生分解性のカチオン性ポリマー
生理活性薬剤を細胞に送達するのに有用な、６００ダルトン未満の分子量を有するポリエチレンイミン、生分解性基、および比較的疎水性の基を含むポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００６年４月６日に出願された米国仮特許出願第６０／７８９，８４２号に基づく優先権を主張し、それは引用によりその全文が全ての図面を含めて本明細書に取り込まれる。さらに、本出願は、２００５年８月３１日に出願された米国特許出願第１１／２１６，９８６号に関し、それは引用によりその全文が全ての図面を含めて本明細書に取り込まれる。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、生理活性薬剤を細胞に送達するための組成物と方法に関する。具体的には、本発明は、ポリ−またはオリゴ−エチレンイミン（ＰＥＩ）、生分解性基、および比較的疎水性の基を含むカチオン性リポポリマーに関し、またｓｉＲＮＡおよびアンチセンスなどのオリゴヌクレオチドを送達するためにそのようなリポポリマーを製造し、使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
ウイルストランスフェクションシステムや非ウイルストランスフェクションシステムの使用を含む多くの技術が、プラスミドＤＮＡなどの生理活性薬剤を細胞に送達するために利用可能である。ウイルスシステムは、概して非ウイルスシステムよりも高いトランスフェクション効率を有するが、ウイルスシステムの安全性に関して疑問があった。Ｖｅｒｍａ Ｉ．Ｍ および Ｓｏｍｉａ Ｎ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８９（１９９７），ｐｐ．２３９−２４２；Ｍａｒｈｓａｌｌ Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（２０００），ｐｐ．２２４４−２２４５を参照されたい。さらに、ウイルスベクターの調製は、複雑で費用のかかるプロセスになりやすい。非ウイルストランスフェクションシステムは、一般的にウイルスシステムよりも効率が劣るが、それらのシステムは一般的にウイルスシステムよりも安全で、調製しやすいと考えられるので、かなりの注目を集めてきた。
【０００４】
多くの非ウイルストランスフェクションシステムは、プラスミドＤＮＡに複合体化されたカチオン性ポリマーの使用を伴う。遺伝子キャリアとして用いられてきたカチオン性ポリマーの例としては、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、およびポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）が挙げられる。残念ながら、ＰＬＬによるトランスフェクション効率は、概して低いものであり、高分子量のＰＬＬは、細胞に対して顕著な毒性を示してきた。幾つかの場合には、２０，０００〜２５，０００ダルトンの分子量の範囲にあるＰＥＩは、エンドソーム分解性薬剤や標的剤を必要としない効率的な遺伝子移入を提供する。Ｂｏｕｓｓｉｆ Ｏ．，Ｌｅｚｏｕａｌｃ’ｈ Ｆ．，Ｚａｎｔａ Ｍ．Ａ．，Ｍｅｒｇｎｙ Ｍ．Ｄ．，Ｓｃｈｅｒｍａｎ Ｄ．，Ｄｅｍｅｎｅｉｘ Ｂ．，Ｂｅｈｒ Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ａｕｇ．１，１９９５，９２（１６）７２９７−３０１を参照されたい。しかしながら、分子量で４００〜２，０００ダルトンの分子量の範囲にあるＰＥＩは、プラスミドＤＮＡ送達に有効ではない。一連のポリアミドアミンデンドリマーが遺伝子送達システムとして研究されてきている。Ｅｉｃｈｍａｎ Ｊ．Ｄ．，Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ Ａ．Ｕ．，Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ Ｊ．Ｆ．，Ｂａｋｅｒ Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．，Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２０００ Ｊｕｌｙ；３（７）：２３２−２４５を参照されたい。残念ながら、ＰＥＩとデンドリマーの両方が、細胞に対して毒性があると報告されているので、ヒト患者への適用における遺伝子送達ツールとしてＰＥＩを使用する可能性を制限している。さらに、商業的に実用的な遺伝子トランスフェクション効率を有するポリアミドアミンデンドリマーの費用は比較的高い。
【０００５】
プラスミドＤＮＡなどの遺伝子、分解性のカチオン性ポリマーを使用して作られたキャリアは、低減された細胞毒性でもって遺伝子を哺乳動物細胞に移入することが報告されている。Ｌｉｍ Ｙ．Ｂ．，Ｋｉｍ Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｅ Ｙ．，Ｌｅｅ Ｗ．Ｋ．，Ｙａｎｇ Ｔ．Ｇ．，Ｌｅｅ Ｍ．Ｊ．，Ｓｕｈ Ｈ．，Ｐａｒｋ Ｊ．Ｓ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３（１０），２４６０−２４６１，２００１を参照されたい。残念ながら、これらの分解性システムも、非分解性ポリマーと比較して、より低い遺伝子移入効率を示した。低分子量ＰＥＩのトランスフェクション効率を向上させるために、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらは、高分子量ＰＥＩが、低分子量ＰＥＩを有するジスルフィド含有リンカーを用いて得ることができることを報告した。Ｇｏｓｓｅｌｉｎ，Ｍｉｃｈｅａｌ Ａ．， Ｇｕｏ，Ｍｅｎｊｉｎ，および Ｌｅｅ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｊ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００１．１２：２３２−２４５を参照されたい。ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）およびジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート−２ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）を用いて製造されたＰＥＩポリマーは、同様の遺伝子トランスフェクション効率と低い細胞毒性を示した。しかし、ジスルフィド含有リンカーは高価であり、このことは、このシステムの大量調製を困難にし、望ましくないものとしている。ジスルフィド含有リンカーを有するポリマーは、還元性条件下でのみ分解し、それは他の条件でのポリマー適用を制限している。
【０００６】
Ｌｙｎｎらは、ジアクリレートを、カチオン性化合物間のリンカー分子として用いる生分解性のカチオン性ポリマーの合成方法を記載している。Ｌｙｎｎ，Ｄａｖｉｄ Ａ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｇ．；Ｐｕｔｎａｍ，Ｄａｖｉｄ；および Ｌａｎｇｅｒ，Ｒｏｂｅｒｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，８１５５−８１５６を参照されたい。しかし、これらのポリマーの合成は、完結するのに何日をも要し、遺伝子送達に使用できる有効な生成物の量が少ない。１００種類を超えるカチオン性ポリマーが、Ｌｙｎｎらの方法に従って製造されたが、これらポリマーのうち２種類のみが効果的な遺伝子トランスフェクション効率を示しただけである。ＰＥＩなどのカチオン性ポリマーは、ｓｉＲＮＡ導入に有効であることは証明されなかった。Ｌｙｎｎらの方法に従って製造された生分解性のカチオン性ポリマーは、ｓｉＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドの送達には使用されてこなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ｓｉＲＮＡやオリゴヌクレオチドの細胞への送達を安全かつ効率的に促進するために使用できるカチオン性ポリマーの必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（本発明の概要）
本発明者らは、オリゴヌクレオチドを細胞に送達することのできる幾つかのポリマー組成物を見出した。ある実施形態では、ポリマーは、送達増強剤および／または画像診断用化合物などの他の部分にさらに複合体化することができる。さらに、本発明者らは、ポリマー組成物を使用して、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための方法を見出した。
【０００９】
本明細書で開示される１実施形態は、式（Ｉ）：
【化１】
（式中、ＰＥＩは、６００ダルトン未満の分子量を有するポリエチレンイミン繰り返し単位である。Ｒは、電子対、水素、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５−Ｃ３０アリール、およびＣ２−Ｃ３０ヘテロアリールから成る群から選択され；Ｌは、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５−Ｃ５０アリール、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルから成る群から選択され、ｍは、約１〜約３０の範囲にある整数である）から成る群から選択される繰り返し単位を含むポリマーを含む。
【００１０】
１実施形態では、ＰＥＩが、式（ＩＩａ）および（ＩＩｂ）：
【化２】
（式中、ｘは約１〜約１２の範囲にある整数であり、ｙは約１〜約６の範囲にある整数であり、およびｚは約１〜約１３の範囲にある整数である）から成る群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含むことができる。
【００１１】
ポリマーは、幾つかの実施形態では、生分解性である。ポリマーが分解することのできる適切な機構は、非制限的に、加水分解、酵素切断、還元、光切断、および超音波処理を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、Ｌは、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ５０アルキニルおよびＣ２−Ｃ５０ヘテロアルキニルから成る群から選択されることができる。他の実施形態では、ＬはＣ１２〜Ｃ１８の脂肪酸、コレステロールおよびそれらの誘導体から成る群から選択されることができる。
【００１３】
１実施形態では、ポリマーは、約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲にある重量平均分子量を有することができる。別の実施形態では、ポリマーは、約１，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にある重量平均分子量を有することができる。
【００１４】
幾つかの実施形態では、ポリマーは架橋されることができる。
【００１５】
本明細書で開示される別の実施形態は、ポリマーと複合体化されたオリゴヌクレオチドをさらに含むことができる。適切なオリゴヌクレオチドの例としては、非制限的に、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡオリゴマーおよびアンチセンスなどのＤＮＡオリゴマーが挙げられる。
【００１６】
オリゴヌクレオチドの他に、ポリマーは、真核細胞に入ることができる送達増強剤をさらに含むことができる。所望の場合には、ポリマーは、ポリマーと複合体化することのできる画像診断用化合物をさらに含むことができる。送達増強剤は、真核細胞における１つ以上の次の機能：受容体認識、細胞内移行、細胞エンドソームからのオリゴヌクレオチドの脱出、核局在化、オリゴヌクレオチドの放出、および系の安定化を促進することができる。オリゴヌクレオチドの例示としては、非制限的に、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスを含む。他の実施形態では、送達増強剤は、ポリマーに結合することができる。
【００１７】
本明細書で開示される１実施形態は、真核細胞を形質移入する方法を含み、それは細胞をポリマーと接触させ、それによりオリゴヌクレオチドを細胞に送達させることから成り、そこではポリマーはさらにオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００１８】
本明細書で開示される別の実施形態は、哺乳類を治療する方法を含み、それは遺伝子治療が必要な哺乳類を特定して、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートしたポリマーを哺乳類に投与することから成り、そこではオリゴヌクレオチドは、目的の遺伝子の発現を低下させるか発現抑制させるのに効果的であるｓｉＲＮＡを含んでいる。
【００１９】
幾つかの実施形態では、ポリマーは、ポリマーに複合体化された画像診断用合物をさらに含むことができる。本明細書で開示される１実施形態は、画像診断用化合物を哺乳類に送達する方法を含み、それは哺乳類にポリマーを投与することから成り、そこではポリマーは画像診断用化合物に複合体化されている。
【００２０】
本明細書で開示される１実施形態は、複数のポリマーから成るポリマーライブラリーを含み、そこではＲ、Ｌ、ＰＥＩ、およびｍから成る群から選択される少なくとも１つのパラメータが、ポリマーの少なくとも２つに関して異なっている。
【００２１】
本明細書で開示される別の実施形態は、ポリマーと真核細胞の特異的受容体を認識することができるリガンドから成る医学診断システムを含む。所望の場合、ポリマーはリガンドに結合させることができる。
【００２２】
本明細書で開示されるさらに別の実施形態では、医薬組成物は、増感剤およびポリマーを含むことができる。増感剤は、可視線照射、紫外線照射、または両方に感受性であることができる。１実施形態では、医薬組成物は増感剤およびポリマーを含み、そこではポリマーはオリゴヌクレオチドに対して親和性を有することができる。
【００２３】
１実施形態では、画像診断用組成物は、画像造影剤とポリマーを含むことができる。所望の場合、画像診断用組成物は、さらに標的剤を含むことができる。
【００２４】
本明細書で開示される１実施形態は、式（Ｉ）：
【化３】
［式中、ＰＥＩは、式（ＩＩｂ）：
【化４】
（式中、ｚは約１〜約１３の範囲にある整数である）の少なくとも１つの繰り返し単位を含むポリエチレンイミン繰り返し単位である。Ｒは、電子対、水素、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５−Ｃ３０アリール、およびＣ２−Ｃ３０ヘテロアリールから成る群から選択されることができる。Ｌは、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５−Ｃ５０アリール、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルから成る群から選択されることができ；およびｍは、約１〜約３０の範囲にある整数である］から成る群から選択される繰り返し単位を含む。
【００２５】
１実施形態では、式（ＩＩｂ）の少なくとも１つの繰り返し単位を含むＰＥＩは、６００ダルトン未満の分子量を有することができる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、ＰＥＩは、式（ＩＩａ）
【化５】
（式中、ｘは約１〜約１２の範囲にある整数であり、およびｙは約１〜約６の範囲にある整数である）の繰り返し単位をさらに含むことができる。
【００２７】
１実施形態では、ＰＥＩが式（ＩＩａ）の繰り返し単位をさらに含むポリマーは、６００ダルトン未満の分子量を有することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
１実施形態は、ポリエチレンイミン、生分解性基、および比較的疎水性の「リポ」基を含むカチオン性リポポリマーを提供する。好ましいカチオン性リポポリマーは、式（Ｉ）：
【化６】
からなる群から選択される繰り返し単位を含む。
【００２９】
式（Ｉ）において、ＰＥＩは、ポリエチレンイミンであり、エステル結合は生分解性基であり、Ｌは比較的疎水性の「リポ」基を表す。例えば、ある実施形態においては、ＬはＣ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５−Ｃ５０アリール；Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール；Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルから成る群から選択される。好ましい実施形態において、ＬはＣ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ５０アルキニルおよびＣ２−Ｃ５０ヘテロアルキニルから成る群から選択される。より好ましい実施形態では、ＬはＣ１２〜Ｃ１８の脂肪酸、コレステロールおよびそれらの誘導体から成る群から選択される。
【００３０】
式（Ｉ）中のＲは、電子対または水素原子を表すことができる。当業者は、Ｒが電子対を表す場合に、式（Ｉ）の繰り返し単位は低いｐＨでカチオン性であることを理解する。また、式（Ｉ）においてＲは、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５−Ｃ３０アリール、またはＣ２−Ｃ３０ヘテロアリールなどの比較的疎水性のリポ基を表すこともあり、この場合、窒素原子は、通常は広いｐＨ範囲にわたって正電荷を有することが理解されるであろう。
【００３１】
ＰＥＩは、式（ＩＩａ）および／または（ＩＩｂ）：
【化７】
（式中、ｘは約１〜約１２の範囲にある整数であり、ｙは約１〜約６の範囲にある整数であり、およびｚは約１〜約１３の範囲にある整数である）の少なくとも１つの繰り返し単位を含むことができる。
【００３２】
本明細書で使用される「式ＩＩ」は、式（ＩＩａ）および（ＩＩｂ）を別々に、または組み合わせて含むＰＥＩを意味する。
【００３３】
式（Ｉ）の繰り返し単位を含むカチオン性リポポリマーは、下記スキームＡに示されるように式（ＩＩＩ）のジアクリレートモノマーをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と反応させることにより調製することができる。
スキームＡ
【化８】
【００３４】
式（ＩＩＩ）において、ＲおよびＬは、式（Ｉ）の繰り返し単位を含有するカチオン性リポポリマーについて上に記載したと同じ意味を有する。スキームＡは、式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリマーの調製を示す。
【００３５】
スキームＡに示される反応は、攪拌下に、好ましくは室温で数時間、エタノールなどの相互溶媒中でＰＥＩとジアクリレート（ＩＩＩ）とを混合し、次に溶媒を蒸発させて生成したポリマーを回収することにより実施することができる。本発明は理論に縛られるものではないが、ＰＥＩとジアクリレート（ＩＩＩ）との反応は、ＰＥＩの１つ以上のアミンと、ジアクリレートの２重結合とのミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ）反応を伴うと考えられる。Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．，ｐｐ．７１１−７１２（１９８５）を参照されたい。スキームＡに示されるジアクリレートは、下記実施例に示される方法で調製することができる。
【００３６】
式（Ｉ）の繰り返し単位を含む多様なポリマーは、ＰＥＩの分子量と構造、ジアクリレート（ＩＩＩ）上のＲ基およびＬ基の大きさと種類、およびＰＥＩに対するジアクリレート（ＩＩＩ）の比率を変えることにより、スキームＡにしたがって製造することができる。異なるジアクリレートの混合物および／または異なるＰＥＩの混合物を使用してもよい。ＰＥＩは多機能性であり得るから、２種類以上のジアクリレートと反応することができる。架橋剤を用いて架橋カチオン性リポポリマーを製造することができ、および／または多機能性ＰＥＩとジアクリレート（ＩＩＩ）の相対的な比率は、調整されて架橋カチオン性リポポリマーを製造することができる。ＰＥＩの分子量は、好ましくは約６００ダルトン未満である。ＰＥＩ：ジアクリレートのモル比は、好ましくは約１：０．５〜約１：２０の範囲にある。カチオン性リポポリマーの重量平均分子量は、約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲、好ましくは約１，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にある。分子量は、ＰＥＧ標準を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによるか、またはアガロースゲル電気泳動により決定することができる。１実施形態において、Ｒ、Ｌ、ＰＥＩ、および／またはｍが、少なくとも２つのポリマーについて異なる複数のカチオン性リポポリマーを調製することにより、ポリマーライブラリーが提供される。
【００３７】
カチオン性リポポリマーは、好ましくは分解性であり、より好ましくは生分解性であり、例えば、加水分解、酵素切断、還元、光切断、および超音波処理からなる群から選択される機構により分解可能である。本発明は理論により制限されるわけではないが、細胞内の式（Ｉ）のカチオン性リポポリマーの分解は、エステル結合の酵素切断および／または加水分解により進行すると考えられる。
【００３８】
カチオン性リポポリマーは、オリゴヌクレオチドと複合体を形成することができるので、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するためのキャリアとして有用である。例えば、ポリマーは、目的の遺伝子の発現を低下させるか発現抑制させるのに効果的であるｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドに複合体化したポリマーを哺乳類に投与することにより、遺伝子治療を必要とする哺乳類の治療をするために使用することができる。ポリマーに複合体化されたオリゴヌクレオチドを含むカチオン性リポポリマーは、相互溶媒中においてカチオン性リポポリマーとオリゴヌクレオチドを混合することにより、さらに好ましくは下記の実施例に記載の方法により形成することができる。
【００３９】
ポリマーに結合されるオリゴヌクレオチドを含むカチオン性リポポリマーは、真核細胞に入ることのできる送達増強剤をさらに含有してもよい。送達増強剤は、複合体と溶解または混合されてよく、またはカチオン性リポポリマーに結合（例えば、共有結合または複合体化）されてよい。送達増強剤は、典型的には、オリゴヌクレオチド／キャリア複合体の経膜輸送を増強し、輸送中の分解を減少し、および／またはキャリアからのオリゴヌクレオチドの放出を促進することにより、オリゴヌクレオチドの細胞への輸送を促進する物質である。ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドの細胞への輸送は、好ましくはオリゴヌクレオチド／キャリア複合体が細胞膜、エンドソーム膜および核膜を通過した後に、オリゴヌクレオチドをキャリアから放出することから成る。例えば、ｓｉＲＮＡの場合、ｓｉＲＮＡ／キャリア複合体は、最初に細胞膜を通過する。これがエンドサイトーシスにより達成される場合、ｓｉＲＮＡ／キャリア複合体は、次に細胞内部に移行する。ｓｉＲＮＡカーゴとともにキャリアは、ポケットの形成により細胞膜に包まれ、続いてそのポケットはピンチオフ（ｐｉｎｃｈｅｄ ｏｆｆ）される。その結果は、ｓｉＲＮＡカ−ゴとキャリアとを包む大きな膜結合構造物である細胞エンドソームとなる。次に、ｓｉＲＮＡ／キャリア複合体は、エンドソーム膜を通過し細胞質に脱出して、細胞質中での酵素的な分解を避け、核膜を横切る。いったん核内に入ると、ｓｉＲＮＡカーゴは、キャリアから分離する。
【００４０】
一般的に、送達増強剤は、ウイルスキャリアシステムと非ウイルスキャリアシステムの２つのカテゴリーに分けられる。ヒトウイルスは、障壁を克服する方法を進化させて上記のように核へと輸送するので、ウイルスまたはウイルス成分は核酸を細胞に運ぶために有用である。送達増強剤として有用なウイルス成分の１例はヘマグルチニンペプチド（ＨＡ−ペプチド）である。このウイルスペプチドは、エンドソーム破砕により生体分子の細胞への移行を容易にする。エンドソームの酸性ｐＨでは、このタンパク質は、細胞質ゾルへの生体分子とキャリアの放出を引き起こす。送達増強剤として有用なウイルス成分の他の例は、当業者に公知である。
【００４１】
非ウイルス送達増強剤は、典型的にはポリマー系または脂質系である。それらは一般的に、核酸の負電荷をつり合わせるように働くポリカチオンである。ポリカチオン性ポリマーは、部分的には、大きさが制限されないＤＮＡプラスミドを縮合するそれらの能力や、ウイルスベクターに関する安全性の懸念などによって、非ウイルス遺伝子送達増強剤として非常に有望であることが示されている。具体例として、オリゴ−リジン、オリゴ−アルギニン、またはそれらの組合せなどの塩基性アミノ酸に富む領域を有するペプチドおよびＰＥＩが挙げられる。これらのポリカチオン性ポリマーは、ＤＮＡの縮合により輸送を促進すると考えられる。ＰＥＩや星型デンドリマーなどの分岐鎖形のポリカチオンは、ＤＮＡ縮合とエンドゾーム放出の両方を媒介することができる。Ｂｏｕｓｓｉｆら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．９２：７２９７−７３０１を参照されたい。ＰＥＩは、ｐＨ６．９でイオン化可能な末端アミンを有し、ｐＨ３．９でイオン化可能な内部アミンを有する高度に分岐したポリマーとして調製することができる。この構成のために、ＰＥＩは小胞膨潤を生じる小胞ｐＨの変化をもたらすことができ、最終的にはエンドソーム捕捉からの放出ができる。
【００４２】
送達を増強する他の方法は、オリゴヌクレオチドカ−ゴの送達の標的とされた細胞上の受容体により認識されるリガンドをカチオン性リポポリマーが含有することである。次に、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を受容体認識により開始することができる。本明細書で、用語「リガンド」は、標的細胞の表面またはその核もしくは細胞質ゾルにある特定の受容体タンパク質に結合することのできる生体分子をいう。１実施形態において、リガンドは、抗体、ホルモン、フェロモンもしくは神経伝達物質、または受容体に結合する、リガンドのように作用することのできる任意の生体分子であってよい。好ましい実施形態では、リガンドは、オリゴヌクレオチドである。抗体は、抗原に応答してＢリンパ球により産生されるタンパク質をいう。リガンドが特定の細胞の受容体に結合する場合、エンドサイトーシスが刺激される。オリゴヌクレオチド輸送を強化するために、多様な種類の細胞とともに用いられてきたリガンドの例は、ガラクトース、トランスフェリン、糖タンパク質アシアロオロソムコイド、アデノウイルスファイバー、マラリアスポロゾイト周囲タンパク質、上皮細胞成長因子、ヒトパピローマウイルスキャプシド、線維芽細胞成長因子および葉酸である。葉酸受容体の場合、結合リガンドは、ポトサイトーシスと呼ばれるプロセスにより内部に取り込まれ、そこでは受容体がリガンドに結合し、周囲の膜が細胞表面から閉鎖され、内部に取り入れられた物質は次に小胞膜を通過して細胞質に入る。Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １：１８５−１９１を参照されたい。１実施形態においては、式（Ｉ）のポリマーおよび真核細胞の特定の受容体を認識するリガンドは、医療診断システムとして使用されることができる。
【００４３】
多様な送達増強剤は、エンドソーム破壊により機能すると考えられる。例えば、上記のＨＡ−タンパク質に加えて、欠陥ウイルス粒子もエンドソーム分解剤として用いられてきた。Ｃｏｔｔｅｎら（Ｊｕｌｙ １９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．８９：６０９４−６０９８を参照されたい。非ウイルス剤は、概して両親媒性または脂質系のいずれかである。
【００４４】
ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドの細胞の細胞質への放出は、エンドソーム破壊を媒介する、分解を減少させる、またはこのプロセスをそろってバイパスする物質により高めることができる。エンドソームｐＨを上昇させるクロロキンは、取り込まれた物質の分解をリソソームの加水分解酵素を阻害することにより低減するために用いられている。Ｗａｇｎｅｒら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ｖｏｌ．８７：３４１０−３４１４を参照されたい。ＰＥＩや星型デンドリマーなどの分岐鎖ポリカチオンは、上記で議論したようにエンドソーム放出も促進する。
【００４５】
エンドソーム分解は、カチオン性リポポリマー／生体分子複合体に取り込まれるキメラタンパク質の成分としてジフテリア毒素とシュードモナス外毒素などの毒素のサブユニットを取り込むことによりバイパスされることができる。Ｕｈｅｒｅｋら（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７３：８８３５−８８４１を参照されたい。これらの成分はエンドソーム膜を経て、小胞体に戻る核酸のシャトリングを促進する。
【００４６】
細胞質にいったん入ると、オリゴヌクレオチドカーゴの核への輸送は、オリゴヌクレオチドキャリア上の核局在化シグナルの包含により高めることができる。例えば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）として機能する特定のアミノ酸配列を用いてよい。オリゴヌクレオチド／キャリア複合体上のＮＬＳは、細胞質ゾルに位置する特定の核輸送受容体タンパク質と相互作用すると考えられる。オリゴヌクレオチド／キャリア複合体がいったん組み立てられると、複合体中の受容体タンパク質は、ヌクレオポリンと複数の接触を行なうことで、複合体が核孔を通って輸送されると考えられる。オリゴヌクレオチド／キャリア複合体がその目的部位に着いた後、それは解離して、カーゴと他の成分を解放する。ＳＶ４０ラージＴ抗原に由来するＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌの配列（配列番号：１）を核への輸送に用いることができる。ＳＶ４０ラージＴ抗原に由来するこの短い配列は、会合巨大分子の核への輸送を引き起こすシグナルを提供すると考えられる。
【００４７】
カチオン性リポポリマーは、さらに、該ポリマーに複合体化された蛍光性であるか、放射性であるか、または放射線不透過染料などの画像診断用化合物を含有してよい。複合体は、相互溶媒中でカチオン性リポポリマーと画像診断用化合物を混合することにより形成することができる。ポリマー（画像診断用化合物と複合体化された）は、次いで哺乳動物へ投与後、ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＣＴ、ＳＰＥＣＴ、他などの周知の技術を用いて追跡することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｗｉｔｈ ＰＥＴ ａｎｄ ＳＰＥＣＴ，Ｖｉｊａｙ Ｓｈａｒｍａ，ＰｈＤ，Ｇａｒｙ Ｄ．Ｌｕｋｅｒ，ＭＤ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，ＭＤ，Ｐｈ．Ｄ．，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＡＧＮＥＴＩＣ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ ＩＭＡＧＩＮＧ １６：３３６−３５１（２００２）を参照）。画像診断用組成物はまた、式（Ｉ）のポリマーを画像造影剤（例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラアセチックアシッド（ＤＯＴＡ）−Ｇｄ（ＩＩＩ）およびジエチレントリアミンペンタアセチックアシッド（ＤＴＰＡ−Ｇｄ（ＩＩＩ））と組み合わせることにより形成することができる。所望の場合には、画像診断用組成物は、さらに、標的剤を含むことができる。適切な標的剤は、非制限的に、ＲＧＤペプチドおよびガラクトース基を含むことができる。
【００４８】
別の実施形態は、増感剤とポリマーとを含む医薬組成物において、そこではポリマーが式（Ｉ）の繰り返し単位とオリゴヌクレオチドとを含み、さらに、真核細胞に入ることのできる送達増強剤および／またはポリマーに複合体化された画像診断用化合物を含んでよい医薬組成物を提供する。増感剤は、光（例えば、可視光照射および／または紫外線照射）または他の刺激にさらされて性質の変化を受けることにより（例えば、ポリマーの分解速度を高めることにより）、生体分子の送達を促進する化合物であってよい。増感剤は、それ自体が、刺激を受けると活性の変化を受ける生体分子であってよい。増感剤は、光活性化薬剤であってよい。適切な活性化薬剤として、フルオレセイン、メロシアニン、キサンテンおよびその誘導体および光反応性ピロール由来の大環状分子およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。適切な光反応性ピロール由来の大環状分子として、天然または合成ポルフィリン、天然または合成のクロリン、天然または合成のバクテリオクロリン、合成イソバクテリオクロリン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、および広範なピロール系大環状システム、例えば、ポルフィセン、サフィリンおよびテキサフィリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００４９】
実施例１
【化９】
塩化オキサリル（１３．５ｍＬ、１５２ ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２００ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、３滴）中のオレイン酸１（１０．７ｇ、３８ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で加えた。反応混合物を約１時間攪拌し、次に室温まで温めた。１時間後、溶液をトルエンで希釈し、蒸留した。残渣をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ジエタノールアミン（１０．９ｍＬ、１１４ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（４９０ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（２１ｍＬ、１５２ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。溶液を０℃で３０分間攪拌し、次に室温で反応を一晩進行させた。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１ＮのＨＣｌとＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下に濃縮した。次に、粗製残渣をシリカゲルカラム（１０：１の酢酸エチル：メタノール）により精製して、化合物２の１３．５ｇ（９９．９％）を無色の油状物として得た。
【００５０】
実施例２
【化１０】
トリエチルアミン（８．１ｇ、８０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．５ｇ、４ｍｍｏｌ）および２（７．１ｇ、２０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２００ｍｌに室温で溶解した。システムにアルゴンを流し、溶液を氷浴中で冷却した。ジクロロメタン２５ｍｌ中の塩化アクリロイル（５．４ｇ、６０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。添加後、反応物を室温まで温め、一晩攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水とＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下に濃縮した。次に、粗製残渣をシリカゲルカラム（１：３の酢酸エチル：ヘキサン）により精製して、化合物３（分子量：４６３．６５）の７．５ｇ（８１％）を無色の油状物として得た。
【００５１】
実施例３
カチオン性リポポリマーの合成は、スキームＡに従って、分子量２３２ダルトンを有するペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）を化合物３と以下のように反応させることにより実施した。ＰＥＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）約０．１ｍｍｏｌ（２３ｍｇ）と化合物３約０．２ｍｍｏｌ（９３ｍｇ）を量り、小さいバイアルに入れ、エタノール１ｍＬを加えて、素早く溶解した。反応混合物を室温で３時間攪拌した。次いで、反応混合物をエーテル中２ＭのＨＣｌ（５ｍＬ）を加えて中和した。白色の沈殿物ＹＴ−１０を遠心分離して集め、エーテルで２回洗浄し、室温で減圧乾燥した。
【００５２】
これは、同様な化合物を含む他の合成手順のモデルとして役立つ一般的な手順であり、一連の分解性カチオン性リポポリマーを合成するために用いることができる。ポリマーＹＴ−１１は、化合物３の約０．３ｍｍｏｌ（１３９ｍｇ）が反応のために使用されたことを除き、同様の方法で製造された。また、ＰＥＩの他の種類が、同様の方法でＹＴ−１０またはＹＴ−１１のリポポリマー合成のために使用された。実施例３で合成された全てのリポポリマーは、表１に列挙される。ＹＴ−２６は、重合後に硬いゲルとなって、中和されなかった。
【表１】
【００５３】
実施例４
ＥＧＦＰ安定細胞株：ＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰとＨｅＬａ−ＥＧＦＰ安定細胞株は、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子発現を有するそれぞれＨＴ−１０８０とＨｅＬａ細胞に由来し、それらはｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＨＴ−１０８０とＨｅＬａ細胞にトランスフェクションさせることによって調製された。トランスフェクションされた細胞は、ネオマイシン耐性能力を用いて選択、クローン化され、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド上に担持された。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２下で、１０％ウシ血清、１００単位／ｍｌペニシリンと１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持された。ＥＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）の下で観察することができる。ＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰとＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞の両方は、青色励起光と緑色発光フィルタ設定の組合せによって、明るい緑の蛍光を示した。
【００５４】
実施例５
ｓｉＲＮＡ送達研究：ＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって合成された。ＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡとルシフェラーゼ遺伝子は、２１ｂｐの二本鎖ＲＮＡであり、それらのセンス鎖の配列は、ＮＮＣ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＧＣ ＧＡＵ ＣＡＣ ＡＵＧ（配列番号：２）であった。
【００５５】
１．５×１０４のＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰとＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、９６−ウエルプレートの各ウエルに対して植え付けた。各ウエルに対して、リポポリマー１．５μｇを含む溶液７．５μＬのアリコートを、１５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを含む７．５μＬのＤＮＡ溶液に加え、完全に混合した。ＤＮＡとリポポリマーの混合物は、ｓｉＲＮＡ−リポポリマー複合体の形成のために、室温で１５分間インキュベーションされた。複合体を各ウエルに加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベーションした。リポフェクタミンが陽性対照として使用された。ｓｉＲＮＡ送達効率は、ＧＦＰシグナル分析によって測定された。
【００５６】
図１は、リポポリマー（ＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２、ＹＴ−２３、ＹＴ−２４およびＹＴ−２５）、リポフェクタミン２０００（陽性対照）でのｓｉＲＮＡ処理後の、および未処理（陰性対照）ｓｉＲＮＡによる、ＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰ細胞中での強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の写真である。
【００５７】
図２は、リポポリマー（ＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２、ＹＴ−２３、ＹＴ−２４およびＹＴ−２５）、リポフェクタミン２０００（陽性対照）でのｓｉＲＮＡ処理後の、および未処理（陰性対照）ｓｉＲＮＡによる、ＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞中での強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の写真である。
【００５８】
図１と２で示されるように、発現抑制された標的ｓｉＲＮＡをいかなる処理もしないと、強い蛍光によって示されるように、ＥＧＦＰ発現は阻害されなかった。図１と２の未処理を参照されたい。リポポリマーキャリアにより発現抑制された標的ｓｉＲＮＡの処置により、ＥＧＦＰの発現は、弱い蛍光によって示されるように、阻害された。図１と２のＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２、ＹＴ−２３、ＹＴ−２４、ＹＴ−２５、およびリポフェクタミン２０００を参照されたい。ＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰ細胞では、ＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２およびＹＴ−２３は、ＥＧＦＰ発現に対して著しい阻害効果を示した。ＹＴ−２４とＹＴ−２５もまた、ｓｉＲＮＡ送達に有効であった。さらに、ＹＴ−１１は、ｓｉＲＮＡを送達する能力を示した。これらの結果は、リポポリマーが、市販のリポフェクタミン２０００と比較して、ｓｉＲＮＡのより良好な、または比肩し得る送達剤であることを示している。
【００５９】
本発明は、実施形態および実施例に関して記述されてきたが、いろいろな省略、付加および修正が、本発明の範囲から逸脱することなく上記の構成および方法がなされ得ること、そしてそのような修正と変更の全てが本発明の範囲内にあると意図されることを当業者は認識しなければならない。従って、本発明は上記の特許請求の範囲によって制限されるのみである。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】リポポリマー（ＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２、ＹＴ−２３、ＹＴ−２４およびＹＴ−２５）、リポフェクタミン２０００（陽性対照）に複合体化されたｓｉＲＮＡ、および未処理（陰性対照）のｓｉＲＮＡによる処置後の、ＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰ細胞中での強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の写真である。
【００６１】
【図２】リポポリマー（ＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２、ＹＴ−２３、ＹＴ−２４およびＹＴ−２５）、リポフェクタミン２０００（陽性対照）に複合体化された、および未処置（陰性対照）のｓｉＲＮＡによる処置後の、ＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞中での強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の写真である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００６年４月６日に出願された米国仮特許出願第６０／７８９，８４２号に基づく優先権を主張し、それは引用によりその全文が全ての図面を含めて本明細書に取り込まれる。さらに、本出願は、２００５年８月３１日に出願された米国特許出願第１１／２１６，９８６号に関し、それは引用によりその全文が全ての図面を含めて本明細書に取り込まれる。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、生理活性薬剤を細胞に送達するための組成物と方法に関する。具体的には、本発明は、ポリ−またはオリゴ−エチレンイミン（ＰＥＩ）、生分解性基、および比較的疎水性の基を含むカチオン性リポポリマーに関し、またｓｉＲＮＡおよびアンチセンスなどのオリゴヌクレオチドを送達するためにそのようなリポポリマーを製造し、使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
ウイルストランスフェクションシステムや非ウイルストランスフェクションシステムの使用を含む多くの技術が、プラスミドＤＮＡなどの生理活性薬剤を細胞に送達するために利用可能である。ウイルスシステムは、概して非ウイルスシステムよりも高いトランスフェクション効率を有するが、ウイルスシステムの安全性に関して疑問があった。Ｖｅｒｍａ Ｉ．Ｍ および Ｓｏｍｉａ Ｎ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８９（１９９７），ｐｐ．２３９−２４２；Ｍａｒｈｓａｌｌ Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（２０００），ｐｐ．２２４４−２２４５を参照されたい。さらに、ウイルスベクターの調製は、複雑で費用のかかるプロセスになりやすい。非ウイルストランスフェクションシステムは、一般的にウイルスシステムよりも効率が劣るが、それらのシステムは一般的にウイルスシステムよりも安全で、調製しやすいと考えられるので、かなりの注目を集めてきた。
【０００４】
多くの非ウイルストランスフェクションシステムは、プラスミドＤＮＡに複合体化されたカチオン性ポリマーの使用を伴う。遺伝子キャリアとして用いられてきたカチオン性ポリマーの例としては、ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、およびポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）が挙げられる。残念ながら、ＰＬＬによるトランスフェクション効率は、概して低いものであり、高分子量のＰＬＬは、細胞に対して顕著な毒性を示してきた。幾つかの場合には、２０，０００〜２５，０００ダルトンの分子量の範囲にあるＰＥＩは、エンドソーム分解性薬剤や標的剤を必要としない効率的な遺伝子移入を提供する。Ｂｏｕｓｓｉｆ Ｏ．，Ｌｅｚｏｕａｌｃ’ｈ Ｆ．，Ｚａｎｔａ Ｍ．Ａ．，Ｍｅｒｇｎｙ Ｍ．Ｄ．，Ｓｃｈｅｒｍａｎ Ｄ．，Ｄｅｍｅｎｅｉｘ Ｂ．，Ｂｅｈｒ Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ａｕｇ．１，１９９５，９２（１６）７２９７−３０１を参照されたい。しかしながら、分子量で４００〜２，０００ダルトンの分子量の範囲にあるＰＥＩは、プラスミドＤＮＡ送達に有効ではない。一連のポリアミドアミンデンドリマーが遺伝子送達システムとして研究されてきている。Ｅｉｃｈｍａｎ Ｊ．Ｄ．，Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ Ａ．Ｕ．，Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ Ｊ．Ｆ．，Ｂａｋｅｒ Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．，Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２０００ Ｊｕｌｙ；３（７）：２３２−２４５を参照されたい。残念ながら、ＰＥＩとデンドリマーの両方が、細胞に対して毒性があると報告されているので、ヒト患者への適用における遺伝子送達ツールとしてＰＥＩを使用する可能性を制限している。さらに、商業的に実用的な遺伝子トランスフェクション効率を有するポリアミドアミンデンドリマーの費用は比較的高い。
【０００５】
プラスミドＤＮＡなどの遺伝子、分解性のカチオン性ポリマーを使用して作られたキャリアは、低減された細胞毒性でもって遺伝子を哺乳動物細胞に移入することが報告されている。Ｌｉｍ Ｙ．Ｂ．，Ｋｉｍ Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｅ Ｙ．，Ｌｅｅ Ｗ．Ｋ．，Ｙａｎｇ Ｔ．Ｇ．，Ｌｅｅ Ｍ．Ｊ．，Ｓｕｈ Ｈ．，Ｐａｒｋ Ｊ．Ｓ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３（１０），２４６０−２４６１，２００１を参照されたい。残念ながら、これらの分解性システムも、非分解性ポリマーと比較して、より低い遺伝子移入効率を示した。低分子量ＰＥＩのトランスフェクション効率を向上させるために、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらは、高分子量ＰＥＩが、低分子量ＰＥＩを有するジスルフィド含有リンカーを用いて得ることができることを報告した。Ｇｏｓｓｅｌｉｎ，Ｍｉｃｈｅａｌ Ａ．， Ｇｕｏ，Ｍｅｎｊｉｎ，および Ｌｅｅ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｊ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００１．１２：２３２−２４５を参照されたい。ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）およびジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート−２ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）を用いて製造されたＰＥＩポリマーは、同様の遺伝子トランスフェクション効率と低い細胞毒性を示した。しかし、ジスルフィド含有リンカーは高価であり、このことは、このシステムの大量調製を困難にし、望ましくないものとしている。ジスルフィド含有リンカーを有するポリマーは、還元性条件下でのみ分解し、それは他の条件でのポリマー適用を制限している。
【０００６】
Ｌｙｎｎらは、ジアクリレートを、カチオン性化合物間のリンカー分子として用いる生分解性のカチオン性ポリマーの合成方法を記載している。Ｌｙｎｎ，Ｄａｖｉｄ Ａ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｇ．；Ｐｕｔｎａｍ，Ｄａｖｉｄ；および Ｌａｎｇｅｒ，Ｒｏｂｅｒｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，８１５５−８１５６を参照されたい。しかし、これらのポリマーの合成は、完結するのに何日をも要し、遺伝子送達に使用できる有効な生成物の量が少ない。１００種類を超えるカチオン性ポリマーが、Ｌｙｎｎらの方法に従って製造されたが、これらポリマーのうち２種類のみが効果的な遺伝子トランスフェクション効率を示しただけである。ＰＥＩなどのカチオン性ポリマーは、ｓｉＲＮＡ導入に有効であることは証明されなかった。Ｌｙｎｎらの方法に従って製造された生分解性のカチオン性ポリマーは、ｓｉＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドの送達には使用されてこなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ｓｉＲＮＡやオリゴヌクレオチドの細胞への送達を安全かつ効率的に促進するために使用できるカチオン性ポリマーの必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（本発明の概要）
本発明者らは、オリゴヌクレオチドを細胞に送達することのできる幾つかのポリマー組成物を見出した。ある実施形態では、ポリマーは、送達増強剤および／または画像診断用化合物などの他の部分にさらに複合体化することができる。さらに、本発明者らは、ポリマー組成物を使用して、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための方法を見出した。
【０００９】
本明細書で開示される１実施形態は、式（Ｉ）：
【化１】
（式中、ＰＥＩは、６００ダルトン未満の分子量を有するポリエチレンイミン繰り返し単位である。Ｒは、電子対、水素、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５−Ｃ３０アリール、およびＣ２−Ｃ３０ヘテロアリールから成る群から選択され；Ｌは、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５−Ｃ５０アリール、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルから成る群から選択され、ｍは、約１〜約３０の範囲にある整数である）から成る群から選択される繰り返し単位を含むポリマーを含む。
【００１０】
１実施形態では、ＰＥＩが、式（ＩＩａ）および（ＩＩｂ）：
【化２】
（式中、ｘは約１〜約１２の範囲にある整数であり、ｙは約１〜約６の範囲にある整数であり、およびｚは約１〜約１３の範囲にある整数である）から成る群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含むことができる。
【００１１】
ポリマーは、幾つかの実施形態では、生分解性である。ポリマーが分解することのできる適切な機構は、非制限的に、加水分解、酵素切断、還元、光切断、および超音波処理を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、Ｌは、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ５０アルキニルおよびＣ２−Ｃ５０ヘテロアルキニルから成る群から選択されることができる。他の実施形態では、ＬはＣ１２〜Ｃ１８の脂肪酸、コレステロールおよびそれらの誘導体から成る群から選択されることができる。
【００１３】
１実施形態では、ポリマーは、約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲にある重量平均分子量を有することができる。別の実施形態では、ポリマーは、約１，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にある重量平均分子量を有することができる。
【００１４】
幾つかの実施形態では、ポリマーは架橋されることができる。
【００１５】
本明細書で開示される別の実施形態は、ポリマーと複合体化されたオリゴヌクレオチドをさらに含むことができる。適切なオリゴヌクレオチドの例としては、非制限的に、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡオリゴマーおよびアンチセンスなどのＤＮＡオリゴマーが挙げられる。
【００１６】
オリゴヌクレオチドの他に、ポリマーは、真核細胞に入ることができる送達増強剤をさらに含むことができる。所望の場合には、ポリマーは、ポリマーと複合体化することのできる画像診断用化合物をさらに含むことができる。送達増強剤は、真核細胞における１つ以上の次の機能：受容体認識、細胞内移行、細胞エンドソームからのオリゴヌクレオチドの脱出、核局在化、オリゴヌクレオチドの放出、および系の安定化を促進することができる。オリゴヌクレオチドの例示としては、非制限的に、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスを含む。他の実施形態では、送達増強剤は、ポリマーに結合することができる。
【００１７】
本明細書で開示される１実施形態は、真核細胞を形質移入する方法を含み、それは細胞をポリマーと接触させ、それによりオリゴヌクレオチドを細胞に送達させることから成り、そこではポリマーはさらにオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００１８】
本明細書で開示される別の実施形態は、哺乳類を治療する方法を含み、それは遺伝子治療が必要な哺乳類を特定して、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートしたポリマーを哺乳類に投与することから成り、そこではオリゴヌクレオチドは、目的の遺伝子の発現を低下させるか発現抑制させるのに効果的であるｓｉＲＮＡを含んでいる。
【００１９】
幾つかの実施形態では、ポリマーは、ポリマーに複合体化された画像診断用合物をさらに含むことができる。本明細書で開示される１実施形態は、画像診断用化合物を哺乳類に送達する方法を含み、それは哺乳類にポリマーを投与することから成り、そこではポリマーは画像診断用化合物に複合体化されている。
【００２０】
本明細書で開示される１実施形態は、複数のポリマーから成るポリマーライブラリーを含み、そこではＲ、Ｌ、ＰＥＩ、およびｍから成る群から選択される少なくとも１つのパラメータが、ポリマーの少なくとも２つに関して異なっている。
【００２１】
本明細書で開示される別の実施形態は、ポリマーと真核細胞の特異的受容体を認識することができるリガンドから成る医学診断システムを含む。所望の場合、ポリマーはリガンドに結合させることができる。
【００２２】
本明細書で開示されるさらに別の実施形態では、医薬組成物は、増感剤およびポリマーを含むことができる。増感剤は、可視線照射、紫外線照射、または両方に感受性であることができる。１実施形態では、医薬組成物は増感剤およびポリマーを含み、そこではポリマーはオリゴヌクレオチドに対して親和性を有することができる。
【００２３】
１実施形態では、画像診断用組成物は、画像造影剤とポリマーを含むことができる。所望の場合、画像診断用組成物は、さらに標的剤を含むことができる。
【００２４】
本明細書で開示される１実施形態は、式（Ｉ）：
【化３】
［式中、ＰＥＩは、式（ＩＩｂ）：
【化４】
（式中、ｚは約１〜約１３の範囲にある整数である）の少なくとも１つの繰り返し単位を含むポリエチレンイミン繰り返し単位である。Ｒは、電子対、水素、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５−Ｃ３０アリール、およびＣ２−Ｃ３０ヘテロアリールから成る群から選択されることができる。Ｌは、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５−Ｃ５０アリール、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルから成る群から選択されることができ；およびｍは、約１〜約３０の範囲にある整数である］から成る群から選択される繰り返し単位を含む。
【００２５】
１実施形態では、式（ＩＩｂ）の少なくとも１つの繰り返し単位を含むＰＥＩは、６００ダルトン未満の分子量を有することができる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、ＰＥＩは、式（ＩＩａ）
【化５】
（式中、ｘは約１〜約１２の範囲にある整数であり、およびｙは約１〜約６の範囲にある整数である）の繰り返し単位をさらに含むことができる。
【００２７】
１実施形態では、ＰＥＩが式（ＩＩａ）の繰り返し単位をさらに含むポリマーは、６００ダルトン未満の分子量を有することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
１実施形態は、ポリエチレンイミン、生分解性基、および比較的疎水性の「リポ」基を含むカチオン性リポポリマーを提供する。好ましいカチオン性リポポリマーは、式（Ｉ）：
【化６】
からなる群から選択される繰り返し単位を含む。
【００２９】
式（Ｉ）において、ＰＥＩは、ポリエチレンイミンであり、エステル結合は生分解性基であり、Ｌは比較的疎水性の「リポ」基を表す。例えば、ある実施形態においては、ＬはＣ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５−Ｃ５０アリール；Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール；Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルから成る群から選択される。好ましい実施形態において、ＬはＣ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ５０アルキニルおよびＣ２−Ｃ５０ヘテロアルキニルから成る群から選択される。より好ましい実施形態では、ＬはＣ１２〜Ｃ１８の脂肪酸、コレステロールおよびそれらの誘導体から成る群から選択される。
【００３０】
式（Ｉ）中のＲは、電子対または水素原子を表すことができる。当業者は、Ｒが電子対を表す場合に、式（Ｉ）の繰り返し単位は低いｐＨでカチオン性であることを理解する。また、式（Ｉ）においてＲは、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５−Ｃ３０アリール、またはＣ２−Ｃ３０ヘテロアリールなどの比較的疎水性のリポ基を表すこともあり、この場合、窒素原子は、通常は広いｐＨ範囲にわたって正電荷を有することが理解されるであろう。
【００３１】
ＰＥＩは、式（ＩＩａ）および／または（ＩＩｂ）：
【化７】
（式中、ｘは約１〜約１２の範囲にある整数であり、ｙは約１〜約６の範囲にある整数であり、およびｚは約１〜約１３の範囲にある整数である）の少なくとも１つの繰り返し単位を含むことができる。
【００３２】
本明細書で使用される「式ＩＩ」は、式（ＩＩａ）および（ＩＩｂ）を別々に、または組み合わせて含むＰＥＩを意味する。
【００３３】
式（Ｉ）の繰り返し単位を含むカチオン性リポポリマーは、下記スキームＡに示されるように式（ＩＩＩ）のジアクリレートモノマーをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と反応させることにより調製することができる。
スキームＡ
【化８】
【００３４】
式（ＩＩＩ）において、ＲおよびＬは、式（Ｉ）の繰り返し単位を含有するカチオン性リポポリマーについて上に記載したと同じ意味を有する。スキームＡは、式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリマーの調製を示す。
【００３５】
スキームＡに示される反応は、攪拌下に、好ましくは室温で数時間、エタノールなどの相互溶媒中でＰＥＩとジアクリレート（ＩＩＩ）とを混合し、次に溶媒を蒸発させて生成したポリマーを回収することにより実施することができる。本発明は理論に縛られるものではないが、ＰＥＩとジアクリレート（ＩＩＩ）との反応は、ＰＥＩの１つ以上のアミンと、ジアクリレートの２重結合とのミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ）反応を伴うと考えられる。Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．，ｐｐ．７１１−７１２（１９８５）を参照されたい。スキームＡに示されるジアクリレートは、下記実施例に示される方法で調製することができる。
【００３６】
式（Ｉ）の繰り返し単位を含む多様なポリマーは、ＰＥＩの分子量と構造、ジアクリレート（ＩＩＩ）上のＲ基およびＬ基の大きさと種類、およびＰＥＩに対するジアクリレート（ＩＩＩ）の比率を変えることにより、スキームＡにしたがって製造することができる。異なるジアクリレートの混合物および／または異なるＰＥＩの混合物を使用してもよい。ＰＥＩは多機能性であり得るから、２種類以上のジアクリレートと反応することができる。架橋剤を用いて架橋カチオン性リポポリマーを製造することができ、および／または多機能性ＰＥＩとジアクリレート（ＩＩＩ）の相対的な比率は、調整されて架橋カチオン性リポポリマーを製造することができる。ＰＥＩの分子量は、好ましくは約６００ダルトン未満である。ＰＥＩ：ジアクリレートのモル比は、好ましくは約１：０．５〜約１：２０の範囲にある。カチオン性リポポリマーの重量平均分子量は、約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲、好ましくは約１，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にある。分子量は、ＰＥＧ標準を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによるか、またはアガロースゲル電気泳動により決定することができる。１実施形態において、Ｒ、Ｌ、ＰＥＩ、および／またはｍが、少なくとも２つのポリマーについて異なる複数のカチオン性リポポリマーを調製することにより、ポリマーライブラリーが提供される。
【００３７】
カチオン性リポポリマーは、好ましくは分解性であり、より好ましくは生分解性であり、例えば、加水分解、酵素切断、還元、光切断、および超音波処理からなる群から選択される機構により分解可能である。本発明は理論により制限されるわけではないが、細胞内の式（Ｉ）のカチオン性リポポリマーの分解は、エステル結合の酵素切断および／または加水分解により進行すると考えられる。
【００３８】
カチオン性リポポリマーは、オリゴヌクレオチドと複合体を形成することができるので、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するためのキャリアとして有用である。例えば、ポリマーは、目的の遺伝子の発現を低下させるか発現抑制させるのに効果的であるｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドに複合体化したポリマーを哺乳類に投与することにより、遺伝子治療を必要とする哺乳類の治療をするために使用することができる。ポリマーに複合体化されたオリゴヌクレオチドを含むカチオン性リポポリマーは、相互溶媒中においてカチオン性リポポリマーとオリゴヌクレオチドを混合することにより、さらに好ましくは下記の実施例に記載の方法により形成することができる。
【００３９】
ポリマーに結合されるオリゴヌクレオチドを含むカチオン性リポポリマーは、真核細胞に入ることのできる送達増強剤をさらに含有してもよい。送達増強剤は、複合体と溶解または混合されてよく、またはカチオン性リポポリマーに結合（例えば、共有結合または複合体化）されてよい。送達増強剤は、典型的には、オリゴヌクレオチド／キャリア複合体の経膜輸送を増強し、輸送中の分解を減少し、および／またはキャリアからのオリゴヌクレオチドの放出を促進することにより、オリゴヌクレオチドの細胞への輸送を促進する物質である。ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドの細胞への輸送は、好ましくはオリゴヌクレオチド／キャリア複合体が細胞膜、エンドソーム膜および核膜を通過した後に、オリゴヌクレオチドをキャリアから放出することから成る。例えば、ｓｉＲＮＡの場合、ｓｉＲＮＡ／キャリア複合体は、最初に細胞膜を通過する。これがエンドサイトーシスにより達成される場合、ｓｉＲＮＡ／キャリア複合体は、次に細胞内部に移行する。ｓｉＲＮＡカーゴとともにキャリアは、ポケットの形成により細胞膜に包まれ、続いてそのポケットはピンチオフ（ｐｉｎｃｈｅｄ ｏｆｆ）される。その結果は、ｓｉＲＮＡカ−ゴとキャリアとを包む大きな膜結合構造物である細胞エンドソームとなる。次に、ｓｉＲＮＡ／キャリア複合体は、エンドソーム膜を通過し細胞質に脱出して、細胞質中での酵素的な分解を避け、核膜を横切る。いったん核内に入ると、ｓｉＲＮＡカーゴは、キャリアから分離する。
【００４０】
一般的に、送達増強剤は、ウイルスキャリアシステムと非ウイルスキャリアシステムの２つのカテゴリーに分けられる。ヒトウイルスは、障壁を克服する方法を進化させて上記のように核へと輸送するので、ウイルスまたはウイルス成分は核酸を細胞に運ぶために有用である。送達増強剤として有用なウイルス成分の１例はヘマグルチニンペプチド（ＨＡ−ペプチド）である。このウイルスペプチドは、エンドソーム破砕により生体分子の細胞への移行を容易にする。エンドソームの酸性ｐＨでは、このタンパク質は、細胞質ゾルへの生体分子とキャリアの放出を引き起こす。送達増強剤として有用なウイルス成分の他の例は、当業者に公知である。
【００４１】
非ウイルス送達増強剤は、典型的にはポリマー系または脂質系である。それらは一般的に、核酸の負電荷をつり合わせるように働くポリカチオンである。ポリカチオン性ポリマーは、部分的には、大きさが制限されないＤＮＡプラスミドを縮合するそれらの能力や、ウイルスベクターに関する安全性の懸念などによって、非ウイルス遺伝子送達増強剤として非常に有望であることが示されている。具体例として、オリゴ−リジン、オリゴ−アルギニン、またはそれらの組合せなどの塩基性アミノ酸に富む領域を有するペプチドおよびＰＥＩが挙げられる。これらのポリカチオン性ポリマーは、ＤＮＡの縮合により輸送を促進すると考えられる。ＰＥＩや星型デンドリマーなどの分岐鎖形のポリカチオンは、ＤＮＡ縮合とエンドゾーム放出の両方を媒介することができる。Ｂｏｕｓｓｉｆら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．９２：７２９７−７３０１を参照されたい。ＰＥＩは、ｐＨ６．９でイオン化可能な末端アミンを有し、ｐＨ３．９でイオン化可能な内部アミンを有する高度に分岐したポリマーとして調製することができる。この構成のために、ＰＥＩは小胞膨潤を生じる小胞ｐＨの変化をもたらすことができ、最終的にはエンドソーム捕捉からの放出ができる。
【００４２】
送達を増強する他の方法は、オリゴヌクレオチドカ−ゴの送達の標的とされた細胞上の受容体により認識されるリガンドをカチオン性リポポリマーが含有することである。次に、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を受容体認識により開始することができる。本明細書で、用語「リガンド」は、標的細胞の表面またはその核もしくは細胞質ゾルにある特定の受容体タンパク質に結合することのできる生体分子をいう。１実施形態において、リガンドは、抗体、ホルモン、フェロモンもしくは神経伝達物質、または受容体に結合する、リガンドのように作用することのできる任意の生体分子であってよい。好ましい実施形態では、リガンドは、オリゴヌクレオチドである。抗体は、抗原に応答してＢリンパ球により産生されるタンパク質をいう。リガンドが特定の細胞の受容体に結合する場合、エンドサイトーシスが刺激される。オリゴヌクレオチド輸送を強化するために、多様な種類の細胞とともに用いられてきたリガンドの例は、ガラクトース、トランスフェリン、糖タンパク質アシアロオロソムコイド、アデノウイルスファイバー、マラリアスポロゾイト周囲タンパク質、上皮細胞成長因子、ヒトパピローマウイルスキャプシド、線維芽細胞成長因子および葉酸である。葉酸受容体の場合、結合リガンドは、ポトサイトーシスと呼ばれるプロセスにより内部に取り込まれ、そこでは受容体がリガンドに結合し、周囲の膜が細胞表面から閉鎖され、内部に取り入れられた物質は次に小胞膜を通過して細胞質に入る。Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １：１８５−１９１を参照されたい。１実施形態においては、式（Ｉ）のポリマーおよび真核細胞の特定の受容体を認識するリガンドは、医療診断システムとして使用されることができる。
【００４３】
多様な送達増強剤は、エンドソーム破壊により機能すると考えられる。例えば、上記のＨＡ−タンパク質に加えて、欠陥ウイルス粒子もエンドソーム分解剤として用いられてきた。Ｃｏｔｔｅｎら（Ｊｕｌｙ １９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．８９：６０９４−６０９８を参照されたい。非ウイルス剤は、概して両親媒性または脂質系のいずれかである。
【００４４】
ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドの細胞の細胞質への放出は、エンドソーム破壊を媒介する、分解を減少させる、またはこのプロセスをそろってバイパスする物質により高めることができる。エンドソームｐＨを上昇させるクロロキンは、取り込まれた物質の分解をリソソームの加水分解酵素を阻害することにより低減するために用いられている。Ｗａｇｎｅｒら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ｖｏｌ．８７：３４１０−３４１４を参照されたい。ＰＥＩや星型デンドリマーなどの分岐鎖ポリカチオンは、上記で議論したようにエンドソーム放出も促進する。
【００４５】
エンドソーム分解は、カチオン性リポポリマー／生体分子複合体に取り込まれるキメラタンパク質の成分としてジフテリア毒素とシュードモナス外毒素などの毒素のサブユニットを取り込むことによりバイパスされることができる。Ｕｈｅｒｅｋら（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７３：８８３５−８８４１を参照されたい。これらの成分はエンドソーム膜を経て、小胞体に戻る核酸のシャトリングを促進する。
【００４６】
細胞質にいったん入ると、オリゴヌクレオチドカーゴの核への輸送は、オリゴヌクレオチドキャリア上の核局在化シグナルの包含により高めることができる。例えば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）として機能する特定のアミノ酸配列を用いてよい。オリゴヌクレオチド／キャリア複合体上のＮＬＳは、細胞質ゾルに位置する特定の核輸送受容体タンパク質と相互作用すると考えられる。オリゴヌクレオチド／キャリア複合体がいったん組み立てられると、複合体中の受容体タンパク質は、ヌクレオポリンと複数の接触を行なうことで、複合体が核孔を通って輸送されると考えられる。オリゴヌクレオチド／キャリア複合体がその目的部位に着いた後、それは解離して、カーゴと他の成分を解放する。ＳＶ４０ラージＴ抗原に由来するＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌの配列（配列番号：１）を核への輸送に用いることができる。ＳＶ４０ラージＴ抗原に由来するこの短い配列は、会合巨大分子の核への輸送を引き起こすシグナルを提供すると考えられる。
【００４７】
カチオン性リポポリマーは、さらに、該ポリマーに複合体化された蛍光性であるか、放射性であるか、または放射線不透過染料などの画像診断用化合物を含有してよい。複合体は、相互溶媒中でカチオン性リポポリマーと画像診断用化合物を混合することにより形成することができる。ポリマー（画像診断用化合物と複合体化された）は、次いで哺乳動物へ投与後、ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＣＴ、ＳＰＥＣＴ、他などの周知の技術を用いて追跡することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｗｉｔｈ ＰＥＴ ａｎｄ ＳＰＥＣＴ，Ｖｉｊａｙ Ｓｈａｒｍａ，ＰｈＤ，Ｇａｒｙ Ｄ．Ｌｕｋｅｒ，ＭＤ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，ＭＤ，Ｐｈ．Ｄ．，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＡＧＮＥＴＩＣ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ ＩＭＡＧＩＮＧ １６：３３６−３５１（２００２）を参照）。画像診断用組成物はまた、式（Ｉ）のポリマーを画像造影剤（例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラアセチックアシッド（ＤＯＴＡ）−Ｇｄ（ＩＩＩ）およびジエチレントリアミンペンタアセチックアシッド（ＤＴＰＡ−Ｇｄ（ＩＩＩ））と組み合わせることにより形成することができる。所望の場合には、画像診断用組成物は、さらに、標的剤を含むことができる。適切な標的剤は、非制限的に、ＲＧＤペプチドおよびガラクトース基を含むことができる。
【００４８】
別の実施形態は、増感剤とポリマーとを含む医薬組成物において、そこではポリマーが式（Ｉ）の繰り返し単位とオリゴヌクレオチドとを含み、さらに、真核細胞に入ることのできる送達増強剤および／またはポリマーに複合体化された画像診断用化合物を含んでよい医薬組成物を提供する。増感剤は、光（例えば、可視光照射および／または紫外線照射）または他の刺激にさらされて性質の変化を受けることにより（例えば、ポリマーの分解速度を高めることにより）、生体分子の送達を促進する化合物であってよい。増感剤は、それ自体が、刺激を受けると活性の変化を受ける生体分子であってよい。増感剤は、光活性化薬剤であってよい。適切な活性化薬剤として、フルオレセイン、メロシアニン、キサンテンおよびその誘導体および光反応性ピロール由来の大環状分子およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。適切な光反応性ピロール由来の大環状分子として、天然または合成ポルフィリン、天然または合成のクロリン、天然または合成のバクテリオクロリン、合成イソバクテリオクロリン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、および広範なピロール系大環状システム、例えば、ポルフィセン、サフィリンおよびテキサフィリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００４９】
実施例１
【化９】
塩化オキサリル（１３．５ｍＬ、１５２ ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２００ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、３滴）中のオレイン酸１（１０．７ｇ、３８ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で加えた。反応混合物を約１時間攪拌し、次に室温まで温めた。１時間後、溶液をトルエンで希釈し、蒸留した。残渣をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ジエタノールアミン（１０．９ｍＬ、１１４ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（４９０ｍｇ、４ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（２１ｍＬ、１５２ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。溶液を０℃で３０分間攪拌し、次に室温で反応を一晩進行させた。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１ＮのＨＣｌとＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下に濃縮した。次に、粗製残渣をシリカゲルカラム（１０：１の酢酸エチル：メタノール）により精製して、化合物２の１３．５ｇ（９９．９％）を無色の油状物として得た。
【００５０】
実施例２
【化１０】
トリエチルアミン（８．１ｇ、８０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．５ｇ、４ｍｍｏｌ）および２（７．１ｇ、２０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２００ｍｌに室温で溶解した。システムにアルゴンを流し、溶液を氷浴中で冷却した。ジクロロメタン２５ｍｌ中の塩化アクリロイル（５．４ｇ、６０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。添加後、反応物を室温まで温め、一晩攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水とＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下に濃縮した。次に、粗製残渣をシリカゲルカラム（１：３の酢酸エチル：ヘキサン）により精製して、化合物３（分子量：４６３．６５）の７．５ｇ（８１％）を無色の油状物として得た。
【００５１】
実施例３
カチオン性リポポリマーの合成は、スキームＡに従って、分子量２３２ダルトンを有するペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）を化合物３と以下のように反応させることにより実施した。ＰＥＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）約０．１ｍｍｏｌ（２３ｍｇ）と化合物３約０．２ｍｍｏｌ（９３ｍｇ）を量り、小さいバイアルに入れ、エタノール１ｍＬを加えて、素早く溶解した。反応混合物を室温で３時間攪拌した。次いで、反応混合物をエーテル中２ＭのＨＣｌ（５ｍＬ）を加えて中和した。白色の沈殿物ＹＴ−１０を遠心分離して集め、エーテルで２回洗浄し、室温で減圧乾燥した。
【００５２】
これは、同様な化合物を含む他の合成手順のモデルとして役立つ一般的な手順であり、一連の分解性カチオン性リポポリマーを合成するために用いることができる。ポリマーＹＴ−１１は、化合物３の約０．３ｍｍｏｌ（１３９ｍｇ）が反応のために使用されたことを除き、同様の方法で製造された。また、ＰＥＩの他の種類が、同様の方法でＹＴ−１０またはＹＴ−１１のリポポリマー合成のために使用された。実施例３で合成された全てのリポポリマーは、表１に列挙される。ＹＴ−２６は、重合後に硬いゲルとなって、中和されなかった。
【表１】
【００５３】
実施例４
ＥＧＦＰ安定細胞株：ＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰとＨｅＬａ−ＥＧＦＰ安定細胞株は、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子発現を有するそれぞれＨＴ−１０８０とＨｅＬａ細胞に由来し、それらはｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＨＴ−１０８０とＨｅＬａ細胞にトランスフェクションさせることによって調製された。トランスフェクションされた細胞は、ネオマイシン耐性能力を用いて選択、クローン化され、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド上に担持された。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２下で、１０％ウシ血清、１００単位／ｍｌペニシリンと１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持された。ＥＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）の下で観察することができる。ＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰとＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞の両方は、青色励起光と緑色発光フィルタ設定の組合せによって、明るい緑の蛍光を示した。
【００５４】
実施例５
ｓｉＲＮＡ送達研究：ＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって合成された。ＥＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡとルシフェラーゼ遺伝子は、２１ｂｐの二本鎖ＲＮＡであり、それらのセンス鎖の配列は、ＮＮＣ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＧＣ ＧＡＵ ＣＡＣ ＡＵＧ（配列番号：２）であった。
【００５５】
１．５×１０４のＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰとＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、９６−ウエルプレートの各ウエルに対して植え付けた。各ウエルに対して、リポポリマー１．５μｇを含む溶液７．５μＬのアリコートを、１５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを含む７．５μＬのＤＮＡ溶液に加え、完全に混合した。ＤＮＡとリポポリマーの混合物は、ｓｉＲＮＡ−リポポリマー複合体の形成のために、室温で１５分間インキュベーションされた。複合体を各ウエルに加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベーションした。リポフェクタミンが陽性対照として使用された。ｓｉＲＮＡ送達効率は、ＧＦＰシグナル分析によって測定された。
【００５６】
図１は、リポポリマー（ＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２、ＹＴ−２３、ＹＴ−２４およびＹＴ−２５）、リポフェクタミン２０００（陽性対照）でのｓｉＲＮＡ処理後の、および未処理（陰性対照）ｓｉＲＮＡによる、ＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰ細胞中での強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の写真である。
【００５７】
図２は、リポポリマー（ＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２、ＹＴ−２３、ＹＴ−２４およびＹＴ−２５）、リポフェクタミン２０００（陽性対照）でのｓｉＲＮＡ処理後の、および未処理（陰性対照）ｓｉＲＮＡによる、ＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞中での強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の写真である。
【００５８】
図１と２で示されるように、発現抑制された標的ｓｉＲＮＡをいかなる処理もしないと、強い蛍光によって示されるように、ＥＧＦＰ発現は阻害されなかった。図１と２の未処理を参照されたい。リポポリマーキャリアにより発現抑制された標的ｓｉＲＮＡの処置により、ＥＧＦＰの発現は、弱い蛍光によって示されるように、阻害された。図１と２のＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２、ＹＴ−２３、ＹＴ−２４、ＹＴ−２５、およびリポフェクタミン２０００を参照されたい。ＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰ細胞では、ＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２およびＹＴ−２３は、ＥＧＦＰ発現に対して著しい阻害効果を示した。ＹＴ−２４とＹＴ−２５もまた、ｓｉＲＮＡ送達に有効であった。さらに、ＹＴ−１１は、ｓｉＲＮＡを送達する能力を示した。これらの結果は、リポポリマーが、市販のリポフェクタミン２０００と比較して、ｓｉＲＮＡのより良好な、または比肩し得る送達剤であることを示している。
【００５９】
本発明は、実施形態および実施例に関して記述されてきたが、いろいろな省略、付加および修正が、本発明の範囲から逸脱することなく上記の構成および方法がなされ得ること、そしてそのような修正と変更の全てが本発明の範囲内にあると意図されることを当業者は認識しなければならない。従って、本発明は上記の特許請求の範囲によって制限されるのみである。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】リポポリマー（ＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２、ＹＴ−２３、ＹＴ−２４およびＹＴ−２５）、リポフェクタミン２０００（陽性対照）に複合体化されたｓｉＲＮＡ、および未処理（陰性対照）のｓｉＲＮＡによる処置後の、ＨＴ−１０８０−ＥＧＦＰ細胞中での強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の写真である。
【００６１】
【図２】リポポリマー（ＹＴ−１０、ＹＴ−１１、ＹＴ−２２、ＹＴ−２３、ＹＴ−２４およびＹＴ−２５）、リポフェクタミン２０００（陽性対照）に複合体化された、および未処置（陰性対照）のｓｉＲＮＡによる処置後の、ＨｅＬａ−ＥＧＦＰ細胞中での強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
ＰＥＩは、６００ダルトン未満の分子量を有するポリエチレンイミン繰り返し単位であり；
Ｒは、電子対、水素、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５−Ｃ３０アリール、およびＣ２−Ｃ３０ヘテロアリールから成る群から選択され；
Ｌは、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５−Ｃ５０アリール、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルから成る群から選択され、；ならびに
ｍは、約１〜約３０の範囲にある整数である）から成る群から選択される繰り返し単位を含むポリマー。
【請求項２】
ＰＥＩが、式（ＩＩａ）および（ＩＩｂ）：
【化２】
（式中、ｘは約１〜約１２の範囲にある整数であり、ｙは約１〜約６の範囲にある整数であり、およびｚは約１〜約１３の範囲にある整数である）から成る群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含む、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
生分解性である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項４】
加水分解、酵素切断、還元、光切断、および超音波処理からなる群から選択される機構により分解性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項５】
Ｌが、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ５０アルキニルおよびＣ２−Ｃ５０ヘテロアルキニルから成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項６】
Ｌが、Ｃ１２〜Ｃ１８の脂肪酸、コレステロールおよびそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項７】
約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲にある重量平均分子量を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項８】
約１，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にある重量平均分子量を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項９】
架橋されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１０】
ポリマーに複合体化されているオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ−オリゴマーおよびＤＮＡ−オリゴマーから成る群から選択される、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスである、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１３】
真核細胞に入ることのできる送達増強剤をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１４】
ポリマーに複合体化された画像診断用化合物をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１５】
送達増強剤が、受容体認識、細胞内移行、細胞エンドソームからのオリゴヌクレオチドの脱出、核局在化、オリゴヌクレオチドの放出、およびシステムの安定化からなる群から選択される真核細胞における１つ以上の機能を促進する、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスから成る群から選択される、請求項１５に記載のポリマー。
【請求項１７】
送達増強剤がポリマーに結合されている、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１８】
式（Ｉ）：
【化３】
［式中、
ＰＥＩは、式（ＩＩｂ）：
【化４】
（式中、ｚは約１〜約１３の範囲にある整数である）の少なくとも１つの繰り返し単位を含むポリエチレンイミン繰り返し単位であり；
Ｒは、電子対、水素、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５−Ｃ３０アリール、およびＣ２−Ｃ３０ヘテロアリールから成る群から選択され；
Ｌは、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５−Ｃ５０アリール、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルから成る群から選択され；ならびに
ｍは、約１〜約３０の範囲にある整数である］から成る群から選択される繰り返し単位を含むポリマー。
【請求項１９】
ＰＥＩが、６００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１８に記載のポリマー。
【請求項２０】
ＰＥＩが、式ＩＩａ：
【化５】
（式中、ｘは約１〜約１２の範囲にある整数であり、およびｙは約１〜約６の範囲にある整数である）の繰り返し単位をさらに含む、請求項１８に記載のポリマー。
【請求項２１】
ＰＥＩが、６００ダルトン未満の分子量を有する、請求項２０に記載のポリマー。
【請求項２２】
細胞を請求項１０〜１７のいずれか１項に記載のポリマーと接触させ、それによりオリゴヌクレオチドを細胞に送達することからなる真核細胞の形質移入方法。
【請求項２３】
Ｒ、Ｌ、ＰＥＩ、およびｍからなる群から選択される少なくとも１つのパラメータが、ポリマーの少なくとも２つに対して異なる請求項１〜２１のいずれか１項に記載の複数のポリマーを含むポリマーライブラリー。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
ＰＥＩは、６００ダルトン未満の分子量を有するポリエチレンイミン繰り返し単位であり；
Ｒは、電子対、水素、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５−Ｃ３０アリール、およびＣ２−Ｃ３０ヘテロアリールから成る群から選択され；
Ｌは、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５−Ｃ５０アリール、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルから成る群から選択され、；ならびに
ｍは、約１〜約３０の範囲にある整数である）から成る群から選択される繰り返し単位を含むポリマー。
【請求項２】
ＰＥＩが、式（ＩＩａ）および（ＩＩｂ）：
【化２】
（式中、ｘは約１〜約１２の範囲にある整数であり、ｙは約１〜約６の範囲にある整数であり、およびｚは約１〜約１３の範囲にある整数である）から成る群から選択される少なくとも１つの繰り返し単位を含む、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
生分解性である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項４】
加水分解、酵素切断、還元、光切断、および超音波処理からなる群から選択される機構により分解性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項５】
Ｌが、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ５０アルキニルおよびＣ２−Ｃ５０ヘテロアルキニルから成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項６】
Ｌが、Ｃ１２〜Ｃ１８の脂肪酸、コレステロールおよびそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項７】
約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲にある重量平均分子量を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項８】
約１，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にある重量平均分子量を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項９】
架橋されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１０】
ポリマーに複合体化されているオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ−オリゴマーおよびＤＮＡ−オリゴマーから成る群から選択される、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスである、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項１３】
真核細胞に入ることのできる送達増強剤をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１４】
ポリマーに複合体化された画像診断用化合物をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１５】
送達増強剤が、受容体認識、細胞内移行、細胞エンドソームからのオリゴヌクレオチドの脱出、核局在化、オリゴヌクレオチドの放出、およびシステムの安定化からなる群から選択される真核細胞における１つ以上の機能を促進する、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスから成る群から選択される、請求項１５に記載のポリマー。
【請求項１７】
送達増強剤がポリマーに結合されている、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１８】
式（Ｉ）：
【化３】
［式中、
ＰＥＩは、式（ＩＩｂ）：
【化４】
（式中、ｚは約１〜約１３の範囲にある整数である）の少なくとも１つの繰り返し単位を含むポリエチレンイミン繰り返し単位であり；
Ｒは、電子対、水素、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ５−Ｃ３０アリール、およびＣ２−Ｃ３０ヘテロアリールから成る群から選択され；
Ｌは、Ｃ２−Ｃ５０アルキル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ５０アルケニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５−Ｃ５０アリール、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２−Ｃ５０アルキニル、Ｃ２−Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２−Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２−Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルから成る群から選択され；ならびに
ｍは、約１〜約３０の範囲にある整数である］から成る群から選択される繰り返し単位を含むポリマー。
【請求項１９】
ＰＥＩが、６００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１８に記載のポリマー。
【請求項２０】
ＰＥＩが、式ＩＩａ：
【化５】
（式中、ｘは約１〜約１２の範囲にある整数であり、およびｙは約１〜約６の範囲にある整数である）の繰り返し単位をさらに含む、請求項１８に記載のポリマー。
【請求項２１】
ＰＥＩが、６００ダルトン未満の分子量を有する、請求項２０に記載のポリマー。
【請求項２２】
細胞を請求項１０〜１７のいずれか１項に記載のポリマーと接触させ、それによりオリゴヌクレオチドを細胞に送達することからなる真核細胞の形質移入方法。
【請求項２３】
Ｒ、Ｌ、ＰＥＩ、およびｍからなる群から選択される少なくとも１つのパラメータが、ポリマーの少なくとも２つに対して異なる請求項１〜２１のいずれか１項に記載の複数のポリマーを含むポリマーライブラリー。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００９−５３２５６４（Ｐ２００９−５３２５６４Ａ）
【公表日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０４２３３（Ｐ２００９−５０４２３３）
【出願日】平成１９年４月３日（２００７．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８１０６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２０４７９
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（０００００３９６４）日東電工株式会社 (5,557)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月３日（２００７．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８１０６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２０４７９
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（０００００３９６４）日東電工株式会社 (5,557)
【Ｆターム（参考）】
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