液体製薬調製物から非金属性タンパク質インヒビターを除去する方法
本発明は、液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、そして、(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る、という工程を含んでなる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、治療上活性なタンパク質を含有してなる液体製薬調製物、特に該調製物から非金属性タンパク質インヒビターの除去に関する。
【０００２】
（発明の背景）
不安定なタンパク質に基づく製薬調製物は凍結乾燥した生成物として製剤化されることが多い。主に、このような製薬タンパク質製剤は、注射の形態で投与することを目的とする。注射の前に、凍結乾燥させた生成物は溶液として調製されなければならず、この再構成工程は時間がかかり複雑であるという特徴があり、最終溶液の汚染のリスクが生じる。
このことを避けるために、直接使用できるように溶液として注射を目的とする製薬製剤を供給することが望ましい。
【０００３】
第VIIa因子のように活性化タンパク質に基づく製薬的溶液の場合、活性化タンパク質のインヒビターの形態の安定剤は一般的に、保存の間の活性なタンパク質の自己分解を予防するために必要とされている。しかしながら、安定剤の中には望ましくない副作用を生じさせうるものがあるので、製薬溶液中での濃度はできるだけ低くしなければならない。
【０００４】
ベンズアミジンのようなセリンプロテアーゼインヒビターのトリプシンへの結合は記載されており(Eur. J. Biochem. 268, 1554-1560 (2001))、アミジノフェニル尿素ベースのインヒビター(Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 1463-1467 (2003))は、自己触媒的分解又は不活性化に対してセリンプロテアーゼ第VIIa因子を安定化することが記載されている。安定剤のアミジンタイプは、望ましくない副作用を示し得、抗凝血物質として作用しうる。第VIIa因子溶液の場合、インヒビターのいずれの抗凝固作用も、活性な製薬的成分の作用に対抗するものであるので、当然望ましくない。
【０００５】
したがって、一方では、一般的な安全上の理由から、適度に低いレベルに濃度を下げることが有意であるとされているが、他方では、タンパク質を安定化させるために必要な安定剤のレベルは一般的に、もちろんインヒビター及び用いるＦVIIa濃度に応じて、０．０５〜５０ｍＭの濃度範囲である。
したがって、微量のタンパク質インヒビターを有するすぐ使用できるタンパク質溶液を調製するための手段が必要とされている。
国際公開第９７／１５３９１号Ａは、ポリペプチドに有意に影響することなく元の保存料レベルの濃度を１０〜９９％低減したポリペプチド溶液のための、保存料を除去するためのゼオライトの使用を開示している。
【０００６】
（発明の概要）
上に述べた必要性からみて、本発明は、液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法を提供する。
【０００７】
また、本発明は、セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ依存性タンパク質の群に属する治療上活性なタンパク質を必要とする被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封した容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得、そして、
(d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する
という工程を含んでなる方法を提供する。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
上記したように、本発明は、液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法を提供する。
【０００９】
本発明は、治療上関係するタンパク質の液体製薬調製物中のセリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属する特定のタンパク質の非金属性インヒビターの量が、治療上活性なタンパク質ないしは治療上活性なタンパク質の活性が実質的に損失していないことが観察される方法で、比較的短時間の間、該溶液を固相ポリマー物質に接触させることによって、効果的に低減されうる又は実質的に除去されうるという発見に基づく。
【００１０】
方法工程(a)
前記方法の第一工程では、(i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器が提供される。
【００１１】
「初期液体製薬調製物」なる用語は、望ましくない多量のインヒビターが存在する場合を除き、すぐ使用できる(一般的に直接注入できる)組成物として調製される液体製薬的組成物(一般的に水溶性の製薬調製物)を意味することを目的とする。このような液体製薬調製物の調製は、当業者に公知であり、例えば国際公開第２００５／０１６３６５号Ａに示される。
液体調製物は一般的に等張性又は高張性である。「等張性」なる用語は「血清と等張な」、すなわちおよそ３００±５０ミリオスモル／ｋｇを意味する。浸透圧は、投与前の溶液の重量モル浸透圧濃度の測定であることを意味する。「高張性」なる用語は、血清の生理学的レベルを超える重量モル浸透圧濃度のレベル、例えばおよそ３００±５０ミリオスモル／ｋｇ(等張)を超えるレベルを示すことを意味する。
前記調製物は、必須成分として(i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターを含む。
【００１２】
セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質
本発明は特に、自己分解する触媒性質を有するタンパク質、ゆえに特にタンパク質が部分的又は完全に活性化型である場合に関することが理解される。
さらに、本発明は、セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性血漿タンパク質の群に属するタンパク質に特に有益である。
【００１３】
本明細書にて用いられる、「ビタミンＫ依存性タンパク質」なる用語はグルタミン酸残基でγ-カルボキシル化される任意のタンパク質を意味する。ビタミンＫ依存性凝固因子は、完全な活性のためにＧｌａ-ドメインのγ-カルボキシル化を必要とする。γ-カルボキシ化されたグルタミン酸(Ｇｌａ)は、特定のカルシウム結合タンパク質に見られるアミノ酸である。代表的なビタミンＫ依存性タンパク質には、限定するものではないが、凝血原凝固因子プロトロンビン(第II因子)、第VII因子、第IX因子、第X因子；抗凝固プロテインＣ及びプロテインＳ；プロテインＺ(血漿にも見られる)；肺サーファクタントタンパク質(Rannels et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5952-56, 1987)、及び骨タンパク質オステオカルシン(骨Ｇｌａ-タンパク質としても知られる)、プロリンリッチＧｌａタンパク質１、及びマトリックスＧｌａ-タンパク質が含まれる。このアミノ酸を含有するタンパク質は、「ビタミンＫ依存性タンパク質」、「Ｇｌａ-タンパク質」又は「γ-カルボキシ化タンパク質」とさまざまに呼称される。
【００１４】
ビタミンＫ依存性タンパク質の生合成には、機能的タンパク質の成熟が得られる前に様々な翻訳後プロセシングが含まれる。ビタミンＫは、これらのビタミンＫ依存性タンパク質のグルタミン酸残基のγ-カルボキシル化に必要な補助因子である。γ-カルボキシ化グルタミン酸(Ｇｌａ)残基は、膜リン脂質を有するこれらのタンパク質の金属性関連相互作用に必要である。γ-カルボキシル化によって、凝固タンパク質は、リン脂質表面上のそれらの補助因子へのビタミンＫ依存性タンパク質のカルシウム依存性の複合体形成のため、及び、それらの生物学的活性のために必要な構造的変化を経ることができる。
【００１５】
前記プロテアーゼ／タンパク質の好適な例は、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、プロテインＣ、第VII因子ポリペプチド、プロテインＺ、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、マトリックスＧｌａタンパク質及びオステオカルシンからなる群から選択されるもの、特に、第VII因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、第X因子ポリペプチド、及び活性化プロテインＣから選択されるビタミンＫ依存性の凝固因子である。上記タンパク質のＰＥＧ化誘導体、切断型、及び配列変異型も、それぞれの親ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１０％を保持する限り包含されることは当然理解されるであろう。
【００１６】
本明細書にて用いられる「変異体」なる用語は、親タンパク質の一又は複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されている、及び／又は親タンパク質の一又は複数のアミノ酸残基が欠失している、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が親タンパク質に付加している、セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ依存性タンパク質、例えばＦVIIを示すことを意図する。前記の付加は親タンパク質のＮ末端及びＣ末端のいずれかないしは両方で起こりうる。また、親タンパク質のアミノ酸鎖内(「鎖内」付加)、場合によって親タンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端の付加(一又は複数)と同時に起こりうる。
【００１７】
このようなプロテアーゼ／タンパク質は、様々な方法で、例えば組織、血液又は他の体液などの天然の供給源からの単離によって、又はトランスジェニック動物(例えば魚、ウサギ、ブタ、ウシ)内での産生又は細胞培養条件下での産生などの組み換え技術によって得られうる。
ある好適な実施態様では、前記タンパク質は、第VII因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、第X因子ポリペプチド及び活性化プロテインＣからなる群から選択されるビタミンＫ依存性の凝固因子である。
【００１８】
本明細書中で用いられる、「第VII因子ポリペプチド」又は「ＦVIIポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第VIIa因子(すなわち米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸配列１−４０６、その変異体、並びに第VII因子関連のポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートを含んでなる任意のタンパク質を意味する。これには、野生型ヒト第VIIa因子と相対的に同じか改善された生物学的活性を実質的に示すＦVII変異体、第VII因子関連のポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートが含まれる。
【００１９】
「第VII因子」なる用語は、非切断(チモーゲン)型の第VII因子ポリペプチド、並びにその生理活性型を得るようにタンパク質分解的にプロセシングされているもの(第VIIa因子と称されうるもの)を包含することを意図する。概して、第VII因子は、残基１５２と１５３の間で切断されて第VIIa因子となる。第VII因子の変異体は、安定性、リン脂質結合性、変更した特異的活性などを含む、ヒト第VII因子と相対的に異なる性質を表しうる。
【００２０】
また、上記の定義の範囲内の「第VII因子」又は「第VIIa因子」には、存在し、ある個体から他の個体に生じうる天然の対立遺伝子変異体が含まれる。また、グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度と位置は、選択した宿主細胞や宿主の細胞性環境の性質に応じて異なりうる。
本明細書中で用いられる「野生型ヒトＦVIIa」は、米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２１】
本明細書で用いる「第VII因子関連ポリペプチド」は、第VIIa因子の生物学的活性が野生型第VIIa因子の活性と比べて減少しているなどの、実質的に変更されている変異体を含むポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、限定するものではないが、ポリペプチドの生物学的活性を変更又は破壊する特定のアミノ酸配列の変更が導入されている第VII因子又は第VIIa因子を含む。
【００２２】
本明細書中で用いられる「第VII因子誘導体」なる用語は野生型第VII因子に対して相対的に同じか又は改善された生物学的活性を実質的に示すＦVIIポリペプチドを表すことを意図し、このＦVIIポリペプチドにおいて、親ペプチドの一又は複数のアミノ酸が、例えばアルキル化、グリコシル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成又はアミド、ポリペプチドとの融合(国際公開第０１／７９２７１号に記載のようにアルブミン-融合タンパク質を含む)などによって遺伝的に及び／又は化学的に及び／又は酵素的に修飾されている。これには、ＰＥＧ化されたヒト第VIIa因子、システイン-ＰＥＧ化ヒト第VIIa因子、グリコＰＥＧ化ヒト第VIIa因子及びその変異体を含むが、これらに限定されるものではない。「ＰＥＧ化されたヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子ポリペプチドにコンジュゲートされたＰＥＧ分子を有するヒト第VIIa因子を意味する。ＰＥＧ分子が第VIIa因子ポリペプチドのいずれかのアミノ酸残基又は糖鎖を含む第VIIa因子ポリペプチドのいずれかの部分に付着しうる(「グリコＰＥＧ化第VIIa因子」)ことは理解される。「システイン-ＰＥＧ化ヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子に導入されるシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートされるＰＥＧ分子を有する第VIIa因子を意味する。第VII因子誘導体の非限定的な例には、国際公開第０３／３１４６４号及び米国公開特許第２００４００４３４４６号、同第２００４００６３９１１号、同第２００４０１４２８５６号、同第２００４０１３７５５７号及び同第２００４０１３２６４０号(Neose Technologies, Inc.)に開示されるグリコＰＥＧ化ＦVII誘導体；国際公開第０１／０４２８７号、米国公開特許第２００３０１６５９９６号、国際公開第０１／５８９３５号、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)及び国際公開第０２／０２７６４号、米国公開特許第２００３０２１１０９４号(University of Minnesota)に開示されるＦVIIコンジュゲートが含まれる。
【００２３】
「改善された生物学的活性」なる用語は、i) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したタンパク質分解活性を有するＦVIIポリペプチド、又はii) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したＴＦ結合活性を有するＦVIIポリペプチド、又はiii) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加した血漿中の半減期を有するＦVIIポリペプチドを指す。
【００２４】
組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したタンパク質分解活性を有する第VII因子変異体の非限定的な例には、Ｓ５２Ａ-ＦVIIa、Ｓ６０Ａ-ＦVIIa( Lino等, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第５５８０５６０号に開示される、増加したタンパク質分解性安定性を表すＦVIIa変異体；残基２９０と２９１又は残基３１５と３１６の間でタンパク質分解的に切断されている第VIIa因子(Mollerup等, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第VIIa因子の酸化型(Kornfelt等, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９(国際公開第０２／０７７２１８号に対応する)に開示されるＦVII変異体；及び、国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)に開示される、増加したタンパク分解性安定性を表すＦVII変異体；国際公開第９９／２０７６７号、米国特許第６０１７８８２号及び同第６７４７００３号、米国公開特許第２００３０１００５０６号(University of Minnesota)及び国際公開第００／６６７５３号、米国公開特許第２００１００１８４１４号、同第２００４２２０１０６号、及び同第２００１３１００５号、米国特許第６７６２２８６号及び同第６６９３０７５号(University of Minnesota)に開示される、変性Ｇｌａ-ドメインを有し、亢進した膜結合を示すＦVII変異体；及び、国際公開第０１／５８９３５号、米国特許第６８０６０６３号、米国公開特許第２００３００９６３３８号(Maxygen ApS)、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０２９０９１号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０８３３６１号(Maxygen ApS)及び国際公開第０４／１１１２４２号(Maxygen ApS)、並びに国際公開第０４／１０８７６３号(Canadian Blood Services)に開示される、ＦVII変異体が含まれる。
【００２５】
野生型ＦVIIaと比較して増加した生物学的活性を有するＦVII変異体の非限定的な例には、国際公開第０１／８３７２５号、国際公開第０２／２２７７６号、ＰＣＴ／ＤＫ０２／００６３５(国際公開第０３／０２７１４７号に対応)、デンマーク特許出願第ＰＡ２００２ ０１４２３号(国際公開第０４／０２９０９０号に対応)、デンマーク特許出願第ＰＡ２００１ ０１６２７号(国際公開第０３／０２７１４７号に対応)、国際公開第０５／２４００６号、国際公開第０５／１２３９１６号、国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)に開示されるＦVII変異体；及び、特願２００１０６１４７９(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示される、亢進された活性を有するＦVIIa変異体が含まれる。
【００２６】
第VII因子の変異体の例には、P10Q-第VII因子、K32E-第VII因子、P10Q/K32E-第VII因子、L305V-第VII因子、L305V/M306D/D309S-第VII因子、L305I-第VII因子、L305T-第VII因子、F374P-第VII因子、V158T/M298Q-第VII因子、V158D/E296V/M298Q-第VII因子、K337A-第VII因子、M298Q-第VII因子、V158D/M298Q-第VII因子、L305V/K337A-第VII因子、V158D/E296V/M298Q/L305V-第VII因子、V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-第VII因子、K157A-第VII因子、E296V-第VII因子、E296V/M298Q-第VII因子、V158D/E296V-第VII因子、V158D/M298K-第VII因子、及びS336G-第VII因子、L305V/K337A-第VII因子、L305V/V158D-第VII因子、L305V/E296V-第VII因子、L305V/M298Q-第VII因子、L305V/V158T-第VII因子、L305V/K337A/V158T-第VII因子、L305V/K337A/M298Q-第VII因子、L305V/K337A/E296V-第VII因子、L305V/K337A/V158D-第VII因子、L305V/V158D/M298Q-第VII因子、L305V/V158D/E296V-第VII因子、L305V/V158T/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/E296V-第VII因子、L305V/E296V/M298Q-第VII因子、L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、S314E/K316H-第VII因子、S314E/K316Q-第VII因子、S314E/L305V-第VII因子、S314E/K337A-第VII因子、S314E/V158D-第VII因子、S314E/E296V-第VII因子、S314E/M298Q-第VII因子、S314E/V158T-第VII因子、K316H/L305V-第VII因子、K316H/K337A-第VII因子、K316H/V158D-第VII因子、K316H/E296V-第VII因子、K316H/M298Q-第VII因子、K316H/V158T-第VII因子、K316Q/L305V-第VII因子、K316Q/K337A-第VII因子、K316Q/V158D-第VII因子、K316Q/E296V-第VII因子、K316Q/M298Q-第VII因子、K316Q/V158T-第VII因子、S314E/L305V/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158D-第VII因子、S314E/L305V/E296V-第VII因子、S314E/L305V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T-第VII因子、S314E/L305V/K337A/V158T-第VII因子、S314E/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/K337A/E296V-第VII因子、S314E/L305V/K337A/V158D-第VII因子、S314E/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V-第VII因子、S314E/L305V/V158T/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V-第VII因子、S314E/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316H/L305V/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158D-第VII因子、K316H/L305V/E296V-第VII因子、K316H/L305V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T-第VII因子、K316H/L305V/K337A/V158T-第VII因子、K316H/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/K337A/E296V-第VII因子、K316H/L305V/K337A/V158D-第VII因子、K316H/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V-第VII因子、K316H/L305V/V158T/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V-第VII因子、K316H/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158D-第VII因子、K316Q/L305V/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/V158T-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/V158D-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/K337A-第VII因子、F374Y/V158D-第VII因子、F374Y/E296V-第VII因子、F374Y/M298Q-第VII因子、F374Y/V158T-第VII因子、F374Y/S314E-第VII因子、F374Y/L305V-第VII因子、F374Y/L305V/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D-第VII因子、F374Y/L305V/E296V-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/S314E-第VII因子、F374Y/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/K337A/V158T-第VII因子、F374Y/K337A/M298Q-第VII因子、F374Y/K337A/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/V158D-第VII因子、F374Y/V158D/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/M298Q-第VII因子、F374Y/V158D/E296V-第VII因子、F374Y/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/M298Q-第VII因子、F374Y/V158T/E296V-第VII因子、F374Y/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/V158D-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/E296V-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/V158T-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/V158D-第VII因子、F374Y/K337A/V158T/M298Q-第VII因子、F374Y/K337A/V158T/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/M298Q/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/M298Q/V158D-第VII因子、F374Y/K337A/E296V/V158D-第VII因子、F374Y/V158D/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/V158D/S314E/E296V-第VII因子、F374Y/V158D/M298Q/E296V-第VII因子、F374Y/V158T/S314E/E296V-第VII因子、F374Y/V158T/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/V158T/M298Q/E296V-第VII因子、F374Y/E296V/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、S52A-Factor VII, S60A-第VII因子；R152E-第VII因子、S344A-第VII因子、T106N-第VII因子、K143N/N145T-第VII因子、V253N-第VII因子、R290N/A292T-第VII因子、G291N-第VII因子、R315N/V317T-第VII因子、K143N/N145T/R315N/V317T-第VII因子；及び、２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII；３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII；１５３Ｉｌｅから２２３Ａｒｇまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII、及び４０６Ｃ-ＦVIIが含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００２７】
したがって、第VII因子ポリペプチドの置換変異体には、位置Ｐ１０、Ｋ３２、Ｌ３０５、Ｍ３０６、Ｄ３０９、Ｌ３０５、Ｌ３０５、Ｆ３７４、Ｖ１５８、Ｍ２９８、Ｖ１５８、Ｅ２９６、Ｋ３３７、Ｍ２９８、Ｍ２９８、Ｓ３３６、Ｓ３１４、Ｋ３１６、Ｋ３１６、Ｆ３７４、Ｓ５２、Ｓ６０、Ｒ１５２、Ｓ３４４、Ｔ１０６、Ｋ１４３、Ｎ１４５、Ｖ２５３、Ｒ２９０、Ａ２９２、Ｇ２９１、Ｒ３１５、Ｖ３１７での置換、及びＴ２３３からＮ２４０まで、又はＲ３０４からＣ３２９までのアミノ酸配列中の置換、付加又は欠失；又はＩ１５３からＲ２２３まで、又はこれらの組み合わせ、特に、Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｌ３０５Ｖ、Ｍ３０６Ｄ、Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｍ２９８Ｋ、Ｓ３３６Ｇ、Ｓ３１４Ｅ、Ｋ３１６Ｈ、Ｋ３１６Ｑ、Ｆ３７４Ｙ、Ｓ５２Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｒ１５２Ｅ、Ｓ３４４Ａ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１４３Ｎ、Ｎ１４５Ｔ、Ｖ２５３Ｎ、Ｒ２９０Ｎ、Ａ２９２Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ｒ３１５Ｎ、Ｖ３１７Ｔなどの変異、及びＴ２３３からＮ２４０まで、又はＲ３０４からＣ３２９まで、又はＩ１５３からＲ２２３までのアミノ酸配列中の置換、付加又は欠失、又はこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
血液凝固の際の第VIIa因子の生物学的活性は、(i) 組織因子(ＴＦ)に結合する、及び(ii) 第IX因子又は第X因子のタンパク質分解性の切断を媒介して活性化した第IX因子又は第X因子(それぞれ第IXa因子又は第Xa因子)を生成するという能力に由来する。
本発明のために、第VII因子ポリペプチドの生物学的活性(「第VII因子生物学的活性」)は、調製物の血液凝固を促進する能力を測定することによって定量化されうる(本明細書中のアッセイ４を参照)。このアッセイにおいて、生物学的活性は、コントロール試料に対する凝固時間の減少として表され、１単位／ｍｌの第VII因子活性を含むプールしたヒト血清標準物質との比較により、「第VII因子単位」に変換される。あるいは、第VIIa因子の生物学的活性は、(i) 脂質膜に包埋されたＴＦ及び第X因子を含む系における第VIIa因子又は第VII因子関連ポリペプチドの活性化第X因子(第Xa因子)生産能の測定(Persson等, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ii) 水性の系における第X因子の加水分解の測定(「インビトロタンパク質分解アッセイ」、下記のアッセイ２を参照)；(iii) 表面プラズモン共鳴(surface plasmon resonance)を基礎とする装置を用いた、第VIIa因子又は第VII因子関連ポリペプチドのＴＦへの物理的な結合の測定(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)；(iv) 第VIIa因子及び／又は第VII因子関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解の測定(「インビトロ加水分解アッセイ」、下記のアッセイ１を参照)；又は(v) ＴＦ-非依存性インビトロ系におけるトロンビンの生成の測定(下記のアッセイ３を参照)によって、定量化されうる。
【００２９】
野生型第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は改善された生物学的活性を有する第VII因子変異体は、上記の凝固アッセイ(アッセイ４)、タンパク質分解アッセイ(アッセイ２)又はＴＦ結合アッセイの一又は複数にて試験された場合に、同じ細胞型で生産された第VIIa因子の特定の活性の少なくともおよそ１０％、好ましくは少なくともおよそ２５％、より好ましくは少なくともおよそ５０％、より好ましくは少なくともおよそ７５％及び最も好ましくは少なくともおよそ９０％を表すものを包含する。野生型第VIIa因子と比較して実質的に低減した生物学的活性を有する第VII因子変異体は、上記の凝固アッセイ(アッセイ４)、タンパク質分解アッセイ(アッセイ２)又はＴＦ結合アッセイの一又は複数にて試験された場合に、同じ細胞型で生産された野生型第VIIa因子の特定の活性のおよそ２５％未満、好ましくはおよそ１０％未満、より好ましくはおよそ５％未満及び最も好ましくはおよそ１％未満を表すものを包含する。野生型第VII因子と比較して実質的に変更された生物学的活性を有する第VII因子変異体には、ＴＦ-非依存性第X因子タンパク質分解活性を示す第VII因子変異体及びＴＦを結合するが第X因子を切断しない変異体が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００３０】
野生型第VII因子と実質的に同じかより良好な生理活性を示すか、ないしは野生型第VII因子と比較して実質的に変更されたか低減した生理活性を示す第VII因子の変異体には、一又は複数のアミノ酸を挿入、欠失又は置換することによって野生型第VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが、これに限定するものではない。
【００３１】
「第X因子ポリペプチド」及び「第IX因子ポリペプチド」なる用語との関連で「ポリペプチド」なる表現は、野生型ヒト第X因子及び第IX因子それぞれのアミノ酸配列を含む任意のタンパク質、並びにそのそれぞれの「変異体」、「関連したポリペプチド」、「誘導体」及び「コンジュゲート」を包含することを意図し、この「変異体」、「関連したポリペプチド」、「誘導体」及び「コンジュゲート」なる表現は適宜変更を加味して第VII因子として定義される。
【００３２】
ある実施態様では、ビタミンＫ依存性ポリペプチドは第VII因子ポリペプチドである。
ある実施態様では、第VII因子ポリペプチドは、ヒト第VIIa因子(ｈＦVIIa)、好ましくは組み換えて作製したヒト第VIIa因子(ｒｈVIIa)である。
他の実施態様では、第VII因子ポリペプチドは第VII因子配列変異体である。
ある実施態様では、第VII因子ポリペプチドは野生型ヒト第VII因子と異なるグリコシル化を有する。
ある実施態様では、第VII因子ポリペプチドは、組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、実質的に同じ又は増加した血漿中の半減期を有する。
現在最も興味深い実施態様では、タンパク質は、第VII因子ポリペプチド、好ましくは活性化型の第VII因子ポリペプチドである。
【００３３】
初期液体製薬調製物では、活性成分の濃度が、単位用量の使用により患者に不必要な不快感を引き起こさない程度にすることが望ましい場合が多い。したがって、およそ２〜１０ｍｌより多い単位用量は望ましくない場合が多い。したがって、本発明の目的のために、タンパク質(例えば第VII因子ポリペプチド)の濃度は一般的に、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌである。異なる実施態様では、タンパク質(例えば第VII因子ポリペプチド)は、０．０１〜４０ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌ、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、０．５〜５．０ｍｇ／ｍｌ、０．６〜４．０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜４．０ｍｇ／ｍｌ、０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、０．１〜４．０ｍｇ／ｍｌ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ、又は０．１〜１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
第VIIa因子の濃度は、ｍｇ／ｍｌ又はＩＵ／ｍｌとして都合よく表され、１ｍｇは通常４３０００〜５６０００ＩＵ以上を表す。
【００３４】
非金属性インヒビター
前述の種類のタンパク質に対する非金属性インヒビターは、もちろん、初期液体製薬調製物中のタンパク質の必要とされる安定性に関して選択される。
【００３５】
「インヒビター」なる用語は、対象のタンパク質の自己触媒的分解を抑制するか又は除くことによって初期液体製薬調製物を安定化することができる任意の化合物を包含することを意図する。
初期液体製薬調製物は、２℃〜８℃の範囲の温度で貯蔵する場合、典型的には少なくとも６か月間、好ましくは最大３６か月間安定であろう。好ましくは、初期液体製薬調製物はより高い温度、例えば２０℃〜３０℃などの環境温度であっても安定であるが、より多くの含量のインヒビターを必要とすることが多い。
【００３６】
「安定性」なる用語は、２℃〜８℃で６か月間貯蔵した後に初期液体製薬調製物がその最初の生物学的活性の少なくとも５０％を保持することを意味することを意図する。好ましくは、初期液体製薬調製物は、２〜８℃で６か月間貯蔵した後にその最初の活性の少なくとも７０％、例として少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保持する。
【００３７】
第VII因子ポリペプチドに関して言えば、「安定性」なる用語は特に、(i) ２℃〜８℃で６か月間貯蔵した後に初期液体製薬調製物が一工程凝血アッセイ(one-stage clot assay)(アッセイ４)にて測定するところの最初の生物学的活性の少なくとも５０％を保持している、又は(ii) ２℃〜８℃で６か月間貯蔵した後に重鎖分解生成物の含量が、初期液体製薬調製物が重鎖分解生成物を含まないとすれば(すなわち、第VII因子ポリペプチドのみを割合の算出に用いる)、最大４０％(w/w)であることを意味することを意図する。好ましくは、初期液体製薬調製物は、２〜８℃で６か月間貯蔵した後にその最初の活性の少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保持する。また好ましくは、初期液体製薬調製物の重鎖分解生成物の含量は、最大３０％(w/w)、最大２５％(w/w)、最大２０％(w/w)、最大１５％(w/w)、最大１０％(w/w)、最大５％(w/w)又は最大３％(w/w)である。
典型的に、インヒビターは最大１０００Ｄａ、例えば最大７５０Ｄａ、例えば最大５００Ｄａの分子量を有する非金属性化合物である。
インヒビターは競合的インヒビターであることが好ましい。
【００３８】
特に第VII因子ポリペプチドに対して特に有用なインヒビターの例は、アミジン類及びグアニジン類からなる群から選択されたもの、例えばベンズアミジン類及びグアニジン類からなる群から選択されたもの、特に国際公開第２００５／０１６３６５号Ａに開示されるものである。
したがって、ある実施態様では、前記タンパク質は第VII因子ポリペプチドであり、インヒビターはベンズアミジン類及びグアニジン類類からなる群から選択される。
【００３９】
ゆえに、特に興味深いインヒビターのあるグループ(一般的に安定化剤(ii)と称される)は、-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフを含むものであり、このときＺ１及びＺ２は-Ｏ-、-Ｓ-、-ＮＲＨ-及び単結合からなる群から独立して選択され、ＲＨは水素、Ｃ１−４-アルキル、アーリル、及びアリールメチルからなる群から選択され、Ｒ１及びＲ２は水素、置換されていてもよいＣ１−６-アルキル、置換されていてもよいＣ２−６-アルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から独立して選択されるか、又は
Ｚ２及びＲ２が前記に定義したものであり、-Ｃ＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１が複素環の一部を形成するか、又は
Ｚ１及びＲ１が前記に定義したものであり、-Ｃ-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２が複素環の一部を形成するか、又は
-Ｚ１-Ｒ１-Ｒ２-Ｚ２-がビラジカルである場合に-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２が複素環を形成する。
【００４０】
「Ｃ１−６-アルキル」なる用語は、１〜６の炭素原子を有し、直鎖状又は分岐状である、非環状及び環状の飽和した炭化水素残基を包含することを意図する。特定の例は、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｓｅｃ-ブチル、ｔｅｒｔ-ブチル基、シクロプロピルメチル、ｎ-ペンチル、イソペンチル、ｎ-ヘキシルなどである。同様に、「Ｃ１−４-アルキル」なる用語は、１〜４の炭素原子を有し、直鎖状又は分岐状である、非環状及び環状の飽和した炭化水素残基を包含する。
【００４１】
同様に、「Ｃ２−６-アルケニル」なる用語は、２〜６の炭素原子を有し、１つの不飽和結合を含み、直鎖状又は分岐状である、非環状及び環状の炭化水素残基を包含することを意図する。Ｃ２−６-アルケニル基の例は、ビニル、アリル、ブタ-１-エン-１-イル、ブタ-２-エン-１-イル、ペンタ-１-エン-１-イル、及びヘキサ-１-エン-１-イルである。
【００４２】
Ｃ１−６-アルキル及びＣ２−６-アルケニル基と関係して「置換されていてもよい」なる用語は、対象の基が、ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ(すなわち、Ｃ１−６-アルキル-オキシ)、Ｃ２−６-アルケニルオキシ、オキソ(ケト又はアルデヒドの官能基を形成)、アリール、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルカルボニル、アミノ、モノ及びジ(Ｃ１−６-アルキル)アミノ、ハロゲンからなる群から選択される基(一又は複数)によって、１回又は数回、好ましくは１〜３回置換されてもよく、このとき任意のアリール及びヘテロシクリルは、置換されていてもよいアリール及びヘテロシクリルに対して以下に特に記載したように置換されてもよいことを意味することを意図する。
【００４３】
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを含む。
本明細書中で用いられる場合、「アリール」なる用語は、フェニル、ナフチル、１,２,３,４-テトラヒドロナフチル、アントラシル、フェナントラシル、ピレニル、ベンゾピレニル、フルオレニル及びキサンテニルなどの完全に又は部分的に芳香族性の炭素環ないしは環系を意味することを意図し、中でもフェニルが好適な例である。
【００４４】
「ヘテロシクリル」なる用語は、一又は複数の炭素原子がヘテロ原子、例えば窒素(=Ｎ-又は-ＮＨ)、硫黄(-Ｓ-)及び／又は酸素(-Ｏ-)原子に置換されている、飽和した、部分的に不飽和の、部分的に芳香族の又は完全に芳香族の炭素環ないし環系を意味することを意図する。ヘテロシクリル基の例は、オキサゾリル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、オキサジアゾリル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、チアゾニル、イソチアゾリル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピペリジニル、クマリル、フリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾジアゾリル、ベンゾオキソゾリル、ジアゾリル、ジアゾリニル、ジアゾリジニル、トリアゾリル、トリアゾリニル、トリアゾリジニル、テトラゾールなどである。好適なヘテロシクリル基は、５-、６-又は７-員環の単環基、例えばイソオキサゾリル、イソオキサゾリニル、オキサゾリル、オキサゾリニル、ピロリル、ピロリニル、ジアゾリル、ジアゾリニル、トリアゾリル、トリアゾリニル、イミダゾリル、イミダゾリニルなどである。
「複素環」なる用語は、「ヘテロシクリル」で定義したものに相当する環を意味することを意図する。
【００４５】
「アリール」、「ヘテロシクリル」及び「複素環」なる用語と関連して、「置換されていてもよい」なる用語は、対象の基が、ヒドロオキシ(エノール系で存在する場合に互変異性のケトの形態で表されうる)、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、フェニル、ベンジル、Ｃ１−６-アルコキシ、オキソ(互変異性エノールの形態で表されうる)、カルボキシ、Ｃ１−６-アルコキシカルボニル、Ｃ１−６-アルキルカルボニル、アミノ、モノ及びジ(Ｃ１−６-アルキル)アミノ、ジハロゲン-Ｃ１−４-アルキル、トリハロゲン-Ｃ１−４-アルキル及びハロゲンから選択される基(一又は複数)によって、１回又は数回、好ましくは１〜３回置換されうることを意味することを意図する。置換基の最も一般的な例は、ヒドロキシ、Ｃ１−４-アルキル、フェニル、ベンジル、Ｃ１−４-アルコキシ、オキソ、アミノ、モノ及びジメチルアミノ、及びハロゲンである。
【００４６】
Ｒ１及びＲ２が水素、置換されていてもよいＣ１−６-アルキル、置換されていてもよいＣ２−６-アルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されうるほか、また、-Ｃ(=Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフの一部が複素環の一部であり、このモチーフの他の部分がＺ１、Ｚ２、Ｒ１及びＲ２それぞれについて定義した意味を有することが考えられる。ある興味深い実施態様では、-Ｃ＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１は１,２-ジアゾール環、イソオキサゾール環、１,２,４-トリアゾール環、及び１,２,４-オキサジアゾール環からなる群から選択される複素環の部分を形成しうるか、又は-Ｃ-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２は１,２-ジアゾリン環、イソオキサゾリン環、１,２,４-トリアゾリン環、及び１,２,４-オキサジアゾリン環からなる群から選択される複素環の部分を形成しうる。このような複素環は上記の通りに置換されてもよい。
【００４７】
ある実施態様では、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一が水素、例えば、両方とも水素である。さらに、上記の実施態様と組み合わせられうるある実施態様では、Ｚ１及びＺ２の少なくとも一が単結合、例えば両方が単結合である。特別な実施態様では、Ｒ１及びＲ２はともに水素であり、Ｚ１及びＺ２はともに単結合である。
【００４８】
-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフは安定化剤(ii)の作用を安定化させるために特に重要であると考えられている。特に、-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフは第VII因子ポリペプチドの基質のアルギニン部分を模倣していると考えられている。
より具体的な実施態様では、安定化剤(ii) は、-Ｃ-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフを含むアミジン化合物と＞Ｎ-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフを含むグアニジン類化合物とからなる群から選択される少なくとも一である。
【００４９】
ある実施態様では、安定化剤(ii)は、モチーフ-Ｃ６Ｈ４-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２を含むベンズアミジン類からなる群から選択される少なくとも一のアミジン化合物であり、このときＣ６Ｈ４は置換されていてもよいベンジン環を意味し、このベンズアミジン(Ｒ１及びＲ２は水素であり、Ｚ１及びＺ２は単結合である)は特定の実施態様を構成する(実施例の項目を参照)。
他の具体的な実施態様では、ベンズアミジン類はモチーフ＞Ｎ-Ｃ６Ｈ４-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２を含んでなり、このときＣ６Ｈ４は置換されていてもよいベンジン環、すなわちｏ-アミノ-ベンズアミジン、ｍ-アミノ-ベンズアミジン又はｐ-アミノ-ベンズアミジンを意味し、このｐ-アミノ-ベンズアミジンなどのｐ-アミノ-ベンズアミジン類は現在最も期待できるものである。
【００５０】
ｐ-アミノ-ベンズアミジン類の更なる例示的な例は、Aventisの欧州特許第１１６２１９４号Ａ１、特に請求項１〜６及び[０００９]〜[００５２]段落に定義されるもの、及び欧州特許第１２７０５５１号Ａ１、特に請求項１及び２と[００１０]-[００３２]段落によって開示されるものである。
【００５１】
他の実施態様では、安定化剤(ii)は、-ＣＨ２-ＮＨ-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフを含むグアニジン化合物からなる群から選択される少なくとも一のグアニジン化合物である。グアニジン化合物の例は、アルギニン、アルギニン誘導体及び少なくとも一のアルギニン残基を含む２〜５のアミノ酸残基のペプチドからなる群から選択されるものである。アルギニンは特定の実施態様を構成する(実施例の項目を参照)。
「アルギニン誘導体」なる用語は、アルギニンホモログ、N-端末の官能基化アルギニン(例えば、Ｎ-メチル化及びＮ-アシル化(例えばアセチル化)誘導体)、Ｃ-端末の官能基化アルギニン(例えば、Ｃ-アミド化、Ｃ-アルキルアミド化、及びＣ-アルキル化誘導体)、及びこれらの組み合わせを包含することを意図する。
【００５２】
上記のように、安定化剤の重要なモチーフは-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２である。また、安定化剤の他の部分は、特に安定化作用の最適化及び患者の耐性に関して重要でありうる。典型的に、安定化剤は式Ｙ-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２を有し、Ｙは有機基である。一般的に、基Ｙは安定化作用の効率を向上させるために選択される。また、基Ｙは式-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２の一又は複数の更なるモチーフを含みうる。
【００５３】
安定化剤(一又は複数)(ii)の濃度は、一般的に少なくとも１μＭである。望ましい(又は必要な)濃度は、一般的に、選択した安定化剤(一又は複数)に、より具体的には第VII因子ポリペプチドに対して選択された安定化剤の結合親和性に依存する。
異なる実施態様では、安定化剤(ii)は、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも２５０μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、例として２０〜２０００μＭ、５０〜５０００μＭ、０．１〜１０ｍＭ、０．２〜２０ｍＭ又は０．５〜５０ｍＭの濃度で存在する。
【００５４】
一実施態様では、安定化剤(ii)はベンズアミジンであり、該薬剤の濃度は少なくとも２ｍＭであるが、置換されたベンズアミジンがより低い濃度で添加されればより強力となると予想される。
一実施態様では、安定化剤(ii)はアルギニンであり、該薬剤の濃度は少なくとも１０ｍＭである。
【００５５】
他の成分
結果として得た液体製薬調製物をヒトなどの哺乳動物に直接非経口投与するために有用にするために、通常、初期液体製薬調製物(及びこれによる結果として得た液体製薬調製物)のｐＨ値を合理的な限界内、例えばおよそ４．０からおよそ９．０、例えばおよそ５．０からおよそ９．０に保つ必要がある。ある条件下で好適なｐＨ値に確実にするために、液体製薬調製物はまた、およそ４．０からおよそ９．０、例えばおよそ５．０からおよそ９．０の範囲にｐＨを保つために好適な緩衝剤(iii)を含む。
【００５６】
「緩衝剤」なる用語は、溶液のｐＨをおよそ５．０からおよそ９．０の許容される範囲に維持する薬剤ないしは薬剤の組合せを包含する。
一実施態様では、緩衝剤(iii)は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ヒスチジン、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グリシンアミド、リン酸、酢酸(例えばナトリウム又は酢酸カルシウム)、乳酸、グルタル酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸及びコハク酸の塩類及び酸からなる群から選択される少なくとも一の成分である。緩衝剤は、混合物が特定の範囲のｐＨ値を提供することができる場合に２以上の成分の混合物を含みうることは理解されるであろう。実施例は上記の酢酸及び酢酸ナトリウムなどであってもよい。緩衝剤の濃度は、溶液の好適なｐＨを維持するために選択される。様々な実施態様では、緩衝剤の濃度は、１〜１００ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜２５ｍＭ、又は２〜２０ｍＭである。
【００５７】
一実施態様では、組成物のｐＨは、およそ５．０からおよそ８．０、例えばおよそ５．０からおよそ７．５、およそ５．０からおよそ７．０、およそ５．０からおよそ６．５、およそ５．０からおよそ６．０、およそ５．５からおよそ７．０、およそ５．５からおよそ６．５、およそ６．０からおよそ７．０、およそ６．４からおよそ６．６、又はおよそ５．２からおよそ５．７に維持される。
【００５８】
タンパク質、インヒビター及び緩衝剤に加えて、初期液体製薬調製物は、組成物の調製、製剤、安定性又は投与に有益な更なる構成成分を含んでもよい。
ゆえにまた、例えば国際公開第２００５／０１６３６５号Ａに開示されるように、初期液体製薬調製物は、非イオン性界面活性剤(一又は複数)、浸透圧変更剤(一又は複数)(イオン強度変更剤(一又は複数)を含む)、抗酸化剤、保存剤などを含んでもよい。
【００５９】
密封容器
初期液体製薬調製物が実際の使用の数か月前に調製されてもよいという事実から、この調製物を密封環境に置いて保存しやすくすることが必要である。したがって、初期液体製薬調製物は密封容器、例えばバイアル、カートリッジ、アンプル、カーポール(carpoule)などで提供される。これは調製物の完全性が確実に保存されるのに対し、工程(b)及び(c)に定義されるように投与のための調製がいつであろうと容易に調製可能にするものである。
【００６０】
したがって、初期液体製薬調製物は典型的には、場合によって容器内の空隙を埋めるための不活性ガスを含む、気密容器(例えば、バイアル又はカートリッジ(例えばペン状塗布器用のカートリッジ))で提供される。不活性ガスは、窒素、アルゴンなどからなる群から選択されうる。容器(例えばバイアル又はカートリッジ)は典型的には、ガラス又はプラスチック、特にガラス製であり、場合によってゴム製の隔壁か又は製薬的組成物の完全性を保ったままで貫通可能な他の封鎖手段によって封鎖される。更なる実施態様では、容器は、密封バッグ、例えば密封されたビニールバッグ、例として、積層(例えば金属(アルミニウムなど)積層プラスチックバッグ)に内包したバイアル又はカートリッジである。
様々な実施態様では、前記密封容器中の製薬調製物の量は、１〜１０用量、例えば１〜５用量、特に１用量に相当する。
【００６１】
方法工程(b)
続く工程(b)において、製薬調製物は、前記インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に接触させる。
接触工程の重要な特徴は、前記インヒビターの実質的な部分が固相ポリマー物質に結合されるのに対して、薬学的に活性なタンパク質は実質的に結合せず、その生物学的活性を維持するということである。
【００６２】
固相ポリマー物質
固相ポリマー物質は、限定するものではないが、分離目的、例えばクロマトグラフィ法で用いられる固相物質として公知の物質を含む、幅広い範囲の物質から選択されうる。
物質の種類の好適な例は、陽イオン交換物質、陰イオン交換物質、極性物質、無極性物質、親水性物質、疎水性物質、及びゲル濾過物質からなる群から選択されるものであり、このイオン交換物質、特に陽イオン交換樹脂が現在のところ好ましい。
好適なポリマー物質のある具体的な特徴は、セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質の活性は、ポリマー物質と１０分間接触させた際に実質的に変化しない(すなわち、最初の活性の少なくとも９０％が維持される)ということである。
【００６３】
現在最も興味深い物質の例は、セルロース繊維、及び親水性合成ポリマー、例としてメタクリル酸及びスチレンコポリマー(例えばポリスチレン／ジビニルベンゼン(ＰＳＤＶＢ))から選択されるものである。
現在最も興味深い商品は、陽イオン交換物質であるＣｈｅｌｅｘ１００(BioRad Laboratories)である。
【００６４】
固相ポリマー物質はインヒビターの少なくとも実質的な部分を保持する一方で、結合しないタンパク質の実質的な部分をそのままにすることが可能でなければならない。「実質的」なる用語は一般的に、「少なくとも７５％」、しかし好ましくは少なくとも８０％、例として少なくとも９０％又はさらに少なくとも９５％を意味する。
あるインヒビターでは、インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持する好適な固形ポリマー物質は、ハンセン溶解度パラメータ(ＨＳＰ)を用いることによって予測されうる(参照：Charles M. Hansen, Hansen's Solubility Parameters: A User's Handbook, CRC Press, 1999)。
【００６５】
溶解度パラメータ(ＨＳＰ)、適合性、表面上の吸着、類似の親和性の物質に対する配向性(自己集合体化)、及び溶解性及び親和性に関する他の現象を調べることによって予測することができる。同じ溶解度パラメータを有する液体は混和することができ、ポリマーは、溶解度パラメータがポリマー自体とさほど違わない液体を溶解又は吸着するであろう。基本的原理は「似たものは似たものを溶解する」であったが、最近では「似たものは似たものを求め合う」と変わってきている。溶解度パラメータ(ＨＳＰ)は単純に定性的概念を数で表すものであり、広範囲に用いられており、生物学の分野を含む様々な産業に対する価値が明らかにされている。
本発明では、対象のインヒビター(一又は複数)の溶解度パラメータ(ＨＳＰ)は、対象の固相ポリマー物質の溶解度パラメータ(ＨＳＰ)と比較する。そして、前記インヒビター(一又は複数)を結合するための好適なポリマー物質はその溶解度パラメータの類似性に基づいて選択される(「似たものは似たものを求め合う」)。
【００６６】
例えば、ベンズアミジンに基づいて求められる計算から、親和性はセルロース誘導体、アクリル酸をベースとしたポリマー、アクリル酸コポリマー、酢酸ビニル(ＰＶＡ)、ビニールブチラール(ＰＶＢ)、アクリロニトリル、スチレンコポリマー、ビニルピロリドン(ＰＶＰ)、並びに酸基を持つポリマー内で期待されることが示唆される。
ＰＶＰ及びＰＶＡのような可溶性ポリマーは、物理的形態を安定させるために架橋結合されうる。
【００６７】
ポリマー物質のバルクは、様々な様式で、例えばフィルターの形態で、例えばプラグフィルター又はディスクフィルターの形態で配置されてもよく、カラム又はバルクはチューブ、針又はチャンバの内部表面を覆っていてもよい。
ポリマー物質のバルクの形態に応じて、初期液体製薬調製物はバッチ式で又はバルクに通すないしはバルクにかざすことによって接触させてもよい。
【００６８】
ある現在のところ好適な実施態様では、液体製薬調製物は、液体製薬調製物をポリマー物質のバルクに通すことによって、ポリマー物質と接触させる。この実施態様では、バルクはフィルターの形態で、例えばプラグフィルター又はディスクフィルターの形態、又はカラムであることが好ましい。
他の実施態様では、液体製薬調製物は、液体製薬調製物をポリマー物質のバルクにかざすことによって、ポリマー物質と接触させる。この実施態様では、バルクは、チューブ、針又はチャンバの内部表面を覆うことが好ましい。
【００６９】
雑菌混入を避け、インヒビター物質を容易に取り除くために、液体製剤は、例えば、ポリマー物質が適する注射器ないしは他の区画及び出口域に含まれてもよい(図３ａ及びｂ)。注入の間、液体製剤はポリマー物質を通り抜け、インヒビターが取り除かれる。
他の実施態様では、液体製剤は注射器又は他の区画に含まれる。注入の直前に、ポリマー物質を有する滅菌フィルターは静脈注入チューブとつながっており、針(例えばバタフライ針)が出口に取り付けられている。注入の間にインヒビターは取り除かれる(前記滅菌フィルターの２つの代替的な例を示す図４ａ及び４ｂを参照)。
他の実施態様では、液体製剤は注射器又は他の区画に含まれる。注入の直前に針(例えばバタフライ針)を備えた注入チューブが出口に取り付けられる。チューブは、チューブ内部を覆うか又はチューブ内を満たすポリマー物質を有する。注入の間にインヒビターが取り除かれる(図５を参照)。
【００７０】
方法工程(c)
続く工程(c)では、液体製薬調製物が前記固相ポリマー物質から分離され、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る。
工程(b)の実際の実施に応じて、結果として得た液体製薬調製物は、特に初期液体製薬調製物が固相ポリマー物質のバルクに通されるか又はかざされる場合に、固相ポリマー物質から分離した形態ですぐに得られうる。しかしながら、分離した形態ですぐに得られない場合には、結果として得た液体製薬調製物は、例えば適度な圧力の装置による濾過、例えばプランジャー、沈殿などによって、固相ポリマー物質から分離すべきである。
【００７１】
その結合故に、非金属性インヒビターの濃度は典型的に、少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％低減している、ないしは実質的に取り除かれている。したがって、インヒビターの濃度は、重要な治療上の作用が取り除かれないレベルにすることができる。
ある現在のところ好適な実施態様では、密封容器内の製薬調製物の量は１用量に相当し、この用量はポリマー物質のバルクに通されるか又はかざされる。
他の好適な実施態様では、密封容器内の製薬調製物の量は２〜１０用量に相当し、１用量に相当する量はポリマー物質のバルクに通されるか又はかざされる。
一般的に、工程(b)の接触時間は、０．１〜１００秒、一般的に０．５〜３０秒の範囲である。
【００７２】
使用方法(方法工程(d))
本発明の方法のある変更法は、結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体、特にヒトに投与する、という続く工程(d)を含んでなる。
一般的に、方法工程(d)は、工程(c)の完了から６０分以内、特に工程(c)の完了から５分以内、好ましくは工程(c)の完了の直後、又は工程(c)とできるだけ連動して実施される。
【００７３】
本発明の調製は、凝固因子欠損(例えば血友病Ａ、血友病Ｂ、凝固第XI因子欠損、凝固第VII因子欠損)；血小板減少症又はフォンウィルブランド病、又は凝固因子インヒビターが原因となるもの、及び脳内出血、又は任意の原因による過剰出血を含む、例えば出血性疾患などの任意の第VII因子応答症候群を治療するために用いられうる。また、調製物は外科手術ないしは他の外傷に関連する患者又は抗凝固療法を受けている患者に投与されてもよい。
【００７４】
「有効量」なる用語は、所望の応答を達成するために用量を設定する有資格者によって決定される有効量である。用量を考慮する要因には、有効性、生物学的利用率、所望の薬物動態／薬力学的な性質、治療条件、患者に関する要因(例えば、体重、健康状態、年齢など)、同時に投与する医薬の有無(例えば抗凝固剤)、投与時間、又は医師が知る他の要因が含まれるであろう。
【００７５】
「治療」なる用語は、疾患、症状又は疾病と戦う目的で、哺乳動物などの被検体、特にヒトの管理や看護として定義され、症状ないし合併症の発症を予防する、又は症状ないし合併症を軽減する、又は疾患、症状又は疾病を取り除くためにタンパク質を投与することを含む。治療上活性なタンパク質を含有する製薬的組成物の発明は、治療を必要とする被検体に非経口投与されてもよい。非経口投与は、注射器、場合によってペン様注射器によって皮下、筋肉内又は静脈内にて実施されてもよい。あるいは、非経口投与は注入ポンプによって実施されうる。
【００７６】
重要な実施態様では、製薬組成物は、当分野で公知の方法に従って、皮下、筋肉内又は静脈内注射に適している。
したがって、更なる態様では、本発明は、セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ依存性タンパク質の群に属する治療上活性なタンパク質を必要とする被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封した容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を結合することが可能な固相ポリマー物質、特に陽イオン交換物質に該製薬調製物を接触させ、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る、そして、
(d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する
という工程を含んでなる方法に関する。
【００７７】
一般的に、結果として生じた液体製薬調製物は上記の通りに注入によって投与される。
また、上記のように、治療上活性なタンパク質を必要とする被検体は典型的には、第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある。
【００７８】
好適な実施態様
現在のところ好適な実施態様は、液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) 第VII因子ポリペプチドとベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質、特に陽イオン交換物質に該液体製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法に関する。
【００７９】
他の現在のところ好適な実施態様は、第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) 第VII因子ポリペプチドと、(ii) ベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質、特に陽イオン交換物質に該製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得て、そして、
(d) この結果として得られた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する、
という工程を含んでなる方法に関する。
【００８０】
本発明の実施態様の一覧を以下に示す。
実施態様１． 液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法。
実施態様２． 前記タンパク質が自己触媒性質を有する、実施態様１に記載の方法。
実施態様３． 前記タンパク質が部分的な又は完全な活性化型である、実施態様１又は２に記載の方法。
実施態様４． 前記タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、プロテインＣ、第VII因子ポリペプチド、プロテインＺ、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、マトリックスＧｌａタンパク質及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様１から３のいずれか一に記載の方法。
実施態様５． 前記タンパク質が、第VII因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、第X因子ポリペプチド及び活性化プロテインＣからなる群から選択されるビタミンＫ依存性凝固因子である、実施態様１から４のいずれか一に記載の方法。
実施態様６． 前記タンパク質が第VII因子ポリペプチド、好ましくは活性化型の第VII因子ポリペプチドである、実施態様１から５のいずれか一に記載の方法。
実施態様７． 前記インヒビターは、最大１０００Ｄａ、例えば最大７５０Ｄａ、例えば最大５００Ｄａの分子量を有する非金属性化合物である、実施態様１から６のいずれか一に記載の方法。
実施態様９． 前記インヒビターがアミジン類及びグアニジン類からなる群から選択される、実施態様１から７のいずれか一に記載の方法。
実施態様１０． 前記タンパク質が第VII因子ポリペプチドであり、前記インヒビターがベンズアミジン類及びグアニジン類からなる群から選択される、実施態様１から９のいずれか一に記載の方法。
実施態様１１． 前記ポリマー物質が、陽イオン交換物質、負イオン交換物質、極性物質、無極性物質、親水性物質、及び疎水性物質からなる群から選択される、実施態様１から１０のいずれか一に記載の方法。
実施態様１２． 前記ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択される、実施態様１から１１のいずれか一に記載の方法。
実施態様１３． 前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、実施態様１から１２のいずれか一に記載の方法。
実施態様１４． 液体製薬調製物をポリマー物質のバルクに通すことによって、前記液体製薬調製物がポリマー物質と接触する、実施態様１から１３のいずれか一に記載の方法。
実施態様１５． 液体製薬調製物をポリマー物質のバルクにかざすことによって、前記液体製薬調製物がポリマー物質と接触する、実施態様１から１３のいずれか一に記載の方法。
実施態様１６． 前記密封した容器中の製薬調製物の量が１〜１０用量、例えば１〜５用量、特に１用量に相当する、実施態様１から１５のいずれか一に記載の方法。
実施態様１７． 前記密封した容器中の製薬調製物の量が１用量に相当し、この用量がポリマー物質のバルクに通される又はかざされる、実施態様１６に記載の方法。
実施態様１８． 前記密封した容器中の製薬調製物の量が２〜１０用量に相当し、１用量に相当する量がポリマー物質のバルクに通される又はかざされる、実施態様１６に記載の方法。
実施態様１９． 工程(b)の接触時間が０．１〜１００秒の範囲である、実施態様１から１８のいずれか一に記載の方法。
実施態様２０． 液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) 第VII因子ポリペプチドとベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該液体製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法。
実施態様２１． 前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、実施態様２０に記載の方法。
実施態様２２． (d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体、特にヒトに投与する、という工程を後に含んでなる、実施態様１から２１のいずれか一に記載の方法。
実施態様２３． セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ依存性タンパク質の群に属する治療上活性なタンパク質を必要とする被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封した容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る、そして、
(d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する
という工程を含んでなる方法。
実施態様２４． 前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、実施態様２３に記載の方法。
実施態様２５． 前記の結果として生じた液体製薬調製物が注射によって投与される、実施態様２３又は２４に記載の方法。
実施態様２６． 治療上活性なタンパク質を必要とする被検体が第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある、実施態様２３から２５のいずれか一に記載の方法。
実施態様２７． 第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) 第VII因子ポリペプチドと、(ii) ベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得て、そして、
(d) この結果として得られた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する、
という工程を含んでなる方法。
実施態様２８． 前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、実施態様２７に記載の方法。
【００８１】
本発明は以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【００８２】
一般的な方法
第VII因子ポリペプチドの生物学的活性を決定するために適切なアッセイ
本発明に関して有用な第VII因子ポリペプチドは、簡単な予備的なインビトロ試験として実施されうる好適なアッセイによって選択されうる。ゆえに、本明細書は、第VII因子ポリペプチドの活性についての簡単な試験(「インビトロ加水分解アッセイ」と題する)を開示する。
【００８３】
第一世代凝血アッセイ
第VII因子ポリペプチドの活性は、基本的には国際公開第９２／１５６８６号又は米国特許第５９９７８６４号に記載のように、一工程凝血アッセイを用いて測定してもよい。簡単に言うと、試験する試料は５０ｍＭ トリス(ｐＨ７．５)、０．１％ ＢＳＡにて希釈し、１００μｌを１０ｍＭ Ｃａ２＋を含む２００μｌのトロンボプラスチンＣと１００μｌの第VII因子欠失血漿とともにインキュベートする。凝固時間を測定し、参照標準物質又は段階希釈のクエン酸化正常ヒト血漿のプールを用いた標準曲線と比較する。
【００８４】
インビトロ加水分解アッセイ(アッセイ１)
天然の(野生型) 第VIIa因子及び第VII因子ポリペプチド(以降、ともに「第VIIa因子」と称する)は、比活性について検定してもよい。また、比活性を直接比較するために同時にアッセイしてもよい。アッセイはマイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)で行う。終濃度１ｍＭの発色基質Ｄ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(Ｓ-２２８８、Chromogenix, Sweden)を、０.１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍｇ/ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ, ｐＨ７.４中の第VIIa因子(終濃度１００ｎＭ)に加える。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレート読み取り機(Molecular Devices, USA)にて４０５ｎｍの吸光度を連続して測定する。２０分間のインキュベートの間に反応した吸光度を、酵素を含まないブランクウェルの吸光度を減算した後、第VII因子ポリペプチドと野生型第VIIa因子との活性間の比率を算出するために用いる。
比率＝(Ａ４０５ｎｍ 第VII因子ポリペプチド)／(Ａ４０５ｎｍ 野生型第VIIa因子)
【００８５】
これに基づき、天然の第VIIa因子より低い、天然の第VIIa因子に相当する、又は天然の第VIIa因子より高い活性を有する第VII因子ポリペプチド、例えば第VII因子ポリペプチドの活性と天然の第VII因子(野生型ＦVII)の活性との間の比率がおよそ１．０対１．０を超える第VII因子ポリペプチドなどが同定されうる。
また、第VII因子ポリペプチドの活性は、第X因子などの生理的な基質を、適宜１００〜１０００ｎＭの濃度で用いて測定してもよく(「インビトロタンパク質分解アッセイ」)、このとき生成された第Xa因子は適する発色色素(例えば、Ｓ-２７６５)を加えた後に測定する。さらに、活性アッセイは生理学的温度で行ってもよい。
【００８６】
インビトロタンパク質分解アッセイ(アッセイ２)
天然の(野生型) 第VIIa因子及び第VII因子ポリペプチド(以降、ともに「第VIIa因子」と称する)は、比活性を直接比較するために同時にアッセイしてもよい。アッセイはマイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)で行う。０.１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍｇ/ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む１００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ, ｐＨ７.４中の第VIIa因子(１０ｎＭ)と第X因子(０．８μＭ)を１５分間インキュベートする。次いで、０.１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍｇ/ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む５０μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ, ｐＨ７.４を加えて第X因子切断を止める。生成された第Xa因子の量は、終濃度０．５ｍＭの発色基質Ｚ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(Ｓ-２７６５、Chromogenix, Sweden)を加えて測定する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレート読み取り機(Molecular Devices, USA)にて４０５ｎｍの吸光度を連続して測定する。１０分間反応させた吸光度を、酵素を含まないブランクウェルの吸光度を減算した後、第VII因子ポリペプチドと野生型第VIIa因子とのタンパク質分解活性間の比率を算出するために用いる。
比率＝(Ａ４０５ｎｍ 第ＶII因子ポリペプチド)／(Ａ４０５ｎｍ 野生型第VIIa因子)
【００８７】
これに基づき、天然の第VIIa因子より低い、天然の第VIIa因子に相当する、又は天然の第VIIa因子より高い活性を有する第VII因子ポリペプチド、例えば第VII因子ポリペプチドの活性と天然の第VII因子(野生型ＦVII)の活性との間の比率がおよそ１．０対１．０を超える第VII因子ポリペプチドなどが同定されうる。
【００８８】
トロンビン生成アッセイ(アッセイ３)
第VII因子ポリペプチドのトロンビン生成能は、生理的濃度のインヒビター及び関係するすべての凝固因子(血友病Ａ状態を模倣する場合には第VIII因子を除く)と活性化血小板を含むアッセイ(アッセイ３)で測定することができる(Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547の543頁に記載される、この文献は出典明記によって本明細書中に援用される)。
【００８９】
一工程凝固アッセイ(凝血アッセイ)(アッセイ４)
また、第VII因子ポリペプチドは一工程凝血アッセイ(アッセイ４)を用いて比活性(「凝血活性」)についてアッセイしてもよい。このために、試験する試料は５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ-バッファ(ｐＨ７．２)、１％ ＢＳＡにて希釈し、４０μｌを、１０ｍＭ Ｃａ２＋と合成リン脂質を含む８０μｌのヒト組み換え組織因子と４０μｌの第VII因子欠失血漿とともにインキュベートする。凝固時間(凝血時間)を測定し、平行してアッセイした参照標準物質を用いた標準曲線と比較する。
【００９０】
実施例１
インヒビターであるＳ-２-[３-(４-カルバミミドイルフェニル)-ウレイド]-Ｎ-[１-(３-メトキシフェニル)-エチル]-アセトアミド(インヒビター０００８)をｒＦVIIa製剤から除去するＣｈｅｌｅｘ１００の能力を以下の方法で調べた。
１.４ｍｇ/ｍｌ ｒＦVIIa、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ ２Ｈ２０及び１０ｍＭ グリシルグリシンを含むｒＦVIIaバルクの溶液を解凍して、４５０μＭのインヒビター０００８を含む２：１の比率のｒＦVIIaバルクとインヒビター０００８の溶液と混合した。１０ｍＭ ヒスチジンを溶液に加え、ｐＨを６．５０に調整した。溶液を２．００ｍｌの一定分量に分けた。
【００９１】
漸増量のＣｈｅｌｅｘ１００を溶液に加え、以下の量のＣｈｅｌｅｘを加えた。２．００ｍｌのｒＦVIIa／インヒビター溶液当たり０、４０、８０、１２０、１６０、２００、２４０、２８０及び３２０ｍｇのＣｈｅｌｅｘ１００。
溶液を１分間撹拌し、０．２２μＭフィルターに濾過した。高性能ゲル浸透クロマトグラフィ(ＧＰ-ＨＰＬＣ)を用いてすべての溶液をインヒビター含量について分析した。
ＧＰ-ＨＰＬＣ法は、移動相として５％イソプロパノールを含む０．２Ｍ 硫酸アンモニウム ｐＨ７．０を用いたＷａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｋ ３００ ＳＷカラム、７.５×３００ｍｍにて行った。流速：０．５ｍｌ／分及び検出：２１５ｎｍ。インヒビターは異なるピークとしてクロマトグラフに表れ、相対的な含量を算出する。結果を図１に示す。
【００９２】
実施例２
ｐ-アミノベンズアミジンをｒＦVIIa製剤から除去するＣｈｅｌｅｘ１００の能力を以下の方法で調べた。
１.４ｍｇ/ｍｌ ｒＦVIIa、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ ２Ｈ２０及び１０ｍＭ グリシルグリシンを含むｒＦVIIaバルクの溶液を解凍して、３０ｍＭのｐ-アミノベンズアミジンを含む２：１の比率のｒＦVIIaバルクとｐ-アミノベンズアミジンの溶液と混合した。１０ｍＭ ヒスチジンを溶液に加え、ｐＨを６．５０に調整した。溶液を２．００ｍｌの一定分量に分けた。
【００９３】
漸増量のＣｈｅｌｅｘ１００を加え、以下の量のＣｈｅｌｅｘを加えた。２．００ｍｌのｒＦVIIa／インヒビター溶液当たり０、１６０、２４０、３２０、４００、４８０、５６０及び６４０ｍｇのＣｈｅｌｅｘ１００。
溶液を１分間撹拌し、０．２２μＭフィルターに濾過した。高性能ゲル浸透クロマトグラフィ(ＧＰ-ＨＰＬＣ)を用いてすべての溶液をインヒビター含量について分析した。
ＧＰ-ＨＰＬＣ法は、移動相として５％イソプロパノールを含む０．２Ｍ 硫酸アンモニウム ｐＨ７．０を用いたＷａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｋ ３００ ＳＷカラム、７.５×３００ｍｍにて行った。流速：０．５ｍｌ／分及び検出：２１５ｍｍ。インヒビターは異なるピークとしてクロマトグラフに表れ、相対的な含量を算出する。結果を図２に示す。
【００９４】
実施例３
ベンズアミジンをｒＦVIIa製剤から除去するＣｈｅｌｅｘ１００の能力を以下の方法で調べた。
５０ｍＭのベンズアミジンによって安定化させた１ｍｇ／ｍｌの第VIIa因子溶液５ｍｌを、ガラスフラスコ中の１ｇのＣｈｅｌｅｘ１００に加え、３０秒間かき混ぜて混合する。
およそ２ｍｌの混合溶液を遠心ガラスに移し、次いで１分間に１００００回転で５分間遠心する。
上清には、ベンズアミジンの含量が１０ｍＭの濃度に低減されている第VIIa因子溶液が含まれる。
【００９５】
実施例４
インヒビターである２-[３-(４-カルバミミドイルフェニル)-ウレイド]-Ｎ-[１-(３-メトキシフェニル)-エチル]-アセトアミドをｒＦVIIa製剤から除去するＣｈｅｌｅｘ１００の能力を以下の方法で調べた。
１.４ｍｇ/ｍｌ ｒＦVIIa、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ ２Ｈ２０及び１０ｍＭ グリシルグリシンを含むｒＦVIIaバルクの溶液(凍結)を解凍して、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ ２Ｈ２０及び１０ｍＭ グリシルグリシンを含む４．５ｍＭのインヒビターである２-[３-(４-カルバミミドイルフェニル)-ウレイド]-Ｎ-[１-(３-メトキシフェニル)-エチル]-アセトアミドのインヒビター溶液と混合した。
混合物比率は以下の通りである。ｒＦVIIaバルク：インヒビター溶液＝２：１。終溶液１０ｍＭ ヒスチジンを加えて、ｐＨを６．５０に調整した。
【００９６】
Ｃｈｅｌｅｘを以下のように調製した。
カラム物質を最大およそ３ｍｍのカラムに対応するＣｈｅｌｅｘ１００物質に置換するためにPharmaciaのＮＡＰＴＭカラムを空にした。カラムは以下のバッファにて平衡化した。５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ヒスチジン及び１０ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ＝６．５０。
１０ｍｌのｒＦVIIa／インヒビター溶液を０．５ｍｌの一定分量のカラムに加え、０．５ｍｌの分画に回収した。
試料は、ＧＰＣによるｒＦVIIaとインヒビターの含量について分析した。溶出量、インヒビター濃度及びｒＦVIIa濃度の関係を図６に示す。
図６は、試験した溶出容量(０．５ｍｌ〜３ｍｌ)内でインヒビター濃度が１７５μＭ未満に低減している(初期値としておよそ１０の低減因子は１．５ｍＭであった)ことと同時に、ｒＦVIIa濃度は初期値の０．９ｍｇ／ｍｌと比べて変化がないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】Ｃｈｅｌｅｘ１００によるＳ-２-[３-(４-カルバミミドイルフェニル)-ウレイド]-Ｎ-[１-(３-メトキシフェニル)-エチル]-アセトアミドの除去を示す。
【図２】Ｃｈｅｌｅｘ１００によるｐ-アミノ-ベンズアミジンの除去を示す。
【図３】ポリマー物質が出口域に適する注射器ないしは他の区画を示す。注入の間、液体製剤はポリマー物質を通り抜け、インヒビターが取り除かれる。
【図４】ポリマー物質を保持する滅菌フィルターが静脈注入チューブとつながっており、針(例えばバタフライ針)が出口に取り付けられている注射器ないしは他の区画を示す。注入の間、液体製剤はポリマー固相物質を通り抜け、インヒビターが取り除かれる。
【図５】ポリマー物質がチューブの内部を覆っているかチューブを満たしている、注射器ないしは他の区画に取り付けるための注入用チューブを示す。チューブは、針(例えばバタフライ針)にて取り付けられる。注入の間、液体製剤はポリマー固相物質を通り抜け、インヒビターが取り除かれる。
【図６】ｒＦVIIa製剤からインヒビターである２-[３-(４-カルバミミドイルフェニル)-ウレイド]-Ｎ-[１-(３-メトキシフェニル)-エチル]-アセトアミドのＣｈｅｌｅｘ１００による除去を示す。
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、治療上活性なタンパク質を含有してなる液体製薬調製物、特に該調製物から非金属性タンパク質インヒビターの除去に関する。
【０００２】
（発明の背景）
不安定なタンパク質に基づく製薬調製物は凍結乾燥した生成物として製剤化されることが多い。主に、このような製薬タンパク質製剤は、注射の形態で投与することを目的とする。注射の前に、凍結乾燥させた生成物は溶液として調製されなければならず、この再構成工程は時間がかかり複雑であるという特徴があり、最終溶液の汚染のリスクが生じる。
このことを避けるために、直接使用できるように溶液として注射を目的とする製薬製剤を供給することが望ましい。
【０００３】
第VIIa因子のように活性化タンパク質に基づく製薬的溶液の場合、活性化タンパク質のインヒビターの形態の安定剤は一般的に、保存の間の活性なタンパク質の自己分解を予防するために必要とされている。しかしながら、安定剤の中には望ましくない副作用を生じさせうるものがあるので、製薬溶液中での濃度はできるだけ低くしなければならない。
【０００４】
ベンズアミジンのようなセリンプロテアーゼインヒビターのトリプシンへの結合は記載されており(Eur. J. Biochem. 268, 1554-1560 (2001))、アミジノフェニル尿素ベースのインヒビター(Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 1463-1467 (2003))は、自己触媒的分解又は不活性化に対してセリンプロテアーゼ第VIIa因子を安定化することが記載されている。安定剤のアミジンタイプは、望ましくない副作用を示し得、抗凝血物質として作用しうる。第VIIa因子溶液の場合、インヒビターのいずれの抗凝固作用も、活性な製薬的成分の作用に対抗するものであるので、当然望ましくない。
【０００５】
したがって、一方では、一般的な安全上の理由から、適度に低いレベルに濃度を下げることが有意であるとされているが、他方では、タンパク質を安定化させるために必要な安定剤のレベルは一般的に、もちろんインヒビター及び用いるＦVIIa濃度に応じて、０．０５〜５０ｍＭの濃度範囲である。
したがって、微量のタンパク質インヒビターを有するすぐ使用できるタンパク質溶液を調製するための手段が必要とされている。
国際公開第９７／１５３９１号Ａは、ポリペプチドに有意に影響することなく元の保存料レベルの濃度を１０〜９９％低減したポリペプチド溶液のための、保存料を除去するためのゼオライトの使用を開示している。
【０００６】
（発明の概要）
上に述べた必要性からみて、本発明は、液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法を提供する。
【０００７】
また、本発明は、セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ依存性タンパク質の群に属する治療上活性なタンパク質を必要とする被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封した容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得、そして、
(d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する
という工程を含んでなる方法を提供する。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
上記したように、本発明は、液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法を提供する。
【０００９】
本発明は、治療上関係するタンパク質の液体製薬調製物中のセリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属する特定のタンパク質の非金属性インヒビターの量が、治療上活性なタンパク質ないしは治療上活性なタンパク質の活性が実質的に損失していないことが観察される方法で、比較的短時間の間、該溶液を固相ポリマー物質に接触させることによって、効果的に低減されうる又は実質的に除去されうるという発見に基づく。
【００１０】
方法工程(a)
前記方法の第一工程では、(i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器が提供される。
【００１１】
「初期液体製薬調製物」なる用語は、望ましくない多量のインヒビターが存在する場合を除き、すぐ使用できる(一般的に直接注入できる)組成物として調製される液体製薬的組成物(一般的に水溶性の製薬調製物)を意味することを目的とする。このような液体製薬調製物の調製は、当業者に公知であり、例えば国際公開第２００５／０１６３６５号Ａに示される。
液体調製物は一般的に等張性又は高張性である。「等張性」なる用語は「血清と等張な」、すなわちおよそ３００±５０ミリオスモル／ｋｇを意味する。浸透圧は、投与前の溶液の重量モル浸透圧濃度の測定であることを意味する。「高張性」なる用語は、血清の生理学的レベルを超える重量モル浸透圧濃度のレベル、例えばおよそ３００±５０ミリオスモル／ｋｇ(等張)を超えるレベルを示すことを意味する。
前記調製物は、必須成分として(i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターを含む。
【００１２】
セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質
本発明は特に、自己分解する触媒性質を有するタンパク質、ゆえに特にタンパク質が部分的又は完全に活性化型である場合に関することが理解される。
さらに、本発明は、セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性血漿タンパク質の群に属するタンパク質に特に有益である。
【００１３】
本明細書にて用いられる、「ビタミンＫ依存性タンパク質」なる用語はグルタミン酸残基でγ-カルボキシル化される任意のタンパク質を意味する。ビタミンＫ依存性凝固因子は、完全な活性のためにＧｌａ-ドメインのγ-カルボキシル化を必要とする。γ-カルボキシ化されたグルタミン酸(Ｇｌａ)は、特定のカルシウム結合タンパク質に見られるアミノ酸である。代表的なビタミンＫ依存性タンパク質には、限定するものではないが、凝血原凝固因子プロトロンビン(第II因子)、第VII因子、第IX因子、第X因子；抗凝固プロテインＣ及びプロテインＳ；プロテインＺ(血漿にも見られる)；肺サーファクタントタンパク質(Rannels et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5952-56, 1987)、及び骨タンパク質オステオカルシン(骨Ｇｌａ-タンパク質としても知られる)、プロリンリッチＧｌａタンパク質１、及びマトリックスＧｌａ-タンパク質が含まれる。このアミノ酸を含有するタンパク質は、「ビタミンＫ依存性タンパク質」、「Ｇｌａ-タンパク質」又は「γ-カルボキシ化タンパク質」とさまざまに呼称される。
【００１４】
ビタミンＫ依存性タンパク質の生合成には、機能的タンパク質の成熟が得られる前に様々な翻訳後プロセシングが含まれる。ビタミンＫは、これらのビタミンＫ依存性タンパク質のグルタミン酸残基のγ-カルボキシル化に必要な補助因子である。γ-カルボキシ化グルタミン酸(Ｇｌａ)残基は、膜リン脂質を有するこれらのタンパク質の金属性関連相互作用に必要である。γ-カルボキシル化によって、凝固タンパク質は、リン脂質表面上のそれらの補助因子へのビタミンＫ依存性タンパク質のカルシウム依存性の複合体形成のため、及び、それらの生物学的活性のために必要な構造的変化を経ることができる。
【００１５】
前記プロテアーゼ／タンパク質の好適な例は、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、プロテインＣ、第VII因子ポリペプチド、プロテインＺ、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、マトリックスＧｌａタンパク質及びオステオカルシンからなる群から選択されるもの、特に、第VII因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、第X因子ポリペプチド、及び活性化プロテインＣから選択されるビタミンＫ依存性の凝固因子である。上記タンパク質のＰＥＧ化誘導体、切断型、及び配列変異型も、それぞれの親ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１０％を保持する限り包含されることは当然理解されるであろう。
【００１６】
本明細書にて用いられる「変異体」なる用語は、親タンパク質の一又は複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されている、及び／又は親タンパク質の一又は複数のアミノ酸残基が欠失している、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が親タンパク質に付加している、セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ依存性タンパク質、例えばＦVIIを示すことを意図する。前記の付加は親タンパク質のＮ末端及びＣ末端のいずれかないしは両方で起こりうる。また、親タンパク質のアミノ酸鎖内(「鎖内」付加)、場合によって親タンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端の付加(一又は複数)と同時に起こりうる。
【００１７】
このようなプロテアーゼ／タンパク質は、様々な方法で、例えば組織、血液又は他の体液などの天然の供給源からの単離によって、又はトランスジェニック動物(例えば魚、ウサギ、ブタ、ウシ)内での産生又は細胞培養条件下での産生などの組み換え技術によって得られうる。
ある好適な実施態様では、前記タンパク質は、第VII因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、第X因子ポリペプチド及び活性化プロテインＣからなる群から選択されるビタミンＫ依存性の凝固因子である。
【００１８】
本明細書中で用いられる、「第VII因子ポリペプチド」又は「ＦVIIポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第VIIa因子(すなわち米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸配列１−４０６、その変異体、並びに第VII因子関連のポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートを含んでなる任意のタンパク質を意味する。これには、野生型ヒト第VIIa因子と相対的に同じか改善された生物学的活性を実質的に示すＦVII変異体、第VII因子関連のポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートが含まれる。
【００１９】
「第VII因子」なる用語は、非切断(チモーゲン)型の第VII因子ポリペプチド、並びにその生理活性型を得るようにタンパク質分解的にプロセシングされているもの(第VIIa因子と称されうるもの)を包含することを意図する。概して、第VII因子は、残基１５２と１５３の間で切断されて第VIIa因子となる。第VII因子の変異体は、安定性、リン脂質結合性、変更した特異的活性などを含む、ヒト第VII因子と相対的に異なる性質を表しうる。
【００２０】
また、上記の定義の範囲内の「第VII因子」又は「第VIIa因子」には、存在し、ある個体から他の個体に生じうる天然の対立遺伝子変異体が含まれる。また、グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度と位置は、選択した宿主細胞や宿主の細胞性環境の性質に応じて異なりうる。
本明細書中で用いられる「野生型ヒトＦVIIa」は、米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２１】
本明細書で用いる「第VII因子関連ポリペプチド」は、第VIIa因子の生物学的活性が野生型第VIIa因子の活性と比べて減少しているなどの、実質的に変更されている変異体を含むポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、限定するものではないが、ポリペプチドの生物学的活性を変更又は破壊する特定のアミノ酸配列の変更が導入されている第VII因子又は第VIIa因子を含む。
【００２２】
本明細書中で用いられる「第VII因子誘導体」なる用語は野生型第VII因子に対して相対的に同じか又は改善された生物学的活性を実質的に示すＦVIIポリペプチドを表すことを意図し、このＦVIIポリペプチドにおいて、親ペプチドの一又は複数のアミノ酸が、例えばアルキル化、グリコシル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成又はアミド、ポリペプチドとの融合(国際公開第０１／７９２７１号に記載のようにアルブミン-融合タンパク質を含む)などによって遺伝的に及び／又は化学的に及び／又は酵素的に修飾されている。これには、ＰＥＧ化されたヒト第VIIa因子、システイン-ＰＥＧ化ヒト第VIIa因子、グリコＰＥＧ化ヒト第VIIa因子及びその変異体を含むが、これらに限定されるものではない。「ＰＥＧ化されたヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子ポリペプチドにコンジュゲートされたＰＥＧ分子を有するヒト第VIIa因子を意味する。ＰＥＧ分子が第VIIa因子ポリペプチドのいずれかのアミノ酸残基又は糖鎖を含む第VIIa因子ポリペプチドのいずれかの部分に付着しうる(「グリコＰＥＧ化第VIIa因子」)ことは理解される。「システイン-ＰＥＧ化ヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子に導入されるシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートされるＰＥＧ分子を有する第VIIa因子を意味する。第VII因子誘導体の非限定的な例には、国際公開第０３／３１４６４号及び米国公開特許第２００４００４３４４６号、同第２００４００６３９１１号、同第２００４０１４２８５６号、同第２００４０１３７５５７号及び同第２００４０１３２６４０号(Neose Technologies, Inc.)に開示されるグリコＰＥＧ化ＦVII誘導体；国際公開第０１／０４２８７号、米国公開特許第２００３０１６５９９６号、国際公開第０１／５８９３５号、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)及び国際公開第０２／０２７６４号、米国公開特許第２００３０２１１０９４号(University of Minnesota)に開示されるＦVIIコンジュゲートが含まれる。
【００２３】
「改善された生物学的活性」なる用語は、i) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したタンパク質分解活性を有するＦVIIポリペプチド、又はii) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したＴＦ結合活性を有するＦVIIポリペプチド、又はiii) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加した血漿中の半減期を有するＦVIIポリペプチドを指す。
【００２４】
組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したタンパク質分解活性を有する第VII因子変異体の非限定的な例には、Ｓ５２Ａ-ＦVIIa、Ｓ６０Ａ-ＦVIIa( Lino等, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第５５８０５６０号に開示される、増加したタンパク質分解性安定性を表すＦVIIa変異体；残基２９０と２９１又は残基３１５と３１６の間でタンパク質分解的に切断されている第VIIa因子(Mollerup等, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第VIIa因子の酸化型(Kornfelt等, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９(国際公開第０２／０７７２１８号に対応する)に開示されるＦVII変異体；及び、国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)に開示される、増加したタンパク分解性安定性を表すＦVII変異体；国際公開第９９／２０７６７号、米国特許第６０１７８８２号及び同第６７４７００３号、米国公開特許第２００３０１００５０６号(University of Minnesota)及び国際公開第００／６６７５３号、米国公開特許第２００１００１８４１４号、同第２００４２２０１０６号、及び同第２００１３１００５号、米国特許第６７６２２８６号及び同第６６９３０７５号(University of Minnesota)に開示される、変性Ｇｌａ-ドメインを有し、亢進した膜結合を示すＦVII変異体；及び、国際公開第０１／５８９３５号、米国特許第６８０６０６３号、米国公開特許第２００３００９６３３８号(Maxygen ApS)、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０２９０９１号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０８３３６１号(Maxygen ApS)及び国際公開第０４／１１１２４２号(Maxygen ApS)、並びに国際公開第０４／１０８７６３号(Canadian Blood Services)に開示される、ＦVII変異体が含まれる。
【００２５】
野生型ＦVIIaと比較して増加した生物学的活性を有するＦVII変異体の非限定的な例には、国際公開第０１／８３７２５号、国際公開第０２／２２７７６号、ＰＣＴ／ＤＫ０２／００６３５(国際公開第０３／０２７１４７号に対応)、デンマーク特許出願第ＰＡ２００２ ０１４２３号(国際公開第０４／０２９０９０号に対応)、デンマーク特許出願第ＰＡ２００１ ０１６２７号(国際公開第０３／０２７１４７号に対応)、国際公開第０５／２４００６号、国際公開第０５／１２３９１６号、国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)に開示されるＦVII変異体；及び、特願２００１０６１４７９(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示される、亢進された活性を有するＦVIIa変異体が含まれる。
【００２６】
第VII因子の変異体の例には、P10Q-第VII因子、K32E-第VII因子、P10Q/K32E-第VII因子、L305V-第VII因子、L305V/M306D/D309S-第VII因子、L305I-第VII因子、L305T-第VII因子、F374P-第VII因子、V158T/M298Q-第VII因子、V158D/E296V/M298Q-第VII因子、K337A-第VII因子、M298Q-第VII因子、V158D/M298Q-第VII因子、L305V/K337A-第VII因子、V158D/E296V/M298Q/L305V-第VII因子、V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-第VII因子、K157A-第VII因子、E296V-第VII因子、E296V/M298Q-第VII因子、V158D/E296V-第VII因子、V158D/M298K-第VII因子、及びS336G-第VII因子、L305V/K337A-第VII因子、L305V/V158D-第VII因子、L305V/E296V-第VII因子、L305V/M298Q-第VII因子、L305V/V158T-第VII因子、L305V/K337A/V158T-第VII因子、L305V/K337A/M298Q-第VII因子、L305V/K337A/E296V-第VII因子、L305V/K337A/V158D-第VII因子、L305V/V158D/M298Q-第VII因子、L305V/V158D/E296V-第VII因子、L305V/V158T/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/E296V-第VII因子、L305V/E296V/M298Q-第VII因子、L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、S314E/K316H-第VII因子、S314E/K316Q-第VII因子、S314E/L305V-第VII因子、S314E/K337A-第VII因子、S314E/V158D-第VII因子、S314E/E296V-第VII因子、S314E/M298Q-第VII因子、S314E/V158T-第VII因子、K316H/L305V-第VII因子、K316H/K337A-第VII因子、K316H/V158D-第VII因子、K316H/E296V-第VII因子、K316H/M298Q-第VII因子、K316H/V158T-第VII因子、K316Q/L305V-第VII因子、K316Q/K337A-第VII因子、K316Q/V158D-第VII因子、K316Q/E296V-第VII因子、K316Q/M298Q-第VII因子、K316Q/V158T-第VII因子、S314E/L305V/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158D-第VII因子、S314E/L305V/E296V-第VII因子、S314E/L305V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T-第VII因子、S314E/L305V/K337A/V158T-第VII因子、S314E/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/K337A/E296V-第VII因子、S314E/L305V/K337A/V158D-第VII因子、S314E/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V-第VII因子、S314E/L305V/V158T/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V-第VII因子、S314E/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316H/L305V/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158D-第VII因子、K316H/L305V/E296V-第VII因子、K316H/L305V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T-第VII因子、K316H/L305V/K337A/V158T-第VII因子、K316H/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/K337A/E296V-第VII因子、K316H/L305V/K337A/V158D-第VII因子、K316H/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V-第VII因子、K316H/L305V/V158T/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V-第VII因子、K316H/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158D-第VII因子、K316Q/L305V/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/V158T-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/V158D-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/K337A-第VII因子、F374Y/V158D-第VII因子、F374Y/E296V-第VII因子、F374Y/M298Q-第VII因子、F374Y/V158T-第VII因子、F374Y/S314E-第VII因子、F374Y/L305V-第VII因子、F374Y/L305V/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D-第VII因子、F374Y/L305V/E296V-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/S314E-第VII因子、F374Y/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/K337A/V158T-第VII因子、F374Y/K337A/M298Q-第VII因子、F374Y/K337A/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/V158D-第VII因子、F374Y/V158D/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/M298Q-第VII因子、F374Y/V158D/E296V-第VII因子、F374Y/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/M298Q-第VII因子、F374Y/V158T/E296V-第VII因子、F374Y/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/V158D-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/E296V-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/V158T-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/V158D-第VII因子、F374Y/K337A/V158T/M298Q-第VII因子、F374Y/K337A/V158T/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/M298Q/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/M298Q/V158D-第VII因子、F374Y/K337A/E296V/V158D-第VII因子、F374Y/V158D/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/V158D/S314E/E296V-第VII因子、F374Y/V158D/M298Q/E296V-第VII因子、F374Y/V158T/S314E/E296V-第VII因子、F374Y/V158T/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/V158T/M298Q/E296V-第VII因子、F374Y/E296V/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、S52A-Factor VII, S60A-第VII因子；R152E-第VII因子、S344A-第VII因子、T106N-第VII因子、K143N/N145T-第VII因子、V253N-第VII因子、R290N/A292T-第VII因子、G291N-第VII因子、R315N/V317T-第VII因子、K143N/N145T/R315N/V317T-第VII因子；及び、２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII；３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII；１５３Ｉｌｅから２２３Ａｒｇまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII、及び４０６Ｃ-ＦVIIが含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００２７】
したがって、第VII因子ポリペプチドの置換変異体には、位置Ｐ１０、Ｋ３２、Ｌ３０５、Ｍ３０６、Ｄ３０９、Ｌ３０５、Ｌ３０５、Ｆ３７４、Ｖ１５８、Ｍ２９８、Ｖ１５８、Ｅ２９６、Ｋ３３７、Ｍ２９８、Ｍ２９８、Ｓ３３６、Ｓ３１４、Ｋ３１６、Ｋ３１６、Ｆ３７４、Ｓ５２、Ｓ６０、Ｒ１５２、Ｓ３４４、Ｔ１０６、Ｋ１４３、Ｎ１４５、Ｖ２５３、Ｒ２９０、Ａ２９２、Ｇ２９１、Ｒ３１５、Ｖ３１７での置換、及びＴ２３３からＮ２４０まで、又はＲ３０４からＣ３２９までのアミノ酸配列中の置換、付加又は欠失；又はＩ１５３からＲ２２３まで、又はこれらの組み合わせ、特に、Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｌ３０５Ｖ、Ｍ３０６Ｄ、Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｍ２９８Ｋ、Ｓ３３６Ｇ、Ｓ３１４Ｅ、Ｋ３１６Ｈ、Ｋ３１６Ｑ、Ｆ３７４Ｙ、Ｓ５２Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｒ１５２Ｅ、Ｓ３４４Ａ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１４３Ｎ、Ｎ１４５Ｔ、Ｖ２５３Ｎ、Ｒ２９０Ｎ、Ａ２９２Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ｒ３１５Ｎ、Ｖ３１７Ｔなどの変異、及びＴ２３３からＮ２４０まで、又はＲ３０４からＣ３２９まで、又はＩ１５３からＲ２２３までのアミノ酸配列中の置換、付加又は欠失、又はこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
血液凝固の際の第VIIa因子の生物学的活性は、(i) 組織因子(ＴＦ)に結合する、及び(ii) 第IX因子又は第X因子のタンパク質分解性の切断を媒介して活性化した第IX因子又は第X因子(それぞれ第IXa因子又は第Xa因子)を生成するという能力に由来する。
本発明のために、第VII因子ポリペプチドの生物学的活性(「第VII因子生物学的活性」)は、調製物の血液凝固を促進する能力を測定することによって定量化されうる(本明細書中のアッセイ４を参照)。このアッセイにおいて、生物学的活性は、コントロール試料に対する凝固時間の減少として表され、１単位／ｍｌの第VII因子活性を含むプールしたヒト血清標準物質との比較により、「第VII因子単位」に変換される。あるいは、第VIIa因子の生物学的活性は、(i) 脂質膜に包埋されたＴＦ及び第X因子を含む系における第VIIa因子又は第VII因子関連ポリペプチドの活性化第X因子(第Xa因子)生産能の測定(Persson等, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ii) 水性の系における第X因子の加水分解の測定(「インビトロタンパク質分解アッセイ」、下記のアッセイ２を参照)；(iii) 表面プラズモン共鳴(surface plasmon resonance)を基礎とする装置を用いた、第VIIa因子又は第VII因子関連ポリペプチドのＴＦへの物理的な結合の測定(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)；(iv) 第VIIa因子及び／又は第VII因子関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解の測定(「インビトロ加水分解アッセイ」、下記のアッセイ１を参照)；又は(v) ＴＦ-非依存性インビトロ系におけるトロンビンの生成の測定(下記のアッセイ３を参照)によって、定量化されうる。
【００２９】
野生型第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は改善された生物学的活性を有する第VII因子変異体は、上記の凝固アッセイ(アッセイ４)、タンパク質分解アッセイ(アッセイ２)又はＴＦ結合アッセイの一又は複数にて試験された場合に、同じ細胞型で生産された第VIIa因子の特定の活性の少なくともおよそ１０％、好ましくは少なくともおよそ２５％、より好ましくは少なくともおよそ５０％、より好ましくは少なくともおよそ７５％及び最も好ましくは少なくともおよそ９０％を表すものを包含する。野生型第VIIa因子と比較して実質的に低減した生物学的活性を有する第VII因子変異体は、上記の凝固アッセイ(アッセイ４)、タンパク質分解アッセイ(アッセイ２)又はＴＦ結合アッセイの一又は複数にて試験された場合に、同じ細胞型で生産された野生型第VIIa因子の特定の活性のおよそ２５％未満、好ましくはおよそ１０％未満、より好ましくはおよそ５％未満及び最も好ましくはおよそ１％未満を表すものを包含する。野生型第VII因子と比較して実質的に変更された生物学的活性を有する第VII因子変異体には、ＴＦ-非依存性第X因子タンパク質分解活性を示す第VII因子変異体及びＴＦを結合するが第X因子を切断しない変異体が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００３０】
野生型第VII因子と実質的に同じかより良好な生理活性を示すか、ないしは野生型第VII因子と比較して実質的に変更されたか低減した生理活性を示す第VII因子の変異体には、一又は複数のアミノ酸を挿入、欠失又は置換することによって野生型第VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが、これに限定するものではない。
【００３１】
「第X因子ポリペプチド」及び「第IX因子ポリペプチド」なる用語との関連で「ポリペプチド」なる表現は、野生型ヒト第X因子及び第IX因子それぞれのアミノ酸配列を含む任意のタンパク質、並びにそのそれぞれの「変異体」、「関連したポリペプチド」、「誘導体」及び「コンジュゲート」を包含することを意図し、この「変異体」、「関連したポリペプチド」、「誘導体」及び「コンジュゲート」なる表現は適宜変更を加味して第VII因子として定義される。
【００３２】
ある実施態様では、ビタミンＫ依存性ポリペプチドは第VII因子ポリペプチドである。
ある実施態様では、第VII因子ポリペプチドは、ヒト第VIIa因子(ｈＦVIIa)、好ましくは組み換えて作製したヒト第VIIa因子(ｒｈVIIa)である。
他の実施態様では、第VII因子ポリペプチドは第VII因子配列変異体である。
ある実施態様では、第VII因子ポリペプチドは野生型ヒト第VII因子と異なるグリコシル化を有する。
ある実施態様では、第VII因子ポリペプチドは、組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、実質的に同じ又は増加した血漿中の半減期を有する。
現在最も興味深い実施態様では、タンパク質は、第VII因子ポリペプチド、好ましくは活性化型の第VII因子ポリペプチドである。
【００３３】
初期液体製薬調製物では、活性成分の濃度が、単位用量の使用により患者に不必要な不快感を引き起こさない程度にすることが望ましい場合が多い。したがって、およそ２〜１０ｍｌより多い単位用量は望ましくない場合が多い。したがって、本発明の目的のために、タンパク質(例えば第VII因子ポリペプチド)の濃度は一般的に、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌである。異なる実施態様では、タンパク質(例えば第VII因子ポリペプチド)は、０．０１〜４０ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌ、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、０．５〜５．０ｍｇ／ｍｌ、０．６〜４．０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜４．０ｍｇ／ｍｌ、０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、０．１〜４．０ｍｇ／ｍｌ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ、又は０．１〜１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
第VIIa因子の濃度は、ｍｇ／ｍｌ又はＩＵ／ｍｌとして都合よく表され、１ｍｇは通常４３０００〜５６０００ＩＵ以上を表す。
【００３４】
非金属性インヒビター
前述の種類のタンパク質に対する非金属性インヒビターは、もちろん、初期液体製薬調製物中のタンパク質の必要とされる安定性に関して選択される。
【００３５】
「インヒビター」なる用語は、対象のタンパク質の自己触媒的分解を抑制するか又は除くことによって初期液体製薬調製物を安定化することができる任意の化合物を包含することを意図する。
初期液体製薬調製物は、２℃〜８℃の範囲の温度で貯蔵する場合、典型的には少なくとも６か月間、好ましくは最大３６か月間安定であろう。好ましくは、初期液体製薬調製物はより高い温度、例えば２０℃〜３０℃などの環境温度であっても安定であるが、より多くの含量のインヒビターを必要とすることが多い。
【００３６】
「安定性」なる用語は、２℃〜８℃で６か月間貯蔵した後に初期液体製薬調製物がその最初の生物学的活性の少なくとも５０％を保持することを意味することを意図する。好ましくは、初期液体製薬調製物は、２〜８℃で６か月間貯蔵した後にその最初の活性の少なくとも７０％、例として少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保持する。
【００３７】
第VII因子ポリペプチドに関して言えば、「安定性」なる用語は特に、(i) ２℃〜８℃で６か月間貯蔵した後に初期液体製薬調製物が一工程凝血アッセイ(one-stage clot assay)(アッセイ４)にて測定するところの最初の生物学的活性の少なくとも５０％を保持している、又は(ii) ２℃〜８℃で６か月間貯蔵した後に重鎖分解生成物の含量が、初期液体製薬調製物が重鎖分解生成物を含まないとすれば(すなわち、第VII因子ポリペプチドのみを割合の算出に用いる)、最大４０％(w/w)であることを意味することを意図する。好ましくは、初期液体製薬調製物は、２〜８℃で６か月間貯蔵した後にその最初の活性の少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保持する。また好ましくは、初期液体製薬調製物の重鎖分解生成物の含量は、最大３０％(w/w)、最大２５％(w/w)、最大２０％(w/w)、最大１５％(w/w)、最大１０％(w/w)、最大５％(w/w)又は最大３％(w/w)である。
典型的に、インヒビターは最大１０００Ｄａ、例えば最大７５０Ｄａ、例えば最大５００Ｄａの分子量を有する非金属性化合物である。
インヒビターは競合的インヒビターであることが好ましい。
【００３８】
特に第VII因子ポリペプチドに対して特に有用なインヒビターの例は、アミジン類及びグアニジン類からなる群から選択されたもの、例えばベンズアミジン類及びグアニジン類からなる群から選択されたもの、特に国際公開第２００５／０１６３６５号Ａに開示されるものである。
したがって、ある実施態様では、前記タンパク質は第VII因子ポリペプチドであり、インヒビターはベンズアミジン類及びグアニジン類類からなる群から選択される。
【００３９】
ゆえに、特に興味深いインヒビターのあるグループ(一般的に安定化剤(ii)と称される)は、-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフを含むものであり、このときＺ１及びＺ２は-Ｏ-、-Ｓ-、-ＮＲＨ-及び単結合からなる群から独立して選択され、ＲＨは水素、Ｃ１−４-アルキル、アーリル、及びアリールメチルからなる群から選択され、Ｒ１及びＲ２は水素、置換されていてもよいＣ１−６-アルキル、置換されていてもよいＣ２−６-アルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から独立して選択されるか、又は
Ｚ２及びＲ２が前記に定義したものであり、-Ｃ＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１が複素環の一部を形成するか、又は
Ｚ１及びＲ１が前記に定義したものであり、-Ｃ-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２が複素環の一部を形成するか、又は
-Ｚ１-Ｒ１-Ｒ２-Ｚ２-がビラジカルである場合に-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２が複素環を形成する。
【００４０】
「Ｃ１−６-アルキル」なる用語は、１〜６の炭素原子を有し、直鎖状又は分岐状である、非環状及び環状の飽和した炭化水素残基を包含することを意図する。特定の例は、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｓｅｃ-ブチル、ｔｅｒｔ-ブチル基、シクロプロピルメチル、ｎ-ペンチル、イソペンチル、ｎ-ヘキシルなどである。同様に、「Ｃ１−４-アルキル」なる用語は、１〜４の炭素原子を有し、直鎖状又は分岐状である、非環状及び環状の飽和した炭化水素残基を包含する。
【００４１】
同様に、「Ｃ２−６-アルケニル」なる用語は、２〜６の炭素原子を有し、１つの不飽和結合を含み、直鎖状又は分岐状である、非環状及び環状の炭化水素残基を包含することを意図する。Ｃ２−６-アルケニル基の例は、ビニル、アリル、ブタ-１-エン-１-イル、ブタ-２-エン-１-イル、ペンタ-１-エン-１-イル、及びヘキサ-１-エン-１-イルである。
【００４２】
Ｃ１−６-アルキル及びＣ２−６-アルケニル基と関係して「置換されていてもよい」なる用語は、対象の基が、ヒドロキシ、Ｃ１−６-アルコキシ(すなわち、Ｃ１−６-アルキル-オキシ)、Ｃ２−６-アルケニルオキシ、オキソ(ケト又はアルデヒドの官能基を形成)、アリール、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルカルボニル、アミノ、モノ及びジ(Ｃ１−６-アルキル)アミノ、ハロゲンからなる群から選択される基(一又は複数)によって、１回又は数回、好ましくは１〜３回置換されてもよく、このとき任意のアリール及びヘテロシクリルは、置換されていてもよいアリール及びヘテロシクリルに対して以下に特に記載したように置換されてもよいことを意味することを意図する。
【００４３】
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを含む。
本明細書中で用いられる場合、「アリール」なる用語は、フェニル、ナフチル、１,２,３,４-テトラヒドロナフチル、アントラシル、フェナントラシル、ピレニル、ベンゾピレニル、フルオレニル及びキサンテニルなどの完全に又は部分的に芳香族性の炭素環ないしは環系を意味することを意図し、中でもフェニルが好適な例である。
【００４４】
「ヘテロシクリル」なる用語は、一又は複数の炭素原子がヘテロ原子、例えば窒素(=Ｎ-又は-ＮＨ)、硫黄(-Ｓ-)及び／又は酸素(-Ｏ-)原子に置換されている、飽和した、部分的に不飽和の、部分的に芳香族の又は完全に芳香族の炭素環ないし環系を意味することを意図する。ヘテロシクリル基の例は、オキサゾリル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、オキサジアゾリル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、チアゾニル、イソチアゾリル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピペリジニル、クマリル、フリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾジアゾリル、ベンゾオキソゾリル、ジアゾリル、ジアゾリニル、ジアゾリジニル、トリアゾリル、トリアゾリニル、トリアゾリジニル、テトラゾールなどである。好適なヘテロシクリル基は、５-、６-又は７-員環の単環基、例えばイソオキサゾリル、イソオキサゾリニル、オキサゾリル、オキサゾリニル、ピロリル、ピロリニル、ジアゾリル、ジアゾリニル、トリアゾリル、トリアゾリニル、イミダゾリル、イミダゾリニルなどである。
「複素環」なる用語は、「ヘテロシクリル」で定義したものに相当する環を意味することを意図する。
【００４５】
「アリール」、「ヘテロシクリル」及び「複素環」なる用語と関連して、「置換されていてもよい」なる用語は、対象の基が、ヒドロオキシ(エノール系で存在する場合に互変異性のケトの形態で表されうる)、Ｃ１−６-アルキル、Ｃ２−６-アルケニル、フェニル、ベンジル、Ｃ１−６-アルコキシ、オキソ(互変異性エノールの形態で表されうる)、カルボキシ、Ｃ１−６-アルコキシカルボニル、Ｃ１−６-アルキルカルボニル、アミノ、モノ及びジ(Ｃ１−６-アルキル)アミノ、ジハロゲン-Ｃ１−４-アルキル、トリハロゲン-Ｃ１−４-アルキル及びハロゲンから選択される基(一又は複数)によって、１回又は数回、好ましくは１〜３回置換されうることを意味することを意図する。置換基の最も一般的な例は、ヒドロキシ、Ｃ１−４-アルキル、フェニル、ベンジル、Ｃ１−４-アルコキシ、オキソ、アミノ、モノ及びジメチルアミノ、及びハロゲンである。
【００４６】
Ｒ１及びＲ２が水素、置換されていてもよいＣ１−６-アルキル、置換されていてもよいＣ２−６-アルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリルからなる群から選択されうるほか、また、-Ｃ(=Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフの一部が複素環の一部であり、このモチーフの他の部分がＺ１、Ｚ２、Ｒ１及びＲ２それぞれについて定義した意味を有することが考えられる。ある興味深い実施態様では、-Ｃ＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１は１,２-ジアゾール環、イソオキサゾール環、１,２,４-トリアゾール環、及び１,２,４-オキサジアゾール環からなる群から選択される複素環の部分を形成しうるか、又は-Ｃ-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２は１,２-ジアゾリン環、イソオキサゾリン環、１,２,４-トリアゾリン環、及び１,２,４-オキサジアゾリン環からなる群から選択される複素環の部分を形成しうる。このような複素環は上記の通りに置換されてもよい。
【００４７】
ある実施態様では、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一が水素、例えば、両方とも水素である。さらに、上記の実施態様と組み合わせられうるある実施態様では、Ｚ１及びＺ２の少なくとも一が単結合、例えば両方が単結合である。特別な実施態様では、Ｒ１及びＲ２はともに水素であり、Ｚ１及びＺ２はともに単結合である。
【００４８】
-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフは安定化剤(ii)の作用を安定化させるために特に重要であると考えられている。特に、-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフは第VII因子ポリペプチドの基質のアルギニン部分を模倣していると考えられている。
より具体的な実施態様では、安定化剤(ii) は、-Ｃ-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフを含むアミジン化合物と＞Ｎ-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフを含むグアニジン類化合物とからなる群から選択される少なくとも一である。
【００４９】
ある実施態様では、安定化剤(ii)は、モチーフ-Ｃ６Ｈ４-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２を含むベンズアミジン類からなる群から選択される少なくとも一のアミジン化合物であり、このときＣ６Ｈ４は置換されていてもよいベンジン環を意味し、このベンズアミジン(Ｒ１及びＲ２は水素であり、Ｚ１及びＺ２は単結合である)は特定の実施態様を構成する(実施例の項目を参照)。
他の具体的な実施態様では、ベンズアミジン類はモチーフ＞Ｎ-Ｃ６Ｈ４-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２を含んでなり、このときＣ６Ｈ４は置換されていてもよいベンジン環、すなわちｏ-アミノ-ベンズアミジン、ｍ-アミノ-ベンズアミジン又はｐ-アミノ-ベンズアミジンを意味し、このｐ-アミノ-ベンズアミジンなどのｐ-アミノ-ベンズアミジン類は現在最も期待できるものである。
【００５０】
ｐ-アミノ-ベンズアミジン類の更なる例示的な例は、Aventisの欧州特許第１１６２１９４号Ａ１、特に請求項１〜６及び[０００９]〜[００５２]段落に定義されるもの、及び欧州特許第１２７０５５１号Ａ１、特に請求項１及び２と[００１０]-[００３２]段落によって開示されるものである。
【００５１】
他の実施態様では、安定化剤(ii)は、-ＣＨ２-ＮＨ-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２モチーフを含むグアニジン化合物からなる群から選択される少なくとも一のグアニジン化合物である。グアニジン化合物の例は、アルギニン、アルギニン誘導体及び少なくとも一のアルギニン残基を含む２〜５のアミノ酸残基のペプチドからなる群から選択されるものである。アルギニンは特定の実施態様を構成する(実施例の項目を参照)。
「アルギニン誘導体」なる用語は、アルギニンホモログ、N-端末の官能基化アルギニン(例えば、Ｎ-メチル化及びＮ-アシル化(例えばアセチル化)誘導体)、Ｃ-端末の官能基化アルギニン(例えば、Ｃ-アミド化、Ｃ-アルキルアミド化、及びＣ-アルキル化誘導体)、及びこれらの組み合わせを包含することを意図する。
【００５２】
上記のように、安定化剤の重要なモチーフは-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２である。また、安定化剤の他の部分は、特に安定化作用の最適化及び患者の耐性に関して重要でありうる。典型的に、安定化剤は式Ｙ-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２を有し、Ｙは有機基である。一般的に、基Ｙは安定化作用の効率を向上させるために選択される。また、基Ｙは式-Ｃ(＝Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２の一又は複数の更なるモチーフを含みうる。
【００５３】
安定化剤(一又は複数)(ii)の濃度は、一般的に少なくとも１μＭである。望ましい(又は必要な)濃度は、一般的に、選択した安定化剤(一又は複数)に、より具体的には第VII因子ポリペプチドに対して選択された安定化剤の結合親和性に依存する。
異なる実施態様では、安定化剤(ii)は、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも２５０μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、例として２０〜２０００μＭ、５０〜５０００μＭ、０．１〜１０ｍＭ、０．２〜２０ｍＭ又は０．５〜５０ｍＭの濃度で存在する。
【００５４】
一実施態様では、安定化剤(ii)はベンズアミジンであり、該薬剤の濃度は少なくとも２ｍＭであるが、置換されたベンズアミジンがより低い濃度で添加されればより強力となると予想される。
一実施態様では、安定化剤(ii)はアルギニンであり、該薬剤の濃度は少なくとも１０ｍＭである。
【００５５】
他の成分
結果として得た液体製薬調製物をヒトなどの哺乳動物に直接非経口投与するために有用にするために、通常、初期液体製薬調製物(及びこれによる結果として得た液体製薬調製物)のｐＨ値を合理的な限界内、例えばおよそ４．０からおよそ９．０、例えばおよそ５．０からおよそ９．０に保つ必要がある。ある条件下で好適なｐＨ値に確実にするために、液体製薬調製物はまた、およそ４．０からおよそ９．０、例えばおよそ５．０からおよそ９．０の範囲にｐＨを保つために好適な緩衝剤(iii)を含む。
【００５６】
「緩衝剤」なる用語は、溶液のｐＨをおよそ５．０からおよそ９．０の許容される範囲に維持する薬剤ないしは薬剤の組合せを包含する。
一実施態様では、緩衝剤(iii)は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ヒスチジン、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グリシンアミド、リン酸、酢酸(例えばナトリウム又は酢酸カルシウム)、乳酸、グルタル酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸及びコハク酸の塩類及び酸からなる群から選択される少なくとも一の成分である。緩衝剤は、混合物が特定の範囲のｐＨ値を提供することができる場合に２以上の成分の混合物を含みうることは理解されるであろう。実施例は上記の酢酸及び酢酸ナトリウムなどであってもよい。緩衝剤の濃度は、溶液の好適なｐＨを維持するために選択される。様々な実施態様では、緩衝剤の濃度は、１〜１００ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜２５ｍＭ、又は２〜２０ｍＭである。
【００５７】
一実施態様では、組成物のｐＨは、およそ５．０からおよそ８．０、例えばおよそ５．０からおよそ７．５、およそ５．０からおよそ７．０、およそ５．０からおよそ６．５、およそ５．０からおよそ６．０、およそ５．５からおよそ７．０、およそ５．５からおよそ６．５、およそ６．０からおよそ７．０、およそ６．４からおよそ６．６、又はおよそ５．２からおよそ５．７に維持される。
【００５８】
タンパク質、インヒビター及び緩衝剤に加えて、初期液体製薬調製物は、組成物の調製、製剤、安定性又は投与に有益な更なる構成成分を含んでもよい。
ゆえにまた、例えば国際公開第２００５／０１６３６５号Ａに開示されるように、初期液体製薬調製物は、非イオン性界面活性剤(一又は複数)、浸透圧変更剤(一又は複数)(イオン強度変更剤(一又は複数)を含む)、抗酸化剤、保存剤などを含んでもよい。
【００５９】
密封容器
初期液体製薬調製物が実際の使用の数か月前に調製されてもよいという事実から、この調製物を密封環境に置いて保存しやすくすることが必要である。したがって、初期液体製薬調製物は密封容器、例えばバイアル、カートリッジ、アンプル、カーポール(carpoule)などで提供される。これは調製物の完全性が確実に保存されるのに対し、工程(b)及び(c)に定義されるように投与のための調製がいつであろうと容易に調製可能にするものである。
【００６０】
したがって、初期液体製薬調製物は典型的には、場合によって容器内の空隙を埋めるための不活性ガスを含む、気密容器(例えば、バイアル又はカートリッジ(例えばペン状塗布器用のカートリッジ))で提供される。不活性ガスは、窒素、アルゴンなどからなる群から選択されうる。容器(例えばバイアル又はカートリッジ)は典型的には、ガラス又はプラスチック、特にガラス製であり、場合によってゴム製の隔壁か又は製薬的組成物の完全性を保ったままで貫通可能な他の封鎖手段によって封鎖される。更なる実施態様では、容器は、密封バッグ、例えば密封されたビニールバッグ、例として、積層(例えば金属(アルミニウムなど)積層プラスチックバッグ)に内包したバイアル又はカートリッジである。
様々な実施態様では、前記密封容器中の製薬調製物の量は、１〜１０用量、例えば１〜５用量、特に１用量に相当する。
【００６１】
方法工程(b)
続く工程(b)において、製薬調製物は、前記インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に接触させる。
接触工程の重要な特徴は、前記インヒビターの実質的な部分が固相ポリマー物質に結合されるのに対して、薬学的に活性なタンパク質は実質的に結合せず、その生物学的活性を維持するということである。
【００６２】
固相ポリマー物質
固相ポリマー物質は、限定するものではないが、分離目的、例えばクロマトグラフィ法で用いられる固相物質として公知の物質を含む、幅広い範囲の物質から選択されうる。
物質の種類の好適な例は、陽イオン交換物質、陰イオン交換物質、極性物質、無極性物質、親水性物質、疎水性物質、及びゲル濾過物質からなる群から選択されるものであり、このイオン交換物質、特に陽イオン交換樹脂が現在のところ好ましい。
好適なポリマー物質のある具体的な特徴は、セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質の活性は、ポリマー物質と１０分間接触させた際に実質的に変化しない(すなわち、最初の活性の少なくとも９０％が維持される)ということである。
【００６３】
現在最も興味深い物質の例は、セルロース繊維、及び親水性合成ポリマー、例としてメタクリル酸及びスチレンコポリマー(例えばポリスチレン／ジビニルベンゼン(ＰＳＤＶＢ))から選択されるものである。
現在最も興味深い商品は、陽イオン交換物質であるＣｈｅｌｅｘ１００(BioRad Laboratories)である。
【００６４】
固相ポリマー物質はインヒビターの少なくとも実質的な部分を保持する一方で、結合しないタンパク質の実質的な部分をそのままにすることが可能でなければならない。「実質的」なる用語は一般的に、「少なくとも７５％」、しかし好ましくは少なくとも８０％、例として少なくとも９０％又はさらに少なくとも９５％を意味する。
あるインヒビターでは、インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持する好適な固形ポリマー物質は、ハンセン溶解度パラメータ(ＨＳＰ)を用いることによって予測されうる(参照：Charles M. Hansen, Hansen's Solubility Parameters: A User's Handbook, CRC Press, 1999)。
【００６５】
溶解度パラメータ(ＨＳＰ)、適合性、表面上の吸着、類似の親和性の物質に対する配向性(自己集合体化)、及び溶解性及び親和性に関する他の現象を調べることによって予測することができる。同じ溶解度パラメータを有する液体は混和することができ、ポリマーは、溶解度パラメータがポリマー自体とさほど違わない液体を溶解又は吸着するであろう。基本的原理は「似たものは似たものを溶解する」であったが、最近では「似たものは似たものを求め合う」と変わってきている。溶解度パラメータ(ＨＳＰ)は単純に定性的概念を数で表すものであり、広範囲に用いられており、生物学の分野を含む様々な産業に対する価値が明らかにされている。
本発明では、対象のインヒビター(一又は複数)の溶解度パラメータ(ＨＳＰ)は、対象の固相ポリマー物質の溶解度パラメータ(ＨＳＰ)と比較する。そして、前記インヒビター(一又は複数)を結合するための好適なポリマー物質はその溶解度パラメータの類似性に基づいて選択される(「似たものは似たものを求め合う」)。
【００６６】
例えば、ベンズアミジンに基づいて求められる計算から、親和性はセルロース誘導体、アクリル酸をベースとしたポリマー、アクリル酸コポリマー、酢酸ビニル(ＰＶＡ)、ビニールブチラール(ＰＶＢ)、アクリロニトリル、スチレンコポリマー、ビニルピロリドン(ＰＶＰ)、並びに酸基を持つポリマー内で期待されることが示唆される。
ＰＶＰ及びＰＶＡのような可溶性ポリマーは、物理的形態を安定させるために架橋結合されうる。
【００６７】
ポリマー物質のバルクは、様々な様式で、例えばフィルターの形態で、例えばプラグフィルター又はディスクフィルターの形態で配置されてもよく、カラム又はバルクはチューブ、針又はチャンバの内部表面を覆っていてもよい。
ポリマー物質のバルクの形態に応じて、初期液体製薬調製物はバッチ式で又はバルクに通すないしはバルクにかざすことによって接触させてもよい。
【００６８】
ある現在のところ好適な実施態様では、液体製薬調製物は、液体製薬調製物をポリマー物質のバルクに通すことによって、ポリマー物質と接触させる。この実施態様では、バルクはフィルターの形態で、例えばプラグフィルター又はディスクフィルターの形態、又はカラムであることが好ましい。
他の実施態様では、液体製薬調製物は、液体製薬調製物をポリマー物質のバルクにかざすことによって、ポリマー物質と接触させる。この実施態様では、バルクは、チューブ、針又はチャンバの内部表面を覆うことが好ましい。
【００６９】
雑菌混入を避け、インヒビター物質を容易に取り除くために、液体製剤は、例えば、ポリマー物質が適する注射器ないしは他の区画及び出口域に含まれてもよい(図３ａ及びｂ)。注入の間、液体製剤はポリマー物質を通り抜け、インヒビターが取り除かれる。
他の実施態様では、液体製剤は注射器又は他の区画に含まれる。注入の直前に、ポリマー物質を有する滅菌フィルターは静脈注入チューブとつながっており、針(例えばバタフライ針)が出口に取り付けられている。注入の間にインヒビターは取り除かれる(前記滅菌フィルターの２つの代替的な例を示す図４ａ及び４ｂを参照)。
他の実施態様では、液体製剤は注射器又は他の区画に含まれる。注入の直前に針(例えばバタフライ針)を備えた注入チューブが出口に取り付けられる。チューブは、チューブ内部を覆うか又はチューブ内を満たすポリマー物質を有する。注入の間にインヒビターが取り除かれる(図５を参照)。
【００７０】
方法工程(c)
続く工程(c)では、液体製薬調製物が前記固相ポリマー物質から分離され、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る。
工程(b)の実際の実施に応じて、結果として得た液体製薬調製物は、特に初期液体製薬調製物が固相ポリマー物質のバルクに通されるか又はかざされる場合に、固相ポリマー物質から分離した形態ですぐに得られうる。しかしながら、分離した形態ですぐに得られない場合には、結果として得た液体製薬調製物は、例えば適度な圧力の装置による濾過、例えばプランジャー、沈殿などによって、固相ポリマー物質から分離すべきである。
【００７１】
その結合故に、非金属性インヒビターの濃度は典型的に、少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％低減している、ないしは実質的に取り除かれている。したがって、インヒビターの濃度は、重要な治療上の作用が取り除かれないレベルにすることができる。
ある現在のところ好適な実施態様では、密封容器内の製薬調製物の量は１用量に相当し、この用量はポリマー物質のバルクに通されるか又はかざされる。
他の好適な実施態様では、密封容器内の製薬調製物の量は２〜１０用量に相当し、１用量に相当する量はポリマー物質のバルクに通されるか又はかざされる。
一般的に、工程(b)の接触時間は、０．１〜１００秒、一般的に０．５〜３０秒の範囲である。
【００７２】
使用方法(方法工程(d))
本発明の方法のある変更法は、結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体、特にヒトに投与する、という続く工程(d)を含んでなる。
一般的に、方法工程(d)は、工程(c)の完了から６０分以内、特に工程(c)の完了から５分以内、好ましくは工程(c)の完了の直後、又は工程(c)とできるだけ連動して実施される。
【００７３】
本発明の調製は、凝固因子欠損(例えば血友病Ａ、血友病Ｂ、凝固第XI因子欠損、凝固第VII因子欠損)；血小板減少症又はフォンウィルブランド病、又は凝固因子インヒビターが原因となるもの、及び脳内出血、又は任意の原因による過剰出血を含む、例えば出血性疾患などの任意の第VII因子応答症候群を治療するために用いられうる。また、調製物は外科手術ないしは他の外傷に関連する患者又は抗凝固療法を受けている患者に投与されてもよい。
【００７４】
「有効量」なる用語は、所望の応答を達成するために用量を設定する有資格者によって決定される有効量である。用量を考慮する要因には、有効性、生物学的利用率、所望の薬物動態／薬力学的な性質、治療条件、患者に関する要因(例えば、体重、健康状態、年齢など)、同時に投与する医薬の有無(例えば抗凝固剤)、投与時間、又は医師が知る他の要因が含まれるであろう。
【００７５】
「治療」なる用語は、疾患、症状又は疾病と戦う目的で、哺乳動物などの被検体、特にヒトの管理や看護として定義され、症状ないし合併症の発症を予防する、又は症状ないし合併症を軽減する、又は疾患、症状又は疾病を取り除くためにタンパク質を投与することを含む。治療上活性なタンパク質を含有する製薬的組成物の発明は、治療を必要とする被検体に非経口投与されてもよい。非経口投与は、注射器、場合によってペン様注射器によって皮下、筋肉内又は静脈内にて実施されてもよい。あるいは、非経口投与は注入ポンプによって実施されうる。
【００７６】
重要な実施態様では、製薬組成物は、当分野で公知の方法に従って、皮下、筋肉内又は静脈内注射に適している。
したがって、更なる態様では、本発明は、セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ依存性タンパク質の群に属する治療上活性なタンパク質を必要とする被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封した容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を結合することが可能な固相ポリマー物質、特に陽イオン交換物質に該製薬調製物を接触させ、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る、そして、
(d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する
という工程を含んでなる方法に関する。
【００７７】
一般的に、結果として生じた液体製薬調製物は上記の通りに注入によって投与される。
また、上記のように、治療上活性なタンパク質を必要とする被検体は典型的には、第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある。
【００７８】
好適な実施態様
現在のところ好適な実施態様は、液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) 第VII因子ポリペプチドとベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質、特に陽イオン交換物質に該液体製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法に関する。
【００７９】
他の現在のところ好適な実施態様は、第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) 第VII因子ポリペプチドと、(ii) ベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質、特に陽イオン交換物質に該製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得て、そして、
(d) この結果として得られた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する、
という工程を含んでなる方法に関する。
【００８０】
本発明の実施態様の一覧を以下に示す。
実施態様１． 液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法。
実施態様２． 前記タンパク質が自己触媒性質を有する、実施態様１に記載の方法。
実施態様３． 前記タンパク質が部分的な又は完全な活性化型である、実施態様１又は２に記載の方法。
実施態様４． 前記タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、プロテインＣ、第VII因子ポリペプチド、プロテインＺ、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、マトリックスＧｌａタンパク質及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様１から３のいずれか一に記載の方法。
実施態様５． 前記タンパク質が、第VII因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、第X因子ポリペプチド及び活性化プロテインＣからなる群から選択されるビタミンＫ依存性凝固因子である、実施態様１から４のいずれか一に記載の方法。
実施態様６． 前記タンパク質が第VII因子ポリペプチド、好ましくは活性化型の第VII因子ポリペプチドである、実施態様１から５のいずれか一に記載の方法。
実施態様７． 前記インヒビターは、最大１０００Ｄａ、例えば最大７５０Ｄａ、例えば最大５００Ｄａの分子量を有する非金属性化合物である、実施態様１から６のいずれか一に記載の方法。
実施態様９． 前記インヒビターがアミジン類及びグアニジン類からなる群から選択される、実施態様１から７のいずれか一に記載の方法。
実施態様１０． 前記タンパク質が第VII因子ポリペプチドであり、前記インヒビターがベンズアミジン類及びグアニジン類からなる群から選択される、実施態様１から９のいずれか一に記載の方法。
実施態様１１． 前記ポリマー物質が、陽イオン交換物質、負イオン交換物質、極性物質、無極性物質、親水性物質、及び疎水性物質からなる群から選択される、実施態様１から１０のいずれか一に記載の方法。
実施態様１２． 前記ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択される、実施態様１から１１のいずれか一に記載の方法。
実施態様１３． 前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、実施態様１から１２のいずれか一に記載の方法。
実施態様１４． 液体製薬調製物をポリマー物質のバルクに通すことによって、前記液体製薬調製物がポリマー物質と接触する、実施態様１から１３のいずれか一に記載の方法。
実施態様１５． 液体製薬調製物をポリマー物質のバルクにかざすことによって、前記液体製薬調製物がポリマー物質と接触する、実施態様１から１３のいずれか一に記載の方法。
実施態様１６． 前記密封した容器中の製薬調製物の量が１〜１０用量、例えば１〜５用量、特に１用量に相当する、実施態様１から１５のいずれか一に記載の方法。
実施態様１７． 前記密封した容器中の製薬調製物の量が１用量に相当し、この用量がポリマー物質のバルクに通される又はかざされる、実施態様１６に記載の方法。
実施態様１８． 前記密封した容器中の製薬調製物の量が２〜１０用量に相当し、１用量に相当する量がポリマー物質のバルクに通される又はかざされる、実施態様１６に記載の方法。
実施態様１９． 工程(b)の接触時間が０．１〜１００秒の範囲である、実施態様１から１８のいずれか一に記載の方法。
実施態様２０． 液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) 第VII因子ポリペプチドとベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該液体製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法。
実施態様２１． 前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、実施態様２０に記載の方法。
実施態様２２． (d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体、特にヒトに投与する、という工程を後に含んでなる、実施態様１から２１のいずれか一に記載の方法。
実施態様２３． セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ依存性タンパク質の群に属する治療上活性なタンパク質を必要とする被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封した容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る、そして、
(d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する
という工程を含んでなる方法。
実施態様２４． 前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、実施態様２３に記載の方法。
実施態様２５． 前記の結果として生じた液体製薬調製物が注射によって投与される、実施態様２３又は２４に記載の方法。
実施態様２６． 治療上活性なタンパク質を必要とする被検体が第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある、実施態様２３から２５のいずれか一に記載の方法。
実施態様２７． 第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) 第VII因子ポリペプチドと、(ii) ベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得て、そして、
(d) この結果として得られた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する、
という工程を含んでなる方法。
実施態様２８． 前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、実施態様２７に記載の方法。
【００８１】
本発明は以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【００８２】
一般的な方法
第VII因子ポリペプチドの生物学的活性を決定するために適切なアッセイ
本発明に関して有用な第VII因子ポリペプチドは、簡単な予備的なインビトロ試験として実施されうる好適なアッセイによって選択されうる。ゆえに、本明細書は、第VII因子ポリペプチドの活性についての簡単な試験(「インビトロ加水分解アッセイ」と題する)を開示する。
【００８３】
第一世代凝血アッセイ
第VII因子ポリペプチドの活性は、基本的には国際公開第９２／１５６８６号又は米国特許第５９９７８６４号に記載のように、一工程凝血アッセイを用いて測定してもよい。簡単に言うと、試験する試料は５０ｍＭ トリス(ｐＨ７．５)、０．１％ ＢＳＡにて希釈し、１００μｌを１０ｍＭ Ｃａ２＋を含む２００μｌのトロンボプラスチンＣと１００μｌの第VII因子欠失血漿とともにインキュベートする。凝固時間を測定し、参照標準物質又は段階希釈のクエン酸化正常ヒト血漿のプールを用いた標準曲線と比較する。
【００８４】
インビトロ加水分解アッセイ(アッセイ１)
天然の(野生型) 第VIIa因子及び第VII因子ポリペプチド(以降、ともに「第VIIa因子」と称する)は、比活性について検定してもよい。また、比活性を直接比較するために同時にアッセイしてもよい。アッセイはマイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)で行う。終濃度１ｍＭの発色基質Ｄ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(Ｓ-２２８８、Chromogenix, Sweden)を、０.１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍｇ/ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ, ｐＨ７.４中の第VIIa因子(終濃度１００ｎＭ)に加える。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレート読み取り機(Molecular Devices, USA)にて４０５ｎｍの吸光度を連続して測定する。２０分間のインキュベートの間に反応した吸光度を、酵素を含まないブランクウェルの吸光度を減算した後、第VII因子ポリペプチドと野生型第VIIa因子との活性間の比率を算出するために用いる。
比率＝(Ａ４０５ｎｍ 第VII因子ポリペプチド)／(Ａ４０５ｎｍ 野生型第VIIa因子)
【００８５】
これに基づき、天然の第VIIa因子より低い、天然の第VIIa因子に相当する、又は天然の第VIIa因子より高い活性を有する第VII因子ポリペプチド、例えば第VII因子ポリペプチドの活性と天然の第VII因子(野生型ＦVII)の活性との間の比率がおよそ１．０対１．０を超える第VII因子ポリペプチドなどが同定されうる。
また、第VII因子ポリペプチドの活性は、第X因子などの生理的な基質を、適宜１００〜１０００ｎＭの濃度で用いて測定してもよく(「インビトロタンパク質分解アッセイ」)、このとき生成された第Xa因子は適する発色色素(例えば、Ｓ-２７６５)を加えた後に測定する。さらに、活性アッセイは生理学的温度で行ってもよい。
【００８６】
インビトロタンパク質分解アッセイ(アッセイ２)
天然の(野生型) 第VIIa因子及び第VII因子ポリペプチド(以降、ともに「第VIIa因子」と称する)は、比活性を直接比較するために同時にアッセイしてもよい。アッセイはマイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)で行う。０.１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍｇ/ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む１００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ, ｐＨ７.４中の第VIIa因子(１０ｎＭ)と第X因子(０．８μＭ)を１５分間インキュベートする。次いで、０.１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍｇ/ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む５０μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ, ｐＨ７.４を加えて第X因子切断を止める。生成された第Xa因子の量は、終濃度０．５ｍＭの発色基質Ｚ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(Ｓ-２７６５、Chromogenix, Sweden)を加えて測定する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレート読み取り機(Molecular Devices, USA)にて４０５ｎｍの吸光度を連続して測定する。１０分間反応させた吸光度を、酵素を含まないブランクウェルの吸光度を減算した後、第VII因子ポリペプチドと野生型第VIIa因子とのタンパク質分解活性間の比率を算出するために用いる。
比率＝(Ａ４０５ｎｍ 第ＶII因子ポリペプチド)／(Ａ４０５ｎｍ 野生型第VIIa因子)
【００８７】
これに基づき、天然の第VIIa因子より低い、天然の第VIIa因子に相当する、又は天然の第VIIa因子より高い活性を有する第VII因子ポリペプチド、例えば第VII因子ポリペプチドの活性と天然の第VII因子(野生型ＦVII)の活性との間の比率がおよそ１．０対１．０を超える第VII因子ポリペプチドなどが同定されうる。
【００８８】
トロンビン生成アッセイ(アッセイ３)
第VII因子ポリペプチドのトロンビン生成能は、生理的濃度のインヒビター及び関係するすべての凝固因子(血友病Ａ状態を模倣する場合には第VIII因子を除く)と活性化血小板を含むアッセイ(アッセイ３)で測定することができる(Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547の543頁に記載される、この文献は出典明記によって本明細書中に援用される)。
【００８９】
一工程凝固アッセイ(凝血アッセイ)(アッセイ４)
また、第VII因子ポリペプチドは一工程凝血アッセイ(アッセイ４)を用いて比活性(「凝血活性」)についてアッセイしてもよい。このために、試験する試料は５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ-バッファ(ｐＨ７．２)、１％ ＢＳＡにて希釈し、４０μｌを、１０ｍＭ Ｃａ２＋と合成リン脂質を含む８０μｌのヒト組み換え組織因子と４０μｌの第VII因子欠失血漿とともにインキュベートする。凝固時間(凝血時間)を測定し、平行してアッセイした参照標準物質を用いた標準曲線と比較する。
【００９０】
実施例１
インヒビターであるＳ-２-[３-(４-カルバミミドイルフェニル)-ウレイド]-Ｎ-[１-(３-メトキシフェニル)-エチル]-アセトアミド(インヒビター０００８)をｒＦVIIa製剤から除去するＣｈｅｌｅｘ１００の能力を以下の方法で調べた。
１.４ｍｇ/ｍｌ ｒＦVIIa、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ ２Ｈ２０及び１０ｍＭ グリシルグリシンを含むｒＦVIIaバルクの溶液を解凍して、４５０μＭのインヒビター０００８を含む２：１の比率のｒＦVIIaバルクとインヒビター０００８の溶液と混合した。１０ｍＭ ヒスチジンを溶液に加え、ｐＨを６．５０に調整した。溶液を２．００ｍｌの一定分量に分けた。
【００９１】
漸増量のＣｈｅｌｅｘ１００を溶液に加え、以下の量のＣｈｅｌｅｘを加えた。２．００ｍｌのｒＦVIIa／インヒビター溶液当たり０、４０、８０、１２０、１６０、２００、２４０、２８０及び３２０ｍｇのＣｈｅｌｅｘ１００。
溶液を１分間撹拌し、０．２２μＭフィルターに濾過した。高性能ゲル浸透クロマトグラフィ(ＧＰ-ＨＰＬＣ)を用いてすべての溶液をインヒビター含量について分析した。
ＧＰ-ＨＰＬＣ法は、移動相として５％イソプロパノールを含む０．２Ｍ 硫酸アンモニウム ｐＨ７．０を用いたＷａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｋ ３００ ＳＷカラム、７.５×３００ｍｍにて行った。流速：０．５ｍｌ／分及び検出：２１５ｎｍ。インヒビターは異なるピークとしてクロマトグラフに表れ、相対的な含量を算出する。結果を図１に示す。
【００９２】
実施例２
ｐ-アミノベンズアミジンをｒＦVIIa製剤から除去するＣｈｅｌｅｘ１００の能力を以下の方法で調べた。
１.４ｍｇ/ｍｌ ｒＦVIIa、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ ２Ｈ２０及び１０ｍＭ グリシルグリシンを含むｒＦVIIaバルクの溶液を解凍して、３０ｍＭのｐ-アミノベンズアミジンを含む２：１の比率のｒＦVIIaバルクとｐ-アミノベンズアミジンの溶液と混合した。１０ｍＭ ヒスチジンを溶液に加え、ｐＨを６．５０に調整した。溶液を２．００ｍｌの一定分量に分けた。
【００９３】
漸増量のＣｈｅｌｅｘ１００を加え、以下の量のＣｈｅｌｅｘを加えた。２．００ｍｌのｒＦVIIa／インヒビター溶液当たり０、１６０、２４０、３２０、４００、４８０、５６０及び６４０ｍｇのＣｈｅｌｅｘ１００。
溶液を１分間撹拌し、０．２２μＭフィルターに濾過した。高性能ゲル浸透クロマトグラフィ(ＧＰ-ＨＰＬＣ)を用いてすべての溶液をインヒビター含量について分析した。
ＧＰ-ＨＰＬＣ法は、移動相として５％イソプロパノールを含む０．２Ｍ 硫酸アンモニウム ｐＨ７．０を用いたＷａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｋ ３００ ＳＷカラム、７.５×３００ｍｍにて行った。流速：０．５ｍｌ／分及び検出：２１５ｍｍ。インヒビターは異なるピークとしてクロマトグラフに表れ、相対的な含量を算出する。結果を図２に示す。
【００９４】
実施例３
ベンズアミジンをｒＦVIIa製剤から除去するＣｈｅｌｅｘ１００の能力を以下の方法で調べた。
５０ｍＭのベンズアミジンによって安定化させた１ｍｇ／ｍｌの第VIIa因子溶液５ｍｌを、ガラスフラスコ中の１ｇのＣｈｅｌｅｘ１００に加え、３０秒間かき混ぜて混合する。
およそ２ｍｌの混合溶液を遠心ガラスに移し、次いで１分間に１００００回転で５分間遠心する。
上清には、ベンズアミジンの含量が１０ｍＭの濃度に低減されている第VIIa因子溶液が含まれる。
【００９５】
実施例４
インヒビターである２-[３-(４-カルバミミドイルフェニル)-ウレイド]-Ｎ-[１-(３-メトキシフェニル)-エチル]-アセトアミドをｒＦVIIa製剤から除去するＣｈｅｌｅｘ１００の能力を以下の方法で調べた。
１.４ｍｇ/ｍｌ ｒＦVIIa、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ ２Ｈ２０及び１０ｍＭ グリシルグリシンを含むｒＦVIIaバルクの溶液(凍結)を解凍して、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ ２Ｈ２０及び１０ｍＭ グリシルグリシンを含む４．５ｍＭのインヒビターである２-[３-(４-カルバミミドイルフェニル)-ウレイド]-Ｎ-[１-(３-メトキシフェニル)-エチル]-アセトアミドのインヒビター溶液と混合した。
混合物比率は以下の通りである。ｒＦVIIaバルク：インヒビター溶液＝２：１。終溶液１０ｍＭ ヒスチジンを加えて、ｐＨを６．５０に調整した。
【００９６】
Ｃｈｅｌｅｘを以下のように調製した。
カラム物質を最大およそ３ｍｍのカラムに対応するＣｈｅｌｅｘ１００物質に置換するためにPharmaciaのＮＡＰＴＭカラムを空にした。カラムは以下のバッファにて平衡化した。５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ヒスチジン及び１０ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ＝６．５０。
１０ｍｌのｒＦVIIa／インヒビター溶液を０．５ｍｌの一定分量のカラムに加え、０．５ｍｌの分画に回収した。
試料は、ＧＰＣによるｒＦVIIaとインヒビターの含量について分析した。溶出量、インヒビター濃度及びｒＦVIIa濃度の関係を図６に示す。
図６は、試験した溶出容量(０．５ｍｌ〜３ｍｌ)内でインヒビター濃度が１７５μＭ未満に低減している(初期値としておよそ１０の低減因子は１．５ｍＭであった)ことと同時に、ｒＦVIIa濃度は初期値の０．９ｍｇ／ｍｌと比べて変化がないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】Ｃｈｅｌｅｘ１００によるＳ-２-[３-(４-カルバミミドイルフェニル)-ウレイド]-Ｎ-[１-(３-メトキシフェニル)-エチル]-アセトアミドの除去を示す。
【図２】Ｃｈｅｌｅｘ１００によるｐ-アミノ-ベンズアミジンの除去を示す。
【図３】ポリマー物質が出口域に適する注射器ないしは他の区画を示す。注入の間、液体製剤はポリマー物質を通り抜け、インヒビターが取り除かれる。
【図４】ポリマー物質を保持する滅菌フィルターが静脈注入チューブとつながっており、針(例えばバタフライ針)が出口に取り付けられている注射器ないしは他の区画を示す。注入の間、液体製剤はポリマー固相物質を通り抜け、インヒビターが取り除かれる。
【図５】ポリマー物質がチューブの内部を覆っているかチューブを満たしている、注射器ないしは他の区画に取り付けるための注入用チューブを示す。チューブは、針(例えばバタフライ針)にて取り付けられる。注入の間、液体製剤はポリマー固相物質を通り抜け、インヒビターが取り除かれる。
【図６】ｒＦVIIa製剤からインヒビターである２-[３-(４-カルバミミドイルフェニル)-ウレイド]-Ｎ-[１-(３-メトキシフェニル)-エチル]-アセトアミドのＣｈｅｌｅｘ１００による除去を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記タンパク質が自己触媒性質を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が部分的な又は完全な活性化型である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、プロテインＣ、第VII因子ポリペプチド、プロテインＺ、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、マトリックスＧｌａタンパク質及びオステオカルシンからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、第VII因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、第X因子ポリペプチド及び活性化プロテインＣからなる群から選択されるビタミンＫ依存性凝固因子である、請求項１から４のいずれか一に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が第VII因子ポリペプチド、好ましくは活性化型の第VII因子ポリペプチドである、請求項１から５のいずれか一に記載の方法。
【請求項７】
前記インヒビターは、最大１０００Ｄａ、例えば最大７５０Ｄａ、例えば最大５００Ｄａの分子量を有する非金属性化合物である、請求項１から６のいずれか一に記載の方法。
【請求項８】
前記インヒビターがアミジン類及びグアニジン類からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質が第VII因子ポリペプチドであり、前記インヒビターがベンズアミジン類及びグアニジン類からなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマー物質が、陽イオン交換物質、負イオン交換物質、極性物質、無極性物質、親水性物質、及び疎水性物質からなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一に記載の方法。
【請求項１３】
液体製薬調製物をポリマー物質のバルクに通すことによって、前記液体製薬調製物がポリマー物質と接触する、請求項１から１２のいずれか一に記載の方法。
【請求項１４】
液体製薬調製物をポリマー物質のバルクにかざすことによって、前記液体製薬調製物がポリマー物質と接触する、請求項１から１２のいずれか一に記載の方法。
【請求項１５】
前記密封した容器中の製薬調製物の量が１〜１０用量、例えば１〜５用量、特に１用量に相当する、請求項１から１４のいずれか一に記載の方法。
【請求項１６】
前記密封した容器中の製薬調製物の量が１用量に相当し、この用量がポリマー物質のバルクに通される又はかざされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記密封した容器中の製薬調製物の量が２〜１０用量に相当し、１用量に相当する量がポリマー物質のバルクに通される又はかざされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
工程(b)の接触時間が０．１〜１００秒の範囲である、請求項１から１７のいずれか一に記載の方法。
【請求項１９】
液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) 第VII因子ポリペプチドとベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該液体製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法。
【請求項２０】
前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
(d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体、特にヒトに投与する、という工程を後に含んでなる、請求項１から２０のいずれか一に記載の方法。
【請求項２２】
セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ依存性タンパク質の群に属する治療上活性なタンパク質を必要とする被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封した容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る、そして、
(d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する
という工程を含んでなる方法。
【請求項２３】
前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記の結果として生じた液体製薬調製物が注射によって投与される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
治療上活性なタンパク質を必要とする被検体が第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある、請求項２２から２４のいずれか一に記載の方法。
【請求項２６】
第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) 第VII因子ポリペプチドと、(ii) ベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得て、そして、
(d) この結果として得られた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する、
という工程を含んでなる方法。
【請求項２７】
前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記タンパク質が自己触媒性質を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が部分的な又は完全な活性化型である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、プロテインＣ、第VII因子ポリペプチド、プロテインＺ、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、マトリックスＧｌａタンパク質及びオステオカルシンからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、第VII因子ポリペプチド、第IX因子ポリペプチド、第X因子ポリペプチド及び活性化プロテインＣからなる群から選択されるビタミンＫ依存性凝固因子である、請求項１から４のいずれか一に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が第VII因子ポリペプチド、好ましくは活性化型の第VII因子ポリペプチドである、請求項１から５のいずれか一に記載の方法。
【請求項７】
前記インヒビターは、最大１０００Ｄａ、例えば最大７５０Ｄａ、例えば最大５００Ｄａの分子量を有する非金属性化合物である、請求項１から６のいずれか一に記載の方法。
【請求項８】
前記インヒビターがアミジン類及びグアニジン類からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質が第VII因子ポリペプチドであり、前記インヒビターがベンズアミジン類及びグアニジン類からなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマー物質が、陽イオン交換物質、負イオン交換物質、極性物質、無極性物質、親水性物質、及び疎水性物質からなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一に記載の方法。
【請求項１３】
液体製薬調製物をポリマー物質のバルクに通すことによって、前記液体製薬調製物がポリマー物質と接触する、請求項１から１２のいずれか一に記載の方法。
【請求項１４】
液体製薬調製物をポリマー物質のバルクにかざすことによって、前記液体製薬調製物がポリマー物質と接触する、請求項１から１２のいずれか一に記載の方法。
【請求項１５】
前記密封した容器中の製薬調製物の量が１〜１０用量、例えば１〜５用量、特に１用量に相当する、請求項１から１４のいずれか一に記載の方法。
【請求項１６】
前記密封した容器中の製薬調製物の量が１用量に相当し、この用量がポリマー物質のバルクに通される又はかざされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記密封した容器中の製薬調製物の量が２〜１０用量に相当し、１用量に相当する量がポリマー物質のバルクに通される又はかざされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
工程(b)の接触時間が０．１〜１００秒の範囲である、請求項１から１７のいずれか一に記載の方法。
【請求項１９】
液体製薬調製物からタンパク質インヒビターを除去する方法であって、
(a) 第VII因子ポリペプチドとベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該液体製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、そして、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る
という工程を含んでなる方法。
【請求項２０】
前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
(d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体、特にヒトに投与する、という工程を後に含んでなる、請求項１から２０のいずれか一に記載の方法。
【請求項２２】
セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ依存性タンパク質の群に属する治療上活性なタンパク質を必要とする被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) セリンプロテアーゼ／ビタミンＫ-依存性タンパク質の群に属するタンパク質と、(ii) 該タンパク質の非金属性インヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封した容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得る、そして、
(d) 結果として生じた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する
という工程を含んでなる方法。
【請求項２３】
前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記の結果として生じた液体製薬調製物が注射によって投与される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
治療上活性なタンパク質を必要とする被検体が第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある、請求項２２から２４のいずれか一に記載の方法。
【請求項２６】
第VII因子応答症候群を患っているか又は第VII因子応答症候群に罹るリスクにある被検体、例えばヒトを治療する方法であって、
(a) (i) 第VII因子ポリペプチドと、(ii) ベンズアミジン類及びグアニジン類から選択されるインヒビターとを含有する初期液体製薬調製物を具備する密封容器を提供し、
(b) 該インヒビターの少なくとも実質的な部分を保持することが可能な固相ポリマー物質に該製薬調製物を接触させ、該ポリマー物質がセルロース繊維及び親水性合成ポリマーからなる群から選択され、
(c) 該固相ポリマー物質から液体製薬調製物を分離し、結果として得られた、初期液体製薬調製物と比べて該インヒビターの濃度が低減している液体製薬調製物を得て、そして、
(d) この結果として得られた液体製薬調製物の治療的ないしは予防的有効量を被検体に投与する、
という工程を含んでなる方法。
【請求項２７】
前記ポリマー物質が陽イオン交換物質からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５２７５３６（Ｐ２００９−５２７５３６Ａ）
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５５７９６（Ｐ２００８−５５５７９６）
【出願日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５１７１１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９６４０６
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（５０７３８３８６２）ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー (42)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５１７１１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９６４０６
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（５０７３８３８６２）ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー (42)
【Ｆターム（参考）】
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