生体試料標本の作製方法
【課題】簡便な操作で、多数の抗原を標的とする免疫反応を行うことができ、しかも、同時実験で結果を比較することができる生体試料標本の作製方法を提供すること。
【解決手段】パラフィンブロック２に通孔４を形成する工程、パラフィンブロック２の通孔４内に組織８を充填する工程、パラフィンブロック２にて組織８が包埋された固形試料１０を切断刃によって薄切し、組織８の周囲にパラフィンが配置された薄切片１２を得る工程、複数の薄切片１２をスライドガラス２４上に乗せる工程、薄切片１２のパラフィンを除去する工程、および組織８を染色する工程、を包含する生体試料標本の作製方法である。
【解決手段】パラフィンブロック２に通孔４を形成する工程、パラフィンブロック２の通孔４内に組織８を充填する工程、パラフィンブロック２にて組織８が包埋された固形試料１０を切断刃によって薄切し、組織８の周囲にパラフィンが配置された薄切片１２を得る工程、複数の薄切片１２をスライドガラス２４上に乗せる工程、薄切片１２のパラフィンを除去する工程、および組織８を染色する工程、を包含する生体試料標本の作製方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織、細胞などの生体試料標本の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料（例えば組織切片、タッチスメア、細胞等）に存在する特定の標的物質（例えば抗原）の存在を判別する手法として、該標的物質をシグナルとして可視化し検出する免疫染色法が従来から用いられている。例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法および放射性同位元素標識抗体法がある。
【０００３】
蛍光抗体法は、標的抗原に対する抗体、通常はモノクローナル抗体を蛍光色素で標識し、組織切片上の抗原の分布を判別する手法で、直説法と間接法の２つの二重染色法に分類することができる。前者では、予め蛍光色素標識された抗体を抗原−抗体反応に用いて標的抗原を直接可視化し、後者では、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させ、いわば間接的に標的抗原を可視化する。
【０００４】
酵素抗体法は、同様に抗原−抗体反応という特異反応を利用する手法である。抗体を酵素で標識し、抗原−抗体反応後に該酵素によって発色基質の沈着を生じさせて抗体の局在を示す点に特徴がある。標識酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ；ＧＯ）等が代表的である。
【０００５】
酵素抗体法には、酵素標識抗体法である直説法、間接法およびアビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（Ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＡＢＣ）法と、非標識抗体法としてのペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＰＡＰ）法とがあり、卵白の塩基性蛋白質であるアビジンに代わり、中性に荷電した、即ち中性化処理が不要なストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を用いるストレプトアビジン・ビオチン化抗体（Ｌａｂｅｌｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＳＡＢまたはＬＳＡＢ）法が主流となっている。
【０００６】
対象生体試料を上記免疫染色法に供する場合、通常、凍結切片やパラフィン切片として固相のマトリクス上に固定したものを調製して反応に付する。
【０００７】
このように免疫的染色法を用いることにより、組織または細胞に存在する種々ペプチド性抗原（組織抗原、腫瘍抗原、免疫担当細胞亜型抗原、酵素、ホルモン等）、非ペプチド性の抗原、その他組織に沈着する免疫複合体等の検出が可能であり、各種疾患の診断マーカーの分布を判別することによる病理診断（例えば腫瘍マーカーの判別による腫瘍診断）も行われている。
【０００８】
しかしながら、従来の免疫染色法では、作成した組織標本または細胞標本一つにつき、一種類の免疫反応しか行えないため、多数の抗原を標的とする免疫反応を行う場合にはそれに応じた多数の標本を調製する必要があり、資源と手間が要求される。
【０００９】
特表２０００−５０５４３１号公報（特許文献１）には、固形のパラフィンブロックに複数の穴を形成し（段落００５０）、その穴内にドナー腫瘍ブロックから採取した組織生検を配列し、そのブロックから組織標本用切片を得ることが記載されている（段落００５１−００５３）。
【００１０】
特開２００４−２５８０１７号公報（特許文献２）には、臓器の目的とする部分から複数の組織を切り抜き、これをパラフィンに包埋してアレイブロックを作製する方法が提案されている。
【００１１】
しかし、これらに記載の方法では、染色実験に供する試料が異なるので、たとえ同一の抗体を用いたとしても、結果が異なる可能性がある。実際の病理学的試験においても、結果のばらつきのために、正確な診断ができないという問題がある。このような結果のばらつきは、免疫染色法の信頼性を損なうこととなり、それゆえ、免疫染色法による病理学的試験の障害となっている。それゆえ、免疫染色法ための、多数の均一な組織片を調製する手法および装置が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２０００−５０５４３１号公報
【特許文献２】特開２００４−２５８０１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記課題を解決するためになされたもので、簡便な操作で、多数の組織片（抗原）を標的とする免疫反応を行うことができ、しかも、染色実験に供する試料が同じものであるので、同時実験で適切なコントロールや他の試料の結果を参照することも可能となり、それゆえ、結果を正確に比較することができる生体試料標本の作製方法を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明の他の目的は、上記方法を用いた疾患の病理診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の生体試料標本の作製には、包埋剤を用いる。なお、本明細書において包埋剤とは、組織片などを薄切しやすい状態にする試薬をいい、非親水性または非水溶性のパラフィン、セロイジン、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂や、親水性または水溶性のカーボワックス、ゼラチン等が用いられる。中でも上記パラフィン包埋法が最も一般的且つ常用されている。
【００１６】
本発明の組織観察用薄切片の作製方法は、包埋剤（例えば、パラフィンブロック）に通孔を形成する工程、該パラフィンブロックの通孔内に組織を充填する工程、該パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片を得る工程、複数の該薄切片をスライドガラス上に乗せる工程、該薄切片のパラフィンを溶融させる工程、および該組織を染色する工程、を包含し、そのことにより上記目的が達成される。
【００１７】
一つの実施形態では、前記スライドガラス上に、シランコート又はリジンコートが施されている。
【００１８】
本発明の疾患の病理診断方法は、上記方法を用いることを含む。
【００１９】
本発明の他の生体試料標本の作製方法は、ブロック状の包埋剤に孔部を形成する工程、該包埋剤の孔部内に生体試料を充填する工程、該包埋剤にて生体試料が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該生体試料の周囲に包埋剤が配置された薄切片を得る工程、複数の該薄切片を固相マトリクス上に乗せる工程、該薄切片の周囲に形成された包埋剤を溶融させる工程、および該生体試料を染色する工程、を包含する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片を得、複数の該薄切片をスライドガラス上に乗せることにより、一度の操作で標的分析物質−特異的結合物質の結合反応を多数同時に行え、多数の標的物質（抗原）の同時染色が可能になり、また、標的分析物質に対する特異的結合物質の所要量も従来法に比べて微量で済む。しかも、染色実験に供する試料が同じものであるので、同時実験で結果を比較することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明に係わる生体試料標本の作製方法に使用するパラフィンブロックの通孔に組織を充填し、スライスした工程を示す斜視図である。
【図２】図２は、図１に示す薄切片を切断具にて切断している状態の断面図である。
【図３】図３は、切断具の刃部に付着した切断片をスライドガラス上へ移動する状態を示す説明図である。
【図４】図４は、スライドガラス上に抗体投入用器具を配置する状態の分解斜視図である。
【図５】図５は、スライドガラス上に抗体投入用器具を配置して抗体溶液を充填する状態の断面である。
【図６】図６は、ガラス基板上に弾性層を設けた状態の断面図である。
【図７】図７は、本発明の生体試料標本の作製方法の他の実施形態の作用説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明にかかる方法には、当該技術分野における当業者によって従来から通常用いられる各種染色法の原理を適用することができ、通常はこれらの各種染色法を用いることで検出可能なシグナルを生成させ、標的とする分析物質を判別することができる。
【００２３】
例として、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法等の原理の適用が可能である他、核酸分子を特異的結合物質として用い、核酸分子どうしのハイブリダイゼーションを利用して標的核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を判別することも可能である（例えばＦＩＳＨ法：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法）。また、前記各種抗体法は、目的に応じて直説法、即ち、予め蛍光色素標識された抗体を抗原−抗体反応に用いて標的抗原を直接可視化し、検出する手法でも、間接法、即ち、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させて、間接的に標的抗原を可視化し、検出する手法でもよい。特異的結合物質を標識するための標識物質・標識の仕方は適宜選択される。
【００２４】
本発明において用いる「被検生体試料」とは、主に生物の組織検体、組織片、生物の液状検体または細胞の検体を含んだ試料を意味する。生物種は特に限定されず哺乳動物、両生類、爬虫類等いずれの種であってもよいが、標的分析物質に対応する抗体蛋白質や核酸分子が最もよく知られている種である哺乳動物が好適であり、より好適なのはヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ウマ、サル等で、更に好適なのはヒト、マウス、ラットで、最も好適なのはヒトである。用いられる組織、生物の液状検体、細胞は、通常、組織であれば切片またはタッチスメアとして調製し使用することができ、液状検体であればスメア標本として調製し使用することができ、また、細胞であればやはりスメア標本にして使用することができる。
【００２５】
前記標本は自体公知の方法により容易に調整することができる。用いられる組織、液状検体、細胞は特に限定されずいずれの種類であっても使用可能で、（１）組織の例としては脳組織、肺、胃、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、腸管組織（小腸、大腸、直腸、結腸など）、皮膚組織、神経組織、血管組織、骨格筋（筋肉）・軟骨組織等があげられ、（２）液状検体の例としては胸水、腹水、尿、等があげられ、（３）細胞としては、接着性で塊を形成している細胞、浮遊性の細胞、等限定されず、例えば、前記組織を構成する細胞（脳細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、軟骨細胞等）、血球系細胞（赤血球、血小板細胞、各種白血球・リンパ球（たとえば単球、好中球、好塩基球、好酸球、貪食細胞、肥満細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞））、体腔液（胸腔液、腹腔液、心膜腔液）中の細胞（マクロファージ、リンパ球（例えばＴ細胞、Ｂ細胞等）、好中球、好酸球、中皮細胞、等）があげられる。
【００２６】
標的分析物質としては、生物の組織、細胞等に存在する物質のうち、抗原性を示す物質であれば特に限定されず、いかなる物質であっても本発明により染色可能である。抗原性を示す物質の例としては、蛋白質、核酸分子、糖、その他各種非ペプチド性物質があげられる。（１）蛋白質としては、各種膜蛋白質、各種可溶性蛋白質があり、組織や細胞等に特異的に発現する蛋白質（例えばマーカー蛋白質）、酵素、受容体や、中間フィラメント、間質成分、その他の組織・細胞特異抗原、その他各種の疾患のマーカーとなる蛋白質（例えば癌細胞・腫瘍に特異的な腫瘍マーカー、等）ならどれでも分析可能である。例えば、ＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ：副腎皮質刺激ホルモン）、Ａｃｔｉｎ、α−ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ、Ａｎｄｒｏｇｅｎ受容体、ｂｃｌ−２、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、各種ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抗原、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：癌胎児性抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎＡ、コラーゲン、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、Ｄｅｓｍｉｎ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ抗原、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、エストロゲン受容体、ＦＳＨ（Ｆｏｃａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ ｈｙａｌｉｎｏｓｉｓ：巣状分節状硝子化）、γ−ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｇａｓｔｒｉｎ、ＧＣＤＦＰ−１５（Ｇｒｏｓｓ ｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１５）、Ｇｒｏｓｓ ｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ１５、成長ホルモン、ＧＡＦＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ、Ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、インスリン、κ−ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｋｉ−６７抗原、λ−ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｌｅｗｉｓ抗原、Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、メラノーマ抗原、μ−ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ、神経特異的エノラーゼ、ｐ５３、胎盤アルカリホスファターゼ、プロゲステロン受容体、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔ（網膜芽細胞腫遺伝子産物）、Ｓ１００ｐｒｏｔｅｉｎ、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ、Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＴＳＨ（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；甲状腺刺激ホルモン）、Ｖｉｌｌｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＶＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：血管作動性小腸ペプチド）、ステロイド受容体、インテグリン、カルレティキュリン、各種サイトカイン受容体、をその一例としてあげることができる。（２）核酸分子にはＤＮＡ、ＲＮＡおよびｍＲＮＡが含まれる。（３）非ペプチド性物質としては、例えば脂質（中性脂質、チン脂質、等）、糖鎖、金属（Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋等内因性のものや、Ｃｄ、Ｈｇ等外因性のもの）等があげられる。
【００２７】
本願明細書において用いる「結合反応」とは、前記標的分析物質とそれに対する特異的結合物質との結合反応（例えば抗原−抗体反応、核酸分子どうしのハイブリダイゼーション反応、等）を意味する。
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２９】
図１に示すように、パラフィンブロック２に通孔４を形成し、該パラフィンブロック２の通孔４内に組織を充填する。
【００３０】
パラフィンブロック２は、通常は直方体状である。パラフィンブロック２に、通孔４を１個形成するのがよく、その断面形状は限定されるものではないが、円形、矩形などであり得る。好ましくは円筒状の通孔４である。該通孔４は、機械加工によって、例えば、パンチなどによってパラフィンブロック２に形成することができる。
【００３１】
他方、生体試料（以下、組織ともいう）に円筒状の針部材を刺し込み、針部材内に組織を取り込んだのち、該針部材から組織を押し出して、上記パラフィンブロック２の通孔４内に充填する。
【００３２】
具体的には、腫瘍などの生体試料標本から針部材を用いて細長い組織試料を採取する。組織試料は、生体試料標本の関心対象の領域から採取することができる。試料は円筒形の試料がよく、円筒形の試料は長さ約1〜4mmで、直径約0.1〜4mmとすることができる。採取した試料は、例えば、核酸の分析を妨害しないように（エタノール固定などの方法で）保存することができる。
【００３３】
このようにして、パラフィンブロック２にて組織８が包埋された固形試料１０が得られる。
【００３４】
次に、この固形試料１０を切断刃によって薄切する。
【００３５】
この工程は、従来より使用されているミクロトームを使用することができる。固形試料１０をミクロトームにかけて薄切を行い、通常、２〜４μｍの厚さの薄切片１２が得られる。図１に示すように、薄切片１２は、パラフィン片のほぼ中央に薄い組織８が配置された状態である。
【００３６】
次に、図３に示すように、複数の切断片１８をスライドガラス２４上に乗せる。
【００３７】
通常は、薄切片１２を水槽の水面に移動させ、スライドガラス２４に乗せることで行われる。図３に示すような切断具１４を用いて、該切断片１８をスライドガラス２４上に配置してもよい。
【００３８】
この切断具１４は、ペン型に構成された切断具本体１５を有し、その先端部に筒状の刃部１６が設けられている。該刃部１６は、円筒状に形成され、その直径は薄切片１２における組織８の外径より大きく設定されている。切断具本体１５には、刃部１６を通じて切断片１８のパラフィンに静電気を付与できる電荷付与部２０およびスイッチなどの制御部２２が設けられている。この制御部２２を操作することにより、切断片１８のパラフィンに静電気を付与し、あるいはパラフィンの静電気をアースし、又は上記とは逆の電荷を付与できるように構成されている。
【００３９】
切断具１４は手動で取り扱いできるように構成してもよく、あるいは自動昇降装置等に取り付け、自動的に上下駆動できるように構成してもよい。この場合には、切断具１４を水平方向へも自動的に駆動できるように構成するのがよい。
【００４０】
切断具１４を用いて薄切片１２を切断し、およびスライドガラス２４へ移動するには次のように行う。
【００４１】
図２に示すように、切断具１４の下方位置において該薄切片１２の下側にゴムシートなどの柔軟性シート２６を配置する。
【００４２】
切断具１４を薄切片１２に押し付け、パラフィンの略中央に組織８が配置された切断片１８を得る。ここで、切断具１４の刃部１６は組織８を切断しないようにする。切断片１８の周囲にはパラフィンが組織８から延出している。
【００４３】
次に、切断具１４の制御部２２を操作することにより、切断片１８のパラフィンに静電気を付与し、切断片１８を切断具１４の先端に付着した状態で切断片１８をスライドガラス２４上へ移動する（図３）。
【００４４】
切断片１８がスライドガラス２４上に乗ったときに、切断具１４の制御部を操作し、パラフィンに付与した静電気を開放（アースし、又は逆電荷を付与）して切断片１８をスライドガラス２４上へ載置する。
【００４５】
スライドガラス２４上には、切断片１８との付着性を高めるために、シランコート又はリジンコートが施されているのが良い。また、スライドガラス２４上に水を付着させておくのが好ましい。
【００４６】
次に、定法に従って、切断片１８のパラフィンを除去し（脱パラフィン工程）、次いで組織８を染色する（染色工程）。
【００４７】
すなわち、キシレン，アルコール，および／または、水の入った槽に、切断片１８が付着したスライドガラス２４を順次浸漬し、脱パラフィンが行われる。その後、所定の染色液で染色を行い、封入剤を滴下した後、カバーガラスをかぶせる封入工程を経て、組織観察用の薄切片試料が作製される。
【００４８】
なお、染色工程は、図４に示す抗体投入用器具２８を用いて行ってもよい。
【００４９】
この抗体投入用器具２８は、矩形状の基板２７に、上記スライドガラス２４上の各組織８に対応する位置に通孔３０を設けて構成されている。通孔の数は複数であり、少なくとも２つ、少なくとも４、少なくとも１６、少なくとも４８、少なくとも９６、あるいは、それ以上である。基板２７の両側部には留め具３１が回動可能に取り付けられている。図５に示すように、この抗体投入用器具２８をスライドガラス２４上に配置した後、留め具３１を回動してスライドガラス２４に固定することで、器具２８の各通孔３０によってスライドガラス２４上に凹部３２が形成される。この凹部３２内に各種の抗体溶液を投入することにより、組織８が反応する。
【００５０】
図６に示すように、スライドガラス２４上には弾性層２６を形成しておくのが良く、凹部３２の下面が弾性層２６でシールされるので、各凹部３２内の抗体溶液が漏れ出したり、隣接する凹部３２内の抗体溶液が混合することがない。
【００５１】
染色後に顕微鏡などを用いて、標的分析物質を決定することにより、それに対する特異的結合物質も決定される。
【００５２】
なお、図７は、他の実施形態を示したものである。
【００５３】
上記実施形態では、針部材を組織に刺し込み、針部材内に組織を取り込んだのち、該針部材から組織を押し出すようにしたが、図７に示すように薄切りした組織をロール状に巻いて、このロール状の組織をパラフィンブロックの通孔に充填してもよい。
【００５４】
すなわち、パラフィンブロックに通孔を形成し、その通孔内に組織を充填してパラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料４０を作成する。次に、この固形試料４０を図７に示すように、切断刃４４によって薄切し該組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片４１を得る。この薄切片４１をロール状に巻き、この長尺なロール４２を適宜寸法に切断して所定寸法の組織の筒状体４５が得られる。
【００５５】
この組織の筒状体４５を、上記したようにパラフィンブロック２の通孔４内に配置する。この実施形態では、パラフィンブロック２に複数の通孔４が形成されている。その後、上記のようにスライスして組織観察用薄切片が作成される。
【００５６】
なお、本明細書において包埋剤とは、組織片などを薄切しやすい状態にする試薬をいい、非親水性または非水溶性のパラフィン、セロイジン、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂や、親水性または水溶性のカーボワックス、ゼラチン等が用いられる。中でも上記パラフィン包埋法が最も一般的且つ常用されている。
【００５７】
また、本発明で使用する固相マトリクスは、標的分析物質とそれの特異的結合物質との結合反応が起きるマトリクスであり、且つ、生成したシグナルを検出する際の基板となるものであり、前記結合反応及びシグナル検出を阻害しない限りにおいてマトリクス素材は特に限定されないが、好適には顕微鏡のスライドグラスである。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、次のような特異的結合物質に対して、組織、細胞などの生体試料を染色するための生体試料標本を提供できる。
【００５９】
例えば、（１）標的分析物質が蛋白質（各種細胞蛋白質、酵素、受容体、疾患マーカー等）である場合、該蛋白質に結合性を有する各種Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ・リガンド（例えば該蛋白質を抗原とする抗体、小分子）が用いられるが、好適には抗体であり、最も好適なのはその特異性と抗体価が確認されたモノクローナル抗体である。
【００６０】
（２）標的分析物質が核酸である場合、それに対する特異的結合物質として相補的核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、抗体等が用いられるが、好適には相補的核酸分子であり、かかる核酸分子どうしのハイブリダイゼーションを利用して標的核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を判別することが可能である（例えばＦＩＳＨ法）。
【００６１】
（３）標的分析物質が非ペプチド性物質（例えば脂質、糖鎖、金属等）である場合、該物質に対する特異的結合物質としては該物質に対する特異的抗体を用いるのが好適である。また、糖鎖の検出においては、例えばレクチンを特異的結合物質として使用すれば検出が容易である。
【符号の説明】
【００６２】
２ バラフィンブロック
４ 通孔
８ 組織
１０ 固形試料
１２ 薄切片
１４ 切断具
１８ 切断片
２０ 電荷付与部
２２ 制御部
２４ スライドガラス
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織、細胞などの生体試料標本の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料（例えば組織切片、タッチスメア、細胞等）に存在する特定の標的物質（例えば抗原）の存在を判別する手法として、該標的物質をシグナルとして可視化し検出する免疫染色法が従来から用いられている。例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法および放射性同位元素標識抗体法がある。
【０００３】
蛍光抗体法は、標的抗原に対する抗体、通常はモノクローナル抗体を蛍光色素で標識し、組織切片上の抗原の分布を判別する手法で、直説法と間接法の２つの二重染色法に分類することができる。前者では、予め蛍光色素標識された抗体を抗原−抗体反応に用いて標的抗原を直接可視化し、後者では、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させ、いわば間接的に標的抗原を可視化する。
【０００４】
酵素抗体法は、同様に抗原−抗体反応という特異反応を利用する手法である。抗体を酵素で標識し、抗原−抗体反応後に該酵素によって発色基質の沈着を生じさせて抗体の局在を示す点に特徴がある。標識酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ；ＧＯ）等が代表的である。
【０００５】
酵素抗体法には、酵素標識抗体法である直説法、間接法およびアビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（Ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＡＢＣ）法と、非標識抗体法としてのペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＰＡＰ）法とがあり、卵白の塩基性蛋白質であるアビジンに代わり、中性に荷電した、即ち中性化処理が不要なストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を用いるストレプトアビジン・ビオチン化抗体（Ｌａｂｅｌｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＳＡＢまたはＬＳＡＢ）法が主流となっている。
【０００６】
対象生体試料を上記免疫染色法に供する場合、通常、凍結切片やパラフィン切片として固相のマトリクス上に固定したものを調製して反応に付する。
【０００７】
このように免疫的染色法を用いることにより、組織または細胞に存在する種々ペプチド性抗原（組織抗原、腫瘍抗原、免疫担当細胞亜型抗原、酵素、ホルモン等）、非ペプチド性の抗原、その他組織に沈着する免疫複合体等の検出が可能であり、各種疾患の診断マーカーの分布を判別することによる病理診断（例えば腫瘍マーカーの判別による腫瘍診断）も行われている。
【０００８】
しかしながら、従来の免疫染色法では、作成した組織標本または細胞標本一つにつき、一種類の免疫反応しか行えないため、多数の抗原を標的とする免疫反応を行う場合にはそれに応じた多数の標本を調製する必要があり、資源と手間が要求される。
【０００９】
特表２０００−５０５４３１号公報（特許文献１）には、固形のパラフィンブロックに複数の穴を形成し（段落００５０）、その穴内にドナー腫瘍ブロックから採取した組織生検を配列し、そのブロックから組織標本用切片を得ることが記載されている（段落００５１−００５３）。
【００１０】
特開２００４−２５８０１７号公報（特許文献２）には、臓器の目的とする部分から複数の組織を切り抜き、これをパラフィンに包埋してアレイブロックを作製する方法が提案されている。
【００１１】
しかし、これらに記載の方法では、染色実験に供する試料が異なるので、たとえ同一の抗体を用いたとしても、結果が異なる可能性がある。実際の病理学的試験においても、結果のばらつきのために、正確な診断ができないという問題がある。このような結果のばらつきは、免疫染色法の信頼性を損なうこととなり、それゆえ、免疫染色法による病理学的試験の障害となっている。それゆえ、免疫染色法ための、多数の均一な組織片を調製する手法および装置が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２０００−５０５４３１号公報
【特許文献２】特開２００４−２５８０１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記課題を解決するためになされたもので、簡便な操作で、多数の組織片（抗原）を標的とする免疫反応を行うことができ、しかも、染色実験に供する試料が同じものであるので、同時実験で適切なコントロールや他の試料の結果を参照することも可能となり、それゆえ、結果を正確に比較することができる生体試料標本の作製方法を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明の他の目的は、上記方法を用いた疾患の病理診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の生体試料標本の作製には、包埋剤を用いる。なお、本明細書において包埋剤とは、組織片などを薄切しやすい状態にする試薬をいい、非親水性または非水溶性のパラフィン、セロイジン、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂や、親水性または水溶性のカーボワックス、ゼラチン等が用いられる。中でも上記パラフィン包埋法が最も一般的且つ常用されている。
【００１６】
本発明の組織観察用薄切片の作製方法は、包埋剤（例えば、パラフィンブロック）に通孔を形成する工程、該パラフィンブロックの通孔内に組織を充填する工程、該パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片を得る工程、複数の該薄切片をスライドガラス上に乗せる工程、該薄切片のパラフィンを溶融させる工程、および該組織を染色する工程、を包含し、そのことにより上記目的が達成される。
【００１７】
一つの実施形態では、前記スライドガラス上に、シランコート又はリジンコートが施されている。
【００１８】
本発明の疾患の病理診断方法は、上記方法を用いることを含む。
【００１９】
本発明の他の生体試料標本の作製方法は、ブロック状の包埋剤に孔部を形成する工程、該包埋剤の孔部内に生体試料を充填する工程、該包埋剤にて生体試料が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該生体試料の周囲に包埋剤が配置された薄切片を得る工程、複数の該薄切片を固相マトリクス上に乗せる工程、該薄切片の周囲に形成された包埋剤を溶融させる工程、および該生体試料を染色する工程、を包含する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片を得、複数の該薄切片をスライドガラス上に乗せることにより、一度の操作で標的分析物質−特異的結合物質の結合反応を多数同時に行え、多数の標的物質（抗原）の同時染色が可能になり、また、標的分析物質に対する特異的結合物質の所要量も従来法に比べて微量で済む。しかも、染色実験に供する試料が同じものであるので、同時実験で結果を比較することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明に係わる生体試料標本の作製方法に使用するパラフィンブロックの通孔に組織を充填し、スライスした工程を示す斜視図である。
【図２】図２は、図１に示す薄切片を切断具にて切断している状態の断面図である。
【図３】図３は、切断具の刃部に付着した切断片をスライドガラス上へ移動する状態を示す説明図である。
【図４】図４は、スライドガラス上に抗体投入用器具を配置する状態の分解斜視図である。
【図５】図５は、スライドガラス上に抗体投入用器具を配置して抗体溶液を充填する状態の断面である。
【図６】図６は、ガラス基板上に弾性層を設けた状態の断面図である。
【図７】図７は、本発明の生体試料標本の作製方法の他の実施形態の作用説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明にかかる方法には、当該技術分野における当業者によって従来から通常用いられる各種染色法の原理を適用することができ、通常はこれらの各種染色法を用いることで検出可能なシグナルを生成させ、標的とする分析物質を判別することができる。
【００２３】
例として、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法等の原理の適用が可能である他、核酸分子を特異的結合物質として用い、核酸分子どうしのハイブリダイゼーションを利用して標的核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を判別することも可能である（例えばＦＩＳＨ法：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法）。また、前記各種抗体法は、目的に応じて直説法、即ち、予め蛍光色素標識された抗体を抗原−抗体反応に用いて標的抗原を直接可視化し、検出する手法でも、間接法、即ち、最初に標的抗原に特異的な一次抗体を抗原との反応に供し、次いで該一次抗体に特異的な標識二次抗体を反応させて、間接的に標的抗原を可視化し、検出する手法でもよい。特異的結合物質を標識するための標識物質・標識の仕方は適宜選択される。
【００２４】
本発明において用いる「被検生体試料」とは、主に生物の組織検体、組織片、生物の液状検体または細胞の検体を含んだ試料を意味する。生物種は特に限定されず哺乳動物、両生類、爬虫類等いずれの種であってもよいが、標的分析物質に対応する抗体蛋白質や核酸分子が最もよく知られている種である哺乳動物が好適であり、より好適なのはヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ウマ、サル等で、更に好適なのはヒト、マウス、ラットで、最も好適なのはヒトである。用いられる組織、生物の液状検体、細胞は、通常、組織であれば切片またはタッチスメアとして調製し使用することができ、液状検体であればスメア標本として調製し使用することができ、また、細胞であればやはりスメア標本にして使用することができる。
【００２５】
前記標本は自体公知の方法により容易に調整することができる。用いられる組織、液状検体、細胞は特に限定されずいずれの種類であっても使用可能で、（１）組織の例としては脳組織、肺、胃、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、腸管組織（小腸、大腸、直腸、結腸など）、皮膚組織、神経組織、血管組織、骨格筋（筋肉）・軟骨組織等があげられ、（２）液状検体の例としては胸水、腹水、尿、等があげられ、（３）細胞としては、接着性で塊を形成している細胞、浮遊性の細胞、等限定されず、例えば、前記組織を構成する細胞（脳細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、軟骨細胞等）、血球系細胞（赤血球、血小板細胞、各種白血球・リンパ球（たとえば単球、好中球、好塩基球、好酸球、貪食細胞、肥満細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞））、体腔液（胸腔液、腹腔液、心膜腔液）中の細胞（マクロファージ、リンパ球（例えばＴ細胞、Ｂ細胞等）、好中球、好酸球、中皮細胞、等）があげられる。
【００２６】
標的分析物質としては、生物の組織、細胞等に存在する物質のうち、抗原性を示す物質であれば特に限定されず、いかなる物質であっても本発明により染色可能である。抗原性を示す物質の例としては、蛋白質、核酸分子、糖、その他各種非ペプチド性物質があげられる。（１）蛋白質としては、各種膜蛋白質、各種可溶性蛋白質があり、組織や細胞等に特異的に発現する蛋白質（例えばマーカー蛋白質）、酵素、受容体や、中間フィラメント、間質成分、その他の組織・細胞特異抗原、その他各種の疾患のマーカーとなる蛋白質（例えば癌細胞・腫瘍に特異的な腫瘍マーカー、等）ならどれでも分析可能である。例えば、ＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ：副腎皮質刺激ホルモン）、Ａｃｔｉｎ、α−ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ、Ａｎｄｒｏｇｅｎ受容体、ｂｃｌ−２、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、各種ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抗原、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：癌胎児性抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎＡ、コラーゲン、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、Ｄｅｓｍｉｎ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ抗原、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、エストロゲン受容体、ＦＳＨ（Ｆｏｃａｌ ｓｅｇｍｅｎｔ ｈｙａｌｉｎｏｓｉｓ：巣状分節状硝子化）、γ−ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｇａｓｔｒｉｎ、ＧＣＤＦＰ−１５（Ｇｒｏｓｓ ｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１５）、Ｇｒｏｓｓ ｃｙｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ１５、成長ホルモン、ＧＡＦＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ、Ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、インスリン、κ−ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｋｉ−６７抗原、λ−ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｌｅｗｉｓ抗原、Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、メラノーマ抗原、μ−ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ、神経特異的エノラーゼ、ｐ５３、胎盤アルカリホスファターゼ、プロゲステロン受容体、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔ（網膜芽細胞腫遺伝子産物）、Ｓ１００ｐｒｏｔｅｉｎ、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ、Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＴＳＨ（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；甲状腺刺激ホルモン）、Ｖｉｌｌｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＶＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：血管作動性小腸ペプチド）、ステロイド受容体、インテグリン、カルレティキュリン、各種サイトカイン受容体、をその一例としてあげることができる。（２）核酸分子にはＤＮＡ、ＲＮＡおよびｍＲＮＡが含まれる。（３）非ペプチド性物質としては、例えば脂質（中性脂質、チン脂質、等）、糖鎖、金属（Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋等内因性のものや、Ｃｄ、Ｈｇ等外因性のもの）等があげられる。
【００２７】
本願明細書において用いる「結合反応」とは、前記標的分析物質とそれに対する特異的結合物質との結合反応（例えば抗原−抗体反応、核酸分子どうしのハイブリダイゼーション反応、等）を意味する。
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２９】
図１に示すように、パラフィンブロック２に通孔４を形成し、該パラフィンブロック２の通孔４内に組織を充填する。
【００３０】
パラフィンブロック２は、通常は直方体状である。パラフィンブロック２に、通孔４を１個形成するのがよく、その断面形状は限定されるものではないが、円形、矩形などであり得る。好ましくは円筒状の通孔４である。該通孔４は、機械加工によって、例えば、パンチなどによってパラフィンブロック２に形成することができる。
【００３１】
他方、生体試料（以下、組織ともいう）に円筒状の針部材を刺し込み、針部材内に組織を取り込んだのち、該針部材から組織を押し出して、上記パラフィンブロック２の通孔４内に充填する。
【００３２】
具体的には、腫瘍などの生体試料標本から針部材を用いて細長い組織試料を採取する。組織試料は、生体試料標本の関心対象の領域から採取することができる。試料は円筒形の試料がよく、円筒形の試料は長さ約1〜4mmで、直径約0.1〜4mmとすることができる。採取した試料は、例えば、核酸の分析を妨害しないように（エタノール固定などの方法で）保存することができる。
【００３３】
このようにして、パラフィンブロック２にて組織８が包埋された固形試料１０が得られる。
【００３４】
次に、この固形試料１０を切断刃によって薄切する。
【００３５】
この工程は、従来より使用されているミクロトームを使用することができる。固形試料１０をミクロトームにかけて薄切を行い、通常、２〜４μｍの厚さの薄切片１２が得られる。図１に示すように、薄切片１２は、パラフィン片のほぼ中央に薄い組織８が配置された状態である。
【００３６】
次に、図３に示すように、複数の切断片１８をスライドガラス２４上に乗せる。
【００３７】
通常は、薄切片１２を水槽の水面に移動させ、スライドガラス２４に乗せることで行われる。図３に示すような切断具１４を用いて、該切断片１８をスライドガラス２４上に配置してもよい。
【００３８】
この切断具１４は、ペン型に構成された切断具本体１５を有し、その先端部に筒状の刃部１６が設けられている。該刃部１６は、円筒状に形成され、その直径は薄切片１２における組織８の外径より大きく設定されている。切断具本体１５には、刃部１６を通じて切断片１８のパラフィンに静電気を付与できる電荷付与部２０およびスイッチなどの制御部２２が設けられている。この制御部２２を操作することにより、切断片１８のパラフィンに静電気を付与し、あるいはパラフィンの静電気をアースし、又は上記とは逆の電荷を付与できるように構成されている。
【００３９】
切断具１４は手動で取り扱いできるように構成してもよく、あるいは自動昇降装置等に取り付け、自動的に上下駆動できるように構成してもよい。この場合には、切断具１４を水平方向へも自動的に駆動できるように構成するのがよい。
【００４０】
切断具１４を用いて薄切片１２を切断し、およびスライドガラス２４へ移動するには次のように行う。
【００４１】
図２に示すように、切断具１４の下方位置において該薄切片１２の下側にゴムシートなどの柔軟性シート２６を配置する。
【００４２】
切断具１４を薄切片１２に押し付け、パラフィンの略中央に組織８が配置された切断片１８を得る。ここで、切断具１４の刃部１６は組織８を切断しないようにする。切断片１８の周囲にはパラフィンが組織８から延出している。
【００４３】
次に、切断具１４の制御部２２を操作することにより、切断片１８のパラフィンに静電気を付与し、切断片１８を切断具１４の先端に付着した状態で切断片１８をスライドガラス２４上へ移動する（図３）。
【００４４】
切断片１８がスライドガラス２４上に乗ったときに、切断具１４の制御部を操作し、パラフィンに付与した静電気を開放（アースし、又は逆電荷を付与）して切断片１８をスライドガラス２４上へ載置する。
【００４５】
スライドガラス２４上には、切断片１８との付着性を高めるために、シランコート又はリジンコートが施されているのが良い。また、スライドガラス２４上に水を付着させておくのが好ましい。
【００４６】
次に、定法に従って、切断片１８のパラフィンを除去し（脱パラフィン工程）、次いで組織８を染色する（染色工程）。
【００４７】
すなわち、キシレン，アルコール，および／または、水の入った槽に、切断片１８が付着したスライドガラス２４を順次浸漬し、脱パラフィンが行われる。その後、所定の染色液で染色を行い、封入剤を滴下した後、カバーガラスをかぶせる封入工程を経て、組織観察用の薄切片試料が作製される。
【００４８】
なお、染色工程は、図４に示す抗体投入用器具２８を用いて行ってもよい。
【００４９】
この抗体投入用器具２８は、矩形状の基板２７に、上記スライドガラス２４上の各組織８に対応する位置に通孔３０を設けて構成されている。通孔の数は複数であり、少なくとも２つ、少なくとも４、少なくとも１６、少なくとも４８、少なくとも９６、あるいは、それ以上である。基板２７の両側部には留め具３１が回動可能に取り付けられている。図５に示すように、この抗体投入用器具２８をスライドガラス２４上に配置した後、留め具３１を回動してスライドガラス２４に固定することで、器具２８の各通孔３０によってスライドガラス２４上に凹部３２が形成される。この凹部３２内に各種の抗体溶液を投入することにより、組織８が反応する。
【００５０】
図６に示すように、スライドガラス２４上には弾性層２６を形成しておくのが良く、凹部３２の下面が弾性層２６でシールされるので、各凹部３２内の抗体溶液が漏れ出したり、隣接する凹部３２内の抗体溶液が混合することがない。
【００５１】
染色後に顕微鏡などを用いて、標的分析物質を決定することにより、それに対する特異的結合物質も決定される。
【００５２】
なお、図７は、他の実施形態を示したものである。
【００５３】
上記実施形態では、針部材を組織に刺し込み、針部材内に組織を取り込んだのち、該針部材から組織を押し出すようにしたが、図７に示すように薄切りした組織をロール状に巻いて、このロール状の組織をパラフィンブロックの通孔に充填してもよい。
【００５４】
すなわち、パラフィンブロックに通孔を形成し、その通孔内に組織を充填してパラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料４０を作成する。次に、この固形試料４０を図７に示すように、切断刃４４によって薄切し該組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片４１を得る。この薄切片４１をロール状に巻き、この長尺なロール４２を適宜寸法に切断して所定寸法の組織の筒状体４５が得られる。
【００５５】
この組織の筒状体４５を、上記したようにパラフィンブロック２の通孔４内に配置する。この実施形態では、パラフィンブロック２に複数の通孔４が形成されている。その後、上記のようにスライスして組織観察用薄切片が作成される。
【００５６】
なお、本明細書において包埋剤とは、組織片などを薄切しやすい状態にする試薬をいい、非親水性または非水溶性のパラフィン、セロイジン、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂や、親水性または水溶性のカーボワックス、ゼラチン等が用いられる。中でも上記パラフィン包埋法が最も一般的且つ常用されている。
【００５７】
また、本発明で使用する固相マトリクスは、標的分析物質とそれの特異的結合物質との結合反応が起きるマトリクスであり、且つ、生成したシグナルを検出する際の基板となるものであり、前記結合反応及びシグナル検出を阻害しない限りにおいてマトリクス素材は特に限定されないが、好適には顕微鏡のスライドグラスである。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、次のような特異的結合物質に対して、組織、細胞などの生体試料を染色するための生体試料標本を提供できる。
【００５９】
例えば、（１）標的分析物質が蛋白質（各種細胞蛋白質、酵素、受容体、疾患マーカー等）である場合、該蛋白質に結合性を有する各種Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ・リガンド（例えば該蛋白質を抗原とする抗体、小分子）が用いられるが、好適には抗体であり、最も好適なのはその特異性と抗体価が確認されたモノクローナル抗体である。
【００６０】
（２）標的分析物質が核酸である場合、それに対する特異的結合物質として相補的核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、抗体等が用いられるが、好適には相補的核酸分子であり、かかる核酸分子どうしのハイブリダイゼーションを利用して標的核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を判別することが可能である（例えばＦＩＳＨ法）。
【００６１】
（３）標的分析物質が非ペプチド性物質（例えば脂質、糖鎖、金属等）である場合、該物質に対する特異的結合物質としては該物質に対する特異的抗体を用いるのが好適である。また、糖鎖の検出においては、例えばレクチンを特異的結合物質として使用すれば検出が容易である。
【符号の説明】
【００６２】
２ バラフィンブロック
４ 通孔
８ 組織
１０ 固形試料
１２ 薄切片
１４ 切断具
１８ 切断片
２０ 電荷付与部
２２ 制御部
２４ スライドガラス
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラフィンブロックに通孔を形成する工程、該パラフィンブロックの通孔内に組織を充填する工程、該パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片を得る工程、複数の該薄切片をスライドガラス上に配置する工程、および該薄切片のパラフィンを除去する工程、を包含する組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項２】
さらに、組織を染色する工程、を包含する請求項１に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項３】
さらに、複数の組織が配置されたスライドガラス上に抗体投入用器具を配置する工程であって、該抗体投入用器具は基板の各組織に対応する位置に通孔を有する工程、および
該抗体投入用器具該スライドガラス上に配置した後、該通孔に抗体溶液を投入する工程、を包含する請求項１に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項４】
前記スライドガラス上に、シランコート又はリジンコートが施されている請求項１に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法を用いることを含む、疾患の病理診断方法。
【請求項６】
ブロック状の包埋剤に孔部を形成する工程、該包埋剤の孔部内に生体試料を充填する工程、該包埋剤にて生体試料が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該生体試料の周囲に包埋剤が配置された薄切片を得る工程、複数の該薄切片を固相マトリクス上に配置する工程、および該薄切片の周囲に形成された包埋剤を除去する工程、を包含する生体試料標本の作製方法。
【請求項７】
さらに、生体試料を染色する工程、を包含する請求項６に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項８】
さらに、複数の組織が配置されたスライドガラス上に抗体投入用器具を配置する工程であって、該抗体投入用器具は基板の各組織に対応する位置に通孔を有する工程、および
該抗体投入用器具該スライドガラス上に配置した後、該通孔に抗体溶液を投入する工程、を包含する請求項６に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項９】
請求項１または６に記載の方法によって作製された、組織観察用薄切片。
【請求項１】
パラフィンブロックに通孔を形成する工程、該パラフィンブロックの通孔内に組織を充填する工程、該パラフィンブロックにて組織が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該組織の周囲にパラフィンが配置された薄切片を得る工程、複数の該薄切片をスライドガラス上に配置する工程、および該薄切片のパラフィンを除去する工程、を包含する組織観察用薄切片の作製方法。
【請求項２】
さらに、組織を染色する工程、を包含する請求項１に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項３】
さらに、複数の組織が配置されたスライドガラス上に抗体投入用器具を配置する工程であって、該抗体投入用器具は基板の各組織に対応する位置に通孔を有する工程、および
該抗体投入用器具該スライドガラス上に配置した後、該通孔に抗体溶液を投入する工程、を包含する請求項１に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項４】
前記スライドガラス上に、シランコート又はリジンコートが施されている請求項１に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法を用いることを含む、疾患の病理診断方法。
【請求項６】
ブロック状の包埋剤に孔部を形成する工程、該包埋剤の孔部内に生体試料を充填する工程、該包埋剤にて生体試料が包埋された固形試料を切断刃によって薄切し、該生体試料の周囲に包埋剤が配置された薄切片を得る工程、複数の該薄切片を固相マトリクス上に配置する工程、および該薄切片の周囲に形成された包埋剤を除去する工程、を包含する生体試料標本の作製方法。
【請求項７】
さらに、生体試料を染色する工程、を包含する請求項６に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項８】
さらに、複数の組織が配置されたスライドガラス上に抗体投入用器具を配置する工程であって、該抗体投入用器具は基板の各組織に対応する位置に通孔を有する工程、および
該抗体投入用器具該スライドガラス上に配置した後、該通孔に抗体溶液を投入する工程、を包含する請求項６に記載の生体試料標本の作製方法。
【請求項９】
請求項１または６に記載の方法によって作製された、組織観察用薄切片。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−１３０５０（Ｐ２０１１−１３０５０Ａ）
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５６３４０（Ｐ２００９−１５６３４０）
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【出願人】（３０７０４８７５６）株式会社パソロジー研究所 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月３０日（２００９．６．３０）
【出願人】（３０７０４８７５６）株式会社パソロジー研究所 (6)
【Ｆターム（参考）】
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