本発明は、1つの態様においては、関心のある1以上のヌクレオチド配列（例えば、1以上のゲノム遺伝子座）との標的ヌクレオチド配列の相互作用の頻度を分析するための方法であって、（a）架橋されたDNAのサンプルを準備し、（b）該架橋DNAを一次制限酵素で消化し、（c）該架橋ヌクレオチド配列を連結し、（d）該架橋を逆転させ、（e）場合によっては、該ヌクレオチド配列を二次制限酵素で消化し、（f）場合によっては、既知ヌクレオチド組成の1以上のDNA配列を、関心のある1以上のヌクレオチド配列に隣接する利用可能な二次制限酵素消化部位に連結し、（g）関心のあるヌクレオチド配列に隣接するDNA配列に各プライマーがハイブリダイズする少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、関心のある1以上のヌクレオチド配列を増幅し、（h）該増幅配列をアレイにハイブリダイズさせ、（i）該DNA配列間の相互作用の頻度を決定する工程を含んでなる方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心のある1以上のヌクレオチド配列（例えば、1以上のゲノム遺伝子座）との標的ヌクレオチド配列の相互作用の頻度を分析するための方法であって、
（a）架橋されたDNAのサンプルを準備し、
（b）該架橋DNAを一次制限酵素で消化し、
（c）該架橋ヌクレオチド配列を連結し、
（d）該架橋を逆転させ、
（e）場合によっては、該ヌクレオチド配列を二次制限酵素で消化し、
（f）場合によっては、既知ヌクレオチド組成の1以上のDNA配列を、関心のある1以上のヌクレオチド配列に隣接する利用可能な二次制限酵素消化部位に連結し、
（g）関心のあるヌクレオチド配列に隣接するDNA配列に各プライマーがハイブリダイズする少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、関心のある1以上のヌクレオチド配列を増幅し、
（h）該増幅配列をアレイにハイブリダイズさせ、
（i）該DNA配列間の相互作用の頻度を決定する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項２】
工程（c）または（f）における連結反応がDNA環の形成をもたらす、請求項1記載の方法。
【請求項３】
工程（h）が、配列決定（例えば、ハイスループット配列決定）による、標的配列と関心のある架橋配列との間の連結産物の分析を含む、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
工程（g）における多重PCRの使用を含む、関心のある1以上のヌクレオチド配列との2以上の標的ヌクレオチド配列の相互作用の頻度を分析するための、請求項１〜３のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
工程（g）における標的配列のそれぞれから得られたPCR産物の一部または全部のプール、およびそれに続く、それらのDNA相互作用の同時分析を含む、関心のある1以上のヌクレオチド配列との2以上の標的ヌクレオチド配列の相互作用の頻度を分析するための、請求項１〜４のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
2以上の増幅された配列を、プールおよびアレイへのハイブリダイゼーションによる分析の前に示差的に標識する、請求項5記載の方法。
【請求項７】
異なる染色体上に配列が存在する場合には、2以上の増幅された配列を同一に標識し、アレイへのハイブリダイゼーションにより分析する、請求項5または請求項6記載の方法。
【請求項８】
DNA-DNA相互作用シグナル間の重複が最小になるのに十分な程度に遠い距離を隔てて同一染色体上に配列が存在する場合には、2以上の増幅配列を同一に標識する、請求項5記載の方法。
【請求項９】
標的配列と関心のある捕捉配列との間で形成された連結接合部を分析するために、ハイスループット配列決定を用いる、請求項１〜８のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
配列決定が、増幅配列の末端への、配列決定に必要なアダプター配列の付加により、標的配列と関心のある捕捉配列との間で形成された連結接合部に向けられる、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
配列決定が、関心のある1以上のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーへの、5'突出部としての配列決定に必要なアダプター配列の全部または一部の付加により、標的配列と関心のある捕捉配列との間で形成された連結接合部に向けられる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
配列決定が、関心のある1以上のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーへのビオチン基質または他の部分の結合、およびそれに続く、該PCR増幅物の、ストレプトアビジンまたはその他により媒介される精製により、標的配列と関心のある捕捉配列との間で形成された連結接合部に向けられる、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
配列決定が、分析される一次および／または二次制限酵素認識部位から400、300、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1ヌクレオチド以内の関心のある1以上のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを設計することにより、標的配列と関心のある捕捉配列との間の連結接合部に向けられる、請求項9〜12のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
配列決定が、関心のある1以上のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを設計して、それらが、分析される一次および／または二次制限酵素認識部位に部分的または完全に重複するようにすることにより、標的配列と関心のある捕捉配列との間の連結接合部に向けられる、請求項9〜12のいずれか1項記載の方法。
【請求項１５】
多重化またはプール化PCRサンプルを分析する場合、各標的配列および関心のある各捕捉配列を明らかに特定するために、連結接合部の各側において十分な配列情報（例えば、12ヌクレオチド以上）が得られるよう、配列を連結接合部を越えて読み取る、請求項9〜14のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
標的ヌクレオチド配列が、ゲノム再編成、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、絶縁体、マトリックス結合領域、遺伝子座制御領域、転写単位、複製起点、組換えホットスポット、転座切断点、動原体、テロメア、遺伝子密集領域、遺伝子過疎領域、反復要素および（ウイルス）組込み部位よりなる群から選ばれる、請求項1〜15のいずれか1項記載の方法。
【請求項１７】
標的ヌクレオチド配列が、疾患に関連している若しくは疾患を引き起こすヌクレオチド配列、または疾患に関連している若しくは疾患を引き起こす遺伝子座から線状DNA鋳型上の15Mbまで若しくはそれ以降に位置するヌクレオチド配列である、請求項1〜16のいずれか1項記載の方法。
【請求項１８】
標的ヌクレオチド配列が、AML1、MLL、MYC、BCL、BCR、ABL1、IGH、LYL1、TAL1、TAL2、LMO2、TCRα/δ、TCRβおよびHOX、または“Catalogue of Unbalanced Chromosome Aberrations in Man” 2nd edition. Albert Schinzel. Berlin: Walter de Gruyter, 2001. ISBN 3-11-011607-3に記載されているとおりの疾患に関連している他の遺伝子座よりなる群から選ばれる、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
標的配列が、相互作用性配列が全染色体またはゲノムをカバーするよう、線状ゲノム鋳型に沿って分布している、請求項1〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
一次制限酵素が、6〜8bpの認識部位を認識する制限酵素である、請求項1〜19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
一次制限酵素が、BglII、HindIII、EcoRI、BamHI、SpeI、PstIおよびNdeIよりなる群から選ばれる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
一次制限酵素が反復配列におけるその非存在または反復配列における存在に基づいて選ばれる、請求項20または請求項21記載の方法。
【請求項２３】
二次制限酵素が、4または5bpヌクレオチド配列認識部位を認識する制限酵素である、請求項1〜22のいずれか1項記載の方法。
【請求項２４】
二次制限酵素認識部位が標的ヌクレオチド配列内の一次制限部位から約350bp以降に位置する、請求項1〜23のいずれか1項記載の方法。
【請求項２５】
1以上のヌクレオチド配列（例えば、1以上のゲノム遺伝子座）との標的ヌクレオチド配列の相互作用の頻度を分析するための方法であって、
（a）架橋されたDNAのサンプルを準備し、
（b）該架橋DNAを一次制限酵素で消化し、
（c）該架橋ヌクレオチド配列を連結し、
（d）該架橋を逆転させ、
（e）場合によっては、該ヌクレオチド配列を二次制限酵素で消化し、
（f）該ヌクレオチド配列を環化し、
（g）該標的ヌクレオチド配列に連結された1以上のヌクレオチド配列を増幅し、
（h）場合によっては、該増幅配列をアレイにハイブリダイズさせ、または配列決定（例えば、ハイスループット配列決定）により該増幅配列を分析し、
（i）該DNA配列間の相互作用の頻度を決定することを含んでなる、上記方法。
【請求項２６】
請求項1〜24のいずれか1項記載の工程（a）〜（i）を行う工程を含んでなる、特定の病態を示す1以上のDNA-DNA相互作用を特定するための方法であって、工程（a）において、罹患細胞および非罹患細胞から架橋DNAのサンプルを準備し、該罹患細胞および非罹患細胞からのDNA配列間の相互作用の頻度における相違が、該染色体鋳型の線状構成における相違（例えば、ゲノム再編成）を示し、これが特定の形質または病態を示す、上記方法。
【請求項２７】
請求項1〜24のいずれか1項記載の工程（a）〜（i）を行う工程を含んでなる、DNA-DNA相互作用における変化により引き起こされる又は該変化に関連した疾患または症候群の診断または予後判定の方法であって、工程（a）が、被験者から架橋DNAのサンプルを準備することを含み、工程（i）が、該DNA配列間の相互作用の頻度を非罹患対照のものと比較することを含み、該対照から得た値と該被験者から得た値との相違が、該被験者が該疾患もしくは症候群に罹患していることを示す又は該被験者が該疾患もしくは症候群に罹患することになることを示す、上記方法。
【請求項２８】
低から高への相互作用頻度の変化が平衡および／または非平衡遺伝的再編成の位置を示す、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
対照と比較した場合の被験者サンプルに関するDNA-DNA相互作用頻度の逆転パターンが平衡および／または非平衡逆位を示す、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
対照と比較した場合の被験者サンプルに関するDNA-DNA相互作用頻度の減少が、より離れた領域に関するDNA-DNA相互作用頻度の増加と組合されて、平衡および／または非平衡欠失を示す、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
対照と比較した場合の被験者サンプルに関するDNA-DNA相互作用頻度の増加または減少が平衡および／または非平衡重複または挿入を示す、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
前記方法を行う前に、スペクトル核型分析および／またはFISHを用いる、請求項27〜31のいずれか1項記載の方法。
【請求項３３】
疾患が遺伝的疾患である、請求項27〜32のいずれか1項記載の方法。
【請求項３４】
該疾患が癌である、請求項27〜33のいずれか1項記載の方法。
【請求項３５】
請求項1〜24のいずれか1項記載の工程（a）〜（i）を行う工程を含んでなる、DNA-DNA相互作用における変化により引き起こされる又は該変化に関連した疾患または症候群の診断または予後判定の方法であって、工程（a）が、被験者から架橋DNAのサンプルを準備することを含み、該方法が、（j）疾患に関連したゲノム再編成を受けた1以上の遺伝子座を特定する追加工程を含む、上記方法。
【請求項３６】
（a）サンプルを1以上の物質と接触させ、
（b）請求項1〜24のいずれか1項記載の工程（a）〜（i）を行うことを含んでなる、DNA-DNA相互作用をモジュレーションする1以上の物質を特定するためのアッセイ方法であって、工程（a）が、架橋されたDNAを該サンプルから準備することを含み、（i）該物質の存在下のDNA配列間の相互作用の頻度と、（ii）該物質の非存在下の該DNA配列間の相互作用の頻度との相違が、該DNA-DNA相互作用をモジュレーションする物質の指標となる、上記方法。
【請求項３７】
（a）請求項1〜24のいずれか1項記載の工程（a）〜（i）を行い、
（b）DNA配列間の相互作用の頻度を対照のものと比較する工程を含んでなる、平衡および／または非平衡再編成（例えば、転座）の位置を検出するための方法であって、該対照と比較した場合の該サンプルにおける低から高へのDNA-DNA相互作用頻度の変化が切断点の位置を示す、上記方法。
【請求項３８】
（a）請求項1〜24のいずれか1項記載の工程（a）〜（i）を行い、
（b）DNA配列間の相互作用の頻度を対照のものと比較する工程を含んでなる、平衡および／または非平衡逆位の位置を検出するための方法であって、該対照と比較した場合の該サンプルに関するDNA-DNA相互作用頻度の逆転パターンが逆位を示す、上記方法。
【請求項３９】
（a）請求項1〜24のいずれか1項記載の工程（a）〜（i）を行い、
（b）DNA配列間の相互作用の頻度を対照のものと比較する工程を含んでなる、欠失の位置を検出するための方法であって、該対照と比較した場合の該サンプルに関するDNA-DNA相互作用頻度の減少が欠失を示す、上記方法。
【請求項４０】
（a）請求項1〜24のいずれか1項記載の工程（a）〜（i）を行い、
（b）DNA配列間の相互作用の頻度を対照のものと比較する工程を含んでなる、重複の位置を検出するための方法であって、該対照と比較した場合の該被験者サンプルに関するDNA-DNA相互作用頻度の増加または減少が重複または挿入を示す、上記方法。
【請求項４１】
2以上の標的配列と相互作用するヌクレオチド配列を増幅する、請求項１〜40のいずれか1項記載の方法。
【請求項４２】
標的配列が、病態に関連していることが知られているゲノム遺伝子座またはその付近に位置する、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
標的配列が、再編成の位置に関する前提知識を伴わずに選ばれ、相互作用性配列が全染色体またはゲノムをカバーするように配置され、特定された相互作用性配列が、染色体内および染色体間で生じたゲノム再編成および線状染色体地図の再構築を可能にする、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
増幅配列を標識する、請求項41〜43のいずれか1項記載の方法。
【請求項４５】
増幅配列をゲノム内のそれらの位置に応じて示差的に標識する、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
平衡および／または非平衡再編成、転座、逆位、欠失、重複または挿入の検出のための、請求項41〜45のいずれか1項記載の方法。
【請求項４７】
請求項35記載のアッセイ方法により得られた又は得られうる物質。
【請求項４８】
関心のある1以上のヌクレオチド配列（例えば、1以上のゲノム遺伝子座）との1以上の標的ヌクレオチド配列の相互作用の頻度を分析するための方法であって、
（a）架橋されたDNAのサンプルを準備し、
（b）該架橋DNAを一次制限酵素で消化し、
（c）該架橋ヌクレオチド配列を連結し、
（d）該架橋を逆転させ、
（e）該連結ヌクレオチド配列を配列決定する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項４９】
サンプルにおけるゲノム再編成の存在を決定するための方法であって、
（a）核酸（例えば、ゲノムDNA）のサンプルを準備し、ここで、該核酸は、疑われるゲノム再編成の位置に隣接した既知配列のヌクレオチド配列を含み、
（b）該DNAを一次制限酵素で消化して複数の制限断片を形成させ、
（c）場合によっては、該制限断片を精製し、
（d）該制限断片を連結して環化DNAを形成させ、
（e）場合によっては、該環化DNAを精製し、
（f）該環化DNAを二次制限酵素で消化して複数の制限断片を形成させ、
（g）該制限断片を連結して環化DNAを形成させ、
（h）既知配列のヌクレオチド配列にハイブリダイズする1以上のプライマーを使用して、疑われるゲノム再編成を増幅し、
（i）疑われるゲノム再編成を配列決定することを含んでなる、上記方法。
【請求項５０】
アレイハイブリダイゼーション工程の代わりに配列決定工程を行う、請求項1〜46のいずれか1項記載の方法。
【請求項５１】
標的ヌクレオチド配列および関心のあるヌクレオチド配列の両方を配列決定により特定する、請求項48または請求項49記載の方法。
【請求項５２】
アダプター配列をPCR産物に連結する、請求項48〜51のいずれか1項記載の方法。
【請求項５３】
各標的配列の一次制限酵素認識部位または二次制限酵素認識部位を場合によっては含む、直に隣接する約6〜50塩基対の核酸配列のデータベース。
【請求項５４】
ゲノム内の全ての関連する一次および二次制限酵素認識部位に直に隣接する約12〜50塩基対の核酸配列のデータベース。
【請求項５５】
特定された捕捉配列のそれぞれのゲノム位置を決定するための、請求項53または請求項54記載の核酸配列のデータベースの使用。
【請求項５６】
本明細書に記載されており実施例または図面のいずれかに参照されているのと実質的に同じ方法または物質またはデータベースまたは使用。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【公表番号】特表２０１０−５１５４４９（Ｐ２０１０−５１５４４９Ａ）
【公表日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４５２５３（Ｐ２００９−５４５２５３）
【出願日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００６２５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８４４０５
【国際公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【出願人】（５０７２８５６５８）エラスムス　ユニバーシティ　メディカル　センター (3)
【Ｆターム（参考）】