癌の処置のための化合物および方法
本発明は、ａ）少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びにｂ）少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター、並びに場合により薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の処置または予防に使用するために、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置または予防に使用するために適した化合物および医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、未分化骨髄芽球の無制限な増殖を引き起こす、前駆細胞の突然変異を起源とする不均一な悪性疾患である。ＡＭＬは、成人に罹患する最も一般的な急性白血病であり、そしてその発症率は年齢と共に増加する。ＡＭＬは比較的稀な疾病であり、米国における癌死亡の約１．２％を占めるが（Jemal et al. (2002) CA Cancer J Clin 52(1):23-47）、その発症率は人口の高齢化に従って増加すると予期される。
【０００３】
ＡＭＬ患者では、骨髄は通常、芽球細胞によって高度に浸潤され、その結果、赤血球、血小板および正常な白血球は減少する。ＡＭＬの症状としては、疲労、息切れ、容易に挫傷しそして容易に出血すること、および感染リスクの増加が挙げられる。ＡＭＬについてのいくつかのリスクファクターが同定されているが、ＡＭＬの具体的原因は依然として不明である。ＡＭＬは急速に進行し、そして典型的には処置せず放置すれば数週間または数カ月以内に死に至る。ＡＭＬの白血病誘発は多段階イベントとして起こる（Gilliland et al. (2004) Hematology Am Soc Hematol Educ Program 80-97）。これらのイベントは２つの群に分類される：第１群は、造血前駆細胞に増殖および／または生存の利点を付与する遺伝子的変化に関わる（例えばＲＡＳ、ＦＬＴ３またはｃ−ＫＩＴの突然変異）。第２は、血球分化に影響を及ぼす、最も頻繁には染色体転座によってしかしまた点突然変異（例えばＣＥＢＰα、ＮＰＭ１）によっても誘発される、転写因子（または転写コアクチベーター）の変化に関わる。
【０００４】
ＡＭＬの処置は、主に、従来の化学療法からなり、そしてもし患者の大半が最初の治療誘導後に寛解しても、彼らの大半は再発する。疾病を伴わない長期の生存を確実にするために設計された、寛解後の処置としては、自己幹細胞救出を伴う高用量化学療法、または同種骨髄移植（ＢＭＴ）が挙げられる。しかしながら、ＡＭＬ患者の大半を構成する高齢患者はＢＭＴに適格ではない。積極的な治療にも関わらず、患者の僅か２０〜３０％のみしか、無病生存を長期に享受できない。従って、他の治療法が必要とされる。
【０００５】
鉄は、エネルギー代謝および細胞増殖に関与する多くの重要な細胞酵素のための補因子として必要とされ、従って、これは全ての生細胞にとって必須である。種々の研究により、腫瘍細胞がトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ１／ＣＤ７１）を強く発現し、そして非腫瘍細胞よりも鉄欠乏に対してより感受性が高いことが示された（Faulk et al. (1980) Lancet 2(1):390-92）。
【０００６】
本発明者らは、以前に、ＴｆＲ１のレセプターが細胞表面上に高度に発現されている場合に、このレセプターに強く結合するモノクローナル抗体（Ａ２４）を特徴付けた。Ａ２４の結合は、リソソーム区画（ここで分解される）へのレセプターの内部移行およびまた鉄欠乏による細胞アポトーシスを誘導する（Moura et al. (2004) Blood 103(5):1838-45, Lepelletier et al. (2007) Cancer Res 67(3):1145-54）。Ａ２４は、腫瘍細胞の増殖を特異的に減少させることが示されたが、正常細胞に対してはそうではない。いくつかの研究により、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）およびマンテル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）において白血病／リンパ腫細胞を根絶するＡ２４の効力が示された（Moura et al. (2004) Blood 103(5):1838-45, Lepelletier et al. (2007) Cancer Res 67(3):1145-54）。
【０００７】
他の研究により近年、鉄キレート剤もまた、in vitroおよびin vivoにおいて抗増殖特性を有することが実証された。種々の鉄キレート剤の効力が、ヌードマウスにおけるヒト異種移植片において示された（Whitnall et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103(40):14901-6）。
【０００８】
ビタミンＤ３（ＶＤ）の抗増殖作用、分化作用およびアポトーシス促進作用が、正常または病的な上皮組織において示された。ＶＤはステロイドスーパーファミリーに属する。ＶＤはその同族レセプター（ＶＤＲ）と会合して、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）を有するヘテロ二量体を形成する。その後、この複合体はＶＤ応答エレメント（ＶＤＲＥ）と結合し、それにより遺伝子転写の変化を誘導する。ＶＤはまたＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を活性化して、細胞分化に関与する遺伝子の転写をモデュレーションする。
【０００９】
in vitroにおいてＶＤは、頭部癌、頸部癌、前立腺癌または大腸癌に由来する細胞系譜における、本来の分化細胞に関連した遺伝子の発現を促進する（Akutsu et al (2001) Mol Endocrinol 15(7) :1127-39, Palmer et al. (2003) Cancer Res 63(22) :7799-806）。
【００１０】
in vitroにおいて、カルシトリオール（活性型ビタミンＤ３）は、扁平上皮癌および前立腺腺癌において抗増殖活性を示し、そして古典的な化学療法剤の抗腫瘍活性を増強する（Hershberger et al. (2001) Clin Cancer Res 7(4):1043-51）。
【００１１】
前立腺癌において、高用量のカルシトリオールの併用または併用なしで広く使用されている化学療法剤（ドセタキセル）の使用を比較した前向き無作為試験において、患者の生存率はＶＤ／ドセタキセル治療群において増加することが判明した（Beer et al. (2007) J Clin Oncol 25(6):669-74）。しかしながら、ビタミンＤ３に対する応答は反復処置後に急速に低下し、従って、その効果は期間が限定的である。
【００１２】
最後に、何人かの著者は、in vitroにおいて分化剤としてのビタミンＤ３の効力を示し、そしてＡＭＬ処置におけるその使用が提案されている（Makashima et al. (1998) Br J Cancer 77(1):33-9）。化学療法（アラシチンまたは６−チオグアニン）と分化剤（ビタミンＤおよびレチノイン酸）の併用を２６名の患者で１回評価し、５０％の寛解が可能となった（完全寛解２７％および部分寛解２３％）（Ferrero et al. (2004) Haematologica 89(5):619-20）。
【００１３】
結論づけると、鉄欠乏およびＶＤは抗腫瘍療法として試験されたが、前記の薬剤のいずれも、ＡＭＬなどの癌に罹患した個体を完全に処置するものとは証明されていない。従って、特にＡＭＬ処置において新たな展望を提供し得る新たな代替治療法が必要とされる。
【００１４】
発明の要約
本発明は、鉄キレート化剤が、特にマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化を通して、ビタミンＤ３と相乗的に作用するという本発明者らによる予期せぬ所見からもたらされる。この併用は、in vitroのＡＭＬ芽球において、およびin vivoのマウスに異種移植されたＡＭＬ腫瘍において効果的であると証明された。本発明者らはまた、併用療法がまた、化学療法に難治性であるＡＭＬ患者の状態を改善し、そして患者の芽球の細胞分化を誘導することを示した。
【００１５】
従って、本発明は、特に癌の予防または処置において使用するための、
ａ）少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びに
ｂ）ＭＡＰＫ経路の活性化を誘導することのできる少なくとも１つの化合物、特に少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター、
並びに場合により薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明はまた、癌の予防または処置において同時、別々または連続的に使用するための組合せ調製物としての、
ａ）少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びに
ｂ）ＭＡＰＫ経路の活性化を誘導することのできる少なくとも１つの化合物、特に少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター
を含む製品に関する。
【００１７】
本発明はまた、癌の予防または処置を目的とした医薬品の製造のための、少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びにＭＡＰＫ経路の活性化を誘導することのできる少なくとも１つの化合物、特に少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーターの使用に関する。
【００１８】
本発明はまた、予防有効量または治療有効量の少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤およびＭＡＰＫ経路の活性化を誘導することのできる少なくとも１つの化合物、特に少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）を個体に投与することを含む、個体における癌の予防および／または処置のための方法に関する。
【００１９】
発明の詳細な説明
本明細書において定義する「鉄取り込み阻害剤」という表現は、細胞による鉄取り込みを減少または妨げる上で活性である化合物を指す。
【００２０】
好ましくは、鉄取り込み阻害剤は、鉄キレート剤およびトランスフェリンレセプター阻害剤からなる群より選択される。
【００２１】
本明細書において使用する「鉄キレート剤」または「鉄キレート化化合物」という表現は同義語として使用され、そして鉄に結合する化合物に関する。鉄と結合または鉄と複合体を形成した鉄キレート化化合物は、本明細書において鉄キレートと呼ばれる。
【００２２】
好ましくは、鉄キレート化化合物は、二座、三座、四座またはより高次の多座化合物であり得る。二座、三座、四座またはより高次の多座の鉄キレート化化合物は、それぞれ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の別々の結合部位を使用して鉄に結合する化合物を指す。本発明の鉄キレート化化合物としては、鉄の全ての酸化状態（例えば、鉄（−ＩＩ）状態、鉄（−Ｉ）状態、鉄（０）状態、鉄（Ｉ）状態、鉄（ＩＩ）状態（二価鉄）、鉄（ＩＩＩ)状態（三価鉄）、鉄（ＩＶ）状態（四価鉄）および／または鉄（Ｖ）を含む）に結合することのできるキレート化化合物が挙げられる。
【００２３】
具体的な二価鉄キレート剤の例としては、１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリジン−４−オン（デフェリプロン、ＤＦＰまたはフェリプロキス）および２−デオキシ−２−Ｎ−カルバモイルメチル−［Ｎ’−２’−メチル−３’−ヒドロキシピリジン−４’−オン］）−Ｄ−グルコピラノース（Feralex-G）が挙げられる。具体的な三価鉄キレート剤の例としては、ピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン（ＰＩＨ）、４，５−ジヒドロ−２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−メチルチアゾール−４−カルボン酸（ＧＴ５６−２５２）、４，５−ジヒドロ−２−（３’−ヒドロキシピリジン−２’−イル）−４−メチルチアゾール−４−カルボン酸（デスフェリチオシンまたはＤＦＴ）および４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］安息香酸（ＩＣＬ−６７０、デフェラシロクス）が挙げられる。鉄キレート剤はまた、遊離酸形、その塩およびその結晶形の置換された３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールであり得る（ＷＯ９７／４９３９５に記載）。具体的な六価鉄キレート剤の例としては、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｏ−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、Ｎ−（５−Ｃ３−Ｌ（５−アミノペンチル）ヒドロキシカルバモイル）−プロピオンアミド）ペンチル）−３（５−（Ｎ−ヒドロキシアセトアミド）−ペンチル）カルバモイル）−プロプリオンヒドロキサム酸（デフェロキサミン、デスフェリオキサミンまたはＤＦＯ）およびヒドロキシメチルでんぷんに結合したデフェロキサミン（Ｓ−ＤＦＯ）が挙げられる。ＤＦＯのさらなる誘導体としては、ＤＦＯの脂肪族、芳香族、コハク酸およびメチルスルホン酸類似体、並びに特に、スルホンアミド−デフェロキサミン、アセトアミド−デフェロキサミン、プロピルアミド−デフェロキサミン、ブチルアミド−デフェロキサミン、ベンゾイルアミド−デフェロキサミン、スクシンアミド−デフェロキサミン、およびメチルスルホンアミド−デフェロキサミンが挙げられる。
【００２４】
本発明による鉄キレート剤はまた、シデロホアまたはキセノシデロホアであり得る。シデロホアまたはキセノシデロホアの例としては、ヒドロキサメートおよびポリカルボキシレートが挙げられる。ヒドロキサメートは、Ｎ−［δ］−ヒドロキシオルニチン部分を含み、そして一般的に４つの例示的なファミリーにカテゴリー化される。１つのカテゴリーは、ロドトルラ酸を含み、これはＮ−［δ］−アセチル−Ｌ−Ｎ［δ］−ヒドロキシオルニチンのジケトピペラジンである。このカテゴリーには、ジメルム酸と命名されたジヒドロキサメートなどの誘導体が含まれる。第２のカテゴリーは、コプロゲンを含み、これはＮ−［δ］−アシル−Ｎ−［δ］−ヒドロキシ−Ｌ−オルニチン部分を含む。コプロゲンはまた、線形構造を有するロドトルラ酸のトリヒドロキサメート誘導体と考えられ得る。第３のカテゴリーは、フェリクロムを含み、これは、Ｎ−［δ］−アシル−Ｎ−［δ］−ヒドロキシオルニチンと、グリシン、セリンまたはアラニンとの組合せのトリペプチドを含む環式ペプチドからなる。第４の例示的カテゴリーは、フシゲンとも呼ばれるフサリニンを含み、これは線形または環式のいずれかのヒドロキサメートであり得る。フサリニンは、無水メバロニン酸によるＮ−ヒドロキシオルニチンのＮアシル化によって特徴付けられる化合物である。ポリカルボキシレートは、リゾフェリンと呼ばれるクエン酸を含むポリカルボキシレートからなる。前記分子は、ジアミノブタンに連結した２つのクエン酸単位を含む。本発明の組成物において鉄キレート剤として有用なシデロフォアの他のカテゴリーとしては、例えば、フェノレート−カテコレートクラスのシデロフォア、ヘミン、および［β］−ケトアルデヒド植物毒素が挙げられる。
【００２５】
本発明による鉄キレート剤はまた、チオセミカルバゾン、潜在的な抗新生物活性を有する合成ヘテロ環カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾンであるトリアピン（３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン、３ＡＰ）、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン類似体、例えばジ−２−ピリジルケトンチオセミカルバゾン（ＤｐＴ）、ジ−２−ピリジルケトンイソニコチノイルヒドラゾン（ＰＫＩＨ）類似体およびジ−２−ピリジルケトン−４，４−ジメチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４４ｍＴ）であり得る。
【００２６】
好ましくは、本発明の鉄キレート剤は、デフェロキサミン、デフェラシロクス、デフェリプロン、トリアピンおよびＤｐ４４ｍＴからなる群より選択される。
【００２７】
「トランスフェリンレセプター阻害剤」という表現は、トランスフェリンレセプターに結合し、そしてトランスフェリンの定着を阻害もしくは妨げるか、または細胞中へのトランスフェリンレセプター／トランスフェリン複合体の内部移行を阻害もしくは妨げる任意の化合物を指す。
【００２８】
トランスフェリンは、鉄の輸送に関与する主要な血漿中タンパク質である。鉄がローディングされたトランスフェリン（Ｆｅ−Ｔｆ）はその細胞受容体（ＴｆＲ）に結合し、そして複合体Ｆｅ−Ｔｆ／ＴｆＲは小胞に内部移行する。小胞のｐＨは酸性化され、これがトランスフェリンによる鉄の遊離を誘導する。その後、レセプターは細胞表面上へとリサイクルされる（Irie et al. (1987) Am J Med Sci 293:103-11）。
【００２９】
本発明によるトランスフェリンレセプター阻害剤は、例えば、抗トランスフェリンレセプター抗体、トランスフェリンレセプターに結合する合成または天然配列ペプチド並びに小分子アンタゴニストおよびアプタマー、からなる群より選択され得る。
【００３０】
好ましくは、本発明によるトランスフェリンレセプター阻害剤は、抗トランスフェリンレセプター抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。より好ましくは、この抗体は、特にＷＯ２００５／１１１０８２（Moura et al. (2001) J Exp Med 194(4):417-25), Moura et al. (2004) Blood 103(5):1838-45, Lepelletier et al. (2007) Cancer Res 67(3):1145-54）に記載のＡ２４である（２００１年５月１０日にＣＮＣＭ（Collection nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris）に、Ｉ−２６６５番の下に寄託される）。
【００３１】
本明細書において使用する「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、そして特に、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ、ヒト化またはヒト抗体、ダイアボディ、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、およびまた抗体フラグメントを網羅する。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２が挙げられる。
【００３２】
ＭＡＰＫ経路は、細胞外刺激に応答し、そして遺伝子発現、有糸分裂、分化、および細胞の生存／アポトーシスなどの種々の細胞活性を調節する、セリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼであるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の関与する任意の生物学的経路に関する。ＭＡＰＫ経路は当業者には周知であり、そして特にBrown et al. ((2008) Handb Exp Pharmacol 1186:205-35)またはRaman et al. ((2007) Oncogene 26(22):3100-12)に記載されている。ＭＡＰＫの例は、Ｊｕｎキナーゼ、ｐ３８および細胞外シグナル調節キナーゼであり得る。本明細書において意図するＭＡＰＫ経路アゴニストは、ＭＡＰキナーゼ経路を誘導することができる。本発明によるＭＡＰＫ経路アゴニストの例は、鉄キレート剤およびビタミンＤ、その類似体およびビタミンＤレセプターモデュレーターであり得る。
【００３３】
本明細書において使用する「ビタミンＤ」という用語は、全ての型のビタミンＤ、例えばビタミンＤ１、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ４（２２−ジヒドロエルゴカルシフェロール）およびビタミンＤ５（シトカルシフェロール）を含む。好ましくは、本発明による「少なくとも１つのビタミンＤ」はビタミンＤ３、より好ましくはその活性型のビタミンＤ３である１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールＤ３（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３またはカルシトリオール）である。
【００３４】
本明細書において意図する「ビタミンＤ類似体」または「ビタミンＤレセプターモデュレーター」は、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）に結合することができ、そして好ましくは結合時に細胞分化を誘導することができる。
【００３５】
ビタミンＤ類似体またはビタミンＤレセプターモデュレーターがビタミンＤレセプターに結合する能力を決定するための試験は当業者に周知である。好ましくは、細胞抽出物上における類似体またはビタミンＤレセプターモデュレーターの特異的結合を推定することによってこの能力を評価することができる。例えば、典型的な結合実験において、超音波処理によって得られた可溶性細胞抽出物を、漸増濃度のビタミンＤ類似体またはビタミンＤレセプターモデュレーターと共にインキュベーションする。結合した類似体および遊離の類似体を、ヒドロキシアパタイト法によって分離することができる。１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の非存在下において測定した全結合から、過剰の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の存在下において得られた非特異的結合を差し引くことによって特異的結合を計算することができる（Skowronski et al. (1995) Endocrynology 136(1): 20-26）。
【００３６】
ビタミンＤ類似体またはビタミンＤレセプターモデュレーターが細胞分化を誘導する能力は、当業者に周知の種々の方法によって測定され得る。例えば、この能力は、Skowronski et al. (前掲書中)に記載のように類似体またはビタミンＤレセプターモデュレーターと共にインキュベーションした後の、ＬＮＣａＰ細胞株におけるＰＳＡ（細胞分化マーカー）の誘導の測定によって推定され得る。
【００３７】
多くのビタミンＤ類似体が当技術分野の最新技術において周知である。「ビタミンＤ類似体」という表現は特に、ビタミンＤ代謝物、ビタミンＤ誘導体およびビタミンＤ前駆体を包含し、好ましくはそれはビタミンＤ３代謝物、ビタミンＤ３誘導体およびビタミンＤ３前駆体を包含する。
【００３８】
本発明によるビタミンＤ類似体は、Ｃ−２４位の周囲における側鎖構造が修飾されたセコステロイド構造を保持し得る。例えば、ビタミンＤ類似体は、パリカルシトール（１９−ノル−１α（ＯＨ）２Ｄ２）、ＩＬＸ２３−７５５３（１６−エン−２３−イン−１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３）、ＯＣＴ（マキサカルシトール、２２−オキサ−１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３）およびＥＢ１０８９（セオカルシトール、１α−ジヒドロキシ−２２，２４−ジエン−２４，２６，２７−トリホモ−ビタミンＤ３）またはコレカルシフェロールであり得る。
【００３９】
より好ましくは、本発明によるビタミンＤ類似体は、パリカルシトール、ＯＣＴ、ＥＢ１０８９およびコレカルシフェロールからなる群より選択される。より好ましくはビタミンＤ類似体はコレカルシフェロールである。
【００４０】
本発明によるビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）は好ましくは、例えばＵＳ２００８／０２００５５２に記載の化合物のような、ＶＤ類似体よりも低カルシウム血症の程度がより低いことが示された非セコステロイド化合物である。より好ましくは、少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）は、ＬＹ２１０８４９１、ＬＹ２１０９８６６およびＬＧ１９０１１９からなる群より選択される（Ma et al. (2006) J Clin Invest 116(4):892-904, Polek et al (2001) Prostate 49(3):224-33）。
【００４１】
「薬学的に許容される担体」という表現は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、無毒性の固体の、半固体のまたは液体の充填剤、希釈剤、封入剤または製剤化助剤の任意の種類を指す。
【００４２】
本発明による医薬組成物の剤形、投与経路、投与量および投与計画は、処置しようとする状態、病気の重症度、患者の年齢、体重および性別などに依存する。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、特に、経口投与（好ましくはＶＤおよび鉄キレート剤の投与のために）、静脈内投与（好ましくはＶＤ、トランスフェリンレセプター阻害剤および鉄キレート剤の投与のために）、皮下投与（好ましくは鉄キレート剤の投与のために）または筋肉内投与（好ましくはＶＤの投与のために）用に製剤化され得る。
【００４４】
好ましくは、本発明による医薬組成物は、ビタミンＤ３およびモノクローナル抗体Ａ２４を含む。また好ましくは、本発明による医薬組成物はビタミンＤ３およびデフェロキサミンおよび／またはデフェラシロクスを含む。
【００４５】
例えば、本発明による少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤は、約０．１〜１０００mg/kg（体重）/日または好ましくは約１〜１００mg/kg（体重）/日の濃度で投与され得る。好ましくは、デフェラシロクスは、約１〜５０mg/kg（体重）/日の濃度で、より好ましくは約１０〜３０mg/kg（体重）/日の濃度で投与され得る。好ましくは、デフェロキサミンは、約１０〜１００mg/kg（体重）/日の濃度で、より好ましくは約６０〜８０mg/kg（体重）/日の濃度で投与され得る。
【００４６】
例えば、本発明による少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）は、約０．００１〜１００g/kg（体重）/日または約０．０１〜５０g/kg（体重）/日または約０．１〜５g/kg（体重）/日、より好ましくは約０．５g/kg（体重）/日の濃度で投与され得る。
【００４７】
前記に定義した、癌を有していた、前記癌を有する、または前記癌を発症しやすい個体に、少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）を投与する前、投与と同時に、またはその投与後に、少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤を投与することができる。少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤および少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）を、第１の結合分子が第２の結合分子と一緒に作用することにより、それ以外の方法で投与した場合よりも増加した利点が得られるような、順序および時間枠内で投与することができる。好ましくは、少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤および少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）は一緒に投与される。
【００４８】
本発明による医薬組成物は、癌の予防または処置に使用され得る。好ましくは、癌は造血器悪性腫瘍である。
【００４９】
本発明に関連して、「処置または予防」という用語は、このような用語を適用する疾患もしくは状態、またはこのような疾患もしくは状態の１つ以上の症状の逆行、軽減、その進行の阻害、または予防を意味する。特に、疾患の処置は、悪性細胞の数を減少させることからなり得る。最も好ましくは、このような処置により、悪性細胞の完全な枯渇に至る。
【００５０】
好ましくは、処置しようとする個体は、癌に罹患したまたは罹患する可能性のあるヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばげっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌ、または霊長類）である。好ましくは、個体はヒトである。
【００５１】
「癌」および「悪性腫瘍」という用語は、未制御な細胞増殖によって典型的には特徴付けられる哺乳動物における病的状態を指すまたは説明する。より正確には、本発明の使用において、疾病、すなわちビタミンＤレセプターを発現する腫瘍は、ビタミンＤモデュレーターに応答する可能性が最も高い。さらに、本発明者らは、鉄取り込み阻害剤を使用することによる鉄欠乏は、細胞表面におけるビタミンＤ受容体の過剰発現によってビタミンＤの感受性を回復させるという仮説を立てる。特に、癌は、固体腫瘍または未分化造血骨髄細胞（造血幹細胞）の未制御な増殖を伴い得る。固形腫瘍形成に関連した癌の例としては、乳癌、膀胱癌、子宮／頸癌、食道癌、膵臓癌、大腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌および胃癌が挙げられる。
【００５２】
好ましくは、本発明による癌または悪性腫瘍は、未分化造血骨髄細胞（造血幹細胞）の未制御な増殖に起因する。
【００５３】
本明細書において意図する「造血幹細胞（ＨＳＣ）」という表現は、例えば、骨髄系統（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球）、赤血球、巨核球／血小板、およびリンパ系譜（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血球型を生じる、成人多能性幹細胞を指す。
【００５４】
本発明による「造血幹細胞悪性腫瘍」または「造血器悪性腫瘍」という表現は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ腫および骨髄異形成症候群（２００１年のＷＨＯ分類に定義）を含む。好ましくは、本発明による癌は、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、非処理細胞（対照）と比較した、Ａ２４（Ａ２４）、デフェロキサミン（ＤＦＯ）またはデフェラシロクス（ＤＦＸ）によって処理されたＣＤ３４＋臍帯血細胞の半固体培養液から得られたマクロファージのコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）の比を示す。
【図２】図２は、Ａ２４およびＤＦＯを用いて７２時間かけて処理されたＡＭＬ患者の芽球におけるＣＤ１１ｂの発現を示す。対照細胞と比較したＭＦＩの増加を計算することによって、得られた値を規準化する。ＡＭＬのサブタイプが識別される：黒い記号はＭ０／Ｍ１／Ｍ２のＡＭＬサブタイプを示し、一方、白抜きの記号はＭ４／Ｍ５サブタイプを示す。８名の患者から得られた平均値が示されている。
【図３】図３は、Ａ２４およびＤＦＯを用いて７２時間かけて処理されたＡＭＬ患者の芽球におけるＣＤ１４の発現を示す。対照細胞と比較したＭＦＩの増加を計算することによって、得られた値を規準化する。ＡＭＬのサブタイプが識別される：黒い記号はＭ０／Ｍ１／Ｍ２のＡＭＬサブタイプを示し、白抜きの記号はＭ４／Ｍ５サブタイプを示す。８名の患者から得られた平均値が示されている。
【図４】図４は、ビタミンＤ３（ＶＤ、２５０nM）、Ａ２４（Ａ２４、１０μg/ml）、デフェロキサミン（ＤＦＯ、５μM）またはデフェラシロクス（ＤＦＸ、３μM）を用いてのＨＬ６０細胞の処理後のｃ−Ｊｕｎ発現の変化を示す。
【図５】図５は、Ａ２４（Ａ２４、１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ、５μM）；またはデフェラシロクス（ＤＦＸ、３μM）を用いて４８時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎ ｍＲＮＡレベル（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４）を示す。
【図６】図６は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（黒色）標識およびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ（灰色）標識を使用してフローサイトメトリーによって評価した初期および後期アポトーシス／壊死を示す。ＨＬ６０細胞を、２μMおよび６μMのＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（ＳＰ）の補充されたまたは補充されていない培地中、Ａ２４（１０μg/ml）またはデフェロキサミン（ＤＦＯ、５μM）の存在下または非存在下において培養した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【図７】図７は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（黒色）およびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ（灰色）を使用してフローサイトメトリーによって評価した初期および後期アポトーシス／壊死を示す。ＨＬ６０細胞を、０．５μMおよび１μMのｐ３８阻害剤のＳＢ２０３５８０（ＳＢ）の補充されたまたは補充されていない培地中、Ａ２４（Ａ２４、１０μg/ml）またはデフェロキサミン（ＤＦＯ、５μM）の存在下または非存在下において培養した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【図８】図８は、Ａ２４（１０μg/ml）（連続的な薄い線）を用いて、ＶＤ（２５０nM）（非連続的な薄い線）を用いて、またはＶＤと鉄キレート化剤との併用（連続的な太い線）で７２時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるＣＤ１４およびＣＤ１１ｂの発現のフローサイトメトリー分析を示す。塗りつぶされているヒストグラムは、対照アイソタイプ標識を示す。
【図９】図９は、ＤＦＯ（５μM）（連続的な薄い線）を用いて、ＶＤ（２５０nM）（非連続的な薄い線）を用いて、またはＶＤと鉄キレート化剤との併用（連続的な太い線）で７２時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるＣＤ１４およびＣＤ１１ｂの発現のフローサイトメトリー分析を示す。塗りつぶされているヒストグラムは対照アイソタイプ標識を示す。
【図１０】図１０は、Ａ２４（Ａ２４／１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ／５μM）、またはビタミンＤ３（ＶＤ／２５０nM）、Ａ２４とデフェロキサミン（Ａ２４＋ＤＦＯ／１０μg/mlおよび５μM）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（ＶＤ＋ＤＦＯ／２５０nMおよび５μM）を用いて６時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるＶＤＲ転写物のレベルを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）。
【図１１】図１１は、Ａ２４（Ａ２４／１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ／５μM）、またはビタミンＤ３（ＶＤ／２５０nM）、Ａ２４とデフェロキサミン（Ａ２４＋ＤＦＯ／１０μg/mlおよび５μM）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（ＶＤ＋ＤＦＯ／２５０nMおよび５μM）を用いて６時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるカテリシジン転写物レベルを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）。
【図１２】図１２は、Ａ２４（Ａ２４／１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ／５μM）、またはビタミンＤ３（ＶＤ／２５０nM）、Ａ２４とデフェロキサミン（Ａ２４＋ＤＦＯ／１０μg/mlおよび５μM）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（ＶＤ＋ＤＦＯ／２５０nMおよび５μM）を用いて６時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるＣＹＰ２４Ａ転写物レベルを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）。
【図１３】図１３は、Ａ２４（Ａ２４／１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ／５μM）、またはビタミンＤ３（ＶＤ／２５０nM）、Ａ２４とデフェロキサミン（Ａ２４＋ＤＦＯ／１０μg/mlおよび５μM）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（ＶＤ＋ＤＦＯ／２５０nMおよび５μM）を用いて１６時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるｃ−Ｊｕｎ転写物レベルを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）。
【図１４】図１４は、Ａ２４（Ａ２４／１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ／５μM）、またはビタミンＤ３（ＶＤ／２５０nM）、Ａ２４とデフェロキサミン（Ａ２４＋ＤＦＯ／１０μg/mlおよび５μM）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（ＶＤ＋ＤＦＯ／２５０nMおよび５μM）を用いて１６時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるｃ−Ｆｏｓ転写物レベルを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）。
【図１５】図１５は、ビヒクル（対照、ｎ＝１２）を用いて注射されたマウスと比較して、デフェロキサミン（ＤＦＯ、ｎ＝１４）（２０mg/日、５〜７回/週のＤＦＯ）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（１μg、１週間に２回のＶＤ、および２０mg/日、５〜７回/週のＤＦＯ）（ＤＦＯ＋ＶＤ、ｎ＝１３）を用いて注射された異種移植マウスにおいて２５日目に測定した腫瘍サイズを示す。個々の腫瘍をプロットする。
【００５６】
実施例
方法
臨床試料および細胞株
ＡＭＬ患者および健康ドナーからの末梢血細胞を、彼らの書面によるインフォームドコンセントが得られた後に分析した（さらなる情報については付録の表２を参照されたい）。末梢血を、処置投与前の初回の診断時に回収した。単球細胞を、フィコール・ハイパック（PAA laboratories）密度遠心分離によって分離し、そして１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Hyclone）、１００ng/mlの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０ng/mlのインターロイキン３（ＩＬ−３）および２５ng/mlのＦＬＴ３−Ｌ（全てR&D Systemsから購入）の補充されたＩＭＤＭ培地（Invitrogen）中に再懸濁した。ＨＬ６０およびＵ９３７細胞株は、J.M. Cayuela (Saint-Louis Hospital, Paris)からの親切な贈り物であった。細胞を、５％ＦＣＳおよび抗生物質の補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Invitrogen）中で培養した。
【００５７】
【表１】
【００５８】
細胞の処理および増殖についてのアッセイ
デフェラシロクスは、ノバルティスによって提供された。ＶＰ１６、ＤＦＯ、ＶＤおよびＦｅＣｌ３を、シグマ・アルドリッチから購入した。ｍＡｂ Ａ２４を、記載のように産生および精製した（Moura et al. (2001) J Exp Med 194:417-25）。ＪＮＫ（ＳＰ６００１２５）、ＥＲＫ（ＰＤ９８０５９）およびｐ３８（ＳＢ２０３５８０）ＭＡＰＫの阻害剤は全て、Santa-Cruz Biotechnologyから購入した。
【００５９】
増殖アッセイのために、ＨＬ６０細胞株を、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁し、そして患者の芽球を、１５％ＢＩＴ ９５００（Stem Cell Technologies）を含むＩＭＤＭ培地中に再懸濁した。細胞を、３枚の９６ウェル組織培養プレート（Falcon）に１ウェルあたり２．５×１０４個加えた。増殖を、記載のように測定した（Lepelletier et al. ((2007) Cancer Res 67:1145-1154）。
【００６０】
細胞遺伝学的分析
蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、第８染色体（ｐＺ８．４）および第１２染色体（ｐＢＲ１２）（対照として使用する）についての特異的セントロメアプローブと共に標準的なプロトコールを使用して実施した。
【００６１】
ＲＮＡ単離、リアルタイム定量ＰＣＲおよびトランスクリプトーム分析
全ＲＮＡを、Nucleospin RNA II (Macherey-Nagel)を使用して抽出した。ＤＮＡｓｅ処理後、一本鎖ｃＤＮＡを、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）を使用して合成した。定量リアルタイムＰＣＲを、Chromo-IV PCR System (MJ Research)を用いて実施し、そしてＰＣＲ産物を、SybrGreen Technology (Jumpstart mastermix, Sigma Aldrich)を使用して定量した。リアルタイム定量ＰＣＲの結果を、デルタデルタＣｔ法（Livak et al. (2001) Methods 25:402-408）を使用して解釈した。使用するプライマー配列の完全なリストは、付録のデータの章の表４において入手可能である。
【００６２】
マイクロアレイのために、アジレント社４４Ｋ全ヒトゲノム（Ｇ４１１２Ａ）の長い（６０ｂｐ）オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよび二色分析法を使用し、処理した試料からのプローブおよびリファレンスＲＮＡからのプローブを、シアニン５およびシアニン３を用いて別々に標識した。これらのマイクロアレイは、４４，２９０個のフィーチャー（feature）を有し、その中の４１，０００個の明確に異なるオリゴヌクレオチドは、そのアクセッションナンバーによって定義される３３，７１５個の配列に属する。直接比較するために、各々の処理した試料からのｃＲＮＡを、シアニン３（Ｃｙ３）−シチジン三リン酸（ＣＴＰ）を用いて標識し、そして非処理のＨＬ６０ＲＮＡリファレンスプールを、シアニン５（Ｃｙ５）−ＣＴＰを用いて標識した。逆転写、リニア増幅、ｃＲＮＡ標識および精製を、アジレント社リニア増幅キットを用いて実施した。マイクロアレイデータを、主にリゾルバ（Resolver）ソフトウェア（Rosetta Inpharmatics）を用いて分析した。全てのデータをフィルターにかけて、両方の色について５０任意単位よりも下の低強度の値を削除した。
【００６３】
腫瘍異種移植片
腫瘍確立の予防のために、５×１０６個のＨＬ６０細胞を、マトリゲルと混合し（１：１、Ｖ／Ｖ）、そして８〜１０週令の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。その後、マウスに、Ａ２４（４０mg/kg、１日目に１回）、ＤＦＯ（２０mg/日、１週間に５〜７回）、ＶＤ（１μg、１週間に２回）またはビヒクル対照としてのＰＢＳを２５日間の間に腹腔内注射した。腫瘍の増殖を、Lepelletier et al. ((2007) Cancer Res 67:1145-1154)に記載のように測定した。
【００６４】
免疫組織化学
パラフィンブロックからの３mmの連続切片を、キシレン中で脱パラフィン処理し、そして一連の段階的なアルコール中で水和させた。染色を、Lab Vision社の免疫組織化学Autostainer（Lab Vision Corporation, Fremont, CA）を使用して、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ（シグマ・アルドリッチ、１：２００）、ｐ−ＥＲＫおよびｐ−Ｊｕｎ（Cell Signaling、１：１０００）に対する一次抗体、その後、ビオチニル化抗Ｉｇおよびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて実施し、そしてＤＡＢ（０．０５％）および０．００３％Ｈ２Ｏ２を含むＰＢＳ中で発色させた。画像を、ＩＭ５０ソフトウェアを使用してデジタルカメラ（DFC320, Leica）およびLeica顕微鏡（ＤＭ−２０００）で得た。
【００６５】
統計分析
データを、平均±ＳＥＭとして表現する。統計分析を、GraphPadPrism 5ソフトウェアを用いて実施した。スチューデントｔ検定を使用して２つの群を比較し、多群比較を、一元配置ＡＮＯＶＡ検定、その後、post-hoc分析（Bonferroni検定）を使用して行なった。クラスカル・ウォリス検定、続いてダンのポスト検定を、ノンパラメトリック比較（指定されている場合）のために使用した。腫瘍を有さない動物曲線の比較のために、ログランク検定を使用した。結果は、０．０５未満（＊）、０．０１未満（＊＊）または０．００１未満（＊＊＊）のＰ値を統計学的有意と考えた。
【００６６】
結果
実施例１：鉄欠乏は、細胞分化に関連した遺伝子の発現に影響を与える
前記の鉄キレート化治療アプローチの抗腫瘍作用に関与する分子機序は依然として完全に解明されていない。これらの機序を新たに洞察するために、鉄キレート剤（デフェロキサミン（ＤＦＯ）およびデフェラシロクス（ＤＦＸ））およびＴｆＲ１障害（ｍＡｂ Ａ２４）の両方によって影響を受ける遺伝子を同定した。理論は、この戦略によって無関係の遺伝子を選択する可能性が減少するだろうというものであった。これらの研究は、細胞株モデル（ＨＬ６０）に焦点を当て、ＡＭＬ患者の発癌に関与するいくつかの遺伝子事象に関連したデータの不均一性を回避した。回収したデータの分析により、１０５個の遺伝子が３つの異なる薬剤によってモデュレーションされたことが明らかとなった。これらの遺伝子の中で、いくつかは細胞分化に関連していた。特に、鉄欠乏剤によって、単球または活性化マクロファージのマーカーはアップレギュレーションされ（ＳＥＲＰＩＮＢ８、ＩＴＧＢ２、ＴＲＥＭＬ２、ＩＴＧＡＭ）、顆粒球分化のマーカーはダウンレギュレーションされた（ＥＬＡ２、ＰＲＴＮ３、ＣＬＣ、ＡＺＵ）。
【００６７】
実施例２：鉄恒常性は顆粒球−単球への分化において役割を果たす
初代造血前駆細胞における鉄欠乏の効果を試験した。鉄欠乏剤（鉄キレート剤のように直接的に、または抗ＴｆＲ ｍＡｂ Ａ２４の使用によって間接的に）の存在下または非存在下における初代ＣＤ３４＋細胞（多能性サイトカインと共に）の半固体培養により、ＣＦＵ−Ｍのコロニー数が増加しＣＦＵ−Ｇが減失したが、このことは、造血前駆細胞からのキレート化鉄が、顆粒球系統よりも単球系統の方への傾倒を誘導したが（図１）、コロニーの総数は変化させなかったことを示唆する。液体培養では、鉄欠乏は、臍帯血細胞の増殖に影響を与えなかったが、単球系統へのその傾倒をモデュレーションした。同様に、単球系統に特異的な転写因子であるＨＯＸＡ１０、ＥＧＲ１およびＭａｆＢの一貫したアップレギュレーションがみられた。培養の細胞学的評価により、鉄の少ない培養において単球細胞数が増強したことを確認した。従って、骨髄ニッチにおいて、鉄の利用可能性は、造血前駆細胞から骨髄単球への分化の転帰か、顆粒球への分化の転帰かを決定する因子であり得る。
【００６８】
実施例３：鉄欠乏は白血病細胞の分化を誘導する
鉄欠乏による、ＡＭＬ細胞の分化の遮断無効化能力を試験した。ＡＭＬ細胞株において、Ａ２４ｍＡｂ、ＤＦＯおよびＤＦＸによる鉄欠乏によって、単球マーカーＣＤ１４およびＣＤ１１ｂ（これは単球分化剤であるビタミンＤ３（ＶＤ）によって誘導される）が誘導された。細胞表面マーカーの誘導は、単球の特徴的な細胞学的改変を伴った。鉄欠乏により、細胞質の拡大、細胞質の好塩基球増加症の減少およびアズール顆粒の減少が誘導された。分化マーカー発現のアップレギュレーションは、培養液に過剰の可溶性鉄を補充した場合に消失し、このことは単球分化プログラムの第１の起源が、細胞の鉄利用可能性に依存することを確認する。
【００６９】
次に、ＡＭＬ患者からの細胞も、鉄欠乏で分化を誘導させ得るかどうかを調査した。種々のＡＭＬサブタイプからの新鮮なＡＭＬ芽球を、診断時に単離し（研究に使用した患者のサブタイプおよび生物学的パラメーターの完全なリストを表１に列挙する）、そしてｍＡｂ Ａ２４およびＤＦＯの存在下において培養した。ＣＤ１４およびＣＤ１１ｂマーカー発現は、培養により一貫してアップレギュレーションされ、このことにより、種々のＡＭＬサブタイプからの芽球は、分化停止に至るその発癌事象は異質であったとしても、鉄欠乏に基づいた分化療法に感受性であることが示された（図２および図３）。in vitroにおける治療量域研究により、分化が細胞増殖停止およびアポトーシスを伴うことを示された。
【００７０】
実施例４：鉄欠乏によって誘導されるＪＵＮキナーゼ経路
ＶＤおよび鉄キレート化剤によって誘導される遺伝子のパターンを（目的変数なしの分析を用いて）比較することによって、モデュレーションされた遺伝子間の高度の類似性を見出した。鉄欠乏によってモデュレーションされた１０５個中３０個の遺伝子が、ＶＤにより改変された遺伝子と共通した。この所見は、両方の分化アプローチ間の類似の可能性を強調する。ＶＤおよび鉄キレート化剤の両方が、単球マーカー（ＳＥＲＰＩＮＢ８、ＩＴＧＢ２、ＴＲＥＭＬ２、ＩＴＧＡＭ）をアップレギュレーションし、そして好中球マーカー（ＥＬＡ２、ＰＲＴＮ３、ＣＬＣ、ＡＺＵ）をダウンレギュレーションした。ＪＵＮキナーゼ経路（ＪＮＫ）は、単球分化に関与する主要なＭＡＰＫ経路であり、そしてＶＤによって誘導されることが以前に示されている（Wang et al; (2003) J Cell Biochem 89:1087-1101）。効果的に、ｃ−Ｊｕｎ遺伝子はＶＤによって誘導されたが、また鉄欠乏によっても誘導された（図４）。さらに、ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎをコードする転写物も、両方の処理によってアップレギュレーションされた（図５）。その特異的阻害剤であるＳＰ６００１２５によるＪＮＫの阻害は、Ａ２４またはＤＦＯを伴う鉄によって誘導される分化を消失させた。ＭＡＰＫ経路（細胞外シグナル調節キナーゼＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８）は頻繁に収束してシグナル伝達を増幅する（Johnson et al. (2002) Science 298:1911-1912, Lopez-Bregami et al. (2007) Cancer Cell 11:447-460）。これに一致して、鉄キレート化剤は、その分子エフェクターのリン酸化によって証明されるような、ＭＡＰＫ関連ＥＲＫおよびｐ３８の経路の活性化を誘導したことが判明した。さらに、ＥＲＫおよびｐ３８経路の選択的阻害は、鉄欠乏によって誘導される細胞分化を遮断した。しかしながら、ＪＮＫおよびｐ３８の阻害剤（図６および図７）は、鉄欠乏によって誘導される細胞アポトーシスを妨げたが、ＥＲＫの阻害剤は妨げなかった。
【００７１】
実施例５：鉄キレート化剤とビタミンＤ３の併用は、ＡＭＬ芽球分化に対して相乗作用を及ぼす
次に、鉄キレート化剤とＶＤの併用が相乗作用を及ぼし得るかどうかを調べた。キレート剤とＶＤの併用は、単球細胞分化マーカーのアップレギュレーションを劇的に増加させた（図８および図９）。これは、単球細胞分化に関与するＶＤＲ遺伝子転写のアップレギュレーション（図１０）によって説明され得る（Himes et al; (2006) J Immunol 176:2219-2228, Wang et al. (2003) J Cell Biochem 89:1087-1101）。上昇したＶＤＲ遺伝子発現の生理学的関連性は、その下流のターゲット遺伝子であるカテリシジン（１０００倍増加）（図１１）およびＣＹＰ２４Ａ（６０００倍増加）（図１２）の転写の急激な増加によって証明された。観察された相乗作用はＪＮＫ経路の活性化にも起因する。なぜなら、ｃ−Ｊｕｎ遺伝子およびｃ−Ｆｏｓ遺伝子が、鉄キレート化とＶＤの併用によって顕著にアップレギュレーションされたからである（図１３および図１４）。さらに、ＶＤを鉄欠乏と併用すると、ＪＮＫのリン酸化は増加した。これらの著名な改変は、処理細胞における形態学的変化を伴った。それ故、鉄欠乏とＶＤなどの分化剤との両方の併用は、その抗白血病特性を維持しつつ、併用療法における副作用を減少させ得る。
【００７２】
実施例６：鉄キレート化とビタミンＤ３の併用は、in vivoのマウス腫瘍異種移植片モデルにおいて相乗作用を及ぼす
分化療法の効力を、in vivoのマウス腫瘍異種移植片モデルにおいてさらに評価した。ＶＤとＤＦＯ療法の組合せは、マウスにおける腫瘍の増殖を有意に減少させた（図１５）。減少した腫瘍増殖は、腫瘍細胞のアポトーシス、細胞分化の特徴、およびＭＡＰＫリン酸化（ＥＲＫおよびＪＮＫ）を伴った。
【００７３】
実施例７：鉄キレート剤とビタミンＤ３の併用は、１名のＡＭＬ患者において芽球分化を誘導した
鉄キレート剤とＶＤの効力を１名のＡＭＬ患者において評価した。６９歳の男性は、最近、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）から急性骨髄性白血病への転換を示した。高用量の化学療法後、患者には依然として芽球無形成はなかった。診断から７月後、芽球が血液中に再度出現し、そして鉄キレート剤（デフェラシロクス１ｇ／日）およびＶＤ（４０００ＵＩ／日）を用いての処置を開始した。この組合せ療法は好中球数の増加を伴ったが、高カルシウム血症は誘導しなかった。重要なことには、組合せ処置は、ＭＧＧ血液塗抹標本上で観察されたように芽球から単球系統への分化を誘導した。この観察は細胞選別、その後の細胞遺伝学的分析によってさらに確認され、ここでは元の芽球トリソミーが、未成熟細胞から誘導された成熟単球には見出されたが、リンパ球およびＮＫ細胞には見出されなかった。それ故、鉄恒常性は、正常な状況および病的な状況の両方における細胞分化の制御において重要な役割を果たす。鉄の少ない環境においてはＢＭ細胞は単球へと分化する傾向にあり、そしてＡＭＬからの芽球は鉄キレート剤の存在下において分化し得る。ゲノムスクリーニングにより、細胞分化に関連した遺伝子が、鉄欠乏によってターゲティングされそしてこれはＶＤと高度に共有されている（３０％の類似性）ことが示される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の処置または予防に使用するために、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置または予防に使用するために適した化合物および医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、未分化骨髄芽球の無制限な増殖を引き起こす、前駆細胞の突然変異を起源とする不均一な悪性疾患である。ＡＭＬは、成人に罹患する最も一般的な急性白血病であり、そしてその発症率は年齢と共に増加する。ＡＭＬは比較的稀な疾病であり、米国における癌死亡の約１．２％を占めるが（Jemal et al. (2002) CA Cancer J Clin 52(1):23-47）、その発症率は人口の高齢化に従って増加すると予期される。
【０００３】
ＡＭＬ患者では、骨髄は通常、芽球細胞によって高度に浸潤され、その結果、赤血球、血小板および正常な白血球は減少する。ＡＭＬの症状としては、疲労、息切れ、容易に挫傷しそして容易に出血すること、および感染リスクの増加が挙げられる。ＡＭＬについてのいくつかのリスクファクターが同定されているが、ＡＭＬの具体的原因は依然として不明である。ＡＭＬは急速に進行し、そして典型的には処置せず放置すれば数週間または数カ月以内に死に至る。ＡＭＬの白血病誘発は多段階イベントとして起こる（Gilliland et al. (2004) Hematology Am Soc Hematol Educ Program 80-97）。これらのイベントは２つの群に分類される：第１群は、造血前駆細胞に増殖および／または生存の利点を付与する遺伝子的変化に関わる（例えばＲＡＳ、ＦＬＴ３またはｃ−ＫＩＴの突然変異）。第２は、血球分化に影響を及ぼす、最も頻繁には染色体転座によってしかしまた点突然変異（例えばＣＥＢＰα、ＮＰＭ１）によっても誘発される、転写因子（または転写コアクチベーター）の変化に関わる。
【０００４】
ＡＭＬの処置は、主に、従来の化学療法からなり、そしてもし患者の大半が最初の治療誘導後に寛解しても、彼らの大半は再発する。疾病を伴わない長期の生存を確実にするために設計された、寛解後の処置としては、自己幹細胞救出を伴う高用量化学療法、または同種骨髄移植（ＢＭＴ）が挙げられる。しかしながら、ＡＭＬ患者の大半を構成する高齢患者はＢＭＴに適格ではない。積極的な治療にも関わらず、患者の僅か２０〜３０％のみしか、無病生存を長期に享受できない。従って、他の治療法が必要とされる。
【０００５】
鉄は、エネルギー代謝および細胞増殖に関与する多くの重要な細胞酵素のための補因子として必要とされ、従って、これは全ての生細胞にとって必須である。種々の研究により、腫瘍細胞がトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ１／ＣＤ７１）を強く発現し、そして非腫瘍細胞よりも鉄欠乏に対してより感受性が高いことが示された（Faulk et al. (1980) Lancet 2(1):390-92）。
【０００６】
本発明者らは、以前に、ＴｆＲ１のレセプターが細胞表面上に高度に発現されている場合に、このレセプターに強く結合するモノクローナル抗体（Ａ２４）を特徴付けた。Ａ２４の結合は、リソソーム区画（ここで分解される）へのレセプターの内部移行およびまた鉄欠乏による細胞アポトーシスを誘導する（Moura et al. (2004) Blood 103(5):1838-45, Lepelletier et al. (2007) Cancer Res 67(3):1145-54）。Ａ２４は、腫瘍細胞の増殖を特異的に減少させることが示されたが、正常細胞に対してはそうではない。いくつかの研究により、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）およびマンテル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）において白血病／リンパ腫細胞を根絶するＡ２４の効力が示された（Moura et al. (2004) Blood 103(5):1838-45, Lepelletier et al. (2007) Cancer Res 67(3):1145-54）。
【０００７】
他の研究により近年、鉄キレート剤もまた、in vitroおよびin vivoにおいて抗増殖特性を有することが実証された。種々の鉄キレート剤の効力が、ヌードマウスにおけるヒト異種移植片において示された（Whitnall et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103(40):14901-6）。
【０００８】
ビタミンＤ３（ＶＤ）の抗増殖作用、分化作用およびアポトーシス促進作用が、正常または病的な上皮組織において示された。ＶＤはステロイドスーパーファミリーに属する。ＶＤはその同族レセプター（ＶＤＲ）と会合して、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）を有するヘテロ二量体を形成する。その後、この複合体はＶＤ応答エレメント（ＶＤＲＥ）と結合し、それにより遺伝子転写の変化を誘導する。ＶＤはまたＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を活性化して、細胞分化に関与する遺伝子の転写をモデュレーションする。
【０００９】
in vitroにおいてＶＤは、頭部癌、頸部癌、前立腺癌または大腸癌に由来する細胞系譜における、本来の分化細胞に関連した遺伝子の発現を促進する（Akutsu et al (2001) Mol Endocrinol 15(7) :1127-39, Palmer et al. (2003) Cancer Res 63(22) :7799-806）。
【００１０】
in vitroにおいて、カルシトリオール（活性型ビタミンＤ３）は、扁平上皮癌および前立腺腺癌において抗増殖活性を示し、そして古典的な化学療法剤の抗腫瘍活性を増強する（Hershberger et al. (2001) Clin Cancer Res 7(4):1043-51）。
【００１１】
前立腺癌において、高用量のカルシトリオールの併用または併用なしで広く使用されている化学療法剤（ドセタキセル）の使用を比較した前向き無作為試験において、患者の生存率はＶＤ／ドセタキセル治療群において増加することが判明した（Beer et al. (2007) J Clin Oncol 25(6):669-74）。しかしながら、ビタミンＤ３に対する応答は反復処置後に急速に低下し、従って、その効果は期間が限定的である。
【００１２】
最後に、何人かの著者は、in vitroにおいて分化剤としてのビタミンＤ３の効力を示し、そしてＡＭＬ処置におけるその使用が提案されている（Makashima et al. (1998) Br J Cancer 77(1):33-9）。化学療法（アラシチンまたは６−チオグアニン）と分化剤（ビタミンＤおよびレチノイン酸）の併用を２６名の患者で１回評価し、５０％の寛解が可能となった（完全寛解２７％および部分寛解２３％）（Ferrero et al. (2004) Haematologica 89(5):619-20）。
【００１３】
結論づけると、鉄欠乏およびＶＤは抗腫瘍療法として試験されたが、前記の薬剤のいずれも、ＡＭＬなどの癌に罹患した個体を完全に処置するものとは証明されていない。従って、特にＡＭＬ処置において新たな展望を提供し得る新たな代替治療法が必要とされる。
【００１４】
発明の要約
本発明は、鉄キレート化剤が、特にマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化を通して、ビタミンＤ３と相乗的に作用するという本発明者らによる予期せぬ所見からもたらされる。この併用は、in vitroのＡＭＬ芽球において、およびin vivoのマウスに異種移植されたＡＭＬ腫瘍において効果的であると証明された。本発明者らはまた、併用療法がまた、化学療法に難治性であるＡＭＬ患者の状態を改善し、そして患者の芽球の細胞分化を誘導することを示した。
【００１５】
従って、本発明は、特に癌の予防または処置において使用するための、
ａ）少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びに
ｂ）ＭＡＰＫ経路の活性化を誘導することのできる少なくとも１つの化合物、特に少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター、
並びに場合により薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明はまた、癌の予防または処置において同時、別々または連続的に使用するための組合せ調製物としての、
ａ）少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びに
ｂ）ＭＡＰＫ経路の活性化を誘導することのできる少なくとも１つの化合物、特に少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター
を含む製品に関する。
【００１７】
本発明はまた、癌の予防または処置を目的とした医薬品の製造のための、少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びにＭＡＰＫ経路の活性化を誘導することのできる少なくとも１つの化合物、特に少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーターの使用に関する。
【００１８】
本発明はまた、予防有効量または治療有効量の少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤およびＭＡＰＫ経路の活性化を誘導することのできる少なくとも１つの化合物、特に少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）を個体に投与することを含む、個体における癌の予防および／または処置のための方法に関する。
【００１９】
発明の詳細な説明
本明細書において定義する「鉄取り込み阻害剤」という表現は、細胞による鉄取り込みを減少または妨げる上で活性である化合物を指す。
【００２０】
好ましくは、鉄取り込み阻害剤は、鉄キレート剤およびトランスフェリンレセプター阻害剤からなる群より選択される。
【００２１】
本明細書において使用する「鉄キレート剤」または「鉄キレート化化合物」という表現は同義語として使用され、そして鉄に結合する化合物に関する。鉄と結合または鉄と複合体を形成した鉄キレート化化合物は、本明細書において鉄キレートと呼ばれる。
【００２２】
好ましくは、鉄キレート化化合物は、二座、三座、四座またはより高次の多座化合物であり得る。二座、三座、四座またはより高次の多座の鉄キレート化化合物は、それぞれ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の別々の結合部位を使用して鉄に結合する化合物を指す。本発明の鉄キレート化化合物としては、鉄の全ての酸化状態（例えば、鉄（−ＩＩ）状態、鉄（−Ｉ）状態、鉄（０）状態、鉄（Ｉ）状態、鉄（ＩＩ）状態（二価鉄）、鉄（ＩＩＩ)状態（三価鉄）、鉄（ＩＶ）状態（四価鉄）および／または鉄（Ｖ）を含む）に結合することのできるキレート化化合物が挙げられる。
【００２３】
具体的な二価鉄キレート剤の例としては、１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリジン−４−オン（デフェリプロン、ＤＦＰまたはフェリプロキス）および２−デオキシ−２−Ｎ−カルバモイルメチル−［Ｎ’−２’−メチル−３’−ヒドロキシピリジン−４’−オン］）−Ｄ−グルコピラノース（Feralex-G）が挙げられる。具体的な三価鉄キレート剤の例としては、ピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン（ＰＩＨ）、４，５−ジヒドロ−２−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−４−メチルチアゾール−４−カルボン酸（ＧＴ５６−２５２）、４，５−ジヒドロ−２−（３’−ヒドロキシピリジン−２’−イル）−４−メチルチアゾール−４−カルボン酸（デスフェリチオシンまたはＤＦＴ）および４−［３，５−ビス（２−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−１−イル］安息香酸（ＩＣＬ−６７０、デフェラシロクス）が挙げられる。鉄キレート剤はまた、遊離酸形、その塩およびその結晶形の置換された３，５−ジフェニル−１，２，４−トリアゾールであり得る（ＷＯ９７／４９３９５に記載）。具体的な六価鉄キレート剤の例としては、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｏ−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、Ｎ−（５−Ｃ３−Ｌ（５−アミノペンチル）ヒドロキシカルバモイル）−プロピオンアミド）ペンチル）−３（５−（Ｎ−ヒドロキシアセトアミド）−ペンチル）カルバモイル）−プロプリオンヒドロキサム酸（デフェロキサミン、デスフェリオキサミンまたはＤＦＯ）およびヒドロキシメチルでんぷんに結合したデフェロキサミン（Ｓ−ＤＦＯ）が挙げられる。ＤＦＯのさらなる誘導体としては、ＤＦＯの脂肪族、芳香族、コハク酸およびメチルスルホン酸類似体、並びに特に、スルホンアミド−デフェロキサミン、アセトアミド−デフェロキサミン、プロピルアミド−デフェロキサミン、ブチルアミド−デフェロキサミン、ベンゾイルアミド−デフェロキサミン、スクシンアミド−デフェロキサミン、およびメチルスルホンアミド−デフェロキサミンが挙げられる。
【００２４】
本発明による鉄キレート剤はまた、シデロホアまたはキセノシデロホアであり得る。シデロホアまたはキセノシデロホアの例としては、ヒドロキサメートおよびポリカルボキシレートが挙げられる。ヒドロキサメートは、Ｎ−［δ］−ヒドロキシオルニチン部分を含み、そして一般的に４つの例示的なファミリーにカテゴリー化される。１つのカテゴリーは、ロドトルラ酸を含み、これはＮ−［δ］−アセチル−Ｌ−Ｎ［δ］−ヒドロキシオルニチンのジケトピペラジンである。このカテゴリーには、ジメルム酸と命名されたジヒドロキサメートなどの誘導体が含まれる。第２のカテゴリーは、コプロゲンを含み、これはＮ−［δ］−アシル−Ｎ−［δ］−ヒドロキシ−Ｌ−オルニチン部分を含む。コプロゲンはまた、線形構造を有するロドトルラ酸のトリヒドロキサメート誘導体と考えられ得る。第３のカテゴリーは、フェリクロムを含み、これは、Ｎ−［δ］−アシル−Ｎ−［δ］−ヒドロキシオルニチンと、グリシン、セリンまたはアラニンとの組合せのトリペプチドを含む環式ペプチドからなる。第４の例示的カテゴリーは、フシゲンとも呼ばれるフサリニンを含み、これは線形または環式のいずれかのヒドロキサメートであり得る。フサリニンは、無水メバロニン酸によるＮ−ヒドロキシオルニチンのＮアシル化によって特徴付けられる化合物である。ポリカルボキシレートは、リゾフェリンと呼ばれるクエン酸を含むポリカルボキシレートからなる。前記分子は、ジアミノブタンに連結した２つのクエン酸単位を含む。本発明の組成物において鉄キレート剤として有用なシデロフォアの他のカテゴリーとしては、例えば、フェノレート−カテコレートクラスのシデロフォア、ヘミン、および［β］−ケトアルデヒド植物毒素が挙げられる。
【００２５】
本発明による鉄キレート剤はまた、チオセミカルバゾン、潜在的な抗新生物活性を有する合成ヘテロ環カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾンであるトリアピン（３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン、３ＡＰ）、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン類似体、例えばジ−２−ピリジルケトンチオセミカルバゾン（ＤｐＴ）、ジ−２−ピリジルケトンイソニコチノイルヒドラゾン（ＰＫＩＨ）類似体およびジ−２−ピリジルケトン−４，４−ジメチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４４ｍＴ）であり得る。
【００２６】
好ましくは、本発明の鉄キレート剤は、デフェロキサミン、デフェラシロクス、デフェリプロン、トリアピンおよびＤｐ４４ｍＴからなる群より選択される。
【００２７】
「トランスフェリンレセプター阻害剤」という表現は、トランスフェリンレセプターに結合し、そしてトランスフェリンの定着を阻害もしくは妨げるか、または細胞中へのトランスフェリンレセプター／トランスフェリン複合体の内部移行を阻害もしくは妨げる任意の化合物を指す。
【００２８】
トランスフェリンは、鉄の輸送に関与する主要な血漿中タンパク質である。鉄がローディングされたトランスフェリン（Ｆｅ−Ｔｆ）はその細胞受容体（ＴｆＲ）に結合し、そして複合体Ｆｅ−Ｔｆ／ＴｆＲは小胞に内部移行する。小胞のｐＨは酸性化され、これがトランスフェリンによる鉄の遊離を誘導する。その後、レセプターは細胞表面上へとリサイクルされる（Irie et al. (1987) Am J Med Sci 293:103-11）。
【００２９】
本発明によるトランスフェリンレセプター阻害剤は、例えば、抗トランスフェリンレセプター抗体、トランスフェリンレセプターに結合する合成または天然配列ペプチド並びに小分子アンタゴニストおよびアプタマー、からなる群より選択され得る。
【００３０】
好ましくは、本発明によるトランスフェリンレセプター阻害剤は、抗トランスフェリンレセプター抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。より好ましくは、この抗体は、特にＷＯ２００５／１１１０８２（Moura et al. (2001) J Exp Med 194(4):417-25), Moura et al. (2004) Blood 103(5):1838-45, Lepelletier et al. (2007) Cancer Res 67(3):1145-54）に記載のＡ２４である（２００１年５月１０日にＣＮＣＭ（Collection nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris）に、Ｉ−２６６５番の下に寄託される）。
【００３１】
本明細書において使用する「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、そして特に、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ、ヒト化またはヒト抗体、ダイアボディ、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、およびまた抗体フラグメントを網羅する。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２が挙げられる。
【００３２】
ＭＡＰＫ経路は、細胞外刺激に応答し、そして遺伝子発現、有糸分裂、分化、および細胞の生存／アポトーシスなどの種々の細胞活性を調節する、セリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼであるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の関与する任意の生物学的経路に関する。ＭＡＰＫ経路は当業者には周知であり、そして特にBrown et al. ((2008) Handb Exp Pharmacol 1186:205-35)またはRaman et al. ((2007) Oncogene 26(22):3100-12)に記載されている。ＭＡＰＫの例は、Ｊｕｎキナーゼ、ｐ３８および細胞外シグナル調節キナーゼであり得る。本明細書において意図するＭＡＰＫ経路アゴニストは、ＭＡＰキナーゼ経路を誘導することができる。本発明によるＭＡＰＫ経路アゴニストの例は、鉄キレート剤およびビタミンＤ、その類似体およびビタミンＤレセプターモデュレーターであり得る。
【００３３】
本明細書において使用する「ビタミンＤ」という用語は、全ての型のビタミンＤ、例えばビタミンＤ１、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ４（２２−ジヒドロエルゴカルシフェロール）およびビタミンＤ５（シトカルシフェロール）を含む。好ましくは、本発明による「少なくとも１つのビタミンＤ」はビタミンＤ３、より好ましくはその活性型のビタミンＤ３である１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールＤ３（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３またはカルシトリオール）である。
【００３４】
本明細書において意図する「ビタミンＤ類似体」または「ビタミンＤレセプターモデュレーター」は、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）に結合することができ、そして好ましくは結合時に細胞分化を誘導することができる。
【００３５】
ビタミンＤ類似体またはビタミンＤレセプターモデュレーターがビタミンＤレセプターに結合する能力を決定するための試験は当業者に周知である。好ましくは、細胞抽出物上における類似体またはビタミンＤレセプターモデュレーターの特異的結合を推定することによってこの能力を評価することができる。例えば、典型的な結合実験において、超音波処理によって得られた可溶性細胞抽出物を、漸増濃度のビタミンＤ類似体またはビタミンＤレセプターモデュレーターと共にインキュベーションする。結合した類似体および遊離の類似体を、ヒドロキシアパタイト法によって分離することができる。１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の非存在下において測定した全結合から、過剰の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の存在下において得られた非特異的結合を差し引くことによって特異的結合を計算することができる（Skowronski et al. (1995) Endocrynology 136(1): 20-26）。
【００３６】
ビタミンＤ類似体またはビタミンＤレセプターモデュレーターが細胞分化を誘導する能力は、当業者に周知の種々の方法によって測定され得る。例えば、この能力は、Skowronski et al. (前掲書中)に記載のように類似体またはビタミンＤレセプターモデュレーターと共にインキュベーションした後の、ＬＮＣａＰ細胞株におけるＰＳＡ（細胞分化マーカー）の誘導の測定によって推定され得る。
【００３７】
多くのビタミンＤ類似体が当技術分野の最新技術において周知である。「ビタミンＤ類似体」という表現は特に、ビタミンＤ代謝物、ビタミンＤ誘導体およびビタミンＤ前駆体を包含し、好ましくはそれはビタミンＤ３代謝物、ビタミンＤ３誘導体およびビタミンＤ３前駆体を包含する。
【００３８】
本発明によるビタミンＤ類似体は、Ｃ−２４位の周囲における側鎖構造が修飾されたセコステロイド構造を保持し得る。例えば、ビタミンＤ類似体は、パリカルシトール（１９−ノル−１α（ＯＨ）２Ｄ２）、ＩＬＸ２３−７５５３（１６−エン−２３−イン−１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３）、ＯＣＴ（マキサカルシトール、２２−オキサ−１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３）およびＥＢ１０８９（セオカルシトール、１α−ジヒドロキシ−２２，２４−ジエン−２４，２６，２７−トリホモ−ビタミンＤ３）またはコレカルシフェロールであり得る。
【００３９】
より好ましくは、本発明によるビタミンＤ類似体は、パリカルシトール、ＯＣＴ、ＥＢ１０８９およびコレカルシフェロールからなる群より選択される。より好ましくはビタミンＤ類似体はコレカルシフェロールである。
【００４０】
本発明によるビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）は好ましくは、例えばＵＳ２００８／０２００５５２に記載の化合物のような、ＶＤ類似体よりも低カルシウム血症の程度がより低いことが示された非セコステロイド化合物である。より好ましくは、少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）は、ＬＹ２１０８４９１、ＬＹ２１０９８６６およびＬＧ１９０１１９からなる群より選択される（Ma et al. (2006) J Clin Invest 116(4):892-904, Polek et al (2001) Prostate 49(3):224-33）。
【００４１】
「薬学的に許容される担体」という表現は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、無毒性の固体の、半固体のまたは液体の充填剤、希釈剤、封入剤または製剤化助剤の任意の種類を指す。
【００４２】
本発明による医薬組成物の剤形、投与経路、投与量および投与計画は、処置しようとする状態、病気の重症度、患者の年齢、体重および性別などに依存する。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、特に、経口投与（好ましくはＶＤおよび鉄キレート剤の投与のために）、静脈内投与（好ましくはＶＤ、トランスフェリンレセプター阻害剤および鉄キレート剤の投与のために）、皮下投与（好ましくは鉄キレート剤の投与のために）または筋肉内投与（好ましくはＶＤの投与のために）用に製剤化され得る。
【００４４】
好ましくは、本発明による医薬組成物は、ビタミンＤ３およびモノクローナル抗体Ａ２４を含む。また好ましくは、本発明による医薬組成物はビタミンＤ３およびデフェロキサミンおよび／またはデフェラシロクスを含む。
【００４５】
例えば、本発明による少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤は、約０．１〜１０００mg/kg（体重）/日または好ましくは約１〜１００mg/kg（体重）/日の濃度で投与され得る。好ましくは、デフェラシロクスは、約１〜５０mg/kg（体重）/日の濃度で、より好ましくは約１０〜３０mg/kg（体重）/日の濃度で投与され得る。好ましくは、デフェロキサミンは、約１０〜１００mg/kg（体重）/日の濃度で、より好ましくは約６０〜８０mg/kg（体重）/日の濃度で投与され得る。
【００４６】
例えば、本発明による少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）は、約０．００１〜１００g/kg（体重）/日または約０．０１〜５０g/kg（体重）/日または約０．１〜５g/kg（体重）/日、より好ましくは約０．５g/kg（体重）/日の濃度で投与され得る。
【００４７】
前記に定義した、癌を有していた、前記癌を有する、または前記癌を発症しやすい個体に、少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）を投与する前、投与と同時に、またはその投与後に、少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤を投与することができる。少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤および少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）を、第１の結合分子が第２の結合分子と一緒に作用することにより、それ以外の方法で投与した場合よりも増加した利点が得られるような、順序および時間枠内で投与することができる。好ましくは、少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤および少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター（ＶＤＲＭ）は一緒に投与される。
【００４８】
本発明による医薬組成物は、癌の予防または処置に使用され得る。好ましくは、癌は造血器悪性腫瘍である。
【００４９】
本発明に関連して、「処置または予防」という用語は、このような用語を適用する疾患もしくは状態、またはこのような疾患もしくは状態の１つ以上の症状の逆行、軽減、その進行の阻害、または予防を意味する。特に、疾患の処置は、悪性細胞の数を減少させることからなり得る。最も好ましくは、このような処置により、悪性細胞の完全な枯渇に至る。
【００５０】
好ましくは、処置しようとする個体は、癌に罹患したまたは罹患する可能性のあるヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばげっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌ、または霊長類）である。好ましくは、個体はヒトである。
【００５１】
「癌」および「悪性腫瘍」という用語は、未制御な細胞増殖によって典型的には特徴付けられる哺乳動物における病的状態を指すまたは説明する。より正確には、本発明の使用において、疾病、すなわちビタミンＤレセプターを発現する腫瘍は、ビタミンＤモデュレーターに応答する可能性が最も高い。さらに、本発明者らは、鉄取り込み阻害剤を使用することによる鉄欠乏は、細胞表面におけるビタミンＤ受容体の過剰発現によってビタミンＤの感受性を回復させるという仮説を立てる。特に、癌は、固体腫瘍または未分化造血骨髄細胞（造血幹細胞）の未制御な増殖を伴い得る。固形腫瘍形成に関連した癌の例としては、乳癌、膀胱癌、子宮／頸癌、食道癌、膵臓癌、大腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌および胃癌が挙げられる。
【００５２】
好ましくは、本発明による癌または悪性腫瘍は、未分化造血骨髄細胞（造血幹細胞）の未制御な増殖に起因する。
【００５３】
本明細書において意図する「造血幹細胞（ＨＳＣ）」という表現は、例えば、骨髄系統（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球）、赤血球、巨核球／血小板、およびリンパ系譜（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血球型を生じる、成人多能性幹細胞を指す。
【００５４】
本発明による「造血幹細胞悪性腫瘍」または「造血器悪性腫瘍」という表現は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ腫および骨髄異形成症候群（２００１年のＷＨＯ分類に定義）を含む。好ましくは、本発明による癌は、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、非処理細胞（対照）と比較した、Ａ２４（Ａ２４）、デフェロキサミン（ＤＦＯ）またはデフェラシロクス（ＤＦＸ）によって処理されたＣＤ３４＋臍帯血細胞の半固体培養液から得られたマクロファージのコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）の比を示す。
【図２】図２は、Ａ２４およびＤＦＯを用いて７２時間かけて処理されたＡＭＬ患者の芽球におけるＣＤ１１ｂの発現を示す。対照細胞と比較したＭＦＩの増加を計算することによって、得られた値を規準化する。ＡＭＬのサブタイプが識別される：黒い記号はＭ０／Ｍ１／Ｍ２のＡＭＬサブタイプを示し、一方、白抜きの記号はＭ４／Ｍ５サブタイプを示す。８名の患者から得られた平均値が示されている。
【図３】図３は、Ａ２４およびＤＦＯを用いて７２時間かけて処理されたＡＭＬ患者の芽球におけるＣＤ１４の発現を示す。対照細胞と比較したＭＦＩの増加を計算することによって、得られた値を規準化する。ＡＭＬのサブタイプが識別される：黒い記号はＭ０／Ｍ１／Ｍ２のＡＭＬサブタイプを示し、白抜きの記号はＭ４／Ｍ５サブタイプを示す。８名の患者から得られた平均値が示されている。
【図４】図４は、ビタミンＤ３（ＶＤ、２５０nM）、Ａ２４（Ａ２４、１０μg/ml）、デフェロキサミン（ＤＦＯ、５μM）またはデフェラシロクス（ＤＦＸ、３μM）を用いてのＨＬ６０細胞の処理後のｃ−Ｊｕｎ発現の変化を示す。
【図５】図５は、Ａ２４（Ａ２４、１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ、５μM）；またはデフェラシロクス（ＤＦＸ、３μM）を用いて４８時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎ ｍＲＮＡレベル（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４）を示す。
【図６】図６は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（黒色）標識およびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ（灰色）標識を使用してフローサイトメトリーによって評価した初期および後期アポトーシス／壊死を示す。ＨＬ６０細胞を、２μMおよび６μMのＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（ＳＰ）の補充されたまたは補充されていない培地中、Ａ２４（１０μg/ml）またはデフェロキサミン（ＤＦＯ、５μM）の存在下または非存在下において培養した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【図７】図７は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（黒色）およびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ（灰色）を使用してフローサイトメトリーによって評価した初期および後期アポトーシス／壊死を示す。ＨＬ６０細胞を、０．５μMおよび１μMのｐ３８阻害剤のＳＢ２０３５８０（ＳＢ）の補充されたまたは補充されていない培地中、Ａ２４（Ａ２４、１０μg/ml）またはデフェロキサミン（ＤＦＯ、５μM）の存在下または非存在下において培養した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【図８】図８は、Ａ２４（１０μg/ml）（連続的な薄い線）を用いて、ＶＤ（２５０nM）（非連続的な薄い線）を用いて、またはＶＤと鉄キレート化剤との併用（連続的な太い線）で７２時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるＣＤ１４およびＣＤ１１ｂの発現のフローサイトメトリー分析を示す。塗りつぶされているヒストグラムは、対照アイソタイプ標識を示す。
【図９】図９は、ＤＦＯ（５μM）（連続的な薄い線）を用いて、ＶＤ（２５０nM）（非連続的な薄い線）を用いて、またはＶＤと鉄キレート化剤との併用（連続的な太い線）で７２時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるＣＤ１４およびＣＤ１１ｂの発現のフローサイトメトリー分析を示す。塗りつぶされているヒストグラムは対照アイソタイプ標識を示す。
【図１０】図１０は、Ａ２４（Ａ２４／１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ／５μM）、またはビタミンＤ３（ＶＤ／２５０nM）、Ａ２４とデフェロキサミン（Ａ２４＋ＤＦＯ／１０μg/mlおよび５μM）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（ＶＤ＋ＤＦＯ／２５０nMおよび５μM）を用いて６時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるＶＤＲ転写物のレベルを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）。
【図１１】図１１は、Ａ２４（Ａ２４／１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ／５μM）、またはビタミンＤ３（ＶＤ／２５０nM）、Ａ２４とデフェロキサミン（Ａ２４＋ＤＦＯ／１０μg/mlおよび５μM）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（ＶＤ＋ＤＦＯ／２５０nMおよび５μM）を用いて６時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるカテリシジン転写物レベルを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）。
【図１２】図１２は、Ａ２４（Ａ２４／１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ／５μM）、またはビタミンＤ３（ＶＤ／２５０nM）、Ａ２４とデフェロキサミン（Ａ２４＋ＤＦＯ／１０μg/mlおよび５μM）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（ＶＤ＋ＤＦＯ／２５０nMおよび５μM）を用いて６時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるＣＹＰ２４Ａ転写物レベルを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）。
【図１３】図１３は、Ａ２４（Ａ２４／１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ／５μM）、またはビタミンＤ３（ＶＤ／２５０nM）、Ａ２４とデフェロキサミン（Ａ２４＋ＤＦＯ／１０μg/mlおよび５μM）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（ＶＤ＋ＤＦＯ／２５０nMおよび５μM）を用いて１６時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるｃ−Ｊｕｎ転写物レベルを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）。
【図１４】図１４は、Ａ２４（Ａ２４／１０μg/ml）；デフェロキサミン（ＤＦＯ／５μM）、またはビタミンＤ３（ＶＤ／２５０nM）、Ａ２４とデフェロキサミン（Ａ２４＋ＤＦＯ／１０μg/mlおよび５μM）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（ＶＤ＋ＤＦＯ／２５０nMおよび５μM）を用いて１６時間かけて処理したＨＬ６０細胞におけるｃ−Ｆｏｓ転写物レベルを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに規準化）。
【図１５】図１５は、ビヒクル（対照、ｎ＝１２）を用いて注射されたマウスと比較して、デフェロキサミン（ＤＦＯ、ｎ＝１４）（２０mg/日、５〜７回/週のＤＦＯ）、デフェロキサミンとビタミンＤ３（１μg、１週間に２回のＶＤ、および２０mg/日、５〜７回/週のＤＦＯ）（ＤＦＯ＋ＶＤ、ｎ＝１３）を用いて注射された異種移植マウスにおいて２５日目に測定した腫瘍サイズを示す。個々の腫瘍をプロットする。
【００５６】
実施例
方法
臨床試料および細胞株
ＡＭＬ患者および健康ドナーからの末梢血細胞を、彼らの書面によるインフォームドコンセントが得られた後に分析した（さらなる情報については付録の表２を参照されたい）。末梢血を、処置投与前の初回の診断時に回収した。単球細胞を、フィコール・ハイパック（PAA laboratories）密度遠心分離によって分離し、そして１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Hyclone）、１００ng/mlの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０ng/mlのインターロイキン３（ＩＬ−３）および２５ng/mlのＦＬＴ３−Ｌ（全てR&D Systemsから購入）の補充されたＩＭＤＭ培地（Invitrogen）中に再懸濁した。ＨＬ６０およびＵ９３７細胞株は、J.M. Cayuela (Saint-Louis Hospital, Paris)からの親切な贈り物であった。細胞を、５％ＦＣＳおよび抗生物質の補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Invitrogen）中で培養した。
【００５７】
【表１】
【００５８】
細胞の処理および増殖についてのアッセイ
デフェラシロクスは、ノバルティスによって提供された。ＶＰ１６、ＤＦＯ、ＶＤおよびＦｅＣｌ３を、シグマ・アルドリッチから購入した。ｍＡｂ Ａ２４を、記載のように産生および精製した（Moura et al. (2001) J Exp Med 194:417-25）。ＪＮＫ（ＳＰ６００１２５）、ＥＲＫ（ＰＤ９８０５９）およびｐ３８（ＳＢ２０３５８０）ＭＡＰＫの阻害剤は全て、Santa-Cruz Biotechnologyから購入した。
【００５９】
増殖アッセイのために、ＨＬ６０細胞株を、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁し、そして患者の芽球を、１５％ＢＩＴ ９５００（Stem Cell Technologies）を含むＩＭＤＭ培地中に再懸濁した。細胞を、３枚の９６ウェル組織培養プレート（Falcon）に１ウェルあたり２．５×１０４個加えた。増殖を、記載のように測定した（Lepelletier et al. ((2007) Cancer Res 67:1145-1154）。
【００６０】
細胞遺伝学的分析
蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、第８染色体（ｐＺ８．４）および第１２染色体（ｐＢＲ１２）（対照として使用する）についての特異的セントロメアプローブと共に標準的なプロトコールを使用して実施した。
【００６１】
ＲＮＡ単離、リアルタイム定量ＰＣＲおよびトランスクリプトーム分析
全ＲＮＡを、Nucleospin RNA II (Macherey-Nagel)を使用して抽出した。ＤＮＡｓｅ処理後、一本鎖ｃＤＮＡを、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）を使用して合成した。定量リアルタイムＰＣＲを、Chromo-IV PCR System (MJ Research)を用いて実施し、そしてＰＣＲ産物を、SybrGreen Technology (Jumpstart mastermix, Sigma Aldrich)を使用して定量した。リアルタイム定量ＰＣＲの結果を、デルタデルタＣｔ法（Livak et al. (2001) Methods 25:402-408）を使用して解釈した。使用するプライマー配列の完全なリストは、付録のデータの章の表４において入手可能である。
【００６２】
マイクロアレイのために、アジレント社４４Ｋ全ヒトゲノム（Ｇ４１１２Ａ）の長い（６０ｂｐ）オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよび二色分析法を使用し、処理した試料からのプローブおよびリファレンスＲＮＡからのプローブを、シアニン５およびシアニン３を用いて別々に標識した。これらのマイクロアレイは、４４，２９０個のフィーチャー（feature）を有し、その中の４１，０００個の明確に異なるオリゴヌクレオチドは、そのアクセッションナンバーによって定義される３３，７１５個の配列に属する。直接比較するために、各々の処理した試料からのｃＲＮＡを、シアニン３（Ｃｙ３）−シチジン三リン酸（ＣＴＰ）を用いて標識し、そして非処理のＨＬ６０ＲＮＡリファレンスプールを、シアニン５（Ｃｙ５）−ＣＴＰを用いて標識した。逆転写、リニア増幅、ｃＲＮＡ標識および精製を、アジレント社リニア増幅キットを用いて実施した。マイクロアレイデータを、主にリゾルバ（Resolver）ソフトウェア（Rosetta Inpharmatics）を用いて分析した。全てのデータをフィルターにかけて、両方の色について５０任意単位よりも下の低強度の値を削除した。
【００６３】
腫瘍異種移植片
腫瘍確立の予防のために、５×１０６個のＨＬ６０細胞を、マトリゲルと混合し（１：１、Ｖ／Ｖ）、そして８〜１０週令の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。その後、マウスに、Ａ２４（４０mg/kg、１日目に１回）、ＤＦＯ（２０mg/日、１週間に５〜７回）、ＶＤ（１μg、１週間に２回）またはビヒクル対照としてのＰＢＳを２５日間の間に腹腔内注射した。腫瘍の増殖を、Lepelletier et al. ((2007) Cancer Res 67:1145-1154)に記載のように測定した。
【００６４】
免疫組織化学
パラフィンブロックからの３mmの連続切片を、キシレン中で脱パラフィン処理し、そして一連の段階的なアルコール中で水和させた。染色を、Lab Vision社の免疫組織化学Autostainer（Lab Vision Corporation, Fremont, CA）を使用して、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ（シグマ・アルドリッチ、１：２００）、ｐ−ＥＲＫおよびｐ−Ｊｕｎ（Cell Signaling、１：１０００）に対する一次抗体、その後、ビオチニル化抗Ｉｇおよびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて実施し、そしてＤＡＢ（０．０５％）および０．００３％Ｈ２Ｏ２を含むＰＢＳ中で発色させた。画像を、ＩＭ５０ソフトウェアを使用してデジタルカメラ（DFC320, Leica）およびLeica顕微鏡（ＤＭ−２０００）で得た。
【００６５】
統計分析
データを、平均±ＳＥＭとして表現する。統計分析を、GraphPadPrism 5ソフトウェアを用いて実施した。スチューデントｔ検定を使用して２つの群を比較し、多群比較を、一元配置ＡＮＯＶＡ検定、その後、post-hoc分析（Bonferroni検定）を使用して行なった。クラスカル・ウォリス検定、続いてダンのポスト検定を、ノンパラメトリック比較（指定されている場合）のために使用した。腫瘍を有さない動物曲線の比較のために、ログランク検定を使用した。結果は、０．０５未満（＊）、０．０１未満（＊＊）または０．００１未満（＊＊＊）のＰ値を統計学的有意と考えた。
【００６６】
結果
実施例１：鉄欠乏は、細胞分化に関連した遺伝子の発現に影響を与える
前記の鉄キレート化治療アプローチの抗腫瘍作用に関与する分子機序は依然として完全に解明されていない。これらの機序を新たに洞察するために、鉄キレート剤（デフェロキサミン（ＤＦＯ）およびデフェラシロクス（ＤＦＸ））およびＴｆＲ１障害（ｍＡｂ Ａ２４）の両方によって影響を受ける遺伝子を同定した。理論は、この戦略によって無関係の遺伝子を選択する可能性が減少するだろうというものであった。これらの研究は、細胞株モデル（ＨＬ６０）に焦点を当て、ＡＭＬ患者の発癌に関与するいくつかの遺伝子事象に関連したデータの不均一性を回避した。回収したデータの分析により、１０５個の遺伝子が３つの異なる薬剤によってモデュレーションされたことが明らかとなった。これらの遺伝子の中で、いくつかは細胞分化に関連していた。特に、鉄欠乏剤によって、単球または活性化マクロファージのマーカーはアップレギュレーションされ（ＳＥＲＰＩＮＢ８、ＩＴＧＢ２、ＴＲＥＭＬ２、ＩＴＧＡＭ）、顆粒球分化のマーカーはダウンレギュレーションされた（ＥＬＡ２、ＰＲＴＮ３、ＣＬＣ、ＡＺＵ）。
【００６７】
実施例２：鉄恒常性は顆粒球−単球への分化において役割を果たす
初代造血前駆細胞における鉄欠乏の効果を試験した。鉄欠乏剤（鉄キレート剤のように直接的に、または抗ＴｆＲ ｍＡｂ Ａ２４の使用によって間接的に）の存在下または非存在下における初代ＣＤ３４＋細胞（多能性サイトカインと共に）の半固体培養により、ＣＦＵ−Ｍのコロニー数が増加しＣＦＵ−Ｇが減失したが、このことは、造血前駆細胞からのキレート化鉄が、顆粒球系統よりも単球系統の方への傾倒を誘導したが（図１）、コロニーの総数は変化させなかったことを示唆する。液体培養では、鉄欠乏は、臍帯血細胞の増殖に影響を与えなかったが、単球系統へのその傾倒をモデュレーションした。同様に、単球系統に特異的な転写因子であるＨＯＸＡ１０、ＥＧＲ１およびＭａｆＢの一貫したアップレギュレーションがみられた。培養の細胞学的評価により、鉄の少ない培養において単球細胞数が増強したことを確認した。従って、骨髄ニッチにおいて、鉄の利用可能性は、造血前駆細胞から骨髄単球への分化の転帰か、顆粒球への分化の転帰かを決定する因子であり得る。
【００６８】
実施例３：鉄欠乏は白血病細胞の分化を誘導する
鉄欠乏による、ＡＭＬ細胞の分化の遮断無効化能力を試験した。ＡＭＬ細胞株において、Ａ２４ｍＡｂ、ＤＦＯおよびＤＦＸによる鉄欠乏によって、単球マーカーＣＤ１４およびＣＤ１１ｂ（これは単球分化剤であるビタミンＤ３（ＶＤ）によって誘導される）が誘導された。細胞表面マーカーの誘導は、単球の特徴的な細胞学的改変を伴った。鉄欠乏により、細胞質の拡大、細胞質の好塩基球増加症の減少およびアズール顆粒の減少が誘導された。分化マーカー発現のアップレギュレーションは、培養液に過剰の可溶性鉄を補充した場合に消失し、このことは単球分化プログラムの第１の起源が、細胞の鉄利用可能性に依存することを確認する。
【００６９】
次に、ＡＭＬ患者からの細胞も、鉄欠乏で分化を誘導させ得るかどうかを調査した。種々のＡＭＬサブタイプからの新鮮なＡＭＬ芽球を、診断時に単離し（研究に使用した患者のサブタイプおよび生物学的パラメーターの完全なリストを表１に列挙する）、そしてｍＡｂ Ａ２４およびＤＦＯの存在下において培養した。ＣＤ１４およびＣＤ１１ｂマーカー発現は、培養により一貫してアップレギュレーションされ、このことにより、種々のＡＭＬサブタイプからの芽球は、分化停止に至るその発癌事象は異質であったとしても、鉄欠乏に基づいた分化療法に感受性であることが示された（図２および図３）。in vitroにおける治療量域研究により、分化が細胞増殖停止およびアポトーシスを伴うことを示された。
【００７０】
実施例４：鉄欠乏によって誘導されるＪＵＮキナーゼ経路
ＶＤおよび鉄キレート化剤によって誘導される遺伝子のパターンを（目的変数なしの分析を用いて）比較することによって、モデュレーションされた遺伝子間の高度の類似性を見出した。鉄欠乏によってモデュレーションされた１０５個中３０個の遺伝子が、ＶＤにより改変された遺伝子と共通した。この所見は、両方の分化アプローチ間の類似の可能性を強調する。ＶＤおよび鉄キレート化剤の両方が、単球マーカー（ＳＥＲＰＩＮＢ８、ＩＴＧＢ２、ＴＲＥＭＬ２、ＩＴＧＡＭ）をアップレギュレーションし、そして好中球マーカー（ＥＬＡ２、ＰＲＴＮ３、ＣＬＣ、ＡＺＵ）をダウンレギュレーションした。ＪＵＮキナーゼ経路（ＪＮＫ）は、単球分化に関与する主要なＭＡＰＫ経路であり、そしてＶＤによって誘導されることが以前に示されている（Wang et al; (2003) J Cell Biochem 89:1087-1101）。効果的に、ｃ−Ｊｕｎ遺伝子はＶＤによって誘導されたが、また鉄欠乏によっても誘導された（図４）。さらに、ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎをコードする転写物も、両方の処理によってアップレギュレーションされた（図５）。その特異的阻害剤であるＳＰ６００１２５によるＪＮＫの阻害は、Ａ２４またはＤＦＯを伴う鉄によって誘導される分化を消失させた。ＭＡＰＫ経路（細胞外シグナル調節キナーゼＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８）は頻繁に収束してシグナル伝達を増幅する（Johnson et al. (2002) Science 298:1911-1912, Lopez-Bregami et al. (2007) Cancer Cell 11:447-460）。これに一致して、鉄キレート化剤は、その分子エフェクターのリン酸化によって証明されるような、ＭＡＰＫ関連ＥＲＫおよびｐ３８の経路の活性化を誘導したことが判明した。さらに、ＥＲＫおよびｐ３８経路の選択的阻害は、鉄欠乏によって誘導される細胞分化を遮断した。しかしながら、ＪＮＫおよびｐ３８の阻害剤（図６および図７）は、鉄欠乏によって誘導される細胞アポトーシスを妨げたが、ＥＲＫの阻害剤は妨げなかった。
【００７１】
実施例５：鉄キレート化剤とビタミンＤ３の併用は、ＡＭＬ芽球分化に対して相乗作用を及ぼす
次に、鉄キレート化剤とＶＤの併用が相乗作用を及ぼし得るかどうかを調べた。キレート剤とＶＤの併用は、単球細胞分化マーカーのアップレギュレーションを劇的に増加させた（図８および図９）。これは、単球細胞分化に関与するＶＤＲ遺伝子転写のアップレギュレーション（図１０）によって説明され得る（Himes et al; (2006) J Immunol 176:2219-2228, Wang et al. (2003) J Cell Biochem 89:1087-1101）。上昇したＶＤＲ遺伝子発現の生理学的関連性は、その下流のターゲット遺伝子であるカテリシジン（１０００倍増加）（図１１）およびＣＹＰ２４Ａ（６０００倍増加）（図１２）の転写の急激な増加によって証明された。観察された相乗作用はＪＮＫ経路の活性化にも起因する。なぜなら、ｃ−Ｊｕｎ遺伝子およびｃ−Ｆｏｓ遺伝子が、鉄キレート化とＶＤの併用によって顕著にアップレギュレーションされたからである（図１３および図１４）。さらに、ＶＤを鉄欠乏と併用すると、ＪＮＫのリン酸化は増加した。これらの著名な改変は、処理細胞における形態学的変化を伴った。それ故、鉄欠乏とＶＤなどの分化剤との両方の併用は、その抗白血病特性を維持しつつ、併用療法における副作用を減少させ得る。
【００７２】
実施例６：鉄キレート化とビタミンＤ３の併用は、in vivoのマウス腫瘍異種移植片モデルにおいて相乗作用を及ぼす
分化療法の効力を、in vivoのマウス腫瘍異種移植片モデルにおいてさらに評価した。ＶＤとＤＦＯ療法の組合せは、マウスにおける腫瘍の増殖を有意に減少させた（図１５）。減少した腫瘍増殖は、腫瘍細胞のアポトーシス、細胞分化の特徴、およびＭＡＰＫリン酸化（ＥＲＫおよびＪＮＫ）を伴った。
【００７３】
実施例７：鉄キレート剤とビタミンＤ３の併用は、１名のＡＭＬ患者において芽球分化を誘導した
鉄キレート剤とＶＤの効力を１名のＡＭＬ患者において評価した。６９歳の男性は、最近、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）から急性骨髄性白血病への転換を示した。高用量の化学療法後、患者には依然として芽球無形成はなかった。診断から７月後、芽球が血液中に再度出現し、そして鉄キレート剤（デフェラシロクス１ｇ／日）およびＶＤ（４０００ＵＩ／日）を用いての処置を開始した。この組合せ療法は好中球数の増加を伴ったが、高カルシウム血症は誘導しなかった。重要なことには、組合せ処置は、ＭＧＧ血液塗抹標本上で観察されたように芽球から単球系統への分化を誘導した。この観察は細胞選別、その後の細胞遺伝学的分析によってさらに確認され、ここでは元の芽球トリソミーが、未成熟細胞から誘導された成熟単球には見出されたが、リンパ球およびＮＫ細胞には見出されなかった。それ故、鉄恒常性は、正常な状況および病的な状況の両方における細胞分化の制御において重要な役割を果たす。鉄の少ない環境においてはＢＭ細胞は単球へと分化する傾向にあり、そしてＡＭＬからの芽球は鉄キレート剤の存在下において分化し得る。ゲノムスクリーニングにより、細胞分化に関連した遺伝子が、鉄欠乏によってターゲティングされそしてこれはＶＤと高度に共有されている（３０％の類似性）ことが示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びに
ｂ）少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター、
並びに場合により薬学的に許容される担体
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤が、鉄キレート剤およびトランスフェリンレセプター阻害剤からなる群より選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシロクス、デフェリプロン、トリアピンおよびＤｐ４４ｍＴからなる群より選択される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
トランスフェリンレセプター阻害剤が、抗トランスフェリンレセプター抗体である、請求項２または３記載の医薬組成物。
【請求項５】
抗トランスフェリンレセプター抗体が、モノクローナル抗体Ａ２４である、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのビタミンＤが、ビタミンＤ３である、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのビタミンＤ類似体が、コレカルシフェロール、パリカルシトリオール、ＯＣＴおよびＥＢ１０８９からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーターが、ＬＹ２１０８４９１、ＬＹ２１０９８６６およびＬＧ１９０１１９からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
− ビタミンＤ３、および
− モノクローナル抗体Ａ２４
を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
− ビタミンＤ３、並びに
− デフェロキサミンおよび／またはデフェラシロクス
を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１１】
癌の予防または処置において使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
癌が、造血器悪性腫瘍である、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌が、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項１１または１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１１〜１３に定義した癌の予防または処置において使用するための、請求項１〜５に定義した少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びに、請求項６、７および８に定義した少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター。
【請求項１５】
請求項１１〜１３に定義した癌の予防または処置において同時、別々または連続的に使用するための組合せ調製物としての、
ａ）請求項１〜５に定義した少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びに
ｂ）請求項６、７および８に定義した少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター
を含む製品。
【請求項１】
ａ）少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びに
ｂ）少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター、
並びに場合により薬学的に許容される担体
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤が、鉄キレート剤およびトランスフェリンレセプター阻害剤からなる群より選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシロクス、デフェリプロン、トリアピンおよびＤｐ４４ｍＴからなる群より選択される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
トランスフェリンレセプター阻害剤が、抗トランスフェリンレセプター抗体である、請求項２または３記載の医薬組成物。
【請求項５】
抗トランスフェリンレセプター抗体が、モノクローナル抗体Ａ２４である、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのビタミンＤが、ビタミンＤ３である、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのビタミンＤ類似体が、コレカルシフェロール、パリカルシトリオール、ＯＣＴおよびＥＢ１０８９からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーターが、ＬＹ２１０８４９１、ＬＹ２１０９８６６およびＬＧ１９０１１９からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
− ビタミンＤ３、および
− モノクローナル抗体Ａ２４
を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
− ビタミンＤ３、並びに
− デフェロキサミンおよび／またはデフェラシロクス
を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１１】
癌の予防または処置において使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
癌が、造血器悪性腫瘍である、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌が、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項１１または１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１１〜１３に定義した癌の予防または処置において使用するための、請求項１〜５に定義した少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びに、請求項６、７および８に定義した少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター。
【請求項１５】
請求項１１〜１３に定義した癌の予防または処置において同時、別々または連続的に使用するための組合せ調製物としての、
ａ）請求項１〜５に定義した少なくとも１つの鉄取り込み阻害剤、並びに
ｂ）請求項６、７および８に定義した少なくとも１つのビタミンＤおよび／または少なくとも１つのその類似体および／または少なくとも１つのビタミンＤレセプターモデュレーター
を含む製品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１２−５３２９２５（Ｐ２０１２−５３２９２５Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２０１１０（Ｐ２０１２−５２０１１０）
【出願日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５４２１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００７２０８
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５４２１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００７２０８
【国際公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
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