異なる個体の核酸を含む生体試料から遺伝子型を決定する方法
【課題】異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定する方法として、前もって決められた配列とそれに相同の配列のコピー数の決定に適した方法を提供する。
【解決手段】生体試料の部分量として濃度が異なる少なくとも２つの部分量を用いて、それぞれ少なくとも１つの増幅反応を行う。続いてこれらの少なくとも２つの部分量のいずれに対しても得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定し、互いに比較する。そして１つの特定の部分量に対して得られた増幅生成物、および／またはすべての部分量に対して得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションする。
【解決手段】生体試料の部分量として濃度が異なる少なくとも２つの部分量を用いて、それぞれ少なくとも１つの増幅反応を行う。続いてこれらの少なくとも２つの部分量のいずれに対しても得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定し、互いに比較する。そして１つの特定の部分量に対して得られた増幅生成物、および／またはすべての部分量に対して得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定する方法、特にはあらかじめ決められた配列のコピー数を決定する方法に関する。本発明はまた、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料から個体の遺伝子型を決定する方法、例えば個別の遺伝子または遺伝子断片といった前もって決められた配列の有無を証明し、または特定の核酸を定量するという方法は、多くの技術分野で用いられている。例を挙げるだけでも、法医学、遺伝子工学例えばクローニングの分野、または医学的診断への応用が知られている。
【０００３】
１つまたは複数の個体の遺伝子型をキャラクタリゼーションするため、犯罪学、法医学、父子関係や血縁関係の調査にしばしば用いられる技術は、遺伝子の指紋の構築である。遺伝子指紋の構築のためには、今日特に次の２つの方法が用いられる。その１つはＲＦＬＰ法（制限酵素断片長多型）であり、もう１つはＶＮＴＲ類型化法（配列反復回数多型）である。これら２つの方法では、まず、例えば血液、唾液、毛根のある毛髪、精液または膣分泌液を含む微量生体物質から、ＤＮＡを分離する。ＲＦＬＰ法の場合は、生体試料からＤＮＡを分離した後、制限酵素を用いてそのＤＮＡを加水分解し、鎖長の異なる多数のＤＮＡ断片とする。その後各ＤＮＡ断片は、寒天ゲル上でその鎖長に従って分離される。続いて公知のサザンブロット法により、各ＤＮＡ断片を寒天ゲルからナイロン膜状に移し、膜上に固定する。次にこのナイロン膜を、蛍光標識された特異的プローブとハイブリダイゼーションさせ、特定のＤＮＡ断片の存在を証明する。続いて特異的プローブとハイブリダイゼーションされたＤＮＡ断片を、例えば酵素反応によって可視化して、遺伝子指紋と呼ばれるバンドパターンを得る。例えば参照試料の対応するパターンと比較することにより、各バンドの相対的位置から、その個体の遺伝子型を逆推論することができる。しかしＲＦＬＰ法を行うには非常に大量のＤＮＡが必要とし、この方法は今のところ、生きている人の父子関係または血縁関係の調査に用いられるに過ぎない。十分な量のＤＮＡを入手できるのは、そのような用途に限られるからである。しかし暴力犯罪の解明といった法医学的方法の場合、極めて小量のＤＮＡしか入手できない場合が多く、ＲＦＬＰ法は適さない。またＲＦＬＰ法が証言能力を持つのは、その生体出発試料が１つの個体のＤＮＡだけを含む場合に限られる。
【０００４】
ＶＮＴＲ類型化法の場合まず、ゲノムの非コード化領域から選択されたＤＮＡ領域を、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、ドイツ語でPolymerasekettenreaktion）によって複製した後、増幅されたＤＮＡ断片を、例えばポリアクリルアミドゲル上で鎖長に従って分離し、続いて可視化する。こうして得られた長いパターンを、対応する参照試料から得られたバンドパターンと比較することによって、参照試料ドナーと、生体試料中にある核酸の持ち主個体との同一性または非同一性を、ある程度の確率をもって推論することができる。しかしこの方法の欠点は、この方法は、特にポリアクリルアミドゲル上でＤＮＡ断片を分離するため、比較的時間がかかることである。またこの方法が証言能力ある結果が得られるのは、調査される生体試料中に、ただただ１つの個体のＤＮＡが含まれる場合に限られる。しかしこの生体出発試料がさまざまな個体の核酸を含む場合は、ＲＦＬＰ法と同じくＶＮＴＲ法も役に立たなくなる。
【０００５】
分子生物学的診断でも、個体の遺伝子型をキャラクタリゼーションする方法、特に配列を定量する方法、あるいは核酸配列のコピー数を定量的に決定する方法は、重要性を増すばかりである。一部に重いケースがある疾病の多数は、ゲノム中の核酸配列のコピー数が通常より偏差を持つことに原因するので、特定の染色体または特定の遺伝子断片のコピー数を決定することにより、該当する疾病を、すでに成長の初期の段階で信頼性をもって診断することができる。
【０００６】
一部に重いケースがある異常であって、染色体全体のコピー数の増加に原因を求められるものの例は、１８番トリソミー（エドワード症候群）、１３番トリソミー（Ｐａｔａｕ症候群）、２１番トリソミー（ダウン症候群）である。これらの疾病はいずれの場合も、対応する１８番、１３番、２１番染色体の１細胞あたりコピー数は３である。それに対して健康な個体は、１細胞あたり前記染色体を２コピー持つ。３つのケースすべてにおいて、該当染色体のコピー数の増加が、非常に重い成長障害の原因となっている。２１番トリソミーのキャリヤはその成長をドラスチックに阻害され、一部に重い奇形を生じる。また１８番トリソミーと１３番トリソミーのキャリヤは、多くの場合生後１年以内に死亡する。
【０００７】
染色体全体のコピー数増加に原因を求められる疾病だけでなく、遺伝子または遺伝子断片のコピー数変化による疾病も、多数知られている。例を挙げるだけでも、この関連ではハンチントン病、進行性の神経変性疾病であって、精神的および身体的能力の衰弱が進んだ場合のアブノーマルで不随意な運動を特徴とするものが挙げられる。
【０００８】
生体試料中の配列コピーを定量する方法が必要なため、そのための方法がこれまでも多数提案された。
【０００９】
核酸配列の有無について証言能力があり、かつ方法手順に応じて該当核酸配列の１細胞あたりはコピー数を、条件から逆推論できる基本的定量方法は、いわゆるＦＩＳＨ法（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）である。この方法の場合、調査される生体試料を、相応の前処理の後、１つまたは複数のそれぞれ異なる蛍光色素で標識されたプローブとともに、次のような条件でインキュベートする。すなわち、プローブがそれと相同な生体試料内配列とハイブリダイゼーションされるのが、可能となるような条件である。ハイブリダイゼーション後に試料を洗滌し、不要なハイブリダイゼーション信号を消去する。次に標本の蛍光信号を蛍光顕微鏡で評価する。存在する蛍光信号はいずれも、対応する蛍光マーカーを施されたプローブに対応する配列の存在を表示している。この場合蛍光の強さから生体試料中の配列の個数を、条件から逆推論することができる。前記の方法の欠点は、誤った結果につながる望ましくないクロスハイブリダイゼーションを、完全には除外できないことである。それだけでなくこの方法は比較的高価であるが、それは１つには、どうしても蛍光色素を用いる必要があるからであり、もう１つには、蛍光顕微鏡のような複雑な装置を必要とするからである。またこの方法の証言能力は、使用されるプローブのクォーリティに大きく依存する。信頼性ある結果が得られるのは、プローブが、該当箇所において９０％以上の効率でハイブリダイゼーションされ、その結果、ハイブリダイゼーションされずに残ってもはや検出されないのは、ターゲット配列の１０％だけとなる場合だけである。また異なる個体の核酸を含む生体試料が用いられる場合は、この方法からは証言能力ある結果は得られない。
【００１０】
蛍光に基づくもう１つの方法は、ＣＧＨ解析（比較ゲノムハイブリダイゼーション）である。この方法の場合、解析される試料の核酸がすべて、色素１で標識される。参照試料から同量の核酸が、色素２で標識される。これら２つの反応投入物は、スプレッドされた中期核型の上でいっしょにハイブリダイゼーションされ、その際、両者の反応投入物に含まれる配列は、スプレッドされた染色体における結合箇所をめぐって競合する。ほぼすべてのハイブリダイゼーション箇所で、色素１の色素２に対する比は１：１に設定される。解析される試料が１つの領域に含むコピーが多くなると（参照試料の通常のコピー数より多くなる）、色素１はそのハイブリダイゼーション箇所で強くなる。解析される試料中に欠失がある場合、このハイブリダイゼーション箇所には色素２だけが認められる。この参照測定によれば、解析される試料中の配列の頻度について相対的な言明が得られる。この方法は手間と費用がかかる。必要な技術機器を比重に正確に設定および／または校正しなければならないからである。異なる標識のため２つの色素が必要とされ、そしてこの実験の標準化は時間もかかるし困難である。それに加えて、様々に異なる個体の核酸を含む生体試料が用いられる場合、この方法からは評価可能な結果が得られない。
【００１１】
核酸配列を定量するもう１つの公知の方法は、リアルタイムＰＣＲ法である。この方法の場合、例えば蛍光標識されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、サイクル数に応じて蛍光信号が増加するのを観察する。蛍光信号が背景蛍光からいちじるしく浮き上がり、ＰＣＲ生成物形成が指数関数的に生じる時点に、しきい値ＰＣＲサイクル（Threshold‐Cycleともいう）を割り当てる。この時点は、増殖されるＤＮＡ配列の初期コピー数と相関する。このようにしてＤＮＡ試料をＤＮＡ希釈シリーズと比較して、相対定量を行う。しかしこの方法の欠点は、出発材料の量を任意に小さくできないことである。なぜならば、出発材料として出発分子が少なくて、例えば１０〜１００コピーなら、増幅が指数関数的であるため、推計学上の誤差が非常に大きくなって、定量的な言明はできなくなる。それだけでなくこの方法は、蛍光強度測定のために複雑で高価な装置を必要とする。また様々に異なる個体の核酸を含む生体試料を用いる場合、この方法は機能できない。
【００１２】
前記の方法すべては、蛍光色素の使用に基づくものであり、蛍光強度を決定するため高価な装置を必要とする。また少なくともある程度信頼性ある結果を得るには、そのため最小限必要な量の出発材料を使わなければならない。さらには異なる個体の核酸を含む生体試料から、個体の遺伝子型を決定するには、前記の方法はいずれも適していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって本発明の課題は、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定する方法として、前もって決められた配列とそれに相同の配列のコピー数の決定、例えば生体試料内の対立遺伝子の絶対個数または相対個数の決定に適している方法を提供することである。またこの方法は、単純かつ安価に実行できて、特には、例えば法医学的試料に含まれるもののように出発試料が小量であっても、信頼性ある結果が得られるものとする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に係る異なる個体の核酸を含む生体試料から遺伝子型を決定する方法は、
ａ）それぞれ異なる濃度の前記生体試料を含む当該生体試料の部分量を少なくとも２つ作成する、
ｂ）前記生体試料から手順ａ）で作成された部分量のいずれについても、それぞれ少なくとも１つの増幅反応を行うが、この場合、当該少なくとも１つの増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つに含有される１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものであり、
ｃ）前記少なくとも２つの部分量に対し、手順ｂ）によるそれぞれ少なくとも１つの増幅反応により得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定して、そこで得られた数を比較する、
ｄ）前記少なくとも２つの部分量のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数として手順ｃ）で決定された個数が等しい場合：手順ａ）で作成された部分量とはそれぞれ異なる濃度を持つ生体試料を少なくとももう１つ作成し、そして手順ｂ）およびｃ）、そして場合によってはｄ）を繰り返すが、この繰り返しは、手順ｃ）において少なくとも１つの部分量に対し、それぞれ異なる増幅生成物がそのほかの部分量に対して異なる個数得られるまで行う、
ｅ）前記少なくとも１つの部分量に対して、そのほかの部分量に対するのと異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が、前記少なくとも１つの増幅反応で得られた場合、当該少なくとも１つの部分量によって得られた増幅性生成物をキャラクタリゼーションし、および／または、そのほかの部分量に対するのとは異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が得られた前記少なくとも１つの部分量に対してのみならず、そのほかの部分量に対しても、得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションする、
という各手順を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定する方法として、前もって決められた配列とそれに相同の配列のコピー数の決定、例えば生体試料内の対立遺伝子の絶対個数または相対個数の決定に適している方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明はこの課題を次のような方法によって解決する。それは、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の固体の遺伝子型を決定する方法、特には、前もって決められた配列のコピー数を決定する方法であって、次の手順を含む。
ａ）それぞれ異なる濃度の前記生体試料を含む当該生体試料の部分量を少なくとも２つ作成する。
ｂ）前記生体試料から手順ａ）で作成された部分量のいずれについても、それぞれ少なくとも１つの増幅反応を行う。この場合、当該少なくとも１つの増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つに含有される１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものである。
ｃ）前記少なくとも２つの部分量に対し、手順ｂ）によるそれぞれ少なくとも１つの増幅反応により得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定して、そこで得られた数を比較する。
ｄ）前記少なくとも２つの部分量のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数として手順ｃ）で決定された個数が等しい場合、手順ａ）で作成された部分量とはそれぞれ異なる濃度を持つ生体試料を少なくとももう１つ作成する。そして手順ｂ）およびｃ）、そして場合によってはｄ）を繰り返すが、この繰り返しは、手順ｃ）において少なくとも１つの部分量に対し、それぞれ異なる増幅生成物がそのほかの部分量に対して異なる個数得られるまで行う。
ｅ）前記少なくとも１つの部分量に対して、そのほかの部分量に対するのと異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が、前記少なくとも１つの増幅反応で得られた場合、当該少なくとも１つの部分量によって得られた増幅性生成物をキャラクタリゼーションし、および／または、そのほかの部分量に対するのとは異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が得られた前記少なくとも１つの部分量に対してのみならず、そのほかの部分量に対しても、得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションする。
【００１７】
生体試料の濃度がそれぞれ異なる少なくとも２つの生体試料部分量を、本発明の手順ａ）によって作成するが、これは、専門家にこの目的で知られているいずれの方法でも行うことができる。例えば、少なくとも２つの部分量を作成するための生体試料から、例えば少なくとも２つの部分量を採取して、次のこれらの部分量を、互いに異なる希釈率で希釈する。同じ試料から２つの部分量を採取して、一方の試料を濃縮することも、同様に可能である。それに対して他方の部分量は、希釈しないでそのままとするか、あるいは希釈する。生体試料の濃度がそれぞれ異なる生体試料部分量を少なくとも２つ作成する畝法であれば、そのほかあらゆる方法を手順ａ）に使用できる。
【００１８】
手順ａ）で少なくとも２つの部分量を採取するという最初に説明したケースで、次にこれら部分量を互いに異なる希釈率で希釈する場合、本発明による方法は例えば下記の手順を含む。
ａ）前記生体試料の１つの部分量を作成する。
ｂ）前記生体試料の部分量を用いて少なくとも１つの増幅反応を行うが、その際、当該少なくとも１つの増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つに含有される１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものである。
ｃ）手順ｂ）の少なくとも１つの増幅反応のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定する。
ｄ）前記生体試料のもう１つの部分量を作成し、当該生体試料の当該もう１つの部分量を希釈し、そして当該希釈された試料を用いて、手順ｂ）と同じ条件下で少なくとも１つの増幅反応を行う。
ｅ）手順ｄ）の少なくとも１つの増幅反応のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定する。
ｆ）手順ｃ）で決定された様々に異なる増幅生成物の個数を、手順ｅ）で決定された様々に異なる増幅生成物の個数と比較する。
ｇ）手順ｃ）で決定された個数が、手順ｅ）で決定された個数に等しい場合、当該生体試料の希釈率を高くして手順ｄ）〜ｆ）を繰り返し、この繰り返しは、手順ｅ）で得られる様々に異なる増幅生成物の個数が、手順ｃ）におけるよりも小さくなるまで行う。
ｈ）手順ｅ）で得られたさそれぞれ異なる増幅生成物の個数が手順ｃ）におけるよりも小さくなる希釈率を用いて、手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応の際にではなく手順ｂ）による少なくとも１つの増幅反応の際に得られた増幅生成物を、キャラクタリゼーションする。および／または、手順ｅ）で得られたそれぞれ異なる増幅生成物が手順ｃ）におけるよりも小さくなる希釈率を用いて、手順ｂ）による少なくとも１つの増幅反応の際だけでなく手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応の際にも得られた増幅生成物を、キャラクタリゼーションする。
【００１９】
本発明にいう１つまたは複数の個体の遺伝子型の決定とは、１つの個体の前もって決められた少なくとも１つの配列について、その有無、コピー数、または核酸配列をキャラクタリゼーションすること、特には前もって決められた配列、例えばゲノム、遺伝子または遺伝子断片の前もって決められた配列の絶対個数または相対個数を決定すること、および／または前もって決められた配列の有無を決定することをいう。
【００２０】
また本発明にいう異なる個体という概念は、―人間の場合―異なる人物だけでなく、１人の人物の様々に異なる細胞タイプ、すなわち互いに遺伝子タイプが異なる細胞タイプをもいう。その例は遺伝子モザイクまたはキメラ、すなわち１人の人物の遺伝子タイプがそれぞれ異なる細胞であって、これは、異なる遺伝子型を混合あるいは交換して初めて形成されるもの（キメラ）、または１つの個体内に生じるもの（遺伝子モザイク）である。遺伝子モザイクの例はガン細胞であって、ＬＯＨ（“異型接合性の消失”）によって生じる。
【００２１】
また本発明にいう相同配列という概念は、ヌクレオチド配列の相互間類似性が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは９０％、さらに特に好ましくは少なくとも９５％である配列をいう。それに対して非相同配列は、相互間の配列類似性が相応に小さい配列をいう。
【００２２】
さらには本発明の場合、生体試料中の前もって決められた配列の個数を相対的に定量決定するとは、１つの生体試料が、前もって決められた配列のコピーを、参照試料よりも少なく含むか、等しく含むか、多く含むかを、決定することをいう。そして試料中の前もって決められた配列の個数を絶対的に定量決定するとは、前もって決められた配列が生体試料中に含まれている具体的個数を決定することをいう。
【００２３】
生体試料から１つの個体の遺伝子型を決定する方法として、従来の技術から知られているものとは異なり、本発明による方法は、１つの個体のＤＮＡを含む生体試料に適するだけでなく、少なくとも２つの異なる個体の核酸を含む生体試料にも適する。本発明はこれを次のようにして達成する。すなわち、まず希釈されていない生体試料の１つの部分量を用いて、少なくとも１つの増幅反応を行う。この増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つが包含する１つの配列、または少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されているものとする。そしてこの少なくとも１つの増幅反応によって得られた、それぞれ異なる増幅生成物の個数を、生体試料の希釈された部分量を用いて同条件下で行われた増幅生成物であって、かつ少なくとも１つの増幅反応で得られた増幅生成物の個数と比較する。この場合の希釈は、希釈された部分量に対する増幅反応においては、生体試料の希釈されない部分量を用いた場合よりも、得られる増幅生成物が少なくなるように行う。したがって本発明による方法の原理は、理論的に可能な増幅生成物の少なくとも一部が得られなくなるまで、異なる個体の核酸を含む生体試料の部分量を希釈することに基づく。この場合、“消失する”増幅生成物は、通常は生体試料中にごくわずかの濃度で存在するＤＮＡの増幅生成物である。異種遺伝子ＤＮＡ混合物、例えば異なる個体の核酸を含む試料の当該混合物中には、各個体の核酸の配列が、異なるコピー数存在する。この場合、各個体の核酸は、それぞれ異なる量が生体試料中に存在する。ＰＣＲは各ターゲット配列を指数関数的に増幅するので、上記の分布の量的不均一性が非常に強められ、１つの個体にわずかな濃度で存在するＤＮＡのターゲット配列、すなわち増幅反応で用いられたプライマーによって増幅されるべき配列は、他方の個体におけるより高い濃度のＤＮＡの対応する配列と比較して、存在するのは非常にわずかであるため、このターゲット配列はもはや検出できない。これは、“アリール・ドロップアウト”と呼ばれる効果、すなわちただ１つの個体のＤＮＡを含む生体試料中で、さまざまな対立遺伝子の１つが増幅される効果と同様である。本発明は、個別細胞に対する実験で得られた驚くべき認識、すなわちこのドロップアウト過程は非常に急激に発生するという認識に基づく。
【００２４】
前記の原理と関連に基づいて、生体試料の希釈されない部分量によって得られた増幅生成物の個数を、生体試料の相応に希釈された部分量によって得られた増幅生成物の個数と比較することによって、それぞれの増幅生成物を、生体出発試料中の核酸が含まれているそれぞれの個体に割り当てることができる。ただしこの場合の希釈率は、希釈された試料によって得られた増幅生成物が、希釈されない試料による増幅生成物よりも少なくなるような値とする。一方では、希釈されない試料だけでなく、希釈された試料によっても得られた増幅生成物は、生体試料中に含まれている核酸の量が多い方の個体に割り当てられる。他方では、希釈されない生体試料によって得られた増幅生成物であっても、希釈された料によってはもはや得られない増幅生成物は、生体試料内に存在するＤＮＡ量が少ない方の個体に割り当てられる。このようにして生体試料のそれぞれの個体に割り当てられた増幅生成物をさらにキャラクタリゼーションすることによって、それぞれ異なる個体の遺伝子タイプを推論することができる。
【００２５】
これを１つの仮想上の実験によって詳しく説明しよう。ある犯行現場で微量の生体試料が得られ、この生体試料は（当初はわからないことであるが）２つの異なる個体の核酸、すなわち犠牲者の核酸と犯人の核酸とを含む。この場合（これも当初はわからないことであるが）生体試料中にある犠牲者の核酸は、犯人の核酸よりも量が多い。ここで１つのプライマー対を用いるＰＣＲを行い、このＰＣＲは、例えば１８番染色体に含まれる正確に１つの核酸配列を増幅するために適合されているものとする。健康な人間は１８番染色体を２つ持つので、１８番染色体の異型接合性キャリヤに対しては、正確に２つの増幅生成物が期待される。犠牲者も犯人も、それぞれ１８番染色体に対して異型接合性がある場合、上記の生体試料の部分量を用いて行われた増幅反応の場合、増幅生成物の理論的に最大可能な個数は、４つの増幅生成物である。この場合、犠牲者の２つの対立因子に対して２つの増幅生成物、犯人の２つの対立因子に対して２つの増幅生成物が含まれる。生体試料の１つの部分量をここで連続的に希釈すると、ある特定の希釈率からは、犠牲者のＤＮＡに対する増幅生成物だけが得られるが、犯人のＤＮＡに対する増幅生成物が得られなくなるという現象が生じる。この特定の希釈率とは、希釈された生体試料中の犯人の核酸の濃度が、ある特定の最小限濃度を下回る希釈率である。これを根拠に、生体試料のこのように希釈された部分量を含む増幅生成物、例えば鎖長１２０および１３０ｂｐの当該各増幅生成物を、生体試料中に含まれているＤＮＡの量が多い方の個体に、割り当てることができる。これに対して、たしかに生体試料の希釈されない部分量による増幅反応によって得られたものであるが、生体試料の希釈された部分量による増幅反応によっては得られなかった増幅生成物、例えば鎖長１２５および１３５ｂｐの各増幅生成物は、生体試料中に含まれているＤＮＡの量が少ない方の個体に割り当てられる。個々の増幅生成物をさらにキャラクタリゼーションすることによって、ここで両者の個体の遺伝子型を推論することができる。例えば個々の増幅生成物を、犠牲者の細胞を含む参照試料によるＰＣＲから得られた増幅生成物と比較して、両者ＤＮＡ試料のいずれが犠牲者に由来するか、正確に割り当てることができる。犠牲者の参照試料を用いて、例えば鎖長１２０および１３０ｂｐの各ＰＣＲ生成物が得られる場合、犯行現場で発見された生体試料中に、少なくとも２つの異なる個体のＤＮＡが存在し、少なくともその一方のＤＮＡが犠牲者に由来することを、上記の実験からある程度の確率をもって推論することができる。さらには、生体試料中で濃度の高い方のＤＮＡは犠牲者のものとすることができ、増幅反応の際に鎖長１２５および１３５ｂｐという２つの増幅生成物を生じたＤＮＡは、犠牲者ではなく犯人に、または犯行に関与しない第三者に割り当てられることが、この実験から推論できる。これにより、犯人または関与しない第三者のものとして得られた増幅生成物を、的を絞ってさらに解析し、例えばデータベースに記憶されているデータと比較することにより、犯人同定の推論が可能となる。
【００２６】
本発明のもう１つの利点は、従来の技術による方法ではどうしても必要だった、ＰＣＲ生成物の絶対的な蛍光強度の決定を、省略できることである。むしろ本発明による方法の場合、それぞれ少なくとも１つの増幅反応によって得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数だけを決定し、それを互いに比較する。その限りにおいて、本発明による方法では、蛍光標識されたプライマーの使用はかならずしも必要ではない。しかしそのようなプライマーを、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数検出に用いる場合、得られたそして蛍光標識された増幅生成物の絶対的蛍光強度を、手間をかけて決定する必要はない。定められたしきい値（例えば係数１０または１００）を超える蛍光が、使用された蛍光係数に対応する波長で存在するか、存在しないかを評価すればそれでよい。したがって本発明の方法は、蛍光を定量的に検出するための高価な装置を用いないで、簡単かつ安価に行うことができる。
【００２７】
基本的に本発明の方法は、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定するのに適する。この場合異なる個体の具体的個数のいかんに依存しない。しかし特に良好な結果が得られるのは、生体試料が、少なくとも２つ、しかし１０個未満の異なる個体の核酸を含む場合である。特に好ましくは、この生体試料は、少なくとも２つ、しかし５つ未満、さらに好ましくは２つまたは３つ、最も好ましくは正確に２つの異なる個体の核酸を含むものとする。
【００２８】
個々の核酸相互間の量的相違または濃度上の相違の点でも、本発明は制限を受けない。しかし好ましくは、生体試料に含まれる個々の個体の核酸相互間の濃度上の相違は１：１０００〜１：１、特に好ましくは１：５００〜１：５、さらに好ましくは１：１００〜１：１０とする。
【００２９】
すでに説明したように、本発明による方法は、特に法医学的調査、例えば犯罪捜査に関連する法医学的調査に適する。しかし本発明の方法はそれだけに限定されるものではなく、少なくとも２つの異なる個体の核酸を含む生体試料であれば、どのような種類のものにでも用いることができる。
【００３０】
本発明による方法のもう１つの特別な用途は、例えば、母性すなわち母体血液や胎児細胞を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定することである。胎児細胞は、約１：１，０００，０００の頻度で母体血液中に現れる。母体血液中の胎児細胞は比較的少ないにもかかわらず、本発明の方法によれば、胎児の遺伝子型を迅速かつ簡単に逆推論することができる。そのためにはまず、希釈されない試料の１つの部分量を用いて増幅反応を行う。この増幅反応は、母親のゲノムから増幅により例えば１５個の異なる増幅生成物を得るよう、適合されているものとする。そして次にこの生体試料のもう１つの部分量を用いて、１つの希釈シリーズを作成する。この場合、各希釈段階間の希釈率を１：２とする。続いていずれの希釈段階でも増幅反応を、希釈されない試料の場合と正確に同じ条件下で行い、いずれの増幅反応に対しても、そこで得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定する。増幅生成物のうち、希釈されない生体試料の部分量によって得られたものであって、生体試料の希釈された部分量によって得られなかったものは、胎児に割り当てることができる。それに対してそのほかの増幅生成物、すなわち希釈されない生体試料によっても、希釈された生体試料によっても得られた増幅生成物は、母親に割り当てることができる。これらの増幅生成物をキャラクタリゼーションすることによって、例えば胎児が２１番トリソミーに罹患しているか、またはその点に関しては健康であるかを、決定することができる。本発明による方法の特別な利点は、母体血液をも胎児細胞をも含む生体試料から、上記のキャラクタリゼーションを行うことができることである。しかもこの場合、従来の技術では必要だった母体血液から胎児細胞を分離することは不要である。
【００３１】
また本発明による方法は、ＬＯＨ（“異型接合性の消失”）によって生じたガン細胞を、混合試料からキャラクタリゼーションするために、例えばこのガン細胞を類型化するために用いることができる。この場合生体試料は、例えば健康な細胞とＬＯＨによって生じたガン細胞の混合物を含む。
【００３２】
この少なくとも１つの増幅反応については、本発明による方法は制限を受けない。むしろ配列多型を証明できるものであれば、考えられるすべての増幅反応を用いることができる。しかし少なくとも１つの増幅反応としてＰＣＲを行えば、有利であることがわかっている。なぜならばＰＣＲは簡単かつ比較的迅速に、わずかな技術上の手間で実行できて、適切なプライマー対を選択することにより、生体試料中の任意の核酸配列を増幅できるからである。
【００３３】
本発明の方法を用いて、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定するため、本発明の考えの発展形として次のことを提案する。それは、ＤＮＡ非コード化領域に含まれる１つの配列、または少なくとも２つ以上の互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するため、前記の少なくとも１つの増幅反応を適合させることである。知られていることであるが、ＤＮＡ非コード化領域はＤＮＡコード化領域よりもいちじるしく多型性があり、その結果、ＤＮＡ非コード化領域に含まれる配列を増幅することによって、比較的大きな確率をもって、個体特異的な配列を増幅する可能性がある。このことは、法医学的な混合試料の際にも、胎児細胞を含む母体血液中にある胎児細胞の遺伝子型を決定する際にも有利である。
【００３４】
さらには、１つの高多型性配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な高多型性配列を増幅するために、前記の少なくとも１つの増幅反応を適合させるのが有利である。特にＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列、およびこれらを任意に組み合わせたものから選択された１つの配列、または２つ以上の互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために、この少なくとも１つの増幅反応を適合させる場合に良好な結果が得られる。ＳＴＲ配列すなわちshort tandem repeat配列は高多型性の配列であって、２〜４ｂｐの鎖長の繰り返し単位だけからなり、個々の個体の間で高い多型性を示す。それとは異なって、ＶＮＴＲ配列すなわちvariable number of tandem repeat配列は、約１５〜３０ｂｐの鎖長に構築された繰り返しＤＮＡ断片からなり、この断片の全長は、この基本単位の繰り返し回数によって決定されている。ＶＮＴＲ配列もまた、通常は高多型性であり、すなわち各繰り返し単位の個数は、異なる個体の間では非常に大きく異なっている。ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism）とは、相同な各配列がただ１つの塩基によって相違するという単純な多型をいう。この配列もまた、本発明による方法を実行するのに非常に適している。なぜならばこの配列は、それぞれの個体の間で非常に大きく異なるからである。しかしこのことを別にすれば、そのほかすべての高多型性配列もまた、本発明による方法のためのマーカーとして適している。
【００３５】
そのほか、ドナーのゲノム中に１対立遺伝子あたり１回だけ生じる１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために、前記の少なくとも１つの増幅反応を適合させるのが好ましい。そうすれば、増幅生成物のキャラクタリゼーションの際に、１つの個体の個々の対立遺伝子を逆推論できるので、例えば異なる個体の核酸を含む生体試料において、１つの個体の個々の対立遺伝子の個数を決定することができる。
【００３６】
１〜１００個、好ましくは２〜２０個、特に好ましくは５〜１５個の互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために、前記少なくとも１つの増幅反応を適合させるのが好ましい。これにより、増幅生成物をキャラクタリゼーションする際に的を絞って個体特異的な結果を得るのに、十分にさまざまな増幅生成物が得られる。他面では実験の手間がそれほどかからない。
【００３７】
本発明の１つの好ましい実施形態の場合、手順ｂ）〜手順ｄ）において、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたＰＣＲを行う。このＰＣＲにおいては、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されているプライマー対を用いるが、そのプライマー対の個数は、この少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の個数に相当する。この実施形態の利点は、生体試料の希釈されない部分量を用いて増幅反応を行う場合も、生体試料の部分量の希釈段階を用いて増幅反応を行う場合も、それぞれ１つのＰＣＲしか必要としないので、本方法を迅速に、かつ大がかりなピペット計量なしに行うことができることである。適切な手順実施の例はマルチプレックスＰＣＲであるが、この場合、増幅されるべき１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を、同時に１つの反応で増幅できるものであれば、そのほかいかなる増幅反応をも使用できる。
【００３８】
本発明のもう１つの好ましい実施形態の場合、手順ｂ）〜手順ｄ）において、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたＰＣＲを行う。この場合手順ａ）において、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の個数に相当する個数の生体試料部分量を作成する。またいずれの部分量も、同量の生物物質を含む。そして手順ｂ）〜手順ｄ）において、それぞれプライマー対を１つずつ使用するＰＣＲを行う。この場合、様々に異なるＰＣＲで使用されるプライマー対は、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されているものとする。この方法手順の利点は、個々の増幅が互いに対立的に、場合によってはネガティブに作用する恐れがないことである。
【００３９】
特に前記の実施形態の場合や、希釈された試料を用いて、希釈されない試料の場合よりもわずかな個数の増幅生成物を得るため、多数の希釈段階を必要とする場合、次のことが必要となる可能性がある。それは、手順ａ）を行う前に、すなわち生体試料の１つの部分量を作成する前に、生体試料を例えば非特異的ＰＣＲによって増幅することである。これは、生体試料の部分量を必要な個数作成するに十分な出発試料を得るためである。
【００４０】
本発明による前記２つの実施形態のほか、これら２つの実施形態の混合形態も考えられる。例えば１つの混合形態の場合、増幅されるべき少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の一方の部分を、少なくとも２つのプライマー対を用いるＰＣＲで、そしてまた増幅されるべき少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の他方の部分を、上記ＰＣＲとは分離されたＰＣＲで増幅する。後者のＰＣＲでは、プライマー対をただ１つだけ用いる。
【００４１】
得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定できるためには、まず増幅生成物の有無を決定しなければならない。増幅生成物の有無を決定するためには、専門化にはこの目的で知られているあらゆる方法を用いることができる。その例を挙げるだけでも、ゲル電気泳動法、一般に行われるハイブリダイゼーション技術、例えばＤＮＡアレイ上の当該技術がある。この場合、使用される検出方法に応じてしきい値を定義し、そのしきい値より上ではＰＣＲ生成物の存在を、しきい値より下ではＰＣＲ生成物の非存在を想定することができる。
【００４２】
増幅生成物の有無の決定だけでなく、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定するため、好ましくは物理的および／または化学的に測定可能な第２のパラメーターを決定しなければならない。これは、個々の増幅生成物を互いに区別するためである。この場合、個々のＰＣＲ生成物を互いに区別するパラメーターの種類は、主として、増幅されるべき１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の種類に依存する。例えば少なくとも１つの増幅反応におけるＰＣＲプライマーを選択する際に、ＳＴＲ断片および／またはＶＮＴＲ断片が、互いに相同な配列および／または非相同な配列として増幅されるように選択する場合、個々のＰＣＲ生成物の第２のパラメーター、または第２の区別標識として、個々のＰＣＲ生成物の鎖長を選択するのが好ましい。その結果として、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数の決定は、ＰＣＲ生成物の有無のチェックと、個々のＰＣＲ生成物の鎖長の決定を含むことになる。この場合、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数は、得られた増幅生成物であって互いに鎖長の異なるものの個数に相当する。これに適する方法は、例えば毛管電気泳動法である。
【００４３】
これに対して前記少なくとも１つの増幅反応の場合、ＰＣＲプライマーとして、１つのＳＮＰ配列、または少なくとも２つの互いに相同なＳＮＰな配列および／または非相同なＳＮＰ配列を増幅するために適合されたプライマーを用いる。したがって第２の区別標識、または第２のパラメーターは、ＳＮＰ断片の場合通常はヌクレオチドに限定される配列、かつ互いに異なる配列の決定であることが望ましい。このために、専門化にはこの目的で知られているすべての方法を利用できる。この場合例を挙げるだけでも、ＤＮＡシーケンシング、または公知のハイブリダイゼーション法がある。
【００４４】
本発明の場合、手順ｂ）〜手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応において、パラメーターを設定する場合、１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列に対して、正の増幅反応の相対頻度が、それぞれ少なくとも近似的に同じ高さとなるように設定する。そうすれば、生体試料中に含まれるそれぞれ異なる個体の核酸が同量で存在する限り、それら核酸の増幅されるべき配列が、等しい効率で増幅される。その結果、ある１つの希釈段階以降は１つの増幅生成物が消失することから、その増幅生成物の消失の原因は、生体試料中の該当個体のＤＮＡが、そのほかの個体のＤＮＡよりも相応に少なくなったためであると、推論することができる。すなわちこの消失の原因は、この増幅生成物に対する増幅反応の効率が、ＤＮＡが同じ量のときでも、そのほかの増幅生成物の場合よりも小さいためだけではない。したがって、個々のＰＣＲプライマーのプライマー結合箇所に対する結合親和力と、そのほかのＰＣＲパラメーター、特にサイクル数および温度制御が、次のように設定されるのが好ましい。すなわち、いずれの増幅されるべき互いに相同な配列および／または非相同な配列に対しても、少なくとも１つの増幅反応の正の増幅反応の相対的頻度が０．２から１未満の範囲、好ましくは０．４から０．６の範囲、特に好ましくは約０．５となるように設定する。増幅されるべき互いに相同な配列および／または非相同な配列に対して、正の増幅反応の相対的頻度が、１となるようなことがあれば、生体試料中のＤＮＡ濃度が小さい核酸の増幅生成物の消失は、希釈段階が比較的高くなってから観察されることであろう。したがって、この少なくとも１つの増幅反応の正の増幅の相対的頻度は、１より下に設定するのが有利である。ＰＣＲ生成物の消失が希釈されない試料ですでに観察されるのを防止するためには、正の増幅反応の相対的頻度が低すぎないようにするべきであろう。
【００４５】
しかし増幅されるべき配列のいずれに対しても、前記少なくとも１つの増幅反応の正の増幅反応に対して設定されるべき相対的頻度として、前記の数値（下記では効率という）が固定された量ではないこと、そして特にＰＣＲに用いられた出発コピーに依存することを、考慮しなければならない。出発コピー数が大きくなるほど、少なくとも１つの増幅反応の効率をそれだけ小さく設定するべきであろう。これは、生体試料中のＤＮＡ濃度が小さい核酸に対する増幅生成物の消失に、すでに比較的低い希釈段階で達するためである。設定される効率の、出発コピー数に対する、すなわち使用される細胞の個数または使用されるコピーの個数に対する依存性を、図１に示した。
【００４６】
本発明の考えの発展形として、手順ｂ）〜手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応と平行して、同じ条件下で対照試料を用いる増幅反応を行うことを提案する。この場合対照試料は、それぞれ異なる増幅生成物を既知の個数生じるのが好ましい。こうして、手順ｂ）〜手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応が正しく行われたかどうか、あるいは場合によってはサーモサイクラーの故障によって、上記の増幅反応がまったく行われなかったか、または行われても不十分だったかを、簡単な方法で確認することができる。
【００４７】
生体試料の部分量の選択されるべき希釈率は、特に生体試料中の核酸の濃度に依存していて、専門家が一般に行う試験の際に容易に決定することができる。しかし基本的には、生体試料の部分量は比率１：１〜１：１０００、好ましくは１：１〜１：１００、特に好ましくは１：１〜１：１０、さらに特に好ましくは１：１〜１：２で希釈するのが有利である。
【００４８】
増幅生成物をキャラクタリゼーションするためには、該当個体の遺伝子系を逆推論できるものであれば、専門家に知られているあらゆる技術を用いることができる。例えばこの増幅生成物のキャラクタリゼーションは、前もって決められた配列の１つまたは複数の対立遺伝子の相対個数を決定することを含む。
【００４９】
前もって決められた配列、例えば染色体、遺伝子または遺伝子断片の対立遺伝子の相対個数を決定するためには、この目的のため専門家に知られているあらゆる方法を用いることができる。例えばこの決定を次のようにして行うことができる。すなわち少なくとも１つの増幅反応を、本発明の手順ｂ）と同じ条件下で参照試料を用いて行う。そして参照試料を用いるこの少なくとも１つの増幅反応によって得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を、部分量の一部分だけに対して得られた増幅生成物の個数と比較する。この参照試料は既知の遺伝子型を持つのが好ましい。そのためには例えば、参照試料を採取された個体が、前もって決められた配列、すなわち決定されるべき対立遺伝子が存在する配列の点で健康な個体であるか、病気の個体であるかを知れば十分である。参照試料の前もって決められた配列のコピー数もまた、同様に既知のものとすることができる。そのほか、前記少なくとも１つの増幅反応においては、本発明の手順ｂ）による少なくとも１つの増幅作用と同じ量のＤＮＡを用いるのが好ましい。これを可能とするためには例えば、生体試料中のＤＮＡ濃度を―場合によっては材料を増殖するための非特異的ＰＣＲの後に―決定することが必要になる場合がある。部分量の一部分だけに対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数、すなわち生体試料中に含まれる量が大きい方の個体に対する個数を、参照試料に対して同一の増幅反応によって得られたそれぞれ異なる増幅生成物の対応する個数と比較する。少なくとも１つの増幅反応で使用された対応するプライマー対が、前もって決められた配列に含まれる対立遺伝子を増幅するために適合されているならば、この比較によって、前もって決められた配列の対立遺伝子の相対個数を決定することができる。
【００５０】
前記の実施形態に代わるものとして、増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、手順ｂ）と同条件下で参照試料を用いて少なくとも１つの増幅反応を行い、そしてこの少なくとも１つの増幅反応によって得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を、すべての部分量に対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と、比較することができる。これによれば前期の実施形態とは異なって、生体試料中に得られたＤＮＡの量が少ない方の個体において、前もって決められた配列の対立遺伝子の相対個数を決定することができる。
【００５１】
本発明の考えの発展形として、増幅生成物をキャラクタリゼーションするために、前記部分量の一部だけに対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数、および／または生体試料のすべての部分量に対して決定されたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を、少なくとも１つの頻度分布と比較することを提案する。この頻度分布とは、例えば手順ｂ）における反応条件と同一の反応条件下で用いられた少なくとも１つの増幅反応かつ同じ増幅反応を、別々にそれぞれ複数回行うことによって、そして続いて１参照試料ごとにそこに含まれたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定することによって、得られた／得られるものである。なおここに挙げた少なくとも１つの増幅反応においては、手順ａ）に挙げたと同じ量の出発材料を、少なくとも２つのそれぞれ異なる参照試料とともに使用している。以上のような方法によって、生体試料中の核酸を採取された個体のいずれにおいても、前もって決められた対立遺伝子の相対個数、あるいは絶対個数さえも、特別な信頼性をもって決定できる。
【００５２】
さらには、増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、得られた増幅生成物をシーケンシングし、あるいはこの生成物に適切なプローブを用いてハイブリダイゼーション法を行う。これは例えば、遺伝子または遺伝子断片の配列を逆推論するためである。
【００５３】
また増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、生体試料の１つまたは複数の希釈段階を用いて、ＰＣＲの多重決定を行うことができる。これは、個々の決定の際に得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数の平均値を比較したものから、例えば生体試料中の前もって決められた配列の相対的または絶対個数を推論するためである。生体試料の１つまたは複数の希釈段階を用いて、ＰＣＲの多重決定を行い、そこで得られた１つの特異的な増幅生成物、例えば対立遺伝子特異的な増幅生成物の個数の平均値を、そこで得られたそのほかの特異的な増幅生成物、例えば対立遺伝子特異的な増幅生成物の個数の平均値と、比較することもできる。例えば生体試料の希釈段階１：５および１：１０に対して、ＰＣＲの５重決定をそれぞれ１つずつ行うことができる。この場合、ＰＣＲで用いられるプライマー対は、少なくとも１つの対立遺伝子特異的な配列を増幅するため、適合されている。１つの個体の対立遺伝子特異的プライマー対に対するＰＣＲによって、例えば２つの増幅生成物が得られる場合、そしてこれら２つの増幅生成物は、個々の希釈段階においては等しい頻度で現れ、例えばそれぞれ平均値で希釈段階１：５のとき０．５回、希釈段階１：１０のとき０回現れる場合、バイアリールダイソミーを推論することができる。しかし個々の希釈段階において２つの対立遺伝子特異的な増幅生成物が得られ、２つのうち一方は、平均すると他方の２倍の頻度で、例えば増幅生成物１は希釈段階１：５で平均０．９回、増幅生成物は２希釈段階１：１０で平均０．５回現れる場合、あるいは一方は他方よりも高い希釈段階で初めて消失して、例えば増幅生成物１は、希釈段階１：１０で初めて得られなくなるが、増幅生成物２は、すでに希釈段階１：５で得られなくなる場合、この場合はバイアリールトリソミーであることを示す。この多重決定をなす回数は好ましくは２〜１０００、特に好ましくは３〜１００、さらに特に好ましくは４〜１５、最も好ましくは５〜１０とする。
【００５４】
本発明のもう１つの対象物は、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子タイプを決定するためのキット、特に前記の方法を行うための当該キットであって、下記を含むものである。
ａ）生体試料中に含まれる少なくとも１つの核酸の１つの配列、または少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を、少なくとも１つのＰＣＲで増幅するために適合されている少なくとも１つのプライマー対。
ｂ１）既知の遺伝子型と、好ましくは前もって決められた配列の既知のコピー数とを持つ参照試料。および／または
ｂ２）少なくとも１つの増幅生成物が２０％から１００％未満の確率で生じるように、反応条件が選択されていた場合に、参照試料を用いて、ｄ）に記載のプロトコルに指定されているのと同じ条件下で行われた少なくとも１つの増幅反応の結果。および／または
ｂ３）少なくとも２つの異なる参照試料が、前もって決められた配列の互いに異なる既知のコピー数を１つずつ持つ場合、当該２つの互いに異なる参照試料を用いて、プロトコルｄ）で指定されたのと同じ反応条件下で、少なくとも１つを増幅反応として同じものを別々にそれぞれ複数回行うことと、次に１参照試料当たり得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定することとによって得られた少なくとも１つの頻度分布。および
ｃ）場合によってはＰＣＲ用緩衝液。および
ｄ）ａ）において少なくとも１つのＰＣＲを行うためのプロトコル、および場合によっては濃度の異なる少なくとも２つの部分量について行われる希釈に関するデータ。
【００５５】
本発明の１つの好ましい実施形態では、このキットが、既知の遺伝子型と、好ましくは前もって決められた配列に関して既知であるコピー数とを持つ参照試料ｂ１）を含む。遺伝子型が既知である参照試料を用いて、生体試料の個々の部分量を用いる場合と同じ増幅反応を少なくとも１つ行う。これにより、本発明の範囲内で増幅生成物をキャラクタリゼーションするとき、生体試料の部分量の１つに対して得られた増幅生成物の個数を、少なくとも１つの増幅反応において参照試料に対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と比較する。この比較によって、生体試料中の１つの個体の核酸において、前もって決められた配列の相対的コピー数を推論することができる。参照試料のうち少なくとも２つの濃度の異なる部分量に、調査される生体試料の部分量と同じ条件下で行われる増幅反応をそれぞれ少なくとも１回加えると、生体試料に含まれる１つの個体の核酸において、前もって決められた配列の絶対的コピー数さえ推論することができる。
【００５６】
本発明のキットは、参照試料の代わりに、あるいはそれより好ましさが減じるとしても参照試料ｂ１）に加えて、ｄ）に記載のプロトコルに指定されるのと同じ条件下で参照試料を用いておこなわれる少なくとも１つの増幅反応の結果ｂ２）、および／または少なくとも１つの頻度分布ｂ３）を含むことができる。上記の反応条件は、少なくとも１つの増幅生成物が、２０％から１００％未満までの確率で形成されるような条件を選択されている。また上記の頻度分布は、少なくとも２つの異なる参照試料を用いて、プロトコルｄ）に指定されたのと同一な反応条件下で行われた少なくとも１つの増幅反応、かつ同一の増幅反応を別々にそれぞれ複数回行うことによって、そしてそれに続いて、１参照試料ごとに得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定することによって、得られたものである。上記の少なくとも２つの異なる参照試料は、前もって決められた配列の、互いに異なる既知のコピー数を１つずつ持つ。プロトコルｄ）にいう生体試料の１つの部分量を用いて少なくとも１つの増幅反応を行い、そこで得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と、ｂ２）にいう結果を比較することにより、生体試料に含まれる１つの個体の核酸中にある前もって決められた配列の相対的コピー数を決定することができる。他方では、ｂ３）にいう頻度分布と相応に比較することによって、生体試料中に含まれる１つの個体の核酸中にある前もって決められた配列の絶対的コピー数を決定することができる。
【００５７】
本発明のキットの１つの好ましい実施形態では、ＤＮＡ非コード化領域に属する１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列、好ましくは高多型性の互いに相同な配列および／または非相同な配列であって、かつ特に好ましくはＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列、およびこれらの任意の組み合わせからなるグループから選択されたものを、少なくとも１つのＰＣＲにおいて増幅するため、前記少なくとも１つのプライマー対が適合されているものとする。
【００５８】
本発明の考えの発展形として、互いに相同な配列および／または非相同な配列を１〜１００個、好ましくは２〜２０個、特に好ましくは５〜１５個、少なくとも１つのＰＣＲで増幅するために、ａ）にいう少なくとも１つのプライマー対、および／または本発明によるキットのｄ）にいうプロトコルを適合させることを提案する。
【００５９】
下記では実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実施例は本発明を説明するものであって、本発明を限定するものではない。
【００６０】
（実施例１）
本例は、母体血液中にある胎児細胞の遺伝子型を決定しようというものである。
【００６１】
胎児細胞は、母体血液中に約１：１，０００，０００の頻度で現れる。胎児細胞は母体血液中で、さまざまな方法で濃縮することができる。その例として、胎児細胞に対して特異的な抗体を持つ磁気ビードを用いるか、あるいは、メンブレン蛋白質によって胎児細胞を検出、分離する細胞ソーターを用いることができる。この方法で、母体血液中にある胎児細胞を、比率１：１０００まで濃縮することができる。
【００６２】
下記では、そのようにして濃縮された試料を用いて、胎児が２１番トリソミーに該当するかどうかを決定したい。この例では、試料中に約１０，０００個の細胞があることが、細胞ソーター実験から既知である。そのほか参照試料実験から、次のことが既知である。すなわち、１細胞あたり２１番染色体が２コピーのとき、ＰＣＲで１０細胞未満を用いるならば、あるいは１細胞あたり２１番染色体が３コピーのとき、ＰＣＲで７細胞未満を用いるならば、ここで用いられたＳＴＲシステムに対して（参照実験と同じプロトコルの場合）ドロップアウトが生じる。すなわち使用されたプライマー対に含まれる増幅生成物の非増幅が生じる。
【００６３】
まず濃縮された混合試料の１つの部分量に、１つのプライマー対を用いるＰＣＲを行ったが、この混合試料は、胎児細胞と母体血液を１：１０００の比率で含む。この場合のプライマー対は、２１番染色体のＳＴＲ配列を１つずつ増幅するために適合されていた。したがって、２１番染色体に関して同型接合性ある健康な個体に対しては１つの増幅生成物が、２１番染色体に関して異型接合性ある健康な個体に対しては２つの増幅生成物が、モノアリールトリソミーを持つ個体に対しては１つの増幅生成物が、バイアリールトリソミーを持つ個体に対しては２つの増幅生成物が予想される。また生体試料のもう１つの部分量を用いて希釈シリーズをピペット計量し、いずれの希釈段階の部分量にも、希釈されない試料の部分量に対するのと同じＰＣＲを行った。この場合下記表１の結果が得られた。
【００６４】
【表１】
表１で認められるように、鎖長が１３２ｂｐおよび１４４ｂｐの各増幅生成物は、希釈率が１：１０００および１：５００となるまで得られる。それに対して、そのほかの２つの増幅生成物、鎖長が１３６ｂｐのものおよび１５６ｂｐのものは、すでに希釈率が１：５および１：７で消失する。このことから、対立遺伝子で鎖長が１３６ｂｐのもの、および１５６のものは、胎児に割り当てることができる。なぜならばこれらの対立遺伝子は、そのほかの２つの対立遺伝子であって鎖長が１３２ｂｐのもの、および１４４ｂｐのものよりも、はるかに小さい希釈率で消失するからである。組織内の母体細胞と比較することにより、この結果を確認することができる。
【００６５】
しかし上記の結果だけでは、鎖長１３６ｂｐおよび１５６ｂｐの各対立遺伝子が、１コピーで現れるか、２コピーで現れるかを、確実に結論することはできない。このためには、希釈段階１：５の生体試料の複数の部分量を用いて、それぞれ前記の増幅反応と同じ増幅反応を、５回の平行する実験で行う。これは基本的に、５回からなる多重決定に相当する。この場合下記表２の結果が得られた。
【００６６】
【表２】
続いて同じ実験を、希釈段階１：７の部分量を用いてそれぞれ５回行った。この場合、下記表３の結果が得られた。
【００６７】
【表３】
上記の表から、鎖長１５６ｂｐの対立遺伝子は、あたえられた希釈段階で、鎖長１３６ｂｐの対立遺伝子よりもいちじるしく高い確率で、ドロップアウト、すなわち予想された増幅生成物の消失を示す。このことから、鎖長１３６ｂｐの対立遺伝子は１細胞あたりそれぞれ２コピー、鎖長１５６ｂｐの対立遺伝子は１細胞あたり１コピー現れることを、ある程度の確率で結論できる。これら２つの対立遺伝子が１細胞当たり等しいコピー数現れるようなことがあれば、等しい希釈率におけるドロップアウトの頻度も等しいこととなろう。
【００６８】
したがって上記の実験によって、２つの異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つの個体の対立遺伝子の相対個数について言明することができる。この具体的ケースでは、この胎児に対してバイアリール２１番トリソミーを診断した。専門家には理解できることであるが、この増幅反応の際に２つ以上のプライマー対を用いるならば、上記の試みによる当該証言の確実性を向上できるであろう。
【００６９】
（実施例２）
実施例１に記載したと同様なプロセスを行ったが、ＰＣＲにおいて、胎児細胞を含む母体血液から、もう１つの生体試料を用いた。この場合、下記表４の結果を得た。
【００７０】
【表４】
上記表４に記載したように、鎖長が１３６ｂｐ、１５６ｂｐ、１６０ｂｐの各増幅生成物は、鎖長が１３２ｂｐ、１４４ｂｐの各増幅生成物よりも低い希釈段階で消失する。このことから、前者３つの増幅生成物は、生体試料中に微量存在する胎児細胞に割り当てるべきであり、それに対して後者２つの増幅生成物は、母親に割り当てるべきであると推論される。希釈されない試料の場合、胎児のものとしては３つの増幅生成物が、それに対して母親のものとしては２つの増幅生成物が含まれていたので、胎児は２１番染色体のトリアリールトリソミーに罹患していると、大きな確率をもって言明することができる。
【００７１】
（実施例３）
下記では法医学的混合試料、すなわち、暴力犯罪の犯行現場で得られた、様々に異なるあの核酸を含む生体試料を、キャラクタリゼーションしたい。
【００７２】
このため実施例１と同様に、生体試料の様々に異なる希釈段階を用いて増幅反応を行い、下記表５の結果を得た。
【００７３】
【表５】
表５から認められるように、合計４つの増幅生成物が得られ、そのうち２つ、すなわち鎖長１３２ｂｐおよび１４４ｂｐの各増幅生成物は、高い希釈段階（１：５００および１：１０００）で初めて消失する。それに対してそのほかの２つ、すなわち鎖長１３６ｂｐおよび１５６ｂｐの各増幅生成物は、１：５および１：７という低い希釈段階ですでに消失する。このことから、この生体試料は２つの異なる個体の核酸を含み、個体１には鎖長１３２ｂｐおよび１４４ｂｐの各対立遺伝子が割り当てられ、他方で個体２には鎖長１３６ｂｐおよび１５６ｂｐの各対立遺伝子が割り当てられると推論される。これらの組み合わせには類似の希釈段階でドロップアウトが生じるので、この結論には容易に達することができる。したがって、さらに第三者の核酸がその生体試料内に含まれていることは、非常にありえない。もしそうならば、２つの個体からただ１つの対立遺伝子が生体試料中に存在することになるからである。しかしこれは非常にありえない。これら２つの個体の核酸は、ここで前記の同様に詳しくキャラクタリゼーションできる。
【００７４】
前記の実施例が示すように、希釈シリーズと、希釈されない生体試料や生体試料の個々の希釈段階を用いて対応する増幅反応を行うこととによって、少なくとも１つの前もって決められた配列の相対的頻度を決定するだけでなく、アイデンティティ決定、すなわち個々の対立遺伝子のコピー数の決定を行うこともできる。そのための前提条件は、生体試料中の個々の個体の核酸の量に差があることである。アイデンティティ決定のためには、この差は係数にして約１０が好ましい。しかし、例えば微量の混合試料から取った１つの固体の対立遺伝子のコピー数を決定したいならば、それより小さい差でも十分である。しかしその場合統計上の確かさを上げるためにはある程度の冗長性、例えば該当する部分量を用いたマルチプレックスＰＣＲ、またはＰＣＲの多重決定などによる冗長性が必要である。
【００７５】
（実施例４）
例えば妊娠中の女性の場合、母体血液だけでなく胎児細胞も含む可能性がある生体試料が、そのような胎児細胞を含むかどうかを、そしてそのような細胞が存在する場合は、母体細胞と胎児細胞との関係はいかなるものかを決定したい。
【００７６】
母体血液に対する胎児細胞の相対的細胞数の決定は、従来の技術で知られているようなＰＣＲに基づく方法では不可能であるか、もし可能であるとしても極めて不完全である。なぜならば、母体血液中に胎児細胞は、細胞百万個に対して１個という頻度でしか現れないからである。その点で、従来の技術から知られている方法の場合、そもそも評価可能な結果を得ようとすれば、母体血液１μｇ以上をＰＣＲに投入しなければならない。しかしこの種の高いＤＮＡ出発量を用いるＰＣＲは、経過がもはや最適ではなく、その結果、不正確な結果しか得られない。これを避けるため、胎児細胞をＦＡＣＳ（蛍光細胞分別器）によって濃縮することが、すでに提案されている。しかしこの濃縮によっては状況にいちじるしくバイアスがかかる。
【００７７】
生体試料中には、胎児細胞以外に母体細胞が過剰量存在し、双方の細胞型がそれぞれ２倍体核型を持つので、この生体試料中には、いずれの遺伝子に対しても最大４個のそれぞれ異なる対立遺伝子が存在する。母体細胞が過剰量存在するという仮説は、つねに存在することとなろう。ＰＣＲにおいて、ここである特定の遺伝子断片に対して対立遺伝子特異的なプライマー対を用い、下記表６の結果を得た。
【００７８】
【表６】
１希釈段階ごとの正のＰＣＲの個数を比較すると、生体試料中に母体細胞が、胎児細胞よりも多く含まれていることは明らかであることがわかる。なぜならば胎児細胞の増幅の場合の方が、母体細胞の場合よりも早く、ＤＮＡコピーにドロップアウトを生じるからである。したがって胎児細胞の場合、最初のドロップアウトは、希釈段階１：８ですでに観察され、１：１６の希釈段階で胎児細胞に対しては何ら増幅生成物が得られなくなる。しかし母体細胞の場合、ドロップアウトは希釈段階１：３２で初めて開始され、その後希釈段階１：６４以降になってから、母体細胞にも増幅細胞が得られなくなる。
【００７９】
これらの２つの試料は最初から混合されていて、ドロップアウトから得たこれら試料に関しての相対比較による言明は（母体細胞の場合の希釈段階１：６４を胎児細胞の場合の希釈段階１：１６と比較）、ここでは、母体細胞は胎児細胞の４倍の量が存在したということである。
【００８０】
胎児細胞および／または母体細胞を、ここで前記と同じようにしてさらにキャラクタリゼーションできる。
【００８１】
（実施例５）
１人の人間の生体試料が、健康な細胞だけでなく、ＬＯＨによって生じたガン細胞をも含むかどうか決定したい。
【００８２】
このため、遺伝子断片Ｄ８５５２２を増幅するプライマー対を用いて、生体試料の様々に異なる希釈段階で増幅反応を行い、下記表７の結果を得た。
【００８３】
【表７】
上記表７からは、対立遺伝子Ｉ‐２は、すべての希釈段階で含まれていたが、対立遺伝子Ｉ−１が増幅されたのは、希釈段階１：１６までに限られた。このことは、この生体試料中に、対立遺伝子Ｉ‐２の方が対立遺伝子Ｉ‐１よりも多くのコピー数が存在することを示す。このことから、この生体試料が、対立遺伝子Ｉの点で異型接合性ある健康な細胞だけでなく、ＬＯＨによって生じたガン細胞、すなわち対立遺伝子Ｉの点では同型接合性しかないガン細胞をも含むことを、ある程度の確率をもって推論することができる。
【００８４】
この結果が正しいことは次のようにして確認できる。すなわちこの生体試料の複数の部分量を希釈して、それにより、これら部分量がそれぞれ細胞を１つだけ含むようにして、次に各分量のＤＮＡを非特異的に増幅する。その後、各部分量のＤＮＡをゲル電気泳動法によって分離し、前記の遺伝子断片にとって特異的なプローブを用いて、サザンブロット法によって可視化する。２つの部分量を適用した後の結果を、図２に記載した。
【００８５】
図２に記載するように、この生体試料は２つの細胞型を含み、そのうち１つは、Ｄ８５５２２遺伝子の２つの対立遺伝子を含む（トレース“Ｎ”の下側２つのバンド）。それに対してもう１つは、Ｄ８５５２２遺伝子の２つの対立遺伝子の一方だけを含む（トレース“Ｔ”の下側のバンド）。ゲルの上半分に結像されたバンドは、いわゆる“コンフォメーション・バンド（conformation band）”であって、新たにフォールディングされた配列によって、各対立遺伝子から生じるものである。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
以上説明したように、本発明は、異なる個体の核酸を含む生体試料から遺伝子型を決定する方法について有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】使用される細胞の個数または使用されるコピーの個数に対する依存性を示す図である。
【図２】可視化した正常な細胞及びガン細胞のＤＮＡを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定する方法、特にはあらかじめ決められた配列のコピー数を決定する方法に関する。本発明はまた、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料から個体の遺伝子型を決定する方法、例えば個別の遺伝子または遺伝子断片といった前もって決められた配列の有無を証明し、または特定の核酸を定量するという方法は、多くの技術分野で用いられている。例を挙げるだけでも、法医学、遺伝子工学例えばクローニングの分野、または医学的診断への応用が知られている。
【０００３】
１つまたは複数の個体の遺伝子型をキャラクタリゼーションするため、犯罪学、法医学、父子関係や血縁関係の調査にしばしば用いられる技術は、遺伝子の指紋の構築である。遺伝子指紋の構築のためには、今日特に次の２つの方法が用いられる。その１つはＲＦＬＰ法（制限酵素断片長多型）であり、もう１つはＶＮＴＲ類型化法（配列反復回数多型）である。これら２つの方法では、まず、例えば血液、唾液、毛根のある毛髪、精液または膣分泌液を含む微量生体物質から、ＤＮＡを分離する。ＲＦＬＰ法の場合は、生体試料からＤＮＡを分離した後、制限酵素を用いてそのＤＮＡを加水分解し、鎖長の異なる多数のＤＮＡ断片とする。その後各ＤＮＡ断片は、寒天ゲル上でその鎖長に従って分離される。続いて公知のサザンブロット法により、各ＤＮＡ断片を寒天ゲルからナイロン膜状に移し、膜上に固定する。次にこのナイロン膜を、蛍光標識された特異的プローブとハイブリダイゼーションさせ、特定のＤＮＡ断片の存在を証明する。続いて特異的プローブとハイブリダイゼーションされたＤＮＡ断片を、例えば酵素反応によって可視化して、遺伝子指紋と呼ばれるバンドパターンを得る。例えば参照試料の対応するパターンと比較することにより、各バンドの相対的位置から、その個体の遺伝子型を逆推論することができる。しかしＲＦＬＰ法を行うには非常に大量のＤＮＡが必要とし、この方法は今のところ、生きている人の父子関係または血縁関係の調査に用いられるに過ぎない。十分な量のＤＮＡを入手できるのは、そのような用途に限られるからである。しかし暴力犯罪の解明といった法医学的方法の場合、極めて小量のＤＮＡしか入手できない場合が多く、ＲＦＬＰ法は適さない。またＲＦＬＰ法が証言能力を持つのは、その生体出発試料が１つの個体のＤＮＡだけを含む場合に限られる。
【０００４】
ＶＮＴＲ類型化法の場合まず、ゲノムの非コード化領域から選択されたＤＮＡ領域を、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、ドイツ語でPolymerasekettenreaktion）によって複製した後、増幅されたＤＮＡ断片を、例えばポリアクリルアミドゲル上で鎖長に従って分離し、続いて可視化する。こうして得られた長いパターンを、対応する参照試料から得られたバンドパターンと比較することによって、参照試料ドナーと、生体試料中にある核酸の持ち主個体との同一性または非同一性を、ある程度の確率をもって推論することができる。しかしこの方法の欠点は、この方法は、特にポリアクリルアミドゲル上でＤＮＡ断片を分離するため、比較的時間がかかることである。またこの方法が証言能力ある結果が得られるのは、調査される生体試料中に、ただただ１つの個体のＤＮＡが含まれる場合に限られる。しかしこの生体出発試料がさまざまな個体の核酸を含む場合は、ＲＦＬＰ法と同じくＶＮＴＲ法も役に立たなくなる。
【０００５】
分子生物学的診断でも、個体の遺伝子型をキャラクタリゼーションする方法、特に配列を定量する方法、あるいは核酸配列のコピー数を定量的に決定する方法は、重要性を増すばかりである。一部に重いケースがある疾病の多数は、ゲノム中の核酸配列のコピー数が通常より偏差を持つことに原因するので、特定の染色体または特定の遺伝子断片のコピー数を決定することにより、該当する疾病を、すでに成長の初期の段階で信頼性をもって診断することができる。
【０００６】
一部に重いケースがある異常であって、染色体全体のコピー数の増加に原因を求められるものの例は、１８番トリソミー（エドワード症候群）、１３番トリソミー（Ｐａｔａｕ症候群）、２１番トリソミー（ダウン症候群）である。これらの疾病はいずれの場合も、対応する１８番、１３番、２１番染色体の１細胞あたりコピー数は３である。それに対して健康な個体は、１細胞あたり前記染色体を２コピー持つ。３つのケースすべてにおいて、該当染色体のコピー数の増加が、非常に重い成長障害の原因となっている。２１番トリソミーのキャリヤはその成長をドラスチックに阻害され、一部に重い奇形を生じる。また１８番トリソミーと１３番トリソミーのキャリヤは、多くの場合生後１年以内に死亡する。
【０００７】
染色体全体のコピー数増加に原因を求められる疾病だけでなく、遺伝子または遺伝子断片のコピー数変化による疾病も、多数知られている。例を挙げるだけでも、この関連ではハンチントン病、進行性の神経変性疾病であって、精神的および身体的能力の衰弱が進んだ場合のアブノーマルで不随意な運動を特徴とするものが挙げられる。
【０００８】
生体試料中の配列コピーを定量する方法が必要なため、そのための方法がこれまでも多数提案された。
【０００９】
核酸配列の有無について証言能力があり、かつ方法手順に応じて該当核酸配列の１細胞あたりはコピー数を、条件から逆推論できる基本的定量方法は、いわゆるＦＩＳＨ法（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）である。この方法の場合、調査される生体試料を、相応の前処理の後、１つまたは複数のそれぞれ異なる蛍光色素で標識されたプローブとともに、次のような条件でインキュベートする。すなわち、プローブがそれと相同な生体試料内配列とハイブリダイゼーションされるのが、可能となるような条件である。ハイブリダイゼーション後に試料を洗滌し、不要なハイブリダイゼーション信号を消去する。次に標本の蛍光信号を蛍光顕微鏡で評価する。存在する蛍光信号はいずれも、対応する蛍光マーカーを施されたプローブに対応する配列の存在を表示している。この場合蛍光の強さから生体試料中の配列の個数を、条件から逆推論することができる。前記の方法の欠点は、誤った結果につながる望ましくないクロスハイブリダイゼーションを、完全には除外できないことである。それだけでなくこの方法は比較的高価であるが、それは１つには、どうしても蛍光色素を用いる必要があるからであり、もう１つには、蛍光顕微鏡のような複雑な装置を必要とするからである。またこの方法の証言能力は、使用されるプローブのクォーリティに大きく依存する。信頼性ある結果が得られるのは、プローブが、該当箇所において９０％以上の効率でハイブリダイゼーションされ、その結果、ハイブリダイゼーションされずに残ってもはや検出されないのは、ターゲット配列の１０％だけとなる場合だけである。また異なる個体の核酸を含む生体試料が用いられる場合は、この方法からは証言能力ある結果は得られない。
【００１０】
蛍光に基づくもう１つの方法は、ＣＧＨ解析（比較ゲノムハイブリダイゼーション）である。この方法の場合、解析される試料の核酸がすべて、色素１で標識される。参照試料から同量の核酸が、色素２で標識される。これら２つの反応投入物は、スプレッドされた中期核型の上でいっしょにハイブリダイゼーションされ、その際、両者の反応投入物に含まれる配列は、スプレッドされた染色体における結合箇所をめぐって競合する。ほぼすべてのハイブリダイゼーション箇所で、色素１の色素２に対する比は１：１に設定される。解析される試料が１つの領域に含むコピーが多くなると（参照試料の通常のコピー数より多くなる）、色素１はそのハイブリダイゼーション箇所で強くなる。解析される試料中に欠失がある場合、このハイブリダイゼーション箇所には色素２だけが認められる。この参照測定によれば、解析される試料中の配列の頻度について相対的な言明が得られる。この方法は手間と費用がかかる。必要な技術機器を比重に正確に設定および／または校正しなければならないからである。異なる標識のため２つの色素が必要とされ、そしてこの実験の標準化は時間もかかるし困難である。それに加えて、様々に異なる個体の核酸を含む生体試料が用いられる場合、この方法からは評価可能な結果が得られない。
【００１１】
核酸配列を定量するもう１つの公知の方法は、リアルタイムＰＣＲ法である。この方法の場合、例えば蛍光標識されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、サイクル数に応じて蛍光信号が増加するのを観察する。蛍光信号が背景蛍光からいちじるしく浮き上がり、ＰＣＲ生成物形成が指数関数的に生じる時点に、しきい値ＰＣＲサイクル（Threshold‐Cycleともいう）を割り当てる。この時点は、増殖されるＤＮＡ配列の初期コピー数と相関する。このようにしてＤＮＡ試料をＤＮＡ希釈シリーズと比較して、相対定量を行う。しかしこの方法の欠点は、出発材料の量を任意に小さくできないことである。なぜならば、出発材料として出発分子が少なくて、例えば１０〜１００コピーなら、増幅が指数関数的であるため、推計学上の誤差が非常に大きくなって、定量的な言明はできなくなる。それだけでなくこの方法は、蛍光強度測定のために複雑で高価な装置を必要とする。また様々に異なる個体の核酸を含む生体試料を用いる場合、この方法は機能できない。
【００１２】
前記の方法すべては、蛍光色素の使用に基づくものであり、蛍光強度を決定するため高価な装置を必要とする。また少なくともある程度信頼性ある結果を得るには、そのため最小限必要な量の出発材料を使わなければならない。さらには異なる個体の核酸を含む生体試料から、個体の遺伝子型を決定するには、前記の方法はいずれも適していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって本発明の課題は、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定する方法として、前もって決められた配列とそれに相同の配列のコピー数の決定、例えば生体試料内の対立遺伝子の絶対個数または相対個数の決定に適している方法を提供することである。またこの方法は、単純かつ安価に実行できて、特には、例えば法医学的試料に含まれるもののように出発試料が小量であっても、信頼性ある結果が得られるものとする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に係る異なる個体の核酸を含む生体試料から遺伝子型を決定する方法は、
ａ）それぞれ異なる濃度の前記生体試料を含む当該生体試料の部分量を少なくとも２つ作成する、
ｂ）前記生体試料から手順ａ）で作成された部分量のいずれについても、それぞれ少なくとも１つの増幅反応を行うが、この場合、当該少なくとも１つの増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つに含有される１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものであり、
ｃ）前記少なくとも２つの部分量に対し、手順ｂ）によるそれぞれ少なくとも１つの増幅反応により得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定して、そこで得られた数を比較する、
ｄ）前記少なくとも２つの部分量のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数として手順ｃ）で決定された個数が等しい場合：手順ａ）で作成された部分量とはそれぞれ異なる濃度を持つ生体試料を少なくとももう１つ作成し、そして手順ｂ）およびｃ）、そして場合によってはｄ）を繰り返すが、この繰り返しは、手順ｃ）において少なくとも１つの部分量に対し、それぞれ異なる増幅生成物がそのほかの部分量に対して異なる個数得られるまで行う、
ｅ）前記少なくとも１つの部分量に対して、そのほかの部分量に対するのと異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が、前記少なくとも１つの増幅反応で得られた場合、当該少なくとも１つの部分量によって得られた増幅性生成物をキャラクタリゼーションし、および／または、そのほかの部分量に対するのとは異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が得られた前記少なくとも１つの部分量に対してのみならず、そのほかの部分量に対しても、得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションする、
という各手順を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定する方法として、前もって決められた配列とそれに相同の配列のコピー数の決定、例えば生体試料内の対立遺伝子の絶対個数または相対個数の決定に適している方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明はこの課題を次のような方法によって解決する。それは、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の固体の遺伝子型を決定する方法、特には、前もって決められた配列のコピー数を決定する方法であって、次の手順を含む。
ａ）それぞれ異なる濃度の前記生体試料を含む当該生体試料の部分量を少なくとも２つ作成する。
ｂ）前記生体試料から手順ａ）で作成された部分量のいずれについても、それぞれ少なくとも１つの増幅反応を行う。この場合、当該少なくとも１つの増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つに含有される１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものである。
ｃ）前記少なくとも２つの部分量に対し、手順ｂ）によるそれぞれ少なくとも１つの増幅反応により得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定して、そこで得られた数を比較する。
ｄ）前記少なくとも２つの部分量のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数として手順ｃ）で決定された個数が等しい場合、手順ａ）で作成された部分量とはそれぞれ異なる濃度を持つ生体試料を少なくとももう１つ作成する。そして手順ｂ）およびｃ）、そして場合によってはｄ）を繰り返すが、この繰り返しは、手順ｃ）において少なくとも１つの部分量に対し、それぞれ異なる増幅生成物がそのほかの部分量に対して異なる個数得られるまで行う。
ｅ）前記少なくとも１つの部分量に対して、そのほかの部分量に対するのと異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が、前記少なくとも１つの増幅反応で得られた場合、当該少なくとも１つの部分量によって得られた増幅性生成物をキャラクタリゼーションし、および／または、そのほかの部分量に対するのとは異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が得られた前記少なくとも１つの部分量に対してのみならず、そのほかの部分量に対しても、得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションする。
【００１７】
生体試料の濃度がそれぞれ異なる少なくとも２つの生体試料部分量を、本発明の手順ａ）によって作成するが、これは、専門家にこの目的で知られているいずれの方法でも行うことができる。例えば、少なくとも２つの部分量を作成するための生体試料から、例えば少なくとも２つの部分量を採取して、次のこれらの部分量を、互いに異なる希釈率で希釈する。同じ試料から２つの部分量を採取して、一方の試料を濃縮することも、同様に可能である。それに対して他方の部分量は、希釈しないでそのままとするか、あるいは希釈する。生体試料の濃度がそれぞれ異なる生体試料部分量を少なくとも２つ作成する畝法であれば、そのほかあらゆる方法を手順ａ）に使用できる。
【００１８】
手順ａ）で少なくとも２つの部分量を採取するという最初に説明したケースで、次にこれら部分量を互いに異なる希釈率で希釈する場合、本発明による方法は例えば下記の手順を含む。
ａ）前記生体試料の１つの部分量を作成する。
ｂ）前記生体試料の部分量を用いて少なくとも１つの増幅反応を行うが、その際、当該少なくとも１つの増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つに含有される１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものである。
ｃ）手順ｂ）の少なくとも１つの増幅反応のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定する。
ｄ）前記生体試料のもう１つの部分量を作成し、当該生体試料の当該もう１つの部分量を希釈し、そして当該希釈された試料を用いて、手順ｂ）と同じ条件下で少なくとも１つの増幅反応を行う。
ｅ）手順ｄ）の少なくとも１つの増幅反応のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定する。
ｆ）手順ｃ）で決定された様々に異なる増幅生成物の個数を、手順ｅ）で決定された様々に異なる増幅生成物の個数と比較する。
ｇ）手順ｃ）で決定された個数が、手順ｅ）で決定された個数に等しい場合、当該生体試料の希釈率を高くして手順ｄ）〜ｆ）を繰り返し、この繰り返しは、手順ｅ）で得られる様々に異なる増幅生成物の個数が、手順ｃ）におけるよりも小さくなるまで行う。
ｈ）手順ｅ）で得られたさそれぞれ異なる増幅生成物の個数が手順ｃ）におけるよりも小さくなる希釈率を用いて、手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応の際にではなく手順ｂ）による少なくとも１つの増幅反応の際に得られた増幅生成物を、キャラクタリゼーションする。および／または、手順ｅ）で得られたそれぞれ異なる増幅生成物が手順ｃ）におけるよりも小さくなる希釈率を用いて、手順ｂ）による少なくとも１つの増幅反応の際だけでなく手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応の際にも得られた増幅生成物を、キャラクタリゼーションする。
【００１９】
本発明にいう１つまたは複数の個体の遺伝子型の決定とは、１つの個体の前もって決められた少なくとも１つの配列について、その有無、コピー数、または核酸配列をキャラクタリゼーションすること、特には前もって決められた配列、例えばゲノム、遺伝子または遺伝子断片の前もって決められた配列の絶対個数または相対個数を決定すること、および／または前もって決められた配列の有無を決定することをいう。
【００２０】
また本発明にいう異なる個体という概念は、―人間の場合―異なる人物だけでなく、１人の人物の様々に異なる細胞タイプ、すなわち互いに遺伝子タイプが異なる細胞タイプをもいう。その例は遺伝子モザイクまたはキメラ、すなわち１人の人物の遺伝子タイプがそれぞれ異なる細胞であって、これは、異なる遺伝子型を混合あるいは交換して初めて形成されるもの（キメラ）、または１つの個体内に生じるもの（遺伝子モザイク）である。遺伝子モザイクの例はガン細胞であって、ＬＯＨ（“異型接合性の消失”）によって生じる。
【００２１】
また本発明にいう相同配列という概念は、ヌクレオチド配列の相互間類似性が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは９０％、さらに特に好ましくは少なくとも９５％である配列をいう。それに対して非相同配列は、相互間の配列類似性が相応に小さい配列をいう。
【００２２】
さらには本発明の場合、生体試料中の前もって決められた配列の個数を相対的に定量決定するとは、１つの生体試料が、前もって決められた配列のコピーを、参照試料よりも少なく含むか、等しく含むか、多く含むかを、決定することをいう。そして試料中の前もって決められた配列の個数を絶対的に定量決定するとは、前もって決められた配列が生体試料中に含まれている具体的個数を決定することをいう。
【００２３】
生体試料から１つの個体の遺伝子型を決定する方法として、従来の技術から知られているものとは異なり、本発明による方法は、１つの個体のＤＮＡを含む生体試料に適するだけでなく、少なくとも２つの異なる個体の核酸を含む生体試料にも適する。本発明はこれを次のようにして達成する。すなわち、まず希釈されていない生体試料の１つの部分量を用いて、少なくとも１つの増幅反応を行う。この増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つが包含する１つの配列、または少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されているものとする。そしてこの少なくとも１つの増幅反応によって得られた、それぞれ異なる増幅生成物の個数を、生体試料の希釈された部分量を用いて同条件下で行われた増幅生成物であって、かつ少なくとも１つの増幅反応で得られた増幅生成物の個数と比較する。この場合の希釈は、希釈された部分量に対する増幅反応においては、生体試料の希釈されない部分量を用いた場合よりも、得られる増幅生成物が少なくなるように行う。したがって本発明による方法の原理は、理論的に可能な増幅生成物の少なくとも一部が得られなくなるまで、異なる個体の核酸を含む生体試料の部分量を希釈することに基づく。この場合、“消失する”増幅生成物は、通常は生体試料中にごくわずかの濃度で存在するＤＮＡの増幅生成物である。異種遺伝子ＤＮＡ混合物、例えば異なる個体の核酸を含む試料の当該混合物中には、各個体の核酸の配列が、異なるコピー数存在する。この場合、各個体の核酸は、それぞれ異なる量が生体試料中に存在する。ＰＣＲは各ターゲット配列を指数関数的に増幅するので、上記の分布の量的不均一性が非常に強められ、１つの個体にわずかな濃度で存在するＤＮＡのターゲット配列、すなわち増幅反応で用いられたプライマーによって増幅されるべき配列は、他方の個体におけるより高い濃度のＤＮＡの対応する配列と比較して、存在するのは非常にわずかであるため、このターゲット配列はもはや検出できない。これは、“アリール・ドロップアウト”と呼ばれる効果、すなわちただ１つの個体のＤＮＡを含む生体試料中で、さまざまな対立遺伝子の１つが増幅される効果と同様である。本発明は、個別細胞に対する実験で得られた驚くべき認識、すなわちこのドロップアウト過程は非常に急激に発生するという認識に基づく。
【００２４】
前記の原理と関連に基づいて、生体試料の希釈されない部分量によって得られた増幅生成物の個数を、生体試料の相応に希釈された部分量によって得られた増幅生成物の個数と比較することによって、それぞれの増幅生成物を、生体出発試料中の核酸が含まれているそれぞれの個体に割り当てることができる。ただしこの場合の希釈率は、希釈された試料によって得られた増幅生成物が、希釈されない試料による増幅生成物よりも少なくなるような値とする。一方では、希釈されない試料だけでなく、希釈された試料によっても得られた増幅生成物は、生体試料中に含まれている核酸の量が多い方の個体に割り当てられる。他方では、希釈されない生体試料によって得られた増幅生成物であっても、希釈された料によってはもはや得られない増幅生成物は、生体試料内に存在するＤＮＡ量が少ない方の個体に割り当てられる。このようにして生体試料のそれぞれの個体に割り当てられた増幅生成物をさらにキャラクタリゼーションすることによって、それぞれ異なる個体の遺伝子タイプを推論することができる。
【００２５】
これを１つの仮想上の実験によって詳しく説明しよう。ある犯行現場で微量の生体試料が得られ、この生体試料は（当初はわからないことであるが）２つの異なる個体の核酸、すなわち犠牲者の核酸と犯人の核酸とを含む。この場合（これも当初はわからないことであるが）生体試料中にある犠牲者の核酸は、犯人の核酸よりも量が多い。ここで１つのプライマー対を用いるＰＣＲを行い、このＰＣＲは、例えば１８番染色体に含まれる正確に１つの核酸配列を増幅するために適合されているものとする。健康な人間は１８番染色体を２つ持つので、１８番染色体の異型接合性キャリヤに対しては、正確に２つの増幅生成物が期待される。犠牲者も犯人も、それぞれ１８番染色体に対して異型接合性がある場合、上記の生体試料の部分量を用いて行われた増幅反応の場合、増幅生成物の理論的に最大可能な個数は、４つの増幅生成物である。この場合、犠牲者の２つの対立因子に対して２つの増幅生成物、犯人の２つの対立因子に対して２つの増幅生成物が含まれる。生体試料の１つの部分量をここで連続的に希釈すると、ある特定の希釈率からは、犠牲者のＤＮＡに対する増幅生成物だけが得られるが、犯人のＤＮＡに対する増幅生成物が得られなくなるという現象が生じる。この特定の希釈率とは、希釈された生体試料中の犯人の核酸の濃度が、ある特定の最小限濃度を下回る希釈率である。これを根拠に、生体試料のこのように希釈された部分量を含む増幅生成物、例えば鎖長１２０および１３０ｂｐの当該各増幅生成物を、生体試料中に含まれているＤＮＡの量が多い方の個体に、割り当てることができる。これに対して、たしかに生体試料の希釈されない部分量による増幅反応によって得られたものであるが、生体試料の希釈された部分量による増幅反応によっては得られなかった増幅生成物、例えば鎖長１２５および１３５ｂｐの各増幅生成物は、生体試料中に含まれているＤＮＡの量が少ない方の個体に割り当てられる。個々の増幅生成物をさらにキャラクタリゼーションすることによって、ここで両者の個体の遺伝子型を推論することができる。例えば個々の増幅生成物を、犠牲者の細胞を含む参照試料によるＰＣＲから得られた増幅生成物と比較して、両者ＤＮＡ試料のいずれが犠牲者に由来するか、正確に割り当てることができる。犠牲者の参照試料を用いて、例えば鎖長１２０および１３０ｂｐの各ＰＣＲ生成物が得られる場合、犯行現場で発見された生体試料中に、少なくとも２つの異なる個体のＤＮＡが存在し、少なくともその一方のＤＮＡが犠牲者に由来することを、上記の実験からある程度の確率をもって推論することができる。さらには、生体試料中で濃度の高い方のＤＮＡは犠牲者のものとすることができ、増幅反応の際に鎖長１２５および１３５ｂｐという２つの増幅生成物を生じたＤＮＡは、犠牲者ではなく犯人に、または犯行に関与しない第三者に割り当てられることが、この実験から推論できる。これにより、犯人または関与しない第三者のものとして得られた増幅生成物を、的を絞ってさらに解析し、例えばデータベースに記憶されているデータと比較することにより、犯人同定の推論が可能となる。
【００２６】
本発明のもう１つの利点は、従来の技術による方法ではどうしても必要だった、ＰＣＲ生成物の絶対的な蛍光強度の決定を、省略できることである。むしろ本発明による方法の場合、それぞれ少なくとも１つの増幅反応によって得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数だけを決定し、それを互いに比較する。その限りにおいて、本発明による方法では、蛍光標識されたプライマーの使用はかならずしも必要ではない。しかしそのようなプライマーを、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数検出に用いる場合、得られたそして蛍光標識された増幅生成物の絶対的蛍光強度を、手間をかけて決定する必要はない。定められたしきい値（例えば係数１０または１００）を超える蛍光が、使用された蛍光係数に対応する波長で存在するか、存在しないかを評価すればそれでよい。したがって本発明の方法は、蛍光を定量的に検出するための高価な装置を用いないで、簡単かつ安価に行うことができる。
【００２７】
基本的に本発明の方法は、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定するのに適する。この場合異なる個体の具体的個数のいかんに依存しない。しかし特に良好な結果が得られるのは、生体試料が、少なくとも２つ、しかし１０個未満の異なる個体の核酸を含む場合である。特に好ましくは、この生体試料は、少なくとも２つ、しかし５つ未満、さらに好ましくは２つまたは３つ、最も好ましくは正確に２つの異なる個体の核酸を含むものとする。
【００２８】
個々の核酸相互間の量的相違または濃度上の相違の点でも、本発明は制限を受けない。しかし好ましくは、生体試料に含まれる個々の個体の核酸相互間の濃度上の相違は１：１０００〜１：１、特に好ましくは１：５００〜１：５、さらに好ましくは１：１００〜１：１０とする。
【００２９】
すでに説明したように、本発明による方法は、特に法医学的調査、例えば犯罪捜査に関連する法医学的調査に適する。しかし本発明の方法はそれだけに限定されるものではなく、少なくとも２つの異なる個体の核酸を含む生体試料であれば、どのような種類のものにでも用いることができる。
【００３０】
本発明による方法のもう１つの特別な用途は、例えば、母性すなわち母体血液や胎児細胞を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定することである。胎児細胞は、約１：１，０００，０００の頻度で母体血液中に現れる。母体血液中の胎児細胞は比較的少ないにもかかわらず、本発明の方法によれば、胎児の遺伝子型を迅速かつ簡単に逆推論することができる。そのためにはまず、希釈されない試料の１つの部分量を用いて増幅反応を行う。この増幅反応は、母親のゲノムから増幅により例えば１５個の異なる増幅生成物を得るよう、適合されているものとする。そして次にこの生体試料のもう１つの部分量を用いて、１つの希釈シリーズを作成する。この場合、各希釈段階間の希釈率を１：２とする。続いていずれの希釈段階でも増幅反応を、希釈されない試料の場合と正確に同じ条件下で行い、いずれの増幅反応に対しても、そこで得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定する。増幅生成物のうち、希釈されない生体試料の部分量によって得られたものであって、生体試料の希釈された部分量によって得られなかったものは、胎児に割り当てることができる。それに対してそのほかの増幅生成物、すなわち希釈されない生体試料によっても、希釈された生体試料によっても得られた増幅生成物は、母親に割り当てることができる。これらの増幅生成物をキャラクタリゼーションすることによって、例えば胎児が２１番トリソミーに罹患しているか、またはその点に関しては健康であるかを、決定することができる。本発明による方法の特別な利点は、母体血液をも胎児細胞をも含む生体試料から、上記のキャラクタリゼーションを行うことができることである。しかもこの場合、従来の技術では必要だった母体血液から胎児細胞を分離することは不要である。
【００３１】
また本発明による方法は、ＬＯＨ（“異型接合性の消失”）によって生じたガン細胞を、混合試料からキャラクタリゼーションするために、例えばこのガン細胞を類型化するために用いることができる。この場合生体試料は、例えば健康な細胞とＬＯＨによって生じたガン細胞の混合物を含む。
【００３２】
この少なくとも１つの増幅反応については、本発明による方法は制限を受けない。むしろ配列多型を証明できるものであれば、考えられるすべての増幅反応を用いることができる。しかし少なくとも１つの増幅反応としてＰＣＲを行えば、有利であることがわかっている。なぜならばＰＣＲは簡単かつ比較的迅速に、わずかな技術上の手間で実行できて、適切なプライマー対を選択することにより、生体試料中の任意の核酸配列を増幅できるからである。
【００３３】
本発明の方法を用いて、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定するため、本発明の考えの発展形として次のことを提案する。それは、ＤＮＡ非コード化領域に含まれる１つの配列、または少なくとも２つ以上の互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するため、前記の少なくとも１つの増幅反応を適合させることである。知られていることであるが、ＤＮＡ非コード化領域はＤＮＡコード化領域よりもいちじるしく多型性があり、その結果、ＤＮＡ非コード化領域に含まれる配列を増幅することによって、比較的大きな確率をもって、個体特異的な配列を増幅する可能性がある。このことは、法医学的な混合試料の際にも、胎児細胞を含む母体血液中にある胎児細胞の遺伝子型を決定する際にも有利である。
【００３４】
さらには、１つの高多型性配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な高多型性配列を増幅するために、前記の少なくとも１つの増幅反応を適合させるのが有利である。特にＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列、およびこれらを任意に組み合わせたものから選択された１つの配列、または２つ以上の互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために、この少なくとも１つの増幅反応を適合させる場合に良好な結果が得られる。ＳＴＲ配列すなわちshort tandem repeat配列は高多型性の配列であって、２〜４ｂｐの鎖長の繰り返し単位だけからなり、個々の個体の間で高い多型性を示す。それとは異なって、ＶＮＴＲ配列すなわちvariable number of tandem repeat配列は、約１５〜３０ｂｐの鎖長に構築された繰り返しＤＮＡ断片からなり、この断片の全長は、この基本単位の繰り返し回数によって決定されている。ＶＮＴＲ配列もまた、通常は高多型性であり、すなわち各繰り返し単位の個数は、異なる個体の間では非常に大きく異なっている。ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism）とは、相同な各配列がただ１つの塩基によって相違するという単純な多型をいう。この配列もまた、本発明による方法を実行するのに非常に適している。なぜならばこの配列は、それぞれの個体の間で非常に大きく異なるからである。しかしこのことを別にすれば、そのほかすべての高多型性配列もまた、本発明による方法のためのマーカーとして適している。
【００３５】
そのほか、ドナーのゲノム中に１対立遺伝子あたり１回だけ生じる１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために、前記の少なくとも１つの増幅反応を適合させるのが好ましい。そうすれば、増幅生成物のキャラクタリゼーションの際に、１つの個体の個々の対立遺伝子を逆推論できるので、例えば異なる個体の核酸を含む生体試料において、１つの個体の個々の対立遺伝子の個数を決定することができる。
【００３６】
１〜１００個、好ましくは２〜２０個、特に好ましくは５〜１５個の互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために、前記少なくとも１つの増幅反応を適合させるのが好ましい。これにより、増幅生成物をキャラクタリゼーションする際に的を絞って個体特異的な結果を得るのに、十分にさまざまな増幅生成物が得られる。他面では実験の手間がそれほどかからない。
【００３７】
本発明の１つの好ましい実施形態の場合、手順ｂ）〜手順ｄ）において、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたＰＣＲを行う。このＰＣＲにおいては、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されているプライマー対を用いるが、そのプライマー対の個数は、この少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の個数に相当する。この実施形態の利点は、生体試料の希釈されない部分量を用いて増幅反応を行う場合も、生体試料の部分量の希釈段階を用いて増幅反応を行う場合も、それぞれ１つのＰＣＲしか必要としないので、本方法を迅速に、かつ大がかりなピペット計量なしに行うことができることである。適切な手順実施の例はマルチプレックスＰＣＲであるが、この場合、増幅されるべき１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を、同時に１つの反応で増幅できるものであれば、そのほかいかなる増幅反応をも使用できる。
【００３８】
本発明のもう１つの好ましい実施形態の場合、手順ｂ）〜手順ｄ）において、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたＰＣＲを行う。この場合手順ａ）において、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の個数に相当する個数の生体試料部分量を作成する。またいずれの部分量も、同量の生物物質を含む。そして手順ｂ）〜手順ｄ）において、それぞれプライマー対を１つずつ使用するＰＣＲを行う。この場合、様々に異なるＰＣＲで使用されるプライマー対は、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されているものとする。この方法手順の利点は、個々の増幅が互いに対立的に、場合によってはネガティブに作用する恐れがないことである。
【００３９】
特に前記の実施形態の場合や、希釈された試料を用いて、希釈されない試料の場合よりもわずかな個数の増幅生成物を得るため、多数の希釈段階を必要とする場合、次のことが必要となる可能性がある。それは、手順ａ）を行う前に、すなわち生体試料の１つの部分量を作成する前に、生体試料を例えば非特異的ＰＣＲによって増幅することである。これは、生体試料の部分量を必要な個数作成するに十分な出発試料を得るためである。
【００４０】
本発明による前記２つの実施形態のほか、これら２つの実施形態の混合形態も考えられる。例えば１つの混合形態の場合、増幅されるべき少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の一方の部分を、少なくとも２つのプライマー対を用いるＰＣＲで、そしてまた増幅されるべき少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の他方の部分を、上記ＰＣＲとは分離されたＰＣＲで増幅する。後者のＰＣＲでは、プライマー対をただ１つだけ用いる。
【００４１】
得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定できるためには、まず増幅生成物の有無を決定しなければならない。増幅生成物の有無を決定するためには、専門化にはこの目的で知られているあらゆる方法を用いることができる。その例を挙げるだけでも、ゲル電気泳動法、一般に行われるハイブリダイゼーション技術、例えばＤＮＡアレイ上の当該技術がある。この場合、使用される検出方法に応じてしきい値を定義し、そのしきい値より上ではＰＣＲ生成物の存在を、しきい値より下ではＰＣＲ生成物の非存在を想定することができる。
【００４２】
増幅生成物の有無の決定だけでなく、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定するため、好ましくは物理的および／または化学的に測定可能な第２のパラメーターを決定しなければならない。これは、個々の増幅生成物を互いに区別するためである。この場合、個々のＰＣＲ生成物を互いに区別するパラメーターの種類は、主として、増幅されるべき１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の種類に依存する。例えば少なくとも１つの増幅反応におけるＰＣＲプライマーを選択する際に、ＳＴＲ断片および／またはＶＮＴＲ断片が、互いに相同な配列および／または非相同な配列として増幅されるように選択する場合、個々のＰＣＲ生成物の第２のパラメーター、または第２の区別標識として、個々のＰＣＲ生成物の鎖長を選択するのが好ましい。その結果として、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数の決定は、ＰＣＲ生成物の有無のチェックと、個々のＰＣＲ生成物の鎖長の決定を含むことになる。この場合、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数は、得られた増幅生成物であって互いに鎖長の異なるものの個数に相当する。これに適する方法は、例えば毛管電気泳動法である。
【００４３】
これに対して前記少なくとも１つの増幅反応の場合、ＰＣＲプライマーとして、１つのＳＮＰ配列、または少なくとも２つの互いに相同なＳＮＰな配列および／または非相同なＳＮＰ配列を増幅するために適合されたプライマーを用いる。したがって第２の区別標識、または第２のパラメーターは、ＳＮＰ断片の場合通常はヌクレオチドに限定される配列、かつ互いに異なる配列の決定であることが望ましい。このために、専門化にはこの目的で知られているすべての方法を利用できる。この場合例を挙げるだけでも、ＤＮＡシーケンシング、または公知のハイブリダイゼーション法がある。
【００４４】
本発明の場合、手順ｂ）〜手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応において、パラメーターを設定する場合、１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列に対して、正の増幅反応の相対頻度が、それぞれ少なくとも近似的に同じ高さとなるように設定する。そうすれば、生体試料中に含まれるそれぞれ異なる個体の核酸が同量で存在する限り、それら核酸の増幅されるべき配列が、等しい効率で増幅される。その結果、ある１つの希釈段階以降は１つの増幅生成物が消失することから、その増幅生成物の消失の原因は、生体試料中の該当個体のＤＮＡが、そのほかの個体のＤＮＡよりも相応に少なくなったためであると、推論することができる。すなわちこの消失の原因は、この増幅生成物に対する増幅反応の効率が、ＤＮＡが同じ量のときでも、そのほかの増幅生成物の場合よりも小さいためだけではない。したがって、個々のＰＣＲプライマーのプライマー結合箇所に対する結合親和力と、そのほかのＰＣＲパラメーター、特にサイクル数および温度制御が、次のように設定されるのが好ましい。すなわち、いずれの増幅されるべき互いに相同な配列および／または非相同な配列に対しても、少なくとも１つの増幅反応の正の増幅反応の相対的頻度が０．２から１未満の範囲、好ましくは０．４から０．６の範囲、特に好ましくは約０．５となるように設定する。増幅されるべき互いに相同な配列および／または非相同な配列に対して、正の増幅反応の相対的頻度が、１となるようなことがあれば、生体試料中のＤＮＡ濃度が小さい核酸の増幅生成物の消失は、希釈段階が比較的高くなってから観察されることであろう。したがって、この少なくとも１つの増幅反応の正の増幅の相対的頻度は、１より下に設定するのが有利である。ＰＣＲ生成物の消失が希釈されない試料ですでに観察されるのを防止するためには、正の増幅反応の相対的頻度が低すぎないようにするべきであろう。
【００４５】
しかし増幅されるべき配列のいずれに対しても、前記少なくとも１つの増幅反応の正の増幅反応に対して設定されるべき相対的頻度として、前記の数値（下記では効率という）が固定された量ではないこと、そして特にＰＣＲに用いられた出発コピーに依存することを、考慮しなければならない。出発コピー数が大きくなるほど、少なくとも１つの増幅反応の効率をそれだけ小さく設定するべきであろう。これは、生体試料中のＤＮＡ濃度が小さい核酸に対する増幅生成物の消失に、すでに比較的低い希釈段階で達するためである。設定される効率の、出発コピー数に対する、すなわち使用される細胞の個数または使用されるコピーの個数に対する依存性を、図１に示した。
【００４６】
本発明の考えの発展形として、手順ｂ）〜手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応と平行して、同じ条件下で対照試料を用いる増幅反応を行うことを提案する。この場合対照試料は、それぞれ異なる増幅生成物を既知の個数生じるのが好ましい。こうして、手順ｂ）〜手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応が正しく行われたかどうか、あるいは場合によってはサーモサイクラーの故障によって、上記の増幅反応がまったく行われなかったか、または行われても不十分だったかを、簡単な方法で確認することができる。
【００４７】
生体試料の部分量の選択されるべき希釈率は、特に生体試料中の核酸の濃度に依存していて、専門家が一般に行う試験の際に容易に決定することができる。しかし基本的には、生体試料の部分量は比率１：１〜１：１０００、好ましくは１：１〜１：１００、特に好ましくは１：１〜１：１０、さらに特に好ましくは１：１〜１：２で希釈するのが有利である。
【００４８】
増幅生成物をキャラクタリゼーションするためには、該当個体の遺伝子系を逆推論できるものであれば、専門家に知られているあらゆる技術を用いることができる。例えばこの増幅生成物のキャラクタリゼーションは、前もって決められた配列の１つまたは複数の対立遺伝子の相対個数を決定することを含む。
【００４９】
前もって決められた配列、例えば染色体、遺伝子または遺伝子断片の対立遺伝子の相対個数を決定するためには、この目的のため専門家に知られているあらゆる方法を用いることができる。例えばこの決定を次のようにして行うことができる。すなわち少なくとも１つの増幅反応を、本発明の手順ｂ）と同じ条件下で参照試料を用いて行う。そして参照試料を用いるこの少なくとも１つの増幅反応によって得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を、部分量の一部分だけに対して得られた増幅生成物の個数と比較する。この参照試料は既知の遺伝子型を持つのが好ましい。そのためには例えば、参照試料を採取された個体が、前もって決められた配列、すなわち決定されるべき対立遺伝子が存在する配列の点で健康な個体であるか、病気の個体であるかを知れば十分である。参照試料の前もって決められた配列のコピー数もまた、同様に既知のものとすることができる。そのほか、前記少なくとも１つの増幅反応においては、本発明の手順ｂ）による少なくとも１つの増幅作用と同じ量のＤＮＡを用いるのが好ましい。これを可能とするためには例えば、生体試料中のＤＮＡ濃度を―場合によっては材料を増殖するための非特異的ＰＣＲの後に―決定することが必要になる場合がある。部分量の一部分だけに対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数、すなわち生体試料中に含まれる量が大きい方の個体に対する個数を、参照試料に対して同一の増幅反応によって得られたそれぞれ異なる増幅生成物の対応する個数と比較する。少なくとも１つの増幅反応で使用された対応するプライマー対が、前もって決められた配列に含まれる対立遺伝子を増幅するために適合されているならば、この比較によって、前もって決められた配列の対立遺伝子の相対個数を決定することができる。
【００５０】
前記の実施形態に代わるものとして、増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、手順ｂ）と同条件下で参照試料を用いて少なくとも１つの増幅反応を行い、そしてこの少なくとも１つの増幅反応によって得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を、すべての部分量に対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と、比較することができる。これによれば前期の実施形態とは異なって、生体試料中に得られたＤＮＡの量が少ない方の個体において、前もって決められた配列の対立遺伝子の相対個数を決定することができる。
【００５１】
本発明の考えの発展形として、増幅生成物をキャラクタリゼーションするために、前記部分量の一部だけに対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数、および／または生体試料のすべての部分量に対して決定されたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を、少なくとも１つの頻度分布と比較することを提案する。この頻度分布とは、例えば手順ｂ）における反応条件と同一の反応条件下で用いられた少なくとも１つの増幅反応かつ同じ増幅反応を、別々にそれぞれ複数回行うことによって、そして続いて１参照試料ごとにそこに含まれたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定することによって、得られた／得られるものである。なおここに挙げた少なくとも１つの増幅反応においては、手順ａ）に挙げたと同じ量の出発材料を、少なくとも２つのそれぞれ異なる参照試料とともに使用している。以上のような方法によって、生体試料中の核酸を採取された個体のいずれにおいても、前もって決められた対立遺伝子の相対個数、あるいは絶対個数さえも、特別な信頼性をもって決定できる。
【００５２】
さらには、増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、得られた増幅生成物をシーケンシングし、あるいはこの生成物に適切なプローブを用いてハイブリダイゼーション法を行う。これは例えば、遺伝子または遺伝子断片の配列を逆推論するためである。
【００５３】
また増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、生体試料の１つまたは複数の希釈段階を用いて、ＰＣＲの多重決定を行うことができる。これは、個々の決定の際に得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数の平均値を比較したものから、例えば生体試料中の前もって決められた配列の相対的または絶対個数を推論するためである。生体試料の１つまたは複数の希釈段階を用いて、ＰＣＲの多重決定を行い、そこで得られた１つの特異的な増幅生成物、例えば対立遺伝子特異的な増幅生成物の個数の平均値を、そこで得られたそのほかの特異的な増幅生成物、例えば対立遺伝子特異的な増幅生成物の個数の平均値と、比較することもできる。例えば生体試料の希釈段階１：５および１：１０に対して、ＰＣＲの５重決定をそれぞれ１つずつ行うことができる。この場合、ＰＣＲで用いられるプライマー対は、少なくとも１つの対立遺伝子特異的な配列を増幅するため、適合されている。１つの個体の対立遺伝子特異的プライマー対に対するＰＣＲによって、例えば２つの増幅生成物が得られる場合、そしてこれら２つの増幅生成物は、個々の希釈段階においては等しい頻度で現れ、例えばそれぞれ平均値で希釈段階１：５のとき０．５回、希釈段階１：１０のとき０回現れる場合、バイアリールダイソミーを推論することができる。しかし個々の希釈段階において２つの対立遺伝子特異的な増幅生成物が得られ、２つのうち一方は、平均すると他方の２倍の頻度で、例えば増幅生成物１は希釈段階１：５で平均０．９回、増幅生成物は２希釈段階１：１０で平均０．５回現れる場合、あるいは一方は他方よりも高い希釈段階で初めて消失して、例えば増幅生成物１は、希釈段階１：１０で初めて得られなくなるが、増幅生成物２は、すでに希釈段階１：５で得られなくなる場合、この場合はバイアリールトリソミーであることを示す。この多重決定をなす回数は好ましくは２〜１０００、特に好ましくは３〜１００、さらに特に好ましくは４〜１５、最も好ましくは５〜１０とする。
【００５４】
本発明のもう１つの対象物は、異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子タイプを決定するためのキット、特に前記の方法を行うための当該キットであって、下記を含むものである。
ａ）生体試料中に含まれる少なくとも１つの核酸の１つの配列、または少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を、少なくとも１つのＰＣＲで増幅するために適合されている少なくとも１つのプライマー対。
ｂ１）既知の遺伝子型と、好ましくは前もって決められた配列の既知のコピー数とを持つ参照試料。および／または
ｂ２）少なくとも１つの増幅生成物が２０％から１００％未満の確率で生じるように、反応条件が選択されていた場合に、参照試料を用いて、ｄ）に記載のプロトコルに指定されているのと同じ条件下で行われた少なくとも１つの増幅反応の結果。および／または
ｂ３）少なくとも２つの異なる参照試料が、前もって決められた配列の互いに異なる既知のコピー数を１つずつ持つ場合、当該２つの互いに異なる参照試料を用いて、プロトコルｄ）で指定されたのと同じ反応条件下で、少なくとも１つを増幅反応として同じものを別々にそれぞれ複数回行うことと、次に１参照試料当たり得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定することとによって得られた少なくとも１つの頻度分布。および
ｃ）場合によってはＰＣＲ用緩衝液。および
ｄ）ａ）において少なくとも１つのＰＣＲを行うためのプロトコル、および場合によっては濃度の異なる少なくとも２つの部分量について行われる希釈に関するデータ。
【００５５】
本発明の１つの好ましい実施形態では、このキットが、既知の遺伝子型と、好ましくは前もって決められた配列に関して既知であるコピー数とを持つ参照試料ｂ１）を含む。遺伝子型が既知である参照試料を用いて、生体試料の個々の部分量を用いる場合と同じ増幅反応を少なくとも１つ行う。これにより、本発明の範囲内で増幅生成物をキャラクタリゼーションするとき、生体試料の部分量の１つに対して得られた増幅生成物の個数を、少なくとも１つの増幅反応において参照試料に対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と比較する。この比較によって、生体試料中の１つの個体の核酸において、前もって決められた配列の相対的コピー数を推論することができる。参照試料のうち少なくとも２つの濃度の異なる部分量に、調査される生体試料の部分量と同じ条件下で行われる増幅反応をそれぞれ少なくとも１回加えると、生体試料に含まれる１つの個体の核酸において、前もって決められた配列の絶対的コピー数さえ推論することができる。
【００５６】
本発明のキットは、参照試料の代わりに、あるいはそれより好ましさが減じるとしても参照試料ｂ１）に加えて、ｄ）に記載のプロトコルに指定されるのと同じ条件下で参照試料を用いておこなわれる少なくとも１つの増幅反応の結果ｂ２）、および／または少なくとも１つの頻度分布ｂ３）を含むことができる。上記の反応条件は、少なくとも１つの増幅生成物が、２０％から１００％未満までの確率で形成されるような条件を選択されている。また上記の頻度分布は、少なくとも２つの異なる参照試料を用いて、プロトコルｄ）に指定されたのと同一な反応条件下で行われた少なくとも１つの増幅反応、かつ同一の増幅反応を別々にそれぞれ複数回行うことによって、そしてそれに続いて、１参照試料ごとに得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定することによって、得られたものである。上記の少なくとも２つの異なる参照試料は、前もって決められた配列の、互いに異なる既知のコピー数を１つずつ持つ。プロトコルｄ）にいう生体試料の１つの部分量を用いて少なくとも１つの増幅反応を行い、そこで得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と、ｂ２）にいう結果を比較することにより、生体試料に含まれる１つの個体の核酸中にある前もって決められた配列の相対的コピー数を決定することができる。他方では、ｂ３）にいう頻度分布と相応に比較することによって、生体試料中に含まれる１つの個体の核酸中にある前もって決められた配列の絶対的コピー数を決定することができる。
【００５７】
本発明のキットの１つの好ましい実施形態では、ＤＮＡ非コード化領域に属する１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列、好ましくは高多型性の互いに相同な配列および／または非相同な配列であって、かつ特に好ましくはＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列、およびこれらの任意の組み合わせからなるグループから選択されたものを、少なくとも１つのＰＣＲにおいて増幅するため、前記少なくとも１つのプライマー対が適合されているものとする。
【００５８】
本発明の考えの発展形として、互いに相同な配列および／または非相同な配列を１〜１００個、好ましくは２〜２０個、特に好ましくは５〜１５個、少なくとも１つのＰＣＲで増幅するために、ａ）にいう少なくとも１つのプライマー対、および／または本発明によるキットのｄ）にいうプロトコルを適合させることを提案する。
【００５９】
下記では実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実施例は本発明を説明するものであって、本発明を限定するものではない。
【００６０】
（実施例１）
本例は、母体血液中にある胎児細胞の遺伝子型を決定しようというものである。
【００６１】
胎児細胞は、母体血液中に約１：１，０００，０００の頻度で現れる。胎児細胞は母体血液中で、さまざまな方法で濃縮することができる。その例として、胎児細胞に対して特異的な抗体を持つ磁気ビードを用いるか、あるいは、メンブレン蛋白質によって胎児細胞を検出、分離する細胞ソーターを用いることができる。この方法で、母体血液中にある胎児細胞を、比率１：１０００まで濃縮することができる。
【００６２】
下記では、そのようにして濃縮された試料を用いて、胎児が２１番トリソミーに該当するかどうかを決定したい。この例では、試料中に約１０，０００個の細胞があることが、細胞ソーター実験から既知である。そのほか参照試料実験から、次のことが既知である。すなわち、１細胞あたり２１番染色体が２コピーのとき、ＰＣＲで１０細胞未満を用いるならば、あるいは１細胞あたり２１番染色体が３コピーのとき、ＰＣＲで７細胞未満を用いるならば、ここで用いられたＳＴＲシステムに対して（参照実験と同じプロトコルの場合）ドロップアウトが生じる。すなわち使用されたプライマー対に含まれる増幅生成物の非増幅が生じる。
【００６３】
まず濃縮された混合試料の１つの部分量に、１つのプライマー対を用いるＰＣＲを行ったが、この混合試料は、胎児細胞と母体血液を１：１０００の比率で含む。この場合のプライマー対は、２１番染色体のＳＴＲ配列を１つずつ増幅するために適合されていた。したがって、２１番染色体に関して同型接合性ある健康な個体に対しては１つの増幅生成物が、２１番染色体に関して異型接合性ある健康な個体に対しては２つの増幅生成物が、モノアリールトリソミーを持つ個体に対しては１つの増幅生成物が、バイアリールトリソミーを持つ個体に対しては２つの増幅生成物が予想される。また生体試料のもう１つの部分量を用いて希釈シリーズをピペット計量し、いずれの希釈段階の部分量にも、希釈されない試料の部分量に対するのと同じＰＣＲを行った。この場合下記表１の結果が得られた。
【００６４】
【表１】
表１で認められるように、鎖長が１３２ｂｐおよび１４４ｂｐの各増幅生成物は、希釈率が１：１０００および１：５００となるまで得られる。それに対して、そのほかの２つの増幅生成物、鎖長が１３６ｂｐのものおよび１５６ｂｐのものは、すでに希釈率が１：５および１：７で消失する。このことから、対立遺伝子で鎖長が１３６ｂｐのもの、および１５６のものは、胎児に割り当てることができる。なぜならばこれらの対立遺伝子は、そのほかの２つの対立遺伝子であって鎖長が１３２ｂｐのもの、および１４４ｂｐのものよりも、はるかに小さい希釈率で消失するからである。組織内の母体細胞と比較することにより、この結果を確認することができる。
【００６５】
しかし上記の結果だけでは、鎖長１３６ｂｐおよび１５６ｂｐの各対立遺伝子が、１コピーで現れるか、２コピーで現れるかを、確実に結論することはできない。このためには、希釈段階１：５の生体試料の複数の部分量を用いて、それぞれ前記の増幅反応と同じ増幅反応を、５回の平行する実験で行う。これは基本的に、５回からなる多重決定に相当する。この場合下記表２の結果が得られた。
【００６６】
【表２】
続いて同じ実験を、希釈段階１：７の部分量を用いてそれぞれ５回行った。この場合、下記表３の結果が得られた。
【００６７】
【表３】
上記の表から、鎖長１５６ｂｐの対立遺伝子は、あたえられた希釈段階で、鎖長１３６ｂｐの対立遺伝子よりもいちじるしく高い確率で、ドロップアウト、すなわち予想された増幅生成物の消失を示す。このことから、鎖長１３６ｂｐの対立遺伝子は１細胞あたりそれぞれ２コピー、鎖長１５６ｂｐの対立遺伝子は１細胞あたり１コピー現れることを、ある程度の確率で結論できる。これら２つの対立遺伝子が１細胞当たり等しいコピー数現れるようなことがあれば、等しい希釈率におけるドロップアウトの頻度も等しいこととなろう。
【００６８】
したがって上記の実験によって、２つの異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つの個体の対立遺伝子の相対個数について言明することができる。この具体的ケースでは、この胎児に対してバイアリール２１番トリソミーを診断した。専門家には理解できることであるが、この増幅反応の際に２つ以上のプライマー対を用いるならば、上記の試みによる当該証言の確実性を向上できるであろう。
【００６９】
（実施例２）
実施例１に記載したと同様なプロセスを行ったが、ＰＣＲにおいて、胎児細胞を含む母体血液から、もう１つの生体試料を用いた。この場合、下記表４の結果を得た。
【００７０】
【表４】
上記表４に記載したように、鎖長が１３６ｂｐ、１５６ｂｐ、１６０ｂｐの各増幅生成物は、鎖長が１３２ｂｐ、１４４ｂｐの各増幅生成物よりも低い希釈段階で消失する。このことから、前者３つの増幅生成物は、生体試料中に微量存在する胎児細胞に割り当てるべきであり、それに対して後者２つの増幅生成物は、母親に割り当てるべきであると推論される。希釈されない試料の場合、胎児のものとしては３つの増幅生成物が、それに対して母親のものとしては２つの増幅生成物が含まれていたので、胎児は２１番染色体のトリアリールトリソミーに罹患していると、大きな確率をもって言明することができる。
【００７１】
（実施例３）
下記では法医学的混合試料、すなわち、暴力犯罪の犯行現場で得られた、様々に異なるあの核酸を含む生体試料を、キャラクタリゼーションしたい。
【００７２】
このため実施例１と同様に、生体試料の様々に異なる希釈段階を用いて増幅反応を行い、下記表５の結果を得た。
【００７３】
【表５】
表５から認められるように、合計４つの増幅生成物が得られ、そのうち２つ、すなわち鎖長１３２ｂｐおよび１４４ｂｐの各増幅生成物は、高い希釈段階（１：５００および１：１０００）で初めて消失する。それに対してそのほかの２つ、すなわち鎖長１３６ｂｐおよび１５６ｂｐの各増幅生成物は、１：５および１：７という低い希釈段階ですでに消失する。このことから、この生体試料は２つの異なる個体の核酸を含み、個体１には鎖長１３２ｂｐおよび１４４ｂｐの各対立遺伝子が割り当てられ、他方で個体２には鎖長１３６ｂｐおよび１５６ｂｐの各対立遺伝子が割り当てられると推論される。これらの組み合わせには類似の希釈段階でドロップアウトが生じるので、この結論には容易に達することができる。したがって、さらに第三者の核酸がその生体試料内に含まれていることは、非常にありえない。もしそうならば、２つの個体からただ１つの対立遺伝子が生体試料中に存在することになるからである。しかしこれは非常にありえない。これら２つの個体の核酸は、ここで前記の同様に詳しくキャラクタリゼーションできる。
【００７４】
前記の実施例が示すように、希釈シリーズと、希釈されない生体試料や生体試料の個々の希釈段階を用いて対応する増幅反応を行うこととによって、少なくとも１つの前もって決められた配列の相対的頻度を決定するだけでなく、アイデンティティ決定、すなわち個々の対立遺伝子のコピー数の決定を行うこともできる。そのための前提条件は、生体試料中の個々の個体の核酸の量に差があることである。アイデンティティ決定のためには、この差は係数にして約１０が好ましい。しかし、例えば微量の混合試料から取った１つの固体の対立遺伝子のコピー数を決定したいならば、それより小さい差でも十分である。しかしその場合統計上の確かさを上げるためにはある程度の冗長性、例えば該当する部分量を用いたマルチプレックスＰＣＲ、またはＰＣＲの多重決定などによる冗長性が必要である。
【００７５】
（実施例４）
例えば妊娠中の女性の場合、母体血液だけでなく胎児細胞も含む可能性がある生体試料が、そのような胎児細胞を含むかどうかを、そしてそのような細胞が存在する場合は、母体細胞と胎児細胞との関係はいかなるものかを決定したい。
【００７６】
母体血液に対する胎児細胞の相対的細胞数の決定は、従来の技術で知られているようなＰＣＲに基づく方法では不可能であるか、もし可能であるとしても極めて不完全である。なぜならば、母体血液中に胎児細胞は、細胞百万個に対して１個という頻度でしか現れないからである。その点で、従来の技術から知られている方法の場合、そもそも評価可能な結果を得ようとすれば、母体血液１μｇ以上をＰＣＲに投入しなければならない。しかしこの種の高いＤＮＡ出発量を用いるＰＣＲは、経過がもはや最適ではなく、その結果、不正確な結果しか得られない。これを避けるため、胎児細胞をＦＡＣＳ（蛍光細胞分別器）によって濃縮することが、すでに提案されている。しかしこの濃縮によっては状況にいちじるしくバイアスがかかる。
【００７７】
生体試料中には、胎児細胞以外に母体細胞が過剰量存在し、双方の細胞型がそれぞれ２倍体核型を持つので、この生体試料中には、いずれの遺伝子に対しても最大４個のそれぞれ異なる対立遺伝子が存在する。母体細胞が過剰量存在するという仮説は、つねに存在することとなろう。ＰＣＲにおいて、ここである特定の遺伝子断片に対して対立遺伝子特異的なプライマー対を用い、下記表６の結果を得た。
【００７８】
【表６】
１希釈段階ごとの正のＰＣＲの個数を比較すると、生体試料中に母体細胞が、胎児細胞よりも多く含まれていることは明らかであることがわかる。なぜならば胎児細胞の増幅の場合の方が、母体細胞の場合よりも早く、ＤＮＡコピーにドロップアウトを生じるからである。したがって胎児細胞の場合、最初のドロップアウトは、希釈段階１：８ですでに観察され、１：１６の希釈段階で胎児細胞に対しては何ら増幅生成物が得られなくなる。しかし母体細胞の場合、ドロップアウトは希釈段階１：３２で初めて開始され、その後希釈段階１：６４以降になってから、母体細胞にも増幅細胞が得られなくなる。
【００７９】
これらの２つの試料は最初から混合されていて、ドロップアウトから得たこれら試料に関しての相対比較による言明は（母体細胞の場合の希釈段階１：６４を胎児細胞の場合の希釈段階１：１６と比較）、ここでは、母体細胞は胎児細胞の４倍の量が存在したということである。
【００８０】
胎児細胞および／または母体細胞を、ここで前記と同じようにしてさらにキャラクタリゼーションできる。
【００８１】
（実施例５）
１人の人間の生体試料が、健康な細胞だけでなく、ＬＯＨによって生じたガン細胞をも含むかどうか決定したい。
【００８２】
このため、遺伝子断片Ｄ８５５２２を増幅するプライマー対を用いて、生体試料の様々に異なる希釈段階で増幅反応を行い、下記表７の結果を得た。
【００８３】
【表７】
上記表７からは、対立遺伝子Ｉ‐２は、すべての希釈段階で含まれていたが、対立遺伝子Ｉ−１が増幅されたのは、希釈段階１：１６までに限られた。このことは、この生体試料中に、対立遺伝子Ｉ‐２の方が対立遺伝子Ｉ‐１よりも多くのコピー数が存在することを示す。このことから、この生体試料が、対立遺伝子Ｉの点で異型接合性ある健康な細胞だけでなく、ＬＯＨによって生じたガン細胞、すなわち対立遺伝子Ｉの点では同型接合性しかないガン細胞をも含むことを、ある程度の確率をもって推論することができる。
【００８４】
この結果が正しいことは次のようにして確認できる。すなわちこの生体試料の複数の部分量を希釈して、それにより、これら部分量がそれぞれ細胞を１つだけ含むようにして、次に各分量のＤＮＡを非特異的に増幅する。その後、各部分量のＤＮＡをゲル電気泳動法によって分離し、前記の遺伝子断片にとって特異的なプローブを用いて、サザンブロット法によって可視化する。２つの部分量を適用した後の結果を、図２に記載した。
【００８５】
図２に記載するように、この生体試料は２つの細胞型を含み、そのうち１つは、Ｄ８５５２２遺伝子の２つの対立遺伝子を含む（トレース“Ｎ”の下側２つのバンド）。それに対してもう１つは、Ｄ８５５２２遺伝子の２つの対立遺伝子の一方だけを含む（トレース“Ｔ”の下側のバンド）。ゲルの上半分に結像されたバンドは、いわゆる“コンフォメーション・バンド（conformation band）”であって、新たにフォールディングされた配列によって、各対立遺伝子から生じるものである。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
以上説明したように、本発明は、異なる個体の核酸を含む生体試料から遺伝子型を決定する方法について有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】使用される細胞の個数または使用されるコピーの個数に対する依存性を示す図である。
【図２】可視化した正常な細胞及びガン細胞のＤＮＡを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の固体の遺伝子型を決定する方法、特には、前もって決められた配列のコピー数を決定する方法であって、
ａ）それぞれ異なる濃度の前記生体試料を含む生体試料の部分量を少なくとも２つ作成する、
ｂ）前記生体試料から手順ａ）で作成された部分量のいずれについても、それぞれ少なくとも１つの増幅反応を行うが、この場合、少なくとも１つの増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つに含有される１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものであり、
ｃ）前記少なくとも２つの部分量に対し、手順ｂ）によるそれぞれ少なくとも１つの増幅反応により得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定して、そこで得られた数を比較する、
ｄ）前記少なくとも２つの部分量のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数として手順ｃ）で決定された個数が等しい場合、手順ａ）で作成された部分量とはそれぞれ異なる濃度を持つ生体試料を少なくとももう１つ作成し、そして手順ｂ）およびｃ）、そして場合によってはｄ）を繰り返すが、この繰り返しは、手順ｃ）において少なくとも１つの部分量に対し、それぞれ異なる増幅生成物がそのほかの部分量に対して異なる個数得られるまで行う、
ｅ）前記少なくとも１つの部分量に対して、そのほかの部分量に対するのと異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が、前記少なくとも１つの増幅反応で得られた場合、当該少なくとも１つの部分量によって得られた増幅性生成物をキャラクタリゼーションし、および／または、そのほかの部分量に対するのとは異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が得られた前記少なくとも１つの部分量に対してのみならず、そのほかの部分量に対しても、得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションする、
という各手順を含む、方法。
【請求項２】
異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定する方法、特には、前もって決められたコピー数を決定する方法であって、
ａ）前記生体試料の１つの部分量を作成する、
ｂ）前記生体試料の部分量を用いて少なくとも１つの増幅反応を行うが、その際、当該少なくとも１つの増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つに含有される１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものであり、
ｃ）手順ｂ）の少なくとも１つの増幅反応のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定する、
ｄ）前記生体試料のもう１つの部分量を作成し、当該生体試料の当該もう１つの部分量を希釈し、そして当該希釈された試料を用いて、手順ｂ）と同じ条件下で少なくとも１つの増幅反応を行う、
ｅ）手順ｄ）の少なくとも１つの増幅反応のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定する、
ｆ）手順ｃ）で決定された様々に異なる増幅生成物の個数を、手順ｅ）で決定された様々に異なる増幅生成物の個数と比較する、
ｇ）手順ｃ）で決定された個数が、手順ｅ）で決定された個数に等しい場合、当該生体試料の希釈率を高くして手順ｄ）〜ｆ）を繰り返し、この繰り返しは、手順ｅ）で得られる様々に異なる増幅生成物の個数が、手順ｃ）におけるよりも小さくなるまで行う、
ｈ）手順ｅ）で得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数が手順ｃ）におけるよりも小さくなる希釈率を用いて、手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応の際にではなく、手順ｂ）による少なくとも１つの増幅反応の際に得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションし、および／または、手順ｅ）で得られたそれぞれ異なる増幅生成物が、手順ｃ）におけるよりも小さくなる希釈率を用いて、手順ｂ）による少なくとも１つの増幅反応の際だけでなく、手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応の際にも得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションする、
という各手順を含む方法。
【請求項３】
前記生体試料が、少なくとも２つの異なる個体、好ましくは少なくとも２つから１０個未満までの範囲、特に好ましくは少なくとも２つから５つ未満までの範囲、さらに好ましくは２つまたは３つ、最も好ましくは正確に２つの異なる個体の核酸を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記各個体の生体試料中に含まれる核酸の濃度の相違が、１：１０００〜１：１、好ましくは１：５００〜１：５、特に好ましくは１：１００〜１：１０であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料として法医学的試料が用いられることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料が胎児細胞を含む母体血液を含み、あるいは好ましくは胎児細胞を含む母体血液からなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料が健康な細胞とＬＯＨによって生じたガン細胞との混合試料であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの増幅反応はＰＣＲ反応であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの増幅反応が、ＤＮＡ非コード化領域に由来する１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を、増幅するため適合されたものであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの増幅反応が、多型性の高い１つの配列、または多型性の高い少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を、増幅するために適合されたものであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの増幅反応が、ＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列、およびこれらの任意の組み合わせからなるグループから選択された１つの配列、または同様に選択された少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を、増幅するために適合されたものであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの増幅反応が、ドナーのゲノムにおいて１対立遺伝子あたりただ１回だけ現れる１つの配列、または同様な現れ方をする少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの増幅反応が１〜１００個の、好ましくは２〜２０個の、特に好ましくは５〜１５個の互いに相同な配列および／または非相同な配列を、増幅するために適合されたものであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
手順ｂ）〜手順ｄ）において、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するため適合されたＰＣＲを行い、当該ＰＣＲにおいては、前記少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されているプライマー対が、前記少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の個数に相当する個数だけ使用されていることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
手順ｂ）〜手順ｄ）において、少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を増幅するため適合されたＰＣＲが行われ、その際手順ａ）において、前記生体試料の部分量が、当該少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列の個数に相当する個数だけ作成され、その際、いずれの部分量も同量の生物物質を含むことと、そしてまた手順ｂ）〜手順ｄ）においては、部分量のいずれについても、プライマー対が１つずつ用いられるＰＣＲが行われ、この場合、それぞれ異なるＰＣＲで用いられるプライマー対が、当該少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を増幅するため適合されていることとを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記生体試料が、手順ａ）が行われる前に非特異的なＰＣＲによって増幅され、そして場合によっては、こうして得られた反応生成物が、必要な個数の部分量に区分されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅生成物の有無の決定が、ゲル電気泳動法、ＤＮＡアレイ上のハイブリダイゼーション技術、ビードシステム、またはそのほかの光学的、電気的、または電気化学的測定によって行われることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅反応の後、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定するため、１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の有無を決定し、そして、得られた増幅生成物から、物理的および／または化学的に測定可能な第２のパラメーターを決定することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列が、ＳＴＲは配列および／またはＶＮＴＲ配列であり、そして第２のパラメーターとして、得られた増幅生成物の鎖長が決定され、その際、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数が、それと異なる鎖長の増幅生成物として得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数に相当することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅生成物の鎖長が、毛管電気泳動法によって決定されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つの配列、または少なくとも２つの互に相同な配列および／または非相同な配列がＳＮＰ配列であり、そして第２のパラメーターとして、得られた増幅生成物の配列が決定され、その際、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数が、それと異なる配列を持つ増幅生成物として得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数に相当することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅生成物の配列が、ＤＮＡシーケンシングまたはハイブリダイゼーション法によって決定されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
手順ｂ）〜手順ｄ）における少なくとも１つのＰＣＲで、前記パラメーターが選択される際、前記１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列のいずれに対しても、正の増幅反応の相対的頻度が、それぞれ少なくともほぼ等しくなるように選択されることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
手順ｂ）〜手順ｄ）における少なくとも１つのＰＣＲで、前記パラメーターが選択される際、前記１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列のいずれに対しても、正の増幅反応の相対的頻度が、０．２から１未満までの範囲、好ましくは０．４から０．６までの範囲、特に好ましくは約０．５であることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
手順ｂ）〜手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応と平行して、対照試料を用いながら同条件下で増幅反応を行うことを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項２に記載する方法の手順ｄ）における生体試料の部分量は、１：１〜１：１０００、好ましくは１：１〜１：１００、特に好ましくは１：１〜１：１０、さらに好ましくは１：１〜１：２の比率で希釈されることを特徴とする、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅生成物をキャラクタリゼーションする際に、前もって決められた配列の対立遺伝子の相対個数を決定することを特徴とする、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、少なくとも１つの増幅反応を、手順ｂ）と同条件下で参照試料を用いて行い、当該参照試料は、前記生体試料と同量のＤＮＡを持ち、そして好ましくは既知の遺伝子型を持つことと、当該少なくとも１つの増幅反応によって得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を、前記部分量のただ一部分に対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と、または、請求項２の方法においてその手順ｃ）で得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数から手順ｅ）で得られたそれを引いたものと、および／または、すべての部分量に対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と、または、請求項２の方法における手順ｅ）で決定されたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と、比較することを特徴とする、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
手順ｃ）で得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数から手順ｅ）で得られたそれの個数を差し引いたもの、および／または手順ｅ）で決定されたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を、少なくとも１つの頻度分布と比較するが、当該頻度分布とは、手順ｂ）におけると同じ反応条件下で用いられた少なくとも１つの増幅反応として同じ当該増幅反応を別々にそれぞれ複数回、少なくとも２つの異なる参照試料を用いて行うことによって、そしてまた１参照資料ごとに得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定することによって、得られた／得られるものであり、この場合、当該増幅反応においては、手順ａ）に挙げたと同量の出発材料が用いられた／用いられるものであり、またこの場合、前記少なくとも２つの異なる参照試料は、前もって決められた配列の互いに異なる既知のコピー数をそれぞれ１つずつ持つことを特徴とする、請求項２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、得られた増幅生成物をシーケンシングし、あるいは当該増幅生成物にハイブリダイゼーション法を行うことを特徴とする、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記生体試料の１つまたは複数の希釈段階を用いて増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、少なくとも１つのＰＣＲの多重決定を行い、当該ＰＣＲの際には好ましくは少なくとも１つの対立遺伝子特異的なプライマー対を使用することを特徴とする、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記多重決定をなす回数が２〜１０００、好ましくは３〜１００、特に好ましくは４〜１５、最も好ましくは５〜１０であることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子タイプを決定するためのキット、特に請求項１〜３２のいずれかに記載の方法を行うための当該キットであって、
ａ）生体試料中に含まれる少なくとも１つの核酸の１つの配列、または少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を、少なくとも１つのＰＣＲで増幅するために適合されている少なくとも１つのプライマー対、
ｂ１）既知の遺伝子型と、好ましくは前もって決められた配列の既知のコピー数とを持つ参照試料、および／または
ｂ２）少なくとも１つの増幅生成物が２０％から１００％未満の確率で生じるように、反応条件が選択されていた場合に、参照試料を用いて、ｄ）に記載のプロトコルに指定されているのと同じ条件下で行われた少なくとも１つの増幅反応の結果、および／または
ｂ３）少なくとも２つの異なる参照試料が、前もって決められた配列の互いに異なる既知のコピー数を１つずつ持つ場合、当該２つの互いに異なる参照試料を用いて、プロトコルｄ）で指定されたのと同じ反応条件下で、少なくとも１つを増幅反応として同じものを別々にそれぞれ複数回行うことと、次に１参照試料当たり得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定することとによって得られた少なくとも１つの頻度分布、および
ｃ）場合によってはＰＣＲ用緩衝液、および
ｄ）ａ）において少なくとも１つのＰＣＲを行うためのプロトコル、および場合によっては実行される希釈に関するデータ
を含む、キット。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのＰＣＲにおいて、ＤＮＡ非コード化領域にある１つの配列、または少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列、好ましくは高多型性の互いに相同な配列および／または非相同な配列、特に好ましくはＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列、およびこれらの任意の組み合わせからなるグループから選択された当該高多型性の配列を増幅するために、前記少なくとも１つのプライマー対が適合されていることを特徴とする、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記ａ）に記載の少なくとも１つのプライマー対および／または前記ｄ）に記載のプロトコルが、少なくとも１つのＰＣＲにおいて、１〜１００個の、好ましくは２〜２０個の、特に好ましくは５〜１５個の互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されていることを特徴とする、請求項３３または３４に記載のキット。
【請求項１】
異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の固体の遺伝子型を決定する方法、特には、前もって決められた配列のコピー数を決定する方法であって、
ａ）それぞれ異なる濃度の前記生体試料を含む生体試料の部分量を少なくとも２つ作成する、
ｂ）前記生体試料から手順ａ）で作成された部分量のいずれについても、それぞれ少なくとも１つの増幅反応を行うが、この場合、少なくとも１つの増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つに含有される１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものであり、
ｃ）前記少なくとも２つの部分量に対し、手順ｂ）によるそれぞれ少なくとも１つの増幅反応により得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定して、そこで得られた数を比較する、
ｄ）前記少なくとも２つの部分量のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数として手順ｃ）で決定された個数が等しい場合、手順ａ）で作成された部分量とはそれぞれ異なる濃度を持つ生体試料を少なくとももう１つ作成し、そして手順ｂ）およびｃ）、そして場合によってはｄ）を繰り返すが、この繰り返しは、手順ｃ）において少なくとも１つの部分量に対し、それぞれ異なる増幅生成物がそのほかの部分量に対して異なる個数得られるまで行う、
ｅ）前記少なくとも１つの部分量に対して、そのほかの部分量に対するのと異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が、前記少なくとも１つの増幅反応で得られた場合、当該少なくとも１つの部分量によって得られた増幅性生成物をキャラクタリゼーションし、および／または、そのほかの部分量に対するのとは異なる個数のそれぞれ異なる増幅生成物が得られた前記少なくとも１つの部分量に対してのみならず、そのほかの部分量に対しても、得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションする、
という各手順を含む、方法。
【請求項２】
異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子型を決定する方法、特には、前もって決められたコピー数を決定する方法であって、
ａ）前記生体試料の１つの部分量を作成する、
ｂ）前記生体試料の部分量を用いて少なくとも１つの増幅反応を行うが、その際、当該少なくとも１つの増幅反応は、生体試料に含まれる核酸の少なくとも１つに含有される１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものであり、
ｃ）手順ｂ）の少なくとも１つの増幅反応のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定する、
ｄ）前記生体試料のもう１つの部分量を作成し、当該生体試料の当該もう１つの部分量を希釈し、そして当該希釈された試料を用いて、手順ｂ）と同じ条件下で少なくとも１つの増幅反応を行う、
ｅ）手順ｄ）の少なくとも１つの増幅反応のいずれに対しても、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定する、
ｆ）手順ｃ）で決定された様々に異なる増幅生成物の個数を、手順ｅ）で決定された様々に異なる増幅生成物の個数と比較する、
ｇ）手順ｃ）で決定された個数が、手順ｅ）で決定された個数に等しい場合、当該生体試料の希釈率を高くして手順ｄ）〜ｆ）を繰り返し、この繰り返しは、手順ｅ）で得られる様々に異なる増幅生成物の個数が、手順ｃ）におけるよりも小さくなるまで行う、
ｈ）手順ｅ）で得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数が手順ｃ）におけるよりも小さくなる希釈率を用いて、手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応の際にではなく、手順ｂ）による少なくとも１つの増幅反応の際に得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションし、および／または、手順ｅ）で得られたそれぞれ異なる増幅生成物が、手順ｃ）におけるよりも小さくなる希釈率を用いて、手順ｂ）による少なくとも１つの増幅反応の際だけでなく、手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応の際にも得られた増幅生成物をキャラクタリゼーションする、
という各手順を含む方法。
【請求項３】
前記生体試料が、少なくとも２つの異なる個体、好ましくは少なくとも２つから１０個未満までの範囲、特に好ましくは少なくとも２つから５つ未満までの範囲、さらに好ましくは２つまたは３つ、最も好ましくは正確に２つの異なる個体の核酸を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記各個体の生体試料中に含まれる核酸の濃度の相違が、１：１０００〜１：１、好ましくは１：５００〜１：５、特に好ましくは１：１００〜１：１０であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料として法医学的試料が用いられることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料が胎児細胞を含む母体血液を含み、あるいは好ましくは胎児細胞を含む母体血液からなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料が健康な細胞とＬＯＨによって生じたガン細胞との混合試料であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの増幅反応はＰＣＲ反応であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの増幅反応が、ＤＮＡ非コード化領域に由来する１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を、増幅するため適合されたものであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの増幅反応が、多型性の高い１つの配列、または多型性の高い少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を、増幅するために適合されたものであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの増幅反応が、ＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列、およびこれらの任意の組み合わせからなるグループから選択された１つの配列、または同様に選択された少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を、増幅するために適合されたものであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの増幅反応が、ドナーのゲノムにおいて１対立遺伝子あたりただ１回だけ現れる１つの配列、または同様な現れ方をする少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されたものであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの増幅反応が１〜１００個の、好ましくは２〜２０個の、特に好ましくは５〜１５個の互いに相同な配列および／または非相同な配列を、増幅するために適合されたものであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
手順ｂ）〜手順ｄ）において、少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するため適合されたＰＣＲを行い、当該ＰＣＲにおいては、前記少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されているプライマー対が、前記少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の個数に相当する個数だけ使用されていることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
手順ｂ）〜手順ｄ）において、少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を増幅するため適合されたＰＣＲが行われ、その際手順ａ）において、前記生体試料の部分量が、当該少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列の個数に相当する個数だけ作成され、その際、いずれの部分量も同量の生物物質を含むことと、そしてまた手順ｂ）〜手順ｄ）においては、部分量のいずれについても、プライマー対が１つずつ用いられるＰＣＲが行われ、この場合、それぞれ異なるＰＣＲで用いられるプライマー対が、当該少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を増幅するため適合されていることとを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記生体試料が、手順ａ）が行われる前に非特異的なＰＣＲによって増幅され、そして場合によっては、こうして得られた反応生成物が、必要な個数の部分量に区分されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅生成物の有無の決定が、ゲル電気泳動法、ＤＮＡアレイ上のハイブリダイゼーション技術、ビードシステム、またはそのほかの光学的、電気的、または電気化学的測定によって行われることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅反応の後、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定するため、１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列の有無を決定し、そして、得られた増幅生成物から、物理的および／または化学的に測定可能な第２のパラメーターを決定することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列が、ＳＴＲは配列および／またはＶＮＴＲ配列であり、そして第２のパラメーターとして、得られた増幅生成物の鎖長が決定され、その際、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数が、それと異なる鎖長の増幅生成物として得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数に相当することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅生成物の鎖長が、毛管電気泳動法によって決定されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つの配列、または少なくとも２つの互に相同な配列および／または非相同な配列がＳＮＰ配列であり、そして第２のパラメーターとして、得られた増幅生成物の配列が決定され、その際、得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数が、それと異なる配列を持つ増幅生成物として得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数に相当することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅生成物の配列が、ＤＮＡシーケンシングまたはハイブリダイゼーション法によって決定されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
手順ｂ）〜手順ｄ）における少なくとも１つのＰＣＲで、前記パラメーターが選択される際、前記１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列のいずれに対しても、正の増幅反応の相対的頻度が、それぞれ少なくともほぼ等しくなるように選択されることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
手順ｂ）〜手順ｄ）における少なくとも１つのＰＣＲで、前記パラメーターが選択される際、前記１つの配列、または少なくとも２つの互いに相同な配列および／または非相同な配列のいずれに対しても、正の増幅反応の相対的頻度が、０．２から１未満までの範囲、好ましくは０．４から０．６までの範囲、特に好ましくは約０．５であることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
手順ｂ）〜手順ｄ）による少なくとも１つの増幅反応と平行して、対照試料を用いながら同条件下で増幅反応を行うことを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項２に記載する方法の手順ｄ）における生体試料の部分量は、１：１〜１：１０００、好ましくは１：１〜１：１００、特に好ましくは１：１〜１：１０、さらに好ましくは１：１〜１：２の比率で希釈されることを特徴とする、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅生成物をキャラクタリゼーションする際に、前もって決められた配列の対立遺伝子の相対個数を決定することを特徴とする、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、少なくとも１つの増幅反応を、手順ｂ）と同条件下で参照試料を用いて行い、当該参照試料は、前記生体試料と同量のＤＮＡを持ち、そして好ましくは既知の遺伝子型を持つことと、当該少なくとも１つの増幅反応によって得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を、前記部分量のただ一部分に対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と、または、請求項２の方法においてその手順ｃ）で得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数から手順ｅ）で得られたそれを引いたものと、および／または、すべての部分量に対して得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と、または、請求項２の方法における手順ｅ）で決定されたそれぞれ異なる増幅生成物の個数と、比較することを特徴とする、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
手順ｃ）で得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数から手順ｅ）で得られたそれの個数を差し引いたもの、および／または手順ｅ）で決定されたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を、少なくとも１つの頻度分布と比較するが、当該頻度分布とは、手順ｂ）におけると同じ反応条件下で用いられた少なくとも１つの増幅反応として同じ当該増幅反応を別々にそれぞれ複数回、少なくとも２つの異なる参照試料を用いて行うことによって、そしてまた１参照資料ごとに得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定することによって、得られた／得られるものであり、この場合、当該増幅反応においては、手順ａ）に挙げたと同量の出発材料が用いられた／用いられるものであり、またこの場合、前記少なくとも２つの異なる参照試料は、前もって決められた配列の互いに異なる既知のコピー数をそれぞれ１つずつ持つことを特徴とする、請求項２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、得られた増幅生成物をシーケンシングし、あるいは当該増幅生成物にハイブリダイゼーション法を行うことを特徴とする、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記生体試料の１つまたは複数の希釈段階を用いて増幅生成物をキャラクタリゼーションするため、少なくとも１つのＰＣＲの多重決定を行い、当該ＰＣＲの際には好ましくは少なくとも１つの対立遺伝子特異的なプライマー対を使用することを特徴とする、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記多重決定をなす回数が２〜１０００、好ましくは３〜１００、特に好ましくは４〜１５、最も好ましくは５〜１０であることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
異なる個体の核酸を含む生体試料から、１つまたは複数の個体の遺伝子タイプを決定するためのキット、特に請求項１〜３２のいずれかに記載の方法を行うための当該キットであって、
ａ）生体試料中に含まれる少なくとも１つの核酸の１つの配列、または少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列を、少なくとも１つのＰＣＲで増幅するために適合されている少なくとも１つのプライマー対、
ｂ１）既知の遺伝子型と、好ましくは前もって決められた配列の既知のコピー数とを持つ参照試料、および／または
ｂ２）少なくとも１つの増幅生成物が２０％から１００％未満の確率で生じるように、反応条件が選択されていた場合に、参照試料を用いて、ｄ）に記載のプロトコルに指定されているのと同じ条件下で行われた少なくとも１つの増幅反応の結果、および／または
ｂ３）少なくとも２つの異なる参照試料が、前もって決められた配列の互いに異なる既知のコピー数を１つずつ持つ場合、当該２つの互いに異なる参照試料を用いて、プロトコルｄ）で指定されたのと同じ反応条件下で、少なくとも１つを増幅反応として同じものを別々にそれぞれ複数回行うことと、次に１参照試料当たり得られたそれぞれ異なる増幅生成物の個数を決定することとによって得られた少なくとも１つの頻度分布、および
ｃ）場合によってはＰＣＲ用緩衝液、および
ｄ）ａ）において少なくとも１つのＰＣＲを行うためのプロトコル、および場合によっては実行される希釈に関するデータ
を含む、キット。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのＰＣＲにおいて、ＤＮＡ非コード化領域にある１つの配列、または少なくとも２つの相同な配列および／または非相同な配列、好ましくは高多型性の互いに相同な配列および／または非相同な配列、特に好ましくはＳＴＲ配列、ＶＮＴＲ配列、ＳＮＰ配列、およびこれらの任意の組み合わせからなるグループから選択された当該高多型性の配列を増幅するために、前記少なくとも１つのプライマー対が適合されていることを特徴とする、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記ａ）に記載の少なくとも１つのプライマー対および／または前記ｄ）に記載のプロトコルが、少なくとも１つのＰＣＲにおいて、１〜１００個の、好ましくは２〜２０個の、特に好ましくは５〜１５個の互いに相同な配列および／または非相同な配列を増幅するために適合されていることを特徴とする、請求項３３または３４に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００９−５１８０５１（Ｐ２００９−５１８０５１Ａ）
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４４７７７（Ｐ２００８−５４４７７７）
【出願日】平成１８年１０月２４日（２００６．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１０２４５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６８３０５
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０２０９６１９６）アドヴァリティクス アーゲー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２４日（２００６．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１０２４５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６８３０５
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０２０９６１９６）アドヴァリティクス アーゲー (9)
【Ｆターム（参考）】
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