生体物質検出装置
【課題】微小間隔でスポットされた検体を解析する際もスポット間の干渉による測定誤差を低減できる生体物質検出装置を提供する。
【解決手段】隣り合う第１および第２のサンプルスポット211,212が異なる発光スペクトルで発光するように複数種類の標識酵素で標識した検体をアレイ状に定着したスライド101を対象とし、スライド101の画像を取得するカラー画像取得部102と、カラー画像取得部102からのカラー画像情報111から標識酵素の種類毎に対応した画像情報を抽出し、抽出した複数の抽出画像情報112,113を出力する画像抽出回路103と、複数の抽出画像情報112,113の各々に対応して設けられていて、各抽出画像情報112,113間で定量的な評価が可能となるように各抽出画像情報112,113を補正し、補正画像情報114,115を出力する第１および第２の画像補正回路104,105とを備えた生体物質検出装置とする。
【解決手段】隣り合う第１および第２のサンプルスポット211,212が異なる発光スペクトルで発光するように複数種類の標識酵素で標識した検体をアレイ状に定着したスライド101を対象とし、スライド101の画像を取得するカラー画像取得部102と、カラー画像取得部102からのカラー画像情報111から標識酵素の種類毎に対応した画像情報を抽出し、抽出した複数の抽出画像情報112,113を出力する画像抽出回路103と、複数の抽出画像情報112,113の各々に対応して設けられていて、各抽出画像情報112,113間で定量的な評価が可能となるように各抽出画像情報112,113を補正し、補正画像情報114,115を出力する第１および第２の画像補正回路104,105とを備えた生体物質検出装置とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質検出装置に関し、詳細には、発光もしくは蛍光性質を有する検体を定着した複数のスポットを有する検査基盤の画像を取得して解析を行う生体物質検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生化学・分子生物学分野においては、従来より、発光もしくは蛍光標識酵素で標識され検査基盤等の複数のスポット領域に分布された検体の画像を取得し、取得した画像から各スポット領域の検体を解析する生体物質検出装置がある。
【０００３】
たとえば特許文献１に、モノクロのＣＣＤカメラで撮影した画像から、検体のスポットを含み且つそれぞれの面積が等しくなるような円形領域にて、スポットおよびその周辺の画素の輝度値を積算して、スポットの値とする方法が開示されている。
【０００４】
しかしこの方法は、互いのスポットからの光が干渉しない場合には有効であるものの、スポット間の距離が近い場合にスポット間の光が干渉して誤差が生じる。図１０は隣り合って定着された２つの検体Ａ，検体Ｂのスポットのモノクロ画像情報における輝度分布を２次元で示したものである。検体Ａ，検体Ｂは同じ発光スペクトルを持った標識酵素で標識され、同等の強度で発光するものである。図中、１００５及び１００６は各々、検体Ａ及び検体Ｂのスポット中心位置である。１００１及び１００２は各々、検体Ａ、検体Ｂについての、干渉を受けない理想的な輝度分布を示している。１００３は、実際に取得される輝度分布を示しており、２つの検体Ａ，Ｂが互いに干渉を起こしていることが表れている。検体Ａを実際に解析するときは、輝度分布１００３を用いて、解析領域１００４の輝度値を積算して行うので、輝度分布１００２の干渉の影響によって誤差を生じることとなる。検体Ｂについても同様である。
【０００５】
このようなスポット間の干渉を低減するために、例えば特許文献２に、マイクロタイタープレートの複数のスポット領域（ウェル）の画像を取得する際に、ＣＣＤカメラ等の画像取得手段とマイクロタイタープレートとの間に各ウェルに対応した開口部を有する遮光プレートを配設して、隣り合うウェルからの発光もしくは蛍光を遮光するようにした装置が提案されている。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００２／００１４７７公報
【特許文献２】特開２００５−２７４３５５公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献２の装置は、上述のようにマイクロタイタープレートに対して遮光プレートを用いているもので、検体のスポット間隔が微小となるマイクロアレイなどの検査基盤に対しては、遮光プレートの開口部の微小化と位置決めが非常に困難であり、適用し難い。
【０００７】
本発明は、上記問題を解決するもので、微小間隔でスポットされた検体を解析する際のスポット間の干渉による測定誤差を低減できる生体物質検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明の生体物質検出装置は、発光もしくは蛍光性質を有する検体を定着した複数のスポットを有する検査基盤の画像を取得して生体物質の解析を行う生体物質検出装置であって、隣り合うスポットが異なる発光スペクトルで発光するように複数種類の標識酵素で標識した検体をアレイ状に定着した検査基盤を対象とし、前記検査基盤の画像をカラー画像情報として取得するカラー画像取得部と、前記カラー画像情報から前記標識酵素の種類毎に対応した画像情報を抽出し、抽出した複数の抽出画像情報を出力する画像抽出回路と、前記複数の抽出画像情報の各々に対応して設けられていて、各抽出画像情報間で定量的な評価が可能となるように各抽出画像情報を補正し、補正画像情報を出力する画像補正回路とを備えたことを特徴とする。
【０００９】
上記構成によれば、標識酵素の種類毎に対応した画像情報を抽出し、補正するようにしたことにより、隣接するスポット間の発光による干渉を低減することができる。
なお、「発光スペクトル」は、発光、蛍光の双方のスペクトルを意味することとする。「標識酵素で標識した検体」は、検体、すなわち複数の生体物質を含む検査対象物に、発光の標識化処理を酵素で行ったものを指し、検体の例はヒトの血液である。生体物質は、生体を構成する基本材料である生体高分子（核酸、タンパク質、多糖）や、これらの構成要素であるヌクレオチド、ヌクレオシド、アミノ酸、各種の糖など、ならびに脂質やビタミン、ホルモンなどを指す。
【００１０】
複数の補正画像情報を１つに合成して合成画像情報を出力する画像合成回路をさらに備えることができる。
画像補正回路は、標識酵素の発光スペクトルとカラー画像取得部の視感度特性とから補正係数を算出し、算出した補正係数を用いて各抽出画像情報を補正するように構成することができる。
【００１１】
検査基盤に、標識酵素の種類毎に発光量を定量化するための基準スポットを設けたときには、画像補正回路は、標識酵素の種類毎の抽出画像情報から前記基準スポットを抽出し、その発光量を算出し、発光量値より補正係数を算出し、算出した補正係数を用いて、前記標識酵素の種類毎の基準スポットの発光量が等しくなるように、前記標識酵素の種類毎の抽出画像情報を補正するように構成することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体物質検出装置によれば、検査基盤にスポットされた各検体を解析する際に、隣接するスポット間の発光による干渉を低減し、測定誤差を低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１の生体物質検出装置およびそれによる解析方法について図１から図６を用いて説明する。
【００１４】
図１は生体物質検出装置のシステム構成を示す。１０２はカラー画像取得部、１０３は画像抽出回路、１０４は第１の画像補正回路、１０５は第２の画像補正回路である。１０１は検査対象のスライドである。
【００１５】
スライド１０１は、生化学反応によって発光する検体が小基盤上にアレイ状に定着されているもので、一般にマイクロアレイ、ＤＮＡチップと呼ばれるものである。検体は、隣り合う一方の検体ともう一方の検体とが異なる発光スペクトルで発光するように、複数種類の標識酵素で標識されアレイ状に定着（スポット）されている。ここでは、２種類の検体であって、異なる発光スペクトルを持つ標識酵素で標識された検体が用いられており、その一方の検体が第１のサンプルスポット２１１を形成し、もう一方の検体が第２のサンプルスポット２１２を形成している。これら第１のサンプルスポット２１１と第２のサンプルスポット２１２は、互いに隣り合わないように、縦方向・横方向に交互に配置されている。
【００１６】
カラー画像取得部１０２はスライド１０１を撮像して、カラー画像情報１１１を取得し、出力する。画像抽出回路１０３は、カラー画像情報１１１から、特定の波長領域の画像情報である第１の抽出画像情報１１２と、それとは異なる波長領域の画像情報である第２の抽出画像情報１１３とを抽出し、出力する。第１の画像補正回路１０４は、第１の抽出画像情報１１２を第２の抽出画像情報１１３と定量評価する為に補正を行い、第１の補正画像情報１１４を出力する。第２の画像補正回路１０５は、第１の画像補正回路１０４と同様に補正を行い、第２の補正画像情報１１５を出力する。
【００１７】
この生体物質検出装置は、検体の発光スペクトルを２種類とした上述のスライド１０１に対応したシステム構成であるが、発光スペクトルが３種類以上の場合には、その波長領域の種類の数だけ抽出画像情報を出力することとし、それぞれの抽出画像情報に対して画像補正回路を備えるシステム構成とする。
【００１８】
以下、図１の生体物質検出装置による解析方法を説明する。
まず、図２に拡大して示す検査対象のスライド１０１を準備する。つまり、ガラス製（シリコン製でもよい）の小基盤上に、隣り合う第１のサンプルスポット２１１と第２のサンプルスポット２１２とが異なる発光スペクトルで発光するように、複数種類の標識酵素で標識した検体をアレイ状に定着する。
【００１９】
ここでは、標識酵素で標識した検体は、解析対象の生体物質（抗原）と、それに特異的に結合する特異的反応物質（抗体）と、これら生体物質と特異的反応物質のいずれかに予め結合された標識酵素とを含むものとしており、生体物質と特異的反応物質と標識酵素との複合体の生成量に応じた発光量で、つまり解析対象の生体物質の量に応じた発光量で標識酵素が発光する。標識酵素としては、発光色が異なる２種類のルシフェラーゼを用い、第１のサンプルスポット２１１は緑色で発光するルシフェラーゼで標識化し、第２のサンプルスポット２１２は赤色で発光するルシフェラーゼで標識化する。
【００２０】
使用する標識酵素（ルシフェラーゼ）による相対発光スペクトルを図３に示す。３０１は緑色に発光するルシフェラーゼの発光スペクトル（第１の発光スペクトルと呼ぶ）である。３０２は赤色に発光するルシフェラーゼの発光スペクトル（第２の発光スペクトルと呼ぶ）である。第１の発光スペクトル３０１を波長λに対する関数Ｌ１（λ）と定義し、第２の発光スペクトル３０２を同じく関数Ｌ２（λ）と定義することとする。図中では、Ｌ２（λ）のピークを１として、それに対する強度（相対強度）を示している。第１の発光スペクトル３０１と第２の発光スペクトル３０２は予め分光計等によってスペクトル分布を測定しておく。このような発光スペクトルを持つルシフェラーゼとして、例えば東洋ビーネット株式会社製のマルチカラールック（登録商標）Ｕｌｔｒａ−ＨＴＳ発光試薬がある。
【００２１】
準備したスライド１０１を所定の位置にセットし、システムをスタートさせると、カラー画像取得部１０２がスライド１０１を撮像してカラー画像情報１１１を取得し、出力する。
【００２２】
カラー画像取得部１０２としては一般のカラーＣＣＤカメラを用いることができるが、ここでは図４に示すようなＲＧＢの視感度特性を持つカラーＣＣＤを用いることとする。図中、４０１は撮影対象の波長に対する青色の感度を示す青色感度曲線であり、同じく、４０２は緑色の感度を示す緑色感度曲線、４０３は赤色の感度を示す赤色感度曲線である。
【００２３】
青色感度曲線４０１を波長λに対する関数Ｆｂ（λ）、緑色感度曲線４０２を同じく関数Ｆｇ（λ）、赤色感度曲線４０３を同じく関数Ｆｒ（λ）と定義することとする。図中では、Ｆｒ（λ）のピークを１として、それに対する感度（相対感度）を示している。青色感度曲線４０１と緑色感度曲線４０２と赤色感度曲線４０３は、予め分光計等によってスペクトル分布を測定しておく。
【００２４】
また、青色感度で取得された画像情報をＩＢ、その輝度値をＩＢ（ｍ，ｎ）、緑色感度で取得された画像情報をＩＧ、その輝度値をＩＧ（ｍ，ｎ）、赤色感度で取得された画像情報の輝度値をＩＲ、その輝度値をＩＲ（ｍ，ｎ）と定義することとする。ｍは横軸方向の画素位置、ｎは縦軸方向の画素位置である。カラー画像情報１１１の大きさは縦４８０画素、横６４０画素であり、ｍは０から６３９、ｎは０から４７９の画素位置をとる。
【００２５】
図５（ａ）（ｂ）（ｃ）は上述のように取得した画像情報における検体の輝度分布を示したものである。
説明を簡単にするために、検体のスポットを２個として、また両スポットにルシフェラーゼが同量結合しているとして、輝度分布を２次元で（つまり両スポットの中心位置を通るライン上の輝度値を）、示している。両スポットを、先と同様に、第１のサンプルスポット２１１，第２のサンプルスポット２１２と呼ぶ。
【００２６】
５０１は画像情報ＩＲの輝度分布、５０２は画像情報ＩＧの輝度分布、５０３は画像情報ＩＢの輝度分布である。５０４は第１のサンプルスポット２１１の中心位置であり、５０２は第１のサンプルスポット２１２の中心位置である。両スポットのルシフェラーゼの結合量が等しくても、前述したようにルシフェラーゼの発光スペクトル分布とカラーＣＣＤカメラの各色の感度曲線が異なるため、同等の発光強度とはならない。
【００２７】
カラー画像取得部１０２からの出力を受けて、画像抽出回路１０３は、カラー画像情報１１１から、第１のサンプルスポット２１１の発光と第２のサンプルスポット２１２の発光とを分離して抽出する。
【００２８】
第１のサンプルスポット２１１について抽出する画像情報の輝度値をＩ１（ｍ，ｎ）、第２のサンプルスポット２１２について抽出する画像情報の輝度値をＩ２（ｍ，ｎ）とすると、各々、以下に示す計算式（１）（２）で算出される。
【００２９】
【数１】
式（１）（２）は、重み付けをした画像情報ＩＢ、ＩＧ、ＩＲの輝度値を加算・減算することを表している。第１のサンプルスポット２１１にかかるＩ１（ｍ，ｎ）は、上述のように緑色で発光するルシフェラーゼで標識化しているため、つまりＩＧ（ｍ，ｎ）のみの成分と仮定しているため、ａ１＝０、ｂ１＝１、ｃ１＝０となり、式（１）′で表されることとなり、図５（ｂ）と同じ輝度分布となる。同様に、第２のサンプルスポット２１２にかかるＩ２（ｍ，ｎ）は、ＩＲ（ｍ，ｎ）のみの成分と仮定しているため、ａ２＝０、ｂ２＝０、ｃ２＝１となり、式（２）′で表されることとなり、図５（ａ）と同じ輝度分布となる。
【００３０】
画像抽出回路１０３は、Ｉ１（ｍ，ｎ）の輝度値を持つ画像情報を第１の抽出画像情報１１２として、またＩ２（ｍ，ｎ）の輝度値を持つ画像情報を第２の抽出画像情報１１３として、出力する。
【００３１】
（ステップ４）
画像抽出回路１０３からの出力を受けた第１の画像補正回路１０４，第２の画像補正回路１０５は、互いの第１の抽出画像情報１１２，第２の抽出画像情報１１３を定量評価できるように補正を行い、第１の補正画像情報１１４，第２の補正画像情報１１５を出力する。
【００３２】
補正に際しては、上述の発光スペクトル分布（Ｌ１（λ），Ｌ２（λ））と、カラーＣＣＤカメラの前記発光スペクトルに対応する色の色感度曲線（Ｆｂ（λ），Ｆｇ（λ），Ｆｒ（λ））とを用いて補正係数を算出し、算出した補正係数を用いる。
【００３３】
詳細にはまず、第１の抽出画像情報１１２の補正係数Ｒ１および第２の抽出画像情報１１３の補正係数Ｒ２を、以下に示す式（３）（４）によって算出する。
【００３４】
【数２】
式（３）（４）において、Ｆｂ（λ）、Ｆｇ（λ）、及びＦｒ（λ）への重み付けａ１，ｂ１，ｃ１，ａ２，ｂ２，ｃ２は、上述の式（１）（２）で各色の画像情報に付した重み付けと同じものを用いる。
【００３５】
式（３）において、｛ａ１×Ｆｂ（λ）＋ｂ１×Ｆｇ（λ）＋ｃ１×Ｆｒ（λ）｝は、ＣＣＤカメラの各色の色感度曲線に式（１）に用いたのと同じ重み付けをして得られる輝度値を示している。従って、この輝度値を発光スペクトルＬ１（λ）と掛け合わせ、全波長領域において積算することにより、緑色で発光する一定量のルシフェラーゼの画像をカラーＣＣＤカメラで取得して、式（１）で計算した時の輝度値を得ることができる。
【００３６】
つまり、式（３）は、Ｌ１（λ）の発光スペクトルを持つルシフェラーゼをモノクロカメラで撮影した場合に取得される輝度値の理想値を計算によって求めるものである。Ｌ１（λ）×Ｆｂ（λ）は青色成分を輝度値に変換する項、Ｌ１（λ）×Ｆｇ（λ）は緑色成分を輝度値に変換する項、Ｌ１（λ）×Ｆｒ（λ）は赤色成分を輝度値に変換する項である。式（１）では青・緑・赤の輝度値を合成する際に各色に重み付けをしているので、式（３）でも同じ重み付けをする。これによって、Ｌ１（λ）の発光スペクトルを式（１）と同じ重み付けで取得した輝度値を計算によって求めることができる。これが第１の抽出画像情報１１２の補正係数Ｒ１である。
【００３７】
式（４）は、Ｌ２（λ）の発光スペクトルを持つルシフェラーゼをモノクロカメラで撮影した場合に取得される輝度値の理想値を計算によって求めるものである。上記と同様にして、Ｌ２（λ）の発光スペクトルを式（２）と同じ重み付けで取得した輝度値を計算によって求めることができる。これが第２の抽出画像情報１１３の補正係数Ｒ２である。
λ＿ｍａｘは積分の上限を示す。全波長領域において積算するため理論上は無限大であるが、本実施の形態では有限の値として１０００ｎｍを採用する。したがって、Ｒ１は、ａ１＝０、ｂ１＝１、ｃ１＝０、および、λ＿ｍａｘ＝１０００を用いた式（３）′で表され、算出される。またＲ２は、ａ２＝０、ｂ２＝０、ｃ２＝１、および、λ＿ｍａｘ＝１０００を用いた式（４）′で表され、算出される。
【００３８】
ここで、第１のサンプルスポット２１１と第２のサンプルスポット２１２に上述したようにルシフェラーゼが同量結合して発光している場合、算出されるＲ１とＲ２との比は、第１の抽出画像情報１１２で取得される輝度値Ｉ１（ｍ，ｎ）と第２の抽出画像情報１１３で取得されるＩ２（ｍ，ｎ）との比を示す。したがって、以下の計算式（５）によって、Ｉ１（ｍ，ｎ）を補正することによって、Ｉ２（ｍ，ｎ）と直接比較できる画像情報の輝度値を求めることができる。
【００３９】
詳述する。上述したように、Ｌ１（λ）とＬ２（λ）は、同量のルシフェラーゼ発光させた場合に得られる発光スペクトルであり、これらＬ１（λ）とＬ２（λ）は相対的な特性を示す。また式（３）は、Ｌ１（λ）の発光スペクトルを持つルシフェラーゼを発光させてモノクロカメラで撮影した場合の輝度値の計算値であり、式（４）は、Ｌ２（λ）の発光スペクトルを持つルシフェラーゼを同量発光させてモノクロカメラで撮影した場合の輝度値の計算値である。
【００４０】
したがって、式（３）の値Ｒ１と式（４）の値Ｒ２の比をとると、同量のルシフェラーゼを発光させた場合にカメラで取得される輝度値の比となる。ルシフェラーゼの量を比較するためには、式（３）もしくは式（４）の値を用いて正規化する必要がある。
【００４１】
ここで、Ｉ１（ｍ，ｎ）とＩ２（ｍ，ｎ）はそれぞれ、Ｌ１（λ）の成分、Ｌ２（λ）の成分を抽出した画像となっているが、抽出するという手法をとっているので、同量のルシフェラーゼが撮影されたとしても、式（３）と式（４）で示したように同じ輝度値にはならない。Ｉ１（ｍ，ｎ）中のＬ１（λ）成分のルシフェラーゼの量とＩ２（ｍ，ｎ）中
のＬ２（λ）成分のルシフェラーゼの量とを輝度値にて比較するためには、理想的な比率（つまり、式（３）と式（４））で正規化する必要がある。以下の式（５）は、式（３）、つまりＲ２を１として正規化するための計算を行っている。式（６）は、Ｒ２で正規化するため、そのままである。
【００４２】
式（５）に示すＣ１（ｍ，ｎ）は、第１の抽出画像情報１１２を補正してできる、第１の補正画像情報１１４の輝度値である。式（６）に示すＣ２（ｍ，ｎ）は、第２の抽出画像情報１１３を補正してできる、第２の補正画像情報１１５の輝度値である。このＣ２（ｍ，ｎ）では、Ｉ２（ｍ，ｎ）をそのまま用いており、補正係数による補正を行っていない。上述の通り、Ｉ１（ｍ，ｎ）をＩ２（ｍ，ｎ）と同じ比較ができるように補正したためである。式（５）（６）より式（５）′（６）′を得る。なお、Ｉ２（ｍ，ｎ）をＩ１（ｍ，ｎ）と同じ比較できるように補正しても構わないし、Ｉ２（ｍ，ｎ）とＩ１（ｍ，ｎ）を両方補正しても構わない。
【００４３】
【数３】
図６は、上述の式（５）′（６）′に基づいて、第１の抽出画像情報１１２（図５（ｂ））と第２の抽出画像情報１１３（図５（ａ））を補正して得られた、第１の補正画像情報１１４と第２の補正画像情報１１５の輝度分布である。図６（ａ）において、６０１は第１の補正画像情報１１４の輝度分布であり、６０３は第２のサンプルスポット２１２の干渉を受けていない場合の、理想となる第１のサンプルスポット２１１の輝度分布を示す。図６（ｂ）において、６０２は第２の補正画像情報１１５の輝度分布であり、６０４は第１のサンプルスポット２１１の干渉を受けていない場合の、理想となる第２のサンプルスポット２１２の輝度分布を示す。
【００４４】
得られた第１の補正画像情報１１４と第２の補正画像情報１１５を用いて解析を行う際、第１のサンプルスポット２１１に関しては輝度分布６０１の所定の解析領域１００４の輝度値の積算値を用いて解析する。同様に、第２のサンプルスポット２１２に関しては輝度分布６０２の所定の解析領域の輝度値の積算値を用いて解析する。
【００４５】
解析領域１００４は隣合ったスポットの間に設ける。領域を大きくすれば目的のスポットからの光を取る量が大きくなる一方、隣のスポットからの干渉の影響が大きくなるのであるが、前者であるシグナル成分（Ｓ）と、後者であるノイズ成分（Ｎ）とにつき、Ｓ／Ｎが最大となる領域を解析領域１００４とする。実際には、予め、それぞれのルシフェラーゼをスポットしたスライドを用意しておき、互いが干渉を起さない状態で画像（ＩＡ，ＩＢ）を取得し、２つの画像を合成して合成画像（ＩＣ）を作成する。合成する際には、それぞれのスポットを測定する条件と同じ間隔となるようにする。ＩＡ中のルシフェラーゼのスポットを中心として円形の領域を広げていき、円形の領域中の総輝度値をＳ、ＩＣの同領域中の総輝度値をＳ＋Ｎとし、Ｓ／Ｎを求める。そして、このＳ／Ｎが最大となる領域を解析領域１００４とする。
【００４６】
以上のようにして第１のサンプルスポット２１１の検体を輝度分布６０１の解析領域１００４の積算値を用いて解析する場合、輝度分布６０３の積算値との差は全積算値（図中の斜線部分）の３％以下となる。先の図１０に示した解析領域１００４（同じ発光スペクトルを持つ標識酵素を用いたもの）の積算値を用いる場合と比較すると３分の１程度の誤差となる。第１の補正画像情報１１４において、スポット領域外からの発光によるノイズ、つまり第２のサンプルスポット２１２での発光による影響がされるためである。同様に、第２のサンプルスポット２１２の検体を輝度分布６０２の所定の解析領域の積算値を用いて解析する場合も、第２の補正画像情報１１５において、第１のサンプルスポット２１１での発光による影響が低減されるため、誤差が低減される。
【００４７】
以上は、第１のサンプルスポット２１１と第２のサンプルスポット２１２という２個のスポットにルシフェラーゼが同量結合して発光している場合について説明したが、同量でない場合や、３個以上のスポットを設ける場合も、同じ手法を用いることができる。
【００４８】
以上説明したように、実施の形態１の生体物質検出装置によれば、異なる発光スペクトルの標識酵素で標識された２種類の検体がアレイ状にスポットされたスライド１０１の撮像画像から、第１の抽出画像情報１１２と第２の抽出画像情報１１３とを抽出し、発光スペクトルと撮像手段の感度曲線とを用いてそれぞれを補正するようにしたことにより、隣接するスポット間の発光による干渉で生じる測定誤差を低減させることができる。
（実施の形態２）
図７は本発明の実施の形態２の生体物質検出装置のシステム構成を示す。
【００４９】
この実施の形態２の生体物質検出装置が実施の形態１のものと異なるところは、第１および第２の基準スポット８０３，８０４が設けられたスライド７０１を検査対象としており、それに対応して、第１の画像補正回路７０２及び第２の画像補正回路７０３がスライド７０１の第１および第２の基準スポット８０３，８０４の発光量を基に補正を行うように構成されている点、その補正画像情報からグレースケールの画像情報を合成する画像合成回路７０４が設けられている点である。
【００５０】
図中、７１１は第１の画像補正回路７０２で補正された第１の補正画像情報、７１２は第２の画像補正回路７０３で補正された第２の補正画像情報、７１３は画像合成回路７０４で合成された合成画像情報（グレースケールの画像情報）である。実施の形態１と同様の構成あるいは動作を有する物は同じ符号を付して詳しい説明を省略する。
【００５１】
図８は検査対象のスライド７０１を拡大して示す。スライド７０１には、実施の形態１で説明した第１のサンプルスポット２１１及び第２のサンプルスポット２１２が形成されている。それぞれ、解析対象の生体物質の量に応じた発光量で発光する。第１の基準スポット８０３は第１の画像補正回路７０２での補正の基準となるものであり、第１のサンプルスポット２１１と同じ発光スペクトルを持つ。同様に、第２の基準スポット８０４は第２の画像補正回路７０３での補正の基準となるものであり、第２のサンプルスポット２１２と同じ発光スペクトルを持つ。
【００５２】
第１の基準スポット８０３及び第２の基準スポット８０４は、図示したように第１のサンプルスポット２１１及び第２のサンプルスポット２１２を定着した領域とは別途の基準スポット領域８０１に形成してもよいし、同じ領域に設けてもよい。同じ領域に設ける場合は、第１の基準スポット８０３と第１のサンプルスポット２１１とが隣り合わないように、また第２の基準スポット８０４と第２のサンプルスポット２１２とが隣り合わないように配置する。
【００５３】
第１の基準スポット８０３と第２の基準スポット８０４を形成する際には、それぞれルシフェラーゼを同量だけ結合させる。第１及び第２のサンプルスポット２１１，２１２、第１及び第２の基準スポット８０３，８０４においてルシフェラーゼが結合する量は、解析対象の生体物質の量に依存するので、第１及び第２の基準スポット８０３，８０４には、解析対象の生体物質と同等の結合能を有していて、含有量が既知のハウスキーピング遺伝子によって生成される蛋白質（例えば、ＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、β−アクチン、β２−マイクログロブリン）を供給してもよいし、あるいは、生体物質の含有量が予め分かっているサンプルから分取して供給してもよい。
【００５４】
以下、図７の生体物質検出装置による解析方法を説明する。
実施の形態１と同様にして、カラー画像取得部１０２がスライド７０１のカラー画像情報１１１を取得し、出力し、画像抽出回路１０３が前記カラー画像情報１１１から第１の抽出画像情報１１２及び第２の抽出画像情報１１３を抽出する。これら第１の抽出画像情報１１２及び第２の抽出画像情報１１３の輝度値はＩ１（ｍ，ｎ）とＩ２（ｍ，ｎ）である。
【００５５】
次に、第１の画像補正回路７０２及び第２の画像補正回路７０３が互いの画像情報を定量評価できるよう補正を行う。
このためにまず、標識酵素（ルシフェラーゼ）の種類毎の基準スポットの発光量を求める。つまり、第１の画像補正回路７０２は、第１の補正画像情報１１２から第１の基準スポット８０３を抽出し、発光量を計算する。この発光量は、第１の基準スポット８０３のピーク値としてもよいし、第１の基準スポット８０３中の輝度値を積算した値としてもよい。算出した値を補正係数Ｒ１とする。同様に、第２の画像補正回路７０３は、第２の補正画像情報１１３から第２の基準スポット８０４を抽出し、発光量を計算する。算出した値を補正係数Ｒ２とする。
【００５６】
次に、標識酵素の種類毎の基準スポットの発光量が等しくなるように、前記標識酵素の種類毎の抽出画像情報を補正する。つまり、第１の画像補正回路７０２は、実施の形態１で説明した式（５）に補正係数Ｒ１とＲ２を当てはめることにより、取得画像を補正した第１の補正画像情報７１１（Ｃ１（ｍ，ｎ））を得る。同様に、第２の画像補正回路７０３は、実施の形態１で説明した式（６）に補正係数Ｒ１とＲ２を当てはめることにより、取得画像を補正した第２の補正画像情報７１２（Ｃ２（ｍ，ｎ））を得る。第１および第２の画像補正回路７０２，７０３は各々、第１の補正画像情報７１１，第２の補正画像情報７１２を出力する。
【００５７】
その後に、画像合成回路７０４が、第１の補正画像情報７１１と第２の補正画像情報７１２を合成して合成画像情報７１３を作成する。つまり各座標の輝度値を求める際に、第１の補正画像情報７１１におけるその座標の輝度値と第２の補正画像情報７１２におけるその座標の輝度値とを比較し、より大きい輝度値をとって、合成画像情報７１３の輝度値とする。
【００５８】
図９において、９０１は合成画像情報７１３の輝度分布である。６０３は、実施の形態１で説明した、第２のサンプルスポット２１２の干渉を受けていない場合の、理想となる第１のサンプルスポット２１１の輝度分布を示している。同様に、６０４は、第１のサンプルスポット２１１の干渉を受けていない場合の、理想となる第２のサンプルスポット２１２の輝度分布を示す。合成画像情報７１３は、第１のサンプルスポット２１１と第２のサンプルスポット２１２との干渉の量を低減させたグレースケールの画像情報となっている。
【００５９】
１色のルシフェラーゼで発光する検体をスポットして通常のモノクロカメラで取得する従来法では、各スポット間が干渉した画像となるのに対し、本方法では、２枚の補正画像を作成するので、各補正画像は隣り合ったスポット間の干渉が低減されたものとなり、この２枚の補正画像を合成するので、従来と同様に全てのスポットが１枚の画像中に収まり、かつ、スポット間の干渉が低減されたグレースケールの画像となるのである。
【００６０】
このため、この１つのグレースケールの画像情報によって、解析を行うことができる。第１のサンプルスポット２１１に関しては輝度分布６０３の解析領域１００４の輝度値の積算値を用いて解析し、第２のサンプルスポット２１２に関しては輝度分布６０４の所定の解析領域１００４の輝度値の積算値を用いて解析することができるのである。
【００６１】
以上説明したように、実施の形態２の生体物質検出装置によれば、スライド７０１に第１の基準スポット８０２及び第２の基準スポット８０３を設けるようにしたことにより、予め標識酵素の発光スペクトルの詳細な情報とカラー画像取得部１０２の詳細な感度特性が得られなくても、隣接した第１及び第２のサンプルスポット２１１，２１２の発光による干渉、それによって生じる測定誤差を低減させることができる。
【００６２】
また画像合成回路７０４によって合成画像情報７１３を作成するようにしたことにより、この１つの合成画像情報７１３のみによって、つまり２つ以上の画像情報を用いるのでなく、解析を行うことができる。このことは、これまでの１種類の酵素標識方式で用いて解析手段を使用できることを意味する。合成画像情報７１３というグレースケールの画像１枚にまとめることができ、かつスポット間の干渉は低減されるため、従来よりある、１枚の画像を解析する解析手段を用いることが可能なのである。上記の実施の形態１では、用いたルシフェラーゼの色数だけ画像を作成するため、実際の解析はそれぞれの画像毎に行う必要があり、各色毎に解析手段を設けなければならないのに較べて、有利である。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明にかかる生体物質検出装置は、スポット間における互いの発光の干渉を低減させることができるので、検査基盤に高密度にスポットした検体の解析装置等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の実施の形態１における生体物質検出装置のシステム構成図
【図２】検査対象のスライドの拡大図
【図３】スライドに用いる標識酵素による相対発光スペクトル図
【図４】図１の生体物質検出装置におけるカラー画像取得部の相対感度特性図
【図５】図４に示す相対感度特性を持つカラー画像取得部で取得した画像情報の輝度分布を示す図
【図６】図１の生体物質検出装置での補正画像情報の輝度分布を示す図
【図７】本発明の実施の形態２における生体物質検出装置のシステム構成図
【図８】検査対象のスライドの拡大図
【図９】図７の生体物質検出装置での合成画像情報の輝度分布を示す図
【図１０】従来より生体物質検出に用いられている標識酵素による輝度分布を示す図
【符号の説明】
【００６５】
１０１ スライド
１１１ カラー画像情報
１１２ 第１の抽出画像情報
１１３ 第２の抽出画像情報
１１４ 第１の補正画像情報
１１５ 第２の補正画像情報
２１１ 第１のサンプルスポット
２１２ 第２のサンプルスポット
３０１ 第１の発光スペクトル
３０２ 第２の発光スペクトル
４０１ 青色感度曲線
４０２ 緑色感度曲線
４０３ 赤色感度曲線
５０１ 画像情報ＩＲの輝度分布
５０２ 画像情報ＩＧの輝度分布
５０３ 画像情報ＩＢの輝度分布
５０４ 検体Ｃのスポット中心位置
５０５ 検体Ｄのスポット中心位置
６０１ 第１の補正画像情報の輝度分布
６０２ 第２の補正画像情報の輝度分布
６０３ 輝度分布
６０４ 輝度分布
７０１ スライド
７０２ 第１の画像補正回路
７０３ 第２の画像補正回路
７０４ 画像合成回路
７１１ 第１の補正画像情報
７１２ 第２の補正画像情報
７１３ 合成画像情報
８０１ 基準スポット領域
８０３ 第１の基準スポット
８０４ 第２の基準スポット
９０１ 合成画像情報の輝度分布
１００１ 輝度分布
１００２ 輝度分布
１００３ 取得輝度分布
１００４ 解析領域
１００５ 検体Ａのスポット中心位置
１００６ 検体Ｂのスポット中心位置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質検出装置に関し、詳細には、発光もしくは蛍光性質を有する検体を定着した複数のスポットを有する検査基盤の画像を取得して解析を行う生体物質検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生化学・分子生物学分野においては、従来より、発光もしくは蛍光標識酵素で標識され検査基盤等の複数のスポット領域に分布された検体の画像を取得し、取得した画像から各スポット領域の検体を解析する生体物質検出装置がある。
【０００３】
たとえば特許文献１に、モノクロのＣＣＤカメラで撮影した画像から、検体のスポットを含み且つそれぞれの面積が等しくなるような円形領域にて、スポットおよびその周辺の画素の輝度値を積算して、スポットの値とする方法が開示されている。
【０００４】
しかしこの方法は、互いのスポットからの光が干渉しない場合には有効であるものの、スポット間の距離が近い場合にスポット間の光が干渉して誤差が生じる。図１０は隣り合って定着された２つの検体Ａ，検体Ｂのスポットのモノクロ画像情報における輝度分布を２次元で示したものである。検体Ａ，検体Ｂは同じ発光スペクトルを持った標識酵素で標識され、同等の強度で発光するものである。図中、１００５及び１００６は各々、検体Ａ及び検体Ｂのスポット中心位置である。１００１及び１００２は各々、検体Ａ、検体Ｂについての、干渉を受けない理想的な輝度分布を示している。１００３は、実際に取得される輝度分布を示しており、２つの検体Ａ，Ｂが互いに干渉を起こしていることが表れている。検体Ａを実際に解析するときは、輝度分布１００３を用いて、解析領域１００４の輝度値を積算して行うので、輝度分布１００２の干渉の影響によって誤差を生じることとなる。検体Ｂについても同様である。
【０００５】
このようなスポット間の干渉を低減するために、例えば特許文献２に、マイクロタイタープレートの複数のスポット領域（ウェル）の画像を取得する際に、ＣＣＤカメラ等の画像取得手段とマイクロタイタープレートとの間に各ウェルに対応した開口部を有する遮光プレートを配設して、隣り合うウェルからの発光もしくは蛍光を遮光するようにした装置が提案されている。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００２／００１４７７公報
【特許文献２】特開２００５−２７４３５５公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献２の装置は、上述のようにマイクロタイタープレートに対して遮光プレートを用いているもので、検体のスポット間隔が微小となるマイクロアレイなどの検査基盤に対しては、遮光プレートの開口部の微小化と位置決めが非常に困難であり、適用し難い。
【０００７】
本発明は、上記問題を解決するもので、微小間隔でスポットされた検体を解析する際のスポット間の干渉による測定誤差を低減できる生体物質検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明の生体物質検出装置は、発光もしくは蛍光性質を有する検体を定着した複数のスポットを有する検査基盤の画像を取得して生体物質の解析を行う生体物質検出装置であって、隣り合うスポットが異なる発光スペクトルで発光するように複数種類の標識酵素で標識した検体をアレイ状に定着した検査基盤を対象とし、前記検査基盤の画像をカラー画像情報として取得するカラー画像取得部と、前記カラー画像情報から前記標識酵素の種類毎に対応した画像情報を抽出し、抽出した複数の抽出画像情報を出力する画像抽出回路と、前記複数の抽出画像情報の各々に対応して設けられていて、各抽出画像情報間で定量的な評価が可能となるように各抽出画像情報を補正し、補正画像情報を出力する画像補正回路とを備えたことを特徴とする。
【０００９】
上記構成によれば、標識酵素の種類毎に対応した画像情報を抽出し、補正するようにしたことにより、隣接するスポット間の発光による干渉を低減することができる。
なお、「発光スペクトル」は、発光、蛍光の双方のスペクトルを意味することとする。「標識酵素で標識した検体」は、検体、すなわち複数の生体物質を含む検査対象物に、発光の標識化処理を酵素で行ったものを指し、検体の例はヒトの血液である。生体物質は、生体を構成する基本材料である生体高分子（核酸、タンパク質、多糖）や、これらの構成要素であるヌクレオチド、ヌクレオシド、アミノ酸、各種の糖など、ならびに脂質やビタミン、ホルモンなどを指す。
【００１０】
複数の補正画像情報を１つに合成して合成画像情報を出力する画像合成回路をさらに備えることができる。
画像補正回路は、標識酵素の発光スペクトルとカラー画像取得部の視感度特性とから補正係数を算出し、算出した補正係数を用いて各抽出画像情報を補正するように構成することができる。
【００１１】
検査基盤に、標識酵素の種類毎に発光量を定量化するための基準スポットを設けたときには、画像補正回路は、標識酵素の種類毎の抽出画像情報から前記基準スポットを抽出し、その発光量を算出し、発光量値より補正係数を算出し、算出した補正係数を用いて、前記標識酵素の種類毎の基準スポットの発光量が等しくなるように、前記標識酵素の種類毎の抽出画像情報を補正するように構成することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体物質検出装置によれば、検査基盤にスポットされた各検体を解析する際に、隣接するスポット間の発光による干渉を低減し、測定誤差を低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１の生体物質検出装置およびそれによる解析方法について図１から図６を用いて説明する。
【００１４】
図１は生体物質検出装置のシステム構成を示す。１０２はカラー画像取得部、１０３は画像抽出回路、１０４は第１の画像補正回路、１０５は第２の画像補正回路である。１０１は検査対象のスライドである。
【００１５】
スライド１０１は、生化学反応によって発光する検体が小基盤上にアレイ状に定着されているもので、一般にマイクロアレイ、ＤＮＡチップと呼ばれるものである。検体は、隣り合う一方の検体ともう一方の検体とが異なる発光スペクトルで発光するように、複数種類の標識酵素で標識されアレイ状に定着（スポット）されている。ここでは、２種類の検体であって、異なる発光スペクトルを持つ標識酵素で標識された検体が用いられており、その一方の検体が第１のサンプルスポット２１１を形成し、もう一方の検体が第２のサンプルスポット２１２を形成している。これら第１のサンプルスポット２１１と第２のサンプルスポット２１２は、互いに隣り合わないように、縦方向・横方向に交互に配置されている。
【００１６】
カラー画像取得部１０２はスライド１０１を撮像して、カラー画像情報１１１を取得し、出力する。画像抽出回路１０３は、カラー画像情報１１１から、特定の波長領域の画像情報である第１の抽出画像情報１１２と、それとは異なる波長領域の画像情報である第２の抽出画像情報１１３とを抽出し、出力する。第１の画像補正回路１０４は、第１の抽出画像情報１１２を第２の抽出画像情報１１３と定量評価する為に補正を行い、第１の補正画像情報１１４を出力する。第２の画像補正回路１０５は、第１の画像補正回路１０４と同様に補正を行い、第２の補正画像情報１１５を出力する。
【００１７】
この生体物質検出装置は、検体の発光スペクトルを２種類とした上述のスライド１０１に対応したシステム構成であるが、発光スペクトルが３種類以上の場合には、その波長領域の種類の数だけ抽出画像情報を出力することとし、それぞれの抽出画像情報に対して画像補正回路を備えるシステム構成とする。
【００１８】
以下、図１の生体物質検出装置による解析方法を説明する。
まず、図２に拡大して示す検査対象のスライド１０１を準備する。つまり、ガラス製（シリコン製でもよい）の小基盤上に、隣り合う第１のサンプルスポット２１１と第２のサンプルスポット２１２とが異なる発光スペクトルで発光するように、複数種類の標識酵素で標識した検体をアレイ状に定着する。
【００１９】
ここでは、標識酵素で標識した検体は、解析対象の生体物質（抗原）と、それに特異的に結合する特異的反応物質（抗体）と、これら生体物質と特異的反応物質のいずれかに予め結合された標識酵素とを含むものとしており、生体物質と特異的反応物質と標識酵素との複合体の生成量に応じた発光量で、つまり解析対象の生体物質の量に応じた発光量で標識酵素が発光する。標識酵素としては、発光色が異なる２種類のルシフェラーゼを用い、第１のサンプルスポット２１１は緑色で発光するルシフェラーゼで標識化し、第２のサンプルスポット２１２は赤色で発光するルシフェラーゼで標識化する。
【００２０】
使用する標識酵素（ルシフェラーゼ）による相対発光スペクトルを図３に示す。３０１は緑色に発光するルシフェラーゼの発光スペクトル（第１の発光スペクトルと呼ぶ）である。３０２は赤色に発光するルシフェラーゼの発光スペクトル（第２の発光スペクトルと呼ぶ）である。第１の発光スペクトル３０１を波長λに対する関数Ｌ１（λ）と定義し、第２の発光スペクトル３０２を同じく関数Ｌ２（λ）と定義することとする。図中では、Ｌ２（λ）のピークを１として、それに対する強度（相対強度）を示している。第１の発光スペクトル３０１と第２の発光スペクトル３０２は予め分光計等によってスペクトル分布を測定しておく。このような発光スペクトルを持つルシフェラーゼとして、例えば東洋ビーネット株式会社製のマルチカラールック（登録商標）Ｕｌｔｒａ−ＨＴＳ発光試薬がある。
【００２１】
準備したスライド１０１を所定の位置にセットし、システムをスタートさせると、カラー画像取得部１０２がスライド１０１を撮像してカラー画像情報１１１を取得し、出力する。
【００２２】
カラー画像取得部１０２としては一般のカラーＣＣＤカメラを用いることができるが、ここでは図４に示すようなＲＧＢの視感度特性を持つカラーＣＣＤを用いることとする。図中、４０１は撮影対象の波長に対する青色の感度を示す青色感度曲線であり、同じく、４０２は緑色の感度を示す緑色感度曲線、４０３は赤色の感度を示す赤色感度曲線である。
【００２３】
青色感度曲線４０１を波長λに対する関数Ｆｂ（λ）、緑色感度曲線４０２を同じく関数Ｆｇ（λ）、赤色感度曲線４０３を同じく関数Ｆｒ（λ）と定義することとする。図中では、Ｆｒ（λ）のピークを１として、それに対する感度（相対感度）を示している。青色感度曲線４０１と緑色感度曲線４０２と赤色感度曲線４０３は、予め分光計等によってスペクトル分布を測定しておく。
【００２４】
また、青色感度で取得された画像情報をＩＢ、その輝度値をＩＢ（ｍ，ｎ）、緑色感度で取得された画像情報をＩＧ、その輝度値をＩＧ（ｍ，ｎ）、赤色感度で取得された画像情報の輝度値をＩＲ、その輝度値をＩＲ（ｍ，ｎ）と定義することとする。ｍは横軸方向の画素位置、ｎは縦軸方向の画素位置である。カラー画像情報１１１の大きさは縦４８０画素、横６４０画素であり、ｍは０から６３９、ｎは０から４７９の画素位置をとる。
【００２５】
図５（ａ）（ｂ）（ｃ）は上述のように取得した画像情報における検体の輝度分布を示したものである。
説明を簡単にするために、検体のスポットを２個として、また両スポットにルシフェラーゼが同量結合しているとして、輝度分布を２次元で（つまり両スポットの中心位置を通るライン上の輝度値を）、示している。両スポットを、先と同様に、第１のサンプルスポット２１１，第２のサンプルスポット２１２と呼ぶ。
【００２６】
５０１は画像情報ＩＲの輝度分布、５０２は画像情報ＩＧの輝度分布、５０３は画像情報ＩＢの輝度分布である。５０４は第１のサンプルスポット２１１の中心位置であり、５０２は第１のサンプルスポット２１２の中心位置である。両スポットのルシフェラーゼの結合量が等しくても、前述したようにルシフェラーゼの発光スペクトル分布とカラーＣＣＤカメラの各色の感度曲線が異なるため、同等の発光強度とはならない。
【００２７】
カラー画像取得部１０２からの出力を受けて、画像抽出回路１０３は、カラー画像情報１１１から、第１のサンプルスポット２１１の発光と第２のサンプルスポット２１２の発光とを分離して抽出する。
【００２８】
第１のサンプルスポット２１１について抽出する画像情報の輝度値をＩ１（ｍ，ｎ）、第２のサンプルスポット２１２について抽出する画像情報の輝度値をＩ２（ｍ，ｎ）とすると、各々、以下に示す計算式（１）（２）で算出される。
【００２９】
【数１】
式（１）（２）は、重み付けをした画像情報ＩＢ、ＩＧ、ＩＲの輝度値を加算・減算することを表している。第１のサンプルスポット２１１にかかるＩ１（ｍ，ｎ）は、上述のように緑色で発光するルシフェラーゼで標識化しているため、つまりＩＧ（ｍ，ｎ）のみの成分と仮定しているため、ａ１＝０、ｂ１＝１、ｃ１＝０となり、式（１）′で表されることとなり、図５（ｂ）と同じ輝度分布となる。同様に、第２のサンプルスポット２１２にかかるＩ２（ｍ，ｎ）は、ＩＲ（ｍ，ｎ）のみの成分と仮定しているため、ａ２＝０、ｂ２＝０、ｃ２＝１となり、式（２）′で表されることとなり、図５（ａ）と同じ輝度分布となる。
【００３０】
画像抽出回路１０３は、Ｉ１（ｍ，ｎ）の輝度値を持つ画像情報を第１の抽出画像情報１１２として、またＩ２（ｍ，ｎ）の輝度値を持つ画像情報を第２の抽出画像情報１１３として、出力する。
【００３１】
（ステップ４）
画像抽出回路１０３からの出力を受けた第１の画像補正回路１０４，第２の画像補正回路１０５は、互いの第１の抽出画像情報１１２，第２の抽出画像情報１１３を定量評価できるように補正を行い、第１の補正画像情報１１４，第２の補正画像情報１１５を出力する。
【００３２】
補正に際しては、上述の発光スペクトル分布（Ｌ１（λ），Ｌ２（λ））と、カラーＣＣＤカメラの前記発光スペクトルに対応する色の色感度曲線（Ｆｂ（λ），Ｆｇ（λ），Ｆｒ（λ））とを用いて補正係数を算出し、算出した補正係数を用いる。
【００３３】
詳細にはまず、第１の抽出画像情報１１２の補正係数Ｒ１および第２の抽出画像情報１１３の補正係数Ｒ２を、以下に示す式（３）（４）によって算出する。
【００３４】
【数２】
式（３）（４）において、Ｆｂ（λ）、Ｆｇ（λ）、及びＦｒ（λ）への重み付けａ１，ｂ１，ｃ１，ａ２，ｂ２，ｃ２は、上述の式（１）（２）で各色の画像情報に付した重み付けと同じものを用いる。
【００３５】
式（３）において、｛ａ１×Ｆｂ（λ）＋ｂ１×Ｆｇ（λ）＋ｃ１×Ｆｒ（λ）｝は、ＣＣＤカメラの各色の色感度曲線に式（１）に用いたのと同じ重み付けをして得られる輝度値を示している。従って、この輝度値を発光スペクトルＬ１（λ）と掛け合わせ、全波長領域において積算することにより、緑色で発光する一定量のルシフェラーゼの画像をカラーＣＣＤカメラで取得して、式（１）で計算した時の輝度値を得ることができる。
【００３６】
つまり、式（３）は、Ｌ１（λ）の発光スペクトルを持つルシフェラーゼをモノクロカメラで撮影した場合に取得される輝度値の理想値を計算によって求めるものである。Ｌ１（λ）×Ｆｂ（λ）は青色成分を輝度値に変換する項、Ｌ１（λ）×Ｆｇ（λ）は緑色成分を輝度値に変換する項、Ｌ１（λ）×Ｆｒ（λ）は赤色成分を輝度値に変換する項である。式（１）では青・緑・赤の輝度値を合成する際に各色に重み付けをしているので、式（３）でも同じ重み付けをする。これによって、Ｌ１（λ）の発光スペクトルを式（１）と同じ重み付けで取得した輝度値を計算によって求めることができる。これが第１の抽出画像情報１１２の補正係数Ｒ１である。
【００３７】
式（４）は、Ｌ２（λ）の発光スペクトルを持つルシフェラーゼをモノクロカメラで撮影した場合に取得される輝度値の理想値を計算によって求めるものである。上記と同様にして、Ｌ２（λ）の発光スペクトルを式（２）と同じ重み付けで取得した輝度値を計算によって求めることができる。これが第２の抽出画像情報１１３の補正係数Ｒ２である。
λ＿ｍａｘは積分の上限を示す。全波長領域において積算するため理論上は無限大であるが、本実施の形態では有限の値として１０００ｎｍを採用する。したがって、Ｒ１は、ａ１＝０、ｂ１＝１、ｃ１＝０、および、λ＿ｍａｘ＝１０００を用いた式（３）′で表され、算出される。またＲ２は、ａ２＝０、ｂ２＝０、ｃ２＝１、および、λ＿ｍａｘ＝１０００を用いた式（４）′で表され、算出される。
【００３８】
ここで、第１のサンプルスポット２１１と第２のサンプルスポット２１２に上述したようにルシフェラーゼが同量結合して発光している場合、算出されるＲ１とＲ２との比は、第１の抽出画像情報１１２で取得される輝度値Ｉ１（ｍ，ｎ）と第２の抽出画像情報１１３で取得されるＩ２（ｍ，ｎ）との比を示す。したがって、以下の計算式（５）によって、Ｉ１（ｍ，ｎ）を補正することによって、Ｉ２（ｍ，ｎ）と直接比較できる画像情報の輝度値を求めることができる。
【００３９】
詳述する。上述したように、Ｌ１（λ）とＬ２（λ）は、同量のルシフェラーゼ発光させた場合に得られる発光スペクトルであり、これらＬ１（λ）とＬ２（λ）は相対的な特性を示す。また式（３）は、Ｌ１（λ）の発光スペクトルを持つルシフェラーゼを発光させてモノクロカメラで撮影した場合の輝度値の計算値であり、式（４）は、Ｌ２（λ）の発光スペクトルを持つルシフェラーゼを同量発光させてモノクロカメラで撮影した場合の輝度値の計算値である。
【００４０】
したがって、式（３）の値Ｒ１と式（４）の値Ｒ２の比をとると、同量のルシフェラーゼを発光させた場合にカメラで取得される輝度値の比となる。ルシフェラーゼの量を比較するためには、式（３）もしくは式（４）の値を用いて正規化する必要がある。
【００４１】
ここで、Ｉ１（ｍ，ｎ）とＩ２（ｍ，ｎ）はそれぞれ、Ｌ１（λ）の成分、Ｌ２（λ）の成分を抽出した画像となっているが、抽出するという手法をとっているので、同量のルシフェラーゼが撮影されたとしても、式（３）と式（４）で示したように同じ輝度値にはならない。Ｉ１（ｍ，ｎ）中のＬ１（λ）成分のルシフェラーゼの量とＩ２（ｍ，ｎ）中
のＬ２（λ）成分のルシフェラーゼの量とを輝度値にて比較するためには、理想的な比率（つまり、式（３）と式（４））で正規化する必要がある。以下の式（５）は、式（３）、つまりＲ２を１として正規化するための計算を行っている。式（６）は、Ｒ２で正規化するため、そのままである。
【００４２】
式（５）に示すＣ１（ｍ，ｎ）は、第１の抽出画像情報１１２を補正してできる、第１の補正画像情報１１４の輝度値である。式（６）に示すＣ２（ｍ，ｎ）は、第２の抽出画像情報１１３を補正してできる、第２の補正画像情報１１５の輝度値である。このＣ２（ｍ，ｎ）では、Ｉ２（ｍ，ｎ）をそのまま用いており、補正係数による補正を行っていない。上述の通り、Ｉ１（ｍ，ｎ）をＩ２（ｍ，ｎ）と同じ比較ができるように補正したためである。式（５）（６）より式（５）′（６）′を得る。なお、Ｉ２（ｍ，ｎ）をＩ１（ｍ，ｎ）と同じ比較できるように補正しても構わないし、Ｉ２（ｍ，ｎ）とＩ１（ｍ，ｎ）を両方補正しても構わない。
【００４３】
【数３】
図６は、上述の式（５）′（６）′に基づいて、第１の抽出画像情報１１２（図５（ｂ））と第２の抽出画像情報１１３（図５（ａ））を補正して得られた、第１の補正画像情報１１４と第２の補正画像情報１１５の輝度分布である。図６（ａ）において、６０１は第１の補正画像情報１１４の輝度分布であり、６０３は第２のサンプルスポット２１２の干渉を受けていない場合の、理想となる第１のサンプルスポット２１１の輝度分布を示す。図６（ｂ）において、６０２は第２の補正画像情報１１５の輝度分布であり、６０４は第１のサンプルスポット２１１の干渉を受けていない場合の、理想となる第２のサンプルスポット２１２の輝度分布を示す。
【００４４】
得られた第１の補正画像情報１１４と第２の補正画像情報１１５を用いて解析を行う際、第１のサンプルスポット２１１に関しては輝度分布６０１の所定の解析領域１００４の輝度値の積算値を用いて解析する。同様に、第２のサンプルスポット２１２に関しては輝度分布６０２の所定の解析領域の輝度値の積算値を用いて解析する。
【００４５】
解析領域１００４は隣合ったスポットの間に設ける。領域を大きくすれば目的のスポットからの光を取る量が大きくなる一方、隣のスポットからの干渉の影響が大きくなるのであるが、前者であるシグナル成分（Ｓ）と、後者であるノイズ成分（Ｎ）とにつき、Ｓ／Ｎが最大となる領域を解析領域１００４とする。実際には、予め、それぞれのルシフェラーゼをスポットしたスライドを用意しておき、互いが干渉を起さない状態で画像（ＩＡ，ＩＢ）を取得し、２つの画像を合成して合成画像（ＩＣ）を作成する。合成する際には、それぞれのスポットを測定する条件と同じ間隔となるようにする。ＩＡ中のルシフェラーゼのスポットを中心として円形の領域を広げていき、円形の領域中の総輝度値をＳ、ＩＣの同領域中の総輝度値をＳ＋Ｎとし、Ｓ／Ｎを求める。そして、このＳ／Ｎが最大となる領域を解析領域１００４とする。
【００４６】
以上のようにして第１のサンプルスポット２１１の検体を輝度分布６０１の解析領域１００４の積算値を用いて解析する場合、輝度分布６０３の積算値との差は全積算値（図中の斜線部分）の３％以下となる。先の図１０に示した解析領域１００４（同じ発光スペクトルを持つ標識酵素を用いたもの）の積算値を用いる場合と比較すると３分の１程度の誤差となる。第１の補正画像情報１１４において、スポット領域外からの発光によるノイズ、つまり第２のサンプルスポット２１２での発光による影響がされるためである。同様に、第２のサンプルスポット２１２の検体を輝度分布６０２の所定の解析領域の積算値を用いて解析する場合も、第２の補正画像情報１１５において、第１のサンプルスポット２１１での発光による影響が低減されるため、誤差が低減される。
【００４７】
以上は、第１のサンプルスポット２１１と第２のサンプルスポット２１２という２個のスポットにルシフェラーゼが同量結合して発光している場合について説明したが、同量でない場合や、３個以上のスポットを設ける場合も、同じ手法を用いることができる。
【００４８】
以上説明したように、実施の形態１の生体物質検出装置によれば、異なる発光スペクトルの標識酵素で標識された２種類の検体がアレイ状にスポットされたスライド１０１の撮像画像から、第１の抽出画像情報１１２と第２の抽出画像情報１１３とを抽出し、発光スペクトルと撮像手段の感度曲線とを用いてそれぞれを補正するようにしたことにより、隣接するスポット間の発光による干渉で生じる測定誤差を低減させることができる。
（実施の形態２）
図７は本発明の実施の形態２の生体物質検出装置のシステム構成を示す。
【００４９】
この実施の形態２の生体物質検出装置が実施の形態１のものと異なるところは、第１および第２の基準スポット８０３，８０４が設けられたスライド７０１を検査対象としており、それに対応して、第１の画像補正回路７０２及び第２の画像補正回路７０３がスライド７０１の第１および第２の基準スポット８０３，８０４の発光量を基に補正を行うように構成されている点、その補正画像情報からグレースケールの画像情報を合成する画像合成回路７０４が設けられている点である。
【００５０】
図中、７１１は第１の画像補正回路７０２で補正された第１の補正画像情報、７１２は第２の画像補正回路７０３で補正された第２の補正画像情報、７１３は画像合成回路７０４で合成された合成画像情報（グレースケールの画像情報）である。実施の形態１と同様の構成あるいは動作を有する物は同じ符号を付して詳しい説明を省略する。
【００５１】
図８は検査対象のスライド７０１を拡大して示す。スライド７０１には、実施の形態１で説明した第１のサンプルスポット２１１及び第２のサンプルスポット２１２が形成されている。それぞれ、解析対象の生体物質の量に応じた発光量で発光する。第１の基準スポット８０３は第１の画像補正回路７０２での補正の基準となるものであり、第１のサンプルスポット２１１と同じ発光スペクトルを持つ。同様に、第２の基準スポット８０４は第２の画像補正回路７０３での補正の基準となるものであり、第２のサンプルスポット２１２と同じ発光スペクトルを持つ。
【００５２】
第１の基準スポット８０３及び第２の基準スポット８０４は、図示したように第１のサンプルスポット２１１及び第２のサンプルスポット２１２を定着した領域とは別途の基準スポット領域８０１に形成してもよいし、同じ領域に設けてもよい。同じ領域に設ける場合は、第１の基準スポット８０３と第１のサンプルスポット２１１とが隣り合わないように、また第２の基準スポット８０４と第２のサンプルスポット２１２とが隣り合わないように配置する。
【００５３】
第１の基準スポット８０３と第２の基準スポット８０４を形成する際には、それぞれルシフェラーゼを同量だけ結合させる。第１及び第２のサンプルスポット２１１，２１２、第１及び第２の基準スポット８０３，８０４においてルシフェラーゼが結合する量は、解析対象の生体物質の量に依存するので、第１及び第２の基準スポット８０３，８０４には、解析対象の生体物質と同等の結合能を有していて、含有量が既知のハウスキーピング遺伝子によって生成される蛋白質（例えば、ＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、β−アクチン、β２−マイクログロブリン）を供給してもよいし、あるいは、生体物質の含有量が予め分かっているサンプルから分取して供給してもよい。
【００５４】
以下、図７の生体物質検出装置による解析方法を説明する。
実施の形態１と同様にして、カラー画像取得部１０２がスライド７０１のカラー画像情報１１１を取得し、出力し、画像抽出回路１０３が前記カラー画像情報１１１から第１の抽出画像情報１１２及び第２の抽出画像情報１１３を抽出する。これら第１の抽出画像情報１１２及び第２の抽出画像情報１１３の輝度値はＩ１（ｍ，ｎ）とＩ２（ｍ，ｎ）である。
【００５５】
次に、第１の画像補正回路７０２及び第２の画像補正回路７０３が互いの画像情報を定量評価できるよう補正を行う。
このためにまず、標識酵素（ルシフェラーゼ）の種類毎の基準スポットの発光量を求める。つまり、第１の画像補正回路７０２は、第１の補正画像情報１１２から第１の基準スポット８０３を抽出し、発光量を計算する。この発光量は、第１の基準スポット８０３のピーク値としてもよいし、第１の基準スポット８０３中の輝度値を積算した値としてもよい。算出した値を補正係数Ｒ１とする。同様に、第２の画像補正回路７０３は、第２の補正画像情報１１３から第２の基準スポット８０４を抽出し、発光量を計算する。算出した値を補正係数Ｒ２とする。
【００５６】
次に、標識酵素の種類毎の基準スポットの発光量が等しくなるように、前記標識酵素の種類毎の抽出画像情報を補正する。つまり、第１の画像補正回路７０２は、実施の形態１で説明した式（５）に補正係数Ｒ１とＲ２を当てはめることにより、取得画像を補正した第１の補正画像情報７１１（Ｃ１（ｍ，ｎ））を得る。同様に、第２の画像補正回路７０３は、実施の形態１で説明した式（６）に補正係数Ｒ１とＲ２を当てはめることにより、取得画像を補正した第２の補正画像情報７１２（Ｃ２（ｍ，ｎ））を得る。第１および第２の画像補正回路７０２，７０３は各々、第１の補正画像情報７１１，第２の補正画像情報７１２を出力する。
【００５７】
その後に、画像合成回路７０４が、第１の補正画像情報７１１と第２の補正画像情報７１２を合成して合成画像情報７１３を作成する。つまり各座標の輝度値を求める際に、第１の補正画像情報７１１におけるその座標の輝度値と第２の補正画像情報７１２におけるその座標の輝度値とを比較し、より大きい輝度値をとって、合成画像情報７１３の輝度値とする。
【００５８】
図９において、９０１は合成画像情報７１３の輝度分布である。６０３は、実施の形態１で説明した、第２のサンプルスポット２１２の干渉を受けていない場合の、理想となる第１のサンプルスポット２１１の輝度分布を示している。同様に、６０４は、第１のサンプルスポット２１１の干渉を受けていない場合の、理想となる第２のサンプルスポット２１２の輝度分布を示す。合成画像情報７１３は、第１のサンプルスポット２１１と第２のサンプルスポット２１２との干渉の量を低減させたグレースケールの画像情報となっている。
【００５９】
１色のルシフェラーゼで発光する検体をスポットして通常のモノクロカメラで取得する従来法では、各スポット間が干渉した画像となるのに対し、本方法では、２枚の補正画像を作成するので、各補正画像は隣り合ったスポット間の干渉が低減されたものとなり、この２枚の補正画像を合成するので、従来と同様に全てのスポットが１枚の画像中に収まり、かつ、スポット間の干渉が低減されたグレースケールの画像となるのである。
【００６０】
このため、この１つのグレースケールの画像情報によって、解析を行うことができる。第１のサンプルスポット２１１に関しては輝度分布６０３の解析領域１００４の輝度値の積算値を用いて解析し、第２のサンプルスポット２１２に関しては輝度分布６０４の所定の解析領域１００４の輝度値の積算値を用いて解析することができるのである。
【００６１】
以上説明したように、実施の形態２の生体物質検出装置によれば、スライド７０１に第１の基準スポット８０２及び第２の基準スポット８０３を設けるようにしたことにより、予め標識酵素の発光スペクトルの詳細な情報とカラー画像取得部１０２の詳細な感度特性が得られなくても、隣接した第１及び第２のサンプルスポット２１１，２１２の発光による干渉、それによって生じる測定誤差を低減させることができる。
【００６２】
また画像合成回路７０４によって合成画像情報７１３を作成するようにしたことにより、この１つの合成画像情報７１３のみによって、つまり２つ以上の画像情報を用いるのでなく、解析を行うことができる。このことは、これまでの１種類の酵素標識方式で用いて解析手段を使用できることを意味する。合成画像情報７１３というグレースケールの画像１枚にまとめることができ、かつスポット間の干渉は低減されるため、従来よりある、１枚の画像を解析する解析手段を用いることが可能なのである。上記の実施の形態１では、用いたルシフェラーゼの色数だけ画像を作成するため、実際の解析はそれぞれの画像毎に行う必要があり、各色毎に解析手段を設けなければならないのに較べて、有利である。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明にかかる生体物質検出装置は、スポット間における互いの発光の干渉を低減させることができるので、検査基盤に高密度にスポットした検体の解析装置等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の実施の形態１における生体物質検出装置のシステム構成図
【図２】検査対象のスライドの拡大図
【図３】スライドに用いる標識酵素による相対発光スペクトル図
【図４】図１の生体物質検出装置におけるカラー画像取得部の相対感度特性図
【図５】図４に示す相対感度特性を持つカラー画像取得部で取得した画像情報の輝度分布を示す図
【図６】図１の生体物質検出装置での補正画像情報の輝度分布を示す図
【図７】本発明の実施の形態２における生体物質検出装置のシステム構成図
【図８】検査対象のスライドの拡大図
【図９】図７の生体物質検出装置での合成画像情報の輝度分布を示す図
【図１０】従来より生体物質検出に用いられている標識酵素による輝度分布を示す図
【符号の説明】
【００６５】
１０１ スライド
１１１ カラー画像情報
１１２ 第１の抽出画像情報
１１３ 第２の抽出画像情報
１１４ 第１の補正画像情報
１１５ 第２の補正画像情報
２１１ 第１のサンプルスポット
２１２ 第２のサンプルスポット
３０１ 第１の発光スペクトル
３０２ 第２の発光スペクトル
４０１ 青色感度曲線
４０２ 緑色感度曲線
４０３ 赤色感度曲線
５０１ 画像情報ＩＲの輝度分布
５０２ 画像情報ＩＧの輝度分布
５０３ 画像情報ＩＢの輝度分布
５０４ 検体Ｃのスポット中心位置
５０５ 検体Ｄのスポット中心位置
６０１ 第１の補正画像情報の輝度分布
６０２ 第２の補正画像情報の輝度分布
６０３ 輝度分布
６０４ 輝度分布
７０１ スライド
７０２ 第１の画像補正回路
７０３ 第２の画像補正回路
７０４ 画像合成回路
７１１ 第１の補正画像情報
７１２ 第２の補正画像情報
７１３ 合成画像情報
８０１ 基準スポット領域
８０３ 第１の基準スポット
８０４ 第２の基準スポット
９０１ 合成画像情報の輝度分布
１００１ 輝度分布
１００２ 輝度分布
１００３ 取得輝度分布
１００４ 解析領域
１００５ 検体Ａのスポット中心位置
１００６ 検体Ｂのスポット中心位置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光もしくは蛍光性質を有する検体を定着した複数のスポットを有する検査基盤の画像を取得して解析を行う生体物質検出装置であって、
隣り合うスポットが異なる発光スペクトルで発光するように複数種類の標識酵素で標識した検体をアレイ状に定着した検査基盤を対象とし、前記検査基盤の画像をカラー画像情報として取得するカラー画像取得部と、
前記カラー画像情報から前記標識酵素の種類毎に対応した画像情報を抽出し、抽出した複数の抽出画像情報を出力する画像抽出回路と、
前記複数の抽出画像情報の各々に対応して設けられていて、各抽出画像情報間で定量的な評価が可能となるように各抽出画像情報を補正し、補正画像情報を出力する画像補正回路とを備えたことを特徴とする生体物質検出装置。
【請求項２】
複数の補正画像情報を１つに合成して合成画像情報を出力する画像合成回路をさらに備えたことを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出装置。
【請求項３】
画像補正回路が、標識酵素の発光スペクトルとカラー画像取得部の視感度特性とから補正係数を算出し、算出した補正係数を用いて各抽出画像情報を補正することを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出装置。
【請求項４】
検査基盤に標識酵素の種類毎に発光量を定量化するための基準スポットが設けられており、画像補正回路は、前記標識酵素の種類毎の抽出画像情報から前記基準スポットを抽出し、その発光量を算出し、発光量値より補正係数を算出し、算出した補正係数を用いて、前記標識酵素の種類毎の基準スポットの発光量が等しくなるように、前記標識酵素の種類毎の抽出画像情報を補正することを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出装置。
【請求項１】
発光もしくは蛍光性質を有する検体を定着した複数のスポットを有する検査基盤の画像を取得して解析を行う生体物質検出装置であって、
隣り合うスポットが異なる発光スペクトルで発光するように複数種類の標識酵素で標識した検体をアレイ状に定着した検査基盤を対象とし、前記検査基盤の画像をカラー画像情報として取得するカラー画像取得部と、
前記カラー画像情報から前記標識酵素の種類毎に対応した画像情報を抽出し、抽出した複数の抽出画像情報を出力する画像抽出回路と、
前記複数の抽出画像情報の各々に対応して設けられていて、各抽出画像情報間で定量的な評価が可能となるように各抽出画像情報を補正し、補正画像情報を出力する画像補正回路とを備えたことを特徴とする生体物質検出装置。
【請求項２】
複数の補正画像情報を１つに合成して合成画像情報を出力する画像合成回路をさらに備えたことを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出装置。
【請求項３】
画像補正回路が、標識酵素の発光スペクトルとカラー画像取得部の視感度特性とから補正係数を算出し、算出した補正係数を用いて各抽出画像情報を補正することを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出装置。
【請求項４】
検査基盤に標識酵素の種類毎に発光量を定量化するための基準スポットが設けられており、画像補正回路は、前記標識酵素の種類毎の抽出画像情報から前記基準スポットを抽出し、その発光量を算出し、発光量値より補正係数を算出し、算出した補正係数を用いて、前記標識酵素の種類毎の基準スポットの発光量が等しくなるように、前記標識酵素の種類毎の抽出画像情報を補正することを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−１５６７１５（Ｐ２００９−１５６７１５Ａ）
【公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３３５４２４（Ｐ２００７−３３５４２４）
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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