異種タンパク質の発現方法及び異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質
【課題】異なる２種のタンパク質を１つの細胞内で発現させ、誘導条件によるタンパク質の生産管理を安定して行うことが可能なタンパク質の生産方法を確立する。
【解決手段】ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を宿主として、ＰＭＯＤ1プロモーターの下流に第１のタンパク質をコードした塩基配列と、ＰＭＯＤ２プロモーターの下流に第２のタンパク質をコードした塩基配列を導入して該ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）の組換え体を得る工程と、酸素の存在下で該組換え体を培養液中で培養し、その過程で、グリセロール及び／又はキシロースの存在下で該ＰＭＯＤ1プロモーターに第１のタンパク質を発現させる工程と、メタノールの存在下で該ＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程と、を含む、異種タンパク質の発現方法により解決する。
【解決手段】ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を宿主として、ＰＭＯＤ1プロモーターの下流に第１のタンパク質をコードした塩基配列と、ＰＭＯＤ２プロモーターの下流に第２のタンパク質をコードした塩基配列を導入して該ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）の組換え体を得る工程と、酸素の存在下で該組換え体を培養液中で培養し、その過程で、グリセロール及び／又はキシロースの存在下で該ＰＭＯＤ1プロモーターに第１のタンパク質を発現させる工程と、メタノールの存在下で該ＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程と、を含む、異種タンパク質の発現方法により解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は異種タンパク質の発現方法及び異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質に関し、具体的には、任意の異種タンパク質をピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）に導入し、特定の条件で誘導されるプロモーターを制御して、異なる２種のタンパク質を発現させる異種タンパク質の発現方法及び異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、安価で扱いやすいメタノールにより強力に誘導されるプロモーターを有し、高密度で培養可能なメチロトローフ酵母を利用した発現系でタンパク質を大量に生産する例が多数報告されており、工業レベルでの利用に有効な発現系として注目されている。
【０００３】
メチロトローフ酵母の一つであるピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）は、１）メタノールによって強力に誘導される２つのプロモーター（ＰＭＯＤ1およびＰＭＯＤ２）を有する、２）それぞれのプロモーターの転写活性は異なる制御を受けており、誘導条件により厳密に支配されている、さらには３）代表的な酵母であるサッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の１０倍以上の高密度で培養できる、という特徴を有している。このような点から、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）は異種タンパク質を１つの細胞で生産できるタンパク質生産ツールとして高いポテンシャルを示すといえる。
【０００４】
従来、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を利用してタンパク質を生産した例としては、例えば、Invitrogen社によって、ＰＭＯＤ1を用いたP. methanolica Expression Kitが商品化されており、ヒト由来のglutamate decarboxylaseや、leptinといったタンパク質の生産が報告されている（非特許文献１及び２）。また、Pichia methanolica由来のプロモーターを用いてS.セルビシエを形質転換し、異種ポリペプチドを生産する方法も開示されている（特許文献１）。さらに、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を形質転換する際に、選択マーカーとして、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＡＤＥ２遺伝子をコードすることにより、商業的に重要性を有するタンパク質を産生する産生系において使用することができる旨が開示されている（特許文献２）。
【非特許文献１】Gellissen, G., Heterologous protein production in methylotrophic yeasts, "Appl. Microbiol. Biotechnol.", 2000, 54:741-750.
【非特許文献２】Raymond, C. K., T. Bukowski, S. D. Holderman, A. F. T. Ching, E. Vanaja, and R. Stamm, Development of the methylotrophic yeast Pichia methanolica for the expression of the 65 kilodalton isoform of human glutamate decarboxylase, "Yeast", 1998, 14:11-23.
【特許文献１】特表２０００−５０００１４号公報
【特許文献２】特表２００２−５１５７４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質の生産は、発現に使用するプロモーターの転写活性と宿主酵母に依存する。酵母における異種遺伝子発現用プロモーターとしては、どのような生育条件下においても常に一定量構成的に発現されるものや、培地成分などにより誘導可能なものがある。しかしながら、プロモーターは強力であっても転写活性のコントロールが困難であったり、一様にタンパク質生産を行なうだけで、目的タンパク質によっては生産が困難なものが少なくない、などの問題があった。このため、安定した発現制御が可能で、多様なタンパク質生産に対応できる応用範囲の広いプロモーターの制御方法の確立が望まれていた。
【０００６】
そこで、本発明は、異なる２種のタンパク質を１つの細胞内で発現させ、誘導条件によるタンパク質の生産管理を安定して行うことが可能なタンパク質の生産方法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）の有する２種のアルコールオキシダーゼプロモーター（配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1および配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２）について種々の検討を行ったところ、それぞれが異なる性質を有し、必要に応じて２種のタンパク質の発現を個々に制御することが可能であることを見出した。
【０００８】
本発明は係る知見に基づくものであり、以下の発明に関するものである。［１］ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を宿主として、ＰＭＯＤ1プロモーターの下流に配列番号：１に記載される第１のタンパク質をコードした塩基配列と、配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターの下流に第２のタンパク質をコードした塩基配列を導入して該ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）の組換え体を得る工程と、酸素の存在下で該組換え体を培養液中で培養し、その過程で、グリセロール及び／又はキシロースの存在下で配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1プロモーターに第１のタンパク質を発現させる工程と、メタノールの存在下で配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程と、を含む、異種タンパク質の発現方法；
【０００９】
［２］前記グリセロール及び／又はキシロースの濃度が、前記培養液の全量を基準として、０．５〜２％（Ｗ／Ｖ）である、［１］に記載の異種タンパク質の発現方法；
【００１０】
［３］前記メタノールの濃度が、０．１〜３．０％（Ｖ／Ｖ）である、［１］又は［２］に記載の異種タンパク質の発現方法；
【００１１】
［４］前記配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程において、前記培養液を８０ｒｐｍ以上の振盪速度で振盪させる、［１］〜［３］のいずれか１に記載の異種タンパク質の発現方法；
【００１２】
［５］前記第１のタンパク質が緑色蛍光タンパク質であり、前記第２のタンパク質が酸性フォスファターゼである、［１］〜［４］のいずれか１に記載の異種タンパク質の発現方法；
【００１３】
［６］［１］〜［５］のいずれか１に記載の異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の異種タンパク質の発現方法によれば、２種類のタンパク質を１つの細胞中で任意に制御しながら安定して発現させることができる。よって、有用タンパク質を生産するためのツールとして幅広く応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
次に、本発明の実施形態について説明する。本実施形態の異種タンパク質の発現方法は、既述のとおり、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を宿主として、配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1プロモーターの下流に第１のタンパク質をコードした塩基配列と、配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターの下流に第２のタンパク質をコードした塩基配列を導入して該ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）の組換え体を得る工程と、酸素の存在下で該組換え体を培養液中で培養し、その過程で、グリセロール及び／又はキシロースの存在下で配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1プロモーターに第１のタンパク質を発現させる工程と、メタノールの存在下で配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程と、を含む。
【００１６】
宿主細胞として使用されるピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）は、一般に入手可能なピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を使用することができ、例えば、市販の菌株を用いることができる。具体的には、Invitrogen社のＰＭＡＤ１１株などを挙げることができる。
【００１７】
ＰＭＯＤ1プロモーター（配列番号：１）は、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）のアルコールオキシダーゼプロモーターを構成するプロモーターのひとつであり、例えば、Invitrogen社のＰＭＯＤ1プロモーターを用いた発現ベクターｐＭＥＴ Ｂを用いることができる。なお、本ベクターは栄養要求性マーカーとしてＡＤＥ２遺伝子を保持している。
【００１８】
ＰＭＯＤ２プロモーター（配列番号：２）は、ＰＭＯＤ1プロモーターと同様、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）のアルコールオキシダーゼプロモーターを構成するプロモーターのひとつであり、ＭＯＤ２遺伝子の５’上流域１６８５ｂｐを含むものである。なお、本実施形態においては、本プロモーターを用いた発現カセットは栄養要求性マーカーを持たないものを用いる。
【００１９】
なお、「ＭＯＤ」は本来メタノールオキシダーゼの略称であるが、近年、この分野では一般に「アルコールオキシダーゼ」のことをＭＯＤと称するようになっているため、本実施形態においても、ＭＯＤはアルコールオキシダーゼを意味する。
【００２０】
図１は、ＰＭＯＤ1プロモーター（上段、配列番号：１）およびＰＭＯＤ２プロモーター（下段、配列番号：２）の塩基配列を示す図である。図１に示すように、ＰＭＯＤ1、ＰＭＯＤ２の相同性は２３％程度である。タンパク質部分をコードするＭＯＤ１、ＭＯＤ２の相同性が８０％以上であることに鑑みれば、ＰＭＯＤ1プロモーター（配列番号：１）、ＰＭＯＤ２プロモーター（配列番号：２）の相同性は低いものである。このことからも遺伝子レベルでＭＯＤ１、ＭＯＤ２の発現制御に違いがあることが表れているといえる。
【００２１】
図２は、ＰＭＯＤ1プロモーター（配列番号：１）、ＰＭＯＤ２プロモーター（配列番号：２）に含まれるモチーフ配列の検索を行った結果を示す図である。図２に示すように、メタノール誘導配列（ＵＡＳ１、ＵＡＳ２）やグルコースリプレッションに関与するＭＩＧ１モチーフが両プロモーターに共通して存在している。そして、それぞれのプロモーターでそれら配列の場所や向きが異なっている。また、ＨＡＰ２／３／４モチーフはＭＯＤ２プロモーターにのみ存在している。この配列はグルコースリプレッション、酸素認識に関与しているという報告があることから、ＰＭＯＤ２においても機能している可能性が高いと考えられる。このように、２つのプロモーターに存在するモチーフ配列の種類、位置、方向、数などの違いによりＰＭＯＤ1プロモーター、ＰＭＯＤ２プロモーターで異なる発現制御が行なわれていると考えられる。
【００２２】
第１のタンパク質をコードした塩基配列および第２のタンパク質をコードした塩基配列は、目的のタンパク質をコードした塩基配列を選択する。タンパク質としては、塩基配列が明らかなタンパク質であれば種々のものを選択することができるが、異種タンパク質を１つの細胞で発現させるという本発明の特性を利用して、２つの異なるタンパク質が相互作用を有するタンパク質を選択することもできる。例えば、異なる２つのタンパク質によって、はじめて活性を得られるような、いわゆる「ヘテロダイマー型」のタンパク質や、インシュリンのようにまず前駆体として生合成され、別のタンパク質によって修飾を受けて活性型になるようなタンパク質等を選択することも可能である。
【００２３】
ＰＭＯＤ1プロモーター及びＰＭＯＤ２プロモーターの下流にタンパク質をコードした塩基配列を導入する方法は、バイオテクノロジー分野で用いられている公知の遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。一方、本過程で得られた発現カセットの宿主への導入には、Raymondらの方法（Raymond, C. K., T. Bukowski, S. D. Holderman, A. F. T. Ching, E. Vanaja, and R. Stamm, Development of the methylotrophic yeast Pichia methanolica for the expression of the 65 kilodalton isoform of human glutamate decarboxylase, "Yeast", 14:11-23.）を用いることができる。
【００２４】
また、２種の発現カセットの導入の場合、宿主の限られた栄養要求性マーカーを補うため、以下の１．および２．の操作を行う。
【００２５】
１．ＰＭＯＤ1プロモーターおよびＰＭＯＤ2プロモーターの下流に発現させたい異種タンパク質をコードする遺伝子を導入した発現カセットは、非相同組み換えによってピヒア メタノリカのゲノムＤＮＡに挿入される。ＰＭＯＤ1プロモーター発現カセット（ｐＭＥＴ B）はＡＤＥ２遺伝子を形質転換マーカーとして利用し、宿主に導入する。
【００２６】
２．ＰＭＯＤ2プロモーター発現カセットには形質転換マーカーを付与せず、非相同組み換えによって１で得られた形質転換体のゲノムＤＮＡに再び挿入するが、５-フルオロオロチジン酸耐性を指標にすることで、ゲノム上のウラシル合成系遺伝子にＰＭＯＤ2プロモーター発現カセットが挿入された変異株を選択することができる。
【００２７】
以上の操作により、栄養要求性を持たない宿主に対する形質転換において、形質転換体を容易に選抜することが可能である。
【００２８】
上記のようにして得られた組換え体は、酸素の存在下、培養液中で培養される。酸素は、培養液中に直接添加してもよいし、振盪培養により培養液を振盪させ、酸素が供給されるようにしてもよい。この場合、８０ｒｐｍ以上の振盪速度で振盪させるのが好ましい。また、酸素の供給量はＰＭＯＤ１プロモーターおよびＰＭＯＤ2プロモーターの発現量に大きく影響する。なお、嫌気的条件下で培養を行っても、第１および第２のタンパク質の発現は認められない。
【００２９】
培養液は、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を液体培養する際に用いられる一般的な組成の培地を用いることができる。例えば、Ｓａｌｔ培地、Ｂａｓａｌ培地などを用いることができる。
【００３０】
ＰＭＯＤ1プロモーター（配列番号：１）は、グリセロール及び／又はキシロースが培地中に存在することによって、第１のタンパク質の発現を誘導する。特にグリセロールによるＰＭＯＤ1プロモーターはメタノール誘導と同様に強力な発現力を示す。なお、グリセロールとメタノールを組み合わせた場合もグリセロール単独で誘導した時と同程度の活性を示す。但し、第２のタンパク質の発現は、後述するようにメタノールの添加によって誘発されるため、第１のタンパク質の発現と第２のタンパク質の発現を制御するという観点からは、第１のタンパク質の発現を誘導する際は、メタノールの添加は行わないほうが好ましい。
【００３１】
一方、グルコース、アラビノース、セロビオースを培地中に添加した場合は、いずれの場合も完全なカタボライトリプレッションが観察される。
【００３２】
グリセロール及び／又はキシロースの濃度は、培養液の全量を基準として、０．５〜２％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。
【００３３】
ＰＭＯＤ２プロモーター（配列番号：２）は、メタノールが培地中に存在することによって、第２のタンパク質の発現を誘導する。培地中のメタノールの濃度は、ＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程においては、０．１〜３．０％（Ｖ／Ｖ）であることが好ましく、０．３〜１．０％（Ｖ／Ｖ）であることがより好ましく、０．３％（Ｖ／Ｖ）であることが更に好ましい。
【００３４】
また、ＰＭＯＤ２プロモーターは、メタノール濃度が０．１〜１．０％（Ｖ／Ｖ）の条件であるときに、培地中の溶存酸素濃度を高めることによって、より効率よく第２のタンパク質の発現を誘導することができる。即ち、ＰＭＯＤ２プロモーターは酸素濃度が上昇するにつれて第２のタンパク質の活性も高くなる。例えば、５００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコで１００ｍｌの培養液を２８℃、１００ｒｐｍ以上の振盪速度で振盪させることにより、第２のタンパク質の発現を効率よく誘導することができる。なお、グルコース、アラビノース、セロビオースを培地中に添加した場合は、ＰＭＯＤ１プロモーターと同様、カタボライトリプレッションが観察される。
【００３５】
宿主細胞において発現したタンパク質は、各種クロマトグラフィー、濃縮・脱塩、ゲルろ過等、常法のタンパク質分離精製方法により分離精製することができる。
【実施例】
【００３６】
異なる２種の異種タンパク質を１つの細胞内で発現させることを目的として、以下の要領により組換え体を作製した。２種類の異種タンパク質としては、視覚的にも発現が確認でき、定量やアッセイが可能な緑色蛍光タンパク質（以下、「ＧＦＰ」と称する）と、酸性フォスファターゼ（以下、「ＡＰ」と称する）を用いた。
【００３７】
ＧＦＰの宿主細胞への導入については、P. methanolica Expression Kit (Invitrogen社製)のプラスミドｐＭＥＴ Ｂを用い、ＰＭＯＤ１プロモーター（配列番号：１）の下流にてＧＦＰを発現させたピヒア メタノリカ（P. methanolica）を作製した。具体的には、ＧＦＰをＰＣＲ法にて増幅し、５’および３’末端にＸｈｏＩおよびＮｏｔＩサイトを付加した。得られた断片をｐＭＥＴ ＢのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入し、ＰｓｔＩにて直鎖状にしたものをRaymondらの方法（Development of the methylotrophic yeast Pichia methanolica for the expression of the 65 kilodalton isoform of human glutamate decarboxylase, "Yeast", 1998, 14:11-23.）に従ってピヒア メタノリカ細胞に導入した。
【００３８】
ＡＰの宿主細胞への導入については、ＰＭＯＤ２プロモーター（配列番号：２）をＰＣＲ法にて増幅し、５’および３’末端にＰｓｔＩおよびＸｈｏＩサイトを付加し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Novagen社製）を用いてサブクローニングした。一方、ｐＭＥＴ ＢをＸｈｏＩおよびＸｂaＩで消化し、得られたＡＵＧ１ターミネーターを含む断片をＰＭＯＤ２プロモーターの下流に連結した。
【００３９】
また、ＰＨＯ５について、５’および３’末端にＸｈｏＩおよびＮｏｔＩサイトを付加してＰＣＲ法にて増幅した後、本断片をＰＭＯＤ２プロモーターの下流でＡＵＧ１ターミネーターの上流に挿入し、ＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５の発現カセットを作成した。得られた発現カセットは、ＰｓｔＩにて直鎖状にし、前記Raymondらの方法に従ってピヒア メタノリカ細胞に導入した。
【００４０】
ＰＭＯＤ2プロモーター発現カセットは形質転換マーカーを持たないため、５-フルオロオロチジン酸耐性を指標にし、ゲノム上のウラシル合成系遺伝子にＰＭＯＤ2プロモーター発現カセットが挿入された変異株を選択することができる。これにより、栄養要求性を持たない宿主に対する形質転換において、形質転換体を容易に選抜することが可能である。
【００４１】
ＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５の形質転換の選択培地として、５’ＦＯＡ（０．０８％）添加ＹＮＢ培地を用い、ウラシル合成に関与する遺伝子の破壊によって、この培地に生育できるものをスクリーニングした。
【００４２】
獲得した組換え体を用いて、誘導炭素源による２つのタンパク質の発現パターンを確認した。
【００４３】
ＧＦＰは蛍光顕微鏡（Nikon ECLIPSE 800、フィルターGFP(R)-BP）による観察を行い、ＧＦＰが発現した場合に観察される蛍光色素が観察された場合は「＋」と評価し、蛍光色素が観察されなかった場合は「−」と評価した。
【００４４】
ＡＰ活性はｐ−ニトロフェノールリン酸を基質にし、ｐＨ４、３７℃にて生成する
ｐ−ニトロフェノール量を吸光度４２０ｎｍで測定した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
次に、前記組換え体を用いて、誘導炭素源による２つのタンパク質の発現のコントロールを試みた。１％グリセロール添加ＹＮＢ培地、振盪速度100ｒｐｍにて本培養し、０、５、２０、２４、２８時間後のＰＭＯＤ１−ＧＦＰの発現、ＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５の発現を観察した。培養過程において、培養開始から２０時間を経過するまではＰＭＯＤ１−ＧＦＰを発現させ、培養開始から２０時間を経過した時点で、メタノールの終濃度が０．５％（Ｖ／Ｖ）になるように培養液中に添加し、ＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５を発現させるようにした。
【００４７】
ＰＭＯＤ１−ＧＦＰの発現はＧＦＰの定量測定で評価した。即ち、培養液をサンプリングし、ＯＤ６６０＝１になるよう純水に懸濁した。そして、懸濁液を分光蛍光光度計（HITACHI F-4010形分光蛍光光度計）の定量測定モードで励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５０７ｎｍで測定し、ＯＤ６６０＝１あたりの蛍光強度を算出した。また、ＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５の発現は、ｐ−ニトロフェノール法により酸性フォスファターゼの活性を測定することで評価した。結果を図３に示す。
【００４８】
図３に示すように、グリセロールによりタンパク質の発現を誘導している間はＰＭＯＤ１−ＧＦＰのみで活性が認められ、培養開始から２０時間後にメタノール添加すると、そこからＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５の発現が認められた。つまり、２つのプロモーターを併用した発現系を考えた場合、グリセロールを炭素源としＰＭＯＤ１による第１のタンパク質の発現を行い、そこに、任意のタイミングでメタノールを添加するだけで、ＰＭＯＤ２による第２のタンパク質の発現を行うことが可能であることが判明した。
【００４９】
なお、本実施例では緑色蛍光タンパク質と、酸性フォスファターゼを発現させた例を説明したが、これに限らず、種々のタンパク質を発現させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＰＭＯＤ1プロモーター（上段、配列番号：１）およびＰＭＯＤ２プロモーター（下段、配列番号：２）の塩基配列を示す図である。
【図２】ＰＭＯＤ1プロモーター、ＰＭＯＤ２プロモーターに含まれるモチーフ配列の検索を行った結果を示す図である。
【図３】実施例１において獲得した組換え体を用いて、誘導炭素源による２つのタンパク質の発現のコントロールを行った結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は異種タンパク質の発現方法及び異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質に関し、具体的には、任意の異種タンパク質をピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）に導入し、特定の条件で誘導されるプロモーターを制御して、異なる２種のタンパク質を発現させる異種タンパク質の発現方法及び異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、安価で扱いやすいメタノールにより強力に誘導されるプロモーターを有し、高密度で培養可能なメチロトローフ酵母を利用した発現系でタンパク質を大量に生産する例が多数報告されており、工業レベルでの利用に有効な発現系として注目されている。
【０００３】
メチロトローフ酵母の一つであるピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）は、１）メタノールによって強力に誘導される２つのプロモーター（ＰＭＯＤ1およびＰＭＯＤ２）を有する、２）それぞれのプロモーターの転写活性は異なる制御を受けており、誘導条件により厳密に支配されている、さらには３）代表的な酵母であるサッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の１０倍以上の高密度で培養できる、という特徴を有している。このような点から、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）は異種タンパク質を１つの細胞で生産できるタンパク質生産ツールとして高いポテンシャルを示すといえる。
【０００４】
従来、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を利用してタンパク質を生産した例としては、例えば、Invitrogen社によって、ＰＭＯＤ1を用いたP. methanolica Expression Kitが商品化されており、ヒト由来のglutamate decarboxylaseや、leptinといったタンパク質の生産が報告されている（非特許文献１及び２）。また、Pichia methanolica由来のプロモーターを用いてS.セルビシエを形質転換し、異種ポリペプチドを生産する方法も開示されている（特許文献１）。さらに、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を形質転換する際に、選択マーカーとして、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＡＤＥ２遺伝子をコードすることにより、商業的に重要性を有するタンパク質を産生する産生系において使用することができる旨が開示されている（特許文献２）。
【非特許文献１】Gellissen, G., Heterologous protein production in methylotrophic yeasts, "Appl. Microbiol. Biotechnol.", 2000, 54:741-750.
【非特許文献２】Raymond, C. K., T. Bukowski, S. D. Holderman, A. F. T. Ching, E. Vanaja, and R. Stamm, Development of the methylotrophic yeast Pichia methanolica for the expression of the 65 kilodalton isoform of human glutamate decarboxylase, "Yeast", 1998, 14:11-23.
【特許文献１】特表２０００−５０００１４号公報
【特許文献２】特表２００２−５１５７４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質の生産は、発現に使用するプロモーターの転写活性と宿主酵母に依存する。酵母における異種遺伝子発現用プロモーターとしては、どのような生育条件下においても常に一定量構成的に発現されるものや、培地成分などにより誘導可能なものがある。しかしながら、プロモーターは強力であっても転写活性のコントロールが困難であったり、一様にタンパク質生産を行なうだけで、目的タンパク質によっては生産が困難なものが少なくない、などの問題があった。このため、安定した発現制御が可能で、多様なタンパク質生産に対応できる応用範囲の広いプロモーターの制御方法の確立が望まれていた。
【０００６】
そこで、本発明は、異なる２種のタンパク質を１つの細胞内で発現させ、誘導条件によるタンパク質の生産管理を安定して行うことが可能なタンパク質の生産方法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）の有する２種のアルコールオキシダーゼプロモーター（配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1および配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２）について種々の検討を行ったところ、それぞれが異なる性質を有し、必要に応じて２種のタンパク質の発現を個々に制御することが可能であることを見出した。
【０００８】
本発明は係る知見に基づくものであり、以下の発明に関するものである。［１］ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を宿主として、ＰＭＯＤ1プロモーターの下流に配列番号：１に記載される第１のタンパク質をコードした塩基配列と、配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターの下流に第２のタンパク質をコードした塩基配列を導入して該ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）の組換え体を得る工程と、酸素の存在下で該組換え体を培養液中で培養し、その過程で、グリセロール及び／又はキシロースの存在下で配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1プロモーターに第１のタンパク質を発現させる工程と、メタノールの存在下で配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程と、を含む、異種タンパク質の発現方法；
【０００９】
［２］前記グリセロール及び／又はキシロースの濃度が、前記培養液の全量を基準として、０．５〜２％（Ｗ／Ｖ）である、［１］に記載の異種タンパク質の発現方法；
【００１０】
［３］前記メタノールの濃度が、０．１〜３．０％（Ｖ／Ｖ）である、［１］又は［２］に記載の異種タンパク質の発現方法；
【００１１】
［４］前記配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程において、前記培養液を８０ｒｐｍ以上の振盪速度で振盪させる、［１］〜［３］のいずれか１に記載の異種タンパク質の発現方法；
【００１２】
［５］前記第１のタンパク質が緑色蛍光タンパク質であり、前記第２のタンパク質が酸性フォスファターゼである、［１］〜［４］のいずれか１に記載の異種タンパク質の発現方法；
【００１３】
［６］［１］〜［５］のいずれか１に記載の異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の異種タンパク質の発現方法によれば、２種類のタンパク質を１つの細胞中で任意に制御しながら安定して発現させることができる。よって、有用タンパク質を生産するためのツールとして幅広く応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
次に、本発明の実施形態について説明する。本実施形態の異種タンパク質の発現方法は、既述のとおり、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を宿主として、配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1プロモーターの下流に第１のタンパク質をコードした塩基配列と、配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターの下流に第２のタンパク質をコードした塩基配列を導入して該ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）の組換え体を得る工程と、酸素の存在下で該組換え体を培養液中で培養し、その過程で、グリセロール及び／又はキシロースの存在下で配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1プロモーターに第１のタンパク質を発現させる工程と、メタノールの存在下で配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程と、を含む。
【００１６】
宿主細胞として使用されるピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）は、一般に入手可能なピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を使用することができ、例えば、市販の菌株を用いることができる。具体的には、Invitrogen社のＰＭＡＤ１１株などを挙げることができる。
【００１７】
ＰＭＯＤ1プロモーター（配列番号：１）は、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）のアルコールオキシダーゼプロモーターを構成するプロモーターのひとつであり、例えば、Invitrogen社のＰＭＯＤ1プロモーターを用いた発現ベクターｐＭＥＴ Ｂを用いることができる。なお、本ベクターは栄養要求性マーカーとしてＡＤＥ２遺伝子を保持している。
【００１８】
ＰＭＯＤ２プロモーター（配列番号：２）は、ＰＭＯＤ1プロモーターと同様、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）のアルコールオキシダーゼプロモーターを構成するプロモーターのひとつであり、ＭＯＤ２遺伝子の５’上流域１６８５ｂｐを含むものである。なお、本実施形態においては、本プロモーターを用いた発現カセットは栄養要求性マーカーを持たないものを用いる。
【００１９】
なお、「ＭＯＤ」は本来メタノールオキシダーゼの略称であるが、近年、この分野では一般に「アルコールオキシダーゼ」のことをＭＯＤと称するようになっているため、本実施形態においても、ＭＯＤはアルコールオキシダーゼを意味する。
【００２０】
図１は、ＰＭＯＤ1プロモーター（上段、配列番号：１）およびＰＭＯＤ２プロモーター（下段、配列番号：２）の塩基配列を示す図である。図１に示すように、ＰＭＯＤ1、ＰＭＯＤ２の相同性は２３％程度である。タンパク質部分をコードするＭＯＤ１、ＭＯＤ２の相同性が８０％以上であることに鑑みれば、ＰＭＯＤ1プロモーター（配列番号：１）、ＰＭＯＤ２プロモーター（配列番号：２）の相同性は低いものである。このことからも遺伝子レベルでＭＯＤ１、ＭＯＤ２の発現制御に違いがあることが表れているといえる。
【００２１】
図２は、ＰＭＯＤ1プロモーター（配列番号：１）、ＰＭＯＤ２プロモーター（配列番号：２）に含まれるモチーフ配列の検索を行った結果を示す図である。図２に示すように、メタノール誘導配列（ＵＡＳ１、ＵＡＳ２）やグルコースリプレッションに関与するＭＩＧ１モチーフが両プロモーターに共通して存在している。そして、それぞれのプロモーターでそれら配列の場所や向きが異なっている。また、ＨＡＰ２／３／４モチーフはＭＯＤ２プロモーターにのみ存在している。この配列はグルコースリプレッション、酸素認識に関与しているという報告があることから、ＰＭＯＤ２においても機能している可能性が高いと考えられる。このように、２つのプロモーターに存在するモチーフ配列の種類、位置、方向、数などの違いによりＰＭＯＤ1プロモーター、ＰＭＯＤ２プロモーターで異なる発現制御が行なわれていると考えられる。
【００２２】
第１のタンパク質をコードした塩基配列および第２のタンパク質をコードした塩基配列は、目的のタンパク質をコードした塩基配列を選択する。タンパク質としては、塩基配列が明らかなタンパク質であれば種々のものを選択することができるが、異種タンパク質を１つの細胞で発現させるという本発明の特性を利用して、２つの異なるタンパク質が相互作用を有するタンパク質を選択することもできる。例えば、異なる２つのタンパク質によって、はじめて活性を得られるような、いわゆる「ヘテロダイマー型」のタンパク質や、インシュリンのようにまず前駆体として生合成され、別のタンパク質によって修飾を受けて活性型になるようなタンパク質等を選択することも可能である。
【００２３】
ＰＭＯＤ1プロモーター及びＰＭＯＤ２プロモーターの下流にタンパク質をコードした塩基配列を導入する方法は、バイオテクノロジー分野で用いられている公知の遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。一方、本過程で得られた発現カセットの宿主への導入には、Raymondらの方法（Raymond, C. K., T. Bukowski, S. D. Holderman, A. F. T. Ching, E. Vanaja, and R. Stamm, Development of the methylotrophic yeast Pichia methanolica for the expression of the 65 kilodalton isoform of human glutamate decarboxylase, "Yeast", 14:11-23.）を用いることができる。
【００２４】
また、２種の発現カセットの導入の場合、宿主の限られた栄養要求性マーカーを補うため、以下の１．および２．の操作を行う。
【００２５】
１．ＰＭＯＤ1プロモーターおよびＰＭＯＤ2プロモーターの下流に発現させたい異種タンパク質をコードする遺伝子を導入した発現カセットは、非相同組み換えによってピヒア メタノリカのゲノムＤＮＡに挿入される。ＰＭＯＤ1プロモーター発現カセット（ｐＭＥＴ B）はＡＤＥ２遺伝子を形質転換マーカーとして利用し、宿主に導入する。
【００２６】
２．ＰＭＯＤ2プロモーター発現カセットには形質転換マーカーを付与せず、非相同組み換えによって１で得られた形質転換体のゲノムＤＮＡに再び挿入するが、５-フルオロオロチジン酸耐性を指標にすることで、ゲノム上のウラシル合成系遺伝子にＰＭＯＤ2プロモーター発現カセットが挿入された変異株を選択することができる。
【００２７】
以上の操作により、栄養要求性を持たない宿主に対する形質転換において、形質転換体を容易に選抜することが可能である。
【００２８】
上記のようにして得られた組換え体は、酸素の存在下、培養液中で培養される。酸素は、培養液中に直接添加してもよいし、振盪培養により培養液を振盪させ、酸素が供給されるようにしてもよい。この場合、８０ｒｐｍ以上の振盪速度で振盪させるのが好ましい。また、酸素の供給量はＰＭＯＤ１プロモーターおよびＰＭＯＤ2プロモーターの発現量に大きく影響する。なお、嫌気的条件下で培養を行っても、第１および第２のタンパク質の発現は認められない。
【００２９】
培養液は、ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を液体培養する際に用いられる一般的な組成の培地を用いることができる。例えば、Ｓａｌｔ培地、Ｂａｓａｌ培地などを用いることができる。
【００３０】
ＰＭＯＤ1プロモーター（配列番号：１）は、グリセロール及び／又はキシロースが培地中に存在することによって、第１のタンパク質の発現を誘導する。特にグリセロールによるＰＭＯＤ1プロモーターはメタノール誘導と同様に強力な発現力を示す。なお、グリセロールとメタノールを組み合わせた場合もグリセロール単独で誘導した時と同程度の活性を示す。但し、第２のタンパク質の発現は、後述するようにメタノールの添加によって誘発されるため、第１のタンパク質の発現と第２のタンパク質の発現を制御するという観点からは、第１のタンパク質の発現を誘導する際は、メタノールの添加は行わないほうが好ましい。
【００３１】
一方、グルコース、アラビノース、セロビオースを培地中に添加した場合は、いずれの場合も完全なカタボライトリプレッションが観察される。
【００３２】
グリセロール及び／又はキシロースの濃度は、培養液の全量を基準として、０．５〜２％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。
【００３３】
ＰＭＯＤ２プロモーター（配列番号：２）は、メタノールが培地中に存在することによって、第２のタンパク質の発現を誘導する。培地中のメタノールの濃度は、ＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程においては、０．１〜３．０％（Ｖ／Ｖ）であることが好ましく、０．３〜１．０％（Ｖ／Ｖ）であることがより好ましく、０．３％（Ｖ／Ｖ）であることが更に好ましい。
【００３４】
また、ＰＭＯＤ２プロモーターは、メタノール濃度が０．１〜１．０％（Ｖ／Ｖ）の条件であるときに、培地中の溶存酸素濃度を高めることによって、より効率よく第２のタンパク質の発現を誘導することができる。即ち、ＰＭＯＤ２プロモーターは酸素濃度が上昇するにつれて第２のタンパク質の活性も高くなる。例えば、５００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコで１００ｍｌの培養液を２８℃、１００ｒｐｍ以上の振盪速度で振盪させることにより、第２のタンパク質の発現を効率よく誘導することができる。なお、グルコース、アラビノース、セロビオースを培地中に添加した場合は、ＰＭＯＤ１プロモーターと同様、カタボライトリプレッションが観察される。
【００３５】
宿主細胞において発現したタンパク質は、各種クロマトグラフィー、濃縮・脱塩、ゲルろ過等、常法のタンパク質分離精製方法により分離精製することができる。
【実施例】
【００３６】
異なる２種の異種タンパク質を１つの細胞内で発現させることを目的として、以下の要領により組換え体を作製した。２種類の異種タンパク質としては、視覚的にも発現が確認でき、定量やアッセイが可能な緑色蛍光タンパク質（以下、「ＧＦＰ」と称する）と、酸性フォスファターゼ（以下、「ＡＰ」と称する）を用いた。
【００３７】
ＧＦＰの宿主細胞への導入については、P. methanolica Expression Kit (Invitrogen社製)のプラスミドｐＭＥＴ Ｂを用い、ＰＭＯＤ１プロモーター（配列番号：１）の下流にてＧＦＰを発現させたピヒア メタノリカ（P. methanolica）を作製した。具体的には、ＧＦＰをＰＣＲ法にて増幅し、５’および３’末端にＸｈｏＩおよびＮｏｔＩサイトを付加した。得られた断片をｐＭＥＴ ＢのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入し、ＰｓｔＩにて直鎖状にしたものをRaymondらの方法（Development of the methylotrophic yeast Pichia methanolica for the expression of the 65 kilodalton isoform of human glutamate decarboxylase, "Yeast", 1998, 14:11-23.）に従ってピヒア メタノリカ細胞に導入した。
【００３８】
ＡＰの宿主細胞への導入については、ＰＭＯＤ２プロモーター（配列番号：２）をＰＣＲ法にて増幅し、５’および３’末端にＰｓｔＩおよびＸｈｏＩサイトを付加し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Novagen社製）を用いてサブクローニングした。一方、ｐＭＥＴ ＢをＸｈｏＩおよびＸｂaＩで消化し、得られたＡＵＧ１ターミネーターを含む断片をＰＭＯＤ２プロモーターの下流に連結した。
【００３９】
また、ＰＨＯ５について、５’および３’末端にＸｈｏＩおよびＮｏｔＩサイトを付加してＰＣＲ法にて増幅した後、本断片をＰＭＯＤ２プロモーターの下流でＡＵＧ１ターミネーターの上流に挿入し、ＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５の発現カセットを作成した。得られた発現カセットは、ＰｓｔＩにて直鎖状にし、前記Raymondらの方法に従ってピヒア メタノリカ細胞に導入した。
【００４０】
ＰＭＯＤ2プロモーター発現カセットは形質転換マーカーを持たないため、５-フルオロオロチジン酸耐性を指標にし、ゲノム上のウラシル合成系遺伝子にＰＭＯＤ2プロモーター発現カセットが挿入された変異株を選択することができる。これにより、栄養要求性を持たない宿主に対する形質転換において、形質転換体を容易に選抜することが可能である。
【００４１】
ＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５の形質転換の選択培地として、５’ＦＯＡ（０．０８％）添加ＹＮＢ培地を用い、ウラシル合成に関与する遺伝子の破壊によって、この培地に生育できるものをスクリーニングした。
【００４２】
獲得した組換え体を用いて、誘導炭素源による２つのタンパク質の発現パターンを確認した。
【００４３】
ＧＦＰは蛍光顕微鏡（Nikon ECLIPSE 800、フィルターGFP(R)-BP）による観察を行い、ＧＦＰが発現した場合に観察される蛍光色素が観察された場合は「＋」と評価し、蛍光色素が観察されなかった場合は「−」と評価した。
【００４４】
ＡＰ活性はｐ−ニトロフェノールリン酸を基質にし、ｐＨ４、３７℃にて生成する
ｐ−ニトロフェノール量を吸光度４２０ｎｍで測定した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
次に、前記組換え体を用いて、誘導炭素源による２つのタンパク質の発現のコントロールを試みた。１％グリセロール添加ＹＮＢ培地、振盪速度100ｒｐｍにて本培養し、０、５、２０、２４、２８時間後のＰＭＯＤ１−ＧＦＰの発現、ＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５の発現を観察した。培養過程において、培養開始から２０時間を経過するまではＰＭＯＤ１−ＧＦＰを発現させ、培養開始から２０時間を経過した時点で、メタノールの終濃度が０．５％（Ｖ／Ｖ）になるように培養液中に添加し、ＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５を発現させるようにした。
【００４７】
ＰＭＯＤ１−ＧＦＰの発現はＧＦＰの定量測定で評価した。即ち、培養液をサンプリングし、ＯＤ６６０＝１になるよう純水に懸濁した。そして、懸濁液を分光蛍光光度計（HITACHI F-4010形分光蛍光光度計）の定量測定モードで励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５０７ｎｍで測定し、ＯＤ６６０＝１あたりの蛍光強度を算出した。また、ＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５の発現は、ｐ−ニトロフェノール法により酸性フォスファターゼの活性を測定することで評価した。結果を図３に示す。
【００４８】
図３に示すように、グリセロールによりタンパク質の発現を誘導している間はＰＭＯＤ１−ＧＦＰのみで活性が認められ、培養開始から２０時間後にメタノール添加すると、そこからＰＭＯＤ２−ＰＨＯ５の発現が認められた。つまり、２つのプロモーターを併用した発現系を考えた場合、グリセロールを炭素源としＰＭＯＤ１による第１のタンパク質の発現を行い、そこに、任意のタイミングでメタノールを添加するだけで、ＰＭＯＤ２による第２のタンパク質の発現を行うことが可能であることが判明した。
【００４９】
なお、本実施例では緑色蛍光タンパク質と、酸性フォスファターゼを発現させた例を説明したが、これに限らず、種々のタンパク質を発現させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＰＭＯＤ1プロモーター（上段、配列番号：１）およびＰＭＯＤ２プロモーター（下段、配列番号：２）の塩基配列を示す図である。
【図２】ＰＭＯＤ1プロモーター、ＰＭＯＤ２プロモーターに含まれるモチーフ配列の検索を行った結果を示す図である。
【図３】実施例１において獲得した組換え体を用いて、誘導炭素源による２つのタンパク質の発現のコントロールを行った結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を宿主として、配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1プロモーターの下流に第１のタンパク質をコードした塩基配列と、配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターの下流に第２のタンパク質をコードした塩基配列を導入して該ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）の組換え体を得る工程と、
酸素の存在下で該組換え体を培養液中で培養し、その過程で、
グリセロール及び／又はキシロースの存在下で配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1プロモーターに第１のタンパク質を発現させる工程と、
メタノールの存在下で配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程と、
を含む、異種タンパク質の発現方法。
【請求項２】
前記グリセロール及び／又はキシロースの濃度が、前記培養液の全量を基準として、０．５〜２％（Ｗ／Ｖ）である請求項１に記載の異種タンパク質の発現方法。
【請求項３】
前記メタノールの濃度が、０．１〜３．０％（Ｖ／Ｖ）である請求項１又は２に記載の異種タンパク質の発現方法。
【請求項４】
前記配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程において、前記培養液を８０ｒｐｍ以上の振盪速度で振盪させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の異種タンパク質の発現方法。
【請求項５】
前記第１のタンパク質が緑色蛍光タンパク質であり、前記第２のタンパク質が酸性フォスファターゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の異種タンパク質の発現方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質。
【請求項１】
ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）を宿主として、配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1プロモーターの下流に第１のタンパク質をコードした塩基配列と、配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターの下流に第２のタンパク質をコードした塩基配列を導入して該ピヒア メタノリカ（Pichia methanolica）の組換え体を得る工程と、
酸素の存在下で該組換え体を培養液中で培養し、その過程で、
グリセロール及び／又はキシロースの存在下で配列番号：１に記載されるＰＭＯＤ1プロモーターに第１のタンパク質を発現させる工程と、
メタノールの存在下で配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程と、
を含む、異種タンパク質の発現方法。
【請求項２】
前記グリセロール及び／又はキシロースの濃度が、前記培養液の全量を基準として、０．５〜２％（Ｗ／Ｖ）である請求項１に記載の異種タンパク質の発現方法。
【請求項３】
前記メタノールの濃度が、０．１〜３．０％（Ｖ／Ｖ）である請求項１又は２に記載の異種タンパク質の発現方法。
【請求項４】
前記配列番号：２に記載されるＰＭＯＤ２プロモーターに第２のタンパク質を発現させる工程において、前記培養液を８０ｒｐｍ以上の振盪速度で振盪させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の異種タンパク質の発現方法。
【請求項５】
前記第１のタンパク質が緑色蛍光タンパク質であり、前記第２のタンパク質が酸性フォスファターゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の異種タンパク質の発現方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の異種タンパク質の発現方法により得られたタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−１７７３３（Ｐ２００８−１７７３３Ａ）
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１９０３８９（Ｐ２００６−１９０３８９）
【出願日】平成１８年７月１１日（２００６．７．１１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年１月１５日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ」に発表
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１１日（２００６．７．１１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年１月１５日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ」に発表
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]