生体活性因子を含有する処方物およびそれを使用する方法
【課題】沈殿した生体活性因子を含有する微粒子を提供する。
【解決手段】生体活性ＢＭＰ−２微粒子を作製する方法およびこの微粒子を使用する方法を開示する。本発明はまた、沈殿した生体活性ＢＭＰ−２微粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。このＢＭＰ−２は、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸配列を有し、組換え的に発現されたタンパク質である。被験体において、ＢＭＰ−２レベルを増加する本発明の方法は、再可溶化されたＢＭＰ−２ポリペプチドを含む水性ＢＭＰ−２懸濁液を提供する工程；および該被験体に、該被験体においてＢＭＰ−２レベルを増加するために十分な量で、該水性懸濁液を導入する工程を包含する。
【解決手段】生体活性ＢＭＰ−２微粒子を作製する方法およびこの微粒子を使用する方法を開示する。本発明はまた、沈殿した生体活性ＢＭＰ−２微粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。このＢＭＰ−２は、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸配列を有し、組換え的に発現されたタンパク質である。被験体において、ＢＭＰ−２レベルを増加する本発明の方法は、再可溶化されたＢＭＰ−２ポリペプチドを含む水性ＢＭＰ−２懸濁液を提供する工程；および該被験体に、該被験体においてＢＭＰ−２レベルを増加するために十分な量で、該水性懸濁液を導入する工程を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、骨形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質−２（ＢＭＰ−２）のような生体活性因子を含有する組成物ならびにこれらの組成物を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
治療剤として使用されるタンパク質は、代表的に、薬学的組成物として提供され、例えば、タンパク質の特性およびそれが患者に導入される様式に依存して変化し得る。
【０００３】
タンパク質の不安定性は、これらの薬学的組成物の調製における主要な問題点であり得る。薬学的処方物の調製の間のタンパク質に対する望まれないストレスは、タンパク質変性、沈殿、または表面に対する吸着のような望まれない効果を生じ得る。
【０００４】
骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含有する薬学的組成物は、非常に興味深い。なぜなら、このタンパク質は、骨成長の開始および創傷治癒の促進のような種々の生物学的に重要なプロセスに関与することが示されてきたからである。例えば、ＢＭＰ−２は、脛骨、顎顔面骨、および脊髄骨に関連する障害を含む、種々の骨関連障害を処置するかまたは予防するために使用されてきた。
【０００５】
ＢＭＰ−２は、トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバーである。成熟タンパク質は、３２キロダルトン（ｋＤａ）のジスルフィド連結されたホモダイマー糖タンパク質である。ＢＭＰ−２は、水中で限られた溶解度を示す。この限られた溶解度は、このタンパク質を含有する薬学的組成物を開発するための試みを妨げ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、沈殿した生体活性因子を含有する微粒子（ｍｉｃｏｒｐａｒｔｉｃｌｅ）が、被験体に対する投与の前に、都合よく調製され、そして水溶液中に再懸濁され得るという発見に、一部基づく。本明細書中に開示される例示的な生体活性因子は、ＢＭＰ−２タンパク質である。ＢＭＰ−２ポリペプチドは、生体活性形態で水溶液中に再溶解されるかまたは再懸濁されるかのいずれかであり得、従って、再溶解されるかまたは再懸濁されるＢＭＰ−２微粒子は、ＢＭＰ−２が、有効であると示された障害または状態を処置または予防するために使用され得る。
【０００７】
所望される場合、添加された沈殿溶液のＢＭＰ−２溶液は、適切な生体分解性ポリマーを含み得、この生体分解性ポリマーとしては、ヒアルロン酸、コラーゲン、カルメロース（ｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、ポリビニルアルコール、キトサンまたはカチオン性デンプンが挙げられるが、これらに限定されない。従って、１つの局面において、本発明は、沈殿された生体活性骨形成タンパク質を含む精製された微粒子を提供する。好ましい骨形成タンパク質は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ−２タンパク質は、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸配列を有し、そして／または組換え発現されたタンパク質である。好ましいＢＭＰ−２タンパク質は、組換えヒトＢＭＰ−２タンパク質（ｒｈＢＭＰ−２）である。微粒子は、骨欠損および／もしくは軟骨欠損、創傷、または組織の処置に対して有益なさらなる因子を、さらに含有し得る。
【０００８】
種々の実施形態において、微粒子は、約０．１μｍ〜２０００μｍの直径を有する。例えば、適切な微粒子直径は、０．５μｍから約１５００μｍ、１μｍから約１０００μｍ、５μｍから約７５０μｍ、１０μｍから約５００μｍ、１５μｍから約２５０μｍ、２５μｍから約１２５μｍ、および３７μｍから約７５μｍの範囲にわたり得るが、これらに限定されない。他の適切な範囲は、０．５μｍから約１４０μｍ、５μｍから約８５μｍ、約１５μｍから約７５μｍ、または約２５μｍから約５０μｍが挙げられるがこれらに限定されない。
【０００９】
所望の場合、ＢＭＰ−２微粒子は、凍結乾燥された処方物として提供され得る。いくつかの実施形態において、微粒子は、水性処方物として提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、微粒子は、ポリマーキャリアと共同して提供される。ポリマーキャリアは、好ましくは、生体分解性である。
【００１１】
適切なポリマーキャリアとしては、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエチレンビニルアセテート、またはナイロンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１２】
沈殿された生体活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）微粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物はまた、本発明内に含まれる。薬学的組成物はまた、好ましくは、再溶解されたＢＭＰ−２タンパク質を含む。
【００１３】
被験体における骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）レベルを上昇させる方法がまた、本発明によって特徴付けられる。本方法は、再溶解されたＢＭＰ−２ポリペプチドを含む水性ＢＭＰ−２懸濁物を提供する工程を包含し、この水性ＢＭＰ−２懸濁物は、被験体におけるＢＭＰ−２レベルを増大するのに十分な量で被験体に水性懸濁物を導入する。
【００１４】
好ましい実施形態において、水性懸濁物は、沈殿された生体活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含む微粒子を、水溶液に導入することによって調製され、沈殿されたＢＭＰ−２タンパク質が、懸濁物を形成するかまたは再溶解され、それによって、水性ＢＭＰ−２懸濁物を調製する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、微粒子は、凍結乾燥された微粒子として水性懸濁物に導入される。
【００１６】
被験体は、好ましくは、哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、またはネコが挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００１７】
ＢＭＰ−２微粒子、または再溶解された微粒子を含有する処方物の投与は、任意の所望の経路を介し得る。例えば、投与は、ＢＭＰ−２レベルの上昇が所望される部位で、局所的であり得る。
【００１８】
骨関連障害は、ＢＭＰ−２微粒子、または再溶解された微粒子を含有する処方物が使用され得る適応症である。例えば、適切な被験体は、骨折しているかまたは骨折の危険にある。骨としては、脛骨、口／顎顔面骨、または脊髄骨が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００１９】
さらなる適応症としては、歯周疾患、および他の歯修復プロセスの処置が挙げられる。このような薬剤は、骨形成細胞を誘引する環境、骨形成細胞の増殖を刺激する環境または骨形成細胞の前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の分化を誘導する環境を提供し得る。さらなる適応症としては、骨粗鬆症、ニューロン生存の上昇が所望される疾患、創傷治癒、および関連する組織修復が挙げられる。この型の創傷としては、火傷、切開、および潰瘍が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２０】
生体活性ＢＭＰ−２微粒子の集団を作製する方法もまた、本発明内にある。本方法は、ＢＭＰ−２ポリペプチドを含む第１の溶液を提供する工程、この第１の溶液を既知のｐＨおよびイオン強度を有する第２の溶液と混合する工程であって、第２の溶液と接触する際に、この第２の溶液が、ＢＭＰ−２ポリペプチドの沈殿を生じる工程、それによって混合された第１の溶液および第２の溶液を形成する工程を包含する。ＢＭＰ−２ポリペプチドは、沈殿させられ、それによって、ＢＭＰ−２微粒子の集団を形成する。
【００２１】
ＢＭＰ−２タンパク質は、好ましくは、約０．１〜約２０ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または約０．７５〜約２．５ｍｇ／ｍｌ）の濃度で第１の溶液中に存在する。第１の溶液は、約１．５〜８のｐＨ（例えば、約３〜５、または約４．２〜４．８）で提供される。特に好ましいｐＨは、約４．５である。混合を容易にするために、第１の溶液は、第２の溶液と混合される場合、乱流溶液として提供され得る。
【００２２】
混合された第１の溶液および第２の溶液の最終ｐＨは、好ましくは約４．０〜約１０．０である。より好ましいｐＨ範囲は、約５．０〜約９．５、または約６．０〜約９．０である。混合された第１の溶液および第２の溶液の特に好ましい最終ｐＨは、約７．４である。
【００２３】
所望される場合、ＢＭＰ−２微粒子は、濃縮され得る。濃縮の方法は、遠心分離および濾過が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００２４】
約７．４のｐＨは、合わせた第１の溶液および第２の溶液について目標とされる場合、この第２の溶液は、混合された第１の溶液および第２の溶液のイオン強度が、５〜１０００ｍＭの範囲にあり、より好ましくは、２０〜３５０ｍＭ、例えば、以下の組成物について約１４０ｍＭであるように処方される：１０７ｍＭ ＮａＣｌ、２７ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１．０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４。
【００２５】
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が所属する当該分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および物質と類似するかまたは等価である方法および物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および物質が、以下に記載される。本明細書中に示される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考は、その全体を参考として援用される。矛盾の場合、定義を含む本明細書は、制御する。さらに、物質、方法、および実施例は、例示のみであり、限定することを意図されない。
【００２６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２７】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
沈殿した生体活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含む、精製微粒子。
（項目２）
上記ＢＭＰ−２が、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸配列を有する、項目１に記載の微粒子。
（項目３）
上記ＢＭＰ−２が、組換え的に発現されたタンパク質である、項目１に記載の微粒子。
（項目４）
上記ＢＭＰ−２が、組換え的に発現されたタンパク質である、項目２に記載の微粒子。
（項目５）
上記微粒子が、約０．１μｍ〜約２０００μｍの直径を有する、項目１に記載の微粒子。
（項目６）
上記微粒子が、約５μｍ〜約７５０μｍの直径を有する、項目１に記載の微粒子。
（項目７）
上記微粒子が、約１５μｍ〜約２５０μｍの直径を有する、項目１に記載の微粒子。
（項目８）
上記微粒子が、約２５μｍ〜約５０μｍの直径を有する、項目１に記載の微粒子。
（項目９）
上記微粒子が、凍結乾燥処方物として提供される、項目１に記載の微粒子。
（項目１０）
上記微粒子が、水性処方物として提供される、項目１に記載の微粒子。
（項目１１）
上記微粒子が、ポリマーキャリアと結合して提供される、項目１に記載の微粒子。
（項目１２）
上記ポリマーキャリアが、生分解性である、項目１１に記載の微粒子。
（項目１３）
上記ポリマーキャリアが、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエチレンビニルアセテート、またはナイロンである、項目１１に記載の微粒子。
（項目１４）
沈殿した生体活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）微粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１５）
再可溶化されたＢＭＰ−２タンパク質をさらに含む、項目１４に記載の薬学的組成物。
（項目１６）
被験体において、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）レベルを増加する方法であって、その方法は、
再可溶化されたＢＭＰ−２ポリペプチドを含む水性ＢＭＰ−２懸濁液を提供する工程；および
その被験体に、その被験体においてＢＭＰ−２レベルを増加するために十分な量で、その水性懸濁液を導入する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）
上記水性懸濁液が、
水溶液に、沈殿した生体活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含む微粒子を導入する工程；および
その沈殿したＢＭＰ−２タンパク質が、再可溶化し、それにより、上記水溶性ＢＭＰ−２懸濁液を調製する工程、
により調製される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記微粒子が、上記水性懸濁液に、凍結乾燥微粒子として導入される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
上記被験体がヒトである、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
上記投与が、ＢＭＰ−２レベルの増加が所望される部位に、局所的である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
上記被験体が骨の破損を有するか、または骨の破損の危険がある、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
上記骨が脛骨である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記骨が口／顎顔面の骨である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
上記骨が脊髄骨である、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
生体活性ＢＭＰ−２微粒子の集団を作製する方法であって、その方法は、
約０．７５ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度、約４．２〜約４．８のｐＨで、ＢＭＰ−２ポリペプチドを含む、第１の溶液を提供する工程；
その第１の溶液と既知のｐＨおよびイオン濃度を有する第２の溶液を混合する工程であって、この工程は、その第２の溶液と接触する際、ＢＭＰ−２ポリペプチドの沈殿を生じ、それにより、その第１の溶液およびその第２の溶液の混合物を形成する工程；および
そのＢＭＰ−２ポリペプチドを沈殿させ得る工程であって、それにより、そのＢＭＰ−２微粒子の集団の形成する工程、
を包含する、方法。
（項目２６）
上記ＢＭＰ−２微粒子を濃縮する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
上記第１の溶液および上記第２の溶液が、１０：１の相対容量で混合される、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
上記第１の溶液が、約ｐＨ４．５を有する、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
上記第１の溶液が、上記第２の溶液と接触する場合、乱流溶液である、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ１０．０を有する、項目２５に記載の方法。
（項目３１）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、約ｐＨ７．４を有する、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、１０７ｍＭ ＮａＣｌ、２７ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１．０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４である、項目２５に記載の方法。
（項目３３）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、約５ｍＭ〜約１０００ｍＭのイオン強度を有する、項目２５に記載の方法。
（項目３４）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、約２０ｍＭ〜約２５０ｍＭのイオン強度を有する、項目２５に記載の方法。
（項目３５）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、約１４０ｍＭのイオン強度を有する、項目２５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、１０分未満の形成期間の間に形成されるＢＭＰ−２微粒子の粒子直径分布を示すグラフである。
【図２】図２は、１０〜１１０分の形成期間の間に形成されるＢＭＰ−２微粒子の粒子直径分布を示すグラフである。
【図３】図３は、１６０分までの形成期間の間に形成されるＢＭＰ−２微粒子の粒子直径分布を示すグラフである。
【図４】図４は、ＢＭＰ−２粒子直径に対する遠心分離の影響を示すグラフである。
【図５】図５は、凍結乾燥に供された微粒子の、経時的な乾燥速度および累積的水損失を示すグラフである。
【図６】図６は、ＢＭＰ−２粒子直径に対する凍結乾燥の影響を示すグラフである。
【図７】図７は、７２０ｍｇのＢＭＰ−２微粒子調製物における粒子直径分布を示すグラフである。
【図８】図８は、微量混合デバイスを使用して調製されるＢＭＰ−２微粒子の直径分布を示すグラフである。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明のＢＭＰ−２微粒子は、ＢＭＰ−２タンパク質の任意の都合の良い供給源を使用して形成される。ＢＭＰ−２タンパク質は、当該分野で公知であり、いくつかの特許、特許出願、刊行物において開示される。代表的な特許としては、米国特許第５，０１３，６４９号、同第６，１５０，３２８号、同第６，１８７，７４２号および同第６，１９０，８８０号が挙げられるがこれらに限定されない。ＢＭＰ−２は、組換え的に産生され得る（組換えヒト骨形成−２（ｒｈＢＭＰ−２）タンパク質）か、またはタンパク質組成物から精製され得る。ＢＭＰ−２は、ホモダイマーであり得るか、または他のＢＭＰ（ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６の各々１つのモノマーから構成されるヘテロダイマーが挙げられるがこれらに限定されない）とのヘテロダイマーであり得るか、もしくはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバー（アクチビン、インヒビンおよびＴＧＦ−β１）とのヘテロダイマー（ＢＭＰの各々の１つのモノマーから構成されるヘテロダイマーおよびＴＧＦ−βスーパーファミリーの関連するメンバーが挙げられるがこれらに限定されない）であり得る。これらのヘテロダイマー性タンパク質の例は、例えば公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０９２２９に記載され、この明細書は、本明細書中に参考として援用される。好ましいＢＭＰ−２は、米国特許第５，０１３，６４９号に開示されるＢＭＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。
【００３０】
ヒトＢＭＰ−２タンパク質は、米国特許第１９０，８８０ ６，１９０，８８０号の図１に開示されるアミノ酸配列またはＤＮＡ配列を含む。この図の内容は、その全体を参考として本明細書中に援用される。ヒトＢＭＰ−２タンパク質は、成熟ＢＭＰ−２サブユニットのジスルフィド連結されたダイマーおよびホモダイマーとしてさらに特徴付けられる。組換え発現されたＢＭＰ−２サブユニットは、異種アミノ末端を有するタンパク質種を含む。１つのＢＭＰ−２サブユニットは、米国特許第１９０，８８０ ６，１９０，８８０号の図１（特に、図中の配列番号１および２を参照のこと）のアミノ酸番号２４９（Ｓｅｒ）−−３９６（Ａｒｇ）を含むことによって特徴付けられる。別のＢＭＰ−２サブユニットは、米国特許第１９０，８８０ ６，１９０，８８０号の図１のアミノ酸番号２６６（Ｔｈｒ）−−３９６（Ａｒｇ）を含むことによって特徴付けられる。別のＢＭＰ−２サブユニットは、米国特許第１９０，８８０ ６，１９０，８８０号の図１のアミノ酸番号２９６（Ｃｙｓ）−−３９６（Ａｒｇ）を含むことによって特徴付けられる。成熟ＢＭＰ−２サブユニットは、米国特許第６，１９０，８８０号の図１のアミノ酸番号２８３（Ｇｌｎ）−−３９６（Ａｒｇ）を含むことによって特徴付けられる。この後者のサブユニットは、ＢＭＰ−２（米国特許第６，１９０，８８０号の図１）の組換え発現から生じる、現在最も豊富なタンパク質種である。しかし、産生されたＢＭＰ−２の特定の種の集団は、培養条件を操作することによって変更され得る。ＢＭＰ−２はまた、米国特許第６，１９０，８８０号の図１の配列の改変を含み得、この改変としては、他の変化の中で、アミノ酸番号２４１〜２８０の欠失およびアミノ酸番号２４５のアルギニンのＩｌｅへの変化が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
米国特許第６，１５０，３２８号（本明細書中に参考として援用される）において詳細に記載されるように、ヒトＢＭＰ−２は、ＢＭＰ−２で形質転換された細胞を培養し、上で同定されたタンパク質種の１つ以上を培養培地から回収し、そして精製することによって産生され得、共産生された他のタンパク質様物質を実質的に含まない。
【００３２】
（生物活性ＢＭＰ−２微粒子の調製）
生物活性ＢＭＰ−２微粒子を、ＢＭＰ−２を含有する溶液と、ＢＭＰ−２の沈澱を生じるイオン濃度およびｐＨを有する第二の溶液とを混合することによって、調製し得る。
【００３３】
第一の溶液中のＢＭＰ−２の濃度は、重要ではないが、この濃度は、好ましくは、沈澱の間に可能な凝集を排除するために十分に低い。他方で、この濃度は、好ましくは、可溶性ＢＭＰの高度な損失を回避するため、および不十分に小さいＢＭＰ−２の粒子の形成を回避するために、十分に高い。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ−２ポリペプチドは、第一の溶液において、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。ＢＭＰ−２についての好ましい濃度範囲は、０．７５ｍｇ／ｍｌ〜２．５ｍｇ／ｍｌである。望ましい場合、懸濁液が、さらに濃縮され得る。
【００３４】
第一の溶液のｐＨは、約１．５〜約８（例えば、約３〜約５、好ましくは、約４．２〜約４．８）である。言及されるｐＨは、約４．５である。好ましい第一の溶液は、５ｍＭのＬ−グルタミン酸、５ｍＭの塩化ナトリウム、０．５％のスクロース、２．５％のグリシン、０．０１％のポリソルベート８０（ｐＨ４．５）をさらに含有する。第二の溶液は、第一のＢＭＰ−２含有溶液と混合される場合に、第二の溶液との接触の際にＢＭＰ−２ポリペプチドの沈澱を生じる、既知のｐＨおよびイオン濃度を有する。ＢＭＰの溶解度は、イオン強度、他の塩および／または緩衝液の関数であるので、調節されたイオンの強度を有する緩衝液が使用され得る。第二の溶液が高いイオン強度の溶液である場合、沈澱は、広範なｐＨ範囲（ｐＨ４〜ｐＨ１０が挙げられるが、これに限定されない）にわたって実施され得る。しかし、好ましい目標ｐＨ（すなわち、第一の溶液および第二の溶液の混合から生じる溶液のｐＨ）は、約ｐＨ７．４である。第二の溶液が、第一の溶液の１０分の１の体積で提供される場合、ｐＨを４．５〜目標値の７．４に上昇させるために適切な組成は、１１２０ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのＮａＨＣＯ３、１１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５．５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、４０ｍＭのＮａＯＨ、および精製水を含有し、その結果、第二の溶液の相体積は、第一の溶液の１０％である。沈澱は、代表的に、時間に依存するプロセスであるので、混合された溶液は、所望の微粒子を得るために十分に長い時間にわたって、平衡にされる。
【００３５】
沈澱した微粒子は、好ましくは、当該分野において公知の方法を使用して濃縮される。好ましい方法は、遠心分離である。遠心分離条件は、微粒子の構造的一体性が損なわれないように選択される。
【００３６】
ＢＭＰ−２の第一の溶液または両方の沈澱溶液のいずれかは、適切なポリマー（ヒアルロン酸、コラーゲン、カルメロースナトリウム（ｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ ｓｏｄｉｕｍ）、ポリビニルアルコール、キトサンまたはカチオン性デンプンが挙げられるが、これらに限定されない）を含有し得る。
【００３７】
望ましい場合、微粒子は、凍結乾燥され得る。一般に、当該分野において公知の任意の凍結乾燥方法が使用され得る。例えば、凍結乾燥は、凍結または乾燥させることによって、実施され得る。凍結のためには、衝撃凍結または通常の凍結のいずれかが使用され得る。凍結のための好ましい処方は、液体窒素中への微粒子の９０秒間の浸漬であり、その後、凍結したバイアルが−８０℃で貯蔵される。
【００３８】
凍結乾燥した微粒子を生成するための適切な乾燥レジメンは、一次乾燥段階および二次乾燥段階を包含する。一次乾燥段階において、ＢＭＰ−２粒子含有バイアルは、減圧の非存在下で−３０℃で平衡化される。次いで、バイアルが１ｍｂａｒで２４〜４８時間、−３０℃に維持される。二次乾燥段階において、このバイアルは、０．０４ｍｂａｒの圧力で２時間以内、２０℃に加熱され、次いで、さらに５時間、同じ温度および圧力にされる。
【００３９】
ＢＭＰ−２ポリペプチドの構造的一体性は、当該分野において公知の方法を使用して実施され得る。例えば、分析は、フーリエ変換赤外分光学を介して実施され得る。さらに、粒子を再溶解した後に、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ペプチドマッピングを実施して、ＢＭＰ−２ポリペプチドの構造的一体性を検証し得る。非対称場のフロー分別が挙げられる技術を使用して、ＢＭＰ−２微粒子の溶解の程度を決定し得る。
【００４０】
ＢＭＰ−２微粒子は、好ましくは、生物活性な形態で提供される。生物活性とは、ＢＭＰ−２が、再可溶化された場合に、ＢＭＰ−２ポリペプチドに関連する少なくとも１つの生物学的化性を維持することを意味する。例えば、ＢＭＰ−２タンパク質は、骨形成を誘導する能力によって特徴付けられ得る。ヒトＢＭＰ−２はまた、Ｗ２０バイオアッセイにおいてインビトロ活性を有する（米国特許第６，１９０，８８０号およびそこに記載される参考文献を参照のこと）。ヒトＢＭＰ−２は、軟骨形成を誘導する能力によって、さらに特徴付けられ得る。ヒトＢＭＰ−２は、上記出願に記載されるラット骨形成アッセイにおいて、軟骨および／または骨の形成を示す能力によって、さらに特徴付けられ得る。
【００４１】
望ましい場合、ＢＭＰ−２微粒子は、ポリマーキャリアに会合して提供され得る。いくつかの実施形態において、このポリマーキャリアは、生分解性である。このポリマーキャリアは、天然または合成であり得る。適切な生分解性キャリアとしては、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエチレン酢酸ビニル、またはナイロンが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーキャリアは、除放マトリックスを提供するように処方され得る。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌグルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される、注射可能なマイクロスフィア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短期間でタンパク質を放出する。適切な天然ポリマーキャリアとしては、コラーゲン、キトサン、ヒアルロン酸、およびセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。望ましい場合、微粒子は、治療量の少なくとも１種のさらなる骨形成タンパク質、あるいは骨および／もしくは軟骨の欠損、損傷、または問題の組織の処置のために有用な別の薬剤を含有し得る。これらの薬剤としては、種々の増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ））が挙げられる。
【００４２】
種々のサイズのＢＭＰ−２微粒子が、それらの製造において使用される条件を変化させることによって、調製され得る。種々の実施形態において、微粒子は、約０．１μｍ〜約２０００μｍの直径を有する。例えば、適切な微粒子直径は、０．５μｍ〜約１５００μｍ、１μｍ〜約１０００μｍ、５μｍ〜約７５０μｍ、１０μｍ〜約５００μｍ、１５μｍ〜約２５０μｍ、２５μｍ〜約１２５μｍ、および３７μｍ〜約７５μｍの範囲であり得るが、これらに限定されない。他の適切な範囲としては、０．５μｍ〜約１４０μｍ、５μｍ〜約８５μｍ、約１５μｍ〜約７５μｍ、または約２５μｍ〜約５０μｍが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
微粒子のサイズは、当該分野において公知の方法およびデバイスを使用して、評価され得る。これらとしては、ＭＡＳＴＥＲＳＩＺＥＲ（登録商標）Ｘ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、粒子の濃度は、４〜５ｍｌのサンプルセル体積に対して最適化される。
【００４４】
ＢＭＰ−２微粒子は、これらを水溶液中に入れることによって、再溶解または再懸濁され得る。処方物緩衝液は、好ましくは、生理学的濃度またはその近くのナトリウムおよびイオンを含有する。水性懸濁液の適切な組成は、１０７ｍＭのＮａＣｌ、２７ｍＭのＮａＨＣＯ３、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＮａ２ＳＯ４を含有する。
【００４５】
（ＢＭＰ−２微粒子を含有する薬学的組成物およびＢＭＰ−２微粒子を使用する方法）
ＢＭＰ−２微粒子は、種々の適応症を処置するための薬学的組成物を調製するために使用され得る。いくつかの実施形態において、微粒子は、合成され、そして水性懸濁液において利用される。他の実施形態において、薬学的組成物は、被験体への送達の直前に微粒子を再懸濁させることによって、調製される。望ましい場合、ＢＭＰ−２粒子は、その意図される作用部位に、粉末として、直接局所的な適用で送達され得る。ＢＭＰ−２微粒子は、さらに、所望であれば、他の非水性ビヒクル（油または生体適合性有機溶媒が挙げられるが、これらに限定されない）中での懸濁液として送達され得る。
【００４６】
本発明のＢＭＰ−２微粒子ベースの薬学的組成物および治療方法は、ＢＭＰ−２タンパク質を溶液に導入する際に起こる、ＢＭＰ−２の再可溶化または再懸濁を利用する。従って、本発明は、再可溶化または再懸濁されたＢＭＰ−２ポリペプチドを含有する水性ＢＭＰ−２懸濁液を提供すること、およびこの水性懸濁液を、この被験体におけるＢＭＰ−２レベルを上昇させるために十分な量で、この被験体に導入することによって、被験体における骨形態タンパク質−２（ＢＭＰ−２）のレベルを上昇させる方法を包含する。ＢＭＰ−２レベルの上昇は、投与後の被験体においてＢＭＰ−２ポリペプチドのレベルを評価することによって、決定され得る。ＢＭＰ−２レベルは、試薬（抗ＢＭＰ−２抗体が挙げられるが、これに限定されない）を使用して、直接決定され得る。いくつかの実施形態において、５×１０２倍、１×１０３倍、１×１０４倍、１×１０５倍、または１×１０６倍、あるいはそれより大きい、ＢＭＰ−２レベルの上昇が、投与後に起こる。
【００４７】
好ましくは、ＢＭＰ−２タンパク質レベルの上昇は、治療有効量である。治療有効量は、ＢＭＰ−２タンパク質での処置から利益を受けることが既知の条件における改善を同定することによって、決定され得る。例えば、ＢＭＰ−２タンパク質は、軟骨および／または骨の形成を誘導する能力によって、ならびに米国特許第５，０６６，０５８号に記載されるラット骨形成アッセイにおいて軟骨および／または骨の形成を示す能力によって、さらに特徴付けられる。好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、このラット骨形成アッセイにおいて、０．５μｇ〜１００μｇ／骨のグラム数の濃度で、活性を示す。より好ましい実施形態において、これらのタンパク質は、このアッセイにおいて、１μｇ〜５０μｇ／骨のグラム数の濃度で、活性を示す。より好ましくは、これらのタンパク質は、１μｇのタンパク質が、米国特許第５，０６６，０５８号の実施例ＶＩＩに記載される改変されたスコア付けを使用して、実施例ＩＩＩに記載されるラット骨形成アッセイにおいて、少なくとも＋１のスコアを有することによって特徴付けられ得る。
【００４８】
ＢＭＰ−２微粒子から再懸濁または再可溶化されたＢＭＰ−２タンパク質を含有する水性懸濁液は、水溶液に、沈澱した生物活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含有する微粒子を導入すること、および沈澱したＢＭＰ−２タンパク質を再可溶化させることによって、調製され得る。
【００４９】
他の実施形態において、微粒子は、凍結乾燥された微粒子として水性懸濁液に導入される。
【００５０】
ＢＭＰ−２微粒子およびその懸濁液は、骨折ならびに軟骨および／または骨の欠損または歯周病に関連する他の状態を修復するための方法ならびに組成物において、使用され得る。さらに、本発明は、創傷治癒および組織修復のための、治療方法および組成物を包含する。このような組成物は、微粒子由来の治療有効量のＢＭＰ−２ポリペプチドを、薬学的に受容可能なビヒクル、キャリアまたはマトリックスとの混合物中で含有する。微粒子から放出されるＢＭＰ−２ポリペプチドは、他の関連するタンパク質および増殖因子と協奏的に、またはおそらく相乗的に作用し得る。
【００５１】
ＢＭＰ−２微粒子は、治療量の少なくとも１種のさらなる骨形成タンパク質と共に使用され得る。さらに、ＢＭＰ−２微粒子は、骨および／または軟骨の欠損、創傷または問題の組織の処置のために有利な、他の薬剤と混合され得る。この薬剤としては、種々の増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ））が挙げられる。このような生理学的に受容可能なタンパク質組成物の調製および処方（ｐＨ、等張性、安定性などに対する当然の考慮を有する）は、当該分野の技術範囲内である。治療組成物はまた、獣医学の応用に対して、現在価値がある。特に、ヒトに加えて家畜動物および純血種のウマは、微粒子から調製されたＢＭＰ−２の微粒子または処方物を含有する治療組成物でのこのような処置のために望ましい患者である。
【００５２】
さらなる適応症としては、歯周病の処置、および他の歯の修復プロセスが挙げられる。このような薬剤は、骨形成細胞を誘引する環境を提供し得るか、骨形成細胞の成長を刺激し得るか、または骨形成細胞の子孫の分化を誘導し得る。さらなる適応症としては、骨粗鬆症、ニューロンの生存の増加が望ましい状態、創傷治癒および関連する組織修復が挙げられる。創傷の型としては、火傷、切開および潰瘍が挙げられるが、これらに限定されない。（創傷治癒および関連組織修復の議論について、本明細書中に参考として援用される、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６を参照のこと）。
【００５３】
治療方法は、ＢＭＰ−２微粒子（または再懸濁されたＢＭＰ−２微粒子から調製された処方物）を投与する工程を包含する。本発明の薬学的組成物は、意図される投与経路と適合性の処方物である。投与の様式は、生物活性薬剤および意図される適用部位に基づいて、選択される。再可溶化または再懸濁される場合、ＢＭＰ−２微粒子の使用は、全身的または局所的であり得る。投与経路の例としては、局所、非経口（静脈内、皮内、皮下が挙げられるが、これらに限定されない）、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、ならびに直腸投与が挙げられる。局所、非経口、皮内、または皮下の適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含有し得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）；等張性を調節するための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖）；および界面活性剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、またはポリソルベート８０）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多用量バイアルに収容され得る。投与が全身である場合、ＢＭＰ−２微粒子、またはＢＭＰ−２微粒子を含有するかもしくはＢＭＰ−２に由来する組成物は、被験体における所望の部位の標的化および／またはその部位での保持を容易にする、会合した物質をさらに含有し得る。
【００５４】
注射可能用途に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性である場合）、または分散物、および滅菌注射用溶液および分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、無菌でなければならず、そして容易にシリンジ中に存在する程度まで流動性でなければならない。この組成物は、製造条件および貯蔵条件下で安定であるべきであり、かつ微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用から保護されるべきである。このキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散媒体、ならびにそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レクチン）を使用することによって、分散物の場合は、必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）がこの組成物中に含まれることが好ましい。注射可能組成物の延長した吸収は、この組成物中に、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによって、もたらされ得る。
【００５５】
滅菌注射用溶液は、活性化合物（ＢＭＰ−２微粒子から再可溶化または再懸濁されたＢＭＰ−２タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）を、必要な量で、上で列挙された成分の１つまたはこれらの成分の組合せを含む適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて滅菌濾過することによって、調製され得る。
【００５６】
この薬学的組成物は、容器、パック、またはディスペンサ中に、投与のための指示書と共に含まれ得る。
【００５７】
再懸濁または再可溶化された生体活性剤を含む経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセル中に封入され得るか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ得、そして錠剤、トローチまたはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための液体キャリアを使用して調製され得、ここで、流体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、そしてかみ砕かれ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるかまたは嚥下される。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは、以下の成分または類似の性質の化合物のうちの任意のものを含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；滑沢剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【００５８】
生体活性剤の吸入による投与について、これらの化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のようなガス）を含む加圧容器またはディスペンサ、あるいはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００５９】
全身投与はまた、経粘膜投与または経皮投与により得る。経粘膜投与または経皮投与について、透過されるバリアに適切な透過剤が、処方物において使用される。このような透過剤は、一般に当該分野で公知であり、これには、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフジシン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成される。経粘膜投与について、活性化合物は、当該分野で一般的に公知のような軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔまたはｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリームに処方される。
【００６０】
これらの化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、従来の坐剤基剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドを含む）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【００６１】
投与される場合、本発明における使用のための薬学的組成物は、代表的に、発熱物質を含まない薬学的に受容可能な形態で送達される。さらに、この組成物は、望ましくは、骨の軟骨または組織の損傷の部位に送達するために、粘性形態でカプセル化されるかまたは注射され得る。局所投与は、創傷治癒および組織修復のために適切であり得る。好ましくは、骨および／または軟骨の形成について、この組成物は、ＢＭＰタンパク質を骨および／または軟骨の損傷部位に送達し得、骨および軟骨を発達させるための構造を提供し得、そして必要に応じて身体に再吸収され得るマトリクスを含む。このようなマトリクスは、他の移植された医療適用のために現在使用される材料から形成され得る。
【００６２】
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、表面的な外見および界面特性に基づく。ＢＭＰ−２組成物の特定の適用は、適切な処方物を規定する。この組成物に潜在的な材料は、生分解性で化学的に規定された、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の潜在的な材料（例えば、骨または皮膚のコラーゲン）は、生分解性であり、生物学的に十分に規定されている。さらなるマトリクスは、純タンパク質または細胞外マトリクス成分から構成される。他の潜在的なマトリクス（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミック）は、非生分解性であり、化学的に規定されている。マトリクスは、上記のタイプの材料の任意のものの組合せ（例えば、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンとリン酸三カルシウム）から構成され得る。バイオセラミックの組成は変更され得る（例えば、カルシウム−アルミン酸塩−リン酸塩）、そして孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状および生分解性を変更するように処理される。
【００６３】
投薬レジメンは、担当の医師により、ＢＭＰ−２タンパク質の作用を変更する種々の要因を考慮して決定される。これらの要因としては、形成されることが所望される骨の重量、骨の損傷部位、損傷した骨の状態、創傷のサイズ、損傷した組織の型、患者の年齢、性別および食餌、任意の感染の重篤度、投与時間および他の臨床的要因が挙げられるが、これらに限定されない。投薬量は、再構築に使用されるマトリクスの型と共に変化し得る。他の公知の成長因子（例えば、ＩＧＦＩ（インシュリン様成長因子Ｉ））の最終組成物への添加はまた、投薬量に影響を与え得る。進行は、骨の成長および／または修復の定期的な評価によってモニタリングされ得る。骨の成長または修復を評価する１つの方法は、Ｘ線画像化による方法である。
【００６４】
本発明は、以下の非限定的な実施例でさらに例示される。
【実施例】
【００６５】
（実施例１：ＢＭＰ−２微粒子の調製）
ＢＭＰ−２微粒子を、ＢＭＰ−２タンパク質を含む第１の溶液と、第２の沈殿溶液とを混合することによって調製する。
【００６６】
この第１の溶液は、ｒｈＢＭＰ−２を、０．１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、ｐＨ ４．５である。第２の溶液は、１０分の１の容量（第１の溶液の容量に対して）で添加された際、ＢＭＰ−２タンパク質が沈殿し、そして合わせた溶液の最終ｐＨがｐＨ７．４になるように処方される。この第２の溶液は、１１２０ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのＮａＨＣＯ３、１１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５．５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、４０ｍＭのＮａＯＨおよび純水を含む。
【００６７】
沈殿を、１０％（容量／容量）の沈殿溶液（これは、生理学的塩およびｐＨ調整剤の両方を含む）を添加することによって実施する。この沈殿は、必要な容量に依存して、滅菌チューブ（１５または５０ｍｌ）中で実施される。ＢＭＰストック溶液で５０ｍｌのチューブを満たすことは、撹拌を使用することによって流動溶液を作製するために十分な空間を有するために、３０ｍｌに制限される。
【００６８】
迅速かつ均一な分布を達成するために、流動ＢＭＰバルク溶液を、沈殿溶液の添加の１０秒前の撹拌によって、および沈殿溶液の添加の１０秒後の撹拌によって作製する。さらに、５０ｍｌのチューブバッチにおいて、元のキャップを、全直径約３ｍｍの中心を有するキャップと交換して、沈殿溶液をピペッティングする。沈殿溶液を添加した後、このチューブを、元のキャップで密閉し、そして所望の時間の間平衡化する（実施例２を参照のこと）。
【００６９】
次いで、ＢＭＰ−２微粒子を、遠心分離によって濃縮し、その後、これらの微粒子を凍結乾燥する。
【００７０】
（実施例２．ＢＭＰ−２微粒子サイズの評価）
ＢＭＰ−２微粒子の直径を、ＭＡＬＶＥＲＮ ＭＡＳＴＥＲＳＩＺＥＲ Ｘ（登録商標）機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して、４〜５ｍｌの容量に対して設計されたサンプルセルを用いて、評価した。ｒｈＢＭＰ−２溶液とストック溶液の混合を使用して、生理学的塩濃度を作成した。
【００７１】
種々の時間の間の平衡化に供された微粒子の集団中の粒子直径の範囲を、図１〜３に示す。図１は、１０分未満の間平衡化された微粒子の、２つのバッチにおいて得られたサイズ分布を示す。ほとんどの粒子の直径は、１０μｍより小さく、ピークは、直径５μｍ〜６μｍの微粒子でピークが検出された。
【００７２】
図２は、１０分と１１０分との間平衡化された微粒子の３つのバッチについて得られたサイズ分布を示す。６μｍ〜９μｍが、最も一般的なサイズ範囲であるが、図１で観察された分布と比較して、１０μｍより大きい直径を有するより多数の微粒子が、観察された。
【００７３】
図３は、１６０分までの間平衡化された粒子の４つのバッチを使用した結果を示す。最も一般的なサイズ範囲は、６μｍ〜９μｍであるが、第２のピークが、３０μｍ〜４０μｍのサイズ範囲で検出される。
【００７４】
これらの結果は、１〜１００μｍの範囲の微粒子が、これらの研究で得られることを示し、そして最大約６±１μｍおよび３１±５μｍの二峰性分布を示した。
【００７５】
粒子サイズに対する遠心分離の影響を決定した。以下の３つの条件下における遠心分離の後の結果を、図４に示す：２３０Ｇで１５分；２５５０Ｇで１０分、または３９９０Ｇで１５分。これらの研究において、粒子サイズは、後の遠心分離によってわずかにしか影響を受けなかった。
【００７６】
微粒子サイズに対する凍結乾燥の影響を試験した。凍結乾燥の程度を、乾燥速度および累積的水分損失を測定することによって評価した。凍結乾燥の程度を、図５に示す。粒子サイズに対する凍結乾燥の影響を、図６に示す。凍結乾燥は、３５μｍのｄ５０値および８５μｍのｄ９０値を有する広い単峰性分布への変化を引き起こした。
【００７７】
多量（７２０ｍｇ）のタンパク質を含む溶液を使用して得られた粒子サイズを試験した。粒子サイズを、沈殿、遠心分離および凍結乾燥の後に決定した。その結果を、図７に示す。遠心分離および凍結乾燥は、沈殿のみに供された微粒子の直径と比較して、微粒子の直径における変化を引き起こした。
【００７８】
ＢＭＰ−２含有溶液と沈殿溶液との混合を、インターデジタルシグナル混合デバイス（ＭＩＣＲＯＭＩＸＥＲ（登録商標）デバイス、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ，Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。このデバイスは、薄い壁を有するラメラを介する拡散を使用して、少ない容量の組合せを可能にする。平衡化を、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、および２．５ｍｇ／ｍｌのＢＭＰ−２濃度を使用して、２０〜４８０分間実施した。直径分布を、図８に示す。３つ全ての濃度について、二峰性のサイズ分布が得られ、ここで、ピークは、約６〜９μｍ付近であり、第２のより広い分布は、約４０〜６０μｍに中心があった。
【００７９】
タンパク質の完全性を、微粒子の溶解後に分析した。ＢＭＰ−２は、溶解後、インタクトであることが見出された。
【００８０】
（他の実施形態）
示される記載は、例示することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。上記の本発明は、ＢＭＰ−２を参照して記載されているが、本明細書中に記載される方法が、他の生体活性剤のための微粒子、およびこれらの微粒子に基づく薬学的組成物を作製するために使用され得ることが理解される。これらの生体活性剤としては、さらなる骨形成タンパク質、トランスフォーミング成長因子−βスーパーファミリーのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。この方法はまた、ＢＭＰ−２と類似した溶解性およびｐＩ特性を有する治療用ポリペプチドを含む微粒子を作製するために使用され得る。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、骨形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質−２（ＢＭＰ−２）のような生体活性因子を含有する組成物ならびにこれらの組成物を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
治療剤として使用されるタンパク質は、代表的に、薬学的組成物として提供され、例えば、タンパク質の特性およびそれが患者に導入される様式に依存して変化し得る。
【０００３】
タンパク質の不安定性は、これらの薬学的組成物の調製における主要な問題点であり得る。薬学的処方物の調製の間のタンパク質に対する望まれないストレスは、タンパク質変性、沈殿、または表面に対する吸着のような望まれない効果を生じ得る。
【０００４】
骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含有する薬学的組成物は、非常に興味深い。なぜなら、このタンパク質は、骨成長の開始および創傷治癒の促進のような種々の生物学的に重要なプロセスに関与することが示されてきたからである。例えば、ＢＭＰ−２は、脛骨、顎顔面骨、および脊髄骨に関連する障害を含む、種々の骨関連障害を処置するかまたは予防するために使用されてきた。
【０００５】
ＢＭＰ−２は、トランスホーミング増殖因子βスーパーファミリーのメンバーである。成熟タンパク質は、３２キロダルトン（ｋＤａ）のジスルフィド連結されたホモダイマー糖タンパク質である。ＢＭＰ−２は、水中で限られた溶解度を示す。この限られた溶解度は、このタンパク質を含有する薬学的組成物を開発するための試みを妨げ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、沈殿した生体活性因子を含有する微粒子（ｍｉｃｏｒｐａｒｔｉｃｌｅ）が、被験体に対する投与の前に、都合よく調製され、そして水溶液中に再懸濁され得るという発見に、一部基づく。本明細書中に開示される例示的な生体活性因子は、ＢＭＰ−２タンパク質である。ＢＭＰ−２ポリペプチドは、生体活性形態で水溶液中に再溶解されるかまたは再懸濁されるかのいずれかであり得、従って、再溶解されるかまたは再懸濁されるＢＭＰ−２微粒子は、ＢＭＰ−２が、有効であると示された障害または状態を処置または予防するために使用され得る。
【０００７】
所望される場合、添加された沈殿溶液のＢＭＰ−２溶液は、適切な生体分解性ポリマーを含み得、この生体分解性ポリマーとしては、ヒアルロン酸、コラーゲン、カルメロース（ｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、ポリビニルアルコール、キトサンまたはカチオン性デンプンが挙げられるが、これらに限定されない。従って、１つの局面において、本発明は、沈殿された生体活性骨形成タンパク質を含む精製された微粒子を提供する。好ましい骨形成タンパク質は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ−２タンパク質は、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸配列を有し、そして／または組換え発現されたタンパク質である。好ましいＢＭＰ−２タンパク質は、組換えヒトＢＭＰ−２タンパク質（ｒｈＢＭＰ−２）である。微粒子は、骨欠損および／もしくは軟骨欠損、創傷、または組織の処置に対して有益なさらなる因子を、さらに含有し得る。
【０００８】
種々の実施形態において、微粒子は、約０．１μｍ〜２０００μｍの直径を有する。例えば、適切な微粒子直径は、０．５μｍから約１５００μｍ、１μｍから約１０００μｍ、５μｍから約７５０μｍ、１０μｍから約５００μｍ、１５μｍから約２５０μｍ、２５μｍから約１２５μｍ、および３７μｍから約７５μｍの範囲にわたり得るが、これらに限定されない。他の適切な範囲は、０．５μｍから約１４０μｍ、５μｍから約８５μｍ、約１５μｍから約７５μｍ、または約２５μｍから約５０μｍが挙げられるがこれらに限定されない。
【０００９】
所望の場合、ＢＭＰ−２微粒子は、凍結乾燥された処方物として提供され得る。いくつかの実施形態において、微粒子は、水性処方物として提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、微粒子は、ポリマーキャリアと共同して提供される。ポリマーキャリアは、好ましくは、生体分解性である。
【００１１】
適切なポリマーキャリアとしては、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエチレンビニルアセテート、またはナイロンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１２】
沈殿された生体活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）微粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物はまた、本発明内に含まれる。薬学的組成物はまた、好ましくは、再溶解されたＢＭＰ−２タンパク質を含む。
【００１３】
被験体における骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）レベルを上昇させる方法がまた、本発明によって特徴付けられる。本方法は、再溶解されたＢＭＰ−２ポリペプチドを含む水性ＢＭＰ−２懸濁物を提供する工程を包含し、この水性ＢＭＰ−２懸濁物は、被験体におけるＢＭＰ−２レベルを増大するのに十分な量で被験体に水性懸濁物を導入する。
【００１４】
好ましい実施形態において、水性懸濁物は、沈殿された生体活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含む微粒子を、水溶液に導入することによって調製され、沈殿されたＢＭＰ−２タンパク質が、懸濁物を形成するかまたは再溶解され、それによって、水性ＢＭＰ−２懸濁物を調製する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、微粒子は、凍結乾燥された微粒子として水性懸濁物に導入される。
【００１６】
被験体は、好ましくは、哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、またはネコが挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００１７】
ＢＭＰ−２微粒子、または再溶解された微粒子を含有する処方物の投与は、任意の所望の経路を介し得る。例えば、投与は、ＢＭＰ−２レベルの上昇が所望される部位で、局所的であり得る。
【００１８】
骨関連障害は、ＢＭＰ−２微粒子、または再溶解された微粒子を含有する処方物が使用され得る適応症である。例えば、適切な被験体は、骨折しているかまたは骨折の危険にある。骨としては、脛骨、口／顎顔面骨、または脊髄骨が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００１９】
さらなる適応症としては、歯周疾患、および他の歯修復プロセスの処置が挙げられる。このような薬剤は、骨形成細胞を誘引する環境、骨形成細胞の増殖を刺激する環境または骨形成細胞の前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の分化を誘導する環境を提供し得る。さらなる適応症としては、骨粗鬆症、ニューロン生存の上昇が所望される疾患、創傷治癒、および関連する組織修復が挙げられる。この型の創傷としては、火傷、切開、および潰瘍が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２０】
生体活性ＢＭＰ−２微粒子の集団を作製する方法もまた、本発明内にある。本方法は、ＢＭＰ−２ポリペプチドを含む第１の溶液を提供する工程、この第１の溶液を既知のｐＨおよびイオン強度を有する第２の溶液と混合する工程であって、第２の溶液と接触する際に、この第２の溶液が、ＢＭＰ−２ポリペプチドの沈殿を生じる工程、それによって混合された第１の溶液および第２の溶液を形成する工程を包含する。ＢＭＰ−２ポリペプチドは、沈殿させられ、それによって、ＢＭＰ−２微粒子の集団を形成する。
【００２１】
ＢＭＰ−２タンパク質は、好ましくは、約０．１〜約２０ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌ、または約０．７５〜約２．５ｍｇ／ｍｌ）の濃度で第１の溶液中に存在する。第１の溶液は、約１．５〜８のｐＨ（例えば、約３〜５、または約４．２〜４．８）で提供される。特に好ましいｐＨは、約４．５である。混合を容易にするために、第１の溶液は、第２の溶液と混合される場合、乱流溶液として提供され得る。
【００２２】
混合された第１の溶液および第２の溶液の最終ｐＨは、好ましくは約４．０〜約１０．０である。より好ましいｐＨ範囲は、約５．０〜約９．５、または約６．０〜約９．０である。混合された第１の溶液および第２の溶液の特に好ましい最終ｐＨは、約７．４である。
【００２３】
所望される場合、ＢＭＰ−２微粒子は、濃縮され得る。濃縮の方法は、遠心分離および濾過が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００２４】
約７．４のｐＨは、合わせた第１の溶液および第２の溶液について目標とされる場合、この第２の溶液は、混合された第１の溶液および第２の溶液のイオン強度が、５〜１０００ｍＭの範囲にあり、より好ましくは、２０〜３５０ｍＭ、例えば、以下の組成物について約１４０ｍＭであるように処方される：１０７ｍＭ ＮａＣｌ、２７ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１．０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４。
【００２５】
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が所属する当該分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および物質と類似するかまたは等価である方法および物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および物質が、以下に記載される。本明細書中に示される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考は、その全体を参考として援用される。矛盾の場合、定義を含む本明細書は、制御する。さらに、物質、方法、および実施例は、例示のみであり、限定することを意図されない。
【００２６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２７】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
沈殿した生体活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含む、精製微粒子。
（項目２）
上記ＢＭＰ−２が、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸配列を有する、項目１に記載の微粒子。
（項目３）
上記ＢＭＰ−２が、組換え的に発現されたタンパク質である、項目１に記載の微粒子。
（項目４）
上記ＢＭＰ−２が、組換え的に発現されたタンパク質である、項目２に記載の微粒子。
（項目５）
上記微粒子が、約０．１μｍ〜約２０００μｍの直径を有する、項目１に記載の微粒子。
（項目６）
上記微粒子が、約５μｍ〜約７５０μｍの直径を有する、項目１に記載の微粒子。
（項目７）
上記微粒子が、約１５μｍ〜約２５０μｍの直径を有する、項目１に記載の微粒子。
（項目８）
上記微粒子が、約２５μｍ〜約５０μｍの直径を有する、項目１に記載の微粒子。
（項目９）
上記微粒子が、凍結乾燥処方物として提供される、項目１に記載の微粒子。
（項目１０）
上記微粒子が、水性処方物として提供される、項目１に記載の微粒子。
（項目１１）
上記微粒子が、ポリマーキャリアと結合して提供される、項目１に記載の微粒子。
（項目１２）
上記ポリマーキャリアが、生分解性である、項目１１に記載の微粒子。
（項目１３）
上記ポリマーキャリアが、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエチレンビニルアセテート、またはナイロンである、項目１１に記載の微粒子。
（項目１４）
沈殿した生体活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）微粒子および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１５）
再可溶化されたＢＭＰ−２タンパク質をさらに含む、項目１４に記載の薬学的組成物。
（項目１６）
被験体において、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）レベルを増加する方法であって、その方法は、
再可溶化されたＢＭＰ−２ポリペプチドを含む水性ＢＭＰ−２懸濁液を提供する工程；および
その被験体に、その被験体においてＢＭＰ−２レベルを増加するために十分な量で、その水性懸濁液を導入する工程、
を包含する、方法。
（項目１７）
上記水性懸濁液が、
水溶液に、沈殿した生体活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含む微粒子を導入する工程；および
その沈殿したＢＭＰ−２タンパク質が、再可溶化し、それにより、上記水溶性ＢＭＰ−２懸濁液を調製する工程、
により調製される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記微粒子が、上記水性懸濁液に、凍結乾燥微粒子として導入される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
上記被験体がヒトである、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
上記投与が、ＢＭＰ−２レベルの増加が所望される部位に、局所的である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
上記被験体が骨の破損を有するか、または骨の破損の危険がある、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
上記骨が脛骨である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記骨が口／顎顔面の骨である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
上記骨が脊髄骨である、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
生体活性ＢＭＰ−２微粒子の集団を作製する方法であって、その方法は、
約０．７５ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度、約４．２〜約４．８のｐＨで、ＢＭＰ−２ポリペプチドを含む、第１の溶液を提供する工程；
その第１の溶液と既知のｐＨおよびイオン濃度を有する第２の溶液を混合する工程であって、この工程は、その第２の溶液と接触する際、ＢＭＰ−２ポリペプチドの沈殿を生じ、それにより、その第１の溶液およびその第２の溶液の混合物を形成する工程；および
そのＢＭＰ−２ポリペプチドを沈殿させ得る工程であって、それにより、そのＢＭＰ−２微粒子の集団の形成する工程、
を包含する、方法。
（項目２６）
上記ＢＭＰ−２微粒子を濃縮する工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
上記第１の溶液および上記第２の溶液が、１０：１の相対容量で混合される、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
上記第１の溶液が、約ｐＨ４．５を有する、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
上記第１の溶液が、上記第２の溶液と接触する場合、乱流溶液である、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ１０．０を有する、項目２５に記載の方法。
（項目３１）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、約ｐＨ７．４を有する、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、１０７ｍＭ ＮａＣｌ、２７ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１．０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４である、項目２５に記載の方法。
（項目３３）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、約５ｍＭ〜約１０００ｍＭのイオン強度を有する、項目２５に記載の方法。
（項目３４）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、約２０ｍＭ〜約２５０ｍＭのイオン強度を有する、項目２５に記載の方法。
（項目３５）
上記混合された第１の溶液および第２の溶液が、約１４０ｍＭのイオン強度を有する、項目２５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、１０分未満の形成期間の間に形成されるＢＭＰ−２微粒子の粒子直径分布を示すグラフである。
【図２】図２は、１０〜１１０分の形成期間の間に形成されるＢＭＰ−２微粒子の粒子直径分布を示すグラフである。
【図３】図３は、１６０分までの形成期間の間に形成されるＢＭＰ−２微粒子の粒子直径分布を示すグラフである。
【図４】図４は、ＢＭＰ−２粒子直径に対する遠心分離の影響を示すグラフである。
【図５】図５は、凍結乾燥に供された微粒子の、経時的な乾燥速度および累積的水損失を示すグラフである。
【図６】図６は、ＢＭＰ−２粒子直径に対する凍結乾燥の影響を示すグラフである。
【図７】図７は、７２０ｍｇのＢＭＰ−２微粒子調製物における粒子直径分布を示すグラフである。
【図８】図８は、微量混合デバイスを使用して調製されるＢＭＰ−２微粒子の直径分布を示すグラフである。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明のＢＭＰ−２微粒子は、ＢＭＰ−２タンパク質の任意の都合の良い供給源を使用して形成される。ＢＭＰ−２タンパク質は、当該分野で公知であり、いくつかの特許、特許出願、刊行物において開示される。代表的な特許としては、米国特許第５，０１３，６４９号、同第６，１５０，３２８号、同第６，１８７，７４２号および同第６，１９０，８８０号が挙げられるがこれらに限定されない。ＢＭＰ−２は、組換え的に産生され得る（組換えヒト骨形成−２（ｒｈＢＭＰ−２）タンパク質）か、またはタンパク質組成物から精製され得る。ＢＭＰ−２は、ホモダイマーであり得るか、または他のＢＭＰ（ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６の各々１つのモノマーから構成されるヘテロダイマーが挙げられるがこれらに限定されない）とのヘテロダイマーであり得るか、もしくはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバー（アクチビン、インヒビンおよびＴＧＦ−β１）とのヘテロダイマー（ＢＭＰの各々の１つのモノマーから構成されるヘテロダイマーおよびＴＧＦ−βスーパーファミリーの関連するメンバーが挙げられるがこれらに限定されない）であり得る。これらのヘテロダイマー性タンパク質の例は、例えば公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０９２２９に記載され、この明細書は、本明細書中に参考として援用される。好ましいＢＭＰ−２は、米国特許第５，０１３，６４９号に開示されるＢＭＰ−２ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。
【００３０】
ヒトＢＭＰ−２タンパク質は、米国特許第１９０，８８０ ６，１９０，８８０号の図１に開示されるアミノ酸配列またはＤＮＡ配列を含む。この図の内容は、その全体を参考として本明細書中に援用される。ヒトＢＭＰ−２タンパク質は、成熟ＢＭＰ−２サブユニットのジスルフィド連結されたダイマーおよびホモダイマーとしてさらに特徴付けられる。組換え発現されたＢＭＰ−２サブユニットは、異種アミノ末端を有するタンパク質種を含む。１つのＢＭＰ−２サブユニットは、米国特許第１９０，８８０ ６，１９０，８８０号の図１（特に、図中の配列番号１および２を参照のこと）のアミノ酸番号２４９（Ｓｅｒ）−−３９６（Ａｒｇ）を含むことによって特徴付けられる。別のＢＭＰ−２サブユニットは、米国特許第１９０，８８０ ６，１９０，８８０号の図１のアミノ酸番号２６６（Ｔｈｒ）−−３９６（Ａｒｇ）を含むことによって特徴付けられる。別のＢＭＰ−２サブユニットは、米国特許第１９０，８８０ ６，１９０，８８０号の図１のアミノ酸番号２９６（Ｃｙｓ）−−３９６（Ａｒｇ）を含むことによって特徴付けられる。成熟ＢＭＰ−２サブユニットは、米国特許第６，１９０，８８０号の図１のアミノ酸番号２８３（Ｇｌｎ）−−３９６（Ａｒｇ）を含むことによって特徴付けられる。この後者のサブユニットは、ＢＭＰ−２（米国特許第６，１９０，８８０号の図１）の組換え発現から生じる、現在最も豊富なタンパク質種である。しかし、産生されたＢＭＰ−２の特定の種の集団は、培養条件を操作することによって変更され得る。ＢＭＰ−２はまた、米国特許第６，１９０，８８０号の図１の配列の改変を含み得、この改変としては、他の変化の中で、アミノ酸番号２４１〜２８０の欠失およびアミノ酸番号２４５のアルギニンのＩｌｅへの変化が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
米国特許第６，１５０，３２８号（本明細書中に参考として援用される）において詳細に記載されるように、ヒトＢＭＰ−２は、ＢＭＰ−２で形質転換された細胞を培養し、上で同定されたタンパク質種の１つ以上を培養培地から回収し、そして精製することによって産生され得、共産生された他のタンパク質様物質を実質的に含まない。
【００３２】
（生物活性ＢＭＰ−２微粒子の調製）
生物活性ＢＭＰ−２微粒子を、ＢＭＰ−２を含有する溶液と、ＢＭＰ−２の沈澱を生じるイオン濃度およびｐＨを有する第二の溶液とを混合することによって、調製し得る。
【００３３】
第一の溶液中のＢＭＰ−２の濃度は、重要ではないが、この濃度は、好ましくは、沈澱の間に可能な凝集を排除するために十分に低い。他方で、この濃度は、好ましくは、可溶性ＢＭＰの高度な損失を回避するため、および不十分に小さいＢＭＰ−２の粒子の形成を回避するために、十分に高い。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ−２ポリペプチドは、第一の溶液において、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。ＢＭＰ−２についての好ましい濃度範囲は、０．７５ｍｇ／ｍｌ〜２．５ｍｇ／ｍｌである。望ましい場合、懸濁液が、さらに濃縮され得る。
【００３４】
第一の溶液のｐＨは、約１．５〜約８（例えば、約３〜約５、好ましくは、約４．２〜約４．８）である。言及されるｐＨは、約４．５である。好ましい第一の溶液は、５ｍＭのＬ−グルタミン酸、５ｍＭの塩化ナトリウム、０．５％のスクロース、２．５％のグリシン、０．０１％のポリソルベート８０（ｐＨ４．５）をさらに含有する。第二の溶液は、第一のＢＭＰ−２含有溶液と混合される場合に、第二の溶液との接触の際にＢＭＰ−２ポリペプチドの沈澱を生じる、既知のｐＨおよびイオン濃度を有する。ＢＭＰの溶解度は、イオン強度、他の塩および／または緩衝液の関数であるので、調節されたイオンの強度を有する緩衝液が使用され得る。第二の溶液が高いイオン強度の溶液である場合、沈澱は、広範なｐＨ範囲（ｐＨ４〜ｐＨ１０が挙げられるが、これに限定されない）にわたって実施され得る。しかし、好ましい目標ｐＨ（すなわち、第一の溶液および第二の溶液の混合から生じる溶液のｐＨ）は、約ｐＨ７．４である。第二の溶液が、第一の溶液の１０分の１の体積で提供される場合、ｐＨを４．５〜目標値の７．４に上昇させるために適切な組成は、１１２０ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのＮａＨＣＯ３、１１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５．５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、４０ｍＭのＮａＯＨ、および精製水を含有し、その結果、第二の溶液の相体積は、第一の溶液の１０％である。沈澱は、代表的に、時間に依存するプロセスであるので、混合された溶液は、所望の微粒子を得るために十分に長い時間にわたって、平衡にされる。
【００３５】
沈澱した微粒子は、好ましくは、当該分野において公知の方法を使用して濃縮される。好ましい方法は、遠心分離である。遠心分離条件は、微粒子の構造的一体性が損なわれないように選択される。
【００３６】
ＢＭＰ−２の第一の溶液または両方の沈澱溶液のいずれかは、適切なポリマー（ヒアルロン酸、コラーゲン、カルメロースナトリウム（ｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ ｓｏｄｉｕｍ）、ポリビニルアルコール、キトサンまたはカチオン性デンプンが挙げられるが、これらに限定されない）を含有し得る。
【００３７】
望ましい場合、微粒子は、凍結乾燥され得る。一般に、当該分野において公知の任意の凍結乾燥方法が使用され得る。例えば、凍結乾燥は、凍結または乾燥させることによって、実施され得る。凍結のためには、衝撃凍結または通常の凍結のいずれかが使用され得る。凍結のための好ましい処方は、液体窒素中への微粒子の９０秒間の浸漬であり、その後、凍結したバイアルが−８０℃で貯蔵される。
【００３８】
凍結乾燥した微粒子を生成するための適切な乾燥レジメンは、一次乾燥段階および二次乾燥段階を包含する。一次乾燥段階において、ＢＭＰ−２粒子含有バイアルは、減圧の非存在下で−３０℃で平衡化される。次いで、バイアルが１ｍｂａｒで２４〜４８時間、−３０℃に維持される。二次乾燥段階において、このバイアルは、０．０４ｍｂａｒの圧力で２時間以内、２０℃に加熱され、次いで、さらに５時間、同じ温度および圧力にされる。
【００３９】
ＢＭＰ−２ポリペプチドの構造的一体性は、当該分野において公知の方法を使用して実施され得る。例えば、分析は、フーリエ変換赤外分光学を介して実施され得る。さらに、粒子を再溶解した後に、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ペプチドマッピングを実施して、ＢＭＰ−２ポリペプチドの構造的一体性を検証し得る。非対称場のフロー分別が挙げられる技術を使用して、ＢＭＰ−２微粒子の溶解の程度を決定し得る。
【００４０】
ＢＭＰ−２微粒子は、好ましくは、生物活性な形態で提供される。生物活性とは、ＢＭＰ−２が、再可溶化された場合に、ＢＭＰ−２ポリペプチドに関連する少なくとも１つの生物学的化性を維持することを意味する。例えば、ＢＭＰ−２タンパク質は、骨形成を誘導する能力によって特徴付けられ得る。ヒトＢＭＰ−２はまた、Ｗ２０バイオアッセイにおいてインビトロ活性を有する（米国特許第６，１９０，８８０号およびそこに記載される参考文献を参照のこと）。ヒトＢＭＰ−２は、軟骨形成を誘導する能力によって、さらに特徴付けられ得る。ヒトＢＭＰ−２は、上記出願に記載されるラット骨形成アッセイにおいて、軟骨および／または骨の形成を示す能力によって、さらに特徴付けられ得る。
【００４１】
望ましい場合、ＢＭＰ−２微粒子は、ポリマーキャリアに会合して提供され得る。いくつかの実施形態において、このポリマーキャリアは、生分解性である。このポリマーキャリアは、天然または合成であり得る。適切な生分解性キャリアとしては、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエチレン酢酸ビニル、またはナイロンが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーキャリアは、除放マトリックスを提供するように処方され得る。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌグルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドから構成される、注射可能なマイクロスフィア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短期間でタンパク質を放出する。適切な天然ポリマーキャリアとしては、コラーゲン、キトサン、ヒアルロン酸、およびセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。望ましい場合、微粒子は、治療量の少なくとも１種のさらなる骨形成タンパク質、あるいは骨および／もしくは軟骨の欠損、損傷、または問題の組織の処置のために有用な別の薬剤を含有し得る。これらの薬剤としては、種々の増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ））が挙げられる。
【００４２】
種々のサイズのＢＭＰ−２微粒子が、それらの製造において使用される条件を変化させることによって、調製され得る。種々の実施形態において、微粒子は、約０．１μｍ〜約２０００μｍの直径を有する。例えば、適切な微粒子直径は、０．５μｍ〜約１５００μｍ、１μｍ〜約１０００μｍ、５μｍ〜約７５０μｍ、１０μｍ〜約５００μｍ、１５μｍ〜約２５０μｍ、２５μｍ〜約１２５μｍ、および３７μｍ〜約７５μｍの範囲であり得るが、これらに限定されない。他の適切な範囲としては、０．５μｍ〜約１４０μｍ、５μｍ〜約８５μｍ、約１５μｍ〜約７５μｍ、または約２５μｍ〜約５０μｍが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
微粒子のサイズは、当該分野において公知の方法およびデバイスを使用して、評価され得る。これらとしては、ＭＡＳＴＥＲＳＩＺＥＲ（登録商標）Ｘ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、粒子の濃度は、４〜５ｍｌのサンプルセル体積に対して最適化される。
【００４４】
ＢＭＰ−２微粒子は、これらを水溶液中に入れることによって、再溶解または再懸濁され得る。処方物緩衝液は、好ましくは、生理学的濃度またはその近くのナトリウムおよびイオンを含有する。水性懸濁液の適切な組成は、１０７ｍＭのＮａＣｌ、２７ｍＭのＮａＨＣＯ３、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＮａ２ＳＯ４を含有する。
【００４５】
（ＢＭＰ−２微粒子を含有する薬学的組成物およびＢＭＰ−２微粒子を使用する方法）
ＢＭＰ−２微粒子は、種々の適応症を処置するための薬学的組成物を調製するために使用され得る。いくつかの実施形態において、微粒子は、合成され、そして水性懸濁液において利用される。他の実施形態において、薬学的組成物は、被験体への送達の直前に微粒子を再懸濁させることによって、調製される。望ましい場合、ＢＭＰ−２粒子は、その意図される作用部位に、粉末として、直接局所的な適用で送達され得る。ＢＭＰ−２微粒子は、さらに、所望であれば、他の非水性ビヒクル（油または生体適合性有機溶媒が挙げられるが、これらに限定されない）中での懸濁液として送達され得る。
【００４６】
本発明のＢＭＰ−２微粒子ベースの薬学的組成物および治療方法は、ＢＭＰ−２タンパク質を溶液に導入する際に起こる、ＢＭＰ−２の再可溶化または再懸濁を利用する。従って、本発明は、再可溶化または再懸濁されたＢＭＰ−２ポリペプチドを含有する水性ＢＭＰ−２懸濁液を提供すること、およびこの水性懸濁液を、この被験体におけるＢＭＰ−２レベルを上昇させるために十分な量で、この被験体に導入することによって、被験体における骨形態タンパク質−２（ＢＭＰ−２）のレベルを上昇させる方法を包含する。ＢＭＰ−２レベルの上昇は、投与後の被験体においてＢＭＰ−２ポリペプチドのレベルを評価することによって、決定され得る。ＢＭＰ−２レベルは、試薬（抗ＢＭＰ−２抗体が挙げられるが、これに限定されない）を使用して、直接決定され得る。いくつかの実施形態において、５×１０２倍、１×１０３倍、１×１０４倍、１×１０５倍、または１×１０６倍、あるいはそれより大きい、ＢＭＰ−２レベルの上昇が、投与後に起こる。
【００４７】
好ましくは、ＢＭＰ−２タンパク質レベルの上昇は、治療有効量である。治療有効量は、ＢＭＰ−２タンパク質での処置から利益を受けることが既知の条件における改善を同定することによって、決定され得る。例えば、ＢＭＰ−２タンパク質は、軟骨および／または骨の形成を誘導する能力によって、ならびに米国特許第５，０６６，０５８号に記載されるラット骨形成アッセイにおいて軟骨および／または骨の形成を示す能力によって、さらに特徴付けられる。好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、このラット骨形成アッセイにおいて、０．５μｇ〜１００μｇ／骨のグラム数の濃度で、活性を示す。より好ましい実施形態において、これらのタンパク質は、このアッセイにおいて、１μｇ〜５０μｇ／骨のグラム数の濃度で、活性を示す。より好ましくは、これらのタンパク質は、１μｇのタンパク質が、米国特許第５，０６６，０５８号の実施例ＶＩＩに記載される改変されたスコア付けを使用して、実施例ＩＩＩに記載されるラット骨形成アッセイにおいて、少なくとも＋１のスコアを有することによって特徴付けられ得る。
【００４８】
ＢＭＰ−２微粒子から再懸濁または再可溶化されたＢＭＰ−２タンパク質を含有する水性懸濁液は、水溶液に、沈澱した生物活性骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含有する微粒子を導入すること、および沈澱したＢＭＰ−２タンパク質を再可溶化させることによって、調製され得る。
【００４９】
他の実施形態において、微粒子は、凍結乾燥された微粒子として水性懸濁液に導入される。
【００５０】
ＢＭＰ−２微粒子およびその懸濁液は、骨折ならびに軟骨および／または骨の欠損または歯周病に関連する他の状態を修復するための方法ならびに組成物において、使用され得る。さらに、本発明は、創傷治癒および組織修復のための、治療方法および組成物を包含する。このような組成物は、微粒子由来の治療有効量のＢＭＰ−２ポリペプチドを、薬学的に受容可能なビヒクル、キャリアまたはマトリックスとの混合物中で含有する。微粒子から放出されるＢＭＰ−２ポリペプチドは、他の関連するタンパク質および増殖因子と協奏的に、またはおそらく相乗的に作用し得る。
【００５１】
ＢＭＰ−２微粒子は、治療量の少なくとも１種のさらなる骨形成タンパク質と共に使用され得る。さらに、ＢＭＰ−２微粒子は、骨および／または軟骨の欠損、創傷または問題の組織の処置のために有利な、他の薬剤と混合され得る。この薬剤としては、種々の増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ））が挙げられる。このような生理学的に受容可能なタンパク質組成物の調製および処方（ｐＨ、等張性、安定性などに対する当然の考慮を有する）は、当該分野の技術範囲内である。治療組成物はまた、獣医学の応用に対して、現在価値がある。特に、ヒトに加えて家畜動物および純血種のウマは、微粒子から調製されたＢＭＰ−２の微粒子または処方物を含有する治療組成物でのこのような処置のために望ましい患者である。
【００５２】
さらなる適応症としては、歯周病の処置、および他の歯の修復プロセスが挙げられる。このような薬剤は、骨形成細胞を誘引する環境を提供し得るか、骨形成細胞の成長を刺激し得るか、または骨形成細胞の子孫の分化を誘導し得る。さらなる適応症としては、骨粗鬆症、ニューロンの生存の増加が望ましい状態、創傷治癒および関連する組織修復が挙げられる。創傷の型としては、火傷、切開および潰瘍が挙げられるが、これらに限定されない。（創傷治癒および関連組織修復の議論について、本明細書中に参考として援用される、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６を参照のこと）。
【００５３】
治療方法は、ＢＭＰ−２微粒子（または再懸濁されたＢＭＰ−２微粒子から調製された処方物）を投与する工程を包含する。本発明の薬学的組成物は、意図される投与経路と適合性の処方物である。投与の様式は、生物活性薬剤および意図される適用部位に基づいて、選択される。再可溶化または再懸濁される場合、ＢＭＰ−２微粒子の使用は、全身的または局所的であり得る。投与経路の例としては、局所、非経口（静脈内、皮内、皮下が挙げられるが、これらに限定されない）、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、ならびに直腸投与が挙げられる。局所、非経口、皮内、または皮下の適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含有し得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）；等張性を調節するための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖）；および界面活性剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、またはポリソルベート８０）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多用量バイアルに収容され得る。投与が全身である場合、ＢＭＰ−２微粒子、またはＢＭＰ−２微粒子を含有するかもしくはＢＭＰ−２に由来する組成物は、被験体における所望の部位の標的化および／またはその部位での保持を容易にする、会合した物質をさらに含有し得る。
【００５４】
注射可能用途に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性である場合）、または分散物、および滅菌注射用溶液および分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、無菌でなければならず、そして容易にシリンジ中に存在する程度まで流動性でなければならない。この組成物は、製造条件および貯蔵条件下で安定であるべきであり、かつ微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用から保護されるべきである。このキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散媒体、ならびにそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レクチン）を使用することによって、分散物の場合は、必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）がこの組成物中に含まれることが好ましい。注射可能組成物の延長した吸収は、この組成物中に、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによって、もたらされ得る。
【００５５】
滅菌注射用溶液は、活性化合物（ＢＭＰ−２微粒子から再可溶化または再懸濁されたＢＭＰ−２タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）を、必要な量で、上で列挙された成分の１つまたはこれらの成分の組合せを含む適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて滅菌濾過することによって、調製され得る。
【００５６】
この薬学的組成物は、容器、パック、またはディスペンサ中に、投与のための指示書と共に含まれ得る。
【００５７】
再懸濁または再可溶化された生体活性剤を含む経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセル中に封入され得るか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ得、そして錠剤、トローチまたはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための液体キャリアを使用して調製され得、ここで、流体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、そしてかみ砕かれ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるかまたは嚥下される。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは、以下の成分または類似の性質の化合物のうちの任意のものを含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；滑沢剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【００５８】
生体活性剤の吸入による投与について、これらの化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のようなガス）を含む加圧容器またはディスペンサ、あるいはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００５９】
全身投与はまた、経粘膜投与または経皮投与により得る。経粘膜投与または経皮投与について、透過されるバリアに適切な透過剤が、処方物において使用される。このような透過剤は、一般に当該分野で公知であり、これには、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフジシン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成される。経粘膜投与について、活性化合物は、当該分野で一般的に公知のような軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔまたはｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリームに処方される。
【００６０】
これらの化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、従来の坐剤基剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドを含む）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【００６１】
投与される場合、本発明における使用のための薬学的組成物は、代表的に、発熱物質を含まない薬学的に受容可能な形態で送達される。さらに、この組成物は、望ましくは、骨の軟骨または組織の損傷の部位に送達するために、粘性形態でカプセル化されるかまたは注射され得る。局所投与は、創傷治癒および組織修復のために適切であり得る。好ましくは、骨および／または軟骨の形成について、この組成物は、ＢＭＰタンパク質を骨および／または軟骨の損傷部位に送達し得、骨および軟骨を発達させるための構造を提供し得、そして必要に応じて身体に再吸収され得るマトリクスを含む。このようなマトリクスは、他の移植された医療適用のために現在使用される材料から形成され得る。
【００６２】
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、表面的な外見および界面特性に基づく。ＢＭＰ−２組成物の特定の適用は、適切な処方物を規定する。この組成物に潜在的な材料は、生分解性で化学的に規定された、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の潜在的な材料（例えば、骨または皮膚のコラーゲン）は、生分解性であり、生物学的に十分に規定されている。さらなるマトリクスは、純タンパク質または細胞外マトリクス成分から構成される。他の潜在的なマトリクス（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミック）は、非生分解性であり、化学的に規定されている。マトリクスは、上記のタイプの材料の任意のものの組合せ（例えば、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンとリン酸三カルシウム）から構成され得る。バイオセラミックの組成は変更され得る（例えば、カルシウム−アルミン酸塩−リン酸塩）、そして孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状および生分解性を変更するように処理される。
【００６３】
投薬レジメンは、担当の医師により、ＢＭＰ−２タンパク質の作用を変更する種々の要因を考慮して決定される。これらの要因としては、形成されることが所望される骨の重量、骨の損傷部位、損傷した骨の状態、創傷のサイズ、損傷した組織の型、患者の年齢、性別および食餌、任意の感染の重篤度、投与時間および他の臨床的要因が挙げられるが、これらに限定されない。投薬量は、再構築に使用されるマトリクスの型と共に変化し得る。他の公知の成長因子（例えば、ＩＧＦＩ（インシュリン様成長因子Ｉ））の最終組成物への添加はまた、投薬量に影響を与え得る。進行は、骨の成長および／または修復の定期的な評価によってモニタリングされ得る。骨の成長または修復を評価する１つの方法は、Ｘ線画像化による方法である。
【００６４】
本発明は、以下の非限定的な実施例でさらに例示される。
【実施例】
【００６５】
（実施例１：ＢＭＰ−２微粒子の調製）
ＢＭＰ−２微粒子を、ＢＭＰ−２タンパク質を含む第１の溶液と、第２の沈殿溶液とを混合することによって調製する。
【００６６】
この第１の溶液は、ｒｈＢＭＰ−２を、０．１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、ｐＨ ４．５である。第２の溶液は、１０分の１の容量（第１の溶液の容量に対して）で添加された際、ＢＭＰ−２タンパク質が沈殿し、そして合わせた溶液の最終ｐＨがｐＨ７．４になるように処方される。この第２の溶液は、１１２０ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのＮａＨＣＯ３、１１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５．５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、４０ｍＭのＮａＯＨおよび純水を含む。
【００６７】
沈殿を、１０％（容量／容量）の沈殿溶液（これは、生理学的塩およびｐＨ調整剤の両方を含む）を添加することによって実施する。この沈殿は、必要な容量に依存して、滅菌チューブ（１５または５０ｍｌ）中で実施される。ＢＭＰストック溶液で５０ｍｌのチューブを満たすことは、撹拌を使用することによって流動溶液を作製するために十分な空間を有するために、３０ｍｌに制限される。
【００６８】
迅速かつ均一な分布を達成するために、流動ＢＭＰバルク溶液を、沈殿溶液の添加の１０秒前の撹拌によって、および沈殿溶液の添加の１０秒後の撹拌によって作製する。さらに、５０ｍｌのチューブバッチにおいて、元のキャップを、全直径約３ｍｍの中心を有するキャップと交換して、沈殿溶液をピペッティングする。沈殿溶液を添加した後、このチューブを、元のキャップで密閉し、そして所望の時間の間平衡化する（実施例２を参照のこと）。
【００６９】
次いで、ＢＭＰ−２微粒子を、遠心分離によって濃縮し、その後、これらの微粒子を凍結乾燥する。
【００７０】
（実施例２．ＢＭＰ−２微粒子サイズの評価）
ＢＭＰ−２微粒子の直径を、ＭＡＬＶＥＲＮ ＭＡＳＴＥＲＳＩＺＥＲ Ｘ（登録商標）機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して、４〜５ｍｌの容量に対して設計されたサンプルセルを用いて、評価した。ｒｈＢＭＰ−２溶液とストック溶液の混合を使用して、生理学的塩濃度を作成した。
【００７１】
種々の時間の間の平衡化に供された微粒子の集団中の粒子直径の範囲を、図１〜３に示す。図１は、１０分未満の間平衡化された微粒子の、２つのバッチにおいて得られたサイズ分布を示す。ほとんどの粒子の直径は、１０μｍより小さく、ピークは、直径５μｍ〜６μｍの微粒子でピークが検出された。
【００７２】
図２は、１０分と１１０分との間平衡化された微粒子の３つのバッチについて得られたサイズ分布を示す。６μｍ〜９μｍが、最も一般的なサイズ範囲であるが、図１で観察された分布と比較して、１０μｍより大きい直径を有するより多数の微粒子が、観察された。
【００７３】
図３は、１６０分までの間平衡化された粒子の４つのバッチを使用した結果を示す。最も一般的なサイズ範囲は、６μｍ〜９μｍであるが、第２のピークが、３０μｍ〜４０μｍのサイズ範囲で検出される。
【００７４】
これらの結果は、１〜１００μｍの範囲の微粒子が、これらの研究で得られることを示し、そして最大約６±１μｍおよび３１±５μｍの二峰性分布を示した。
【００７５】
粒子サイズに対する遠心分離の影響を決定した。以下の３つの条件下における遠心分離の後の結果を、図４に示す：２３０Ｇで１５分；２５５０Ｇで１０分、または３９９０Ｇで１５分。これらの研究において、粒子サイズは、後の遠心分離によってわずかにしか影響を受けなかった。
【００７６】
微粒子サイズに対する凍結乾燥の影響を試験した。凍結乾燥の程度を、乾燥速度および累積的水分損失を測定することによって評価した。凍結乾燥の程度を、図５に示す。粒子サイズに対する凍結乾燥の影響を、図６に示す。凍結乾燥は、３５μｍのｄ５０値および８５μｍのｄ９０値を有する広い単峰性分布への変化を引き起こした。
【００７７】
多量（７２０ｍｇ）のタンパク質を含む溶液を使用して得られた粒子サイズを試験した。粒子サイズを、沈殿、遠心分離および凍結乾燥の後に決定した。その結果を、図７に示す。遠心分離および凍結乾燥は、沈殿のみに供された微粒子の直径と比較して、微粒子の直径における変化を引き起こした。
【００７８】
ＢＭＰ−２含有溶液と沈殿溶液との混合を、インターデジタルシグナル混合デバイス（ＭＩＣＲＯＭＩＸＥＲ（登録商標）デバイス、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ，Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。このデバイスは、薄い壁を有するラメラを介する拡散を使用して、少ない容量の組合せを可能にする。平衡化を、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、および２．５ｍｇ／ｍｌのＢＭＰ−２濃度を使用して、２０〜４８０分間実施した。直径分布を、図８に示す。３つ全ての濃度について、二峰性のサイズ分布が得られ、ここで、ピークは、約６〜９μｍ付近であり、第２のより広い分布は、約４０〜６０μｍに中心があった。
【００７９】
タンパク質の完全性を、微粒子の溶解後に分析した。ＢＭＰ−２は、溶解後、インタクトであることが見出された。
【００８０】
（他の実施形態）
示される記載は、例示することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。上記の本発明は、ＢＭＰ−２を参照して記載されているが、本明細書中に記載される方法が、他の生体活性剤のための微粒子、およびこれらの微粒子に基づく薬学的組成物を作製するために使用され得ることが理解される。これらの生体活性剤としては、さらなる骨形成タンパク質、トランスフォーミング成長因子−βスーパーファミリーのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。この方法はまた、ＢＭＰ−２と類似した溶解性およびｐＩ特性を有する治療用ポリペプチドを含む微粒子を作製するために使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−５９２１１（Ｐ２０１０−５９２１１Ａ）
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８４５６４（Ｐ２００９−２８４５６４）
【出願日】平成２１年１２月１５日（２００９．１２．１５）
【分割の表示】特願２００３−５６５４２６（Ｐ２００３−５６５４２６）の分割
【原出願日】平成１５年２月１０日（２００３．２．１０）
【出願人】（５０４２９９７４８）
【出願人】（５０４３０１８８９）ザ ユニバーシティー オブ エアランゲン−ニュルンベルク (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１５日（２００９．１２．１５）
【分割の表示】特願２００３−５６５４２６（Ｐ２００３−５６５４２６）の分割
【原出願日】平成１５年２月１０日（２００３．２．１０）
【出願人】（５０４２９９７４８）
【出願人】（５０４３０１８８９）ザ ユニバーシティー オブ エアランゲン−ニュルンベルク (1)
【Ｆターム（参考）】
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