．０液量オンス(４．４〜１１．８×１０-5ｍ3)の比率で、種子に施与することを含み、この部分的に乾燥した液体接種材料が、実質的に定常期まで増殖した細菌を含み、乾燥処理剤が乾燥剤を含むことを特徴とする当該方法。
【請求項２】
部分的に乾燥した接種材料製品が、部分的に乾燥した接種材料製品並びに少なくとも一種の水及び殺生物性化合物を含む混合物として種子に施与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
部分的に乾燥した接種材料製品及び水を、３．５〜６．０液量オンス(１０．４〜１７．７×１０-5ｍ3)／種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)の合わせた比率で種子に施与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
部分的に乾燥した接種材料製品を、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり２．０〜３．２液量オンス(５．９〜９．５×１０-5ｍ3)で施与する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
混合物が、部分的に乾燥した接種材料製品及び少なくとも一種の殺生物性化合物を含み、該混合物が、種子に、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり９．２液量オンス(２７．２×１０-5ｍ3)未満の比率で施与される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一種の殺生物性化合物が、殺虫剤、殺真菌剤、除草剤、殺細菌剤、農薬、殺ウイルス剤、殺ダニ剤、ダニ駆除剤、殺線虫剤、殺鼠剤、又はこれらの組合せの少なくとも一つを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
部分的に乾燥した接種材料製品を、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり２．０〜３．２液量オンス(５．９〜９．５×１０-5ｍ3)の比率で施与する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
細菌が、Rhizobium、Bradyrhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Pseudomonas、Serratia、Bacillus、Pasteuria、Azotobacter、Enterobacter、Azospirillum、及び Cyanobacteria属の少なくとも一つである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
乾燥剤が、非還元糖及び糖アルコールの少なくとも一種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
乾燥剤が、トレハロース、スクロース、グリセロール、トリエチレングリコール、ソルビトール及びマンニトールの少なくとも一つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
乾燥剤が、部分的に乾燥した接種材料製品の５〜５０％(重量／体積)である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
乾燥剤が、トレハロースを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
トレハロースが、部分的に乾燥した接種材料製品の１０〜４０％(重量／体積)を構成する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
トレハロースが、部分的に乾燥した接種材料製品の２０〜３０％(重量／体積)を構成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
種子が、マメ科植物の種子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１０週間後の種子上の細菌数が、１×１０5を超える、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
方法が、部分的に乾燥した接種材料製品を種子に施与した後、増量剤を種子に適用することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
種子を、大豆、アルファルファ、落花生、エンドウマメ、レンズマメ及びインゲンマメよりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
部分的に乾燥した接種材料製品を、種子に施与する前に、馴化段階に入れる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
馴化段階が、１〜１０日である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
馴化段階が、２〜３日である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
種子を処理する方法であって、該方法は：
下記の超濃縮物を種子上に投与すること：
細菌、水、少なくとも一種の乾燥剤、及び少なくとも一種のポリマー；及び
調節剤を該種子に投与することを含み；
該超濃縮物を、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり０．１〜０．５ｆｌ ｏｚ.(３．０〜１４．８×１０-6ｍ3)の適用比率で投与すること及び該調節剤を種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり１．２〜２．５ｆｌ ｏｚ.(３．５〜７．４×１０-5ｍ3)の比率で投与することを特徴とする当該方法。
【請求項２３】
超濃縮物中の細菌濃度が、１×１０11〜１×１０12ｃｆｕ／ｍｌである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
調節剤が、少なくとも一種の乾燥剤及び少なくとも一種のポリマーを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
調節剤が、水を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
超濃縮物を、種子に、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり０．２ｆｌ ｏｚ.(０．５９×１０-5ｍ3)の適用比率で投与し、調節剤を、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり１．８ｆｌ ｏｚ.(５．３×１０-5ｍ3)の適用比率で投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
種子を処理する方法であって、該方法は、部分的に乾燥した接種材料製品を、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり１．５〜４．０液量オンス(４．４〜１１．８×１０-5ｍ3)の比率で、種子に施与することを含み、この部分的に乾燥した液体接種材料が、実質的に定常期まで増殖した細菌を含み、乾燥処理剤が乾燥剤を含むことを特徴とする当該方法。
【請求項２】
部分的に乾燥した接種材料製品が、部分的に乾燥した接種材料製品並びに少なくとも一種の水及び殺生物性化合物を含む混合物として種子に施与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
部分的に乾燥した接種材料製品及び水を、３．５〜６．０液量オンス(１０．４〜１７．７×１０-5ｍ3)／種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)の合わせた比率で種子に施与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
部分的に乾燥した接種材料製品を、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり２．０〜３．２液量オンス(５．９〜９．５×１０-5ｍ3)で施与する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
混合物が、部分的に乾燥した接種材料製品及び少なくとも一種の殺生物性化合物を含み、該混合物が、種子に、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり９．２液量オンス(２７．２×１０-5ｍ3)未満の比率で施与される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一種の殺生物性化合物が、殺虫剤、殺真菌剤、除草剤、殺細菌剤、農薬、殺ウイルス剤、殺ダニ剤、ダニ駆除剤、殺線虫剤、殺鼠剤、又はこれらの組合せの少なくとも一つを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
部分的に乾燥した接種材料製品を、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり２．０〜３．２液量オンス(５．９〜９．５×１０-5ｍ3)の比率で施与する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
細菌が、Rhizobium、Bradyrhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Pseudomonas、Serratia、Bacillus、Pasteuria、Azotobacter、Enterobacter、Azospirillum、及び Cyanobacteria属の少なくとも一つである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
乾燥剤が、非還元糖及び糖アルコールの少なくとも一種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
乾燥剤が、トレハロース、スクロース、グリセロール、トリエチレングリコール、ソルビトール及びマンニトールの少なくとも一つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
乾燥剤が、部分的に乾燥した接種材料製品の５〜５０％(重量／体積)である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
乾燥剤が、トレハロースを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
トレハロースが、部分的に乾燥した接種材料製品の１０〜４０％(重量／体積)を構成する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
トレハロースが、部分的に乾燥した接種材料製品の２０〜３０％(重量／体積)を構成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
種子が、マメ科植物の種子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１０週間後の種子上の細菌数が、１×１０5を超える、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
方法が、部分的に乾燥した接種材料製品を種子に施与した後、増量剤を種子に適用することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
種子を、大豆、アルファルファ、落花生、エンドウマメ、レンズマメ及びインゲンマメよりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
部分的に乾燥した接種材料製品を、種子に施与する前に、馴化段階に入れる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
馴化段階が、１〜１０日である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
馴化段階が、２〜３日である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
種子を処理する方法であって、該方法は：
下記の超濃縮物を種子上に投与すること：
細菌、水、少なくとも一種の乾燥剤、及び少なくとも一種のポリマー；及び
調節剤を該種子に投与することを含み；
該超濃縮物を、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり０．１〜０．５ｆｌ ｏｚ.(３．０〜１４．８×１０-6ｍ3)の適用比率で投与すること及び該調節剤を種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり１．２〜２．５ｆｌ ｏｚ.(３．５〜７．４×１０-5ｍ3)の比率で投与することを特徴とする当該方法。
【請求項２３】
超濃縮物中の細菌濃度が、１×１０11〜１×１０12ｃｆｕ／ｍｌである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
調節剤が、少なくとも一種の乾燥剤及び少なくとも一種のポリマーを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
調節剤が、水を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
超濃縮物を、種子に、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり０．２ｆｌ ｏｚ.(０．５９×１０-5ｍ3)の適用比率で投与し、調節剤を、種子１００ポンド(４５．４ｋｇ)当たり１．８ｆｌ ｏｚ.(５．３×１０-5ｍ3)の適用比率で投与する、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００９−５４０８２５（Ｐ２００９−５４０８２５Ａ）
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１６４８９（Ｐ２００９−５１６４８９）
【出願日】平成１９年５月２３日（２００７．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１２４２０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００２３７１
【国際公開日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【出願人】（５０７２１１６９１）ベッカー アンダーウッド インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２３日（２００７．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１２４２０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／００２３７１
【国際公開日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【出願人】（５０７２１１６９１）ベッカー アンダーウッド インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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