生物学的に活性な血清パラオキソナーゼのレベルを決定するための方法および組成物
生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを決定する方法が提供される。その方法は、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することを含み、ラクトナーゼ活性は生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す。また、酵素のラクトナーゼ活性を測定するために使用されることができる新規な化合物が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学的診断、特にＰＯＮ１のような生物学的に活性な血清パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）のレベルを決定するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清パラオキソナーゼ（ＰＯＮ１）は、ＰＯＮと名付けられる大きな酵素ファミリーのうちの最もよく知られているメンバーである。ＰＯＮ１は、エステル、有機リン酸塩（例えば、パラオキソン）およびラクトンのような広範囲の基質を加水分解する、抗アテローム発生特性および解毒特性を備えるＨＤＬ関連酵素である。長い間、ＰＯＮ１はアリールエステラーゼおよびパラオキソナーゼであると考えられ、その活性はそれに基づいて測定された。しかしながら、ＰＯＮ１は本来、種々のラクトンの加水分解［１，２］および形成［３］の両方を触媒するラクトナーゼであることが最近明らかになった。構造−反応性研究［４］および実験室進化実験［５］は、ＰＯＮ１の本来の活性がラクトナーゼであること、およびパラオキソナーゼおよびアリールエステラーゼが不規則な活性であることを示す。ＡｐｏＡ−Ｉを担持するＨＤＬ粒子に結合することによるＰＯＮ１の活性化の研究は、ラクトン基質、特に脂肪親和性のラクトンに対する高い特異性を示す［６］。最後に、ラクトナーゼ活性はＰＯＮファミリーの全てのメンバーによって共有される唯一の活性であり、メンバーのうちのいくつかはパラオキソナーゼ活性もアリールエステラーゼ活性も示さない［２］。
【０００３】
ヒト血清におけるＰＯＮ１の活性は、ＰＯＮ１の多型、その活性を調節する種々の環境的因子、およびアテローム性動脈硬化および他の障害に対する罹病性の間にありうる関連性を扱う多くの研究の対象であった［７］。しかしながら、分析は生理学的な関連性を有さない酢酸フェニルまたはパラオキソンを用いる。より関連性のある分析はラクトナーゼ活性を扱わなければならない。脂肪族のラクトンでラクトナーゼ活性を測定するための現在の方法は、ｐＨ指示薬分析［１，４］およびＨＰＬＣ［２，３］に基づく。ＨＰＬＣは極めて面倒であり、一方ｐＨ指示薬分析は較正の繰り返しを必要とし、しかもｐＨおよび緩衝液強度がきっちりと制御されることができる純粋な酵素サンプルでのみ正確な結果をもたらす。
【０００４】
最近、Ｓｉｃａｒｄと共同研究者ら［９］は、ウンベリフェロンで置換された６員環および７員環のラクトンを用いる蛍光ベースのラクトナーゼ分析を開発した。しかしながら、これらの基質は長いアルキル側鎖を有する５員環のオキソ−ラクトンを含むＰＯＮ１の好適な基質とは有意に異なる［２，４，６］。これらの基質はまた、ＰＯＮ１に対するｐＨ最適条件（８．０〜８．５）で高いバックグラウンド率を示す。
【０００５】
したがって、上記の制限が全くないラクトナーゼ活性のための新規な分析に対する必要性が広く認識されており、それを有することは極めて有利である。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の１つの側面によれば、生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを決定する方法であって、生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することを含む方法が提供される。
【０００７】
本発明の別の側面によれば、被験者におけるＰＯＮ状態を決定する方法であって、（ａ）被験者のＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性レベルを決定すること、ただし、ラクトナーゼ活性は被験者における生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す；および（ｂ）被験者のＰＯＮ酵素を遺伝子型決定し、それによって被験者のＰＯＮ状態を決定することを含む方法が提供される。
【０００８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＰＯＮ酵素はＰＯＮ１、ＰＯＮ２およびＰＯＮ３からなる群から選択される。
【０００９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、生物学的に活性なＰＯＮ酵素は、アポリポタンパク質複合ＰＯＮ酵素を含む。
【００１０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性の決定は、
（ｉ）クロマトグラフィ分析；
（ｉｉ）ｐＨ指示薬分析；
（ｉｉｉ）分光光度分析；
（ｉｖ）共役酵素分析（ｃｏｕｐｌｅｄ ａｓｓａｙ）；
（ｖ）電気化学的分析；および／または
（ｖｉ）熱量分析
によって行なわれる。
【００１１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分光光度分析は、少なくとも１つのラクトンを含みかつラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる基質の存在下で行なわれる。
【００１２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分光光度分析は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析（ｉｌｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ）からなる群から選択される。
【００１３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンに結合される。
【００１４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンの一部を形成する。
【００１５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分は少なくとも１つのチオールを含む。
【００１６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、基質はラクトンに結合されているチオアルコキシ基を含む。
【００１７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む。
【００１８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出は発色分析または蛍光発生分析によって行われる。
【００１９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、基質はラクトンのヘテロ原子に隣接する炭素に結合されたチオアルコキシ基を有する、５員、６員または７員のラクトンを含む。
【００２０】
本発明のさらに別の側面によれば、サンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定する方法であって、（ａ）サンプルを、少なくとも１つのラクトンを含みかつラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる化合物と接触させること、ただし、検出可能な部分は化合物がラクトナーゼの基質と実質的に同じ構造を有するように選択される；および（ｂ）部分のレベルを分光光度的に決定し、それによってサンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定することを含む方法が提供される。
【００２１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、部分のレベルの決定は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析からなる群から選択される。
【００２２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンに結合される。
【００２３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンの一部を形成する。
【００２４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分は少なくとも１つのチオールを含む。
【００２５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、基質はラクトンに結合されているチオアルコキシ基を含む。
【００２６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む。
【００２７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出は発色分析によって行われる。
【００２８】
本発明のさらに別の側面によれば、被験者におけるＰＯＮ酵素の異常なレベルまたは異常な活性に関連する障害の素因を決定するかまたは障害を診断するためのキットであって、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することができる少なくとも１つの薬剤を含むキットが提供される。
【００２９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つのラクトンを含みかつラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる化合物である。
【００３０】
本発明のさらなる側面によれば、少なくとも１つのラクトンを含みかつラクトンの分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能なチオール含有部分を形成することができる化合物が提供される。
【００３１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、チオール含有部分は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析からなる群から選択される分光光度分析によって検出可能である。
【００３２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンに結合される。
【００３３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンの一部を形成する。
【００３４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はチオアルコキシ基を含む。
【００３５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む。
【００３６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ラクトンは、５員、６員または７員のラクトンである。
【００３７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ラクトンは５員のラクトンである。
【００３８】
本発明は、生物学的に活性な血清パラオキソナーゼのレベルを決定するための方法および組成物を提供することによって、現在知られている構成の欠点に対処することに成功している。
【００３９】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００４０】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１ａ〜１ｂは、ＰＯＮ１のラクトナーゼ活性の比色測定（図１ａ）および蛍光発生測定（図１ｂ）を示すグラフである。図１ａ−ＰＯＮ１の存在下（８．３７５×１０−９Ｍ；黒四角）または非存在下（白丸）の、４１２ｎｍでの吸光度によって監視された、０．５ｍＭ ＤＴＮＢでの０．２ｍＭ ＴＢＢＬのグラフ。図１ｂ−ＰＯＮ１の存在下（８．３７５×１０−９Ｍ；黒四角）または非存在下（白丸）の、４００ｎｍでの励起および５１６ｎｍでの放射によって検出された、５０μＭ ＣＰＭでの０．２５ｍＭ ＴＢＢＬのグラフ。
図２ａ〜２ｂは、ヒト血清におけるＰＯＮ１のラクトナーゼ活性（図２ａ）およびアリールエステラーゼ活性（図２ｂ）を示すグラフである。血清はＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で１：４００に希釈され、反応物は、図２ａ−０．５ｍＭ ＴＢＢＬおよび０．５ｍＭ ＤＴＮＢ；図２ｂ−１．０ｍＭ 酢酸フェニルを含んでいた。インヒビター無し（黒四角）、１００μＭ ２−ヒドロキシキノリン（白丸）、または５ｍＭ ＥＤＴＡ（黒三角）で観察された速度および血清無しのバックグラウンド加水分解（白四角）の速度が示される。ＴＢＢＬの加水分解は、ＤＴＮＢで検出され、４１２ｎｍでの吸光度によって監視される（図２ａ）。酢酸フェニルの加水分解は、２７０ｎｍでの吸光度で直接的に監視される（図２ｂ）。
図３は、ＦＡＣＳ分析によって決定された、チオアルキルブチロラクトン基質（ＴＢＢＬ）およびｗ／ｏ／ｗエマルジョンを使用する、ＰＯＮ１発現Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＯＮ１のラクトナーゼ活性を示すグラフである。細胞質中にｒｅＰＯＮ１を発現する細胞はＴＢＢＬおよびチオール検出色素ＣＰＭとともに乳化された。ＧＦＰおよびＰＯＮ１を発現する単細胞（白色）およびＧＦＰのみでのコントロール細胞（灰色）についての５３０ｎｍでの蛍光放射（チオール−ＣＰＭ付加物）の代表的ヒストグラムが示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、生物学的に活性なラクトナーゼ、特に血清パラオキソナーゼのレベルを決定するための方法および組成物、その合成基質の新規なファミリーおよびそれを調製する方法の発明である。
【００４２】
本発明の原理および作用は、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００４３】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行されることができる。また、本明細書において用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００４４】
パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）は、ＰＯＮ２およびＰＯＮ３も含むタンパク質ファミリーのメンバーである。ＰＯＮ１は、エステル、有機リン酸塩（例えば、パラオキソン）およびラクトンのような広範囲の基質を加水分解する、抗アテローム発生特性および解毒特性を備えるＨＤＬ関連酵素である。長い間、ＰＯＮ１はアリールエステラーゼおよびパラオキソナーゼであると考えられ、その活性はそれに基づいて測定された。しかしながら、ＰＯＮ１は本来、種々のラクトンの加水分解および形成の両方を触媒するラクトナーゼであることが最近明らかになった。構造−反応性研究および実験室進化実験は、ＰＯＮ１の本来の活性がラクトナーゼであること、およびパラオキソナーゼおよびアリールエステラーゼが不規則な活性であることを示す。
【００４５】
現在の慣習は、生理学的毒素または生体異物毒素（すなわち、身体または生体に対して異質な化学化合物）に対してＰＯＮ１によって提供される保護の程度を決定するのは、ＰＯＮ１が毒性の有機リン酸塩を分解し、酸化脂質を代謝する触媒効率であることを示唆する。さらに、ＰＯＮ１のより高い濃度は、より良好な保護を提供する。
【００４６】
したがって、適切な危険性評価のためにはＰＯＮレベルおよび活性を知ることが重要である。
【００４７】
上記で言及したように、ＰＯＮのラクトナーゼ活性は最近発見されたとはいえ、ＰＯＮの生物学的活性を正確に評価するためのＰＯＮラクトナーゼ活性の分析は提案されてこなかった。
【００４８】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ＰＯＮのラクトナーゼ活性を決定することが個体における生物学的に活性なＰＯＮのレベルを決定するために使用されうることを発見した。これらの知見は、アテローム性動脈硬化のような、ＰＯＮの低下した活性またはレベルに関連する多くの状態に対する正確な危険性評価を容易にすることができる。
【００４９】
したがって、本発明の１つの側面によれば、生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを決定する方法が提供される。
【００５０】
本明細書において使用される表現「ＰＯＮ酵素」は、ヒトＰＯＮ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００４３７．３）、ヒトＰＯＮ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００２９６．１）、およびヒトＰＯＮ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００９３１．１）のようなパラオキソナーゼ酵素（例えば、哺乳動物パラオキソナーゼ）を示す。
【００５１】
本明細書において使用される表現「生物学的に活性なＰＯＮ酵素」は、例えば酸化脂質の加水分解のような生物学的な（例えば、生理学的な）事象に関わるＰＯＮ酵素の部分を示す。
【００５２】
例えば、生物学的に活性なＰＯＮ酵素は、ＨＤＬ−ａｐｏＡ−Ｉのような種々のアポリポタンパク質粒子に関連するＰＯＮ酵素の部分を示すことができる。ａｐｏＡ−Ｉと関連するＰＯＮ酵素がａｐｏＡ−ＩＶおよびａｐｏＡ−ＩＩと比較してより高いＰＯＮラクトナーゼ活性を刺激することができることが最近確立されてきた（ＧａｕｄｕｋｏｖおよびＴａｗｆｉｋ（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（印刷中）を参照のこと）。
【００５３】
好ましくは、本発明のＰＯＮ酵素は、以下にさらに記載されるように、動物被験体（例えば、ヒト）に由来する生物学的サンプル中に存在する。
【００５４】
本発明のこの側面の方法は、生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することによって行われる。
【００５５】
本明細書において使用される表現「ラクトナーゼ活性」は、ラクトン加水分解活性を示し、それは典型的には、本発明のこの側面に従ってラクトンのエステル結合の加水分解を示す。
【００５６】
酵素のラクトナーゼ活性を決定する方法は、当該分野において周知である。これらの方法は典型的には、例えば、クロマトグラフィ分析（例えば、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ、ＧＣ、ＣＰＥ）、ｐＨ指示薬分析、共役酵素分析（すなわち、これらの分析において、分析される酵素以外の酵素が測定可能な生成物を産出するために加えられる；例えば、カルボン酸生成物はデヒドロゲナーゼによってターンオーバーされ、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨの濃度の変化が吸光度または蛍光によって監視される）、熱量分析（すなわち、熱量の変化を監視すること）、電気化学的分析（すなわち、レドックス電位の変化を監視すること）、および／または分光光度分析のような公知の生化学的分析によって行われる。
【００５７】
典型的な酵素分析は、試験される酵素が特異的に触媒する化学反応に基づく。化学反応は典型的には、基質またはその類似物の生成物への変換である。基質または生成物のいずれかのレベル、すなわち濃度の微細な変化を検出する能力は、定性的および定量的に酵素の活性を決定することを可能にし、試験される酵素に対する特定の基質の特異性を定量的に決定しさえする。基質および／または生成物のレベルの微細な変化を測定するために、これらの化合物は、ｐＨ、分子量、色または他の直接的もしくは間接的に測定可能な化学的および／または物理的性質の変化のような化学的または物理的に検出されることができる化学的および／または物理的性質を有するべきである。
【００５８】
以下は、本発明のこの側面に従って使用されうる例示的なラクトナーゼ分析の説明である。
【００５９】
ｐＨ指示薬分析−ｐＨ指示薬に基づく酵素の分析は、典型的には脂肪族のラクトンでラクトナーゼ活性を測定するために使用される。ｐＨ指示薬分析は、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（登録商標）ＰＬＵＳマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、Ｂｉｌｌｅｃｋｅら（２０００）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８：１３３５−１３４２に記載されるような連続的なｐＨ感受性比色分析（すなわち、ｐＨ指示薬によって生成される色の強度を測定すること）を使用して達成されてもよい。２ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００４％（ｗ／ｖ）フェノールレッド、および希釈／非希釈ＰＯＮ含有サンプル（例えば、１００〜１０００倍に希釈された血清サンプル）を含有する反応（２００μｌ最終容量）は、メタノール中の１００ｍＭ基質溶液２μｌで開始され、３７℃で３〜１０分間実行される。速度は、既知量のＨＣＬを使用して生成された標準曲線から予測される速度因子（ｍＯＤ／μｍｏｌ Ｈ＋）を使用して、４７５ｎｍ（等吸収点）で補正しながら５５８ｎｍでの吸光度減少の勾配から計算される。ラクトンの自発性の加水分解および大気中のＣＯ２による酸性化は好ましくは、酵素の代わりに同じ容量の保存緩衝液での平行反応を実行することによって補正される。
【００６０】
あるいは、カルボン酸形成から生じるプロトン放出は、ｐＨ指示薬クレゾールパープルを用いて監視されることができる。反応は、１ｍＭ ＣａＣｌ２および０．２Ｍ ＮａＣｌを含有するＢｉｃｉｎｅ緩衝液２．５ｍＭにおいて、ｐＨ８．０〜８．３で行われる。反応混合物は、０．２〜０．３ｍＭのクレゾールレッド（ＤＭＳＯ中の６０ｍＭストックから）を含有する。基質と酵素サンプルとの混合時に、５７７ｎｍでの吸光度の減少がマイクロタイタープレートリーダーにおいて監視される。分析は、速度因子（−ＯＤ／Ｈ＋のモル）を与える酢酸でのその場での較正（標準酸滴定曲線）を必要とする。
【００６１】
ＨＰＬＣ分析−種々のラクトン基質の加水分解は、ＨＰＬＣ分析によって検出されることができる。したがって、例えば、アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）の加水分解は、ＨＰＬＣ（例えば、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ−１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒子）を使用して１９７ｎｍで設定されたＷａｔｅｒｓ ２９９６フォトダイオードアレイ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ２６９５システム）によって分析されることができる。酵素反応は、５０μｌ容量の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、２５μＭ ＡＨＬ（例えば、メタノール中の２ｍＭストック溶液から）、および希釈／非希釈ＰＯＮ含有サンプル（例えば、１００〜１０００倍に希釈された血清サンプル）において室温で実行される。反応は５０μｌアセトニトリル（ＡＣＮ）で停止され、タンパク質を除去するために遠心分離される。上清（４０μｌ）はＨＰＬＣシステムに充填され、８５％ ＣＡＮ／０．２％酢酸（テトラデカ−ホモセリンラクトン）、０．７５％ ＣＡＮ／０．２％酢酸（ドデカ−ホモセリンラクトン）、５０％ ＣＡＮ／０．２％酢酸（ヘプタ−ホモセリンラクトン）、または２０％ ＣＡＮ／０．２％酢酸（３−オキソ−ヘキサノイルホモセリンラクトン）でアイソクラチック溶出される。
【００６２】
スタチンラクトン（メバスタチン、ロバスタチン、およびシンバスタチン）の加水分解は、例えば、Ｍｏｄｅｌ １２６ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ、２３８ｎｍで設定されたＭｏｄｅｌ １６８ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、２０μｌループのＭｏｄｅｌ ７１２５ Ｒｈｅｏｄｙｎｅ 手動注入弁、およびＢｅｃｋｍａｎ ＯＤＳ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅカラム（Ｃ １８、２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を備えるＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ＨＰＬＣを用いることによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析されることができる。ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ）およびシンバスタチンは、Ｍｅｒｃｋから２０ｍｇ錠剤として購入でき、ラクトンはそれらの錠剤からクロロホルムで抽出され、乾燥するまで蒸発され、メタノール中に再溶解される。メバスタチンはＳｉｇｍａから購入できる。
【００６３】
１ｍｌの最終容量において、１０〜２００μｌの酵素溶液およびメタノール中の基質溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）１０μｌは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＣａＣｌ２中で２５℃でインキュベートされる。アリコート（１００μｌ）は特定の時点で除去され、アセトニトリル（１００μｌ）に添加され、ボルテックスされ、そして１分間最大速度で遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）される。上清は新しい試験管中に注がれ、蓋をされ、そしてＨＰＬＣ分析まで氷上で保存される。
【００６４】
サンプルは、移動相Ａ＝酢酸／アセトニトリル／水（２：２４９：２４９、ｖ／ｖ／ｖ）および移動相Ｂ＝アセトニトリルからなる移動相を用いてメバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチンのそれぞれについて５０／５０、４５／５５および４０／６０のＡ／Ｂ比率で１．０ｍｌ／分の流速でアイソクラチック溶出される。
【００６５】
分光光度分析−分光光度分析において、基質の消費および／または生成物の形成は、酵素触媒時に形成される分光光度的に検出可能な部分の濃度に起こる変化を追跡することによって測定されることができる。分光光度分析の例としては、限定されないが、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析が挙げられる。
【００６６】
燐光分析は、放射エネルギーまたは他のタイプのエネルギーの吸収後に分光光度的に検出可能な部分によって生成されるルミネセンスの変化を監視する。燐光は、燐光をもたらす放射が終わった後も持続する点で蛍光と区別される。
【００６７】
蛍光分析は、光もしくは他の形態の電磁放射または他の手段による刺激または励起下で、分光光度的に検出可能な部分によって生成されるルミネセンスの変化を監視する。光は刺激が持続している間のみ発せられる。この現象の点で蛍光は、他の放射による励起が終わった後にも光が発せられ続ける燐光と異なる。
【００６８】
発色分析は、特徴的な波長を有する分光光度的に検出可能な部分によって生成される分析媒体の色の変化を監視する。
【００６９】
ルミネセンス分析は、化学ルミネセンスによって生成されるルミネセンス、したがって酵素反応時に生成または消費される分光光度的に検出可能な部分によって生成されるルミネセンスの変化を監視する。ルミネセンスは、より高いエネルギー状態からより低いエネルギー状態への物質内の電子の移動によって引き起こされる。
【００７０】
本発明の文脈において使用される表現「分光光度的に検出可能な」は、紫外線〜赤外線の範囲の波長を有する測定可能な電磁放射の挙動に関係する物理的現象を記述する。定量的に測定されることができる分光光度的に検出可能な特性の非限定的な例は、化学化合物の色、照度、および赤外線および／またはＵＶに特異的な特性である。
【００７１】
したがって、表現「分光光度的に検出可能な部分」は、酵素分析時に形成され、かつ上記で定義されるような１つ以上の分光光度的に検出可能な特性によって特徴付けられる部分を記述する。したがって、酵素活性と相関するこのような部分の濃度は、酵素反応分析時に定量的に決定されることができる。
【００７２】
上記で言及されたように、ラクトンはＰＯＮ酵素の天然基質である。したがって、上で述べられた分析の各々において、基質は好ましくは１つ以上のラクトン部分を含む。
【００７３】
当該分野において周知であるように、用語「ラクトン」は、典型的にはアルコールとカルボン酸エステルの間の分子間反応の縮合生成物である環状エステルのような環状カルボン酸部分を記述する。この縮合生成物はしばしば当該分野において「オキソ−ラクトン」として示される。用語「ラクトン」はまた、典型的には、環状チオカルボン酸部分を示し、したがって、チオール基とカルボン酸、アルコールとチオカルボン酸、およびチオール基とチオカルボン酸の間の分子間反応の縮合生成物も含む。このようなラクトンはしばしば当該分野において「チオラクトン」として集合的に示される。
【００７４】
当該分野においてさらに周知であるように、ラクトン環のサイズは典型的には４〜８個の原子の範囲である。環張力および他の熱力学的考察により、一般的なラクトンの環サイズは５〜７個の原子の範囲である。このようなラクトンは、ＰＯＮ酵素の好ましい基質としても知られている。
【００７５】
一般的に使用される接頭辞はラクトンの環サイズを示すために使用されることができる：βラクトンは４員環のラクトンを記述し、γラクトンは５員環のラクトンを記述し、そしてδラクトンは６員環のラクトンを記述する。
【００７６】
したがって、本明細書において使用される用語「ラクトン」は、ラクトン環中に４〜８個の原子、好ましくは５〜７個の原子を有する、上記のようなオキソ−ラクトンおよびチオラクトンを包含する。ラクトン部分は置換されていても置換されていなくてもよい。置換されている場合、ラクトン環中の１つ以上の炭素原子は、限定されないが、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を通して結合される）、またはヘテロ脂環式（環炭素を通して結合される）、アルコキシ、チオアルコキシ（これらの用語は以下に定義される）などのような１つ以上の置換基によって置換されることができる。
【００７７】
本明細書において使用される用語「アルキル」は、直鎖基および分枝鎖基を含む飽和脂肪族炭化水素を記述する。好ましくは、アルキル基は１〜２０個の炭素原子を有する。数値範囲、例えば「１〜２０個」が本明細書において示される場合には常に、基（この場合アルキル基）が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など２０個までの炭素原子を含むことができることを意味する。より好ましくは、アルキルは１〜１０個の炭素原子を有する中間サイズのアルキルである。最も好ましくは、特記しない限り、アルキルは１〜４個の炭素原子を有する低級アルキルである。アルキル基は置換されていても置換されていなくてもよい。
【００７８】
用語「アルケニル」は、少なくとも２個の炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素の二重結合からなるアルキル基を示す。
【００７９】
用語「シクロアルキル」は、環の１つ以上が完全共役のπ電子系を有しない、すべて炭素からなる単環基または縮合環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を記述する。
【００８０】
用語「ヘテロ脂環式」は、窒素、酸素、および硫黄のような１個以上の原子を環中に有する単環基または縮合環基を記述する。この環は、１つ以上の二重結合を有してもよい。しかし、環は完全共役のπ電子系を有さない。
【００８１】
用語「アリール」は、完全共役のπ電子系を有する、すべて炭素からなる単環基または縮合環多環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を記述する。
【００８２】
用語「ヘテロアリール」は、例えば、窒素、酸素および硫黄などの１個以上の原子を環（単数または複数）中に有し、さらには完全共役のπ電子系を有する単環基または縮合環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を記述する。ヘテロアリール基の非限定的な例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリンおよびプリンが含まれる。
【００８３】
用語「チオール」および「チオヒドロキシ」は−ＳＨ基を示す。
【００８４】
用語「ヒドロキシ」は−ＯＨ基を示す。
【００８５】
本明細書において使用される用語「アルコキシ」は、本明細書において定義されるような−Ｏ−アルキル基を示す。
【００８６】
本明細書において使用される用語「チオアルコキシ」は、本明細書において定義されるような−Ｓ−アルキル基を示す。
【００８７】
上記のラクトン部分は、上記の酵素分析において基質として使用される場合、さらに物質の一部を形成することができる。したがって、例えば、ラクトン部分は脂肪酸、ステロイド等の一部を形成することができる。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することは、分光光度分析によって行われる。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、このような分析は、１つ以上のラクトンを含みかつ１つ以上の分光光度的に検出可能な部分を形成することができる基質を利用する。酵素はこのような基質と接触させられ、検出可能な部分の量が測定される。
【００８９】
本明細書において記述される分光光度分析の１つの実施形態において、分光光度的に検出可能な部分がラクトンの不可欠な部分を形成する基質が利用される。このような分析において、酵素はラクトンを加水分解し、分光光度的に検出可能な種が分析媒体中に生成される。したがって、基質は、その構造中に予め分光光度的に検出可能な部分を有する予め分光光度的に検出可能な物質である。
【００９０】
本明細書において使用される表現「予め分光光度的に検出可能な部分または物質」は、ある条件下で、ここでは酵素反応に供された場合に、検出可能な部分を形成することができる部分または物質を記述するために使用される。
【００９１】
ラクトン含有基質の一部を形成する分光光度的に検出可能な部分は、このような基質がその天然の酵素に対する基質の天然の化学的および空間的な特異性を維持し、それによって酵素と基質の間の天然の化学的相互作用を維持するので極めて有利である。これらの相互作用を維持することは、酵素の天然の生物学的活性を研究し決定することを可能にし、また天然阻害剤および合成阻害剤のような酵素の他の化学的エフェクター間の生物学的に有意義な比較も可能にする。
【００９２】
本明細書において記述される分光光度分析の１つの実施形態において、分光光度的に検出可能な部分がラクトンに結合される基質が利用される。このような基質は、分光光度的に検出可能な部分が典型的には分析において行われる酵素反応時に放出されるように選択される。
【００９３】
本発明のこの側面の好ましい実施形態によれば、分光光度的に検出可能な部分はチオール基を含む。
【００９４】
チオールは、極めて便利な検出可能な基である。チオール分析は、例えば、チオール基によるプロ色素（ｐｒｏ−ｄｙｅ）５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸；ＤＴＮＢ、Ｅｌｌｍａｎ試薬としても知られる［Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．，１９５９，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８２，７０−７７］）の還元に基づく分光光度的な方法を用いて行われることができる。この反応は着色種を生成し、その種は以下で記述されかつさらに以下の実施例の節において例示されるように、４１２ｎｍの波長で検出されることができる。
【００９５】
上記で検討されたように、チオール基は、本実施形態において利用される基質においてラクトンの一部を形成することができる。したがって、基質中の１つ以上のラクトン部分はラクトン環中に硫黄原子を有してもよく、その硫黄原子は酵素加水分解時にチオールを生成する。下記のスキーム１で示されるように、チオールは上記のように、ＤＴＮＢとのその典型的な反応によって検出されることができる。
【００９６】
任意選択的に、チオール含有基は、基質中のラクトン部分に結合されることができる。このようなチオール含有基質は、チオールを含有する検出可能な部分が酵素反応時に放出されるように設計される。この点で分類されるチオールを含む好ましい検出可能な部分は、チオアルコキシ基である。チオアルコキシ基は下記のスキームＩＩに示されるように、酵素反応時にチオアルキルが生成されるようにラクトンに結合されることができる。
【００９７】
さらに本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ラクトナーゼ活性分析において有効なＰＯＮ基質として役立ちうる一連の新規なラクトン含有化合物を設計し、首尾良く調製し、そして使用した。
【００９８】
このようなラクトン含有化合物は、１つ以上のラクトン環を含み、ラクトン環は、その分解時に１つ以上の分光光度的に検出可能なチオール含有部分を形成することができ、そして以下の一般式Ｉによって集合的に表される。
式中、ＸおよびＹはそれぞれ酸素または硫黄原子であり、Ｚは炭素または硫黄原子であり、ＹおよびＺの少なくとも１つは硫黄であり、ｎは２〜４の整数であり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を通して結合される）またはヘテロ脂環式（環炭素を通して結合される）、アルコキシなどである。
【００９９】
したがって、新規なラクトンは、ｎが２であるとき５員のラクトンであり、ｎが３であるとき６員のラクトンであり、またはｎが４であるとき７員のラクトンである。好ましくはｎは２であり、５員のラクトンを形成する。
【０１００】
１つの好ましい実施形態において、ＸおよびＹはともに酸素原子であり、Ｚは硫黄原子である。好ましくは、Ｒ１は２〜１２個の炭素原子を有するアルキル基である。
【０１０１】
このようなラクトンは典型的には、ＰＯＮによるラクトナーゼによって行われる酵素加水分解を受け、その後、加水分解において形成される、１つの原子に同じ種類の原子が２つ結合したチオアルコキシ／チオヒドロキシ−ヒドロキシ部分の早い自然分解の結果としてチオールを放出する。上記のスキームＩＩに示されるように、生じたチオールは、上に記述されかつ以下の実施例の節で例示されるように、ＤＴＮＢでの典型的反応によって検出されることができる。
【０１０２】
別の好ましい実施形態において、Ｘは酸素であり、Ｙは硫黄であり、その結果、化合物はチオラクトンである。この実施形態において、Ｚは炭素または硫黄のいずれか、好ましくは炭素であることができ、そしてＲ１は水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を通して結合される）、またはヘテロ脂環式（環炭素を通して結合される）、アルコキシなどであることができ、好ましくは２〜１２個の炭素原子を有するアルキルである。このようなチオラクトンは、後に検出されることができるチオール基を生成する、ＰＯＮによるラクトナーゼによって行われる酵素加水分解を受けることができる。
【０１０３】
ＰＯＮ分析における５位で結合されたアルキル基またはチオアルコキシ基を有する５員のラクトンの使用は、これらの化合物が長いアルキル側鎖を有する５員環のオキソ−ラクトンを含むＰＯＮ１の好ましい基質とほぼ同一であるので、極めて有利である［２、４、６］。
【０１０４】
酵素反応において生成されるチオール含有部分（例えば、チオアルキル）は、上記で検討されたように、例えば燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析、およびイルミネセンス分析において分光光度的に検出可能な部分として役立つことができ、それらは典型的には酵素活性の検出および定量化のための比較的単純かつ迅速な技術である。
【０１０５】
下記で実証および例示されるように、本発明者は、５位で５員環のラクトンに結合される分光光度的に検出可能なチオアルコキシ部分を有する一連のラクトン基質を使用している。下記の実施例の節において示されるように、５−エチルスルファニル−ジヒドロ−フラン−２−オン、５−ブチルスルファニル−ジヒドロ−フラン−２−オン、および５−ヘキシルスルファニル−ジヒドロ−フラン−２−オンのラクトンが調製された。下記の表１に示されるこれらのラクトンは、ラクトンで観察されるｋｃａｔ／ＫＭ値に匹敵しかつ酵素基質について許容可能な値であると考えられる、１．５×１０５〜４．４５×１０５の範囲のｋｃａｔ／ＫＭ値を示した。
【０１０６】
酵素活性のｋｃａｔ／ＫＭ値は、基質特異性の強さを与える。それは同じ酵素に対する異なる基質の特異性を比較すること、または同じ基質を変換する異なる酵素の触媒速度の比較を可能にする。この速度は二次の速度定数の単位を有し、そしてｌ／（濃度×時間）として表される。ある酵素で１０８Ｍ−１秒−１以上の値が観察されたが、１０４〜１０６Ｍ−１秒−１の範囲のｋｃａｔ／ＫＭ比率を有する基質が良好な基質、すなわち酵素分析において妥当な親和性、特異性、および迅速なターンオーバーを示すと考えられる。
【０１０７】
上記の新規なラクトンのような、酵素反応時に検出可能な部分を形成しかつ生理学的なラクトナーゼ基質に構造的に類似するラクトンは、サンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定するために利用されることができる。
【０１０８】
したがって、本発明の別の側面によれば、サンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定する方法が提供される。本発明のこの側面によれば、その方法は、
（ａ）サンプルを、上記で定義されるような１つ以上のラクトンを含み、かつ、１つ以上のラクトンの加水分解時に上記で定義されるような１つ以上の分光光度的に検出可能な部分を形成することができる化合物と接触させること、ただし、検出可能な部分は化合物がラクトナーゼの基質と実質的に同じ構造を有するように選択される；および
（ｂ）分光光度的に検出可能な部分のレベルを分光光度的に測定し、それによってサンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定すること
によって行われる。
【０１０９】
本明細書において使用される表現「ラクトナーゼの基質と実質的に同じ構造を有する」は、天然基質の構造とほぼ同一であり、１個または２個の原子の置換、側鎖の伸長などの比較的小さな化学的および／または構造的特徴によって天然基質と異なる合成基質の化学構造を示す。
【０１１０】
上記で示されるラクトナーゼ活性分析の特定の場合におけるように、いかなるラクトナーゼ活性の分析も、上記で検討されたような燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析、およびイルミネセンス分析のような分光光度分析技術を使用することが好ましい。なぜなら、これらの分析は通常、分光光度的に検出可能な部分および他の化学部分の濃度の微細な変化を決定するために、広く入手可能な機械および測定装置を必要とするからである。
【０１１１】
いかなるラクトナーゼ活性のレベルを測定することも、上記で検討されるＰＯＮラクトナーゼ活性分析の例において記述されるように、ラクトン環の一部を形成することまたは置換基としてラクトンに結合されることのいずれかによってラクトンに結合される検出可能な部分の濃度レベルを追跡することによって行われる。
【０１１２】
本明細書において検討されるＰＯＮラクトナーゼ活性分析の例におけるように、検出可能な部分は好ましくは１つ以上のチオール基を含む。
【０１１３】
ラクトナーゼ活性を決定するための上記の薬剤が、例えば被験者におけるＰＯＮ酵素のような、ラクトナーゼの異常なレベルまたは活性に関連する障害または状態の素因を決定するためのまたは障害または状態を診断するためのキット中に含まれてもよいことは注意されるべきである。
【０１１４】
本明細書において使用される用語「被験者（被験体）」または「個体」は、被験者（例えば、哺乳動物）を示し、好ましくはＰＯＮ酵素の異常なレベルまたは活性に関連する障害に罹患していると疑われるかまたは罹患の危険性のあるヒト被験者を示す。
【０１１５】
本明細書において使用される用語「診断する」は、疾患、状態または症状を分類すること、疾患、状態、または症状の重篤度を決定すること、疾患の進行を監視すること、疾患の結果および／または回復の見通しを予測することを示す。
【０１１６】
本明細書において使用される表現「ＰＯＮ酵素の異常なレベル（健康な被験者から得られたコントロールサンプルに比べて高いレベルまたは低いレベル）または活性に関連する障害または状態」は、ＰＯＮ（例えば、ＰＯＮ１）活性が変化した種々の病理学的および生理学的状態および疾患を示す（例えば、Ｃｏｓｔａら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６９：５４１−５５０およびその参考文献を参照のこと）。例えば、血清ＰＯＮ１活性は、インスリン依存性（Ｉ型）および非インスリン依存性（ＩＩ型）糖尿病、アルツハイマー病（Ｄａｎｔｏｉｎｅら、２００２ パラオキソナーゼ１活性：痴呆の新しい脈管マーカーか？ Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２００２ １１月；９７７：９６−１９１）、ならびに動脈硬化を含む種々の心臓疾患において低いことが示されている（Ｃｏｓｔａら（２００５）；Ｍａｃｋｎｅｓｓら（２００４） 心臓血管疾患におけるパラオキソナーゼ１活性の役割：治療的介入の可能性 Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｒｕｇｓ．２００４；４（４）：２１１−７；Ｄｕｒｒｉｎｇｔｏｎら（２００１） パラオキソナーゼおよび動脈硬化 Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２００１ ２１（４）：４７３−８０）。減少したＰＯＮ活性はまた、慢性の腎不全、慢性関節リウマチ、または魚眼病（深刻な角膜の混濁によって特徴付けられる）を有する患者においても見出されている。甲状腺亢進はまた、低い血清ＰＯＮ活性、肝臓疾患、アルツハイマー病、および血管性痴呆に関連する。低いＰＯＮ活性はまた、感染性疾患においても観察される（例えば、急性期応答の間）。異常に低いＰＯＮレベルはまた、環境化学物質（例えば、コバルト、カドミウム、ニッケル、亜鉛、銅、バリウム、ランタン、水銀のような金属；ジクロロ酢酸、四塩化炭素）、薬物（例えば、コリン作用性ムスカリン様アンタゴニスト、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アルコール）のような種々の外因性化合物への曝露に関連する。述べたように、減少したＰＯＮレベルはまた、妊娠および老年期のような種々の生理学的状態の特徴でもあり、一般的な健康状態の被験者の指標になりうる。例えば、喫煙者は低い血清ＰＯＮ１活性を示し、身体運動は喫煙者のＰＯＮ１レベルを回復させることが知られている。
【０１１７】
したがって、本発明の薬剤（例えば、上記のようなラクトナーゼ基質）は、反応緩衝液、保存緩衝液、およびサンプル希釈緩衝液をさらに含むことができる診断用キット中に含まれることができる。好ましくは、キットは印刷物をさらに含み、例えば印刷物は診断用キットの使用説明書を含む。
【０１１８】
上で述べたように、生物学的に活性なＰＯＮのレベルを決定する能力は、個体のＰＯＮ状態を決定することを容易にすることができる。
【０１１９】
本明細書において使用される表現「ＰＯＮ状態」は、ＰＯＮ活性（すなわち、ラクトナーゼ活性）およびＰＯＮ遺伝子型を示す。
【０１２０】
ＰＯＮ１多型と疾患との関連を調査する大半の研究は、ヌクレオチド多型のみを試験し、そのヌクレオチド多型について遺伝子のコード領域（例えば、Ｑ１９２Ｒ、Ｌ５５Ｍ、Ｃ−１０８Ｔ）、イントロン、および制御領域における多型を含む１６０以上の多型が記載されている。しかしながら、すべての知られているＰＯＮ１（または他の）多型を遺伝子型決定するときでさえ、この分析がＰＯＮ活性のレベルも多型の状態（すなわち、どの多型が個体の２つの染色体のそれぞれにあるのか）も与えなかったことが明らかになっている。したがって、機能的なゲノム分析は、より多くの有益なアプローチを提供するだろう。
【０１２１】
したがって、本発明の別の側面によれば、個体のＰＯＮ状態を決定する方法が提供される。
【０１２２】
本発明のこの側面の方法は、被験者のＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性レベルを決定すること（ただし前記ラクトナーゼ活性は被験者における生物学的に活性なＰＯＮの指標である）；および、被験者のＰＯＮ酵素を遺伝子型決定し、それによって被験者のＰＯＮ状態を決定することによって行われる。
【０１２３】
ＰＯＮ酵素の遺伝子型決定は、当該分野で周知の分子生物学的方法または生化学的方法を使用して、核酸レベルまたはタンパク質レベル（多型が翻訳されたタンパク質に影響を及ぼす場合）で行われることができる。
【０１２４】
ＰＯＮの多型形態は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、少なくとも１つのヌクレオチドの微小欠失および／または微小挿入、短い欠失および挿入、複数のヌクレオチド変化、短いタンデムリピート（ＳＴＲ）、および可変数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）の結果であることができる。
【０１２５】
多型データを得るために、被験者のＰＯＮ酵素を含む生物学的サンプル（例えば、血清サンプル、尿サンプル、滑液サンプル、生検（例えば、肝臓生検））は、ＤＮＡ多型、ＲＮＡ多型、および／またはタンパク質多型の対立遺伝子決定に供される。
【０１２６】
以下は、本発明に従って使用されることができる多型（例えば、ＳＮＰ）検出方法の非限定的な列挙である。
【０１２７】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）：この方法において、プライマー伸長または連鎖反応事象がマッチまたはミスマッチの指標として使用されることができるように、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が多型ヌクレオチド付近にハイブリダイズするように設計される。放射能標識された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）でのハイブリダイゼーションはまた、特異的ＳＮＰの検出に適用されている（Ｃｏｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０：２７８−２８２、１９８３）。方法は、一つのヌクレオチドだけ異なる短いＤＮＡ断片の融点の差異に基づく。厳密なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、変異体対立遺伝子と野生型対立遺伝子の間で差異を生じさせることができる。
【０１２８】
ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭ分析（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，米国）：この技術は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼの各酵素ならびにアデノシン５’ホスホスルファート（ＡＰＳ）およびルシフェリン基質の存在下での一本鎖のＰＣＲ増幅されたＤＮＡテンプレートに対する配列決定用プライマーのハイブリダイゼーションに基づく。次の工程において、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）のうちの最初のものが反応に加えられ、そのデオキシヌクレオチド三リン酸がテンプレート鎖において塩基に対して相補的であるならば、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖内へのそのデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みを触媒する。それぞれの取り込み事象は、取り込まれたヌクレオチドの量に対して等モル量でのピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を伴う。最後の工程において、ＡＴＰスルフリラーゼはアデノシン５’ホスホスルファートの存在下でＰＰｉをＡＴＰに定量的に変換する。このＡＴＰは、ＡＴＰの量に比例する量で可視光を生じさせるオキシルシフェリンへのルシフェリンのルシフェラーゼ媒介の変換を行わせる。ルシフェラーゼにより触媒される反応において生じた光は電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、ｐｙｒｏｇｒａｍＴＭにおけるピークとして見られる。それぞれの光シグナルが、取り込まれたヌクレオチドの数に比例している。
【０１２９】
ＡｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅＴＭ分析（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、米国）：この技術は、蛍光分極化（ＦＰ）検出に基づく。目的のＳＮＰを含有する配列のＰＣＲ増幅後、過剰なプライマーおよびｄＮＴＰはエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩでのインキュベーションにより除かれる。これらの酵素が熱により不活化されると、Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ−ＦＰプロセスは、熱安定ポリメラーゼを使用して、２つの蛍光ターミネーターの一方を、ＳＮＰ部位のすぐ上流で停止するプライマーに添加する。添加されたターミネーターはその増大したＦＰによって同定され、元のＤＮＡサンプルに存在する対立遺伝子を表す。Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅプロセスは、ＡｃｙｃｌｏＰｏｌＴＭ（Ａｒｃｈｅｏｎ科から得られる新規な変異型熱安定ポリメラーゼ）、および目的のＳＮＰについての可能性のある対立遺伝子を表す、Ｒ１１０およびＴＡＭＲＡで標識された１対のＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓＴＭを使用する。ＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ非ヌクレオチド類似物は様々なＤＮＡポリメラーゼとともに生物学的に活性である。２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−三リン酸と同様に、非環状類似物は鎖ターミネーターとして機能する。類似物は、ＤＮＡ鎖の３’末端上に塩基特異的な様式でＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ、そして、３’−ヒドロキシルが存在しないので、さらなる鎖伸張において機能することができない。ＡｃｙｃｌｏＰｏｌは、種々のＴａｑ変異体が誘導体化２’，３’−ジデオキシヌクレオチドターミネーターに対して有するよりも、誘導体化されたＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓに対して高い親和性および特異性を有することが見出されている。
【０１３０】
ＳＮＰ検出の分野における進歩は、さらに正確で、容易で、かつ、費用のかからない大規模なＳＮＰ遺伝子型決定技術を提供してきたことが理解される：このような技術は、例えば、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ、Ｈｏｗｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．ら、１９９９、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：８７〜８）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動［ＭＡＤＧＥ、Ｄａｙ，Ｉ．Ｎ．ら、１９９５、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）のために配置されたウエルを備える水平ポリアクリルアミドゲルを使用するハイスループット遺伝子型決定、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９：８３０〜５］、ＴａｑＭａｎシステム（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ら、１９９１、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼの５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を利用することによる特異的ポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８：７２７６〜８０）、ならびに、様々なＤＮＡ「チップ」技術、例えば、米国特許第６３０００６３号（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、２００１）（これは参照として全てが本明細書中に組み込まれる）に開示されるＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップ）、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ら（ＰＣＴ出願番号９２／１５７１２）によって記載されるＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＢＡＴＭ）、ペプチド核酸プローブ（ＰＮＡ、Ｒｅｎ Ｂら、２００４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：ｅ４２）およびロックド核酸プローブ（ＬＮＡ、Ｌａｔｏｒｒａ Ｄら、２００３、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２２：７９〜８５）、分子ビーコン（Ａｂｒａｖａｙａ Ｋら、２００３、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ．４１：４６８〜７４）、インターカレーション色素［Ｇｅｒｍｅｒ，Ｓ．およびＨｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．オリゴヌクレオチドプローブを用いないシングルチューブ遺伝子型決定、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：７２〜７８（１９９９）］、ＦＲＥＴプライマー（Ｓｏｌｉｎａｓ Ａら、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：Ｅ９６）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｂｅａｕｄｅｔ Ｌら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００１、１１（４）：６００〜８）、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ（Ｂｅｌｌ ＰＡら、２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．７０〜２、７４、７６〜７）、多重ミニ配列決定（Ｃｕｒｃｉｏ Ｍら、２００２、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２３：１４６７〜７２）、ＳｎａＰｓｈｏｔ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄら、２００２、Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ、６３：５０８〜１３）、ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（Ｃａｓｈｍａｎ ＪＲら、２００１、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ．２９：１６２９〜３７）、ＧＯＯＤ分析（Ｓａｕｅｒ ＳおよびＧｕｔ ＩＧ、２００３、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１７：１２６５〜７２）、マイクロアレイミニ配列決定（Ｌｉｌｊｅｄａｈｌ Ｕら、２００３、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３：７〜１７）、アレイ型プライマー伸張（ＡＰＥＸ）（Ｔｏｎｉｓｓｏｎ Ｎら、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．３８：１６５〜７０）、マイクロアレイプライマー伸張（Ｏ’Ｍｅａｒａ Ｄら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ７５）、Ｔａｇアレイ（Ｆａｎ ＪＢら、２０００、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：８５３〜６０）、テンプレート指向取り込み（ＴＤＩ）（Ａｋｕｌａ Ｎら、２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３２：１０７２〜８）、蛍光分極化（Ｈｓｕ ＴＭら、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３１：５６０、５６２、５６４〜８）、比色オリゴヌクレオチドライゲーション分析（ＯＬＡ、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ＤＡら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：８９２３〜７）、配列コード化ＯＬＡ（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ Ｐら、１９９９、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｒｅｅｎ．６：６７〜９）、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応，Ｐａｄｌｏｃｋプローブ、ローリングサークル増幅、Ｉｎｖａｄｅｒ分析（総説、Ｓｈｉ ＭＭ、２００１、ハイスループットな変異検出技術および遺伝子型決定技術による大規模な薬理遺伝学研究を実現する、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．４７：１６４〜７２）、コード化マイクロスフェア（Ｒａｏ ＫＶら、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ６６）およびＭａｓｓＡｒｒａｙ（Ｌｅｕｓｈｎｅｒ Ｊ、Ｃｈｉｕ ＮＨ、２０００、Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．５：３４１〜８０）などである。
【０１３１】
上で言及されたように、細胞の遺伝的プロファイルはまた、細胞トランスクリプトームの分析を介して行われることができる。
【０１３２】
本発明の細胞におけるＲＮＡの発現レベルは、当該分野において公知の方法を用いて決定されることができる。
【０１３３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：この方法は、比較的希なＲＮＡ分子のＰＣＲ増幅を用いる。まず、ＲＮＡ分子は細胞から精製され、逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ−ＲＴ）およびオリゴｄＴ、ランダムヘキサマー、または遺伝子特異的プライマーのようなプライマーを用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと変換される。次いで、遺伝子特異的プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを適用することによって、ＰＣＲ装置においてＰＣＲ増幅反応が実行される。当業者は、特異的なＲＮＡ分子を検出するために適切な遺伝子特異的プライマーの長さおよび配列、ならびにＰＣＲ条件（すなわち、アニーリング温度、サイクル数など）を選択することが可能である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応はＰＣＲサイクル数を調製することおよび増幅生成物を既知のコントロールと比較することによって用いられうることが理解される。
【０１３４】
本発明の培養物の細胞において発現されるタンパク質の発現および／または活性レベルは、当該分野において公知の方法を用いて決定されることができる。
【０１３５】
酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）：この方法は、マイクロタイタープレートのウエルのような表面への、タンパク質基質を含有するサンプル（例えば、固定された細胞またはタンパク質性溶液）の固定を含む。酵素にカップリングされた基質特異的な抗体が適用され、基質に結合させられる。次いで、抗体の存在が、抗体にカップリングされた酵素を用いる比色反応によって検出および定量される。この方法において一般的に用いられる酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。十分に較正され、かつ、応答の直線範囲内にある場合、サンプルに存在する基質の量は、生じた色の量に比例している。基質標準物が、定量精度を改善するために一般に用いられる。
【０１３６】
ウエスタンブロット：この方法は、基質をアクリルアミドゲルによって他のタンパク質から分離し、その後、基質をメンブラン（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）に転写することを含む。次いで、基質の存在が基質に特異的な抗体によって検出され、次いで、抗体が抗体結合試薬によって検出される。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡまたは他の抗体であり得る。抗体結合試薬は、上記のように放射能標識または酵素連結されることができる。検出は、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によって行われることができる。この方法は、基質量の定量と、電気泳動期間中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示すメンブラン上での相対的な位置によるその同一性の決定の両方を可能にする。
【０１３７】
放射免疫分析（ＲＩＡ）：１つの形式において、この方法は、所望のタンパク質（すなわち、基質）を、特異的な抗体と、アガロースビーズのような沈殿可能なキャリア上に固定化される放射能標識された抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５で標識されたプロテインＡ）とで沈殿させることを含む。沈殿ペレットにおけるカウント数が基質の量に比例している。
【０１３８】
ＲＩＡに代わる形式において、標識された基質および非標識の抗体結合タンパク質が使用される。未知量の基質を含有するサンプルが様々な量で加えられる。標識された基質からの沈殿カウントの減少が、添加されたサンプルにおける基質の量に比例する。
【０１３９】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質特異的な抗体による細胞におけるその場での基質の検出を含む。基質特異的な抗体はフルオロフォアに連結される。検出は、細胞が光ビームを通過するときにそれぞれの細胞から放射される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行われる。この方法は、２つ以上の抗体を同時に用いることができる。
【０１４０】
免疫組織化学分析：この方法は、基質特異的な抗体による、固定された細胞におけるその場での基質の検出を含む。基質特異的な抗体は酵素連結されることができるか、またはフルオロフォアに連結されることができる。検出は顕微鏡および主観的または自動的評価によって行われる。酵素連結された抗体が用いられる場合、比色反応が必要とされる場合がある。免疫組織化学の後に、例えばＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅまたはＧｉｅｍｓａ染色を用いる細胞核の対比染色が続くことが多いことが理解される。
【０１４１】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例の実験に基づいて当業者には明らかになるだろう。さらに、本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および側面のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１４２】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１４３】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験手順には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；また利用可能な免疫分析は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９９６）；なお、これらの文献のすべては、あたかも本明細書中に完全に記載されているように組み込まれる。その他の一般的な参考文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当該分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１４４】
実施例１
５−チオアルキル置換ブチロラクトン（ＴＸＢＬ）の合成
４−フェニルチオ−４−ブタノライドの合成方法［１２］が、５−チオエチル、チオブチルおよびチオヘキシルブチロラクトンの合成について使用された（スキーム２）。まず、γ−ブチロラクトン環が、対応するチオールで開かれた［１３］。得られた４−（アルキルチオ）−酪酸が次いで過沃素酸ナトリウムで酸化され、４−（アルキルスルフィニル）−酪酸［１４］を得た。これはＰｕｍｍｅｒｅｒ転位［１２］によって対応するラクトンに対して閉じられた。この経路は、種々の長さの側鎖（以下のスキーム３においてＲによって表される）の５−チオ−ブチロラクトンへの結合を可能にする一般なものであることが見出された。
【０１４５】
材料および実験手順
材料−化学物質はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｆｌｕｋａ、およびＡｃｒｏｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入された。
【０１４６】
５−チオブチルブチロラクトン（ＴＢＢＬ）のために与えられる５−チオアルキル置換ブチロラクトンの典型的な合成：
４−（ブチルチオ）−酪酸。γ−ブチロラクトン（１２．９ｍｍｏｌ、１．１１ｇ）は、ＡｌＢｒ３（２．２当量、２８．３８ｍｍｏｌ、７．５６ｇ）とブタンチオール（約２０ｍｌ）の混合物に液滴状に添加された。得られた混合物は、室温で２時間攪拌され、次いで水（約５０ｍｌ）にゆっくりと注がれた。水性混合物はＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍｌ）で抽出され、有機相はＮａＣｌブラインで洗浄され、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥された。溶媒は蒸発され、生成物は減圧で乾燥された。収率：１．８４ｇ、８０．９％。
【０１４７】
４−（ブチルスルフィニル）−酪酸。０℃で、２１ｍｌ（１０．５ｍｍｏｌ）の過沃素酸ナトリウムの０．５Ｍ溶液に、４−（ブチルチオ）−酪酸（１．８４ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）が添加され、反応物は０℃で一晩攪拌された。沈殿した過沃素酸ナトリウムは濾過によって除去され、濾液は蒸発された。得られた固体はＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍｌ、１５分間抽出）で抽出され、次いで溶媒は蒸発によって除去され、４−（ブチルスルフィニル）−酪酸（１．８８ｇ、９４％）を生成した。
【０１４８】
５−（チオブチル）ブチロラクトン。トルエン中の４−（ブチルスルフィニル）−酪酸（６３０ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）の溶液に、無水酢酸（３当量、１０ｍｍｏｌ、１ｇ）および触媒量のｐ−トルエンスルホン酸が添加された。得られた溶液は数時間還流され、次いで溶媒は乾燥するまで蒸発された。残渣は酢酸エチル：ヘキサン（１：３）中に溶解され、次いでフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル：ヘキサン（１：３））により精製され、５−（チオブチル）ブチロラクトン（１３０ｍｇ、２３．３％）を与えた。
【０１４９】
実施例２
ＴＸＢＬの酵素加水分解の反応速度分析
ＰＯＮ１による３種のＴＸＢＬの酵素加水分解の反応速度パラメータは、ＤＴＮＢで放出されたチオール部分を検出することによって決定された。
【０１５０】
材料および実験手順
材料−ＣＰＭ色素（７−ジエチルアミノ−３−（４’マレイミジル−フェニル）−４−メチルクマリン）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから購入された。反応は、チオレドキシンと６×Ｈｉｓタグとの融合物中で発現され、かつ文献に記載されるように［１９］精製された組換えＰＯＮ１変異体ｒｅＰＯＮ１−Ｇ２Ｅ６で行われた。
【０１５１】
ＤＴＮＢでの反応速度測定−チオアルキル置換ラクトンの酵素加水分解の速度は、１ｍＭ ＣａＣｌ２および５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（活性緩衝液）中で決定された。酵素ストックは、０．１％Ｔｅｒｇｉｔｏｌを含有する活性緩衝液中で保存され、使用された酵素濃度は８．３７５×１０−９Ｍであった。１００〜４００ｍＭの基質のストックがアセトニトリル中で調製され、反応を開始する直前に反応緩衝液で希釈された。５−（チオヘキシル）−ブチロラクトン（ＴＨＢＬ）は、０．０３〜０．２４％の最終濃度で、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤で緩衝液中に溶解された。基質濃度は０．３×ＫＭ〜（２〜３）×ＫＭの範囲で変化された。共溶媒の割合は、全ての反応物において１％で保たれた。ＤＴＮＢ色素（Ｅｌｌｍａｎ試薬、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））は、０．５ｍＭの最終濃度でＤＭＳＯ中の１００ｍＭストックから使用された。ε４１２ｎｍ＝７，０００ＯＤ／Ｍを使用して活性を計算した。生成物の形成は、マイクロタイタープレート読み取り機（ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＨＴＴＭ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ；光学長〜０．５ｃｍ）上で、９６ウエルプレートを用いて２００μｌの反応容量において４１２ｎｍで分光光度的に監視された。初期速度（ｖ０）は各々の基質について８つの異なる濃度で決定された。ｖ０値は酵素の非存在下での自然加水分解のバックグラウンド速度について補正された。反応速度パラメータ（ｋｃａｔ、ＫＭ、ｋｃａｔ／ＫＭ）は、プログラムＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ ５．０を使用して、データをＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ方程式［ｖｏ＝ｋｃａｔ［Ｅ］０［Ｓ］０／（［Ｓ］０＋ＫＭ）］に当てはめることによって得られた。
【０１５２】
ＣＰＭでの反応速度測定−４−（チオブチル）ブチロラクトン（ＴＢＢＬ）の酵素加水分解の速度は、８．３７５×１０−９Ｍ酵素で活性緩衝液において決定された。基質はアセトニトリル中の４００ｍＭストックから使用され、その基質は反応を開始する直前に反応緩衝液で希釈され、ＣＰＭと測定前に加水分解された基質との間の反応を完了させるために、ＣＰＭ色素（７−ジエチルアミノ−３−（４’マレイミジル−フェニル）−４−メチルクマリン）で３分間インキュベートされた。ＣＰＭ色素は５０μＭの最終濃度でＤＭＦ中の５ｍＭストックから使用され、反応混合物はＣＰＭ可溶化のために０．１％のトリトンを含有した。生成物の形成は、マイクロタイタープレート読み取り機（励起−４００ｎｍフィルター、放射−４５０ｎｍおよび５１６ｎｍフィルター、Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅを備えるＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴＴＭ Ｍｕｌｔｉ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ；光学長〜０．５ｃｍ）上で、９６ウエルプレートを用いて、２００μｌの反応容量におけるＣＰＭ蛍光を追跡することによって監視された。
【０１５３】
結果
５−（チオブチル）ブチロラクトン（ＴＢＢＬ）加水分解の典型的な比色分析が図１ａに示され、反応速度パラメータは下記の表１に列挙される。これらの新規な基質に対するｋｃａｔおよびＫＭ値は、相同の５−アルキル−置換ブチロラクトンで観察されたｋｃａｔおよびＫＭ値に類似している（表２、下記）。
【０１５４】
５−チオアルキルラクトンの酵素加水分解の速度はまた、図１ｂに示される蛍光発生チオール検出プローブＣＰＭ［１１］で追跡された。
【０１５５】
実施例３
ヒト血清および生細胞におけるＰＯＮ１活性の測定
上記の発色分析および蛍光発生分析は、ヒト血清サンプルにおけるＰＯＮのラクトナーゼ活性を測定するために使用された。
【０１５６】
材料および実験手順
ＴＢＢＬおよび酢酸フェニルでの血清活性−反応は活性緩衝液において行なわれ、血清は１〜４００の最終希釈度で使用された。ＴＢＢＬの反応混合物は、アセトニトリル中の４００ｍＭストックからの０．５ｍＭ ＴＢＢＬおよびＤＭＳＯ中の１００ｍＭストックからの０．５ｍＭ ＤＴＮＢを含有した。酢酸フェニルの反応混合物は、メタノール中の５００ｍＭストックからの１ｍＭ酢酸フェニルを含有した。全ての反応混合物は、最終１％ ＤＭＳＯを含有した。２−ヒドロキシキノリンは、ＤＭＳＯ中の５００ｍＭストックから使用され、ＥＤＴＡは水中の０．５Ｍストックから使用された。血清は、反応の開始前に５〜１０分間阻害剤とともにインキュベートされた。
【０１５７】
ＦＡＣＳによるＴＢＢＬでのＰＯＮ１活性の検出−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の乳化およびＦＡＣＳ分析は、既に記載される［１６］ように行なわれた。
【０１５８】
結果
ヒト血清におけるＰＯＮ１レベルは、図２ａ〜ｂに示されるように、新たに合成された基質（実施例１〜２を参照のこと）を使用して検出された。測定されたラクトナーゼ活性が血清において存在する他のヒドロラーゼと対照的にＰＯＮ１によって媒介されることを裏付けるために、血清はまた、２−ヒドロキシキノリン（ＰＯＮ１活性の選択的拮抗阻害剤［４］）およびＥＤＴＡ（ＰＯＮ１活性に対して重要なカルシウムをキレート化する）とともに予めインキュベートされた。平行して、ＰＯＮ１活性は、血清におけるＰＯＮ１レベルに対するプローブとして通常使用される酢酸フェニルで決定された。ＴＢＢＬでの活性は、酢酸フェニルでの活性に匹敵し、同様に阻害されていた（下記の表３を参照のこと）。これは、新規なラクトン基質がヒト血清におけるＰＯＮ１レベルを評価するために使用されることができること、およびラクトナーゼおよびアリールエステラーゼ活性の９０％より多くがＰＯＮ１に起因することを明確に実証する。ＥＤＴＡによる高い阻害率（＞９９％）は、金属キレート化剤に敏感なＰＯＮ１以外の血清酵素のためかもしれない。
【０１５９】
ＰＯＮ１活性はまた、酵素活性の生成物とともに細胞を区画に分けるエマルジョン小滴およびＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）を使用して生細胞において検出された［１５，１６］。まず、細胞質において組み換えＰＯＮ１（ｒｅＰＯＮ１）を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞、ならびにＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）は、ラクトン基質（ＴＢＢＬ）および蛍光発生チオール検出色素ＣＰＭとともに油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンの水性小滴において区画に分けられた。次いでｗ／ｏエマルジョンは再乳化され、ＦＡＣＳに適している連続する水相を有するｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンを生成した［１５］。閾値を引き起こすＦＡＣＳはＧＦＰの放射に対して設定され、適切なゲートは単一のＥ．ｃｏｌｉ細胞の放射レベルに対応して選択された［１６］。図３に示されるように、区画に分けられた細胞におけるＰＯＮ１ラクトナーゼ活性の検出は、５３０ｎｍでチオール検出色素の蛍光シグナルを介したものであった。ｒｅＰＯＮ１を担持しない細胞に対して、明らかな差異（平均蛍光において２０倍より大きい）が観察された。
【０１６０】
結論として、上記の結果は、５−チオアルキルラクトンがＰＯＮ１のラクトナーゼ活性を分析するために極めて有用でありかつ敏感なプローブであることを実証する。これらの基質でのＰＯＮ１の速度は、ＰＯＮ１の好ましい基質である脂肪族の５−アルキル置換ラクトンに類似しており、ＰＯＮ１の天然基質によく似ているかもしれない［２］。５−チオアルキルラクトンは、無傷の細胞および血清のような複雑な生物学的サンプルで使用されることができ、その結果、ハイスループット様式でヒト血清におけるＰＯＮ１のレベルを試験する生理学的に関連性を持つ新規な手段を提供する。これらの基質はまた、ＦＡＣＳおよび二重エマルジョンを使用するラクトナーゼ活性に対するスクリーニングの強力な手段を提供し、その手段は定方向進化および機能的ゲノムについて数時間で１０７より多い酵素変異体のライブラリのスクリーニングを可能にする［１６，１７］。最後に、新規な５−チオアルキルラクトンはＰＯＮ１以外の酵素とともに、特に発色／蛍光発生基質が存在しない他のＰＯＮファミリーのメンバーとともに使用されることができる。例えば、ＰＯＮ３のラクトナーゼ活性は、精製された酵素サンプルおよび粗細胞溶解物の両方において、ＴＥＢＬおよびＴＢＢＬで分析されることができた（データ示さず）。他の酵素（例えば、プセウドモナス・ジミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ホスホトリエステラーゼ）のラクトナーゼ活性もまた検出されることができた［１８］。
【０１６１】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１６２】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形全てを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は全て、個々の刊行物、特許または特許願、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１ａ〜１ｂは、ＰＯＮ１のラクトナーゼ活性の比色測定（図１ａ）および蛍光発生測定（図１ｂ）を示すグラフである。
【図２】図２ａ〜２ｂは、ヒト血清におけるＰＯＮ１のラクトナーゼ活性（図２ａ）およびアリールエステラーゼ活性（図２ｂ）を示すグラフである。
【図３】図３は、ＦＡＣＳ分析によって決定された、チオアルキルブチロラクトン基質（ＴＢＢＬ）およびｗ／ｏ／ｗエマルジョンを使用する、ＰＯＮ１発現Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＯＮ１のラクトナーゼ活性を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学的診断、特にＰＯＮ１のような生物学的に活性な血清パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）のレベルを決定するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清パラオキソナーゼ（ＰＯＮ１）は、ＰＯＮと名付けられる大きな酵素ファミリーのうちの最もよく知られているメンバーである。ＰＯＮ１は、エステル、有機リン酸塩（例えば、パラオキソン）およびラクトンのような広範囲の基質を加水分解する、抗アテローム発生特性および解毒特性を備えるＨＤＬ関連酵素である。長い間、ＰＯＮ１はアリールエステラーゼおよびパラオキソナーゼであると考えられ、その活性はそれに基づいて測定された。しかしながら、ＰＯＮ１は本来、種々のラクトンの加水分解［１，２］および形成［３］の両方を触媒するラクトナーゼであることが最近明らかになった。構造−反応性研究［４］および実験室進化実験［５］は、ＰＯＮ１の本来の活性がラクトナーゼであること、およびパラオキソナーゼおよびアリールエステラーゼが不規則な活性であることを示す。ＡｐｏＡ−Ｉを担持するＨＤＬ粒子に結合することによるＰＯＮ１の活性化の研究は、ラクトン基質、特に脂肪親和性のラクトンに対する高い特異性を示す［６］。最後に、ラクトナーゼ活性はＰＯＮファミリーの全てのメンバーによって共有される唯一の活性であり、メンバーのうちのいくつかはパラオキソナーゼ活性もアリールエステラーゼ活性も示さない［２］。
【０００３】
ヒト血清におけるＰＯＮ１の活性は、ＰＯＮ１の多型、その活性を調節する種々の環境的因子、およびアテローム性動脈硬化および他の障害に対する罹病性の間にありうる関連性を扱う多くの研究の対象であった［７］。しかしながら、分析は生理学的な関連性を有さない酢酸フェニルまたはパラオキソンを用いる。より関連性のある分析はラクトナーゼ活性を扱わなければならない。脂肪族のラクトンでラクトナーゼ活性を測定するための現在の方法は、ｐＨ指示薬分析［１，４］およびＨＰＬＣ［２，３］に基づく。ＨＰＬＣは極めて面倒であり、一方ｐＨ指示薬分析は較正の繰り返しを必要とし、しかもｐＨおよび緩衝液強度がきっちりと制御されることができる純粋な酵素サンプルでのみ正確な結果をもたらす。
【０００４】
最近、Ｓｉｃａｒｄと共同研究者ら［９］は、ウンベリフェロンで置換された６員環および７員環のラクトンを用いる蛍光ベースのラクトナーゼ分析を開発した。しかしながら、これらの基質は長いアルキル側鎖を有する５員環のオキソ−ラクトンを含むＰＯＮ１の好適な基質とは有意に異なる［２，４，６］。これらの基質はまた、ＰＯＮ１に対するｐＨ最適条件（８．０〜８．５）で高いバックグラウンド率を示す。
【０００５】
したがって、上記の制限が全くないラクトナーゼ活性のための新規な分析に対する必要性が広く認識されており、それを有することは極めて有利である。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の１つの側面によれば、生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを決定する方法であって、生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することを含む方法が提供される。
【０００７】
本発明の別の側面によれば、被験者におけるＰＯＮ状態を決定する方法であって、（ａ）被験者のＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性レベルを決定すること、ただし、ラクトナーゼ活性は被験者における生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す；および（ｂ）被験者のＰＯＮ酵素を遺伝子型決定し、それによって被験者のＰＯＮ状態を決定することを含む方法が提供される。
【０００８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＰＯＮ酵素はＰＯＮ１、ＰＯＮ２およびＰＯＮ３からなる群から選択される。
【０００９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、生物学的に活性なＰＯＮ酵素は、アポリポタンパク質複合ＰＯＮ酵素を含む。
【００１０】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性の決定は、
（ｉ）クロマトグラフィ分析；
（ｉｉ）ｐＨ指示薬分析；
（ｉｉｉ）分光光度分析；
（ｉｖ）共役酵素分析（ｃｏｕｐｌｅｄ ａｓｓａｙ）；
（ｖ）電気化学的分析；および／または
（ｖｉ）熱量分析
によって行なわれる。
【００１１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分光光度分析は、少なくとも１つのラクトンを含みかつラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる基質の存在下で行なわれる。
【００１２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分光光度分析は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析（ｉｌｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ）からなる群から選択される。
【００１３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンに結合される。
【００１４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンの一部を形成する。
【００１５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分は少なくとも１つのチオールを含む。
【００１６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、基質はラクトンに結合されているチオアルコキシ基を含む。
【００１７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む。
【００１８】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出は発色分析または蛍光発生分析によって行われる。
【００１９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、基質はラクトンのヘテロ原子に隣接する炭素に結合されたチオアルコキシ基を有する、５員、６員または７員のラクトンを含む。
【００２０】
本発明のさらに別の側面によれば、サンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定する方法であって、（ａ）サンプルを、少なくとも１つのラクトンを含みかつラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる化合物と接触させること、ただし、検出可能な部分は化合物がラクトナーゼの基質と実質的に同じ構造を有するように選択される；および（ｂ）部分のレベルを分光光度的に決定し、それによってサンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定することを含む方法が提供される。
【００２１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、部分のレベルの決定は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析からなる群から選択される。
【００２２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンに結合される。
【００２３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンの一部を形成する。
【００２４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分は少なくとも１つのチオールを含む。
【００２５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、基質はラクトンに結合されているチオアルコキシ基を含む。
【００２６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む。
【００２７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出は発色分析によって行われる。
【００２８】
本発明のさらに別の側面によれば、被験者におけるＰＯＮ酵素の異常なレベルまたは異常な活性に関連する障害の素因を決定するかまたは障害を診断するためのキットであって、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することができる少なくとも１つの薬剤を含むキットが提供される。
【００２９】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つのラクトンを含みかつラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる化合物である。
【００３０】
本発明のさらなる側面によれば、少なくとも１つのラクトンを含みかつラクトンの分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能なチオール含有部分を形成することができる化合物が提供される。
【００３１】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、チオール含有部分は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析からなる群から選択される分光光度分析によって検出可能である。
【００３２】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンに結合される。
【００３３】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はラクトンの一部を形成する。
【００３４】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、検出可能な部分はチオアルコキシ基を含む。
【００３５】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む。
【００３６】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ラクトンは、５員、６員または７員のラクトンである。
【００３７】
記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ラクトンは５員のラクトンである。
【００３８】
本発明は、生物学的に活性な血清パラオキソナーゼのレベルを決定するための方法および組成物を提供することによって、現在知られている構成の欠点に対処することに成功している。
【００３９】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００４０】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１ａ〜１ｂは、ＰＯＮ１のラクトナーゼ活性の比色測定（図１ａ）および蛍光発生測定（図１ｂ）を示すグラフである。図１ａ−ＰＯＮ１の存在下（８．３７５×１０−９Ｍ；黒四角）または非存在下（白丸）の、４１２ｎｍでの吸光度によって監視された、０．５ｍＭ ＤＴＮＢでの０．２ｍＭ ＴＢＢＬのグラフ。図１ｂ−ＰＯＮ１の存在下（８．３７５×１０−９Ｍ；黒四角）または非存在下（白丸）の、４００ｎｍでの励起および５１６ｎｍでの放射によって検出された、５０μＭ ＣＰＭでの０．２５ｍＭ ＴＢＢＬのグラフ。
図２ａ〜２ｂは、ヒト血清におけるＰＯＮ１のラクトナーゼ活性（図２ａ）およびアリールエステラーゼ活性（図２ｂ）を示すグラフである。血清はＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で１：４００に希釈され、反応物は、図２ａ−０．５ｍＭ ＴＢＢＬおよび０．５ｍＭ ＤＴＮＢ；図２ｂ−１．０ｍＭ 酢酸フェニルを含んでいた。インヒビター無し（黒四角）、１００μＭ ２−ヒドロキシキノリン（白丸）、または５ｍＭ ＥＤＴＡ（黒三角）で観察された速度および血清無しのバックグラウンド加水分解（白四角）の速度が示される。ＴＢＢＬの加水分解は、ＤＴＮＢで検出され、４１２ｎｍでの吸光度によって監視される（図２ａ）。酢酸フェニルの加水分解は、２７０ｎｍでの吸光度で直接的に監視される（図２ｂ）。
図３は、ＦＡＣＳ分析によって決定された、チオアルキルブチロラクトン基質（ＴＢＢＬ）およびｗ／ｏ／ｗエマルジョンを使用する、ＰＯＮ１発現Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＯＮ１のラクトナーゼ活性を示すグラフである。細胞質中にｒｅＰＯＮ１を発現する細胞はＴＢＢＬおよびチオール検出色素ＣＰＭとともに乳化された。ＧＦＰおよびＰＯＮ１を発現する単細胞（白色）およびＧＦＰのみでのコントロール細胞（灰色）についての５３０ｎｍでの蛍光放射（チオール−ＣＰＭ付加物）の代表的ヒストグラムが示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、生物学的に活性なラクトナーゼ、特に血清パラオキソナーゼのレベルを決定するための方法および組成物、その合成基質の新規なファミリーおよびそれを調製する方法の発明である。
【００４２】
本発明の原理および作用は、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００４３】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行されることができる。また、本明細書において用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００４４】
パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）は、ＰＯＮ２およびＰＯＮ３も含むタンパク質ファミリーのメンバーである。ＰＯＮ１は、エステル、有機リン酸塩（例えば、パラオキソン）およびラクトンのような広範囲の基質を加水分解する、抗アテローム発生特性および解毒特性を備えるＨＤＬ関連酵素である。長い間、ＰＯＮ１はアリールエステラーゼおよびパラオキソナーゼであると考えられ、その活性はそれに基づいて測定された。しかしながら、ＰＯＮ１は本来、種々のラクトンの加水分解および形成の両方を触媒するラクトナーゼであることが最近明らかになった。構造−反応性研究および実験室進化実験は、ＰＯＮ１の本来の活性がラクトナーゼであること、およびパラオキソナーゼおよびアリールエステラーゼが不規則な活性であることを示す。
【００４５】
現在の慣習は、生理学的毒素または生体異物毒素（すなわち、身体または生体に対して異質な化学化合物）に対してＰＯＮ１によって提供される保護の程度を決定するのは、ＰＯＮ１が毒性の有機リン酸塩を分解し、酸化脂質を代謝する触媒効率であることを示唆する。さらに、ＰＯＮ１のより高い濃度は、より良好な保護を提供する。
【００４６】
したがって、適切な危険性評価のためにはＰＯＮレベルおよび活性を知ることが重要である。
【００４７】
上記で言及したように、ＰＯＮのラクトナーゼ活性は最近発見されたとはいえ、ＰＯＮの生物学的活性を正確に評価するためのＰＯＮラクトナーゼ活性の分析は提案されてこなかった。
【００４８】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ＰＯＮのラクトナーゼ活性を決定することが個体における生物学的に活性なＰＯＮのレベルを決定するために使用されうることを発見した。これらの知見は、アテローム性動脈硬化のような、ＰＯＮの低下した活性またはレベルに関連する多くの状態に対する正確な危険性評価を容易にすることができる。
【００４９】
したがって、本発明の１つの側面によれば、生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを決定する方法が提供される。
【００５０】
本明細書において使用される表現「ＰＯＮ酵素」は、ヒトＰＯＮ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００４３７．３）、ヒトＰＯＮ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００２９６．１）、およびヒトＰＯＮ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００９３１．１）のようなパラオキソナーゼ酵素（例えば、哺乳動物パラオキソナーゼ）を示す。
【００５１】
本明細書において使用される表現「生物学的に活性なＰＯＮ酵素」は、例えば酸化脂質の加水分解のような生物学的な（例えば、生理学的な）事象に関わるＰＯＮ酵素の部分を示す。
【００５２】
例えば、生物学的に活性なＰＯＮ酵素は、ＨＤＬ−ａｐｏＡ−Ｉのような種々のアポリポタンパク質粒子に関連するＰＯＮ酵素の部分を示すことができる。ａｐｏＡ−Ｉと関連するＰＯＮ酵素がａｐｏＡ−ＩＶおよびａｐｏＡ−ＩＩと比較してより高いＰＯＮラクトナーゼ活性を刺激することができることが最近確立されてきた（ＧａｕｄｕｋｏｖおよびＴａｗｆｉｋ（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（印刷中）を参照のこと）。
【００５３】
好ましくは、本発明のＰＯＮ酵素は、以下にさらに記載されるように、動物被験体（例えば、ヒト）に由来する生物学的サンプル中に存在する。
【００５４】
本発明のこの側面の方法は、生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することによって行われる。
【００５５】
本明細書において使用される表現「ラクトナーゼ活性」は、ラクトン加水分解活性を示し、それは典型的には、本発明のこの側面に従ってラクトンのエステル結合の加水分解を示す。
【００５６】
酵素のラクトナーゼ活性を決定する方法は、当該分野において周知である。これらの方法は典型的には、例えば、クロマトグラフィ分析（例えば、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ、ＧＣ、ＣＰＥ）、ｐＨ指示薬分析、共役酵素分析（すなわち、これらの分析において、分析される酵素以外の酵素が測定可能な生成物を産出するために加えられる；例えば、カルボン酸生成物はデヒドロゲナーゼによってターンオーバーされ、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨの濃度の変化が吸光度または蛍光によって監視される）、熱量分析（すなわち、熱量の変化を監視すること）、電気化学的分析（すなわち、レドックス電位の変化を監視すること）、および／または分光光度分析のような公知の生化学的分析によって行われる。
【００５７】
典型的な酵素分析は、試験される酵素が特異的に触媒する化学反応に基づく。化学反応は典型的には、基質またはその類似物の生成物への変換である。基質または生成物のいずれかのレベル、すなわち濃度の微細な変化を検出する能力は、定性的および定量的に酵素の活性を決定することを可能にし、試験される酵素に対する特定の基質の特異性を定量的に決定しさえする。基質および／または生成物のレベルの微細な変化を測定するために、これらの化合物は、ｐＨ、分子量、色または他の直接的もしくは間接的に測定可能な化学的および／または物理的性質の変化のような化学的または物理的に検出されることができる化学的および／または物理的性質を有するべきである。
【００５８】
以下は、本発明のこの側面に従って使用されうる例示的なラクトナーゼ分析の説明である。
【００５９】
ｐＨ指示薬分析−ｐＨ指示薬に基づく酵素の分析は、典型的には脂肪族のラクトンでラクトナーゼ活性を測定するために使用される。ｐＨ指示薬分析は、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（登録商標）ＰＬＵＳマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、Ｂｉｌｌｅｃｋｅら（２０００）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８：１３３５−１３４２に記載されるような連続的なｐＨ感受性比色分析（すなわち、ｐＨ指示薬によって生成される色の強度を測定すること）を使用して達成されてもよい。２ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００４％（ｗ／ｖ）フェノールレッド、および希釈／非希釈ＰＯＮ含有サンプル（例えば、１００〜１０００倍に希釈された血清サンプル）を含有する反応（２００μｌ最終容量）は、メタノール中の１００ｍＭ基質溶液２μｌで開始され、３７℃で３〜１０分間実行される。速度は、既知量のＨＣＬを使用して生成された標準曲線から予測される速度因子（ｍＯＤ／μｍｏｌ Ｈ＋）を使用して、４７５ｎｍ（等吸収点）で補正しながら５５８ｎｍでの吸光度減少の勾配から計算される。ラクトンの自発性の加水分解および大気中のＣＯ２による酸性化は好ましくは、酵素の代わりに同じ容量の保存緩衝液での平行反応を実行することによって補正される。
【００６０】
あるいは、カルボン酸形成から生じるプロトン放出は、ｐＨ指示薬クレゾールパープルを用いて監視されることができる。反応は、１ｍＭ ＣａＣｌ２および０．２Ｍ ＮａＣｌを含有するＢｉｃｉｎｅ緩衝液２．５ｍＭにおいて、ｐＨ８．０〜８．３で行われる。反応混合物は、０．２〜０．３ｍＭのクレゾールレッド（ＤＭＳＯ中の６０ｍＭストックから）を含有する。基質と酵素サンプルとの混合時に、５７７ｎｍでの吸光度の減少がマイクロタイタープレートリーダーにおいて監視される。分析は、速度因子（−ＯＤ／Ｈ＋のモル）を与える酢酸でのその場での較正（標準酸滴定曲線）を必要とする。
【００６１】
ＨＰＬＣ分析−種々のラクトン基質の加水分解は、ＨＰＬＣ分析によって検出されることができる。したがって、例えば、アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）の加水分解は、ＨＰＬＣ（例えば、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ−１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒子）を使用して１９７ｎｍで設定されたＷａｔｅｒｓ ２９９６フォトダイオードアレイ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ２６９５システム）によって分析されることができる。酵素反応は、５０μｌ容量の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、２５μＭ ＡＨＬ（例えば、メタノール中の２ｍＭストック溶液から）、および希釈／非希釈ＰＯＮ含有サンプル（例えば、１００〜１０００倍に希釈された血清サンプル）において室温で実行される。反応は５０μｌアセトニトリル（ＡＣＮ）で停止され、タンパク質を除去するために遠心分離される。上清（４０μｌ）はＨＰＬＣシステムに充填され、８５％ ＣＡＮ／０．２％酢酸（テトラデカ−ホモセリンラクトン）、０．７５％ ＣＡＮ／０．２％酢酸（ドデカ−ホモセリンラクトン）、５０％ ＣＡＮ／０．２％酢酸（ヘプタ−ホモセリンラクトン）、または２０％ ＣＡＮ／０．２％酢酸（３−オキソ−ヘキサノイルホモセリンラクトン）でアイソクラチック溶出される。
【００６２】
スタチンラクトン（メバスタチン、ロバスタチン、およびシンバスタチン）の加水分解は、例えば、Ｍｏｄｅｌ １２６ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ、２３８ｎｍで設定されたＭｏｄｅｌ １６８ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、２０μｌループのＭｏｄｅｌ ７１２５ Ｒｈｅｏｄｙｎｅ 手動注入弁、およびＢｅｃｋｍａｎ ＯＤＳ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅカラム（Ｃ １８、２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を備えるＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ＨＰＬＣを用いることによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析されることができる。ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ）およびシンバスタチンは、Ｍｅｒｃｋから２０ｍｇ錠剤として購入でき、ラクトンはそれらの錠剤からクロロホルムで抽出され、乾燥するまで蒸発され、メタノール中に再溶解される。メバスタチンはＳｉｇｍａから購入できる。
【００６３】
１ｍｌの最終容量において、１０〜２００μｌの酵素溶液およびメタノール中の基質溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）１０μｌは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＣａＣｌ２中で２５℃でインキュベートされる。アリコート（１００μｌ）は特定の時点で除去され、アセトニトリル（１００μｌ）に添加され、ボルテックスされ、そして１分間最大速度で遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）される。上清は新しい試験管中に注がれ、蓋をされ、そしてＨＰＬＣ分析まで氷上で保存される。
【００６４】
サンプルは、移動相Ａ＝酢酸／アセトニトリル／水（２：２４９：２４９、ｖ／ｖ／ｖ）および移動相Ｂ＝アセトニトリルからなる移動相を用いてメバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチンのそれぞれについて５０／５０、４５／５５および４０／６０のＡ／Ｂ比率で１．０ｍｌ／分の流速でアイソクラチック溶出される。
【００６５】
分光光度分析−分光光度分析において、基質の消費および／または生成物の形成は、酵素触媒時に形成される分光光度的に検出可能な部分の濃度に起こる変化を追跡することによって測定されることができる。分光光度分析の例としては、限定されないが、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析が挙げられる。
【００６６】
燐光分析は、放射エネルギーまたは他のタイプのエネルギーの吸収後に分光光度的に検出可能な部分によって生成されるルミネセンスの変化を監視する。燐光は、燐光をもたらす放射が終わった後も持続する点で蛍光と区別される。
【００６７】
蛍光分析は、光もしくは他の形態の電磁放射または他の手段による刺激または励起下で、分光光度的に検出可能な部分によって生成されるルミネセンスの変化を監視する。光は刺激が持続している間のみ発せられる。この現象の点で蛍光は、他の放射による励起が終わった後にも光が発せられ続ける燐光と異なる。
【００６８】
発色分析は、特徴的な波長を有する分光光度的に検出可能な部分によって生成される分析媒体の色の変化を監視する。
【００６９】
ルミネセンス分析は、化学ルミネセンスによって生成されるルミネセンス、したがって酵素反応時に生成または消費される分光光度的に検出可能な部分によって生成されるルミネセンスの変化を監視する。ルミネセンスは、より高いエネルギー状態からより低いエネルギー状態への物質内の電子の移動によって引き起こされる。
【００７０】
本発明の文脈において使用される表現「分光光度的に検出可能な」は、紫外線〜赤外線の範囲の波長を有する測定可能な電磁放射の挙動に関係する物理的現象を記述する。定量的に測定されることができる分光光度的に検出可能な特性の非限定的な例は、化学化合物の色、照度、および赤外線および／またはＵＶに特異的な特性である。
【００７１】
したがって、表現「分光光度的に検出可能な部分」は、酵素分析時に形成され、かつ上記で定義されるような１つ以上の分光光度的に検出可能な特性によって特徴付けられる部分を記述する。したがって、酵素活性と相関するこのような部分の濃度は、酵素反応分析時に定量的に決定されることができる。
【００７２】
上記で言及されたように、ラクトンはＰＯＮ酵素の天然基質である。したがって、上で述べられた分析の各々において、基質は好ましくは１つ以上のラクトン部分を含む。
【００７３】
当該分野において周知であるように、用語「ラクトン」は、典型的にはアルコールとカルボン酸エステルの間の分子間反応の縮合生成物である環状エステルのような環状カルボン酸部分を記述する。この縮合生成物はしばしば当該分野において「オキソ−ラクトン」として示される。用語「ラクトン」はまた、典型的には、環状チオカルボン酸部分を示し、したがって、チオール基とカルボン酸、アルコールとチオカルボン酸、およびチオール基とチオカルボン酸の間の分子間反応の縮合生成物も含む。このようなラクトンはしばしば当該分野において「チオラクトン」として集合的に示される。
【００７４】
当該分野においてさらに周知であるように、ラクトン環のサイズは典型的には４〜８個の原子の範囲である。環張力および他の熱力学的考察により、一般的なラクトンの環サイズは５〜７個の原子の範囲である。このようなラクトンは、ＰＯＮ酵素の好ましい基質としても知られている。
【００７５】
一般的に使用される接頭辞はラクトンの環サイズを示すために使用されることができる：βラクトンは４員環のラクトンを記述し、γラクトンは５員環のラクトンを記述し、そしてδラクトンは６員環のラクトンを記述する。
【００７６】
したがって、本明細書において使用される用語「ラクトン」は、ラクトン環中に４〜８個の原子、好ましくは５〜７個の原子を有する、上記のようなオキソ−ラクトンおよびチオラクトンを包含する。ラクトン部分は置換されていても置換されていなくてもよい。置換されている場合、ラクトン環中の１つ以上の炭素原子は、限定されないが、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を通して結合される）、またはヘテロ脂環式（環炭素を通して結合される）、アルコキシ、チオアルコキシ（これらの用語は以下に定義される）などのような１つ以上の置換基によって置換されることができる。
【００７７】
本明細書において使用される用語「アルキル」は、直鎖基および分枝鎖基を含む飽和脂肪族炭化水素を記述する。好ましくは、アルキル基は１〜２０個の炭素原子を有する。数値範囲、例えば「１〜２０個」が本明細書において示される場合には常に、基（この場合アルキル基）が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など２０個までの炭素原子を含むことができることを意味する。より好ましくは、アルキルは１〜１０個の炭素原子を有する中間サイズのアルキルである。最も好ましくは、特記しない限り、アルキルは１〜４個の炭素原子を有する低級アルキルである。アルキル基は置換されていても置換されていなくてもよい。
【００７８】
用語「アルケニル」は、少なくとも２個の炭素原子と少なくとも１つの炭素−炭素の二重結合からなるアルキル基を示す。
【００７９】
用語「シクロアルキル」は、環の１つ以上が完全共役のπ電子系を有しない、すべて炭素からなる単環基または縮合環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を記述する。
【００８０】
用語「ヘテロ脂環式」は、窒素、酸素、および硫黄のような１個以上の原子を環中に有する単環基または縮合環基を記述する。この環は、１つ以上の二重結合を有してもよい。しかし、環は完全共役のπ電子系を有さない。
【００８１】
用語「アリール」は、完全共役のπ電子系を有する、すべて炭素からなる単環基または縮合環多環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を記述する。
【００８２】
用語「ヘテロアリール」は、例えば、窒素、酸素および硫黄などの１個以上の原子を環（単数または複数）中に有し、さらには完全共役のπ電子系を有する単環基または縮合環（すなわち、隣接炭素原子対を共有する環）基を記述する。ヘテロアリール基の非限定的な例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリンおよびプリンが含まれる。
【００８３】
用語「チオール」および「チオヒドロキシ」は−ＳＨ基を示す。
【００８４】
用語「ヒドロキシ」は−ＯＨ基を示す。
【００８５】
本明細書において使用される用語「アルコキシ」は、本明細書において定義されるような−Ｏ−アルキル基を示す。
【００８６】
本明細書において使用される用語「チオアルコキシ」は、本明細書において定義されるような−Ｓ−アルキル基を示す。
【００８７】
上記のラクトン部分は、上記の酵素分析において基質として使用される場合、さらに物質の一部を形成することができる。したがって、例えば、ラクトン部分は脂肪酸、ステロイド等の一部を形成することができる。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することは、分光光度分析によって行われる。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、このような分析は、１つ以上のラクトンを含みかつ１つ以上の分光光度的に検出可能な部分を形成することができる基質を利用する。酵素はこのような基質と接触させられ、検出可能な部分の量が測定される。
【００８９】
本明細書において記述される分光光度分析の１つの実施形態において、分光光度的に検出可能な部分がラクトンの不可欠な部分を形成する基質が利用される。このような分析において、酵素はラクトンを加水分解し、分光光度的に検出可能な種が分析媒体中に生成される。したがって、基質は、その構造中に予め分光光度的に検出可能な部分を有する予め分光光度的に検出可能な物質である。
【００９０】
本明細書において使用される表現「予め分光光度的に検出可能な部分または物質」は、ある条件下で、ここでは酵素反応に供された場合に、検出可能な部分を形成することができる部分または物質を記述するために使用される。
【００９１】
ラクトン含有基質の一部を形成する分光光度的に検出可能な部分は、このような基質がその天然の酵素に対する基質の天然の化学的および空間的な特異性を維持し、それによって酵素と基質の間の天然の化学的相互作用を維持するので極めて有利である。これらの相互作用を維持することは、酵素の天然の生物学的活性を研究し決定することを可能にし、また天然阻害剤および合成阻害剤のような酵素の他の化学的エフェクター間の生物学的に有意義な比較も可能にする。
【００９２】
本明細書において記述される分光光度分析の１つの実施形態において、分光光度的に検出可能な部分がラクトンに結合される基質が利用される。このような基質は、分光光度的に検出可能な部分が典型的には分析において行われる酵素反応時に放出されるように選択される。
【００９３】
本発明のこの側面の好ましい実施形態によれば、分光光度的に検出可能な部分はチオール基を含む。
【００９４】
チオールは、極めて便利な検出可能な基である。チオール分析は、例えば、チオール基によるプロ色素（ｐｒｏ−ｄｙｅ）５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸；ＤＴＮＢ、Ｅｌｌｍａｎ試薬としても知られる［Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．，１９５９，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８２，７０−７７］）の還元に基づく分光光度的な方法を用いて行われることができる。この反応は着色種を生成し、その種は以下で記述されかつさらに以下の実施例の節において例示されるように、４１２ｎｍの波長で検出されることができる。
【００９５】
上記で検討されたように、チオール基は、本実施形態において利用される基質においてラクトンの一部を形成することができる。したがって、基質中の１つ以上のラクトン部分はラクトン環中に硫黄原子を有してもよく、その硫黄原子は酵素加水分解時にチオールを生成する。下記のスキーム１で示されるように、チオールは上記のように、ＤＴＮＢとのその典型的な反応によって検出されることができる。
【００９６】
任意選択的に、チオール含有基は、基質中のラクトン部分に結合されることができる。このようなチオール含有基質は、チオールを含有する検出可能な部分が酵素反応時に放出されるように設計される。この点で分類されるチオールを含む好ましい検出可能な部分は、チオアルコキシ基である。チオアルコキシ基は下記のスキームＩＩに示されるように、酵素反応時にチオアルキルが生成されるようにラクトンに結合されることができる。
【００９７】
さらに本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ラクトナーゼ活性分析において有効なＰＯＮ基質として役立ちうる一連の新規なラクトン含有化合物を設計し、首尾良く調製し、そして使用した。
【００９８】
このようなラクトン含有化合物は、１つ以上のラクトン環を含み、ラクトン環は、その分解時に１つ以上の分光光度的に検出可能なチオール含有部分を形成することができ、そして以下の一般式Ｉによって集合的に表される。
式中、ＸおよびＹはそれぞれ酸素または硫黄原子であり、Ｚは炭素または硫黄原子であり、ＹおよびＺの少なくとも１つは硫黄であり、ｎは２〜４の整数であり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は各々独立して水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を通して結合される）またはヘテロ脂環式（環炭素を通して結合される）、アルコキシなどである。
【００９９】
したがって、新規なラクトンは、ｎが２であるとき５員のラクトンであり、ｎが３であるとき６員のラクトンであり、またはｎが４であるとき７員のラクトンである。好ましくはｎは２であり、５員のラクトンを形成する。
【０１００】
１つの好ましい実施形態において、ＸおよびＹはともに酸素原子であり、Ｚは硫黄原子である。好ましくは、Ｒ１は２〜１２個の炭素原子を有するアルキル基である。
【０１０１】
このようなラクトンは典型的には、ＰＯＮによるラクトナーゼによって行われる酵素加水分解を受け、その後、加水分解において形成される、１つの原子に同じ種類の原子が２つ結合したチオアルコキシ／チオヒドロキシ−ヒドロキシ部分の早い自然分解の結果としてチオールを放出する。上記のスキームＩＩに示されるように、生じたチオールは、上に記述されかつ以下の実施例の節で例示されるように、ＤＴＮＢでの典型的反応によって検出されることができる。
【０１０２】
別の好ましい実施形態において、Ｘは酸素であり、Ｙは硫黄であり、その結果、化合物はチオラクトンである。この実施形態において、Ｚは炭素または硫黄のいずれか、好ましくは炭素であることができ、そしてＲ１は水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を通して結合される）、またはヘテロ脂環式（環炭素を通して結合される）、アルコキシなどであることができ、好ましくは２〜１２個の炭素原子を有するアルキルである。このようなチオラクトンは、後に検出されることができるチオール基を生成する、ＰＯＮによるラクトナーゼによって行われる酵素加水分解を受けることができる。
【０１０３】
ＰＯＮ分析における５位で結合されたアルキル基またはチオアルコキシ基を有する５員のラクトンの使用は、これらの化合物が長いアルキル側鎖を有する５員環のオキソ−ラクトンを含むＰＯＮ１の好ましい基質とほぼ同一であるので、極めて有利である［２、４、６］。
【０１０４】
酵素反応において生成されるチオール含有部分（例えば、チオアルキル）は、上記で検討されたように、例えば燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析、およびイルミネセンス分析において分光光度的に検出可能な部分として役立つことができ、それらは典型的には酵素活性の検出および定量化のための比較的単純かつ迅速な技術である。
【０１０５】
下記で実証および例示されるように、本発明者は、５位で５員環のラクトンに結合される分光光度的に検出可能なチオアルコキシ部分を有する一連のラクトン基質を使用している。下記の実施例の節において示されるように、５−エチルスルファニル−ジヒドロ−フラン−２−オン、５−ブチルスルファニル−ジヒドロ−フラン−２−オン、および５−ヘキシルスルファニル−ジヒドロ−フラン−２−オンのラクトンが調製された。下記の表１に示されるこれらのラクトンは、ラクトンで観察されるｋｃａｔ／ＫＭ値に匹敵しかつ酵素基質について許容可能な値であると考えられる、１．５×１０５〜４．４５×１０５の範囲のｋｃａｔ／ＫＭ値を示した。
【０１０６】
酵素活性のｋｃａｔ／ＫＭ値は、基質特異性の強さを与える。それは同じ酵素に対する異なる基質の特異性を比較すること、または同じ基質を変換する異なる酵素の触媒速度の比較を可能にする。この速度は二次の速度定数の単位を有し、そしてｌ／（濃度×時間）として表される。ある酵素で１０８Ｍ−１秒−１以上の値が観察されたが、１０４〜１０６Ｍ−１秒−１の範囲のｋｃａｔ／ＫＭ比率を有する基質が良好な基質、すなわち酵素分析において妥当な親和性、特異性、および迅速なターンオーバーを示すと考えられる。
【０１０７】
上記の新規なラクトンのような、酵素反応時に検出可能な部分を形成しかつ生理学的なラクトナーゼ基質に構造的に類似するラクトンは、サンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定するために利用されることができる。
【０１０８】
したがって、本発明の別の側面によれば、サンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定する方法が提供される。本発明のこの側面によれば、その方法は、
（ａ）サンプルを、上記で定義されるような１つ以上のラクトンを含み、かつ、１つ以上のラクトンの加水分解時に上記で定義されるような１つ以上の分光光度的に検出可能な部分を形成することができる化合物と接触させること、ただし、検出可能な部分は化合物がラクトナーゼの基質と実質的に同じ構造を有するように選択される；および
（ｂ）分光光度的に検出可能な部分のレベルを分光光度的に測定し、それによってサンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定すること
によって行われる。
【０１０９】
本明細書において使用される表現「ラクトナーゼの基質と実質的に同じ構造を有する」は、天然基質の構造とほぼ同一であり、１個または２個の原子の置換、側鎖の伸長などの比較的小さな化学的および／または構造的特徴によって天然基質と異なる合成基質の化学構造を示す。
【０１１０】
上記で示されるラクトナーゼ活性分析の特定の場合におけるように、いかなるラクトナーゼ活性の分析も、上記で検討されたような燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析、およびイルミネセンス分析のような分光光度分析技術を使用することが好ましい。なぜなら、これらの分析は通常、分光光度的に検出可能な部分および他の化学部分の濃度の微細な変化を決定するために、広く入手可能な機械および測定装置を必要とするからである。
【０１１１】
いかなるラクトナーゼ活性のレベルを測定することも、上記で検討されるＰＯＮラクトナーゼ活性分析の例において記述されるように、ラクトン環の一部を形成することまたは置換基としてラクトンに結合されることのいずれかによってラクトンに結合される検出可能な部分の濃度レベルを追跡することによって行われる。
【０１１２】
本明細書において検討されるＰＯＮラクトナーゼ活性分析の例におけるように、検出可能な部分は好ましくは１つ以上のチオール基を含む。
【０１１３】
ラクトナーゼ活性を決定するための上記の薬剤が、例えば被験者におけるＰＯＮ酵素のような、ラクトナーゼの異常なレベルまたは活性に関連する障害または状態の素因を決定するためのまたは障害または状態を診断するためのキット中に含まれてもよいことは注意されるべきである。
【０１１４】
本明細書において使用される用語「被験者（被験体）」または「個体」は、被験者（例えば、哺乳動物）を示し、好ましくはＰＯＮ酵素の異常なレベルまたは活性に関連する障害に罹患していると疑われるかまたは罹患の危険性のあるヒト被験者を示す。
【０１１５】
本明細書において使用される用語「診断する」は、疾患、状態または症状を分類すること、疾患、状態、または症状の重篤度を決定すること、疾患の進行を監視すること、疾患の結果および／または回復の見通しを予測することを示す。
【０１１６】
本明細書において使用される表現「ＰＯＮ酵素の異常なレベル（健康な被験者から得られたコントロールサンプルに比べて高いレベルまたは低いレベル）または活性に関連する障害または状態」は、ＰＯＮ（例えば、ＰＯＮ１）活性が変化した種々の病理学的および生理学的状態および疾患を示す（例えば、Ｃｏｓｔａら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６９：５４１−５５０およびその参考文献を参照のこと）。例えば、血清ＰＯＮ１活性は、インスリン依存性（Ｉ型）および非インスリン依存性（ＩＩ型）糖尿病、アルツハイマー病（Ｄａｎｔｏｉｎｅら、２００２ パラオキソナーゼ１活性：痴呆の新しい脈管マーカーか？ Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２００２ １１月；９７７：９６−１９１）、ならびに動脈硬化を含む種々の心臓疾患において低いことが示されている（Ｃｏｓｔａら（２００５）；Ｍａｃｋｎｅｓｓら（２００４） 心臓血管疾患におけるパラオキソナーゼ１活性の役割：治療的介入の可能性 Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｒｕｇｓ．２００４；４（４）：２１１−７；Ｄｕｒｒｉｎｇｔｏｎら（２００１） パラオキソナーゼおよび動脈硬化 Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２００１ ２１（４）：４７３−８０）。減少したＰＯＮ活性はまた、慢性の腎不全、慢性関節リウマチ、または魚眼病（深刻な角膜の混濁によって特徴付けられる）を有する患者においても見出されている。甲状腺亢進はまた、低い血清ＰＯＮ活性、肝臓疾患、アルツハイマー病、および血管性痴呆に関連する。低いＰＯＮ活性はまた、感染性疾患においても観察される（例えば、急性期応答の間）。異常に低いＰＯＮレベルはまた、環境化学物質（例えば、コバルト、カドミウム、ニッケル、亜鉛、銅、バリウム、ランタン、水銀のような金属；ジクロロ酢酸、四塩化炭素）、薬物（例えば、コリン作用性ムスカリン様アンタゴニスト、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アルコール）のような種々の外因性化合物への曝露に関連する。述べたように、減少したＰＯＮレベルはまた、妊娠および老年期のような種々の生理学的状態の特徴でもあり、一般的な健康状態の被験者の指標になりうる。例えば、喫煙者は低い血清ＰＯＮ１活性を示し、身体運動は喫煙者のＰＯＮ１レベルを回復させることが知られている。
【０１１７】
したがって、本発明の薬剤（例えば、上記のようなラクトナーゼ基質）は、反応緩衝液、保存緩衝液、およびサンプル希釈緩衝液をさらに含むことができる診断用キット中に含まれることができる。好ましくは、キットは印刷物をさらに含み、例えば印刷物は診断用キットの使用説明書を含む。
【０１１８】
上で述べたように、生物学的に活性なＰＯＮのレベルを決定する能力は、個体のＰＯＮ状態を決定することを容易にすることができる。
【０１１９】
本明細書において使用される表現「ＰＯＮ状態」は、ＰＯＮ活性（すなわち、ラクトナーゼ活性）およびＰＯＮ遺伝子型を示す。
【０１２０】
ＰＯＮ１多型と疾患との関連を調査する大半の研究は、ヌクレオチド多型のみを試験し、そのヌクレオチド多型について遺伝子のコード領域（例えば、Ｑ１９２Ｒ、Ｌ５５Ｍ、Ｃ−１０８Ｔ）、イントロン、および制御領域における多型を含む１６０以上の多型が記載されている。しかしながら、すべての知られているＰＯＮ１（または他の）多型を遺伝子型決定するときでさえ、この分析がＰＯＮ活性のレベルも多型の状態（すなわち、どの多型が個体の２つの染色体のそれぞれにあるのか）も与えなかったことが明らかになっている。したがって、機能的なゲノム分析は、より多くの有益なアプローチを提供するだろう。
【０１２１】
したがって、本発明の別の側面によれば、個体のＰＯＮ状態を決定する方法が提供される。
【０１２２】
本発明のこの側面の方法は、被験者のＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性レベルを決定すること（ただし前記ラクトナーゼ活性は被験者における生物学的に活性なＰＯＮの指標である）；および、被験者のＰＯＮ酵素を遺伝子型決定し、それによって被験者のＰＯＮ状態を決定することによって行われる。
【０１２３】
ＰＯＮ酵素の遺伝子型決定は、当該分野で周知の分子生物学的方法または生化学的方法を使用して、核酸レベルまたはタンパク質レベル（多型が翻訳されたタンパク質に影響を及ぼす場合）で行われることができる。
【０１２４】
ＰＯＮの多型形態は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、少なくとも１つのヌクレオチドの微小欠失および／または微小挿入、短い欠失および挿入、複数のヌクレオチド変化、短いタンデムリピート（ＳＴＲ）、および可変数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）の結果であることができる。
【０１２５】
多型データを得るために、被験者のＰＯＮ酵素を含む生物学的サンプル（例えば、血清サンプル、尿サンプル、滑液サンプル、生検（例えば、肝臓生検））は、ＤＮＡ多型、ＲＮＡ多型、および／またはタンパク質多型の対立遺伝子決定に供される。
【０１２６】
以下は、本発明に従って使用されることができる多型（例えば、ＳＮＰ）検出方法の非限定的な列挙である。
【０１２７】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）：この方法において、プライマー伸長または連鎖反応事象がマッチまたはミスマッチの指標として使用されることができるように、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が多型ヌクレオチド付近にハイブリダイズするように設計される。放射能標識された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）でのハイブリダイゼーションはまた、特異的ＳＮＰの検出に適用されている（Ｃｏｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０：２７８−２８２、１９８３）。方法は、一つのヌクレオチドだけ異なる短いＤＮＡ断片の融点の差異に基づく。厳密なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、変異体対立遺伝子と野生型対立遺伝子の間で差異を生じさせることができる。
【０１２８】
ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭ分析（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，米国）：この技術は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼの各酵素ならびにアデノシン５’ホスホスルファート（ＡＰＳ）およびルシフェリン基質の存在下での一本鎖のＰＣＲ増幅されたＤＮＡテンプレートに対する配列決定用プライマーのハイブリダイゼーションに基づく。次の工程において、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）のうちの最初のものが反応に加えられ、そのデオキシヌクレオチド三リン酸がテンプレート鎖において塩基に対して相補的であるならば、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖内へのそのデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みを触媒する。それぞれの取り込み事象は、取り込まれたヌクレオチドの量に対して等モル量でのピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を伴う。最後の工程において、ＡＴＰスルフリラーゼはアデノシン５’ホスホスルファートの存在下でＰＰｉをＡＴＰに定量的に変換する。このＡＴＰは、ＡＴＰの量に比例する量で可視光を生じさせるオキシルシフェリンへのルシフェリンのルシフェラーゼ媒介の変換を行わせる。ルシフェラーゼにより触媒される反応において生じた光は電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、ｐｙｒｏｇｒａｍＴＭにおけるピークとして見られる。それぞれの光シグナルが、取り込まれたヌクレオチドの数に比例している。
【０１２９】
ＡｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅＴＭ分析（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、米国）：この技術は、蛍光分極化（ＦＰ）検出に基づく。目的のＳＮＰを含有する配列のＰＣＲ増幅後、過剰なプライマーおよびｄＮＴＰはエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩでのインキュベーションにより除かれる。これらの酵素が熱により不活化されると、Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ−ＦＰプロセスは、熱安定ポリメラーゼを使用して、２つの蛍光ターミネーターの一方を、ＳＮＰ部位のすぐ上流で停止するプライマーに添加する。添加されたターミネーターはその増大したＦＰによって同定され、元のＤＮＡサンプルに存在する対立遺伝子を表す。Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅプロセスは、ＡｃｙｃｌｏＰｏｌＴＭ（Ａｒｃｈｅｏｎ科から得られる新規な変異型熱安定ポリメラーゼ）、および目的のＳＮＰについての可能性のある対立遺伝子を表す、Ｒ１１０およびＴＡＭＲＡで標識された１対のＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓＴＭを使用する。ＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ非ヌクレオチド類似物は様々なＤＮＡポリメラーゼとともに生物学的に活性である。２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−三リン酸と同様に、非環状類似物は鎖ターミネーターとして機能する。類似物は、ＤＮＡ鎖の３’末端上に塩基特異的な様式でＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ、そして、３’−ヒドロキシルが存在しないので、さらなる鎖伸張において機能することができない。ＡｃｙｃｌｏＰｏｌは、種々のＴａｑ変異体が誘導体化２’，３’−ジデオキシヌクレオチドターミネーターに対して有するよりも、誘導体化されたＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓに対して高い親和性および特異性を有することが見出されている。
【０１３０】
ＳＮＰ検出の分野における進歩は、さらに正確で、容易で、かつ、費用のかからない大規模なＳＮＰ遺伝子型決定技術を提供してきたことが理解される：このような技術は、例えば、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ、Ｈｏｗｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．ら、１９９９、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：８７〜８）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動［ＭＡＤＧＥ、Ｄａｙ，Ｉ．Ｎ．ら、１９９５、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）のために配置されたウエルを備える水平ポリアクリルアミドゲルを使用するハイスループット遺伝子型決定、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９：８３０〜５］、ＴａｑＭａｎシステム（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ら、１９９１、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼの５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を利用することによる特異的ポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８：７２７６〜８０）、ならびに、様々なＤＮＡ「チップ」技術、例えば、米国特許第６３０００６３号（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、２００１）（これは参照として全てが本明細書中に組み込まれる）に開示されるＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップ）、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ら（ＰＣＴ出願番号９２／１５７１２）によって記載されるＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＢＡＴＭ）、ペプチド核酸プローブ（ＰＮＡ、Ｒｅｎ Ｂら、２００４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：ｅ４２）およびロックド核酸プローブ（ＬＮＡ、Ｌａｔｏｒｒａ Ｄら、２００３、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２２：７９〜８５）、分子ビーコン（Ａｂｒａｖａｙａ Ｋら、２００３、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ．４１：４６８〜７４）、インターカレーション色素［Ｇｅｒｍｅｒ，Ｓ．およびＨｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．オリゴヌクレオチドプローブを用いないシングルチューブ遺伝子型決定、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：７２〜７８（１９９９）］、ＦＲＥＴプライマー（Ｓｏｌｉｎａｓ Ａら、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：Ｅ９６）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｂｅａｕｄｅｔ Ｌら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００１、１１（４）：６００〜８）、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ（Ｂｅｌｌ ＰＡら、２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．７０〜２、７４、７６〜７）、多重ミニ配列決定（Ｃｕｒｃｉｏ Ｍら、２００２、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２３：１４６７〜７２）、ＳｎａＰｓｈｏｔ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄら、２００２、Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ、６３：５０８〜１３）、ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（Ｃａｓｈｍａｎ ＪＲら、２００１、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ．２９：１６２９〜３７）、ＧＯＯＤ分析（Ｓａｕｅｒ ＳおよびＧｕｔ ＩＧ、２００３、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１７：１２６５〜７２）、マイクロアレイミニ配列決定（Ｌｉｌｊｅｄａｈｌ Ｕら、２００３、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３：７〜１７）、アレイ型プライマー伸張（ＡＰＥＸ）（Ｔｏｎｉｓｓｏｎ Ｎら、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．３８：１６５〜７０）、マイクロアレイプライマー伸張（Ｏ’Ｍｅａｒａ Ｄら、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ７５）、Ｔａｇアレイ（Ｆａｎ ＪＢら、２０００、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：８５３〜６０）、テンプレート指向取り込み（ＴＤＩ）（Ａｋｕｌａ Ｎら、２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３２：１０７２〜８）、蛍光分極化（Ｈｓｕ ＴＭら、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３１：５６０、５６２、５６４〜８）、比色オリゴヌクレオチドライゲーション分析（ＯＬＡ、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ＤＡら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：８９２３〜７）、配列コード化ＯＬＡ（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ Ｐら、１９９９、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｒｅｅｎ．６：６７〜９）、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応，Ｐａｄｌｏｃｋプローブ、ローリングサークル増幅、Ｉｎｖａｄｅｒ分析（総説、Ｓｈｉ ＭＭ、２００１、ハイスループットな変異検出技術および遺伝子型決定技術による大規模な薬理遺伝学研究を実現する、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．４７：１６４〜７２）、コード化マイクロスフェア（Ｒａｏ ＫＶら、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ６６）およびＭａｓｓＡｒｒａｙ（Ｌｅｕｓｈｎｅｒ Ｊ、Ｃｈｉｕ ＮＨ、２０００、Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．５：３４１〜８０）などである。
【０１３１】
上で言及されたように、細胞の遺伝的プロファイルはまた、細胞トランスクリプトームの分析を介して行われることができる。
【０１３２】
本発明の細胞におけるＲＮＡの発現レベルは、当該分野において公知の方法を用いて決定されることができる。
【０１３３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：この方法は、比較的希なＲＮＡ分子のＰＣＲ増幅を用いる。まず、ＲＮＡ分子は細胞から精製され、逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ−ＲＴ）およびオリゴｄＴ、ランダムヘキサマー、または遺伝子特異的プライマーのようなプライマーを用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと変換される。次いで、遺伝子特異的プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを適用することによって、ＰＣＲ装置においてＰＣＲ増幅反応が実行される。当業者は、特異的なＲＮＡ分子を検出するために適切な遺伝子特異的プライマーの長さおよび配列、ならびにＰＣＲ条件（すなわち、アニーリング温度、サイクル数など）を選択することが可能である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応はＰＣＲサイクル数を調製することおよび増幅生成物を既知のコントロールと比較することによって用いられうることが理解される。
【０１３４】
本発明の培養物の細胞において発現されるタンパク質の発現および／または活性レベルは、当該分野において公知の方法を用いて決定されることができる。
【０１３５】
酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）：この方法は、マイクロタイタープレートのウエルのような表面への、タンパク質基質を含有するサンプル（例えば、固定された細胞またはタンパク質性溶液）の固定を含む。酵素にカップリングされた基質特異的な抗体が適用され、基質に結合させられる。次いで、抗体の存在が、抗体にカップリングされた酵素を用いる比色反応によって検出および定量される。この方法において一般的に用いられる酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。十分に較正され、かつ、応答の直線範囲内にある場合、サンプルに存在する基質の量は、生じた色の量に比例している。基質標準物が、定量精度を改善するために一般に用いられる。
【０１３６】
ウエスタンブロット：この方法は、基質をアクリルアミドゲルによって他のタンパク質から分離し、その後、基質をメンブラン（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）に転写することを含む。次いで、基質の存在が基質に特異的な抗体によって検出され、次いで、抗体が抗体結合試薬によって検出される。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡまたは他の抗体であり得る。抗体結合試薬は、上記のように放射能標識または酵素連結されることができる。検出は、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によって行われることができる。この方法は、基質量の定量と、電気泳動期間中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示すメンブラン上での相対的な位置によるその同一性の決定の両方を可能にする。
【０１３７】
放射免疫分析（ＲＩＡ）：１つの形式において、この方法は、所望のタンパク質（すなわち、基質）を、特異的な抗体と、アガロースビーズのような沈殿可能なキャリア上に固定化される放射能標識された抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５で標識されたプロテインＡ）とで沈殿させることを含む。沈殿ペレットにおけるカウント数が基質の量に比例している。
【０１３８】
ＲＩＡに代わる形式において、標識された基質および非標識の抗体結合タンパク質が使用される。未知量の基質を含有するサンプルが様々な量で加えられる。標識された基質からの沈殿カウントの減少が、添加されたサンプルにおける基質の量に比例する。
【０１３９】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質特異的な抗体による細胞におけるその場での基質の検出を含む。基質特異的な抗体はフルオロフォアに連結される。検出は、細胞が光ビームを通過するときにそれぞれの細胞から放射される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行われる。この方法は、２つ以上の抗体を同時に用いることができる。
【０１４０】
免疫組織化学分析：この方法は、基質特異的な抗体による、固定された細胞におけるその場での基質の検出を含む。基質特異的な抗体は酵素連結されることができるか、またはフルオロフォアに連結されることができる。検出は顕微鏡および主観的または自動的評価によって行われる。酵素連結された抗体が用いられる場合、比色反応が必要とされる場合がある。免疫組織化学の後に、例えばＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅまたはＧｉｅｍｓａ染色を用いる細胞核の対比染色が続くことが多いことが理解される。
【０１４１】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例の実験に基づいて当業者には明らかになるだろう。さらに、本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および側面のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１４２】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１４３】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験手順には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；また利用可能な免疫分析は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９９６）；なお、これらの文献のすべては、あたかも本明細書中に完全に記載されているように組み込まれる。その他の一般的な参考文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当該分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１４４】
実施例１
５−チオアルキル置換ブチロラクトン（ＴＸＢＬ）の合成
４−フェニルチオ−４−ブタノライドの合成方法［１２］が、５−チオエチル、チオブチルおよびチオヘキシルブチロラクトンの合成について使用された（スキーム２）。まず、γ−ブチロラクトン環が、対応するチオールで開かれた［１３］。得られた４−（アルキルチオ）−酪酸が次いで過沃素酸ナトリウムで酸化され、４−（アルキルスルフィニル）−酪酸［１４］を得た。これはＰｕｍｍｅｒｅｒ転位［１２］によって対応するラクトンに対して閉じられた。この経路は、種々の長さの側鎖（以下のスキーム３においてＲによって表される）の５−チオ−ブチロラクトンへの結合を可能にする一般なものであることが見出された。
【０１４５】
材料および実験手順
材料−化学物質はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｆｌｕｋａ、およびＡｃｒｏｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入された。
【０１４６】
５−チオブチルブチロラクトン（ＴＢＢＬ）のために与えられる５−チオアルキル置換ブチロラクトンの典型的な合成：
４−（ブチルチオ）−酪酸。γ−ブチロラクトン（１２．９ｍｍｏｌ、１．１１ｇ）は、ＡｌＢｒ３（２．２当量、２８．３８ｍｍｏｌ、７．５６ｇ）とブタンチオール（約２０ｍｌ）の混合物に液滴状に添加された。得られた混合物は、室温で２時間攪拌され、次いで水（約５０ｍｌ）にゆっくりと注がれた。水性混合物はＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍｌ）で抽出され、有機相はＮａＣｌブラインで洗浄され、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥された。溶媒は蒸発され、生成物は減圧で乾燥された。収率：１．８４ｇ、８０．９％。
【０１４７】
４−（ブチルスルフィニル）−酪酸。０℃で、２１ｍｌ（１０．５ｍｍｏｌ）の過沃素酸ナトリウムの０．５Ｍ溶液に、４−（ブチルチオ）−酪酸（１．８４ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）が添加され、反応物は０℃で一晩攪拌された。沈殿した過沃素酸ナトリウムは濾過によって除去され、濾液は蒸発された。得られた固体はＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍｌ、１５分間抽出）で抽出され、次いで溶媒は蒸発によって除去され、４−（ブチルスルフィニル）−酪酸（１．８８ｇ、９４％）を生成した。
【０１４８】
５−（チオブチル）ブチロラクトン。トルエン中の４−（ブチルスルフィニル）−酪酸（６３０ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）の溶液に、無水酢酸（３当量、１０ｍｍｏｌ、１ｇ）および触媒量のｐ−トルエンスルホン酸が添加された。得られた溶液は数時間還流され、次いで溶媒は乾燥するまで蒸発された。残渣は酢酸エチル：ヘキサン（１：３）中に溶解され、次いでフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル：ヘキサン（１：３））により精製され、５−（チオブチル）ブチロラクトン（１３０ｍｇ、２３．３％）を与えた。
【０１４９】
実施例２
ＴＸＢＬの酵素加水分解の反応速度分析
ＰＯＮ１による３種のＴＸＢＬの酵素加水分解の反応速度パラメータは、ＤＴＮＢで放出されたチオール部分を検出することによって決定された。
【０１５０】
材料および実験手順
材料−ＣＰＭ色素（７−ジエチルアミノ−３−（４’マレイミジル−フェニル）−４−メチルクマリン）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから購入された。反応は、チオレドキシンと６×Ｈｉｓタグとの融合物中で発現され、かつ文献に記載されるように［１９］精製された組換えＰＯＮ１変異体ｒｅＰＯＮ１−Ｇ２Ｅ６で行われた。
【０１５１】
ＤＴＮＢでの反応速度測定−チオアルキル置換ラクトンの酵素加水分解の速度は、１ｍＭ ＣａＣｌ２および５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（活性緩衝液）中で決定された。酵素ストックは、０．１％Ｔｅｒｇｉｔｏｌを含有する活性緩衝液中で保存され、使用された酵素濃度は８．３７５×１０−９Ｍであった。１００〜４００ｍＭの基質のストックがアセトニトリル中で調製され、反応を開始する直前に反応緩衝液で希釈された。５−（チオヘキシル）−ブチロラクトン（ＴＨＢＬ）は、０．０３〜０．２４％の最終濃度で、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤で緩衝液中に溶解された。基質濃度は０．３×ＫＭ〜（２〜３）×ＫＭの範囲で変化された。共溶媒の割合は、全ての反応物において１％で保たれた。ＤＴＮＢ色素（Ｅｌｌｍａｎ試薬、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））は、０．５ｍＭの最終濃度でＤＭＳＯ中の１００ｍＭストックから使用された。ε４１２ｎｍ＝７，０００ＯＤ／Ｍを使用して活性を計算した。生成物の形成は、マイクロタイタープレート読み取り機（ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＨＴＴＭ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ；光学長〜０．５ｃｍ）上で、９６ウエルプレートを用いて２００μｌの反応容量において４１２ｎｍで分光光度的に監視された。初期速度（ｖ０）は各々の基質について８つの異なる濃度で決定された。ｖ０値は酵素の非存在下での自然加水分解のバックグラウンド速度について補正された。反応速度パラメータ（ｋｃａｔ、ＫＭ、ｋｃａｔ／ＫＭ）は、プログラムＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ ５．０を使用して、データをＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ方程式［ｖｏ＝ｋｃａｔ［Ｅ］０［Ｓ］０／（［Ｓ］０＋ＫＭ）］に当てはめることによって得られた。
【０１５２】
ＣＰＭでの反応速度測定−４−（チオブチル）ブチロラクトン（ＴＢＢＬ）の酵素加水分解の速度は、８．３７５×１０−９Ｍ酵素で活性緩衝液において決定された。基質はアセトニトリル中の４００ｍＭストックから使用され、その基質は反応を開始する直前に反応緩衝液で希釈され、ＣＰＭと測定前に加水分解された基質との間の反応を完了させるために、ＣＰＭ色素（７−ジエチルアミノ−３−（４’マレイミジル−フェニル）−４−メチルクマリン）で３分間インキュベートされた。ＣＰＭ色素は５０μＭの最終濃度でＤＭＦ中の５ｍＭストックから使用され、反応混合物はＣＰＭ可溶化のために０．１％のトリトンを含有した。生成物の形成は、マイクロタイタープレート読み取り機（励起−４００ｎｍフィルター、放射−４５０ｎｍおよび５１６ｎｍフィルター、Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅを備えるＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴＴＭ Ｍｕｌｔｉ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ；光学長〜０．５ｃｍ）上で、９６ウエルプレートを用いて、２００μｌの反応容量におけるＣＰＭ蛍光を追跡することによって監視された。
【０１５３】
結果
５−（チオブチル）ブチロラクトン（ＴＢＢＬ）加水分解の典型的な比色分析が図１ａに示され、反応速度パラメータは下記の表１に列挙される。これらの新規な基質に対するｋｃａｔおよびＫＭ値は、相同の５−アルキル−置換ブチロラクトンで観察されたｋｃａｔおよびＫＭ値に類似している（表２、下記）。
【０１５４】
５−チオアルキルラクトンの酵素加水分解の速度はまた、図１ｂに示される蛍光発生チオール検出プローブＣＰＭ［１１］で追跡された。
【０１５５】
実施例３
ヒト血清および生細胞におけるＰＯＮ１活性の測定
上記の発色分析および蛍光発生分析は、ヒト血清サンプルにおけるＰＯＮのラクトナーゼ活性を測定するために使用された。
【０１５６】
材料および実験手順
ＴＢＢＬおよび酢酸フェニルでの血清活性−反応は活性緩衝液において行なわれ、血清は１〜４００の最終希釈度で使用された。ＴＢＢＬの反応混合物は、アセトニトリル中の４００ｍＭストックからの０．５ｍＭ ＴＢＢＬおよびＤＭＳＯ中の１００ｍＭストックからの０．５ｍＭ ＤＴＮＢを含有した。酢酸フェニルの反応混合物は、メタノール中の５００ｍＭストックからの１ｍＭ酢酸フェニルを含有した。全ての反応混合物は、最終１％ ＤＭＳＯを含有した。２−ヒドロキシキノリンは、ＤＭＳＯ中の５００ｍＭストックから使用され、ＥＤＴＡは水中の０．５Ｍストックから使用された。血清は、反応の開始前に５〜１０分間阻害剤とともにインキュベートされた。
【０１５７】
ＦＡＣＳによるＴＢＢＬでのＰＯＮ１活性の検出−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の乳化およびＦＡＣＳ分析は、既に記載される［１６］ように行なわれた。
【０１５８】
結果
ヒト血清におけるＰＯＮ１レベルは、図２ａ〜ｂに示されるように、新たに合成された基質（実施例１〜２を参照のこと）を使用して検出された。測定されたラクトナーゼ活性が血清において存在する他のヒドロラーゼと対照的にＰＯＮ１によって媒介されることを裏付けるために、血清はまた、２−ヒドロキシキノリン（ＰＯＮ１活性の選択的拮抗阻害剤［４］）およびＥＤＴＡ（ＰＯＮ１活性に対して重要なカルシウムをキレート化する）とともに予めインキュベートされた。平行して、ＰＯＮ１活性は、血清におけるＰＯＮ１レベルに対するプローブとして通常使用される酢酸フェニルで決定された。ＴＢＢＬでの活性は、酢酸フェニルでの活性に匹敵し、同様に阻害されていた（下記の表３を参照のこと）。これは、新規なラクトン基質がヒト血清におけるＰＯＮ１レベルを評価するために使用されることができること、およびラクトナーゼおよびアリールエステラーゼ活性の９０％より多くがＰＯＮ１に起因することを明確に実証する。ＥＤＴＡによる高い阻害率（＞９９％）は、金属キレート化剤に敏感なＰＯＮ１以外の血清酵素のためかもしれない。
【０１５９】
ＰＯＮ１活性はまた、酵素活性の生成物とともに細胞を区画に分けるエマルジョン小滴およびＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）を使用して生細胞において検出された［１５，１６］。まず、細胞質において組み換えＰＯＮ１（ｒｅＰＯＮ１）を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞、ならびにＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）は、ラクトン基質（ＴＢＢＬ）および蛍光発生チオール検出色素ＣＰＭとともに油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンの水性小滴において区画に分けられた。次いでｗ／ｏエマルジョンは再乳化され、ＦＡＣＳに適している連続する水相を有するｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンを生成した［１５］。閾値を引き起こすＦＡＣＳはＧＦＰの放射に対して設定され、適切なゲートは単一のＥ．ｃｏｌｉ細胞の放射レベルに対応して選択された［１６］。図３に示されるように、区画に分けられた細胞におけるＰＯＮ１ラクトナーゼ活性の検出は、５３０ｎｍでチオール検出色素の蛍光シグナルを介したものであった。ｒｅＰＯＮ１を担持しない細胞に対して、明らかな差異（平均蛍光において２０倍より大きい）が観察された。
【０１６０】
結論として、上記の結果は、５−チオアルキルラクトンがＰＯＮ１のラクトナーゼ活性を分析するために極めて有用でありかつ敏感なプローブであることを実証する。これらの基質でのＰＯＮ１の速度は、ＰＯＮ１の好ましい基質である脂肪族の５−アルキル置換ラクトンに類似しており、ＰＯＮ１の天然基質によく似ているかもしれない［２］。５−チオアルキルラクトンは、無傷の細胞および血清のような複雑な生物学的サンプルで使用されることができ、その結果、ハイスループット様式でヒト血清におけるＰＯＮ１のレベルを試験する生理学的に関連性を持つ新規な手段を提供する。これらの基質はまた、ＦＡＣＳおよび二重エマルジョンを使用するラクトナーゼ活性に対するスクリーニングの強力な手段を提供し、その手段は定方向進化および機能的ゲノムについて数時間で１０７より多い酵素変異体のライブラリのスクリーニングを可能にする［１６，１７］。最後に、新規な５−チオアルキルラクトンはＰＯＮ１以外の酵素とともに、特に発色／蛍光発生基質が存在しない他のＰＯＮファミリーのメンバーとともに使用されることができる。例えば、ＰＯＮ３のラクトナーゼ活性は、精製された酵素サンプルおよび粗細胞溶解物の両方において、ＴＥＢＬおよびＴＢＢＬで分析されることができた（データ示さず）。他の酵素（例えば、プセウドモナス・ジミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ホスホトリエステラーゼ）のラクトナーゼ活性もまた検出されることができた［１８］。
【０１６１】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１６２】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形全てを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は全て、個々の刊行物、特許または特許願、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１ａ〜１ｂは、ＰＯＮ１のラクトナーゼ活性の比色測定（図１ａ）および蛍光発生測定（図１ｂ）を示すグラフである。
【図２】図２ａ〜２ｂは、ヒト血清におけるＰＯＮ１のラクトナーゼ活性（図２ａ）およびアリールエステラーゼ活性（図２ｂ）を示すグラフである。
【図３】図３は、ＦＡＣＳ分析によって決定された、チオアルキルブチロラクトン基質（ＴＢＢＬ）およびｗ／ｏ／ｗエマルジョンを使用する、ＰＯＮ１発現Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＯＮ１のラクトナーゼ活性を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを決定する方法であって、生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することを含む方法。
【請求項２】
被験者におけるＰＯＮ状態を決定する方法であって、
（ａ）被験者のＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性レベルを決定すること、ただし、前記ラクトナーゼ活性は被験者における生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す；および
（ｂ）被験者の前記ＰＯＮ酵素を遺伝子型決定し、それによって被験者のＰＯＮ状態を決定すること
を含む方法。
【請求項３】
ＰＯＮ酵素は、ＰＯＮ１、ＰＯＮ２およびＰＯＮ３からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的に活性なＰＯＮ酵素は、アポリポタンパク質複合ＰＯＮ酵素を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性の決定は、
（ｉ）クロマトグラフィ分析；
（ｉｉ）ｐＨ指示薬分析；
（ｉｉｉ）分光光度分析；
（ｉｖ）共役酵素分析；
（ｖ）電気化学的分析；および／または
（ｖｉ）熱量分析
によって行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記分光光度分析は、少なくとも１つのラクトンを含みかつ前記ラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる基質の存在下で行なわれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記分光光度分析は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能な部分は前記ラクトンに結合される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記検出可能な部分は前記ラクトンの一部を形成する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能な部分は少なくとも１つのチオールを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質は前記ラクトンに結合されているチオアルコキシ基を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出は発色分析または蛍光発生分析によって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記基質は、前記ラクトンのヘテロ原子に隣接する炭素に結合されたチオアルコキシ基を有する、５員、６員または７員のラクトンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定する方法であって、
（ａ）サンプルを、少なくとも１つのラクトンを含みかつ前記ラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる化合物と接触させること、ただし、前記検出可能な部分は前記化合物が前記ラクトナーゼの基質と実質的に同じ構造を有するように選択される；および
（ｂ）前記部分のレベルを分光光度的に決定し、それによってサンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定すること
を含む方法。
【請求項１６】
前記部分の前記レベルの決定は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能な部分は前記ラクトンに結合される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能な部分は前記ラクトンの一部を形成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出可能な部分は少なくとも１つのチオールを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質は前記ラクトンに結合されているチオアルコキシ基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出は発色分析によって行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
被験者におけるＰＯＮ酵素の異常なレベルまたは異常な活性に関連する障害の素因を決定するかまたは障害を診断するためのキットであって、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することができる少なくとも１つの薬剤を含むキット。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つのラクトンを含みかつ前記ラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる化合物である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
少なくとも１つのラクトンを含みかつ前記ラクトンの分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能なチオール含有部分を形成することができる化合物。
【請求項２６】
前記チオール含有部分は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析からなる群から選択される分光光度分析によって検出可能である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
前記検出可能な部分は前記ラクトンに結合される、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２８】
前記検出可能な部分は前記ラクトンの一部を形成する、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２９】
前記検出可能な部分はチオアルコキシ基を含む、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３０】
前記チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
前記ラクトンは、５員、６員または７員のラクトンである、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３２】
前記ラクトンは５員のラクトンである、請求項２７に記載の化合物。
【請求項１】
生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを決定する方法であって、生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することを含む方法。
【請求項２】
被験者におけるＰＯＮ状態を決定する方法であって、
（ａ）被験者のＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性レベルを決定すること、ただし、前記ラクトナーゼ活性は被験者における生物学的に活性なＰＯＮ酵素のレベルを示す；および
（ｂ）被験者の前記ＰＯＮ酵素を遺伝子型決定し、それによって被験者のＰＯＮ状態を決定すること
を含む方法。
【請求項３】
ＰＯＮ酵素は、ＰＯＮ１、ＰＯＮ２およびＰＯＮ３からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的に活性なＰＯＮ酵素は、アポリポタンパク質複合ＰＯＮ酵素を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性の決定は、
（ｉ）クロマトグラフィ分析；
（ｉｉ）ｐＨ指示薬分析；
（ｉｉｉ）分光光度分析；
（ｉｖ）共役酵素分析；
（ｖ）電気化学的分析；および／または
（ｖｉ）熱量分析
によって行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記分光光度分析は、少なくとも１つのラクトンを含みかつ前記ラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる基質の存在下で行なわれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記分光光度分析は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能な部分は前記ラクトンに結合される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記検出可能な部分は前記ラクトンの一部を形成する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能な部分は少なくとも１つのチオールを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質は前記ラクトンに結合されているチオアルコキシ基を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出は発色分析または蛍光発生分析によって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記基質は、前記ラクトンのヘテロ原子に隣接する炭素に結合されたチオアルコキシ基を有する、５員、６員または７員のラクトンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定する方法であって、
（ａ）サンプルを、少なくとも１つのラクトンを含みかつ前記ラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる化合物と接触させること、ただし、前記検出可能な部分は前記化合物が前記ラクトナーゼの基質と実質的に同じ構造を有するように選択される；および
（ｂ）前記部分のレベルを分光光度的に決定し、それによってサンプルにおけるラクトナーゼの活性を決定すること
を含む方法。
【請求項１６】
前記部分の前記レベルの決定は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能な部分は前記ラクトンに結合される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能な部分は前記ラクトンの一部を形成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出可能な部分は少なくとも１つのチオールを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質は前記ラクトンに結合されているチオアルコキシ基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出は発色分析によって行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
被験者におけるＰＯＮ酵素の異常なレベルまたは異常な活性に関連する障害の素因を決定するかまたは障害を診断するためのキットであって、ＰＯＮ酵素のラクトナーゼ活性を決定することができる少なくとも１つの薬剤を含むキット。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つのラクトンを含みかつ前記ラクトンの加水分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能な部分を形成することができる化合物である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
少なくとも１つのラクトンを含みかつ前記ラクトンの分解時に少なくとも１つの分光光度的に検出可能なチオール含有部分を形成することができる化合物。
【請求項２６】
前記チオール含有部分は、燐光分析、蛍光分析、発色分析、ルミネセンス分析およびイルミネセンス分析からなる群から選択される分光光度分析によって検出可能である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
前記検出可能な部分は前記ラクトンに結合される、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２８】
前記検出可能な部分は前記ラクトンの一部を形成する、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２９】
前記検出可能な部分はチオアルコキシ基を含む、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３０】
前記チオアルコキシ基は２〜１２個の炭素原子を含む、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
前記ラクトンは、５員、６員または７員のラクトンである、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３２】
前記ラクトンは５員のラクトンである、請求項２７に記載の化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５０４１７７（Ｐ２００９−５０４１７７Ａ）
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２６６１０（Ｐ２００８−５２６６１０）
【出願日】平成１８年８月１４日（２００６．８．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００６／０００９４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２０６３２
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０２３７９１４７）イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月１４日（２００６．８．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００６／０００９４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２０６３２
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０２３７９１４７）イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド (14)
【Ｆターム（参考）】
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