画期的新薬開発のためのターゲットタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する新薬候補物質のスクリーニング方法
本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用阻害物質のスクリーニング方法に関し、より詳しくはゾル−ゲル物質とタンパク質が混合されたスポットが固定化されているタンパク質チップを利用して、タンパク質−タンパク質相互作用阻害物質をスクリーニングする方法に関する。本発明によると、ゾル−ゲル物質を用いて、９６ウェルプレートで簡便にタンパク質チップを作製でき、天然物質ライブラリーから簡単にタンパク質−タンパク質相互作用阻害物質をスクリーニングすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用阻害物質のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、ゾル−ゲル物質とタンパク質が混合されたスポットが固定化されているタンパク質チップを利用して、タンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質−タンパク質相互作用を阻害する低分子阻害剤の開発には多くの問題点があることが知られているが、その重要性のためにタンパク質−タンパク質相互作用を阻害できる低分子物質を開発しようとする試みが継続的に進行し、いくつかの成功例がある（Nature Reviews Drug Discovery, 3:853, 2004）。
【０００３】
新薬開発の方法は、主に特定の分析システムを構築し、これに対して保有している数十〜数百万種の化合物ライブラリーを高速でスクリーンする方法を取っており、このような方法は、化合物の保有量や高速スクリーンシステムの構築等の様々な制約のため、主に多国籍製薬企業等で行われているが、小規模の実験室では適用するには困難であった。さらに従来構築されていなかった天然物ライブラリーのような数万個程度の比較的小さい大きさのライブラリーを利用した新規高速スクリーンシステムを構築するためには、少ない費用で短い時間に概念を立証することが必要である。また学校及び研究所のような中、小規模の実験室では新しい概念の分析システム及びスクリーニングシステムを用いてリード化合物を確保する戦略が必要である。
【０００４】
そのためには、少ないサンプルに適用できるチップベースのスクリーニング（chip-based screening）が適当であり、かつ既に構築された安価な高分子を利用したチップシステムを利用して、新しい新薬探索方法を確立して、オリジナル技術を確保することが新薬開発産業のインフラの向上に寄与すると予想される。
【０００５】
そこで、本発明者等は、実験室ベースの小規模実験でも有用に使用できるチップベースのタンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤をスクリーニングする方法を開発しようと鋭意努力した結果、ゾル−ゲル物質とタンパク質を混合してスポッティングしたタンパク質チップを利用する場合、既存の抗体分析方法を利用して、簡便に阻害剤をスクリーニングできることを確認して、本発明を完成した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、タンパク質−タンパク質相互作用を簡便に分析できるチップベースのタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【０００７】
本発明は（ａ）ゾル−ゲル物質とタンパク質が混合されたスポットが固定化されているタンパク質チップを作製する工程；（ｂ）前記タンパク質チップと前記チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質を前記結合を阻害する候補物質の存在下において反応させる工程；及び（ｃ）前記チップに固定化されたタンパク質と前記固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質の間の結合を測定して、前記候補物質がない場合のタンパク質−タンパク質相互作用に比べて、タンパク質−タンパク質相互作用が阻害される場合の候補物質をタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質として選定する工程を含むタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。
【０００８】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】サイクリンＴタンパク質の構造の相同性を示した図である。
【図２】組み換えＣＤＫ９及びサイクリンＴのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１での発現を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。
【図３】組み換えヒトＣＤＫ９の発現パターン及び精製過程を確認した図である。
【図４】組み換えヒトサイクリンＴの発現パターン及び精製過程を確認した図である。
【図５】ゾル−ゲルチップでＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の相互作用をタンパク質チップ上で確認する方法を示した模式図である。
【図６】ゾル−ゲルチップでタンパク質間結合を確認した結果を示した図である。
【図７】ゾル−ゲルチップで天然物４つを利用した予備実験の結果を示した図である。
【図８】ゾル−ゲルチップでの分析条件確立のための結果を示した図である。
【図９】ゾル−ゲル物質の組成による分析結果を示した図である。
【図１０】ゾル−ゲル物質の組成による分析結果を示した図である。
【図１１】天然物ライブラリーを利用したＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の相互作用阻害効果を確認した結果を示した図である。
【図１２】ゾル−ゲル物質の組成によるＢＳＡシグナルを確認した結果を示した図である。
【図１３】ゾル−ゲル物質の組成によるＢＳＡシグナルを確認した結果を示した図である。
【図１４】天然物ｆｕｌｌスクリーニング用タンパク質−タンパク質阻害分析システムの作製過程を示した図である。
【図１５】三つの天然物を利用した低密度（low density）チップでのＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の相互作用阻害効果を分析した図である。
【図１６】サイクリンＴ１とＣＤＫ９の相互作用機構を示した模式図である。
【図１７】サイクリンＴ１のアプタマー作製のためＳＥＬＥＸ方法を示した模式図である。
【図１８】サイクリンＴ１アプタマーの作用機構を示した模式図である。
【図１９】ゾル−ゲルチップでのアプタマーとサイクリンＴ１の結合を確認した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１１】
一観点において、本発明は、（ａ）ゾル−ゲル物質とタンパク質が混合されたスポットが固定化されているタンパク質チップを作製する工程；（ｂ）前記タンパク質チップと前記チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質を、前記結合を阻害する候補物質の存在下において反応させる工程；及び（ｃ）前記チップに固定化されたタンパク質と前記固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質の間の結合を測定して、前記候補物質がない場合のタンパク質−タンパク質相互作用に比べて、タンパク質−タンパク質相互作用が阻害される場合の候補物質をタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質として選定する工程を含むタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。
【００１２】
本発明において、前記候補物質は、天然物、化合物及びアプタマーからなる群から選択されることを特徴とし、前記工程（ｃ）におけるタンパク質間の結合は、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質に対する抗体を利用して確認することを特徴とする。
【００１３】
本発明において、前記スポットは、９６ウェルプレートに固定されていることを特徴とする。本発明において、前記タンパク質チップに固定化されたタンパク質は、サイクリンＴ１で、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質はＣＤＫ９であることを特徴とする。
【００１４】
本発明において、前記工程（ｃ）において候補物質をタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質として選定することは、候補物質がチップに固定化されたタンパク質と結合して、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質がタンパク質チップに固定化されたタンパク質と結合できないようにする場合、前記候補物質を阻害物質として選定する。
【００１５】
例えば、サイクリンＴ１は、ＣＤＫ９と相互作用するタンパク質であり、サイクリンＴ１が固定されたタンパク質チップに候補物質とＣＤＫ９を反応させた際に、候補物質がサイクリンＴ１と結合して、ＣＤＫ９がサイクリンＴ１に結合することを抑制する場合、候補物質をサイクリンＴ１とＣＤＫ９の相互作用を阻害する物質として選定でき、前記阻害はＣＤＫ９に対する抗体をタンパク質チップで処理し、Ｃｙ３等の蛍光物質で標識されたＣＤＫ９抗体に対する二次抗体を処理して確認できる。即ち、前記候補物質がない場合におけるＣＤＫ９抗体シグナルに比べて、候補物質を処理した際のＣＤＫ９抗体シグナルが減少する場合、前記候補物質をサイクリンＴ１−ＣＤＫ９相互作用に対する阻害物質として選定することができる。
【００１６】
本発明において、前記ゾル−ゲル物質は、ＴＭＯＳ １７．５重量部、ＭＴＭＳ ５〜１５重量部及びＧＰＴＭＯＳ ０〜１５重量部を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明では新しい医薬探索技術を確立して、これから出てきた候補群を検証して新しいタンパク質−タンパク質相互作用阻害天然物質を発掘するため、タンパク質−タンパク質相互作用に対するチップベースの天然物スクリーニングシステムを構築した。
【００１８】
本発明の一実施例においては、サイクリンＴ／Ｃｄｋ９の相互作用を分析できるチップベースのシステムを確立して、サイクリンＴ／Ｃｄｋ９阻害剤候補をスクリーニングした。即ち、図５に示したように、ゾル−ゲル物質と混合されたサイクリンＴタンパク質を基板上にスポッティングして、タンパク質チップを作製し、前記タンパク質チップを放線菌培養抽出液、カビ培養抽出液、植物抽出液及びアプタマー等のサイクリンＴ／Ｃｄｋ９の相互作用阻害物質候補及びＣｄｋ９と反応させた後、Ｃｄｋ９抗体及びＣｙ３で標識された二次抗体を順に反応させた後、スキャニングし、シグナルの有無を確認して、シグナルが確認されないスポットに反応させた物質を、阻害物質として確認した。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００２０】
《実施例１：サイクリンＴ遺伝子及びＣＤＫ９遺伝子のクローニング及びサイクリンＴ及びＣＤＫ９の精製》
サイクリンＴは、相同性が大きいタンパク質であり、特に、サイクリンボックスという共通部分が存在し、この部分がＣＤＫ９との結合を左右すると知られており、ヒトサイクリンＴ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＮＭ＿００１２４０）のサイクリンボックスは、２６６個のアミノ酸で形成されて、配列番号１の塩基配列として表した（図１）。
ヒトＣＤＫ９（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＢＣ００１９６８）は、配列番号２で表した。
ＣＤＫ９を増幅するための鋳型として、ヒトｃＤＮＡ ｍｉｘｔｕｒｅを用い、ヒトサイクリンＴ１を増幅するための鋳型としては、ＨＥＫ２９３細胞とＨｅＬａ細胞の１：１混合物を用いた。
【００２１】
ＰＣＲに用いられたプライマーは、下記に示す。
配列番号３：ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＣＡＧＴＡＣＧＡＣＴＣ（ヒトＣＤＫ９フォワードプライマー、ＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅ含む）
配列番号４：ＣＴＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣＧＣＧＣＴＣＡＡＡＣＴＣＣ（ヒトＣＤＫ９リバースプライマー、ＸｈｏＩ ｓｉｔｅ含む）
配列番号５：ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＡ（ヒトサイクリンＴ１フォワードプライマー、ＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅ含む）
配列番号６：ＧＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＣＧＣＡＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡ（ヒトサイクリンＴ１リバースプライマー、ＳａｌＩ ｓｉｔｅ含む）
【００２２】
ヒトＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の遺伝子を増幅した後、Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）にライゲーションしてＴＡクローニングし、大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。形質転換されたコロニーからプラスミドを精製し、電気永動でクローニングされた遺伝子を確認し、シークエンスを行い、塩基配列を確認し、クローニングされた遺伝子をｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）でクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｅｌｌに形質転換させた。
【００２３】
前記製造されたヒトＣＤＫ９遺伝子とヒトサイクリンＴ１遺伝子により形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１を各々培養し、ＩＰＴＧで各遺伝子の発現を誘導した後、追加培養してから、菌体を回収して、タンパク質発現の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図２）。
【００２４】
回収された各々の菌体にＰＭＳＦが含まれているＨｉｓ−Ｔａｇ結合バッファー１０ｍＬを添加して懸濁させて、超音波破砕して、菌体を破った溶液をＨｉｓ ｔａｇ ｒｅｓｉｎに適用させて、ヒトＣＤＫ９遺伝子及びヒトサイクリンＴ１を各々精製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでヒトＣＤＫ９タンパク質及びヒトサイクリンＴ１タンパク質が十分に発現したかを確認した（図３及び図４）。
【００２５】
《実施例２：チップ上でのタンパク質と阻害剤の相互作用確認》
ゾル−ゲルチップで、ＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の相互作用を確認するため、図５に示した方法でタンパク質間の結合をチップ上で確認した。
ヒトサイクリンＴ１及びＣＤＫ９を各々５０ｎｇずつゾル−ゲル物質組成１（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、５％ ＧＰＴＭＯＳ）に混ぜてＡｒｒａｙｅｒで９６−ウェルプレートにスポッティングして固定化した。アフィニティーのない物質がチップに付着することを防止するため、スキムミルクが入っている結合バッファーでブロッキングした後、ＣＤＫ９に結合する抗体のＡｎｔｉ−ＣＤＫ９を１／５００濃度で、常温で１時間反応させた。スキャナーでシグナルを確認するため、ｃｙ３で標識された二次抗体を１／１０００濃度で、常温で１時間反応させた後、スキャンしてシグナルを確認した（図６）。
【００２６】
その結果、図６に示したように、弱いもののＣＤＫ９にＡｎｔｉ−ＣＤＫ９が結合してシグナルが見られることが分かった。
天然物ライブラリーを本格的にスクリーニングする前に４種類の天然物を選定してチップベースのアッセイシステムの条件を確立した。前記結果からＣＤＫ９のシグナルが弱かったため、チップに固定化するヒトサイクリンＴ１とＣＤＫ９の量を５０ｎｇの３倍の１５０ｎｇに増やして、ゾル−ゲル物質組成２（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、１５％ ＧＰＴＭＯＳ）に混ぜて、９６−ウェルプレートに固定化した。
【００２７】
スキムミルクが入っている結合バッファーでブロッキングした後、ＣＤＫ９（５０ｎｇ／ｒｘｎ ｖｏｌ．５０μＬ）を反応させて、洗浄した後、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９を１／５００濃度で、常温で１時間反応させた後、洗浄してｃｙ３で標識された二次抗体を１／１０００濃度で、常温で１時間反応させて、洗浄した後、スキャニングしてシグナルを確認した。
【００２８】
その結果、図７に示したように、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９のみを反応させたウェルでは、ＣＤＫ９スポットのシグナルが確認されたのに対して、ＣＤＫ９とＡｎｔｉ−ＣＤＫ９を反応させたウェルではシグナルが現れなかった。従って、天然物ライブラリースクリーニングの前にＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の結合をチップ上で確認する実験を優先的に実施することにした。
【００２９】
ヒトサイクリンＴ１の１８０ｎｇとＣＤＫ９の１５０ｎｇを各々ゾル−ゲル物質組成１（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、５％ ＧＰＴＭＯＳ）に混ぜて、９６−ウェルプレートにスポッティングした。スキムミルクが入っている結合バッファーでブロッキングした後、ＣＤＫ９（５０ｎｇ／ｒｘｎ ｖｏｌ．５０μＬ）を反応させて、洗浄した後、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９を１／５００濃度で、常温で１時間反応させた後、洗浄してｃｙ３で標識された二次抗体を１／１０００濃度で、常温で１時間反応した後、洗浄してスキャニングでシグナルを確認した。
【００３０】
その結果、図８に示したように、ＣＤＫ９とＡｎｔｉ−ＣＤＫ９、二次抗体を全て反応させた２番ウェルでは何も固定化しない陰性スポットでもシグナルが見られるのに対して、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９、二次抗体を反応させた１番、４番ウェルではシグナルがほとんど見られず、同様の実験を繰り返すと、陽性スポットを除いた全てのスポットでシグナルが見られなかった。
【００３１】
前記二つの実験と先の図４の結果からゾル−ゲル物質の組成がタンパク質に合わなかったため、実験結果が一定に出なかったと判断して、先に適切なゾル−ゲル物質組成を選定することにした。また、陰性スポットでシグナルが出ることからブロッキングが正しくできでいないと考えられ、以後の実験からブロッキングする時間を１時間から２時間に増やした。
【００３２】
《実施例３：ゾル−ゲル物質選定》
タンパク質を固定化してアッセイするのに適切なゾル−ゲル物質を選定するため、実施例２で用いた組成１（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、５％ ＧＰＴＭＯＳ）とポアサイズが組成２−９より大きかったため、大きいタンパク質分子をアッセイするのに良い組成である組成２（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、１５％ ＧＰＴＭＯＳ）の２種類ゾル材料に図９のように、ＣＤＫ９（１５０ｎｇ／ゾル−ゲル物質１１μＬ）とヒトサイクリンＴ１（１８０ｎｇ／ゾル−ゲル物質１１μＬ）、陽性対照群及び陰性対照群を各々固定化した後、実施例２と同様な方法で、抗体を処理した後、スキャニングした。
【００３３】
その結果、図９に示したように、組成２でＣＤＫ９とＡｎｔｉ−ＣＤＫ９がよく結合してシグナルが見られ、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９はヒトサイクリンＴ１には結合しないことを確認した。従って、以後の実施例ではゾル−ゲル物質組成２を利用した。
【００３４】
また、ゾル−ゲルチップにＣＤＫ９を反応させてチップ上でヒトサイクリンＴ１と結合できるかを確認した。図９のようなゾル−ゲルチップをスキムミルクバッファーでブロッキングした後、ＣＤＫ９（６０ｎｇ／ｒｘｎ ｖｏｌ．６０μＬ）を反応させて洗浄した後、ＣＤＫ９に結合する抗体であるＡｎｔｉ−ＣＤＫ９を１／５００濃度で、常温で１時間反応させて、洗浄した後、Ｃｙ３で標識された二次抗体を１／１０００濃度で、常温で１時間反応させて、スキャニングした。
【００３５】
その結果、図１０に示したように、組成１では陰性スポットでもシグナルが見られるが、組成２ではヒトサイクリンＴ１とＣＤＫ９が結合したスポットでシグナルが見られ、またＣＤＫ９を反応させないウェルでヒトサイクリンＴ１にＡｎｔｉ−ＣＤＫ９が結合しないことも確認した。
【００３６】
前記結果から、タンパク質の相互結合を分析するには組成１が適していることを確認し、チップベースの分析システムを介して、チップ上でＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の結合を確認した。
【００３７】
《実施例４：チップベースの分析システムを利用した天然物ライブラリースクリーニング》
実施例２及び３で確立されたタンパク質相互作用に対するチップベースのアッセイシステムを利用して、天然物ライブラリーをスクリーニングした。天然物ライブラリーは韓国生命工学研究院から放線菌培養抽出液２１種、カビ培養抽出液４０種及び植物抽出液１９種を分譲して用いて、放線菌培養抽出液はアセトン：水=１：１溶媒に溶解し、植物抽出液は５ｍｍｇ／ｍＬ濃度で水に溶解した。
【００３８】
一次的に放線菌培養抽出液＃１５、カビ培養抽出液（バッチＡ）＃２５、カビ培養抽出液（バッチＢ）中＃５５、植物抽出液＃４１１を選定して、チップベースのアッセイに適用した。前記天然物抽出液は、１／１００の濃度で１μＬずつ、ヒトサイクリンＴ１とＣＤＫ９（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、１５０ｎｇずつゾル−ゲル物質組成２と混ぜて、１１μＬで準備した後、９６−ウェルプレートに固定化した。
【００３９】
スキムミルクバッファーでブロッキングした後、ＣＤＫ９（６０ｎｇ／ｒｘｎ ｖｏｌ．６０μＬ）を反応させて、洗浄した後、ＣＤＫ９に結合する抗体であるＡｎｔｉ−ＣＤＫ９を１／５００濃度で、常温で１時間反応させて洗浄した後、その上にｃｙ３で標識された二次抗体を１／１０００濃度で、常温で１時間反応させた。
【００４０】
その結果、図１１に示したように、ＣＤＫ９を反応させないウェルでもヒトサイクリンＴ１にシグナルが現れた。しかしながら、これはゾル−ゲルスポットの乾燥時間が長すぎ、その後スキャニングしたために、バックグラウンドがシグナルのように見られたと考えられた。従って、スキャニング時にスポットを乾燥させる時間を一定にして、分析を行うようにした。
【００４１】
《実施例５：チップベースの分析システムのゾル−ゲル物質改良》
ゾル−ゲルの処方（formulation）を変化させて、ＣＤＫ９とサイクリンＴ１の相互作用が最もよく行われる組成を探すため、組成１で三つのシリケートモノマーとバッファーの組成を変化させて、組成１とは異なったポアサイズを有するように新しい組成を製造した。
【００４２】
各々の組成でのタンパク質相互作用を確認するため、まずＢＳＡを各々の組成のゾル−ゲル物質で固定化して、９６ウェルプレートにスポッティングした。５００ｎｇ／μＬのＢＳＡを各組成のゾル−ゲルに混ぜてスポッティングし、シグナルを確認するため、Ｃｙ３−ａｎｔｉ−ＢＳＡを１／５００に希釈して１時間反応させた後、洗浄して、スキャニングした。
【００４３】
その結果、図１２に示したように、元の組成である組成１（２−９）より組成Ｔ、組成３（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、０％ ＧＰＴＭＯＳ、２−９Ｃ）でさらに濃いシグナルを確認し、残りの組成のゾル−ゲルスポットは、ウェル表面で分析途中に落ちたことを確認することができた。
【００４４】
組成３（２−９Ｃ）及び組成１（２−９）を利用してＢＳＡを固定化して、前記と同じ方法で分析を行った後、シグナルを確認した結果、組成１より組成３のシグナルがさらに鮮明であることを確認することができた（図１３）。
【００４５】
《実施例６：チップベースの分析を利用した天然物スクリーニング》
実施例５で確認された組成を利用して、図１４に示したように、天然物ｆｕｌｌスクリーニング用タンパク質−タンパク質阻害分析システムを作製した。選ばれた三つの天然物を基に、再び低密度チップを作製した時、図１５に示したように、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９と二次抗体だけ反応させた場合には、ＣＤＫ９と天然物を固定したスポットだけでシグナルが見られ、ＣＤＫ９、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９と二次抗体を反応させた場合にはＣＤＫ９と天然物、ヒトサイクリンＴ１と天然物を固定化したスポット全部からシグナルが見られたが、シグナルが弱く減少することも観察された。
【００４６】
従って、天然物中、放線菌培養抽出液＃１５、かび培養抽出液（バッチＡ）＃２５、カビ培養抽出液（バッチＢ）＃５５、植物抽出液＃４１１は、ＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の結合に弱く作用していることが分かった。
【００４７】
《実施例７：ＣＤＫ９とサイクリンＴ１の相互作用を阻害する核酸マーカー開発》
本発明のチップベースのシステムがタンパク質相互作用に対する阻害剤開発に適用作用するかを検証するため、アプタマーを作製して、検証を行った。
【００４８】
Ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤＫ９とサイクリンＴ１が結合すると、Ｔａｔタンパク質がサイクリンＴ１のＣ−ターミナルに結合して、ＲＮＡポリメラーゼが結合しながら細胞分裂に対する機構が作用するようになる（図１６）。
【００４９】
ＣｄＫ９と結合する部分であるサイクリンＴのサイクリンボックスに対してＣ−ターミナル部位がない新しいタンパク質を作製し、ＳＥＬＥＸ法でこれに対するＲＮＡアプタマー（aptamer）を開発した。
鋳型：ＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ−Ｎ４０−ＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＴ
【００５０】
４０ｂｐのランダム配列を有した１本鎖を注文作製して、ＰＣＲ後、逆転写して、１０１５のｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙを有するＲＮＡライブラリーを作製した。
【００５１】
タンパク質はよく結合するが、ＤＮＡ及びＲＮＡは結合しないニトロセルロースメンブレン（nitrocellulose membrane）を利用してフィルター結合アッセイ技法を導入してサイクリンＴ１を固定化した。
【００５２】
ＲＮＡライブラリーとターゲットタンパク質であるサイクリンＴを１：１の割合で２時間反応させた後、ニトロセルロースメンブレンに移してフィルタリングし、タンパク質に結合しないＲＮＡ分子を洗浄した。メンブレンでタンパク質−ＲＮＡを溶出させて、ＰＣＩ処理後、エタノール沈殿過程を介してＲＮＡを取得した。前記取得されたＲＮＡをＰＣＲで増幅させ、逆転写して、ＳＥＬＥＸを行う新しいライブラリーを作製した。前記過程を８回繰り返しサイクリンＴに対するアプタマーを取得した（図１７）。
【００５３】
前記アプタマーをＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ後、任意のコロニーを採取してシーケンシングして、アプタマーシーケンス（配列番号７〜１０）を確認して、ｍ−ｆｏｌｄプログラムを利用して、二次構造を確認した。
配列番号７：ＵＵＡＣＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＣＧＵＣＧＣＵＣＣＧＧＧＵＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧ
配列番号８：ＡＣＣＡＴＣＧＣＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＧＡＡＧＴＧ
配列番号９：ＡＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＴＡＡＴＡＴＴＣＣＧＧＣＧＴＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴ
配列番号１０：ＣＡＣＧＣＧＴＴＣＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧ
【００５４】
前記アプタマーは、サイクリンＩ１のＮ−ターミナルの部分に結合して、ＣＤＫ９との相互作用を阻害することによって、ＲＮＡポリメラーゼが結合できないようにして、細胞の増殖と予想した（図１８）。
【００５５】
ゾル−ゲル２−９Ｃ組成を利用して、サイクリンＴ１を固定化させて、アプタマーとの結合の程度を確認した。サイクリンＴ１が固定化されているウェル中に４個のＣｙ３ ｌａｂｅｌｅｄ ａｐｔａｍｅｒを各々２時間ずつ反応させた後、洗浄してスキャニングして、サイクリンＴ１と結合するアプタマーとサイクリンＴ１と結合しないアプタマーを確認した（図１９）。
【００５６】
サイクリンＴ１（１ｍｇ／１ｍＬ）をゾル−ゲル組成３によく混ぜて、９６ウェルプレートにスポッティングして、サイクリンＴ１が固定化されているチップを作製した。各ウェルにアプタマー、ＣＤＫ９、ａｎｔｉ−ＣＤＫ９とＣｙ３−標識二次抗体を順に１時間ずつ反応させた後、洗浄した。
【００５７】
前の結果から、サイクリンＴ１と結合しないアプタマーを反応させたウェルにはゾル−ゲルの中のサイクリンＴ１とＣＤＫ９が結合してシグナルが確認され、サイクリンＴ１と結合したアプタマーを反応させたウェルにはシグナルが確認されなかった。
この結果から、本発明に係るチップベースのタンパク質−タンパク質阻害剤スクリーニングシステムが作用することを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上説明したように、本発明によると、ゾル−ゲル物質を用いて、９６ウェルプレートで簡便にタンパク質チップを作製でき、天然物質ライブラリーから簡単にタンパク質−タンパク質相互作用阻害物質をスクリーニングすることができる。
【００５９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用阻害物質のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、ゾル−ゲル物質とタンパク質が混合されたスポットが固定化されているタンパク質チップを利用して、タンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質−タンパク質相互作用を阻害する低分子阻害剤の開発には多くの問題点があることが知られているが、その重要性のためにタンパク質−タンパク質相互作用を阻害できる低分子物質を開発しようとする試みが継続的に進行し、いくつかの成功例がある（Nature Reviews Drug Discovery, 3:853, 2004）。
【０００３】
新薬開発の方法は、主に特定の分析システムを構築し、これに対して保有している数十〜数百万種の化合物ライブラリーを高速でスクリーンする方法を取っており、このような方法は、化合物の保有量や高速スクリーンシステムの構築等の様々な制約のため、主に多国籍製薬企業等で行われているが、小規模の実験室では適用するには困難であった。さらに従来構築されていなかった天然物ライブラリーのような数万個程度の比較的小さい大きさのライブラリーを利用した新規高速スクリーンシステムを構築するためには、少ない費用で短い時間に概念を立証することが必要である。また学校及び研究所のような中、小規模の実験室では新しい概念の分析システム及びスクリーニングシステムを用いてリード化合物を確保する戦略が必要である。
【０００４】
そのためには、少ないサンプルに適用できるチップベースのスクリーニング（chip-based screening）が適当であり、かつ既に構築された安価な高分子を利用したチップシステムを利用して、新しい新薬探索方法を確立して、オリジナル技術を確保することが新薬開発産業のインフラの向上に寄与すると予想される。
【０００５】
そこで、本発明者等は、実験室ベースの小規模実験でも有用に使用できるチップベースのタンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤をスクリーニングする方法を開発しようと鋭意努力した結果、ゾル−ゲル物質とタンパク質を混合してスポッティングしたタンパク質チップを利用する場合、既存の抗体分析方法を利用して、簡便に阻害剤をスクリーニングできることを確認して、本発明を完成した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、タンパク質−タンパク質相互作用を簡便に分析できるチップベースのタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
【０００７】
本発明は（ａ）ゾル−ゲル物質とタンパク質が混合されたスポットが固定化されているタンパク質チップを作製する工程；（ｂ）前記タンパク質チップと前記チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質を前記結合を阻害する候補物質の存在下において反応させる工程；及び（ｃ）前記チップに固定化されたタンパク質と前記固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質の間の結合を測定して、前記候補物質がない場合のタンパク質−タンパク質相互作用に比べて、タンパク質−タンパク質相互作用が阻害される場合の候補物質をタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質として選定する工程を含むタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。
【０００８】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】サイクリンＴタンパク質の構造の相同性を示した図である。
【図２】組み換えＣＤＫ９及びサイクリンＴのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１での発現を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。
【図３】組み換えヒトＣＤＫ９の発現パターン及び精製過程を確認した図である。
【図４】組み換えヒトサイクリンＴの発現パターン及び精製過程を確認した図である。
【図５】ゾル−ゲルチップでＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の相互作用をタンパク質チップ上で確認する方法を示した模式図である。
【図６】ゾル−ゲルチップでタンパク質間結合を確認した結果を示した図である。
【図７】ゾル−ゲルチップで天然物４つを利用した予備実験の結果を示した図である。
【図８】ゾル−ゲルチップでの分析条件確立のための結果を示した図である。
【図９】ゾル−ゲル物質の組成による分析結果を示した図である。
【図１０】ゾル−ゲル物質の組成による分析結果を示した図である。
【図１１】天然物ライブラリーを利用したＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の相互作用阻害効果を確認した結果を示した図である。
【図１２】ゾル−ゲル物質の組成によるＢＳＡシグナルを確認した結果を示した図である。
【図１３】ゾル−ゲル物質の組成によるＢＳＡシグナルを確認した結果を示した図である。
【図１４】天然物ｆｕｌｌスクリーニング用タンパク質−タンパク質阻害分析システムの作製過程を示した図である。
【図１５】三つの天然物を利用した低密度（low density）チップでのＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の相互作用阻害効果を分析した図である。
【図１６】サイクリンＴ１とＣＤＫ９の相互作用機構を示した模式図である。
【図１７】サイクリンＴ１のアプタマー作製のためＳＥＬＥＸ方法を示した模式図である。
【図１８】サイクリンＴ１アプタマーの作用機構を示した模式図である。
【図１９】ゾル−ゲルチップでのアプタマーとサイクリンＴ１の結合を確認した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１１】
一観点において、本発明は、（ａ）ゾル−ゲル物質とタンパク質が混合されたスポットが固定化されているタンパク質チップを作製する工程；（ｂ）前記タンパク質チップと前記チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質を、前記結合を阻害する候補物質の存在下において反応させる工程；及び（ｃ）前記チップに固定化されたタンパク質と前記固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質の間の結合を測定して、前記候補物質がない場合のタンパク質−タンパク質相互作用に比べて、タンパク質−タンパク質相互作用が阻害される場合の候補物質をタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質として選定する工程を含むタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。
【００１２】
本発明において、前記候補物質は、天然物、化合物及びアプタマーからなる群から選択されることを特徴とし、前記工程（ｃ）におけるタンパク質間の結合は、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質に対する抗体を利用して確認することを特徴とする。
【００１３】
本発明において、前記スポットは、９６ウェルプレートに固定されていることを特徴とする。本発明において、前記タンパク質チップに固定化されたタンパク質は、サイクリンＴ１で、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質はＣＤＫ９であることを特徴とする。
【００１４】
本発明において、前記工程（ｃ）において候補物質をタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質として選定することは、候補物質がチップに固定化されたタンパク質と結合して、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質がタンパク質チップに固定化されたタンパク質と結合できないようにする場合、前記候補物質を阻害物質として選定する。
【００１５】
例えば、サイクリンＴ１は、ＣＤＫ９と相互作用するタンパク質であり、サイクリンＴ１が固定されたタンパク質チップに候補物質とＣＤＫ９を反応させた際に、候補物質がサイクリンＴ１と結合して、ＣＤＫ９がサイクリンＴ１に結合することを抑制する場合、候補物質をサイクリンＴ１とＣＤＫ９の相互作用を阻害する物質として選定でき、前記阻害はＣＤＫ９に対する抗体をタンパク質チップで処理し、Ｃｙ３等の蛍光物質で標識されたＣＤＫ９抗体に対する二次抗体を処理して確認できる。即ち、前記候補物質がない場合におけるＣＤＫ９抗体シグナルに比べて、候補物質を処理した際のＣＤＫ９抗体シグナルが減少する場合、前記候補物質をサイクリンＴ１−ＣＤＫ９相互作用に対する阻害物質として選定することができる。
【００１６】
本発明において、前記ゾル−ゲル物質は、ＴＭＯＳ １７．５重量部、ＭＴＭＳ ５〜１５重量部及びＧＰＴＭＯＳ ０〜１５重量部を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明では新しい医薬探索技術を確立して、これから出てきた候補群を検証して新しいタンパク質−タンパク質相互作用阻害天然物質を発掘するため、タンパク質−タンパク質相互作用に対するチップベースの天然物スクリーニングシステムを構築した。
【００１８】
本発明の一実施例においては、サイクリンＴ／Ｃｄｋ９の相互作用を分析できるチップベースのシステムを確立して、サイクリンＴ／Ｃｄｋ９阻害剤候補をスクリーニングした。即ち、図５に示したように、ゾル−ゲル物質と混合されたサイクリンＴタンパク質を基板上にスポッティングして、タンパク質チップを作製し、前記タンパク質チップを放線菌培養抽出液、カビ培養抽出液、植物抽出液及びアプタマー等のサイクリンＴ／Ｃｄｋ９の相互作用阻害物質候補及びＣｄｋ９と反応させた後、Ｃｄｋ９抗体及びＣｙ３で標識された二次抗体を順に反応させた後、スキャニングし、シグナルの有無を確認して、シグナルが確認されないスポットに反応させた物質を、阻害物質として確認した。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００２０】
《実施例１：サイクリンＴ遺伝子及びＣＤＫ９遺伝子のクローニング及びサイクリンＴ及びＣＤＫ９の精製》
サイクリンＴは、相同性が大きいタンパク質であり、特に、サイクリンボックスという共通部分が存在し、この部分がＣＤＫ９との結合を左右すると知られており、ヒトサイクリンＴ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＮＭ＿００１２４０）のサイクリンボックスは、２６６個のアミノ酸で形成されて、配列番号１の塩基配列として表した（図１）。
ヒトＣＤＫ９（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＢＣ００１９６８）は、配列番号２で表した。
ＣＤＫ９を増幅するための鋳型として、ヒトｃＤＮＡ ｍｉｘｔｕｒｅを用い、ヒトサイクリンＴ１を増幅するための鋳型としては、ＨＥＫ２９３細胞とＨｅＬａ細胞の１：１混合物を用いた。
【００２１】
ＰＣＲに用いられたプライマーは、下記に示す。
配列番号３：ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＣＡＧＴＡＣＧＡＣＴＣ（ヒトＣＤＫ９フォワードプライマー、ＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅ含む）
配列番号４：ＣＴＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣＧＣＧＣＴＣＡＡＡＣＴＣＣ（ヒトＣＤＫ９リバースプライマー、ＸｈｏＩ ｓｉｔｅ含む）
配列番号５：ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＡ（ヒトサイクリンＴ１フォワードプライマー、ＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅ含む）
配列番号６：ＧＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＣＧＣＡＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡ（ヒトサイクリンＴ１リバースプライマー、ＳａｌＩ ｓｉｔｅ含む）
【００２２】
ヒトＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の遺伝子を増幅した後、Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）にライゲーションしてＴＡクローニングし、大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。形質転換されたコロニーからプラスミドを精製し、電気永動でクローニングされた遺伝子を確認し、シークエンスを行い、塩基配列を確認し、クローニングされた遺伝子をｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）でクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｅｌｌに形質転換させた。
【００２３】
前記製造されたヒトＣＤＫ９遺伝子とヒトサイクリンＴ１遺伝子により形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１を各々培養し、ＩＰＴＧで各遺伝子の発現を誘導した後、追加培養してから、菌体を回収して、タンパク質発現の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図２）。
【００２４】
回収された各々の菌体にＰＭＳＦが含まれているＨｉｓ−Ｔａｇ結合バッファー１０ｍＬを添加して懸濁させて、超音波破砕して、菌体を破った溶液をＨｉｓ ｔａｇ ｒｅｓｉｎに適用させて、ヒトＣＤＫ９遺伝子及びヒトサイクリンＴ１を各々精製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでヒトＣＤＫ９タンパク質及びヒトサイクリンＴ１タンパク質が十分に発現したかを確認した（図３及び図４）。
【００２５】
《実施例２：チップ上でのタンパク質と阻害剤の相互作用確認》
ゾル−ゲルチップで、ＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の相互作用を確認するため、図５に示した方法でタンパク質間の結合をチップ上で確認した。
ヒトサイクリンＴ１及びＣＤＫ９を各々５０ｎｇずつゾル−ゲル物質組成１（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、５％ ＧＰＴＭＯＳ）に混ぜてＡｒｒａｙｅｒで９６−ウェルプレートにスポッティングして固定化した。アフィニティーのない物質がチップに付着することを防止するため、スキムミルクが入っている結合バッファーでブロッキングした後、ＣＤＫ９に結合する抗体のＡｎｔｉ−ＣＤＫ９を１／５００濃度で、常温で１時間反応させた。スキャナーでシグナルを確認するため、ｃｙ３で標識された二次抗体を１／１０００濃度で、常温で１時間反応させた後、スキャンしてシグナルを確認した（図６）。
【００２６】
その結果、図６に示したように、弱いもののＣＤＫ９にＡｎｔｉ−ＣＤＫ９が結合してシグナルが見られることが分かった。
天然物ライブラリーを本格的にスクリーニングする前に４種類の天然物を選定してチップベースのアッセイシステムの条件を確立した。前記結果からＣＤＫ９のシグナルが弱かったため、チップに固定化するヒトサイクリンＴ１とＣＤＫ９の量を５０ｎｇの３倍の１５０ｎｇに増やして、ゾル−ゲル物質組成２（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、１５％ ＧＰＴＭＯＳ）に混ぜて、９６−ウェルプレートに固定化した。
【００２７】
スキムミルクが入っている結合バッファーでブロッキングした後、ＣＤＫ９（５０ｎｇ／ｒｘｎ ｖｏｌ．５０μＬ）を反応させて、洗浄した後、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９を１／５００濃度で、常温で１時間反応させた後、洗浄してｃｙ３で標識された二次抗体を１／１０００濃度で、常温で１時間反応させて、洗浄した後、スキャニングしてシグナルを確認した。
【００２８】
その結果、図７に示したように、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９のみを反応させたウェルでは、ＣＤＫ９スポットのシグナルが確認されたのに対して、ＣＤＫ９とＡｎｔｉ−ＣＤＫ９を反応させたウェルではシグナルが現れなかった。従って、天然物ライブラリースクリーニングの前にＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の結合をチップ上で確認する実験を優先的に実施することにした。
【００２９】
ヒトサイクリンＴ１の１８０ｎｇとＣＤＫ９の１５０ｎｇを各々ゾル−ゲル物質組成１（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、５％ ＧＰＴＭＯＳ）に混ぜて、９６−ウェルプレートにスポッティングした。スキムミルクが入っている結合バッファーでブロッキングした後、ＣＤＫ９（５０ｎｇ／ｒｘｎ ｖｏｌ．５０μＬ）を反応させて、洗浄した後、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９を１／５００濃度で、常温で１時間反応させた後、洗浄してｃｙ３で標識された二次抗体を１／１０００濃度で、常温で１時間反応した後、洗浄してスキャニングでシグナルを確認した。
【００３０】
その結果、図８に示したように、ＣＤＫ９とＡｎｔｉ−ＣＤＫ９、二次抗体を全て反応させた２番ウェルでは何も固定化しない陰性スポットでもシグナルが見られるのに対して、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９、二次抗体を反応させた１番、４番ウェルではシグナルがほとんど見られず、同様の実験を繰り返すと、陽性スポットを除いた全てのスポットでシグナルが見られなかった。
【００３１】
前記二つの実験と先の図４の結果からゾル−ゲル物質の組成がタンパク質に合わなかったため、実験結果が一定に出なかったと判断して、先に適切なゾル−ゲル物質組成を選定することにした。また、陰性スポットでシグナルが出ることからブロッキングが正しくできでいないと考えられ、以後の実験からブロッキングする時間を１時間から２時間に増やした。
【００３２】
《実施例３：ゾル−ゲル物質選定》
タンパク質を固定化してアッセイするのに適切なゾル−ゲル物質を選定するため、実施例２で用いた組成１（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、５％ ＧＰＴＭＯＳ）とポアサイズが組成２−９より大きかったため、大きいタンパク質分子をアッセイするのに良い組成である組成２（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、１５％ ＧＰＴＭＯＳ）の２種類ゾル材料に図９のように、ＣＤＫ９（１５０ｎｇ／ゾル−ゲル物質１１μＬ）とヒトサイクリンＴ１（１８０ｎｇ／ゾル−ゲル物質１１μＬ）、陽性対照群及び陰性対照群を各々固定化した後、実施例２と同様な方法で、抗体を処理した後、スキャニングした。
【００３３】
その結果、図９に示したように、組成２でＣＤＫ９とＡｎｔｉ−ＣＤＫ９がよく結合してシグナルが見られ、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９はヒトサイクリンＴ１には結合しないことを確認した。従って、以後の実施例ではゾル−ゲル物質組成２を利用した。
【００３４】
また、ゾル−ゲルチップにＣＤＫ９を反応させてチップ上でヒトサイクリンＴ１と結合できるかを確認した。図９のようなゾル−ゲルチップをスキムミルクバッファーでブロッキングした後、ＣＤＫ９（６０ｎｇ／ｒｘｎ ｖｏｌ．６０μＬ）を反応させて洗浄した後、ＣＤＫ９に結合する抗体であるＡｎｔｉ−ＣＤＫ９を１／５００濃度で、常温で１時間反応させて、洗浄した後、Ｃｙ３で標識された二次抗体を１／１０００濃度で、常温で１時間反応させて、スキャニングした。
【００３５】
その結果、図１０に示したように、組成１では陰性スポットでもシグナルが見られるが、組成２ではヒトサイクリンＴ１とＣＤＫ９が結合したスポットでシグナルが見られ、またＣＤＫ９を反応させないウェルでヒトサイクリンＴ１にＡｎｔｉ−ＣＤＫ９が結合しないことも確認した。
【００３６】
前記結果から、タンパク質の相互結合を分析するには組成１が適していることを確認し、チップベースの分析システムを介して、チップ上でＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の結合を確認した。
【００３７】
《実施例４：チップベースの分析システムを利用した天然物ライブラリースクリーニング》
実施例２及び３で確立されたタンパク質相互作用に対するチップベースのアッセイシステムを利用して、天然物ライブラリーをスクリーニングした。天然物ライブラリーは韓国生命工学研究院から放線菌培養抽出液２１種、カビ培養抽出液４０種及び植物抽出液１９種を分譲して用いて、放線菌培養抽出液はアセトン：水=１：１溶媒に溶解し、植物抽出液は５ｍｍｇ／ｍＬ濃度で水に溶解した。
【００３８】
一次的に放線菌培養抽出液＃１５、カビ培養抽出液（バッチＡ）＃２５、カビ培養抽出液（バッチＢ）中＃５５、植物抽出液＃４１１を選定して、チップベースのアッセイに適用した。前記天然物抽出液は、１／１００の濃度で１μＬずつ、ヒトサイクリンＴ１とＣＤＫ９（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、１５０ｎｇずつゾル−ゲル物質組成２と混ぜて、１１μＬで準備した後、９６−ウェルプレートに固定化した。
【００３９】
スキムミルクバッファーでブロッキングした後、ＣＤＫ９（６０ｎｇ／ｒｘｎ ｖｏｌ．６０μＬ）を反応させて、洗浄した後、ＣＤＫ９に結合する抗体であるＡｎｔｉ−ＣＤＫ９を１／５００濃度で、常温で１時間反応させて洗浄した後、その上にｃｙ３で標識された二次抗体を１／１０００濃度で、常温で１時間反応させた。
【００４０】
その結果、図１１に示したように、ＣＤＫ９を反応させないウェルでもヒトサイクリンＴ１にシグナルが現れた。しかしながら、これはゾル−ゲルスポットの乾燥時間が長すぎ、その後スキャニングしたために、バックグラウンドがシグナルのように見られたと考えられた。従って、スキャニング時にスポットを乾燥させる時間を一定にして、分析を行うようにした。
【００４１】
《実施例５：チップベースの分析システムのゾル−ゲル物質改良》
ゾル−ゲルの処方（formulation）を変化させて、ＣＤＫ９とサイクリンＴ１の相互作用が最もよく行われる組成を探すため、組成１で三つのシリケートモノマーとバッファーの組成を変化させて、組成１とは異なったポアサイズを有するように新しい組成を製造した。
【００４２】
各々の組成でのタンパク質相互作用を確認するため、まずＢＳＡを各々の組成のゾル−ゲル物質で固定化して、９６ウェルプレートにスポッティングした。５００ｎｇ／μＬのＢＳＡを各組成のゾル−ゲルに混ぜてスポッティングし、シグナルを確認するため、Ｃｙ３−ａｎｔｉ−ＢＳＡを１／５００に希釈して１時間反応させた後、洗浄して、スキャニングした。
【００４３】
その結果、図１２に示したように、元の組成である組成１（２−９）より組成Ｔ、組成３（２５．０％ ＴＭＯＳ、７．５％ ＭＴＭＳ、０％ ＧＰＴＭＯＳ、２−９Ｃ）でさらに濃いシグナルを確認し、残りの組成のゾル−ゲルスポットは、ウェル表面で分析途中に落ちたことを確認することができた。
【００４４】
組成３（２−９Ｃ）及び組成１（２−９）を利用してＢＳＡを固定化して、前記と同じ方法で分析を行った後、シグナルを確認した結果、組成１より組成３のシグナルがさらに鮮明であることを確認することができた（図１３）。
【００４５】
《実施例６：チップベースの分析を利用した天然物スクリーニング》
実施例５で確認された組成を利用して、図１４に示したように、天然物ｆｕｌｌスクリーニング用タンパク質−タンパク質阻害分析システムを作製した。選ばれた三つの天然物を基に、再び低密度チップを作製した時、図１５に示したように、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９と二次抗体だけ反応させた場合には、ＣＤＫ９と天然物を固定したスポットだけでシグナルが見られ、ＣＤＫ９、Ａｎｔｉ−ＣＤＫ９と二次抗体を反応させた場合にはＣＤＫ９と天然物、ヒトサイクリンＴ１と天然物を固定化したスポット全部からシグナルが見られたが、シグナルが弱く減少することも観察された。
【００４６】
従って、天然物中、放線菌培養抽出液＃１５、かび培養抽出液（バッチＡ）＃２５、カビ培養抽出液（バッチＢ）＃５５、植物抽出液＃４１１は、ＣＤＫ９とヒトサイクリンＴ１の結合に弱く作用していることが分かった。
【００４７】
《実施例７：ＣＤＫ９とサイクリンＴ１の相互作用を阻害する核酸マーカー開発》
本発明のチップベースのシステムがタンパク質相互作用に対する阻害剤開発に適用作用するかを検証するため、アプタマーを作製して、検証を行った。
【００４８】
Ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤＫ９とサイクリンＴ１が結合すると、Ｔａｔタンパク質がサイクリンＴ１のＣ−ターミナルに結合して、ＲＮＡポリメラーゼが結合しながら細胞分裂に対する機構が作用するようになる（図１６）。
【００４９】
ＣｄＫ９と結合する部分であるサイクリンＴのサイクリンボックスに対してＣ−ターミナル部位がない新しいタンパク質を作製し、ＳＥＬＥＸ法でこれに対するＲＮＡアプタマー（aptamer）を開発した。
鋳型：ＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ−Ｎ４０−ＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＴ
【００５０】
４０ｂｐのランダム配列を有した１本鎖を注文作製して、ＰＣＲ後、逆転写して、１０１５のｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙを有するＲＮＡライブラリーを作製した。
【００５１】
タンパク質はよく結合するが、ＤＮＡ及びＲＮＡは結合しないニトロセルロースメンブレン（nitrocellulose membrane）を利用してフィルター結合アッセイ技法を導入してサイクリンＴ１を固定化した。
【００５２】
ＲＮＡライブラリーとターゲットタンパク質であるサイクリンＴを１：１の割合で２時間反応させた後、ニトロセルロースメンブレンに移してフィルタリングし、タンパク質に結合しないＲＮＡ分子を洗浄した。メンブレンでタンパク質−ＲＮＡを溶出させて、ＰＣＩ処理後、エタノール沈殿過程を介してＲＮＡを取得した。前記取得されたＲＮＡをＰＣＲで増幅させ、逆転写して、ＳＥＬＥＸを行う新しいライブラリーを作製した。前記過程を８回繰り返しサイクリンＴに対するアプタマーを取得した（図１７）。
【００５３】
前記アプタマーをＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ後、任意のコロニーを採取してシーケンシングして、アプタマーシーケンス（配列番号７〜１０）を確認して、ｍ−ｆｏｌｄプログラムを利用して、二次構造を確認した。
配列番号７：ＵＵＡＣＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＣＧＵＣＧＣＵＣＣＧＧＧＵＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧ
配列番号８：ＡＣＣＡＴＣＧＣＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＧＡＡＧＴＧ
配列番号９：ＡＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＴＡＡＴＡＴＴＣＣＧＧＣＧＴＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴ
配列番号１０：ＣＡＣＧＣＧＴＴＣＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧ
【００５４】
前記アプタマーは、サイクリンＩ１のＮ−ターミナルの部分に結合して、ＣＤＫ９との相互作用を阻害することによって、ＲＮＡポリメラーゼが結合できないようにして、細胞の増殖と予想した（図１８）。
【００５５】
ゾル−ゲル２−９Ｃ組成を利用して、サイクリンＴ１を固定化させて、アプタマーとの結合の程度を確認した。サイクリンＴ１が固定化されているウェル中に４個のＣｙ３ ｌａｂｅｌｅｄ ａｐｔａｍｅｒを各々２時間ずつ反応させた後、洗浄してスキャニングして、サイクリンＴ１と結合するアプタマーとサイクリンＴ１と結合しないアプタマーを確認した（図１９）。
【００５６】
サイクリンＴ１（１ｍｇ／１ｍＬ）をゾル−ゲル組成３によく混ぜて、９６ウェルプレートにスポッティングして、サイクリンＴ１が固定化されているチップを作製した。各ウェルにアプタマー、ＣＤＫ９、ａｎｔｉ−ＣＤＫ９とＣｙ３−標識二次抗体を順に１時間ずつ反応させた後、洗浄した。
【００５７】
前の結果から、サイクリンＴ１と結合しないアプタマーを反応させたウェルにはゾル−ゲルの中のサイクリンＴ１とＣＤＫ９が結合してシグナルが確認され、サイクリンＴ１と結合したアプタマーを反応させたウェルにはシグナルが確認されなかった。
この結果から、本発明に係るチップベースのタンパク質−タンパク質阻害剤スクリーニングシステムが作用することを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上説明したように、本発明によると、ゾル−ゲル物質を用いて、９６ウェルプレートで簡便にタンパク質チップを作製でき、天然物質ライブラリーから簡単にタンパク質−タンパク質相互作用阻害物質をスクリーニングすることができる。
【００５９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ゾル−ゲル物質とタンパク質とが混合されたスポットが固定化されているタンパク質チップを作製する工程；
（ｂ）前記タンパク質チップと、前記チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質とを、前記結合を阻害する候補物質の存在下において反応させる工程；及び
（ｃ）前記チップに固定化されたタンパク質と、前記固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質との間の結合を測定して、前記候補物質がない場合のタンパク質−タンパク質相互作用に比べて、タンパク質−タンパク質相互作用が阻害される場合の候補物質をタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質として選定する工程。
【請求項２】
前記候補物質は、天然物、化合物及びアプタマーからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｃ）におけるタンパク質間の結合は、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質に対する抗体を利用して確認することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記スポットは、９６ウェルプレートに固定されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質チップに固定化されたタンパク質は、サイクリンＴ１で、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質はＣＤＫ９であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ゾル−ゲル物質は、ＴＭＯＳ １７．５重量部、ＭＴＭＳ ５〜１５重量部及びＧＰＴＭＯＳ ０〜１５重量部を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１】
以下の工程を含むタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法：
（ａ）ゾル−ゲル物質とタンパク質とが混合されたスポットが固定化されているタンパク質チップを作製する工程；
（ｂ）前記タンパク質チップと、前記チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質とを、前記結合を阻害する候補物質の存在下において反応させる工程；及び
（ｃ）前記チップに固定化されたタンパク質と、前記固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質との間の結合を測定して、前記候補物質がない場合のタンパク質−タンパク質相互作用に比べて、タンパク質−タンパク質相互作用が阻害される場合の候補物質をタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する物質として選定する工程。
【請求項２】
前記候補物質は、天然物、化合物及びアプタマーからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｃ）におけるタンパク質間の結合は、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質に対する抗体を利用して確認することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記スポットは、９６ウェルプレートに固定されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質チップに固定化されたタンパク質は、サイクリンＴ１で、タンパク質チップに固定化されたタンパク質に結合能を有するタンパク質はＣＤＫ９であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ゾル−ゲル物質は、ＴＭＯＳ １７．５重量部、ＭＴＭＳ ５〜１５重量部及びＧＰＴＭＯＳ ０〜１５重量部を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２０１２−５２８３２３（Ｐ２０１２−５２８３２３Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１２９７６（Ｐ２０１２−５１２９７６）
【出願日】平成２２年５月２８日（２０１０．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３３９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３７９０３
【国際公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【出願人】（５０８２９０１２７）トングク ユニバーシティー インダストリー−アカデミック コーオペレイション ファウンデーション (4)
【氏名又は名称原語表記】ＤＯＮＧＧＵＫ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ−ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】２６，Ｐｉｌ−ｄｏｎｇ ３−ｇａ，Ｊｕｎｇ−ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ １００−７１５，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２８日（２０１０．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３３９３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３７９０３
【国際公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【出願人】（５０８２９０１２７）トングク ユニバーシティー インダストリー−アカデミック コーオペレイション ファウンデーション (4)
【氏名又は名称原語表記】ＤＯＮＧＧＵＫ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ−ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】２６，Ｐｉｌ−ｄｏｎｇ ３−ｇａ，Ｊｕｎｇ−ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ １００−７１５，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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